ES2250964T3 - Receptor de la quimioquina c-c(c-c ckr-1). - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONAN DNA AISLADOS QUE CODIFICAN EL RECEPTOR DE QUIMIOQUINA C - C HUMANO CKR - 1 C - C Y METODOS PARA OBTENER TAL DNA, JUNTO CON SISTEMAS DE PRESENTACION PARA LA PRODUCCION RECOMBINANTE DE CKR - 1 C - C UTIL EN COMPOSICIONES TERAPEUTICAS O DE DIAGNOSTICO. ADICIONALMENTE, SE PROPORCIONA UN METODO PARA IDENTIFICAR NUEVOS RECEPTORES DE QUIMIOQUINA.

Description

Receptor de la quimiocina C-C(C-C CKR-1).

Esta invención se refiere al campo de los receptores de citocinas, sus anticuerpos, y su uso como agentes diagnósticos y terapéuticos.

Antecedentes de la invención

Las citocinas son moléculas biológicas que afectan las células efectoras inflamatorias y relacionadas con el sistema inmune. Las citocinas inflamatorias, o "quimiocinas", tienen una variedad de propiedades biológicas, incluyendo la quimiotaxis y activación selectiva de leucocitos. Estas quimiocinas forman una superfamilia, denominada en la literatura alternativamente como la superfamilia PDF4 o las intercrinas, que se ha dividido en dos clases en base a si los dos primeros residuos cisteína conservados están separados por un aminoácido intermedio (C-X-C, o \alpha) o si son adyacentes (C-C, o \beta). Los miembros de la clase C-X-C incluyen, por ejemplo, la interleucina-8 (IL-8), el factor estimulador del crecimiento de los melanocitos (MGSA), y el factor 4 de las plaquetas (PF4), mientras que la clase C-C incluye el RANTES (Regulado a partir de la Activación, Expresado y Secretado en T Normales) y el péptido-1 quimiotáctico de monocitos (MCP-1). La clase C-X-C ejerce la actividad proinflamatoria principalmente a través de su acción sobre neutrófilos, mientras que la clase C-C parece ser quimioatractores de monocitos.

Mucha atención se ha concentrado en las interacciones receptor/ligando en esta superfamilia, habiendo más datos disponibles sobre la unión de quimiocinas C-X-C que sobre las C-C. Ha pasado a estar claro que las interacciones receptor/ligando de quimiocina sobre las células inflamatorias diana parecen estar estrictamente reguladas. Por ejemplo, no se ha observado competición cruzada por los sitios de unión, tanto sobre monocitos como sobre neutrófilos, entre miembros de las ramas C-X-C o C-C (Leonard, E.J., et al., Immunol. Today, 11:97-101 (1990); Samanta, A.K., et al., J. Exp. Med., 169:1185-1189 (1989); Yoshimura, T. et al., J. Immunol. 145:292-297 (1990); de forma consistente con los efectos quimioatractores diferenciales sobre estos dos tipos de células. Los datos sobre la unión directa para las quimiocinas C-C son sorprendentemente escasos. Se ha publicado que el HCP-1 humano se une a monocitos con una afinidad de aproximadamente 2 nM, sin sitios detectables sobre los neutrófilos (Valente, A.J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:309-314 (1991); Yoshimura, T., et al., J. Immunol., 145:292-297 (1990)). Un único informe muestra que la Act-2, una variante del MIP-1\beta humano (HuMIP-1\beta), se une a entre 7.000 y 45.000 sitios sobre PBMC con una afinidad de entre 7,8 y 12 nM (Napolitano, M., et al., J. Exp. Med., 172:285-289 (1990)). Kwon y colaboradores han caracterizado la unión del MIP-1\alpha de ratón sobre una célula T de ratón y una línea celular de macrófago, hallando respectivamente una K_{d} de 1,5 y 0,9 nM (Oh, K.O., et al., J. Immunol., 147:2978-2983 (1991)).

La mayoría de los detalles moleculares en relación con la motilidad de leucocitos permanecen sin elucidar. Sin embargo, recientemente, usando técnicas moleculares, se han clonado los receptores para la anafilatoxina C5a (Gerard, N.P., et al., Nature, 349:614-617 (1991)), el tripéptido formilado bacteriano fMLP (Boulay, F., et al., Biochemistry, 29:111123-11133 (1990)), y la quimiocina C-X-C IL-8 (Holmes, W.E., et al., Science, 253:1278-1280 (1991); Murphy, P.M., et al., Science, 253:1280-1283 (1991)). Todos estos receptores muestran secuencias de aminoácidos que se ha predicho se ajustan a una arquitectura que contiene siete segmentos transmembrana conectados mediante una serie de bucles intra- y extracelulares. Las secuencias primarias de estos receptores revelaron dominios que están conservados en los receptores asociados con la motilidad celular, pero no en otros receptores con siete segmentos transmem-
brana.

En consecuencia, es un objeto de la invención proporcionar un receptor de quimiocina C-C (C-C CKR-1) aislado para su uso como un reactivo terapéutico o de diagnóstico.

Es otro objeto de la invención construir variantes del C-C CKR-1 para su uso como antagonistas o agonistas. Es otro objeto de la invención generar anticuerpos contra el C-C CKR-1 para su uso como agentes de diagnóstico y terapéuticos.

Es otro objeto de la invención proporcionar un procedimiento para identificar nuevos receptores de quimiocinas.

Resumen de la invención

Un aspecto de la invención es el aislamiento del nuevo receptor de quimiocina C-C CKR-1.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende C-C CKR-1 que está libre de polipéptidos contaminantes de la especie animal de la que se deriva el C-C CKR-1.

En otro aspecto de la invención, el C-C CKR-1, o fragmentos del mismo (los cuales podrían sintetizarse mediante procedimientos químicos), se fusiona (mediante expresión recombinante o procedimiento covalentes in vitro) con un polipéptido inmunogénico, y este polipéptido de fusión, a su vez, se usa para inmunizar un animal para generar anticuerpos contra un epítopo del C-C CKR-1. Los anticuerpos anti-C-C CKR-1 se recuperan del suero de animales inmunizados. Alternativamente, se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células del animal inmunizado de la forma convencional.

Otro aspecto de la invención es el uso de anticuerpos anti-C-C CKR-1 en el diagnóstico de (in vitro o in vivo) o (cuando se inmovilizan sobre una matriz insoluble) en la purificación de receptores de quimiocinas que se unen a ellos.

Otro aspecto de la invención es la derivación del C-C CKR-1 in vitro para preparar C-C CKR-1 inmovilizado y C-C CKR-1 marcado, particularmente con propósitos de diagnóstico del C-C CKR-1 o sus anticuerpos, o para la purificación por afinidad de los propios anticuerpos contra el C-C CKR-1.

Otro aspecto de la invención es la formulación del C-C CKR-1, sus derivados, o sus anticuerpos, en vehículos fisiológicamente aceptables, especialmente para uso terapéutico. Tales vehículos incluyen las formulaciones de liberación ininterrumpida del C-C CKR-1.

En aún otros aspectos, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el C-C CKR-1,
marcada o sin marcar, y una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de, o se hibrida en condiciones definidas con una secuencia de ácido nucleico que codifica el C-C CKR-1.

Además, la invención proporciona un vector replicable que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica el C-C CKR-1, unida operativamente a secuencias de control reconocidas por un huésped transformado por el vector; las células huéspedes transformadas con el vector; y un procedimiento para usar una molécula de ácido nucleico que codifica el C-C CKR-1, para efectuar la producción de C-C CKR-1, que comprende expresar la molécula de ácido nucleico en un cultivo de las células huéspedes transformadas y recuperar el C-C CKR-1 del cultivo de células huéspedes. La secuencia de ácido nucleico es útil también en ensayos de hibridación del ácido nucleico del C-C
CKR-1.

Otro aspecto de la invención son las variantes por sustitución, supresión o inserción de aminoácidos del C-C CKR-1
y/o de residuos glicosilo, incluyendo las variantes que tienen una glicosilación no nativa. Estas variantes se preparan mediante procedimientos in vitro o recombinantes. Las variantes de la secuencia se examinan opcionalmente en busca de reactividad inmunocruzada con el C-C CKR-1, y en busca de actividad antagonista o agonista del C-C CKR-1.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para identificar nuevos receptores de quimiocinas C-C, tal como se detalla más adelante en las reivindicaciones.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para determinar la actividad biológica de una variante de quimiocina C-C sobre el C-C CKR-1, transformando una célula huésped con ADN que codifica el C-C CKR-1, cultivando la célula huésped para expresar el receptor sobre su superficie, recolectando las células, poniendo en contacto las células con una variante de quimiocina C-C, y determinando la actividad biológica de la variante sobre el receptor.

La invención podría usarse para proporcionar animales transgénicos que comprenden el C-C CKR-1 de otra especie, animales en los que el C-C CKR-1 se expresa en un tejido en el cual no se halla ordinariamente, o animales en los que el C-C CKR-1 está inactivado mediante, por ejemplo, la interrupción del gen.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 (SEC. ID. Nº: 1-7) ilustra la secuencia de aminoácidos predicha del C-C CKR-1, y el alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha con las del HUMSTR (nº de acceso en Genbank #M99293), la del IL8rA (Holmes, W.E., et al., Science, 253:1278-1280 (1991)), la del IL8rB (Murphy, P.M., et al., Science, 253:1280-1283 (1991)), receptor de la C5a (Gerard, N.P., et al., Nature, 349:614-617 (1991)), receptor del fMLP (Boulay, F., et al., Biochemistry, 29:111123-11133 (1990)), y la pauta de lectura abierta del citomegalovirus, US28. Los siete dominios transmembrana están sobrerayados. Los sitios de glicosilación se indican con puntos negros encima de la secuencia. Los dos residuos cisteína implicados en el enlace disulfuro se indican con asteriscos. El sitio consenso para la fosforilación con proteína quinasa C está indicado como "+". Los aminoácidos conservados que aparecen más de dos veces en el alineamiento están encuadrados.

La Figura 2 ilustra el análisis de transferencia Northern del ARN procedente de células hematopoyéticas sondeadas con C-C CKR-1. 5 \mug de poli-A^{+} ó 20 \mug de ARN total procedente de las líneas celulares indicadas, se fraccionaron según tamaño en 1% formaldehído-agarosa, se transfirieron sobre nitrocelulosa, y se hibridaron con ADNc de C-C CKR-1 marcado radiactivamente. Se lavó el filtro con 0,5\times SSC, 0,1% SDS a 55ºC, y la autorradiografía se reveló después de 4-6 horas de exposición a -70ºC con pantallas intensificadoras. También se corrieron en el gel marcadores de peso molecular de ARN y se indican al lado.

Las Figuras 3A y 3B ilustran el análisis de transferencia Southern de ADN genómico humano sondeado con C-C
CKR-1. En la Figura 3A, se digirieron 10 \mug de ADN genómico con el enzima de restricción indicado, se corrió sobre un gel de agarosa al 0,6%, de transfirió sobre Genescreen® y se hibridó con cADN de C-C CKR-1 marcado radiactivamente. Se lavó el filtro con 0,5\times SSC, 1% SDS a 55ºC, y la autorradiografía se reveló después de exposición durante la noche a -70ºC con pantallas intensificadoras. También se corrieron en el gel marcadores de peso molecular de ADN y se indican al lado. En la Figura 3B, la misma transferencia se lavó en condiciones más rigurosas con 0,2\times SSC, 0,1% SDS a 60ºC, y la autorradiografía se realizó tal como se ha indicado más arriba.

Las Figuras 4A y 4B son gráficas que ilustran las concentraciones de Ca^{++} intracelulares de células 293 transfectadas con ADNc de C-C CKR-1 y desafiadas con MIP-1\alpha humano (HuMIP-1\alpha) y RANTES. En la Figura 4A, células confluentes al 50% se transfectaron con 10-20 \mug de ADN plasmídico mediante el procedimiento de precipitación con calcio-fosfato. Después de la expresión transitoria durante 12-24 horas, se recolectaron las células, se cargaron con la sonda de calcio INDO-1 AM, y se ensayaron mediante procedimientos espectrofluorométricos, a 37ºC, con agitación ininterrumpida. Tal como se indica, transcurridos 12 segundos se añadieron varias concentraciones de HuMIP-1\alpha. Las concentraciones de Ca^{++} intracelulares se determinaron tal como se ha descrito (Naccache, P.H., et al., J. Immunol., 142:2438-2444 (1989)). En la Figura 4B, los detalles fueron como en la Figura 4A, excepto que, tal como se ha indicado, se usaron varias concentraciones de RANTES.

Las Figuras 5A y 5B son gráficas que ilustran la desensibilización en respuesta al desafío del mismo o diferentes ligandos por parte de células 293 que transitoriamente expresan el C-C CKR-1. Los detalles son tal como sed describieron en la Figura 4. Las células transfectadas se desafiaron primero durante 12 segundos con 100 nM de HuMIP-1\alpha
o 250 nM de RANTES, y a continuación durante 70 segundos con la misma concentración de ligandos en el orden indicado.

