ES2240975T3 - Casete de expresion de una proteina p30 de toxoplasma gondii. - Google Patents
Casete de expresion de una proteina p30 de toxoplasma gondii.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA CASILLA DE EXPRESION PARA LA PRODUCCION Y LA SECRECION DE UNA PROTEINA P30 DE TAXOPLASMA GONDII EN UNA CELULA NO MAMIFERA, UN VECTOR, UNA CELULA QUE LA COMPRENDE Y LOS ANTICUERPOS QUE PUEDEN SER GENERADOS. SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE LA PROTEINA P30, UN PROCEDIMIENTO DE DETECCION DE ANTICUERPOS ANTITOXOPLASMA O DE LA PROTEINA P30, LOS REACTIVOS CORRESPONDIENTES ASI COMO A UNA COMPOSICION FARMACEUTICAS PARA EL TRATAMIENTO O LA PREVENCION DE UNA INFECCION CON TOXOPLASMA GONDII.
Description
Casete de expresión de una proteína P30 de
Toxoplasma gondii.
La presente invención tiene como objeto un
sistema de expresión de un antígeno de superficie de Toxoplasma
gondii, el antígeno obtenido de este modo y su utilización con
finalidad diagnóstica y/o terapéutica.
La toxoplasmosis es una enfermedad infecciosa
causada por un protozoo parásito, Toxoplasma gondii, miembro
de la clase Esporozos y del orden de los Coccidios. Toxoplasma
gondii es un parásito intracelular que se reproduce en una gran
variedad de tipos celulares en el interior de sus huéspedes, que son
los mamíferos.
Este parásito constituye un patógeno importante,
no sólo en medicina humana, sino también en medicina veterinaria,
que se extiende geográficamente de modo amplio.
En el hombre, se han descrito dos formas del
parásito: el "taquizoito", que es la forma de multiplicación
que se encuentra durante la fase aguda de la enfermedad, y el
"bradizoito", forma resistente que persiste enquistada en los
tejidos nerviosos y que es responsable, con seguridad, del
mantenimiento de una inmunidad duradera en la reinfección.
En el hombre, la toxoplasmosis cursa a menudo de
forma asintomática, y pasa la mayor parte del tiempo desapercibida
sin presentar consecuencias. Existen, sin embargo, casos para los
cuales una infección por el toxoplasma o una reactivación de una
infección adquirida anteriormente, puede generar alteraciones graves
para las personas denominadas de riesgo, que son las mujeres
embarazadas y los individuos inmunodeprimidos o con inmunosupresión.
Este organismo presenta lugares de replicación múltiples. Sin
embargo, puede ser responsable de dolencias oculares y cerebrales
graves cuando su lugar de replicación son las células del sistema
nervioso central y las células del sistema reticuloendotelial. La
mujer embarazada representa un individuo de alto riesgo, ya que una
infección toxoplásmica, especialmente durante los primeros meses
del embarazo, puede originar graves complicaciones fetales y
neonatales, si no se emprende precozmente el tratamiento maternal y
se prosigue asiduamente. En particular, los recién nacidos que están
contaminados por la vía transplacentaria, están sometidos a
dolencias cerebrales y oculares graves, incluso mortales en ciertos
casos. Los enfermos inmunodeprimidos y particularmente, los afectos
de SIDA, están sometidos a toxoplasmosis graves, debido lo más
frecuente a la reactivación de infecciones
anteriores.
anteriores.
Era pues, indispensable, disponer de ensayos
diagnósticos que permitieran determinar la presencia del parásito
particularmente en la mujer embarazada, bien mediante la detección
de anticuerpos eventualmente presentes en el individuo, o mediante
la detección de la presencia de antígenos del toxoplasma en el
individuo.
HUGUES en "Current topics in Microbiology and
Immunology", Vol. 120 (1985), SPRINGER Ed, páginas
105-139, ha listado cierto número de ensayos
serodiagnósticos disponibles comercialmente, tales como la prueba de
coloración de SABIN y FELDMAN, estandarizada por BEVERLY y BEATTLE
en 1958 y pefeccionada por FELDMAN y LAMB (1966), WALDELAND (1976) y
BALFOUR et al (1982); la prueba de detección de anticuerpos
mediante inmunofluorescencia de REMINGTON (1968), optimizada en 1975
por KARIM y LUDLAM; las pruebas de hemoaglutinación; la prueba ELISA
para la detección de anticuerpos específicos del Toxoplasma,
mediante aislamiento de la IgM in situ sobre microplaca,
descrita en 1983 por WIELARRD et al.
Las distintas pruebas puestas en práctica se
basan en la detección de anticuerpos o de antígenos específicos de
la toxoplasmosis. Uno de los puntos críticos consistía, pues, en la
caracterización de los antígenos importantes de Toxoplasma
gondii, que indujeran una respuesta inmunitaria específica y
fueran susceptibles de utilizarse en las pruebas serológicas de
detección.
A este respecto, Burg et al (Abstract c85
J. Cell. Biochem., 1986, 1017, 145) han descrito la
explotación de una genoteca de expresión en E. coli
utilizando ADN complementario (ADNc) obtenido a partir de ARN
mensajeros de Toxoplasma gondii, y el aislamiento a partir
de esta genoteca, de secuencias que codifican los antígenos que se
encuentran en la superficie del parásito, mediante antisueros
policlonales dirigidos contra las proteínas antigénicas de
superficie purificadas P30 y P22.
Hay autores que han mostrado que la P30
constituye el antígeno superficial más importante (véase Kasper
et al., J. Immunol. 1983, 130,
2407-2412), y puede utilizarse para la producción
de vacunas o en las pruebas diagnósticas, particularmente en los
inmunoensayos. Además, Boothroyd et al (véase la solicitud de
patente WO 89/08700), han identificado y obtenido el material
genérico que codifica la P30 de Toxoplasma gondii y sugieren
la utilización del gen para la producción de proteína recombinante,
de péptidos y de anticuerpos. Este gen se ha clonado (Burg et
al., 1988, J. Immunol., 141, 3584-3591).
El análisis de la secuencia muestra una señal de secreción situada
en el extremo N-terminal que se separa en la
proteína P30 madura y una región C-terminal
fuertemente hidrófoba que igualmente se separa y que es cambiada por
un glucolípido que permite su anclaje en la membrana y un sitio
potencial de N-glucosilación.
Persiste sin embargo un problema, que consiste en
la obtención de cantidades suficientes del antígeno P30 que sirvan
tanto para la preparación de vacunas como para su utilización en
las pruebas inmunológicas. Kim et al (Infection and
Immunity, enero 1994, 62, 203-209), han
descrito la expresión, en las células CHO, de una P30 recombinante
conformada de modo similar a la de la proteína natural, que tiene
éxito, sin embargo, en la obtención de tasas satisfactorias de
expresión.
Existe además un interés en la producción de una
P30 que se secrete en el medio de cultivo, para facilitar su
obtención, así como poder utilizarla en la preparación de pruebas
diagnósticas o de composiciones farmacéuticas.
En consecuencia, la presente invención tiene como
objeto un casete de expresión funcional en una célula que proviene
de un organismo eucariota no mamífero, que permite la expresión de
un fragmento de ADN que codifica una proteína P30 de Toxoplasma
gondii, situado bajo el control de los elementos necesarios para
su expresión; siendo secretada dicha proteína P30 a partir de dicha
célula que procede de un organismo eucariota y siendo reconocida
por antisueros humanos.
De forma general, en el ámbito de la presente
invención puede utilizarse cualquier célula que proceda de un
organismo eucariota no mamífero, y muy particularmente, una célula
de insecto o una célula que proceda de un organismo eucariota
inferior. El término "célula que procede de un organismo
eucariota inferior" se refiere a una célula que procede de un
organismo eucariota unicelular o pluricelular que no posee un
mecanismo que permite la diferenciación celular. Dichas células se
conocen por el experto en la materia. Se preferirá, sin embargo,
recurrir a un hongo, particularmente unicelular, o a una levadura,
particularmente de la cepa Kluyveromyces, Pichia,
Hasegawaea, Saccharomyces o
Schizosaccharomyces, y seleccionada muy particularmente
entre el grupo formado por Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces
malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae,
Schizosaccharomyces octosporus y Hasegawaea japonicus.
Por supuesto que estos ejemplos no son limitativos. Un gran número
de estas células están comercialmente disponibles en colecciones
tales como la ATCC (Rockville, MA, USA) y la AFRC (Agriculture and
Food Research Council, Norfolk, UK).
A los fines de la presente invención, dicha
célula puede ser de tipo salvaje o mutante. En este contexto, se
prefiere particularmente una célula mutante auxótrofa que haya
perdido la capacidad de sintetizar un metabolito esencial para su
crecimiento, por lo menos, de forma que no pueda crecer mas que en
un medio suplementado por este metabolito específico o mediante
complementación con un gen que permita su síntesis. Aunque se
conozcan actualmente muchas mutaciones auxotróficas para distintos
metabolitos esenciales, se pueden citar más particularmente las
mutaciones que inhiben la síntesis de la arginina, de la leucina y
del uracilo. Dichas mutaciones se describen en la literatura que
puede consultar el experto en la materia. Se pueden generar
generalmente muchas mutaciones auxotróficas que afecten a diversas
vías biosintéticas aplicando el siguiente planteamiento:
brevemente, basta con cultivar paralelamente las células de tipo
salvaje tratadas mediante un mutágeno en presencia y en ausencia
del metabolito esencial diana y buscar los mutantes que no se
multiplicarán mas que en su presencia, contrariamente a las células
salvajes, que pueden crecer en los dos casos.
