ES2250377T3 - Moleculas organicas pequeñas reguladoras de la proliferacion celular. - Google Patents
Moleculas organicas pequeñas reguladoras de la proliferacion celular.Info
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Abstract
Una preparación farmacéutica que comprende un compuesto con una estructura de Fórmula VIII: Fórmula VIII En donde, como valencia se permite, U representa un arilo sustituido o sin sustituir o anillo heteroarilo fusionado al anillo que contiene nitrógeno; V representa metileno, 1, 1-etileno ó 1, 1-propileno; W representa S ó O, preferiblemente O; X representa C=O, C=S, o SO2; R3 representa, arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior sustituido o sin sustituir, alquinilo inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, aralquilo, o heteroaralquilo; R4 representa, un aralquilo o alquilo inferior sustituido o sin sustituir, tales como un fenetilo, benzilo, o aminoalquilo, etc; R5 representa, un arilo, heteroarilo, aralquilo, o heteroaralquilo sustituido o sin sustituir, incluyendo grupos aromáticos policíclicos o heteroaromáticos. o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Description
Moléculas orgánicas pequeñas reguladoras de la
proliferación celular.
La formación de patrones es la actividad por la
cuál las células embrionarias forman disposiciones ordenadas en el
espacio de tejidos diferenciados. La complejidad física de los
organismos mayores se presenta durante la embriogénesis a través de
la interacción del linaje celular intrínseco y la señal celular
extrínseca. Las interacciones inductivas son esenciales para el
patrón embrionario en el desarrollo de los vertebrados desde el
establecimiento más temprano del plan corporal, hasta el diseño de
los sistemas de órganos, para la generación de los diversos tipos de
células durante la diferenciación tisular. (Davidson, E., (1990)
Development 108: 365-389; Gurdon, J.B.,
(1992) Cell 68: 185-199; Jessell, T.M. et
al., (1992) Cell 68: 257-270). Los
efectos de las interacciones entre las células de desarrollo son
variados. Generalmente, las células respondientes son desviadas de
una ruta de diferenciación celular a otra por células inductoras que
difieren de los dos, los estados inducido y no inducido de las
células respondientes (inducciones). Algunas veces las células
inducen a sus vecinas a diferenciarse como ellas mismas (inducción
homogénea); en otros casos una célula inhibe a sus vecinas de una
diferenciación como la suya. Las interacciones celulares en el
desarrollo temprano pueden ser secuenciales, como una inducción
inicial entre dos tipos celulares que lleva a una progresiva
amplificación de la diversidad. Por otra parte, las interacciones
inductivas no sólo tienen lugar en embriones, sino también en
células adultas, y pueden actuar para establecer y mantener patrones
morfogenéticos así como para inducir la diferenciación (J.B. Gurdon
(1992) Cell 68:185-199).
Miembros de la familia Hedgehog de
moléculas señalizadoras median muchos procesos importantes de corto
y largo alcance de patronaje durante el desarrollo de invertebrados
y vertebrados. En la mosca, un único gen hedgehog regula el
patronaje del disco segmental e imaginal. En contraste, en
vertebrados, una única familia de genes hedgehog está
involucrada en el control de la asimetría
izquierda-derecha, la polaridad en el SNC, somites y
miembros, la organogénesis, la condrogénesis, y la
espermatogénesis.
El primer gen hedgehog fue identificado
por un cribaje genético en la mosca de la fruta Drosophila
melanogaster (Nüsslein-Volhard, C. y Wieschaus,
E. (1980) Nature 287, 795-801). Este cribaje
identificó un número de mutaciones que afectaban al desarrollo
embrionario y larval. En 1992 y 1993, la naturaleza molecular del
gen Drosophila hedgehog (hh) fue presentada (C.F., Lee
et al. (1992) Cell 71, 33-50), y desde
entonces, diversos homólogos del hedgehog han sido aislados
de varias especies de vertebrados. Mientras tan sólo ha sido
encontrado un gen hedgehog en Drosophila y otros
invertebrados, múltiples genes Hedgehog están presentes en
vertebrados.
La familia vertebrada de genes hedgehog
incluye al menos 4 miembros, por ejemplo, parálogos del único gen
hedgehog drosophila. Genes y proteínas hedgehog ejemplares
están descritos en las publicaciones del PCT WO 95/18856 y WO
96/17924. Tres de estos miembros, aquí nombrados como Desert
hedgehog (Dhh), Sonic hedgehog (Shh), y
Indian hedgehog (Ihh), aparentemente existen en todos
los vertebrados, incluyendo peces, aves y mamíferos. Un cuarto
miembro, aquí referido como tiggie-winkle
hedgehog (Thh), aparece específicamente en peces.
Desert hedgehog (Dhh) se expresa en los tests tanto en el
desarrollo embrionario del ratón como en el adulto roedor y humano;
Indian hedgehog (Ihh) está involucrado en el desarrollo de
los huesos durante la embriogénesis y en la formación de huesos en
el adulto; y, Shh, que como se ha descrito anteriormente,
está principalmente involucrado en actividades morfogénicas y
neuroinductivas. Dada las críticas funciones inductivas de los
polipéptidos hedgehog en el desarrollo y el mantenimiento de los
órganos de los vertebrados, la identificación de las proteínas
hedgehog interactuantes es de suprema importancia tanto en contextos
clínicos como de investigación.
Las diversas proteínas Hedgehog constan de
un péptido de señal, una región N-terminal altamente
conservada, y un dominio C-terminal más divergente.
Además de la división de las secuencias señal en el proceso
secretor (Lee, J.J. et al. (1992) Cell
71:33-50; Tabata, T. et al. (1992) Genes
Dev. 2635-2645; Chang, D.E. et al. (1994)
Development 120:3339-3353), las proteínas
precursoras Hedgehog experimentan una división autoproteolítica
interna, la cuál depende de secuencias conservadas en la porción
C-terminal (Lee et al. (1994) Science
266:1528-1537; Porter et al. (1995)
Nature 374:363-366). Esta autodivisión lleva
a un péptido de 19kD N-terminal y a un péptido
C-terminal de 26-28kD (Lee et
al. (1992) supra; Tabata et al. (1992)
supra; Chang et al. (1994) supra; Lee et
al. (1994) supra; Bumcrot, D.A., et al. (1995)
Mol. Cell. Biol. 15:2294-2303; Porter et
al. (1995) supra; Ekker, S.C. et al. (1995)
Curr. Biol. 5:944-955; Lai, C.J. et
al. (1995) Development 121:2349-2360).
El péptido N-terminal permanece fuertemente asociado
con la superficie en las que éste fue sintetizado, mientras que el
péptido C-terminal se puede difundir libremente
tanto in vitro como in vivo (Porter et al.
(1995) Nature 374:363; Lee et al. (1994) supra;
Bumcrot et al. (1995) supra; Mart, E. et al.
(1995) Development 121:2537-2547; Roelink, H.
et al. (1995) Cell 81:445-455).
Interesantemente, la retención de la superficie celular del péptido
N-terminal es dependiente de la autodivisión, como
una forma truncada de HH codificado por un RNA que termina
precisamente en la posición normal de división interna, es
difundible in vitro (Porter et al. (1995)
supra) y in vivo (Porter, J.A. et al. (1996)
Cell 86, 21-34). Estudios bioquímicos han
mostrado que la división autoproteolítica de la proteína HH
precursora se desarrolla a través de un tioéster interno intermedio
que posteriormente se rompe con una sustitución nucleofílica. Es
probable que el nucleófilo sea una pequeña molécula lipofílica que
se una covalentemente a la terminación C-terminal
del N-péptido (Porter et al. (1996)
supra), atándolo a la superficie celular. Las implicaciones
biológicas son profundas. Como resultado de la unión, se genera una
alta concentración local de péptido Hedgehog
N-terminal en la superficie de las células
productoras de Hedgehog. Es este péptido N-terminal
el que es tan necesario como suficiente para las actividades de
señalización Hedgehog de corto y largo alcance en Drosophila
y vertebrados (Porter et al. (1995) supra; Ekker et
al. (1995) supra; Lai et al. (1995) supra;
Roelink, H. et al. (1995) Cell
81:445-455; Porter et al. (1996)
supra; Fietz, M.J. et al. (1995) Curr. Biol.
5:643-651; Fan, C.-M. et al. (1995)
Cell 81:457-465; Mart, E., et al.
(1995) Nature 375:322-325;
Lopez-Martinez et al. (1995) Curr.
Biol. 5:791-795; Ekker, S.C. et al.
(1995) Development 121:2337-2347; Forbes,
A.J. et al. (1996) Development
122:1125-1135).
HH está implicado en procesos de patronaje de
corto y largo alcance en varios puntos durante el desarrollo de
Drosophila. En el establecimiento de la polaridad del
segmento en el embrión temprano, éste tiene efectos de corto alcance
los cuáles parecen ser mediados directamente, mientras que en el
patronaje de los discos imaginales, éste induce efectos de largo
alcance vía la inducción de señales secundarias.
En vertebrados, diversos genes hedgehog
han sido clonados en los últimos años. De estos genes, Shh ha
recibido la mayoría de la atención experimental, ya que se expresa
en diferentes centros organizadores que son la fuente de señales que
patronizan tejidos cercanos. Una evidencia reciente indica que
Shh está involucrado en éstas interacciones.
La expresión de Shh comienza poco después
del inicio de la gastrulación en el presunto mesodermo medio, el
nodo en el ratón (Chang et al. (1994) supra; Echelard,
Y. et al. (1993) Cell 75:1417-1430),
la rata (Roelink, H. et al. (1994) Cell
76:761-775) y el polluelo (Riddle, R.D. et
al. (1993) Cell 75:1401-1416), y la
concha del pez cebra (Ekker et al. (1995) supra;
Krauss, S. et al (1993) Cell
75:1431-1444). En los embriones de pollo, el patrón
de expresión del Shh en el nodo desarrolla una asimetría
izquierda-derecha, que parece ser responsable del
situs izquierda-derecha del corazón (Levin,
M. et al. (1995) Cell 82:803-814).
En el SNC, el Shh de la notocorda y del
"floorplate" parece inducir el engrosamiento ventral de la
célula. Cuando se expresa ectópicamente, Shh lleva a una
centralización de largas regiones del cerebro medio y posterior en
el ratón (Echelard et al. (1993) sumara; Goodrich,
L.V. et al. (1996) Genes Dev.
10:301-312), Xenopus (Roelink, H. et
al. (1994) supra; Ruiz y Altaba, A. et al. (1995)
Mol. Cell. Neurosci. 6:106-121), y el pez
cebra (Ekker et al. (1995) supra: Krauss et al.
(1993) supra; Hammersclunidt, M., et al. (1996)
Genes Dev. 10:647-658). En explantes de
neuroectodermos intermedios a nivel de médula espinal, la proteína
Shh induce el desarrollo del "floorplate" y la neurona
motora a distintos umbrales de concentración, "floorplate" a
altas concentraciones y neuronas motoras a más bajas concentraciones
(Roelink et al. (1995) supra; Mart' et al.
(1995) supra; Tanabe, Y. et al. (1995) Curr.
Biol. 5:651-658). Por otra parte, el bloqueo de
anticuerpos sugiere que la Shh producida por la notocorda se
requiere para la inducción mediada por la notocorda del
engrosamiento de la neurona motora (Mart' et al. (1995)
supra). Así, una alta concentración de Shh en la
superficie de las células medias productoras de Shh parece
explicar la inducción del "floorplate" mediada por contacto
observada in vitro (Placzek, M. et al. (1993)
Development 117:205-218), y en el
posicionamiento medio del "floorplate" inmediatamente encima de
la notocorda in vivo. Concentraciones menores liberadas de la
Shh de la notocorda y del "floorplate" inducen
presumiblemente a neuronas motoras en regiones ventrolaterales más
distantes en un proceso que se ha mostrado como independiente del
contacto in vitro (Yermada, T. et al. (1993)
Cell 73:673-686). En explantes cogidos a
nivel del cerebro medio y del frontal, Shh también induce los
tipos celulares neuronales ventrolaterales apropiados, precursores
dopaminérgicos (Heynes, M. et al. (1995) Neuron,
15:35-44; Wang, M.Z. et al. (1995) Nature
Med. 1:1184-1188) y colinérgicos (Ericson, J.
et al. (1995) Cell 81:747-756),
respectivamente, indicando que la Shh es un inductor común de
la especificación ventral sobre toda la longitud del SNC. Estas
observaciones plantean una cuestión tal cómo la respuesta
diferencial a al Shh está regulada en posiciones
anteroposteriores particulares.
La Shh de la línea media también patrocina
las regiones paraxiales del embrión de los vertebrados, los somites
en el tronco (Fan et al. (1995) supra) y el mesénquima
rostral de la cabeza de los somites (Hammerschmidt et al.
(1996) supra). En explantes de mesodermo paraxial de pollo y
ratón, el Shh promueve la expresión de marcadores
esclerotoma-específicos como Pax1 y
Twist, a expensas del marcador "dermamyotomal"
Pax3. Además, experimentos de filtro barrera sugieren que
Shh media la inducción del esclerotoma directamente más que
por activación de un mecanismo de señalización secundario (Fan,
C.-M. y Tessier-Lavigne, M. (1994) Cell 79,
1175-1186).
Shh también induce la expresión génica
miotomal (Hammerschmidt et al. (1996) supra; Johnson,
R.L. et al (1994) Cell 79:1165-1173;
Münsterberg, A.E. et al. (1995) Genes Dev.
9:2911-2922; Weinberg, E.S. et al. (1996)
Development 122:271-280), aunque recientes
experimentos indican que miembros de la familia WNT, homólogos
vertebrados de Drosophila wingless, son requeridos conjuntamente
(Münsterberg et al. (1995) supra).
Desconcertantemente, la inducción miotomal en polluelos requiere
unas concentraciones mayores de Shh que la inducción de
marcadores esclerotomales (Münsterberg et al (1995)
supra), aunque el esclerotoma se origina desde células
somíticas en posiciones más cercanas a la notocorda. Se obtuvieron
resultados similares en el pez cebra, donde altas concentraciones de
Hedgehog inducen el marcador miotomal y reprimen la expresión génica
esclerotomal (Hammerschmidt et al. (1996) supra). En
contraste con los amniotas, sin embargo, estas observaciones son
consistentes con la arquitectura del embrión del pez, como aquí, el
miotoma es el componente predominante y más axial de los somites.
Así, la modulación de la señalización Shh y la adquisición de
nuevos factores de señalización podría haber modificado la
estructura del somita durante la evolución de los vertebrados.
En los brotes de los miembros de los vertebrados,
un subconjunto de células mesenquimales posteriores, la "Zona de
actividad polarizante" (ZAP), regula la identidad digital
anteroposterior (revisado en Honig, L.S. (1981) Nature
291:72-73). La expresión ectópica de la Shh o
la aplicación de cadenas insertadas en el péptido Shh imita
el efecto de los injertos ZAP anteriores, generando una duplicación
de imagen de espejo de los dígitos (Chang et al (1994)
supra; Lopez-Martinez et al. (1995)
supra; Riddle et al. (1993) supra) (Fig. 2g).
Así, la identidad digital parece depender principalmente de la
concentración de Shh, aunque es posible que otras señales
puedan a transmitir esta información sobre las distancias
sustanciales que parecen ser requeridas para el patronaje AP
(100-150 \mum). Similar a la interacción de HH y
DPP en los discos imaginales de Drosophila, el Shh
activa la expresión de Bmp2 en el brote de los miembros de
los vertebrados (Francis, P.H. et al. (1994)
Development 120:209-21 8), un homólogo del
dpp. Sin embargo, a diferencia del DPP en Drosophila,
Bmp2 falla al imitar el efecto polarizante de Shh sobre
la aplicación ectópica en el brote de miembros del polluelo (Francis
et al. (1994) supra). Además del patronaje
anteroposterior, el Shh también parece estar involucrado en
la regulación de la extensión proximodistal de los miembros mediante
la inducción de la síntesis del factor de crecimiento fibroblasto
FGF4 en la cresta ectodérmica apical posterior (Laufer, E. et
al. (1994) Cell 79:993-1003; Niswander,
L. et al.(1994) Nature
371:609-612).
La cercana relación entre las proteínas Hedgehog
y BMPs parece haberse conservado en muchos, pero probablemente no en
todos los sitios de la expresión del Hedgehog en vertebrados.
Por ejemplo, en el intestino posterior del pollo, Shh se ha
mostrado como inductor de la expresión de Bmp4, otro homólogo
dpp vertebrado (Roberts, Di. et al. (1995)
Development 121:3163-3174). Además,
Shh y Bmp2, 4, ó 6 muestran una sorprendente
correlación en su expresión en células epiteliales y mesenquimales
del estómago, el sistema urogenital, el pulmón, las raíces de los
dientes y los folículos pilosos (Bitgood, M.J. y McMahon, A.P.
(1995) Dev Biol. 172:126-138). Además,
Ihh, uno de los otros dos genes Hedgehog del ratón, es
expresado adyacentemente a las células que expresan Bmp en la
tripa y el cartílago en desarrollo (Bitgood y McMahon (1995)
supra).
Una reciente evidencia sugiere un modelo en el
que Ihh juega un papel crucial en la regulación del
desarrollo condrogénico (Roberts et al. (1995) supra).
Durante la formación del cartílago, los condrocitos se desarrollan
desde un estado proliferativo mediante un estado intermedio,
prehipertrófico hasta condrocitos hipertróficos diferenciados.
Ihh se expresa en los condrocitos prehipertróficos e inicia
una cascada de señalización que lleva al bloqueo de la
diferenciación de los condrocitos. Su blanco directo es el
pericondrio alrededor del dominio de expresión del Ihh, el
cuál responde mediante la expresión de Gli y Patched
(Ptc), blancos transcripcionales de las señales Hedgehog
(mirar abajo). Muy probablemente, esto lleva a una señalización
secundaria que resulta en la síntesis de la proteína relacionada a
la hormona paratiroide (PTHrP) en el pericondrio periarticular.
PTHrP por sí misma emite señales de vuelta a los condrocitos
prehipertróficos, bloqueando su mayor diferenciación. Al mismo
tiempo, PTHrP reprime la expresión de Ihh, de ese modo se
forma un lazo de retroalimentación negativa que modula la tasa de
diferenciación de los condrocitos.
Patched fue originalmente identificado en
Drosophila como un gen de polaridad de segmento, uno de un grupo de
genes desarrolladores que afectan a la diferenciación celular dentro
de los segmentos individuales que tiene lugar en series homólogas a
lo largo del eje anterior-posterior del embrión.
Ver Hooper, J.E. et al. (1989) Cell 59:751; y Nakano,
Y. et al. (1989) Nature 341:508. Los patrones de
expresión del homólogo vertebrado de patched sugieren su
implicación en el desarrollo del tubo neural, el esqueleto, los
miembros, la estructura cráneo-facial, y la
piel.
Estudios genéticos y funcionales demuestran que
el patched es parte de la cascada de señalización hedgehog,
una vía conservada evolutivamente que regula la expresión de un
número de genes cascada. Ver Perrimon, N. (1995) Cell 80:517;
y Perrimon, N. (1996) Cell 86:513. Patched participa
en la represión transcripcional constitutiva de los genes diana; su
efecto se opone al de una glicoproteína secretada, codificada por el
hedgehog, o un homólogo vertebrado, el cuál induce la activación
transcripcional. Los genes bajo el control de esta vía incluyen
miembros de las familias Wnt y TGF-beta.
Las proteínas Patched poseen dos grandes
dominios extracelulares, doce segmentos transmembrana, y diversos
segmentos citoplasmáticos. Ver Hooper, supra; Nakano,
supra; Johnson, R.LL et al. (1996) Science 272:1668; y
Hahn, H. et al. (1996) Cell 85:841. El papel
bioquímico del patched en la vía de señalización del
hedgehog no es claro. Sin embargo, se ha informado de una
interacción directa con la proteína hedgehog (Chen, Y. et al.
(1996) Cell 87:553), y patched podría participar en
un complejo receptor hedgehog junto con otra proteína
transmembrana codificada por el gen smoothened. Ver Perrimon,
supra; y Chen, supra.
El homólogo humano del patched fue
recientemente clonado y mapeado al cromosoma 9g22.3. Ver Johnson,
supra; y Hahn, supra. Esta región ha sido implicada en
la síndrome de Nevo de células basales (BCNS), que se caracteriza
por anormalidades en el desarrollo incluyendo alteraciones de
costilla y cráneo-faciales, anormalidades de las
manos y pies, y espina bífida.
BCNS también predispone a múltiples tipos de
tumores, los más frecuentes son carcinomas de células basales (CBC)
que tienen lugar en muchas localizaciones en el cuerpo y aparecen en
las primeras dos décadas de vida. La mayoría de los casos de CBC,
sin embargo, no están relacionados con el síndrome y se manifiestan
esporádicamente en pequeños números en lugares expuestos al sol en
gente de mediana edad o mayor de ascendencia
Norte-europea.
Recientes estudios en CBC relacionados con BCNS y
CBC esporádicos sugieren que una pérdida funcional de los dos alelos
del patched lleva al desarrollo de CBC. Ver Johnson,
supra Hahn, supra; y Gailani, M.R. et al.
(1996) Nature Genetics 14:78. Deleciones de un solo alelo del
cromosoma 9q22.3 ocurren frecuentemente tanto en CBC esporádicos
como en hereditarios. Análisis relacionados revelaron que el alelo
heredado defectuoso era conservado y el alelo normal se perdía en
tumores de pacientes con BCNS.
Los tumores esporádicos también demostraron un
pérdida de los dos alelos del patched. De doce tumores en los
que se identifican mutaciones del patched con un ensayo de
polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP), nueve
tenían deleción cromosómica del segundo alelo y los otros tres
tenían mutaciones inactivantes en ambos alelos (Gailani,
supra). Las alteraciones no ocurrían en la correspondiente
línea germinal del DNA.
La mayoría de las mutaciones identificadas
resultaron en codones stop prematuros o desplazamiento de marcos.
Lench, et al., Hum. Genet. 1997 Oct;
100(5.-6): 497-502. Sin embargo, algunas
eran mutaciones puntuales que llevaban a sustituciones de
aminoácidos tanto en dominios extracelulares como citoplasmáticos.
Estos sitios de mutación podrían indicar importancia funcional para
la interacción con proteínas extracelulares o con miembros
citoplasmáticos de la vía de señalización de cascada.
La implicación del patched en la inhibición de la
expresión génica y la ocurrencia de deleciones alélicas frecuentes
del patched en CBC soportan la teoría de la función supresora de
tumores de este gen. Su papel en la regulación de las familias
génicas conocidas por estar involucradas en la señalización celular
y comunicación intercelular proporciona un posible mecanismo de
supresión de tumores.
La presente invención usa métodos disponibles y
composiciones para modular la diferenciación o la proliferación de
una célula.
En ciertas realizaciones, los compuestos útiles
en la presente invención pueden representarse por la fórmula general
(II).
Fórmula
II
en donde, cuando la valencia y la
estabilidad lo
permiten,
Ar y Ar' representan independientemente anillos
arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos,
Y, independientemente para cada caso, está
ausente.
X, está seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-,
-S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)-, y un grupo
metileno opcionalmente sustituido por 1-2 grupos
tales como grupos alquilo inferior, alquenilo, o alquinilo,
M representa, independientemente para cada caso,
un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tales como -CH2-,
-CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc. o dos M juntos
representan eteno o etino sustituidos o no sustituidos, donde
algunos o todos los casos de M en M_{j} forman la totalidad o
parte de una estructura cíclica;
R representa, independientemente para cada caso,
H o sustituido o sin sustituir;
Cy' representa un arilo, heterociclilo,
heteroarilo o cicloalquilo, sustituidos o no sustituidos, incluyendo
grupos policíclicos;
j representa, independientemente para cada caso,
un número entero desde el 0 al 10, preferiblemente del 2 al 7; y
i representa, independientemente para cada caso,
un número entero del 0 al 5, preferiblemente del 0 al 2.
En ciertas realizaciones, M representa,
independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o
sin sustituir, tal como -CH_{2}-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-,
-C(=O)-, etc.
En ciertas realizaciones, Ar y Ar' representan
anillos fenilo, por ejemplo, no sustituidos o sustituidos por uno o
más grupos incluyendo heteroátomos tales como O, N, y S. En algunas
realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo fenilo.
En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representa un
anillo heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo,
pirimidilo, etc. En algunas realizaciones, Y y Ar' están unidos a Ar
en una relación meta y/o 1,3.
Y está ausente de todas las posiciones.
En ciertas realizaciones, Cy' es un arilo o
heteroarilo sustituido o sin sustituir. En algunas realizaciones,
Cy' está directamente unido a X. En algunas realizaciones, Cy' es un
anillo bicíclico o heteroarilo sustituido o sin sustituir,
preferiblemente los dos (bicíclico y heteroarilo), tales como
benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En
ciertas realizaciones, Cy' es un anillo arilo monocíclico o
heteroarilo sustituido al menos con un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir, es decir, formando un sistema biarilo.
En algunas realizaciones, Cy' incluye dos anillos arilo o
heteroarilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, el mismo o
diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por
ejemplo, para formar un sistema de anillo biarilo o bicíclico.
En ciertas realizaciones, X es seleccionado de
-C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
En algunas realizaciones, R representa H o un
alquilo inferior, por ejemplo, H o Me.
En ciertas realizaciones, NR_{2} representa una
amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con uno
o dos grupos alquilo inferiores, preferiblemente una amina primaria
o secundaria.
En algunas realizaciones, los sustituyentes en Ar
o Ar' son seleccionados entre halógeno, alquilo inferior, alquenilo
inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona,
aldehído, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, ácido,
sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido,
fosforilo, fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo,
-(CH_{2})_{p}alquenilo,
-(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo,
-(CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH,
-(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior,
-(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior,
-O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH,
-(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior,
-(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior,
-S(CH_{2})_{n}R,
-(CH_{2})_{p}
N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de las anteriores, donde p y n, individualmente para cada caso, representan números enteros desde el 0 hasta el 10, principalmente del 0 al 5.
N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de las anteriores, donde p y n, individualmente para cada caso, representan números enteros desde el 0 hasta el 10, principalmente del 0 al 5.
La presente invención también se refiere a una
preparación farmacéutica que consta de un método in vitro
para causar agonismo en la vía del hedgehog en una célula usando un
compuesto con la estructura de la Fórmula VIII:
Fórmula
VIII
en donde, cuando la valencia y la
estabilidad lo
permiten,
U representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir fusionado al anillo que contiene el
nitrógeno.;
V representa metileno,
1,1-etileno ó 1,1-propileno;
W representa S ó O, preferiblemente O;
X representa C=O, C=S, o SO_{2};
R_{3} representa, arilo, heteroarilo, alquilo
inferior, alquenilo inferior sustituido o sin sustituir, alquinilo
inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo,
heterociclilalquilo, aralquilo, o heteroaralquilo;
R_{4} representa, un aralquilo o alquilo
inferior sustituido o sin sustituir, tales como un fenetilo,
bencilo, o aminoalquilo, etc;
R_{5} representa, un arilo, heteroarilo,
aralquilo, o heteroaralquilo sustituido o sin sustituir, incluyendo
grupos aromáticos policíclicos o heteroaromáticos.
En ciertas realizaciones, U representa un anillo
fenilo fusionado con el anillo que contiene nitrógeno.
En algunas realizaciones, R_{3} es seleccionado
de un, arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior,
aralquilo, y heteroaralquilo sustituido o sin sustituir.
En algunas realizaciones, R_{4} es un grupo
alquilo inferior no sustituido, o es un grupo alquilo inferior
sustituido con una amina secundaria o terciaria.
En ciertas realizaciones, R_{5} es seleccionado
de un, fenilo o naftilo sustituido o sin sustituir, o es un grupo
diariloalquilo, como 2,2-difeniletilo,
difenilmetilo, etc.
Adicionalmente, compuestos que tienen la
estructura de la Fórmula IX pueden ser útiles en los compuestos
farmacéuticos, métodos in vitro y usos para la preparación de
un medicamento de la presente invención.
La presente invención también proporciona
compuestos de las fórmulas X y XI, detallados más adelante.
En ciertas realizaciones, un compuesto
independiente de Hedgehog útil en la presente invención, tal
como se ha descrito anteriormente, puede tener un EC_{50} para
inducir o aumentar una o más actividades hedgehog (como por ejemplo
la regulación del aumento de expresión de gli) de menos de
1000 nm, menos de 100 nm, menos de 10 nm, o incluso menos de 1 nm.
En ciertas realizaciones, un compuesto dependiente de
hedgehog útil en la presente invención, como se ha descrito
anteriormente, aumenta una o más actividades hedgehog (como
la regulación del aumento de expresión de gli) en al menos
uno, dos o incluso tres órdenes de magnitud.
Las figuras 1-31 representan
reacciones útiles para sintetizar compuestos de acuerdo con la
presente invención.
Las figuras 32 y 33 ilustran compuestos
representativos de acuerdo con la presente invención.
Las figuras 34a y 34b presentan resultados de los
ensayos informadores de la vía hedgehog usando compuestos de
la presente invención.
La figura 35 presenta resultados del ensayo que
muestran la regulación de la sobreexpresión de PTC y Gli por
agonistas del hedgehog de la presente invención.
Las figuras 36 y 37 representan la proliferación
incrementada de precursores neuronales cerebelares en presencia de
los agonistas en cuestión.
Las figuras 38A y B muestran los efectos de los
agonistas en cuestión en la curación de un nervio ciático roto
cuando se mide en un ensayo de control.
Las figuras 39A-D demuestran el
efecto de agonistas en cuestión en la curación de un nervio ciático
roto cuando se mide con un ensayo de extensión de dedo.
La figura 40 muestra los efectos de los agonistas
en cuestión en combinación con una pequeña pérdida de proteína
hedgehog en el pulmón, escápula, piel, y tejido
especializado en ratones en desarrollo.
La figura 41 presenta el efecto de los agonistas
dependientes añadiendo o no proteína hedgehog en páncreas,
riñón, piel, y tejido del corazón de ratones en desarrollo.
La figura 42 muestra el efecto de un agonista en
cuestión en la extremidad anterior de un ratón recién nacido.
La figura 43 presenta el efecto de un antagonista
dependiente en las extremidades anteriores de un ratón recién nacido
a diferentes concentraciones.
La figura 44 representa los efectos de un
agonista en cuestión en el desarrollo del tejido pulmonar.
La figura 45 muestra los efectos de un agonista
en cuestión en el desarrollo del tejido renal.
Figuras 46A y B muestran los efectos de los
agonistas dependientes en el tejido de la piel de ratón en presencia
y ausencia de proteína hedgehog.
Las figuras 47A y B comparan la actividad de los
agonistas en cuestión en células marcadoras humanas y de
ratón.
La figura 48 muestra la regulación de la
sobreexpresión de Gli en células HEPM tratadas con un
fragmento N-terminal modificado de Sonic hedgehog o
con un agonista en cuestión.
La presente invención se refiere al
descubrimiento de que las vías de transducción de señal reguladas
por hedgehog, patched (ptc), gli y/o smoothened pueden
ser moduladas, al menos en parte, por pequeñas moléculas. Sin querer
ligarse a ninguna teoría en particular, la activación de una vía
patched-smoothened a través de la alteración
de asociaciones de la superficie celular (tales como complejos)
puede ser el mecanismo por el cuál actúan estos agentes. Se cree que
la vía hedgehog está regulada negativamente por asociación
del patched y el smoothened, como por ejemplo en forma
de complejos de proteínas, la asociación de las cuáles alterada por
la unión del hedgehog al patched. Por lo tanto, la capacidad
de estos agentes para activar la hedgehog puede ser debida a
la capacidad de dichas moléculas para interactuar con o unirse a
patched o smoothened, para alterar de otra manera la
asociación de smoothened con patched, o al menos para
promover la capacidad de estas proteínas para activar una vía de
transducción mediada por señal hedgehog, ptc, y/o
smoothened. Este modo de acción, por ejemplo, la modulación
de una vía dependiente de smoothened, es para distinguirse de
los compuestos que modulan la vía hedgehog mediante la
activación directa de la vía AMPc, por ejemplo, uniéndose o
interactuando con PKA, adenilato ciclasa, AMPc fosfodiesterasa,
etc.
Ciertos agonistas hedgehog aquí revelados
modulan la actividad hedgehog en ausencia de la misma
proteína hedgehog, por ejemplo, los compuestos imitan la
actividad hedgehog, antes que suplementar o incrementar
meramente la actividad de la proteína hedgehog, por ejemplo,
promoviendo la unión de hedgehog a patched. Estos
compuestos son llamados aquí agonistas independientes de hedgehog y
solos pueden imitar el fenotipo o efecto resultante del tratamiento
hedgehog. Otros ciertos compuestos de la presente invención
aumentan la actividad de la proteína hedgehog, y requieren la
presencia o adición de proteína hedgehog para observar el
fenotipo o efecto resultante de la inducción hedgehog. Tales
agonistas dependientes de hedgehog pueden ser usados en
preparaciones o tratamientos terapéuticos que incluyan proteína
hedgehog, o pueden ser utilizados para incrementar la
actividad de la proteína hedgehog producida naturalmente por
las células o el tejido a ser tratado con el agonista. Los agonistas
hedgehog aquí revelados podrían inducir la disociación de un
complejo patched-smoothened o alterar
interacciones entre patched y smoothened, como por
ejemplo uniéndose a patched o a smoothened, y de esa
manera activando la vía hedgehog. En ciertas realizaciones ,
las composiciones y métodos de la presente invención emplean un
compuesto que actúa sobre uno o más componentes de la membrana
extracelular de una célula diana.
En algunas realizaciones, agonistas
hedgehog útiles en la presente inducen la regulación
transcripcional dependiente de hedgehog, tal como expresión
de los genes gli1 o ptc. Tales agonistas pueden así
inducir o incrementar la activación de la vía dependiente de
hedgehog como resultado de, por ejemplo, niveles aumentados
de proteína hedgehog.
Está, por tanto, específicamente contemplado que
estas pequeñas moléculas que modulan aspectos de la actividad de
transducción de señal del hedgehog, ptc, o smoothened
son asimismo capaces de promover la proliferación (u otras
consecuencias biológicas) en células que tienen una vía ptc
smo funcional. En realizaciones preferidas, los agonistas
dependientes son moléculas orgánicas que tienen un peso molecular
menor de 2500 amu, más preferiblemente menor que 1500 amu, e incluso
más preferiblemente menor de 750 amu, y son capaces de inducir o
aumentar al menos algunas de las actividades biológicas de las
proteínas hedgehog, preferiblemente específicamente en
células diana. La activación de la vía hedgehog por un
agonista hedgehog puede ser cuantificada, por ejemplo,
mediante la detección del incremento en la transcripción de
ptc o gli1 en presencia del agonista, relativo a un
control en ausencia del agonista. Por ejemplo, un incremento de al
menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, o incluso al menos un
50% podría ser indicativo de la activación de la vía hedgehog
por un compuesto test. En ciertas realizaciones, la actividad
agonista de los compuestos dependientes no es inhibida por el
anticuerpo hedgehog 5E1, pero es inhibida por jervina o un
antagonista con la fórmula:
Esta calidad puede ser cuantificada, por ejemplo,
determinando si el anticuerpo o antagonista induce a una disminución
de más del 50%, más del 20%, más del 10%, o incluso más del 5% de la
regulación de la sobreexpresión de ptc o
gli-1 inducida por el agonista en ausencia
del hedgehog, etc. En ciertas realizaciones, un compuesto
útil en la presente invención, tal y como se describe anteriormente,
podría tener un EC_{50} para inducir o aumentar una o más
actividades hedgehog (como por ejemplo la regulación de la
sobreexpresión de ptc o gli) de menos de unos 1000 nM,
menos de 100 nM, menos de 10 nM, o incluso menos de 1 nM. Las
secuencias codificantes para genes Gli humanos ejemplares
incluyen, por ejemplo, la secuencia génica
Gli-1 de entrada GenBank X07384 y la
secuencia génica Gli-2 de entrada GenBank
AB007298. Ver también Kinzler et al. Nature 1988, 332, 371.
El nivel de expresión de gli o ptc puede determinarse,
por ejemplo, midiendo el nivel de mRNA (transcripción) o el nivel de
proteína (traducción).
Así, los métodos de la presente invención
incluyen el uso de pequeñas moléculas que antagonizan la inhibición
ptc de la señalización hedgehog, por ejemplo mediante
la activación de smoothened o de componentes cascada del
camino de señal, en la regulación de la reparación y/o el
comportamiento funcional de un amplio rango de células, tejidos y
órganos. Por ejemplo, el método en cuestión tiene aplicaciones
terapéuticas y cosméticas que se extiende desde la regulación de los
tejidos neurales, formación y reparación de hueso y cartílago,
regulación de la espermatogénesis, regulación del músculo liso,
regulación del pulmón, hígado, órganos urogenitales (por ejemplo, la
vejiga), y otros órganos surgidos del intestino primitivo,
regulación de la función hematopoyética, regulación del crecimiento
de la piel y el pelo, etc. Además, los métodos en cuestión pueden
llevarse a cabo en células que son proporcionadas en cultivos
(in vitro), o en células de un animal completo (in
vivo). Ver, por ejemplo, las publicaciones del WO 95/18856 y WO
96/17924 (las especificaciones de las cuáles se han incorporado
expresamente aquí).
En una realización, el método en cuestión puede
ser para tratar células epiteliales. En general, una célula
epitelial puede ponerse en contacto con una gran cantidad de un
agonista hedgehog para inducir el crecimiento y/o la
formación de tejido epitelial. El método tratado puede llevarse a
cabo en células epiteliales las cuáles podrían estar tanto
dispersadas en un cultivo como en una parte de un tejido u órgano
intacto. Además, el método puede llevarse a cabo en células
provenientes de un cultivo (in vitro), o en células en un
animal completo (in vivo).
Los agonistas hedgehog de la presente
invención pueden usarse como parte de regímenes en el tratamiento de
desórdenes de, o reparación quirúrgica o estética de, por ejemplo
tejidos epiteliales como piel y órganos de la piel; tejidos corneal,
cristalino y otros tejidos oculares; membranas mucosas; y epitelio
periodontal. Los métodos y composiciones aquí reveladas facilitan el
tratamiento o prevención de variedad de tejidos epiteliales y
mucosos dañados. Por ejemplo, el método en cuestión puede usarse
para controlar los procesos de curación de heridas, como por ejemplo
podría ser deseable con cualquier operación que involucrara tejido
epitelial, así como operaciones dermatológicas o periodontales. Una
reparación quirúrgica ejemplar para la que agonistas hedgehog
pueden ser útiles incluye quemada severa y regeneración de la piel,
injertos de piel, heridas de presión, úlceras dérmicas, fisuras,
reducción de cicatrices post-operación, y colitis
ulcerosa.
