ES2250377T3 - Moleculas organicas pequeñas reguladoras de la proliferacion celular. - Google Patents

Moleculas organicas pequeñas reguladoras de la proliferacion celular.

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ES2250377T3 ES01922914T ES01922914T ES2250377T3 ES 2250377 T3 ES2250377 T3 ES 2250377T3 ES 01922914 T ES01922914 T ES 01922914T ES 01922914 T ES01922914 T ES 01922914T ES 2250377 T3 ES2250377 T3 ES 2250377T3
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Abstract

Una preparación farmacéutica que comprende un compuesto con una estructura de Fórmula VIII: Fórmula VIII En donde, como valencia se permite, U representa un arilo sustituido o sin sustituir o anillo heteroarilo fusionado al anillo que contiene nitrógeno; V representa metileno, 1, 1-etileno ó 1, 1-propileno; W representa S ó O, preferiblemente O; X representa C=O, C=S, o SO2; R3 representa, arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior sustituido o sin sustituir, alquinilo inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, aralquilo, o heteroaralquilo; R4 representa, un aralquilo o alquilo inferior sustituido o sin sustituir, tales como un fenetilo, benzilo, o aminoalquilo, etc; R5 representa, un arilo, heteroarilo, aralquilo, o heteroaralquilo sustituido o sin sustituir, incluyendo grupos aromáticos policíclicos o heteroaromáticos. o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Moléculas orgánicas pequeñas reguladoras de la proliferación celular.
Antecedentes de la invención
La formación de patrones es la actividad por la cuál las células embrionarias forman disposiciones ordenadas en el espacio de tejidos diferenciados. La complejidad física de los organismos mayores se presenta durante la embriogénesis a través de la interacción del linaje celular intrínseco y la señal celular extrínseca. Las interacciones inductivas son esenciales para el patrón embrionario en el desarrollo de los vertebrados desde el establecimiento más temprano del plan corporal, hasta el diseño de los sistemas de órganos, para la generación de los diversos tipos de células durante la diferenciación tisular. (Davidson, E., (1990) Development 108: 365-389; Gurdon, J.B., (1992) Cell 68: 185-199; Jessell, T.M. et al., (1992) Cell 68: 257-270). Los efectos de las interacciones entre las células de desarrollo son variados. Generalmente, las células respondientes son desviadas de una ruta de diferenciación celular a otra por células inductoras que difieren de los dos, los estados inducido y no inducido de las células respondientes (inducciones). Algunas veces las células inducen a sus vecinas a diferenciarse como ellas mismas (inducción homogénea); en otros casos una célula inhibe a sus vecinas de una diferenciación como la suya. Las interacciones celulares en el desarrollo temprano pueden ser secuenciales, como una inducción inicial entre dos tipos celulares que lleva a una progresiva amplificación de la diversidad. Por otra parte, las interacciones inductivas no sólo tienen lugar en embriones, sino también en células adultas, y pueden actuar para establecer y mantener patrones morfogenéticos así como para inducir la diferenciación (J.B. Gurdon (1992) Cell 68:185-199).
Miembros de la familia Hedgehog de moléculas señalizadoras median muchos procesos importantes de corto y largo alcance de patronaje durante el desarrollo de invertebrados y vertebrados. En la mosca, un único gen hedgehog regula el patronaje del disco segmental e imaginal. En contraste, en vertebrados, una única familia de genes hedgehog está involucrada en el control de la asimetría izquierda-derecha, la polaridad en el SNC, somites y miembros, la organogénesis, la condrogénesis, y la espermatogénesis.
El primer gen hedgehog fue identificado por un cribaje genético en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Nüsslein-Volhard, C. y Wieschaus, E. (1980) Nature 287, 795-801). Este cribaje identificó un número de mutaciones que afectaban al desarrollo embrionario y larval. En 1992 y 1993, la naturaleza molecular del gen Drosophila hedgehog (hh) fue presentada (C.F., Lee et al. (1992) Cell 71, 33-50), y desde entonces, diversos homólogos del hedgehog han sido aislados de varias especies de vertebrados. Mientras tan sólo ha sido encontrado un gen hedgehog en Drosophila y otros invertebrados, múltiples genes Hedgehog están presentes en vertebrados.
La familia vertebrada de genes hedgehog incluye al menos 4 miembros, por ejemplo, parálogos del único gen hedgehog drosophila. Genes y proteínas hedgehog ejemplares están descritos en las publicaciones del PCT WO 95/18856 y WO 96/17924. Tres de estos miembros, aquí nombrados como Desert hedgehog (Dhh), Sonic hedgehog (Shh), y Indian hedgehog (Ihh), aparentemente existen en todos los vertebrados, incluyendo peces, aves y mamíferos. Un cuarto miembro, aquí referido como tiggie-winkle hedgehog (Thh), aparece específicamente en peces. Desert hedgehog (Dhh) se expresa en los tests tanto en el desarrollo embrionario del ratón como en el adulto roedor y humano; Indian hedgehog (Ihh) está involucrado en el desarrollo de los huesos durante la embriogénesis y en la formación de huesos en el adulto; y, Shh, que como se ha descrito anteriormente, está principalmente involucrado en actividades morfogénicas y neuroinductivas. Dada las críticas funciones inductivas de los polipéptidos hedgehog en el desarrollo y el mantenimiento de los órganos de los vertebrados, la identificación de las proteínas hedgehog interactuantes es de suprema importancia tanto en contextos clínicos como de investigación.
Las diversas proteínas Hedgehog constan de un péptido de señal, una región N-terminal altamente conservada, y un dominio C-terminal más divergente. Además de la división de las secuencias señal en el proceso secretor (Lee, J.J. et al. (1992) Cell 71:33-50; Tabata, T. et al. (1992) Genes Dev. 2635-2645; Chang, D.E. et al. (1994) Development 120:3339-3353), las proteínas precursoras Hedgehog experimentan una división autoproteolítica interna, la cuál depende de secuencias conservadas en la porción C-terminal (Lee et al. (1994) Science 266:1528-1537; Porter et al. (1995) Nature 374:363-366). Esta autodivisión lleva a un péptido de 19kD N-terminal y a un péptido C-terminal de 26-28kD (Lee et al. (1992) supra; Tabata et al. (1992) supra; Chang et al. (1994) supra; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot, D.A., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:2294-2303; Porter et al. (1995) supra; Ekker, S.C. et al. (1995) Curr. Biol. 5:944-955; Lai, C.J. et al. (1995) Development 121:2349-2360). El péptido N-terminal permanece fuertemente asociado con la superficie en las que éste fue sintetizado, mientras que el péptido C-terminal se puede difundir libremente tanto in vitro como in vivo (Porter et al. (1995) Nature 374:363; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot et al. (1995) supra; Mart, E. et al. (1995) Development 121:2537-2547; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445-455). Interesantemente, la retención de la superficie celular del péptido N-terminal es dependiente de la autodivisión, como una forma truncada de HH codificado por un RNA que termina precisamente en la posición normal de división interna, es difundible in vitro (Porter et al. (1995) supra) y in vivo (Porter, J.A. et al. (1996) Cell 86, 21-34). Estudios bioquímicos han mostrado que la división autoproteolítica de la proteína HH precursora se desarrolla a través de un tioéster interno intermedio que posteriormente se rompe con una sustitución nucleofílica. Es probable que el nucleófilo sea una pequeña molécula lipofílica que se una covalentemente a la terminación C-terminal del N-péptido (Porter et al. (1996) supra), atándolo a la superficie celular. Las implicaciones biológicas son profundas. Como resultado de la unión, se genera una alta concentración local de péptido Hedgehog N-terminal en la superficie de las células productoras de Hedgehog. Es este péptido N-terminal el que es tan necesario como suficiente para las actividades de señalización Hedgehog de corto y largo alcance en Drosophila y vertebrados (Porter et al. (1995) supra; Ekker et al. (1995) supra; Lai et al. (1995) supra; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445-455; Porter et al. (1996) supra; Fietz, M.J. et al. (1995) Curr. Biol. 5:643-651; Fan, C.-M. et al. (1995) Cell 81:457-465; Mart, E., et al. (1995) Nature 375:322-325; Lopez-Martinez et al. (1995) Curr. Biol. 5:791-795; Ekker, S.C. et al. (1995) Development 121:2337-2347; Forbes, A.J. et al. (1996) Development 122:1125-1135).
HH está implicado en procesos de patronaje de corto y largo alcance en varios puntos durante el desarrollo de Drosophila. En el establecimiento de la polaridad del segmento en el embrión temprano, éste tiene efectos de corto alcance los cuáles parecen ser mediados directamente, mientras que en el patronaje de los discos imaginales, éste induce efectos de largo alcance vía la inducción de señales secundarias.
En vertebrados, diversos genes hedgehog han sido clonados en los últimos años. De estos genes, Shh ha recibido la mayoría de la atención experimental, ya que se expresa en diferentes centros organizadores que son la fuente de señales que patronizan tejidos cercanos. Una evidencia reciente indica que Shh está involucrado en éstas interacciones.
La expresión de Shh comienza poco después del inicio de la gastrulación en el presunto mesodermo medio, el nodo en el ratón (Chang et al. (1994) supra; Echelard, Y. et al. (1993) Cell 75:1417-1430), la rata (Roelink, H. et al. (1994) Cell 76:761-775) y el polluelo (Riddle, R.D. et al. (1993) Cell 75:1401-1416), y la concha del pez cebra (Ekker et al. (1995) supra; Krauss, S. et al (1993) Cell 75:1431-1444). En los embriones de pollo, el patrón de expresión del Shh en el nodo desarrolla una asimetría izquierda-derecha, que parece ser responsable del situs izquierda-derecha del corazón (Levin, M. et al. (1995) Cell 82:803-814).
En el SNC, el Shh de la notocorda y del "floorplate" parece inducir el engrosamiento ventral de la célula. Cuando se expresa ectópicamente, Shh lleva a una centralización de largas regiones del cerebro medio y posterior en el ratón (Echelard et al. (1993) sumara; Goodrich, L.V. et al. (1996) Genes Dev. 10:301-312), Xenopus (Roelink, H. et al. (1994) supra; Ruiz y Altaba, A. et al. (1995) Mol. Cell. Neurosci. 6:106-121), y el pez cebra (Ekker et al. (1995) supra: Krauss et al. (1993) supra; Hammersclunidt, M., et al. (1996) Genes Dev. 10:647-658). En explantes de neuroectodermos intermedios a nivel de médula espinal, la proteína Shh induce el desarrollo del "floorplate" y la neurona motora a distintos umbrales de concentración, "floorplate" a altas concentraciones y neuronas motoras a más bajas concentraciones (Roelink et al. (1995) supra; Mart' et al. (1995) supra; Tanabe, Y. et al. (1995) Curr. Biol. 5:651-658). Por otra parte, el bloqueo de anticuerpos sugiere que la Shh producida por la notocorda se requiere para la inducción mediada por la notocorda del engrosamiento de la neurona motora (Mart' et al. (1995) supra). Así, una alta concentración de Shh en la superficie de las células medias productoras de Shh parece explicar la inducción del "floorplate" mediada por contacto observada in vitro (Placzek, M. et al. (1993) Development 117:205-218), y en el posicionamiento medio del "floorplate" inmediatamente encima de la notocorda in vivo. Concentraciones menores liberadas de la Shh de la notocorda y del "floorplate" inducen presumiblemente a neuronas motoras en regiones ventrolaterales más distantes en un proceso que se ha mostrado como independiente del contacto in vitro (Yermada, T. et al. (1993) Cell 73:673-686). En explantes cogidos a nivel del cerebro medio y del frontal, Shh también induce los tipos celulares neuronales ventrolaterales apropiados, precursores dopaminérgicos (Heynes, M. et al. (1995) Neuron, 15:35-44; Wang, M.Z. et al. (1995) Nature Med. 1:1184-1188) y colinérgicos (Ericson, J. et al. (1995) Cell 81:747-756), respectivamente, indicando que la Shh es un inductor común de la especificación ventral sobre toda la longitud del SNC. Estas observaciones plantean una cuestión tal cómo la respuesta diferencial a al Shh está regulada en posiciones anteroposteriores particulares.
La Shh de la línea media también patrocina las regiones paraxiales del embrión de los vertebrados, los somites en el tronco (Fan et al. (1995) supra) y el mesénquima rostral de la cabeza de los somites (Hammerschmidt et al. (1996) supra). En explantes de mesodermo paraxial de pollo y ratón, el Shh promueve la expresión de marcadores esclerotoma-específicos como Pax1 y Twist, a expensas del marcador "dermamyotomal" Pax3. Además, experimentos de filtro barrera sugieren que Shh media la inducción del esclerotoma directamente más que por activación de un mecanismo de señalización secundario (Fan, C.-M. y Tessier-Lavigne, M. (1994) Cell 79, 1175-1186).
Shh también induce la expresión génica miotomal (Hammerschmidt et al. (1996) supra; Johnson, R.L. et al (1994) Cell 79:1165-1173; Münsterberg, A.E. et al. (1995) Genes Dev. 9:2911-2922; Weinberg, E.S. et al. (1996) Development 122:271-280), aunque recientes experimentos indican que miembros de la familia WNT, homólogos vertebrados de Drosophila wingless, son requeridos conjuntamente (Münsterberg et al. (1995) supra). Desconcertantemente, la inducción miotomal en polluelos requiere unas concentraciones mayores de Shh que la inducción de marcadores esclerotomales (Münsterberg et al (1995) supra), aunque el esclerotoma se origina desde células somíticas en posiciones más cercanas a la notocorda. Se obtuvieron resultados similares en el pez cebra, donde altas concentraciones de Hedgehog inducen el marcador miotomal y reprimen la expresión génica esclerotomal (Hammerschmidt et al. (1996) supra). En contraste con los amniotas, sin embargo, estas observaciones son consistentes con la arquitectura del embrión del pez, como aquí, el miotoma es el componente predominante y más axial de los somites. Así, la modulación de la señalización Shh y la adquisición de nuevos factores de señalización podría haber modificado la estructura del somita durante la evolución de los vertebrados.
En los brotes de los miembros de los vertebrados, un subconjunto de células mesenquimales posteriores, la "Zona de actividad polarizante" (ZAP), regula la identidad digital anteroposterior (revisado en Honig, L.S. (1981) Nature 291:72-73). La expresión ectópica de la Shh o la aplicación de cadenas insertadas en el péptido Shh imita el efecto de los injertos ZAP anteriores, generando una duplicación de imagen de espejo de los dígitos (Chang et al (1994) supra; Lopez-Martinez et al. (1995) supra; Riddle et al. (1993) supra) (Fig. 2g). Así, la identidad digital parece depender principalmente de la concentración de Shh, aunque es posible que otras señales puedan a transmitir esta información sobre las distancias sustanciales que parecen ser requeridas para el patronaje AP (100-150 \mum). Similar a la interacción de HH y DPP en los discos imaginales de Drosophila, el Shh activa la expresión de Bmp2 en el brote de los miembros de los vertebrados (Francis, P.H. et al. (1994) Development 120:209-21 8), un homólogo del dpp. Sin embargo, a diferencia del DPP en Drosophila, Bmp2 falla al imitar el efecto polarizante de Shh sobre la aplicación ectópica en el brote de miembros del polluelo (Francis et al. (1994) supra). Además del patronaje anteroposterior, el Shh también parece estar involucrado en la regulación de la extensión proximodistal de los miembros mediante la inducción de la síntesis del factor de crecimiento fibroblasto FGF4 en la cresta ectodérmica apical posterior (Laufer, E. et al. (1994) Cell 79:993-1003; Niswander, L. et al.(1994) Nature 371:609-612).
La cercana relación entre las proteínas Hedgehog y BMPs parece haberse conservado en muchos, pero probablemente no en todos los sitios de la expresión del Hedgehog en vertebrados. Por ejemplo, en el intestino posterior del pollo, Shh se ha mostrado como inductor de la expresión de Bmp4, otro homólogo dpp vertebrado (Roberts, Di. et al. (1995) Development 121:3163-3174). Además, Shh y Bmp2, 4, ó 6 muestran una sorprendente correlación en su expresión en células epiteliales y mesenquimales del estómago, el sistema urogenital, el pulmón, las raíces de los dientes y los folículos pilosos (Bitgood, M.J. y McMahon, A.P. (1995) Dev Biol. 172:126-138). Además, Ihh, uno de los otros dos genes Hedgehog del ratón, es expresado adyacentemente a las células que expresan Bmp en la tripa y el cartílago en desarrollo (Bitgood y McMahon (1995) supra).
Una reciente evidencia sugiere un modelo en el que Ihh juega un papel crucial en la regulación del desarrollo condrogénico (Roberts et al. (1995) supra). Durante la formación del cartílago, los condrocitos se desarrollan desde un estado proliferativo mediante un estado intermedio, prehipertrófico hasta condrocitos hipertróficos diferenciados. Ihh se expresa en los condrocitos prehipertróficos e inicia una cascada de señalización que lleva al bloqueo de la diferenciación de los condrocitos. Su blanco directo es el pericondrio alrededor del dominio de expresión del Ihh, el cuál responde mediante la expresión de Gli y Patched (Ptc), blancos transcripcionales de las señales Hedgehog (mirar abajo). Muy probablemente, esto lleva a una señalización secundaria que resulta en la síntesis de la proteína relacionada a la hormona paratiroide (PTHrP) en el pericondrio periarticular. PTHrP por sí misma emite señales de vuelta a los condrocitos prehipertróficos, bloqueando su mayor diferenciación. Al mismo tiempo, PTHrP reprime la expresión de Ihh, de ese modo se forma un lazo de retroalimentación negativa que modula la tasa de diferenciación de los condrocitos.
Patched fue originalmente identificado en Drosophila como un gen de polaridad de segmento, uno de un grupo de genes desarrolladores que afectan a la diferenciación celular dentro de los segmentos individuales que tiene lugar en series homólogas a lo largo del eje anterior-posterior del embrión. Ver Hooper, J.E. et al. (1989) Cell 59:751; y Nakano, Y. et al. (1989) Nature 341:508. Los patrones de expresión del homólogo vertebrado de patched sugieren su implicación en el desarrollo del tubo neural, el esqueleto, los miembros, la estructura cráneo-facial, y la piel.
Estudios genéticos y funcionales demuestran que el patched es parte de la cascada de señalización hedgehog, una vía conservada evolutivamente que regula la expresión de un número de genes cascada. Ver Perrimon, N. (1995) Cell 80:517; y Perrimon, N. (1996) Cell 86:513. Patched participa en la represión transcripcional constitutiva de los genes diana; su efecto se opone al de una glicoproteína secretada, codificada por el hedgehog, o un homólogo vertebrado, el cuál induce la activación transcripcional. Los genes bajo el control de esta vía incluyen miembros de las familias Wnt y TGF-beta.
Las proteínas Patched poseen dos grandes dominios extracelulares, doce segmentos transmembrana, y diversos segmentos citoplasmáticos. Ver Hooper, supra; Nakano, supra; Johnson, R.LL et al. (1996) Science 272:1668; y Hahn, H. et al. (1996) Cell 85:841. El papel bioquímico del patched en la vía de señalización del hedgehog no es claro. Sin embargo, se ha informado de una interacción directa con la proteína hedgehog (Chen, Y. et al. (1996) Cell 87:553), y patched podría participar en un complejo receptor hedgehog junto con otra proteína transmembrana codificada por el gen smoothened. Ver Perrimon, supra; y Chen, supra.
El homólogo humano del patched fue recientemente clonado y mapeado al cromosoma 9g22.3. Ver Johnson, supra; y Hahn, supra. Esta región ha sido implicada en la síndrome de Nevo de células basales (BCNS), que se caracteriza por anormalidades en el desarrollo incluyendo alteraciones de costilla y cráneo-faciales, anormalidades de las manos y pies, y espina bífida.
BCNS también predispone a múltiples tipos de tumores, los más frecuentes son carcinomas de células basales (CBC) que tienen lugar en muchas localizaciones en el cuerpo y aparecen en las primeras dos décadas de vida. La mayoría de los casos de CBC, sin embargo, no están relacionados con el síndrome y se manifiestan esporádicamente en pequeños números en lugares expuestos al sol en gente de mediana edad o mayor de ascendencia Norte-europea.
Recientes estudios en CBC relacionados con BCNS y CBC esporádicos sugieren que una pérdida funcional de los dos alelos del patched lleva al desarrollo de CBC. Ver Johnson, supra Hahn, supra; y Gailani, M.R. et al. (1996) Nature Genetics 14:78. Deleciones de un solo alelo del cromosoma 9q22.3 ocurren frecuentemente tanto en CBC esporádicos como en hereditarios. Análisis relacionados revelaron que el alelo heredado defectuoso era conservado y el alelo normal se perdía en tumores de pacientes con BCNS.
Los tumores esporádicos también demostraron un pérdida de los dos alelos del patched. De doce tumores en los que se identifican mutaciones del patched con un ensayo de polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP), nueve tenían deleción cromosómica del segundo alelo y los otros tres tenían mutaciones inactivantes en ambos alelos (Gailani, supra). Las alteraciones no ocurrían en la correspondiente línea germinal del DNA.
La mayoría de las mutaciones identificadas resultaron en codones stop prematuros o desplazamiento de marcos. Lench, et al., Hum. Genet. 1997 Oct; 100(5.-6): 497-502. Sin embargo, algunas eran mutaciones puntuales que llevaban a sustituciones de aminoácidos tanto en dominios extracelulares como citoplasmáticos. Estos sitios de mutación podrían indicar importancia funcional para la interacción con proteínas extracelulares o con miembros citoplasmáticos de la vía de señalización de cascada.
La implicación del patched en la inhibición de la expresión génica y la ocurrencia de deleciones alélicas frecuentes del patched en CBC soportan la teoría de la función supresora de tumores de este gen. Su papel en la regulación de las familias génicas conocidas por estar involucradas en la señalización celular y comunicación intercelular proporciona un posible mecanismo de supresión de tumores.
Resumen de la invención
La presente invención usa métodos disponibles y composiciones para modular la diferenciación o la proliferación de una célula.
En ciertas realizaciones, los compuestos útiles en la presente invención pueden representarse por la fórmula general (II).
Fórmula II
1
en donde, cuando la valencia y la estabilidad lo permiten,
Ar y Ar' representan independientemente anillos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos,
Y, independientemente para cada caso, está ausente.
X, está seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido por 1-2 grupos tales como grupos alquilo inferior, alquenilo, o alquinilo,
M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tales como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc. o dos M juntos representan eteno o etino sustituidos o no sustituidos, donde algunos o todos los casos de M en M_{j} forman la totalidad o parte de una estructura cíclica;
R representa, independientemente para cada caso, H o sustituido o sin sustituir;
Cy' representa un arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, sustituidos o no sustituidos, incluyendo grupos policíclicos;
j representa, independientemente para cada caso, un número entero desde el 0 al 10, preferiblemente del 2 al 7; y
i representa, independientemente para cada caso, un número entero del 0 al 5, preferiblemente del 0 al 2.
En ciertas realizaciones, M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH_{2}-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc.
En ciertas realizaciones, Ar y Ar' representan anillos fenilo, por ejemplo, no sustituidos o sustituidos por uno o más grupos incluyendo heteroátomos tales como O, N, y S. En algunas realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo fenilo. En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, etc. En algunas realizaciones, Y y Ar' están unidos a Ar en una relación meta y/o 1,3.
Y está ausente de todas las posiciones.
En ciertas realizaciones, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir. En algunas realizaciones, Cy' está directamente unido a X. En algunas realizaciones, Cy' es un anillo bicíclico o heteroarilo sustituido o sin sustituir, preferiblemente los dos (bicíclico y heteroarilo), tales como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo arilo monocíclico o heteroarilo sustituido al menos con un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, es decir, formando un sistema biarilo. En algunas realizaciones, Cy' incluye dos anillos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, el mismo o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo biarilo o bicíclico.
En ciertas realizaciones, X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
En algunas realizaciones, R representa H o un alquilo inferior, por ejemplo, H o Me.
En ciertas realizaciones, NR_{2} representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con uno o dos grupos alquilo inferiores, preferiblemente una amina primaria o secundaria.
En algunas realizaciones, los sustituyentes en Ar o Ar' son seleccionados entre halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, ácido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo, -(CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, -O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}
N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de las anteriores, donde p y n, individualmente para cada caso, representan números enteros desde el 0 hasta el 10, principalmente del 0 al 5.
La presente invención también se refiere a una preparación farmacéutica que consta de un método in vitro para causar agonismo en la vía del hedgehog en una célula usando un compuesto con la estructura de la Fórmula VIII:
Fórmula VIII
2
en donde, cuando la valencia y la estabilidad lo permiten,
U representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir fusionado al anillo que contiene el nitrógeno.;
V representa metileno, 1,1-etileno ó 1,1-propileno;
W representa S ó O, preferiblemente O;
X representa C=O, C=S, o SO_{2};
R_{3} representa, arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior sustituido o sin sustituir, alquinilo inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, aralquilo, o heteroaralquilo;
R_{4} representa, un aralquilo o alquilo inferior sustituido o sin sustituir, tales como un fenetilo, bencilo, o aminoalquilo, etc;
R_{5} representa, un arilo, heteroarilo, aralquilo, o heteroaralquilo sustituido o sin sustituir, incluyendo grupos aromáticos policíclicos o heteroaromáticos.
En ciertas realizaciones, U representa un anillo fenilo fusionado con el anillo que contiene nitrógeno.
En algunas realizaciones, R_{3} es seleccionado de un, arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior, aralquilo, y heteroaralquilo sustituido o sin sustituir.
En algunas realizaciones, R_{4} es un grupo alquilo inferior no sustituido, o es un grupo alquilo inferior sustituido con una amina secundaria o terciaria.
En ciertas realizaciones, R_{5} es seleccionado de un, fenilo o naftilo sustituido o sin sustituir, o es un grupo diariloalquilo, como 2,2-difeniletilo, difenilmetilo, etc.
Adicionalmente, compuestos que tienen la estructura de la Fórmula IX pueden ser útiles en los compuestos farmacéuticos, métodos in vitro y usos para la preparación de un medicamento de la presente invención.
La presente invención también proporciona compuestos de las fórmulas X y XI, detallados más adelante.
En ciertas realizaciones, un compuesto independiente de Hedgehog útil en la presente invención, tal como se ha descrito anteriormente, puede tener un EC_{50} para inducir o aumentar una o más actividades hedgehog (como por ejemplo la regulación del aumento de expresión de gli) de menos de 1000 nm, menos de 100 nm, menos de 10 nm, o incluso menos de 1 nm. En ciertas realizaciones, un compuesto dependiente de hedgehog útil en la presente invención, como se ha descrito anteriormente, aumenta una o más actividades hedgehog (como la regulación del aumento de expresión de gli) en al menos uno, dos o incluso tres órdenes de magnitud.
Breve descripción de las imágenes
Las figuras 1-31 representan reacciones útiles para sintetizar compuestos de acuerdo con la presente invención.
Las figuras 32 y 33 ilustran compuestos representativos de acuerdo con la presente invención.
Las figuras 34a y 34b presentan resultados de los ensayos informadores de la vía hedgehog usando compuestos de la presente invención.
La figura 35 presenta resultados del ensayo que muestran la regulación de la sobreexpresión de PTC y Gli por agonistas del hedgehog de la presente invención.
Las figuras 36 y 37 representan la proliferación incrementada de precursores neuronales cerebelares en presencia de los agonistas en cuestión.
Las figuras 38A y B muestran los efectos de los agonistas en cuestión en la curación de un nervio ciático roto cuando se mide en un ensayo de control.
Las figuras 39A-D demuestran el efecto de agonistas en cuestión en la curación de un nervio ciático roto cuando se mide con un ensayo de extensión de dedo.
La figura 40 muestra los efectos de los agonistas en cuestión en combinación con una pequeña pérdida de proteína hedgehog en el pulmón, escápula, piel, y tejido especializado en ratones en desarrollo.
La figura 41 presenta el efecto de los agonistas dependientes añadiendo o no proteína hedgehog en páncreas, riñón, piel, y tejido del corazón de ratones en desarrollo.
La figura 42 muestra el efecto de un agonista en cuestión en la extremidad anterior de un ratón recién nacido.
La figura 43 presenta el efecto de un antagonista dependiente en las extremidades anteriores de un ratón recién nacido a diferentes concentraciones.
La figura 44 representa los efectos de un agonista en cuestión en el desarrollo del tejido pulmonar.
La figura 45 muestra los efectos de un agonista en cuestión en el desarrollo del tejido renal.
Figuras 46A y B muestran los efectos de los agonistas dependientes en el tejido de la piel de ratón en presencia y ausencia de proteína hedgehog.
Las figuras 47A y B comparan la actividad de los agonistas en cuestión en células marcadoras humanas y de ratón.
La figura 48 muestra la regulación de la sobreexpresión de Gli en células HEPM tratadas con un fragmento N-terminal modificado de Sonic hedgehog o con un agonista en cuestión.
Descripción detallada de la invención I.Visión general
La presente invención se refiere al descubrimiento de que las vías de transducción de señal reguladas por hedgehog, patched (ptc), gli y/o smoothened pueden ser moduladas, al menos en parte, por pequeñas moléculas. Sin querer ligarse a ninguna teoría en particular, la activación de una vía patched-smoothened a través de la alteración de asociaciones de la superficie celular (tales como complejos) puede ser el mecanismo por el cuál actúan estos agentes. Se cree que la vía hedgehog está regulada negativamente por asociación del patched y el smoothened, como por ejemplo en forma de complejos de proteínas, la asociación de las cuáles alterada por la unión del hedgehog al patched. Por lo tanto, la capacidad de estos agentes para activar la hedgehog puede ser debida a la capacidad de dichas moléculas para interactuar con o unirse a patched o smoothened, para alterar de otra manera la asociación de smoothened con patched, o al menos para promover la capacidad de estas proteínas para activar una vía de transducción mediada por señal hedgehog, ptc, y/o smoothened. Este modo de acción, por ejemplo, la modulación de una vía dependiente de smoothened, es para distinguirse de los compuestos que modulan la vía hedgehog mediante la activación directa de la vía AMPc, por ejemplo, uniéndose o interactuando con PKA, adenilato ciclasa, AMPc fosfodiesterasa, etc.
Ciertos agonistas hedgehog aquí revelados modulan la actividad hedgehog en ausencia de la misma proteína hedgehog, por ejemplo, los compuestos imitan la actividad hedgehog, antes que suplementar o incrementar meramente la actividad de la proteína hedgehog, por ejemplo, promoviendo la unión de hedgehog a patched. Estos compuestos son llamados aquí agonistas independientes de hedgehog y solos pueden imitar el fenotipo o efecto resultante del tratamiento hedgehog. Otros ciertos compuestos de la presente invención aumentan la actividad de la proteína hedgehog, y requieren la presencia o adición de proteína hedgehog para observar el fenotipo o efecto resultante de la inducción hedgehog. Tales agonistas dependientes de hedgehog pueden ser usados en preparaciones o tratamientos terapéuticos que incluyan proteína hedgehog, o pueden ser utilizados para incrementar la actividad de la proteína hedgehog producida naturalmente por las células o el tejido a ser tratado con el agonista. Los agonistas hedgehog aquí revelados podrían inducir la disociación de un complejo patched-smoothened o alterar interacciones entre patched y smoothened, como por ejemplo uniéndose a patched o a smoothened, y de esa manera activando la vía hedgehog. En ciertas realizaciones , las composiciones y métodos de la presente invención emplean un compuesto que actúa sobre uno o más componentes de la membrana extracelular de una célula diana.
En algunas realizaciones, agonistas hedgehog útiles en la presente inducen la regulación transcripcional dependiente de hedgehog, tal como expresión de los genes gli1 o ptc. Tales agonistas pueden así inducir o incrementar la activación de la vía dependiente de hedgehog como resultado de, por ejemplo, niveles aumentados de proteína hedgehog.
Está, por tanto, específicamente contemplado que estas pequeñas moléculas que modulan aspectos de la actividad de transducción de señal del hedgehog, ptc, o smoothened son asimismo capaces de promover la proliferación (u otras consecuencias biológicas) en células que tienen una vía ptc smo funcional. En realizaciones preferidas, los agonistas dependientes son moléculas orgánicas que tienen un peso molecular menor de 2500 amu, más preferiblemente menor que 1500 amu, e incluso más preferiblemente menor de 750 amu, y son capaces de inducir o aumentar al menos algunas de las actividades biológicas de las proteínas hedgehog, preferiblemente específicamente en células diana. La activación de la vía hedgehog por un agonista hedgehog puede ser cuantificada, por ejemplo, mediante la detección del incremento en la transcripción de ptc o gli1 en presencia del agonista, relativo a un control en ausencia del agonista. Por ejemplo, un incremento de al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, o incluso al menos un 50% podría ser indicativo de la activación de la vía hedgehog por un compuesto test. En ciertas realizaciones, la actividad agonista de los compuestos dependientes no es inhibida por el anticuerpo hedgehog 5E1, pero es inhibida por jervina o un antagonista con la fórmula:
3
Esta calidad puede ser cuantificada, por ejemplo, determinando si el anticuerpo o antagonista induce a una disminución de más del 50%, más del 20%, más del 10%, o incluso más del 5% de la regulación de la sobreexpresión de ptc o gli-1 inducida por el agonista en ausencia del hedgehog, etc. En ciertas realizaciones, un compuesto útil en la presente invención, tal y como se describe anteriormente, podría tener un EC_{50} para inducir o aumentar una o más actividades hedgehog (como por ejemplo la regulación de la sobreexpresión de ptc o gli) de menos de unos 1000 nM, menos de 100 nM, menos de 10 nM, o incluso menos de 1 nM. Las secuencias codificantes para genes Gli humanos ejemplares incluyen, por ejemplo, la secuencia génica Gli-1 de entrada GenBank X07384 y la secuencia génica Gli-2 de entrada GenBank AB007298. Ver también Kinzler et al. Nature 1988, 332, 371. El nivel de expresión de gli o ptc puede determinarse, por ejemplo, midiendo el nivel de mRNA (transcripción) o el nivel de proteína (traducción).
Así, los métodos de la presente invención incluyen el uso de pequeñas moléculas que antagonizan la inhibición ptc de la señalización hedgehog, por ejemplo mediante la activación de smoothened o de componentes cascada del camino de señal, en la regulación de la reparación y/o el comportamiento funcional de un amplio rango de células, tejidos y órganos. Por ejemplo, el método en cuestión tiene aplicaciones terapéuticas y cosméticas que se extiende desde la regulación de los tejidos neurales, formación y reparación de hueso y cartílago, regulación de la espermatogénesis, regulación del músculo liso, regulación del pulmón, hígado, órganos urogenitales (por ejemplo, la vejiga), y otros órganos surgidos del intestino primitivo, regulación de la función hematopoyética, regulación del crecimiento de la piel y el pelo, etc. Además, los métodos en cuestión pueden llevarse a cabo en células que son proporcionadas en cultivos (in vitro), o en células de un animal completo (in vivo). Ver, por ejemplo, las publicaciones del WO 95/18856 y WO 96/17924 (las especificaciones de las cuáles se han incorporado expresamente aquí).
En una realización, el método en cuestión puede ser para tratar células epiteliales. En general, una célula epitelial puede ponerse en contacto con una gran cantidad de un agonista hedgehog para inducir el crecimiento y/o la formación de tejido epitelial. El método tratado puede llevarse a cabo en células epiteliales las cuáles podrían estar tanto dispersadas en un cultivo como en una parte de un tejido u órgano intacto. Además, el método puede llevarse a cabo en células provenientes de un cultivo (in vitro), o en células en un animal completo (in vivo).
