ES2240972T3 - Mutantes de la trombina. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN MUTANTES DE TROMBINA (TS) QUE PUEDEN ACTIVAR UNA PROTEINA C SIN UNA ACTIVIDAD SIGNIFICATIVA DE COAGULACION DEL FIBRINOGENO, Y VICEVERSA. LOS TS QUE TIENEN MAYORES PROPIEDADES DE ACTIVACION DE LA PROTEINA C EN RELACION A LA COAGULACION DE FIBRINOGENOS SON UTILES, EN PARTICULAR, COMO ANTICOAGULANTES Y PARA LA SELECCION DE SUSTANCIAS QUE AGONIZAN O ANTAGONIZAN ESTA PROPIEDAD Y EN PROCEDIMIENTOS DE DIAGNOSTICO PARA DETERMINAR EL ESTADO DE LA VIA ANTICOAGULANTE MEDIADA POR LA PROTEINA C ACTIVADA DE UN PACIENTE. LOS TS PROCOAGULANTES SON UTILES PARA FOMENTAR LA COAGULACION DURANTE UNA TERAPIA DE TUMORES SOLIDOS, COMO SUSTANCIA DE IMPREGNACION DE VENDAS, O EN ENSAYOS DE DIAGNOSTICO. LOS TS SE PRODUCEN EN CULTIVOS DE CELULAS RECOMBINANTES O MEDIANTE METODOS IN VITRO.

Description

Mutantes de la trombina.

Antecedentes de la invención

La trombina, una enzima clave en la hemoestasis, tiene propiedades tanto procoagulantes como anticoagulantes, en base a sus diferentes especificidades de substratos. La trombina es segregada del hígado como un zimogen inactivo, la protrombina, que es activada por los factores de coagulación Va y Xa para dar lugar a la \alpha-trombina madura (completa). Este proceso puede ser mimetizado in vitro mediante la rotura proteolítica de la protrombina con varios venenos de serpiente tales como el veneno de Echis carinatus.

La trombina actúa como un procoagulante por medio de la escisión proteolítica del fibrinógeno, dando lugar esencialmente a la formación de un coágulo de fibrina insoluble, la activación de los cofactores de coagulación factor V y Factor VIII a FVa y FVIIIa, la escisión del factor XI a Factor XIa activado (conduciendo a la activación adicional de los factores IX y X y a la perpetuación de la coagulación) y la escisión del receptor de la trombina de las plaquetas, dando lugar a la activación de las plaquetas. Por otro lado, cuando la trombina se une a la trombomodulina (TM), una proteína de la membrana integral en las células endoteliales, la trombina sufre un cambio conformacional de modo que la trombina pierde su actividad procoagulante y en su lugar adquiere la capacidad para convertir una proteína del plasma llamada proteína C (PC) en una proteína C activada (aPC). La aPC, una proteasa de la serina, actúa como un potente anticoagulante mediante la inactivación del FV activado (FVa) y del FVIII activado (FVIIIa), dos cofactores esenciales en la cascada de la coagulación. La aPC también inactiva el inhibidor-1 del activador de plasminógeno (PAI-1), el principal inhibidor fisiológico del tPA (el activador de plasminógeno del tejido), potenciando de este modo la fibrinolisis normal. El mecanismo puede servir para asegurar que la coagulación de la sangre permanece localizada en el sitio de la lesión. Los niños completamente deficientes en PC son esencialmente incompatibles con la vida, con un trastorno trombótico fatal llamado purpura fulminans neonatal; algunos pacientes con una deficiencia parcial de PC tienen trombosis recurrente. Además, muchos modelos animales recientes que utilizan la infusión de la aPC han mostrado que la aPC exógena es una molécula anti-trómbica y anti-inflamatoria.

La trombina humana es generada a partir de un precursor de polipéptidos, la protrombina, de aproximadamente 579 aminoácidos completos (sometido a una variación alélica potencial o a micro-heterogeneidad N-terminal) más una pre-secuencia de aproximadamente 43 residuos (Degen y col., "Biochemistry" 22:2087 [1993]). La presecuencia es eliminada de forma proteolítica por la célula durante el procedimiento de expresión y de secreción de la protrombina. La protrombina es un zimogen, o proteasa inactiva, que es activada por escisión proteolítica. Al menos tres sitios básicos son sometidos a escisión. La protrombina, in vivo, es escindida entre los residuos R271 y T272 (Degen y col. números de residuos) por el Factor Xa en presencia del Factor Va, de fosfolípidos y de iones calcio para dar lugar a la pretrombina 2 y al Fragmento 1,2. La protrombina también es escindida proteolíticamente por el mismo sistema entre R320 y 1321 para dar lugar a la meizotrombina, que a su vez es escindida autolíticamente entre R155 y 5156 para producir el Fragmento 1 (1-155) y meizotrombina des 1 (un disulfuro unido al dipéptido que se extiende desde el residuo 156 hasta el carboxi terminal de la protrombina, escindida a R323). Finalmente, la trombina es generada a partir de la pretrombina 2 por escisión proteolítica entre R320 y I321, o a partir de la meizotrombina des 1 por escisión proteolítica entre R271 y T272. A continuación la trombina por sí misma autoriza la escisión entre T289 y T285 para generar la cadena A con N terminal completa. Para los objetivos de la presente invención, el residuo N-terminal completo de la cadena de trombina A (Degen T285) es numerada "T1a" y a continuación es numerada de forma consecutiva al residuo de arginina en R36a. La cadena B es numerada a partir de su residuo Il N-terminal (Degen I321) a través de E259. Los dos péptidos de la trombina están unidos de forma covalente por la unión disulfuro entre C9a y C119.

Actualmente se utilizan dos sistemas de numeración diferentes para la trombina, además del sistema basado en el DNA de Degen y col. Uno está basado en la alineación con el quimotripsinogen (Bode y col., "EMBOJ" 8:3467 (1989). Un segundo está favorecido por Sadler y sus colaboradores de la Universidad de Washington. El sistema de numeración de Sadler es el que se utiliza en esta especificación. Bajo este protocolo, la cadena B de la trombina comienza con Il y se extiende hasta E259, mientras que la cadena A es designada con la posdata "a" tal como se ha señalado anteriormente, como en T1a hasta R36a. Esta trombina es llamada "trombina de la secuencia de referencia", y en la Figura 1 se muestra su secuencia entera. Por ejemplo, Wu y col., ("PNAS USA" 88:6775, (1991)) describen varios mutantes de trombina numerados de acuerdo con el esquema de Sadler. Los mutantes de Wu y col. y el correspondiente quimotripsinogen y los números de los residuos de Degen y col., se muestran respectivamente y de forma secuencial del modo siguiente: H43 (57, 363), K52 (60f, 372), N53 (60g, 373), R62 (67, 382), R68 (73, 388), R70 (75, 390), D99 (102, 419) y S205 (195, 525).