En otro aspecto de la presente invención, un
agonista hedgehog puede ser usado para lograr el crecimiento
del pelo, como por ejemplo en el tratamiento de la alopecia mediante
el cual se potencia el crecimiento del cabello.
En otra realización preferida, el método tratado
puede usarse como parte de un régimen de tratamiento para
meduloblastoma maligno y otros tumores neuroectodermales malignos
del SNC primario.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona preparaciones farmacéuticas que contienen, como
principio activo, un agonista hedgehog, un antagonista
ptc, o un agonista smoothened tal como se describe
aquí, formulado en una cantidad suficiente para promover, in
vivo, la proliferación u otras consecuencias biológicas.
Los tratamientos en cuestión que usan agonistas
hedgehog, antagonistas patched, o agonistas
smoothened pueden ser efectivos tanto para sujetos humanos
como animales. Los sujetos animales para los que es aplicable la
invención se extienden tanto a animales domésticos y ganado, criados
tanto como animales de compañía como para propósitos comerciales.
Ejemplos son perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdo, y
cabras.
Por conveniencia, ciertos términos empleados en
laespecificación, ejemplos, y reivindicaciones adjuntas se han
recogido aquí.
La frase "modificación aberrante o mutación"
de un gen se refiere a aquellas lesiones genéticas como, por
ejemplo, deleciones, sustitución o adición de nucleótidos a un gen,
así como también grandes cambios de posición cromosómica del gen y/o
metilación anormal del gen. Asimismo, la no expresión de un gen hace
referencia a niveles aberrantes de transcripción del gen relativo a
aquellos niveles en una célula normal bajo condiciones similares,
así como también el splicing de tipo no salvaje del mRNA transcrito
a partir del gen.
"Heridas de quemadura" se refiere a casos
donde grandes áreas superficiales de la piel han sido extraídas o
perdidas de un individuo debido a calor y/o a agentes químicos.
El "corium" o "dermis" se refiere a la
capa de la piel más profunda de la epidermis, que consta de una base
densa de tejido conectivo vascular, y que contiene los nervios y
órganos terminales de la sensibilidad. Las raíces del pelo, y las
glándulas sebáceas y del sudor son estructuras de la epidermis que
están profundamente incrustadas en la dermis.
"Tejido dental" hace referencia al tejido en
la boca que es similar al tejido epitelial, por ejemplo el tejido de
laencía. El método de la presente invención es útil para tratar la
enfermedad periodontal.
"Úlceras dérmicas de la piel" se refiere a
lesiones en la piel causadas por pérdidas superficiales de tejido,
normalmente con inflamación. Las úlceras dérmicas de la piel que
pueden ser tratadas con el método de la presente invención incluyen
úlceras decúbitas, úlceras diabéticas, úlcera por estasis venoso y
úlceras arteriales. Las heridas decúbitas se refieren a úlceras
crónicas que resultan de la presión aplicada en áreas de la piel
durante extensos periodos de tiempo. Las heridas de este tipo son
llamadas a menudo úlceras de decúbito o úlceras de presión. Las
úlceras por estasis venoso resultan del estancamiento de la sangre u
otros fluidos de venas defectuosas. Las úlceras arteriales hacen
referencia a piel necrótica en las áreas alrededor de arterias que
tienen una pobre circulación de la sangre.
El término "ED_{50}" significa la dosis de
una droga que produce el 50% de su máxima respuesta o efecto.
Una "cantidad efectiva" de, por ejemplo, un
agonista hedgehog, respecto al método de tratamiento en
cuestión, se refiere a una cantidad de agonista en una preparación
que, cuando se aplica como parte de un régimen de dosis deseado
aporta aproximadamente, por ejemplo, un cambio en la tasa de
proliferación celular y/o en el estado de diferenciación de una
célula y/o en la tasa de supervivencia de una célula de acuerdo con
estándars clínicamente aceptables para el desorden a ser tratado o
el propósito cosmético.
Los términos "epitelio", "epitelial" y
"epithelium" hacen referencia a la membrana celular interna y a
las superficies externas del cuerpo (cutáneas, mucosas y serosas),
incluyendo las glándulas y otras estructuras derivadas de éstas, por
ejemplo, corneal, esofagal, epidermal, y células epiteliales del
folículo piloso. Otro tejido epitelial ejemplar incluye: el epitelio
olfativo, que es el epitelio pseudoestratificado que recubre la
región olfativa de la cavidad nasal, y que contiene los receptores
del sentido del olfato; el epitelio glandular, que se refiere al
epitelio compuesto de células secretoras; epitelio escamoso, que
hace referencia al epitelio compuesto por células aplanadas con
forma de disco. El término epithelium puede referirse también a
epitelio transicional, como el que se encuentra característicamente
cubriendo órganos huecos que están sujetos a grandes cambios
mecánicos debido a la contracción y distensión , por ejemplo, tejido
que representa una transición entre epitelio escamoso estratificado
y epitelio columnar.
El término "epitelialización" se refiere a
la curación mediante el crecimiento de tejido epitelial sobre una
superficie desnuda.
El término "glándula epidérmica" hace
referencia a una agregación de células asociada con la epidermis y
especializada en la secreción o excreción de materiales no
relacionados con sus necesidades metabólicas ordinarias. Por
ejemplo, las "glándulas sebáceas" son glándulas holocrinas en
el corium que secretan una sustancia oleosa y sebo. El término
"glándulas sudoríparas" se refiere a glándulas que segregan
sudor, situadas en el corium o tejido subcutáneo, abiertas por un
conducto a la superficie del cuerpo.
El término "epidermis" se refiere a la capa
de la piel más externa y no vascular, derivada del ectodermo
embrionario, variando su grosor entre 0,07-1,4 mm.
En las superficies palmar y plantar ésta comprende, de dentro hacia
fuera, cinco capas: capa basal compuesta de células columnares
ordenadas perpendicularmente; célula espinosa o capa espinosa
compuesta de células poliédricas aplanadas con protuberancias o
espinas; capa granular compuesta de células granulares aplanadas;
capa clara compuesta de diversas capas de células claras y
transparentes en las que el núcleo es indistinto o está ausente; y
capa córnea compuesta de células aplanadas, cornificadas y sin
núcleo. En la epidermis de la superficie general del cuerpo, la capa
clara está normalmente ausente.
Las "heridas escisionales" incluyen
desgarros, abrasiones, cortes, pinchazos o laceraciones en la capa
epitelial de la piel y pueden extenderse a la capa dérmica e incluso
a la grasa subcutánea y más allá. Las heridas escisionales pueden
ser el resultado de procedimientos quirúrgicos o de penetraciones
accidentales en la piel.
El "estado de crecimiento" de una célula se
refiere a la tasa de proliferación de la célula y/o al estado de
diferenciación de ésta. Un "estado de crecimiento alterado" es
un estado de crecimiento caracterizado por una tasa anormal de
proliferación, por ejemplo, una célula que presenta una tasa de
proliferación aumentada o disminuida relativa a una célula
normal.
El término "pelo" se refiere a una
estructura parecida a un hilo, especialmente la estructura
epidérmica especializada compuesta de queratina y que se desarrolla
a partir de un hundimiento de papila en el corium, producido sólo
por mamíferos y característico de este grupo de animales.
"Pelo" también hace referencia a la agregación de dichos pelos.
Un "folículo piloso" se refiere a una de las invaginaciones
tubulares de la epidermis que encierran los pelos, y desde las
cuáles crecen los pelos. Las "células epiteliales del folículo
piloso" se refieren a células epiteliales que envuelven la papila
dérmica en el folículo piloso, por ejemplo, células pedunculares,
células de la vaina del exterior de la raíz, células matriciales, y
células de la vaina del interior de la raíz. Tales células pueden
ser células no malignas normales, o células
transformadas/inmortalizadas.
El término "agonista hedgehog" se
refiere a un agente que potencia o recapitula la bioactividad del
hedgehog, como por ejemplo activar la transcripción de genes
diana. Los agonistas hedgehog preferidos pueden usarse para
imitar o aumentar la actividad o efecto de la proteína
hedgehog en un modo dependiente de smoothened. El
término "agonista hedgehog" como se usa aquí se refiere
no sólo a cualquier agente que pueda actuar mediante la activación
directa de la función normal de la proteína hedgehog, sino
también a cualquier agente que active la vía de señalización
hedgehog, y así inhiba la función de ptc.
El término "pérdida de función
hedgehog" se refiere a una modificación aberrante o
mutación de un gen ptc, un gen hedgehog, o un gen
smoothened, o una disminución (o pérdida) en el nivel de
expresión de dicho gen, que resulta en un fenotipo equivalente al de
una célula en contacto con un inhibidor hedgehog; por
ejemplo, inhibición aberrante de una vía hedgehog. La pérdida
de función puede incluir un incremente en la capacidad del producto
del gen ptc para regular el nivel de expresión de genes Ci,
por ejemplo, Glilo, Gli2, y GIi3. El término
"pérdida de función hedgehog" también es utilizado aquí
para referirse a cualquier fenotipo celular similar (por ejemplo,
mostrar una reducida proliferación) que ocurre debido a una
alteración en cualquier parte de la vía de transducción por señal
hedgehog, incluyendo, pero no limitada a, una modificación o
mutación del mismo hedgehog. Por ejemplo, una célula con una
tasa de proliferación anormalmente baja debido a la inactivación de
la vía de señalización hedgehog tendría un fenotipo "pérdida de
función hedgehog", incluso si el hedgehog no
estuviera mutado en esa célula.
Tal y como se usa aquí, "células
inmortalizadas" se refiere a células que han sido alteradas por
medios químicos y/o recombinantes de tal manera que las células
tienen la capacidad de crecer a través de un número indefinido de
divisiones en cultivo.
"Tejido epitelial interno" hace referencia
al tejido dentro del cuerpo que tiene características similares a la
capa epidérmica de la piel. Algunos ejemplos incluyen el
recubrimiento del intestino. El método de la presente invención es
útil para promover la curación de ciertos daños internos, por
ejemplo daños causados por cirugía.
El término "queratosis" se refiere a un
desorden de la proliferación de la piel caracterizado por
hiperplasia de la capa córnea (callosa) de la epidermis. Ejemplos de
desórdenes queratósicos incluyen queratosis folicular, queratosis
palmar y plantar, queratosis faríngea, queratosis pilar, y
queratosis actínica.
El término "LD_{50}" significa la dosis de
una droga que es letal en el 50% de los individuos testeados.
El término "uña" se refiere a la lámina
cutánea cobertora en la superficie dorsal del final distal de un
dedo de la mano o del pie.
El término "ganancia de función
patched" hace referencia a una modificación aberrante o
mutación de un gen ptc, o un aumento del nivel de expresión
del gen, que resulta en un fenotipo que equivale al de una célula en
contacto con un inhibidor hedgehog, por ejemplo, una desactivación
aberrante de una vía hedgehog. La ganancia de función puede incluir
un aumento de la capacidad del producto del gen ptc para
regular el nivel de expresión de genes Ci, por ejemplo, Glilo,
G112 y G1i3.
Un "paciente" o "sujeto" a ser tratado
por el método en cuestión puede ser tanto un humano o un animal no
humano.
El término "profármaco" está pensado para
abarcar componentes que, bajo condiciones fisiológicas, son
convertidos en los agentes terapéuticamente activos de la presente
invención. Un método común para fabricar un profármaco es incluir
fracciones seleccionadas que son hidrolizadas bajo condiciones
fisiológicas para poner de manifiesto la molécula deseada. En otras
realizaciones, el profármaco es transformado mediante una actividad
enzimática del animal huésped.
Tal como se usa aquí, "proliferar" y
"proliferación" se refiere a células que experimentan
mitosis.
A lo largo de toda esta aplicación, el término
"desorden proliferativo de la piel" se refiere a cualquier
enfermedad/desorden de la piel marcado por una proliferación
aberrante o no deseada del tejido cutáneo. Estas condiciones se
caracterizan típicamente por proliferación celular epidérmica o
diferenciación celular incompleta, e incluye, por ejemplo, ictiosis
ligada al cromosoma X, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis
alérgica de contacto, hiperqueratosis epidermolítica, y dermatitis
seborreica. Por ejemplo, la epidermodisplasia es una forma de
desarrollo defectuoso de la epidermis. Otro ejemplo es la
"epidermolisis", que hace referencia a un estado aflojado de la
epidermis con formación de ampollas y bullas tanto espontáneamente
como en el sitio del trauma.
El término "piel" se refiere a la cubierta
protectora externa del cuerpo, que consta del corium y la epidermis,
y se entiende que incluye las glándulas sudoríparas y sebáceas, así
como también las estructuras del folículo piloso. A lolargo de la
presente aplicación, el adjetivo "cutáneo" puede ser usado, y
debe ser entendido para referirse generalmente a cualidades de la
piel, cuando sean apropiadas al contexto en que son usadas.
El término "pequeña molécula" hace
referencia a un compuesto que tiene un peso molecular menor de 2500
amu, preferiblemente menor de 2000 amu, incluso más preferible si es
menor de 1500 amu, y aun mejor si es menor de 1000 amu, o lo más
preferible es que el peso molecular sea menor de 750 amu.
El término "pérdida de función
smoothened" se refiere a una modificación aberrante o
mutación de un gen smo, o a un nivel disminuido de expresión
del gen, que resulta en un fenotipo equivalente al de una célula en
contacto con un inhibidor hedgehog, por ejemplo, una
desactivación aberrante de una vía hedgehog. No queriendo
ligarse a ninguna teoría en particular, se observa que ptc
podría no señalizar directamente dentro de la célula, sino que
interactúa preferiblemente con smoothened, otra proteína de
límite de membrana localizada en la cascada de ptc en la
señalización hedgehog (Marigo et al., (1996)
Nature 384: 177-179). El gen smo es un
gen de polaridad de segmentos requerido para el correcto patronaje
de cada segmento Drosophila (Alcedo et al., (1996)
Cell 86: 221-232). Los hómologos humanos de
smo han sido identificados. Ver, por ejemplo, Stone et
al. (1996) Nature 384:129-134, y la
entrada en GenBank U84401. El gen smoothened codifica una
proteína integral de membrana con características de receptores
heterotriméricos acoplados a la proteína G; es decir, 7 regiones
transmembrana. Esta proteína muestra homología con la proteína
Frizzled (Fz) de Drosophila, un miembro de la vía
wingless. Originalmente se pensaba que smo codifica un
receptor de la señal Hh. Sin embargo, posteriormente esta sugerencia
fue rechazada, cuando se obtuvo evidencia de que ptc era el
receptor Hh. Las células que expresan Smo fallan al unirse a
Hh, indicando que smo no interactúa directamente con Hh
(Nusse, (1996) Nature 384: 119-120). Mejor
dicho, la unión del Sonic hedgehog (SHH) a su receptor,
PTCH, se cree que previene la inhibición normal por
PTCH de smoothened (SMO), una proteína de siete
dominios transmembrana.
El término "índice terapéutico" se refiere
al índice terapéutico de un fármaco definido como
LD_{50}/ED_{50}.
El término "acilamino" es conocido en la
materia y se refiere a un fragmento que puede representarse con la
fórmula general:
en donde R9 es como se ha definido
anteriormente, y R'11 representa un hidrógeno, un alquilo, un
alquenilo o -(CH_{2})_{m}-
R_{8}, en donde m y R8 son como se han definido anteriormente.
R_{8}, en donde m y R8 son como se han definido anteriormente.
Aquí, el término "grupo alifático" se
refiere a un grupo hidrocarburo alifático de cadena simple, cadena
ramificada o cíclico e incluye grupos alifáticos saturados e
insaturados, tales como un grupo alquilo, un grupo alquenilo, y un
grupo alquinilo.
Los términos "alquenilo" y "alquinilo"
hacen referencia a grupos alifáticos insaturados análogos en
longitud y posible sustitución a los alquilos descritos
anteriormente, pero que contienen al menos un enlace doble o
triplerespectivamente.
Los términos "alcoxilo" o "alcoxi" tal
y como se utilizan aquí se refieren a un grupo alquilo, como se ha
definido anteriormente, que tiene un radical oxígeno unido a él.
Grupos alcoxilo representativos incluyen metoxi, etoxi,propiloxi,
tert- butoxi y similares. Un "éter" son dos hidrocarburos
covalentemente unidos por un oxígeno. Por consiguiente, el
sustituyente de un alquilo que transforma este alquilo en un éter es
o equivale a un alcoxilo, tal y como los que pueden ser
representados por uno de los siguientes: -O-alquilo,
-O-alquenilo, -O-alquinilo,
-O-(CH_{2}-R_{8}, donde m y R_{8} se han
descrito con anterioridad.
El término "alquilo" se refiere al radical
de grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena
simple, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo
(alicíclico), grupos cicloalquilo alquilo sustituidos, y grupos
alquilo cicloalquilo sustituidos. En realizaciones preferidas, un
alquilo de cadena simple o ramificada tiene 30 o menos átomos de
carbono en su eje (por ejemplo, C_{1}-C_{30}
para cadenas simples, C_{3}-C_{30} para cadenas
ramificadas), y más preferiblemente 20 o menos. Asimismo, los
cicloalquilos preferidos tienen entre 3 y 10 átomos de carbono en su
estructura de anillo, y más preferiblemente tienen 5, 6 ó 7 carbonos
en su estructura anular.
Por otra parte, el término "alquilo" (o
"alquilo inferior") tal y como se usa a lo largo de toda la
especificación, ejemplos, y reivindicaciones está pensado para
incluir tanto "alquilos no sustituidos" como "alquiles
sustituidos", el último de los cuáles se refiere a fragmentos
alquilo que tienen sustituyentes reemplazando un hidrógeno en uno o
más carbonos del eje del hidrocarburo. Tales sustituyentes pueden
incluir, por ejemplo, un halógeno, un hidroxilo, un carbonilo (tales
como un carboxilo, un alcoxicarbonilo, un formilo, o un acilo), un
tiocarbonilo (tales como por ejemplo: un tioéster, un tioacetato, o
un tioformato), un alcoxilo, un fosforilo, un fosfato, un fosfonato,
un fosfinato, un amino, un amido, una amidina, una imina, un ciano,
un nitro, un ácido, un sulfhidrilo, un alquiltio, un sulfato, un
sulfonato, un sulfamoilo, un sulfonamido, un sulfonilo, un
heterociclilo, un aralquilo, o un fragmento aromático o
heteroaromático. Se entenderá por aquellos expertos en la materia
que los fragmentos sustituidos en la cadena hidrocarburo pueden ser
sustituidos ellos mismos, si fuera conveniente. Por ejemplo, los
sustituyentes de un alquilo sustituido pueden incluir formas
sustituidas y no sustituidas de grupos amino, ácido, imino, amido,
fosforilo (incluyendo fosfonato y fosfinato), sulfonilo (incluyendo
sulfato, sulfonamido, sulfamoilo y sulfonato), y grupos sililo, así
como también éteres, alquitios, carbonilos (incluyendo cetonas,
aldehídos, carboxilatos, y ésteres), -CF_{3}, -CN y similares.
Alquilos sustituidos ejemplares son descritos más adelante. Los
cicloalquilos pueden ser sustituidos además con alquilos,
alquenilos, alcoxis, alquiltios, aminoalquilos, alquilos carbonilo
sustituidos, -CF_{3}, -CN, y similares.
A no ser que el número de carbonos fuera
especificado de otra manera, un "alquilo inferior" tal y como
es usado aquí significa un grupo alquilo, como se define
anteriormente, pero que tiene de uno a diez carbonos, más
preferiblemente de uno a seis átomos de carbono en su estructura
principal. Asimismo, los "alquenilos inferiores" y
"alquiniles inferiores" tienen cadenas de longitud parecida. En
toda la aplicación, los grupos alquilo preferidos son los alquilos
inferiores. En realizaciones preferidas, un sustituyente denominado
aquí como alquilo es un alquilo inferior.
El término "alquiltio" se refiere a un grupo
alquilo, tal y como se ha definido anteriormente, que tiene un
radical sulfuro unido a él. En realizaciones preferentes, el
fragmento "alquiltio" está representado por uno de los
siguientes:
-S-alquilo, -S-alquenilo, -S-alquinilo, y -S-(CH_{2})m-R_{8}, donde m y R_{8} han sido definidos anteriormente. Grupos alquiltio representativos incluyen metilito, etiltio, y similares.
-S-alquilo, -S-alquenilo, -S-alquinilo, y -S-(CH_{2})m-R_{8}, donde m y R_{8} han sido definidos anteriormente. Grupos alquiltio representativos incluyen metilito, etiltio, y similares.
Los términos "amina" y "amino" son
conocidos en la materia y se refieren tanto a aminas no sustituidas
como sustituidas, por ejemplo, un fragmento que puederepresentarse
con la fórmula general:
en donde R_{9}, R_{10} y
R'_{10} cada uno independientemente representan un hidrógeno, un
alquilo, un alquenilo,
-(CH_{2})_{m}-R_{8}, o R_{9} y
R_{l0} unidos el uno al otro con el átomo N al que están ligados
completando un heterociclo que tiene de 4 a 8 átomos en la
estructura de anillo; R_{8} representa un arilo, un cicloalquilo,
un cicloalquenilo, un heterociclo o un policiclo; y m es cero o un
número entero en el intervalo de 1 a 8. En realizaciones preferidas,
sólo uno de R_{9} o R_{l0} puede ser un carbonilo, por ejemplo,
R_{9}, R_{l0} y el nitrógeno juntos no forman una imida. En
realizaciones aun más preferidas, el término 'amina' no abarca
amidas, por ejemplo, donde uno de R_{9} y R_{10} representa un
carbonilo. En realizaciones incluso más preferidas, R_{9} y
R_{10} (y opcionalmente R'_{10}) cada uno independientemente
representan un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, o
-(CH_{2})_{m}-R_{8}. Así, el término
"alquilamina" tal y como se usa aquí significa un grupo amino,
descrito anteriormente, que tiene un alquilo sustituido o sin
sustituir unido a él, es decir, al menos uno de R_{9} y R_{10}
es un grupo
alquilo.
El término "amido" es conocido en la materia
como un carbonilo amido sustituido e incluye un fragmento que puede
ser representado por la fórmula general:
en donde R_{9}, R_{l0} son tal
y como se han definido anteriormente. Realizaciones preferentes de
la amida no incluirían imidas que pueden ser
inestables.
El término "aralquilo", como se usa aquí, se
refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo (por
ejemplo, un grupo aromático o heteroaromático).
El término "arilo" tal y como se usa aquí
incluye grupos aromáticos de anillo simple de 5, 6, y 7 miembros
que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos, por ejemplo,
benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol,
pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares.
Estos grupos arilo que tienen heteroátomos en la estructura de
anillo podrían ser denomanidos también como "heterociclos
arilo" o "heteroaromáticos". El anillo aromático puede ser
sustituido en una o más posiciones del anillo con sustituyentes como
los descritos anteriormente, por ejemplo, halógeno, ácido, alquilo,
aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, alcoxilo,
amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato,
fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo,
sulfonamido, cetona, aldehído, éster, heterociclilo, fragmentos
aromáticos o heteroaromáticos, -CF_{3}, -CN, o similares. El
término "arilo" también incluye sistemas de anillo policíclicos
que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos
son comunes a dos anillos adyacentes (los anillos son "anillos
fusionados") donde al menos uno de los anillos es aromático, por
ejemplo, los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos,
cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos y/o heterociclilos.
El término "carbociclo", tal como se usa
aquí, se refiere a un anillo aromático o no aromático en el que cada
átomo del anillo es carbono.
El término "carbonilo" es conocido en la
materia e incluye fragmentos como los que se pueden representar por
la fórmula general:
en donde X es un enlace o
representa un oxígeno o un azufre, y R_{11} representa un
hidrógeno, un alquilo, un alquenilo,
-(CH_{2})_{m}-R_{8} o una sal
farmacéutica aceptable, R'_{11} representa un hidrógeno, un
alquilo, un alquenilo o
-(CH_{2})_{m}-R_{8}, donde m y R_{8}
son como se han definido anteriormente. Cuando X es un oxígeno y
R_{11} o R'_{11} no son hidrógenos, la fórmula representa un
"éster". Cuando X es un oxígeno, y R_{11} es como se define
anteriormente, el fragmento se denomina aquí como grupo carboxilo, y
particularmente cuando R_{11} es un hidrógeno, la fórmula
representa un "ácido carboxílico". Cuando X es un oxígeno, y
R'_{11} es hidrógeno, la fórmula representa un "formato". En
general, cuando el átomo de oxígeno de la fórmula anterior es
reemplazado por un azufre, la fórmula representa un grupo
"tiocarbonilo". Cuando X es un azufre y R_{11} o R'_{11} no
son hidrógenos, la fórmula representa un "tioéster". Cuando X
es un azufre y R_{11} es hidrógeno, la fórmula representa un
"ácido tiocarboxílico". Cuando X es un azufre y R'_{11} es
hidrógeno, la fórmula representa un "tioformato". Por otro
lado, cuando X es un enlace, y R_{11} no es hidrógeno, la fórmula
anterior representa un grupo "cetona". Cuando X es un enlace, y
R_{11} es hidrógeno, la fórmula anterior representa un grupo
"aldehído".
El término "heteroátomo" tal y como se usa
aquí significa un átomo de cualquier elemento excepto carbono o
hidrógeno. Os heteroátomos preferibles son boro, nitrógeno, oxígeno,
fósforo, sulfuro y selenio.
El término "heterociclilo" o "grupo
heterocíclico" se refieren a estructuras de anillo de 3 a 10
miembros, más preferiblemente a anillos de 3 a 7 miembros, las
estructuras de anillo de los cuáles incluyen de uno a cuatro
heteroátomos. Los heterociclos pueden ser también policiclos. Los
grupos heterociclilo incluyen, por ejemplo, tiofeno, tiantreno,
furano, pirano, isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxatiino,
pirrolo, imidazolo, pirazolo, isotiazolo, isoxazolo, piridina,
pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindolo, indolo,
indazolo, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, fthalazina,
naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinnolina, pteridina,
carbazol, carbolino, fenantridina, acridina, pirimidina,
fenantrolina, fenazina, fenarsazina, fenotiazina, furazan,
fenoxaziria, pirrolidina, oxolano, tiolano, oxazolo, piperidina,
piperazina, morfolina, lactonas, lactamas tales como azetidinonas y
pirrolidinonas, sultamas, sultonas, y similares. El anillo
heterocíclico, puede ser sustituido en una o más posiciones por
sustituyentes como los descritos anteriormente, como por ejemplo,
halógeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo,
hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato,
fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio,
sulfonilo, cetona, aldehído, éster, un fragmento heterociclilo,
aromático o heteroaromático, -CF_{3}, -CN, o similares.
Tal y como se usa aquí, el término "nitro"
significa -NO_{2}; el término "halógeno" designa -F, -Cl,
-Br o -I; el término "sulfhidrilo" significa -SH; el término
"hidroxilo" significa -OH; y el término "sulfonilo"
significa -SO_{2}-.
Una "fosfonamidita" puede representarse con
la fórmula general:
--- Q_{2}
---
\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\para}{R _{48} }}--- O ---,
\hskip0.5cmo
\hskip0.5cm---Q_{2}---
\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\para}{R _{48} }}---OR_{46}
En donde R_{9} y R_{10} son como se define
anteriormente, Q_{2} representa O, S o N, y R_{48} representa
un alquilo inferior o un arilo, Q_{2} representa O, S ó N.
Una "fosforamidita" puede representarse por
la fórmula general:
--- Q_{2} ---
\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\dpara}{O}}--- O ---,
\hskip0.5cmo
\hskip0.5cm--- Q_{2} ---
\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\dpara}{O}}--- OR_{46}
en donde R_{9} y R_{10} son
como se definen anteriormente, y Q_{2} representa O, S o
N.
Un "fosforilo" puede ser representado en
general por la fórmula:
---
\melm{\delm{\para}{OR _{46} }}{P}{\uelm{\dpara}{Q _{1} }}---
\newpage
en donde Q_{1} representa S ó O, y R_{46}
representa hidrógeno, un alquilo inferior o un arilo. Cuando se usa
para sustituir, por ejemplo, un alquilo, el grupo fosforilo del
fosforilalquilo puede ser representado por la fórmula general:
--- Q_{2}
---
\melm{\delm{\para}{OR _{46} }}{P}{\uelm{\dpara}{Q _{1} }}--- O ---,
\hskip0.5cmo
\hskip0.5cm--- Q_{2} ---
\melm{\delm{\para}{OR _{46} }}{P}{\uelm{\dpara}{Q _{1} }}--- OR_{46}
en donde Q_{1} representa S ó O,
y cada R_{46} independientemente representa hidrógeno, un alquilo
inferior o un arilo, Q_{2} representa O, S ó N. Cuando Q_{1} es
un S, el fragmento fosforilo es un
"fosforotioato".
Los términos "policiclilo" o "grupo
policíclico" serefieren a dos o más anillos (por ejemplo,
cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos y/o
heterociclilos) en los que dos o más carbonos son comunes a dos
anillos adyacentes, por ejemplo, los anillos son "anillos
fusionados". Los anillos que están unidos a través de átomos no
adyacentes se denominan anillos "puente". Cada uno de los
anillos del policiclo puede ser sustituido por sustituyentes tales
como los descritos anteriormente, como por ejemplo, halógeno,
alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo,
amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato,
fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo,
cetona, aldehído, éster, un fragmento heterociclilo, aromático o
heteroaromático, -CF_{3}, -CN, o similares.
La frase "grupo protector" tal y como se usa
aquí significa sustituyentes temporales que protegen a un grupo
funcional potencialmente reactivo de transformaciones químicas no
deseadas. Ejemplos de dichos grupos protectores incluyen ésteres de
ácidos carboxílicos, éteres sililo de alcoholes, y acetales y
cetales de aldehídos y cetonas, respectivamente. El campo de la
química de los grupos protectores ha sido revisado (Greene, T.W.;
Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis,
^{2nd}ed.; Wiley: New York, 1991).
Un "selenoalquilo" se refiere a un grupo
alquilo que tiene un grupo seleno sustituido unido a él.
"Selenoéters" ejemplares que podrían ser sustituidos en el
alquilo son seleccionados de uno de los siguientes:
-Se-alquilo, -Se-alquenilo,
-Se-alquinilo, y -Se-(CH_{2})_{m}
R_{8}, m y R_{8} han sido definidos anteriormente.
Como se usa aquí, el término "sustituido"
está contemplado para incluir todos los sustituyentes permitidosde
compuestos orgánicos. En un amplio aspecto, los sustituyentes
permitidos incluyen sustituyentes de compuestos orgánicos cíclicos y
acíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y
heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos. Sustituyentes
ilustrativos incluyen, por ejemplo, aquellos descritos aquí
anteriormente. Los sustituyentes permitidos pueden ser uno o más y
el mismo o diferentes para compuestos orgánicos apropiados. Para los
propósitos de esta invención, los heteroátomos como el nitrógeno
podrían tener sustituyentes hidrógeno y/o cualquier sustituyente
permitido de los compuestos orgánicos aquí descritos que satisfagan
las valencias de los heteroátomos. Esta invención no está pensada
para ser limitada de ninguna manera por los sustituyentes permitidos
de compuestos orgánicos.
Se entiende que "sustitución" o
"sustituido con" incluye la cláusula implícita que dicha
sustitución es acorde con valencias permitidas del átomo sustituido
y del sustituyente, y que la sustitución da como resultado un
compuesto estable, por ejemplo, que no sufre transformaciones
espontáneamente tales como por reorganización, ciclación,
eliminación, etc.
El término "sulfamoilo" es conocido en la
materia e incluye un fragmento que puede representarse con la
fórmula general:
en la que R_{9} y R_{10} son
tal y como se ha definido
anteriormente.
El término "sulfato" es también conocido en
la materia e incluye un fragmento que puede ser representado por la
fórmula general:
--- O ---
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}--- OR_{41}
en la que R_{41} es como se ha
definido
anteriormente.
El término "sulfonamido" se conoce en la
materia e incluye un fragmento que puede representarse por la
fórmula general:
---
\delm{N}{\delm{\para}{R _{9} }}---
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}--- R'_{11}
en la que R_{9} y R'_{11} son
como se han definido con
anterioridad.
El término "sulfonato" es conocido en la
materia e incluye un fragmento que puede representarse con la
fórmula general:
---
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}--- OR_{41}
en la que R_{41} es un par de
electrones, hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, o
arilo.
Los términos "sulfóxido" o "sulfinilo",
tal y como se usa aquí, se refiere a un fragmento que puede ser
representado por la fórmula general:
---
\uelm{S}{\uelm{\dpara}{O}}--- R_{44}
en el que R_{44} es seleccionado
del grupo que consta de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo,
cicloalquilo, heterociclilo, aralquilo, o
arilo.
Pueden hacerse sustituciones análogas a grupos
alquenilos y alquinilos para producir, por ejemplo, aminoalquenilos,
aminoalquinilos, amidoalquenilos, amidoalquinilos, iminoalquenilos,
iminoalquinilos, tioalquenilos, tioalquinilos, alquenilos
carbonil-sustituidos o alquinilos
carbonil-sustituidos.
Tal y como se usa aquí, la definición de cada
expresión, por ejemplo, alquilo, m, n, etc., cuando aparece más de
una vez en alguna estructura, se entiende que es independiente de su
definición en cualquier parte de la misma estructura.
Los términos triflilo, tosilo, mesilo, y
nonaflilo son conocidos en la materia y se refieren a grupos
trifluorometanosulfonilo, p-toluenosulfonilo,
metanosulfonilo, y nonafluorobutanosulfonilo, respectivamente. Los
términos triflato, tosilato, mesilato, y nonaflato son también
conocidos en la materia y se refieren a grupos funcionales de
ésteres y moléculas que contienen los grupos
trifluorometanosulfonato, p-toluenosulfonato,
metanosulfonato, y nonafluorobutanosulfonato, respectivamente.
Las abreviaturas Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms
representan metilo, etilo, fenilo, trifluorometanosulfonilo,
nonafluorobutanosulfonilo, p-toluenosulfonilo y
metanosulfonilo, respectivamente. Un listado más exhaustivo de las
abreviaturas utilizadas habitualmente por los químicos orgánicos
hábiles en la materia aparece en el primer tema de cada volumen del
Journal of Organic Chemistry; este listado se presenta
típicamente en una tabla titulada Listado Estándar de
Abreviaturas (Standard List of Abbreviations). Las abreviaturas
contenidas en dicho listado, y todas las abreviaturas utilizadas por
los químicos orgánicos especialistas en la materia han sido
incorporadas aquí por referencia.
Ciertos compuestos de la presente invención
puedenexistir en particulares formas geométricas y
estereoisoméricas. La presente invención contempla todos los
dichocompuestos, incluyendo isómeros cis- y trans-, enantioisómeros
R- y S-, diastereómeros, (D)-isómeros,
(L)-isómeros, mezclas racémicas de éstos, y otras
mezclas de los mismos, que entren dentro del marco de las invención.
Pueden estar presentes átomos de carbono asimétricos adicionales en
un sustituyente tal como un grupo alquilo. Todos los dichos
isómeros, así como también las mezclas de éstos, se han pensado para
ser incluidos en esta invención.
Si, por ejemplo, se desea un enantiómero
particular de un compuesto de la presente invención, puede ser
preparado mediante síntesis asimétrica, o por derivación con un
auxiliar quiral, donde la mezcla diastereomérica resultante es
separada y el grupo auxiliar se rompe para proporcionar los
enantiómeros puros deseados. Alternativamente, cuando la molécula
contiene un grupo funcional básico, tal como amino, o un grupo
funcional acídico, como un carboxilo, las sales diastereoméricas
pueden ser formadas con un ácido o una base ópticamente activos
apropiados, seguido por la resolución de los diastereómeros así
formados por cristalización fraccional o medios cromatográficos bien
conocidos en la materia, y subsiguiente recuperación de los
enantiómeros puros.
Los equivalentes contemplados de los compuestos
descritos anteriormente incluyen compuestos que de otra manera
corresponden a éstos, y que tienen las mismas propiedades generales
que éstos (por ejemplo, la capacidad para activar la señalización
hedgehog), en donde se han hecho una o más variaciones
simples de sustituyentes, las cuáles no afectan adversamente la
eficacia del compuesto. En general, los compuestos de la presente
invención pueden prepararse mediante los métodos ilustrados en
esquemas de reacciones generales como, por ejemplo, el descrito más
adelante, o por modificaciones del mismo, usando materiales de
partida fácilmente obtenibles, reactivos y procedimientos de
síntesis convencionales. En estas reacciones, es posible también
usar variantes que son en ellas conocidos, pero no mencionadas
aquí.
Por própositos de esta invención, los elementos
químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los
Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed.,
1986-87, dentro de la cubierta. También por
propósitos de esta invención, el término "hidrocarburo" está
contemplado para incluir todos los compuestos permitidos que tienen
al menos un átomo hidrógeno y uno de carbono. En un amplio aspecto,
los hidrocarburos permitidos incluyen compuestos orgánicos acíclicos
y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y
heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos, los cuáles pueden estar
sustituidos o no sustituidos.
Como se describe con más detalle a continuación,
está contemplado que los métodos en cuestión pueden llevarse a cabo
usando una variedad de diferentes moléculas pequeñas que pueden ser
fácilmente identificadas, por ejemplo, por los ensayos de barrido de
fármacos como los que se describen aquí.
En ciertas realizaciones, compuestos útiles en la
presente invención podrían ser representados con la fórmula general
(II):
Fórmula
II
dónde, cuando la velencia y la
estabilidad lo
permiten,
Ar y Ar' independientemente representan anillos
arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos;
Y, independientemente para cada caso, está
ausente;
X, es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-,
-S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN), -P(=O)(OR)-, y un grupo
metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos
tales como grupos alquilo inferior, grupos alquenilo o grupos
alquinilo;
M representa, independientemente para cada caso,
ungrupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH2-,
-CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc., o dos M juntas representan eteno o etino sustituidos o no sustituidos, donde alguno o todos los casos de M en M_{j} forman toda o parte de una estructura cíclica;
-CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc., o dos M juntas representan eteno o etino sustituidos o no sustituidos, donde alguno o todos los casos de M en M_{j} forman toda o parte de una estructura cíclica;
R representa, independientemente para cada caso,
H o alquilo sustituido o sin sustituir;
Cy' representa un arilo, un heterociclilo, un
heteroarilo o un cicloalquilo sustituidos o no sustituidos,
incluyendo grupos policíclicos;
j representa, independientemente para cada caso,
un número entero del 0 al 10, preferiblemente entre 2 y 7; y
i representa, independientemente para cada caso,
un número entero del 0 al 5, preferentemente del 0 al 2.
En ciertas realizaciones, M representa,
independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o
sin sustituir, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-,
-C(=O)-, etc.