Un casete de expresión según la invención, está
destinado a la producción de una proteína P30 secretada por la
célula procedente de un organismo eucariótico no mamífero y
reconocida por antisueros antitoxoplásmicos. Dichos antisueros
provienen de pacientes que contrajeron una toxoplasmosis reciente o
lejana y que contienen inmunoglobulinas que reconocen los antígenos
de Toxoplasma gondii y particularmente, la P30. Ni que decir
tiene que dicha proteína P30 puede ser reconocida igualmente
mediante otros anticuerpos dirigidos contra la proteína P30 natural,
como por ejemplo los anticuerpos monoclonales o policlonales
obtenidos mediante inmunización de especies variadas con la
proteína natural.
Por proteína P30 se entiende el antígeno
superficial de Toxoplasma gondii producido mediante las
técnicas de recombinación genética descritas en la presente
solicitud, o cualquier fragmento o mutante de este antígeno, con la
condición de que reaccione inmunológicamente con los anticuerpos
dirigidos contra la proteína P30 de este parásito. Ventajosamente,
dicha proteína posee una secuencia en aminoácidos que presenta un
grado de homología de por lo menos un 70%, preferentemente de por lo
menos un 85%, y de forma completamente preferida, por lo menos, de
un 95%, respecto a la secuencia especificada por Burg et al
(1988, supra). Prácticamente, dicho equivalente puede
obtenerse mediante deleción, sustitución y /o adición de uno o
varios amino ácidos de la proteína original. El experto en la
materia conoce las técnicas que permiten efectuar estas
modificaciones sin que quede afectado el reconocimiento
inmunológico.
Un fragmento de ADN que se utilice con la
finalidad de la presente invención, puede obtenerse mediante
cualquier procedimiento que se utilice en el ámbito de la técnica,
por ejemplo clonando una genoteca de ADN genómico de Toxoplasma
gondii o de ADN complementario (ADNc) con una sonda adecuada
mediante PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) o aún, mediante
síntesis química.
En al ámbito de la presente invención, se
recurrirá a una proteína P30 a la que le falte la totalidad o parte
de la región C-terminal hidrófoba y que comprenda
los elementos apropiados para permitir la secreción, como por
ejemplo una señal de secreción. Por supuesto, esta última puede ser
homóloga, es decir, proceder de la proteína P30 original. En este
contexto, un casete de expresión preferido según la invención
permitirá la producción de una proteína P30 que presente una
secuencia tal como la que se muestra en el identificador de
secuencia nº: 1 que empieza en el aminoácido +1 y que finaliza en
el aminoácido +299. Como se ha dicho anteriormente, puede tratarse
igualmente de un mutante o de un fragmento de dicha proteína
P30.
Alternativamente, se puede utilizar igualmente
una señal heteróloga de secreción, es decir, que proceda de una
proteína secretada o membranosa cualquiera, con la condición, sin
embargo, que sea funcional en la célula que proceda del organismo
eucariota no mamífero que se considere. Según esta variante, un
casete de expresión según la invención incluye un fragmento de ADN
que codifica una proteína P30 que posee una secuencia tal como la
que se ha mostrado en el identificador secuencial nº:1 que comienza
en el aminoácido +31 y que finaliza en el aminoácido +299, o un
fragmento o mutante de dicha proteína P30, comprendiendo dicho
fragmento de ADN, además, una secuencia que codifica una señal
heteróloga de secreción. Este último se sitúa generalmente por
encima del primer residuo N-terminal de la proteína
P30 madura, es decir, el residuo 31 de la SEC ID nº:1. La elección
de una señal de secreción es amplia y está en las manos del experto
en la materia.
Como ejemplo, se cita la de la fosfatasa ácida
principal (pho1) de Schizosaccharomyces pombe (Elliot et
al., 1986, J. Biol. Chem. 261,
2936-2941) y la secuencia pre-pro de
la feromona sexual alfa (Mating Factor alfa o MF\alpha) de
Saccharomyces cerevisiae (Kurjan et Herskowitz, 1982, Cell,
30, 933-934).
Según una forma de realización ventajosa, un
casete de expresión según la invención permite la producción de una
proteína P30 de Taxoplasma gondii no glucosilada. Aunque
todos los procedimientos convencionales puedan ponerse en práctica
para inhibir la N-glucosilación en la célula
procedente del organismo eucariota no mamífero que se considere,
como por ejemplo, la adición de tunicamicina al medio de cultivo,
se prefiere sin embargo mutar el sitio potencial de
N-glucosilación, con el fin de que ya no sea
reconocido por los enzimas celulares que participan en la
glucosilación. Para esto, se utiliza preferentemente un fragmento de
ADN que codifica una proteína P30 que comprende una mutación por lo
menos; dicha mutación está caracterizada por la presencia de un
residuo aminoácido distinto del residuo natural en posición 241 y/o
243 de la secuencia tal como la que se ha mostrado en el
identificador de secuencia nº:1, con la condición de que el residuo
aminoácido en posición 243 no sea una treonina. Un mutante de la
proteína P30 particularmente preferido en el ámbito de la presente
invención incluye un residuo glutamina en posición 241, en lugar del
residuo natural de asparagina.
Por supuesto, un casete de expresión según la
invención puede permitir la producción de una proteína P30 (que
posee una secuencia en aminoácidos tal como la que se ha
especificado anteriormente), fusionada con un elemento exógeno que
pueda ayudar a su estabilidad, su purificación o su producción. La
elección de tal elemento es amplia y está al alcance del experto en
la materia. Puede tratarse particularmente de una proteína o de un
péptido exógeno. Se puede citar, por ejemplo, la proteína pho1 de
Schizosaccharomyces pombe, la
\beta-galactosidasa, un encadenamiento de
residuos de lisina (poli Lys) o histidina (poli His). La fusión
puede tener lugar en N o en C-terminal de la
proteína P30 que se utilice en la presente invención.
Un casete de expresión según la invención incluye
elementos necesarios para la expresión de dicho fragmento de ADN en
la célula procedente del organismo eucariota no mamífero que se
considere. Por "elementos necesarios para la expresión" se
entiende el conjunto de elementos que permiten la transcripción de
un fragmento de ADN en ARN mensajero (ARNm) y la traducción de este
último en la proteína. Entre éstos, la región promotora reviste una
importancia particular. Puede ser constitutiva, es decir, permitir
un nivel de transcripción constante a lo largo del ciclo celular.
Como ejemplos no limitativos, se indican las regiones promotores
procedentes de los genes PGK
(3-fosfoglicerato quinasa) y MF\alpha de
Saccharomyces cerevisiae (Hitzeman et al., 1983,
Science, 219, 620-625), adh (alcohol
deshidrogenasa) de Schizosaccharomyces pombe (Russel et
Hall, 1983, J. Biol. Chem., 258, 143-149) y
los promotores precoz p39K (Guarino et al., 1986, J. Virol.,
57, 563) y tardío p12,5K (Hill-Perkins et
al., 1990, J. Gen. Virol., 71, 971-976)
de baculovirus.
Sin embargo, puede ser ventajoso recurrir a una
región promotora regulable que permite variar los niveles de
transcripción en función de las condiciones de cultivo o de la fase
de crecimiento celular según la presencia de un inductor (activación
de la transcripción) o de un represor (represión). De forma
general, las regiones promotoras regulables proceden de genes
regulables para los cuales los mecanismos de regulación pueden ser
muy variados. Tratándose de Schizosaccharomyces pombe, se
pueden citar los genes de choque térmico cuya expresión aumenta con
la temperatura (Gallo et al., 1991, Mol. Cell. Biol.,
11, 281-288) y el gen que codifica la enzima
fructosa bifosfatasa (bfp), cuya transcripción está reprimida
en presencia de glucosa e inducida en condiciones de carencia
(Hoffman et Winston, 1989, Gene, 84,
473-479). Entran igualmente en esta categoría, los
genes regulables por la tiamina, como los genes pho4 (Yang
et Schweingruber, 1990, Curr. Genet., 18,
269-272), nmt1 (Maundrell, 1990, J. Biol.
Chem., 265, 10857-10864) y thi2
(Zurlinden et Schweingruber, 1992, Gene, 117,
141-143), cuya expresión está regulada a nivel
transcripcio-
nal por la tiamina, y reprimida, más precisamente, en presencia de tiamina e inducida o desreprimida en su ausencia.
nal por la tiamina, y reprimida, más precisamente, en presencia de tiamina e inducida o desreprimida en su ausencia.