Se conoce de la literatura que los sitios de unión de la trombina para la activación del fibrinógeno y de la proteína C están solapados pero no son idénticos. Esto está basado en un pequeño número de mutantes de la trombina (Wu y col., op cit). Wu y col. describieron que un polipéptido que tiene la secuencia de trombina pero con el ácido glutámico sustituido en la posición 52 (K52E) era aproximadamente 2,5 veces más activo en la producción de PC activada que la trombina de tipo silvestre y poseía sólo aproximadamente un 17% de la actividad de coagulación del fibrinógeno normal de la trombina de tipo silvestre. A la inversa, un polipéptido que tenga la secuencia de trombina pero con el ácido glutámico sustituido en la posición 70 (R70E) se ha descrito que tiene la actividad de coagulación de la trombina de tipo silvestre pero sólo aproximadamente el 7% de la capacidad de activación de la PC de la trombina de tipo silvestre. De acuerdo con Wu y col., la proteína R68E pierde de forma esencial ambas funciones.

Para otros polipéptidos que tengan la homología de secuencia para la trombina, ver Le Bonniec y col., "JBC" 268(25):19055 (1993); Le Bonniec y col., "JBC" 266(21):13796 (1991); Le Bonniec y col., "PNAS USA" 88:7371 (1991); Sheehan y col., "JBC" 268(5):3639 (1993); Horrevoet y col., "JBC" 268(2):779 (1993); Suzuki y col., "JBC" 266(28):18498 (1991); Sheehan y col., "Thrombosis and Haemostasis" 69: Resumen 1784 (1993); Gan y col., "Thrombosis and Haemostasis" 69: Resumen 1783 (1993); Gan y col., "Thrombosis and Haemostasis" 69: Resumen 1787 (1993), y Naray-Szabo y col., "Theochem" 59:401 (1989).

El papel pivotal de la trombina en la coagulación de la sangre ha hecho de esta proteína un objetivo en el desarrollo de agentes para el tratamiento de la trombosis. La mayoría de los esfuerzos se han focalizado en la inhibición directa de la actividad proteolítica de la trombina, y de hecho numerosos inhibidores de las actividades procoagulantes de la trombina tienen un efecto anticoagulante (Hirsh, 1991; Hirsh, 1991a). Sin embargo, la potencia de estos inhibidores puede estar limitada por la inhibición concomitante de la actividad anticoagulante de la trombina. A la inversa, el efecto anticoagulante ha sido conseguido por el aumento o la estimulación del proceso anticoagulante de la trombina, es decir, por la administración de la TM soluble (Gomi, y col., "Blood" 75:1396-1399, 1990; y Light, D., WO 93/15755) o de la proteína C activada ("aPC") Dreyfus y col., 1991; Gruber y col., 1990; Gruber y col., 1991; Tailor y col., 1987). Esta estrategia no bloquea la coagulación en curso resultante de la trombina previamente activada.

Bode y col., EMBO J8:3467 (1989), supra, describen la estructura refinada del cristal de 1,9 Angstroms de la \alpha-trombina humana, en relación a un complejo estequiométrico formado entre la \alpha-trombina humana y la D-Phe-Pro-Arg clorometilcetona, mostrando de este modo la significación de un segmento de inserción Tyr-Pro-Pro-Trp.

Padmanabhan y col., J. Biol. Chem. 268/24, (1993) 17651-17654, describen la estructura de la \alpha-trombina inhibida por un aptámero de DNA de una única hebra de 15-Mer a una resolución de 2,9 Angstroms, y describe los mutantes Arg75 hasta Glu y Lys149E hasta Ala, de acuerdo con el sistema de numeración de quimotripsinogen de Bode y col., 1992, supra.

Constituye un objeto de esta invención el preparar nuevos polipéptidos que posean actividades fisicoquímicas o biológicas incrementadas.

Constituye un objeto adicional de esta invención la preparación de nuevos polipéptidos en los que las actividades procoagulantes y anticoagulantes de la trombina hayan sido sustancialmente segregadas, y que también resistan de forma opcional la inhibición de la antitrombina III (AT-III) mediada por la heparina.

Otro objeto es obtener dichos polipéptidos que puedan ser expresados en rendimientos elevados en cultivos de células recombinantes.

Un objeto adicional de esta invención es proporcionar nuevos polipéptidos que sean específicos del substrato para la activación de la proteína C o del fibrinógeno, pero que no proteolicen de forma sustancial los polipéptidos que normalmente no son substratos de la trombina.

Otro objeto de esta invención es proporcionar nuevos polipéptidos modificados de forma covalente que sean útiles en la selección de sustratos que sean agonistas o antagonistas de las actividades procoagulantes o anticoagulantes de la trombina.

Un objeto adicional es proporcionar nuevos polipéptidos que activen la proteína C pero que sean sustancialmente incapaces de, o tengan la actividad proteolítica reducida frente a cualesquiera uno o más de entre el fibrinógeno, el receptor de plaquetas de la trombina, y/o los Factores XIII, V, XI o VIII.

Todavía un objeto adicional es obtener nuevos polipéptidos útiles en la purificación de polipéptidos interactivos de la trombina tales como la TM o la aPC a partir de los cultivos de células o de las fuentes naturales.

Otro objeto es identificar nuevos polipéptidos que retengan al menos un grado sustancial de la actividad proteolítica de la trombina deseada, incluyendo el kcat y Km de la trombina para el substrato deseado.

En un objeto adicional, se proporcionan nuevos polipéptidos que muestran una actividad de inactivación de la PAI-1 incrementada en comparación con la trombina de tipo silvestre.

Un objeto adicional es proporcionar un método para la identificación de deficiencias en la función de la trombomodulina en pacientes con trastornos de coagulación.

En otros objetos, se proporcionan nuevos polipéptidos para el tratamiento de la trombosis, en particular de la trombosis asociada con el shock séptico, para la terapia de tumores sólidos y para la preparación de apósitos mejorados para heridas, o para terapias y utilidades diagnósticas que se basan en una propiedad de la trombina.

\newpage

Otro objeto es identificar nuevos análogos de trombina que tengan una habilidad intensificada o reducida para estimular la proliferación de células (Ben-Sharit y col., "PNAS USA" 83:976-980 (1986)).