En ciertas realizaciones, Ar y Ar' representan
anillos fenilo, por ejemplo, no sustituidos o sustituidos con uno o
más grupos incluyendo heteroátomos tales como O, N y S. En ciertas
realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representan un anillo
fenilo. En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar y Ar'
representan un anillo heteroarilo, por ejemplo, un piridilo,
tiazolilo, tienilo, pirimidilo, etc. En ciertas realizaciones, Y y
Ar' están unidos a Ar en una relación meta y/o 1,3-.
Y está ausente de todas las posiciones.
En ciertas realizaciones, Cy' es un arilo o
heteroarilo sustituido o sin sustituir. En ciertas realizaciones,
Cy' está directamente unido a X. En ciertas realizaciones, Cy' es un
anillo bicíclico o heteroarilo sustituido o sin sustituir,
preferiblemente tanto bicíclico como heterocíclico, tal como por
ejemplo benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc.
En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo arilo monocíclico o
heteroarilo sustituido al menos con un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir, es decir, formando un sistema biarilo.
En ciertas realizaciones, Cy' incluye dos anillos arilo o
heteroarilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, los mismos o
diferentes, directamente conectado por uno o más enlaces, por
ejemplo, para formar un sistema de anillo biarilo o bicíclico.
En ciertas realizaciones, X es seleccionada de
-C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
En ciertas realizaciones, R representa un H o un
alquilo inferior, por ejemplo, H o Me.
En ciertas realizaciones, NR_{2} representa una
amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con uno
o dos grupos alquilo inferior, preferiblemente una amina primaria o
secundaria.
En ciertas realizaciones, sustituyentes en Ar o
Ar' son seleccionados de los siguientes: halógeno, alquilo inferior,
alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo,
cetona, aldehído, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido,
sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido,
fosforilo, fosfonato, fosfinato,
-(CH_{2})_{p}
alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo, -(CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior,
-(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR- alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de los anteriores, en donde p y n, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo, -(CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior,
-(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR- alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de los anteriores, en donde p y n, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
La presente invención también se refiere a una
preparación farmacéutica que consta de un método in vitro
para causar agonismo la vía del hedgehog en la célula usando el
compuesto que tiene la estructura de la Fórmula VIII:
Fórmula
VIII
en donde, cuando la valencia y la
estabilidad lo
permiten,
U representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir fusionado al anillo que contiene el
nitrógeno;
V representa un metileno,
1,1-etileno o 1,1-propileno;
W representa S ó O, preferentemente O;
X representa C=O, C=S, ó SO_{2};
R_{3} representa un, arilo, heteroarilo,
alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior,
carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo,
heterociclilalquilo, aralquilo, o heteroaralquilo sustituidos o no
sustituidos;
R_{4} representa, un aralquilo o alquilo
inferior sustituidos o no sustituidos, tales como un fenetilo,
benzilo, o aminoalquilo, etc;
R_{5} representa, un arilo, heteroarilo,
aralquilo, o heteroaralquilo, sustituidos o no sustituidos,
incluyendo grupos aromáticos policíclicos o heteroaromáticos.
En ciertas realizaciones, U representa un anillo
fenilo fusionado con el anillo que contiene nitrógeno.
En algunas realizaciones, R_{3} es seleccionado
de un, arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior,
aralquilo, y heteroaralquilo sustituidos o no sustituidos.
En algunas realizaciones, R_{4} es un grupo
alquilo inferior no sustituido, o es un grupo alquilo inferior
sustituido con una amina secundaria o terciaria.
En ciertas realizaciones, R_{5} es seleccionado
de un fenilo o naftilo sustituido o sin sustituir,, o es un grupo
diariloalquilo, como 2,2-difeniletilo,
difenilmetilo, etc.
La presente invención también se refiere a con
una preparación farmacéutica que consta de un método in vitro
para agudizar la vía del hedgehog en un compuesto en una célula
usando el compuesto que tiene la estructura de la Fórmula IX. La
invención también proporciona el uso de compuestos representados por
la fórmula general (IX) en la fabricación de un medicamento para
modular la proliferación o diferenciación de una célula en un
animal.
Fórmula
IX
en donde, cuando la valencia y la
estabilidad lo
permiten,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo (sustituido
o sin sustituir) arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo,
o un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y, independientemente para cada caso, está
ausente excepto en la secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar
donde está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S- o -Se-, si Z
no es un anillo, entonces Y unido a Z está ausente; X es
seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-,
-S(O)-, -C(=NCN)-, P(=O)(OR)-;
M representa, independientemente para cada caso,
un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como
-CH_{2}-,
-CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc.; R representa, independientemente para cada caso, H o un alquilo sustituido o sin sustituir;
-CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc.; R representa, independientemente para cada caso, H o un alquilo sustituido o sin sustituir;
i representa 0 para todos los casos, excepto en
la secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar,
donde i representa 1; y
k representa 0 para todos los casos, excepto en
la secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar,
donde k representa un número entero del 0 al 3.
En ciertas realizaciones, Ar representa un anillo
arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, por ejemplo, no
sustituido o sustituido con uno o más grupos incluyendo
opcionalmente heteroátomos tales como O, N, y S. En ciertas
realizaciones, al menos uno de Ar o Ar' representa un anillo
heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo,
pirimidilo, furanilo, etc. En ciertas realizaciones, los casos de Y
unido a Ar están dispuestos en una relación meta y/o 1,3.
En ciertas realizaciones, Y está ausente de todas
las posiciones. En ciertas realizaciones, la única actual casuística
de Y está unida a M_{k}. En realizaciones donde Y está presente en
una posición, i o k preferiblemente representa 2 en un M_{i/k}
adyacente si i/k=0 resultaría en dos casos de Y estando directamente
unidos el uno al otro, o un caso de Y estando unido a N. En ciertas
realizaciones, en donde dos casos de Y están unidos a M, al menos
uno de dichos casos de Y está ausente. En ciertas realizaciones, no
están presentes más de dos casos de Y.
Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o sin
sustituir. En ciertas realizaciones, Cy' está directamente unido a
X. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo bicíclico o heteroaril
sustituido o sin sustituir, preferentemente los dos tanto bíciclico
como heteroarilo, tales como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol,
benzopiridina, etc. En ciertas realizaciones, Cy' un anillo arilo
monocíclico o heteroarilo sustituido al menos con un anillo arilo o
heteroarilo sustituido o sin sustituir, es decir, formando un
sistema biarilo. En ciertas realizaciones, Cy' incluye dos anillos
arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, los
mismos o diferentes, directamente unidos por uno o más enlaces, por
ejemplo, para formar un sistema anular biarilo o bicíclico. En
ciertas realizaciones, Cy' representa un
benzo(b)tien-2-ilo
sustituido o sin sustituir.
En ciertas realizaciones, X es seleccionado de
-C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
Cy representa un anillo aromático carbocíclico o
heterocíclico sustituido o sin sustituir, es decir, incluyendo al
menos un átomo sp^{3} hibridado, y preferiblemente una pluralidad
de átomos sp^{3} hibridados. En ciertas realizaciones, Cy incluye
una amina dentro de los átomos del anillo o sobre un sustituyente
del anillo, por ejemplo, Cy es piridilo, imidazolilo, pirrolilo,
piperidilo, pirrolidilo, piperazilo, etc., y/o lleva un sustituyente
amino. Cy es un anillo de seis miembros directamente unido a N y
lleva un sustituyente amino en la cuarta posición del anillo
relativa a N, los sustituyentes N y amina podrían disponerse en
trans en el anillo.
En ciertas realizaciones, sustituyentes en Ar o
Z, en donde Z es un anillo arilo o heteroarilo, son seleccionados de
los siguientes: halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior,
arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído,
amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo,
sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, fosforilo,
fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo,
-(CH_{2})_{p}alquenilo,
-(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo,
-(CH_{2})_{p}aralquilo,
-(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, -O(CH_{2})nR, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})n_{R}, y formas protegidas de las anteriores, en donde n y p, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
-(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, -O(CH_{2})nR, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})n_{R}, y formas protegidas de las anteriores, en donde n y p, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
En ciertas realizaciones, Z está directamente
unido a Ar, o unido a Ar a través de una cadena de uno o dos átomos.
En ciertas realizaciones, Z-Y-M,
juntos, está ausente.
En ciertas realizaciones, compuestos útiles en la
presente invención podrían representarse por la fórmula general
(X):
Fórmula
X
en donde, cuando la valencia y la
estabilidad lo
permiten,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo, sustituido
o sin sustituir, arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo o
un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente siempre excepto en la secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar
donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o -Se-,
si Z no es un anillo, entonces Y unido a Z está ausente;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-,
-S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)-, y un
grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2
grupos tales como grupos alquilo inferior, alquenilo o
alquinilo;
R representa, independientemente para cada caso,
H o un alquilo sustituido o sin sustituir;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido
o sin sustituir, incluyendo grupos policíclicos;
M representa, independientemente para cada caso,
un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH_{2}-,
-CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O), etc.;
j representa, independientemente para cada caso,
un número entero del 2 al 10, preferiblemente del 2 al 7;
i representa, independientemente para cada caso,
un número entero del 0 al 5, preferiblemente del 0 al 2; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar,
donde k es un número entero del 0 al 3.
En ciertas realizaciones, NR_{2} representa una
amina primaria o secundaria o una amina terciaria sustituida con uno
o dos grupos alquilo inferior, grupos arilo o grupos aralquilo,
respectivamente, preferiblemente una amina primaria o
secundaria.
En ciertas realizaciones, M representa,
independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o
sin sustituir, tal como -CH_{2}-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-,
-C(=O), etc.
En ciertas realizaciones, Ar representa un anillo
arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, por ejemplo, no
sustituido o sustituido con uno o más grupos incluyendo
opcionalmente heteroátomos tales como O, N y S. En ciertas
realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo fenilo.
En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representa un
anillo heteroaril, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo,
pirimidilo, furanilo, etc. En ciertas realizaciones, los casos de Y
unido a Ar están dispuestos en una relación meta y/o 1,3.
En ciertas realizaciones, Y está ausente de todas
las posiciones. En ciertas realizaciones, el único caso actual de Y
está unido a M_{k}. En realizaciones donde Y está presente en una
posición, i ó k preferiblemente representan 2 en un M_{i/k}
adyacente si i/k=0 resultaría en dos casos de Y estando directamente
unidos el uno al otro, o un caso de Y estando unido a N. En ciertas
realizaciones, donde dos casos de Y están unidos a M, al menos uno
de dichos casos de Y está ausente. En ciertas realizaciones, no
están presentes más de dos casos de Y.
Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o sin
sustituir. En ciertas realizaciones, Cy' está directamente unido a
X. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo bicíclico o
heteroarilo sustituido o sin sustituir, preferentemente los dos
tanto bicíclico como heteroarilo, tales como benzotiofeno,
benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas
realizaciones, Cy' un anillo arilo monocíclico o heteroarilo
sustituido al menos con un anillo arilo o heteroarilo sustituido o
sin sustituir, es decir, formando un sistema biarilo. En ciertas
realizaciones, Cy' incluye dos anillos arilo o heteroarilo
sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes,
directamente conectado por uno o más enlaces, por ejemplo, para
formar un sistema anular biarilo o bicíclico. En ciertas
realizaciones, Cy' representa un
benzo(b)tien-2-il
sustituido o sin sustituir.
En ciertas realizaciones, X es seleccionado de
-C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
En ciertas realizaciones, sustituyentes en Ar o
Z, en donde Z es un anillo arilo o heteroarilo, son seleccionados de
los siguientes: halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior,
arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído,
amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo,
sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, fosforilo,
fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo,
-(CH_{2})_{p}alquenilo,
-(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo,
-(CH_{2})_{p}aralquilo,
-(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, -O(CH_{2})nR, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de las anteriores, en donde n y p, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
-(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, -O(CH_{2})nR, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de las anteriores, en donde n y p, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
En ciertas realizaciones, Z está directamente
unido a Ar, o unido a Ar a través de una cadena de uno o dos átomos.
En ciertas realizaciones, Z-Y-M,
juntos, está ausente.
En ciertas realizaciones, compuestos útiles en la
presente invención podrían representarse por la fórmula general
(XI):
Fórmula
XI
en donde, cuando la valencia y la
estabilidad lo
permiten,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo (sustituido
o sin sustituir) arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo, o
un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y, está ausente en todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar
donde está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S- o -Se-,
siempre que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está
ausente;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-,
-S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, P(=O)(OR)-;
M representa, independientemente para cada caso,
un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH_{2}-,
-CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc., o dos M juntos
representan eteno o etino sustituidos o no sustituidos;
R representa, independientemente para cada caso,
H o un alquilo sustituido o sin sustituir;
i representa 0 para todos los casos, excepto en
la secuencia
N-M_{i}-Y-Ar,
donde i es 1; y
k representa 0 para todos los casos, excepto en
la secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar,
donde k representa un número entero del 0 al 3.
En ciertas realizaciones, NR_{2} representa una
amina primaria o secundaria o una amina terciaria sustituida con uno
o dos grupos alquilo inferior, grupos arilo o grupos aralquilo,
respectivamente, preferiblemente una amina primaria o
secundaria.
En ciertas realizaciones, M representa,
independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o
sin sustituir, tal como -CH_{2}-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-,
-C(=O), etc.
En ciertas realizaciones, Ar y Z
independientemente representan anillos arilo o heteroarilo
sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, no sustituidos o
sustituidos con uno o más grupos incluyendo opcionalmente
heteroátomos como O, N, y S. En ciertas realizaciones, al menos uno
de Ar y Z representa un anillo fenilo. En ciertas realizaciones, al
menos uno de Ar y Z representa un anillo heteroarilo, por ejemplo,
un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, furanilo, etc. En
ciertas realizaciones, los casos de Y unido a Ar están dispuestos en
una relación meta y/o 1,3-.
En ciertas realizaciones, Y está ausente de todas
las posiciones. En ciertas realizaciones, la única actual casuística
de Y es unida a M_{k}. En materializaciones donde Y está presente
en una posición, i o k preferiblemente representan 2 en un M_{i/k}
adyacente si i/k=0 resultaría en dos casos de Y estando directamente
unido el uno al otro, o un caso de Y estando unido a N. En ciertas
realizaciones, donde dos casos de Y están unidos a M, al menos uno
de dichos casos de Y está ausente. En ciertas realizaciones, no
están presentes más de dos casos de Y.
Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o sin
sustituir. En ciertas realizaciones, Cy' está directamente unido a
X. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo bicíclico o heteroaril
sustituido o sin sustituir, preferentemente los dos tanto bíciclico
como heteroarilo, tales como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol,
benzopiridina, etc. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo arilo
monocíclico o heteroarilo sustituido al menos con un anillo arilo o
heteroarilo sustituido o sin sustituir, es decir, formando un
sistema biarilo. En ciertas realizaciones, Cy' incluye dos anillos
arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, el
mismo o diferente, directamente conectado por uno o más enlaces, por
ejemplo, para formar un sistema anular biaril o bicíclico. En
ciertas realizaciones, Cy' representa un
benzo(b)tien-2-il
sustituido o sin sustituir.
Cy representa un anillo aromático carbocíclico o
heterocíclico sustituido o sin sustituir, es decir, incluyendo al
menos un átomo sp^{3} hibridado, y preferiblemente una pluralidad
de átomos sp^{3} hibridados. Cy es un anillo de seis miembros
directamente unido a N y lleva un sustituyente amino en la cuarta
posición del anillo relativa a N. Los sustituyentes N y amina
podrían disponerse trans en el anillo.
En ciertas realizaciones, X es seleccionado de
-C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
En ciertas realizaciones, sustituyentes en Ar o
Z, donde Z es un anillo arilo o heteroarilo, son seleccionados de
los siguientes: halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior,
arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído,
amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo,
sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, fosforilo,
fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo,
-(CH_{2})_{p}alquenilo,
-(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo,
-(CH_{2})_{p}aralquilo,
-(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, -O(CH_{2})nR, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})n_{R}, y formas protegidas de las anteriores, donde n y p, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
-(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, -O(CH_{2})nR, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})n_{R}, y formas protegidas de las anteriores, donde n y p, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
En ciertas realizaciones, Z está directamente
unido a Ar, o unido a Ar a través de una cadena de uno o dos átomos.
En ciertas realizaciones, Z-Y-M,
juntos, está ausente.
En ciertas realizaciones, los agonistas en
cuestión pueden ser elegidos en base a su selectividad por la vía
hedgehog. Esta selectividad puede ser para la vía
hedgehog versus otras vías, o por selectividad entre
vías hedgehog particulares, por ejemplo,
ptc-1, ptc-2, etc.
En ciertas realizaciones preferidas, los
agonistas en estudio modulan la transducción por señal mediada
ptc-smo con un ED_{50} de 1 mM o menor, más
preferentemente de 1 \muM o menor, e incluso más preferiblemente
de 1 nM o menos. Para los agonistas hedgehog-dependientes,
los agonistas en cuestión aumentan la actividad de hedgehog
10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces.
En realizaciones particulares, la pequeña
molécula se escoge para ser utilizada porque ésta es más selectiva
para una isoforma patched sobre la siguiente, por ejemplo, 10
veces más, y más preferiblemente al menos 100 o incluso 1000 veces
más selectiva para una ruta patched (ptc-1,
ptc-2) sobre otra.
En ciertas realizaciones, un compuesto que es un
agonista de la vía hedgehog es escogido selectivamente para
agudizar la actividad hedgehog sobre protein kinasas con
excepción de PKA, tales como PKC, por ejemplo, el compuesto modula
la actividad de la vía PKA/hedgehog al menos un orden de
magnitud más fuertemente que éste modula la actividad de otra
protein quinasa, preferentemente al menos dos órdenes de magnitud
más fuertemente, incluso más preferiblemente al menos tres órdenes
de magnitud más fuertemente. Así, por ejemplo, un activador
preferente de la vía hedgehog podría activar la actividad
hedgehog con una k_{i} de al menos un orden de magnitud
inferior que su k_{i} para la activación de PKC, preferiblemente
al menos dos órdenes de magnitud menor, incluso más preferentemente
al menos tres órdenes de magnitud menos. En ciertas realizaciones,
la k_{i} para la activación PKA/hedgehog es menor de 10 nM,
preferiblemente menor de 1 nM, incluso más preferentemente menor de
0,1 nM.
Los compuestos de la presente invención pueden
ser fácilmente preparados por técnicas estándar de síntesis
orgánica, por ejemplo, de acuerdo con los ejemplos mostrados en la
Ejemplificación siguiente. Por ejemplo, un compuesto en cuestión
puede ser preparado haciendo reaccionar un compuesto o un par de
compuestos designados A con un compuesto o par de compuestos
designados B y un compuesto designado C, como se muestra a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Similarmente, un compuesto designado C
anteriormente puede ser reaccionado con un compuesto o un par de
compuestos designados D y un compuesto o par de compuestos
designados E:
Alternativamente, un compuesto o par de
compuestos designados A anteriormente y un compuesto o par de
compuestos designado E arriba pueden reaccionar con un compuesto
designado F:
Combinaciones de compuestos como los indicados
anteriormente son preferiblemente hechos reaccionar unos con otros
en series, por ejemplo, dos compuestos son reaccionados juntos, el
producto se hace reaccionar con un tercer compuesto, etc., y los
compuestos pueden generalmente unirse en series en cualquier orden,
como bien entenderá un experto en la materia. En ciertas
realizaciones, grupos funcionales de uno o más compuestos pueden
requerir protección durante una o más reacciones, tal y como se
entiende en la materia, y cualquier grupo protector apropiado puede
emplearse para este propósito. Un experto en la materia puede
seleccionar rápidamente grupos protectores apropiados para un grupo
funcional particular y una reacción particular. Los pasos para la
elaboración pueden llevarse a cabo a cualquier tiempo para modificar
grupos funcionales o fragmentos en el producto de una reacción, por
ejemplo, para convertir N(R)_{2} = NH_{2} en
N(R)_{2} = NHR, por ejemplo, por sustitución
nucleofílica, alquilación reductiva, o cualquier otro método
apropiado.
En los compuestos designados A-F
anteriormente, los elementos M, X, Y, Z, Cy, Cy', Ar, i, k, R, etc.
son definidos como anteriormente (como será ampliado por la
descripción de más adelante), y R' independientemente para cada caso
representa H, un grupo protector, o un grupo reactivo lábil, tal
como un grupo trialquilsililo (por ejemplo, trimetilsililo), y R''
independientemente para cada caso representa 1) un grupo saliente,
tal como un halógeno (por ejemplo, F, CI, Br, o I), alquiltio,
ciano, alcoxi, o cualquier otro grupo capaz de ser reemplazado por
una amina nucleófila cuando está unido a X, 2) un grupo activable,
como por ejemplo OH, que puede ser activado por una agente
activante, tal como una carbodiimida (por ejemplo,
diisopropilcarbodiimida, diciclohexilcarbodiimida,
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida,
etc.), reactivos de base fosfórica (como BOP-Cl,
PyBROP, etc.), cloruro de oxalilo, fosgeno, trifosgeno, o cualquier
reactivo similar, para resultas en un reactivo intermedio que tenga
una susceptibilidad incrementada, relativa al compuesto donde
R''=OH, para unirse con una amina, o 3) X y R'' juntos representan
un grupo electrofílico capaz de reaccionar con una amina, tal como
un isocianato, u otro fragmentos reactivo similar.
Las varias subunidades designadas
A-F pueden ser combinadas utilizando cualquiera de
una plétora de reacciones bien conocidas por los expertos en la
materia, dependiendo de los fragmentos a ser unidos. Por ejemplo,
una amina, tal como una de los grupos NH_{2} indicados en las
subunidades A-F, puede unirse con un grupo alquilo
por alquilación reductiva (por ejemplo, el caso terminal de que M
sea un aldehído), por desplazamiento nucleofílico de un grupo
saliente (tal como un halógeno, sulfonato, u otro sustituyente
apropiado), por apertura nucleofílica de un epóxido, o por cualquier
otra reacción adecuada conocida por los expertos en la materia.
Similarmente, las aminas pueden ser unidas con derivados de ácidos
carboxílicos activados o derivados de ácidos tiocarboxílicos, por
ejemplo, preparados in situ a partir de un ácido carboxílico
o un ácido tiocarboxílico y un agente activante o preparados como
compuestos aislados tales como isocianatos, cloruros de ácido
carboxílico, etc., para proporcionar amidas, ureas, tioureas,
tioamidas, etc., con ésteres de cloroformato, cloruros de sulfonilo,
u otros compuestos similares para proporcionar uretanos,
sulfonamidas, etc., o con otros reactivos electrofílicos que forman
enlaces covalentes con una amina.
Los anillos arilo y/o heteroarilo pueden ser
fácilmente unidos directamente usando Stille, Suzuki, u otras
reacciones relacionadas, tales como reacciones de acoplamiento
mediadas por paladio. Los anillos arilo y/o heteroarilo pueden ser
unidos fácilmente a través de un heteroátomo, por ejemplo,
utilizando reacciones tales como la reacción Ullman, cualquiera de
las diversas reacciones mediadas por paladio desarrolladas por S.
Buchwald y otras, por sustitución aromática nucleofílica, u otras
reacciones semejantes. Similarmente, aminas, alcoholes, tioles, y
otros compuestos parecidos que contengan heteroátomos pueden ser
unidos a anillos arilo y/o heteroarilo usando reacciones mediadas
por paladio desarrolladas por S. Buchwald y otros, sustitución
aromática nucleofílica, etc. Se pueden preparar anillos arilo y/o
heteroarilo unidos por cadenas de hidrocarburos sustituidos o no
sustituidos, mediante Stille, Suzuki, Heck,
Friedel-Crafts, y otras reacciones como ya sabrán
los expertos en la materia.
Un listado de un número de reacciones sintéticas
comunes potencialmente útiles para preparar compuestos de la
presente invención están descritos con gran detalle más adelante y
en las Figuras 1-31. Los grupos variables incluidos
en las subunidades designadas A-F anteriormente
pueden variarse para corresponderse con cualquiera de las Fórmulas
II, VIII-XI sin apartarse de las aproximaciones de
síntesis general explicadas con anterioridad.
Similarmente, compuestos de la presente invención
pueden ser preparados uniendo un fragmento apropiado a una
estructura parcialmente montada. Por ejemplo, un compuesto de
Fórmula XI puede prepararse por cualquiera de los pasos
I-VI que se muestran en el esquema siguiente.
Similarmente, un compuesto de Fórmula X podría
prepararse por cualquiera de los pasos del esquema siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
En los esquemas anteriores, M, Cy, Ar, X,.Cy', Y,
Z, R, i, k, R', y R'' corresponden a su uso anterior y pueden
definirse más estrictamente tal y como se muestra en la descripción
de la Fórmula X o XI o corresponden a elementos de Fórmula II o
VIII, opcionalmente cuando es modificado por la descripción que
acompaña la Fórmula II o VIII.
Las reacciones apropiadas para llevar a cabo el
paso I incluyen las reacciones mediadas por paladio desarrolladas
por S. Buchwald y otros, sustitución aromática nucelofílica, unión
oxidativa, etc.
Las reacciones adecuadas para llevar a cabo el
paso II incluyen desplazamientos nucleofílicos de un grupo saliente
en M, alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado
electrofílico del ácido carboxílico/tiocarboxílico (ácido cloroso,
isocianato, isotiocianato, o un ácido carboxílico activado por
BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida, u otro reactivo
activador (tales como los que son comúnmente utilizados en la
materia de las asociaciones peptídicas), u otras reacciones
similares, incluyendo aquellas mostradas en detalle en ciertas de
las Figuras 1-31 y la descripción acompañante de
debajo, o, donde M y Y están ausentes, una asociación mediada por
paladio como la desarrollada por Buchwald y otros.
Las reacciones adecuadas para llevar a cabo los
pasos III o IV incluyen la reacción de Y-R' con un
derivado electrofílico de carbonilo o sulfonilo
(X-R'' = ácido cloroso, isocianato, isotiocianato,
cloroformato, sulfonilo cloroso, o un ácido activado por
BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida, u otro reactivo
activador (tales como los que se usan comúnmente en el arte de la
asociación de péptidos), u otras reacciones similares, tales como
las mostradas en detalle en ciertas de las Figuras
1-31 y la descripción acompañante de debajo.
Las reacciones adecuadas para llevar a cabo el
paso V incluyen desplazamiento nucleofílico de un grupo saliente,
alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado
electrofílico del ácido carboxílico/tiocarboxílico (ácido cloroso,
isocianato, isotiocianato, o un ácido carboxílico activado con
BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida, u otro reactivo
activador (tales como los que se utilizan comúnmente en la materia
de la asociación de péptidos)), u otras reacciones similares,
incluyendo aquellas mostradas en detalle en ciertas de las Figuras
1-31 y en la descripción acompañante de debajo.
Las reacciones adecuadas para llevar a cabo el
paso VI incluyen desplazamiento nucleofílico de un grupo saliente,
alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado
electrofílico del ácido carboxílico/tiocarboxílico (ácido cloroso,
isocianato, isotiocianato, o un ácido carboxílico activado con
BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida, u otro reactivo
activador (tales como los que se utilizan comúnmente en la materia
de la asociación de péptidos)), u otras reacciones similares,
incluyendo aquellas mostradas en detalle en ciertas de las Figuras
1-31 y en la descripción acompañante de debajo.
Las reacciones adecuadas para llevar a cabo el
paso VII donde Y se une con un caso presente de M incluyen
desplazamiento nucleofílico de un grupo saliente, alquilación
reductiva, reacción de la amina con un derivado electrofílico del
ácido carboxílico/tiocarboxílico (ácido cloroso, isocianato,
isotiocianato, o un ácido carboxílico activado con
BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida, u otro reactivo
activador (tales como los que se utilizan comúnmente en la materia
de la asociación de péptidos)), u otras reacciones similares,
incluyendo aquellas mostradas en detalle en ciertas de las Figuras
1-31 y en la descripción acompañante de debajo. En
materializaciones donde casos de M están ausentes, las reacciones de
asociación apropiadas incluyen reacciones mediadas por paladio
desarrolladas por S. Buchwald y otros, sustitución aromática
nucleofílica, asociación oxidativa, etc. En materializaciones donde
M e Y están ausentes y Z representa un anillo arilo o heteroarilo,
las reacciones apropiadas incluyen Stille, Suzuki, y otras
reacciones adecuadas para formar sistemas biarilo.
También están descritos métodos que además
incluyen reaccionando un compuesto de Fórmula II donde al menos una
R de NR_{2} representa H bajo condiciones que conviertan este
compuesto en un compuesto de la misma fórmula donde el caso
correspondiente de R representa un grupo alquilo inferior. Por
ejemplo, alquilaciones reductivas con un aldehído y un reactivo
reductor, alquilaciones nucleofílicas con un haluro de alquilo tal
como MeI, u otras reacciones similares se pueden emplear. En ciertas
realizaciones, tales reacciones pueden llevarse a cabo a través de
un intermediario sililado (por ejemplo, R=SiMe_{3}).
Un experto en la materia apreciará fácilmente que
los compuestos de la presente invención susceptibles de sintetizarse
de acuerdo con un amplio conjunto de protocolos bien conocidos en la
materia además de los descritos aquí, todos los cuáles han sido
pensados para entrar dentro ámbito de la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención está
relacionado con un método de modulación de un estado diferenciado,
supervivencia y/o proliferación de una célula, al poner en contacto
la célula con un agonista hedgehog de acuerdo con el método
presente y según garanticen las circunstancias.
Por ejemplo, la invención contempla que, a la luz
de los descubrimientos en la aparentemente amplia participación del
hedgehog, ptc y smoothened en la formación de
configuraciones de diferentes tejidos en vertebrados ordenadas en el
espacio, el presente método podría usarse como parte de un proceso
de generación y/o mantenimiento de un conjunto de tejidos de
vertebrados diferentes tanto in vitro como in vivo. El
agonista de hedgehog, ya sea inductivo o
anti-inductivo respecto a la proliferación o
diferenciación de un tejido concreto, puede ser cualquiera de las
preparaciones antes descritas, siendo así adecuado.
Por ejemplo, el presente método es aplicable a
técnicas de cultivo celular. Los sistemas de cultivo neuronal in
vitro se han mostrado como herramientas indispensables y
fundamentales para el estudio del desarrollo, así como la
identificación de factores neurotróficos como el factor de
crecimiento nervioso (NGF, del inglés Nerve Growth Factor), los
factores neurotróficos ciliares (CNTF, del inglés Ciliary
NeuroTrophic Factor), y el factor neurotrófico derivado del cerebro
(BDNF, del inglés Brain Derived Neurotrophic Factor). Un uso del
presente método puede estar en los cultivos de células madre
neuronales, como en el uso de dichos cultivos para la generación de
nuevas neuronas y glía. En tales realizaciones del presente método,
las células cultivadas pueden ponerse en contacto con un agonista de
hedgehog de la presente invención para alterar la proporción
de proliferación de las células madre neuronales en el cultivo y/o
alterar la tasa de diferenciación, o para mantener la integridad de
un cultivo de ciertas células neuronales diferenciadas
terminalmente. En una realización de ejemplo, el presente método
puede usarse para cultivar, por ejemplo, neuronas sensoras o, de
forma alternativa, neuronas motoras. Tales cultivos neuronales
pueden usarse como sistemas de ensayo convenientes, así como fuentes
de células implantables para tratamientos terapéuticos.
De acuerdo con la presente invención, grandes
cantidades de células progenitoras neurales no tumorigénicas pueden
perpetuarse in vitro y su tasa de proliferación y/o
diferenciación puede verse afectada por el contacto con los
agonistas de hedgehog de la presente invención. En general,
se proporciona un método que comprende los pasos de aislamiento de
células progenitoras neurales de un animal, perpetuando estas
células in vitro o in vivo, preferentemente en
presencia de factores de crecimiento, y regulando la diferenciación
de estas células en fenotipos neurales concretos, p.ej. neuronas y
glía, por contacto de las células con un agonista de
hedgehog.
Se cree que las células progenitoras están bajo
influencia inhibitoria tónica que mantiene los progenitores en un
estado contenido hasta que se requiere su diferenciación. Sin
embargo, recientemente se ha descubierto técnicas nuevas que
permiten que estas células proliferen, y al contrario que las
neuronas que están diferenciadas de forma terminal y por lo tanto
no-divisibles, pueden producirse en un número
ilimitado y son altamente adecuadas para trasplantes en huéspedes
heterólogos y autólogos con enfermedades neurodegenerativas.
Por "progenitor" se entiende una célula
madre oligopotente o multipotente que es capaz de dividirse sin
límite y, bajo unas condiciones concretas, puede producircélulas
hija que diferencian de forma terminal en por ejemplo neuronas y
glía. Estas células pueden usarse para trasplantarse en huéspedes
heterólogos o autólogos. Por heterólogo se entiende un huésped que
no sea el animal del que se han derivado originariamente las células
progenitoras. Por autólogo se entiende el mismo huésped del que se
han derivado originariamente las células.
Se puede obtener las células a partir de tejido
neural embrionario, post-natal, juvenil o adulto de
cualquier animal. Por cualquier animal se entiende cualquier animal
multicelular que contenga tejido nervioso. Más concretamente, se
entiende un pez, un reptil, un ave, un anfibio o un mamífero y
similares. Los donantes preferidos son mamíferos, especialmente
ratones y humanos.
En el caso de un donador animal heterólogo, puede
aplicarse la eutanasia al animal y extraerse las áreas del cerebro y
de interés específico utilizando procedimientos estériles. Las áreas
del cerebro de interés particular incluyen cualquier área de la que
se pueda obtener células progenitoras que sirva para restaurar la
función a un área degenerada del cerebro del huésped. Estas regiones
incluyen áreas del sistema nervioso central (SNC), incluyendo la
corteza cerebral, el cerebelo, el mesencéfalo, el tronco cerebral,
la médula espinal y el tejido ventricular, y las áreas del sistema
nervioso periférico (SNP), incluyendo el cuerpo carótido y la médula
adrenal. Más concretamente, estas áreas incluyen las regiones en los
ganglios basales, preferiblemente el cuerpo estriado, que consiste
en el caudado y el putamen, o varios grupos celulares como el globos
pallidus, el núcleo subtalámico, el núcleo basal que se encuentra
degenerado en los pacientes de la enfermedad de Alzheimer, o la
parte compacta de la sustancia negra que se encuentra degenerada en
los pacientes de la enfermedad de Parkinson.
Las células progenitoras neurales heterólogas
humanas pueden derivar de tejido fetal obtenido de un aborto
electivo, o de un donante de órganos post-natal,
juvenil o adulto. El tejido neural autólogo puede obtenerse por
biopsia, o a partir de pacientes a los que se les aplica
neurocirugía en la que se elimina tejido neural, en concreto durante
la cirugía por epilepsia, y más concretamente durante lobectomías
temporales e hipocampalectomías.
Se puede obtener células de tejidos donantes por
disociación de células individuales a partir de la matriz
extracelular del tejido en contacto. La disociación puede obtenerse
usando cualquier procedimiento conocido, incluyendo el tratamiento
con enzimas, como la tripsina, la colagenasa y los similares, o
usando métodos físicos de disociación como un instrumento romo o
picando con un escalpelo para permitir la obtención de tipos
celulares específicos a partir de un tejido. La disociación de
células fetales puede realizarse en un medio de cultivo tisular,
mientras que el medio preferido para la disociación de células
juveniles y adultas es el fluido espinal cerebral artificial
(aCSF). El aCSF común contiene NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2} 1,3
mM, CaCl_{2} 2 mM, NaHCO_{3} 6 mM y D-glucosa
10 mM. El aCSF bajo en Ca^{2+} contiene los mismos ingredientes
excepto por el MgCl_{2} a concentración de 3,2 mM y el CaCl_{2}
a una concentración de 0,1 mM.
Las células disociadas pueden colocarse en un
medio de cultivo conocido capaz de permitir el crecimiento celular,
incluyendo MEM, DMEM, RPMI, F-12 y similares. Estos
medios contienen suplementos necesarios para el metabolismo celular,
como la glutamina y otros aminoácidos, vitaminas, minerales y
proteínas útiles, como la transferrina y las similares. Los medios
también contienen antibióticos para evitar la contaminación con
levaduras, bacterias y hongos como la penicilina, la estreptomicina,
la gentamicina y similares. En algunos casos, el medio puede
contener suero derivado de bovino, equino, pollo y similares. Un
medio particularmente preferido para las células es una mezcla de
DMEM y F-12.
Las condiciones para el cultivo deberían ser
cercanas a las condiciones fisiológicas. El pH del medio de cultivo
debería ser cercano al pH fisiológico, preferiblemente entre pH
6-8, más preferiblemente cercano a pH 7, más
concretamente alrededor de pH 7,4. Las células deberían cultivarse a
una temperatura cercana a la temperatura fisiológica,
preferiblemente entre 30ºC-40ºC, más preferiblemente
entre 32ºC-38ºC, y preferentemente entre
35ºC-37ºC.
Las células pueden crecer en suspensión o en un
sustrato fijo, pero la proliferación de progenitores se realiza
preferiblemente en suspensión para generar grandes cantidades de
células por formación de "neurosferas" (ver, por ejemplo,
Reynolds et al. (1992) Science
255:1070-1709; y las publicaciones PCT WO93/01275,
WO94/09119, WO94/10292, y WO94/16718). En el caso de propagar (o
separar) células en suspensión, se agita bien los frascos y se deja
que las neurosferas se asienten en la esquina del fondo del frasco.
Las esferas se transfieren luego a un tubo de centrifugación de 50ml
y se centrifugan a baja velocidad. El medio se aspira, se
resuspenden las células en una pequeña cantidad de medio con factor
de crecimiento, y las células se disocian mecánicamente y e
resuspenden en alícuotas separadas de medio.
Las suspensiones celulares en medio de cultivo se
complementan con cualquier factor de crecimiento que permita la
proliferación de células progenitoras y el sembrado en cualquier
receptáculo capaz de contener células, aunque tal como se ha
especificado anteriormente, es preferible en frascos de cultivo o
frascos rotativos. Las células típicamente proliferan en
3-4 días en una incubadora a 37ºC y la proliferación
puede reiniciarse en cualquier momento después por disociación de
las células y resuspensión en medio fresco que contenga factores de
crecimiento.
En ausencia de sustrato, las células se despegan
del fondo del frasco y continúan proliferando en suspensión formando
una esfera hueca de células no diferenciadas. Después de
aproximadamente 3-10 días in vitro, se
alimenta cada 2-7 días a los grupos proliferativos
(neurosferas), y más concretamente cada 2-4 días por
centrifugación suave y resuspensión en un medio que contenga factor
de crecimiento.
Tras 6-7 días in vitro,
las células individuales en las neurosferas pueden separarse por
disociación física de las neurosferas con un instrumento romo, más
concretamente por titulación de las neurosferas con una pipeta. Las
células individuales a partir de las neurosferas disociadas son
suspendidas en medio de cultivo que contenga factores de
crecimiento, y la diferenciación de las células puede ser controlada
por preparación de cultivos en placas (o resuspensión) de las
células en presencia de un agonista hedgehog.