Tratándose de una región promotora regulable, se
prefiere muy particularmente recurrir a una región promotora
regulable por la tiamina. Esta última puede aislarse, mediante
técnicas convencionales, de genes que respondan a este tipo de
regulación, tales como los mencionados anteriormente. Por supuesto,
puede modificarse mediante mutación, deleción y/o adición de uno o
varios nucleótido(s) respecto a la secuencia de la región
promotora original, a condición sin embargo que estas modificaciones
no alteren de forma drástica su capacidad de regulación. Se puede
igualmente utilizar un fragmento de tal región promotora,
particularmente un fragmento que incluya las secuencias de
activación y/o de represión responsables de la regulación por la
tiamina. Éste se sitúa por encima de sitios convencionales de una
secuencia TATA y de un sitio de iniciación de la transcripción,
capaces de iniciar la transcripción en la célula procedente del
organismo eucariota no mamífero que se considere. Aunque un solo
fragmento de la región promotora sea suficiente para asegurar la
regulación mediante la tiamina, se puede considerar igualmente,
para mejorar los niveles de expresión, la utilización de varios
fragmentos situados en tandem y en una orientación cualquiera
respecto a la secuencia TATA.
Un casete de expresión según la invención,
particularmente interesante, es el que asocia una región promotora
procedente del gen pho4 de Schizosaccharomyces pombe
y un fragmento de ADN que codifica una proteína P30 tal como la
definida anteriormente.
Por otra parte, un casete de expresión según la
invención puede, además, contener otros elementos que contribuyen a
la expresión del fragmento de ADN, particularmente una secuencia de
finalización de la transcripción, tal como la del gen arg3
de Schizosaccharomyces pombe (Van Huffel et al., 1992,
Eur. J. Biochem., 205, 33-43), así como las
secuencias activadoras de la transcripción.
Según una forma de realización particularmente
ventajosa, un casete de expresión según la invención permite la
producción, bajo forma secretada de la célula del no mamífero, de
0,1 mg/l por lo menos de una proteína P30, ventajosamente, por lo
menos, 0,2 mg/l y preferentemente, 0,3 mg/l por lo menos.
La presente invención abarca igualmente un vector
que comprende un casete de expresión según la invención. Puede
tratarse de un vector vírico y particularmente de un vector
derivado de un baculovirus, destinado muy particularmente a la
expresión en una célula de insecto.
Puede igualmente tratarse de un vector plasmídico
de replicación autónoma y en particular, de un vector multicopia
que presente entre 5 y 500 copias en la célula huésped,
ventajosamente entre 10 y 400 copias, y, preferentemente, entre 20 y
300 copias. Se citan, como ejemplo, los vectores derivados de pGEM3
(Weilguny et al., 1991, Gene, 99,
47-54) y pFL20 (Losson y Lacroute, 1983, Cell,
32, 371-377). Además, un vector según la
invención puede igualmente incluir elementos que aseguren su
replicación, tales como el origen 2 de Saccharomyces
cerevisiae o ars de Schizosaccharomyces pombe y,
opcionalmente, ori de Escherichia coli. Además, puede
igualmente comprender un gen de selección, como (i), un gen que
permite la síntesis de un metabolito esencial, particularmente el
gen URA3 o LEU2 de Saccharomyces cerevisiae y
el gen ura4 o leu1 de Schizosaccharomyces pombe
o (ii), un gen de resistencia a un antibiótico.
La presente invención se refiere igualmente a una
célula procedente de un organismo eucariótico no mamífero, que
comprende un casete de expresión según la invención, sea bajo forma
integrada en el genoma celular, o inserta en un vector. Una célula
según la invención se ha definido anteriormente. Se prefiere muy
particularmente, una célula de insecto, un hongo unicelular o una
levadura, particularmente una levadura seleccionada de entre el
grupo formado por Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces
malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae,
Schizosaccharomyces octosporus y Hasegawaea
japonicus.
La presente invención se refiere igualmente a una
proteína P30 producida por una casete de expresión, un vector o una
célula procedente de un organismo eucariota no mamífero según la
invención. En el ámbito de la presente invención, la proteína P30
puede modificarse in vitro, particularmente mediante adición
o deleción de grupos químicos, tales como fosfatos, azúcares o
ácido mirístico, de forma que se mejore su estabilidad o la
presentación de uno o varios epítopos.
La presente invención tiene igualmente como
objeto un procedimiento para la preparación de una proteína P30,
según el cual:
- (i)
- se cultiva en condiciones apropiadas, una célula procedente de un organismo eucariota no mamífero; y
- (ii)
- se recupera dicha proteína secretada de dicha célula procedente de un organismo eucariota no mamífero.
En el ámbito de la invención, la proteína P30 se
recupera directamente en el medio de cultivo según las técnicas
convencionales de purificación, como por ejemplo la cromatografía
intercambiadora de iones o de interacciones hidrófobas, la
filtración sobre gel o la inmunopurificación.
Tratándose de la variante según la cual la
proteína P30 se produce utilizando un casete de expresión que
incluye una región promotora regulable mediante la tiamina y,
procedente, en particular, del gen pho4 de
Schizosaccharomyces pombe, las células que albergan dicho
casete se cultivan en un medio suplementado en tiamina cuando el
cultivo apunta únicamente a su propagación. Cuando un cultivo se
emprende con objeto de obtener una proteína P30 de Toxoplasma
gondii, las células se transfieren a un medio desprovisto de
tiamina. Tal variante está destinada a llevarse a cabo más
particularmente con células eucariotas inferiores. De este modo,
según un procedimiento de la inven-
ción:
ción:
- (i)
- se cultiva en condiciones apropiadas, en ausencia de tiamina, una célula procedente de un organismo eucariota inferior; y
- (ii)
- se recupera dicha proteína secretada de dicha célula procedente de un organismo eucariota inferior.
La presente invención se refiere también a un
reactivo para la detección y/o la vigilancia de una infección por
Toxoplasma gondii, que comprende como sustancia reactiva una
proteína recombinante tal como la definida anterior-
mente.
mente.
El reactivo anterior se fija o fijará directa o
indirectamente sobre un soporte sólido apropiado. El soporte sólido
puede tener, sin limitación, forma de cono, tubo, pocillo, esfera o
similar.
El término "soporte sólido", tal como se
utiliza en la presente memoria, incluye todos los materiales sobre
los que puede inmovilizarse un reactivo para utilizarlo en ensayos
diagnósticos. Materiales naturales, de síntesis, modificados
químicamente o no, pueden utilizarse como soporte sólido,
particularmente los polisacáridos tales como materiales de
celulosa, por ejemplo papel, derivados de celulosa tales como el
acetato de celulosa y nitrocelulosa; polímeros tales como cloruro de
vinilo, polietileno, poliestirenos, poliacrilato o copolímeros
tales como polímero de cloruro de vinilo y de propileno, polímeros
de cloruro de vinilo y acetato de vinilo; copolímeros a base de
estireno; fibras naturales tales como algodón y fibras sintéticas
tales como nylon.
Preferentemente, el soporte sólido es un polímero
de poliestireno o un copolímero de
butadieno-estireno. Ventajosamente, el soporte es un
poliestireno o un copolímero a base de estireno que comprende entre
un 10 y un 90% en peso aproximadamente de motivos estireno.
La fijación del reactivo sobre el soporte sólido
puede llevarse a cabo de forma directa o indirecta.
De forma directa, son posibles dos
planteamientos: mediante adsorción del reactivo sobre el soporte
sólido, es decir, mediante enlaces no covalentes (principalmente de
tipo hidrógeno, Van der Walls o iónico), o estableciendo enlaces
covalentes entre el reactivo y el soporte.
De forma indirecta, se puede fijar previamente
(mediante adsorción o covalencia) sobre el soporte sólido un
compuesto "anti-reactivo" capaz de interactuar
con el reactivo, de forma que se inmovilice el conjunto sobre el
soporte sólido. Como ejemplo, se puede citar un anticuerpo
anti-P30, con la condición de que reaccione
inmunológicamente con una parte de la proteína distinta de la que
intervenga en la reacción de reconocimiento de los anticuerpos
séricos; un sistema ligando-receptor, por ejemplo,
injertando sobre la proteína P30 una molécula tal como una vitamina
e inmovilizando sobre la fase sólida el receptor correspondiente
(por ejemplo, el sistema biotina-estreptavidina).
Por forma indirecta, se entiende igualmente el injerto previo o la
inserción mediante recombinación genética de una proteína o de un
polipéptido en un extremo de la proteína P30 y la inmovilización de
esta última sobre el soporte sólido mediante adsorción pasiva o
covalencia de la proteína o del polipéptido.
La invención se refiere aún a un procedimiento
para la detección de anticuerpos antitoxoplasma en una muestra
biológica, tal como una muestra de sangre, de un individuo o de un
animal susceptible de estar o de haber estado infectado por
Toxoplasma gondii, según el cual se llevan a cabo, por lo
menos, las etapas siguientes:
- -
- se prepara una mezcla que incluye:
- i)
- un reactivo tal que como el definido anteriormente, que es o será inmovilizado sobre un soporte sólido,
- ii)
- la muestra,
- iii)
- una antiinmunoglobulina marcada;
- -
- se incuba la mezcla durante un tiempo predeterminado;
- -
- se separa la fase sólida de la fase líquida; y
- -
- se pone en evidencia la presencia eventual del anticuerpo antitoxoplasma midiendo el grado de marcaje en la fase sólida.