Las Figuras 6A y 6B son gráficas que ilustran la unión del ^{125}I-HuMIP-1\alpha y ^{125}I-RANTES sobre células 293 transfectadas con el ADNc de C-C CKR-1. En la Figura 6A, las células renales embrionarias humanas (células 293) se transfectaron con 10-20 \mug de ADN plasmídico tal como se describió en la Figura 4. Las células transfectadas se incubaron durante 2 horas a 4ºC con ^{125}I-HuMIP-1\alpha en presencia de concentraciones crecientes de HuMIP-1\alpha sin marcar. El recuadro muestra el análisis de Scatchard de los datos de unión y revela una K_{d} de 5,1 \pm 0,3 nM del
^{125}I-HuMIP-1\alpha para el C-C CKR-1. La Figura 6B ilustra el desplazamiento del ^{125}I-RANTES con HuMIP-1\alpha sin marcar sobre células 293 transfectadas con el ADNc de C-C CKR-1. El análisis de Scatchard de los datos de unión reveló una K_{d} de 7,6 \pm 1,5 nM para el desplazamiento del ^{125}I-RANTES por parte del HuMIP-1\alpha.

La Figura 7 es una gráfica que ilustra el desplazamiento de la unión del ^{125}I-HuMIP-1\alpha a las células 293 transfectadas con el ADNc del C-C CKR-1. Las células se transfectaron tal como se esbozó en la Figura 4, y se incubaron durante 2 horas a 4ºC con ^{125}I-HuMIP-1\alpha en presencia de concentraciones crecientes de los ligandos de competición cruzada, HuMIP-1\alpha, MIP-1\alpha de ratón, HuMIP-1\beta, MCP-1 e IL-8. La K_{d} y el número de sitios, mostrados en la esquina inferior izquierda, se determinaron mediante análisis de Scatchard de los datos de unión.

La Figura 8 es una gráfica que ilustra la concentración intracelular de Ca^{++} de las células 293 que expresan transitoriamente el C-C CKR-1 y son desafiadas con HuMIP-1\alpha, RANTES, HuMIP-1\beta y MCP-1. Los detalles son tal como se describieron en la Figura 4.

La Figura 9 (SEC. Nº ID.: 8) es la secuencia de nucleótidos del C-C CKR-1 y de su región 3' no codificante.

La Figura 10 es una gráfica que ilustra la unión del HuMIP-1\alpha marcado radiactivamente a células 293 transfectadas con la región codificante de la pauta de lectura abierta US28 en el genoma del citomegalovirus (CMV). Las células 293 se transfectaron con una construcción de expresión que contenía la secuencia codificante de la US28 en la orientación con sentido y sin sentido. Transcurridas 12 horas, se recolectaron las células y se incubaron con 0,9 nM de
^{125}I-HuMIP-1\alpha en combinación con 1 \muM de uno de HuMIP-1\alpha sin marcar, MIP-1\alpha de ratón, MCP-1, RANTES o IL-8. La cantidad de ^{125}I-HuMIP-1\alpha desplazable se determinó sustrayendo la cantidad de ^{125}I-HuMIP-1\alpha unido en ausencia de cualquier ligando frío de la cantidad unida en presencia del ligando frío. El valor de fondo se refiere al recuento obtenido a partir de células transfectadas con la orientación anti-sentido de la US28.

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

En general, las palabras y frases siguientes tienen la definición indicada cuando se usan en la descripción, ejemplos y reivindicaciones.

"C-C CKR-1" es el receptor de la quimiocina descrito más abajo, junto con si secuencia de aminoácidos o análogos celulares, alelos, mutaciones predeterminadas de las secuencia de aminoácidos, variantes de glicosilación, y modificaciones covalentes. Las realizaciones del C-C CKR-1 excluyen los receptores de quimiocinas conocidos, en particular aquéllos expuestos en la sección Precedentes de más arriba, y los receptores de quimiocinas evidentemente obvios a partir de tales receptores de quimiocinas.

"Receptor huérfano" se define como el polipéptido predicho codificado por el ácido nucleico, el cual se hibrida en condiciones de baja rigurosidad con sondas diseñadas a partir de secuencias conocidas de ácido nucleico de receptor de quimiocinas, u otras secuencias conocidas que es probable que tengan similitud estructural con los receptores de citocinas, o que son detectables mediante cebadores de PCR diseñados de esa forma, en donde el polipéptido predicha no se conoce previamente en el campo.

"Actividad biológica cualitativa del C-C CKR-1" es define como la reactividad inmunológica cruzada con al menos un epítopo del C-C CKR-1 purificado.

"Que inmunológicamente reacciona de forma cruzada" se pretende que signifique que el polipéptido candidato es capaz de inhibir competitivamente la unión del C-C CKR-1 nativo a anticuerpos policlonales o antisueros generados contra el C-C CKR-1 nativo.

"Ácido nucleico o polipéptido del C-C CKR-1 aislado" es un ácido nucleico o polipéptido del C-C CKR-1 que está identificado y separado de al menos un contaminante (respectivamente ácido nucleico o polipéptido) con el cual ordinariamente está asociado en la naturaleza, tal como los procedentes de la fuente humana de ácido nucleico o polipéptido del C-C CKR-1. En las realizaciones preferidas, el C-C CKR-1 estará aislado hasta niveles de pureza farmacéuticamente aceptables con respecto a proteínas de su especie de origen. En las realizaciones preferidas, la proteína C-C CKR-1 estará purificada hasta (1) más del 95% en peso de proteína, y más preferiblemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante un secuenciador de aminoácidos disponible comercialmente en la fecha de registro de ésta, o (3) hasta la homogeneidad mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS (SDS-PAGE) no reductora convencional, usando azul de Coomassie, o preferiblemente tinción de plata. El C-C CKR-1 aislado incluye el C-C CKR-1 in situ dentro de células recombinantes que no expresan ordinariamente el C-C CKR-1 en cuestión, puesto que, en este caso, al menos un componente del entorno natural del C-C CKR-1 no estará presente. El C-C CKR-1 aislado incluye el
C-C CKR-1 en un cultivo de célula recombinante de otra especie distinta de la especie de origen del C-C CKR-1, puesto que el C-C CKR-1 en tales circunstancias carecerá de polipéptidos fuente. Sin embargo, de forma ordinaria, el C-C CKR-1 se preparará al menos mediante un paso de purificación.

El ácido nucleico aislado del C-C CKR-1 incluye un ácido nucleico que se identifica y separar de al menos un ácido nucleico contaminante con el cual está ordinariamente asociado en la fuente natural del ácido nucleico del C-C CKR-1.
Por tanto, el ácido nucleico del C-C CKR-1 está presente en otras formas aparte de la forma o disposición en que se halla en la naturaleza. Sin embargo, el ácido nucleico aislado que codifica el C-C CKR-1 incluye el ácido nucleico del C-C CKR-1 en células que ordinariamente expresan el C-C CKR-1, en donde el ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales, o alternativamente está flanqueado por una secuencia de ADN diferente de la hallada en la naturaleza.

El ácido nucleico o polipéptido podría marcarse, para propósitos de diagnóstico y sondeo, usando una marca tal como se describe y define adicionalmente más abajo en la discusión de los ensayos de diagnóstico.

"Ácido nucleico del C-C CKR-1" se define como un ARN o ADN (a) que contiene al menos 25 bases de la secuencia genómica o de ADNc que codifica el C-C CKR-1, (b) o es complementario de la secuencia genómica o de ADNc que codifica el C-C CKR-1, (c) que se hibrida con tal ácido nucleico y permanece unido establemente a éste en condiciones rigurosas, o (d) codifica un polipéptido que comparte al menos el 60%, preferiblemente al menos el 70%, con la secuencia de aminoácidos del C-C CKR-1, y el polipéptido tiene la habilidad de unir al menos una quimiocina C-C. Preferiblemente, el ARN o ADN de hibridación contiene al menos 25 bases, más preferiblemente 40, y más preferiblemente 60 bases, las cuales son idénticas a las secuencias que codifican el C-C CKR-1 descritas más abajo. De forma óptima, el ácido nucleico del C-C CKR-1 consiste esencialmente sólo en la secuencia que codifica el
C-C CKR-1 o el complemento de tales secuencias.

Las condiciones de "rigurosidad" para la hibridación se definen como las condiciones de lavado después de la reacción de hibridación. Típicamente, las condiciones de hibridación se definen como el empleo de la incubación durante la noche a 24ºC, en una solución que comprende un 20% de formamida, 5\times SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5\times de solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y
20 \mug/ml de ADN cortado y desnaturalizado de esperma de salmón. Las condiciones de "rigurosidad elevada" para el lavado se definen típicamente como el empleo de 0,2\times SSC, 0,1% de SDS a 55ºC, mientras que las condiciones de "baja rigurosidad" para el lavado se definen típicamente como el empleo de 0,5\times SSC, 1% de SDS a 42ºC. Estas condiciones son bien conocidas en la técnica. Consultar, por ejemplo, Current Protocols un Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., Greene Publishing Associates, N.Y., 1989.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped determinado. Las secuencias de control que son apropiadas para los procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciado-
res.

Un ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder de secreción está operativamente unido al ADN de un polipéptido si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificantes si está posicionado de tal forma que facilita la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque ser contiguos. La unión se consigue mediante la ligación en los sitios de restricción apropiados. Si tales sitios no existen, entonces se usan adaptadores o eslabones de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Los plásmidos de partida usados para practicar esta invención están disponibles comercialmente, o están disponibles públicamente de forma no restringida, o pueden construirse a partir de tales plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, se conocen otros plásmidos equivalentes en la técnica y serán aparentes al especialista capacitado. Los procedimientos para la digestión con enzimas de restricción, la recuperación y aislamiento del ADN, el análisis de la hibridación, y la ligación son convencionales, y en este momento son bien conocidos por el especialista capacitado. De forma similar, las líneas celulares usadas para practicar esta invención están disponibles comercialmente o están disponibles públicamente de forma no restringida.

Otro procedimiento para obtener el gen de interés es sintetizarlo químicamente usando uno de los procedimientos descritos en Engels et al., (Angew, Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734 (1989)). Estos procedimientos incluyen los procedimientos del triéster, fosfito, fosforamidito, y H-fosfonato, procediéndose típicamente mediante síntesis de oligonucleótidos sobre soportes sólidos.

La "recuperación" o "aislamiento" de un determinado fragmento de ADN a partir del digerido de restricción significa la separación del digerido sobre gel de poliacrilamida o agarosa mediante electroforesis, la identificación del fragmento de interés mediante comparación de su movilidad respecto la de fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocidos, la retirada de la sección del gel que contiene el fragmento deseado, y l separación del gel del ADN. Este procedimiento se conoce generalmente. Por ejemplo, ver Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Los aminoácidos se denominan mediante sus abreviaturas de tres letras estándares de la IUPAC.

B. Procedimientos generales para practicar la invención 1. Preparación del ácido nucleico del C-C CKR-1 nativo

El uso del artículo determinado "el" en relación al C-C CKR-1 no se pretende que sugiera que sólo una secuencia de ADN codifica el C-C CKR-1. De hecho, se espera que los alelos, intermedios del procesamiento, y variantes de la secuencia predeterminadas descritas más abajo, varíen en su secuencia respecto del ADN que codifica el C-C CKR-1
nativo. Además, el C-C CKR-1 podría hallarse dentro de una subfamilia de receptores de quimiocinas que tienen un elevado grado de homología de secuencia pero que varían lo suficiente como para no constituir alelos. Todas estas secuencias se hallan dentro del ámbito del ácido nucleico del C-C CKR-1.

Las secuencia de ADN que codifican el C-C CKR-1 podrían ser genómicas o de ADNc. Cualquier biblioteca genómica representativa podría examinarse con las sondas descritas más abajo. Los procedimientos para la preparación de ADN genómico y la construcción de bibliotecas de ADNc son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., ver más arriba.

2. Variantes de la secuencia de aminoácidos del C-C CKR-1

Las variante de secuencia de aminoácidos del C-C CKR-1 se preparan introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del C-C CKR-1, o mediante la síntesis in vitro del polipéptido C-C CKR-1 deseado. Tales variantes incluyen, por ejemplo, las supresiones, o inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del C-C CKR-1 nativo. Puede hacerse cualquier combinación de supresión, inserción, y sustitución para llegar a una construcción final, a condición de que la construcción final posea las características deseadas.

Los cambios de aminoácidos podrían alterar el procesamiento post-traducción del C-C CKR-1, tal como cambiando el número o posición de los sitios de glicosilación, o alterando sus características de anclaje a la membrana.

Al diseñar variantes de la secuencia de aminoácidos del C-C CKR-1, la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la(s) característica(s) del C-C CKR-1 a modificar. Los sitios para la mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por ejemplo, (1) sustituyendo primer con las elecciones de aminoácido conservadores, y a continuación con selecciones más radicales dependiendo de los resultados conseguidos, (2) suprimiendo el residuo diana; o (3) insertando residuos, de la misma o diferente clase, adyacentes al sitio ubicado, o combinaciones de las opciones 1-3.

Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del polipéptido C-C CKR-1 que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis, se denomina "mutagénesis de barrido con alanina", tal como fue descrito por Cunningham y Well (Science, 244:1081-1085 (1989)). En éste, se identifica un residuo o grupo de residuos (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen con un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente, alanina o polialanina) para afectar la interacción del aminoácido con el entorno acuoso que lo envuelve dentro o fuera de la célula. Aquellos dominios que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación introduciendo variantes adicionales u otras en o para los sitios de sustitución. Por tanto, mientras que el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no tiene porque estar predeterminada. Por ejemplo, para optimizar las prestaciones de una mutación en un sitio determinado, podría realizarse la mutagénesis por barrido con alanina o aleatoria en el codón o región diana, y se examinan las variantes del C-C CKR-1 en busca de la combinación óptima con la actividad deseada.