Para ilustrar mejor otros usos de los presentes
agonistas de hedgehog, se indica que el injerto intracerebral
surge como un enfoque adicional para terapias del sistema nervioso
central. Por ejemplo, un enfoque para la reparación de tejidos
cerebrales dañados incluye el trasplante de células a partir de
animales fetales o neonatos en cerebro adulto (Dunnett et al.
(1987) J Exp Biol 123:265-289; y Freund et
al. (1985) J neurosci 5:603-616). Las
neuronas fetales de varias regiones cerebrales pueden incorporarse
con éxito en el cerebro adulto, y tales injertos pueden aliviar los
defectos de conducta. Por ejemplo, el trastorno de movimiento
inducido por lesiones de las proyecciones dopaminérgicas en los
ganglios basales pueden evitarse por injertos de neuronas
dopaminérgicas embrionarias. Las funciones cognitivas complejas que
se ven alteradas tras lesiones del neocórtex pueden también
recuperarse parcialmente por injertos de células corticales
embrionarias. EL presente método puede usarse para regular el estado
de crecimiento en el cultivo, o donde se usa el tejido fetal,
especialmente las células madre neuronales, puede usase para regular
la tasa de diferenciación de las células madre.
Las células madre útiles en la presente invención
son generalmente conocidas. Por ejemplo, varias células de la cresta
neural han sido identificadas, algunas de las cuales son
multipotentes y es posible que representen células de la cresta
neural no asignadas, y otras de las cuales pueden generar un sólo
tipo de célula, como las neuronas sensoras, y es posible que
representen células progenitoras no programadas. El papel de los
agonistas de hedgehog utilizados en el presente método para
cultivar células madre puede ser el de regular la diferenciación del
progenitor no programado o el de regular las restricciones
posteriores del destino de desarrollo de una célula progenitora
programada para convertirse en una célula neuronal diferenciada de
forma terminal. Por ejemplo, el presente método puede usarse in
vitro para regular la diferenciación de las células de la cresta
neural en células gliales, células de schwann, células cromafin,
neuronas parasimpáticos o simpáticas colinérgicas, así como neuronas
serotonérgicas y peptidérgicas. Los agonistas hedgehog pueden
usarse solos, o pueden usarse en combinación con otros factores
neurotróficos que actúan para potenciar más concretamente un destino
de diferenciación en particular de la célula progenitora
neuronal.
Además de la implantación de células cultivadas
en presencia de los presentes agonistas de hedgehog, aún otro
aspecto de la presente invención concierne a la aplicación
terapéutica de un agonista de hedgehog para regular el estado
de crecimiento de neuronas y otras células neuronales tanto en el
sistema nervioso central como en el sistema nervioso periférico. La
capacidad de ptc, hedgehog, y smoothened para
regular la diferenciación neuronal durante el desarrollo del sistema
nervioso y también presumiblemente en el estado adulto indica que,
en ciertos casos, se espera que los presentes agonistas
hedgehog faciliten control de las neuronas adultas respecto
al mantenimiento, a la actuación funcional y al envejecimiento de
las células normales; procesos de reparación y regeneración en
células lesionadas química o mecánicamente; y el tratamiento de
degeneración en ciertas condiciones patológicas. A la luz de esto,
la presente invención contempla específicamente las aplicaciones del
método presente al protocolo de tratamiento de (prevención y/o
reducción de la gravedad de) condiciones neurológicas que derivan
de: (i daño agudo, subagudo o crónico del sistema nervioso,
incluyendo daños traumáticos, químicos, vasculares y déficits (como
la isquemia provocada por un derrame cerebral), junto con los daños
infecciosos/inflamatorios y inducidos por tumores; (ii)
envejecimiento del sistema nervioso incluyendo la enfermedad de
Alzheimer; (iii) enfermedades neurodegenerativas crónicas del
sistema nervioso, incluyendo la enfermedad de Parkinson, la corea de
Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y similares, así como
las degeneraciones espinocerebelares; y (iv) enfermedades
inmunológicas crónicas del sistema nervioso o que afecten al sistema
nervioso, incluyendo la esclerosis múltiple. Por ejemplo, en el caso
específico de la enfermedad de Parkinson, la intervención por
aumento de la actividad de hedgehog por un agonista puede
mejorar la supervivencia in vivo de neuronas dopaminérgicas
fetales o adultas, y así puede proporcionar un tratamiento más
efectivo para esta enfermedad. De esta manera, en una realización,
el presente método comprende la administración de un animal que
padece la enfermedad de Parkinson, o con riesgo de padecerla, una
cantidad de agonista de hedgehog efectiva para aumentar la
tasa de supervivencia de neuronas dopaminérgicas en el animal.
El presente método es aplicable a técnicas de
cultivo celular. Los sistemas de cultivo neuronal in vitro se
han mostrado como herramientas indispensables y fundamentales para
el estudio de desarrollo neural, así como la identificación de
factores neurotróficos como el factor de crecimiento nervioso (NGF),
los factores neurotróficos ciliares (CNTF), y el factor neurotrófico
derivado del cerebro (BDNF). Una vez que una célula neuronal se ha
diferenciado de forma terminal, ya no cambiará a otro tipo celular
diferenciado de forma terminal. Sin embargo, las células neuronales
pueden perder su estado diferenciado. Eso se observa comúnmente
cuando crecen en un cultivo a partir de tejido adulto, y cuando
forman un blastema durante la regeneración. El presente método
proporciona un método para asegurar un entorno restrictivo adecuado
para mantener las células dopaminérgicas y GABAérgicas en estados
diferenciados, y puede usarse, por ejemplo, en cultivos celulares
designados para evaluar las actividades específicas de otros
factores tróficos.
En tales realizaciones del método presente, se
puede poner en contacto un cultivo de células diferenciadas,
incluyendo células dopaminérgicas y/o GABAérgicas con un agonista de
hedgehog para mantener la integridad de un cultivo de células
neuronales diferenciadas de forma terminal al evitar la pérdida de
diferenciación. El método presente puede usarse en conjunción con
agentes que inducen a la diferenciación de precursores neuronales,
p.ej., células madre o progenitoras, en neuronas GABAérgicas o
dopaminérgicas.
Muchos trastornos neuronales están asociados con
la degeneración de poblaciones discretas de elementos neuronales y
pueden tratarse con regímenes terapéuticos que incluyen un agonista
de hedgehog. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer está
asociada con déficits en varios sistemas neurotransmisores, tanto
los que proyectan sobre el neocórtex y los que residen con el
córtex. Por ejemplo, se ha observado que el núcleo basal en
pacientes con enfermedad de Alzheimer tiene una profunda (75%)
pérdida de neuronas en comparación con controles de la misma edad.
Aunque la enfermedad de Alzheimer es claramente la forma de demencia
más común, muchos otros trastornos pueden producir demencia. Varias
de estas enfermedades degenerativas caracterizadas por la muerte de
las neuronas en varias partes del sistema nervioso central,
especialmente la corteza cerebral. Sin embargo, algunas formas de
demencia están asociadas a la degeneración del tálamo de la materia
blanca que subyace a la corteza cerebral. Aquí, la disfunción
cognitiva resulta del aislamiento de las áreas corticales por la
degeneración de eferentes y aferentes. La enfermedad de Huntington
implica la degeneración de neuronas colinérgicas corticales y
intraestriatales y neuronas GABAérgicas. La enfermedad de Pick es
una degeneración neuronal grave en el neocórtex de los lóbulos
temporal anterior y frontal, a veces acompañada por la muerte de
neuronas en el cuerpo estriado. El tratamiento de pacientes que
padecen tales condiciones degenerativas puede incluir la aplicación
de agonistas de hedgehog para controlar, por ejemplo, los
eventos de apoptosis y la diferenciación que producen la pérdida de
neuronas (p.ej. para mejorar la supervivencia de las neuronas
existentes), así como para promover la diferenciación y repoblación
por las células progenitoras en el área afectada.
Además de las demencias degenerativas inducidas,
se puede aplicar una preparación farmacéutica de uno o más de los
presentes agonistas de hedgehog oportunamente en el
tratamiento de trastornos neurodegenerativos que tienen
manifestaciones de temblores y movimientos involuntarios. La
enfermedad de Parkinson, por ejemplo, afecta primariamente las
estructuras sobcorticales y se caracteriza por la degeneración del
camino nigrostraiatal, el núcleo del rafe, locus cereleus y
el núcleo motor del vago. El balismo está típicamente asociado con
daños en el núcleo subtalámico, a menudo debidos a accidentes
vasculares agudos. También se incluye enfermedades neurogénicas y
miopáticas que afectan de forma última a la división somática del
sistema nervioso periférico y se manifiestan como trastornos
neuromusculares. Entre los ejemplos se incluye las atrofias crónicas
como la esclerosis lateral amiotrófica, el síndrome de
Guillain-Barre y la neuropatía periférica crónica,
así como otras enfermedades que pueden hacerse manifiestas por
parálisis bulbares progresivas o atrofias musculares espinales. El
presente método es útil para el tratamiento de trastornos del
cerebelo que tienen como resultado ataxia o hipotonía, como todas
aquellas lesiones en el cerebelo que producen trastornos en las
extremidades ipsilaterales a la lesión. Por ejemplo, una preparación
de agonista de hedgehog puede usarse para tratar una forma
restringida de degeneración cortical cerebelar que implique los
lóbulos anteriores (área de las piernas y vermis) como en los
pacientes alcohólicos comunes.
En una realización ilustrativa, el presente
método se usa para tratar esclerosis lateral amiotrófica. ALS es el
nombre que se le da al complejo de trastornos que implican neuronas
motoras inferiores y superiores. Los pacientes pueden presentar
atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva,
esclerosis lateral primaria, o una combinación de estas condiciones.
La mayor anormalidad patológica se caracteriza por una degeneración
selectiva y progresiva de las neuronas motoras inferiores en la
médula espinal y en las neuronas motoras superiores en el córtex
cerebral. La aplicación terapéutica de un agonista de
hedgehog puede usarse sola, o en conjunción con otros
factores neurotróficos como CNTF, BDNF o NGT para evitar y/o
invertir la degeneración de neuronas motoras en pacientes de
ALS.
Los agonistas de Hedgehog de la presente
invención pueden usarse también en el tratamiento de trastornos
autonómicos del sistema nervioso periférico, que incluyen los
trastornos que afectan la inervación del músculo liso y del tejido
endocrino (como el tejido glandular). Por ejemplo, el método
presente puede usarse para tratar taquicardia o arritmias cardíacas
atriales que pueden surgir a partir de condiciones degenerativas de
los nervios que inervan el músculo estriado del corazón.
Además, un papel potencial de algunos de los
agonistas hedgehog deriva del papel de las proteínas de
hedgehog en el desarrollo y mantenimiento de los procesos
dendríticos de las neuronas axonales. Los papeles potenciales de los
agonistas de hedgehog incluyen consecuentemente guías para
las proyecciones axonales y la capacidad para impulsar la
diferenciación o mantenimiento de las células inervadoras a sus
procesos axonales. De acuerdo con esto, las composiciones que
incluyen agonistas de hedgehog pueden usarse para apoyar la
supervivencia y reproyección de varios tipos de neuronas simpáticas
gangliónicas y neuronas sensoras así como neuronas motoras.
Concretamente, tales composiciones terapéuticas pueden ser útiles en
tratamientos diseñados para rescatar, por ejemplo, varias neuronas
de una muerte inducida por una lesión así como guiar la reproyección
de estas neuronas tras tal daño. Estas enfermedades incluyen, pero
no de forma limitada, infarto con trauma del SNC, infección (como
una infección viral con varicella-zoster),
enfermedad metabólica, deficiencia nutricional, agentes tóxicos
(como el tratamiento con cisplatina).
El presente método también puede usarse para la
generación de prótesis nerviosas para reparar daños nerviosos
centrales y periféricos. Concretamente, donde hay un axón aplastado
o gravemente dañado está intubado por el uso de un dispositivo de
prótesis, los agonistas de hedgehog pueden añadirse al
dispositivo prostético para regular la tasa de crecimiento y
regeneración de los procesos dendríticos. Los canales de guía
nerviosa de ejemplo se describen en las patentes estadounidenses
5.092.871 y 4.955.892.
En otra realización, el presente método puede
usarse en el tratamiento de transformaciones neoplásticas o
hiperplásticas como puede ocurrir en el sistema nervioso central.
Por ejemplo, los agonistas hedgehog pueden ser usados para
hacer que las células transformadas e vuelvan
post-mitóticas o apoptóticas. El presente método
puede, por lo tanto, usarse como parte de un tratamiento para, p.ej.
gliomas malignos, meningiomas, meduloblastomas, tumores
neuroectodérmicos y ependiomomas.
El presente método tiene una amplia aplicación
para el tratamiento o la profilaxis de trastornos que afectan a la
regulación de nervios periféricos, incluyendo neuronas ganglionares
periféricas, simpáticas, neuronas sensoras, y neuronas motoras. En
general, el método puede caracterizarse por incluir un paso de
administración a un animal de una cantidad de agonista de
hedgehog efectiva para alterar el estado de proliferación y/o
diferenciación de las células nerviosas periféricas tratadas. Tales
composiciones terapéuticas pueden ser útiles en tratamientos
diseñados para rescatar, por ejemplo, ganglios retinales, nervios
del oído interno y acústicos, y neuronas motoras, de muerte inducida
por lesión, así como para guiar la reproyección de estas neuronas
tras un daño tal. Estas enfermedades y condiciones incluyen, pero
sin limitación, el trauma químico o mecánico, la infección (como la
infección vírica con varicella-zoster), enfermedades
metabólicas como la diabetes, la deficiencia nutricional y los
agentes tóxicos (como el tratamiento de cisplatina). Los objetivos
del tratamiento en cada caso pueden ser: (1) eliminar la causa de la
enfermedad y (2) rebajar los síntomas.
La neuropatía periférica es una condición que
implica un daño en el final de los nervios en las manos y los pies.
La neuropatía periférica generalmente se refiere a un trastorno que
afecta a los nervios periféricos, normalmente manifestada como una
combinación de disfunciones motoras, sensoras, sensorimotoras o
neurales autonómicas. La gran variedad de morfologías que muestran
las neuropatías periféricas pueden atribuirse cada una de forma
única a una variedad igualmente amplia de causas. Por ejemplo, las
neuropatías periféricas pueden adquirirse genéticamente, pueden ser
el resultado de una enfermedad sistémica, o pueden estar inducidas
por un agente tóxico. Algunos agentes tóxicos que causan
neurotoxicidades son fármacos terapéuticos, agentes
antineoplásticos, contaminantes en la comida o medicinas, y
contaminantes ambientales e industriales.
Concretamente, entre los agentes
quimioterapéuticos que se sabe que causan neuropatías sensoriales
y/o motoras se incluye la vincristina, un fármaco antineoplásico
utilizado para tratar sarcomas y malignidades hematológicas. La
neurotoxicidad está relacionada con la dosis, y se muestra como una
neuropatía periférica y una motilidad intestinal reducida,
especialmente en los músculos distales de las manos y pies,
hipotensión postural y atonía de la bufeta urinaria. Se ha
documentado problemas similares con taxol y cisplatina (Mollman,
J.E., 1990, New Eng Tour MEd. 322:126-127), aunque
la neurotoxicidad derivada de la cisplatina puede ser aliviada con
factor de crecimiento nervioso (NGF) (Apfel, S.C. et al.,
1992, Annals of NEurology 31:76-80). Aunque la
neurotoxicidad es a veces reversible tras la eliminación del agente
neurotóxico, la recuperación puede ser un proceso muy lento (Legha,
S., 1986, Medical Toxicology 1:421-427; Olesen et
al., 1991, Drug Safety 6:302-314).
Existen varias neuropatías periféricas
hereditarias, como por ejemplo: enfermedad de Refsum,
abetalipoproteinemia, enfermedad de Tangier, enfermedad de Krabbe,
leucodistrofía metacromática, enfermedad de Fabry, síndrome de
Dejerine-Sottas, y otros. De todas las neuropatías
hereditarias, la más común es claramente la enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth.
La enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth (CMT) (también
conocida como atrofia muscular peroneal , o neuropatía sensorial
motora hereditaria (HMSN, del inglés hereditary motor sensory
neuropathy)) es el trastorno neurológico hereditario más común. Se
caracteriza por debilidad y atrofia, inicialmente de los músculos
peroneales, debido a la desmielización segmental de los nervios
periféricos y asociada a la degeneración de axones y células
corneales. La herencia dominante autonómica es usual, y los
trastornos degenerativos asociados del SNC, como la ataxia de
Friedreich, son también comunes.
Por un lado, el método de la presente invención
puede usarse en el tratamiento y mantenimiento de neuropatías
hereditarias. Este grupo de neuropatías se sabe que cada vez es más
reconocido debido a los dramáticos avances hechos en genética
molecular. Los síntomas de las diferentes neuropatías hereditarias
pueden variar ampliamente. Un común denominador es normalmente el
pronto inicio de entumecimiento leve y hormigueo en los pies que
progresan lentamente hasta incluir las piernas y las manos y luego
el resto de las extremidades superiores. La mayoría de neuropatías
hereditarias tienen un componente motor que consiste en debilidad
distal en las extremidades inferiores y superiores. La mayoría de
pacientes con neuropatías hereditarias tienen arco alto en los pies
o deformidades óseas. Los síntomas son progresivos muy lentamente y
la mayoría de los pacientes andan todavía durante dos décadas
después del inicio de sus síntomas.
El diagnóstico de una neuropatía hereditaria es
normalmente sugerido por el temprano inicio de los síntomas
neuropáticos, especialmente cuando también está presente un
historial familiar positivo. Antes de los recientes avances
genéticos, el diagnóstico se apoyaba en los descubrimientos típicos
de una ralentización marcada de los estudios de conducción nerviosa
en electromiografía y una biopsia nerviosa. Lo que se descubría
típicamente en una biopsia nerviosa es por ejemplo la presencia de
los llamados "bulbos de cebolla", lo que indica una recurrente
desmielización y una remielización de las fibras nerviosas. Con los
últimos avances genéticos puede diagnosticarse dos grandes
neuropatías hereditarias conocidas como la enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth y la neuropatía
hereditaria con responsabilidad en las parálisis de presión con un
simple análisis de sangre que identifica las diferentes mutaciones
responsables de estas dos entidades.
Las neuropatías hereditarias están causadas por
anormalidades genéticas que se transmiten de generación en
generación. Para muchas de estas, los defectos genéticos se conocen,
y existen pruebas para el diagnostico y la orientación prenatal.
Como se ha indicado anteriormente, el presente
método puede usarse como parte de un régimen terapéutico en el
tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie Tooth
(CMT). Este es un término general que se da a las neuropatías
sensorimotoras hereditarias. La CMT de tipo 1 (CMT 1) está asociada
a la desmielización o a la rotura de las capas de mielina. Se ha
identificado varias anormalidades diferentes. La CMT de tipo 1A está
normalmente causada por la duplicación de un gen que codifica para
la proteína de mielina llamada PMP-22, y la CMT de
tipo 1B está causada por una mutación en la proteína de mielina
llamada la glucoproteína Po. La CMTX es una neuropatía sensorimotora
hereditaria que afecta sobre todo a hombres. Está causada por la
mutación en un gen que codifica para una proteína llamada Conexina
32 en el cromosoma X.
En otra realización, el presente método puede
usarse en el tratamiento de neuropatías amiloidóticas familiares y
otras neuropatías hereditarias relacionadas. La neuropatía
amiloidótica se presenta normalmente con dolor, pérdida sensorial y
disfunción autonómica. Está causada por una mutación en una proteína
llamada Transtiretina, y tiene como resultado la deposición de la
proteína como amiloide en los nervios periféricos.
El presente método puede utilizarse en el
tratamiento de Porfirio hereditaria, que puede tener componentes de
neuropatía periférica. Aún otra neuropatía hereditaria para la que
los métodos presentes pueden utilizarse en su tratamiento es la
neuropatía sensorial hereditaria de tipo II (HSN II). Los métodos y
composiciones de la presente invención pueden también usarse en el
tratamiento mantenimiento de neuropatías adquiridas.
Por ejemplo, los agonistas de hedgehog
pueden usarse para evitar neuropatías diabéticas. La diabetes es la
causa más conocida comúnmente de neuropatía. Produce síntomas en
aproximadamente un 10% de la gente con diabetes. En la mayoría de
casos, la neuropatía es predominantemente sensorial, con dolor y
pérdida sensorial en las manos y pies. Pero algunos diabéticos
tienen mononeuritis o mononeuritis multiplex, que causa debilidad en
uno o más nervios, o amiyotropía o plexopatía lumbosacral, que causa
debilidad en las piernas.
Este método puede también usarse para el
tratamiento de neuropatías inmunomediadas. La función principal del
sistema inmunitario es la de proteger el cuerpo contra organismos
infecciosos que entran desde el exterior. En algunos casos, sin
embargo, el sistema inmunitario se vuelve contra el cuerpo y causa
enfermedades autoinmunes. El sistema inmunitario consta de varios
tipos de células linfocíticas sanguíneas, incluyendo los linfocitos
T, que también regulan la respuesta inmunitaria; y los linfocitos B
o las células plasmáticas, que segregan proteínas especializadas
llamadas "anticuerpos". A veces, por razones desconocidas, el
sistema inmunitario ataca por error ciertas partes del cuerpo como
los nenes periféricos. Esto es, una neuropatía periférica
"autoinmune". Existen varios tipos diferentes, en función de la
parte del nervio periférico que es atacado el tipo de la reacción
inmunitaria. A continuación se encuentran breves descripciones de
las neuropatías que están mediadas por el sistema inmunitario.
Por ejemplo, un agonista de hedgehog puede
usarse para tratar el síndrome de Guillain-Barre
(GBS), una neuropatía aguda que comienza repentinamente o
rápidamente. El síndrome de Guillain-Barre puede
progresar hasta la parálisis y el fallo respiratorio en días o
semanas tras el inicio. La neuropatía está causada por la
destrucción por parte del sistema inmunitario de las capas de
mielina de los nervios sensoriales y motores. A menudo está
precedida por una infección, vacunación o trauma, y se cree que es
lo que dispara la reacción autoinmune. La enfermedad es
auto-limitante, con recuperación espontánea en seis
a ocho semanas. Pero la recuperación es a menudo incompleta.
Otras neuropatías que empiezan de forma aguda, y
que pueden tratarse con el método de la presente invención, incluyen
la neuropatía motora aguda, la neuropatía sensorial aguda, y la
neuropatía autonómica aguda, en las que hay un ataque inmune contra
los nervios motores, sensoriales o autonómicos, respectivamente. El
síndrome de Miller-Fisher es otra variante en la que
hay una parálisis de mirada ocular, descoordinación y una forma de
andar tambaleante.
Aún otra neuropatía adquirida que puede ser
tratada con el presente método es la polineuropatía desmilinizante
inflamatoria crónica (CIDP, del inglés Chrnic Inflammatory
Demyelinating Polyneuropathy). Se cree que la CIDP es una forma
crónica y más indolente del síndrome de
Guillain-Barre. LA enfermedad progresa o bien con
ataques repetidos, llamados relapsos o en forma de pasos o
constante. Como en la GBS, parece haber una destrucción de las capas
de mielina por los anticuerpos y linfocitos T. Pero como no existe
una prueba específica para CIP, el diagnóstico se basa en las
características clínicas y de laboratorio.
Las polineuropatías crónicas con anticuerpos en
los nervios periféricos son todavía neuropatías periféricas para las
que los presentes métodos pueden usarse para tratarlas o evitarlas.
En algunos tipos de neuropatías crónicas, los anticuerpos para
componentes específicos de nervios han sido identificados. Entre
ellos se incluye la neuropatía desmielinizante asociada a
anticuerpos para la glucoproteína asociada a la mielina (MAG), la
neuropatía motora asociada con anticuerpos para los gangliósidos GM1
ó GD1a, y la neuropatía sensorial asociada con
anti-sulfatido o anticuerpos gangliósidos GD1b. Los
anticuerpos en estos casos se unen a los oligosacáridos o a las
moléculas del estilo de azúcares que están unidas a proteínas
(glucoproteínas) o lípidos (glucolípidos o gangliósidos) en los
nervios. Se sospecha que estos anticuerpos son responsables de las
neuropatías.
El presente método puede también usarse como
parte del plan terapéutico para tratar neuropatías asociadas a
vasculitis o inflamación de los vasos sanguíneos en nervios
periféricos. La neuropatía puede también estar causada por
vasculitis -una inflamación de los vasos sanguíneos en los nervios
periféricos. Produce pequeños "derrames cerebrales" a lo largo
de los nervios periféricos, y puede estar restringido a los nervios
o puede ser generalizado, incluir una erupción cutánea, o implicar
otros órganos. Varias enfermedades reumatológicas como la artritis
reumatoide, lupus, periarteritis nodosa, o síndrome de
Sjogren, están asociados con la vasculitis generalizada, que puede
también incluir los nervios periféricos. La vasculitis puede causar
polineuritis, mononeuritis, o mononeuritis multiplex, en función de
la distribución y gravedad de las lesiones.
En otra realización, el método de la presente
invención puede usarse para el tratamiento de plexitis braquial o
lumbosacral. El plexo braquial, que se encuentra bajo la axila,
contiene los nervios de la mano y el brazo. La plexitis braquial es
el resultado de la inflamación de este fascículo nervioso, y produce
debilidad y dolor en uno o ambos brazos. La plexitis umbosacral, que
tiene lugar en la pelvis, causa debilidad y dolor en las
piernas.
Los agonistas de hedgehog pueden también
ser adecuados para el uso en el tratamiento de neuropatías asociadas
a gammopatías monoclonales. En la gammopatía monoclonal, los clones
individuales de células B o células plasmáticas en la médula ósea o
los órganos linfoides, se expanden para formar tumores benignos o
malignos y segregan anticuerpos. "Monoclonal" es porque hay
clones individuales de anticuerpos y "gammopatía" es por las
gammaglobulinas, que es otro nombre para los anticuerpos. En algunos
casos, los anticuerpos reaccionan con componentes nerviosos; en
otros, los fragmentos de anticuerpos forman depósitos amiloides.
Aún otro aspecto de la presente invención está
relacionado con el uso del presente método en el tratamiento de
neuropatías asociadas con tumores o neoplasmas. La neuropatía puede
ser debida a la infiltración directa de nervios por células
tumorales o a efectos indirectos del tumor. En este último caso se
llama neuropatía paraneoplásica. Se han descrito varios tipos. Por
ejemplo, los presentes métodos pueden usarse para coordinar la
neuropatía sensorial asociada a cáncer de pulmón. Esta neuropatía
está asociada a anticuerpos para una proteína llamada Hu, que está
presente en las neuronas sensoriales de los nervios periféricos. De
forma similar, el presente método puede usarse para tratar
neuropatías asociadas con el mieloma múltiple. El mieloma múltiple
es un tumor óseo que está causado por las células plasmáticas
secretoras de anticuerpos en la médula ósea. El tumor está
constituido por un único clon de células plasmáticas, y los
anticuerpos que producen son idénticos o monoclonales. Algunas
personas con mieloma múltiple desarrollan polineuropatías
sensorimotoras con degeneración de axones en los nervios
periféricos. En otras realizaciones, el presente método puede usarse
para tratar neuropatías asociadas con la macroglobulemia de
Waldenstrom, la leucemia linfocítica crónica, o el linfoma de
células B. Estos son tumores causados por linfocitos B que secretan
anticuerpos en el bazo, médula ósea, o nódulos linfáticos. Estos
anticuerpos son monoclonales y frecuentemente reaccionan con los
componentes del nervio periférico, como MAG, GM1 o sulfátidos. En
otras realizaciones, los agonistas de hedgehog de la presente
invención pueden usarse como parte del protocolo terapéutico para el
tratamiento de pacientes con cánceres donde la neuropatía es una
consecuencia de la irradiación local o puede estar causada por
medicaciones como la vincristina y la cisplatina.
La presente invención también contempla el uso de
los agonistas de hedgehog para el tratamiento de neuropatías
asociadas con amiloidosis. El amiloide es una sustancia depositada
en los nervios periféricos e interfiere en sus operaciones: el
trastorno se llama amiloidosis. Existen dos tipos principales:
amiloidosis primaria, en la que los depósitos contienen fragmentos
de anticuerpos monoclonales (ver la gammopatía monoclonal
previamente descrita); y amiloidosis hereditaria en la que los
depósitos contienen una proteína mutada llamada Transtiretina. La
amiloidosis primaria está normalmente asociada con gammopatías
monoclonales o mieloma.
Otro aspecto de la presente invención proporciona
el presente método como la forma de tratar neuropatías causadas por
infecciones. Las neuropatías periféricas pueden estar causadas por
infección de los nervios periféricos. Los virus que causan
neuropatías periféricas son, entre otros, el virus del SIDA, el
VIH-I, que causa neuropatía sensorial progresiva
lenta, el citomegalovirus, que causa una neuropatía paralítica
progresiva rápidamente, el Herpes zoster, que provoca escamaciones,
y el poliovirus, que causa una neuropatía motora. Las infecciones
por hepatitis B o C están a veces asociadas con la neuropatía
vasculítica.
Las infecciones bacterianas que causan
neuropatías incluyen la lepra, que causa una neuropatía sensorial
localizada, y difteria, que puede causar una neuropatía paralítica
progresiva rápidamente. Otras enfermedades infecciosas que causan
neuropatía incluyen la enfermedad de Lyme, que está causada por una
espiroqueta, y la tripanosomiasis, que está causada por un parásito.
Ambas están comúnmente presentes con una neuropatía multifocal.
Las neuropatías causadas por un desequilibrio
nutricional son también trastornos candidatos para el tratamiento
con el presente método. Las deficiencias en las vitaminas B12, B1
(tiamina), B6 (piridoxina), o E, por ejemplo, pueden producir
polineuropatías con degeneración de los axones de los nervios
periféricos. Esto puede ser debido a una dieta pobre, o incapacidad
para absorber los nutrientes del estómago o intestinos. Además, las
megadosis de vitamina B6 también pueden causar neuropatías
periféricas, y el presente método puede usarse como parte de un
programa de desintoxicación en tales casos.
Aún otro uso del presente método es en el
tratamiento de neuropatías que surgen en enfermedades renales. El
fallo renal crónico puede causar una neuropatía periférica
predominantemente sensorial con degeneración de los axones de los
nervios periféricos.
Otro aspecto de la presente invención proporciona
un método para tratar las neuropatías hipotiroideas. El
hipotiroidismo está a veces asociado con una polineuropatía
sensorial dolorosa con degeneración axonal. La mononeuropatía o la
mononeuropatía multiplex puede también ocurrir debido a la
compresión de los nervios periféricos por tejidos inflamados.
El presente método puede también usarse en el
tratamiento de neuropatías causadas por el alcohol y toxinas.
Ciertas toxinas pueden causar una neuropatía periférica. La
toxicidad del plomo está asociada con una neuropatía motora; el
arsénico o mercurio causan una neuropatía sensorial, y el talio
puede causar una polineuropatía. Varios solventes orgánicos y
insecticidas pueden también causar polineuropatías. El alcohol es
directamente tóxico para los nervios y el exceso de alcohol es una
causa principal de neuropatías. El presente método puede usarse, en
ciertas realizaciones, como parte de un programa de desintoxicación
más amplio.
En otra realización, los métodos y composiciones
de la presente invención pueden usarse para el tratamiento de
neuropatías causadas por fármacos. Se sabe que varios fármacos
causan neuropatías. Se incluyen, entre otros, la vincristina y
cisplatina en el cáncer, la nitrofurantoína, que se usa en
pielonefritis, amiodarona en arritmias cardíacas, disulfiram en
alcoholismo, ddC y ddI en SIDA, y dapsona, que se usa para tratar la
lepra. Como anteriormente, el presente método puede usarse en
ciertas realizaciones como parte de un programa de desintoxicación
más amplio.
El método de la presente invención puede también
usarse en el tratamiento de neuropatías causadas por un trauma o una
compresión. Las neuropatías localizadas pueden ser el resultado de
la compresión de nervios por presión externa o por tendones
superpuestos y otros tejidos. El más conocido de estos es el
síndrome de túnel carpiano, que resulta de la compresión en la
muñeca, y las radiculopatías lumbares (ciática) o cervicales que
resultan de la compresión de las raíces de los nervios cuando salen
de la espina. Otras áreas frecuentes de compresión de los nervios
incluyen los codos, las axilas, y la parte trasera de las
rodillas.
El presente método es también útil en varias
neuropatías idiomáticas. El término "idiopático" se usa cuando
la causa de la neuropatía no puede encontrarse. En estos casos, la
neuropatía se clasifica de acuerdo con sus manifestaciones, por
ejemplo, polineuropatía idiomática sensorimotora, o motora, o
sensorial.
El presente método tiene una amplia aplicabilidad
al tratamiento o profilaxis de trastornos que afectan al tejido
muscular. En general, el método puede caracterizarse por incluir un
paso de administración a un animal de una cantidad de agonista de
hedgehog efectivo para alterar el estado proliferativo de un
tejido muscular tratado. La forma de administración y los regímenes
de dosificación variarán en función del tejido o tejidos musculares
que hay que tratar.
En otro aspecto, la invención está dirigida a un
factor músculo-trófico, y su uso en la estimulación
de la diferenciación o del crecimiento muscular en mamíferos. Tale
estimulación del crecimiento muscular es útil para tratar atrofia, o
desgaste, en particular, atrofia muscular esquelética y atrofia
muscular cardíaca. Además, ciertas enfermedades donde el tejido
muscular está dañado, es anormal, o está atrofiado, son tratables
usando la invención, como por ejemplo, envejecimiento normal,
atrofia por falta de uso, desgaste o cachexia, y varios trastornos
secundarios asociados con el envejecimiento y la perdida de masa
muscular, como la hipertensión, la intolerancia a la glucosa y la
diabetes, la dislipidemia y la enfermedad cardiovascular
aterosclerótica. El tratamiento de miopatías musculares como las
distrofias musculares es también una realización de la
invención.
Debido a la falta de nervios o de uso, los
músculos esqueléticos padecen atrofias rápidas que llevan a un
descenso profundo del tamaño, del contenido proteico y la fuerza
contráctil. Esta atrofia es un componente importante de muchas
enfermedades neuromusculares en humanos. En un contexto clínico, las
composiciones que contienen los presentes agonistas de
hedgehog, pueden usarse para inhibir la degeneración
muscular, por ejemplo, descendiendo la pérdida de masa muscular,
como parte de un tratamiento para tales desórdenes de desgaste
muscular.
En realizaciones preferidas, se administra de
acuerdo con la invención composiciones farmacéuticas a pacientes que
padecen algún trastorno, es decir, una condición física anormal, una
enfermedad o condición patofisiológica asociada con una regulación
anormal y/o aberrante del tejido muscular. Los trastornos para los
que se administra las composiciones de la invención son
preferiblemente aquellos que producen directa o indirectamente una
desgaste (esto es, pérdida) de masa muscular, por lo tanto, un
desorden de desgaste muscular. Entre ellas se encuentran las
distrofias musculares, la cachexia cardiaca, el enfisema, la lepra,
la malnutrición, la osteomalacia, la leucemia aguda infantil, SIDA
con cachexia y cáncer con cachexia.
Las distrofias musculares son enfermedades
genéticas que se caracterizan por una debilidad progresiva y una
degeneración de las fibras musculares sin pruebas de degeneración
neural. En la distrofia muscular de Duchenne (DMD) los pacientes
muestran de media una reducción del 67% de la masa muscular, y en la
distrofia miotónica, la síntesis proteica muscular fraccional se ha
mostrado que desciende en una media del 28%, sin ningún descenso
correspondiente de la síntesis proteica no muscular (posiblemente
debido a respuesta reducida de órganos terminales a sustratos u
hormonas anabólicas). La degradación proteica acelerada se ha
demostrado en los músculos de los pacientes DMD. El presente método
puede usarse como parte de una estrategia terapéutica para la
prevención, y en algunos casos la inversión, de las condiciones de
desgaste muscular asociadas a tales distrofias.
El fallo cardíaco congestivo (CHF) grave se
caracteriza por una "cachexia cardiaca", esto es, una desgaste
proteica muscular de tanto el músculo cardiaco como el esquelético
con un descenso medio del peso corporal de 19%. La cachexia cardiaca
está causada por una tasa aumentada de rotura proteica miofibrilar.
El presente método puede usarse como parte de un tratamiento para la
cachexia cardiaca.
El enfisema es una enfermedad pulmonar
obstructiva crónica, que se definen por un alargamiento de los
espacios de aire distales a los brionquiolos no respiratorios
terminales, acompañado de cambios destructivos en las paredes
alveolares. Las manifestaciones clínicas del funcionamiento pulmonar
reducido incluyen la tos, la respiración sibilante, las infecciones
respiratorias recurrentes, el enema, la discapacidad funcional y un
periodo de vida reducido. La fluxión de tirosina se aumenta en un
47% en pacientes enfisematosos. También el flujo de leucina por todo
el cuerpo se mantiene normal, la oxidación de la leucina de todo el
cuerpo aumenta, y la síntesis de proteína de todo el cuerpo
desciende. El resultado es un descenso en la síntesis proteica
muscular, acompañada por un descenso en la proteína corporal y en la
masa muscular esquelética. Este descenso se vuelve más evidente con
la progresión de la enfermedad y con deterioración a largo plazo.
Los presentes agonistas hedgehog pueden usarse para evitar
y/o invertir las condiciones de desgaste muscular asociadas a tales
enfermedades.
En la diabetes mellitus existe desgaste
generalizado de los músculos pequeños de las manos, que es debida a
una denervación parcial crónica (neuropatía). Esto es especialmente
evidente y empeora con la progresión de la enfermedad a largo plazo
y la gravedad. El presente método puede usarse como parte de una
estrategia terapéutica para el tratamiento de diabetes mellitus.
La lepra está asociada al desgaste muscular que
tiene lugar entre los metacarpios del dedo gordo y el dedo índice.
La malnutrición grave se caracteriza por, entre otras cosas,
desgaste muscular grave. El presente método puede usarse para tratar
efectos de la lepra que provocan desgaste muscular.
La osteomalacia es un trastorno nutricional
causado por una deficiencia de la vitamina D y calcio. En niños se
llama "raquitismo" y en adultos "osteomalacia". Está
marcada por un debilitamiento de los huesos (debido a una
mineralización reducida, con exceso de acumulación de osteoide),
dolor, blandura, desgaste muscular y debilidad, anorexia y una
pérdida de peso generalizada. Puede ser el resultado de una
malnutrición de repetidos embarazos y lactancias (agotando o
reducción de las existencias de vitamina D y calcio) y resistencia
la vitamina D. El método presente puede usarse como parte de una
estrategia terapéutica para el tratamiento de la osteomalacia.