En una forma de realización de la invención,
- -
- se prepara una mezcla que comprende:
- i)
- el reactivo inmovilizado sobre el soporte sólido, y
- ii)
- la muestra;
- -
- se incuba la mezcla durante un tiempo predeterminado que permita la formación de un complejo inmune que se inmoviliza sobre el soporte sólido;
- -
- se añade una antiinmunoglobulina marcada en condiciones de incubación apropiadas que permitan su reacción con el complejo inmune inmovilizado;
- -
- se separa la fase sólida de la fase líquida; y
- -
- se pone en evidencia la presencia eventual de anticuerpos antitoxoplasma midiendo el grado de marcaje en la fase sólida.
En otra forma de realización de la invención, el
procedimiento para la detección de anticuerpos antitoxoplasma en
una muestra biológica tal como una muestra de sangre de un
individuo o de un animal susceptible de estar o de haber estado
infectado por Toxoplasma gondii, comprende, por lo menos,
las etapas siguientes:
- -
- se prepara una mezcla que incluye:
- i)
- una antiinmunoglobulina que se fija o se fijará sobre un soporte sólido;
- ii)
- la muestra;
- iii)
- un reactivo marcado, que comprende como sustancia reactiva la proteína P30 anteriormente citada;
- -
- se incuba la mezcla durante un tiempo predeterminado;
- -
- se separa la fase líquida de la fase sólida; y
- -
- se pone en evidencia la presencia de eventuales anticuerpos antitoxoplasma midiendo el grado de marcaje en la fase sólida.
Ventajosamente, se prepara una mezcla que incluye
la antiinmunoglobulina fijada sobre el soporte sólido y la
muestra,
- -
- se incuba la mezcla durante un tiempo predeterminado que permita la formación de un complejo inmune que se inmovilice sobre el soporte sólido;
- -
- se separa la fase líquida de la fase sólida;
- -
- se añade el reactivo marcado que incluye como sustancia reactiva la proteína P30 anteriormente citada; y
- -
- se pone en evidencia la presencia de eventuales anticuerpos antitoxoplasma midiendo el grado de marcaje en la fase sólida.
Como ejemplo, se puede citar como marcador un
enzima tal como la peroxidasa de Raifort, la fosfatasa alcalina; un
isótopo radioactivo tal como ^{125}I, ^{3}H, ^{57}Co, un
marcador luminiscente o similar.
La invención se refiere igualmente a anticuerpos
monoclonales o policlonales obtenidos mediante reacción
inmunológica de un organismo humano o animal provisto de un agente
inmunógeno constituido por la proteína P30 recombinante, y la
utilización de ésta como sustancia reactiva en un reactivo para la
detección y/o la vigilancia de una infección por Toxoplasma
gondii en una muestra biológica tal como la obtenida en un
muestreo tisular; marcándose previamente los anticuerpos mediante
cualquier marcador apropiado, tal como el definido
anteriormente.
También, la invención tiene como objeto un
procedimiento para la detección de la proteína P30 de Toxoplasma
gondii en una muestra biológica tal como la obtenida en un
muestreo tisular de un individuo o de un animal susceptible de estar
o de haber estado infectado por Toxoplasma gondii, según el
cual se pone en contacto la muestra y un reactivo tal como los
definidos anteriormente en condiciones apropiadas que permitan una
eventual reacción inmunológica, detectándose la presencia eventual
de un complejo inmune formado con el reactivo anteriormente citado
midiendo el grado de marcaje en la muestra biológica.
La invención tiene asimismo como objeto una
composición inmunoterapéutica activa, particularmente una
preparación vacunal, que comprende como principio activo una
proteína P30 recombinante, conjugándose eventualmente el principio
activo con un soporte farmacéuticamente aceptable, y eventualmente,
un excipiente y/o un adyuvante apropiado.
La presente invención abarca igualmente una
composición farmacéutica destinada al tratamiento o a la prevención
de una infección por Toxoplasma gondii en el hombre o en un
animal, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un
casete de expresión, de un vector, de una célula procedente de un
organismo eucariota no mamífero, o de una proteína P30 según la
invención, o preparado según un procedimiento según la
invención.
Los ejemplos que se mencionan a continuación
permitirán evidenciar otras características y ventajas de la
presente invención. Estos ejemplos se ilustran refiriéndolos a las
figuras siguientes.
La Figura 1 es una representación esquemática del
vector pTG3747 para la expresión de una proteína P30 de
Toxoplasma gondii en Saccharomyces cerevisiae.
La Figura 2 es una representación esquemática del
vector pTG8630 para la expresión de una proteína P30 no glucosilada
de Toxoplasma gondii en una cepa de Schizosaccharomyces
pombe auxótrofa para el uracilo.
La Figura 3 es una representación esquemática del
vector pTG8638 para la expresión de una proteína P30 de
Toxoplasma gondii en una cepa de Schizosaccharomyces
pombe de tipo salvaje auxótrofa para el uracilo.
Las construcciones que se describen a
continuación se llevaron a cabo según las técnicas generales de
ingeniería genética y de clonación molecular que se detallan en
Maniatis et al (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El conjunto de las
etapas de clonación que utilizan plásmidos bacterianos se realiza
mediante paso en la cepa de Escherichia coli (E.
coli) 5K. En cuanto a las etapas en las que interviene un
bacteriófago de tipo M13, se realizan en E. coli JM101.
Se utiliza la técnica del acetato de litio (Ito
et al., 1983, J. Bacteriol., 153,
163-168)para introducir los distintos
vectores en las cepas de Schizosaccharomyces pombe y
Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, puede utilizarse
igualmente cualquier otra técnica estándar. Por otra parte, en lo
que se refiere al gen que codifica la proteína P30, la posición de
los nucleótidos corresponde a la que se especifica en Burg et
al (1988, supra).
Se aíslan las secuencias que codifican la
proteína P30 de Toxoplasma gondii a partir de un plásmido de
la técnica anterior que incluye el gen correspondiente (gen P30)
que abarca por lo menos los nucleótidos 334 a 1632. Este plásmido de
iniciación se denomina en lo sucesivo pbM 89.
Se genera mediante PCR (reacción en cadena de la
polimerasa) un fragmento de ADN que codifica una proteína P30
madura, desprovista del péptido señal natural y provista de un
codon de detención en la parte C terminal, justo por encima del
nucleótido 1258. Se utiliza como matriz el vector pbM89 y los
iniciadores 1367, que lleva en el extremo 5' un sitio
HindIII (SEC ID nº:2) y 1366, que lleva en el extremo 5' un
sitio SalI (SEC ID nº: 3). Paralelamente, se aísla del vector
M13TG3868 un fragmento SphI-HindIII que incluye el
promotor del gen MF\alpha seguido por las secuencias que
codifican el péptido pre-pro del mismo gen. El
vector M13TG3868 procede del vector M13TG3841, que se describe en la
publicación de la solicitud internacional WO 90/13646, en el cual
se ha introducido un sitio HindIII en el extremo 3' de la
secuencia pro MF\alpha. Dicha modificación está al alcance
del experto en la materia. Este fragmento
SphI-HindIII, así como el producto de amplificación
digerido por HindIII y SaII, se clonan entre los
sitios SphI y SalI del vector pTG4812. Este último
proviene del vector pTG3828, que se describe en la solicitud
europea EPA 396 436, en el cual se ha introducido el gen
KEX2 que codifica una endoproteasa capaz de separar las
secuencias pre seguidas por pro MF\alpha (secuencia que se
indica en este mismo documento europeo). Se obtiene pTG3747 que
contiene, particularmente, el promotor MF\alpha que dirige
la expresión de un fragmento que incluye las secuencias pré-pro
MF\alpha seguidas por secuencias que codifican la P30
madura. El gen de selección que permite el aislamiento de los
clones, está constituido por el gen URA3 de Saccharomyces
cerevisiae.
Por supuesto, está al alcance del experto en la
materia volver a clonar el gen de la P30, amplificado previamente
mediante PCR, a partir de ADN extraído de Toxoplasma gondii
en los plásmidos apropiados, con objeto de obtener nuevas
construcciones.
Se introdujo pTG3747 en una cepa de levadura de
la especie Saccharomyces cerevisiae, como la cepa TGY 73.4
de genotipo MF\alpha, pra1, prb1, prc1, csp1, ura3, his3,
pep4-3. La cepa no transformada se desarrolló
en un medio rico, por ejemplo el medio YPG (1% de extracto de
levadura, 1% de bactopeptona DIFCO y un 2% de glucosa). Después de
transformación mediante el vector pTG3747, se seleccionaron los
prototrofos Ura+ sobre un medio mínimo, por ejemplo, el medio YNBG
(que contiene el 0,7% de bases nitrogenadas para levadura (Yeast
Nitrogen Base DIFCO), 0,5% de casaminoácidos y 1% de glucosa). Las
colonias seleccionadas se analizaron de la forma siguiente. Después
de 24 horas de precultivo en medio mínimo, se diluyeron las células
de forma que se obtuviera una DO_{600nm} de 1 aproximadamente,
prosiguiéndose el cultivo en las mismas condiciones durante
alrededor de 72 horas. Mediante centrifugación, se separaron
células y sobrenadante. Se precipitó una alícuota del sobrenadante
del cultivo, bien mediante el ácido tricloroacético (0,3M final) en
el caso de un reconocimiento don un anticuerpo de origen animal o
con PEG-4000 (20% final) en el caso de un
reconocimiento con un anticuerpo de origen humano. El sedimento de
precipitación se volvió a diluir en un tampón de depósito
(alrededor de 1/200 del volumen de partida) que no incluía agente
reductor (-mercaptoetanol o DTT). El análisis se llevó a cabo
mediante transferencia Western después de una migración
electroforética sobre un gel SDS-PAGE 12%, seguido
de una transferencia sobre una membrana de nitrocelulosa (0,45
\mum, Schleicher Schüll). Ésta se incubó con un suero policlonal
de conejo antitoxoplasma positivo, un antisuero humano antitoxo
positivo o el anticuerpo monoclonal 1E1E7 que reconoce un epítopo
de la proteína P30 (Fortier et al., 1991, Eur.J. Microbiol.
infect. Dis., 10, 38-40). La reacción se
reveló mediante un conjugado anti-conejo,
anti-humano o anti-ratón marcado con
la fosfatasa alcalina
(Immunoresearch).