Los agonistas hedgehog de la presente invención pueden usarse como parte de regímenes en el tratamiento de desórdenes de, o reparación quirúrgica o estética de, por ejemplo tejidos epiteliales como piel y órganos de la piel; tejidos corneal, cristalino y otros tejidos oculares; membranas mucosas; y epitelio periodontal. Los métodos y composiciones aquí reveladas facilitan el tratamiento o prevención de variedad de tejidos epiteliales y mucosos dañados. Por ejemplo, el método en cuestión puede usarse para controlar los procesos de curación de heridas, como por ejemplo podría ser deseable con cualquier operación que involucrara tejido epitelial, así como operaciones dermatológicas o periodontales. Una reparación quirúrgica ejemplar para la que agonistas hedgehog pueden ser útiles incluye quemada severa y regeneración de la piel, injertos de piel, heridas de presión, úlceras dérmicas, fisuras, reducción de cicatrices post-operación, y colitis ulcerosa.
En otro aspecto de la presente invención, un agonista hedgehog puede ser usado para lograr el crecimiento del pelo, como por ejemplo en el tratamiento de la alopecia mediante el cual se potencia el crecimiento del cabello.
En otra realización preferida, el método tratado puede usarse como parte de un régimen de tratamiento para meduloblastoma maligno y otros tumores neuroectodermales malignos del SNC primario.
En otro aspecto, la presente invención proporciona preparaciones farmacéuticas que contienen, como principio activo, un agonista hedgehog, un antagonista ptc, o un agonista smoothened tal como se describe aquí, formulado en una cantidad suficiente para promover, in vivo, la proliferación u otras consecuencias biológicas.
Los tratamientos en cuestión que usan agonistas hedgehog, antagonistas patched, o agonistas smoothened pueden ser efectivos tanto para sujetos humanos como animales. Los sujetos animales para los que es aplicable la invención se extienden tanto a animales domésticos y ganado, criados tanto como animales de compañía como para propósitos comerciales. Ejemplos son perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdo, y cabras.
II. Definiciones
Por conveniencia, ciertos términos empleados en laespecificación, ejemplos, y reivindicaciones adjuntas se han recogido aquí.
La frase "modificación aberrante o mutación" de un gen se refiere a aquellas lesiones genéticas como, por ejemplo, deleciones, sustitución o adición de nucleótidos a un gen, así como también grandes cambios de posición cromosómica del gen y/o metilación anormal del gen. Asimismo, la no expresión de un gen hace referencia a niveles aberrantes de transcripción del gen relativo a aquellos niveles en una célula normal bajo condiciones similares, así como también el splicing de tipo no salvaje del mRNA transcrito a partir del gen.
"Heridas de quemadura" se refiere a casos donde grandes áreas superficiales de la piel han sido extraídas o perdidas de un individuo debido a calor y/o a agentes químicos.
El "corium" o "dermis" se refiere a la capa de la piel más profunda de la epidermis, que consta de una base densa de tejido conectivo vascular, y que contiene los nervios y órganos terminales de la sensibilidad. Las raíces del pelo, y las glándulas sebáceas y del sudor son estructuras de la epidermis que están profundamente incrustadas en la dermis.
"Tejido dental" hace referencia al tejido en la boca que es similar al tejido epitelial, por ejemplo el tejido de laencía. El método de la presente invención es útil para tratar la enfermedad periodontal.
"Úlceras dérmicas de la piel" se refiere a lesiones en la piel causadas por pérdidas superficiales de tejido, normalmente con inflamación. Las úlceras dérmicas de la piel que pueden ser tratadas con el método de la presente invención incluyen úlceras decúbitas, úlceras diabéticas, úlcera por estasis venoso y úlceras arteriales. Las heridas decúbitas se refieren a úlceras crónicas que resultan de la presión aplicada en áreas de la piel durante extensos periodos de tiempo. Las heridas de este tipo son llamadas a menudo úlceras de decúbito o úlceras de presión. Las úlceras por estasis venoso resultan del estancamiento de la sangre u otros fluidos de venas defectuosas. Las úlceras arteriales hacen referencia a piel necrótica en las áreas alrededor de arterias que tienen una pobre circulación de la sangre.
El término "ED_{50}" significa la dosis de una droga que produce el 50% de su máxima respuesta o efecto.
Una "cantidad efectiva" de, por ejemplo, un agonista hedgehog, respecto al método de tratamiento en cuestión, se refiere a una cantidad de agonista en una preparación que, cuando se aplica como parte de un régimen de dosis deseado aporta aproximadamente, por ejemplo, un cambio en la tasa de proliferación celular y/o en el estado de diferenciación de una célula y/o en la tasa de supervivencia de una célula de acuerdo con estándars clínicamente aceptables para el desorden a ser tratado o el propósito cosmético.
Los términos "epitelio", "epitelial" y "epithelium" hacen referencia a la membrana celular interna y a las superficies externas del cuerpo (cutáneas, mucosas y serosas), incluyendo las glándulas y otras estructuras derivadas de éstas, por ejemplo, corneal, esofagal, epidermal, y células epiteliales del folículo piloso. Otro tejido epitelial ejemplar incluye: el epitelio olfativo, que es el epitelio pseudoestratificado que recubre la región olfativa de la cavidad nasal, y que contiene los receptores del sentido del olfato; el epitelio glandular, que se refiere al epitelio compuesto de células secretoras; epitelio escamoso, que hace referencia al epitelio compuesto por células aplanadas con forma de disco. El término epithelium puede referirse también a epitelio transicional, como el que se encuentra característicamente cubriendo órganos huecos que están sujetos a grandes cambios mecánicos debido a la contracción y distensión , por ejemplo, tejido que representa una transición entre epitelio escamoso estratificado y epitelio columnar.
El término "epitelialización" se refiere a la curación mediante el crecimiento de tejido epitelial sobre una superficie desnuda.
El término "glándula epidérmica" hace referencia a una agregación de células asociada con la epidermis y especializada en la secreción o excreción de materiales no relacionados con sus necesidades metabólicas ordinarias. Por ejemplo, las "glándulas sebáceas" son glándulas holocrinas en el corium que secretan una sustancia oleosa y sebo. El término "glándulas sudoríparas" se refiere a glándulas que segregan sudor, situadas en el corium o tejido subcutáneo, abiertas por un conducto a la superficie del cuerpo.
El término "epidermis" se refiere a la capa de la piel más externa y no vascular, derivada del ectodermo embrionario, variando su grosor entre 0,07-1,4 mm. En las superficies palmar y plantar ésta comprende, de dentro hacia fuera, cinco capas: capa basal compuesta de células columnares ordenadas perpendicularmente; célula espinosa o capa espinosa compuesta de células poliédricas aplanadas con protuberancias o espinas; capa granular compuesta de células granulares aplanadas; capa clara compuesta de diversas capas de células claras y transparentes en las que el núcleo es indistinto o está ausente; y capa córnea compuesta de células aplanadas, cornificadas y sin núcleo. En la epidermis de la superficie general del cuerpo, la capa clara está normalmente ausente.
Las "heridas escisionales" incluyen desgarros, abrasiones, cortes, pinchazos o laceraciones en la capa epitelial de la piel y pueden extenderse a la capa dérmica e incluso a la grasa subcutánea y más allá. Las heridas escisionales pueden ser el resultado de procedimientos quirúrgicos o de penetraciones accidentales en la piel.
El "estado de crecimiento" de una célula se refiere a la tasa de proliferación de la célula y/o al estado de diferenciación de ésta. Un "estado de crecimiento alterado" es un estado de crecimiento caracterizado por una tasa anormal de proliferación, por ejemplo, una célula que presenta una tasa de proliferación aumentada o disminuida relativa a una célula normal.
El término "pelo" se refiere a una estructura parecida a un hilo, especialmente la estructura epidérmica especializada compuesta de queratina y que se desarrolla a partir de un hundimiento de papila en el corium, producido sólo por mamíferos y característico de este grupo de animales. "Pelo" también hace referencia a la agregación de dichos pelos. Un "folículo piloso" se refiere a una de las invaginaciones tubulares de la epidermis que encierran los pelos, y desde las cuáles crecen los pelos. Las "células epiteliales del folículo piloso" se refieren a células epiteliales que envuelven la papila dérmica en el folículo piloso, por ejemplo, células pedunculares, células de la vaina del exterior de la raíz, células matriciales, y células de la vaina del interior de la raíz. Tales células pueden ser células no malignas normales, o células transformadas/inmortalizadas.
El término "agonista hedgehog" se refiere a un agente que potencia o recapitula la bioactividad del hedgehog, como por ejemplo activar la transcripción de genes diana. Los agonistas hedgehog preferidos pueden usarse para imitar o aumentar la actividad o efecto de la proteína hedgehog en un modo dependiente de smoothened. El término "agonista hedgehog" como se usa aquí se refiere no sólo a cualquier agente que pueda actuar mediante la activación directa de la función normal de la proteína hedgehog, sino también a cualquier agente que active la vía de señalización hedgehog, y así inhiba la función de ptc.
El término "pérdida de función hedgehog" se refiere a una modificación aberrante o mutación de un gen ptc, un gen hedgehog, o un gen smoothened, o una disminución (o pérdida) en el nivel de expresión de dicho gen, que resulta en un fenotipo equivalente al de una célula en contacto con un inhibidor hedgehog; por ejemplo, inhibición aberrante de una vía hedgehog. La pérdida de función puede incluir un incremente en la capacidad del producto del gen ptc para regular el nivel de expresión de genes Ci, por ejemplo, Glilo, Gli2, y GIi3. El término "pérdida de función hedgehog" también es utilizado aquí para referirse a cualquier fenotipo celular similar (por ejemplo, mostrar una reducida proliferación) que ocurre debido a una alteración en cualquier parte de la vía de transducción por señal hedgehog, incluyendo, pero no limitada a, una modificación o mutación del mismo hedgehog. Por ejemplo, una célula con una tasa de proliferación anormalmente baja debido a la inactivación de la vía de señalización hedgehog tendría un fenotipo "pérdida de función hedgehog", incluso si el hedgehog no estuviera mutado en esa célula.
Tal y como se usa aquí, "células inmortalizadas" se refiere a células que han sido alteradas por medios químicos y/o recombinantes de tal manera que las células tienen la capacidad de crecer a través de un número indefinido de divisiones en cultivo.
"Tejido epitelial interno" hace referencia al tejido dentro del cuerpo que tiene características similares a la capa epidérmica de la piel. Algunos ejemplos incluyen el recubrimiento del intestino. El método de la presente invención es útil para promover la curación de ciertos daños internos, por ejemplo daños causados por cirugía.
El término "queratosis" se refiere a un desorden de la proliferación de la piel caracterizado por hiperplasia de la capa córnea (callosa) de la epidermis. Ejemplos de desórdenes queratósicos incluyen queratosis folicular, queratosis palmar y plantar, queratosis faríngea, queratosis pilar, y queratosis actínica.
El término "LD_{50}" significa la dosis de una droga que es letal en el 50% de los individuos testeados.
El término "uña" se refiere a la lámina cutánea cobertora en la superficie dorsal del final distal de un dedo de la mano o del pie.
El término "ganancia de función patched" hace referencia a una modificación aberrante o mutación de un gen ptc, o un aumento del nivel de expresión del gen, que resulta en un fenotipo que equivale al de una célula en contacto con un inhibidor hedgehog, por ejemplo, una desactivación aberrante de una vía hedgehog. La ganancia de función puede incluir un aumento de la capacidad del producto del gen ptc para regular el nivel de expresión de genes Ci, por ejemplo, Glilo, G112 y G1i3.
Un "paciente" o "sujeto" a ser tratado por el método en cuestión puede ser tanto un humano o un animal no humano.
El término "profármaco" está pensado para abarcar componentes que, bajo condiciones fisiológicas, son convertidos en los agentes terapéuticamente activos de la presente invención. Un método común para fabricar un profármaco es incluir fracciones seleccionadas que son hidrolizadas bajo condiciones fisiológicas para poner de manifiesto la molécula deseada. En otras realizaciones, el profármaco es transformado mediante una actividad enzimática del animal huésped.
Tal como se usa aquí, "proliferar" y "proliferación" se refiere a células que experimentan mitosis.
A lo largo de toda esta aplicación, el término "desorden proliferativo de la piel" se refiere a cualquier enfermedad/desorden de la piel marcado por una proliferación aberrante o no deseada del tejido cutáneo. Estas condiciones se caracterizan típicamente por proliferación celular epidérmica o diferenciación celular incompleta, e incluye, por ejemplo, ictiosis ligada al cromosoma X, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, hiperqueratosis epidermolítica, y dermatitis seborreica. Por ejemplo, la epidermodisplasia es una forma de desarrollo defectuoso de la epidermis. Otro ejemplo es la "epidermolisis", que hace referencia a un estado aflojado de la epidermis con formación de ampollas y bullas tanto espontáneamente como en el sitio del trauma.
El término "piel" se refiere a la cubierta protectora externa del cuerpo, que consta del corium y la epidermis, y se entiende que incluye las glándulas sudoríparas y sebáceas, así como también las estructuras del folículo piloso. A lolargo de la presente aplicación, el adjetivo "cutáneo" puede ser usado, y debe ser entendido para referirse generalmente a cualidades de la piel, cuando sean apropiadas al contexto en que son usadas.
El término "pequeña molécula" hace referencia a un compuesto que tiene un peso molecular menor de 2500 amu, preferiblemente menor de 2000 amu, incluso más preferible si es menor de 1500 amu, y aun mejor si es menor de 1000 amu, o lo más preferible es que el peso molecular sea menor de 750 amu.
El término "pérdida de función smoothened" se refiere a una modificación aberrante o mutación de un gen smo, o a un nivel disminuido de expresión del gen, que resulta en un fenotipo equivalente al de una célula en contacto con un inhibidor hedgehog, por ejemplo, una desactivación aberrante de una vía hedgehog. No queriendo ligarse a ninguna teoría en particular, se observa que ptc podría no señalizar directamente dentro de la célula, sino que interactúa preferiblemente con smoothened, otra proteína de límite de membrana localizada en la cascada de ptc en la señalización hedgehog (Marigo et al., (1996) Nature 384: 177-179). El gen smo es un gen de polaridad de segmentos requerido para el correcto patronaje de cada segmento Drosophila (Alcedo et al., (1996) Cell 86: 221-232). Los hómologos humanos de smo han sido identificados. Ver, por ejemplo, Stone et al. (1996) Nature 384:129-134, y la entrada en GenBank U84401. El gen smoothened codifica una proteína integral de membrana con características de receptores heterotriméricos acoplados a la proteína G; es decir, 7 regiones transmembrana. Esta proteína muestra homología con la proteína Frizzled (Fz) de Drosophila, un miembro de la vía wingless. Originalmente se pensaba que smo codifica un receptor de la señal Hh. Sin embargo, posteriormente esta sugerencia fue rechazada, cuando se obtuvo evidencia de que ptc era el receptor Hh. Las células que expresan Smo fallan al unirse a Hh, indicando que smo no interactúa directamente con Hh (Nusse, (1996) Nature 384: 119-120). Mejor dicho, la unión del Sonic hedgehog (SHH) a su receptor, PTCH, se cree que previene la inhibición normal por PTCH de smoothened (SMO), una proteína de siete dominios transmembrana.
El término "índice terapéutico" se refiere al índice terapéutico de un fármaco definido como LD_{50}/ED_{50}.
El término "acilamino" es conocido en la materia y se refiere a un fragmento que puede representarse con la fórmula general:
4
en donde R9 es como se ha definido anteriormente, y R'11 representa un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo o -(CH_{2})_{m}-
R_{8}, en donde m y R8 son como se han definido anteriormente.
Aquí, el término "grupo alifático" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático de cadena simple, cadena ramificada o cíclico e incluye grupos alifáticos saturados e insaturados, tales como un grupo alquilo, un grupo alquenilo, y un grupo alquinilo.
Los términos "alquenilo" y "alquinilo" hacen referencia a grupos alifáticos insaturados análogos en longitud y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un enlace doble o triplerespectivamente.
Los términos "alcoxilo" o "alcoxi" tal y como se utilizan aquí se refieren a un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, que tiene un radical oxígeno unido a él. Grupos alcoxilo representativos incluyen metoxi, etoxi,propiloxi, tert- butoxi y similares. Un "éter" son dos hidrocarburos covalentemente unidos por un oxígeno. Por consiguiente, el sustituyente de un alquilo que transforma este alquilo en un éter es o equivale a un alcoxilo, tal y como los que pueden ser representados por uno de los siguientes: -O-alquilo, -O-alquenilo, -O-alquinilo, -O-(CH_{2}-R_{8}, donde m y R_{8} se han descrito con anterioridad.
El término "alquilo" se refiere al radical de grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena simple, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo (alicíclico), grupos cicloalquilo alquilo sustituidos, y grupos alquilo cicloalquilo sustituidos. En realizaciones preferidas, un alquilo de cadena simple o ramificada tiene 30 o menos átomos de carbono en su eje (por ejemplo, C_{1}-C_{30} para cadenas simples, C_{3}-C_{30} para cadenas ramificadas), y más preferiblemente 20 o menos. Asimismo, los cicloalquilos preferidos tienen entre 3 y 10 átomos de carbono en su estructura de anillo, y más preferiblemente tienen 5, 6 ó 7 carbonos en su estructura anular.
Por otra parte, el término "alquilo" (o "alquilo inferior") tal y como se usa a lo largo de toda la especificación, ejemplos, y reivindicaciones está pensado para incluir tanto "alquilos no sustituidos" como "alquiles sustituidos", el último de los cuáles se refiere a fragmentos alquilo que tienen sustituyentes reemplazando un hidrógeno en uno o más carbonos del eje del hidrocarburo. Tales sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, un halógeno, un hidroxilo, un carbonilo (tales como un carboxilo, un alcoxicarbonilo, un formilo, o un acilo), un tiocarbonilo (tales como por ejemplo: un tioéster, un tioacetato, o un tioformato), un alcoxilo, un fosforilo, un fosfato, un fosfonato, un fosfinato, un amino, un amido, una amidina, una imina, un ciano, un nitro, un ácido, un sulfhidrilo, un alquiltio, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoilo, un sulfonamido, un sulfonilo, un heterociclilo, un aralquilo, o un fragmento aromático o heteroaromático. Se entenderá por aquellos expertos en la materia que los fragmentos sustituidos en la cadena hidrocarburo pueden ser sustituidos ellos mismos, si fuera conveniente. Por ejemplo, los sustituyentes de un alquilo sustituido pueden incluir formas sustituidas y no sustituidas de grupos amino, ácido, imino, amido, fosforilo (incluyendo fosfonato y fosfinato), sulfonilo (incluyendo sulfato, sulfonamido, sulfamoilo y sulfonato), y grupos sililo, así como también éteres, alquitios, carbonilos (incluyendo cetonas, aldehídos, carboxilatos, y ésteres), -CF_{3}, -CN y similares. Alquilos sustituidos ejemplares son descritos más adelante. Los cicloalquilos pueden ser sustituidos además con alquilos, alquenilos, alcoxis, alquiltios, aminoalquilos, alquilos carbonilo sustituidos, -CF_{3}, -CN, y similares.
A no ser que el número de carbonos fuera especificado de otra manera, un "alquilo inferior" tal y como es usado aquí significa un grupo alquilo, como se define anteriormente, pero que tiene de uno a diez carbonos, más preferiblemente de uno a seis átomos de carbono en su estructura principal. Asimismo, los "alquenilos inferiores" y "alquiniles inferiores" tienen cadenas de longitud parecida. En toda la aplicación, los grupos alquilo preferidos son los alquilos inferiores. En realizaciones preferidas, un sustituyente denominado aquí como alquilo es un alquilo inferior.
El término "alquiltio" se refiere a un grupo alquilo, tal y como se ha definido anteriormente, que tiene un radical sulfuro unido a él. En realizaciones preferentes, el fragmento "alquiltio" está representado por uno de los siguientes:
-S-alquilo, -S-alquenilo, -S-alquinilo, y -S-(CH_{2})m-R_{8}, donde m y R_{8} han sido definidos anteriormente. Grupos alquiltio representativos incluyen metilito, etiltio, y similares.
Los términos "amina" y "amino" son conocidos en la materia y se refieren tanto a aminas no sustituidas como sustituidas, por ejemplo, un fragmento que puederepresentarse con la fórmula general:
5
en donde R_{9}, R_{10} y R'_{10} cada uno independientemente representan un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, -(CH_{2})_{m}-R_{8}, o R_{9} y R_{l0} unidos el uno al otro con el átomo N al que están ligados completando un heterociclo que tiene de 4 a 8 átomos en la estructura de anillo; R_{8} representa un arilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un heterociclo o un policiclo; y m es cero o un número entero en el intervalo de 1 a 8. En realizaciones preferidas, sólo uno de R_{9} o R_{l0} puede ser un carbonilo, por ejemplo, R_{9}, R_{l0} y el nitrógeno juntos no forman una imida. En realizaciones aun más preferidas, el término 'amina' no abarca amidas, por ejemplo, donde uno de R_{9} y R_{10} representa un carbonilo. En realizaciones incluso más preferidas, R_{9} y R_{10} (y opcionalmente R'_{10}) cada uno independientemente representan un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, o -(CH_{2})_{m}-R_{8}. Así, el término "alquilamina" tal y como se usa aquí significa un grupo amino, descrito anteriormente, que tiene un alquilo sustituido o sin sustituir unido a él, es decir, al menos uno de R_{9} y R_{10} es un grupo alquilo.
El término "amido" es conocido en la materia como un carbonilo amido sustituido e incluye un fragmento que puede ser representado por la fórmula general:
6
en donde R_{9}, R_{l0} son tal y como se han definido anteriormente. Realizaciones preferentes de la amida no incluirían imidas que pueden ser inestables.
El término "aralquilo", como se usa aquí, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo (por ejemplo, un grupo aromático o heteroaromático).
El término "arilo" tal y como se usa aquí incluye grupos aromáticos de anillo simple de 5, 6, y 7 miembros que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos, por ejemplo, benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares. Estos grupos arilo que tienen heteroátomos en la estructura de anillo podrían ser denomanidos también como "heterociclos arilo" o "heteroaromáticos". El anillo aromático puede ser sustituido en una o más posiciones del anillo con sustituyentes como los descritos anteriormente, por ejemplo, halógeno, ácido, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, sulfonamido, cetona, aldehído, éster, heterociclilo, fragmentos aromáticos o heteroaromáticos, -CF_{3}, -CN, o similares. El término "arilo" también incluye sistemas de anillo policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes (los anillos son "anillos fusionados") donde al menos uno de los anillos es aromático, por ejemplo, los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos y/o heterociclilos.
El término "carbociclo", tal como se usa aquí, se refiere a un anillo aromático o no aromático en el que cada átomo del anillo es carbono.
El término "carbonilo" es conocido en la materia e incluye fragmentos como los que se pueden representar por la fórmula general:
7
en donde X es un enlace o representa un oxígeno o un azufre, y R_{11} representa un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, -(CH_{2})_{m}-R_{8} o una sal farmacéutica aceptable, R'_{11} representa un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo o -(CH_{2})_{m}-R_{8}, donde m y R_{8} son como se han definido anteriormente. Cuando X es un oxígeno y R_{11} o R'_{11} no son hidrógenos, la fórmula representa un "éster". Cuando X es un oxígeno, y R_{11} es como se define anteriormente, el fragmento se denomina aquí como grupo carboxilo, y particularmente cuando R_{11} es un hidrógeno, la fórmula representa un "ácido carboxílico". Cuando X es un oxígeno, y R'_{11} es hidrógeno, la fórmula representa un "formato". En general, cuando el átomo de oxígeno de la fórmula anterior es reemplazado por un azufre, la fórmula representa un grupo "tiocarbonilo". Cuando X es un azufre y R_{11} o R'_{11} no son hidrógenos, la fórmula representa un "tioéster". Cuando X es un azufre y R_{11} es hidrógeno, la fórmula representa un "ácido tiocarboxílico". Cuando X es un azufre y R'_{11} es hidrógeno, la fórmula representa un "tioformato". Por otro lado, cuando X es un enlace, y R_{11} no es hidrógeno, la fórmula anterior representa un grupo "cetona". Cuando X es un enlace, y R_{11} es hidrógeno, la fórmula anterior representa un grupo "aldehído".
El término "heteroátomo" tal y como se usa aquí significa un átomo de cualquier elemento excepto carbono o hidrógeno. Os heteroátomos preferibles son boro, nitrógeno, oxígeno, fósforo, sulfuro y selenio.
El término "heterociclilo" o "grupo heterocíclico" se refieren a estructuras de anillo de 3 a 10 miembros, más preferiblemente a anillos de 3 a 7 miembros, las estructuras de anillo de los cuáles incluyen de uno a cuatro heteroátomos. Los heterociclos pueden ser también policiclos. Los grupos heterociclilo incluyen, por ejemplo, tiofeno, tiantreno, furano, pirano, isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxatiino, pirrolo, imidazolo, pirazolo, isotiazolo, isoxazolo, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindolo, indolo, indazolo, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, fthalazina, naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinnolina, pteridina, carbazol, carbolino, fenantridina, acridina, pirimidina, fenantrolina, fenazina, fenarsazina, fenotiazina, furazan, fenoxaziria, pirrolidina, oxolano, tiolano, oxazolo, piperidina, piperazina, morfolina, lactonas, lactamas tales como azetidinonas y pirrolidinonas, sultamas, sultonas, y similares. El anillo heterocíclico, puede ser sustituido en una o más posiciones por sustituyentes como los descritos anteriormente, como por ejemplo, halógeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, cetona, aldehído, éster, un fragmento heterociclilo, aromático o heteroaromático, -CF_{3}, -CN, o similares.
Tal y como se usa aquí, el término "nitro" significa -NO_{2}; el término "halógeno" designa -F, -Cl, -Br o -I; el término "sulfhidrilo" significa -SH; el término "hidroxilo" significa -OH; y el término "sulfonilo" significa -SO_{2}-.
Una "fosfonamidita" puede representarse con la fórmula general:
--- Q_{2} --- 
\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\para}{R _{48} }}
--- O ---, 
\hskip0.5cm
o 
\hskip0.5cm
---Q_{2}---
\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\para}{R _{48} }}
---OR_{46}
En donde R_{9} y R_{10} son como se define anteriormente, Q_{2} representa O, S o N, y R_{48} representa un alquilo inferior o un arilo, Q_{2} representa O, S ó N.
Una "fosforamidita" puede representarse por la fórmula general:
--- Q_{2} --- 
\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\dpara}{O}}
--- O ---, 
\hskip0.5cm
o 
\hskip0.5cm
--- Q_{2} --- 
\melm{\delm{\para}{N(R _{9} )R _{10} }}{P}{\uelm{\dpara}{O}}
--- OR_{46}
en donde R_{9} y R_{10} son como se definen anteriormente, y Q_{2} representa O, S o N.
Un "fosforilo" puede ser representado en general por la fórmula:
--- 
\melm{\delm{\para}{OR _{46} }}{P}{\uelm{\dpara}{Q _{1} }}
--- 
\newpage
en donde Q_{1} representa S ó O, y R_{46} representa hidrógeno, un alquilo inferior o un arilo. Cuando se usa para sustituir, por ejemplo, un alquilo, el grupo fosforilo del fosforilalquilo puede ser representado por la fórmula general:
--- Q_{2} --- 
\melm{\delm{\para}{OR _{46} }}{P}{\uelm{\dpara}{Q _{1} }}
--- O ---, 
\hskip0.5cm
o 
\hskip0.5cm
--- Q_{2} --- 
\melm{\delm{\para}{OR _{46} }}{P}{\uelm{\dpara}{Q _{1} }}
--- OR_{46}
en donde Q_{1} representa S ó O, y cada R_{46} independientemente representa hidrógeno, un alquilo inferior o un arilo, Q_{2} representa O, S ó N. Cuando Q_{1} es un S, el fragmento fosforilo es un "fosforotioato".
Los términos "policiclilo" o "grupo policíclico" serefieren a dos o más anillos (por ejemplo, cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos y/o heterociclilos) en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes, por ejemplo, los anillos son "anillos fusionados". Los anillos que están unidos a través de átomos no adyacentes se denominan anillos "puente". Cada uno de los anillos del policiclo puede ser sustituido por sustituyentes tales como los descritos anteriormente, como por ejemplo, halógeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, cetona, aldehído, éster, un fragmento heterociclilo, aromático o heteroaromático, -CF_{3}, -CN, o similares.
La frase "grupo protector" tal y como se usa aquí significa sustituyentes temporales que protegen a un grupo funcional potencialmente reactivo de transformaciones químicas no deseadas. Ejemplos de dichos grupos protectores incluyen ésteres de ácidos carboxílicos, éteres sililo de alcoholes, y acetales y cetales de aldehídos y cetonas, respectivamente. El campo de la química de los grupos protectores ha sido revisado (Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, ^{2nd}ed.; Wiley: New York, 1991).
Un "selenoalquilo" se refiere a un grupo alquilo que tiene un grupo seleno sustituido unido a él. "Selenoéters" ejemplares que podrían ser sustituidos en el alquilo son seleccionados de uno de los siguientes: -Se-alquilo, -Se-alquenilo, -Se-alquinilo, y -Se-(CH_{2})_{m} R_{8}, m y R_{8} han sido definidos anteriormente.
Como se usa aquí, el término "sustituido" está contemplado para incluir todos los sustituyentes permitidosde compuestos orgánicos. En un amplio aspecto, los sustituyentes permitidos incluyen sustituyentes de compuestos orgánicos cíclicos y acíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos. Sustituyentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, aquellos descritos aquí anteriormente. Los sustituyentes permitidos pueden ser uno o más y el mismo o diferentes para compuestos orgánicos apropiados. Para los propósitos de esta invención, los heteroátomos como el nitrógeno podrían tener sustituyentes hidrógeno y/o cualquier sustituyente permitido de los compuestos orgánicos aquí descritos que satisfagan las valencias de los heteroátomos. Esta invención no está pensada para ser limitada de ninguna manera por los sustituyentes permitidos de compuestos orgánicos.
Se entiende que "sustitución" o "sustituido con" incluye la cláusula implícita que dicha sustitución es acorde con valencias permitidas del átomo sustituido y del sustituyente, y que la sustitución da como resultado un compuesto estable, por ejemplo, que no sufre transformaciones espontáneamente tales como por reorganización, ciclación, eliminación, etc.
El término "sulfamoilo" es conocido en la materia e incluye un fragmento que puede representarse con la fórmula general:
8
en la que R_{9} y R_{10} son tal y como se ha definido anteriormente.
El término "sulfato" es también conocido en la materia e incluye un fragmento que puede ser representado por la fórmula general:
--- O --- 
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}
--- OR_{41}
en la que R_{41} es como se ha definido anteriormente.
El término "sulfonamido" se conoce en la materia e incluye un fragmento que puede representarse por la fórmula general:
--- 
\delm{N}{\delm{\para}{R _{9} }}
--- 
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}
--- R'_{11}
en la que R_{9} y R'_{11} son como se han definido con anterioridad.
El término "sulfonato" es conocido en la materia e incluye un fragmento que puede representarse con la fórmula general:
--- 
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}
--- OR_{41}
en la que R_{41} es un par de electrones, hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, o arilo.
Los términos "sulfóxido" o "sulfinilo", tal y como se usa aquí, se refiere a un fragmento que puede ser representado por la fórmula general:
--- 
\uelm{S}{\uelm{\dpara}{O}}
--- R_{44}
en el que R_{44} es seleccionado del grupo que consta de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, aralquilo, o arilo.
Pueden hacerse sustituciones análogas a grupos alquenilos y alquinilos para producir, por ejemplo, aminoalquenilos, aminoalquinilos, amidoalquenilos, amidoalquinilos, iminoalquenilos, iminoalquinilos, tioalquenilos, tioalquinilos, alquenilos carbonil-sustituidos o alquinilos carbonil-sustituidos.
Tal y como se usa aquí, la definición de cada expresión, por ejemplo, alquilo, m, n, etc., cuando aparece más de una vez en alguna estructura, se entiende que es independiente de su definición en cualquier parte de la misma estructura.
Los términos triflilo, tosilo, mesilo, y nonaflilo son conocidos en la materia y se refieren a grupos trifluorometanosulfonilo, p-toluenosulfonilo, metanosulfonilo, y nonafluorobutanosulfonilo, respectivamente. Los términos triflato, tosilato, mesilato, y nonaflato son también conocidos en la materia y se refieren a grupos funcionales de ésteres y moléculas que contienen los grupos trifluorometanosulfonato, p-toluenosulfonato, metanosulfonato, y nonafluorobutanosulfonato, respectivamente.
Las abreviaturas Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms representan metilo, etilo, fenilo, trifluorometanosulfonilo, nonafluorobutanosulfonilo, p-toluenosulfonilo y metanosulfonilo, respectivamente. Un listado más exhaustivo de las abreviaturas utilizadas habitualmente por los químicos orgánicos hábiles en la materia aparece en el primer tema de cada volumen del Journal of Organic Chemistry; este listado se presenta típicamente en una tabla titulada Listado Estándar de Abreviaturas (Standard List of Abbreviations). Las abreviaturas contenidas en dicho listado, y todas las abreviaturas utilizadas por los químicos orgánicos especialistas en la materia han sido incorporadas aquí por referencia.
Ciertos compuestos de la presente invención puedenexistir en particulares formas geométricas y estereoisoméricas. La presente invención contempla todos los dichocompuestos, incluyendo isómeros cis- y trans-, enantioisómeros R- y S-, diastereómeros, (D)-isómeros, (L)-isómeros, mezclas racémicas de éstos, y otras mezclas de los mismos, que entren dentro del marco de las invención. Pueden estar presentes átomos de carbono asimétricos adicionales en un sustituyente tal como un grupo alquilo. Todos los dichos isómeros, así como también las mezclas de éstos, se han pensado para ser incluidos en esta invención.
Si, por ejemplo, se desea un enantiómero particular de un compuesto de la presente invención, puede ser preparado mediante síntesis asimétrica, o por derivación con un auxiliar quiral, donde la mezcla diastereomérica resultante es separada y el grupo auxiliar se rompe para proporcionar los enantiómeros puros deseados. Alternativamente, cuando la molécula contiene un grupo funcional básico, tal como amino, o un grupo funcional acídico, como un carboxilo, las sales diastereoméricas pueden ser formadas con un ácido o una base ópticamente activos apropiados, seguido por la resolución de los diastereómeros así formados por cristalización fraccional o medios cromatográficos bien conocidos en la materia, y subsiguiente recuperación de los enantiómeros puros.
Los equivalentes contemplados de los compuestos descritos anteriormente incluyen compuestos que de otra manera corresponden a éstos, y que tienen las mismas propiedades generales que éstos (por ejemplo, la capacidad para activar la señalización hedgehog), en donde se han hecho una o más variaciones simples de sustituyentes, las cuáles no afectan adversamente la eficacia del compuesto. En general, los compuestos de la presente invención pueden prepararse mediante los métodos ilustrados en esquemas de reacciones generales como, por ejemplo, el descrito más adelante, o por modificaciones del mismo, usando materiales de partida fácilmente obtenibles, reactivos y procedimientos de síntesis convencionales. En estas reacciones, es posible también usar variantes que son en ellas conocidos, pero no mencionadas aquí.
Por própositos de esta invención, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87, dentro de la cubierta. También por propósitos de esta invención, el término "hidrocarburo" está contemplado para incluir todos los compuestos permitidos que tienen al menos un átomo hidrógeno y uno de carbono. En un amplio aspecto, los hidrocarburos permitidos incluyen compuestos orgánicos acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos, los cuáles pueden estar sustituidos o no sustituidos.