En la leucemia aguda infantil existe una
malnutrición de energía proteica que lleva a una desgaste muscular
esquelética. Los estudios han demostrado que algunos niños muestran
la desgaste muscular incluso antes de ser diagnosticados leucemia,
con una media de 27% de descenso de masa muscular. También existe un
aumento del 33-37% simultáneo de tejido adiposo, que
no tiene como resultado un cambio neto en el peso corporal relativo
y la circunferencia de las extremidades. Tales pacientes pueden
recibir tratamiento con un agonista de hedgehog de acuerdo
con el método de la presente invención.
La caquexia cancerígena es un síndrome complejo
que tiene lugar con incidencia variable en pacientes con tumores
sólidos y malignidad hematológica. Clínicamente, la cachexia de
cáncer se manifiesta por una pérdida de peso con una depleción del
tejido adiposo y la masa muscular magra, y es una causa de muerte
que resulta a partir del cáncer. Los pacientes de cachexia de cáncer
tienen tiempos de supervivencia más cortos, y una respuesta
disminuida a quimioterapia. Además de los trastornos que producen
desgaste muscular, hay otras circunstancias y condiciones que
parecen ir unidas de alguna forma con un descenso de la masa
muscular. Tales aflicciones incluyen la desgaste muscular d3bida a
un dolor en la espalda crónico, una edad avanzada, una
hospitalización de larga duración debido a una enfermedad o daño,
alcoholismo y terapia corticoestoroidea. El presente método puede
usarse como parte de una estrategia
terapéutica para evitar, y en algunos casos invertir, las condiciones de desgaste muscular asociadas con tales cánceres.
terapéutica para evitar, y en algunos casos invertir, las condiciones de desgaste muscular asociadas con tales cánceres.
Los estudios han demostrado que los casos graves
de dolor lumbar bajo, existe desgaste muscular paraespinal. El
descenso de la desgaste muscular paraespinal alivia el dolor y
mejora la función. Un curso de tratamiento para una enfermedad puede
incluir la administración de una cantidad terapéutica de un agonista
de hedgehog.
También se cree que la debilidad generalizada en
edad avanzada es debida al desgaste muscular. A medida que el cuerpo
envejece, una proporción cada vez mayor de músculo esquelético es
reemplazado por tejido fibroso. El resultado es una reducción
significativa en el poder del músculo, pero sólo una reducción
marginal en la masa libre de grasa. El presente método puede usarse
como parte de un tratamiento y estrategias preventivas para
evitar/invertir la desgaste muscular en pacientes de edad
avanzada.
Los estudios también han demostrado que en
pacientes que padecen daños o enfermedades crónicas y
hospitalización durante largos periodos de tiempo, existe una
desgaste muscular unilateral de larga duración, con un descenso
medio del 32% de la masa muscular. Los estudios muestran además que
esto puede corregirse con fisioterapia intensiva. Sin embargo, para
más pacientes puede ser más efectivo aumentar por lo menos tales
terapias con tratamientos con el presente método.
En personas alcohólicas existe una desgaste del
músculo tibial anterior. Este daño en el músculo proximal está
causado por un daño neurogénico, por ejemplo, una actividad
enzimática glicolítica y fosforilasa disminuida. El daño se vuelve
visible y empeora con la duración del consumo excesivo de alcohol.
Los pacientes tratados con corticoesteroides sufren una pérdida de
masa muscular. Estos pacientes pueden también ser sujetos del
tratamiento con el presente método.
Los compuestos de la invención pueden usarse para
aliviar la pérdida de masa muscular resultante de las condiciones
antes mencionadas, y de otras muchas. Adicionalmente, los agonistas
de hedgehog de la presente invención son útiles en las
aplicaciones a la ganadería animal y en veterinaria para
contrarrestar la pérdida de peso en animales, o para impulsar el
crecimiento. Por ejemplo, la invención puede también encontrar uso
en el aumento de la eficiencia de la producción de carne animal.
Especialmente, los animales pueden ser alimentados o inyectados con
un agonista de hedgehog para aumentar la masa muscular
esquelética general, por ejemplo, para aumentar el peso de los
animales de granja, como las vacas, cerdos, ovejas, pollos y
salmón.
El mantenimiento de tejidos y órganos ex
vivo es también altamente deseable. La terapia de sustitución de
tejidos está bien establecida en el tratamiento de enfermedades
humanas. Existen varias situaciones donde puede interesar
trasplantar células musculares, especialmente células madre
musculares, en un huésped recipiente donde, las células del
recipiente son inexistentes, están dañadas o son células musculares
disfuncionales en enfermedades de desgaste muscular. Por ejemplo, el
trasplante de mioblastos normales puede ser útil para tratar la
distrofia muscular de Duchenne y otras degeneraciones y enfermedades
de desgaste. Ver, por ejemplo, Partridge (1991) Muscle &
Nerve 14:197-212. En el caso de los mioblastos,
pueden inyectarse en varios sitios para tratar enfermedades de
desgaste muscular.
El presente método puede usarse para regular el
crecimiento de células y tejidos musculares in vitro, así
como acelerar el injerto de tejido muscular implantado a un huésped
animal. En este sentido, la presente invención también concierte a
los cultivos de mioblastos que han sido ampliados por tratamiento
con un agonista de hedgehog. En una realización ilustrativa,
tal método comprende la obtención de una muestra de músculo,
preferiblemente una que incluya mioblastos; opcionalmente tratar la
muestra de célula enzimáticamente para separar las células; hacer un
cultivo en la presencia de un agonista de hedgehog.
Aún otro aspecto de la presente invención
concierte a la observación en la materia de que ptc,
hedgehog, y/o smoothened están implicados en las
señales mofogénicas relacionadas con otras vías organogénicas
vertebradas además de la diferenciación neuronal, como se ha
descrito anteriormente, ya que tienen papeles claros en otras
formaciones del patrón endodérmico, así como en los procesos de
diferenciación mesodérmico y endodérmico. De esta manera, se
contempla en la invención que las composiciones que contengan
agonistas de hedgehog pueden también ser utilizadas para
cultivos celulares así como para métodos terapéuticos que incluyan
la generación y mantenimiento de tejido no neuronal.
En una realización, la presente invención usa el
descubrimiento de que ptc, hedgehog, y
smoothened están aparentemente implicados en el control del
desarrollo de las células madre responsables de la formación del
tracto digestivo, hígado, pulmones y otros órganos que derivan del
intestino primitivo. Los nervios Shh como una señal inductiva
de la endoderma a la mesoderma, cosa que es crítica para la
morfogénesis intestinal. Por lo tanto, por ejemplo, los agonistas de
hedgehog del presente método pueden utilizarse para regular
el desarrollo y mantenimiento de un hígado artificial que puede
tener múltiples funciones metabólicas de un hígado normal. En una
realización ejemplar, el presente método puede usarse para regular
la proliferación y diferenciación de las células madre del tubo
digestivo para formar cultivos de hepatocitos que pueden usarse para
poblar matrices extracelulares, o que pueden estar encapsuladas en
polímeros biocompatibles para formar hígados artificiales tanto
implantables como extracorpóreos.
En otra realización, las composiciones
terapéuticas de agonista de hedgehog pueden utilizarse en
conjunción con trasplantes de esos hígados artificiales, así como
estructuras hepáticas embrionarias, para regular la respuesta del
implante intraperitoneal, la vascularización y la diferenciación
in vivo y el mantenimiento del tejido hepático injertado.
En todavía otra realización, el presente método
puede utilizarse terapéuticamente para regular tales órganos tras
ataques patológicos, químicos o físicos. Por ejemplo, las
composiciones terapéuticas que contienen agonistas de
hedgehog puede usarse en la reparación hepática subsiguiente
a una hepatectomía parcial.
La generación del páncreas y el intestino delgado
a partir de intestino embrionario depende de la señalización
intercelular entre las células de la endoderma y la mesoderma del
intestino. Concretamente, existe la sugerencia de que la
diferenciación de la mesoderma intestinal en músculo dependa de
señales de las células endodérmicas adyacentes. Un mediador
candidato de las señales derivadas endodérmicamente en el intestino
posterior embrionario es el Sonic hedgehog. Ver, por ejemplo,
Apelqvist et al. (1997) Curr Biol
7:801-4. El gen Shh es expresado a lo
largo de la endoderma intestinal embrionaria con la excepción de la
endoderma del primordio pancreático, que en cambio expresa altos
niveles de proteína de homeodominio Ipf1/Pdx1 (factor promotor de
insulina 1/homeobox pancreático y duodenal 1), un regulador esencial
del desarrollo pancreático temprano. Apelqvist et al.
Supra, han examinado si la expresión diferencial de
Shh en el tubo intestinal embrionario controla la
diferenciación de la mesoderma de alrededor en derivados de
mesoderma especializados del intestino delgado y el páncreas. Para
probar esto, usaron el promotor del gen Ipf1/Pdx1 para expresar
selectivamente Shh en el epitelio de páncreas en desarrollo.
En el ratón transgénico Ipf1/Pdx1-Shh, la mesoderma
pancreática se desarrolló hasta formar músculo liso y células
intestinales de Cajal, características del intestino, más que en la
mesénquima pancreática y el bazo. Además, los explantes pancreáticos
expuestos a Shh siguieron un programa similar de diferenciación
intestinal. Estos resultados proporcionan pruebas de que la
expresión diferencial de Shh derivado endodérmicamente controla el
futuro de la mesoderma adyacente en diferentes regiones del tubo
intestinal.
En el contexto de la presente invención, se
contempla por lo tanto que los agonistas de hedgehog puedan
usarse para controlar o regular la proliferación y/o diferenciación
de tejido pancreático tanto in vivo como in vitro.
Existe una gran variedad de células patológicas
proliferativas y condiciones de diferenciación mediante las cuales
los agonistas de la presente invención pueden proporcionar
beneficios terapéuticos, siendo la estrategia general, por ejemplo,
la corrección de la expresión de insulina aberrante, o la modulación
de la diferenciación. Más generalmente, sin embargo, la presente
invención está relacionada con un método de inducción y/o
mantenimiento de un estado diferenciado potenciando la supervivencia
y/o afectando la proliferación de células pancreáticas, al poner en
contacto las células con los presentes agonistas. Por ejemplo, la
invención contempla que, a la luz de la aparente implicación de
ptc, hedgehog, y smoothened en la formación de
ordenaciones espaciales del tejido pancreático, el presente método
podría usarse como parte de una técnica para generar y/o mantener
tales tejidos tanto in vitro como in vivo. Por
ejemplo, la modulación de la función de hedgehog puede
utilizarse en cultivos celulares y en métodos terapéuticos que
incluyan la generación y el mantenimiento de células \beta y
posiblemente también para tejidos no pancreáticos, como en el
control del desarrollo y mantenimiento de tejidos del tracto
digestivo, bazo, pulmones, y otros órganos que derivan del intestino
primitivo.
En una realización ejemplar, el presente método
puede usarse en el tratamiento de trastornos hiperplásicos y
neoplásicos teniendo efecto sobre el tejido pancreático,
particularmente aquéllos caracterizados por una proliferación
aberrante de células pancreáticas. Por ejemplo, el cáncer
pancreático está marcado por una proliferación anormal de células
pancreáticas que puede resultar en alteraciones de la capacidad
secretora de insulina del páncreas. Por ejemplo, ciertas
hiperplasias pancreáticas, como los carcinomas pancreáticos, pueden
dar como resultado una hipoinsulinemia debida a una disfunción de
las células \beta o al descenso de masa celular en islotes. En la
medida que la señalización de ptc, hedgehog, y
smoothened puede estar indicada en la progresión de una
enfermedad, los presentes agonistas pueden usarse para potenciar la
regeneración del tejido tras una terapia
anti-tumor.
Además, la manipulación de las propiedades de
señalización de hedgehog en diferentes puntos puede ser útil
como parte de una estrategia para la regeneración/reparación de
tejido pancreático tanto in vivo como in vitro. En una
realización, la presente invención utiliza la aparente relación de
ptc, hedgehog, y smoothened en la regulación
del desarrollo de tejido pancreático. En general, el presente método
puede utilizarse terapéuticamente para regular el páncreas tras un
ataque patológico, químico o físico. En otra realización, el
presente método puede aplicarse a técnicas de cultivo celular,
concretamente puede aplicarse para potenciar la generación inicial
de dispositivos de tejido pancreático prostético. La manipulación de
la proliferación y diferenciación del tejido pancreático, por
ejemplo, mediante una alteración de la actividad de hedgehog,
puede proporcionar una manera de controlar más exhaustivamente las
características de un tejido cultivado. En una realización ejemplar,
el presente método puede usarse para aumentar la producción de
dispositivos prostéticos que requieren células de islote pancreático
beta, como se puede usar en los dispositivos de encapsulación
descritos en, por ejemplo, la patente estadounidense de Aebischer
et al. nº 4.892.538, la patente estadounidense de Aebischer
et al. nº 5.106.627, la patente estadounidense de Lim nº
4.391.909, y la patente estadounidense de Sefton nº 4.353.888. Las
células progenitoras tempranas a los islotes pancreáticos son
multipotenciales, y aparentemente coactivan todos los genes
específicos de islotes a partir del momento en que aparecen. A
medida que el desarrollo tiene lugar, la expresión de hormonas
específicas de islotes, como la insulina, se vuelve restringida al
patrón de expresión característico de células de islote maduras. El
fenotipo de islotes maduros, sin embargo, no es estable en cultivos,
mientras que se puede observar la reaparición de las características
embrionarias en células beta maduras. Utilizando los presentes
agonistas de hedgehog, la vía de diferenciación o el índice
proliferativo de células puede regularse.
Además, la manipulación del estado diferenciativo
de tejido pancreático puede también utilizarse en conjunción con un
trasplante de páncreas artificial para impulsar a la implantación,
vascularización, y mantenimiento diferenciación in vivo del
tejido injertado. Por ejemplo, la manipulación de la función de
hedgehog para afectar a la diferenciación de tejido puede
utilizarse como una forma de mantener la viabilidad del injerto.
Bellusci et al. (1997) Development
124:53 informan de que el Sonic hedgehog regula la
proliferación celular mesenquimal del pulmón in vivo. De
acuerdo con esto, la presente invención puede usarse para regular la
regeneración de tejido pulmonar, por ejemplo, en el tratamiento del
enfisema.
En otra realización de la presente invención, las
composiciones que contienen agonistas de hedgehog pueden
usarse en la generación in vitro de tejido esquelético, como
la formación de células madre esqueletogénicas, así como el
tratamiento in vivo de las deficiencias del tejido
esquelético. La presente invención contempla particularmente el uso
de agonistas de hedgehog para regular la tasa de
condrogénesis y/o osteogénesis. Por "deficiencia del tejido
esquelético" se entiende una deficiencia en el tejido conectivo
esquelético u óseo en cualquier lugar donde se desee recuperar el
tejido conectivo u óseo, sin importar como se originó la
deficiencia, p.ej. ya sea como resultado de la intervención
quirúrgica, eliminación del tumor, ulceración, implante, fractura, u
otra condición degenerativa o traumática.
Por ejemplo, el método de la presente invención
puede usarse como parte de un régimen para recuperar la función del
cartílago de un tejido conectivo. Tales métodos son útiles, por
ejemplo, en la reparación de defectos o lesiones en tejidos
cartilaginosos, que son el resultado del desgaste degenerativo que
finalmente acaba siendo artritis, así como otros desórdenes
mecánicos que pueden ser causados por un trauma en el tejido, como
una deslocalización del tejido de desgarro del menisco, una
meniscectomía, una laxación de una articulación por un ligamento
desgarrado, una alineación incorrecta de las articulaciones, una
fractura ósea, o por una enfermedad hereditaria. El presente método
de reparación es también útil para remodelar la matriz de cartílago,
como en la cirugía plástica o reconstructiva, así como la cirugía
periodontal. El presente método puede también aplicarse para mejorar
un procedimiento de reparación previo, por ejemplo, después de una
reparación quirúrgica de un menisco, ligamento, o cartílago. Además,
puede evitar el inicio o exacerbación de una enfermedad degenerativa
si se aplica de forma suficientemente temprana tras un
trauma.
trauma.
En una realización de la presente invención, el
presente método comprende el tratamiento del tejido conectivo
afligido con una cantidad suficiente terapéuticamente de un agonista
de hedgehog, particularmente un agonista selectivo para la
transducción de señal de hedgehog indio, para regular la
respuesta reparatoria de un cartílago en el tejido conectivo
manteniendo el índice de diferenciación y/o proliferación de
condorcitos incrustados en el tejido. Tales tejidos conectivos como
el cartílago articular, cartílago interarticular (meniscos),
cartílago costal (que conecta las costillas verdaderas y el
esternón), ligamentos, y tendones, son particularmente adecuados
para el tratamiento en terapias reconstructivas y/o regenerativas
utilizando el presente método. Como se usa aquí, las terapias
regenerativas incluyen el tratamiento de estados degenerativos que
han progresado hasta el punto en el que las deficiencias en el
tejido se manifiestan de forma obvia, así como los tratamientos
preventivos de tejido donde la degeneración está en las primeras
etapas o es inminente.
En una realización ilustrativa, el presente
método puede usarse como parte de una intervención terapéutica en el
tratamiento del cartílago de una articulación diartroidal, como la
rodilla, el tobillo, el codo, la cadera, la muñeca, el nudillo de
cualquier dedo de pies y manos, o la articulación tempomandibular.
El tratamiento puede ir dirigido al menisco de la articulación, al
cartílago articular, o a ambos. Para ilustrarlo mejor, el presente
método puede usarse para tratar un trastorno degenerativo en una
rodilla, como el que puede resultar de un daño traumático (p.ej. un
accidente deportivo o un gasto excesivo) u osteoartritis. Los
presentes agonistas pueden administrarse como una inyección en la
articulación con, por ejemplo, una aguja artroscópica. En algunos
ejemplos el agente inyectado puede estar en la forma de un hidrogel
o de otro vehículo de liberación lenta descrito anteriormente para
permitir un contacto más extendido y regular del agente con el
tejido tratado.
La presente invención también contempla el uso
del presente método en la materia de los trasplantes de cartílago y
de terapias con dispositivos prostéticos. Sin embargo, los problemas
surgen, por ejemplo, debido a que las características del cartílago
y fibrocartílago varían entre los diferentes tejidos: como entre el
cartílago del menisco, el articular, los ligamentos y los tendones,
entre las dos terminaciones del mismo ligamento o tendón, y entre
las partes superficiales y profundas del tejido. La colocación zonal
de estos tejidos puede reflejar un cambio gradual en las propiedades
mecánicas, y se produce un fracaso cuando el tejido implantado, que
no se ha diferenciado bajo esas condiciones, carece de la capacidad
para responder adecuadamente. Por ejemplo, cuando el cartílago del
menisco se usa para reparar ligamentos cruzados anteriores, el
tejido sufre una metaplasia a tejido fibroso puro. Regulando la tasa
de condrogénesis, el presente método puede usarse para encarar
concretamente este problema, ayudando a controlar adaptativamente
las células implantadas en el nuevo entorno y conseguir condrocitos
efectivos hipertróficos parecidos a los de etapas anteriores de
desarrollo del tejido.
De la misma manera, el presente método puede
aplicarse para mejorar tanto la generación de dispositivos de
cartílago prostético como su implantación. La necesidad de un
tratamiento mejorado ha motivado la investigación centrada en la
creación de un nuevo cartílago que se basa en plantillas de
colágeno-glucosaminoglicano (Stone et al.
(1990) Clin Orthop Relat Red 252:129), condrocitos aislados
(Grande et al. (1989) J Orthop Res 7:208; y Takigawa
et al. (1987) Bone Miner 2:449), y condrocitos unidos
a polímeros naturales o sintéticos (Walitani et al. (1989)
J Bone Jt Surg 71B-74; Vacanti et al.
(1991) Plast Reconstr Surg 88:753; von Schoreder et
al. (1991) J Biomed Mater Res 25:329; Freed et al.
(1993) J Biomed Mater Res 27:11; y la patente estadounidense
de Vacanti et al. nº 5.041.138). Por ejemplo, los condrocitos
pueden crecer en un cultivo biodegradable de esqueletos moleculares
altamente porosos biocompatibles formados a partir de polímeros como
el ácido poliglucólico, el ácido poliláctico, el gel de azarosa, u
otros polímeros que se degradan como el tiempo como función de la
hidrólisis de la columna vertebral del polímero en monómeros
inocuos. Las matrices están diseñadas para permitir un adecuado
intercambio de nutrientes y gas a las células hasta que tiene lugar
el injerto. Las células pueden cultivarse in vitro hasta que
el volumen celular apropiado y la densidad se han desarrollado para
las células que se van a implantar. Una ventaja de las matrices es
que pueden ser moldeadas en la forma deseada individualmente, de
forma que el producto final se parece mucho a la oreja o nariz del
paciente (a modo de ejemplo), o puede usarse las matrices flexibles,
lo que permite una manipulación en el momento del implante, como en
una articulación.
En una realización del presente método, los
implantes están en contacto con un agonista de hedgehog
durante ciertas etapas del proceso de cultivo para controlar la tasa
de diferenciación de condrocitos y la formación de condrocitos
hipertróficos en el cultivo.
En otra realización, el dispositivo implantado es
tratado con un agonista hedgehog para remodelar activamente
la matriz implantada y para hacer que sea más posible que desarrolle
la función que interesa. Como se ha indicado antes respecto a los
trasplantes tisulares, los trasplantes artificiales sufren la misma
deficiencia de no ser derivados en un contexto que es comparable al
contexto mecánico real en el que la matriz es implantada. La
capacidad de regular los condrocitos en la matriz gracias al
presente método puede permitir que un implante adquiera
características similares a las del tejido que se pretende que
llegue a reemplazar.
En otra realización, el presente método se usa
para mejorar la unión de los dispositivos prostéticos. Para
ilustrarlo mejor, el presente método puede usarse en la implantación
de una prótesis periodontal, donde el tratamiento del tejido
conectivo de alrededor estimula la formación de ligamentos
periodontales sobre la prótesis.
En otras realizaciones, el presente método puede
usarse como parte de un régimen APRA la generación de hueso
(osetogénesis) en un sitio en el animal donde tal tejido esquelético
sea deficiente. El Indian hedgehog está particularmente
asociado a los condrocitos hipertróficos que son finalmente
reemplazados por osteoblastos. Por ejemplo, la administración de un
agonista de hedgehog de la presente invención puede usarse
como parte de un método para regular la tasa de pérdida ósea en un
sujeto. Las preparaciones que contienen agonistas de hedgehog
pueden usarse, por ejemplo, para controlar la osificación
endocondral en la formación de un "modelo" para la
osificación.
En otra realización de la presente invención, un
agonista de hedgehog puede usarse para regular la
espermatogénesis. Se ha demostrado que las proteínas
hedgehog, concretamente la Dhh, están involucradas en la
diferenciación y/o proliferación y mantenimiento de las células
madre testiculares. La expresión de Dhh es iniciada en las
precursoras de las células de Seroli tras la activación del Sry (gen
determinante testicular) y persiste en los testículos en el adulto.
Los machos son viables pero infértiles, puesto que carecen
completamente de esperma maduro. El examen de los testículos en
desarrollo en diferentes marcos genéticos sugiere que la Dhh regula
las etapas tempranas y tardías de espermatogénesis. Bitgood et
al. (1996) Curr Biol 6:298. En una realización preferida,
el agonista de hedgehog puede usarse como un agente de
fertilidad. De una forma parecida, los agonistas de hedgehog
del presente método son potencialmente útiles para la modulación de
la función ovárica normal.
El presente método también tiene una gran
aplicabilidad en el tratamiento o profilaxis de trastornos que
afectan al tejido epitelial, así como en usos cosméticos. En
general, el método puede caracterizarse por incluir un paso de
administración a un animal de una cantidad de agonista de
hedgehog efectiva para alterar el estado de crecimiento de un
tejido epitelial tratado. El modo de administración y los regímenes
de dosis variarán en función del tejido o tejidos que se va a
tratar. Por ejemplo, las formulaciones tópicas serán preferidas
donde el tejido para tratar sea tejido epidérmico, como tejidos
dérmicos o mucosos.
Un método que "mejora la cicatrización de una
herida" tiene como resultado la cicatrización de heridas más
rápidamente debido al tratamiento que aquéllas heridas que tienen
que cicatrizarse sin tratamiento. La "mejora de la cicatrización
de heridas" puede también significar que el método regula la
proliferación y/o crecimiento de, inter alia, queratinocitos,
o que las heridas cicatricen con menos marcas, menos contracción de
la herida, menos deposición de colágeno y más área de superficie. En
ciertos ejemplos, la "mejora de la cicatrización de heridas"
puede también significar que ciertos métodos de cicatrización de
heridas han mejorado el índice de éxito (p.ej. el índice en caso de
injertos de piel), cuando se usa conjuntamente con el método de la
presente invención.
Las complicaciones son un riesgo constante con
heridas que no se han cicatrizado del todo y permanecen abiertas.
Aunque la mayoría de heridas cicatrizan rápidamente sintratamiento,
algunos tipos de heridas se resisten a cicatrizar. Las heridas que
cubren grandes áreas de superficie también permanecen abiertas
durante periodos de tiempo largos. En una realización de esta
invención, el presente método puede usarse para acelerar la
cicatrización de heridas que implican tejidos epiteliales, como
resultado de cirugía, quemaduras, inflamaciones o irritaciones.
Ciertos agonistas de hedgehog de la presente invención pueden
también aplicarse de forma profiláctica, como en la forma de una
preparación cosmética, para mejorar el proceso de regeneración
tisular, p.ej. de la piel, cabello o uñas.
A pesar del significativo progreso en las
técnicas quirúrgicas reconstructivas, la cicatrización puede ser un
obstáculo importante para recuperar la función normal y la
apariencia de una piel cicatrizada. Esto es particularmente cierto
cuando la cicatrización patológica, como los queloides o las
cicatrices hipertróficas de las manos o cara causan una discapacidad
funcional o una deformidad física. En las circunstancias más graves,
esa cicatrización puede precipitar una ansiedad psicosocial y una
vida de privaciones económicas. La reparación de heridas incluye las
etapas de hemostasis, inflamación, proliferación, y remodelamiento.
La etapa proliferativa incluye la multiplicación de fibroblastos y
de células endoteliales y epiteliales. Mediante el uso del presente
método, la tasa de proliferación de células epiteliales centro de la
herida y alrededor puede controlarse para acelerar el cierre de la
herida y/o minimizar la formación de tejido de cicatriz.
Las quemaduras de segundo y tercer grado son un
ejemplo de tipos de heridas que a menudo cubre grandes áreas de
superficie y por lo tanto requiere periodos prolongados de tiempo
para cerrarse. Como resultado, las complicaciones con riesgo para la
vida, como la infección y pérdida de fluidos corporales a menudo
tiene lugar. Además, la cicatrización en quemadas se produce a
menudo de forma desordenada, lo que provoca marcas y
desfiguraciones. En algunos casos, la contracción de la herida
debida a la deposición excesiva de colágeno tiene como resultado una
movilidad reducida de los músculos en la zona circundante a la
herida. Las composiciones y el método de la presente invención
pueden usarse para acelerar el índice de cicatrización de heridas y
mejorar los procesos de cicatrización que tienen resultados
cosméticos más deseables y menos contracción de la herida y
cicatrización.
Las quemaduras graves que cubren grandes áreas se
tratan a menudo con autoinjertos de piel tomados de áreas no dañadas
del cuerpo del paciente. El presente método puede usarse en
conjunción con injertos de piel para mejorar las tasas de aceptación
del injerto acelerando el crecimiento tanto en la piel injertada
como en la piel del paciente que sea proximal al injerto.
Las úlceras dérmicas son otro ejemplo de heridas
susceptibles de ser tratadas con el presente método, p.ej. para
causar el cierre de la úlcera y/o para evitar que la úlcera se
vuelva una herida crónica. Uno de cada siete individuos con diabetes
desarrolla úlceras dérmicas en sus extremidades, que son
susceptibles de infectarse. Los individuos con úlceras diabéticas
infectas requieren a menudo hospitalización, servicios intensivos,
antibióticos caros, y, en algunos casos, amputación. Las úlceras
dérmicas, como las provocadas por enfermedades venosas (úlceras de
estasis venosa), la presión excesiva (úlceras decubitus) y
las úlceras arteriales, también oponen resistencia a cicatrizar. Los
tratamientos existentes en el campo hasta ahora están generalmente
limitados a mantener la herida protegida, libre de infecciones y, en
algunos casos, recuperar el flujo sanguíneo por cirugía vascular. De
acuerdo con el presente método, la zona afectada de piel puede
tratarse con una terapia que incluye un agonista de hedgehog
que impulsa la epitelización de la herida, p.ej. acelera la tasa de
cicatrización de las úlceras de piel.
El presente tratamiento también puede ser
efectivo como parte de un régimen terapéutico para tratar úlceras
orales y paraorales, p.ej. como resultado de radioterapia o
quimioterapia. Tales úlceras se desarrollan frecuentemente a los
pocos días de la quimioterapia o la radioterapia. Estas úlceras
normalmente empiezan como pequeñas lesiones de formas irregulares y
dolorosas, normalmente cubiertas por una delicada membrana necrótica
gris y rodeadas por tejido inflamatorio. En muchos casos, la falta
de tratamiento resulta en la proliferación de tejido alrededor de la
periferia de una lesión sobre la base inflamatoria. Por ejemplo, los
bordes de epitelio de la úlcera normalmente muestran actividad
proliferativa, lo que provoca la pérdida de continuidad de la
superficie del epitelio. Estas lesiones, debido a su tamaño y a la
pérdida de integridad epitelial, llevan al cuerpo a una infección
secundaria potencial. La ingestión rutinaria de comida y agua se
vuelve una tarea dolorosa, y si las úlceras proliferan a lo largo
del canal alimenticio, la diarrea es normalmente evidente con todos
sus factores complicativos. De acuerdo con la presente invención, un
tratamiento para tales úlceras que incluye la aplicación de un
agonista de hedgehog puede reducir la proliferación anormal y
la diferenciación del epitelio afectado, ayudando a reducir la
gravedad de los eventos inflamatorios posterio-
res.
res.
En otra realización de ejemplo, el método tratado
se proporciona para tratar o prevenir enfermedades
gastrointestinales. Brevemente, una amplia variedad de enfermedades
se asocian con la interrupción del epitelio o vellosidades
gastrointestinales, incluyendo quimioterapia -y enteritis inducida
por terapia de radiación (i.e., toxicidad de intestino) y mucositis,
enfermedad de úlcera péptica, gastroenteritis y colitis,
alteraciones atróficas de las vellosidades, y similares. Por
ejemplo, terapia con agentes quimioterapéuticos usada en el
transplante de médula ósea y la terapia cancerosa afecta rápidamente
las células que proliferan en ambos tejidos hematopoyéticos e
intestino delgado, llevando a toxicidades severas y con frecuencia
toxicidades que limitan la dosis. El daño de la barrera mucosa del
intestino resulta en complicaciones serias de hemorragias y sepsis.
El método tratado se puede usar para promocionar la proliferación
del epitelio gastrointestinal y por lo tanto el incremento de las
dosis toleradas para agentes de radiación y de quimioterapia. El
tratamiento efectivo de enfermedades gastrointestinales puede ser
determinado mediante varios criterios, incluyendo una puntuación de
enteritis, otros tests bien conocidos en la materia.
Levine et al. (1997) J Neurosci
r.7:6277 muestran que las proteínas hedgehog pueden regular la
mitogenesis y la diferenciación de fotoreceptores en la retina de
vertebrados, y Ihh es un factor candidato del epitelio pigmentado
para promover la proliferación del progenitor retinal y la
diferenciación del fotoreceptor. De la misma manera, Jensen et
al. (1997) Development 124:363 demostró que tal
tratamiento de cultivos de células perinatales retinales de ratón
con el fragmento amino-terminal de los Sonic
hedgehog resulta en un incremento en la proporción de células
que incorporan bromodesoxuridina, en número de células totales, y en
bastones fotoreceptores, células amacrinas y células gliales Muller,
sugiriendo que Sonic hedgehog promueve la proliferación de
células precursoras retinales. Así, el método tratado se puede usar
en el tratamiento de enfermedades degenerativas de células retinales
y regular la diferenciación de los fotoreceptores.
Con la edad, la epidermis disminuye y los
apéndices cutáneos se atrofian. El pelo empieza a escasear y las
secreciones sebáceas disminuyen, con la consiguiente susceptibilidad
a secarse, agrietarse, y a fisurarse. La dermis disminuye con la
pérdida de las fibras elásticas y colágenas. Además, la
proliferación de queratinocitos (que es indicativo del espesor de la
piel y la capacidad proliferativa de la piel) disminuye con la edad.
Se piensa que un incremento en la proliferación de queratinocitos
contrarresta, p.ej., arrugas, espesor, elasticidad y se reparan. De
acuerdo con la presente invención, una forma proliferativa a partir
de un agonista del hodgehog puede ser usado tanto
terapéuticamente como cosméticamente para contrarrestar, al menos
durante un tiempo, los efectos de la edad sobre la piel.
Aun otro aspecto de la presente invención se
refiere al uso del método tratado para promover el crecimiento del
pelo. El pelo básicamente está compuesto por queratina, una proteína
resistente e insoluble; su fuerza principal se debe a su enlace
disulfuro de cisteínas. Cada pelo individual comprende un hueco
cilíndrico y una raíz, y está contenido en un folículo, una
depresión como un frasco en la piel. La parte inferior del folículo
contiene una proyección como un dedo llamado papila, que consiste en
tejido conectivo a partir del cual el pelo crece, y a través del
cual los vasos sanguíneos abastecen las células con nutrientes. El
eje central es la parte que se extiende hacia el exterior desde la
superficie de la piel, mientras que la raíz se ha descrito como la
parte enterrada del pelo. La base de la raíz se expande en el bulbo
del pelo, que queda bajo la papila. Las células a partir de las que
se produce el crecimiento del pelo en el bulbo del folículo; se
extruyen en forma de fibras puesto que las células proliferan en el
folículo. El "crecimiento del pelo" se refiere a la formación y
elongación de la fibra del pelo mediante células en división.
Como se conoce bien en la materia, el ciclo común
del pelo se divide en tres estadios: anágeno, catágeno, y telógeno.
Durante la fase activa (anágeno), las células madre epidérmicas de
la papila dérmica se dividen rápidamente. Las células hijas se
trasladan hacia arriba y se diferencian a partir de las capas
concéntricas del mismo pelo. El estadio transicional, catágeno, se
marca mediante el cese de la mitosis de las células madre en el
folículo. El estadio restante se conoce como telógeno, donde el pelo
se retiene en el cuero cabelludo durante varias semanas antes que un
nuevo pelo emerja de debajo desalojando el eje central de la fase
telógeno desde su folículo. A partir de este modelo queda claro que
cuantas más células madre dividiéndose, mayor crecimiento capilar.
Concordantemente, los métodos para incrementar o reducir el
crecimiento capilar pueden llevarse a cabo potenciando o inhibiendo,
respectivamente, la proliferación de estas células madre.
Así, en ciertas realizaciones, el método tratado
puede emplearse como una forma de promover el crecimiento del pelo
humano, p.ej., para corregir la calvicie, alopecia, u otras
enfermedades caracterizadas por la pérdida de pelo.
El método en cuestión también puede usarse en el
tratamiento de una herida del tejido ocular. Generalmente, el daño
del tejido córneo, ya sea por enfermedad, cirugía o lesión, puede
afectar las células epiteliales y/o endoteliales, dependiendo de la
naturaleza de la lesión. Las células epiteliales de la córnea son
células epiteliales no queraticinadas forrando la superficie extrema
de la córnea y proporcionan una barrera contra el ambiente externo.
La curación de las lesiones de la córnea concierne tanto a médicos
como investigadores. Los oftalmólogos frecuentemente se enfrentan
con distrofias corneales y daños problemáticos que resultan en
erosión epitelial persistente y recurrente, frecuentemente llevando
a la pérdida endotelial permanente. El uso de formas proliferativas
de los agonistas hedgehog en cuestión pueden utilizarse en estos
casos para promover la epitelización del tejido de la córnea
afectado.
Para ilustrar más, alteraciones específicas
generalmente asociadas con el daño celular epitelial en el ojo, y
por las que el método en cuestión puede proporcionar un tratamiento
beneficioso, incluyen defectos epiteliales de la córnea
persistentes, erosiones recurrentes, úlceras neurotróficas de la
córnea, queratoconjuntivitis sicca, úlceras microbiales de la
córnea, úlceras virales de la córnea, y similares. Los
procedimientos quirúrgicos que generalmente causan daño a las capas
epiteliales celulares incluyen procedimientos láser realizados sobre
la superficie ocular, cualquiera de los procedimientos quirúrgicos
refractarios tales como queratotomía radial, y queratotomía
astigmática, crisis conjuntivales, transplantes conjuntivales,
epiceratoplastia, y raspado de córnea. Además, heridas superficiales
tales como arañazos, erosión de la superficie, inflamación, etc.
Pueden causar pérdida de células epiteliales. De acuerdo con la
presente invención, el epitelio de la córnea está en contacto con
una cantidad de agonista hedgehog efectivo para causar la
proliferación de las células epiteliales de la córnea para curar
apropiadamente la herida.
En otro aspecto de la invención, el método en
cuestión puede ser usado para inducir la diferenciación y/o promover
la proliferación del tejido derivado epitelialmente. Tales formas de
estas moléculas pueden proporcionar una base para la terapia de
diferenciación para el tratamiento de condiciones hiperplásicas y/o
neoplásicas implicando el tejido epitelial. Por ejemplo, tales
preparaciones pueden usarse para el tratamiento de enfermedades
cutáneas en las que hay proliferación o crecimiento anormales de
células de la piel.
El presente método puede usarse para mejorar la
tasa de aceptación "take rate" de un injerto de la piel. Los
injertos del tejido epidérmico pueden, si la tasa de aceptación del
injerto es muy larga, crear ampollas y escamarse, disminuyendo la
probabilidad de que el injerto "tome", es decir se adhiera a la
herida y forme una membrana basal con el tejido de granulación
subyacente. La tasa de aceptación pueden incrementar por el método
en cuestión induciendo la proliferación de los queratinocitos. El
método para incrementar los take rates comprende el contacto del
autoinjerto de la piel con una cantidad efectiva para cicatrizar la
herida de un agonista hedgehog descrito en el método para
promover la cicatrización de la herida y en el método para promover
el crecimiento y proliferación de los ceratinocitos, como se ha
descrito antes.
Los equivalentes de la piel tienen varios usos no
solamente como un sustituto para la piel humana o animal para
injertos de piel, sino que también como piel de prueba para
determinar los efectos de las sustancias farmacéuticas y cosméticos
sobre la piel. La principal dificultad en los análisis
farmacológicos, químicos y cosméticos es la dificultad para
determinar la eficacia y seguridad de los productos sobre la piel.
Una ventaja de los equivalentes de la piel de la invención es su uso
como un indicador de los efectos producidos por tales sustancias a
través de análisis in vitro sobre piel de prueba.