(Immunoresearch).
Cuando se analizan los sobrenadantes del cultivo
de la cepa TGY 73.4, se detecta una proteína P30 recombinante que
se presenta con forma de un material heterogéneo, probablemente
debido a fragmentaciones proteolíticas por el enzima KEX2 o de una
gran heterogeneidad en la glucosilación, que se reconoce sin embargo
en la transferencia Western mediante antisueros humanos
antitoxoplasma positivos.
El plásmido pEVp11 (Russell y Nurse, 1986, Cell,
45, 145-153), contiene la región promotora
del gen adh de Schizosaccharomyces pombe bajo forma de
un fragmento SphI-EcoRI de 700 pares de
bases, estando el sitio EcoRI situado en la región del
extremo 5' del gen adh, 59 pares de bases por encima del
iniciador ATG. Es digerido por los enzimas EcoRI y
HindIII y se introduce un fragmento sintético que resulta de
la reasociación de los oligonucleótidos de cadena única OTG2781 y
OTG2782 (descritos respectivamente en las SEC ID nº:4 y nº:5), con
el fin de completar la región promotora adh hasta 11 pares de
bases por encima del ATG iniciador y de crear los sitios de
restricción apropiados que faciliten las etapas ulteriores de
clonación. Se genera pTG1702.
Un fragmento HpaI-ClaI de 0,92
pares de bases se aísla de pCVH3 (Van Huffel et al., 1992,
Eur. J. Biochem., 205, 33-43), tratándose
seguidamente con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. Este
fragmento incluye los últimos codones del gen arg3 de
Schizosaccharomyces pombe seguidos por la secuencia de
finalización de la transcripción. Se inserta en pTG1702 digerido
por HindIII y cuyos extremos se han convertido en libres por
tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, para dar
pTG1746.
pTG1746 es digerido por XbaI y tratado con
el fragmento Klenow de la ADN polimerasa antes de ser digerido por
BamHI. El fragmento que incluye las secuencias de
finalización de la transcripción, se introduce en el vector pDW230
digerido por EcoRI, se somete a un tratamiento con el
fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y se digiere seguidamente
con BamHI. Se obtiene pTG1751.
El vector pDW230 es similar al pDW232 descrito en
la literatura (Weilguny et al., 1991, Gene, 99,
47-54). Proceden los dos de pGEM3, en el que se ha
insertado un origen de replicación funcional en
Schizosaccharomyces pombe (origen ars1), así como el
gen ura4 de Schizosaccharomyces pombe en tanto que
marcador de selección; con la diferencia de que la introducción del
fragmento que lleva el origen ars1 al nivel del sitio
NaeI de pGEM3, dando lugar a pDW230, ha supuesto una
deleción de este sitio hasta la base 2862.
Se genera el vector pTG1754 mediante unión de los
fragmentos SphI-BamHI de pTG1751 (que incluye la
secuencia de finalización de la transcripción arg3) y de
pTG1702 (que incluye el promotor adh).
Paralelamente, las secuencias que codifican la
P30 provista de su propia señal de secreción, se obtienen de la
forma siguiente: se modifica el gen P30 mediante mutagénesis, de
forma que se genera una secuencia consenso de iniciación para la
levadura a nivel del segundo ATG iniciador (TAAAAAATGTCT) y
un codón de detención en la misma posición que anteriormente. La
PCR utiliza el vector pbM89 como matriz y los oligonucleótidos 722
(SEC ID nº:6) y 723 (SEC ID nº:7) que llevan en su extremo 5' un
sitio BglII. El producto de amplificación tratado por
BglII, es clonado en el vector pTG2886 linearizado mediante
el enzima BglII. Este último se describe en la publicación
europea EPA 396 436.1. Los clones recombinantes se analizan mediante
digestión enzimática HindIII-BamHI, con el fin de
determinar la orientación de la inserción con respecto al promotor.
Un clon que presenta la orientación adecuada se denomina
pTG2886-P30. Después de digestión mediante
BglII, el fragmento que incluye las secuencias que codifican
la proteína P30 provista de su propia señal de secreción, se
inserta en el vector pTG1754 previamente digerido por BamHI.
Se obtiene pTG 3733.
Se reemplaza la secuencia que codifica la señal
de secreción natural de la proteína P30 (residuos +1 a +30 de la SEC
ID nº:1) por la secuencia del gen pho1 de
Schizosaccharomyces pombe que codifica la señala de secreción
de la fosfatasa. Para llevar esto a cabo, el vector
pTG2886-P30 se digiere por BamHI,
introduciéndose un fragmento sintético que presenta los mismos
extremos sobresalientes que llevan un sitio BglII interno en
el extremo 5', y que resulta de la reasociación de los
oligonucleótidos OTG4096 y OTG4097 (SEC ID nº: 8 y 9).
El fragmento BglII que lleva la secuencia
que codifica la señal de secreción pho1 seguida de la P30 madura
(residuos +31 a +299 de la SEC ID nº:1) se aísla del vector
obtenido en la etapa anterior. Se inserta en el sitio BamHI
del vector pTG1754. Los transformantes que presentan la orientación
correcta respecto al promotor adh, son seleccionados
mediante digestión EcoRI-BamHI. Se genera
pTG8610.
El fragmento BamHI-SmaI, que
incluye las secuencias P30, se aísla de pTG8610 y se introduce en
los mismos sitios de M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene
26, 91-99), con el fin de mutar el sitio de
glucosilación. Se genera M13TG8620. La mutagénesis se lleva a cabo
mediante un equipo comercial según las recomendaciones del
proveedor (por ejemplo Amersham), utilizando el oligonucleótido
OTG5829 (SEC ID nº:10). La mutagénesis tiene como objeto sustituir
el residuo asparagina en posición 241 por una glutamina, creando un
sitio HindIII, facilitando la selección de los mutantes. Se
obtiene M13TG8622.
Se constituye el vector de expresión pTG8630
insertando entre los sitios SphI-PstI del vector
pTG8610 un primer fragmento SphI-DraII
obtenido de pTG8610 y un segundo fragmento DraII-PstI
purificado de M13TG8622.
Se inserta entre los sitios BamHI y
SacI del vector pTG1702 (ejemplo 2.1) un fragmento de ADN
sintético procedente de la reasociación de los oligonucleótidos
OTG2872 y OTG2873 (SEC ID nº:11 y nº:12). Se genera pTG1716 que
comprende la secuencia que codifica la señal de secreción de la
fosfatasa ácida principal de Schizosaccharomyces pombe
(pho1) por debajo de la región promotora adh.
pTG1716 se modifica insertando entre los sitios
MluI y HindIII una secuencia de ADN que codifica la
variante Lys47 de la hirudina (HV2 Lys47). Se obtiene pTG1722.
El fragmento SphI-SacI que incluye
la región promotora adh seguida por la secuencia que
codifica la señal de secreción pho1 y HV2 Lys 47, se aísla de
pTG1722. Se subclona a continuación entre los mismos sitios de
pTG1751. Resultando de esto pTG1757.
Por otra parte, la región promotora del gen
pho4 de Schizosaccharomyces pombe se obtiene mediante
PCR a partir del clon pSp4B (Yang y Schweingruber, 1990, Current
Genet., 18, 269-272) mediante los iniciadores
OTG3569 que incluye un sitio SphI (SEC ID nº:13) y OTG3239
provisto de un sitio BamHI (SEC ID nº:14). El fragmento
SphI-BamHI generado de este modo se sustituye con el
fragmento SphI-BamHI que lleva la región promotora
adh de pTG1757 para dar lugar a pTG2734.
Se aísla mediante PCR y a partir del vector
pTG2734, un fragmento de 642 pares de bases que incluye las
secuencias del extremo 5' que flanquean el gen pho4 de
Schizosaccharomyces pombe situadas por encima de la secuencia
TATA. Se utilizan los iniciadores OTG3569 (SEC ID nº:13) y OTG3210
(SEC ID nº:15). El fragmento PCR SphI-NcoI obtenido de
este modo, se introduce en pTG1757 digerido por los mismos enzimas
para dar lugar a pTG2735.