III. Compuestos ejemplares de la invención
Como se describe con más detalle a continuación, está contemplado que los métodos en cuestión pueden llevarse a cabo usando una variedad de diferentes moléculas pequeñas que pueden ser fácilmente identificadas, por ejemplo, por los ensayos de barrido de fármacos como los que se describen aquí.
En ciertas realizaciones, compuestos útiles en la presente invención podrían ser representados con la fórmula general (II):
Fórmula II
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dónde, cuando la velencia y la estabilidad lo permiten,
Ar y Ar' independientemente representan anillos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos;
Y, independientemente para cada caso, está ausente;
X, es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN), -P(=O)(OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tales como grupos alquilo inferior, grupos alquenilo o grupos alquinilo;
M representa, independientemente para cada caso, ungrupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH2-,
-CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc., o dos M juntas representan eteno o etino sustituidos o no sustituidos, donde alguno o todos los casos de M en M_{j} forman toda o parte de una estructura cíclica;
R representa, independientemente para cada caso, H o alquilo sustituido o sin sustituir;
Cy' representa un arilo, un heterociclilo, un heteroarilo o un cicloalquilo sustituidos o no sustituidos, incluyendo grupos policíclicos;
j representa, independientemente para cada caso, un número entero del 0 al 10, preferiblemente entre 2 y 7; y
i representa, independientemente para cada caso, un número entero del 0 al 5, preferentemente del 0 al 2.
En ciertas realizaciones, M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc.
En ciertas realizaciones, Ar y Ar' representan anillos fenilo, por ejemplo, no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos incluyendo heteroátomos tales como O, N y S. En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representan un anillo fenilo. En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representan un anillo heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, etc. En ciertas realizaciones, Y y Ar' están unidos a Ar en una relación meta y/o 1,3-.
Y está ausente de todas las posiciones.
En ciertas realizaciones, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir. En ciertas realizaciones, Cy' está directamente unido a X. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo bicíclico o heteroarilo sustituido o sin sustituir, preferiblemente tanto bicíclico como heterocíclico, tal como por ejemplo benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo arilo monocíclico o heteroarilo sustituido al menos con un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, es decir, formando un sistema biarilo. En ciertas realizaciones, Cy' incluye dos anillos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectado por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo biarilo o bicíclico.
En ciertas realizaciones, X es seleccionada de -C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
En ciertas realizaciones, R representa un H o un alquilo inferior, por ejemplo, H o Me.
En ciertas realizaciones, NR_{2} representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con uno o dos grupos alquilo inferior, preferiblemente una amina primaria o secundaria.
En ciertas realizaciones, sustituyentes en Ar o Ar' son seleccionados de los siguientes: halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}
alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo, -(CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior,
-(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR- alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de los anteriores, en donde p y n, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
La presente invención también se refiere a una preparación farmacéutica que consta de un método in vitro para causar agonismo la vía del hedgehog en la célula usando el compuesto que tiene la estructura de la Fórmula VIII:
Fórmula VIII
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en donde, cuando la valencia y la estabilidad lo permiten,
U representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir fusionado al anillo que contiene el nitrógeno;
V representa un metileno, 1,1-etileno o 1,1-propileno;
W representa S ó O, preferentemente O;
X representa C=O, C=S, ó SO_{2};
R_{3} representa un, arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, aralquilo, o heteroaralquilo sustituidos o no sustituidos;
R_{4} representa, un aralquilo o alquilo inferior sustituidos o no sustituidos, tales como un fenetilo, benzilo, o aminoalquilo, etc;
R_{5} representa, un arilo, heteroarilo, aralquilo, o heteroaralquilo, sustituidos o no sustituidos, incluyendo grupos aromáticos policíclicos o heteroaromáticos.
En ciertas realizaciones, U representa un anillo fenilo fusionado con el anillo que contiene nitrógeno.
En algunas realizaciones, R_{3} es seleccionado de un, arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior, aralquilo, y heteroaralquilo sustituidos o no sustituidos.
En algunas realizaciones, R_{4} es un grupo alquilo inferior no sustituido, o es un grupo alquilo inferior sustituido con una amina secundaria o terciaria.
En ciertas realizaciones, R_{5} es seleccionado de un fenilo o naftilo sustituido o sin sustituir,, o es un grupo diariloalquilo, como 2,2-difeniletilo, difenilmetilo, etc.
La presente invención también se refiere a con una preparación farmacéutica que consta de un método in vitro para agudizar la vía del hedgehog en un compuesto en una célula usando el compuesto que tiene la estructura de la Fórmula IX. La invención también proporciona el uso de compuestos representados por la fórmula general (IX) en la fabricación de un medicamento para modular la proliferación o diferenciación de una célula en un animal.
Fórmula IX
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en donde, cuando la valencia y la estabilidad lo permiten,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo (sustituido o sin sustituir) arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo, o un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y, independientemente para cada caso, está ausente excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar donde está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S- o -Se-, si Z no es un anillo, entonces Y unido a Z está ausente; X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, P(=O)(OR)-;
M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH_{2}-,
-CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc.; R representa, independientemente para cada caso, H o un alquilo sustituido o sin sustituir;
i representa 0 para todos los casos, excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar, donde i representa 1; y
k representa 0 para todos los casos, excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar, donde k representa un número entero del 0 al 3.
En ciertas realizaciones, Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, por ejemplo, no sustituido o sustituido con uno o más grupos incluyendo opcionalmente heteroátomos tales como O, N, y S. En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar o Ar' representa un anillo heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, furanilo, etc. En ciertas realizaciones, los casos de Y unido a Ar están dispuestos en una relación meta y/o 1,3.
En ciertas realizaciones, Y está ausente de todas las posiciones. En ciertas realizaciones, la única actual casuística de Y está unida a M_{k}. En realizaciones donde Y está presente en una posición, i o k preferiblemente representa 2 en un M_{i/k} adyacente si i/k=0 resultaría en dos casos de Y estando directamente unidos el uno al otro, o un caso de Y estando unido a N. En ciertas realizaciones, en donde dos casos de Y están unidos a M, al menos uno de dichos casos de Y está ausente. En ciertas realizaciones, no están presentes más de dos casos de Y.
Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir. En ciertas realizaciones, Cy' está directamente unido a X. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo bicíclico o heteroaril sustituido o sin sustituir, preferentemente los dos tanto bíciclico como heteroarilo, tales como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas realizaciones, Cy' un anillo arilo monocíclico o heteroarilo sustituido al menos con un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, es decir, formando un sistema biarilo. En ciertas realizaciones, Cy' incluye dos anillos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente unidos por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema anular biarilo o bicíclico. En ciertas realizaciones, Cy' representa un benzo(b)tien-2-ilo sustituido o sin sustituir.
En ciertas realizaciones, X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
Cy representa un anillo aromático carbocíclico o heterocíclico sustituido o sin sustituir, es decir, incluyendo al menos un átomo sp^{3} hibridado, y preferiblemente una pluralidad de átomos sp^{3} hibridados. En ciertas realizaciones, Cy incluye una amina dentro de los átomos del anillo o sobre un sustituyente del anillo, por ejemplo, Cy es piridilo, imidazolilo, pirrolilo, piperidilo, pirrolidilo, piperazilo, etc., y/o lleva un sustituyente amino. Cy es un anillo de seis miembros directamente unido a N y lleva un sustituyente amino en la cuarta posición del anillo relativa a N, los sustituyentes N y amina podrían disponerse en trans en el anillo.
En ciertas realizaciones, sustituyentes en Ar o Z, en donde Z es un anillo arilo o heteroarilo, son seleccionados de los siguientes: halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo, -(CH_{2})_{p}aralquilo,
-(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, -O(CH_{2})nR, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})n_{R}, y formas protegidas de las anteriores, en donde n y p, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
En ciertas realizaciones, Z está directamente unido a Ar, o unido a Ar a través de una cadena de uno o dos átomos. En ciertas realizaciones, Z-Y-M, juntos, está ausente.
En ciertas realizaciones, compuestos útiles en la presente invención podrían representarse por la fórmula general (X):
Fórmula X
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en donde, cuando la valencia y la estabilidad lo permiten,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo, sustituido o sin sustituir, arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo o un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente siempre excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o -Se-, si Z no es un anillo, entonces Y unido a Z está ausente;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tales como grupos alquilo inferior, alquenilo o alquinilo;
R representa, independientemente para cada caso, H o un alquilo sustituido o sin sustituir;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, incluyendo grupos policíclicos;
M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH_{2}-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O), etc.;
j representa, independientemente para cada caso, un número entero del 2 al 10, preferiblemente del 2 al 7;
i representa, independientemente para cada caso, un número entero del 0 al 5, preferiblemente del 0 al 2; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar, donde k es un número entero del 0 al 3.
En ciertas realizaciones, NR_{2} representa una amina primaria o secundaria o una amina terciaria sustituida con uno o dos grupos alquilo inferior, grupos arilo o grupos aralquilo, respectivamente, preferiblemente una amina primaria o secundaria.
En ciertas realizaciones, M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH_{2}-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O), etc.
En ciertas realizaciones, Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, por ejemplo, no sustituido o sustituido con uno o más grupos incluyendo opcionalmente heteroátomos tales como O, N y S. En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo fenilo. En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo heteroaril, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, furanilo, etc. En ciertas realizaciones, los casos de Y unido a Ar están dispuestos en una relación meta y/o 1,3.
En ciertas realizaciones, Y está ausente de todas las posiciones. En ciertas realizaciones, el único caso actual de Y está unido a M_{k}. En realizaciones donde Y está presente en una posición, i ó k preferiblemente representan 2 en un M_{i/k} adyacente si i/k=0 resultaría en dos casos de Y estando directamente unidos el uno al otro, o un caso de Y estando unido a N. En ciertas realizaciones, donde dos casos de Y están unidos a M, al menos uno de dichos casos de Y está ausente. En ciertas realizaciones, no están presentes más de dos casos de Y.
Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir. En ciertas realizaciones, Cy' está directamente unido a X. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo bicíclico o heteroarilo sustituido o sin sustituir, preferentemente los dos tanto bicíclico como heteroarilo, tales como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas realizaciones, Cy' un anillo arilo monocíclico o heteroarilo sustituido al menos con un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, es decir, formando un sistema biarilo. En ciertas realizaciones, Cy' incluye dos anillos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectado por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema anular biarilo o bicíclico. En ciertas realizaciones, Cy' representa un benzo(b)tien-2-il sustituido o sin sustituir.
En ciertas realizaciones, X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
En ciertas realizaciones, sustituyentes en Ar o Z, en donde Z es un anillo arilo o heteroarilo, son seleccionados de los siguientes: halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo, -(CH_{2})_{p}aralquilo,
-(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, -O(CH_{2})nR, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de las anteriores, en donde n y p, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
En ciertas realizaciones, Z está directamente unido a Ar, o unido a Ar a través de una cadena de uno o dos átomos. En ciertas realizaciones, Z-Y-M, juntos, está ausente.
En ciertas realizaciones, compuestos útiles en la presente invención podrían representarse por la fórmula general (XI):
Fórmula XI
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en donde, cuando la valencia y la estabilidad lo permiten,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo (sustituido o sin sustituir) arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo, o un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y, está ausente en todos los casos excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar donde está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S- o -Se-, siempre que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está ausente;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, P(=O)(OR)-;
M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH_{2}-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O)-, etc., o dos M juntos representan eteno o etino sustituidos o no sustituidos;
R representa, independientemente para cada caso, H o un alquilo sustituido o sin sustituir;
i representa 0 para todos los casos, excepto en la secuencia N-M_{i}-Y-Ar, donde i es 1; y
k representa 0 para todos los casos, excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar, donde k representa un número entero del 0 al 3.
En ciertas realizaciones, NR_{2} representa una amina primaria o secundaria o una amina terciaria sustituida con uno o dos grupos alquilo inferior, grupos arilo o grupos aralquilo, respectivamente, preferiblemente una amina primaria o secundaria.
En ciertas realizaciones, M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir, tal como -CH_{2}-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=O), etc.
En ciertas realizaciones, Ar y Z independientemente representan anillos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos incluyendo opcionalmente heteroátomos como O, N, y S. En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar y Z representa un anillo fenilo. En ciertas realizaciones, al menos uno de Ar y Z representa un anillo heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, furanilo, etc. En ciertas realizaciones, los casos de Y unido a Ar están dispuestos en una relación meta y/o 1,3-.
En ciertas realizaciones, Y está ausente de todas las posiciones. En ciertas realizaciones, la única actual casuística de Y es unida a M_{k}. En materializaciones donde Y está presente en una posición, i o k preferiblemente representan 2 en un M_{i/k} adyacente si i/k=0 resultaría en dos casos de Y estando directamente unido el uno al otro, o un caso de Y estando unido a N. En ciertas realizaciones, donde dos casos de Y están unidos a M, al menos uno de dichos casos de Y está ausente. En ciertas realizaciones, no están presentes más de dos casos de Y.
Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir. En ciertas realizaciones, Cy' está directamente unido a X. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo bicíclico o heteroaril sustituido o sin sustituir, preferentemente los dos tanto bíciclico como heteroarilo, tales como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas realizaciones, Cy' es un anillo arilo monocíclico o heteroarilo sustituido al menos con un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, es decir, formando un sistema biarilo. En ciertas realizaciones, Cy' incluye dos anillos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, el mismo o diferente, directamente conectado por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema anular biaril o bicíclico. En ciertas realizaciones, Cy' representa un benzo(b)tien-2-il sustituido o sin sustituir.
Cy representa un anillo aromático carbocíclico o heterocíclico sustituido o sin sustituir, es decir, incluyendo al menos un átomo sp^{3} hibridado, y preferiblemente una pluralidad de átomos sp^{3} hibridados. Cy es un anillo de seis miembros directamente unido a N y lleva un sustituyente amino en la cuarta posición del anillo relativa a N. Los sustituyentes N y amina podrían disponerse trans en el anillo.
En ciertas realizaciones, X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
En ciertas realizaciones, sustituyentes en Ar o Z, donde Z es un anillo arilo o heteroarilo, son seleccionados de los siguientes: halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}arilo, -(CH_{2})_{p}aralquilo,
-(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, -O(CH_{2})nR, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})n_{R}, y formas protegidas de las anteriores, donde n y p, individualmente para cada caso, representan números enteros del 0 al 10, preferiblemente del 0 al 5.
En ciertas realizaciones, Z está directamente unido a Ar, o unido a Ar a través de una cadena de uno o dos átomos. En ciertas realizaciones, Z-Y-M, juntos, está ausente.
En ciertas realizaciones, los agonistas en cuestión pueden ser elegidos en base a su selectividad por la vía hedgehog. Esta selectividad puede ser para la vía hedgehog versus otras vías, o por selectividad entre vías hedgehog particulares, por ejemplo, ptc-1, ptc-2, etc.
En ciertas realizaciones preferidas, los agonistas en estudio modulan la transducción por señal mediada ptc-smo con un ED_{50} de 1 mM o menor, más preferentemente de 1 \muM o menor, e incluso más preferiblemente de 1 nM o menos. Para los agonistas hedgehog-dependientes, los agonistas en cuestión aumentan la actividad de hedgehog 10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces.
En realizaciones particulares, la pequeña molécula se escoge para ser utilizada porque ésta es más selectiva para una isoforma patched sobre la siguiente, por ejemplo, 10 veces más, y más preferiblemente al menos 100 o incluso 1000 veces más selectiva para una ruta patched (ptc-1, ptc-2) sobre otra.
En ciertas realizaciones, un compuesto que es un agonista de la vía hedgehog es escogido selectivamente para agudizar la actividad hedgehog sobre protein kinasas con excepción de PKA, tales como PKC, por ejemplo, el compuesto modula la actividad de la vía PKA/hedgehog al menos un orden de magnitud más fuertemente que éste modula la actividad de otra protein quinasa, preferentemente al menos dos órdenes de magnitud más fuertemente, incluso más preferiblemente al menos tres órdenes de magnitud más fuertemente. Así, por ejemplo, un activador preferente de la vía hedgehog podría activar la actividad hedgehog con una k_{i} de al menos un orden de magnitud inferior que su k_{i} para la activación de PKC, preferiblemente al menos dos órdenes de magnitud menor, incluso más preferentemente al menos tres órdenes de magnitud menos. En ciertas realizaciones, la k_{i} para la activación PKA/hedgehog es menor de 10 nM, preferiblemente menor de 1 nM, incluso más preferentemente menor de 0,1 nM.
Síntesis de los compuestos de estudio
Los compuestos de la presente invención pueden ser fácilmente preparados por técnicas estándar de síntesis orgánica, por ejemplo, de acuerdo con los ejemplos mostrados en la Ejemplificación siguiente. Por ejemplo, un compuesto en cuestión puede ser preparado haciendo reaccionar un compuesto o un par de compuestos designados A con un compuesto o par de compuestos designados B y un compuesto designado C, como se muestra a continuación:
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Similarmente, un compuesto designado C anteriormente puede ser reaccionado con un compuesto o un par de compuestos designados D y un compuesto o par de compuestos designados E:
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Alternativamente, un compuesto o par de compuestos designados A anteriormente y un compuesto o par de compuestos designado E arriba pueden reaccionar con un compuesto designado F:
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Combinaciones de compuestos como los indicados anteriormente son preferiblemente hechos reaccionar unos con otros en series, por ejemplo, dos compuestos son reaccionados juntos, el producto se hace reaccionar con un tercer compuesto, etc., y los compuestos pueden generalmente unirse en series en cualquier orden, como bien entenderá un experto en la materia. En ciertas realizaciones, grupos funcionales de uno o más compuestos pueden requerir protección durante una o más reacciones, tal y como se entiende en la materia, y cualquier grupo protector apropiado puede emplearse para este propósito. Un experto en la materia puede seleccionar rápidamente grupos protectores apropiados para un grupo funcional particular y una reacción particular. Los pasos para la elaboración pueden llevarse a cabo a cualquier tiempo para modificar grupos funcionales o fragmentos en el producto de una reacción, por ejemplo, para convertir N(R)_{2} = NH_{2} en N(R)_{2} = NHR, por ejemplo, por sustitución nucleofílica, alquilación reductiva, o cualquier otro método apropiado.
En los compuestos designados A-F anteriormente, los elementos M, X, Y, Z, Cy, Cy', Ar, i, k, R, etc. son definidos como anteriormente (como será ampliado por la descripción de más adelante), y R' independientemente para cada caso representa H, un grupo protector, o un grupo reactivo lábil, tal como un grupo trialquilsililo (por ejemplo, trimetilsililo), y R'' independientemente para cada caso representa 1) un grupo saliente, tal como un halógeno (por ejemplo, F, CI, Br, o I), alquiltio, ciano, alcoxi, o cualquier otro grupo capaz de ser reemplazado por una amina nucleófila cuando está unido a X, 2) un grupo activable, como por ejemplo OH, que puede ser activado por una agente activante, tal como una carbodiimida (por ejemplo, diisopropilcarbodiimida, diciclohexilcarbodiimida, 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, etc.), reactivos de base fosfórica (como BOP-Cl, PyBROP, etc.), cloruro de oxalilo, fosgeno, trifosgeno, o cualquier reactivo similar, para resultas en un reactivo intermedio que tenga una susceptibilidad incrementada, relativa al compuesto donde R''=OH, para unirse con una amina, o 3) X y R'' juntos representan un grupo electrofílico capaz de reaccionar con una amina, tal como un isocianato, u otro fragmentos reactivo similar.
Las varias subunidades designadas A-F pueden ser combinadas utilizando cualquiera de una plétora de reacciones bien conocidas por los expertos en la materia, dependiendo de los fragmentos a ser unidos. Por ejemplo, una amina, tal como una de los grupos NH_{2} indicados en las subunidades A-F, puede unirse con un grupo alquilo por alquilación reductiva (por ejemplo, el caso terminal de que M sea un aldehído), por desplazamiento nucleofílico de un grupo saliente (tal como un halógeno, sulfonato, u otro sustituyente apropiado), por apertura nucleofílica de un epóxido, o por cualquier otra reacción adecuada conocida por los expertos en la materia. Similarmente, las aminas pueden ser unidas con derivados de ácidos carboxílicos activados o derivados de ácidos tiocarboxílicos, por ejemplo, preparados in situ a partir de un ácido carboxílico o un ácido tiocarboxílico y un agente activante o preparados como compuestos aislados tales como isocianatos, cloruros de ácido carboxílico, etc., para proporcionar amidas, ureas, tioureas, tioamidas, etc., con ésteres de cloroformato, cloruros de sulfonilo, u otros compuestos similares para proporcionar uretanos, sulfonamidas, etc., o con otros reactivos electrofílicos que forman enlaces covalentes con una amina.
Los anillos arilo y/o heteroarilo pueden ser fácilmente unidos directamente usando Stille, Suzuki, u otras reacciones relacionadas, tales como reacciones de acoplamiento mediadas por paladio. Los anillos arilo y/o heteroarilo pueden ser unidos fácilmente a través de un heteroátomo, por ejemplo, utilizando reacciones tales como la reacción Ullman, cualquiera de las diversas reacciones mediadas por paladio desarrolladas por S. Buchwald y otras, por sustitución aromática nucleofílica, u otras reacciones semejantes. Similarmente, aminas, alcoholes, tioles, y otros compuestos parecidos que contengan heteroátomos pueden ser unidos a anillos arilo y/o heteroarilo usando reacciones mediadas por paladio desarrolladas por S. Buchwald y otros, sustitución aromática nucleofílica, etc. Se pueden preparar anillos arilo y/o heteroarilo unidos por cadenas de hidrocarburos sustituidos o no sustituidos, mediante Stille, Suzuki, Heck, Friedel-Crafts, y otras reacciones como ya sabrán los expertos en la materia.
Un listado de un número de reacciones sintéticas comunes potencialmente útiles para preparar compuestos de la presente invención están descritos con gran detalle más adelante y en las Figuras 1-31. Los grupos variables incluidos en las subunidades designadas A-F anteriormente pueden variarse para corresponderse con cualquiera de las Fórmulas II, VIII-XI sin apartarse de las aproximaciones de síntesis general explicadas con anterioridad.
Similarmente, compuestos de la presente invención pueden ser preparados uniendo un fragmento apropiado a una estructura parcialmente montada. Por ejemplo, un compuesto de Fórmula XI puede prepararse por cualquiera de los pasos I-VI que se muestran en el esquema siguiente.
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Similarmente, un compuesto de Fórmula X podría prepararse por cualquiera de los pasos del esquema siguiente.
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En los esquemas anteriores, M, Cy, Ar, X,.Cy', Y, Z, R, i, k, R', y R'' corresponden a su uso anterior y pueden definirse más estrictamente tal y como se muestra en la descripción de la Fórmula X o XI o corresponden a elementos de Fórmula II o VIII, opcionalmente cuando es modificado por la descripción que acompaña la Fórmula II o VIII.
Las reacciones apropiadas para llevar a cabo el paso I incluyen las reacciones mediadas por paladio desarrolladas por S. Buchwald y otros, sustitución aromática nucelofílica, unión oxidativa, etc.
Las reacciones adecuadas para llevar a cabo el paso II incluyen desplazamientos nucleofílicos de un grupo saliente en M, alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado electrofílico del ácido carboxílico/tiocarboxílico (ácido cloroso, isocianato, isotiocianato, o un ácido carboxílico activado por BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida, u otro reactivo activador (tales como los que son comúnmente utilizados en la materia de las asociaciones peptídicas), u otras reacciones similares, incluyendo aquellas mostradas en detalle en ciertas de las Figuras 1-31 y la descripción acompañante de debajo, o, donde M y Y están ausentes, una asociación mediada por paladio como la desarrollada por Buchwald y otros.
Las reacciones adecuadas para llevar a cabo los pasos III o IV incluyen la reacción de Y-R' con un derivado electrofílico de carbonilo o sulfonilo (X-R'' = ácido cloroso, isocianato, isotiocianato, cloroformato, sulfonilo cloroso, o un ácido activado por BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida, u otro reactivo activador (tales como los que se usan comúnmente en el arte de la asociación de péptidos), u otras reacciones similares, tales como las mostradas en detalle en ciertas de las Figuras 1-31 y la descripción acompañante de debajo.
Las reacciones adecuadas para llevar a cabo el paso V incluyen desplazamiento nucleofílico de un grupo saliente, alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado electrofílico del ácido carboxílico/tiocarboxílico (ácido cloroso, isocianato, isotiocianato, o un ácido carboxílico activado con BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida, u otro reactivo activador (tales como los que se utilizan comúnmente en la materia de la asociación de péptidos)), u otras reacciones similares, incluyendo aquellas mostradas en detalle en ciertas de las Figuras 1-31 y en la descripción acompañante de debajo.
Las reacciones adecuadas para llevar a cabo el paso VI incluyen desplazamiento nucleofílico de un grupo saliente, alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado electrofílico del ácido carboxílico/tiocarboxílico (ácido cloroso, isocianato, isotiocianato, o un ácido carboxílico activado con BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida, u otro reactivo activador (tales como los que se utilizan comúnmente en la materia de la asociación de péptidos)), u otras reacciones similares, incluyendo aquellas mostradas en detalle en ciertas de las Figuras 1-31 y en la descripción acompañante de debajo.
Las reacciones adecuadas para llevar a cabo el paso VII donde Y se une con un caso presente de M incluyen desplazamiento nucleofílico de un grupo saliente, alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado electrofílico del ácido carboxílico/tiocarboxílico (ácido cloroso, isocianato, isotiocianato, o un ácido carboxílico activado con BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida, u otro reactivo activador (tales como los que se utilizan comúnmente en la materia de la asociación de péptidos)), u otras reacciones similares, incluyendo aquellas mostradas en detalle en ciertas de las Figuras 1-31 y en la descripción acompañante de debajo. En materializaciones donde casos de M están ausentes, las reacciones de asociación apropiadas incluyen reacciones mediadas por paladio desarrolladas por S. Buchwald y otros, sustitución aromática nucleofílica, asociación oxidativa, etc. En materializaciones donde M e Y están ausentes y Z representa un anillo arilo o heteroarilo, las reacciones apropiadas incluyen Stille, Suzuki, y otras reacciones adecuadas para formar sistemas biarilo.
También están descritos métodos que además incluyen reaccionando un compuesto de Fórmula II donde al menos una R de NR_{2} representa H bajo condiciones que conviertan este compuesto en un compuesto de la misma fórmula donde el caso correspondiente de R representa un grupo alquilo inferior. Por ejemplo, alquilaciones reductivas con un aldehído y un reactivo reductor, alquilaciones nucleofílicas con un haluro de alquilo tal como MeI, u otras reacciones similares se pueden emplear. En ciertas realizaciones, tales reacciones pueden llevarse a cabo a través de un intermediario sililado (por ejemplo, R=SiMe_{3}).
Un experto en la materia apreciará fácilmente que los compuestos de la presente invención susceptibles de sintetizarse de acuerdo con un amplio conjunto de protocolos bien conocidos en la materia además de los descritos aquí, todos los cuáles han sido pensados para entrar dentro ámbito de la presente invención.
IV. Aplicaciones a modo de ejemplo de métodos y composiciones
Otro aspecto de la presente invención está relacionado con un método de modulación de un estado diferenciado, supervivencia y/o proliferación de una célula, al poner en contacto la célula con un agonista hedgehog de acuerdo con el método presente y según garanticen las circunstancias.
Por ejemplo, la invención contempla que, a la luz de los descubrimientos en la aparentemente amplia participación del hedgehog, ptc y smoothened en la formación de configuraciones de diferentes tejidos en vertebrados ordenadas en el espacio, el presente método podría usarse como parte de un proceso de generación y/o mantenimiento de un conjunto de tejidos de vertebrados diferentes tanto in vitro como in vivo. El agonista de hedgehog, ya sea inductivo o anti-inductivo respecto a la proliferación o diferenciación de un tejido concreto, puede ser cualquiera de las preparaciones antes descritas, siendo así adecuado.
Por ejemplo, el presente método es aplicable a técnicas de cultivo celular. Los sistemas de cultivo neuronal in vitro se han mostrado como herramientas indispensables y fundamentales para el estudio del desarrollo, así como la identificación de factores neurotróficos como el factor de crecimiento nervioso (NGF, del inglés Nerve Growth Factor), los factores neurotróficos ciliares (CNTF, del inglés Ciliary NeuroTrophic Factor), y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, del inglés Brain Derived Neurotrophic Factor). Un uso del presente método puede estar en los cultivos de células madre neuronales, como en el uso de dichos cultivos para la generación de nuevas neuronas y glía. En tales realizaciones del presente método, las células cultivadas pueden ponerse en contacto con un agonista de hedgehog de la presente invención para alterar la proporción de proliferación de las células madre neuronales en el cultivo y/o alterar la tasa de diferenciación, o para mantener la integridad de un cultivo de ciertas células neuronales diferenciadas terminalmente. En una realización de ejemplo, el presente método puede usarse para cultivar, por ejemplo, neuronas sensoras o, de forma alternativa, neuronas motoras. Tales cultivos neuronales pueden usarse como sistemas de ensayo convenientes, así como fuentes de células implantables para tratamientos terapéuticos.
De acuerdo con la presente invención, grandes cantidades de células progenitoras neurales no tumorigénicas pueden perpetuarse in vitro y su tasa de proliferación y/o diferenciación puede verse afectada por el contacto con los agonistas de hedgehog de la presente invención. En general, se proporciona un método que comprende los pasos de aislamiento de células progenitoras neurales de un animal, perpetuando estas células in vitro o in vivo, preferentemente en presencia de factores de crecimiento, y regulando la diferenciación de estas células en fenotipos neurales concretos, p.ej. neuronas y glía, por contacto de las células con un agonista de hedgehog.
Se cree que las células progenitoras están bajo influencia inhibitoria tónica que mantiene los progenitores en un estado contenido hasta que se requiere su diferenciación. Sin embargo, recientemente se ha descubierto técnicas nuevas que permiten que estas células proliferen, y al contrario que las neuronas que están diferenciadas de forma terminal y por lo tanto no-divisibles, pueden producirse en un número ilimitado y son altamente adecuadas para trasplantes en huéspedes heterólogos y autólogos con enfermedades neurodegenerativas.
Por "progenitor" se entiende una célula madre oligopotente o multipotente que es capaz de dividirse sin límite y, bajo unas condiciones concretas, puede producircélulas hija que diferencian de forma terminal en por ejemplo neuronas y glía. Estas células pueden usarse para trasplantarse en huéspedes heterólogos o autólogos. Por heterólogo se entiende un huésped que no sea el animal del que se han derivado originariamente las células progenitoras. Por autólogo se entiende el mismo huésped del que se han derivado originariamente las células.
Se puede obtener las células a partir de tejido neural embrionario, post-natal, juvenil o adulto de cualquier animal. Por cualquier animal se entiende cualquier animal multicelular que contenga tejido nervioso. Más concretamente, se entiende un pez, un reptil, un ave, un anfibio o un mamífero y similares. Los donantes preferidos son mamíferos, especialmente ratones y humanos.
En el caso de un donador animal heterólogo, puede aplicarse la eutanasia al animal y extraerse las áreas del cerebro y de interés específico utilizando procedimientos estériles. Las áreas del cerebro de interés particular incluyen cualquier área de la que se pueda obtener células progenitoras que sirva para restaurar la función a un área degenerada del cerebro del huésped. Estas regiones incluyen áreas del sistema nervioso central (SNC), incluyendo la corteza cerebral, el cerebelo, el mesencéfalo, el tronco cerebral, la médula espinal y el tejido ventricular, y las áreas del sistema nervioso periférico (SNP), incluyendo el cuerpo carótido y la médula adrenal. Más concretamente, estas áreas incluyen las regiones en los ganglios basales, preferiblemente el cuerpo estriado, que consiste en el caudado y el putamen, o varios grupos celulares como el globos pallidus, el núcleo subtalámico, el núcleo basal que se encuentra degenerado en los pacientes de la enfermedad de Alzheimer, o la parte compacta de la sustancia negra que se encuentra degenerada en los pacientes de la enfermedad de Parkinson.
Las células progenitoras neurales heterólogas humanas pueden derivar de tejido fetal obtenido de un aborto electivo, o de un donante de órganos post-natal, juvenil o adulto. El tejido neural autólogo puede obtenerse por biopsia, o a partir de pacientes a los que se les aplica neurocirugía en la que se elimina tejido neural, en concreto durante la cirugía por epilepsia, y más concretamente durante lobectomías temporales e hipocampalectomías.
Se puede obtener células de tejidos donantes por disociación de células individuales a partir de la matriz extracelular del tejido en contacto. La disociación puede obtenerse usando cualquier procedimiento conocido, incluyendo el tratamiento con enzimas, como la tripsina, la colagenasa y los similares, o usando métodos físicos de disociación como un instrumento romo o picando con un escalpelo para permitir la obtención de tipos celulares específicos a partir de un tejido. La disociación de células fetales puede realizarse en un medio de cultivo tisular, mientras que el medio preferido para la disociación de células juveniles y adultas es el fluido espinal cerebral artificial (aCSF). El aCSF común contiene NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2} 1,3 mM, CaCl_{2} 2 mM, NaHCO_{3} 6 mM y D-glucosa 10 mM. El aCSF bajo en Ca^{2+} contiene los mismos ingredientes excepto por el MgCl_{2} a concentración de 3,2 mM y el CaCl_{2} a una concentración de 0,1 mM.
Las células disociadas pueden colocarse en un medio de cultivo conocido capaz de permitir el crecimiento celular, incluyendo MEM, DMEM, RPMI, F-12 y similares. Estos medios contienen suplementos necesarios para el metabolismo celular, como la glutamina y otros aminoácidos, vitaminas, minerales y proteínas útiles, como la transferrina y las similares. Los medios también contienen antibióticos para evitar la contaminación con levaduras, bacterias y hongos como la penicilina, la estreptomicina, la gentamicina y similares. En algunos casos, el medio puede contener suero derivado de bovino, equino, pollo y similares. Un medio particularmente preferido para las células es una mezcla de DMEM y F-12.
Las condiciones para el cultivo deberían ser cercanas a las condiciones fisiológicas. El pH del medio de cultivo debería ser cercano al pH fisiológico, preferiblemente entre pH 6-8, más preferiblemente cercano a pH 7, más concretamente alrededor de pH 7,4. Las células deberían cultivarse a una temperatura cercana a la temperatura fisiológica, preferiblemente entre 30ºC-40ºC, más preferiblemente entre 32ºC-38ºC, y preferentemente entre 35ºC-37ºC.
Las células pueden crecer en suspensión o en un sustrato fijo, pero la proliferación de progenitores se realiza preferiblemente en suspensión para generar grandes cantidades de células por formación de "neurosferas" (ver, por ejemplo, Reynolds et al. (1992) Science 255:1070-1709; y las publicaciones PCT WO93/01275, WO94/09119, WO94/10292, y WO94/16718). En el caso de propagar (o separar) células en suspensión, se agita bien los frascos y se deja que las neurosferas se asienten en la esquina del fondo del frasco. Las esferas se transfieren luego a un tubo de centrifugación de 50ml y se centrifugan a baja velocidad. El medio se aspira, se resuspenden las células en una pequeña cantidad de medio con factor de crecimiento, y las células se disocian mecánicamente y e resuspenden en alícuotas separadas de medio.
Las suspensiones celulares en medio de cultivo se complementan con cualquier factor de crecimiento que permita la proliferación de células progenitoras y el sembrado en cualquier receptáculo capaz de contener células, aunque tal como se ha especificado anteriormente, es preferible en frascos de cultivo o frascos rotativos. Las células típicamente proliferan en 3-4 días en una incubadora a 37ºC y la proliferación puede reiniciarse en cualquier momento después por disociación de las células y resuspensión en medio fresco que contenga factores de crecimiento.