Así, en una realización del método en cuestión se
puede usar como parte de un protocolo para injertar piel de, p.ej.,
áreas desnudas, heridas y quemaduras granuladas. El uso delos
agonistas hedgehog pueden promocionar tales técnicas para injertar
autoinjertos y autoinjertos epidérmicos (queratinocitos autogénicos
de cultivo) y aloinjertos epidérmicos (queratinocitos alogéncios de
cultivo). En el caso del aloinjerto, el uso del método en cuestión
para promocionar la formación de los equivalentes de la piel en el
cultivo ayuda a proporcionar/mantener un suministro inmediato de
tales injertos (p.ej., en bancos de tejido) de manera que los
pacientes puedan recuperarse en un procedimiento simple con un
material que permita que la cicatrización permanente tenga
lugar.
En esta consideración, la presente invención
también se refiere a equivalentes de tejido vivo de la piel
compuestos que comprenden una capa epidérmica de queratinocitos
cultivados que se han expandido por tratamiento con un agonista
hedgehog. El método en cuestión se puede usar como parte de
un proceso para la preparación de equivalentes de piel viva. En una
realización ilustrativa, tal método comprende la obtención de una
muestra de piel, tratando la muestra de piel enzimáticamente para
separar la epidermis de la dermis, tratando la epidermis
enzimáticamente para liberar las células de queratinocitos,
cultivando, en presencia de un agonista hedgehog, los
queratinocitos epidérmicos hasta la confluencia, en paralelo, o
separadamente, tratando la dermis enzimáticamente para liberar los
fibroblastos, cultivando los fibroblastos hasta la
sub-confluencia, inoculando una membrana esponjosa
de colágeno entrecruzada porosa con los fibroblastos cultivados,
incubando la esponja de colágeno inoculada sobre su superficie para
permitir el crecimiento de los fibroblastos a través de la esponja
de colágeno, y luego inoculándolo con queratinocitos cultivados, e
incubando más el complejo equivalente del compuesto de la piel en
presencia de un agonista hedgehog para promover el
crecimiento de las células.
En otras realizaciones, las láminas de piel que
contienen ambas capas epiteliales y del mesénquima pueden ser
aisladas en cultivos y expandirse con medios de cultivo
suplementados con una forma proliferativa de un agonista
hedgehog. Cualquier muestra de la piel susceptible a técnicas
de cultivo celular puede usarse de acuerdo con la presente
invención. Las muestras de piel pueden ser autogénicas o
alogénicas.
En otro aspecto de la invención, el método en
cuestión puede usarse en conjunción con varios procedimientos
periodónticos en que se desee el control de la proliferación celular
epitelial en y alrededor de los tejidos periodónticos. En una
realización, los agonistas hedgehog pueden usarse para
promocionar la reepitelialización alrededor de los dientes naturales
y prostéticos, p.ej., para promover la formación de tejido de las
encías.
Los productos génicos Hedgehog son capaces de
regular la maduración de los linfocitos T. Ciertos aspectos de la
invención se dirigen a los agonistas hedgehog y sus usos como
agentes inmunomoduladores contra ambas alteraciones inmunológicas
adquiridas y hereditarias.
Por ejemplo, tales composiciones pueden usarse
para incrementar la población de las células T ayudantes a niveles
óptimos en el huésped, p.ej., para estimular el sistema inmune del
animal. Tales usos de las composiciones en cuestión pueden usarse en
el tratamiento de infecciones bacterianas o virales, así como para
ayudar al cuerpo a luchar contra las células cancerígenas.
Alternativamente, esas sustancias también incapacitan al huésped a
regular enfermedades presentes a partir del desarreglo del proceso
de auto-reconocimiento en el que hay un ataque
excesivo por células T huéspedes contra tejidos endógenos. En tales
instancias, las composiciones en cuestión pueden usarse para reducir
la proliferación de la población de células T de manera que los
signos y síntomas de enfermedades inflamatorias
auto-dirigidas (autoimmunes) tales como artritis
reumatoide y esclerosis múltiple mejoran.
Como se describe aquí, las proteínas
hedgehog inhiben la maduración de linfocitos T. Basado sobre
su efecto inhibitorio, la administración de los agonistas
hedgehog se sugiere aquí como tratamiento para varios tipos
de alteraciones inmunológicas implicando la activación de la
inmunidad celular no deseada, p.ej., rechazo de injerto,
alteraciones autoinmunes, y similares.
En general, el método de la presente invención
comprende la administración a animales, o a linfocitos cultivados
in vitro, una cantidad de un agonista hedgehog que
produce una respuesta no tóxica de la célula de inhibición de la
maduración. El método en cuestión se puede llevar a cabo sobre
células que pueden ser dispersadas en cultivo o bien una parte de
tejido u órgano intacto. Además, el método puede ser realizado sobre
células que son proporcionadas en cultivo (in vitro), o sobre
células en un animal entero (in vivo). La invención también
se refiere a métodos para controlar la realización funcional de
células T mediante el uso de preparaciones farmacéuticas de la
invención.
Sin querer que se relacionen mediante ninguna
teoría particular, el efecto inhibitorio de hedgehog sobre la
maduración de células T puede ser debido al menos a la
capacidad de las proteínas hedgehog para antcausar antagonismo
(directamente o indirectamente) la regulación mediada por la
expresión génica de patched y otros efectos fisiológicos
mediados por esta proteína. El producto génico patched, una
proteína de la superficie celular, se entiende para señalar a través
de una vía a la que causa la represión transcripcional de miembros
de las familias Wnt y DppBMP de los morfogenes, proteínas que
imparten información posicional. En otros tejidos, la introducción
de Hedgehog alivia (desreprime) esta inhibición otorgada por
patched, permitiendo la expresión de los programas génicos
particulares.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden agonistas
hedgehog. Los agonistas hedgehog para el uso en el
método en cuestión pueden ser formulados convenientemente para la
administración con un medio biológicamente aceptable, tal como agua,
salino tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol,
polietilenglicol líquido y similares) o mezclas adecuadas de los
mismos. La concentración óptima del principio activo en el medio
escogido puede ser determinada empíricamente, de acuerdo con
procedimientos bien conocidos por los químicos médicos. Como se usa
aquí, "medio biológicamente aceptable" incluye cualquiera o
todos los solventes, medio de dispersión, y similares que pueden ser
apropiados para la vía de administración deseada de la preparación
farmacéutica. El uso de tal medio para sustancias farmacéuticamente
activas se conoce en la materia. Excepto en el grado que como
cualquier medio o agente convencional es incompatible con la
actividad del agonista hedgehog, se contempla su uso en la
preparación farmacéutica de la invención. Se describen vehículos
adecuados e incluso la formulación de otras proteínas, por ejemplo,
en el libro Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's
Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA
1985). Estos vehículos incluyen "formulaciones depósito"
inyectables.
Formulaciones farmacéuticas de la presente
invención también pueden incluir composiciones veterinarias, p.ej.,
preparaciones farmacéuticas de los agonistas hedgehog
adecuadas para usos veterinarios, p.ej., para el tratamiento de
ganado o animales domésticos, p.ej., perros.
Mecanismos recargables o biodegradables también
pueden proporcionar métodos de introducción. Se han desarrollado y
probado varios mecanismos poliméricos de liberación lenta in
vivo en años recientes para fármacos de liberación controlada,
incluyendo biofármacos proteináceos. Una variedad de polímeros
biocompatibles (incluyendo hidrogeles), incluyendo ambos polímeros
biodegradables y no-degradables, pueden usarse para
formar un implante para la liberación sostenida en un sitio
particular para un agonista hedgehog.
Las preparaciones de la presente invención se
pueden dar oralmente, parenteralmente, tópicamente, o rectalmente.
Por supuesto se dan mediante formas adecuadas para la vía de
administración. Por ejemplo, se administran en comprimidos o
cápsulas, mediante inyección, inhalación, loción ocular, ungüento,
supositorio, parche de liberación controlada, etc., administración
mediante inyección, infusión o inhalación; tópica mediante loción o
ungüento; y rectal mediante supositorios. Las administraciones
orales y tópicas son preferidas.
Las frases "administración parenteral" y
"administrado parenteralmente" como se usa aquí significa modos
de administración diferentes de administración enteral y tópica,
generalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación,
inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial,
intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal,
intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular,
intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, y
intraesternal.
Las frases "administración sistémica",
"administrado sistémicamente", "administración periférica"
y "administrado periféricamente" como se usa aquí significan la
administración de un compuesto, fármaco u otro material que no sea
directamente en el sistema nervioso central, tal que entre al
sistema del paciente y, así, está sujeto al metabolismo y otros
procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea.
Estos compuestos pueden ser administrados a
humanos y otros animales para la terapia mediante, cualquier vía
adecuada de administración, incluyendo oralmente, nasalmente, como
mediante, por ejemplo, un vaporizador, rectalmente,
intravaginalmente, parenteralmente, intracisternalmente y
tópicamente, como mediante polvos, ungüentos ogotos, incluyendo
bucalmente y sublingualmente. A pesar de la vía de administración
seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden
ser usados en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones
farmacéuticas de la presente invención, se formulan en dosis
farmacéuticamente aceptables tales como las descritas antes o
mediante otros métodos convencionales conocidos por aquellos
entendidos en la materia.
Los niveles de dosificación actuales de los
principios activos en las composiciones farmacéuticas de esta
invención pueden variar de tal manera para obtener una cantidad del
principio activo el cual es efectivo para conseguir la respuesta
terapéutica deseada para un paciente particular, composición, y modo
de administración, sin ser tóxico para el paciente.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá
de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto
particular empleado de la presente invención, o el éster, sal o
amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de
administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se
emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o
materiales fusionados en combinación con el agonista particular
hedgehog empleado, la edad, sexo, peso, condición, salud
general e historial médico previo del paciente que se trata, y
factores similares bien conocidos en materias médicas.
Un físico o veterinario entendido ordinariamente
en la materia puede determinar rápidamente y prescribir la cantidad
efectiva requerida de la composición farmacéutica. Por ejemplo, el
físico o veterinario podría empezar dosis de los compuestos
empleados de la invención en la composición farmacéutica a niveles
inferiores que los requeridos con el fin de conseguir el efecto
terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosis hasta
conseguir el efecto deseado.
En general, una dosis diaria adecuada de un
compuesto de la invención será que la cantidad del compuesto que es
la dosis efectiva más baja para producir un efecto terapéutico.
Tales dosis efectivas generalmente dependerán de los factores antes
descritos. Generalmente, las dosis intravenosos,
intracerebroventriculares, y subcutáneas de los compuestos de esta
invención para un paciente están en un rango alrededor de 0,0001
hasta alrededor de 100 mg por kilogramo de peso corporal,
preferiblemente a partir de alrededor 0,001 hasta alrededor de 10 mg
por kilogramo, más preferiblemente a partir de alrededor de 0,01
hasta alrededor de 1 mg por kilogramo.
Si se desea, la dosis diaria efectiva del
compuesto activo puede ser administrado como dos, tres, cuatro,
cinco, seis o más sub-dosis administrada
separadamente a intervalos apropiados durante el día, opcionalmente,
en formas de dosificación unitarias.
El término "tratamiento" pretende abarcar
también profilaxis, terapia, y cura.
Los pacientes que reciben este tratamiento es
algún animal con necesidad, incluyendo primates, en particular
humanos, y otros mamíferos tales como equinos, ganado, cerdos y
ovejas; y aves de corral y animales domésticos en general.
El compuesto de la invención puede ser
administrado tal como o en mezclas con transportadores
farmacéuticamente aceptables y/o transportadores estériles y pueden
ser administrados en conjunción con otros agentes antimicrobianos
tales como penicilinas, cefalosporinas, aminoglicósicos, y
glicopéptidos. La terapia conjunta, así incluye administración
secuencial, simultánea y separada del principio activo de una manera
que los efectos terapéuticos de del primero administrado no
desaparece completamente cuando el se administra el
subsiguiente.
Mientras sea posible que un compuesto de la
presente invención se administre sólo, es preferible administrar el
compuesto como una formulación farmacéutica (composición). Los
agonistas hedgehog de acuerdo con la invención pueden ser
formulados para administración de cualquier manera para el uso en
medicina humana o veterinaria. En ciertas realizaciones, el
compuesto incluido en la preparación farmacéutica puede ser activo
por sí mismo, o puede ser un profármaco, p.ej., capaz de ser
convertido a un principio activo en un entorno fisiológico.
Así, otro aspecto de la presente invención
proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que
comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de
los compuestos descritos antes, formulados junto con uno o más
transportadores farmacéuticamente aceptables (aditivos) y/o
diluyentes. Como se han descrito con detalle antes, las
composiciones farmacéuticas de la presente invención puede ser
especialmente formulada para la administración en formas sólidas o
líquidas, incluyendo aquellos adaptados para lo siguiente: (1)
administración oral, por ejemplo, drenajes (soluciones o
suspensiones acuosas o no-acuosas), comprimidos,
píldoras, granulados, pastas para aplicación en la lengua; (2)
administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección
subcutánea, intramuscular o intravenosa como, por ejemplo, una
solución o suspensión estéril; (3) aplicación tópica, por ejemplo,
como una crema, ungüento o vaporizador aplicado a la piel; o (4)
intravaginalmente o intrarectalmente, por ejemplo, como un
supositorio vaginal, crema o espuma. Sin embargo, en ciertas
realizaciones los compuestos en cuestión pueden ser simplemente
disueltos o suspendidos en agua estéril. En ciertas realizaciones,
la preparación farmacéutica no es pirogénica, es decir, no eleva la
temperatura corporal de un paciente.
La frase "cantidad terapéuticamente
efectiva" como se ha usado aquí significa que la cantidad de un
compuesto, material, o composición que comprende un compuesto de la
presente invención que es efectivo para producir algún efecto
terapéutico deseado en al menos una sub-población de
células en un animal y de ese modo bloquea las consecuencias
biológicas de esta vía en las células tratadas, una proporción
beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento
médico.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se
emplea aquí para referirse a aquellos compuestos, materiales,
composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del
alcance del juicio médico, adecuadas para el uso en contacto con los
tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad,
irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación,
conmensurada con una proporción beneficio/riesgo razonable.
La frase "transportador farmacéuticamente
aceptable" como se ha usado aquí significa un material
farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo, tal como un
relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, solvente o material
encapsulante, implicado en llevar o transportar los agonistas en
cuestión desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o
porción del cuerpo. Cada transportador debe ser "aceptable" en
el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la
formulación y no ser perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos
de materiales que pueden servir como transportadores
farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como
lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de
maíz y almidón de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como
carboximetilcelulosa sódica, celulosa de etilo y acetato de
celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina (7)
talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y grasas para
supositorios (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de
semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de
oliva, aceite de maíz y aceite de soja, (10) glicoles, tales como
propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol,
manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo
y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como
hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico;
(16) agua libre de pirógenos; (17) salina isotónica; (18) solución
de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de tampón fosfato;
y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en
formulaciones farmacéuticas.
Como se ha propuesto antes, ciertas realizaciones
de los agonistas hedgehog presentes pueden contener un grupo
funcional básico, tal como amino o alquilamino, y son, así, capaces
de formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos
farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente
aceptables" en este respecto se refiere a a sales de adición
ácidas, relativamente no-tóxicas, inorgánicas y
orgánicas de la presente invención. Estas sales pueden prepararse
in situ durante el aislamiento y purificación finales de los
compuestos de la invención, o separadamente por reacción de un
compuesto purificado de la invención en su forma de base con un
ácido orgánico o inorgánico adecuado y asilando la sal así formada.
Sales representativas incluyen sales de hidrobromuro, hidrocloruro,
sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato,
palmitato, esterato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato,
citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato,
mesilato, glucoheptonato, lactobionato, y laurilsulfonato y
similares. (Ver, por ejemplo, Berge et al. (1977)
"Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.
66:1-19)
Las sales farmacéuticamente aceptables de los
compuestos en cuestión incluyen las sales convencionales no tóxicas
o sales de amonio cuaternarias de los compuestos, p.ej., de ácidos
orgánicos o inorgánicos no-tóxicos. Por ejemplo,
tales sales no tóxicas convencionales incluyen aquellos derivados de
ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico,
sulfámico, fosfórico, nítrico, y similares; y sales preparadas a
partir de ácidos orgánicos tales como acético, propiónico,
succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico,
cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico,
fenilacético, glutámico; benzoico, salicílico, sulfanílico,
2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico,
metanosulfónico, etandisulfónico, oxálico, isotiónico, y
similares.
En otros casos, los compuestos de la presente
invención pueden contener uno o más grupos funcionales acídicos y,
así, son capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con
bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales
farmacéuticamente aceptables" en estas instancias se refiere a
sales de adición básicas no-tóxicas, inorgánicas y
orgánicas de compuestos de la presente invención. Estas sales
también pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento
y purificación final de los compuestos, o separadamente por reacción
del compuesto purificado en su forma de ácido libre con una base
adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un
catión metálico farmacéuticamente aceptable, con amonio, o con una
amina orgánica primaria, secundaria o terciaria farmacéuticamente
aceptable. Sales alcalinas o alcalinotérreas representativas
incluyen sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio, y sales
de aluminio y similares. Aminas orgánicas representativas útiles
para la formación de sales básicas de adicción incluyen etilamina,
dietilamina, etilenediamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina
y similares. (Ver, por ejemplo, Berge et al.,
supra)
Agentes humectantes, emulsificantes y
lubricantes, tales como laurilsulfato sódico y estereato de
magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación,
agentes decubierta, edulcorantes, flavorantes y agentes
perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar
presentes en las composiciones.
Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente
aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como
ácido ascórbico, hidroclorato de cisteína, bisulfato de sodio,
metabisulfato de sodio, sulfito de sodio y similares; (2)
antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo,
hidroxianisol butilatado (BHA), hidroxitolueno butilatado (BHT),
lecitina, propilgallato, alfa-tocoferol, y
similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido
cítrico, ácido etilendiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido
tartárico, ácido fosfórico, y similares.
Formulaciones de la presente invención incluyen
aquellos aquéllas adecuadas para administración oral, nasal, tópica
(incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las
formulaciones pueden ser presentadas convenientemente en formas de
dosificaciones unitarias y pueden ser preparadas por cualquier
método bien conocido en la materia de farmacia. La cantidad de
principio activo que puede ser combinada con un material
transportador para producir una forma de dosis simple variará
dependiendo del huésped que sea tratado, el modo particular de
administración. La cantidad de principio activo que se puede
combinar con un material transportador para producir una forma de
dosificación simple generalmente será esta cantidad del compuesto
que produce un efecto terapéutico. Generalmente, fuera del cien por
cien, esta cantidad oscilará desde alrededor del 1 por ciento a
alrededor del noventa y nueve por ciento de principio activo,
preferiblemente desde alrededor del 5 por ciento a alrededor del 70
por ciento, más preferiblemente desde alrededor del 10 por ciento a
alrededor del 30 por ciento. Los métodos de preparación de estas
formulaciones o composiciones incluyen el paso de llevar a la
asociación de un compuesto de la presente invención con el
transportador y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios.
En general, las formulaciones se preparan uniformemente e
íntimamente llevando a la asociación de un compuesto de la presente
invención con transportadores líquidos, o transportadores sólidos
divididos finamente, o ambos, y luego, si es necesario, modelando el
producto.
Las formulaciones de la invención adecuadas para
administración oral pueden ser en la forma de cápsulas, cápsulas,
píldoras, comprimidos, pastillas (usando una base saborizante,
normalmente sacarosa y acacia o tragacanto), polvos, granulados, o
como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso,
o como una emulsión líquida aceite en agua o agua en aceite, o como
un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal
como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o como lavados de
boca y similares, cada uno conteniendo una cantidad predeterminada
de un compuesto de la presente invención como un principio activo.
Un compuesto de la presente invención también puede ser administrado
como un bolo, A compound of the present invention may also be
administered as a bolus, electuario o pasta.
En formas de dosificación sólida de la invención
para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas,
polvos, granulados y similares), el principio activo se mezcla con
uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables, tales como
citrato de sodio o fosfato dicálcico, y/o cualquiera de los
siguientes: (1) rellenos o extensores, tales como almidones,
lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o ácido salicílico; (2)
agregantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa,
alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3)
humectantes, tales como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tales
como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata
o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato sódico;
(5) agentes retardantes en solución, tales como parafina; (6)
aceladores de la absorción, tales como compuestos de amonio
cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, cetil
alcohol y glicerol monostearato; (8) absorbentes, tales como caolina
y arcilla de bentonita, (9) lubricantes, tales como talco, etereato
de calcio, estereato de magnesio, glicoles de polietileno sólidos,
laurildulfato sódico, y mezclas de los mismos; y (10) agentes
colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las
composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes
tamponantes. Las composiciones sólidas de un tipo similar también
pueden ser empleadas como rellenos en cápsulas de gelatina blandas o
duras usando tales excipientes como lactosa o azúcares de la leche,
así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Un
comprimido puede estar hecho por compresión o moldeamiento,
opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos
pueden prepararse usando agregantes (por ejemplo, gelatina o
hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte,
conservante, desintegrante (por ejemplo, glicolaro de almidón de
sodio o carboximetilcelulosa sódica entrecruzada), agente activo de
superficie o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden estar
hechos moldeando en una máquina adecuado una mezcla del compuesto en
polvos humedecidos con un diluyente líquido inerte.
Los comprimidos, y otras formas de dosificación
sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención,
tales como grageas, cápsulas, píldoras y granulados, opcionalmente
pueden ser evaluados o preparados con cubiertas y capas, tales como
cubiertas entéricas y otras cubiertas bien conocidas en la materia
de la formulación farmacéutica. También pueden ser formulados de tal
manera para proporcionar principios activos de liberación lenta o
controlada usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en
proporciones variantes para proporcionar un perfil de liberación
deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas.
Pueden ser esterilizados por, por ejemplo, filtración a través de un
filtro retenedor de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes
en la forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse
en agua estéril, o algún medio inyectable estéril inmediatamente
antes de su uso. Estas composiciones también pueden contener
opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición
que liberan el principio activo solamente, o preferentemente, en una
porción determinada del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de
una manera retardada. Ejemplos de las composiciones de imbibición
que pueden usarse pueden incluir sustancias poliméricas y ceras. El
principio activo también puede ser de forma microencapsulada, si se
apropia, con uno o más de los excipientes antes descritos.
Las formas de dosificación líquidas para
administración oral de los compuestos de la invención incluyen
emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones,
soluciones, suspensiones, jarabes y elixires. Además del principio
activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener
diluyentes inertes comúnmente usados en la materia, tales como, por
ejemplo, agua o otros solventes, agentes solubilizantes y
emulsificantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico,
carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de
bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites
(en particular, semilla de algodón, cacahuete, maíz, aceites de
germen, oliva, castor y sésamo), glicerol, alcohol de
tetrahidrofurilo, polietilenglicols y ésteres de ácidos grasos de
sorbitano, y mezclas de mismos.
Excepto diluyentes inertes, las composiciones
orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes
humectantes, emulsificantes y agentes suspensores, edulcorantes,
aromatizantes, colorantes, perfumantes y agentes conservantes.
Las suspensiones, además de los compuestos
activos como, por ejemplo, alcoholes etoxilados de isostearilo,
polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa
microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita,
agar-agar y tragacanta, y mezclas de los
mismos.
Las formulaciones de las composiciones
farmacéuticas de la invención para administración rectal o vaginal
pueden presentarse como un supositorio, que puede ser preparado
mezclando uno o más compuestos de la invención con uno o más
excipientes o transportadores no irritantes que comprenden, por
ejemplo, tampón de cacao, polietilenglicol, una cera para
supositorios o un salicilato, y que es sólido a temperatura
ambiente, pero líquido a temperatura corporal y, por tanto, se
fundirá en la cavidad del recto o la vagina y liberará el agonista
hedgehog activo.
Las formulaciones de la presente invención que
son adecuados para la administración vaginal también incluyen
formulaciones supositorios vaginales, tampones, cremas, geles,
pastas, espumas o vaporizadores que contienen tales transportadores
como se conocen en la materia para ser apropiados.
Las formas de dosificación para la administración
tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen
polvos, vaporizadores, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles,
soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede ser
mezclado bajo condiciones estériles con un transportador
farmacéuticamente aceptable, y con cualquiera de los conservantes,
tampones, o propelentes que pueden ser requeridos.
Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden
contener, además de un compuesto activo de esta invención,
excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites,
grasas, parafina, almidón, tragacanto, derivados de celulosa,
polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido de silicio, talco y
óxido de zinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y los vaporizadores pueden contener,
además de un compuesto de esta invención, excipientes tales como
lactosa, talco, ácido de silicio, hidróxido de aluminio, silicatos
de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los
sprays adicionalmente contienen propulsores, tales como
clorofluorohidrocarbonos e hidrocarbonos volátiles no sustituidos,
tales como butano y propano. Los parches transdérmicos tienen la
ventaja añadida de proporcionar liberación controlada de un
compuesto de la presente invención al cuerpo. Tales formas de
dosificación pueden hacerse disolviendo o dispersando los agonistas
hedgehog en el medio próximo. Los potenciadores de la
absorción también pueden usarse para incrementar el flujo de los
agonistas hedgehog a través de la piel. La proporción de tal
flujo puede ser controlado proporcionando una tasa que controla la
membrana o dispersando el compuesto en una matriz o gel
polimérico.
Las formulaciones oftálmicas, ungüentos oculares,
polvos, soluciones y similares, también se contemplan como para
estar dentro del alcance de esta invención.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención
adecuadas para administración parenteral comprenden uno o más
compuestos de la invención en combinación con una o más soluciones,
dispersiones, suspensiones o emulsiones isotónicas estériles
farmacéuticamente aceptables acuosas o no acuosas, o polvos
estériles que pueden ser reconstituidos en soluciones inyectables o
dispersiones justo antes de usarlas, que pueden contener
antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen la
formulación isotónica con la sangre del receptor previsto o agentes
suspensores o espesantes.
Ejemplos de transportadores adecuados acuosos o
no acuosos que pueden ser empleados en las composiciones
farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales
como glicerol, propileno glicol, polietilenglicol, y similares), y
mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como
aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato
de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo,
mediante el uso de materiales para la cubierta, tales como lecitina,
mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el
caso de las dispersiones, y mediante el uso de surfactantes.
Estas composiciones, también pueden contener
adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes
emulsificantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de
mircroorganismos puede estar asegurada por la inclusión de varios
agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno,
clorobutanol, ácido fenolsórbico, y similares. También se puede
desear incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro
sódico, y similares dentro de las composiciones. Además, la
absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede
llevarse por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales
como monoestereato de aluminio y gelatina.
En algunos casos, con el fin de prolongar el
efecto de un fármaco, se desea enlentecer la absorción del fármaco
desde la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede llevarse a
cabo mediante el uso de una suspensión líquida de materila
cristalino o amorfo que tiene un solubilidad en agua pobre. La tasa
de absorción del fármaco depende de su velocidad de disolución que,
de hecho, puede depender del tamaño de cristal y la forma
cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma
farmacéutica administrada parenteralmente se realiza disolviendo o
suspendiendo el fármaco en un vehículo aceitoso.
Las formas inyectables de depósito están hechas
formando matrices microencapsuladas de los compuestos en cuestión en
polímeros biodegradables tales como
polilacturo-poliglicoluro. Dependiendo de la
proporción de fármaco apolimerizar, y la naturaleza del polímero
particular empleado, la proporción de fármaco liberado, puede ser
controlada. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen
poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las
formulaciones de inyectables de depósito también se preparan
trampeando en fármaco en liposomas o microemulsiones que son
compatibles con el tejido corporal.
Cuando los compuestos de la presente invención se
administran como fármacos, a humanos y animales, pueden ser dados
por sí o como una composición farmacéutica que contiene, por
ejemplo, 0,1 a 99,5% (más preferible, 0,5 a 90%) de principio activo
en combinación con un transporador farmacéuticamente aceptable.
La adición del compuesto activo de la invención a
la alimentación animal preferiblemente se lleva a cabo preparando un
alimento apropiado premezclado que contenga el compuesto activo en
una cantidad efectiva e incorporando la premezcla en la ración
completa.
Alternativamente, un concentrado intermediario o
un suplemento alimenticio que contiene el principio activo pueden
ser combinado con el alimento. La manera en que tales premezclas
alimenticias y las raciones completas pueden ser administradas se
describen en libros de (tales como "Applied Animal Nutrition",
W.H. Freedman and CO., San Francisco, U.S.A., 1969 o "Livestock
Feeds and Feeding" O y B books, Corvallis, Ore., U.S.A.,
1977).
Los inhibidores en cuestión, y congéneros de los
mismos, pueden ser preparados rápidamente empleando las tecnologías
acoplamiento de Suzuki, Stille, y similares. Estas reacciones de
acoplamiento se llevan a cabo bajo condiciones relativamente suaves
y toleran un amplio rango de la funcionalidad
"espectadora".
Los compuestos de la presente invención,
particularmente bibliotecas de variantes que tienen varias clases
representativas de sustituyentes, son susceptibles a la química
combinatoria y otros esquemas de síntesis paralelos (ver, por
ejemplo, PCT WO 94/08051). El resultado es que grandes bibliotecas
de compuestos relacionados, p.ej., una biblioteca variegada de
compuestos representados antes, pueden ser cribados rápidamente en
ensayos de alto rendimiento con el fin de identificar compuestos
principales potenciales agonistas de hedgehog, así como para
refinar la especificidad, toxicidad y/o el perfil
citotóxico-cinético de un compuesto principal. Por
ejemplo, los ensayos de bioactividad de ptc, hedgehog, o
smoothened pueden usarse para cribar una biblioteca de los
compuestos en cuestión para aquéllos que tienen actividad
antagonista hacia ptc o actividad agonista hacia
hedgehog o smoothened.
Simplemente para ilustrar, una biblioteca
combinatoria para los propósitos de la presente invención es una
mezcla de compuestos relacionados químicamente que pueden ser
cribados juntos para una propiedad deseada. La preparación de
algunos compuestos relacionados en una reacción simple reduce y
simplica perfectamente el número de procesos de cribado que
necesitan ser realizados. El cribado para las propiedades físicas
apropiadas puede hacerse mediante métodos convencionales.
La diversidad en la biblioteca puede crearse a
una variedad de diferentes niveles. Por ejemplo, el sustrato de
grupos arilo usados en las reacciones combinatorias pueden ser
diversas en términos del núcleo de la porción arilo, p.ej., una
variedad en términos de la estructura del anillo, y/o puede variar
con respecto a los otros sustituyentes.
Una variedad de técnicas están disponibles en la
materia para generar bibliotecas combinatorias de moléculas
orgánicas pequeñas tales como los hedgehog en cuestión. Ver,
por ejemplo, Blondelle et al. (1995) Trends Anal.
Chem. 14;83; las Patentes estadounidenses de Affymax 5,359,115
y 5,362,899: la Patente Estadounidense de Eliman 5,288,514: el Still
et al. Publicación PCT WO 94/08051; las Patentes
Estadounidense de ArQule 5,736,412 y 5,712,171; Chen et al.
(1994) JACS 116:2661: Kerr et al. (1993) JACS
115:252; publicaciones PCT W092/10092, W093109668 y W091/07087; y el
Lerner et al. Publicación PCT W093/20242). Por consiguiente,
una variedad de bibliotecas en el orden de alrededor de 100 a
1.000.000 o más diversómeros de los agonistas hedgehog en
cuestión puede ser sintetizada y cribada para actividades o
propiedades particulares.
En una realización ejemplar, una biblioteca de
los diversómeros candidatos de los agonistas de hedgehog
pueden ser sintetizados utilizando un esquema adaptado a las
técnicas descritas en el Still et al. Publicación PCT WO
94/08051, p.ej., siendo unidos a una cuenta polimérica por un grupo
hidrolizable o fotolizable, opcionalmente localizado a una de las
posiciones de los agonistas candidatos o un sustituyente de un
intermediario sintético. De acuerdo con la técnica Still et
al., la librería se sintetiza en un conjunto de cuentas, cada
cunta incluyendo un grupo de tags que identifican el diversómero
particular sobre esa cuenta. La biblioteca de cuentas luego puede
ser "plaqueada" con células que responden a hedgehog.
Los diversómeros también pueden ser liberados desde la cuenta,
p.ej., por hidrólisis.
Las estructuras de los compuestos útiles en la
presente invención dan por ellas mismas fácilmente una síntesis
eficiente. La naturaleza de las estructuras de los compuestos en
cuestión, como generalmente se han citado antes, permite el
ensamblaje combinatorio rápido de tales compuestos. Por ejemplo,
como en el esquema publicado más adelante, un grupo arilo activado,
tal como un triftato o bromuro de arilo, unido a una cuenta o otro
soporte sólido que pueda unirse a otro grupo arilo realizando un
acoplamiento de Stille o Suzuki con un estanano de arilo o un ácido
arilborónico. Si el segundo grupo arilo se funcionaliza con un
aldehído, un sustituyente amina puede añadirse a través de una
aminación reductora. Alternativamente, el segundo grupo arilo podría
ser funcionalizado con un grupo saliente, tales como un triflato,
tosilato, o haluro, capaces de ser reemplazados por una amina. O, el
segundo grupo arilo puede ser funcionalizado con un grupo amino
capaz de llevar a cabo la aminación reductora con una amina, p.ej.,
CyKNH_{2}. Otras técnicas posibles acoplantes incluyen las
reacciones de aminoarilación mediadas por metales. La amina
secundaria resultante luego además puede ser funcionalizada por una
acilación, alquilación, o arilación para generar una amina o amida
terciaria que luego puede ser dividida a partir de la resina o el
soporte. Las reacciones que generalmente son suaves y se han
aplicado exitosamente en esquemas de síntesis combinatoria en fase
sólida. Además, el amplio rango de sustratos y parejas de
acoplamiento adecuadas y disponibles para estas reacciones permite
el rápido ensamblaje de diversas grandes bibliotecas de compuestos
para probar en ensayos publicados aquí. Para ciertos esquemas, y
para ciertas sustituciones sobre los varios sustityentes de los
compuestos en cuestión, un entendido en la materia reconocerá la
necesidad de enmascarar ciertos grupos funcionales con un grupo
protector adecuado. Tales técnicas son bien conocidas en la materia
y se aplican fácilmente a los esquemas de síntesis combinatoria
\vskip1.000000\baselineskip
Algunas variaciones sobre los mecanismos
anteriores y relacionados permiten la síntesis de diversas
bibliotecas de compuestos que pueden ser probados como agonistas de
la función de hedgehog.
Hay una variedad de ensayos disponibles para
determinar la capacidad de un compuesto para producir antagonismo de
la función ptc o agonismo en la función smoothened o
hedgehog, algunos de los cuales pueden estar dispuestos en los
formatos de alto rendimiento. En algunos programas de cribado de
fármacos que prueban bibliotecas de compuestos y extractos
naturales, se quieren ensayos de alto rendimiento con el fin de
maximizar el número de compuestos investigados en un periodo dado de
tiempo. Así, las bibliotecas de bibliotecas de productos sintéticos
y naturales pueden ser probados para otros compuestos que sean
agonistas hedgehog.
Además de ensayos libres de células, los
compuestos de prueba también pueden ser probados en ensayos basado
en células. En una realización, la célula sensible a la adición de
la proteína hedgehog puede contactar con un agente test de
interés, con la evaluación del ensayo para, p.ej., promocionar la
proliferación de la célula en presencia del agente de prueba.
Un número de productos génicos han sido
implicados en la transducción de señales mediada por patched,
incluyendo patched, los factores de transcripción de la
familia cubitus interruptus (ci), la quinasa de
serina/treonina fusionada (fu) y los productos génicos de
costal-2, smoothened y suppressor of
fused.
La inducción de células mediante proteínas
hedgehog pone en marcha una cascada implicando la activación e
inhibición de efectores corriente abajo, la última consecuencia de
que es, en algunos casos, un cambio detectable en la transcripción o
traducción de un gen. Dianas transcripcionales potenciales de la
señalización mediada por hedgehog son el gen patched (Hidalgo
y Ingham, 1990 Development 110, 291-301;
Marigo et al., 1996) y los homólogos vertebrados del gen de
la drosophila cubitus interruptus, los genes Gli (Hui
et al. (1994) Dev Biol 162:402-413).
Se ha mostrado que la expresión del gen Patched induce
células de la yema de la extremidad y la placa neural que son
sensibles a Shh. (Marigo et al. (1996) PNAS,
93:9346-51; Marigo et al. (1996)
Development 122:1225-1233). Los genes
Gli codifican los supuestos factores de transcripción que
tienen dominios de unión al DNA de dedos de zinc (Orenic et
al. (1990) Genes & Dev 4:1053-1067;
Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol
10:634-642). La transcripción del gen Gli se
ha dado para ser sobreregulado en respuesta a hedgehog en
yemas de extremidades, mientras que la transcripción del gen
Gli3 está sub-regulada en respuesta a la
inducción de hedgehog (Marigo et al. (1996)
Development 122:1225-1233). Seleccionando las
secuencias regulatorias transcripcionales a partir de tales genes
diana, p.ej., a partir de patched o Gli, que son
sensibles a la sobre- o sub-regulación de aquellos
genes en respuesta a la señalización de hedgehog, y
operablemente unidos a tales promotores a un gen marcador, se puede
derivar un ensayo basado en la transcripción que es sensible a la
capacidad de un compuesto prueba específico para modificar las vía
de señalización mediadas por hedgehog. La expresión de los
genes marcadores, así, proporciona una herramienta valiosa de
cribado para el desarrollo de compuestos que actúan como agonistas
de hedgehog.
Los ensayos basados en genes marcadores miden el
final del estadio de la cascada de eventos antes descrita, p.ej., la
modulación transcripcional. En consecuencia, en la práctica de una
realización del ensayo, un constructo del gen marcador se inserta en
la célula reactiva con el fin de generar una señal de detección
dependiente de la activación de la vía hedgehog, o
estimulación por Shh por sí mismo. La cantidad de la
transcripción desde el gen marcador puede ser medida usando
cualquier método conocido por aquellos expertos de la materia que
sea adecuado. Por ejemplo, la expresión del mRNA del gen marcador
puede ser detectada usando protección de RNA o protección de RNAasa,
o el producto proteico del gen marcador puede ser identificado
mediante una marca característica o una actividad biológica
intrínseca. La cantidad de la expresión de los genes reporteros
luego está comparado con la cantidad de expresión en la misma célula
en ausencia del compuesto de prueba o puede ser comparado con la
cantidad de transcripción en una célula sustancialmente idéntica que
le falta la proteína receptora diana. Cualquier incremento
estadístico o por lo contrario significativo en la cantidad de la
transcripción indica que el compuesto de prueba tiene de alguna
manera antagonizada la señal normal ptc (o agonizada la señal
hedgehog o smoothened), p.ej., el compuesto de prueba es un
agonista potencial hedgehog.