En fin, se introduce el fragmento EcoRI
aislado de pTG8610 y que incluye la secuencia que codifica la
proteína P30 seguida por el finalizador arg3 en el vector
pTG2735 digerido por EcoRI. Se obtiene el vector pTG8644 en
le cual las secuencias que codifican la señal de secreción pho1 y
la proteína P30 (residuos +31 a +299 de la SEC ID nº:1) se
encuentran bajo el control de un promotor híbrido constituido por
las secuencias del gen pho4 responsables de la regulación por
la tiamina, situadas por encima de la secuencia TATA del gen
adh.
Se trata de generar vectores de expresión tales
como los de los ejemplos 2.1, 2.2 ó 2.3 que incluyen, además, un
gen que permite la selección en una cepa salvaje que no presenta
auxotrofía, por ejemplo, un gen de resistencia a un antibiótico,
como el gen neo (neomicina) que confiere la resistencia a
G418.
El gen neo procede del vector Tn5 (Berck
et al., 1982, Gene, 19, 327-336).
Éste se modifica mediante técnicas clásicas de mutagénesis con el
fin de crear sitios de restricción que faciliten las etapas
ulteriores de clonación, como un sitio BamHI en los extremos
5' (en posición 138) y 3' (en posición 1280) del gen neo. El
fragmento BamHI se trata mediante la ADN polimerasa Klenow
antes de introducirlo en el sitio EcoRI de pDW230, cuyos
extremos se han liberado mediante tratamiento con Klenow. Se
obtiene pTG1796.
El gen neo se sitúa bajo el control del
promotor IE1 de CMV (citomegalovirus) que se extiende entre los
nucleótidos -727 a +78 (Boshart et al., 1985, Cell, 41,
521-530). En el extremo 5' del promotor se introduce
un sitio BamHI y en el extremo 3', un sitio HindIII.
El fragmento BamHI-HindII tratado mediante la ADN
polimerasa Klenow, se inserta por encima del gen neo en el
sitio BamHI que se ha liberalizado por tratamiento mediante
el fragmento Klenow de pTG1796. Se genera pTG3777, en el cual se
podrá introducir los casetes de expresión de la proteína P30
descritos anteriormente.
El fragmento SphI-NdeI que incluye
el casete de expresión "promotor
adh-P30-term arg3", se aísla de pTG8610,
tratándose seguidamente mediante la ADN polimerasa T4. Se clona en
el sitio HindIII tratado con la ADN polimerasa T4, de
pTG3777 para dar lugar al vector pTG8638.
Los vectores de expresión de los ejemplos 2.1,
2.2 y 2.3 se introducen en una cepa de Schizosaccharomyces
pombe mutante, por ejemplo la cepa D18 auxótrofa para el
uracilo y disponible en la AFRC con la referencia 2036. Se utiliza,
como control negativo, la misma cepa transformada en paralelo con
el vector pTG1754. Por supuesto que podría convenir cualquiera otra
cepa que presente este tipo de auxotrofía.
Las cepas para las que la expresión de la P30 es
constitutiva, a saber lastransformadas por los vectores pTG8610 y
PTG8630, se cultivan a 30ºC en un medio sintético Kappeli
optimizado para la levadura (Fiechter y al., 1981, Adv., Microbiol.
Physiol. 22, 123-183) y suplementado con 2%
de glucosa y una mezcla de vitaminas.
Las cepas transformadas por el vector pTG8644 se
precultivan en el mismo medio Kappeli suplementado. Sin embargo, la
mezcla de vitaminas comprende particularmente la tiamina a una
concentración final de 0,002 g/l (medio thi+). Cuando los cultivos
alcanzan una DO (densidad óptica) a 600 nm comprendida entre 1 y 2,
se diluyen hasta una DO de alrededor de 0,05, bien en el medio
thi+, bien en un medio Kappeli suplementado con 2% de glucosa y una
mezcla de vitaminas desprovista de tiamina (medio thi-). El cultivo
se prosigue a 30ºC hasta la finalización de la fase
exponencial.
Alícuotas de cada uno de los cultivos se
muestrean regularmente durante la fase exponencial, así como al
final del crecimiento. Los sobrenadantes del cultivo se analizan
mediante transferencia Western, tal como se describe en el ejemplo
1.2.
Las levaduras transformadas mediante pTG8610 o
pTG3733 sintetizan y secretan una P30 recombinante que es
reconocida indistintamente por los tres anticuerpos citados
anteriormente (antisuero de conejo, antisuero humano toxo positivo y
anticuerpo 1E1E7). La P30 recombinante se presenta bajo forma de un
material homogéneo de aspecto ligeramente difuso de masa molecular
aparente (MMA) de alrededor de 35 kDa. Una señal más intensa se
observa en el sobrenadante de cultivo de pTG8610 que indica que la
eficacia de la señal de secreción pho1 es superior para la secreción
de la proteína P30 en Schizosaccharomyces pombe a la de la
señal natural de la P30. Se puede notar que, en condiciones
reductoras (el tampón de depósito contiene un agente reductor) los
anticuerpos no reconocen ya la P30 recombinante, indicando que
únicamente los epítopos conformacionales están implicados en el
reconocimiento en la transferencia Western, tal como se observa con
la P30 original.
Igualmente, se detecta una producción de la
proteína P30 recombinante en los sobrenadantes del cultivo de la
Schizosaccharomyces pombe transformada por pTG8644, cuando
el cultivo se lleva a cabo en ausencia de tiamina. La proteína P30
es revelada mediante los antisueros humanos y presenta una MMA de
35 kDa. En cambio, cuando el cultivo se realiza en presencia de
tiamina, no se visualiza ningún producto mediante estos mismos
anticuerpos específicos de la proteína P30.
El análisis de los sobrenadantes de levaduras
transformadas mediante pTG8630, realizado utilizando un antisuero
de conejo toxopositivo, revela, en condiciones no reductoras, una
banda mayoritaria de alrededor de 28 kDa, es decir, inferior en 5
kDa aproximadamente a la observada para el producto de expresión de
pTG8610 o pTG8644. Esta diferencia de masa molecular se explica por
el hecho de que se trata de una proteína capaz de no glucosilarse,
ya que ha mutado a nivel del sitio de la
N-glucosilación.
En la AFRC, están disponibles distintas cepas
salvajes de Schizosaccharomyces pombe. Se citan, como
ejemplo, las cepas 20 286 y 26 760, en las que se transforma el
vector pTG8638. Se seleccionan los transformantes respecto a su
resistencia al G418 (concentración de 0,2 a 1 mg/ml). Después de
cultivo en medio líquido selectivo (medio YPG que contiene
neomicina), se analizan los sobrenadantes de cultivo mediante
transferencia Western con la ayuda de antisueros humanos. Se detecta
una banda principal para la P30 recombinante glucosilada en la
posición alcanzada.
El fragmento EcoR1 aislado de pTG8630
(ejemplo 2.2) y que incluye la secuencia que codifica la P30 no
glucosilada seguida por el finalizador arg3, se introdujo en
el vector pTG2735 (ejemplo 2.3) digerido por EcoRI. Se genera
pTG9643. La proteína de fusión puede producirse según la misma
tecnología que la utilizada en el ejemplo 2.5.
El vector pTG8644 (el ejemplo 2.3 es digerido por
PstI y SmaI introduciéndose un fragmento sintético
procedente de la reasociación de los oligonucleótidos OTG6438 y
6439 (SEC. ID nº:16 y 17). Se genera pTG8667 que incluye el promotor
híbrido pho4/adh, las secuencias que codifican la señal de secreción
pho1 y la proteína P30 seguida por 6 residuos de histidina que
forma una cola poly His. La proteína de fusión puede producirse
según la misma tecnología que la utilizada en el ejemplo 2.5.
El fragmento BamH1-Pst1 del pTG8667
(que contiene la secuencia de la P30 glucosilada), es reemplazada
por un fragmento equivalente aislado de pTG8630 (P30 no
glucosilada). Se genera de este modo pTG9618. La proteína de fusión
puede ser producida según la misma tecnología que la utilizada en el
ejemplo 2.5.
El plásmido pTG9643 se digirió por BamH1 y
un fragmento de ADN sintético procedente de la reasociación de los
oligonucleótidos OTG10055 y 10094 (SEC. ID. nº: 18 y 19) se clonó al
nivel de este sitio. Se obtuvo pTG8221, en el que 8 residuos de
histidina preceden a la proteína P30.
El fragmento de ADN que codifica la proteína P30
provista de su péptido señal, se aisló de
pTG2886-P30 después de digestión por BglII,
insertándose en un vector baculovírico; por ejemplo, el vector
pACMP1 digerido por BamHI (Hill-Perkins y
Possee, 1990, J. Gen. Virol., 71, 971-976) o
el vector descrito por Guaniro et al (1986, J. Virol.,
57, 563), para dar lugar, respectivamente a pTG3729 y
pTG3731.
Los recombinantes se generaron tal como se
describe por J.M VLAK et al, en Proceedings of the
Baculovirus and Recombinant Protein Production Workshop,
"Baculovirus and recombinant protein production processes", 29
marzo-1 de abril, Interlaken, Suiza.