Estos y otros objetos de la invención serán aparentes para la consideración de esta especificación como un conjunto.

Resumen de la invención

Esta invención se refiere a nuevos polipéptidos (de aquí en adelante "NPs") en los que se han segregado las propiedades de la trombina, es decir, en donde los polipéptidos fallan en poseer hasta un grado sustancial una o más propiedades indeseadas de la trombina mientras que todavía retienen una o más de las propiedades deseables de la trombina. Además, esta invención se refiere a los NPs en los que los residuos de trombina objetivo han sido mutagenizados.

De forma específicamente excluida del alcance de los NPs están las variantes de la secuencia de aminoácidos conocidas de la trombina, de forma específica la trombina R70E, la trombina R68E, la trombina K154A, la trombina K252E, la trombina K174E, la trombina R180E, la trombina D99A, la trombina D99N, la trombina E202Q, la trombina E25K, la trombina R245E, la trombina S205A, la R197E, la D199E, la trombina N151D, la K154E, la trombina desP48,P49,W50, la trombina desE146,T147,W148, la trombina desT147-S158, las trombinas de la patente WO 93/13208 en las que al menos ha sido mutado un residuo de amino ácido en el sitio de activación de la trombina, y la trombina en la que el bucle F19-E25 está sustituido por el bucle equivalente a partir del activador de plasminógeno del tejido. Sin embargo, la trombina K52E está sólo excluida hasta la extensión en que es posible su fabricación por el estado de la técnica. Las trombinas variantes del sitio de activación están excluidas sólo hasta la extensión en que el término "sitio de activación" está definido y descrito en la patente WO 93/13208. También se encuentran excluidos del alcance de los nuevos polipéptidos de esta invención las fusiones de dichas trombinas conocidas con un polipéptido no trombina o un polipéptido preprotrombina o protrombina. Sin embargo, no se encuentran excluidos del alcance de los NPs, los NPs que representan trombinas conocidas en las que se han hecho sustituciones adicionales, inserciones o eliminaciones de amino ácidos.

También se excluyen del alcance de los nuevos polipéptidos las trombinas que se encuentran de forma natural, tanto de humanos como de animales (incluyendo los alelos que se encuentran de forma natural), que no han sido aislados o purificados a partir de sangre u otros tejidos corporales, es decir, que son productos de la naturaleza. Sin embargo, será bien entendido, que los NPs de esta invención incluyen variaciones alélicas a partir de la secuencia de referencia de la trombina además de las mutaciones contempladas en la presente invención.

En ciertas realizaciones de esta invención, se proporcionan nuevos polipéptidos proteolíticamente activos que tienen una relación entre la activación de la proteína C y la coagulación del fibrinógeno que difiere de la trombina de tipo silvestre. En particular, se proporcionan dos clases generales de nuevos polipéptidos. En la primera clase, llamada "Activadores de la Proteína C", o "PCA", se proporcionan nuevos polipéptidos que poseen una relación entre la actividad anticoagulante y la actividad procoagulante de más de aproximadamente 2. Los polipéptidos de los PCA son capaces de activar la proteína C pero son sustancialmente incapaces de escindir el fibrinógeno. De forma sorprendente, nuestros estudios experimentales en animales demuestran que incluso niveles residuales de actividad procoagulante en los PCA son bien tolerados y no proporcionan ninguna evidencia de coagulación intravascular diseminada u otras respuestas procoagulantes clínicamente adversas. Además, inesperadamente hemos sido capaces de identificar los PCA que están desprovistos de cualquier actividad procoagulante detectable en nuestro ensayo pero que todavía son capaces de una activación sustancial de la Proteína C. De este modo, una realización de esta invención comprende la administración a un sujeto que precise de terapia anticoagulante de una dosis terapéuticamente efectiva de un
PCA.

En una extensión de la anterior realización, se preparó un PCA y se administró siendo su actividad anticoagulante sustancialmente resistente a la inhibición por un inhibidor de la trombina predeterminado, por ejemplo la heparina y la AT-III. En una realización se administró el PCA in vivo conjuntamente con heparina. La heparina inhibe la actividad procoagulante de la trombina endógena sin afectar la actividad anticoagulante del PCA, con lo que da lugar a un potente efecto anticoagulante. Esta realización de la invención tiene la ventaja adicional de que se espera que el PCA administrado sea resistente a la eliminación de la AT-III - heparina in vivo y de este modo muestre una vida media biológica más larga.

En otras realizaciones se proporcionan PCAs que tienen la actividad proteolítica reducida respecto al receptor de la trombina de las plaquetas y de este modo no activan las plaquetas a dosis terapéuticas. Los PCAs se proporcionan de modo que tengan una EC50 para la estimulación de la agregación de las plaquetas de más de 10 nM; de forma ordinaria de más de 20 nM. Las EC50s mayores que la de la trombina de tipo silvestre reducen o eliminan la agregación de las plaquetas detectable por la PCA cuando se utiliza la PCA a dosis capaces de activar la Proteína C.

Un Segundo grupo de nuevos polipéptidos de esta invención es llamado "Proteínas de la Coagulación del Fibrinógeno" o "FCP". Estos polipéptidos poseen una relación de la actividad anticoagulante a actividad procoagulante de menos de 05. Estos NPs contienen mutaciones en los dominios de la trombina de activación de la proteína C que reducen la actividad anticoagulante del polipéptido resultante a menos de aproximadamente la mitad que la trombina de tipo silvestre, pero retienen la capacidad para coagular el fibrinógeno. Estos polipétidos son útiles, por ejemplo, en diagnósticos, métodos preparativos y artículos quirúrgicos hemoestáticos. Una realización adicional de esta invención comprende la administración a un sujeto que precise de una terapia procoagulante de una dosis terapéuticamente efectiva de una FCP.

Hasta la extensión que cualquier descripción realizada de un FCP o PCA haya aparecido en la literatura del estado de la técnica, dichos polipéptidos del estado de la técnica son útiles en los métodos terapéuticos anteriores de esta invención.

De este modo, de acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona, un nuevo polipéptido (NP) proteolíticamente activo que tiene al menos aproximadamente una homología de la secuencia de amino ácidos del 80% con la trombina de la secuencia de referencia y tiene una relación de actividad activante de la proteína C respecto a la coagulación del fibrinógeno que es mayor de aproximadamente dos veces la de la trombina de la secuencia de referencia, en la que al menos un residuo de amino ácido ha sido sustituido por al menos uno de los siguientes residuos de aminoácidos de la trombina, o al menos uno de los siguientes residuos de amino ácidos de la trombina ha sido suprimido, o un residuo de amino ácido ha sido insertado de forma inmediatamente adyacente a al menos uno de los siguientes residuos amino ácidos de la trombina: W50, D51 R93, E94, R98, D122, R123, E124, S128, Q131, E169, K174, D175, S176, T177, D183, D193, K196, A200, N216, W227, E229, D232, R233, D234, G235, K236, Y237, F239, o W249, no obstante, siempre que el NP no sea trombina K174E o trombina desP48P49W50.