Las variantes del C-C CKR-1 que exhiben al menos una actividad biológica de la secuencia progenitora, por ejemplo, la unión de quimiocina o la actividad antigénica. Preferiblemente, el C-C CKR-1 antigénicamente activo es un polipéptido que se une a un anticuerpo generado contra el polipéptido en su conformación nativa, "conformación nativa" indicando generalmente el polipéptido tal como se halla en la naturaleza, el cual no ha sido desnaturalizado por agentes caotrópicos, calor u otro tratamiento que modifique sustancialmente la estructura tridimensional del polipéptido (esto puede determinarse, por ejemplo, mediante la migración en geles de calibración por tamaño, no reductores, no desnaturalizantes). El anticuerpo usado en la determinación de la actividad antigénica es un anticuerpo policlonal de conejo generado formulando el polipéptido nativo que no es de conejo, en el adyuvante completo de Freund, inyectando subcutáneamente la formulación, e impulsando la respuesta inmune mediante inyección intraperitoneal de la formulación hasta que el título del anticuerpo anti-polipéptido se estabili-
za.

Las supresiones en la secuencia de aminoácidos generalmente oscilan entre aproximadamente 1 a 30 residuos, más preferiblemente entre 1 a 10 residuos, y típicamente son contiguas. Preferiblemente, las supresiones se hacen en regiones de la proteína que son las menos conservadas cuando la secuencia de aminoácido del C-C CKR-1 se compara con otros receptores de quimiocinas. Tales supresiones es más probable que modifiquen la actividad biológica de los polipéptidos de forma más significativas que las supresiones hechas en cualquier otra parte. El número de supresiones consecutivas se seleccionará con objeto de preservas la estructura terciaria del C-C CKR-1 en el dominio afectado, por ejemplo, la hoja plegada beta o la hélice alfa.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen las fusiones amino- y/o carboxi terminales que oscilan en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como las inserciones intrasecuencia de un único o múltiples residuos aminoácidos. Las inserciones intrasecuencia (es decir, las inserciones dentro de la secuencia del C-C CKR-1) podrían oscilar generalmente desde aproximadamente 1 hasta 10 residuos, más preferiblemente de 1 a 5, y los más preferiblemente de 1 a 3.

Las variantes por inserción del C-C CKR-1 o de sus segmentos extracelulares incluyen la fusión a los extremos N- o C-terminales del C-C CKR-1 de polipéptidos inmunogénicos, por ejemplo, polipéptidos bacterianos tales como la \beta-lactamasa o un enzima codificado por el locus trp de E. coli., o proteína de levadura, y fusiones C-terminales con proteínas que tienen un vida media larga, tales como los dominios V_{H} o V_{C} de inmunoglobulinas, los cuales comprenden las regiones constantes, la albúmina, o la ferritina (por ejemplo, tal como se ha descrito en WO 89/02.992, publicada el 6 de abril de 1989).

Otro grupo de variantes son las variantes por sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen suprimido al menos un residuo aminoácido en la molécula de C-C CKR-1, y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para las mutaciones por sustitución incluyen los sitios identificados como el(los) sitio(s) activo(s) del C-C CKR-1, y los sitios en donde los aminoácidos que se hallan en el C-C CKR-1 procedente de varias especies son sustancialmente diferentes en términos de volumen de la cadena lateral, carga, y/o hidrofobici-
dad.

Otros sitios de interés son aquéllos en los que determinados residuos del C-C CKR-1 están conservados cuando se comparan con otros receptores de quimiocinas. Estas posiciones podrían ser importantes para la actividad biológica del C-C CKR-1. Estos sitios, especialmente aquéllos que se hallan dentro de una secuencia de al menos otros tres sitios idénticamente conservados, se sustituyen de forma conservadora. Tales sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla I, bajo la cabecera "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ilustrativas" en la Tabla I, o tal como se describe adicionalmente más abajo, en referencia a las clases de aminoácidos, y se examinan los
productos.

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TABLA 1

Residuo original	Sustituciones ilustrativas	Sustituciones preferidas
Ala (A)	ser	ser
Arg (R)	lys; gln; asn; ala	lys
Asn (N)	gln; his; lys; arg; ala; asp	asp
Asp (D)	glu; asn; ala	asn
Cys (C)	ser; ala; val	ala
Gln (Q)	asp; glu; ala	asn; glu
Glu (E)	asp; gln; ala	gln
Gly (G)	ala; ans	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg; ala	asn

TABLA 1 (continuación)

Residuo original	Sustituciones ilustrativas	Sustituciones preferidas
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe	val
Leu (L)	ile; val; met; ala; phe	met
Lys (K)	arg; gln; asn; met; ala	arg
Met (M)	leu; phe; ile; ala	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	leu
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr; ala	ala
Thr (T)	ser; val; ala	ser
Trp (W)	tyr; phe; ala	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ala; gln	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; thr	ala

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Las modificaciones sustanciales en función de la identidad inmunológica del C-C CKR-1 se consiguen seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren de forma natural se dividen en grupos en base a sus propiedades comunes de la cadena lateral:

(1)

hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3)

ácidos: asp, glu;

(4)

básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5)

residuos que influyen sobre la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras comportarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otro. Tales residuos sustituidos podrían introducirse en regiones del C-C CKR-1 que son homólogas con otros receptores de quimiocinas, o, más preferiblemente, en regiones no homólogas de la molécula.

Cualquier residuo cisteína que no esté implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del C-C CKR-1 podría sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad frente a la oxidación de la molécula y prevenir el entrecruzamiento aberrante.

El ADN que codifica las variantes de la secuencia de aminoácidos del C-C CKR-1 se prepara mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento a partir de la fuente natural (en el caso de variantes de la secuencia de aminoácidos que ocurren de forma natural), o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), la mutagénesis mediante PCR, y la mutagénesis con casete de una variante preparada previamente o de una versión no variante del C-C CKR-1. Estas técnicas podrían utilizar el ácido nucleico (ADN o ARN) del C-C CKR-1, o un ácido nucleico complementario del ácido nucleico del C-C CKR-1. La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un procedimiento preferido para preparar las variantes por sustitución, supresión e inserción del ADN del C-C CKR-1. Esta técnica es bien conocida en la técnica (ver, por ejemplo, tal como describieron Adelman et al., DNA, 2:183 (1983). La mutagénesis mediante la PCR es apropiada también para construir variantes de aminoácidos del C-C CKR-1 (ver Erlich, más arriba, pp.
61-70). Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis con casete, se basa en la técnica descrita por Wells et al., (Gene, 34:315-323 (1985)).

3. Inserción de ADN en un vehículo de clonación

El ADNc o ADN genómico que codifica el C-C CKR-1 nativo o variante se inserta en un vector replicable para su ulterior clonación (amplificación del ADN) o para su replicación. Hay muchos vectores disponibles, y la selección del vector apropiado dependerá de (1) si deber usarse para la amplificación del ADN o para la expresión del ADN, (2) del tamaño del ADN a insertarse en el vector, y (3) de la célula huésped a transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación del ADN o expresión del ADN) y la célula huésped con la que es compatible. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

a. Componente secuencias de señal

En general, una secuencia de señal podría ser un componente del vector, o podría ser parte del ADN del C-C CKR-1
que se inserta en el vector.

b. Componente origen de replicación

Ambos, los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huéspedes seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una que permite que el vector se replique de forma independiente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación procedente del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es apropiado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, el componente origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamíferos (el origen del SV40 podría usarse típicamente sólo porque contiene un promotor temprano).

La mayoría de los vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicación en al menos una clase de organismo, pero pueden transfectarse a otro organismo para su expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. coli y a continuación el mismo vector se transfecta a levaduras o células de mamífero para su expresión, aun cuando no es capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El ADN podría amplificarse también mediante su inserción en el genoma del huésped. Esto se consigue fácilmente usando especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de ADN que es complementaria de una secuencia que se halla en el ADN genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector resulta en su recombinación homóloga con el genoma y en la inserción del ADN del C-C CKR-1. Sin embargo, la recuperación del ADN genómico que codifica el C-C CKR-1 es más compleja que la del vector replicado exógenamente, porque se requiere la digestión con enzimas de restricción para cortar el ADN del C-C CKR-1.

c. Componente gen de selección

Los vectores de expresión y clonación deberían contener un gen de selección, también denominado marcador que puede seleccionarse. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huéspedes transformadas y cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huéspedes no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia frente a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de D-alanina para Bacilli.

Un ejemplo de esquema de selección utiliza una droga para detener el crecimiento en una célula huésped. Esas células que son sucesivamente transformadas con un gen heterólogo expresan una proteína que confiere resistencia frente a la droga y por tanto sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante usan las drogas neomicina (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1:327-341 (1982)), el ácido micofenólico (Mulligan et al., Science, 209:1422-1427 (1980)), o la higromicina (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)). Los tres ejemplos citados más arriba emplean genes bacterianos bajo control eucariota para conferir respectivamente resistencia frente a la droga apropiada G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina.

Otro ejemplo de marcadores que pueden seleccionarse apropiados para las células de mamífero son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para capturar el ácido nucleico del C-C CKR-1, tales como la reductasa de dihidrofolato (DHFR) o la quinasa de timidina. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión de selección que sólo los transformantes están únicamente adaptados para sobrevivir gracias a haber captado el marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes en condiciones en las que la concentración de agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificación de ambos, el gen de selección y el ADN que codifica el C-C CKR-1. La amplificación es el proceso mediante el cual los genes con mayor demanda de producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. A partir del ADN amplificado se sintetizan cantidades crecientes de C-C CKR-1.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de la DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de la DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea la DHFR del tipo salvaje es la línea celular del ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como describieron Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)). Las células transformadas se exponen a continuación a niveles crecientes de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen de la DHFR, y, de forma concomitante, a múltiples copias de otro ADN que comprende los vectores de expresión, tales como el ADN que codifica el C-C CKR-1.
Esta técnica de amplificación puede usarse con cualquier otro huésped apropiado, por ejemplo, el ATCC nº CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia de la DHFR endógena, si, por ejemplo, se emplea un gen de la DHFR mutante que es altamente resistente al Mtx (EP-117.060). Alternativamente, las células huéspedes (particularmente los huéspedes del tipo salvaje que contienen la DHFR endógena) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el C-C CKR-1, la proteína DHFR del tipo salvaje, y otro marcador que puede seleccionarse, tal como la aminoglicósido-3'-fosfotransferasa (APH), pueden seleccionarse mediante cultivo celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador que puede seleccionarse, tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, la kanamicina, neomicina o G418.

Un gen de selección apropiado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39-43 (1979)); Kingsman et al., Gene, 7:141-152 (1979)); o Tschemper et al., Gene, 10:157-166 (1980)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, la ATCC nº 44.076. La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC nº 20.622 ó 38.626) son complementada por plásmidos conocidos portadores del gen Leu2.

e. Componente promotor

Los vectores de expresión usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operativamente unido al ácido nucleico del C-C CKR-1. Los promotores son secuencias no traducidas ubicadas cadena arriba (5') respecto el codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 p.b.) que controla la transcripción y traducción de una secuencia de ácido nucleico determinada, tal como la del C-C CKR-1, a la cual están operativamente unidos. Tales promotores típicamente se agrupan en dos clases, inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles incrementados de transcripción, a partir del ADN bajo su control, en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo; por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En este momento, son bien conocidos un número elevado de promotores reconocidos por una variedad de células huéspedes potenciales. Estos promotores están operativamente unidos al ADN que codifica el C-C CKR-1 mediante la supresión del promotor del ADN fuente, usando la digestión con enzimas de restricción, e insertando la secuencia del promotor aislado en el vector. Ambas, la secuencia promotora del C-C CKR-1 nativo y muchos promotores heterólogos, podrían usarse para dirigir la amplificación y/o expresión del ADN del C-C CKR-1. Sin embargo, se prefieren los promotores heterólogos, puesto que generalmente permiten una mayor expresión y rendimientos más elevados de C-C CKR-1 expresado en comparación con el promotor nativo del C-C CKR-1.

Los promotores apropiados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de la
\beta-lactamasas y de la lactosa (Chang et al., Nature, 275:617-624 (1978)); y Goeddel et al., Nature, 281:544-548 (1979)), el de la fosfatasa alcalina, y sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8(18):4057-4074 (1980), y EP-36,776), y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25, (1983)). Sin embargo, son apropiados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo de ese modo que un trabajador capacitado las una operativamente al ADN que codifica el C-C CKR-1 (Siebenlist, et al., Cell, 20:269-281 (1980)) usando eslabones o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para uso en sistemas bacterianos generalmente contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica el C-C CKR-1.

Las secuencias promotoras apropiadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255(24):12073-12080 (1980)) u otros enzimas glicolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149-167 (1968)); y Holland, Biochemistry, 17:4900-4907 (1978)), tales como la enolasa, la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la isomerasa de la glucosa-6-fosfato, la mutasa del 3-fosfoglicerato, la quinasa del piruvato, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa, y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, los cuales son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras de las deshidrogenasa 2 del alcohol, del isocitocromo C, de la fosfatasa ácida, de los enzimas asociados con el metabolismo del nitrógeno, de la metalotioneína, de la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, y de los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman et al., EP-73.657A. Los potenciadores de levadura también se usan ventajosamente con los promotores de levadura.

Las secuencias de promotores son conocidas para los eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases cadena arriba respecto del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada de 70 a 80 bases cadena arriba respecto del inicio de la transcripción de muchos genes es la región CXCAAT, en donde X podría ser cualquier nucleótido. En el extremo 30 de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que podría ser la señal para la adición de la cola poli-A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan convenientemente en los vectores de expresión en
mamíferos.