La invención que ahora se está describiendo
generalmente, se entenderá más fácilmente por referencia a los
siguientes ejemplos que se incluyen meramente para proposiciones de
ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente
invención, y no pretenden limitar la invención.
En la sección experimental de más abajo, el
término "proteína Hh" se usa para designar
octil-Shh-N, una forma lipofílica de
un fragmento derivado de bacterias de la proteína humana sonic
hedgehog (aminoácidos 24-198,
Shh-N). Específicamente, Shh-N se ha
unido covalentemente in vitro mediante su cisteína
amino-terminal a un grupo octilmaleimida. Esta forma
modificada, como otras descritas recientemente (Pepinsky et
al., J. Biol. Chem. 1998, 273,
14037-45) exhiben la potencia específica más alta
que el fragmento no modificado correspondiente en varios ensayos
basados en células de señalización hedgehog.
Para medir la actividad agonista hedgehog
de compuestos, usamos células [10T1/2(s12)] que contienen la
construcción marcadora Gli-Luc sensible a
hedgehog. En cada MTP (MicroTiter Plate;
96-well plate), 10.000-20.000
células por pocillo se colocaron en placas, en medio completo (10%
de FBS). Después de alrededor de 24-48hr, las placas
se cambiaron a un medio bajo en suero (=0,5% FBS).
Subsiguientemente, un compuesto de prueba se añadió a
1-5 PM en presencia o ausencia de
octil-hedgehog (ver abajo). Tras otras 24hr, el
medio se deshizo de las MTPs y se reemplazó con mezcla del ensayo
con luciferasa, que contenía tampón de lisis con sustrato
luciferasa. Las placas se incubaron a TA durante alrededor de
15-30 min y se leyeron en un luminómetro.
Cribado
A
Las placas se incubaron durante 48hr antes del
cambio a contenido en suero bajo. Los compuestos se cribaron a
1-2 \muM en presencia de la proteína Hh (0,01
\mug/ml; EC30 = alrededor del 30% de la actividad inducida
máxima)
Cribado
B
Las placas se incubaron durante 24hr antes del
cambio a conentido en suero bajo. Los compuestos se cribaron a 5
\muM sin añadir la proteína Hh.
Para el contaje por visualización usamos las
células [10T1/2(SV-Luc)] que contienen un
casete de expresión de la luciferasa SV40 que permite un nivel
constitutivo de actividad luciferasa en las células. Este ensayo
permite ensayar la especificidad de los compuestos seleccionados en
el ensayo Gli-Luc, es decir, si los compuestos
estimulan específicamente la vía de señalización hedgehog
solamente, o construcciones de marcadores en general. Las placas y
el cultivo celular así como el manejo del compuesto se realizaron
como en el ensayo Gli-Luc. En este ensayo, no se
añadió ninguna proteína Hh porque la construcción del marcador ya
está constitutivamente activo.
A partir del cribado A, identificamos dianas en
las Figuras 32 y 33. La subunidad
1,4-diaminociclohexano de los compuestos de la
Figura 32 que incluyen esta fracción tienen los dos sustituyentes
amino dispuestos en una realación trans, p.ej., ambos sustituyentes
ecuatoriales sobre la subunidad de ciclohexano. Estas dianas se
confirmaron en el Cribado B. Los datos mostrados en las Figuras 34a
y 34b esencialmente implicadas que dosifican los dos compuestos en
ambos ensayos (Gli-Luc &
SV-Luc).
Los datos a partir del cual el ensayo
Gli-Luc se convierte en la actividad porcentual
donde la actividad completa con la proteína Hh se encuentra al 100%
(Figura 35; Tabla 1). Los datos muestran que los dos compuestos
estimulan la actividad significativamente a partir de la
construcción marcadora Gli-luc (es decir, activar la
señalización hedgehog) casi en ausencia de la proteína Hh; el rango
de concentración 0,1-15 \muM, EC50 = 2 \muM,
EC_{r}.. = 50-70% de actividad inducida máxima con
la proteína Hh). Además, el compuesto, muestra una inducción más
destacada en presencia de hedgehog (EC50 =
0,2-0,3 pM, EC. = 70-90% de la
actividad máx inducida con la proteína Hh), indicando una sinergia
entre los compuestos y la proteína Hh, consistente en los
compuestos que sirven como agonistas para la vía
hedgehog.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto | EC50 (\muM) | Compuesto | EC50 (\muM) |
A | A' | <10 | |
B | <10 | B' | <10 |
C | <1 | C' | <10 |
D | <0,1 | D' | <10 |
E | <10 | E' | <10 |
F | <10 | F' | <10 |
G | <10 | G' | <10 |
H | <1 | H' | >10 |
I | >10 | I' | <1 |
J | <1 | J' | <1 |
K | <1 | K' | <10 |
L | <0,05 | L' | <0,05 |
M | <1 | M' | <10 |
N | <1 | N' | <1 |
O | <1 | O' | <1 |
P | <1 | P' | <1 |
Q | <1 | Q' | <1 |
R | <1 | R' | <0,05 |
S | <1 | S' | <0,1 |
T | <10 | T' | <0,5 |
U | <10 | U' | <1 |
Compuesto | EC50 (\muM) | Compuesto | EC50 (\muM) |
V | <0 | V' | <1 |
W | <10 | W' | <10 |
X | <10 | X' | <10 |
Y | <10 | Y' | <10 |
Z | <10 | Z' | <10 |
A'' | <10 | B'' | <10 |
C'' | <10 | D'' | <10 |
E'' | <10 | F'' | <0,1 |
G'' | <0,1 | H'' | <0,1 |
I'' | <0,1 | J'' | <0,5 |
K'' | <0,5 | L'' | <1 |
M'' | <1 | N'' | <1 |
O'' | <1 | P'' | <10 |
Q'' | <1 | R'' | <1 |
S'' | <10 | T'' | <10 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos del ensayo SV-Luc
(Figura 35) indican que los dos compuestos no afectan la actividad
luciferasa sobre el rango de concentraciones (más de 15 \muM)
probado, sugiriendo que los compuestos no estimulan la actividad de
una construcción del marcador de por sí, pero son probablemente
específicos a la vía hdgehog. También, la actividad no
afectada sugiere que los compuestos no son intrínsecamente tóxicos
a las células.
Los compuestos de las Figuras 32 y 33 se probaron
por su capacidad para activar la transcripción de dos dianas bien
estudiadas de la vía Hedgehog: el factor de transcripción
Gli-1, y el componente Ptc-1 del
receptor Hedgehog putativo. Como se representa en la Figura
35, encontramos que, a una concentración de compuesto de 8 \muM,
la inducción de ambas dianas fue aproximadamente del 60% para el
compuesto B p-cianofenil y 40% para el compuesto A
m-nitrofenil que se obtuvo con la concentración
óptima de proteína Hh.
Los ensayos se realizaron como sigue:
Se sembraron células C3H 10T1/2 murinas en una
densidad de 200.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos
en medio completo (10% FBS). Tras 24 hr, se eliminó el medio y se
reemplazó con medio de "deprivación" (0,5% FBS) conteniendo
diluciones del compuesto o proteína Hh. Tras 16-18
hr, El RNA total se preparó usando TriZol (Life Technologies,
inc.).
Alícuotas de un microgramo de RNA total se usaron
para preparar cDNAhexámero-cebado aleatorio con
transcriptasa reversa M-MTV (Life Technologies,
Inc.).
Para medir los niveles relativos de transcritos
Gli-1 y Ptc-1, los ensayos TaqMan (PE Biosystems) se
realizaron con un Sistema de Detección de Secuencias ABI Prism 7700.
Como control interno, los niveles del transcrito GAPDH se midieron
simultáneamente en cada reacción. Los datos se analizaron usando el
Detector de Secuencia v1.6.3 (Perkin Elmer).
\newpage
Para probar la eficacia de los mecanismos de
señalización Hedgehog, se determinó la capacidad de los
agonistas para estimular la proliferación de los precusores de
neurona cerebelar. Se sabe que los precusores de neurona granular
cerebelar responden a la proteína Hh mediante proliferación. Para
probar los agonistas, se diseccionaron neuronas cerebelares de los
cerebros de ratas después del nacimiento (una semana), y se
colocaron en cultivos de células primarias. Se añadieron una vez
agentes de tratamiento, durante el primer día de cultivo (0 DIV).
Las células se dejaron en cultivo hasta 2 DIV, cuando se añadió
3H-timidina durante 5 horas; la incorporación por
parte de las células de esta 3H-timidina proporciona
una medida del nivel de proliferación de las células. Entonces se
lisaron las células, y se determinó la incorporación de
3H-timidina. El control positivo fue la proteína Hh,
a una concentración final de 1,0 \mug/ml. La proteína Hh sola
provocó un aumento de aproximadamente 20 veces en la incorporación
de 3H-timidina, consecuente con la conocida
capacidad de Shh de estimular la proliferación de estas células. Las
células estimuladas de proteína no Hh, incluyendo las células
tratadas con el vehículo de control (DMS0), tuvieron unos niveles
muy bajos de proliferación. Sin embargo, se encontró que dos de los
agonistas Hh en la Figura 32 que se probaron, A y B, estimulaban
considerablemente la incorporación de 3H-timidina
en ausencia del tratamiento de proteína Hh, tal y como se representa
en la Figura. A 5,0 \muM, el compuesto p-cianofenil B
provocó una inducción de 10,2 veces más de la incorporación de
3H-timidina. La Figura 37 muestra que el agonista D
también estimuló fuertemente la incorporación de
3H-timidina en ausencia Shh. A 1,0, 0,3, o 0,1
\muNI, D provocó una inducción de 16-, 17-, o 13- veces más,
respectivamente, de la incorporación de 3H timidina en las células.
Estas observaciones demuestran que los agonistas hedgehog
pueden estimular reacciones biológicas hedgehog conocidas en
células diana.
Los ratones machos CD-1 fueron
anestesiados con Avertina, 240 mg/kg IP. Se afeitó y limpió la zona
del lado ventral de la pata del ratón alrededor de la rodilla con
70% de etanol para eliminar el pelo y después se fregó con Betadine.
La piel sobre el muslo se sostuvo con fórceps y se utilizaron unas
tijeras pequeñas para hacer un corte en la piel de ¼
pulgada(\sim6mm). Se quitó la grasa para exponer el nervio
femoral, la arteria y la vena. Con las puntas de los fórceps curvos
a #7 apuntando hacia abajo, se diseminó el músculo justo por debajo
de la arteria/vena femoral para dejar ver el nervio ciático en lo
profundo del músculo. Mientras se usaba un par de fórceps para
aguantar el músculo a parte, se utilizó un segundo para subir
cuidadosamente el nervio. Se fue con cuidado para no levantar las
fibras del músculo. Los fórceps se abrieron y cerraron 3 veces para
separar el nervio del músculo. Se aguantó el nervio levantado del
músculo con los fórceps curvos y se pinzaron los hemostatos al
nervio para mantenerlo en medio de los hemostatos. Los hemostatos se
mantenieron en el lugar durante 10 segundos. Así, ambos nervios
ciáticos se presionaron aproximadamente 1+cm por encima de la
rodilla (y ramificaciones). Se dejaron de sujetar los hemostatos y
el nervio reayó en el músculo. Se utilizó una punta pequeña de
pipeta(P2) para aplicar una cantidad pequeña de tinte para
marcar tejidos histológicos a la zona presionada. Se utilizó una
pinza quirúrgica para cerrar la incisión. Se fue con cuidado para no
pinzar la piel al músculo. Las pinzas se dejaron en su lugar durante
todo el experimento.
Se realizó cirugía de control a un grupo de
ratones. Esto implicó levantar el nervio con los fórceps y dejarlo
recaer en su lugar sin ninguna compresión. Este lugar también se
puede marcar con el tinte histológico.
El tratamiento con medicamentos empezó el mismo
día de la cirugía. Para la proteína Shh, se administró una fusión de
proteína de Shh e inmunoglobina (tal y como se describe en la
Solicitud Provisional Estadounidense No. 60/164025, incorporada aquí
por referencia) a una dosis de 1 mg/kg en una solución de PBS, se
dio una inyección subcutánea en medio del lomo del animal con un
indicador de 28, jeringa de insulina de ½cc y se repitió durante
cada día hasta el día 12-13. (La recuperación fue
completa hasta entonces.) Para la administración de agonista, se
liberó mediante una minibomba (1 \muL/hora), una solución del
agonista en 43% DMSO/PBS (Figuras 38A y 39B), o en 10% DMSO/agua
(Figuras 38B y 39D). Los ensayos de comportamiento se iniciaron el
día 4 post cirugía y continuaron hasta el día 12 o 13.
Se situó un ratón en una rejilla cableada de
metal de 8''x8'' (similar a una rejilla de tubos de ensayo) con
oberturas de 1cm, y la rejilla se invirtió lentamente 10 veces con
un movimiento constante. Se anotó número de veces que el ratón falló
a la hora de agarrarse con sus extremidades izquierda y derecha. Se
apartó el ratón de los bordes de la rejilla y se volvió a colocar
bien en la rejilla cuando fue necesario. Si el ratón enganchó su
pata alrededor o a través de la reja se consideró como fallo. Se
repitió una inversión si el ratón estaba caminando, y falló al
agarrarse a la rejilla.
Los fallos de la pata izquierda y derecha se
juntaron con otros animales de ese grupo experimental (6
animales/grupo x 2 puntuaciones de agarre de pata/animal = 12
puntuaciones de agarre/grupo en cualquier punto temporal dado). Los
resultados para el agonista D se describen en la Figura 38A. Los
animales se trataron con vehículo sólo generalmente empezaron a
recuperarse por sí solos al día 9 post-cirugía. La
Figura 38B describe los resultados obtenidos usando agonista D
disuelto en un vehículo de 10% DMSO/agua en el protocolo de
tratamiento.
Las mediciones de la extensión del dedo comenzó
el día 4 post-cirugía y se midió cada día. El ratón
se sostuvo por la parte proximal de la cola y se le permitió
mantenerse sobre el cable superior de la jaula con sus extremidades
frontales. Se utilizó un pequeño pincel o aplicador de algodón para
pintar los dedos y almohadillas de las patas traseras del ratón. Se
permitió caminar al ratón a través de de una hoja de papel limpia,
para dejar al menos dos imprentas claras de cada extremidad trasera.
Usando una regla, se dibujó una línea a través de las imprentas de
dedos más amplia de cada pie y se midió la distancia entre ellas. A
medida que el animal se recuperaba, la distancia aumentó hasta
medidas normales.
Se hicieron las medias de las puntuaciones de las
patas izquierda y derecha y se juntaron con la de los otros animales
de ese grupo experimental (6 animales/grupo x 2 puntuaciones de
extensión de dedos/animal = 12 puntuaciones de extensión de dedos/
grupo en cualquier punto temporal dado). Los resultados usando
agonista D se describen en las Figuras 39A y B. La Figura 39D
describe los efectos del agonista D disuelto en un vehículo de 10%
DMSO/agua en este protocolo.
Ratones con un transgen
\beta-galactosidasa (ratones
ptc-lacZ) bajo el control regulatorio del locus
patched expresa la proteína
\beta-galactosidasa en las mismas células en las
que el gen patched de ratón endógeno se expresa. La proteína
\beta-galactosidasa puede así utilizarse como un
indicador fiel de la expresión del gen patched endógeno. El
gen patched es un componente conocido de la ruta de
señalización hedgehog y está sobreregulado cuando la ruta hedgehog
está activada. Así, en los ratones ptc-lacZ la
proteína \beta-galactosidasa está sobreexpresada
ya que la ruta hedgehog está activada, resultando en una tinción
azul más intensa, (debido a mayores niveles del enzima
\beta-galactosidasa) cuando los tejidos están
teñidos para la actividad enzimática con el sustrato
X-gal.
Los ratones Ptc lacZ se dividieron en cuatro
grupos de tratamiento y se trataron con los siguientes compuestos o
combinación de compuestos o durante cuatro días, empezando el primer
día tras el nacimiento (dipal-Shh = Sonic hedgehog
dipalmitoilado):
1) | dipal-Shh | 10 mg/kg/inyección | 2X/día |
2) | dipal-Shh | 1 mg/kg/inyección | 2X/día |
vehículo | 10-15 \mul/inyección | 4X/día | |
3) | dipal-Shh | 1 mg/kg/inyección | 2X/día |
agonista B | 15 mg/kg/inyección | 4X/día | |
4) | sin tratamiento |
El vehículo para el agonista fue de 10 % DMSO en
PBS (pH 7,2). El agonista se inyectó de un stock a 4,67mM disuelto
en la solución vehículo.
18 horas tras las últimas inyecciones, se
sacrificaron los ratones y se recogieron los siguientes tejidos:
cráneo, riñón, pulmón, escápula, piel y corazón. Todos los tejidos
se fijaron en 0,2% de glutaraldehído, 5 mM EDTA (pH 8,0), 20 mM de
MgCl_{2}, 100 mM Na_{2}HPO_{4} durante 30 minutos antes de
teñir en 1 mg/ml X-gal, 12,5 mM de ferrocianuro
potásico, 2 mM MgCl_{2}, 0,01% deoxycolato, 0,02%
NP-40, y 100 mM Na_{2}HPO_{4} durante 30 horas.
Los tejidos se juzgaron por su intensidad relativa y se
fotografiaron.
Todos los tejidos del grupo de tratamiento 3
(agonista + dipal-Shh en baja dosis) mostraron una
sobreregulación significativa de la
\beta-galactosidasa (como se visualiza por una
tinción azul más intensa) en comparación con aquellos del grupo de
tratamiento 2 (vehículo + dipal-Shh en baja dosis), como se
ve en la Figura 40, mientras que los tejidos del grupo 3 se muestran
en el lado derecho de cada marco. Las imágenes en la Figura 41
muestran un ejemplo de tejido de cada uno de los cuatro grupos de
tratamiento. La sobreregulación observada en el grupo 3 fue parecida
a la vista en el grupo de tratamiento 1 (dipal-Shh dosis
alta). El nivel de tinción de \beta-galactosidasa
en el grupo de tratamiento 2 fue parecido al visto en el grupo de
tratamiento 4 (sin tratamiento).
El Agonista B fue claramente capaz de
sobreregular la ruta hedgehog in vivo en presencia de
dipal-shh en dosis bajaque por si misma es
insuficiente para producir sobreregulación detectable.
Figura 42: Los ratones Ptc-lacZ
se dividieron en dos grupos de tratamiento y se trataron con los
siguientes compuestos durante tres días, empezando el primer día
después del nacimiento:
1) | vehículo | 8-15 \mul/inyección | 4X/día |
2) | agonista D | 4 mg/kg/inyección | 4X/día |
El vehículo para el agonista fue de 10 % DMSO en
PBS (pH 7,2). El agonista se inyectó de un stock a 1,0mM disuelto
en la solución vehículo.
18 horas tras las últimas inyecciones, se
sacrificaron los ratones y se recogieron las extremidades anteriores
y procesaron como se ha descrito antes. Las extremidades anteriores
de los ratones tratados con agonista mostraron unasobreregulación
fuerte en los nervios, vasos sanguíneos, cartílago, y tejido
conectivo.
El Agonista D fue claramente capaz de
sobreregular la ruta hedgehog in vivo en ausencia de
dipal-Shh. La sobreregulación vista en esta dosis de agonista
D es mayor que la vista en las inyecciones de dipal-Shh a 10
mg/kg/inyección, 2X/día.
En un tercer experimento, los ratones
Ptc-lacZ se dividieron en cinco grupos de
tratamiento y se trataron con los siguientes compuestos durante
cuatro días, empezando el primer día después del nacimiento:
1) | vehículo | 9-20 \mul/inyección | 4X/día |
2) | agonista D | 0,9 mg/kg/inyección | 4X/día |
3) | agonista D | 0,3 mg/kg/inyección | 4X/día |
4) | agonista D | 0,1 mg/kg/inyección | 4X/día |
5) | octil-shh | 10 mg/kg/inyección | 2X/día |
El vehículo para el agonista fue de 10 % DMSO en
PBS (pH 7,2). El agonista se inyectó de stocks a 0,3, 0,1 y 0,03mM
disuelto en la solución vehículo.
18 horas tras las últimas inyecciones, se
sacrificaron los ratones y se recogieron las extremidades anteriores
y se procesaron como se ha descrito antes. Los resultados de este
experimento se muestran en la Figura 43, en la que no se muestra el
vehículo control. Las extremidades anteriores de los ratones
tratados con agonista mostraron de nuevo una sobreregulación fuerte
en los nervios, vasos sanguíneos, cartílago, y tejido conectivo (en
comparación con el grupo vehículo). El grupo de 0,9 mg/kg mostró los
niveles más altos de sobreregulación en este experimento. Ambos
grupos de dosis de 0,9 mg/kg y 0,3 mg/kg mostraron mayor
sobreregulación que el grupo de 10 mg/kg de proteína Hh. El grupo de
0,1 mg/kg mostró una sobreregulación muy débil que fue claramente
inferior a la vista en el grupo de proteína Hh.
El Agonista D fue claramente de sobreregular la
ruta hedgehog in vivo en una forma de respuesta a dosis. La
sobreregulación vista en las dosis de 0,9 y 0,3 mg/kg de agonista D
es mayor que las vistas en las inyecciones de proteína Hh en 10
mg/kg/inyección, 2X/día.
Se recogieron pulmones lacZ E12.5
ptc-1 (d11) y se identificaron los embriones
transgénicos por detección de lacZ usando colas. Los explantes se
ensamblaron en filtros de 1 \mum pe de policarbonato (Costar)
situados sobre rejillas de plástico (cámara histológica de
imbibición) y se situaron en placas de cultivo de tejidos estándar
de 12-pocillos rellenadas con medio de cultivo de
explante de pulmón (basado en DMEM, aditivos optimizados para
cultivo de pulmones de ratón) durante 48h, fijados en fijador de
lacZ enjuagado y teñido para lacZ O/N a 37ºC.
Los resultados se muestran en la Figura 44. En el
panel de control de la izquierda, se puede observar la expresión de
LacZ en el mesénquima inmediatamente adyacente a las puntas
de ramificación distales, un patrón que refleja una expresión
endógena patched. El tratamiento con 5 \muM de agonista B lleva a
una expresión de gen indicador que ha aumentado significativamente y
a una expansión del dominio de expresión del transgén, indicativo de
la sobre regulación de la trayectoria hedgehog. El panel de más a la
derecha muestra los resultados del tratamiento con 5 \mug/mL de
proteína Hh.
Se recogieron pulmones E13.5 antiguos
ptc-1 (d11) lacZ y se identificaron embriones
transgénicos por la detección lacZ usando colas. Los explantes se
ensamblaron en 1 \mum filtros de
policarbonato(Costar)situados sobre rejillas de
plástico (cámara histológica de imbibición) y se situaron en placas
de cultivo estándar de 12-pocillos que se rellenaron
con medio de cultivo de explante de riñón (basado en DMEM, aditivos
optimizados para cultivo de pulmones de ratón) durante 48h, fijados
en fijador de lacZ enjuagado y teñido para lacZ O/N a 37ºC.
Los resultados se muestran en la Figura 45. En el
panel de control de la izquierda, se puede observar la expresión de
LacZ en el mesénquima inmediatamente adyacente al epitelio
uretérico más próximo, un patrón que refleja una expresión endógena
patched. El tratamiento con 5 \muM de agonista B lleva a una
expresión de gen indicador que ha aumentado significativamente y a
una expansión del dominio de expresión del transgén, indicativo de
la sobre regulación de la trayectoria hedgehog. Tener en cuenta que
el señal permanece localizado en la mesénquima y no se expande en
los epitelios uretérico y tubular situados a mayor distancia,
indicando que solo los tipos de células mesénquimas que responden al
señal de hedgehog en la situación endógena responden al agonista,
mientras que los tipos de células que habitualmente no activan esta
trayectoria no son afectadas por el tratamiento agonista. El panel
de más a la derecha muestra los resultados del tratamiento 5
\mug/mL de proteína Hh.
Se extirpó piel de los cachorros
ptc-lacZ E17.5 con un perforador de 2 mm. Entonces,
esas muestras de piel se cultivaron durante 6 días en medios de
control, o medios que incluían o bien agonista B o D o proteína Hh,
o bien medios que incluían tanto agonista como Hh. Entonces, se
tiñeron los explantes con tinte X-Gal. La Figura 46A
muestra los resultados para el agonista B. El tratamiento con solo
el agonista muestra mayor tinción que cultivando con una baja dosis
de proteína Hh sola, y el tratamiento con agonista y una baja dosis
de proteína Hh muestra una tinción parecido al de una dosis
sustancialmente mayor de proteína Hh. En la Figura 46B se presentan
resultados análogos para el agonista D.
Las Figuras 47A y B comparan la actividad de los
compuestos O y R en las células indicadoras de ratones (células TM3
con una construcción indicadora Gli-Luc, tal
y como se ha descrito arriba) y en las células indicadoras humanas
(células mesénquimas palatales embrionarias humanas (HEPM) con una
construcción Gli-Luc). La Figura 48 muestra
un análisis PRC cuantitativo de RNA expresado del gen diana
hedgehog Gli-1 en células humanas tratadas
con el vehículo, proteína Hh, y el agonista O. La activación de la
línea celular indicadora y el mensaje elevado
Gli-1 en respuesta a los compuestos demuestra
que este agonista funciona en las células humanas.
En las Figuras 1-31 se muestran
los esquemas sintéticos ejemplares para generar los agonistas
hedgehog útiles en los métodos y composiciones de la presente
invención.
Las condiciones de reacción de los esquemas
ilustrados en las Figuras 1-31 son las
siguientes:
1) R_{1}CH_{2}CN,NaNH_{2}, tolueno
- (Arzneim-Forsch, 1990,40,11,1241)
2) H_{2}SO_{4},H_{2}O, relujo
- (Arzneim-Forsch, 1990,40,11',1241)
4) NaOH, EtOH, reflujo
5) (Boc)_{2}O, 2M NaOH, THF
6) LiHDMS, R_{1}X, THF
- (Solicitud de Patente Merck # WO 96/06609)
7) Pd-C, H_{2}, MeOH
8) t-BuONO, CuBr, HBr,
H_{2}O
- (J. Org. Chem. 1977,42,2426)
9) ArB(OH)_{2},
Pd(PPh_{3})_{4}, Dioxano
- (J. Med. Chem. 1996,39,217-223)
10) R_{12}(H)C=CR_{13}R_{14},
Pd(OAc)_{2}, Et_{3}N, DMF
- (Org. React. 1982, 27, 345)
11) Tf_{2}O, THF
- (J. Am. Chem. Soc. 1987,109,5478-5486)
12) ArSnBu_{3}, Pd(PPh_{3})4,
Dioxano
- (J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486)
13) KMnO_{4}, Py, H_{2}O
- (J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223)
14) NaOR_{1}, THF
15) NaSR_{1}, THF
16) HNR_{1}R_{13}, THF
17) HONO, NaBF_{4}
- (Adv. Fluorine Chem. 1965,4,1-30)
18) Pd(OAc)_{2}, NaH, DPPF,
PhCH_{3}, R_{1}OH
- (J. Org. Chem. 1997,62,5413-5418)
19) i. R_{1}X, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}, ii.
R_{13}X
20) SOCl_{2}, cat DMF
21) CH_{2}N_{2}, Et_{2}O
22) Ag_{2}O, Na_{2}CO_{3},
Na_{2}S_{2}O_{3}, H_{2}O
- (Tetrahedron Lett. 1979, 2667)
23) AgO_{2}CPh, Et_{3}N, MeOH
- (Org. Syn., 1970, 50, 77; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5432)
24) LiOH, THF-MeOH
25)(EtO)_{2}P(O)CH_{2}CO_{2}R,
BuLi, THF
26)
MeO_{2}CCH(Br)=P(Ph)_{3}, benceno
27) KOH o KOtBu
28) Base,
X(CH_{2})_{n}CO_{2}R
29) DPPA, Et_{3}N, tolueno
- (Synthesis 1985, 220)
30) NONO, H_{2}O
31) SO_{2}, CuCl, HCl, H_{2}O
- (Synthesis 1969, 1-10, 6)
32) Reactivo Lawesson, tolueno
- (Tetrahedron Asym. 1996, 7, 12, 3553)
33) R_{2}M, solvente
34) 30% H_{2}O_{2}, CH_{3}CO_{2}H
glacial
- (Helv. Chim. Acta. 1968, 349, 323)
35) trifosgeno, CH_{2}Cl_{2}
- (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
36)
i.(EtO)_{2}P(O)CHLiSO_{2}Oi-Pr,
THF, ii. NaI
37) Ph_{3}PCH_{3}I,
NaCH_{2}S(O)CH_{3}, DMSO
- (Synthesis 1987, 498)
\newpage
38) Br_{2}, CHCl_{3} o otro solvente
- (Synthesis 1987, 498)
39) BuLi, Bu_{3}SnCl
40) ClSO_{2}OTMS, CCl_{4}
- (Chem. Ber. 1995, 128, 575-580)
41) MeOH-HCl, reflujo
42) LAH, Et_{2}O o LiBH_{4}, EtOH o
BH_{3}-THF
- (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
43) MsCl, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
- (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
44) Na_{2}SO_{3}, H_{2}O
- (Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
45) R_{2}R_{4}NH, Et_{3}N,
CH_{2}Cl_{2}
46) R_{2}M, solvente
47) CH_{3}NH(OCH_{3}), EDC, HOBt,
DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF
- (Tetrahedron Lett, 1981, 22, 3815)
48) MeLi, THF
49) mCPBA, CH_{2}Cl_{2}
50) HONO, Cu_{2}O,
Cu(NO_{3})_{2}, H_{2}O
- (J. Org. Chem. 1977, 42, 2053)
51) R_{1}M, solvente
52) HONO, NaS(S)COEt, H_{2}O
- (Org. Synth. 1947, 27, 81)
53) HSR_{2} o HSR_{4}, CH_{2}Cl_{2}
54) i-BuOC(O)Cl,
Et_{3}N, NH_{3}, THF
55) R_{2}R_{4}NH, CH_{2}Cl_{2},
NaBH(OAc)_{3}
56) R_{2}R_{4}NH, MeOH/CH_{3}CO_{2}H,
NaBH_{3}CN
57) R_{2}OH, EDC, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2}
o DMF
58) R_{2}OH, HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2}
o DMF
59) R_{2}R_{4}NH, EDC, HOBt, DIEA,
CH_{2}Cl_{2} o DMF
60) R_{2}R_{4}NH, HBTU, HOBt, DIEA,
CH_{2}Cl_{2} o DMF
61) POCl_{3}, Py, CH_{2}Cl_{2}
62) R_{2}R_{4}NCO, solvente
63) R_{2}OC(O)C1, Et_{3}N,
solvente
64) R_{2}CO_{2}H, EDC o HBTU, HOBt, DIEA,
CH_{2}Cl_{2} o DMF
65) R_{2}X, Et_{3}N, solvente
66) (CH_{3}S)_{2}C=N(CN), DMF,
EtOH
- (J. Med. Chem. 1994, 37, 57-66)
67) R_{2}SO_{2}Cl, Et_{3}N,
CH_{2}Cl_{2}
68) R_{2}- o R_{3}- o R_{4}CHO,
MeOH/CH_{3}CO_{2}H, NaBH_{3}CN
- (Synthesis 1975,135-146)
69) Boc(Tr)-D o
L-CysOH, HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o
DMF
70) Boc(Tr)-D o
L-CysH, NaBH_{3}CN, MeOH/CH_{3}CO_{2}H
- (Synthesis 1975, 135-146)
71)
S-Tr-N-Boc de
cisteina, ClCH_{2}CH_{2}Cl o THF,
NaBH(OAc)_{3}.
- (J. Org. Chem. 1996, 61, 3849-3862)
72) TFA, CH_{2}Cl_{2}, Et_{3}SiH o (3:1:1)
tioanisol/etanoditiol/DMS
73) TFA, CH_{2}Cl_{2}
74) DPPA, Et_{3}N, tolueno,
HOCH_{2}CH_{2}SiCH_{3}
- (Tetrahedron Lett. 1984, 25, 3515) 7
75) TBAF, THF
76) Base, TrSH o BnSH
77) Base, R_{2}X o R_{4}X
78) R_{3}NH_{2}, MeOH/CH_{3}CO_{2}H,
NaBH_{3}CN
79) N_{2}H_{4}, KOH
80) Pd_{2}(dba)_{3},
P(o-tol)_{3}, RNH_{2}, NaOtBu,
Dioxano, R_{1}NH_{2}
- (Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7181-7184).
81) Cianamida.
82) Fmoc-Cl, bicarbonato
sódico.
83) BnCOCI, carbonato sódico.
84) AliloOCOCI, piridina.
85) Bromuro de bencilo, base.
86) Cloruro Oxalilo, DMSO.
87) RCONH_{2}.
88) Carbonildiimidazol, solventes neutrales (ej.
DCM, DMF, THF, tolueno).
89) Tiocarbonildiimidazol, solventes neutrales
(ej. DCM, DMF, THF, tolueno).
90) Bromuro de cianogeno, solventes neutrales
(ej. DCM, DMF, THF, tolueno).
91) RCOCl, Trietilamina
92) RNHNH_{2}, EDC.
93) RO_{2}000Cl, Et_{3}N, DCM.
94) MsOH, Piridina (J. Het. Chem., 1980,
607.)
95) Base, solventes neutrales (ej. DCM, tolueno,
THF).
96) H_{2}NOR, EDC.
97) RCSNH_{2}.
98) RCOCHBrR, solventes neutrales (ej. DCM, DMF,
THF, tolueno), (Org. Proc. Prep. Intl., 1992,24, 127).
99) CH_{2}N_{2}, HCl. (Synthesis,
1993,197).
100) NH_{2}NHR, solventes neutrales (ej. DCM,
DMF, THF, tolueno).
101) RSO_{2}Cl, DMAP. (Tetrahedron Lett., 1993,
34, 2749).
102) Et_{3}N, RX. (J. Org. Chem., 1990, 55,
6037).
103) NOCl o Cl_{2} (J. Org. Chem., 1990, 55,
3916).
104) H_{2}NOH, solventes neutrales (e.g., DCM,
DMF, THF, tolueno).
105) RCCR, solventes neutrales (DCM, THF,
Tolueno).
106) RCHCHR, neutral solvents (DCM, THF,
Toluene).
107) H_{2}NOH, HCl.
108) Tiocarbonildiimidazol, SiO_{2} o
BF_{3}OEt_{2}. (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228).
109) Tiocarbonildiimidazol, DBU o DBN. (J. Med.
Chem., 1996, 39, 5228).
110) HNO_{2}, HCl.
111) ClCH_{2}CO_{2}Et (Org. Reactions, 1959,
10,143).
112) Enamina morfolina (Eur. J. Med. Chem.,
1982,17, 27).
113) RCOCHR'CN
114) RCOCHR'CO_{2}Et
115) Na_{2}SO_{3}
116) H_{2}NCHRCO_{2}Et
117) EtO_{2}CCHRNCO
118) RCNHNH_{2}.
119) RCOCO_{2}H, (J. Med. Chem.,
1995,38,3741).
120) RCHO, KOAc.
121) 2-Fluoronitrobenceno.
122) SnCl2, EtOH, DMF.
123) RCHO, NaBH_{3}CN, HOAc.
124) NH_{3}, MeOH.
125)
2,4,6-Me_{3}PhSO_{2}NH_{2}.
126) Et_{2}NH, CH_{2}Cl_{2}
127) MeOC(O)Cl, Et_{3}N,
CH_{2}Cl_{2}
128) R_{2}NH_{2}, EDC, HOBT, Et_{3}N,
CH_{2}Cl_{2}
129) DBU, PhCH_{3}
130)
BocNHCH(CH_{2}STr)CH_{2}NH_{2}, EDC, HOBT,
Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
131) R_{2}NHCH_{2}CO_{2}Me, HBTU, HOBT,
Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
132)
BocNHCH(CH_{2}STr)CH_{2}OMs, LiHMDS, THF
133) R_{2}NHCH_{2}CO_{2}Me,
NaBH(OAc)_{3}, ClCH_{2}CH_{2}Cl o THF
134)
R_{2}NHCH_{2}CH(OEt)_{2}, HBTU, HOBT, Et_{3}N,
CH_{2}Cl_{2}
135) NaBH(OAc)_{3},
ClCH_{2}CH_{2}Cl o THF, AcOH.
136) Piperidina, DMF.
137) Pd(Ph_{3}P)_{4},
Bu_{3}SnH.
138) RCO_{2}H, EDC, HOBT, Et_{3}N, DCM.
139) RNH_{2}, solventes neutrales.
140) RCHO, NaBH_{3}CN, HOAc.
141) RNCO, solvente.
142) RCO_{2}H, EDC o HBTU, HOBt, DIEA,
CH_{2}Cl_{2} o DMF.
143) RCOCl, Trietilamina
144) RSO_{2}Cl, Et_{3}N,
CH_{2}Cl_{2}.
145) SnCl_{2}, EtOH, DMF.
146) RNH_{2}, EDC, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2}
o DMF.
147) Dibromoetano, Et_{3}N,
CH_{2}Cl_{2}
148) Cloruro de oxalil, solventes neutrales.
149) LiOH, THF-MeOH.
150) Carbonildiimidazol, solventes neutrales (ej.
DCM, DMF, THF, tolueno).
151) RNH_{2}, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}.
152) Base, RX.
153) DBU, PhCH_{3}
154) DPPA, Et_{3}N, tolueno (Synthesis 1985,
220)
155) SOCl_{2}, cat DMF.
156) ArH, Ácido de Lewis (AlCl_{3}, SnCl_{4},
TiCl_{4}), CH_{2}Cl_{2}.
157) H_{2}NCHRCO_{2}Et, solventes
neutrales.
158) BocHNCHRCO_{2}H, EDC o HBTU, HOBt, DIEA,
CH_{2}Cl_{2} o DMF.
159) TFA, CH_{2}Cl_{2}.
Se puede dar función a las subunidades de arilo
utilizando una gran variedad de reacciones que ya conocen los
expertos en la materia. La química de los anillos aromáticos y
heteroaromáticos es muy rica, y aquí solo se pueden mostrar algunos
ejemplos de reacciones que son útiles. A continuación se muestran un
número de ejemplos ilustrativos particularmente útiles para generar
porciones de biarilo de los compuestos.
Acoplamiento de Suzuki núm. 1:
Acoplamiento de Suzuki núm. 2:
Acoplamiento de Stille núm. 1:
Acoplamiento de Stille núm. 2:
\newpage
Acoplamiento de Stille núm. 3:
Los miembros de las categorías de los sustratos
de acoplamiento resaltados arriba - arilestanano, ácidos
arilbóricos, triflatos de arilo y haluros de arilo - están
disponibles de los heterociclos parentales. En general, las
transformaciones necesarias para preparar un sustrato de
acoplamiento son fáciles y cómodas para el escalaje. A continuación
se muestran ejemplos ilustrativos.