Los sobrenadantes se centrifugaron durante 10
minutos a 1000 tpm (revoluciones por minuto), guardándose a
-20^{0}C antes de ser analizados en SDS-PAGE al
12%, seguido por una Transferencia Western y en radioinmuno-
precipitación.
precipitación.
Para esta última técnica, el cultivo celular se
marcó con 300 \muCi del marcador tran ^{35}S (nombre comercial:
ICN Biomedical France, ref. 51006) a la hora, y a las 26 y 30 horas
después de la infección. Se recupera el sobrenadante 48 horas
después de ésta. La inmunoprecipitación se lleva a cabo según el
siguiente protocolo: los sobrenadantes del cultivo se centrifugan a
2000 tpm durante 20 minutos, se diluyen a la mitad en el tampón NET
2x (NP40 0,1%, EDTA 1mM, Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl
150 mM, Gelatina al 0,25%, NaN_{3} al 0,02%, Aprotinina al 2%,
PMSF 2 mM), inmunoprecipitándose a continuación con sueros humanos
toxopositivos o bien, con el anticuerpo monoclonal 1E1E7 durante 2
horas a 4ºC, añadiendo finalmente proteína A Sepharose (Pharmacia).
El precipitado se lavó sucesivamente con los tampones NET1x,
Tris-NP40, PBS 1x (Na_{2}HPO_{4} 12H_{2}O 8 mM
KH_{2}PO_{4} 2mM, NaCl 150 mM) y PBS 0,1 x. El análisis se
realizó después de migración electroforética sobre gel
SDS-PAGE al 12%, autoradiografiándose. La p30
recombinante se observó en el sobrenadante del cultivo de las
células infectadas por los baculovirus
recombinantes.
recombinantes.
Cuando se analizan los sobrenadantes del cultivo
mediante transferencia Western en condiciones no reductoras, tanto
los sueros humanos toxopositivos como el antisuero de conejo
reconocen un doblete compuesto por una banda principal de una MMA de
alrededor de 28 kDa y de una banda secundaria de una MMA de 29 kDa
aproximadamente. No se observó ninguna diferencia significativa
entre las proteínas P30 recombinantes producidas por los virus
recombinantes.
Al contrario, en condiciones reducidas, no se
detectó ningún producto por el DTT.
Los sobrenadantes del cultivo (volumen de 10
litros) obtenidos como se ha descrito en el ejemplo 2, se redujeron
de 20 a 50 veces mediante concentración sobre fibras huecas o sobre
casetes tangenciales de ultrafiltración (volumen final: 500 a 200
ml) (umbral de corte 10.000 daltons), dializándose mediante esta
misma operación en un tampón Tris, 50 mM, pH 8,5 aproximadamente,
sin NaCl o un tampón equivalente, que se utilizará en la
etapa
siguiente.
siguiente.
La segunda etapa consiste en una cromatografía de
intercambio iónico clásica, por ejemplo sobre una columna de 100 ml
de gel DEAE TRISACRYL (DEAE: dietilaminoetilo) o Hyper D,
(comercializada por la sociedad Biosepra) o DEAETSK (Merck), que
permiten recuperar, por un gradiente de fuerza iónica de 0 a 1M de
NaCl, los eluidos. que se ensayan en gel SDS PAGE y se analizan
mediante Transferencia Western. El análisis permite evidenciar la
banda de alrededor de 30 kD de la P30 recombinante.
Para llevar a cabo el aislamiento de esta
proteína recombinante, puede realizarse una etapa de cromatografía
de afinidad sobre un soporte cromatográfico unido mediante
covalencia al anticuerpo monoclonal 1E1E7 anti P30. Después de
elución específica por variación del pH (pH 2,5 o pH 11,5), el pico
obtenido de la proteína P30 es de pureza suficiente para utilizar
esta proteína en los equipos de diagnóstico.
Cuando la proteína P30 se fusiona a una cola
polihistidínica igualmente bien en C que en N terminal, se puede
incluir una etapa de cromatografía quelato de metal. Los soportes
adaptados a esta tecnología son conocidos por el experto en la
materia y están disponibles comercialmente. Se pueden citar como
ejemplos la quelatina Sepharose (Pharmacia) para cargar en iones
metálicos y el quelato de Níquel (NINTA Agarose, Quiagen).
La reactividad de la P30 recombinante se ensayó
respecto a 151 sueros conocidos, de los cuales 95 se dieron como
sueros positivos y 56 como negativos, utilizando el aparato VIDAS
(marca registrada), comercializado por la Sociedad bioMérieux
SA.
El ensayo automatizado en el sistema Vidas
permite la medición cuantitativa de las IgG antitoxoplásmicas en un
suero humano. El principio de dosificación asocia el procedimiento
inmunoenzimático con una detección final en fluorescencia
(ELFA).
Todas las etapas de las reacciones son
gestionadas por el instrumento. Sobre un cono en resina K
(copolímero butadieno-estireno), de utilización
única que sirve a la vez como fase sólida y de sistema de pipeteo,
se adsorbe una preparación que incluye los antígenos de membrana y
citoplásmico de Toxoplasma gondii; obteniéndose esta
preparación mediante exposición a ultrasonidos de los toxoplasmas
completos. Los otros reactivos necesarios para el ensayo
diagnóstico se pre-reparten en un cartucho asociado
al cono. La fase de incubación del suero humano permite la fijación
de las IgG antitoxoplásmicas si están presentes; a continuación, se
añade una globulina anti IgG humana marcada (Boehringer ref: 1272
896) con fosfatasa alcalina (Boehringer ref.: 556.602), para
revelar la presencia de estas eventuales IgG antitoxoplásmicas.
El resultado o título se expresa en UI/ml
(Unidades internacionales) con respecto a una curva de calibración
memorizada en el Vidas. Los resultados se presentan en el cuadro
que sigue (véase colonia Vidas-Títulos).
La P30 (5 ng/pocillo) que va a ensayarse se fija
en los pocillos de una placa de microtitulación) Polylabo,
ref:13159). Los mismos sueros humanos que se han ensayado sobre el
aparato VIDAS como se ha descrito anteriormente, se incubaron
durante 1 hora a 37ºC, después de lo cual una globulina anti IgG
humana marcada con la peroxidasa (ref 815462) se añadió para
revelar las IgG séricas eventuales que reaccionen contra esta
P30.
Los resultados se dan en densidad óptica leída a
492 nm y se presentan en la tabla que sigue (véase colonia P30
REC).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\newpage
Como se puede apreciar en la lectura de la tabla
anterior, existe una correlación muy buena entre los resultados
obtenidos con los ensayos efectuados en el aparato VIDAS en
presencia de antígenos de membrana y citoplásmicos de Toxoplasma, y
los obtenidos en un ensayo clásico sobre microplaca en presencia de
la proteína P30 recombinante de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Transgene S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11 rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Strasbourg
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 67082
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELEFONO: (33) 88 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (33) 88 22 58 07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BioMerieux S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Chemin de l'Orme
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Marcy l'etoile
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 68280
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELEFONO: (33) 78 87 20 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (33) 78 87 20 90
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cassette d'expression d'une proteine P30 de Toxoplasma gondii
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version # 1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 299 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Proteína P30 de Toxoplasma gondii
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Cepa RH
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: Sitio de fragmentación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 30..31
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTROS DATOS: /marca = secreción
\vskip0.500000\baselineskip
- /nota = "señal de secreción comprendida entre los residuos 1 a 30 comprendido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1..30
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTROS DATOS: /marca = secreción
\vskip0.500000\baselineskip
- /nota = "señal de secreción comprendida entre los residuos 1 a 30 comprendido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis 1367
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATGCAAGC TTGGATAAAA AGATCGGATC CCCCTCTTG
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis 1366
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGTCAGTCG ACATTCAACT GGCTGTTCC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 79 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG2781)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 79 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG2782)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis 722
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGGTTAGA TCTAAAAAAT GTCTCCGAAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis 723
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAATGAGA TCTTAACTGG CTGT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG4096)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG4097)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5829)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCAGGGTCA AGCTTCGAG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 74 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG2872)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG2873)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG3569)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTGGGCATG CGTCTTTTGA TGCTAAATAA ATTAAATTGT TGG
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG3239)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGAAATACC ACTTAACTTC ATGGATCCCG AGAAAAAACA ATG
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG3210)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCAAACCAT GGCAATCAAT CCGGATATCT GCTAAC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 58 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6438)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTCAGCAA AATCGGCTGC GGGAACAGCT AGCCACCATC ACCATCACCA CTGAACCC
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6439)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG10055)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCATCATC ACCATCACCA TCATCAC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG10094)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCGTGATG ATGGTGATGG TGATGAT
\hfill27
Claims (29)
1. Casete de expresión funcional en una célula
procedente de un organismo eucariota no mamífero, expresando dicho
casete un fragmento de ADN que codifica una proteína P30 de
Toxoplasma gondii, que se sitúa bajo el control de los
elementos necesarios para su expresión: secretándose dicha proteína
P30 de dicha célula procedente de un organismo eucariota y siendo
reconocida por los antisueros antitoxoplásmicos,
caracterizado porque dicho fragmento de ADN codifica una
proteína P30 a la que le falta toda la región
C-terminal hidrófoba.