La transcripción del C-C CKR-1 a partir de vectores en células de mamífero está controlada por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B, y más preferiblemente el Virus 40 de los Simios (SV40), a partir de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, y a partir del promotor asociado normalmente con la secuencia del C-C CKR-1, a condición que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restricción del SV40 que contiene también el origen de replicación viral del SV40 (Fiers et al., Nature, 273:113-120 (1978); Mulligan y Berg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E (Greenaway et al., Gene, 18:355-360 (1982)). En US-4.419.446 se descubre un sistema para expresar ADN en huéspedes de mamífero usando el virus del papiloma bovino como vector. Una modificación de este sistema se describe en US-4.601.978. Ver también, Gray et al., Nature, 295:503-508 (1982), sobre la expresión de ADNc, que codifica el interferón inmune, en células de mono; Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982), sobre la expresión del cADN del interferón \beta humano en células de ratón bajo el control del promotor de la quinasa de timidina del virus herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 (1982), sobre la expresión del gen del interferón \beta1 humano en células cultivadas de ratón y conejo; y Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982), sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células renales de mono CV-1, en fibroblastos embrionarios de pollo, en células ováricas de hámster chino, en células HeLa, en células NIH-3T3 de ratón, usando como promotor la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.

f. Componente elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica el C-C CKR-1 de esta invención por parte de eucariotas superiores se incrementa a menudo mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos del ADN que actúan en cis, usualmente de aproximadamente 10-300 p.b., que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los potenciadores son relativamente independiente de su posición y orientación, habiéndose hallado 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:464-468 (1981)) y 3' (Lusky et al., Mol. Cell. Biol., 3(6):1108-1122 (1983)) respecto la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al., Cell,
33:729-740 (1983)) así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne et al., Mol. Cell. Biol., 4(7):
1293-1305 (1984)). Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente se usará un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador podría ayustarse dentro del vector, en una posición 5' ó 3' respecto el ADN del C-C CKR-1, pero preferiblemente se ubica en un sitio 5' respecto del
promotor.

g. Componente terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huéspedes eucariotas (de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción, y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están disponibles comúnmente en el extremo 5' y, ocasionalmente, en las regiones 3' no traducidas de ADN virales o ADNc. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el C-C CKR-1. Las regiones 3' no traducidas incluyen también sitios de terminación de la transcripción.

Los vectores apropiados que contienen uno o más de los componentes listados más arriba, y las secuencias codificante y de control deseadas, se construyen mediante técnicas de ligación estándares. Los plásmidos aislados o fragmentos del ADN se cortan, adaptan y religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

En el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, se usan las mezclas de ligación para transformar E. coli K12 de la cepa 294 (ATCC 31.446) y los transformantes exitosos se seleccionan mediante resistencia a la ampicilina o tetraciclina según convenga. Los plásmidos procedentes de los transformantes se preparan, se analizan mediante digestión con endonucleasa de restricción, y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res., 9(2):309-321 (1981)), o mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499-560 (1980)).

Los vectores de expresión que proporcionan las expresión transitoria en células de mamífero del ADN que codifica el C-C CKR-1 son particularmente útiles en la práctica de esta invención. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de tal forma que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión, y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión apropiado y una célula huésped, permiten la identificación positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADN clonados, así como el examen rápido de tales polipéptidos con propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. Por tanto, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles en la invención para los propósitos de identificar análogos y variantes del C-C CKR-1 que tienen actividad similar a la del C-C CKR-1, y para el análisis del efecto de la unión de variantes de quimiocinas al C-C CKR-1.

Otros procedimientos, vectores y células huéspedes apropiadas para su adaptación a la síntesis del C-C CKR-1 en cultivo de células de vertebrado recombinantes se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)); Mantel et al., Nature, 281:40-46 (1979)); EP-117.060; y EP-117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión del C-C CKR-1 en cultivo de células de mamífero es el pRK5 (EP, nº de publicación 307.247) o el pSVI6B (EE.UU., solicitud con nº de serie 07/441.574, registrada el 22 de noviembre de 1989).

4. Selección y transformación de las células huésped

Las células huéspedes apropiadas para la clonación o expresión de los vectores de expresión del C-C CKR-1 son las células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores descritas más arriba. Las procariotas apropiadas incluyen las eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos y Gram-positivos, por ejemplo, E. coli, Bacilli tales como B. subtilis, especies de Pseudomonas tales como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, o Serratias marcescens. Un huésped de clonación E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.5446), aunque otras cepas como E. coli B, E. coli \chi1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son apropiadas. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. Preferiblemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Alternativamente, son apropiados los procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo la PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.

Además de las procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes apropiados para vectores que contienen el ADN del C-C CKR-1. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadería, es el más comúnmente usado de entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, un cierto número de otros géneros, especies, y cepas están comúnmente disponibles y son útiles para la práctica de la invención, tales como S. pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140-143 (1981)), Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 (1983)), Pichia pastoris (EP-183.070), Trichoderma reesia (EP-244.234), Neurospora crassa (Case et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)), y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26:205-221 (1983)); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)), y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:
475-479 (1985)).

Las células huéspedes apropiadas para la expresión del polipéptido del C-C CKR-1 glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Tales células huéspedes son capaces de un procesamiento complejo y de actividades de glicosilación. En principio, es útil cualquier cultivo de células eucariotas superiores, sea un cultivo procedente de vertebrados o de invertebrados. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células huéspedes de insecto permisivas a partir de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Ver, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller et al., en Genetic Engineering, J.K. Setlow et al., 8:277-279 (Plenum Publishing, 1986), y Maeda et al., Nature, 315:592-594 (1985)). Una diversidad de tales cepas virales están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 del NPV de Autographa californica, y la cepa Bm-5 del NPV de Bombyx mori, y tales virus podrían usarse como el virus acorde con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden utilizarse como huéspedes. Típicamente, las células vegetales se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, al cual se ha manipulado previamente para contener el ADN del C-C CKR-1. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el ADN que codifica el C-C CKR-1 es transferido a la célula huésped vegetal de fal forma que ésta es transfectada y, en condiciones apropiadas, expresa el ADN del C-C CKR-1. Además, hay disponibles secuencias de señal y reguladoras compatibles con las células vegetales, tales como las secuencias del promotor de la sintasa de nopalina y de la señal de poliadenilación. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561-573 (1982). Además, los segmentos de ADN aislados de la región cadena arriba del gen 780 del T-ADN son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes que pueden expresarse en plantas en tejido vegetal que contenga ADN recombinante. Ver la EP-321.196, publicada el 21 de junio de 1989.

Sin embargo, el interés en las células de vertebrados ha sido máximo, y la propagación de las células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) ha devenido un procedimiento rutinario en los últimos años (Tissue Culture, Academic Press, Eds. Kruse y Patterson, 1973). Los ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por el SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea renal embrionaria humana (293 o células 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-72 (1977)); las células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)); las células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); las células renales de mono (CV1, ATCC CCL 70); las células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); las células de carcinoma cervical humanas (HeLa, ATCC CCL 2); las células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); las células hepáticas de la rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); las células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); las células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); las células MRC 5; las células FS4; y una línea celular humana de hepatoma (Hep G2). Las células huéspedes preferidas son las células 293 renal embrionaria humana y las ováricas de hámster chino.

El huésped escogido para la expresión podría ser también un organismo multicelular, tal como en un animal transgénico. Tales animales se han producido mediante la transfección de células madre, células somáticas, o embriones con ADN heterólogo, implantando apropiadamente las células transfectadas y dejando que las células maduren dentro, o se integren establemente dentro de animales adultos que contienen el ADN heterólogo. Un porcentaje reproducible de tales animales transcriben y expresan el ADN heterólogo como una proteína que puede identificarse en los tejidos, incluyendo la sangre y suero. Los procedimientos apropiados para crear animales transgénicos se describen en la patente estadounidense 4.396.601 y en Palmiter et al., Nature, 300:611-615 (1982).

Las células huéspedes se transfectan y son preferiblemente transformadas con los vectores de expresión o clonación de esta patente descritos más arriba, y se cultivan en medio nutritivo convencional, modificado según sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la captación de un vector de expresión por parte de una célula huésped, se expresen o no de hecho alguna secuencia codificante. Numerosos procedimientos de transfección son conocidos por el técnico ordinariamente capacitado, por ejemplo, el CaPO_{4} y la electroporación. La transfección exitosa generalmente se reconoce cuando ocurre cualquier indicación de la operación de este vector dentro de la célula huésped.

La transformación significa introducir ADN dentro de un organismo de forma que el ADN es replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándares apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio empleando cloruro cálcico, tal como se describe en la Sección 1.82 de Sambrook et al., se usa generalmente con procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales en forma de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, tal como describieron Shaw et al., Gene, 23:315-330 (1983) y WO-89/05.859, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin tales paredes celulares, se prefiere el procedimiento de la precipitación con fosfato cálcico descrito en las Secciones 16.30-16.37 de Sambrook et al., ver más arriba. Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huéspedes de mamífero han sido descritos por Axel en US-4.399.216, concedida el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras se realizan típicamente de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bacteriol., 130(2):946-947 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76(8):3829-3833 (1979). Sin embargo, también podrían usarse otros procedimientos para introducir ADN dentro de células, tales como la inyección nuclear, la electroporación, o la fusión de protoplastos.

5. Cultivando las células huéspedes

Las células procariotas usadas para producir el polipéptido del C-C CKR-1 de esta invención se cultivaron en medio apropiado tal como se describe de forma general en Sambrook et al., ver más arriba.

Las células de mamífero usadas para producir el C-C CKR-1 de esta invención podrían cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como el F10 de Ham (Sigma), el Medio Esencial Mínimo (MEM, Sigma), el RPMI-1640 (Sigma), y el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son apropiados para cultivar las células huéspedes. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y McKeehan, Meth. Enz., 58:44-93 (1979); Barnes y Sato, Anal. Biochem., 102:255-270 (1980); patentes US-4.767.704, US-4.657.866,
US-4.927.762; o US-4.560.655; WO-90/03430; WO-87/00195; solicitud de patente estadounidense nº 30.985; o patente US-5.122.469, podría usarse como medio de cultivo para las células huéspedes. Cualquiera de estos medios podría suplementarse según fuera necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como la insulina, transferrina, o factor del crecimiento epidérmico), sales (tales como el cloruro sódico, cálcico, magnésico y fosfatos), tampones (tales como el HEPES), nucleósidos (tales como la adenosina y la timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamicina™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquier otros suplementos necesarios podrían incluirse también en las concentraciones apropiadas que serán conocidas por los especialistas en la técnica. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH, y similares, son aquéllas previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes al especialista ordinariamente capacitado.

Las células huéspedes preferidas en este descubrimiento abarcan las células en cultivo in vitro, así como las células que se hallan dentro de un animal huésped.

6. Detectando la amplificación/expresión del gen

La amplificación y/o expresión del gen podrían mediarse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980), transferencia en punto (análisis del ADN), o hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente. Podrían emplearse varias sondas, más comúnmente radioisótopos, particularmente el ^{32}P. Sin embargo, también podrían emplearse otras técnicas, tales como los nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. A continuación, la biotina sirve como sitio para la unión de avidina o anticuerpos, los cuales podrían marcarse con una amplia variedad de marcas, tales como radionúcleos, compuestos fluorescentes, enzimas, o similares.

Alternativamente, podrían emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplexes específicos, incluyendo los dúplexes de ADN, dúplexes de ARN, y dúplexes híbridos de ADN-ARN o dúplexes de ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos podrían marcarse, y podría llevarse a cabo el ensayo en el que el dúplex está unido a una superficie, de forma que, a partir de la formación del dúplex sobre la superficie, puede detectarse la presencia

\hbox{de anticuerpo unido al
dúplex.}

Alternativamente, la expresión del gen podría medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo del cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. En las técnicas de tinción inmunohistoquímicas, se prepara una muestra de células, típicamente mediante deshidratación y fijación, seguida por reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto del gen acoplado, en donde las marcas son usualmente detectables visualmente, tales como marcas enzimáticas, marcas fluorescentes, marcas luminiscentes, y similares. Una técnica de tinción particularmente sensible y apropiada para su uso en la presente invención es la descrita

\hbox{por Hu  et al., Am. J. Clin. Path .,
75:734-738 (1980).}

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o para el ensayo de muestras de fluidos podría ser monoclonal o policlonal, y podría prepararse en cualquier mamífero. De forma conveniente, los anticuerpos podrían prepararse contra un polipéptido de C-C CKR-1 nativo o sintético, o contra variantes del mismo.

7. Purificación del polipéptido del C-C CKR-1

El C-C CKR-1 se recupera a partir de los cultivos de células mediante solubilización de la membrana celular con detergente.