En ausencia de sustrato, las células se despegan del fondo del frasco y continúan proliferando en suspensión formando una esfera hueca de células no diferenciadas. Después de aproximadamente 3-10 días in vitro, se alimenta cada 2-7 días a los grupos proliferativos (neurosferas), y más concretamente cada 2-4 días por centrifugación suave y resuspensión en un medio que contenga factor de crecimiento.
Tras 6-7 días in vitro, las células individuales en las neurosferas pueden separarse por disociación física de las neurosferas con un instrumento romo, más concretamente por titulación de las neurosferas con una pipeta. Las células individuales a partir de las neurosferas disociadas son suspendidas en medio de cultivo que contenga factores de crecimiento, y la diferenciación de las células puede ser controlada por preparación de cultivos en placas (o resuspensión) de las células en presencia de un agonista hedgehog.
Para ilustrar mejor otros usos de los presentes agonistas de hedgehog, se indica que el injerto intracerebral surge como un enfoque adicional para terapias del sistema nervioso central. Por ejemplo, un enfoque para la reparación de tejidos cerebrales dañados incluye el trasplante de células a partir de animales fetales o neonatos en cerebro adulto (Dunnett et al. (1987) J Exp Biol 123:265-289; y Freund et al. (1985) J neurosci 5:603-616). Las neuronas fetales de varias regiones cerebrales pueden incorporarse con éxito en el cerebro adulto, y tales injertos pueden aliviar los defectos de conducta. Por ejemplo, el trastorno de movimiento inducido por lesiones de las proyecciones dopaminérgicas en los ganglios basales pueden evitarse por injertos de neuronas dopaminérgicas embrionarias. Las funciones cognitivas complejas que se ven alteradas tras lesiones del neocórtex pueden también recuperarse parcialmente por injertos de células corticales embrionarias. EL presente método puede usarse para regular el estado de crecimiento en el cultivo, o donde se usa el tejido fetal, especialmente las células madre neuronales, puede usase para regular la tasa de diferenciación de las células madre.
Las células madre útiles en la presente invención son generalmente conocidas. Por ejemplo, varias células de la cresta neural han sido identificadas, algunas de las cuales son multipotentes y es posible que representen células de la cresta neural no asignadas, y otras de las cuales pueden generar un sólo tipo de célula, como las neuronas sensoras, y es posible que representen células progenitoras no programadas. El papel de los agonistas de hedgehog utilizados en el presente método para cultivar células madre puede ser el de regular la diferenciación del progenitor no programado o el de regular las restricciones posteriores del destino de desarrollo de una célula progenitora programada para convertirse en una célula neuronal diferenciada de forma terminal. Por ejemplo, el presente método puede usarse in vitro para regular la diferenciación de las células de la cresta neural en células gliales, células de schwann, células cromafin, neuronas parasimpáticos o simpáticas colinérgicas, así como neuronas serotonérgicas y peptidérgicas. Los agonistas hedgehog pueden usarse solos, o pueden usarse en combinación con otros factores neurotróficos que actúan para potenciar más concretamente un destino de diferenciación en particular de la célula progenitora neuronal.
Además de la implantación de células cultivadas en presencia de los presentes agonistas de hedgehog, aún otro aspecto de la presente invención concierne a la aplicación terapéutica de un agonista de hedgehog para regular el estado de crecimiento de neuronas y otras células neuronales tanto en el sistema nervioso central como en el sistema nervioso periférico. La capacidad de ptc, hedgehog, y smoothened para regular la diferenciación neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso y también presumiblemente en el estado adulto indica que, en ciertos casos, se espera que los presentes agonistas hedgehog faciliten control de las neuronas adultas respecto al mantenimiento, a la actuación funcional y al envejecimiento de las células normales; procesos de reparación y regeneración en células lesionadas química o mecánicamente; y el tratamiento de degeneración en ciertas condiciones patológicas. A la luz de esto, la presente invención contempla específicamente las aplicaciones del método presente al protocolo de tratamiento de (prevención y/o reducción de la gravedad de) condiciones neurológicas que derivan de: (i daño agudo, subagudo o crónico del sistema nervioso, incluyendo daños traumáticos, químicos, vasculares y déficits (como la isquemia provocada por un derrame cerebral), junto con los daños infecciosos/inflamatorios y inducidos por tumores; (ii) envejecimiento del sistema nervioso incluyendo la enfermedad de Alzheimer; (iii) enfermedades neurodegenerativas crónicas del sistema nervioso, incluyendo la enfermedad de Parkinson, la corea de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y similares, así como las degeneraciones espinocerebelares; y (iv) enfermedades inmunológicas crónicas del sistema nervioso o que afecten al sistema nervioso, incluyendo la esclerosis múltiple. Por ejemplo, en el caso específico de la enfermedad de Parkinson, la intervención por aumento de la actividad de hedgehog por un agonista puede mejorar la supervivencia in vivo de neuronas dopaminérgicas fetales o adultas, y así puede proporcionar un tratamiento más efectivo para esta enfermedad. De esta manera, en una realización, el presente método comprende la administración de un animal que padece la enfermedad de Parkinson, o con riesgo de padecerla, una cantidad de agonista de hedgehog efectiva para aumentar la tasa de supervivencia de neuronas dopaminérgicas en el animal.
El presente método es aplicable a técnicas de cultivo celular. Los sistemas de cultivo neuronal in vitro se han mostrado como herramientas indispensables y fundamentales para el estudio de desarrollo neural, así como la identificación de factores neurotróficos como el factor de crecimiento nervioso (NGF), los factores neurotróficos ciliares (CNTF), y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Una vez que una célula neuronal se ha diferenciado de forma terminal, ya no cambiará a otro tipo celular diferenciado de forma terminal. Sin embargo, las células neuronales pueden perder su estado diferenciado. Eso se observa comúnmente cuando crecen en un cultivo a partir de tejido adulto, y cuando forman un blastema durante la regeneración. El presente método proporciona un método para asegurar un entorno restrictivo adecuado para mantener las células dopaminérgicas y GABAérgicas en estados diferenciados, y puede usarse, por ejemplo, en cultivos celulares designados para evaluar las actividades específicas de otros factores tróficos.
En tales realizaciones del método presente, se puede poner en contacto un cultivo de células diferenciadas, incluyendo células dopaminérgicas y/o GABAérgicas con un agonista de hedgehog para mantener la integridad de un cultivo de células neuronales diferenciadas de forma terminal al evitar la pérdida de diferenciación. El método presente puede usarse en conjunción con agentes que inducen a la diferenciación de precursores neuronales, p.ej., células madre o progenitoras, en neuronas GABAérgicas o dopaminérgicas.
Muchos trastornos neuronales están asociados con la degeneración de poblaciones discretas de elementos neuronales y pueden tratarse con regímenes terapéuticos que incluyen un agonista de hedgehog. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer está asociada con déficits en varios sistemas neurotransmisores, tanto los que proyectan sobre el neocórtex y los que residen con el córtex. Por ejemplo, se ha observado que el núcleo basal en pacientes con enfermedad de Alzheimer tiene una profunda (75%) pérdida de neuronas en comparación con controles de la misma edad. Aunque la enfermedad de Alzheimer es claramente la forma de demencia más común, muchos otros trastornos pueden producir demencia. Varias de estas enfermedades degenerativas caracterizadas por la muerte de las neuronas en varias partes del sistema nervioso central, especialmente la corteza cerebral. Sin embargo, algunas formas de demencia están asociadas a la degeneración del tálamo de la materia blanca que subyace a la corteza cerebral. Aquí, la disfunción cognitiva resulta del aislamiento de las áreas corticales por la degeneración de eferentes y aferentes. La enfermedad de Huntington implica la degeneración de neuronas colinérgicas corticales y intraestriatales y neuronas GABAérgicas. La enfermedad de Pick es una degeneración neuronal grave en el neocórtex de los lóbulos temporal anterior y frontal, a veces acompañada por la muerte de neuronas en el cuerpo estriado. El tratamiento de pacientes que padecen tales condiciones degenerativas puede incluir la aplicación de agonistas de hedgehog para controlar, por ejemplo, los eventos de apoptosis y la diferenciación que producen la pérdida de neuronas (p.ej. para mejorar la supervivencia de las neuronas existentes), así como para promover la diferenciación y repoblación por las células progenitoras en el área afectada.
Además de las demencias degenerativas inducidas, se puede aplicar una preparación farmacéutica de uno o más de los presentes agonistas de hedgehog oportunamente en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos que tienen manifestaciones de temblores y movimientos involuntarios. La enfermedad de Parkinson, por ejemplo, afecta primariamente las estructuras sobcorticales y se caracteriza por la degeneración del camino nigrostraiatal, el núcleo del rafe, locus cereleus y el núcleo motor del vago. El balismo está típicamente asociado con daños en el núcleo subtalámico, a menudo debidos a accidentes vasculares agudos. También se incluye enfermedades neurogénicas y miopáticas que afectan de forma última a la división somática del sistema nervioso periférico y se manifiestan como trastornos neuromusculares. Entre los ejemplos se incluye las atrofias crónicas como la esclerosis lateral amiotrófica, el síndrome de Guillain-Barre y la neuropatía periférica crónica, así como otras enfermedades que pueden hacerse manifiestas por parálisis bulbares progresivas o atrofias musculares espinales. El presente método es útil para el tratamiento de trastornos del cerebelo que tienen como resultado ataxia o hipotonía, como todas aquellas lesiones en el cerebelo que producen trastornos en las extremidades ipsilaterales a la lesión. Por ejemplo, una preparación de agonista de hedgehog puede usarse para tratar una forma restringida de degeneración cortical cerebelar que implique los lóbulos anteriores (área de las piernas y vermis) como en los pacientes alcohólicos comunes.
En una realización ilustrativa, el presente método se usa para tratar esclerosis lateral amiotrófica. ALS es el nombre que se le da al complejo de trastornos que implican neuronas motoras inferiores y superiores. Los pacientes pueden presentar atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, o una combinación de estas condiciones. La mayor anormalidad patológica se caracteriza por una degeneración selectiva y progresiva de las neuronas motoras inferiores en la médula espinal y en las neuronas motoras superiores en el córtex cerebral. La aplicación terapéutica de un agonista de hedgehog puede usarse sola, o en conjunción con otros factores neurotróficos como CNTF, BDNF o NGT para evitar y/o invertir la degeneración de neuronas motoras en pacientes de ALS.
Los agonistas de Hedgehog de la presente invención pueden usarse también en el tratamiento de trastornos autonómicos del sistema nervioso periférico, que incluyen los trastornos que afectan la inervación del músculo liso y del tejido endocrino (como el tejido glandular). Por ejemplo, el método presente puede usarse para tratar taquicardia o arritmias cardíacas atriales que pueden surgir a partir de condiciones degenerativas de los nervios que inervan el músculo estriado del corazón.
Además, un papel potencial de algunos de los agonistas hedgehog deriva del papel de las proteínas de hedgehog en el desarrollo y mantenimiento de los procesos dendríticos de las neuronas axonales. Los papeles potenciales de los agonistas de hedgehog incluyen consecuentemente guías para las proyecciones axonales y la capacidad para impulsar la diferenciación o mantenimiento de las células inervadoras a sus procesos axonales. De acuerdo con esto, las composiciones que incluyen agonistas de hedgehog pueden usarse para apoyar la supervivencia y reproyección de varios tipos de neuronas simpáticas gangliónicas y neuronas sensoras así como neuronas motoras. Concretamente, tales composiciones terapéuticas pueden ser útiles en tratamientos diseñados para rescatar, por ejemplo, varias neuronas de una muerte inducida por una lesión así como guiar la reproyección de estas neuronas tras tal daño. Estas enfermedades incluyen, pero no de forma limitada, infarto con trauma del SNC, infección (como una infección viral con varicella-zoster), enfermedad metabólica, deficiencia nutricional, agentes tóxicos (como el tratamiento con cisplatina).
El presente método también puede usarse para la generación de prótesis nerviosas para reparar daños nerviosos centrales y periféricos. Concretamente, donde hay un axón aplastado o gravemente dañado está intubado por el uso de un dispositivo de prótesis, los agonistas de hedgehog pueden añadirse al dispositivo prostético para regular la tasa de crecimiento y regeneración de los procesos dendríticos. Los canales de guía nerviosa de ejemplo se describen en las patentes estadounidenses 5.092.871 y 4.955.892.
En otra realización, el presente método puede usarse en el tratamiento de transformaciones neoplásticas o hiperplásticas como puede ocurrir en el sistema nervioso central. Por ejemplo, los agonistas hedgehog pueden ser usados para hacer que las células transformadas e vuelvan post-mitóticas o apoptóticas. El presente método puede, por lo tanto, usarse como parte de un tratamiento para, p.ej. gliomas malignos, meningiomas, meduloblastomas, tumores neuroectodérmicos y ependiomomas.
El presente método tiene una amplia aplicación para el tratamiento o la profilaxis de trastornos que afectan a la regulación de nervios periféricos, incluyendo neuronas ganglionares periféricas, simpáticas, neuronas sensoras, y neuronas motoras. En general, el método puede caracterizarse por incluir un paso de administración a un animal de una cantidad de agonista de hedgehog efectiva para alterar el estado de proliferación y/o diferenciación de las células nerviosas periféricas tratadas. Tales composiciones terapéuticas pueden ser útiles en tratamientos diseñados para rescatar, por ejemplo, ganglios retinales, nervios del oído interno y acústicos, y neuronas motoras, de muerte inducida por lesión, así como para guiar la reproyección de estas neuronas tras un daño tal. Estas enfermedades y condiciones incluyen, pero sin limitación, el trauma químico o mecánico, la infección (como la infección vírica con varicella-zoster), enfermedades metabólicas como la diabetes, la deficiencia nutricional y los agentes tóxicos (como el tratamiento de cisplatina). Los objetivos del tratamiento en cada caso pueden ser: (1) eliminar la causa de la enfermedad y (2) rebajar los síntomas.
La neuropatía periférica es una condición que implica un daño en el final de los nervios en las manos y los pies. La neuropatía periférica generalmente se refiere a un trastorno que afecta a los nervios periféricos, normalmente manifestada como una combinación de disfunciones motoras, sensoras, sensorimotoras o neurales autonómicas. La gran variedad de morfologías que muestran las neuropatías periféricas pueden atribuirse cada una de forma única a una variedad igualmente amplia de causas. Por ejemplo, las neuropatías periféricas pueden adquirirse genéticamente, pueden ser el resultado de una enfermedad sistémica, o pueden estar inducidas por un agente tóxico. Algunos agentes tóxicos que causan neurotoxicidades son fármacos terapéuticos, agentes antineoplásticos, contaminantes en la comida o medicinas, y contaminantes ambientales e industriales.
Concretamente, entre los agentes quimioterapéuticos que se sabe que causan neuropatías sensoriales y/o motoras se incluye la vincristina, un fármaco antineoplásico utilizado para tratar sarcomas y malignidades hematológicas. La neurotoxicidad está relacionada con la dosis, y se muestra como una neuropatía periférica y una motilidad intestinal reducida, especialmente en los músculos distales de las manos y pies, hipotensión postural y atonía de la bufeta urinaria. Se ha documentado problemas similares con taxol y cisplatina (Mollman, J.E., 1990, New Eng Tour MEd. 322:126-127), aunque la neurotoxicidad derivada de la cisplatina puede ser aliviada con factor de crecimiento nervioso (NGF) (Apfel, S.C. et al., 1992, Annals of NEurology 31:76-80). Aunque la neurotoxicidad es a veces reversible tras la eliminación del agente neurotóxico, la recuperación puede ser un proceso muy lento (Legha, S., 1986, Medical Toxicology 1:421-427; Olesen et al., 1991, Drug Safety 6:302-314).
Existen varias neuropatías periféricas hereditarias, como por ejemplo: enfermedad de Refsum, abetalipoproteinemia, enfermedad de Tangier, enfermedad de Krabbe, leucodistrofía metacromática, enfermedad de Fabry, síndrome de Dejerine-Sottas, y otros. De todas las neuropatías hereditarias, la más común es claramente la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.
La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) (también conocida como atrofia muscular peroneal , o neuropatía sensorial motora hereditaria (HMSN, del inglés hereditary motor sensory neuropathy)) es el trastorno neurológico hereditario más común. Se caracteriza por debilidad y atrofia, inicialmente de los músculos peroneales, debido a la desmielización segmental de los nervios periféricos y asociada a la degeneración de axones y células corneales. La herencia dominante autonómica es usual, y los trastornos degenerativos asociados del SNC, como la ataxia de Friedreich, son también comunes.
Por un lado, el método de la presente invención puede usarse en el tratamiento y mantenimiento de neuropatías hereditarias. Este grupo de neuropatías se sabe que cada vez es más reconocido debido a los dramáticos avances hechos en genética molecular. Los síntomas de las diferentes neuropatías hereditarias pueden variar ampliamente. Un común denominador es normalmente el pronto inicio de entumecimiento leve y hormigueo en los pies que progresan lentamente hasta incluir las piernas y las manos y luego el resto de las extremidades superiores. La mayoría de neuropatías hereditarias tienen un componente motor que consiste en debilidad distal en las extremidades inferiores y superiores. La mayoría de pacientes con neuropatías hereditarias tienen arco alto en los pies o deformidades óseas. Los síntomas son progresivos muy lentamente y la mayoría de los pacientes andan todavía durante dos décadas después del inicio de sus síntomas.
El diagnóstico de una neuropatía hereditaria es normalmente sugerido por el temprano inicio de los síntomas neuropáticos, especialmente cuando también está presente un historial familiar positivo. Antes de los recientes avances genéticos, el diagnóstico se apoyaba en los descubrimientos típicos de una ralentización marcada de los estudios de conducción nerviosa en electromiografía y una biopsia nerviosa. Lo que se descubría típicamente en una biopsia nerviosa es por ejemplo la presencia de los llamados "bulbos de cebolla", lo que indica una recurrente desmielización y una remielización de las fibras nerviosas. Con los últimos avances genéticos puede diagnosticarse dos grandes neuropatías hereditarias conocidas como la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y la neuropatía hereditaria con responsabilidad en las parálisis de presión con un simple análisis de sangre que identifica las diferentes mutaciones responsables de estas dos entidades.
Las neuropatías hereditarias están causadas por anormalidades genéticas que se transmiten de generación en generación. Para muchas de estas, los defectos genéticos se conocen, y existen pruebas para el diagnostico y la orientación prenatal.
Como se ha indicado anteriormente, el presente método puede usarse como parte de un régimen terapéutico en el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie Tooth (CMT). Este es un término general que se da a las neuropatías sensorimotoras hereditarias. La CMT de tipo 1 (CMT 1) está asociada a la desmielización o a la rotura de las capas de mielina. Se ha identificado varias anormalidades diferentes. La CMT de tipo 1A está normalmente causada por la duplicación de un gen que codifica para la proteína de mielina llamada PMP-22, y la CMT de tipo 1B está causada por una mutación en la proteína de mielina llamada la glucoproteína Po. La CMTX es una neuropatía sensorimotora hereditaria que afecta sobre todo a hombres. Está causada por la mutación en un gen que codifica para una proteína llamada Conexina 32 en el cromosoma X.
En otra realización, el presente método puede usarse en el tratamiento de neuropatías amiloidóticas familiares y otras neuropatías hereditarias relacionadas. La neuropatía amiloidótica se presenta normalmente con dolor, pérdida sensorial y disfunción autonómica. Está causada por una mutación en una proteína llamada Transtiretina, y tiene como resultado la deposición de la proteína como amiloide en los nervios periféricos.
El presente método puede utilizarse en el tratamiento de Porfirio hereditaria, que puede tener componentes de neuropatía periférica. Aún otra neuropatía hereditaria para la que los métodos presentes pueden utilizarse en su tratamiento es la neuropatía sensorial hereditaria de tipo II (HSN II). Los métodos y composiciones de la presente invención pueden también usarse en el tratamiento mantenimiento de neuropatías adquiridas.
Por ejemplo, los agonistas de hedgehog pueden usarse para evitar neuropatías diabéticas. La diabetes es la causa más conocida comúnmente de neuropatía. Produce síntomas en aproximadamente un 10% de la gente con diabetes. En la mayoría de casos, la neuropatía es predominantemente sensorial, con dolor y pérdida sensorial en las manos y pies. Pero algunos diabéticos tienen mononeuritis o mononeuritis multiplex, que causa debilidad en uno o más nervios, o amiyotropía o plexopatía lumbosacral, que causa debilidad en las piernas.
Este método puede también usarse para el tratamiento de neuropatías inmunomediadas. La función principal del sistema inmunitario es la de proteger el cuerpo contra organismos infecciosos que entran desde el exterior. En algunos casos, sin embargo, el sistema inmunitario se vuelve contra el cuerpo y causa enfermedades autoinmunes. El sistema inmunitario consta de varios tipos de células linfocíticas sanguíneas, incluyendo los linfocitos T, que también regulan la respuesta inmunitaria; y los linfocitos B o las células plasmáticas, que segregan proteínas especializadas llamadas "anticuerpos". A veces, por razones desconocidas, el sistema inmunitario ataca por error ciertas partes del cuerpo como los nenes periféricos. Esto es, una neuropatía periférica "autoinmune". Existen varios tipos diferentes, en función de la parte del nervio periférico que es atacado el tipo de la reacción inmunitaria. A continuación se encuentran breves descripciones de las neuropatías que están mediadas por el sistema inmunitario.
Por ejemplo, un agonista de hedgehog puede usarse para tratar el síndrome de Guillain-Barre (GBS), una neuropatía aguda que comienza repentinamente o rápidamente. El síndrome de Guillain-Barre puede progresar hasta la parálisis y el fallo respiratorio en días o semanas tras el inicio. La neuropatía está causada por la destrucción por parte del sistema inmunitario de las capas de mielina de los nervios sensoriales y motores. A menudo está precedida por una infección, vacunación o trauma, y se cree que es lo que dispara la reacción autoinmune. La enfermedad es auto-limitante, con recuperación espontánea en seis a ocho semanas. Pero la recuperación es a menudo incompleta.
Otras neuropatías que empiezan de forma aguda, y que pueden tratarse con el método de la presente invención, incluyen la neuropatía motora aguda, la neuropatía sensorial aguda, y la neuropatía autonómica aguda, en las que hay un ataque inmune contra los nervios motores, sensoriales o autonómicos, respectivamente. El síndrome de Miller-Fisher es otra variante en la que hay una parálisis de mirada ocular, descoordinación y una forma de andar tambaleante.
Aún otra neuropatía adquirida que puede ser tratada con el presente método es la polineuropatía desmilinizante inflamatoria crónica (CIDP, del inglés Chrnic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy). Se cree que la CIDP es una forma crónica y más indolente del síndrome de Guillain-Barre. LA enfermedad progresa o bien con ataques repetidos, llamados relapsos o en forma de pasos o constante. Como en la GBS, parece haber una destrucción de las capas de mielina por los anticuerpos y linfocitos T. Pero como no existe una prueba específica para CIP, el diagnóstico se basa en las características clínicas y de laboratorio.
Las polineuropatías crónicas con anticuerpos en los nervios periféricos son todavía neuropatías periféricas para las que los presentes métodos pueden usarse para tratarlas o evitarlas. En algunos tipos de neuropatías crónicas, los anticuerpos para componentes específicos de nervios han sido identificados. Entre ellos se incluye la neuropatía desmielinizante asociada a anticuerpos para la glucoproteína asociada a la mielina (MAG), la neuropatía motora asociada con anticuerpos para los gangliósidos GM1 ó GD1a, y la neuropatía sensorial asociada con anti-sulfatido o anticuerpos gangliósidos GD1b. Los anticuerpos en estos casos se unen a los oligosacáridos o a las moléculas del estilo de azúcares que están unidas a proteínas (glucoproteínas) o lípidos (glucolípidos o gangliósidos) en los nervios. Se sospecha que estos anticuerpos son responsables de las neuropatías.
El presente método puede también usarse como parte del plan terapéutico para tratar neuropatías asociadas a vasculitis o inflamación de los vasos sanguíneos en nervios periféricos. La neuropatía puede también estar causada por vasculitis -una inflamación de los vasos sanguíneos en los nervios periféricos. Produce pequeños "derrames cerebrales" a lo largo de los nervios periféricos, y puede estar restringido a los nervios o puede ser generalizado, incluir una erupción cutánea, o implicar otros órganos. Varias enfermedades reumatológicas como la artritis reumatoide, lupus, periarteritis nodosa, o síndrome de Sjogren, están asociados con la vasculitis generalizada, que puede también incluir los nervios periféricos. La vasculitis puede causar polineuritis, mononeuritis, o mononeuritis multiplex, en función de la distribución y gravedad de las lesiones.
En otra realización, el método de la presente invención puede usarse para el tratamiento de plexitis braquial o lumbosacral. El plexo braquial, que se encuentra bajo la axila, contiene los nervios de la mano y el brazo. La plexitis braquial es el resultado de la inflamación de este fascículo nervioso, y produce debilidad y dolor en uno o ambos brazos. La plexitis umbosacral, que tiene lugar en la pelvis, causa debilidad y dolor en las piernas.
Los agonistas de hedgehog pueden también ser adecuados para el uso en el tratamiento de neuropatías asociadas a gammopatías monoclonales. En la gammopatía monoclonal, los clones individuales de células B o células plasmáticas en la médula ósea o los órganos linfoides, se expanden para formar tumores benignos o malignos y segregan anticuerpos. "Monoclonal" es porque hay clones individuales de anticuerpos y "gammopatía" es por las gammaglobulinas, que es otro nombre para los anticuerpos. En algunos casos, los anticuerpos reaccionan con componentes nerviosos; en otros, los fragmentos de anticuerpos forman depósitos amiloides.
Aún otro aspecto de la presente invención está relacionado con el uso del presente método en el tratamiento de neuropatías asociadas con tumores o neoplasmas. La neuropatía puede ser debida a la infiltración directa de nervios por células tumorales o a efectos indirectos del tumor. En este último caso se llama neuropatía paraneoplásica. Se han descrito varios tipos. Por ejemplo, los presentes métodos pueden usarse para coordinar la neuropatía sensorial asociada a cáncer de pulmón. Esta neuropatía está asociada a anticuerpos para una proteína llamada Hu, que está presente en las neuronas sensoriales de los nervios periféricos. De forma similar, el presente método puede usarse para tratar neuropatías asociadas con el mieloma múltiple. El mieloma múltiple es un tumor óseo que está causado por las células plasmáticas secretoras de anticuerpos en la médula ósea. El tumor está constituido por un único clon de células plasmáticas, y los anticuerpos que producen son idénticos o monoclonales. Algunas personas con mieloma múltiple desarrollan polineuropatías sensorimotoras con degeneración de axones en los nervios periféricos. En otras realizaciones, el presente método puede usarse para tratar neuropatías asociadas con la macroglobulemia de Waldenstrom, la leucemia linfocítica crónica, o el linfoma de células B. Estos son tumores causados por linfocitos B que secretan anticuerpos en el bazo, médula ósea, o nódulos linfáticos. Estos anticuerpos son monoclonales y frecuentemente reaccionan con los componentes del nervio periférico, como MAG, GM1 o sulfátidos. En otras realizaciones, los agonistas de hedgehog de la presente invención pueden usarse como parte del protocolo terapéutico para el tratamiento de pacientes con cánceres donde la neuropatía es una consecuencia de la irradiación local o puede estar causada por medicaciones como la vincristina y la cisplatina.
La presente invención también contempla el uso de los agonistas de hedgehog para el tratamiento de neuropatías asociadas con amiloidosis. El amiloide es una sustancia depositada en los nervios periféricos e interfiere en sus operaciones: el trastorno se llama amiloidosis. Existen dos tipos principales: amiloidosis primaria, en la que los depósitos contienen fragmentos de anticuerpos monoclonales (ver la gammopatía monoclonal previamente descrita); y amiloidosis hereditaria en la que los depósitos contienen una proteína mutada llamada Transtiretina. La amiloidosis primaria está normalmente asociada con gammopatías monoclonales o mieloma.
Otro aspecto de la presente invención proporciona el presente método como la forma de tratar neuropatías causadas por infecciones. Las neuropatías periféricas pueden estar causadas por infección de los nervios periféricos. Los virus que causan neuropatías periféricas son, entre otros, el virus del SIDA, el VIH-I, que causa neuropatía sensorial progresiva lenta, el citomegalovirus, que causa una neuropatía paralítica progresiva rápidamente, el Herpes zoster, que provoca escamaciones, y el poliovirus, que causa una neuropatía motora. Las infecciones por hepatitis B o C están a veces asociadas con la neuropatía vasculítica.
Las infecciones bacterianas que causan neuropatías incluyen la lepra, que causa una neuropatía sensorial localizada, y difteria, que puede causar una neuropatía paralítica progresiva rápidamente. Otras enfermedades infecciosas que causan neuropatía incluyen la enfermedad de Lyme, que está causada por una espiroqueta, y la tripanosomiasis, que está causada por un parásito. Ambas están comúnmente presentes con una neuropatía multifocal.
Las neuropatías causadas por un desequilibrio nutricional son también trastornos candidatos para el tratamiento con el presente método. Las deficiencias en las vitaminas B12, B1 (tiamina), B6 (piridoxina), o E, por ejemplo, pueden producir polineuropatías con degeneración de los axones de los nervios periféricos. Esto puede ser debido a una dieta pobre, o incapacidad para absorber los nutrientes del estómago o intestinos. Además, las megadosis de vitamina B6 también pueden causar neuropatías periféricas, y el presente método puede usarse como parte de un programa de desintoxicación en tales casos.
Aún otro uso del presente método es en el tratamiento de neuropatías que surgen en enfermedades renales. El fallo renal crónico puede causar una neuropatía periférica predominantemente sensorial con degeneración de los axones de los nervios periféricos.
Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para tratar las neuropatías hipotiroideas. El hipotiroidismo está a veces asociado con una polineuropatía sensorial dolorosa con degeneración axonal. La mononeuropatía o la mononeuropatía multiplex puede también ocurrir debido a la compresión de los nervios periféricos por tejidos inflamados.
El presente método puede también usarse en el tratamiento de neuropatías causadas por el alcohol y toxinas. Ciertas toxinas pueden causar una neuropatía periférica. La toxicidad del plomo está asociada con una neuropatía motora; el arsénico o mercurio causan una neuropatía sensorial, y el talio puede causar una polineuropatía. Varios solventes orgánicos y insecticidas pueden también causar polineuropatías. El alcohol es directamente tóxico para los nervios y el exceso de alcohol es una causa principal de neuropatías. El presente método puede usarse, en ciertas realizaciones, como parte de un programa de desintoxicación más amplio.
En otra realización, los métodos y composiciones de la presente invención pueden usarse para el tratamiento de neuropatías causadas por fármacos. Se sabe que varios fármacos causan neuropatías. Se incluyen, entre otros, la vincristina y cisplatina en el cáncer, la nitrofurantoína, que se usa en pielonefritis, amiodarona en arritmias cardíacas, disulfiram en alcoholismo, ddC y ddI en SIDA, y dapsona, que se usa para tratar la lepra. Como anteriormente, el presente método puede usarse en ciertas realizaciones como parte de un programa de desintoxicación más amplio.
El método de la presente invención puede también usarse en el tratamiento de neuropatías causadas por un trauma o una compresión. Las neuropatías localizadas pueden ser el resultado de la compresión de nervios por presión externa o por tendones superpuestos y otros tejidos. El más conocido de estos es el síndrome de túnel carpiano, que resulta de la compresión en la muñeca, y las radiculopatías lumbares (ciática) o cervicales que resultan de la compresión de las raíces de los nervios cuando salen de la espina. Otras áreas frecuentes de compresión de los nervios incluyen los codos, las axilas, y la parte trasera de las rodillas.
El presente método es también útil en varias neuropatías idiomáticas. El término "idiopático" se usa cuando la causa de la neuropatía no puede encontrarse. En estos casos, la neuropatía se clasifica de acuerdo con sus manifestaciones, por ejemplo, polineuropatía idiomática sensorimotora, o motora, o sensorial.
El presente método tiene una amplia aplicabilidad al tratamiento o profilaxis de trastornos que afectan al tejido muscular. En general, el método puede caracterizarse por incluir un paso de administración a un animal de una cantidad de agonista de hedgehog efectivo para alterar el estado proliferativo de un tejido muscular tratado. La forma de administración y los regímenes de dosificación variarán en función del tejido o tejidos musculares que hay que tratar.
En otro aspecto, la invención está dirigida a un factor músculo-trófico, y su uso en la estimulación de la diferenciación o del crecimiento muscular en mamíferos. Tale estimulación del crecimiento muscular es útil para tratar atrofia, o desgaste, en particular, atrofia muscular esquelética y atrofia muscular cardíaca. Además, ciertas enfermedades donde el tejido muscular está dañado, es anormal, o está atrofiado, son tratables usando la invención, como por ejemplo, envejecimiento normal, atrofia por falta de uso, desgaste o cachexia, y varios trastornos secundarios asociados con el envejecimiento y la perdida de masa muscular, como la hipertensión, la intolerancia a la glucosa y la diabetes, la dislipidemia y la enfermedad cardiovascular aterosclerótica. El tratamiento de miopatías musculares como las distrofias musculares es también una realización de la invención.
Debido a la falta de nervios o de uso, los músculos esqueléticos padecen atrofias rápidas que llevan a un descenso profundo del tamaño, del contenido proteico y la fuerza contráctil. Esta atrofia es un componente importante de muchas enfermedades neuromusculares en humanos. En un contexto clínico, las composiciones que contienen los presentes agonistas de hedgehog, pueden usarse para inhibir la degeneración muscular, por ejemplo, descendiendo la pérdida de masa muscular, como parte de un tratamiento para tales desórdenes de desgaste muscular.
En realizaciones preferidas, se administra de acuerdo con la invención composiciones farmacéuticas a pacientes que padecen algún trastorno, es decir, una condición física anormal, una enfermedad o condición patofisiológica asociada con una regulación anormal y/o aberrante del tejido muscular. Los trastornos para los que se administra las composiciones de la invención son preferiblemente aquellos que producen directa o indirectamente una desgaste (esto es, pérdida) de masa muscular, por lo tanto, un desorden de desgaste muscular. Entre ellas se encuentran las distrofias musculares, la cachexia cardiaca, el enfisema, la lepra, la malnutrición, la osteomalacia, la leucemia aguda infantil, SIDA con cachexia y cáncer con cachexia.
Las distrofias musculares son enfermedades genéticas que se caracterizan por una debilidad progresiva y una degeneración de las fibras musculares sin pruebas de degeneración neural. En la distrofia muscular de Duchenne (DMD) los pacientes muestran de media una reducción del 67% de la masa muscular, y en la distrofia miotónica, la síntesis proteica muscular fraccional se ha mostrado que desciende en una media del 28%, sin ningún descenso correspondiente de la síntesis proteica no muscular (posiblemente debido a respuesta reducida de órganos terminales a sustratos u hormonas anabólicas). La degradación proteica acelerada se ha demostrado en los músculos de los pacientes DMD. El presente método puede usarse como parte de una estrategia terapéutica para la prevención, y en algunos casos la inversión, de las condiciones de desgaste muscular asociadas a tales distrofias.
El fallo cardíaco congestivo (CHF) grave se caracteriza por una "cachexia cardiaca", esto es, una desgaste proteica muscular de tanto el músculo cardiaco como el esquelético con un descenso medio del peso corporal de 19%. La cachexia cardiaca está causada por una tasa aumentada de rotura proteica miofibrilar. El presente método puede usarse como parte de un tratamiento para la cachexia cardiaca.