En aspectos adicionales, la invención también proporciona un ácido nucleico que codifique el NP, un vector replicable que comprenda el ácido nucleico, una célula recombinante que comprenda el vector, y un método que comprenda el cultivar la célula y recuperar el NP del cultivo de las células.

También se proporciona una composición farmacéutica, que comprende un NP activo preoteolíticamente junto con un soporte farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto todavía adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para uso en un método para el tratamiento de las enfermedades o estados trombóticos que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un NP proteolíticamente activo, para uso en terapia a para uso en el tratamiento de las enfermedades o estados trombóticos.

La presente invención también proporciona, en un aspecto adicional, el uso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades o estados trombóticos de un NP proteolíticamente activo.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la secuencia de nucleótidos para la trombina de la secuencia de referencia que codifica el DNA (a la que también se hace referencia como trombina de tipo silvestre), su secuencia complementaria, y la secuencia de amino ácidos deducida de la trombina de la secuencia de referencia (Sistema sadler).

Las Figs. 2A y 2B comparan las actividades en conejos de la trombina humana de tipo silvestre recombinante (Fig. 2A) y la K52A PCA (Fig. 2B). Este estudio muestra que el nuevo polipéptido, en comparación con la trombina humana de tipo silvestre, no produce una reducción significativa en el fibrinógeno circulante pero es capaz de inducir anticoagulación, tal como se mide por el ensayo de PTT activado.

La Fig. 3 muestra que la K52A PCA tiene una significativa vida media in vivo, confiriendo actividad anticoagulante para hasta aproximadamente 150 minutos después de la administración.

La Fig. 4 compara las actividades anticoagulantes de dos dosis de un nuevo polipéptido de esta invención (PCA-2, E229A PCA) en monos cynomolgus.

La Fig. 5 compara las actividades anticoagulantes de dos PCAs de esta invención (K52A y E229A) en monos cynomolgus.

La Fig. 6 demuestra la continua dependencia de la trombomodulina de dos NPs de esta invención, el K52A y el E229A.

La Fig. 7 ilustra la potencia sustancialmente reducida para la activación de las plaquetas de dos de los NPs de esta invención en comparación con la trombina de tipo silvestre.

Descripción detallada de la invención

Los nuevos polipéptidos de esta invención tienen una secuencia de polipéptidos que es al menos aproximadamente un 80% homóloga por la secuencia de amino ácidos (ordinariamente de al menos aproximadamente el 90%, y preferiblemente al menos aproximadamente el 95%) con la trombina de la secuencia de referencia, pero tiene una propiedad cualitativa o cuantitativa significante no poseída por la trombina de secuencia de referencia, tal como se ha descrito en otra parte de la presente invención.

\newpage

Se define "homología" como el porcentaje de residuos en una secuencia de amino ácidos candidata que sean idénticos a los residuos en la trombina de la secuencia de referencia después de alinear las dos secuencias e introducir espacios, en el caso en que sea necesario, para conseguir el máximo porcentaje de homología. Los métodos y programas computacionales para la alineación son conocidos en el estado de la técnica. Un programa computacional que puede ser utilizado o adaptado para objetivos de determinar si una secuencia candidata cae dentro de esta definición es el "Align 2", de Genentech, Inc., que fue solicitado con la documentación de usuario en la Oficina de Copyright de Estados Unidos, Washington, DC 20559, el 10 de Diciembre de 1991.

Mediante el cálculo de la homología de la secuencia de amino ácidos el candidato y las secuencias de referencia están alineadas de modo que produzcan el número máximo de residuos alineados, con inserciones y eliminaciones de residuos representados por espacios en las secuencias alineadas. Por ejemplo, un polipéptido de 120 residuos conteniendo un fragmento de la secuencia de referencia de la trombina de 100 residuos fusionado a su N-terminal a un residuo de 20 heterólogo, secuencia de la señal bacteriana, pero con una única sustitución en el fragmento de la trombina, se calcula para ser homólogo en un 99% a la secuencia de referencia de la trombina mientras que la secuencia del fragmento corresponde exactamente a la secuencia de referencia de la trombina alineada de forma máxima excepto para un único residuo de sustitución y los 20 residuos de la fusión N-terminal. De este modo, si la comparación de maximización del alineamiento del candidato y las secuencias de referencia revela una inserción (o supresión) de uno o más residuos de amino ácidos, entonces estos residuos son ignorados para los objetivos de hacer el cálculo de la homología.

En otro ejemplo, la designación "E202A NP" tal como se utiliza en la presente invención significa que el polipéptido así denominado incluye la sustitución alanina en el sitio 202 de la cadena B de la trombina incluyendo cualquiera de los siguientes: cadena B de la trombina humana madura (libre de la cadena A), protrombina humana conteniendo tanto la cadena A como la B, una fusión de un polipéptido bacteriano con la trombina de cadena B humana, o un fragmento conteniendo el sitio 202 de la cadena B de trombina humana, de modo que cada uno de estos derivados retenga la capacidad de activar la proteína C o de escindir el fibrinógeno para producir un coágulo, o puede ser procesado para hacerlo. Están incluidos los fragmentos de las cadenas A o B de la trombina, así como en particular de la cadena B, siempre que de nuevo el polipéptido en su totalidad sea al menos capaz de activar la proteína C o de escindir el fibrinógeno para producir un coágulo. Los fragmentos de trombina oscilan entre aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100 o más residuos. De forma general, los NPs que contienen más de una sustitución en la secuencia de la trombina también incluirán la secuencia de la trombina que interviene.

El análisis de homología está basado en cualquiera una o más de las secuencias imputadas a partir del ácido nucleico utilizado para expresar el NP, la secuencia del producto tal como se ha producido primero in vitro, o la secuencia después de cualquier modificación post-traduccional. De este modo, si las secuencias de referencia y la candidata son idénticas cuando se expresan, pero se desamina un residuo de glutamina al final a ácido glutámico, el primer candidato es homólogo al 100%, pero la secuencia desaminada no lo es.