Cuando un C-C CKR-1 humano se expresa en una célula recombinante distinta de una de origen humano, el C-C CKR-1 está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar el C-C CKR-1 a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas en proteína como C-C CKR-1. Como un primer paso, las células se centrifugan para separarla del medio de cultivo, seguida por procedimientos de purificación apropiados, tales como: fraccionamiento sobre columnas de inmunoafinidad o intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tales como la DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

Las variantes del C-C CKR-1 en las que se han suprimido, insertado o sustituido residuos, se recuperan de la misma forma que el C-C CKR-1 nativo, tomando en consideración cualesquier cambios sustanciales en las propiedades causados por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión del C-C CKR-1 con otra proteína o polipéptido; por ejemplo, una antígeno bacteriano o viral, facilita la purificación; puede usarse una columna de inmunoafinidad que contenga anticuerpo contra el antígeno para adsorber la fusión. Las columnas de inmunoafinidad, tales como la columna de anti-C-C CRK-1 policlonal de conejo, pueden emplearse para adsorber la variante del C-C CKR-1 uniéndola al menos a un epítopo inmune restante. También podría emplearse un inhibidor de proteasa, tal como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y podrían incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. Alguien especialista en la técnica se percatará de que los procedimientos de purificación apropiados para el C-C CKR-1 nativo podrían requerir modificaciones para tomar en consideración los cambios en el carácter del C-C CKR-1 o de sus variantes a partir de su expresión en cultivos de células recombinantes.

8. Modificaciones covalentes de los polipéptidos del C-C CKR-1

Las modificaciones covalentes del polipéptido del C-C CKR-1 o sus sustituyentes glucosilo se incluyen dentro del ámbito de esta invención. Tanto el C-C CKR-1 nativo como las variantes de la secuencia de aminoácidos del C-C CKR-1 podrían modificarse covalentemente. Las modificaciones covalentes del C-C CKR-1, de los fragmentos del mismo, o de los anticuerpos contra el mismo, se introducen en la molécula haciendo reaccionar los residuos aminoácidos apuntados del C-C CKR-1, de los fragmentos del mismo, o del anticuerpo contra el C-C CKR-1, con un agente derivatizador orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales. Más comúnmente, el C-C CKR-1 y sus anticuerpos se unen covalentemente a grupos detectables usados en el diagnóstico, por ejemplo, enzimas, radioisótopos, marcadores de espín, antígenos, grupos fluorescentes o quimioluminiscentes, y similares.

Los residuos cisteinilo, más habitualmente se hacen reaccionar con \alpha-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, para rendir derivados carboximetilos o carboxamidometilos. Los residuos cisteinilo se derivatizan también mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta-(5-imidazol)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil-disulfuro, metil-2-piridil-disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola.

Los residuos histidilo se derivatizan mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral del histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo es también útil; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinilo y amino terminal se hacen reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinilo. Otros reactivos apropiados para derivatizar residuos que contienen \alpha-amino incluyen los imidoésteres tales como el metil picolinimidato; el piridoxal fosfato; el piridoxal; el cloroborohidruro; el ácido trinitrobencensulfónico; la O-metilisourea; la 2, 4-pentanodiona; y la reacción con glioxilato catalizada por la transaminasa.

Los residuos arginilo se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos, el fenilglioxal, la 2,3-butanodiona, la 1,2-ciclohexanodiona, y la ninhidrina. La derivatización de residuos arginilo requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al elevado pK_{a} del grupo funcional de la guanidina. Además, estos reactivos podrían reaccionar con los grupos de la lisina así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de los residuos tirosilo podría hacerse, con especial interés en la introducción de marcas espectrales dentro de los residuos tirosilo, mediante reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, se usan la N-acetilimidazola y el tetranitrometano para formar respectivamente especies O-acetil-tirosilo y derivados 3-nitro. Los residuos tirosilo se yodan usando ^{125}I o ^{131}I para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayos, siendo apropiado el procedimiento de la cloramina T descrito más
arriba.

Los grupos carboxilos laterales (aspartilo y glutamilo) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), en donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como la 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o la 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilfenil)carbodiimida. Además, los residuos aspartilo y glutamilo se convierten en residuos asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para el entrecruzamiento del C-C CKR-1, de sus fragmentos, o de sus anticuerpos, a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en procedimientos para purificar los anticuerpos anti-C-C CKR-1, y viceversa. Los agentes entrecruzadores comúnmente usados incluyen, por ejemplo, el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehído, los ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplos, los ésteres con ácido 4-azidosalicílico, los imidoésteres homobifuncionales, incluyendo los disuccinimidilésteres tales como el
3-3'-ditiobis-(succinimidilpropionato), y las maleimidas bifuncionales tales como la bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizante tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato rinden intermedios fotoactivables que son capaces de formar enlaces cruzados en presencia de luz. Alternativamente, para la inmovilización de proteínas, se emplean matrices insolubles en agua, tales como los carbohidratos activados con cianuro bromuro, y los sustratos reactivos descritos en US-3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440.

Los residuos glutaminilo y asparaginilo frecuentemente se desamidan respectivamente a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones suavemente ácidas. Cualquier forma de estos residuos se halla dentro del ámbito de esta invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo y treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Mollecular Properties, Eds. W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86, 1983), la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido del C-C CKR-1 incluida dentro del ámbito de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Por alteración se quiere significar suprimir uno o más grupos carbohidratos hallados en el polipéptido nativo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido nativo.

La glicosilación de polipéptidos está típicamente unida a N o a O. Unida a N se refiere a la unión del grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Así pues, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, más comúnmente, serina o treonina, aunque también podrían usarse la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido del C-C CKR-1 se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal forma que contenga una o más de las secuencias de tripéptido descritas más arriba (para los sitios de glicosilación unidos a N). La alteración podría hacerse también mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos serina o treonina en la secuencia del C-C CKR-1 nativo (para sitios de glicosilación unidos a O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos del C-C CKR-1 se altera preferiblemente a través de cambios a nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido del C-C CKR-1 en bases preseleccionadas de tal forma que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. Las mutaciones del ADN podrían realizarse usando procedimientos descritos más arriba bajo la cabecera de "Variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido del C-C CKR-1".

Otros medios para incrementar el número de grupos carbohidrato sobre el polipéptido del C-C CKR-1 es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren la producción del polipéptido en una célula huésped que tiene capacidades de glicosilación para la glicosilación unidad a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el(los) azúcar(es) podría(n) unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en WO-87/05.330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston (CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)).

La supresión de grupos carbohidratos presentes en el polipéptido del C-C CKR-1 podría conseguirse química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la eliminación de la mayoría de los azúcares, excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el polipéptido intacto. La desglicosilación química está descrita por Hakimuddin, et al. (Arch. Biochem. Biophys., 259:52-57 (1987)) y por Edge et al. (Anal. Biochem., 118:131-118 (1981)). La eliminación enzimática de grupos carbohidratos sobre polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una variedad de endo- y exoglicosidasas, tal como describieron Thotakura et al. (Meth. Enzymol., 138:350-359 (1987)).

La glicosilación en sitios de glicosilación potenciales podría impedirse mediante el uso del compuesto tunicamicina tal como describieron Duskin et al., (J. Biol. Chem., 257:3105-3109 (1982)). La tunicamicina bloquea la formación de los enlaces proteína-N-glicósido.

El C-C CKR-1 también podría atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, respectivamente microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato)), en sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en microemulsiones. Tales técnicas se descubren en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Ed. A. Osol, (1980).

Las preparaciones de C-C CKR-1 son útiles también para generar anticuerpos, para su uso como estándares en ensayos del C-C CKR-1 (por ejemplo, marcando el C-C CKR-1 para su uso como un estándar en un radioinmunoensayo, en un inmunoensayo unido a enzima, o un ensayo con radiorreceptor), en técnicas de purificación por afinidad, y en ensayos de unión al receptor del tipo competitivos cuando está marcado con yodo radiactivo, enzimas, fluoróforos, marcadores de espín, y similares.

Puesto que a menudo es difícil predecir con antelación las características de una variante del C-C CKR-1, se apreciará que será necesario cierto examen de la variante recuperada para seleccionar la variante óptima. Por ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico de la molécula del C-C CKR-1, tal como la afinidad por un determinado anticuerpo, se mide mediante un inmunoensayo del tipo competitivo. La variante se ensaya en busca de cambios en la supresión o potenciación de su actividad en comparación con la actividad observada para el C-C CKR-1 nativo en el mismo ensayo. Otras modificaciones potenciales de la proteína o del polipéptido, tales como el redox o la estabilidad térmica, la hidrofobicidad, la susceptibilidad a la degradación proteolítica, o la tendencia a agregarse con portadores o en multímeros, se ensayan mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.

9. Composiciones terapéuticas y administración del C-C CKR-1

Las formulaciones terapéuticas del C-C CKR-1 (incluyendo sus fragmentos unidores del C-C CKR-1) o de los anticuerpos contra el mismo se preparan para el almacenamiento mezclando el C-C CKR-1, que tiene el grado de pureza deseado, con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, ver más arriba), en forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina del suero, la gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares alcohol tales como el manitol y sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como el Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).

El C-C CKR-1 o anticuerpo a usarse para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estéril, antes o después de la liofilización y reconstitución. El C-C CKR-1 ordinariamente se almacenará en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas del C-C CKR-1 o anticuerpo se colocan generalmente en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que se puede perforar por medio de una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración del C-C CKR-1 o anticuerpo está de acuerdo con los procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión mediante rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, o intralesional, o mediante sistemas de liberación continua tal como se ha destacado más arriba.

Los ejemplos apropiados de composiciones de liberación continua incluyen las matrices de polímero semipermeable en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación continua incluyen los poliláctidos (US-3. 773.919, EP-58.481), los copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), el poli(2-hidroxietilmetacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981), y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), el etilenvinil acetato (Langer et al., ver más arriba) o el poli-D-(-)-3-hidroxibutirato (EP-133.988). Las composiciones de liberación continua de C-C CKR-1 o anticuerpo incluyen también el C-C CKR-1 o anticuerpo atrapados liposomalmente. Los liposomas que contienen C-C CKR-1 o anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos per se: DE-3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP-52.322; EP-36.676; EP-88.046; EP-143.949; EP-142.641; la solicitud de patente japonesa 83-118.008; US-4.485.045 y 4.544.545; y
EP-102.324. Ordinariamente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 angstroms), en los cuales el contenido de lípido es superior a aproximadamente el 30% molar en colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima con el C-C CKR-1 o anticuerpo.

Una cantidad terapéutica de C-C CKR-1 o su anticuerpo a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y de la condición del paciente. Por ejemplo, se espera que el C-C CKR-1 sea terapéuticamente efectivo en el tratamiento de la inflamación mediada por citoquina. En consecuencia, será necesario para el terapeuta valorar la dosis y modificar la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el clínico administrará el C-C CKR-1 o su anticuerpo hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales.

10. Preparación de anticuerpo contra el C-C CKR-1

Los anticuerpos policlonales contra el C-C CKR-1 generalmente se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de C-C CKR-1 y un adyuvante. La inmunización con células recombinantes transformadas con el C-C CKR-1 (por ejemplo, células de ratón o CHO transformadas con el C-C CKR-1 humano) podría ser satisfactoria, o podría ser útil separar el C-C CKR-1 y conjugarlo, o un fragmento conteniendo la secuencia aminoácido diana, con una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa con forma de ojo de cerradura, la albúmina del suero, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de la tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, el éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos cisteína), la N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina), el glutaraldehído, el anhídrido succínico, el SOCl_{2}, o el R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1} son grupos alquilo dife-
rentes.

Los animales ordinariamente se inmunizan contra las célula, o conjugados inmunogénicos, o derivados, combinando 1 mg o 1 \mug de C-C CKR-1 en adyuvante completo de Freund, e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tardes, se estimulan los animales con de 1/5 a 1/10 de la cantidad original del conjugado en el adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días más tarde, se sangran los animales y se ensaya el suero para determinar el título de anti-C-C CKR-1. Los animales se estimulan hasta que el título se estabiliza. Preferiblemente, el animal se estimula con el conjugado del mismo C-C CKR-1, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través un agente entrecruzador diferente. Los conjugando pueden prepararse también en cultivo de células recombinantes como proteínas de fusión. También se usan agentes agregantes, tales como el alum, para potenciar la respuesta inmune.

Otra opción es emplear biblioteca combinatorias de dominio variable y métodos de examen para identificar los anticuerpos anti-C-C CKR-1 deseados.

Los anticuerpos monoclonales se preparan recuperando células de bazo a partir de animales inmunizados, e inmortalizando las células de la forma convencional, por ejemplo, mediante fusión con células de mieloma o mediante transformación con el virus de Epstein-Barr (EB), y examinando en busca de clones que expresan el anticuerpo deseado.

El anticuerpo monoclonal preferiblemente es específico para cada polipéptido diana del C-C CKR-1. El anticuerpo se selecciona para que sea agonista, antagonista, o para que no tenga efecto alguno sobre la actividad o sobre la unión del C-C CKR-1.

11. Usos del ácido nucleico del C-C CKR-1, y de los anticuerpos

El ácido nucleico que codifica el C-C CKR-1 podría usarse como un diagnóstico para la tipificación específica del tejido. Por ejemplo, podrían usarse procedimientos tales como la hibridación in situ, y la transferencia Northern y Southern, y el análisis mediante la PCR, para determinar si el ADN y/o ARN que codifican el C-C CKR-1 están presentes en los tipos de células que se están evaluando.

El polipéptido del C-C CKR-1 aislado podría usarse en ensayos diagnósticos cuantitativos como un estándar o control respecto al que podrían compararse las muestras, por ejemplo, procedentes de eritrocitos, que contienen cantidades desconocidas de C-C CKR-1. Las células recombinantes que expresan el C-C CKR-1 pueden usarse en ensayos para ligandos del C-C CKR-1 de la misma forma que, por ejemplo, se usan los neutrófilos en los ensayos de la IL-8. Los polipéptidos del C-C CKR-1, los fragmentos o células (como tales, o derivatizadas) también pueden usarse como inmunogenes en la producción de anticuerpos contra el C-C CKR-1, o para la purificación de tales anticuerpos a partir de ascites o medio de cultivo de células recombinantes.