El enfisema es una enfermedad pulmonar obstructiva crónica, que se definen por un alargamiento de los espacios de aire distales a los brionquiolos no respiratorios terminales, acompañado de cambios destructivos en las paredes alveolares. Las manifestaciones clínicas del funcionamiento pulmonar reducido incluyen la tos, la respiración sibilante, las infecciones respiratorias recurrentes, el enema, la discapacidad funcional y un periodo de vida reducido. La fluxión de tirosina se aumenta en un 47% en pacientes enfisematosos. También el flujo de leucina por todo el cuerpo se mantiene normal, la oxidación de la leucina de todo el cuerpo aumenta, y la síntesis de proteína de todo el cuerpo desciende. El resultado es un descenso en la síntesis proteica muscular, acompañada por un descenso en la proteína corporal y en la masa muscular esquelética. Este descenso se vuelve más evidente con la progresión de la enfermedad y con deterioración a largo plazo. Los presentes agonistas hedgehog pueden usarse para evitar y/o invertir las condiciones de desgaste muscular asociadas a tales enfermedades.
En la diabetes mellitus existe desgaste generalizado de los músculos pequeños de las manos, que es debida a una denervación parcial crónica (neuropatía). Esto es especialmente evidente y empeora con la progresión de la enfermedad a largo plazo y la gravedad. El presente método puede usarse como parte de una estrategia terapéutica para el tratamiento de diabetes mellitus.
La lepra está asociada al desgaste muscular que tiene lugar entre los metacarpios del dedo gordo y el dedo índice. La malnutrición grave se caracteriza por, entre otras cosas, desgaste muscular grave. El presente método puede usarse para tratar efectos de la lepra que provocan desgaste muscular.
La osteomalacia es un trastorno nutricional causado por una deficiencia de la vitamina D y calcio. En niños se llama "raquitismo" y en adultos "osteomalacia". Está marcada por un debilitamiento de los huesos (debido a una mineralización reducida, con exceso de acumulación de osteoide), dolor, blandura, desgaste muscular y debilidad, anorexia y una pérdida de peso generalizada. Puede ser el resultado de una malnutrición de repetidos embarazos y lactancias (agotando o reducción de las existencias de vitamina D y calcio) y resistencia la vitamina D. El método presente puede usarse como parte de una estrategia terapéutica para el tratamiento de la osteomalacia.
En la leucemia aguda infantil existe una malnutrición de energía proteica que lleva a una desgaste muscular esquelética. Los estudios han demostrado que algunos niños muestran la desgaste muscular incluso antes de ser diagnosticados leucemia, con una media de 27% de descenso de masa muscular. También existe un aumento del 33-37% simultáneo de tejido adiposo, que no tiene como resultado un cambio neto en el peso corporal relativo y la circunferencia de las extremidades. Tales pacientes pueden recibir tratamiento con un agonista de hedgehog de acuerdo con el método de la presente invención.
La caquexia cancerígena es un síndrome complejo que tiene lugar con incidencia variable en pacientes con tumores sólidos y malignidad hematológica. Clínicamente, la cachexia de cáncer se manifiesta por una pérdida de peso con una depleción del tejido adiposo y la masa muscular magra, y es una causa de muerte que resulta a partir del cáncer. Los pacientes de cachexia de cáncer tienen tiempos de supervivencia más cortos, y una respuesta disminuida a quimioterapia. Además de los trastornos que producen desgaste muscular, hay otras circunstancias y condiciones que parecen ir unidas de alguna forma con un descenso de la masa muscular. Tales aflicciones incluyen la desgaste muscular d3bida a un dolor en la espalda crónico, una edad avanzada, una hospitalización de larga duración debido a una enfermedad o daño, alcoholismo y terapia corticoestoroidea. El presente método puede usarse como parte de una estrategia
terapéutica para evitar, y en algunos casos invertir, las condiciones de desgaste muscular asociadas con tales cánceres.
Los estudios han demostrado que los casos graves de dolor lumbar bajo, existe desgaste muscular paraespinal. El descenso de la desgaste muscular paraespinal alivia el dolor y mejora la función. Un curso de tratamiento para una enfermedad puede incluir la administración de una cantidad terapéutica de un agonista de hedgehog.
También se cree que la debilidad generalizada en edad avanzada es debida al desgaste muscular. A medida que el cuerpo envejece, una proporción cada vez mayor de músculo esquelético es reemplazado por tejido fibroso. El resultado es una reducción significativa en el poder del músculo, pero sólo una reducción marginal en la masa libre de grasa. El presente método puede usarse como parte de un tratamiento y estrategias preventivas para evitar/invertir la desgaste muscular en pacientes de edad avanzada.
Los estudios también han demostrado que en pacientes que padecen daños o enfermedades crónicas y hospitalización durante largos periodos de tiempo, existe una desgaste muscular unilateral de larga duración, con un descenso medio del 32% de la masa muscular. Los estudios muestran además que esto puede corregirse con fisioterapia intensiva. Sin embargo, para más pacientes puede ser más efectivo aumentar por lo menos tales terapias con tratamientos con el presente método.
En personas alcohólicas existe una desgaste del músculo tibial anterior. Este daño en el músculo proximal está causado por un daño neurogénico, por ejemplo, una actividad enzimática glicolítica y fosforilasa disminuida. El daño se vuelve visible y empeora con la duración del consumo excesivo de alcohol. Los pacientes tratados con corticoesteroides sufren una pérdida de masa muscular. Estos pacientes pueden también ser sujetos del tratamiento con el presente método.
Los compuestos de la invención pueden usarse para aliviar la pérdida de masa muscular resultante de las condiciones antes mencionadas, y de otras muchas. Adicionalmente, los agonistas de hedgehog de la presente invención son útiles en las aplicaciones a la ganadería animal y en veterinaria para contrarrestar la pérdida de peso en animales, o para impulsar el crecimiento. Por ejemplo, la invención puede también encontrar uso en el aumento de la eficiencia de la producción de carne animal. Especialmente, los animales pueden ser alimentados o inyectados con un agonista de hedgehog para aumentar la masa muscular esquelética general, por ejemplo, para aumentar el peso de los animales de granja, como las vacas, cerdos, ovejas, pollos y salmón.
El mantenimiento de tejidos y órganos ex vivo es también altamente deseable. La terapia de sustitución de tejidos está bien establecida en el tratamiento de enfermedades humanas. Existen varias situaciones donde puede interesar trasplantar células musculares, especialmente células madre musculares, en un huésped recipiente donde, las células del recipiente son inexistentes, están dañadas o son células musculares disfuncionales en enfermedades de desgaste muscular. Por ejemplo, el trasplante de mioblastos normales puede ser útil para tratar la distrofia muscular de Duchenne y otras degeneraciones y enfermedades de desgaste. Ver, por ejemplo, Partridge (1991) Muscle & Nerve 14:197-212. En el caso de los mioblastos, pueden inyectarse en varios sitios para tratar enfermedades de desgaste muscular.
El presente método puede usarse para regular el crecimiento de células y tejidos musculares in vitro, así como acelerar el injerto de tejido muscular implantado a un huésped animal. En este sentido, la presente invención también concierte a los cultivos de mioblastos que han sido ampliados por tratamiento con un agonista de hedgehog. En una realización ilustrativa, tal método comprende la obtención de una muestra de músculo, preferiblemente una que incluya mioblastos; opcionalmente tratar la muestra de célula enzimáticamente para separar las células; hacer un cultivo en la presencia de un agonista de hedgehog.
Aún otro aspecto de la presente invención concierte a la observación en la materia de que ptc, hedgehog, y/o smoothened están implicados en las señales mofogénicas relacionadas con otras vías organogénicas vertebradas además de la diferenciación neuronal, como se ha descrito anteriormente, ya que tienen papeles claros en otras formaciones del patrón endodérmico, así como en los procesos de diferenciación mesodérmico y endodérmico. De esta manera, se contempla en la invención que las composiciones que contengan agonistas de hedgehog pueden también ser utilizadas para cultivos celulares así como para métodos terapéuticos que incluyan la generación y mantenimiento de tejido no neuronal.
En una realización, la presente invención usa el descubrimiento de que ptc, hedgehog, y smoothened están aparentemente implicados en el control del desarrollo de las células madre responsables de la formación del tracto digestivo, hígado, pulmones y otros órganos que derivan del intestino primitivo. Los nervios Shh como una señal inductiva de la endoderma a la mesoderma, cosa que es crítica para la morfogénesis intestinal. Por lo tanto, por ejemplo, los agonistas de hedgehog del presente método pueden utilizarse para regular el desarrollo y mantenimiento de un hígado artificial que puede tener múltiples funciones metabólicas de un hígado normal. En una realización ejemplar, el presente método puede usarse para regular la proliferación y diferenciación de las células madre del tubo digestivo para formar cultivos de hepatocitos que pueden usarse para poblar matrices extracelulares, o que pueden estar encapsuladas en polímeros biocompatibles para formar hígados artificiales tanto implantables como extracorpóreos.
En otra realización, las composiciones terapéuticas de agonista de hedgehog pueden utilizarse en conjunción con trasplantes de esos hígados artificiales, así como estructuras hepáticas embrionarias, para regular la respuesta del implante intraperitoneal, la vascularización y la diferenciación in vivo y el mantenimiento del tejido hepático injertado.
En todavía otra realización, el presente método puede utilizarse terapéuticamente para regular tales órganos tras ataques patológicos, químicos o físicos. Por ejemplo, las composiciones terapéuticas que contienen agonistas de hedgehog puede usarse en la reparación hepática subsiguiente a una hepatectomía parcial.
La generación del páncreas y el intestino delgado a partir de intestino embrionario depende de la señalización intercelular entre las células de la endoderma y la mesoderma del intestino. Concretamente, existe la sugerencia de que la diferenciación de la mesoderma intestinal en músculo dependa de señales de las células endodérmicas adyacentes. Un mediador candidato de las señales derivadas endodérmicamente en el intestino posterior embrionario es el Sonic hedgehog. Ver, por ejemplo, Apelqvist et al. (1997) Curr Biol 7:801-4. El gen Shh es expresado a lo largo de la endoderma intestinal embrionaria con la excepción de la endoderma del primordio pancreático, que en cambio expresa altos niveles de proteína de homeodominio Ipf1/Pdx1 (factor promotor de insulina 1/homeobox pancreático y duodenal 1), un regulador esencial del desarrollo pancreático temprano. Apelqvist et al. Supra, han examinado si la expresión diferencial de Shh en el tubo intestinal embrionario controla la diferenciación de la mesoderma de alrededor en derivados de mesoderma especializados del intestino delgado y el páncreas. Para probar esto, usaron el promotor del gen Ipf1/Pdx1 para expresar selectivamente Shh en el epitelio de páncreas en desarrollo. En el ratón transgénico Ipf1/Pdx1-Shh, la mesoderma pancreática se desarrolló hasta formar músculo liso y células intestinales de Cajal, características del intestino, más que en la mesénquima pancreática y el bazo. Además, los explantes pancreáticos expuestos a Shh siguieron un programa similar de diferenciación intestinal. Estos resultados proporcionan pruebas de que la expresión diferencial de Shh derivado endodérmicamente controla el futuro de la mesoderma adyacente en diferentes regiones del tubo intestinal.
En el contexto de la presente invención, se contempla por lo tanto que los agonistas de hedgehog puedan usarse para controlar o regular la proliferación y/o diferenciación de tejido pancreático tanto in vivo como in vitro.
Existe una gran variedad de células patológicas proliferativas y condiciones de diferenciación mediante las cuales los agonistas de la presente invención pueden proporcionar beneficios terapéuticos, siendo la estrategia general, por ejemplo, la corrección de la expresión de insulina aberrante, o la modulación de la diferenciación. Más generalmente, sin embargo, la presente invención está relacionada con un método de inducción y/o mantenimiento de un estado diferenciado potenciando la supervivencia y/o afectando la proliferación de células pancreáticas, al poner en contacto las células con los presentes agonistas. Por ejemplo, la invención contempla que, a la luz de la aparente implicación de ptc, hedgehog, y smoothened en la formación de ordenaciones espaciales del tejido pancreático, el presente método podría usarse como parte de una técnica para generar y/o mantener tales tejidos tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, la modulación de la función de hedgehog puede utilizarse en cultivos celulares y en métodos terapéuticos que incluyan la generación y el mantenimiento de células \beta y posiblemente también para tejidos no pancreáticos, como en el control del desarrollo y mantenimiento de tejidos del tracto digestivo, bazo, pulmones, y otros órganos que derivan del intestino primitivo.
En una realización ejemplar, el presente método puede usarse en el tratamiento de trastornos hiperplásicos y neoplásicos teniendo efecto sobre el tejido pancreático, particularmente aquéllos caracterizados por una proliferación aberrante de células pancreáticas. Por ejemplo, el cáncer pancreático está marcado por una proliferación anormal de células pancreáticas que puede resultar en alteraciones de la capacidad secretora de insulina del páncreas. Por ejemplo, ciertas hiperplasias pancreáticas, como los carcinomas pancreáticos, pueden dar como resultado una hipoinsulinemia debida a una disfunción de las células \beta o al descenso de masa celular en islotes. En la medida que la señalización de ptc, hedgehog, y smoothened puede estar indicada en la progresión de una enfermedad, los presentes agonistas pueden usarse para potenciar la regeneración del tejido tras una terapia anti-tumor.
Además, la manipulación de las propiedades de señalización de hedgehog en diferentes puntos puede ser útil como parte de una estrategia para la regeneración/reparación de tejido pancreático tanto in vivo como in vitro. En una realización, la presente invención utiliza la aparente relación de ptc, hedgehog, y smoothened en la regulación del desarrollo de tejido pancreático. En general, el presente método puede utilizarse terapéuticamente para regular el páncreas tras un ataque patológico, químico o físico. En otra realización, el presente método puede aplicarse a técnicas de cultivo celular, concretamente puede aplicarse para potenciar la generación inicial de dispositivos de tejido pancreático prostético. La manipulación de la proliferación y diferenciación del tejido pancreático, por ejemplo, mediante una alteración de la actividad de hedgehog, puede proporcionar una manera de controlar más exhaustivamente las características de un tejido cultivado. En una realización ejemplar, el presente método puede usarse para aumentar la producción de dispositivos prostéticos que requieren células de islote pancreático beta, como se puede usar en los dispositivos de encapsulación descritos en, por ejemplo, la patente estadounidense de Aebischer et al. nº 4.892.538, la patente estadounidense de Aebischer et al. nº 5.106.627, la patente estadounidense de Lim nº 4.391.909, y la patente estadounidense de Sefton nº 4.353.888. Las células progenitoras tempranas a los islotes pancreáticos son multipotenciales, y aparentemente coactivan todos los genes específicos de islotes a partir del momento en que aparecen. A medida que el desarrollo tiene lugar, la expresión de hormonas específicas de islotes, como la insulina, se vuelve restringida al patrón de expresión característico de células de islote maduras. El fenotipo de islotes maduros, sin embargo, no es estable en cultivos, mientras que se puede observar la reaparición de las características embrionarias en células beta maduras. Utilizando los presentes agonistas de hedgehog, la vía de diferenciación o el índice proliferativo de células puede regularse.
Además, la manipulación del estado diferenciativo de tejido pancreático puede también utilizarse en conjunción con un trasplante de páncreas artificial para impulsar a la implantación, vascularización, y mantenimiento diferenciación in vivo del tejido injertado. Por ejemplo, la manipulación de la función de hedgehog para afectar a la diferenciación de tejido puede utilizarse como una forma de mantener la viabilidad del injerto.
Bellusci et al. (1997) Development 124:53 informan de que el Sonic hedgehog regula la proliferación celular mesenquimal del pulmón in vivo. De acuerdo con esto, la presente invención puede usarse para regular la regeneración de tejido pulmonar, por ejemplo, en el tratamiento del enfisema.
En otra realización de la presente invención, las composiciones que contienen agonistas de hedgehog pueden usarse en la generación in vitro de tejido esquelético, como la formación de células madre esqueletogénicas, así como el tratamiento in vivo de las deficiencias del tejido esquelético. La presente invención contempla particularmente el uso de agonistas de hedgehog para regular la tasa de condrogénesis y/o osteogénesis. Por "deficiencia del tejido esquelético" se entiende una deficiencia en el tejido conectivo esquelético u óseo en cualquier lugar donde se desee recuperar el tejido conectivo u óseo, sin importar como se originó la deficiencia, p.ej. ya sea como resultado de la intervención quirúrgica, eliminación del tumor, ulceración, implante, fractura, u otra condición degenerativa o traumática.
Por ejemplo, el método de la presente invención puede usarse como parte de un régimen para recuperar la función del cartílago de un tejido conectivo. Tales métodos son útiles, por ejemplo, en la reparación de defectos o lesiones en tejidos cartilaginosos, que son el resultado del desgaste degenerativo que finalmente acaba siendo artritis, así como otros desórdenes mecánicos que pueden ser causados por un trauma en el tejido, como una deslocalización del tejido de desgarro del menisco, una meniscectomía, una laxación de una articulación por un ligamento desgarrado, una alineación incorrecta de las articulaciones, una fractura ósea, o por una enfermedad hereditaria. El presente método de reparación es también útil para remodelar la matriz de cartílago, como en la cirugía plástica o reconstructiva, así como la cirugía periodontal. El presente método puede también aplicarse para mejorar un procedimiento de reparación previo, por ejemplo, después de una reparación quirúrgica de un menisco, ligamento, o cartílago. Además, puede evitar el inicio o exacerbación de una enfermedad degenerativa si se aplica de forma suficientemente temprana tras un
trauma.
En una realización de la presente invención, el presente método comprende el tratamiento del tejido conectivo afligido con una cantidad suficiente terapéuticamente de un agonista de hedgehog, particularmente un agonista selectivo para la transducción de señal de hedgehog indio, para regular la respuesta reparatoria de un cartílago en el tejido conectivo manteniendo el índice de diferenciación y/o proliferación de condorcitos incrustados en el tejido. Tales tejidos conectivos como el cartílago articular, cartílago interarticular (meniscos), cartílago costal (que conecta las costillas verdaderas y el esternón), ligamentos, y tendones, son particularmente adecuados para el tratamiento en terapias reconstructivas y/o regenerativas utilizando el presente método. Como se usa aquí, las terapias regenerativas incluyen el tratamiento de estados degenerativos que han progresado hasta el punto en el que las deficiencias en el tejido se manifiestan de forma obvia, así como los tratamientos preventivos de tejido donde la degeneración está en las primeras etapas o es inminente.
En una realización ilustrativa, el presente método puede usarse como parte de una intervención terapéutica en el tratamiento del cartílago de una articulación diartroidal, como la rodilla, el tobillo, el codo, la cadera, la muñeca, el nudillo de cualquier dedo de pies y manos, o la articulación tempomandibular. El tratamiento puede ir dirigido al menisco de la articulación, al cartílago articular, o a ambos. Para ilustrarlo mejor, el presente método puede usarse para tratar un trastorno degenerativo en una rodilla, como el que puede resultar de un daño traumático (p.ej. un accidente deportivo o un gasto excesivo) u osteoartritis. Los presentes agonistas pueden administrarse como una inyección en la articulación con, por ejemplo, una aguja artroscópica. En algunos ejemplos el agente inyectado puede estar en la forma de un hidrogel o de otro vehículo de liberación lenta descrito anteriormente para permitir un contacto más extendido y regular del agente con el tejido tratado.
La presente invención también contempla el uso del presente método en la materia de los trasplantes de cartílago y de terapias con dispositivos prostéticos. Sin embargo, los problemas surgen, por ejemplo, debido a que las características del cartílago y fibrocartílago varían entre los diferentes tejidos: como entre el cartílago del menisco, el articular, los ligamentos y los tendones, entre las dos terminaciones del mismo ligamento o tendón, y entre las partes superficiales y profundas del tejido. La colocación zonal de estos tejidos puede reflejar un cambio gradual en las propiedades mecánicas, y se produce un fracaso cuando el tejido implantado, que no se ha diferenciado bajo esas condiciones, carece de la capacidad para responder adecuadamente. Por ejemplo, cuando el cartílago del menisco se usa para reparar ligamentos cruzados anteriores, el tejido sufre una metaplasia a tejido fibroso puro. Regulando la tasa de condrogénesis, el presente método puede usarse para encarar concretamente este problema, ayudando a controlar adaptativamente las células implantadas en el nuevo entorno y conseguir condrocitos efectivos hipertróficos parecidos a los de etapas anteriores de desarrollo del tejido.
De la misma manera, el presente método puede aplicarse para mejorar tanto la generación de dispositivos de cartílago prostético como su implantación. La necesidad de un tratamiento mejorado ha motivado la investigación centrada en la creación de un nuevo cartílago que se basa en plantillas de colágeno-glucosaminoglicano (Stone et al. (1990) Clin Orthop Relat Red 252:129), condrocitos aislados (Grande et al. (1989) J Orthop Res 7:208; y Takigawa et al. (1987) Bone Miner 2:449), y condrocitos unidos a polímeros naturales o sintéticos (Walitani et al. (1989) J Bone Jt Surg 71B-74; Vacanti et al. (1991) Plast Reconstr Surg 88:753; von Schoreder et al. (1991) J Biomed Mater Res 25:329; Freed et al. (1993) J Biomed Mater Res 27:11; y la patente estadounidense de Vacanti et al. nº 5.041.138). Por ejemplo, los condrocitos pueden crecer en un cultivo biodegradable de esqueletos moleculares altamente porosos biocompatibles formados a partir de polímeros como el ácido poliglucólico, el ácido poliláctico, el gel de azarosa, u otros polímeros que se degradan como el tiempo como función de la hidrólisis de la columna vertebral del polímero en monómeros inocuos. Las matrices están diseñadas para permitir un adecuado intercambio de nutrientes y gas a las células hasta que tiene lugar el injerto. Las células pueden cultivarse in vitro hasta que el volumen celular apropiado y la densidad se han desarrollado para las células que se van a implantar. Una ventaja de las matrices es que pueden ser moldeadas en la forma deseada individualmente, de forma que el producto final se parece mucho a la oreja o nariz del paciente (a modo de ejemplo), o puede usarse las matrices flexibles, lo que permite una manipulación en el momento del implante, como en una articulación.
En una realización del presente método, los implantes están en contacto con un agonista de hedgehog durante ciertas etapas del proceso de cultivo para controlar la tasa de diferenciación de condrocitos y la formación de condrocitos hipertróficos en el cultivo.
En otra realización, el dispositivo implantado es tratado con un agonista hedgehog para remodelar activamente la matriz implantada y para hacer que sea más posible que desarrolle la función que interesa. Como se ha indicado antes respecto a los trasplantes tisulares, los trasplantes artificiales sufren la misma deficiencia de no ser derivados en un contexto que es comparable al contexto mecánico real en el que la matriz es implantada. La capacidad de regular los condrocitos en la matriz gracias al presente método puede permitir que un implante adquiera características similares a las del tejido que se pretende que llegue a reemplazar.
En otra realización, el presente método se usa para mejorar la unión de los dispositivos prostéticos. Para ilustrarlo mejor, el presente método puede usarse en la implantación de una prótesis periodontal, donde el tratamiento del tejido conectivo de alrededor estimula la formación de ligamentos periodontales sobre la prótesis.
En otras realizaciones, el presente método puede usarse como parte de un régimen APRA la generación de hueso (osetogénesis) en un sitio en el animal donde tal tejido esquelético sea deficiente. El Indian hedgehog está particularmente asociado a los condrocitos hipertróficos que son finalmente reemplazados por osteoblastos. Por ejemplo, la administración de un agonista de hedgehog de la presente invención puede usarse como parte de un método para regular la tasa de pérdida ósea en un sujeto. Las preparaciones que contienen agonistas de hedgehog pueden usarse, por ejemplo, para controlar la osificación endocondral en la formación de un "modelo" para la osificación.
En otra realización de la presente invención, un agonista de hedgehog puede usarse para regular la espermatogénesis. Se ha demostrado que las proteínas hedgehog, concretamente la Dhh, están involucradas en la diferenciación y/o proliferación y mantenimiento de las células madre testiculares. La expresión de Dhh es iniciada en las precursoras de las células de Seroli tras la activación del Sry (gen determinante testicular) y persiste en los testículos en el adulto. Los machos son viables pero infértiles, puesto que carecen completamente de esperma maduro. El examen de los testículos en desarrollo en diferentes marcos genéticos sugiere que la Dhh regula las etapas tempranas y tardías de espermatogénesis. Bitgood et al. (1996) Curr Biol 6:298. En una realización preferida, el agonista de hedgehog puede usarse como un agente de fertilidad. De una forma parecida, los agonistas de hedgehog del presente método son potencialmente útiles para la modulación de la función ovárica normal.
El presente método también tiene una gran aplicabilidad en el tratamiento o profilaxis de trastornos que afectan al tejido epitelial, así como en usos cosméticos. En general, el método puede caracterizarse por incluir un paso de administración a un animal de una cantidad de agonista de hedgehog efectiva para alterar el estado de crecimiento de un tejido epitelial tratado. El modo de administración y los regímenes de dosis variarán en función del tejido o tejidos que se va a tratar. Por ejemplo, las formulaciones tópicas serán preferidas donde el tejido para tratar sea tejido epidérmico, como tejidos dérmicos o mucosos.
Un método que "mejora la cicatrización de una herida" tiene como resultado la cicatrización de heridas más rápidamente debido al tratamiento que aquéllas heridas que tienen que cicatrizarse sin tratamiento. La "mejora de la cicatrización de heridas" puede también significar que el método regula la proliferación y/o crecimiento de, inter alia, queratinocitos, o que las heridas cicatricen con menos marcas, menos contracción de la herida, menos deposición de colágeno y más área de superficie. En ciertos ejemplos, la "mejora de la cicatrización de heridas" puede también significar que ciertos métodos de cicatrización de heridas han mejorado el índice de éxito (p.ej. el índice en caso de injertos de piel), cuando se usa conjuntamente con el método de la presente invención.
Las complicaciones son un riesgo constante con heridas que no se han cicatrizado del todo y permanecen abiertas. Aunque la mayoría de heridas cicatrizan rápidamente sintratamiento, algunos tipos de heridas se resisten a cicatrizar. Las heridas que cubren grandes áreas de superficie también permanecen abiertas durante periodos de tiempo largos. En una realización de esta invención, el presente método puede usarse para acelerar la cicatrización de heridas que implican tejidos epiteliales, como resultado de cirugía, quemaduras, inflamaciones o irritaciones. Ciertos agonistas de hedgehog de la presente invención pueden también aplicarse de forma profiláctica, como en la forma de una preparación cosmética, para mejorar el proceso de regeneración tisular, p.ej. de la piel, cabello o uñas.
A pesar del significativo progreso en las técnicas quirúrgicas reconstructivas, la cicatrización puede ser un obstáculo importante para recuperar la función normal y la apariencia de una piel cicatrizada. Esto es particularmente cierto cuando la cicatrización patológica, como los queloides o las cicatrices hipertróficas de las manos o cara causan una discapacidad funcional o una deformidad física. En las circunstancias más graves, esa cicatrización puede precipitar una ansiedad psicosocial y una vida de privaciones económicas. La reparación de heridas incluye las etapas de hemostasis, inflamación, proliferación, y remodelamiento. La etapa proliferativa incluye la multiplicación de fibroblastos y de células endoteliales y epiteliales. Mediante el uso del presente método, la tasa de proliferación de células epiteliales centro de la herida y alrededor puede controlarse para acelerar el cierre de la herida y/o minimizar la formación de tejido de cicatriz.
Las quemaduras de segundo y tercer grado son un ejemplo de tipos de heridas que a menudo cubre grandes áreas de superficie y por lo tanto requiere periodos prolongados de tiempo para cerrarse. Como resultado, las complicaciones con riesgo para la vida, como la infección y pérdida de fluidos corporales a menudo tiene lugar. Además, la cicatrización en quemadas se produce a menudo de forma desordenada, lo que provoca marcas y desfiguraciones. En algunos casos, la contracción de la herida debida a la deposición excesiva de colágeno tiene como resultado una movilidad reducida de los músculos en la zona circundante a la herida. Las composiciones y el método de la presente invención pueden usarse para acelerar el índice de cicatrización de heridas y mejorar los procesos de cicatrización que tienen resultados cosméticos más deseables y menos contracción de la herida y cicatrización.
Las quemaduras graves que cubren grandes áreas se tratan a menudo con autoinjertos de piel tomados de áreas no dañadas del cuerpo del paciente. El presente método puede usarse en conjunción con injertos de piel para mejorar las tasas de aceptación del injerto acelerando el crecimiento tanto en la piel injertada como en la piel del paciente que sea proximal al injerto.
Las úlceras dérmicas son otro ejemplo de heridas susceptibles de ser tratadas con el presente método, p.ej. para causar el cierre de la úlcera y/o para evitar que la úlcera se vuelva una herida crónica. Uno de cada siete individuos con diabetes desarrolla úlceras dérmicas en sus extremidades, que son susceptibles de infectarse. Los individuos con úlceras diabéticas infectas requieren a menudo hospitalización, servicios intensivos, antibióticos caros, y, en algunos casos, amputación. Las úlceras dérmicas, como las provocadas por enfermedades venosas (úlceras de estasis venosa), la presión excesiva (úlceras decubitus) y las úlceras arteriales, también oponen resistencia a cicatrizar. Los tratamientos existentes en el campo hasta ahora están generalmente limitados a mantener la herida protegida, libre de infecciones y, en algunos casos, recuperar el flujo sanguíneo por cirugía vascular. De acuerdo con el presente método, la zona afectada de piel puede tratarse con una terapia que incluye un agonista de hedgehog que impulsa la epitelización de la herida, p.ej. acelera la tasa de cicatrización de las úlceras de piel.
El presente tratamiento también puede ser efectivo como parte de un régimen terapéutico para tratar úlceras orales y paraorales, p.ej. como resultado de radioterapia o quimioterapia. Tales úlceras se desarrollan frecuentemente a los pocos días de la quimioterapia o la radioterapia. Estas úlceras normalmente empiezan como pequeñas lesiones de formas irregulares y dolorosas, normalmente cubiertas por una delicada membrana necrótica gris y rodeadas por tejido inflamatorio. En muchos casos, la falta de tratamiento resulta en la proliferación de tejido alrededor de la periferia de una lesión sobre la base inflamatoria. Por ejemplo, los bordes de epitelio de la úlcera normalmente muestran actividad proliferativa, lo que provoca la pérdida de continuidad de la superficie del epitelio. Estas lesiones, debido a su tamaño y a la pérdida de integridad epitelial, llevan al cuerpo a una infección secundaria potencial. La ingestión rutinaria de comida y agua se vuelve una tarea dolorosa, y si las úlceras proliferan a lo largo del canal alimenticio, la diarrea es normalmente evidente con todos sus factores complicativos. De acuerdo con la presente invención, un tratamiento para tales úlceras que incluye la aplicación de un agonista de hedgehog puede reducir la proliferación anormal y la diferenciación del epitelio afectado, ayudando a reducir la gravedad de los eventos inflamatorios posterio-
res.
En otra realización de ejemplo, el método tratado se proporciona para tratar o prevenir enfermedades gastrointestinales. Brevemente, una amplia variedad de enfermedades se asocian con la interrupción del epitelio o vellosidades gastrointestinales, incluyendo quimioterapia -y enteritis inducida por terapia de radiación (i.e., toxicidad de intestino) y mucositis, enfermedad de úlcera péptica, gastroenteritis y colitis, alteraciones atróficas de las vellosidades, y similares. Por ejemplo, terapia con agentes quimioterapéuticos usada en el transplante de médula ósea y la terapia cancerosa afecta rápidamente las células que proliferan en ambos tejidos hematopoyéticos e intestino delgado, llevando a toxicidades severas y con frecuencia toxicidades que limitan la dosis. El daño de la barrera mucosa del intestino resulta en complicaciones serias de hemorragias y sepsis. El método tratado se puede usar para promocionar la proliferación del epitelio gastrointestinal y por lo tanto el incremento de las dosis toleradas para agentes de radiación y de quimioterapia. El tratamiento efectivo de enfermedades gastrointestinales puede ser determinado mediante varios criterios, incluyendo una puntuación de enteritis, otros tests bien conocidos en la materia.
Levine et al. (1997) J Neurosci r.7:6277 muestran que las proteínas hedgehog pueden regular la mitogenesis y la diferenciación de fotoreceptores en la retina de vertebrados, y Ihh es un factor candidato del epitelio pigmentado para promover la proliferación del progenitor retinal y la diferenciación del fotoreceptor. De la misma manera, Jensen et al. (1997) Development 124:363 demostró que tal tratamiento de cultivos de células perinatales retinales de ratón con el fragmento amino-terminal de los Sonic hedgehog resulta en un incremento en la proporción de células que incorporan bromodesoxuridina, en número de células totales, y en bastones fotoreceptores, células amacrinas y células gliales Muller, sugiriendo que Sonic hedgehog promueve la proliferación de células precursoras retinales. Así, el método tratado se puede usar en el tratamiento de enfermedades degenerativas de células retinales y regular la diferenciación de los fotoreceptores.
Con la edad, la epidermis disminuye y los apéndices cutáneos se atrofian. El pelo empieza a escasear y las secreciones sebáceas disminuyen, con la consiguiente susceptibilidad a secarse, agrietarse, y a fisurarse. La dermis disminuye con la pérdida de las fibras elásticas y colágenas. Además, la proliferación de queratinocitos (que es indicativo del espesor de la piel y la capacidad proliferativa de la piel) disminuye con la edad. Se piensa que un incremento en la proliferación de queratinocitos contrarresta, p.ej., arrugas, espesor, elasticidad y se reparan. De acuerdo con la presente invención, una forma proliferativa a partir de un agonista del hodgehog puede ser usado tanto terapéuticamente como cosméticamente para contrarrestar, al menos durante un tiempo, los efectos de la edad sobre la piel.
Aun otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del método tratado para promover el crecimiento del pelo. El pelo básicamente está compuesto por queratina, una proteína resistente e insoluble; su fuerza principal se debe a su enlace disulfuro de cisteínas. Cada pelo individual comprende un hueco cilíndrico y una raíz, y está contenido en un folículo, una depresión como un frasco en la piel. La parte inferior del folículo contiene una proyección como un dedo llamado papila, que consiste en tejido conectivo a partir del cual el pelo crece, y a través del cual los vasos sanguíneos abastecen las células con nutrientes. El eje central es la parte que se extiende hacia el exterior desde la superficie de la piel, mientras que la raíz se ha descrito como la parte enterrada del pelo. La base de la raíz se expande en el bulbo del pelo, que queda bajo la papila. Las células a partir de las que se produce el crecimiento del pelo en el bulbo del folículo; se extruyen en forma de fibras puesto que las células proliferan en el folículo. El "crecimiento del pelo" se refiere a la formación y elongación de la fibra del pelo mediante células en división.
Como se conoce bien en la materia, el ciclo común del pelo se divide en tres estadios: anágeno, catágeno, y telógeno. Durante la fase activa (anágeno), las células madre epidérmicas de la papila dérmica se dividen rápidamente. Las células hijas se trasladan hacia arriba y se diferencian a partir de las capas concéntricas del mismo pelo. El estadio transicional, catágeno, se marca mediante el cese de la mitosis de las células madre en el folículo. El estadio restante se conoce como telógeno, donde el pelo se retiene en el cuero cabelludo durante varias semanas antes que un nuevo pelo emerja de debajo desalojando el eje central de la fase telógeno desde su folículo. A partir de este modelo queda claro que cuantas más células madre dividiéndose, mayor crecimiento capilar. Concordantemente, los métodos para incrementar o reducir el crecimiento capilar pueden llevarse a cabo potenciando o inhibiendo, respectivamente, la proliferación de estas células madre.