2. Casete de expresión según la reivindicación 1,
caracterizado porque es funcional en una célula de
insecto.
3. Casete de expresión según la reivindicación 1,
caracterizado porque es funcional en una célula procedente
de un organismo eucariota inferior.
4. Casete de expresión según la reivindicación 3,
caracterizado porque la célula procedente de un organismo
eucariota inferior, es una levadura o un hongo.
5. Casete de expresión según la reivindicación 4,
caracterizado porque la célula procedente de un organismo
eucario tan inferior, es seleccionada de entre el grupo constituido
por Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces
pombe, Schizosaccharomyces malidevorans,
Schizosaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces
octosporus y Hasegawaea japonicus.
6. Casete de expresión según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el fragmento de
ADN codifica una proteína P30 que tiene una secuencia tal como la
que se muestra en el identificador de secuencia nº:1, empezando en
el aminoácido +1 y finalizando en el aminoácido +299 o un
equivalente inmunológico de dicha proteína
P30.
P30.
7. Casete de expresión según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el fragmento de
ADN codifica una proteína P30 que tiene una secuencia tal como la
que se muestra en el identificador de secuencia nº:1, empezando en
el aminoácido +31 y finalizando en el aminoácido +299 o un
equivalente inmunológico de dicha proteína P30, comprendiendo dicho
fragmento de ADN, además, una secuencia que codifica una señal
heteróloga de
secreción.
secreción.
8. Casete de expresión según la reivindicación 7,
caracterizado porque dicha secuencia que codifica una señal
heteróloga de secreción procede del gen pho1 de
Schizosaccharomyces pombe o del gen de la feromona sexual
alfa (Mating Factor \alpha, Mf\alpha) de
Saccharomyces cerevisiae.
9. Casete de expresión según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en el cual el fragmento de ADN codifica una
proteína P30 que comprende por lo menos una mutación; estando
caracterizada dicha mutación porque presenta un residuo de
aminoácido distinto del residuo natural en posición 241 y /o 243 de
la secuencia tal como la que se muestra en el identificador de
secuencia nº:1, con la condición, sin embargo, de que dicha
mutación esté caracterizada porque presente un residuo
distinto a una treonina en posición 243.
10. Casete de expresión según la reivindicación
9, caracterizado porque el residuo aminoácido en posición
241 es un residuo glutamina.
11. Casete de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los elementos
necesarios para la expresión de dicho fragmento de ADN comprenden
particularmente una región promotora funcional en dicha célula
procedente de un organismo eucariota no mamífero.
12. Casete de expresión según la reivindicación
11, caracterizado porque la región promotora se selecciona
de entre el grupo constituido por las regiones promotoras
procedentes de los genes PGK de Saccharomyces
cerevisiae, adh y pho-4 de
Schizosaccharomyces pombe y p12,5K y p39K de baculovirus.
13. Vector que comprende un casete de expresión
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Célula procedente de un organismo eucariota
no mamífero que comprende un casete de expresión según una de las
reivindicaciones 1 a 12, o un vector según la reivindicación
13.
15. Hongo unicelular o una levadura según la
reivindicación 14.
16. Levadura según la reivindicación 15,
seleccionada de entre el grupo constituido por Saccharomyces
cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,
Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces
sloofiae, Schizosaccharomyces octosporus y Hasegawaea
japonicus.
17. Proteína P30 a la que le falta toda la región
C-terminal hidrófoba, producida mediante un casete
de expresión según una de las reivindicaciones 1 a 12, un vector
según la reivindicación 13, o una célula procedente de un organismo
eucariota no mamífero según una de las reivindicaciones 14 a 16.
\newpage
18. Procedimiento para la preparación de una
proteína P30 según la reivindicación 17, según el cual:
- (i)
- se cultiva en condiciones apropiadas una célula procedente de un organismo eucariota no mamífero, según una de las reivindicaciones 14 a 16; y
- (ii)
- se recupera dicha proteína secretada de dicha célula procedente de un organismo eucariota no mamífero.
19. Reactivo para la detección y/o la vigilancia
de una infección por Toxoplasma gondii, caracterizado
porque comprende como sustancia reactiva una proteína según la
reivindicación 17.
20. Procedimiento para la detección de
anticuerpos antitoxoplasma en una muestra biológica, tal como una
muestra de sangre, de un individuo o de un animal susceptible de
estar o de haber estado infectado por Toxoplasma gondii,
caracterizado porque comprende, por lo menos, las etapas
siguientes:
- -
- se prepara una mezcla que incluye:
- i)
- un reactivo según la reivindicación 19, que es o será inmovilizado sobre un soporte sólido,
- ii)
- la muestra,
- iii)
- una antiinmunoglobulina marcada;
- -
- se incuba la mezcla durante un tiempo predeterminado;
- -
- se separa la fase sólida de la fase líquida; y
- -
- se pone en evidencia la presencia eventual del anticuerpo antitoxoplasma midiendo el grado de marcaje en la fase sólida.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado porque:
- -
- se prepara una mezcla que comprende:
- i)
- el reactivo inmovilizado sobre el soporte sólido, y
- ii)
- la muestra;
- -
- se incuba la mezcla durante un tiempo predeterminado que permita la formación de un complejo inmune inmovilizado sobre el soporte sólido;
- -
- se añade una antiinmunoglobulina marcada en condiciones de incubación apropiadas que permitan su reacción con el complejo inmune inmovilizado;
- -
- se separa la fase sólida de la fase líquida; y
- -
- se pone en evidencia la presencia eventual de anticuerpos antitoxoplasma midiendo el grado de marcaje en la fase sólida.
22. Anticuerpos monoclonales o policlonales
caracterizados porque se obtienen mediante reacción
inmunológica de un organismo humano o animal con un agente
inmunógeno, constituidos por una proteína tal como la definida en la
reivindicación 17.
23. Reactivo de detección de la presencia de
Toxoplasma gondii, caracterizado porque comprende
como sustancia reactiva un anticuerpo, según la reivindicación 22,
marcado.
24. Procedimiento para la detección de
anticuerpos antitoxoplasma en una muestra biológica tal como una
muestra de sangre de un individuo o de un animal susceptible de
estar o de haber estado infectado por Toxoplasma gondii,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- -
- se prepara una mezcla que incluye:
- i)
- un primer reactivo, según la reivindicación 19, que se inmoviliza sobre un soporte sólido
- ii)
- la muestra;
- iii)
- un segundo reactivo marcado, según la reivindicación 23;
- -
- se incuba la mezcla durante un tiempo predeterminado;
- -
- se separa la fase líquida de la fase sólida; y
- -
- se pone en evidencia la presencia eventual de anticuerpos antitoxoplasma midiendo el grado de marcaje en la fase sólida.
25. Procedimiento para la detección de
anticuerpos antitoxoplasma en una muestra biológica tal como una
muestra de sangre de un individuo o de un animal susceptible de
estar o de haber estado infectado por Toxoplasma gondii,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- -
- se prepara una mezcla que incluye:
- i)
- una antiinmunoglobina que se fija o se fijará sobre un soporte sólido;
- ii)
- la muestra;
- iii)
- un reactivo marcado, según la reivindicación 19;
- -
- se incuba la mezcla durante un tiempo predeterminado;
- -
- se separa la fase líquida de la fase sólida; y
- -
- se pone en evidencia la presencia eventual de anticuerpos antitoxoplasma midiendo el grado de marcaje en la fase sólida.
26. Procedimiento según la reivindicación 25,
caracterizado porque:
- -
- se prepara una mezcla que incluye:
- i)
- una antiinmunoglobina que se fija sobre un soporte sólido;
- ii)
- la muestra;
- -
- se incuba la mezcla durante un tiempo predeterminado que permita la formación de un complejo inmune inmovilizado sobre el soporte sólido;
- -
- se separa la fase líquida de la fase sólida; y
- -
- se añade el reactivo según la reivindicación 19, marcado; y
- -
- se pone en evidencia la presencia eventual de anticuerpos antitoxoplasma midiendo el grado de marcaje en la fase sólida.
27. Procedimiento para la detección de la
proteína P30 de Toxoplasma gondii en una muestra biológica,
tal como un muestreo tisular, de un individuo o de un animal
susceptible de estar o haber estado infectado por Toxoplasma
gondii, caracterizado porque se pone en contacto la
muestra y un reactivo según la reivindicación 23 en condiciones
apropiadas que permitan una eventual reacción inmunológica, y se
detecta la presencia eventual de un complejo inmune formado con
dicho reactivo marcado, midiendo el grado de marcaje en la muestra
biológica.
28. Composición farmacéutica destinada al
tratamiento o a la prevención de una infección por Toxoplasma
gondii en un individuo o en un animal, que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de un casete de expresión según una
de las reivindicaciones 1 a 12, de un vector según la reivindicación
13, de una célula procedente de un organismo eucariota no mamífero
según una de las reivindicaciones 14 a 16, o de una proteína P30
según la reivindicación 17 o preparada según un procedimiento según
la reivindicación 18.
29. Composición inmunoterapéutica activa,
particularmente una preparación vacunal, caracterizada
porque comprende como principio activo, una proteína según la
reivindicación 17, estando este principio conjugado eventualmente
con un soporte inmunológico apropiado, y eventualmente un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
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