Los anticuerpos contra el C-C CKR-1 son útiles en los ensayos diagnósticos de la expresión del C-C CKR-1 en células o tejidos específicos, en donde los anticuerpos se marcan de la misma forma descrita más arriba para el C-C CKR-1, y/o se inmovilizan sobre una matriz insoluble. Los anticuerpos contra el C-C CKR-1 son útiles también para la purificación mediante afinidad del C-C CKR-1 a partir de cultivo de células recombinantes o de fuentes naturales. Los anticuerpos contra el C-C CKR-1 que no reaccionan detectablemente de forma cruzada con otros receptores de quimiocinas pueden usarse para purificar cada C-C CKR-1 libre de otros receptores de quimiocinas homólogos. Los anticuerpos contra el C-C CKR-1 son antagonistas de la superfamilia PF4 son útiles como agentes antiinflamatorios o en el tratamiento de otros trastornos mediados por la superfamilia PF4.

Los ensayos diagnósticos apropiados para el C-C CKR-1 y su anticuerpos son bien conocidos per se. Tales ensayos incluyen los ensayos competitivos y en sándwich, y los ensayos de inhibición estérica. Los procedimientos competitivos y en sándwich emplean un paso de separación de fase como una parte integral del procedimiento, mientras que los ensayos de inhibición estérica se realizan en una única mezcla de reacción. Fundamentalmente, se usa el mismo procedimiento para el ensayo del C-C CKR-1 y de sustancias que unen el C-C CKR-1, aunque se favorecerán ciertos procedimientos dependiendo del peso molecular de la sustancia que se esté ensayando. Por tanto, la sustancia a ensayarse se denomina como analito, con independencia de su estado, sea un antígeno o un anticuerpo, y las proteínas que unen el analito se denominan parejas de unión, sean anticuerpos, receptores de superficie celular, o antígenos.

Los procedimientos analíticos para el C-C CKR-1 o sus anticuerpos usan todos uno o más de los siguientes reactivos: análogo del analito marcado, análogo del analito inmovilizado, pareja de unión marcada, pareja de unión inmovilizada, y conjugados estéricos. Los reactivos marcados también se denominan "trazadores".

La marca usada (y esto es útil también para marcar el ácido nucleico del C-C CKR-1 para su uso como sonda) es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión del analito a su pareja de unión. Se conocen numerosas marcas para uso en inmunoensayos, incluyendo los ejemplos grupos que podrían detectarse directamente, tales como fluorocromos, agentes quimioluminiscentes, y marcas radiactivas, así como porciones, tales como enzimas, que deben reaccionar o derivatizarse para ser detectados. Los ejemplos de tales marcas incluyen los radioisótopos ^{32}P, ^{14}C, ^{125}I, ^{3}H, y ^{131}I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras, o la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, la luciferasa de la luciérnaga y la luciferasa bacteriana (patente estadounidense nº 4.737.456), la luciferina, las 2,3-dihidroftalazinedionas; la peroxidasa de rábano silvestre, la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa, la glucoamilasa, el lisozima, las oxidasas de sacáridos, por ejemplo, la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa, y la deshidrogenasa de la glucosa-6-fosfato, las oxidasas heterocíclicas, tales como la uricasa y la xantina oxidasa, acopladas con un enzima que emplea el peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante tal como la HRP, la lactoperoxidasa, o la microperoxidasa, la biotina/avidina, las marcas de espín, las marcas de bacteriófago, los radicales libres estables, y similares.

Hay procedimientos convencionales disponibles para unir estar marcas covalentemente a proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, podrían usarse agentes de acoplamiento tales como los dialdehídos, la carbodiimidas, la dimaleimidas, los bis-imidatos, la bencidina bis-diazotizada, y similares, para marcar los anticuerpos con los marcas fluorescentes, quimioluminiscentes, y enzimáticas descritas más arriba. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 3.940.475 (fluorimetría) y 3.645.090 (enzimas); Hunter et al., Nature, 144:495-496 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods, 40:219-230 (1981); y Nygren, J., Histochem. Cytochem., 30: 407-412 (1982). Las marcas preferidas en ésta son los enzimas como la peroxidasa de rábano silvestre y la fosfatasa alcalina.

La conjugación de tal marca, incluyendo los enzimas, al anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar para alguien con la formación ordinaria en las técnicas de inmunoensayo. Ver, por ejemplo, O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use In Enzyme Immunoassay," en Methods in Enzymology, Eds. J.J. Langone y H. Van Vunakis, volumen 73 (Academic Press, Nueva York, Nueva York, 1981), pp. 147-166. Tales procedimientos de enlace son apropiados para su uso con los anticuerpos y polipéptidos de esta invención.

En ciertos procedimientos de ensayo se requiere la inmovilización de los reactivos. La inmovilización comporta separar la pareja de unión de cualquier analito que permanezca libre en solución. Esto se consigue convencionalmente bien solubilizando la pareja de unión o análogo del analito antes del procedimiento de ensayo, como mediante la adsorción a una matriz o superficie insoluble en agua (Bennich et al., US-3.720.760), mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando el entrecruzamiento con glutaraldehído), o mediante la posterior insolubilización de la pareja o análogo, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación.

Otros procedimientos de ensayo, conocidos como ensayos competitivos o en sándwich, están bien establecidos y son ampliamente usados en la industria de diagnósticos comerciales.

Los ensayos competitivos se fundamentan en la capacidad de un análogo trazador para competir con el analito de la muestra de ensayo por un número limitado de sitios de unión sobre una pareja de unión común. La pareja de unión generalmente se insolubiliza antes o después de la competición, y a continuación el trazador y analito unidos a la pareja de unión se separan del trazador y analito no unidos. Esta separación se consigue decantando (cuando la pareja de unión estaba preinsolubilizada) o mediante centrifugación (cuando la pareja de unión se precipitó después de la reacción competitiva). La cantidad de analito de la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de trazador unido, según se mide por la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan curvas de dosis-respuesta con cantidades conocidas de analito, y se comparan con los resultados del ensayo para determinar cuantitativamente la cantidad de analito presente en la muestra de ensayo. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA cuando los enzimas se usan como los marcadores detectables.

Otra especie de ensayo competitivo, denominada ensayo "homogéneo", no requiere una fase de separación. En ésta, no requiere una separación de fase. En éste, se prepara y usa un conjugado de un enzima con el analito de tal forma que, cuando el anti-analito une el analito, la presencia del anti-analito modifica la actividad del enzima. En este caso, el C-C CKR-1 o sus fragmentos inmunológicamente activos, se conjugan con un puente orgánico bifuncional a una enzima tal como la peroxidasa. Los conjugados se seleccionan para su uso con un anti-C-C CKR-1, de tal forma que la unión del anti-C-C CKR-1 inhibe o potencia la actividad del enzima de la marca. Este procedimiento per se se practica ampliamente bajo el nombre de EMIT.

Los conjugados estéricos se usan en procedimientos de impedimento estérico para ensayos homogéneos. Estos conjugados se sintetizan uniendo covalentemente un hapteno de bajo peso molecular a un analito pequeño, de forma que el anticuerpo contra el hapteno es sustancialmente incapaz de unir el conjugado al mismo tiempo que el anti-analito. En este procedimiento de ensayo, el analito presente en la muestra de ensayo unirá el anti-analito, permitiendo de ese modo que el anti-hapteno se una al conjugado, resultando en un cambio en el carácter del hapteno conjugado, por ejemplo, un cambio en la fluorescencia cuando el hapteno es un fluoróforo.

Los ensayos en sándwich son particularmente útiles para la determinación del C-C CKR-1 o anticuerpos contra el C-C CKR-1. En los ensayos en sándwich secuenciales, una pareja de unión inmovilizada se usa para adsorber el analito de la muestra de ensayo, la muestra de ensayo se retira mediante lavado, el analito unido se usa para adsorber la pareja de unión marcada, y el material unido se separa a continuación del trazador residual. La cantidad de trazador unido es directamente proporcional al analito en la muestra de ensayo. En los ensayos en sándwich "simultáneos", la muestra de ensayo no se separa antes de añadir la pareja de unión marcada. Un ensayo en sándwich secuencial, usando un anticuerpo monoclonal anti-C-C CKR-1 como un anticuerpo, y un anticuerpo policlonal anti-C-C CKR-1 como el otro, es útil para ensayar muestras en busca de actividad del C-C CKR-1.

Los anteriores son meramente ensayos diagnósticos ilustrativos par el C-C CKR-1 y sus anticuerpos. Otros procedimientos, desarrollados ahora y a partir de ahora, para la determinación de estos analitos se incluyen dentro del ámbito de esta invención, incluyendo los bioensayos descritos más arriba.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

C. Ejemplos experimentales

Ejemplo I

Aislamiento de receptores huérfanos

Se empleó una estrategia de clonación de "receptor huérfano" en un intento de aislar los ADNc que codifican los receptores de las quimiocinas C-C. Los receptores de superficie celular para los quimioatractores C5a (Gerard, N.P., et al., Nature, 349:614-617 (1991)), el tripéptido bacteriano fMLP (Boulay, F., et al., Biochemistry, 29:111123-11133 (1990)), así como los dos receptores de la quimiocina C-X-C IL-8, receptores A y B (IL8rA e IL8rB) (Holmes, W.E., et al., Science, 253:1278-1280 (1991); Murphy, P.M., et al., Science, 253:1280-1283 (1991)) se halló que pertenecían a la superfamilia de receptores de proteínas cuyas estructuras se predice que atraviesan siete veces la membrana celular (Dohlman, H.G., et al., Annu. Rev. Biochem., 60:653-658 (1991)). Puesto que las moléculas que abarcan siete veces la membrana están típicamente asociadas con proteínas G, cuya función puede inhibirse mediante la toxina pertusis, asumimos que los receptores de la clase de proteína quimiocinas C-C compartirían también la arquitectura de siete elementos transmembrana. De acuerdo con esto, se sintetizaron dos oligonucleótidos degenerados correspondientes a las secuencias de aminoácidos conservadas en dos regiones transmembrana (TM) del IL8rA, y de los receptores del C5a y del fMLP. El primer oligonucleótido correspondía a una región en TM2: LNLA(L/V)AD(L/F)(L/G) (SEC. Nº ID.: 9) y el segundo en TM7: NP(I/M)(I/L)Y(A/V)(F/V)(I/M/A)GS (SEC. Nº ID.: 10).

Estos oligómeros se usaron a continuación como cebadores en experimentos de RT-PCR usando sustratos de ADNc procedentes de diferentes tipos de células hematopoyéticas que se sabe responden a las quimiocinas C-C, incluyendo las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), y las líneas celulares U937, HL60 y THP-1. La PCR se realizó tal como sigue: se usaron 1-2 \mug de ARN total procedente de diferentes líneas celulares hematopoyéticas como sustratos de la RT-PCR (Larrick, J.W., Trends Biotech., 10:146-152 (1992)), tal como recomendaba el proveedor (Perkin Elmer, Norwalk, CT). En la PCR se usaron los oligonucleótidos degenerados correspondientes a las regiones conservadas de los receptores de quimioatractores. Las condiciones de la PCR fueron como sigue: 94ºC durante 0,5 min, 50-55ºC durante 0,5 min, 72ºC durante 0,5-1 min, 30 ciclos. Los productos de la PCR se clonaron con extremos romos en el sitio SmaI del pBS (Stratagene, La Jolla, CA) tal como se había descrito previamente (Nguyen, T. et al., Gene, 109:211-218 (1991)). El ADN plasmídico se aisló usando el equipo Quiagen (Quiagen Inc., Chatsworth, CA) según recombinada el proveedor. La secuenciación se realizó con el equipo Sequenase (USBC, Cleveland, OH) según recomendaba el proveedor.

La subclonación y secuenciación de los productos de la PCR reveló la presencia de IL8rA, IL8rB, receptor del C5a, y dos nuevos clones que tenían características de receptores con siete segmentos transmembrana y una marcada similitud con los dos receptores de la IL-8. La caracterización funcional parcial de estos receptores huérfanos reveló que no unían el HuMIP-1\alpha. Sin embargo, se apreció que estos dos clones, los cuales estaban más relacionados con los receptores de la IL-8 que con otros receptores que abarcan siete veces la membrana, poseían un nuevo motivo de aminoácidos conservado en el extremo de TM3, DRYLAIVHA (SEC Nº ID.: 11), el cual parecía definir una subfamilia de las moléculas que abarcan la membrana siete veces relacionadas con el receptor de la IL-8, que excluía los receptores del C5a y fMLP. Por tanto, se llevó a cabo una segunda ronda de RT-PCR/clonación del huérfano usando el oligonucleótido degenerado de la TM2 y un oligonucleótido degenerado de DRYLAIVHA (SEC. Nº ID.: 11). Además, para incrementar las probabilidades de obtener receptores de quimiocinas C-C, el ADNc se obtuvo de monocitos humanos cultivados, los cuales unían el HuMIP-1\alpha marcado radiactivamente, y de células B, las cuales respondían quimiotácticamente al HuMIP-1\alpha, y se usó en la reacción de la PCR. La clonación y la secuenciación de estos productos de la PCR reveló varios receptores adicionales únicos que abarcaban siete veces la
membrana.