Así, en ciertas realizaciones, el método tratado puede emplearse como una forma de promover el crecimiento del pelo humano, p.ej., para corregir la calvicie, alopecia, u otras enfermedades caracterizadas por la pérdida de pelo.
El método en cuestión también puede usarse en el tratamiento de una herida del tejido ocular. Generalmente, el daño del tejido córneo, ya sea por enfermedad, cirugía o lesión, puede afectar las células epiteliales y/o endoteliales, dependiendo de la naturaleza de la lesión. Las células epiteliales de la córnea son células epiteliales no queraticinadas forrando la superficie extrema de la córnea y proporcionan una barrera contra el ambiente externo. La curación de las lesiones de la córnea concierne tanto a médicos como investigadores. Los oftalmólogos frecuentemente se enfrentan con distrofias corneales y daños problemáticos que resultan en erosión epitelial persistente y recurrente, frecuentemente llevando a la pérdida endotelial permanente. El uso de formas proliferativas de los agonistas hedgehog en cuestión pueden utilizarse en estos casos para promover la epitelización del tejido de la córnea afectado.
Para ilustrar más, alteraciones específicas generalmente asociadas con el daño celular epitelial en el ojo, y por las que el método en cuestión puede proporcionar un tratamiento beneficioso, incluyen defectos epiteliales de la córnea persistentes, erosiones recurrentes, úlceras neurotróficas de la córnea, queratoconjuntivitis sicca, úlceras microbiales de la córnea, úlceras virales de la córnea, y similares. Los procedimientos quirúrgicos que generalmente causan daño a las capas epiteliales celulares incluyen procedimientos láser realizados sobre la superficie ocular, cualquiera de los procedimientos quirúrgicos refractarios tales como queratotomía radial, y queratotomía astigmática, crisis conjuntivales, transplantes conjuntivales, epiceratoplastia, y raspado de córnea. Además, heridas superficiales tales como arañazos, erosión de la superficie, inflamación, etc. Pueden causar pérdida de células epiteliales. De acuerdo con la presente invención, el epitelio de la córnea está en contacto con una cantidad de agonista hedgehog efectivo para causar la proliferación de las células epiteliales de la córnea para curar apropiadamente la herida.
En otro aspecto de la invención, el método en cuestión puede ser usado para inducir la diferenciación y/o promover la proliferación del tejido derivado epitelialmente. Tales formas de estas moléculas pueden proporcionar una base para la terapia de diferenciación para el tratamiento de condiciones hiperplásicas y/o neoplásicas implicando el tejido epitelial. Por ejemplo, tales preparaciones pueden usarse para el tratamiento de enfermedades cutáneas en las que hay proliferación o crecimiento anormales de células de la piel.
El presente método puede usarse para mejorar la tasa de aceptación "take rate" de un injerto de la piel. Los injertos del tejido epidérmico pueden, si la tasa de aceptación del injerto es muy larga, crear ampollas y escamarse, disminuyendo la probabilidad de que el injerto "tome", es decir se adhiera a la herida y forme una membrana basal con el tejido de granulación subyacente. La tasa de aceptación pueden incrementar por el método en cuestión induciendo la proliferación de los queratinocitos. El método para incrementar los take rates comprende el contacto del autoinjerto de la piel con una cantidad efectiva para cicatrizar la herida de un agonista hedgehog descrito en el método para promover la cicatrización de la herida y en el método para promover el crecimiento y proliferación de los ceratinocitos, como se ha descrito antes.
Los equivalentes de la piel tienen varios usos no solamente como un sustituto para la piel humana o animal para injertos de piel, sino que también como piel de prueba para determinar los efectos de las sustancias farmacéuticas y cosméticos sobre la piel. La principal dificultad en los análisis farmacológicos, químicos y cosméticos es la dificultad para determinar la eficacia y seguridad de los productos sobre la piel. Una ventaja de los equivalentes de la piel de la invención es su uso como un indicador de los efectos producidos por tales sustancias a través de análisis in vitro sobre piel de prueba.
Así, en una realización del método en cuestión se puede usar como parte de un protocolo para injertar piel de, p.ej., áreas desnudas, heridas y quemaduras granuladas. El uso delos agonistas hedgehog pueden promocionar tales técnicas para injertar autoinjertos y autoinjertos epidérmicos (queratinocitos autogénicos de cultivo) y aloinjertos epidérmicos (queratinocitos alogéncios de cultivo). En el caso del aloinjerto, el uso del método en cuestión para promocionar la formación de los equivalentes de la piel en el cultivo ayuda a proporcionar/mantener un suministro inmediato de tales injertos (p.ej., en bancos de tejido) de manera que los pacientes puedan recuperarse en un procedimiento simple con un material que permita que la cicatrización permanente tenga lugar.
En esta consideración, la presente invención también se refiere a equivalentes de tejido vivo de la piel compuestos que comprenden una capa epidérmica de queratinocitos cultivados que se han expandido por tratamiento con un agonista hedgehog. El método en cuestión se puede usar como parte de un proceso para la preparación de equivalentes de piel viva. En una realización ilustrativa, tal método comprende la obtención de una muestra de piel, tratando la muestra de piel enzimáticamente para separar la epidermis de la dermis, tratando la epidermis enzimáticamente para liberar las células de queratinocitos, cultivando, en presencia de un agonista hedgehog, los queratinocitos epidérmicos hasta la confluencia, en paralelo, o separadamente, tratando la dermis enzimáticamente para liberar los fibroblastos, cultivando los fibroblastos hasta la sub-confluencia, inoculando una membrana esponjosa de colágeno entrecruzada porosa con los fibroblastos cultivados, incubando la esponja de colágeno inoculada sobre su superficie para permitir el crecimiento de los fibroblastos a través de la esponja de colágeno, y luego inoculándolo con queratinocitos cultivados, e incubando más el complejo equivalente del compuesto de la piel en presencia de un agonista hedgehog para promover el crecimiento de las células.
En otras realizaciones, las láminas de piel que contienen ambas capas epiteliales y del mesénquima pueden ser aisladas en cultivos y expandirse con medios de cultivo suplementados con una forma proliferativa de un agonista hedgehog. Cualquier muestra de la piel susceptible a técnicas de cultivo celular puede usarse de acuerdo con la presente invención. Las muestras de piel pueden ser autogénicas o alogénicas.
En otro aspecto de la invención, el método en cuestión puede usarse en conjunción con varios procedimientos periodónticos en que se desee el control de la proliferación celular epitelial en y alrededor de los tejidos periodónticos. En una realización, los agonistas hedgehog pueden usarse para promocionar la reepitelialización alrededor de los dientes naturales y prostéticos, p.ej., para promover la formación de tejido de las encías.
Los productos génicos Hedgehog son capaces de regular la maduración de los linfocitos T. Ciertos aspectos de la invención se dirigen a los agonistas hedgehog y sus usos como agentes inmunomoduladores contra ambas alteraciones inmunológicas adquiridas y hereditarias.
Por ejemplo, tales composiciones pueden usarse para incrementar la población de las células T ayudantes a niveles óptimos en el huésped, p.ej., para estimular el sistema inmune del animal. Tales usos de las composiciones en cuestión pueden usarse en el tratamiento de infecciones bacterianas o virales, así como para ayudar al cuerpo a luchar contra las células cancerígenas. Alternativamente, esas sustancias también incapacitan al huésped a regular enfermedades presentes a partir del desarreglo del proceso de auto-reconocimiento en el que hay un ataque excesivo por células T huéspedes contra tejidos endógenos. En tales instancias, las composiciones en cuestión pueden usarse para reducir la proliferación de la población de células T de manera que los signos y síntomas de enfermedades inflamatorias auto-dirigidas (autoimmunes) tales como artritis reumatoide y esclerosis múltiple mejoran.
Como se describe aquí, las proteínas hedgehog inhiben la maduración de linfocitos T. Basado sobre su efecto inhibitorio, la administración de los agonistas hedgehog se sugiere aquí como tratamiento para varios tipos de alteraciones inmunológicas implicando la activación de la inmunidad celular no deseada, p.ej., rechazo de injerto, alteraciones autoinmunes, y similares.
En general, el método de la presente invención comprende la administración a animales, o a linfocitos cultivados in vitro, una cantidad de un agonista hedgehog que produce una respuesta no tóxica de la célula de inhibición de la maduración. El método en cuestión se puede llevar a cabo sobre células que pueden ser dispersadas en cultivo o bien una parte de tejido u órgano intacto. Además, el método puede ser realizado sobre células que son proporcionadas en cultivo (in vitro), o sobre células en un animal entero (in vivo). La invención también se refiere a métodos para controlar la realización funcional de células T mediante el uso de preparaciones farmacéuticas de la invención.
Sin querer que se relacionen mediante ninguna teoría particular, el efecto inhibitorio de hedgehog sobre la maduración de células T puede ser debido al menos a la capacidad de las proteínas hedgehog para antcausar antagonismo (directamente o indirectamente) la regulación mediada por la expresión génica de patched y otros efectos fisiológicos mediados por esta proteína. El producto génico patched, una proteína de la superficie celular, se entiende para señalar a través de una vía a la que causa la represión transcripcional de miembros de las familias Wnt y DppBMP de los morfogenes, proteínas que imparten información posicional. En otros tejidos, la introducción de Hedgehog alivia (desreprime) esta inhibición otorgada por patched, permitiendo la expresión de los programas génicos particulares.
En otro aspecto, la presente invención proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden agonistas hedgehog. Los agonistas hedgehog para el uso en el método en cuestión pueden ser formulados convenientemente para la administración con un medio biológicamente aceptable, tal como agua, salino tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares) o mezclas adecuadas de los mismos. La concentración óptima del principio activo en el medio escogido puede ser determinada empíricamente, de acuerdo con procedimientos bien conocidos por los químicos médicos. Como se usa aquí, "medio biológicamente aceptable" incluye cualquiera o todos los solventes, medio de dispersión, y similares que pueden ser apropiados para la vía de administración deseada de la preparación farmacéutica. El uso de tal medio para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la materia. Excepto en el grado que como cualquier medio o agente convencional es incompatible con la actividad del agonista hedgehog, se contempla su uso en la preparación farmacéutica de la invención. Se describen vehículos adecuados e incluso la formulación de otras proteínas, por ejemplo, en el libro Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Estos vehículos incluyen "formulaciones depósito" inyectables.
Formulaciones farmacéuticas de la presente invención también pueden incluir composiciones veterinarias, p.ej., preparaciones farmacéuticas de los agonistas hedgehog adecuadas para usos veterinarios, p.ej., para el tratamiento de ganado o animales domésticos, p.ej., perros.
Mecanismos recargables o biodegradables también pueden proporcionar métodos de introducción. Se han desarrollado y probado varios mecanismos poliméricos de liberación lenta in vivo en años recientes para fármacos de liberación controlada, incluyendo biofármacos proteináceos. Una variedad de polímeros biocompatibles (incluyendo hidrogeles), incluyendo ambos polímeros biodegradables y no-degradables, pueden usarse para formar un implante para la liberación sostenida en un sitio particular para un agonista hedgehog.
Las preparaciones de la presente invención se pueden dar oralmente, parenteralmente, tópicamente, o rectalmente. Por supuesto se dan mediante formas adecuadas para la vía de administración. Por ejemplo, se administran en comprimidos o cápsulas, mediante inyección, inhalación, loción ocular, ungüento, supositorio, parche de liberación controlada, etc., administración mediante inyección, infusión o inhalación; tópica mediante loción o ungüento; y rectal mediante supositorios. Las administraciones orales y tópicas son preferidas.
Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" como se usa aquí significa modos de administración diferentes de administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, y intraesternal.
Las frases "administración sistémica", "administrado sistémicamente", "administración periférica" y "administrado periféricamente" como se usa aquí significan la administración de un compuesto, fármaco u otro material que no sea directamente en el sistema nervioso central, tal que entre al sistema del paciente y, así, está sujeto al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea.
Estos compuestos pueden ser administrados a humanos y otros animales para la terapia mediante, cualquier vía adecuada de administración, incluyendo oralmente, nasalmente, como mediante, por ejemplo, un vaporizador, rectalmente, intravaginalmente, parenteralmente, intracisternalmente y tópicamente, como mediante polvos, ungüentos ogotos, incluyendo bucalmente y sublingualmente. A pesar de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden ser usados en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en dosis farmacéuticamente aceptables tales como las descritas antes o mediante otros métodos convencionales conocidos por aquellos entendidos en la materia.
Los niveles de dosificación actuales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden variar de tal manera para obtener una cantidad del principio activo el cual es efectivo para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición, y modo de administración, sin ser tóxico para el paciente.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto particular empleado de la presente invención, o el éster, sal o amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales fusionados en combinación con el agonista particular hedgehog empleado, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente que se trata, y factores similares bien conocidos en materias médicas.
Un físico o veterinario entendido ordinariamente en la materia puede determinar rápidamente y prescribir la cantidad efectiva requerida de la composición farmacéutica. Por ejemplo, el físico o veterinario podría empezar dosis de los compuestos empleados de la invención en la composición farmacéutica a niveles inferiores que los requeridos con el fin de conseguir el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosis hasta conseguir el efecto deseado.
En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invención será que la cantidad del compuesto que es la dosis efectiva más baja para producir un efecto terapéutico. Tales dosis efectivas generalmente dependerán de los factores antes descritos. Generalmente, las dosis intravenosos, intracerebroventriculares, y subcutáneas de los compuestos de esta invención para un paciente están en un rango alrededor de 0,0001 hasta alrededor de 100 mg por kilogramo de peso corporal, preferiblemente a partir de alrededor 0,001 hasta alrededor de 10 mg por kilogramo, más preferiblemente a partir de alrededor de 0,01 hasta alrededor de 1 mg por kilogramo.
Si se desea, la dosis diaria efectiva del compuesto activo puede ser administrado como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administrada separadamente a intervalos apropiados durante el día, opcionalmente, en formas de dosificación unitarias.
El término "tratamiento" pretende abarcar también profilaxis, terapia, y cura.
Los pacientes que reciben este tratamiento es algún animal con necesidad, incluyendo primates, en particular humanos, y otros mamíferos tales como equinos, ganado, cerdos y ovejas; y aves de corral y animales domésticos en general.
El compuesto de la invención puede ser administrado tal como o en mezclas con transportadores farmacéuticamente aceptables y/o transportadores estériles y pueden ser administrados en conjunción con otros agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas, aminoglicósicos, y glicopéptidos. La terapia conjunta, así incluye administración secuencial, simultánea y separada del principio activo de una manera que los efectos terapéuticos de del primero administrado no desaparece completamente cuando el se administra el subsiguiente.
V. Composiciones farmacéuticas
Mientras sea posible que un compuesto de la presente invención se administre sólo, es preferible administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición). Los agonistas hedgehog de acuerdo con la invención pueden ser formulados para administración de cualquier manera para el uso en medicina humana o veterinaria. En ciertas realizaciones, el compuesto incluido en la preparación farmacéutica puede ser activo por sí mismo, o puede ser un profármaco, p.ej., capaz de ser convertido a un principio activo en un entorno fisiológico.
Así, otro aspecto de la presente invención proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de los compuestos descritos antes, formulados junto con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables (aditivos) y/o diluyentes. Como se han descrito con detalle antes, las composiciones farmacéuticas de la presente invención puede ser especialmente formulada para la administración en formas sólidas o líquidas, incluyendo aquellos adaptados para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, drenajes (soluciones o suspensiones acuosas o no-acuosas), comprimidos, píldoras, granulados, pastas para aplicación en la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento o vaporizador aplicado a la piel; o (4) intravaginalmente o intrarectalmente, por ejemplo, como un supositorio vaginal, crema o espuma. Sin embargo, en ciertas realizaciones los compuestos en cuestión pueden ser simplemente disueltos o suspendidos en agua estéril. En ciertas realizaciones, la preparación farmacéutica no es pirogénica, es decir, no eleva la temperatura corporal de un paciente.
La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" como se ha usado aquí significa que la cantidad de un compuesto, material, o composición que comprende un compuesto de la presente invención que es efectivo para producir algún efecto terapéutico deseado en al menos una sub-población de células en un animal y de ese modo bloquea las consecuencias biológicas de esta vía en las células tratadas, una proporción beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea aquí para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del juicio médico, adecuadas para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, conmensurada con una proporción beneficio/riesgo razonable.
La frase "transportador farmacéuticamente aceptable" como se ha usado aquí significa un material farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo, tal como un relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante, implicado en llevar o transportar los agonistas en cuestión desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada transportador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, celulosa de etilo y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y grasas para supositorios (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja, (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de tampón fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Como se ha propuesto antes, ciertas realizaciones de los agonistas hedgehog presentes pueden contener un grupo funcional básico, tal como amino o alquilamino, y son, así, capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en este respecto se refiere a a sales de adición ácidas, relativamente no-tóxicas, inorgánicas y orgánicas de la presente invención. Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos de la invención, o separadamente por reacción de un compuesto purificado de la invención en su forma de base con un ácido orgánico o inorgánico adecuado y asilando la sal así formada. Sales representativas incluyen sales de hidrobromuro, hidrocloruro, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, esterato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, y laurilsulfonato y similares. (Ver, por ejemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19)
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos en cuestión incluyen las sales convencionales no tóxicas o sales de amonio cuaternarias de los compuestos, p.ej., de ácidos orgánicos o inorgánicos no-tóxicos. Por ejemplo, tales sales no tóxicas convencionales incluyen aquellos derivados de ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico, y similares; y sales preparadas a partir de ácidos orgánicos tales como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico; benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etandisulfónico, oxálico, isotiónico, y similares.
En otros casos, los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más grupos funcionales acídicos y, así, son capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en estas instancias se refiere a sales de adición básicas no-tóxicas, inorgánicas y orgánicas de compuestos de la presente invención. Estas sales también pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos, o separadamente por reacción del compuesto purificado en su forma de ácido libre con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, con amonio, o con una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria farmacéuticamente aceptable. Sales alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio, y sales de aluminio y similares. Aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales básicas de adicción incluyen etilamina, dietilamina, etilenediamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares. (Ver, por ejemplo, Berge et al., supra)
Agentes humectantes, emulsificantes y lubricantes, tales como laurilsulfato sódico y estereato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes decubierta, edulcorantes, flavorantes y agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones.
Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, hidroclorato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfato de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilatado (BHA), hidroxitolueno butilatado (BHT), lecitina, propilgallato, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.
Formulaciones de la presente invención incluyen aquellos aquéllas adecuadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden ser presentadas convenientemente en formas de dosificaciones unitarias y pueden ser preparadas por cualquier método bien conocido en la materia de farmacia. La cantidad de principio activo que puede ser combinada con un material transportador para producir una forma de dosis simple variará dependiendo del huésped que sea tratado, el modo particular de administración. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material transportador para producir una forma de dosificación simple generalmente será esta cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. Generalmente, fuera del cien por cien, esta cantidad oscilará desde alrededor del 1 por ciento a alrededor del noventa y nueve por ciento de principio activo, preferiblemente desde alrededor del 5 por ciento a alrededor del 70 por ciento, más preferiblemente desde alrededor del 10 por ciento a alrededor del 30 por ciento. Los métodos de preparación de estas formulaciones o composiciones incluyen el paso de llevar a la asociación de un compuesto de la presente invención con el transportador y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan uniformemente e íntimamente llevando a la asociación de un compuesto de la presente invención con transportadores líquidos, o transportadores sólidos divididos finamente, o ambos, y luego, si es necesario, modelando el producto.
Las formulaciones de la invención adecuadas para administración oral pueden ser en la forma de cápsulas, cápsulas, píldoras, comprimidos, pastillas (usando una base saborizante, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto), polvos, granulados, o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o como lavados de boca y similares, cada uno conteniendo una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como un principio activo. Un compuesto de la presente invención también puede ser administrado como un bolo, A compound of the present invention may also be administered as a bolus, electuario o pasta.
En formas de dosificación sólida de la invención para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, granulados y similares), el principio activo se mezcla con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico, y/o cualquiera de los siguientes: (1) rellenos o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o ácido salicílico; (2) agregantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tales como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato sódico; (5) agentes retardantes en solución, tales como parafina; (6) aceladores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, cetil alcohol y glicerol monostearato; (8) absorbentes, tales como caolina y arcilla de bentonita, (9) lubricantes, tales como talco, etereato de calcio, estereato de magnesio, glicoles de polietileno sólidos, laurildulfato sódico, y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes tamponantes. Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden ser empleadas como rellenos en cápsulas de gelatina blandas o duras usando tales excipientes como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Un comprimido puede estar hecho por compresión o moldeamiento, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos pueden prepararse usando agregantes (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, desintegrante (por ejemplo, glicolaro de almidón de sodio o carboximetilcelulosa sódica entrecruzada), agente activo de superficie o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden estar hechos moldeando en una máquina adecuado una mezcla del compuesto en polvos humedecidos con un diluyente líquido inerte.
Los comprimidos, y otras formas de dosificación sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, tales como grageas, cápsulas, píldoras y granulados, opcionalmente pueden ser evaluados o preparados con cubiertas y capas, tales como cubiertas entéricas y otras cubiertas bien conocidas en la materia de la formulación farmacéutica. También pueden ser formulados de tal manera para proporcionar principios activos de liberación lenta o controlada usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en proporciones variantes para proporcionar un perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Pueden ser esterilizados por, por ejemplo, filtración a través de un filtro retenedor de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en agua estéril, o algún medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición que liberan el principio activo solamente, o preferentemente, en una porción determinada del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de una manera retardada. Ejemplos de las composiciones de imbibición que pueden usarse pueden incluir sustancias poliméricas y ceras. El principio activo también puede ser de forma microencapsulada, si se apropia, con uno o más de los excipientes antes descritos.
Las formas de dosificación líquidas para administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires. Además del principio activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la materia, tales como, por ejemplo, agua o otros solventes, agentes solubilizantes y emulsificantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, semilla de algodón, cacahuete, maíz, aceites de germen, oliva, castor y sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurilo, polietilenglicols y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y mezclas de mismos.
Excepto diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, emulsificantes y agentes suspensores, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y agentes conservantes.
Las suspensiones, además de los compuestos activos como, por ejemplo, alcoholes etoxilados de isostearilo, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanta, y mezclas de los mismos.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la invención para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede ser preparado mezclando uno o más compuestos de la invención con uno o más excipientes o transportadores no irritantes que comprenden, por ejemplo, tampón de cacao, polietilenglicol, una cera para supositorios o un salicilato, y que es sólido a temperatura ambiente, pero líquido a temperatura corporal y, por tanto, se fundirá en la cavidad del recto o la vagina y liberará el agonista hedgehog activo.
Las formulaciones de la presente invención que son adecuados para la administración vaginal también incluyen formulaciones supositorios vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o vaporizadores que contienen tales transportadores como se conocen en la materia para ser apropiados.
Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen polvos, vaporizadores, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede ser mezclado bajo condiciones estériles con un transportador farmacéuticamente aceptable, y con cualquiera de los conservantes, tampones, o propelentes que pueden ser requeridos.
Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo de esta invención, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, grasas, parafina, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido de silicio, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y los vaporizadores pueden contener, además de un compuesto de esta invención, excipientes tales como lactosa, talco, ácido de silicio, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los sprays adicionalmente contienen propulsores, tales como clorofluorohidrocarbonos e hidrocarbonos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano. Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar liberación controlada de un compuesto de la presente invención al cuerpo. Tales formas de dosificación pueden hacerse disolviendo o dispersando los agonistas hedgehog en el medio próximo. Los potenciadores de la absorción también pueden usarse para incrementar el flujo de los agonistas hedgehog a través de la piel. La proporción de tal flujo puede ser controlado proporcionando una tasa que controla la membrana o dispersando el compuesto en una matriz o gel polimérico.
Las formulaciones oftálmicas, ungüentos oculares, polvos, soluciones y similares, también se contemplan como para estar dentro del alcance de esta invención.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención adecuadas para administración parenteral comprenden uno o más compuestos de la invención en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables acuosas o no acuosas, o polvos estériles que pueden ser reconstituidos en soluciones inyectables o dispersiones justo antes de usarlas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor previsto o agentes suspensores o espesantes.
Ejemplos de transportadores adecuados acuosos o no acuosos que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propileno glicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales para la cubierta, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de surfactantes.
Estas composiciones, también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de mircroorganismos puede estar asegurada por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico, y similares. También se puede desear incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico, y similares dentro de las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede llevarse por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestereato de aluminio y gelatina.
En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, se desea enlentecer la absorción del fármaco desde la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede llevarse a cabo mediante el uso de una suspensión líquida de materila cristalino o amorfo que tiene un solubilidad en agua pobre. La tasa de absorción del fármaco depende de su velocidad de disolución que, de hecho, puede depender del tamaño de cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma farmacéutica administrada parenteralmente se realiza disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo aceitoso.
Las formas inyectables de depósito están hechas formando matrices microencapsuladas de los compuestos en cuestión en polímeros biodegradables tales como polilacturo-poliglicoluro. Dependiendo de la proporción de fármaco apolimerizar, y la naturaleza del polímero particular empleado, la proporción de fármaco liberado, puede ser controlada. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de inyectables de depósito también se preparan trampeando en fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.
Cuando los compuestos de la presente invención se administran como fármacos, a humanos y animales, pueden ser dados por sí o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, 0,1 a 99,5% (más preferible, 0,5 a 90%) de principio activo en combinación con un transporador farmacéuticamente aceptable.
La adición del compuesto activo de la invención a la alimentación animal preferiblemente se lleva a cabo preparando un alimento apropiado premezclado que contenga el compuesto activo en una cantidad efectiva e incorporando la premezcla en la ración completa.
Alternativamente, un concentrado intermediario o un suplemento alimenticio que contiene el principio activo pueden ser combinado con el alimento. La manera en que tales premezclas alimenticias y las raciones completas pueden ser administradas se describen en libros de (tales como "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and CO., San Francisco, U.S.A., 1969 o "Livestock Feeds and Feeding" O y B books, Corvallis, Ore., U.S.A., 1977).
VI. Esquemas sintéticos e identificación de agonistas activos
Los inhibidores en cuestión, y congéneros de los mismos, pueden ser preparados rápidamente empleando las tecnologías acoplamiento de Suzuki, Stille, y similares. Estas reacciones de acoplamiento se llevan a cabo bajo condiciones relativamente suaves y toleran un amplio rango de la funcionalidad "espectadora".
a. Bibliotecas combinatorias
Los compuestos de la presente invención, particularmente bibliotecas de variantes que tienen varias clases representativas de sustituyentes, son susceptibles a la química combinatoria y otros esquemas de síntesis paralelos (ver, por ejemplo, PCT WO 94/08051). El resultado es que grandes bibliotecas de compuestos relacionados, p.ej., una biblioteca variegada de compuestos representados antes, pueden ser cribados rápidamente en ensayos de alto rendimiento con el fin de identificar compuestos principales potenciales agonistas de hedgehog, así como para refinar la especificidad, toxicidad y/o el perfil citotóxico-cinético de un compuesto principal. Por ejemplo, los ensayos de bioactividad de ptc, hedgehog, o smoothened pueden usarse para cribar una biblioteca de los compuestos en cuestión para aquéllos que tienen actividad antagonista hacia ptc o actividad agonista hacia hedgehog o smoothened.
Simplemente para ilustrar, una biblioteca combinatoria para los propósitos de la presente invención es una mezcla de compuestos relacionados químicamente que pueden ser cribados juntos para una propiedad deseada. La preparación de algunos compuestos relacionados en una reacción simple reduce y simplica perfectamente el número de procesos de cribado que necesitan ser realizados. El cribado para las propiedades físicas apropiadas puede hacerse mediante métodos convencionales.
La diversidad en la biblioteca puede crearse a una variedad de diferentes niveles. Por ejemplo, el sustrato de grupos arilo usados en las reacciones combinatorias pueden ser diversas en términos del núcleo de la porción arilo, p.ej., una variedad en términos de la estructura del anillo, y/o puede variar con respecto a los otros sustituyentes.
Una variedad de técnicas están disponibles en la materia para generar bibliotecas combinatorias de moléculas orgánicas pequeñas tales como los hedgehog en cuestión. Ver, por ejemplo, Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14;83; las Patentes estadounidenses de Affymax 5,359,115 y 5,362,899: la Patente Estadounidense de Eliman 5,288,514: el Still et al. Publicación PCT WO 94/08051; las Patentes Estadounidense de ArQule 5,736,412 y 5,712,171; Chen et al. (1994) JACS 116:2661: Kerr et al. (1993) JACS 115:252; publicaciones PCT W092/10092, W093109668 y W091/07087; y el Lerner et al. Publicación PCT W093/20242). Por consiguiente, una variedad de bibliotecas en el orden de alrededor de 100 a 1.000.000 o más diversómeros de los agonistas hedgehog en cuestión puede ser sintetizada y cribada para actividades o propiedades particulares.
En una realización ejemplar, una biblioteca de los diversómeros candidatos de los agonistas de hedgehog pueden ser sintetizados utilizando un esquema adaptado a las técnicas descritas en el Still et al. Publicación PCT WO 94/08051, p.ej., siendo unidos a una cuenta polimérica por un grupo hidrolizable o fotolizable, opcionalmente localizado a una de las posiciones de los agonistas candidatos o un sustituyente de un intermediario sintético. De acuerdo con la técnica Still et al., la librería se sintetiza en un conjunto de cuentas, cada cunta incluyendo un grupo de tags que identifican el diversómero particular sobre esa cuenta. La biblioteca de cuentas luego puede ser "plaqueada" con células que responden a hedgehog. Los diversómeros también pueden ser liberados desde la cuenta, p.ej., por hidrólisis.
Las estructuras de los compuestos útiles en la presente invención dan por ellas mismas fácilmente una síntesis eficiente. La naturaleza de las estructuras de los compuestos en cuestión, como generalmente se han citado antes, permite el ensamblaje combinatorio rápido de tales compuestos. Por ejemplo, como en el esquema publicado más adelante, un grupo arilo activado, tal como un triftato o bromuro de arilo, unido a una cuenta o otro soporte sólido que pueda unirse a otro grupo arilo realizando un acoplamiento de Stille o Suzuki con un estanano de arilo o un ácido arilborónico. Si el segundo grupo arilo se funcionaliza con un aldehído, un sustituyente amina puede añadirse a través de una aminación reductora. Alternativamente, el segundo grupo arilo podría ser funcionalizado con un grupo saliente, tales como un triflato, tosilato, o haluro, capaces de ser reemplazados por una amina. O, el segundo grupo arilo puede ser funcionalizado con un grupo amino capaz de llevar a cabo la aminación reductora con una amina, p.ej., CyKNH_{2}. Otras técnicas posibles acoplantes incluyen las reacciones de aminoarilación mediadas por metales. La amina secundaria resultante luego además puede ser funcionalizada por una acilación, alquilación, o arilación para generar una amina o amida terciaria que luego puede ser dividida a partir de la resina o el soporte. Las reacciones que generalmente son suaves y se han aplicado exitosamente en esquemas de síntesis combinatoria en fase sólida. Además, el amplio rango de sustratos y parejas de acoplamiento adecuadas y disponibles para estas reacciones permite el rápido ensamblaje de diversas grandes bibliotecas de compuestos para probar en ensayos publicados aquí. Para ciertos esquemas, y para ciertas sustituciones sobre los varios sustityentes de los compuestos en cuestión, un entendido en la materia reconocerá la necesidad de enmascarar ciertos grupos funcionales con un grupo protector adecuado. Tales técnicas son bien conocidas en la materia y se aplican fácilmente a los esquemas de síntesis combinatoria
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Algunas variaciones sobre los mecanismos anteriores y relacionados permiten la síntesis de diversas bibliotecas de compuestos que pueden ser probados como agonistas de la función de hedgehog.
b. Ensayos de cribado
Hay una variedad de ensayos disponibles para determinar la capacidad de un compuesto para producir antagonismo de la función ptc o agonismo en la función smoothened o hedgehog, algunos de los cuales pueden estar dispuestos en los formatos de alto rendimiento. En algunos programas de cribado de fármacos que prueban bibliotecas de compuestos y extractos naturales, se quieren ensayos de alto rendimiento con el fin de maximizar el número de compuestos investigados en un periodo dado de tiempo. Así, las bibliotecas de bibliotecas de productos sintéticos y naturales pueden ser probados para otros compuestos que sean agonistas hedgehog.
Además de ensayos libres de células, los compuestos de prueba también pueden ser probados en ensayos basado en células. En una realización, la célula sensible a la adición de la proteína hedgehog puede contactar con un agente test de interés, con la evaluación del ensayo para, p.ej., promocionar la proliferación de la célula en presencia del agente de prueba.
Un número de productos génicos han sido implicados en la transducción de señales mediada por patched, incluyendo patched, los factores de transcripción de la familia cubitus interruptus (ci), la quinasa de serina/treonina fusionada (fu) y los productos génicos de costal-2, smoothened y suppressor of fused.
La inducción de células mediante proteínas hedgehog pone en marcha una cascada implicando la activación e inhibición de efectores corriente abajo, la última consecuencia de que es, en algunos casos, un cambio detectable en la transcripción o traducción de un gen. Dianas transcripcionales potenciales de la señalización mediada por hedgehog son el gen patched (Hidalgo y Ingham, 1990 Development 110, 291-301; Marigo et al., 1996) y los homólogos vertebrados del gen de la drosophila cubitus interruptus, los genes Gli (Hui et al. (1994) Dev Biol 162:402-413). Se ha mostrado que la expresión del gen Patched induce células de la yema de la extremidad y la placa neural que son sensibles a Shh. (Marigo et al. (1996) PNAS, 93:9346-51; Marigo et al. (1996) Development 122:1225-1233). Los genes Gli codifican los supuestos factores de transcripción que tienen dominios de unión al DNA de dedos de zinc (Orenic et al. (1990) Genes & Dev 4:1053-1067; Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol 10:634-642). La transcripción del gen Gli se ha dado para ser sobreregulado en respuesta a hedgehog en yemas de extremidades, mientras que la transcripción del gen Gli3 está sub-regulada en respuesta a la inducción de hedgehog (Marigo et al. (1996) Development 122:1225-1233). Seleccionando las secuencias regulatorias transcripcionales a partir de tales genes diana, p.ej., a partir de patched o Gli, que son sensibles a la sobre- o sub-regulación de aquellos genes en respuesta a la señalización de hedgehog, y operablemente unidos a tales promotores a un gen marcador, se puede derivar un ensayo basado en la transcripción que es sensible a la capacidad de un compuesto prueba específico para modificar las vía de señalización mediadas por hedgehog. La expresión de los genes marcadores, así, proporciona una herramienta valiosa de cribado para el desarrollo de compuestos que actúan como agonistas de hedgehog.
Los ensayos basados en genes marcadores miden el final del estadio de la cascada de eventos antes descrita, p.ej., la modulación transcripcional. En consecuencia, en la práctica de una realización del ensayo, un constructo del gen marcador se inserta en la célula reactiva con el fin de generar una señal de detección dependiente de la activación de la vía hedgehog, o estimulación por Shh por sí mismo. La cantidad de la transcripción desde el gen marcador puede ser medida usando cualquier método conocido por aquellos expertos de la materia que sea adecuado. Por ejemplo, la expresión del mRNA del gen marcador puede ser detectada usando protección de RNA o protección de RNAasa, o el producto proteico del gen marcador puede ser identificado mediante una marca característica o una actividad biológica intrínseca. La cantidad de la expresión de los genes reporteros luego está comparado con la cantidad de expresión en la misma célula en ausencia del compuesto de prueba o puede ser comparado con la cantidad de transcripción en una célula sustancialmente idéntica que le falta la proteína receptora diana. Cualquier incremento estadístico o por lo contrario significativo en la cantidad de la transcripción indica que el compuesto de prueba tiene de alguna manera antagonizada la señal normal ptc (o agonizada la señal hedgehog o smoothened), p.ej., el compuesto de prueba es un agonista potencial hedgehog.