Para los objetivos de la presente invención "actividad procoagulante" está definida como la actividad determinada por el ensayo de coagulación del fibrinógeno del Ejemplo 2.3, corregido para normalizar la concentración de NP y la correspondiente trombina de tipo silvestre.

Para los objetivos de la presente invención "actividad anticoagulante" se define como la actividad determinada por el ensayo de activación de la proteína C del Ejemplo 2.4, corregida para normalizar la concentración de NO y la correspondiente trombina de tipo silvestre.

La concentración de NP y de trombina se determina por cualquier ensayo adecuado. La Tabla 1a que se muestra a continuación describe los resultados en los que las concentraciones de proteína del NP y de la trombina están inferidas a partir de la actividad amidolítica. Sin embargo, también es satisfactorio un inmunoensayo para este objetivo. Por ejemplo, el PPAK puede ser utilizado para capturar el NP y la trombina, y las proteínas unidas detectadas por anticuerpos anti-trombina marcados. Si el NP o la trombina es sustancialmente homogénea entonces pueden utilizarse los ensayos de proteína total tales como el bien conocido método de Lowry para determinar su concentración en la muestra del ensayo.

La trombina de tipo silvestre "correspondiente" significa una proteína que está preparada por esencialmente el mismo método que se prepare el NP del analito y tiene la misma secuencia que el NP excepto que las mutaciones encontradas en el NP se han revertido de nuevo a la secuencia encontrada en la trombina de la secuencia de referencia.

En algunas realizaciones los nuevos polipéptidos poseen (a) al menos un epitope inmune que es capaz de una reacción cruzada sustancial con un anticuerpo incrementado frente a la trombina de la secuencia de referencia, (b) dos cadenas homólogas a las cadenas A y B de la trombina de la secuencia de referencia que están unidas por una única unión disulfuro, (c) los residuos del sitio activo de la trombina S205, H43 y D99, (d) un kcat para el fibrinógeno o la proteína C, tal como pueda ser el caso, que es al menos aproximadamente un 20% de, preferiblemente al menos aproximadamente un 75% de y más preferiblemente más de igual a, que el de la secuencia de referencia, (e) un Km para el fibrinógeno o la proteína C, tal como pueda ser el caso, que sea tanto como aproximadamente el 150%, preferiblemente tanto como aproximadamente el 100% y más preferiblemente tanto como aproximadamente el 50%, y preferiblemente al menos aproximadamente del 75%, de la de la secuencia de referencia, (f) actividad proteolítica medida por hidrólisis de S-2238 que sea mayor que aproximadamente un 50% de la trombina de la secuencia de referencia, preferiblemente mayor que aproximadamente el 75% y más preferiblemente mayor que aproximadamente el 90% de la trombina de la secuencia de referencia, y/o (g) que tenga un substrato con una especificidad no mayor que la trombina de la secuencia de referencia, por ej., que sea capaz de romper las proteínas humanas distintas de los substratos de la trombina natural in vivo en una proporción no mayor que aproximadamente el 150%, y preferiblemente no mayor de aproximadamente el 120% de la secuencia de referencia.

El PCA de esta invención posee de forma típica (a) una actividad procoagulante que es igual a o menor que aproximadamente 50, 25, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ó 1% de la trombina de la secuencia de referencia, (b) una relación de actividad anticoagulante a actividad procoagulante que es mayor que aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25 ó 50 cuando se compara con la trombina de secuencia de referencia, y (c) una actividad anticoagulante que es igual a o mayor que aproximadamente el 5, 10, 15, 25, 50, 75 o 100% de la actividad anticoagulante de la trombina de la secuencia de referencia.

La FCP de esta invención posee de forma típica (a) una actividad anticoagulante que es igual a o menor que aproximadamente 50, 25, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1% de la trombina de la secuencia de referencia, (b) una relación de actividad anticoagulante a actividad procoagulante que es menor que aproximadamente 0,5, 0,25, 0,15, 0,10, 0,09 o 0,08, cuando se compara con la trombina de la secuencia de referencia, y (c) una actividad procoagulante que es igual a o mayor que aproximadamente 5, 10, 15, 25, 50, 75 o 100% de la actividad procoagulante de la trombina de la secuencia de referencia.

Los nuevos polipéptidos de esta invención comprenden sustituciones por, eliminaciones de, o inserciones de cualquier residuo de amino ácido adyacente a, cualquiera de los sitios de los residuos de amino ácidos de la secuencia de referencia que se muestran en la Tabla 1 o 1b que se muestra a continuación. La Tabla 1 muestra los resultados de un estudio en el que los residuos de trombina han sido sustituidos con alanina. Los NPs de sustitución son aquellos en los que al menos un residuo de amino ácido en la secuencia de referencia ha sido eliminado y un amino ácido diferente ha sido insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser únicas, cuando sólo ha sido sustituido un amino ácido en la molécula, o pueden ser múltiples, cuando dos o más amino ácidos han sido sustituidos en 2 o más sitios de trombina. Las columnas de la Tabla 1, de izquierda a derecha muestran nuestro número de código, los residuos sustituidos, dos columnas de los datos de hidrólisis de S-2238 (una medición de la actividad proteolítica de la trombina y un índice de la ruptura conformacional ocasionada por la sustitución), la coagulación del fibrinógeno (una medida de la actividad procoagulante), la activación de la proteína C (una medida de la actividad anticoagulante), la relación de activación de la proteína C a la actividad de coagulación del fibrinógeno, y la inhibición de la AT-III dependiente de heparina (una medición de la capacidad del NP para contrarrestar la inactivación por la AT-III en la presencia de heparina). No se pudo detectar expresión en nuestro sistema de NPs Mt3 y Mt37c.

TABLA 1

1

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

El parámetro más destacado de la Tabla 1 es la relación PA/FC. Cuanto más varía esta relación a partir de 1,0, mayor es la segregación del procoagulante y las propiedades de activación del PC en los mutantes. Aquellos con el valor aritmético más alto son particularmente dedicados a la activación del PC, mientras que aquellos con el menor valor son dedicados a la función procoagulante. Sin embargo, está comprendido dentro del alcance de esta invención el sustituir de forma adicional cualquier residuo de amino ácido distinto de la alanina en los sitios de la Tabla 1, por ej. uno de los 20 residuos que se encuentran de forma natural descritos anteriormente. Para las utilidades terapéuticas anticoagulantes óptimas las capacidades de activación del PC del NP deben ser de al menos aproximadamente el 5%, ordinariamente entre el 10% y el 30%, de la trombina de la secuencia de referencia, sin contrarrestar la relación PA/FC, de modo que se puede asegurar que estará presente la suficiente actividad de la enzima para ejercer un efecto fisiológico o diagnóstico. Además, la actividad de coagulación de la fibrina absoluta de la PCA idealmente debe ser menor que aproximadamente el 10% de la trombina de referencia, generalmente menos de aproximadamente el 5% y ordinariamente menos de aproximadamente el 3% y preferiblemente menos de aproximadamente el 1% de tipo silvestre, para ayudar a asegurar la seguridad clínica. No es necesario que el NP retenga el mismo nivel de actividad de activación de la proteína C que la trombina de la secuencia de referencia debido a que una menor potencia es fácilmente superada en terapia por una simple administración de más enzima. En este respecto los PCAs E229 y R233 son particularmente atractivos.