Preparación de un Yoduro de arilo
Preparación de un Estanano de arilo
Preparación de un Triflato de arilo
Preparación de Ácido bórico de arilo
Método 1: agua (3x), acetona (2x),
N,N-dimetilformamida (3x), agua (2x), acetona (lx),
N,N-dimetilformamida (3x), agua(2x), acetona (3x),
metanol (3x), acetona (3x) y metanol (3x);
Método 2: diclorometano, hexano,
N,N-dimetilformamida, diclorometano, hexano, diclorometano y
hexano;
Método 3: agua, N,N-dimetilformamida,
agua, 1,0M de solución de hidróxido sódico acuosa, agua,
N-N-dimetil-
formamida, agua, 1,0 de solución de hidróxido sódico acuosa, agua, N,N-dimetilformamida, diclorometano, metanol, diclorometano y metanol.
formamida, agua, 1,0 de solución de hidróxido sódico acuosa, agua, N,N-dimetilformamida, diclorometano, metanol, diclorometano y metanol.
Método 4: N,N-dimetilformamida,
diclorometano, N,N-dimetilformamida, diclorometano,
metanol, diclorometano, metanol (2x) y éter (2x).
Esquema
General
\newpage
Paso
A
Se añadió lentamente metóxido sódico (233 g, 4,31
mol) a una mezcla en agitación de clorometil poliestireno (2,4 kg,
3,6 mol carga funcional) y 4-hidroxibenzil alcohol
(581 g, 4,68 mol) en N,N-dimetilacetamida (10L) a
temperatura ambiente bajo nitrógeno. Tras diluir con
N,N-dimetilacetamida (13L), la mezcla se calentó a
50ºC durante 5 h y luego se filtró por una cánula a través de un
filtro P-ETFE (70 \mum). El producto bruto se lavó
extensivamente usando la secuencia del Método 1, después se secó al
vacío a 60ºC para proporcionar 2630 g de la resina del título.
4-Metilmorfolina (660 mL, 6,0
mol) se añadió por goteo durante 2h a una mezcla agitada de
hidroxibenz-4-iloximetil
poliestireno (2000 g, 2,5 mol carga funcional) y
4-nitrofenol cloroformato (1209 g, 6,0 mol) en
diclorometano (22L) a (0ºC bajo nitrógeno). La mezcla se calentó
gradualmente a temperatura ambiente, se agitó durante la noche y se
filtró por una cánula en un filtro P-ETFE (70
\mum). La resina bruta se lavó extensivamente usando la secuencia
del Método 2, luego se secó al vacío a temperatura ambiente para
proporcionar 2728 g de una mezcla de la resina del título y
clorhidrato de 4-metilmorfolina.
Paso
B
(Nitrofen-4'-iloxicarboxi)benz-4-iloximetil
poliestireno bruto (1002,5 g, \sim 0,9 mol carga funcional) se
hinchó durante 15 min en una mezcla 50% v/v de diclorometano anhidro
y N,N-dimetilformamida (9L) bajo nitrógeno.
N,Ndiisopropilamina (626 mL, 5 mol equivalentes) y se añadió la
diamina apropiada (5 mol equivalentes) y la mezcla se agitó
enérgicamente toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla se
filtró a través de un filtro-P-ETFE
(70 \mum), se lavó intensamente usando la secuencia del Método 3
y se secó al vacío a 60ºC para proporcionar la diamina unida a la
resina.
(Nitrofen-4'-iloxicarboxi)benz-4-iloximetil
poliestireno bruto (1002,5 g, -0,9 mol carga funcional) se hinchó
durante 15 min en diclorometano (7L) bajo nitrógeno y se trató con
etilendiamina (181 mL, 2,7 mol). La suspensión resultante espesa,
amarilla se diluyó con diclorometano (2L) y se agitó vigorosamente
toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla se lavó intensamente
usando la secuencia del Método 3 y se secó al vacío a 60ºC para
proporcionar la diamina unida a resina.
(Nitrofen-4'-iloxicarboxi)benz-4-iloximetil
poliestireno bruto (1002,5 g, -0,9 mol carga funcional) se hinchó en
tetrahidrofurano (7L) durante 15 min bajo nitrógeno y se trató con
una solución de m-xililendiamina (828 mL, 6,27 mol)
en tetrahidrofurano (1L). La suspensión resultante espesa, amarilla
se diluyó con diclorometano (2L) y se agitó vigorosamente toda la
noche a temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de un
filtro-P-ETFE (70 \mum), se lavó
intensamente usando la secuencia del Método 3 y se secó al vacío a
60ºC para proporcionar la diamina unida a
resina.
resina.
Paso
C
Una suspensión del bromuro de arilo apropiado (1
equivalente) y carbonato potásico (2,2 equivalentes) entolueno (13
volúmenes) se agitó y desgasificó a temperatura ambiente.
Tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (0,01
equivalente) se añadió y el vaso de reacción se evacuó y purgó con
nitrógeno (tres veces). Tras 15 min, una solución desgasificada de
ácido
2-metoxi-5-formilfenilborónico
(1,2 equivalentes) en etanol (6,3 volúmenes) se añadió con una
cánula, entonces se calentó la mezcla bajo reflujo y se agitó
durante la noche bajo nitrógeno. Tras enfriar, el sólido se filtró
de la solución y se lavó vigorosamente con tolueno. El filtrado se
evaporó hasta la sequedad bajo presión reducida para proporcionar el
producto bruto. Este se trituró con éter dietílico (5 volúmenes) y
la solución resultante se filtró, y lavó con éter dietílico y se
secó al vacío. El biaril aldehído se obtuvo como un polvo
amarillo.
\newpage
Paso
D
La resina apropiada (1 equivalente, -0,75 mmol
carga funcional) se hinchó en una mezcla de tetrahidrofurano,
trimetilortoformato y diclorometano (1:1:1, v/v/v, 10 mL) durante 15
min, entonces se agitó generosamente y se trató con el aldehído
apropiado (2 equivalentes). Tras la agitación vigorosa durante la
noche a temperatura ambiente, la resina se filtró, se lavó
vigorosamente con tetrahidrofurano y se secó al vacío a 40ºC. La
resina secada se hinchó entonces en tetrahidrofurano durante 15 min
y se trató con ácido acético (0,12 equivalente) y
triacetoxiborhidruro sódico (5 equivalentes). La suspensión de
resina se agitó generosamente durante la noche a temperatura
ambiente, entonces se filtró, se lavó intensamente usando la
secuencia del Método 4 y se secó al vacío a 60ºC.
La resina apropiada (1 equivalente) se hinchó en
diclorometano (10 volúmenes) durante 10 min y se trató con el
cloruro ácido apropiada (3 equivalentes) y
N,N-diisopropiletilamina (3 equivalentes). La
suspensión de resina se agitó vigorosamente durante la noche a
temperatura ambiente, se filtró, y se lavó intensamente usando la
secuencia del Método 4 y se secó al vacío a 40ºC.
El siguiente esquema ejemplar ilustra una ruta a
través de la cual los agonistas hedgehog de la presente
invención pueden prepararse. Las variaciones en esta ruta ejemplar
se entenderá fácilmente y se realizara por aquellos entendidos en la
materia, permitiendo la preparación de un amplio rango de compuestos
que caen dentro de la fórmula general presentada. Los números de
compuesto usados por este esquema son consistentes con los
procedimientos de debajo, y son independientes de los números de
compuesto usados en cualquier otro lugar de la solicitud, como puede
ser las figuras.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de
di-t-butil-dicarbonato
(12,0 g, 54,7 mmol) y tetrahidrofurano (250 mL) se añadió lentamente
bajo nitrógeno durante 3h a una suspensión de
1,4-diaminociclohexano (50,0 g, 0,44 mol) en
tetrahidrofurano (250 mL) mientras se mantiene la temperatura por
debajo de 10ºC. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y
se agitó subsiguientemente durante 16 horas, luego se filtró. El
filtrado se concentró al vacío para proporcionar un residuo. Se
añadió agua (500 mL) al residuo, seguido por la agitación durante
aproximadamente 15 min, tras el cual la mezcla se filtró y la fase
acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 200 mL). Los extractos
orgánicos se combinaron y se concentraron para proporcionar un
residuo que se disolvió en t-butilmetil éter (350
mL) y se lavó con agua (3 x 50 mL). El t-butilmetil
éter se eliminó al vacío para proporcionar el compuesto del título 1
(8,1 g, 69%) como un sólido: \deltaH (360 MHz: CDCl_{3})
1,06-1,24 (m, 41-1), 1,43 (s, 913),
1,83 (d, 2H), 1,98 (d,2H), 2,56-2,66 (m, 1H),
3,30-3,35 (m, 1H) y 4,31-4,38 (m,
1H).
Amina 1 (15,0 g, 0,7 mol) se añadió lentamente
durante 45 min a una solución 1N de hidruro de aluminio litio en THF
(450 mL, 0,36 mol) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó durante 30 min
a temperatura ambiente, luego se agitó a reflujo durante
5-6 horas bajo nitrógeno. Se añadió agua (13,2 mL) a
la mezcla seguido por 15% de hidróxido sódico acuoso (13,2 mL), y
agua (39,7 mL). La mezcla se agitó entonces durante
15-30 min. El sólido se eliminó por filtración y se
lavó con t-butilmetil éter (200 mL), diclorometano
(200 mL), y t-butilmetil éter (200 mL). Los
extractos orgánicos se recogieron, se secaron (MgSO_{4}), y
filtraron. El agente secante se lavó entonces con diclorometano y
los extractos orgánicos se combinaron y concentraron al vacío para
proporcionar el compuesto del título 2 (7,52 g, 84%) como un sólido
amarillo pálido: \deltaH (360 MHz: CDCl_{3}) 1,041,20 (q, 4H),
1,51 (br s, 311), 1,80-1,96 (m, 4H),
2,25-2,35 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,612,72 (m,
1H).
Benzaldehído (12,8 mL, 0,13 mol) se añadió en una
porción simple a una solución de N-metilamina 2
(16,2 g, 0,13 mol) y tolueno (150 mL) bajo nitrógeno La mezcla
resultante se calentó a reflujo usando un aparato Dean Stark durante
4 h. Tras dejar la mezcla enfriara temperatura ambiente, se añadió
el di-t-butil dicarbonato (27,5 g,
0,13 mol) en porciones y la mezcla se agitó durante 16h. La mezcla
se concentró al vacío para dejar un aceite amarillo, al que se
añadió 1N hidrógeno sulfato potásico acuoso (90 mL) seguido por
agitación vigorosa hasta que TLC indicó que se había completado la
reacción (\sim 2,5 h). La mezcla se extrajo en éter (3 x 100 mL) y
la fase acuosa se hizo alcalina (pH \sim 12) con hidróxido sódico
acuoso. La fase acuosa se saturó entonces con cloruro sódico y el
producto se extrajo en cloroformo (3 x 40 mL). Los extractos
combinados se concentraron al vacío para proporcionar el compuesto
del título 3 (16,3 g, 59%) como un aceite amarillo: \deltaH (360
MHz: CDCl_{3}) 1,11-1,34 (m, 5H), 1,45 (s, 9H),
1,66 (br d, 2H), 1,90 (br d, 2H), 2,56-2,66 (m,
113), 2,71 (s, 3H) y 3,98 (br s, 211).
Una solución de amina 3 (5.0 g, 21,92 mmol),
aldehído 4 (5,19 g, 21,92 mmol) y trimetil ortoformato (50 ml) se
agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 h.
Triacetoxiborhidruro sódico (6,5 g, 30,7 mmol) se añadió luego por
porciones y la mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta
completar la reacción, como se determinó por, análisis
LC-MS. Se añadió agua cuidadosamente y la mezcla se
agitó durante 5 min, seguido por la separación de las capas. La capa
de trimetil ortoformato se vertió en hidrógeno sulfato potásico
acuoso 1N (100 mL) y se agitó durante 15 min. El sólido precipitado
se filtró, y lavó con agua (50 mL), enfriada con tributil metil éter
(3 x 30 mL). El precipitado lavado se suspendió entonces en
diclorometano (150 mL) al que se añadió hidrógeno carbonato sódico
acuoso saturado (50 mL) y el pH se hizo alcalino
(pH-10) mientras se mantuvo en agitación vigorosa.
La capa de diclorometano se lavó con agua, y salmuera, y el extracto
orgánico se secó (MgSO_{4}) y se concentró al vacío para
proporcionar el compuesto del título 5 (6,9 g, 69%) como un sólido
blanco apagado: \deltaH (360 MHz: CDCl_{3})
1,18-1,31 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 1,68 (d, 2H), 2,01
(d, 2H), 2,44-2,56 (m, 1H), 2:69 (s, 3H), 3,76 (s,
2H), 3,80 (s, 3H), 6,92 (d, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,29 (d, 1H), 7,61
(d, 2H) y 7,66 (d, 2H).
N,N-Diisopropiletilamina (2,1 mL,
12,1 mmol) se añadió a una solución de amina 5 (2,2 g, 4,9 mmol),
cloruro de
3-clorobenzo[b]tiofen-2-carbonilo
(1,3 g, 5,86 mmol) y diclorometano anhidro (22 mL), con agitación
bajo argón. Una vez que todo el material de partida ha sido
consumido como se monitorizó por TLC (\sim2,5 horas), la mezcla se
lavó con agua, hidrógeno carbonato sódico saturado acuoso, y
salmuera. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}), y concentró al
vacío. El residuo amarillo se purificó entonces por cromatografía en
gel de sílice usando hexano/acetato de etilo 3:1 para proporcionar
el compuesto del título 6 (2,93 g, 93%) como un sólido amarillo
pálido.
Se añadió ácido clorhídrico concentrado (27,5
mL), a una solución del compuesto 6 (11,0 g, 17,1 mmol) y etanol
(82,5 mL). La mezcla se agitó hasta completar la reacción como se
monitorizó por TLC. La mezcla se concentró al vacío y se añadió
diclorometano y se concentró de nuevo, esto se repitió hasta que se
obtuvo un sólido. El sólido se mezcló con
t-butilmetil éter (30 mL), se filtró, y la capa
orgánica se secó (MgSO_{4}) y se concentró al vacío para
proporcionar elcompuesto del título 7 (10,0 g, 99%): \deltaH (360
MHz: DMSO, 70ºC)1,30-1,50 (m, 2H), 1,85 (lac
s, 4H), 2,12 (br d, 2H), 2,48 (s, 3H), 2,91 (br t, 1H), 3,81 (s,
3H), 3,87 (br s, 1H), 4,71 (s, 2H), 7,14 (d,1H), 7,29 (s, 1H), 7,40
(d, 1H), 7,57-7,68 (m, 4H),
7,80-7,90 (m, 3H), 8,09 (d, 1H), 8,82 (br s,
2H).
Todas las publicaciones y patentes citadas aquí
se incorporan por referencia en su totalidad.
Aquellos entendidos en el campo reconocerán, o
serán capaces de averiguar usando la experimentación habitual,
muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención
descritas aquí. Tales equivalentes se proponen estar abarcados por
las siguientes reivindicaciones.
Claims (76)
1. Una preparación farmacéutica que comprende un
compuesto con una estructura de Fórmula VIII:
Fórmula
VIII
En donde, como valencia se permite,
U representa un arilo sustituido o sin sustituir
o anillo heteroarilo fusionado al anillo que contiene
nitrógeno;
V representa metileno,
1,1-etileno ó 1,1-propileno;
W representa S ó O, preferiblemente O;
X representa C=O, C=S, o SO_{2};
R_{3} representa, arilo, heteroarilo, alquilo
inferior, alquenilo inferior sustituido o sin sustituir, alquinilo
inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo,
heterociclilalquilo, aralquilo, o heteroaralquilo;
R_{4} representa, un aralquilo o alquilo
inferior sustituido o sin sustituir, tales como un fenetilo,
benzilo, o aminoalquilo, etc;
R_{5} representa, un arilo, heteroarilo,
aralquilo, o heteroaralquilo sustituido o sin sustituir, incluyendo
grupos aromáticos policíclicos o heteroaromáticos.
o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
2. Un método in vitro para modular la
proliferación o diferenciación de una célula, que comprende
contactar la célula con un compuesto que posee una estructura de
Fórmula VIII:
Fórmula
VIII
En donde, como valencia se permite,
U representa un arilo sustituido o sin sustituir
o anillo heteroarilo fusionado al anillo que contiene
nitrógeno;
V representa metileno,
1,1-etileno ó 1,1-propileno;
W representa S ó O, preferiblemente O;
X representa C=O, C=S, o SO_{2};
R_{3} representa, arilo, heteroarilo, alquilo
inferior, alquenilo inferior sustituido o sin sustituir, alquinilo
inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo,
heterociclilalquilo, aralquilo, o heteroaralquilo;
R_{4} representa, un aralquilo o alquilo
inferior sustituido o sin sustituir, tales como un fenetilo,
benzilo, o aminoalquilo, etc;
R_{5} representa, un arilo, heteroarilo,
aralquilo, o heteroaralquilo sustituido o sin sustituir, incluyendo
grupos aromáticos policíclicos o heteroaromáticos.
o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
3. Una preparación farmacéutica que comprende un
excipiente estéril farmacéuticamente aceptable y un compuesto
representado por la Fórmula general (IX):
Fórmula
IX
En donde, como valencia se permite,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo arilo,
carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o sin
sustituir, un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente siempre excepto en la secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar
donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o -Se-,
a menos que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está
ausente;
R representa, independientemente para cada caso,
H o alquilo sustituido o sin sustituir;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-,
-S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)-;
M representa, independientemente para cada caso,
un grupo metileno sustituido o sin sustituir;
Cy representa un anillo carbocíclico o
heterocíclico de seis miembros no aromático directamente unido a N y
lleva un sustituyente amino en la posición 4 del anillo relacionado
con N;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido
o sin sustituir; incluyendo grupos policíclicos;
i representa 0 para todos los casos excepto en la
secuencia
N-M_{i}-Y-Ar,
donde i representa 1; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y=M_{k}-Y-Ar,
donde k representa un número entero de 0 a 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
4. La preparación farmacéutica de la
reivindicación 3, donde los sustituyentes N y amina sobre Cy están
dispuestos trans en el anillo.
5. Una preparación farmacéutica de la
reivindicación 3, donde Y no está en
M_{k}-Y-Ar, y k representa 0 para
todos los casos excepto en la secuencia
Z-Y-M_{k}-Ar,
donde k representa 0 o 1.
6. La preparación farmacéutica de la
reivindicación 3 o 4, donde Z representa un anillo arilo o
heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Y está ausente en todos los casos; y
k representa 0 para todos los casos.
7. Una preparación farmacéutica de la
reivindicación 6, en donde.
Ar está sustituido con R_{2};.
Z está sustituido con R_{1};
R_{1} y R_{2} representan independientemente
y como lo valencia permite, de 0-5 sustituyentes en
el anillo al que está unido, seleccionado de halógeno, alquilo
inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo,
tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, amido, amidino,
ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato,
sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato,
-(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo,
-(CH_{2})_{p}alquinilo,
-(CH_{2})_{p}
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH,
-(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, (CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior;
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH,
-(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, (CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior;
En donde alquilo inferior, alquenilo inferior y
alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que
tiene de uno a diez carbonos.
8. La preparación farmacéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 4-6, en donde el sustituyente
amino sobre Cy es una amina primaria o una amina secundaria
sustituida con un grupo alquilo inferior; en donde el alquilo
inferior se refiere a un grupo que tiene de uno a diez carbonos.
9. La preparación farmacéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 3-6, en donde Ar es
bicíclico.
10. La preparación farmacéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 3-9, en donde R es hidrógeno o
Me.
11. La preparación farmacéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 3-10, en donde Cy' es un anillo
bicíclico sustituido o sin sustituir.
12. La preparación farmacéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 3-11, en donde Cy' es un grupo
benzotiofeno sustituido o sin sustituir.
13. La preparación farmacéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 3-.12, en donde Cy' es un grupo
benzotiofeno-2-ilo sustituido o sin
sustituir.
14. La preparación farmacéutica de cualquiera de
las reivindicaciones 3-13, en donde X se selecciona
de -C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
15. Un método in vitro para usar agonistas
de la ruta hedgehog en una célula, que comprende el contacto de una
célula con el agonista de hedgehog en una cantidad suficiente para
modular la proliferación o diferenciación de tal célula, en donde el
agonista de hedgehog interviene en la ruta hedgehog en ausencia de
la proteína hedgehog.
16. Un método in vitro para usar agonistas
de la ruta hedgehog en una célula, que comprende el contacto de una
célula con el agonista de hedgehog en una cantidad suficiente para
modular la proliferación o diferenciación de tal célula, en donde el
agonista de hedgehog interactúa con smoothened e interviene en la
ruta hedgehog.
17. El método in vitro de la
reivindicación 15 o 16, en donde el agonista hedgehog está
representado por la Fórmula general (IX):
Fórmula
IX
En donde, como valencia se permite,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo arilo,
carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o sin
sustituir, un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente para todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar
donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o -Se-,
a menos que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está
ausente;
R representa, independientemente para cada caso,
H o alquilo sustituido o sin sustituir;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-,
-S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, y -P(=O)(OR)-;
M representa, independientemente para cada caso,
un grupo metileno sustituido o sin sustituir;
Cy representa un anillo carbocíclico o
heterocíclico de seis miembros no aromático directamente unido a N y
lleva un sustituyente amino en la posición 4 del anillo relacionado
con N;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido
o sin sustituir; incluyendo grupos policíclicos;
i representa 0 para todos los casos excepto en la
secuencia
N-M_{i}-Y-Ar,
donde i representa 1; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y=M_{k}-Y-Ar,
donde k representa un número entero de 0 a 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
18. El método in vitro de la
reivindicación 17, en donde los sustituyentes N y amina sobre Cy
están dispuestos en trans en el anillo.
19. El método in vitro de la
reivindicación 17, en donde Y está ausente en
M_{k}-Y-Ar y k representa 0 para
todos los casos excepto en la secuencia
Z-Y-M_{k}-Ar,
donde k representa 0 o 1.
20. El método in vitro de la
reivindicación 17 o 18, en donde
Z representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir;
Y está ausente para todos los casos;
k representa 0 para todos los casos;
21. El método in vitro de la
reivindicación 20, en donde
Ar está sustituido con R_{2};
Z está sustituido con R_{1};
R_{1} y R_{2} representa, independientemente
y como permite la valencia, de 0-5 sustituyentes
sobre el anillo al que está unido, seleccionado de halógeno, alquilo
inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo,
tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, amido, amidino,
ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato,
sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato,
-(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo,
-(CH_{2})_{p}alquinilo,
-(CH_{2})_{p}
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH,
-(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior; en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que poseen de uno a diez carbonos.
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH,
-(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior; en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que poseen de uno a diez carbonos.
22. El método in vitro de cualquiera de
las reivindicaciones 18-20, en donde el amino
sustituyente sobre Cy es una amina primaria o una amina secundaria
sustituida con un grupo alquilo inferior; en donde alquilo inferior
se refiere a un grupo con uno a diez carbonos.
23. El método in vitro de cualquiera de
las reivindicaciones 17-20, en donde Ar es
bicíclico.
24. El método in vitro de cualquiera de
las reivindicaciones 17-23, en donde R representa
un hidrógeno o Me.
25. El método in vitro de cualquiera de
las reivindicaciones 17-24, en donde Cy' es un
anillo bicíclico sustituido o sin sustituir.
26. El método in vitro de cualquiera de
las reivindicaciones 17-25, en donde X se
selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
27. El método in vitro de cualquiera de
las reivindicaciones 17-26, en donde Cy' es un
grupo benzotiofeno sustituido o sin sustituir.
28. El método in vitro de cualquiera de
las reivindicaciones 17-27, en donde Cy' es un
grupo benzotiofeno-2-ilo sustituido
o sin sustituir.
29. El método in vitro de cualquiera de
las reivindicaciones 15-28, en donde el agonista
hedgehog actúa sobre la transducción de señal mediada por hedgehog
con un ED_{50} de 1 mM o menos.
30. El método in vitro de cualquiera de
las reivindicaciones 15-28, en donde el agonista
hedgehog actúa sobre la transducción de señal mediada por hedgehog
con un ED_{50} de 1 \muM o menos.
31. El método in vitro de cualquiera de
las reivindicaciones 15-28, en donde el agonista
hedgehog actúa sobre la transducción de señal mediada por hedgehog
con un ED_{50} de 1 nM o menos.
32. El uso de un agonista de hedgehog en la
elaboración de un medicamento para modular la proliferación o
diferenciación de una célula en un animal, en donde el agonista de
hedgehog actúa en la ruta hedgehog en ausencia de la proteína
hedgehog.
33. El uso de un agonista de hedgehog en la
elaboración de un medicamento para modular la proliferación o
diferenciación de una célula en un animal, en donde el agonista de
hedgehog interactúa con smoothened y actúa en la ruta hedgehog.
34. El uso de la reivindicación 32 o 33, en
donde, el agonista de hedgehog está representado por la Fórmula
general (IX):
Fórmula
IX
en donde, como la valencia
permite,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo arilo,
carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o sin
sustituir, un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente para todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar
donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o -Se-,
a menos que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está
ausente;
R representa, independientemente para cada caso,
H o alquilo sustituido o sin sustituir;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-,
-S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, y -P(=O)(OR)-;
M representa, independientemente para cada caso,
un grupo metileno sustituido o sin sustituir;
Cy representa un anillo carbocíclico o
heterocíclico de seis miembros no aromático directamente unido a N y
lleva un sustituyente amino en la posición 4 del anillo relacionado
con N;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido
o sin sustituir; incluyendo grupos policíclicos;
i representa 0 para todos los casos excepto en la
secuencia
N-M_{i}-Y-Ar,
donde i representa 1; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y=M_{k}-Y-Ar,
donde k representa un número entero de 0 a 3; o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
35. El uso de la reivindicación 34, en donde los
sustituyentes N y amina sobre Cy están dispuestos en posición
trans en el anillo.
36. El uso de la reivindicación 34, en donde Y
está ausente en M_{k}-Y-Ar.
37. El uso de la reivindicación 34 o 35, en
donde
Z representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir; Y está ausente para todos los casos;
k representa 0 para todos los casos.
38. El uso de la reivindicación 37, en donde Ar
está sustituido con R_{2};
Z está sustituido con R_{1};
R_{1} y R_{2} representa, independientemente
y como permite la valencia, de 0-5 sustituyentes
sobre el anillo al que está unido, seleccionado de halógeno, alquilo
inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo,
tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, amido, amidino,
ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato,
sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato,
-(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo,
-(CH_{2})_{p}alquinilo,
-(CH_{2})_{p}
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior; en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que poseen de uno a diez carbonos.
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior; en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que poseen de uno a diez carbonos.
39. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
35-37, en donde el sustituyente amino sobre Cy es
una amina primaria o una amina secundaria sustituida con un grupo
alquilo inferior; en donde alquilo inferior se refiere a un grupo
con uno a diez carbonos.
40. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
34-37, en donde Ar es bicíclico.
41. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
34-40, en donde Cy' es un anillo bicíclico
sustituido o sin sustituir
42. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
34-41, en donde X se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-,
y -S(O_{2})-.
43. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
34-42, en donde R representa H o Me.
44. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
34-43, en donde Cy' es benzotiofeno sustituido o sin
sustituir.
45. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
34-44, en donde Cy' es un grupo
benzotiofeno-2-ilo sustituido o sin
sustituir.
46. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
32-45, en donde el agonista hedgehog actúa sobre la
transducción de señal mediada por hedgehog con un ED_{50} de 1 mM
o menos.
47. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
32-45, en donde el agonista hedgehog actúa sobre la
transducción de señal mediada por hedgehog con un ED_{50} de 1
\muM o menos.
48. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
32-45, en donde el agonista hedgehog actúa sobre la
transducción de señal mediada por hedgehog con un ED_{50} de 1 nM
o menos.
49. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
32-48, en donde el medicamento es para una
aplicación terapéutica ocosmética.
50. El uso de la reivindicación 49, en donde la
aplicación terapéutica o cosmética se selecciona de la regulación de
tejidos neurales, formación y reparación de huesos y cartílago,
regulación de la espermatogénesis, regulación del músculo liso,
regulación de pulmón, hígado y otros órganos generados a partir del
intestino primitivo, regulación de la función hematopoyética, y
regulación del crecimiento de la piel y del pelo.
51. El uso de la reivindicación 49, en donde la
aplicación terapéutica o cosmética se selecciona del tratamiento o
prevención de atrofias crónicas
52. El uso de la reivindicación 51, en donde las
atrofias crónicas se seleccionan de esclerosis lateral amiotrófica,
síndrome de Guillain-Barre y neuropatía crónica
periférica, parálisis bulbar o atrofias musculares espinales, y
degeneración cortico-cerebelar involucrando los
lóbulos anteriores (áreas vermis y pierna) que es común en pacientes
alcohólicos.
53. El uso de la reivindicación 49, en donde la
aplicación terapéutica es el tratamiento o prevención de daños
agudos, subagudos, o crónicos al, sistema nervioso seleccionados de
daño químico, daño vascular, daño isquémico y daño resultante de
apoplejía, daño inducido por tumor e infeccioso/inflamatorio.
54. El uso de la reivindicación 49, en donde la
aplicación terapéutica es el tratamiento o prevención de
enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso.
55. El uso de la reivindicación 54, en donde la
enfermedad se selecciona de la enfermedad de Parkinson, corea de
Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, y degeneraciones
espinocerebelar.
56. El uso de la reivindicación 49, en donde la
aplicación terapéutica es el tratamiento o prevención de una
enfermedad caracterizada por el envejecimiento aberrante del sistema
nervioso.
57. El uso de la reivindicación 56, en donde la
enfermedad es la enfermedad de Alzheimer.
58. El uso de la reivindicación 49, en donde la
aplicación terapéutica es el tratamiento o prevención de una
enfermedad inmunológica crónica del sistema nervioso.
59. El uso de la reivindicación 58, en donde la
enfermedad es la esclerosis múltiple.
60. Un compuesto representado por la fórmula
general (XI):
Fórmula
XI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde, como la valencia
permite,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo arilo,
carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o sin
sustituir, o un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente para todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar
donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o
-Se-, a menos que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está
ausente;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-,
-S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, y -P(=O)(OR)-;
R representa, independientemente para cada caso,
H o alquilo sustituido o sin sustituir, en donde al menos uno de R
en NR_{2} es un alquilo sustituido o sin sustituir;
Cy representa un anillo carbocíclico o
heterocíclico de seis miembros no aromático directamente unido a N y
lleva un sustituyente NR_{2} en la posición 4 del anillo
relacionado con N;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido
o sin sustituir; incluyendo grupos policíclicos;
M representa, independientemente para cada caso,
un grupo metileno sustituido o sin sustituir; o dos M en conjunto
representan eteno o etino sustituido o sin sustituir;
i representa 0 para todos los casos excepto en la
secuencia
N-M_{i}-Y-Ar,
donde i representa 1; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y=M_{k}-Y-Ar,
donde k representa un número entero de 0 a 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
61. El compuesto de la reivindicación 60, en
donde los sustituyentes N y amina sobre Cy están dispuestos en
trans en el anillo, y representan 0 para todos los casos
excepto en la secuencia
Z-Y-Mk-Ar, donde k
representa 0 o 1
62. El compuesto representado por la Fórmula
general X:
Fórmula
X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde, como la valencia
permite,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo arilo,
carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o sin
sustituir, o un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente para todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar
donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o
-Se-, a menos que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está
ausente;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-,
-S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, y -P(=O)(OR)-; y un
grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2
grupos.
R representa, independientemente para cada caso,
H o alquilo sustituido o sin sustituir, en donde al menos uno de R
en NR_{2} es un alquilo sustituido o sin sustituir;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido
o sin sustituir; incluyendo grupos policíclicos;
M representa, independientemente para cada caso,
un grupo metileno sustituido o sin sustituir;
j representa, independientemente para cada caso,
un número entero de 2 a 10;
i representa, independientemente para cada caso,
un número entero de 0 a 5; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la
secuencia
Z-Y-M_{k}-Y-Ar,
donde k representa un número entero de 0 a 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
63. El compuesto de la reivindicación 60, en
donde
Z representa un anillo arilo o heteroarilo
sustituido o sin sustituir; Y está ausente en todos los casos; k
representa 0 para todos los casos
\newpage
64. El compuesto representado para la Fórmula
general (II):
Fórmula
II
en donde, como la valencia
permite,
Ar y Ar' independientemente representa anillos
arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Y, independientemente para cada caso, está
ausente;
X se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-,
-S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)-, y un grupo
metileno opcionalmente sustituido por 1-2 grupos
seleccionados de grupos alquilo inferior, alquenilo y alquinilo;
M representa, independientemente para cada caso,
un grupo metileno sustituido o sin sustituir; o dos M juntas que
representan eteno o etino sustituido o sin sustituir, en donde
alguno o todos los casos de M en forma de M_{j} forman todo o
parte de una o estructura cíclica;
R representa, independientemente para cada caso,
H o alquilo sustituido o sin sustituir, en donde al menos uno de R
en NR_{2} es un alquilo sustituido o sin sustituir;
Cy' representa arilo heterociclilo, heteroarilo
sustituido o sin sustituir, o cicloalquilo;
i representa, independientemente para cada caso,
un número entero de 0 a 5; y
j representa, individualmente para cada caso, un
número entero de 0 a 10;
en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y
alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo con uno
a diez carbonos;
o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
65. El compuesto de la reivindicación 60, en
donde
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo
opcionalmente substituido con R_{2};
Z representa un anillo arilo o heteroarilo
opcionalmente substituido con R_{1};
Y está ausente para todos los casos;
k representa 0 para todos los casos;
R_{1} y R_{2} representan, independientemente
y como permite la valencia, de 0-5 sustituyentes
sobre el anillo al que está unido, seleccionado de halógeno, alquilo
inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo,
tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, amido, amidino,
ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato,
sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato,
-(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo,
-(CH_{2})_{p}alquinilo,
-(CH_{2})_{p}
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH,
-(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior; en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que poseen de uno a diez carbonos.
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH,
-(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior; en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que poseen de uno a diez carbonos.
66. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 60-64, en donde NR_{2} representa
una amina secundaria donde R representa un grupo alquilo sin
sustituir.
67. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 60-64, en donde Ar es
bicíclico.
68. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 60-67, en donde Cy' es un anillo
bicíclico sustituido o sin sustituir.
69. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones60-68, en donde X se selecciona de
-C(=O)-, -C(=S)-, y
-S(O_{2})-.
-S(O_{2})-.
70. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 60-69, en donde Cy' es un grupo
benzotiofeno sustituido o sin sustituir.
71. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 60-70, en donde Cy' es un grupo
benzotiofen-2-ilo sustituido o sin
sustituir.
72. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 60-71, en donde R es H o Me.
73. El compuesto de la reivindicación 60, en
donde el compuesto se selecciona de cualquiera de los compuestos
C1-C49
74. Una composición farmacéutica que comprende
cualquiera de los compuestos de la reivindicación 73.
75. Un método in vitro para usar agonistas
en la ruta hedgehog en una célula, comprendiendo el contacto de una
célula con los compuestos de la reivindicación 73.
76. El uso de cualquiera de los compuestos de la
reivindicación 73 en la elaboración de un medicamento para modular
la proliferación o diferenciación de una célula en un animal.
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US7390659B2 (en) * | 2002-07-16 | 2008-06-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for inducing differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
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US20080058521A1 (en) * | 2006-01-26 | 2008-03-06 | Wyeth | Processes for the preparation of compounds |
WO2008057497A2 (en) * | 2006-11-02 | 2008-05-15 | Curis, Inc. | Small organic molecule regulators of cell proliferation |
WO2008057468A1 (en) * | 2006-11-02 | 2008-05-15 | Curis, Inc. | Small organic molecule regulators of cell proliferation |
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US8193182B2 (en) | 2008-01-04 | 2012-06-05 | Intellikine, Inc. | Substituted isoquinolin-1(2H)-ones, and methods of use thereof |
US20100317699A1 (en) * | 2008-01-29 | 2010-12-16 | Novartis Ag | Use of hedgehog agonists in the treatment of musculoskeletal-related disorders |
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CA2765706A1 (en) * | 2009-06-17 | 2010-12-23 | Aderans Research Institute, Inc. | Methods and compositions for increasing trichogenic potency of dermal cells |
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CA2799579A1 (en) | 2010-05-21 | 2011-11-24 | Intellikine, Inc. | Chemical compounds, compositions and methods for kinase modulation |
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US8940742B2 (en) | 2012-04-10 | 2015-01-27 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds and uses thereof |
MX2020009849A (es) | 2012-11-01 | 2021-09-13 | Infinity Pharmaceuticals Inc | Tratamiento de canceres utilizando moduladores de las isoformas de pi3 cinasa. |
AU2013352256A1 (en) | 2012-11-29 | 2015-06-18 | Strasspharma, Llc | Methods of modulating follicle stimulating hormone activity |
WO2014151386A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Salts and solid forms of isoquinolinones and composition comprising and methods of using the same |
US9192609B2 (en) | 2013-04-17 | 2015-11-24 | Hedgepath Pharmaceuticals, Inc. | Treatment and prognostic monitoring of proliferation disorders using hedgehog pathway inhibitors |
RU2019134551A (ru) | 2013-05-30 | 2019-11-22 | Инфинити Фармасьютикалз, Инк. | Лечение злокачественных опухолей с использованием модуляторов изоформ pi3-киназы |
MX2021012208A (es) | 2013-10-04 | 2023-01-19 | Infinity Pharmaceuticals Inc | Compuestos heterocíclicos y usos de los mismos. |
US9751888B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-09-05 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds and uses thereof |
US20160244452A1 (en) | 2013-10-21 | 2016-08-25 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds and uses thereof |
MX2016012021A (es) | 2014-03-19 | 2017-04-13 | Infinity Pharmaceuticals Inc | Compuestos heterociclicos para utilizarlos en el tratamiento de trastornos mediados por pi3k-gamma. |
WO2015160986A2 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapies |
WO2015168079A1 (en) | 2014-04-29 | 2015-11-05 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Pyrimidine or pyridine derivatives useful as pi3k inhibitors |
WO2016054491A1 (en) | 2014-10-03 | 2016-04-07 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds and uses thereof |
WO2016142427A1 (en) | 2015-03-10 | 2016-09-15 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method ank kit for reprogramming somatic cells |
WO2016196928A1 (en) | 2015-06-04 | 2016-12-08 | PellePharm, Inc. | Topical formulations for delivery of hedgehog inhibitor compounds and use thereof |
US20170231968A1 (en) | 2016-02-11 | 2017-08-17 | PellePharm, Inc. | Method for relief of and treatment of pruritus |
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