Ejemplificación
La invención que ahora se está describiendo generalmente, se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen meramente para proposiciones de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención.
En la sección experimental de más abajo, el término "proteína Hh" se usa para designar octil-Shh-N, una forma lipofílica de un fragmento derivado de bacterias de la proteína humana sonic hedgehog (aminoácidos 24-198, Shh-N). Específicamente, Shh-N se ha unido covalentemente in vitro mediante su cisteína amino-terminal a un grupo octilmaleimida. Esta forma modificada, como otras descritas recientemente (Pepinsky et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 14037-45) exhiben la potencia específica más alta que el fragmento no modificado correspondiente en varios ensayos basados en células de señalización hedgehog.
Cribado de compuestos
Para medir la actividad agonista hedgehog de compuestos, usamos células [10T1/2(s12)] que contienen la construcción marcadora Gli-Luc sensible a hedgehog. En cada MTP (MicroTiter Plate; 96-well plate), 10.000-20.000 células por pocillo se colocaron en placas, en medio completo (10% de FBS). Después de alrededor de 24-48hr, las placas se cambiaron a un medio bajo en suero (=0,5% FBS). Subsiguientemente, un compuesto de prueba se añadió a 1-5 PM en presencia o ausencia de octil-hedgehog (ver abajo). Tras otras 24hr, el medio se deshizo de las MTPs y se reemplazó con mezcla del ensayo con luciferasa, que contenía tampón de lisis con sustrato luciferasa. Las placas se incubaron a TA durante alrededor de 15-30 min y se leyeron en un luminómetro.
Cribado A
Las placas se incubaron durante 48hr antes del cambio a contenido en suero bajo. Los compuestos se cribaron a 1-2 \muM en presencia de la proteína Hh (0,01 \mug/ml; EC30 = alrededor del 30% de la actividad inducida máxima)
Cribado B
Las placas se incubaron durante 24hr antes del cambio a conentido en suero bajo. Los compuestos se cribaron a 5 \muM sin añadir la proteína Hh.
Contaje por visualización de Compuestos (SV-Luc)
Para el contaje por visualización usamos las células [10T1/2(SV-Luc)] que contienen un casete de expresión de la luciferasa SV40 que permite un nivel constitutivo de actividad luciferasa en las células. Este ensayo permite ensayar la especificidad de los compuestos seleccionados en el ensayo Gli-Luc, es decir, si los compuestos estimulan específicamente la vía de señalización hedgehog solamente, o construcciones de marcadores en general. Las placas y el cultivo celular así como el manejo del compuesto se realizaron como en el ensayo Gli-Luc. En este ensayo, no se añadió ninguna proteína Hh porque la construcción del marcador ya está constitutivamente activo.
A partir del cribado A, identificamos dianas en las Figuras 32 y 33. La subunidad 1,4-diaminociclohexano de los compuestos de la Figura 32 que incluyen esta fracción tienen los dos sustituyentes amino dispuestos en una realación trans, p.ej., ambos sustituyentes ecuatoriales sobre la subunidad de ciclohexano. Estas dianas se confirmaron en el Cribado B. Los datos mostrados en las Figuras 34a y 34b esencialmente implicadas que dosifican los dos compuestos en ambos ensayos (Gli-Luc & SV-Luc).
Los datos a partir del cual el ensayo Gli-Luc se convierte en la actividad porcentual donde la actividad completa con la proteína Hh se encuentra al 100% (Figura 35; Tabla 1). Los datos muestran que los dos compuestos estimulan la actividad significativamente a partir de la construcción marcadora Gli-luc (es decir, activar la señalización hedgehog) casi en ausencia de la proteína Hh; el rango de concentración 0,1-15 \muM, EC50 = 2 \muM, EC_{r}.. = 50-70% de actividad inducida máxima con la proteína Hh). Además, el compuesto, muestra una inducción más destacada en presencia de hedgehog (EC50 = 0,2-0,3 pM, EC. = 70-90% de la actividad máx inducida con la proteína Hh), indicando una sinergia entre los compuestos y la proteína Hh, consistente en los compuestos que sirven como agonistas para la vía hedgehog.
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TABLA 1
Compuesto EC50 (\muM) Compuesto EC50 (\muM)
A A' <10
B <10 B' <10
C <1 C' <10
D <0,1 D' <10
E <10 E' <10
F <10 F' <10
G <10 G' <10
H <1 H' >10
I >10 I' <1
J <1 J' <1
K <1 K' <10
L <0,05 L' <0,05
M <1 M' <10
N <1 N' <1
O <1 O' <1
P <1 P' <1
Q <1 Q' <1
R <1 R' <0,05
S <1 S' <0,1
T <10 T' <0,5
U <10 U' <1
TABLA 1 (continuación)
Compuesto EC50 (\muM) Compuesto EC50 (\muM)
V <0 V' <1
W <10 W' <10
X <10 X' <10
Y <10 Y' <10
Z <10 Z' <10
A'' <10 B'' <10
C'' <10 D'' <10
E'' <10 F'' <0,1
G'' <0,1 H'' <0,1
I'' <0,1 J'' <0,5
K'' <0,5 L'' <1
M'' <1 N'' <1
O'' <1 P'' <10
Q'' <1 R'' <1
S'' <10 T'' <10 
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Los datos del ensayo SV-Luc (Figura 35) indican que los dos compuestos no afectan la actividad luciferasa sobre el rango de concentraciones (más de 15 \muM) probado, sugiriendo que los compuestos no estimulan la actividad de una construcción del marcador de por sí, pero son probablemente específicos a la vía hdgehog. También, la actividad no afectada sugiere que los compuestos no son intrínsecamente tóxicos a las células.
Agonista Hh: Medida Cuantitativa de la RT-PCR de la sobreregulación de Gli
Los compuestos de las Figuras 32 y 33 se probaron por su capacidad para activar la transcripción de dos dianas bien estudiadas de la vía Hedgehog: el factor de transcripción Gli-1, y el componente Ptc-1 del receptor Hedgehog putativo. Como se representa en la Figura 35, encontramos que, a una concentración de compuesto de 8 \muM, la inducción de ambas dianas fue aproximadamente del 60% para el compuesto B p-cianofenil y 40% para el compuesto A m-nitrofenil que se obtuvo con la concentración óptima de proteína Hh.
Los ensayos se realizaron como sigue:
Se sembraron células C3H 10T1/2 murinas en una densidad de 200.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos en medio completo (10% FBS). Tras 24 hr, se eliminó el medio y se reemplazó con medio de "deprivación" (0,5% FBS) conteniendo diluciones del compuesto o proteína Hh. Tras 16-18 hr, El RNA total se preparó usando TriZol (Life Technologies, inc.).
Alícuotas de un microgramo de RNA total se usaron para preparar cDNAhexámero-cebado aleatorio con transcriptasa reversa M-MTV (Life Technologies, Inc.).
Para medir los niveles relativos de transcritos Gli-1 y Ptc-1, los ensayos TaqMan (PE Biosystems) se realizaron con un Sistema de Detección de Secuencias ABI Prism 7700. Como control interno, los niveles del transcrito GAPDH se midieron simultáneamente en cada reacción. Los datos se analizaron usando el Detector de Secuencia v1.6.3 (Perkin Elmer).
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Inducción de proliferación precursor cerebelar de neurona por mecanismo de señalización agonista Hedgehog
Para probar la eficacia de los mecanismos de señalización Hedgehog, se determinó la capacidad de los agonistas para estimular la proliferación de los precusores de neurona cerebelar. Se sabe que los precusores de neurona granular cerebelar responden a la proteína Hh mediante proliferación. Para probar los agonistas, se diseccionaron neuronas cerebelares de los cerebros de ratas después del nacimiento (una semana), y se colocaron en cultivos de células primarias. Se añadieron una vez agentes de tratamiento, durante el primer día de cultivo (0 DIV). Las células se dejaron en cultivo hasta 2 DIV, cuando se añadió 3H-timidina durante 5 horas; la incorporación por parte de las células de esta 3H-timidina proporciona una medida del nivel de proliferación de las células. Entonces se lisaron las células, y se determinó la incorporación de 3H-timidina. El control positivo fue la proteína Hh, a una concentración final de 1,0 \mug/ml. La proteína Hh sola provocó un aumento de aproximadamente 20 veces en la incorporación de 3H-timidina, consecuente con la conocida capacidad de Shh de estimular la proliferación de estas células. Las células estimuladas de proteína no Hh, incluyendo las células tratadas con el vehículo de control (DMS0), tuvieron unos niveles muy bajos de proliferación. Sin embargo, se encontró que dos de los agonistas Hh en la Figura 32 que se probaron, A y B, estimulaban considerablemente la incorporación de 3H-timidina en ausencia del tratamiento de proteína Hh, tal y como se representa en la Figura. A 5,0 \muM, el compuesto p-cianofenil B provocó una inducción de 10,2 veces más de la incorporación de 3H-timidina. La Figura 37 muestra que el agonista D también estimuló fuertemente la incorporación de 3H-timidina en ausencia Shh. A 1,0, 0,3, o 0,1 \muNI, D provocó una inducción de 16-, 17-, o 13- veces más, respectivamente, de la incorporación de 3H timidina en las células. Estas observaciones demuestran que los agonistas hedgehog pueden estimular reacciones biológicas hedgehog conocidas en células diana.
Ensayo de compresión de nervios
Los ratones machos CD-1 fueron anestesiados con Avertina, 240 mg/kg IP. Se afeitó y limpió la zona del lado ventral de la pata del ratón alrededor de la rodilla con 70% de etanol para eliminar el pelo y después se fregó con Betadine. La piel sobre el muslo se sostuvo con fórceps y se utilizaron unas tijeras pequeñas para hacer un corte en la piel de ¼ pulgada(\sim6mm). Se quitó la grasa para exponer el nervio femoral, la arteria y la vena. Con las puntas de los fórceps curvos a #7 apuntando hacia abajo, se diseminó el músculo justo por debajo de la arteria/vena femoral para dejar ver el nervio ciático en lo profundo del músculo. Mientras se usaba un par de fórceps para aguantar el músculo a parte, se utilizó un segundo para subir cuidadosamente el nervio. Se fue con cuidado para no levantar las fibras del músculo. Los fórceps se abrieron y cerraron 3 veces para separar el nervio del músculo. Se aguantó el nervio levantado del músculo con los fórceps curvos y se pinzaron los hemostatos al nervio para mantenerlo en medio de los hemostatos. Los hemostatos se mantenieron en el lugar durante 10 segundos. Así, ambos nervios ciáticos se presionaron aproximadamente 1+cm por encima de la rodilla (y ramificaciones). Se dejaron de sujetar los hemostatos y el nervio reayó en el músculo. Se utilizó una punta pequeña de pipeta(P2) para aplicar una cantidad pequeña de tinte para marcar tejidos histológicos a la zona presionada. Se utilizó una pinza quirúrgica para cerrar la incisión. Se fue con cuidado para no pinzar la piel al músculo. Las pinzas se dejaron en su lugar durante todo el experimento.
Se realizó cirugía de control a un grupo de ratones. Esto implicó levantar el nervio con los fórceps y dejarlo recaer en su lugar sin ninguna compresión. Este lugar también se puede marcar con el tinte histológico.
El tratamiento con medicamentos empezó el mismo día de la cirugía. Para la proteína Shh, se administró una fusión de proteína de Shh e inmunoglobina (tal y como se describe en la Solicitud Provisional Estadounidense No. 60/164025, incorporada aquí por referencia) a una dosis de 1 mg/kg en una solución de PBS, se dio una inyección subcutánea en medio del lomo del animal con un indicador de 28, jeringa de insulina de ½cc y se repitió durante cada día hasta el día 12-13. (La recuperación fue completa hasta entonces.) Para la administración de agonista, se liberó mediante una minibomba (1 \muL/hora), una solución del agonista en 43% DMSO/PBS (Figuras 38A y 39B), o en 10% DMSO/agua (Figuras 38B y 39D). Los ensayos de comportamiento se iniciaron el día 4 post cirugía y continuaron hasta el día 12 o 13.
Ensayos de comportamiento - Ensayo de agarre
Se situó un ratón en una rejilla cableada de metal de 8''x8'' (similar a una rejilla de tubos de ensayo) con oberturas de 1cm, y la rejilla se invirtió lentamente 10 veces con un movimiento constante. Se anotó número de veces que el ratón falló a la hora de agarrarse con sus extremidades izquierda y derecha. Se apartó el ratón de los bordes de la rejilla y se volvió a colocar bien en la rejilla cuando fue necesario. Si el ratón enganchó su pata alrededor o a través de la reja se consideró como fallo. Se repitió una inversión si el ratón estaba caminando, y falló al agarrarse a la rejilla.
Los fallos de la pata izquierda y derecha se juntaron con otros animales de ese grupo experimental (6 animales/grupo x 2 puntuaciones de agarre de pata/animal = 12 puntuaciones de agarre/grupo en cualquier punto temporal dado). Los resultados para el agonista D se describen en la Figura 38A. Los animales se trataron con vehículo sólo generalmente empezaron a recuperarse por sí solos al día 9 post-cirugía. La Figura 38B describe los resultados obtenidos usando agonista D disuelto en un vehículo de 10% DMSO/agua en el protocolo de tratamiento.
Ensayo de comportamiento - mediciones de la extensión del dedo
Las mediciones de la extensión del dedo comenzó el día 4 post-cirugía y se midió cada día. El ratón se sostuvo por la parte proximal de la cola y se le permitió mantenerse sobre el cable superior de la jaula con sus extremidades frontales. Se utilizó un pequeño pincel o aplicador de algodón para pintar los dedos y almohadillas de las patas traseras del ratón. Se permitió caminar al ratón a través de de una hoja de papel limpia, para dejar al menos dos imprentas claras de cada extremidad trasera. Usando una regla, se dibujó una línea a través de las imprentas de dedos más amplia de cada pie y se midió la distancia entre ellas. A medida que el animal se recuperaba, la distancia aumentó hasta medidas normales.
Se hicieron las medias de las puntuaciones de las patas izquierda y derecha y se juntaron con la de los otros animales de ese grupo experimental (6 animales/grupo x 2 puntuaciones de extensión de dedos/animal = 12 puntuaciones de extensión de dedos/ grupo en cualquier punto temporal dado). Los resultados usando agonista D se describen en las Figuras 39A y B. La Figura 39D describe los efectos del agonista D disuelto en un vehículo de 10% DMSO/agua en este protocolo.
Ensayos de Ratones Indicadores
Ratones con un transgen \beta-galactosidasa (ratones ptc-lacZ) bajo el control regulatorio del locus patched expresa la proteína \beta-galactosidasa en las mismas células en las que el gen patched de ratón endógeno se expresa. La proteína \beta-galactosidasa puede así utilizarse como un indicador fiel de la expresión del gen patched endógeno. El gen patched es un componente conocido de la ruta de señalización hedgehog y está sobreregulado cuando la ruta hedgehog está activada. Así, en los ratones ptc-lacZ la proteína \beta-galactosidasa está sobreexpresada ya que la ruta hedgehog está activada, resultando en una tinción azul más intensa, (debido a mayores niveles del enzima \beta-galactosidasa) cuando los tejidos están teñidos para la actividad enzimática con el sustrato X-gal.
Los ratones Ptc lacZ se dividieron en cuatro grupos de tratamiento y se trataron con los siguientes compuestos o combinación de compuestos o durante cuatro días, empezando el primer día tras el nacimiento (dipal-Shh = Sonic hedgehog dipalmitoilado):
1) dipal-Shh 10 mg/kg/inyección 2X/día
2) dipal-Shh 1 mg/kg/inyección 2X/día
vehículo 10-15 \mul/inyección 4X/día
3) dipal-Shh 1 mg/kg/inyección 2X/día
agonista B 15 mg/kg/inyección 4X/día
4) sin tratamiento
El vehículo para el agonista fue de 10 % DMSO en PBS (pH 7,2). El agonista se inyectó de un stock a 4,67mM disuelto en la solución vehículo.
18 horas tras las últimas inyecciones, se sacrificaron los ratones y se recogieron los siguientes tejidos: cráneo, riñón, pulmón, escápula, piel y corazón. Todos los tejidos se fijaron en 0,2% de glutaraldehído, 5 mM EDTA (pH 8,0), 20 mM de MgCl_{2}, 100 mM Na_{2}HPO_{4} durante 30 minutos antes de teñir en 1 mg/ml X-gal, 12,5 mM de ferrocianuro potásico, 2 mM MgCl_{2}, 0,01% deoxycolato, 0,02% NP-40, y 100 mM Na_{2}HPO_{4} durante 30 horas. Los tejidos se juzgaron por su intensidad relativa y se fotografiaron.
Todos los tejidos del grupo de tratamiento 3 (agonista + dipal-Shh en baja dosis) mostraron una sobreregulación significativa de la \beta-galactosidasa (como se visualiza por una tinción azul más intensa) en comparación con aquellos del grupo de tratamiento 2 (vehículo + dipal-Shh en baja dosis), como se ve en la Figura 40, mientras que los tejidos del grupo 3 se muestran en el lado derecho de cada marco. Las imágenes en la Figura 41 muestran un ejemplo de tejido de cada uno de los cuatro grupos de tratamiento. La sobreregulación observada en el grupo 3 fue parecida a la vista en el grupo de tratamiento 1 (dipal-Shh dosis alta). El nivel de tinción de \beta-galactosidasa en el grupo de tratamiento 2 fue parecido al visto en el grupo de tratamiento 4 (sin tratamiento).
El Agonista B fue claramente capaz de sobreregular la ruta hedgehog in vivo en presencia de dipal-shh en dosis bajaque por si misma es insuficiente para producir sobreregulación detectable.
Figura 42: Los ratones Ptc-lacZ se dividieron en dos grupos de tratamiento y se trataron con los siguientes compuestos durante tres días, empezando el primer día después del nacimiento:
1) vehículo 8-15 \mul/inyección 4X/día
2) agonista D 4 mg/kg/inyección 4X/día
El vehículo para el agonista fue de 10 % DMSO en PBS (pH 7,2). El agonista se inyectó de un stock a 1,0mM disuelto en la solución vehículo.
18 horas tras las últimas inyecciones, se sacrificaron los ratones y se recogieron las extremidades anteriores y procesaron como se ha descrito antes. Las extremidades anteriores de los ratones tratados con agonista mostraron unasobreregulación fuerte en los nervios, vasos sanguíneos, cartílago, y tejido conectivo.
El Agonista D fue claramente capaz de sobreregular la ruta hedgehog in vivo en ausencia de dipal-Shh. La sobreregulación vista en esta dosis de agonista D es mayor que la vista en las inyecciones de dipal-Shh a 10 mg/kg/inyección, 2X/día.
En un tercer experimento, los ratones Ptc-lacZ se dividieron en cinco grupos de tratamiento y se trataron con los siguientes compuestos durante cuatro días, empezando el primer día después del nacimiento:
1) vehículo 9-20 \mul/inyección 4X/día
2) agonista D 0,9 mg/kg/inyección 4X/día
3) agonista D 0,3 mg/kg/inyección 4X/día
4) agonista D 0,1 mg/kg/inyección 4X/día
5) octil-shh 10 mg/kg/inyección 2X/día
El vehículo para el agonista fue de 10 % DMSO en PBS (pH 7,2). El agonista se inyectó de stocks a 0,3, 0,1 y 0,03mM disuelto en la solución vehículo.
18 horas tras las últimas inyecciones, se sacrificaron los ratones y se recogieron las extremidades anteriores y se procesaron como se ha descrito antes. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 43, en la que no se muestra el vehículo control. Las extremidades anteriores de los ratones tratados con agonista mostraron de nuevo una sobreregulación fuerte en los nervios, vasos sanguíneos, cartílago, y tejido conectivo (en comparación con el grupo vehículo). El grupo de 0,9 mg/kg mostró los niveles más altos de sobreregulación en este experimento. Ambos grupos de dosis de 0,9 mg/kg y 0,3 mg/kg mostraron mayor sobreregulación que el grupo de 10 mg/kg de proteína Hh. El grupo de 0,1 mg/kg mostró una sobreregulación muy débil que fue claramente inferior a la vista en el grupo de proteína Hh.
El Agonista D fue claramente de sobreregular la ruta hedgehog in vivo en una forma de respuesta a dosis. La sobreregulación vista en las dosis de 0,9 y 0,3 mg/kg de agonista D es mayor que las vistas en las inyecciones de proteína Hh en 10 mg/kg/inyección, 2X/día.
Ensayo de ramificación de pulmones
Se recogieron pulmones lacZ E12.5 ptc-1 (d11) y se identificaron los embriones transgénicos por detección de lacZ usando colas. Los explantes se ensamblaron en filtros de 1 \mum pe de policarbonato (Costar) situados sobre rejillas de plástico (cámara histológica de imbibición) y se situaron en placas de cultivo de tejidos estándar de 12-pocillos rellenadas con medio de cultivo de explante de pulmón (basado en DMEM, aditivos optimizados para cultivo de pulmones de ratón) durante 48h, fijados en fijador de lacZ enjuagado y teñido para lacZ O/N a 37ºC.
Los resultados se muestran en la Figura 44. En el panel de control de la izquierda, se puede observar la expresión de LacZ en el mesénquima inmediatamente adyacente a las puntas de ramificación distales, un patrón que refleja una expresión endógena patched. El tratamiento con 5 \muM de agonista B lleva a una expresión de gen indicador que ha aumentado significativamente y a una expansión del dominio de expresión del transgén, indicativo de la sobre regulación de la trayectoria hedgehog. El panel de más a la derecha muestra los resultados del tratamiento con 5 \mug/mL de proteína Hh.
Ensayo de ramificación del riñón
Se recogieron pulmones E13.5 antiguos ptc-1 (d11) lacZ y se identificaron embriones transgénicos por la detección lacZ usando colas. Los explantes se ensamblaron en 1 \mum filtros de policarbonato(Costar)situados sobre rejillas de plástico (cámara histológica de imbibición) y se situaron en placas de cultivo estándar de 12-pocillos que se rellenaron con medio de cultivo de explante de riñón (basado en DMEM, aditivos optimizados para cultivo de pulmones de ratón) durante 48h, fijados en fijador de lacZ enjuagado y teñido para lacZ O/N a 37ºC.
Los resultados se muestran en la Figura 45. En el panel de control de la izquierda, se puede observar la expresión de LacZ en el mesénquima inmediatamente adyacente al epitelio uretérico más próximo, un patrón que refleja una expresión endógena patched. El tratamiento con 5 \muM de agonista B lleva a una expresión de gen indicador que ha aumentado significativamente y a una expansión del dominio de expresión del transgén, indicativo de la sobre regulación de la trayectoria hedgehog. Tener en cuenta que el señal permanece localizado en la mesénquima y no se expande en los epitelios uretérico y tubular situados a mayor distancia, indicando que solo los tipos de células mesénquimas que responden al señal de hedgehog en la situación endógena responden al agonista, mientras que los tipos de células que habitualmente no activan esta trayectoria no son afectadas por el tratamiento agonista. El panel de más a la derecha muestra los resultados del tratamiento 5 \mug/mL de proteína Hh.
Explantes de piel
Se extirpó piel de los cachorros ptc-lacZ E17.5 con un perforador de 2 mm. Entonces, esas muestras de piel se cultivaron durante 6 días en medios de control, o medios que incluían o bien agonista B o D o proteína Hh, o bien medios que incluían tanto agonista como Hh. Entonces, se tiñeron los explantes con tinte X-Gal. La Figura 46A muestra los resultados para el agonista B. El tratamiento con solo el agonista muestra mayor tinción que cultivando con una baja dosis de proteína Hh sola, y el tratamiento con agonista y una baja dosis de proteína Hh muestra una tinción parecido al de una dosis sustancialmente mayor de proteína Hh. En la Figura 46B se presentan resultados análogos para el agonista D.
Actividad en las células humanas
Las Figuras 47A y B comparan la actividad de los compuestos O y R en las células indicadoras de ratones (células TM3 con una construcción indicadora Gli-Luc, tal y como se ha descrito arriba) y en las células indicadoras humanas (células mesénquimas palatales embrionarias humanas (HEPM) con una construcción Gli-Luc). La Figura 48 muestra un análisis PRC cuantitativo de RNA expresado del gen diana hedgehog Gli-1 en células humanas tratadas con el vehículo, proteína Hh, y el agonista O. La activación de la línea celular indicadora y el mensaje elevado Gli-1 en respuesta a los compuestos demuestra que este agonista funciona en las células humanas.
Preparación de los compuestos de la presente invención a. Esquemas sintéticos ilustrativos
En las Figuras 1-31 se muestran los esquemas sintéticos ejemplares para generar los agonistas hedgehog útiles en los métodos y composiciones de la presente invención.
Las condiciones de reacción de los esquemas ilustrados en las Figuras 1-31 son las siguientes:
1) R_{1}CH_{2}CN,NaNH_{2}, tolueno
(Arzneim-Forsch, 1990,40,11,1241)
2) H_{2}SO_{4},H_{2}O, relujo
(Arzneim-Forsch, 1990,40,11',1241)
4) NaOH, EtOH, reflujo
5) (Boc)_{2}O, 2M NaOH, THF
6) LiHDMS, R_{1}X, THF
(Solicitud de Patente Merck # WO 96/06609)
7) Pd-C, H_{2}, MeOH
8) t-BuONO, CuBr, HBr, H_{2}O
(J. Org. Chem. 1977,42,2426)
9) ArB(OH)_{2}, Pd(PPh_{3})_{4}, Dioxano
(J. Med. Chem. 1996,39,217-223)
10) R_{12}(H)C=CR_{13}R_{14}, Pd(OAc)_{2}, Et_{3}N, DMF
(Org. React. 1982, 27, 345)
11) Tf_{2}O, THF
(J. Am. Chem. Soc. 1987,109,5478-5486)
12) ArSnBu_{3}, Pd(PPh_{3})4, Dioxano
(J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486)
13) KMnO_{4}, Py, H_{2}O
(J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223)
14) NaOR_{1}, THF
15) NaSR_{1}, THF
16) HNR_{1}R_{13}, THF
17) HONO, NaBF_{4}
(Adv. Fluorine Chem. 1965,4,1-30)
18) Pd(OAc)_{2}, NaH, DPPF, PhCH_{3}, R_{1}OH
(J. Org. Chem. 1997,62,5413-5418)
19) i. R_{1}X, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}, ii. R_{13}X
20) SOCl_{2}, cat DMF
21) CH_{2}N_{2}, Et_{2}O
22) Ag_{2}O, Na_{2}CO_{3}, Na_{2}S_{2}O_{3}, H_{2}O
(Tetrahedron Lett. 1979, 2667)
23) AgO_{2}CPh, Et_{3}N, MeOH
(Org. Syn., 1970, 50, 77; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5432)
24) LiOH, THF-MeOH
25)(EtO)_{2}P(O)CH_{2}CO_{2}R, BuLi, THF
26) MeO_{2}CCH(Br)=P(Ph)_{3}, benceno
27) KOH o KOtBu
28) Base, X(CH_{2})_{n}CO_{2}R
29) DPPA, Et_{3}N, tolueno
(Synthesis 1985, 220)
30) NONO, H_{2}O
31) SO_{2}, CuCl, HCl, H_{2}O
(Synthesis 1969, 1-10, 6)
32) Reactivo Lawesson, tolueno
(Tetrahedron Asym. 1996, 7, 12, 3553)
33) R_{2}M, solvente
34) 30% H_{2}O_{2}, CH_{3}CO_{2}H glacial
(Helv. Chim. Acta. 1968, 349, 323)
35) trifosgeno, CH_{2}Cl_{2}
(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
36) i.(EtO)_{2}P(O)CHLiSO_{2}Oi-Pr, THF, ii. NaI
37) Ph_{3}PCH_{3}I, NaCH_{2}S(O)CH_{3}, DMSO
(Synthesis 1987, 498)
\newpage
38) Br_{2}, CHCl_{3} o otro solvente
(Synthesis 1987, 498)
39) BuLi, Bu_{3}SnCl
40) ClSO_{2}OTMS, CCl_{4}
(Chem. Ber. 1995, 128, 575-580)
41) MeOH-HCl, reflujo
42) LAH, Et_{2}O o LiBH_{4}, EtOH o BH_{3}-THF
(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
43) MsCl, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
44) Na_{2}SO_{3}, H_{2}O
(Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8589)
45) R_{2}R_{4}NH, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
46) R_{2}M, solvente
47) CH_{3}NH(OCH_{3}), EDC, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF
(Tetrahedron Lett, 1981, 22, 3815)
48) MeLi, THF
49) mCPBA, CH_{2}Cl_{2}
50) HONO, Cu_{2}O, Cu(NO_{3})_{2}, H_{2}O
(J. Org. Chem. 1977, 42, 2053)
51) R_{1}M, solvente
52) HONO, NaS(S)COEt, H_{2}O
(Org. Synth. 1947, 27, 81)
53) HSR_{2} o HSR_{4}, CH_{2}Cl_{2}
54) i-BuOC(O)Cl, Et_{3}N, NH_{3}, THF
55) R_{2}R_{4}NH, CH_{2}Cl_{2}, NaBH(OAc)_{3}
56) R_{2}R_{4}NH, MeOH/CH_{3}CO_{2}H, NaBH_{3}CN
57) R_{2}OH, EDC, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF
58) R_{2}OH, HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF
59) R_{2}R_{4}NH, EDC, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF
60) R_{2}R_{4}NH, HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF
61) POCl_{3}, Py, CH_{2}Cl_{2}
62) R_{2}R_{4}NCO, solvente
63) R_{2}OC(O)C1, Et_{3}N, solvente
64) R_{2}CO_{2}H, EDC o HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF
65) R_{2}X, Et_{3}N, solvente
66) (CH_{3}S)_{2}C=N(CN), DMF, EtOH
(J. Med. Chem. 1994, 37, 57-66)
67) R_{2}SO_{2}Cl, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
68) R_{2}- o R_{3}- o R_{4}CHO, MeOH/CH_{3}CO_{2}H, NaBH_{3}CN
(Synthesis 1975,135-146)
69) Boc(Tr)-D o L-CysOH, HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF
70) Boc(Tr)-D o L-CysH, NaBH_{3}CN, MeOH/CH_{3}CO_{2}H
(Synthesis 1975, 135-146)
71) S-Tr-N-Boc de cisteina, ClCH_{2}CH_{2}Cl o THF, NaBH(OAc)_{3}.
(J. Org. Chem. 1996, 61, 3849-3862)
72) TFA, CH_{2}Cl_{2}, Et_{3}SiH o (3:1:1) tioanisol/etanoditiol/DMS
73) TFA, CH_{2}Cl_{2}
74) DPPA, Et_{3}N, tolueno, HOCH_{2}CH_{2}SiCH_{3}
(Tetrahedron Lett. 1984, 25, 3515) 7
75) TBAF, THF
76) Base, TrSH o BnSH
77) Base, R_{2}X o R_{4}X
78) R_{3}NH_{2}, MeOH/CH_{3}CO_{2}H, NaBH_{3}CN
79) N_{2}H_{4}, KOH
80) Pd_{2}(dba)_{3}, P(o-tol)_{3}, RNH_{2}, NaOtBu, Dioxano, R_{1}NH_{2}
(Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7181-7184).
81) Cianamida.
82) Fmoc-Cl, bicarbonato sódico.
83) BnCOCI, carbonato sódico.
84) AliloOCOCI, piridina.
85) Bromuro de bencilo, base.
86) Cloruro Oxalilo, DMSO.
87) RCONH_{2}.
88) Carbonildiimidazol, solventes neutrales (ej. DCM, DMF, THF, tolueno).
89) Tiocarbonildiimidazol, solventes neutrales (ej. DCM, DMF, THF, tolueno).
90) Bromuro de cianogeno, solventes neutrales (ej. DCM, DMF, THF, tolueno).
91) RCOCl, Trietilamina
92) RNHNH_{2}, EDC.
93) RO_{2}000Cl, Et_{3}N, DCM.
94) MsOH, Piridina (J. Het. Chem., 1980, 607.)
95) Base, solventes neutrales (ej. DCM, tolueno, THF).
96) H_{2}NOR, EDC.
97) RCSNH_{2}.
98) RCOCHBrR, solventes neutrales (ej. DCM, DMF, THF, tolueno), (Org. Proc. Prep. Intl., 1992,24, 127).
99) CH_{2}N_{2}, HCl. (Synthesis, 1993,197).
100) NH_{2}NHR, solventes neutrales (ej. DCM, DMF, THF, tolueno).
101) RSO_{2}Cl, DMAP. (Tetrahedron Lett., 1993, 34, 2749).
102) Et_{3}N, RX. (J. Org. Chem., 1990, 55, 6037).
103) NOCl o Cl_{2} (J. Org. Chem., 1990, 55, 3916).
104) H_{2}NOH, solventes neutrales (e.g., DCM, DMF, THF, tolueno).
105) RCCR, solventes neutrales (DCM, THF, Tolueno).
106) RCHCHR, neutral solvents (DCM, THF, Toluene).
107) H_{2}NOH, HCl.
108) Tiocarbonildiimidazol, SiO_{2} o BF_{3}OEt_{2}. (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228).
109) Tiocarbonildiimidazol, DBU o DBN. (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228).
110) HNO_{2}, HCl.
111) ClCH_{2}CO_{2}Et (Org. Reactions, 1959, 10,143).
112) Enamina morfolina (Eur. J. Med. Chem., 1982,17, 27).
113) RCOCHR'CN
114) RCOCHR'CO_{2}Et
115) Na_{2}SO_{3}
116) H_{2}NCHRCO_{2}Et
117) EtO_{2}CCHRNCO
118) RCNHNH_{2}.
119) RCOCO_{2}H, (J. Med. Chem., 1995,38,3741).
120) RCHO, KOAc.
121) 2-Fluoronitrobenceno.
122) SnCl2, EtOH, DMF.
123) RCHO, NaBH_{3}CN, HOAc.
124) NH_{3}, MeOH.
125) 2,4,6-Me_{3}PhSO_{2}NH_{2}.
126) Et_{2}NH, CH_{2}Cl_{2}
127) MeOC(O)Cl, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
128) R_{2}NH_{2}, EDC, HOBT, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
129) DBU, PhCH_{3}
130) BocNHCH(CH_{2}STr)CH_{2}NH_{2}, EDC, HOBT, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
131) R_{2}NHCH_{2}CO_{2}Me, HBTU, HOBT, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
132) BocNHCH(CH_{2}STr)CH_{2}OMs, LiHMDS, THF
133) R_{2}NHCH_{2}CO_{2}Me, NaBH(OAc)_{3}, ClCH_{2}CH_{2}Cl o THF
134) R_{2}NHCH_{2}CH(OEt)_{2}, HBTU, HOBT, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
135) NaBH(OAc)_{3}, ClCH_{2}CH_{2}Cl o THF, AcOH.
136) Piperidina, DMF.
137) Pd(Ph_{3}P)_{4}, Bu_{3}SnH.
138) RCO_{2}H, EDC, HOBT, Et_{3}N, DCM.
139) RNH_{2}, solventes neutrales.
140) RCHO, NaBH_{3}CN, HOAc.
141) RNCO, solvente.
142) RCO_{2}H, EDC o HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF.
143) RCOCl, Trietilamina
144) RSO_{2}Cl, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}.