Además de las sustituciones de la alanina que se muestran en la Tabla 1, se encuentra dentro del alcance de esta invención el sustituir otros residuos en la secuencia de referencia de la trombina. Los residuos insertados en la secuencia son generalmente amino ácidos de origen natural, de forma común G, A, Y, V, L, I, S, T, D, E, Q, C, M, N, F, P, W, K, R o H (utilizando el código convencional de letra única; EP 323,149). Residuos adecuados para la inserción también incluyen hidroxiprolina, ácido beta-hidroxiaspártico, ácido gamma-carboxiglutámico, hidroxilisina o norleucina, para ser utilizados como alternativas a sus homónimos.

Estas sustituciones pueden ser conservadoras de modo que el residuo sustituyente tendrá una semejanza estructural o funcional al residuo sustituido. Otras sustituciones serán menos conservadoras de modo que constituirán un intercambio entre diferentes clases de residuos estructurales o funcionales. Para los objetivos de la presente invención, estas clases son las siguientes: 1. Electropositiva: R, K, H; 2. Electronegativa: D, E; 3. Alifática: V, L, I, M; 4. Aromática: F, Y, W; 5. Pequeña: A, S, T, G, P, C; 6. Cargada: R, K, D, E, H; 7. Polar: S, T, Q, N, Y, H, W; y 8. Hidrofílica Pequeña: C, S, T. Las sustituciones inter-grupos generalmente tendrán mayores efectos en la función de la proteína que las sustituciones conservadoras (intra-clases). De este modo, se encuentra particularmente dentro del alcance de esta invención el introducir sustituciones conservadoras en los sitios de la Tabla 1 o 1b y, si los resultados no son satisfactorios, introducir sustituciones no conservadoras en los sitios. De forma típica, sin embargo, no están favorecidas las sustituciones o inserciones de prolina, glicina, y cisteína.

Un objeto de esta invención es obtener los NPs que son mínimamente inmunogénicos o no-inmunogénicos en humanos. En este respecto, no están favorecidas las sustituciones o inserciones de residuos de K o R en la secuencia.

Las sustituciones se hacen preferiblemente en los sitios de la Tabla 1 en donde la sustitución de la alanina da lugar a una relación PA/FC que es mayor que 2,0 o menor que 0,5 (W50, K52, E229, R233, D234, y R98).

Se seleccionaron cuatro de estos sitios para la mutagénesis de saturación (E229, R233, W50 y K52). Además, se introdujeron de forma variable dobles y triples mutaciones en los sitios W50, K52, R233, E229, E202, K106, K107, D193 y K196. Se prepararon estos NPs y se expresaron en cultivos de células recombinantes del mismo modo que los mutantes de la Tabla 1, y a continuación se ensayaron para los niveles de expresión, la actividad amidolítica, la aPC y la actividad de coagulación del fibrinógeno. Los resultados se muestran en la Tabla 1a ("INF" = aproximaciones al infinito; los NPs de modelo todavía no han sido caracterizados).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1a

5

6

7

Los datos en la Tabla 1a se obtuvieron tal como se proporcionaron en la Tabla 1, y las actividades (activación de la proteína C y coagulación del fibrinógeno) se normalizaron por la actividad amidolítica, excepto que en la Tabla 1a cuando la actividad amidolítica específica del NP fue menor del 75% de la correspondiente a la trombina de tipo silvestre, los valores de actividad del NP para la activación de la proteína C y la coagulación del fibrinógeno fueron corregidos por multiplicación por la correspondiente actividad amidolítica específica del NP (expresado como % del tipo silvestre). Se deberá notar que los valores numéricos para la actividad del PA y del FC difieren entre las Tablas 1 y 1a para los NPs que aparecen en ambas Tablas. Esto es el resultado de dos factores. En primer lugar, los resultados de la Tabla 1a representan de forma general los resultados de sólo 1 ó 2 ensayos de replicación, mientras que los de la Tabla 1 están basados en hasta 4 replicados. Ya que el coeficiente de variación de los ensayos de PA y de FC está en el intervalo de aproximadamente 10-20%, puede esperarse que los resultados de la Tabla 1a varíen entre los de la Tabla 1 para los mismos NPs. En segundo lugar, los resultados de la Tabla 1a fueron corregidos para la concentración de proteína basada en las manchas Western si la actividad amidolítica fue menor del 75% de la trombina de tipo silvestre, tal como se ha descrito anteriormente. Esto permite una comparación más ajustada entre los varios NPs en la Tabla 1a ya que los resultados están corregidos para la misma concentración de proteína tal como se ha determinado por la mancha del Western. La corrección fue ampliamente innecesaria con los NPs de la Tabla 1 debido, para la mayor parte, a que los mutantes de la alanina retuvieron la mayor parte de la actividad proteolítica de la trombina de la secuencia de referencia.

Se identificaron los PCAs particularmente destacables en la Tabla 1a; los datos indican retención de al menos parte de la actividad de la aPC pero una eliminación esencialmente completa de la actividad del FC detectable en nuestro ensayo (600 segundos sin coagulación). Estos fueron los mutantes dobles W50A,E229A y E229A,R233A; y los mutantes simples E229D (que sólo difieren de forma remarcable de la enzima de tipo silvestre por un grupo metileno único), E229F, E229S, E229W, E229Y, R233E, R233G, R233M, R233N, R233S, W50E, W50K, W50C, y K52C.

Los PCAs de la Tabla 1 y 1a son sólo representativos de los NPs en los que los residuos de trombina están mutados con el fin de producir PCAs particularmente seguros y potentes. Fácilmente se identificaron otros PCAs de este tipo por los métodos descritos en la presente invención u otros métodos aparentes para el técnico medio en la materia. Por ejemplo, se seleccionaron los sitios múltiples de variación por aditividad de las actividades, y otros sitios prometedores identificados por selección de la alanina se sometieron a mutagénesis de saturación para seleccionar la modificación óptima. Ya que se hace aparente que pueden identificarse de forma exitosa otros NPs que tienen las propiedades procoagulantes y anticoagulantes deseadas, sería meramente una cuestión de experimentación de rutina el identificarlos y aislarlos.