Los monocitos se cultivaron mediante técnicas estándares comúnmente conocidas en la técnica. De forma breve, se separaron células de la capa de leucocitos en un gradiente de Ficoll. Las células mononucleares recuperadas de la interficie se centrifugaron repetidamente para suprimir las plaquetas. Los monocitos se separaron de otras células mononucleares adhiriéndolos a placas de cultivo de células. Las células no adherentes se eliminaron mediante lavado y los monocitos adherentes se cultivaron a continuación durante 48-72 horas antes de su uso.

Alternativamente, el ADN genómico o ADNc se pudo examinar en busca de la presencia de genes de receptores huérfanos mediante hibridación tradicional de la transferencia Southern con los oligómeros descritos más arriba, o con sondas diseñadas a partir de ADN clonado de una proteína que abarca la membrana siete veces.

Ejemplo II

Caracterización del ADN del C-C CKR-1

Se aisló un ADNc correspondiente a un clon, el JOSH1, examinando una biblioteca de cADN de \lambdagt10 preparada a partir de células HL60 tratadas con PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) con fragmentos de restricción marcados con ^{32}P. Se aisló el ADN de fagos y los insertos de los clones \lambdagt10 se obtuvieron mediante la PCR, empleando 20 ciclos con cebadores flanqueadores del inserto y en enzima polimerasa del ADN de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA), según recomendaba el proveedor. Los productos de la PCR se subclonaron en el sitio SmaI del pRK5 tal como se describió más arriba.

La secuencia de nucleótidos de JOSH1 reveló una pauta de lectura abierta de 1065 bases, que codificaba una proteína de 355 aminoácidos (Figuras 1 y 9). La secuencia de aminoácidos deducida, designada provisionalmente como el receptor I de quimiocina C-C (C-C CKR-1), tiene características claves relacionadas con los receptores vinculados a la proteína G de la superfamilia de receptores que abarcan siete veces la membrana. Por ejemplo, tiene siete regiones hidrofóbicas que se predice abarcan la membrana celular, y residuos cisteína en el primer y segundo bucle extracelular que están implicados en la formación de un enlace disulfuro (Figura 1). Sin embargo, ciertas características de la proteína C-C CKR-1 predicha la hacen distinta de los receptores clásicos que abarcan siete veces la membrana. El extremo carboxilo es relativamente corto y carece de residuos cisteína implicados en el anclaje a membrana a través de un grupo palmitoilado (O'Dowd, B.F. et al., J. Biol. Chem., 264:7564-7569 (1989)), y los segmentos entre los dominios transmembrana son relativamente cortos, una característica consistente con otros receptores quimioatractores (Boulay, F., et al., Biochemistry, 30:2993-2999 (1991); Boulay, F., et al., Biochemistry, 29:111123-11133 (1990); Gerard, N.P., et al., Nature, 349:614-617 (1991); Holmes, W.E., et al., Science, 253:1278-1280 (1991); Murphy, P.M., et al., Science, 253:1280-1283 (1991)). Hay tres sitios potenciales de glicosilación en el C-C CKR-1 (Figura 1), uno en el extremo N-terminal, uno en el primer bucle citoplasmático, y el tercero en el TM6. Este último sitio es improbable que esté glicosilado, puesto que se predice que esté enterrado en la membrana celular. Finalmente, hay una secuencia consenso para un sitio de fosforilación para la proteína quinasa C, en la posición 192, pero esta posición se predice que sea extracelular.

Se comparó la secuencia de aminoácidos deducida del C-C CKR-1 con otros receptores quimioatractores vinculados a la proteína G (Figura 1). Los IL8rA e IL8rB mostraron aproximadamente un 32% de identidad de secuencia con el C-C CKR-1, mientras que los receptores del C5a y fMLP mostraron aproximadamente un 23% de identidad (Figura 1). Recientemente se ha depositado en Genebank (código de acceso #M99293), por parte de Federsspiel et al., una molécula putativa que abarca siete veces la membrana, HUMST-SR, que se halló tenía un 31% de identidad con el C-C CKR-1. La secuencia de esta molécula es idéntica a uno de los receptores putativos aislados en nuestro primer intento de clonación mediante RT-PCR descrito más arriba. El ligando para el HUMSTSR todavía no ha sido identificado. El segundo grupo de receptores que está estrechamente relacionado con el C-C CKR-1 son los receptores del neuropéptido Y y de la angiotensina II (no se muestran los datos). En último lugar, una pauta de lectura abierta en el genoma del citomegalovirus, denominada US28, tiene aproximadamente un 33% de identidad con el C-C CKR-1, y aproximadamente un 60% de identidad en la región N-terminal antes de la TM1 con el C-C CKR-1.

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Ejemplo III

Análisis Northern y Southern del C-C CKR-1

La expresión del C-C CKR-1 se verificó en un panel limitado de líneas de células hematopoyéticas usando el análisis de transferencia Northern. La hibridación de la transferencia Northern se realizó como sigue. Se aisló el ARN total usando el procedimiento del guanidinio-isotiocianato-CsCl (Sambrook et al., 1989), o mediante el procedimiento del RNAzol según recomendaba el proveedor. Se aisló el poli-A^{+} ARN usando Dynabeads oligoT (DYNAL, Great Neck, NY) según recomendaba el proveedor. El ARNm de HL60, denominado "HL60-C" en este informe, se obtuvo de Clontech (Palo Alto, CA). 20 \mug de ARN total ó 5 \mug de poli-A^{+} ARN se fraccionaron en geles de formaldehído-agarosa, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, y se hibridaron con ADNc de C-C CKR-1 (Korneluk, R.G. et al., J. Biol. Chem., 261:8407-8413 (1986)).

Se detectó una única banda de aproximadamente 3 kb en las líneas celulares pre-monocíticas, por ejemplo, células U937 y HL60 no diferenciadas o diferenciadas (Figura 2), pero no en una preparación comercial de ARN de HL60 (HL60-C, Figura 2). También se detectaron niveles inferiores de mARN en las líneas de células B 1788 y Daudi, pero se detectó poco o ningún mARN en las células K562 (Figura 2). Los niveles más elevados se detectaron en células THP-1 tratadas con PMA, en donde se obtuvo una señal intensa cuando se analizaron 20 \mug de ARN total (Figura 2).

La hibridación de la transferencia Southern se realizó como sigue. El ADN genómico humano, obtenido de Clontech (Palo Alto, CA), se digirió mediante restricción, se transfirió sobre Genescreen® (Dupont), y se hibridó (Neote, K., et al., J. Clin. Invest., 86:1524-1531 (1990)) con el ADNc del C-C CKR-1. El patrón de hibridación indicó que el gen del C-C CKR-1 podía carecer de intrones. Más aún, esto sugería la existencia de un segundo gen relacionado o posiblemente de un pseudo-gen. Las Figuras 3A y 3B representan los lavados con bajo y elevada rigurosidad de la misma transferencia de ADN genómico humano, el cual se había digerido con varios enzimas de restricción. En condiciones de elevada rigurosidad (Figura 3B), se detectaron fragmentos de restricción simples que se hibridaban con el ADNc del C-C CKR-1 cuando el ADN genómico se digería con BamHI, HindIII o SacI, y, tal como se predecía a partir de la secuencia del ADNc, se detectan dos fragmentos en las digestiones de ADN con EcoRI y PstI. Sin embargo, la hibridación con baja rigurosidad reveló la presencia de bandas adicionales que se hibridaban con el ADNc del C-C CKR-1, por ejemplo, un fragmento de PstI de aproximadamente 7 kb y un fragmento de HindIII de aproximadamente 1,6 kb (Figura 3A). Estas bandas desaparecían cuando las transferencias se lavaban en condiciones de elevada rigurosidad, mientras que las otras bandas permanecían inalteradas entre los dos lavados.

Ejemplo IV

Señalización a través del C-C CKR-1 en respuesta al HuMIP-1\alpha y RANTES

MCP-1, RANTES, HuMIP-1\alpha y huMIP-1\beta inducen un incremento rápido y transitorio del Ca^{++} intracelular en monocitos humanos (Rollins, B.J., et al., Blood, 78:1112-1116 (1991); Sozzani, S., et al., J. Immunol., 147:2215-2221 (1991)). Para determinar si el C-C CKR-1 era un receptor funcional de quimiocinas C-C, se expresó transitoriamente en células 293 renales humanas y se midieron los niveles intracelulares de Ca^{++} en respuesta a diferentes quimiocinas C-C.

Se expresó el RANTES recombinante en E. coli y se purificó tal como describieron Kuna et al. (J. Immunol. 149:636-642 (1992b)). El huMIP-1\alpha y el huMIP-1\beta se expresaron en E. coli, y se purificaron tal como describieron Rot et al. (J. Exp. Med., en prensa). El huMIP-1\alpha se yodó mediante el procedimiento del cloroglicourilo (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 80:849-857 (1978)) hasta una actividad específica inicial de 472 Ci/mmol. El huMIP-1\alpha marcado se purificó mediante una combinación de filtración en gel y HPLC en fase inversa. El
RANTES marcado con ^{125}I, actividad específica de 2200 Ci/mmol, se obtuvo de Dupont/NEN (Boston, MA). El MCP-1 recombinante y el MIP-1\alpha de ratón se obtuvieron de Peprotech (Rocky Hill, NJ).

Se transfectaron células 293 renales embrionarias humanas con 10-20 \mug de ADN plasmídico mediante el procedimiento del fosfato cálcico según está descrito (Schall, T.J., et al., Eur. J. Immunol., 22:1477-1481 (1992)) o mediante el procedimiento modificado del fosfato cálcico (Chen, C. et al., Mol. Cell. Biol., 7:2745-2752 (1987)). Las células transfectadas se ensayaron después de la expresión transitoria durante 12-24 horas.

Las mediciones del Ca^{++} intracelular se realizaron en el SLM 8000C esencialmente tal como se ha descrito (Naccache, P.H. et al., J. Immunol., 142:2438-2444 (1989)), con modificaciones menores: se usó INDO-1-AM a una concentración final de 20 mg/ml y se usaron 2-4 \times 10^{6} células por ensayo.

Inicialmente se usó una dosis 100 nM de RANTES, huMIP-1\alpha, huMIP-1\beta, y MCP-1 como una primera aproximación de la concentración máxima fisiológicamente relevante. Cuando las células transfectadas, cargadas con la sonda de calcio INDO-1-AM, se desafiaron con 100 nM de uno de huMIP-1\alpha o RANTES, se observó un incremento rápido del Ca^{++} intracelular (Figura 4). El desafío con la misma dosis de MCP-1 o huMIP-1\beta produjo un pequeño flujo detectable de Ca^{++} (no se muestran los datos). Las células control, transfectadas con el vector solo o con el vector conteniendo el C-C CKR-1 en la orientación opuesta (no codificante), no respondieron a ninguno de los ligandos (no se muestran los datos). Las respuestas de señalización eran dependientes de la dosis, 10 n; de huMIP-1\alpha y 100 nM de RANTES eran suficientes para obtener una respuesta máxima o prácticamente máxima (Figura 4A y 4B).

Se sabe que la exposición rápida y sucesiva al mismo ligando desensibiliza la capacidad de señalización de los receptores vinculados a la proteína G (Schild, H.O., "Receptor classification with special reference to \beta-adrenergic receptors," en Drug Receptors, Ed. H.P. Rang (University Press, 1973), pp. 29-36). Además, la desensibilización puede ocurrir también cuando dos agonistas diferentes señalizan a través del mismo receptor. El huMIP-1\alpha claramente bloquea la capacidad del receptor C-C CKR-1 para transmitir una segunda señal de Ca^{++} cuando se añade el huMIP-1\alpha sucesivamente dos veces a las células transfectadas (Figura 5A). De forma similar, el RANTES bloquea la respuesta frente a un segundo desafío a la misma concentración (Figura 5B). Cuando el huMIP-1\alpha se añade primero, bloquea la respuesta al RANTES, indicando que ha ocurrido la desensibilización completa (Figura 5C). Sin embargo, el desafío de las células transfectadas con el C-C CKR-1 con 250 nM de RANTES no impidió un flujo subsiguiente de Ca++ a causa de la adición de huMIP-1\alpha 100 mM (Figura 5D), indicando que no había ocurrido la desensibilización del receptor. Sin embargo, el subsiguiente flujo de Ca^{++} por parte del huMIP-1\alpha está reducido, desde un cambio de Ca^{++} intracelular de aproximadamente 70 nM (Figuras 5A y 5C) hasta aproximadamente 40 nM (Figura 5D), sugiriendo que había ocurrido una desensibilización parcial.

Ejemplo V

Unión del HuMIP-1\alpha y RANTES al C-C CKR-1

Con objeto de investigar adicionalmente la interacción del huMIP-1\alpha y RANTES con el C-C CKR-1 clonado, se llevaron a cabo experimentos de unión con ligandos marcados con ^{125}I.

Los ensayos de unión se realizaron tal como se ha descrito previamente (Horuk, R. et al., J. Biol. Chem., 262:
16275-16278 (1987)). Las células transfectadas (2 \times 10^{6} células por ml) se incubaron con ligandos marcados radiactivamente y diversas concentraciones de ligandos sin marcar, a 4ºC, durante 2 horas. La incubación se terminó retirando alícuotas de la suspensión de células, y separando las células del tampón mediante centrifugación a través de una mezcla de silicona/aceite de parafina tal como se ha descrito previamente (Robb, R.J. et al., J. Exp. Med., 160:
1126-1146 (1984)). La unión no específica se determinó en presencia de 1 \muM de ligando no marcado. Se representaron las determinaciones de ensayos individuales, representativas de al menos tres experimentos independientes. Los datos de unión se ajustaron con una curva con el programa de ordenador LIGAND (Munson, P.J. et al., Anal. Biochem., 107:220-239 (1980)) modificado para el PC de IBM (McPherson, G.A., Comp. Prog. Biomed., 17:107-114 (1983)) para determinar la afinidad (K_{d}), el número de sitios, y la unión no específica. Las curvas mostradas son las isotermas de la unión determinadas por LIGAND.