145) SnCl_{2}, EtOH, DMF.
146) RNH_{2}, EDC, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF.
147) Dibromoetano, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}
148) Cloruro de oxalil, solventes neutrales.
149) LiOH, THF-MeOH.
150) Carbonildiimidazol, solventes neutrales (ej. DCM, DMF, THF, tolueno).
151) RNH_{2}, Et_{3}N, CH_{2}Cl_{2}.
152) Base, RX.
153) DBU, PhCH_{3}
154) DPPA, Et_{3}N, tolueno (Synthesis 1985, 220)
155) SOCl_{2}, cat DMF.
156) ArH, Ácido de Lewis (AlCl_{3}, SnCl_{4}, TiCl_{4}), CH_{2}Cl_{2}.
157) H_{2}NCHRCO_{2}Et, solventes neutrales.
158) BocHNCHRCO_{2}H, EDC o HBTU, HOBt, DIEA, CH_{2}Cl_{2} o DMF.
159) TFA, CH_{2}Cl_{2}.
b. Preparación ilustrativa de subunidades de arilo
Se puede dar función a las subunidades de arilo utilizando una gran variedad de reacciones que ya conocen los expertos en la materia. La química de los anillos aromáticos y heteroaromáticos es muy rica, y aquí solo se pueden mostrar algunos ejemplos de reacciones que son útiles. A continuación se muestran un número de ejemplos ilustrativos particularmente útiles para generar porciones de biarilo de los compuestos.
Acoplamiento de Suzuki núm. 1:
22
Acoplamiento de Suzuki núm. 2:
23
Acoplamiento de Stille núm. 1:
24
Acoplamiento de Stille núm. 2:
25 
\newpage
Acoplamiento de Stille núm. 3:
26
c. Preparación ilustrativa de los sustratos de acoplamiento
Los miembros de las categorías de los sustratos de acoplamiento resaltados arriba - arilestanano, ácidos arilbóricos, triflatos de arilo y haluros de arilo - están disponibles de los heterociclos parentales. En general, las transformaciones necesarias para preparar un sustrato de acoplamiento son fáciles y cómodas para el escalaje. A continuación se muestran ejemplos ilustrativos.
Preparación de un Yoduro de arilo
27
Preparación de un Estanano de arilo
28
Preparación de un Triflato de arilo
29
Preparación de Ácido bórico de arilo
30
Síntesis en fase sólida de los compuestos General Protocolos de lavado
Método 1: agua (3x), acetona (2x), N,N-dimetilformamida (3x), agua (2x), acetona (lx), N,N-dimetilformamida (3x), agua(2x), acetona (3x), metanol (3x), acetona (3x) y metanol (3x);
Método 2: diclorometano, hexano, N,N-dimetilformamida, diclorometano, hexano, diclorometano y hexano;
Método 3: agua, N,N-dimetilformamida, agua, 1,0M de solución de hidróxido sódico acuosa, agua, N-N-dimetil-
formamida, agua, 1,0 de solución de hidróxido sódico acuosa, agua, N,N-dimetilformamida, diclorometano, metanol, diclorometano y metanol.
Método 4: N,N-dimetilformamida, diclorometano, N,N-dimetilformamida, diclorometano, metanol, diclorometano, metanol (2x) y éter (2x).
Esquema General
31
32 
\newpage
Paso A
Preparación de (Nitrofen-4'-iloxicarboxi)benz-4-iloximetil poliestiren-(Wang -PNP carbonato poliestireno) Hidroxibenz-4-iloximetil poliestireno (resina Wang)
Se añadió lentamente metóxido sódico (233 g, 4,31 mol) a una mezcla en agitación de clorometil poliestireno (2,4 kg, 3,6 mol carga funcional) y 4-hidroxibenzil alcohol (581 g, 4,68 mol) en N,N-dimetilacetamida (10L) a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Tras diluir con N,N-dimetilacetamida (13L), la mezcla se calentó a 50ºC durante 5 h y luego se filtró por una cánula a través de un filtro P-ETFE (70 \mum). El producto bruto se lavó extensivamente usando la secuencia del Método 1, después se secó al vacío a 60ºC para proporcionar 2630 g de la resina del título.
(Nitrofen-4'-iloxicarboxi)benz-4-iloximetil poliestireno-(Wang PNP carbonato poliestireno)
4-Metilmorfolina (660 mL, 6,0 mol) se añadió por goteo durante 2h a una mezcla agitada de hidroxibenz-4-iloximetil poliestireno (2000 g, 2,5 mol carga funcional) y 4-nitrofenol cloroformato (1209 g, 6,0 mol) en diclorometano (22L) a (0ºC bajo nitrógeno). La mezcla se calentó gradualmente a temperatura ambiente, se agitó durante la noche y se filtró por una cánula en un filtro P-ETFE (70 \mum). La resina bruta se lavó extensivamente usando la secuencia del Método 2, luego se secó al vacío a temperatura ambiente para proporcionar 2728 g de una mezcla de la resina del título y clorhidrato de 4-metilmorfolina.
Paso B
Preparación de diaminas unidas a resina Wang Método General (para piperazina, homopiperazina y trans-l,4-diaminociclohexano)
(Nitrofen-4'-iloxicarboxi)benz-4-iloximetil poliestireno bruto (1002,5 g, \sim 0,9 mol carga funcional) se hinchó durante 15 min en una mezcla 50% v/v de diclorometano anhidro y N,N-dimetilformamida (9L) bajo nitrógeno. N,Ndiisopropilamina (626 mL, 5 mol equivalentes) y se añadió la diamina apropiada (5 mol equivalentes) y la mezcla se agitó enérgicamente toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de un filtro-P-ETFE (70 \mum), se lavó intensamente usando la secuencia del Método 3 y se secó al vacío a 60ºC para proporcionar la diamina unida a la resina.
Etilendiamina unida a resina Wang
(Nitrofen-4'-iloxicarboxi)benz-4-iloximetil poliestireno bruto (1002,5 g, -0,9 mol carga funcional) se hinchó durante 15 min en diclorometano (7L) bajo nitrógeno y se trató con etilendiamina (181 mL, 2,7 mol). La suspensión resultante espesa, amarilla se diluyó con diclorometano (2L) y se agitó vigorosamente toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla se lavó intensamente usando la secuencia del Método 3 y se secó al vacío a 60ºC para proporcionar la diamina unida a resina.
m-Xililendiamina unida a resina Wang
(Nitrofen-4'-iloxicarboxi)benz-4-iloximetil poliestireno bruto (1002,5 g, -0,9 mol carga funcional) se hinchó en tetrahidrofurano (7L) durante 15 min bajo nitrógeno y se trató con una solución de m-xililendiamina (828 mL, 6,27 mol) en tetrahidrofurano (1L). La suspensión resultante espesa, amarilla se diluyó con diclorometano (2L) y se agitó vigorosamente toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de un filtro-P-ETFE (70 \mum), se lavó intensamente usando la secuencia del Método 3 y se secó al vacío a 60ºC para proporcionar la diamina unida a
resina.
Paso C
Preparación del bloque de construcción usando un proceso de acoplamiento de Suzuki
Una suspensión del bromuro de arilo apropiado (1 equivalente) y carbonato potásico (2,2 equivalentes) entolueno (13 volúmenes) se agitó y desgasificó a temperatura ambiente. Tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (0,01 equivalente) se añadió y el vaso de reacción se evacuó y purgó con nitrógeno (tres veces). Tras 15 min, una solución desgasificada de ácido 2-metoxi-5-formilfenilborónico (1,2 equivalentes) en etanol (6,3 volúmenes) se añadió con una cánula, entonces se calentó la mezcla bajo reflujo y se agitó durante la noche bajo nitrógeno. Tras enfriar, el sólido se filtró de la solución y se lavó vigorosamente con tolueno. El filtrado se evaporó hasta la sequedad bajo presión reducida para proporcionar el producto bruto. Este se trituró con éter dietílico (5 volúmenes) y la solución resultante se filtró, y lavó con éter dietílico y se secó al vacío. El biaril aldehído se obtuvo como un polvo amarillo.
\newpage
Paso D
Bloque de construcción cargado en Diamina Wang Alquilación Reductiva
La resina apropiada (1 equivalente, -0,75 mmol carga funcional) se hinchó en una mezcla de tetrahidrofurano, trimetilortoformato y diclorometano (1:1:1, v/v/v, 10 mL) durante 15 min, entonces se agitó generosamente y se trató con el aldehído apropiado (2 equivalentes). Tras la agitación vigorosa durante la noche a temperatura ambiente, la resina se filtró, se lavó vigorosamente con tetrahidrofurano y se secó al vacío a 40ºC. La resina secada se hinchó entonces en tetrahidrofurano durante 15 min y se trató con ácido acético (0,12 equivalente) y triacetoxiborhidruro sódico (5 equivalentes). La suspensión de resina se agitó generosamente durante la noche a temperatura ambiente, entonces se filtró, se lavó intensamente usando la secuencia del Método 4 y se secó al vacío a 60ºC.
Tapa de cloruro ácido
La resina apropiada (1 equivalente) se hinchó en diclorometano (10 volúmenes) durante 10 min y se trató con el cloruro ácido apropiada (3 equivalentes) y N,N-diisopropiletilamina (3 equivalentes). La suspensión de resina se agitó vigorosamente durante la noche a temperatura ambiente, se filtró, y se lavó intensamente usando la secuencia del Método 4 y se secó al vacío a 40ºC.
Solución de síntesis en fase del compuesto concerniente
El siguiente esquema ejemplar ilustra una ruta a través de la cual los agonistas hedgehog de la presente invención pueden prepararse. Las variaciones en esta ruta ejemplar se entenderá fácilmente y se realizara por aquellos entendidos en la materia, permitiendo la preparación de un amplio rango de compuestos que caen dentro de la fórmula general presentada. Los números de compuesto usados por este esquema son consistentes con los procedimientos de debajo, y son independientes de los números de compuesto usados en cualquier otro lugar de la solicitud, como puede ser las figuras.
Síntesis de clorhidrato de (4'-ciano-6-metoxi-bifenil-3-ilmetil)-(4-metilaminociclohexil)-3-cloro-benzo[b]tiofen-2-carboxamida (7) 
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(4-Amino-ciclohexil)-carbamato de t-butilo (1)
Una solución de di-t-butil-dicarbonato (12,0 g, 54,7 mmol) y tetrahidrofurano (250 mL) se añadió lentamente bajo nitrógeno durante 3h a una suspensión de 1,4-diaminociclohexano (50,0 g, 0,44 mol) en tetrahidrofurano (250 mL) mientras se mantiene la temperatura por debajo de 10ºC. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó subsiguientemente durante 16 horas, luego se filtró. El filtrado se concentró al vacío para proporcionar un residuo. Se añadió agua (500 mL) al residuo, seguido por la agitación durante aproximadamente 15 min, tras el cual la mezcla se filtró y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 200 mL). Los extractos orgánicos se combinaron y se concentraron para proporcionar un residuo que se disolvió en t-butilmetil éter (350 mL) y se lavó con agua (3 x 50 mL). El t-butilmetil éter se eliminó al vacío para proporcionar el compuesto del título 1 (8,1 g, 69%) como un sólido: \deltaH (360 MHz: CDCl_{3}) 1,06-1,24 (m, 41-1), 1,43 (s, 913), 1,83 (d, 2H), 1,98 (d,2H), 2,56-2,66 (m, 1H), 3,30-3,35 (m, 1H) y 4,31-4,38 (m, 1H).
N Metil-ciclohexano-1,4-diamina (2)
Amina 1 (15,0 g, 0,7 mol) se añadió lentamente durante 45 min a una solución 1N de hidruro de aluminio litio en THF (450 mL, 0,36 mol) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó durante 30 min a temperatura ambiente, luego se agitó a reflujo durante 5-6 horas bajo nitrógeno. Se añadió agua (13,2 mL) a la mezcla seguido por 15% de hidróxido sódico acuoso (13,2 mL), y agua (39,7 mL). La mezcla se agitó entonces durante 15-30 min. El sólido se eliminó por filtración y se lavó con t-butilmetil éter (200 mL), diclorometano (200 mL), y t-butilmetil éter (200 mL). Los extractos orgánicos se recogieron, se secaron (MgSO_{4}), y filtraron. El agente secante se lavó entonces con diclorometano y los extractos orgánicos se combinaron y concentraron al vacío para proporcionar el compuesto del título 2 (7,52 g, 84%) como un sólido amarillo pálido: \deltaH (360 MHz: CDCl_{3}) 1,041,20 (q, 4H), 1,51 (br s, 311), 1,80-1,96 (m, 4H), 2,25-2,35 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,612,72 (m, 1H).
(4-Amino-ciclohexil)-metil-carbamato de t-butilo (3)
Benzaldehído (12,8 mL, 0,13 mol) se añadió en una porción simple a una solución de N-metilamina 2 (16,2 g, 0,13 mol) y tolueno (150 mL) bajo nitrógeno La mezcla resultante se calentó a reflujo usando un aparato Dean Stark durante 4 h. Tras dejar la mezcla enfriara temperatura ambiente, se añadió el di-t-butil dicarbonato (27,5 g, 0,13 mol) en porciones y la mezcla se agitó durante 16h. La mezcla se concentró al vacío para dejar un aceite amarillo, al que se añadió 1N hidrógeno sulfato potásico acuoso (90 mL) seguido por agitación vigorosa hasta que TLC indicó que se había completado la reacción (\sim 2,5 h). La mezcla se extrajo en éter (3 x 100 mL) y la fase acuosa se hizo alcalina (pH \sim 12) con hidróxido sódico acuoso. La fase acuosa se saturó entonces con cloruro sódico y el producto se extrajo en cloroformo (3 x 40 mL). Los extractos combinados se concentraron al vacío para proporcionar el compuesto del título 3 (16,3 g, 59%) como un aceite amarillo: \deltaH (360 MHz: CDCl_{3}) 1,11-1,34 (m, 5H), 1,45 (s, 9H), 1,66 (br d, 2H), 1,90 (br d, 2H), 2,56-2,66 (m, 113), 2,71 (s, 3H) y 3,98 (br s, 211).
{4-[(4'-Ciano-6-metoxi-bifenil-3-ilmetil)-amino]ciclohexil}-metil-carbamato de t-butilo (5)
Una solución de amina 3 (5.0 g, 21,92 mmol), aldehído 4 (5,19 g, 21,92 mmol) y trimetil ortoformato (50 ml) se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 h. Triacetoxiborhidruro sódico (6,5 g, 30,7 mmol) se añadió luego por porciones y la mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta completar la reacción, como se determinó por, análisis LC-MS. Se añadió agua cuidadosamente y la mezcla se agitó durante 5 min, seguido por la separación de las capas. La capa de trimetil ortoformato se vertió en hidrógeno sulfato potásico acuoso 1N (100 mL) y se agitó durante 15 min. El sólido precipitado se filtró, y lavó con agua (50 mL), enfriada con tributil metil éter (3 x 30 mL). El precipitado lavado se suspendió entonces en diclorometano (150 mL) al que se añadió hidrógeno carbonato sódico acuoso saturado (50 mL) y el pH se hizo alcalino (pH-10) mientras se mantuvo en agitación vigorosa. La capa de diclorometano se lavó con agua, y salmuera, y el extracto orgánico se secó (MgSO_{4}) y se concentró al vacío para proporcionar el compuesto del título 5 (6,9 g, 69%) como un sólido blanco apagado: \deltaH (360 MHz: CDCl_{3}) 1,18-1,31 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 1,68 (d, 2H), 2,01 (d, 2H), 2,44-2,56 (m, 1H), 2:69 (s, 3H), 3,76 (s, 2H), 3,80 (s, 3H), 6,92 (d, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,29 (d, 1H), 7,61 (d, 2H) y 7,66 (d, 2H).
{4-[(3-Cloro-benzo[b]tiofen-2-carbonil)-(4'-ciano-6-metoxi-bifenil-3-ilmetil)-amino]-ciclohexil}-metil-carbamato de t-butilo (6)
N,N-Diisopropiletilamina (2,1 mL, 12,1 mmol) se añadió a una solución de amina 5 (2,2 g, 4,9 mmol), cloruro de 3-clorobenzo[b]tiofen-2-carbonilo (1,3 g, 5,86 mmol) y diclorometano anhidro (22 mL), con agitación bajo argón. Una vez que todo el material de partida ha sido consumido como se monitorizó por TLC (\sim2,5 horas), la mezcla se lavó con agua, hidrógeno carbonato sódico saturado acuoso, y salmuera. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}), y concentró al vacío. El residuo amarillo se purificó entonces por cromatografía en gel de sílice usando hexano/acetato de etilo 3:1 para proporcionar el compuesto del título 6 (2,93 g, 93%) como un sólido amarillo pálido.
Clorhidrato de (4'-ciano-6-metoxi-bifenil-3ilmetil)-(4-metilamino-ciclohexil)-3-Cloro-benzo[b]tiofen-2-carboxamida (7)
Se añadió ácido clorhídrico concentrado (27,5 mL), a una solución del compuesto 6 (11,0 g, 17,1 mmol) y etanol (82,5 mL). La mezcla se agitó hasta completar la reacción como se monitorizó por TLC. La mezcla se concentró al vacío y se añadió diclorometano y se concentró de nuevo, esto se repitió hasta que se obtuvo un sólido. El sólido se mezcló con t-butilmetil éter (30 mL), se filtró, y la capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y se concentró al vacío para proporcionar elcompuesto del título 7 (10,0 g, 99%): \deltaH (360 MHz: DMSO, 70ºC)1,30-1,50 (m, 2H), 1,85 (lac s, 4H), 2,12 (br d, 2H), 2,48 (s, 3H), 2,91 (br t, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,87 (br s, 1H), 4,71 (s, 2H), 7,14 (d,1H), 7,29 (s, 1H), 7,40 (d, 1H), 7,57-7,68 (m, 4H), 7,80-7,90 (m, 3H), 8,09 (d, 1H), 8,82 (br s, 2H).
Todas las publicaciones y patentes citadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad.
Aquellos entendidos en el campo reconocerán, o serán capaces de averiguar usando la experimentación habitual, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas aquí. Tales equivalentes se proponen estar abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (76)

1. Una preparación farmacéutica que comprende un compuesto con una estructura de Fórmula VIII:
Fórmula VIII
34
En donde, como valencia se permite,
U representa un arilo sustituido o sin sustituir o anillo heteroarilo fusionado al anillo que contiene nitrógeno;
V representa metileno, 1,1-etileno ó 1,1-propileno;
W representa S ó O, preferiblemente O;
X representa C=O, C=S, o SO_{2};
R_{3} representa, arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior sustituido o sin sustituir, alquinilo inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, aralquilo, o heteroaralquilo;
R_{4} representa, un aralquilo o alquilo inferior sustituido o sin sustituir, tales como un fenetilo, benzilo, o aminoalquilo, etc;
R_{5} representa, un arilo, heteroarilo, aralquilo, o heteroaralquilo sustituido o sin sustituir, incluyendo grupos aromáticos policíclicos o heteroaromáticos.
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Un método in vitro para modular la proliferación o diferenciación de una célula, que comprende contactar la célula con un compuesto que posee una estructura de Fórmula VIII:
Fórmula VIII
35
En donde, como valencia se permite,
U representa un arilo sustituido o sin sustituir o anillo heteroarilo fusionado al anillo que contiene nitrógeno;
V representa metileno, 1,1-etileno ó 1,1-propileno;
W representa S ó O, preferiblemente O;
X representa C=O, C=S, o SO_{2};
R_{3} representa, arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior sustituido o sin sustituir, alquinilo inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, aralquilo, o heteroaralquilo;
R_{4} representa, un aralquilo o alquilo inferior sustituido o sin sustituir, tales como un fenetilo, benzilo, o aminoalquilo, etc;
R_{5} representa, un arilo, heteroarilo, aralquilo, o heteroaralquilo sustituido o sin sustituir, incluyendo grupos aromáticos policíclicos o heteroaromáticos.
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. Una preparación farmacéutica que comprende un excipiente estéril farmacéuticamente aceptable y un compuesto representado por la Fórmula general (IX):
Fórmula IX
36
En donde, como valencia se permite,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente siempre excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o -Se-, a menos que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está ausente;
R representa, independientemente para cada caso, H o alquilo sustituido o sin sustituir;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)-;
M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir;
Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico de seis miembros no aromático directamente unido a N y lleva un sustituyente amino en la posición 4 del anillo relacionado con N;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; incluyendo grupos policíclicos;
i representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia N-M_{i}-Y-Ar, donde i representa 1; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y=M_{k}-Y-Ar, donde k representa un número entero de 0 a 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. La preparación farmacéutica de la reivindicación 3, donde los sustituyentes N y amina sobre Cy están dispuestos trans en el anillo.
5. Una preparación farmacéutica de la reivindicación 3, donde Y no está en M_{k}-Y-Ar, y k representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Ar, donde k representa 0 o 1.
6. La preparación farmacéutica de la reivindicación 3 o 4, donde Z representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Y está ausente en todos los casos; y
k representa 0 para todos los casos.
7. Una preparación farmacéutica de la reivindicación 6, en donde.
Ar está sustituido con R_{2};.
Z está sustituido con R_{1};
R_{1} y R_{2} representan independientemente y como lo valencia permite, de 0-5 sustituyentes en el anillo al que está unido, seleccionado de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH,
-(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, (CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior;
En donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que tiene de uno a diez carbonos.
8. La preparación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el sustituyente amino sobre Cy es una amina primaria o una amina secundaria sustituida con un grupo alquilo inferior; en donde el alquilo inferior se refiere a un grupo que tiene de uno a diez carbonos.
9. La preparación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en donde Ar es bicíclico.
10. La preparación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-9, en donde R es hidrógeno o Me.
11. La preparación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-10, en donde Cy' es un anillo bicíclico sustituido o sin sustituir.
12. La preparación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-11, en donde Cy' es un grupo benzotiofeno sustituido o sin sustituir.
13. La preparación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-.12, en donde Cy' es un grupo benzotiofeno-2-ilo sustituido o sin sustituir.
14. La preparación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 3-13, en donde X se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
15. Un método in vitro para usar agonistas de la ruta hedgehog en una célula, que comprende el contacto de una célula con el agonista de hedgehog en una cantidad suficiente para modular la proliferación o diferenciación de tal célula, en donde el agonista de hedgehog interviene en la ruta hedgehog en ausencia de la proteína hedgehog.
16. Un método in vitro para usar agonistas de la ruta hedgehog en una célula, que comprende el contacto de una célula con el agonista de hedgehog en una cantidad suficiente para modular la proliferación o diferenciación de tal célula, en donde el agonista de hedgehog interactúa con smoothened e interviene en la ruta hedgehog.
17. El método in vitro de la reivindicación 15 o 16, en donde el agonista hedgehog está representado por la Fórmula general (IX):
Fórmula IX
37
En donde, como valencia se permite,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o -Se-, a menos que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está ausente;
R representa, independientemente para cada caso, H o alquilo sustituido o sin sustituir;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, y -P(=O)(OR)-;
M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir;
Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico de seis miembros no aromático directamente unido a N y lleva un sustituyente amino en la posición 4 del anillo relacionado con N;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; incluyendo grupos policíclicos;
i representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia N-M_{i}-Y-Ar, donde i representa 1; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y=M_{k}-Y-Ar, donde k representa un número entero de 0 a 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
18. El método in vitro de la reivindicación 17, en donde los sustituyentes N y amina sobre Cy están dispuestos en trans en el anillo.
19. El método in vitro de la reivindicación 17, en donde Y está ausente en M_{k}-Y-Ar y k representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Ar, donde k representa 0 o 1.
20. El método in vitro de la reivindicación 17 o 18, en donde
Z representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Y está ausente para todos los casos;
k representa 0 para todos los casos;
21. El método in vitro de la reivindicación 20, en donde
Ar está sustituido con R_{2};
Z está sustituido con R_{1};
R_{1} y R_{2} representa, independientemente y como permite la valencia, de 0-5 sustituyentes sobre el anillo al que está unido, seleccionado de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH,
-(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior; en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que poseen de uno a diez carbonos.
22. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en donde el amino sustituyente sobre Cy es una amina primaria o una amina secundaria sustituida con un grupo alquilo inferior; en donde alquilo inferior se refiere a un grupo con uno a diez carbonos.
23. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 17-20, en donde Ar es bicíclico.
24. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 17-23, en donde R representa un hidrógeno o Me.
25. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 17-24, en donde Cy' es un anillo bicíclico sustituido o sin sustituir.
26. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 17-25, en donde X se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
27. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 17-26, en donde Cy' es un grupo benzotiofeno sustituido o sin sustituir.
28. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 17-27, en donde Cy' es un grupo benzotiofeno-2-ilo sustituido o sin sustituir.
29. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 15-28, en donde el agonista hedgehog actúa sobre la transducción de señal mediada por hedgehog con un ED_{50} de 1 mM o menos.
30. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 15-28, en donde el agonista hedgehog actúa sobre la transducción de señal mediada por hedgehog con un ED_{50} de 1 \muM o menos.
31. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 15-28, en donde el agonista hedgehog actúa sobre la transducción de señal mediada por hedgehog con un ED_{50} de 1 nM o menos.
32. El uso de un agonista de hedgehog en la elaboración de un medicamento para modular la proliferación o diferenciación de una célula en un animal, en donde el agonista de hedgehog actúa en la ruta hedgehog en ausencia de la proteína hedgehog.
33. El uso de un agonista de hedgehog en la elaboración de un medicamento para modular la proliferación o diferenciación de una célula en un animal, en donde el agonista de hedgehog interactúa con smoothened y actúa en la ruta hedgehog.
34. El uso de la reivindicación 32 o 33, en donde, el agonista de hedgehog está representado por la Fórmula general (IX):
Fórmula IX
38
en donde, como la valencia permite,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o -Se-, a menos que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está ausente;
R representa, independientemente para cada caso, H o alquilo sustituido o sin sustituir;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, y -P(=O)(OR)-;
M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir;
Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico de seis miembros no aromático directamente unido a N y lleva un sustituyente amino en la posición 4 del anillo relacionado con N;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; incluyendo grupos policíclicos;
i representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia N-M_{i}-Y-Ar, donde i representa 1; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y=M_{k}-Y-Ar, donde k representa un número entero de 0 a 3; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
35. El uso de la reivindicación 34, en donde los sustituyentes N y amina sobre Cy están dispuestos en posición trans en el anillo.
36. El uso de la reivindicación 34, en donde Y está ausente en M_{k}-Y-Ar.
37. El uso de la reivindicación 34 o 35, en donde
Z representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; Y está ausente para todos los casos;
k representa 0 para todos los casos.
38. El uso de la reivindicación 37, en donde Ar está sustituido con R_{2};
Z está sustituido con R_{1};
R_{1} y R_{2} representa, independientemente y como permite la valencia, de 0-5 sustituyentes sobre el anillo al que está unido, seleccionado de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH, -(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior; en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que poseen de uno a diez carbonos.
39. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 35-37, en donde el sustituyente amino sobre Cy es una amina primaria o una amina secundaria sustituida con un grupo alquilo inferior; en donde alquilo inferior se refiere a un grupo con uno a diez carbonos.
40. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 34-37, en donde Ar es bicíclico.
41. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 34-40, en donde Cy' es un anillo bicíclico sustituido o sin sustituir
42. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 34-41, en donde X se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-, y -S(O_{2})-.
43. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 34-42, en donde R representa H o Me.
44. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 34-43, en donde Cy' es benzotiofeno sustituido o sin sustituir.
45. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 34-44, en donde Cy' es un grupo benzotiofeno-2-ilo sustituido o sin sustituir.
46. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 32-45, en donde el agonista hedgehog actúa sobre la transducción de señal mediada por hedgehog con un ED_{50} de 1 mM o menos.
47. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 32-45, en donde el agonista hedgehog actúa sobre la transducción de señal mediada por hedgehog con un ED_{50} de 1 \muM o menos.
48. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 32-45, en donde el agonista hedgehog actúa sobre la transducción de señal mediada por hedgehog con un ED_{50} de 1 nM o menos.
49. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 32-48, en donde el medicamento es para una aplicación terapéutica ocosmética.
50. El uso de la reivindicación 49, en donde la aplicación terapéutica o cosmética se selecciona de la regulación de tejidos neurales, formación y reparación de huesos y cartílago, regulación de la espermatogénesis, regulación del músculo liso, regulación de pulmón, hígado y otros órganos generados a partir del intestino primitivo, regulación de la función hematopoyética, y regulación del crecimiento de la piel y del pelo.
51. El uso de la reivindicación 49, en donde la aplicación terapéutica o cosmética se selecciona del tratamiento o prevención de atrofias crónicas
52. El uso de la reivindicación 51, en donde las atrofias crónicas se seleccionan de esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Guillain-Barre y neuropatía crónica periférica, parálisis bulbar o atrofias musculares espinales, y degeneración cortico-cerebelar involucrando los lóbulos anteriores (áreas vermis y pierna) que es común en pacientes alcohólicos.
53. El uso de la reivindicación 49, en donde la aplicación terapéutica es el tratamiento o prevención de daños agudos, subagudos, o crónicos al, sistema nervioso seleccionados de daño químico, daño vascular, daño isquémico y daño resultante de apoplejía, daño inducido por tumor e infeccioso/inflamatorio.
54. El uso de la reivindicación 49, en donde la aplicación terapéutica es el tratamiento o prevención de enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso.
55. El uso de la reivindicación 54, en donde la enfermedad se selecciona de la enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, y degeneraciones espinocerebelar.
56. El uso de la reivindicación 49, en donde la aplicación terapéutica es el tratamiento o prevención de una enfermedad caracterizada por el envejecimiento aberrante del sistema nervioso.
57. El uso de la reivindicación 56, en donde la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer.
58. El uso de la reivindicación 49, en donde la aplicación terapéutica es el tratamiento o prevención de una enfermedad inmunológica crónica del sistema nervioso.
59. El uso de la reivindicación 58, en donde la enfermedad es la esclerosis múltiple.
60. Un compuesto representado por la fórmula general (XI):
Fórmula XI
\vskip1.000000\baselineskip
39 
\vskip1.000000\baselineskip
en donde, como la valencia permite,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, o un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o -Se-, a menos que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está ausente;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, y -P(=O)(OR)-;
R representa, independientemente para cada caso, H o alquilo sustituido o sin sustituir, en donde al menos uno de R en NR_{2} es un alquilo sustituido o sin sustituir;
Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico de seis miembros no aromático directamente unido a N y lleva un sustituyente NR_{2} en la posición 4 del anillo relacionado con N;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; incluyendo grupos policíclicos;
M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir; o dos M en conjunto representan eteno o etino sustituido o sin sustituir;
i representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia N-M_{i}-Y-Ar, donde i representa 1; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y=M_{k}-Y-Ar, donde k representa un número entero de 0 a 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
61. El compuesto de la reivindicación 60, en donde los sustituyentes N y amina sobre Cy están dispuestos en trans en el anillo, y representan 0 para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y-Mk-Ar, donde k representa 0 o 1
62. El compuesto representado por la Fórmula general X:
Fórmula X
\vskip1.000000\baselineskip
40 
\vskip1.000000\baselineskip
en donde, como la valencia permite,
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Z está ausente o representa un anillo arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir, o un sustituyente nitro, ciano o halógeno;
Y está ausente para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar donde Y está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S-, o -Se-, a menos que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está ausente;
X es seleccionado de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -C(=NCN)-, y -P(=O)(OR)-; y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos.
R representa, independientemente para cada caso, H o alquilo sustituido o sin sustituir, en donde al menos uno de R en NR_{2} es un alquilo sustituido o sin sustituir;
Cy' representa un arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; incluyendo grupos policíclicos;
M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir;
j representa, independientemente para cada caso, un número entero de 2 a 10;
i representa, independientemente para cada caso, un número entero de 0 a 5; y
k representa 0 para todos los casos excepto en la secuencia Z-Y-M_{k}-Y-Ar, donde k representa un número entero de 0 a 3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
63. El compuesto de la reivindicación 60, en donde
Z representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir; Y está ausente en todos los casos; k representa 0 para todos los casos
\newpage
64. El compuesto representado para la Fórmula general (II):
Fórmula II
41
en donde, como la valencia permite,
Ar y Ar' independientemente representa anillos arilo o heteroarilo sustituido o sin sustituir;
Y, independientemente para cada caso, está ausente;
X se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-, -S(O2)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=O)(OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido por 1-2 grupos seleccionados de grupos alquilo inferior, alquenilo y alquinilo;
M representa, independientemente para cada caso, un grupo metileno sustituido o sin sustituir; o dos M juntas que representan eteno o etino sustituido o sin sustituir, en donde alguno o todos los casos de M en forma de M_{j} forman todo o parte de una o estructura cíclica;
R representa, independientemente para cada caso, H o alquilo sustituido o sin sustituir, en donde al menos uno de R en NR_{2} es un alquilo sustituido o sin sustituir;
Cy' representa arilo heterociclilo, heteroarilo sustituido o sin sustituir, o cicloalquilo;
i representa, independientemente para cada caso, un número entero de 0 a 5; y
j representa, individualmente para cada caso, un número entero de 0 a 10;
en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo con uno a diez carbonos;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
65. El compuesto de la reivindicación 60, en donde
Ar representa un anillo arilo o heteroarilo opcionalmente substituido con R_{2};
Z representa un anillo arilo o heteroarilo opcionalmente substituido con R_{1};
Y está ausente para todos los casos;
k representa 0 para todos los casos;
R_{1} y R_{2} representan, independientemente y como permite la valencia, de 0-5 sustituyentes sobre el anillo al que está unido, seleccionado de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehído, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, -(CH_{2})_{p}alquilo, -(CH_{2})_{p}alquenilo, -(CH_{2})_{p}alquinilo, -(CH_{2})_{p}
arilo, (CH_{2})_{p}aralquilo, -(CH_{2})_{p}OH, -(CH_{2})_{p}O- alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}O-alquenilo inferior, O(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}SH,
-(CH_{2})_{p}S-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}S-alquenilo inferior, -S(CH_{2})_{n}R, -(CH_{2})_{p}N(R)_{2}, -(CH_{2})_{p}NR-alquilo inferior, -(CH_{2})_{p}
NR-alquenilo inferior, -NR(CH_{2})_{n}R, y formas protegidas de lo anterior; en donde alquilo inferior, alquenilo inferior y alquinilo inferior, respectivamente, se refieren a un grupo que poseen de uno a diez carbonos.
66. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 60-64, en donde NR_{2} representa una amina secundaria donde R representa un grupo alquilo sin sustituir.
67. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 60-64, en donde Ar es bicíclico.
68. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 60-67, en donde Cy' es un anillo bicíclico sustituido o sin sustituir.
69. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones60-68, en donde X se selecciona de -C(=O)-, -C(=S)-, y
-S(O_{2})-.
70. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 60-69, en donde Cy' es un grupo benzotiofeno sustituido o sin sustituir.
71. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 60-70, en donde Cy' es un grupo benzotiofen-2-ilo sustituido o sin sustituir.
72. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 60-71, en donde R es H o Me.
73. El compuesto de la reivindicación 60, en donde el compuesto se selecciona de cualquiera de los compuestos C1-C49
42
43
44
45
46
74. Una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los compuestos de la reivindicación 73.
75. Un método in vitro para usar agonistas en la ruta hedgehog en una célula, comprendiendo el contacto de una célula con los compuestos de la reivindicación 73.
76. El uso de cualquiera de los compuestos de la reivindicación 73 en la elaboración de un medicamento para modular la proliferación o diferenciación de una célula en un animal.
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