Se hace aparente a partir de las Tablas 1 y 1a que el E229 y R233 son residuos clave para los PCAs. La modificación de los residuos de trombina en contacto de Van der Waals con E229 o R233, con los residuos próximos a los E229 o R233 y con los residuos en contacto con el dominio que contiene el R233 y el bucle que contiene el E229 puede afectar la coagulación de fibrinógeno y la activación de la proteína C de un modo análogo a la sustitución directa del E229 o R233 provocando la posición o la orientación del E229 o del R233 a cambiar, o por ruptura de las interacciones intramoleculares normalmente asociadas con E229 o R233. Con el fin de identificar los residuos cuya sustitución puede mimetizar la sustitución del E229, se correlacionaron los residuos en cercana proximidad al E229 en la estructura tri-dimensional de la trombina (Bode, W. y col., EMBO J. 8:3467:3475 (1989)). Los residuos cuyo C\alpha estuvo dentro de una esfera de 10 \ring{A} circundante el C\alpha de E229 están listados en la siguiente Tabla 1b.

TABLA 1b

8

Uno de los sitios identificado de forma independiente por este análisis es el R233, el cual ha demostrado por los resultados descritos en la Tabla 1a que juega un papel significativo en la especificidad del PCA. Se han identificado otros tres sitios en la selección original descrita en la Tabla 1 y todos tres rindieron una relación PA/FC superior a 1, confirmando de nuevo el papel instrumental de este dominio en la segregación de la especificidad del substrato de la trombina respecto a la actividad del aPC. De acuerdo con ello, se encuentra dentro del alcance de esta invención el preparar NPs en los que se haya insertado un residuo adyacente a, sustituido por o eliminado en cualesquiera uno o más de los residuos señalados en la Tabla 1b. En particular, son de especial interés los residuos que se encuentran dentro de los 10 Angstroms del E229 C\alpha o R233 C\alpha, e incluso más los que están dentro de los 8 Angstroms. Sin embargo, los C201 y C231 no son sitios preferidos ya que están apareados para formar un puente de disulfuro en la trombina en estado natural. Los G228, G230, G235 y G238 tampoco son los preferidos. De acuerdo con ello, los residuos preferidos de la Tabla 1b para la sustitución, inserción o eliminación son 5176, T177, W227, D232, K236, Y237, y G239. Las sustituciones para los residuos de la Tabla 1b son preferidos sobre las eliminaciones o las inserciones, y son realizadas con miembros de una clase diferente a la que pertenecen los residuos naturales, o las sustituciones pueden ser por otros miembros diferentes de los de la clase de los residuos naturales. Sin embargo, en general, la cisteína, la prolina y la glicina no estarán sustituidos en lugar de cualquiera de los residuos de la Tabla 1b. Los residuos de 10 Angstroms para el R233 se solaparán con muchos de los residuos próximos del E229 y los adicionales que no se solapen son fácilmente identificados utilizando la estructura en tres dimensiones de Bode (op cit).

Los polipéptidos del PCA son generalmente polipéptidos en los que los residuos en uno o más de los siguientes sitios de trombina han sido sustituidos por los correspondientes residuos de la secuencia de referencia: K52, W50, E229, D234 y R233. Los residuos K52, y/o K196, de forma independiente están preferiblemente sustituidos con un residuo de amino ácidos de origen natural, por ej., G, A, V, L, I, S, T, D, N, E, Q, C, M, F, Y, P, W, R o H. El K52 está sustituido de forma ordinaria con cisteína, glicina, alanina, ácido glutámico, ácido aspártico, asparagina o glutamina, en algunos casos con cualquier residuo de amino ácido de origen natural distinto de ácido glutámico, o en otras realizaciones, con un residuo diferente de ácido glutámico o ácido aspártico, mientras que el K196 está sustituido, de forma típica, con alanina, ácido glutámico, ácido aspártico, asparagina, glutamina, arginina o histidina.

El W50 está preferiblemente sustituido con un residuo de amino ácido de origen natural, por ej., G, A, V, L, I, S, T, D, E, Q, C, M, F, P, N, K, R, Y, o H, de forma típica cisteína, alanina, fenilalanina, lisina, arginina o histidina.

El R233 está preferiblemente sustituido con un residuo de amino ácido de origen natural, por ej., G, A, V, L, I, S, T, W, D, Q, C, M, F, P, N, K, E, Y, o H, de forma típica alanina, lisina, asparagina, glutamina, ácido glutámico, treonina, histidina o serina.

Los NPs que representan combinaciones de los anteriormente mencionados se encuentran dentro del alcance de esta invención. Se introducen en la trombina 2, 3, 4, 5, o más sustituciones a partir de los anteriormente mencionados, tal como se define en la presente invención. Los resultados de las sustituciones de amino ácidos individuales son generalmente aditivas excepto cuando el residuo interacciona con cada otro de forma directa o indirecta. Se espera que los PCAs adicionales se obtengan de múltiples sustituciones en combinaciones de los residuos clave descritos anteriormente (W50, K52, D193, K196, E229, R233, D234). Éstos son fácilmente seleccionados utilizando los mismos procedimientos descritos a continuación con el fin de identificar aquellos que tengan propiedades mejoradas, en particular una reducción intensificada en la actividad procoagulante en relación con la actividad anticoagulante. Estos incluyen por ejemplo los E229,R233,D234; E229,R233; E229,D234; R233,D234; E229,K52; R233,K52; D234,K52; E229,R233,K52; E229,D234,K52; R233,D234,K52; E229,R233,D234,K52; W50,D58; W50,K52; W50,E229;
W50,R233; W50,D234; W50,E229,R233,D234; W50,E229,R233; W50,E229,D234; W50,R233,D234; W50,E229,
K52; W50,R233,K52; W50,D234,K52; W50,E229,R2,33,K52; W50,E229,D234,K52; W50,R233,D234,K52; W50,
E229,R233,D234,K52.