Por tanto, cuando las células 293, que transitoriamente expresaban el C-C CKR-1, se incubaron con ^{125}I-huMIP-1\alpha y concentraciones crecientes de huMIP-1\alpha sin marcar, se observó la unión desplazable del ^{125}I-huMIP-1\alpha al C-C CKR-1 (Figura 6A). El análisis de Scatchard mostró una constante de disociación (K_{d}) de 5,1 \pm 0,3 nM y aproximadamente 130.000 sitios/célula. Esta K_{d} está dentro del rango de la determinada para la unión del huMIP-1\alpha a monocitos humanos, y sugiere que el C-C CKR-1 es al menos uno de los receptores del huMIP-1\alpha presente sobre monocitos. Sin embargo, no pudo conseguirse la unión directa del RANTES al C-C CKR-1, es decir, el ^{125}I-RANTES no pudo ser desplazado por el RANTES sin marcar. De forma interesante, a medida que se incrementaba la cantidad de RANTES sin marcar en el ensayo de unión, se observó un incremento concomitante del ^{125}I-RANTES unido a las células (no se muestran los datos). Puesto que el C-C CKR-1 transduce una señal (moviliza el Ca^{++}) en respuesta al RANTES (Figura 4) y, por tanto, el ligando estar uniéndose al receptor clonado, no está clara la razón para el inusual perfil de unión observado para el ^{125}I-RANTES. Se obtuvieron fenómenos de unión similares si se usaban otras células diana que respondían al RANTES. De forma interesante, el ^{125}I-RANTES pudo ser desplazado por huMIP-1\alpha sin marcar sobre células 293 que expresaban el C-C CKR-1 transitoriamente (Figura 6B). El análisis de Scatchard de este desplazamiento heterólogo sugirió una K_{d} de 7,6 \pm 1,5 nM (aproximadamente 350.000 sitios/célula) y es consistente con la K_{d} de los datos de unión del huMIP-1\alpha descritos más arriba. Estas observaciones nos sugirieron inicialmente que el C-C CKR-1 une el huMIP-1\alpha y el RANTES y subsiguientemente transduce una señal incrementando los niveles intracelulares de Ca^{++}.

Ejemplo VI

Desplazamiento del HuMIP-1\alpha por parte de quimiocinas heterólogas

Para caracterizar adicionalmente las propiedades de unión del C-C CKR-1, y en particular para intentar definir una K_{d} para la unión del RANTES al C-C CKR-1 clonado, se realizó el desplazamiento heterólogo del ^{125}I-huMIP-1\alpha con RANTES y también con huMIP-1\beta, MCP-1, IL-8, y MIP-1\alpha de ratón. De forma interesante, todas las quimiocinas C-C (RANTES, MIP-1\beta y MCP-1) desplazaron el ^{125}I-huMIP-1\alpha, pero la quimiocina C-X-C IL-8 no lo hizo (Figura 7). A partir del análisis de Scatchard se determinó que la K_{d} para el RANTES, huMIP-1\beta y MCP-1, y el MIP-1\alpha era respectivamente de 486 \pm 280, 232 \pm 70,1, 122 \pm 39,9 y 4,2 \pm 2,7 nM, y en cada caso había presentes aproximadamente 250.000-350.000 sitios/célula (Figura 7). Estos resultados revelaron una amplia especificidad de ligando del C-C CKR-1, incluyendo cierta ausencia de especificidad de especie en la unión. De forma más importante, sugirió que la afinidad de unión entre el ligando y el receptor no predice la eficacia de la señalización que resulta de la interacción, es decir, aunque el huMIP-1\beta y el MCP-1 se unen con una afinidad superior que el RANTES, 100 mM de MIP-1\beta o MCP-1 no transmiten una señal a través del receptor clonado, mientras que el RANTES sí que lo hace (Figura
4).

\newpage

Ejemplo VII

Movilización del calcio en respuesta al HuMIP-1\beta y MCP-1

Para determinar la relevancia de la unión del huMIP-1\beta y MCP-1 al C-C CKR-1, se desafiaron células 293, transfectadas con el ADNc del C-C CKR-1, con dosis elevadas de huMIP-1\beta y MCP-1, y se determinaron los niveles intracelulares de Ca^{++}. Se tuvo que usar una concentración de 1 mM del MPC-1 recombinante para producir un flujo de Ca^{++}. Sin embargo, este flujo de Ca^{++} fue sólo del 20% de la respuesta máxima obtenida con el huMIP-1\alpha o RANTES (Figura 8). Concentraciones inferiores rindieron un flujo casi indetectable (no se muestran los datos). Los experimentos de control utilizando células THP-1 y 50-100 nM de MCP-1 rindieron los intensos flujos de Ca^{++} esperados (un incremento transitorio de 200-300 nM de Ca^{++}, no se muestran los datos). De forma similar, se necesitaron 250 nM de huMIP-1\beta para producir un flujo de Ca^{++} en células 293 que transitoriamente expresaban el C-C CKR-1, el cual fue aproximadamente el 20% de la señal máxima obtenida con el huMIP-1\alpha o RANTES (Figura 8). Estos resultados apoyan la sugerencia de que las afinidades de unión del huMIP-1\beta y MCP-1 no reflejan sus capacidades de señalización.

Ejemplo VIII

Unión del HuMIP-1\alpha a células 293 que expresan la proteína codificada por el US28

Puesto que la secuencia de aminoácidos del C-C CKR-1 es aproximadamente un 35% idéntica a una pauta de lectura abierta en el genoma del CMV humano denominada US28, buscamos determinar si la proteína codificada por esta pauta de lectura abierta uniría el huMIP-1\alpha. Se amplificó la pauta de lectura abierta US28 a partir de un lote de citomegalovirus, virus Towne (amable donación del Dr. Philip Dormitzer), con cebadores que flanqueaban la región codificante, usando la PCR y la polimerasa del ADN termoestable Pfu. El producto de la PCR se subclonó en el vector de expresión pRK5 y su identidad se confirmó mediante secuenciación. El ADN del plásmido que contenía la US28 en la dirección con sentido, y el opuesto, anti-sentido, se transfectó en células 293. Las células transfectadas se usaron a continuación para determinar la unión del huMIP-1\alpha marcado radiactivamente. Las células 293 transfectadas con la secuencia codificante de la US28 en la orientación con sentido unieron el ^{125}-huMIP-1\alpha, mientras que se obtuvo una unión despreciable en las células transfectadas con la orientación anti-sentido (Figura 10). El huMIP-1\alpha marcado radiactivamente también se pudo desplazar con 1 \muM de MIP-1\alpha de ratón, huMIP-1\beta, RANTES y MCP-1, pero no con la quimiocina C-X-C IL-8 (Figura 10). Estos resultados indican que la proteína codificada por la US28 une específicamente quimiocinas C-C y no quimiocinas C-X-C.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: GENENTECH, INC.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR DE QUIMIOCINA C-C

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN: 460 Point San Bruno Blvd

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

(ZIP): 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete de 360 Kb, 5,25 pulgadas

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: patin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Fitts, Renne A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 35.136

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA: 806

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 415/225-1489

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415/952-9881

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 910/371-7168

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 355 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 1:

\newpage

1

2

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 352 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

3

\newpage

4

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 350 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 355 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 4:

\newpage

8

9

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 350 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

10

\newpage

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 350 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 323 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 7:

\newpage

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1495 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 8:

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\vskip1.000000\baselineskip

17

\newpage

18

\newpage

19

20

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 9:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 9:

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100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 10:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Pro Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

101

Claims (35)

1. Polipéptido C-C CKR-1 aislado que tiene

(i)

la capacidad de unir al menos una quimiocina C-C, y

(ii)

la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 1, o una secuencia que comparte al menos el 60% de identidad de secuencia a lo largo de su longitud total con la secuencia de la Figura 1.

2. Polipéptido según se reivindica en la reivindicación 1, el cual tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 70% de identidad de secuencia a lo largo de su longitud total con la secuencia de la Figura 1.

3. Polipéptido según se reivindica en la reivindicación 2, el cual tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 1.

4. Polipéptido según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual tiene la capacidad de unir una quimiocina C-C seleccionada de entre: RANTES, HuMIP-1\alpha, HuMIP-1\beta, o MCP-1.

5. Composición que comprende el polipéptido C-C CKR-1 de la reivindicación 1, en donde el polipéptido C-C CKR-1 se deriva de una fuente natural, y cuya composición está libre de un polipéptido contaminante de la especie animal que es la fuente del polipéptido C-C CKR-1.

6. Anticuerpo que es capaz de unir el polipéptido C-C CKR-1 de la reivindicación 1, que no reacciona de manera cruzada con otro receptor de quimiocina.

7. Anticuerpo según se reivindica en la reivindicación 6, el cual es un anticuerpo monoclonal.

8. Molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido C-C CKR-1 de la reivindicación 1.

9. Molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8 que es ADN y contiene más de aproximadamente 25 bases.

10. Molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8 que es ADNc.

11. Molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8 que es una secuencia genómica.

12. Molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8 que además comprende un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico.

13. Molécula de ácido nucleico de la reivindicación 12, en donde el promotor es heterólogo para el polipéptido C-C CKR-1.

14. Vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 8 unida operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora transformada con el vector.

15. Célula hospedadora transformada con el vector de la reivindicación 14.

16. Procedimiento para determinar la presencia de un ácido nucleico del C-C CKR-1, que comprende hibridar el ácido nucleico según la reivindicación 8, o su complementario, con un ácido nucleico de muestra de ensayo, y determinar la presencia del ácido nucleico del C-C CKR-1 con el cual se hibrida.

17. Procedimiento para amplificar una muestra de ensayo de ácido nucleico, que comprende cebar una reacción de polimerasa de ácido nucleico con un ácido nucleico según la reivindicación 8 o su complementario.

18. Composición que comprende el polipéptido C-C CKR-1 de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

19. Composición que comprende el anticuerpo de la reivindicación 6 ó 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Polipéptido aislado que comprende el polipéptido C-C CKR-1 de la reivindicación 1, fusionado con un polipéptido heterólogo al polipéptido C-C CKR-1.

21. Procedimiento para identificar un receptor de quimiocina C-C según se reivindica en la reivindicación 1, que comprende,

(a)

diseñar un cebador de la PCR correspondiente a una región transmembrana de una proteína con siete segmentos transmembrana;

(b)

cebar una reacción de PCR con un sustrato de ADNc procedente de un tipo de célula hematopoyético que se sabe responde a la quimiocina C-C;

(c)

recuperar los productos de la PCR del paso (b).

22. Procedimiento de la reivindicación 21, en donde el cebador comprende un conjunto de oligonucleótidos degenerados que codifican la secuencia LNLA(L/V)AD(L/F)(L/G).

23. Procedimiento de la reivindicación 21, en donde el cebador comprende un conjunto de oligonucleótidos degenerados que codifican la secuencia NP(I/M)(I/L)Y(A/V)(F/V)(I/M/A)GQ.

24. Procedimiento de la reivindicación 21, en donde el cebador comprende un conjunto de oligonucleótidos degenerados que codifican la secuencia DRYLAIVHA.

25. Procedimiento de la reivindicación 21, en donde el tipo de célula son monocitos humanos cultivados.

26. Procedimiento que comprende transformar una célula hospedadora con ADN que codifica el polipéptido del
C-C CKR-1 de la reivindicación 1, cultivar la célula hospedadora para expresar el receptor sobre su superficie, recolectar las células, poner en contacto las células con una variante de quimiocina C-C, y determinar la actividad biológica de la variante sobre el receptor.

27. Ensayo para un analito del polipéptido C-C CKR-1 de la reivindicación 1, ensayo que comprende ensayar para determinar la unión del analito a una pareja de unión, en donde dicha pareja de unión es dicho polipéptido C-C
CKR-1.

28. Ensayo, según se reivindica en la reivindicación 27, que es un ensayo competitivo, un ensayo en sándwich, o un ensayo de inhibición estérica.

29. Ensayo, según se reivindica en la reivindicación 27 o reivindicación 28, que usa uno o más de los siguientes reactivos: análogo del analito marcado, análogo del analito inmovilizado, pareja de unión marcada, pareja de unión inmovilizada.

30. Ensayo, tal como se ha reivindicado en la reivindicación 29, en donde la pareja de unión se separa de cualquier analito que permanezca libre en solución.

31. Ensayo, según se reivindica en la reivindicación 30, que usa un análogo del analito, en donde bien la pareja de unión o el análogo del analito se insolubiliza antes del procedimiento de ensayo.

32. Ensayo, según se reivindica en la reivindicación 31, que usa un análogo del analito, en donde bien la pareja de unión o el análogo del analito se insolubiliza después del procedimiento de ensayo.

33. Ensayo, según se reivindica en la reivindicación 28, que es un ensayo competitivo homogéneo.

34. Ensayo, según se reivindica en la reivindicación 28, que es un ensayo en sándwich simultáneo.

35. Ensayo, según se reivindica en la reivindicación 28, que es un ensayo en sándwich secuencial.