Realizaciones que sirven de ejemplo de los NPs con múltiples sustituciones que caen dentro los siguientes (la clase de sustitución es designada por el anterior número de clase, por ej., W50,3 significa W50 sustituidos cualquiera de los V, L, I o M): W50,1,,2,,3,,5,,6,,7 o ,8, K52,2,,3,,4,,5,,6,,7 o, 8; W50,1,,2,,3,,5,,6,,7 o ,8, E229,1,,3,,4,,5,,6,,7 o, 8; K52,2,,3,,4,,5,,6,,7 o, 8; R233,2,,3,,4,,5,,6,,7 o ,8;

Los NPs con múltiples sustituciones particulares son W50F, Y o H,E229D, N o Q; W50F,Y o H,R233K o H; E229D, N o QR233K o H; W50A,K52A; W50A,E229A; W50A,R233A; K52A,D193A,K196A; K52A,E229A; K52A,
K233A; E229L,R233E; E229L,R233N; E229L,W50K; E229L,K52W; E229A,W50L; E229L,W50M; R233E,W50G; R233E,W50K; R233E,W50K; R233E, W50L; R233E,W50M; R233E,W50R; R233E,W50T; R233E,K52W; W50L,
K52A; W50L,K52W; y E229A,R233A.

Ejemplos adicionales de los NPs con sustituciones múltiples están seleccionados entre los siguientes: K52G,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52A,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52V,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52L,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52I,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52S,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52T,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52D,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q M, F, Y, P, W, R, K o H; K52N,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52E,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52Q,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q M, F, Y, P, W, R, K o H; K52M,E229G; A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52F,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52Y,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52P,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52W,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q M, F, Y, P, W, R, K o H; K52R,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; K52H,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, C, Q, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50G,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50A,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50V,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50L,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50I,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50S,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50T,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50D,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50N,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50E,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50Q,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50M,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50F,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50Y,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50P,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50K,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50R,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50H,E229G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, M, F, Y, P, W, R, K o H; W50G,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50A,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50V,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50L,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50I,R233G, A, V, I,.L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50S,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50T,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50D,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50N,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50E,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50Q,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50M,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50F,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50Y,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50P,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50K,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50R,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; W50H,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229G,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229A,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229V,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229L,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229I,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229S,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229T,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229D,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229N,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229Q,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229M,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229F,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229Y,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229P,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229K,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229R,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; E229H,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y, P, N, K, E o H; y E229W,R233G, A, V, I, L, S, T, W, D, Q, C, M, F, Y; P, N, K, E o H.

Los NPs que tienen uno o más amino ácidos insertados de forma inmediatamente adyacente a un amino ácido de la trombina en cualquiera de las posiciones de la Tabla 1, 1a o 1b designada en la secuencia de referencia están incluidos dentro del alcance de esta invención. Los NPs insercionales tendrán generalmente una estructura de polipéptido que comprende la secuencia NH_{2} -PP-A-(X)_{n1} -B-PP-COOH, en donde X es el residuo(s) insertado (que puede ser igual o diferente), n1 es un número entero, cualquiera de los A o B son los sitios del residuo designados para la inserción y PP representa el resto del NP o un enlace en el N o C terminal del NP. Ejemplos de ellos incluyen K52AA, R233RA, K52KA, K52AK, E229AE, E229EW, E229WE, E229EY, E229YE, y E229EA (leyendo en la dirección del terminal N a C). De forma típica se han encontrado inserciones dentro de aproximadamente 10 Angstroms de E229 y de forma adyacente a cualquier residuo de la Tabla 1b. Las inserciones incluyen polipéptidos de trombina o de no trombina en el intervalo entre 1 y aproximadamente 1000 o más residuos, aunque éstos son introducidos de forma típica en los finales del N o en el C terminal de las cadenas NP A y/o B. Estos polipéptidos incluyen secuencias de protrombina o fragmentos de la misma (tanto de humanos como de animales), secuencias antigénicas para la purificación por inmunoafinidad de los productos del NP del cultivo de células, secuencias de señal y similares, tal como se describen a continuación de forma más completa.

También se incluyen dentro del alcance de esta invención los NPs en los que el sitio de glicosilación es introducido o eliminado de la secuencia de referencia, tanto por sustitución, inserción o eliminación de uno o más residuos de amino ácidos. Dichos cambios darán lugar a la instalación o eliminación de la secuencia NXS o NXT, en donde X puede ser cualquier residuo. De este modo, la asparagina puede estar sustituida por cualquier residuo localizado 2 residuos N-terminal a la serina o a la treonina para introducir un sitio de glicosilación.

También se incluyen dentro del alcance de esta invención los NPs de eliminación, es decir, NPs en los que se ha eliminado uno o más de los residuos de amino ácidos de la secuencia de referencia en el sitio designado, con lo que los residuos de flanqueo están ahora unidos por un enlace de péptido en la forma ordinaria. Cualquiera de los sitios establecidos en las Tablas 1 o 1b es adecuado para la eliminación, aunque generalmente no es preferido eliminar los residuos P, C o G. Además, la cadena A de trombina en su totalidad es eliminada de forma opcional en algunas de las realizaciones de los NP. En las realizaciones de esta invención, las eliminaciones se hacen dentro de aproximadamente 10 Angstroms de E229 e incluyen cualquiera de los residuos en la Tabla 1b, preferiblemente el A200.

De forma típica, las eliminaciones o inserciones son relativamente pequeñas, del orden de 1 a 10 residuos y generalmente no más de 2, aunque las eliminaciones o inserciones pueden ser bastante grandes si no son en partes de la secuencia de referencia requerida para la actividad procoagulante o anticoagulante como puede ser el caso, o la secuencia adicional va a ser eliminada en cualquier punto durante el procesamiento post-traduccional o post-recuperación. El número de residuos que es eliminado o insertado en parte dependerá de si éstos se encuentran o no en los componentes estructurales secundarios tales como hélices o capas (con lo que sólo 1 o, preferiblemente 2 residuos son insertados o eliminados), o son en dominios estructuralmente menos confinados tales como bucles, en donde mayores números de residuos pueden ser eliminados o insertados sin perturbar de forma indebida la estructura de la trombina.

También se incluye dentro del alcance de esta invención los NPs que tienen combinaciones de eliminaciones, inserciones y/o sustituciones. De forma típica, una eliminación de un residuo único puede estar acompañada por una inserción entre 1 y 3 residuos aproximadamente del sitio de la eliminación; las eliminaciones de dominios mayores no necesariamente para una actividad procoagulante o aPC, como puede ser el caso, no necesita estar acompañada por una inserción.

Los NPs de esta invención pueden estar sometidos a modificación post-traduccional covalente, por ej., desaminación de la asparagina o glutamina, o oxidación de los residuos de cisterna, y glicosilación ausente o variante en el N53 dependiendo de la célula huésped utilizada para expresar la variante. Los NPs conteniendo dichas modificaciones están incluidos dentro del alcance de esta invención. Si el N53 es glicosilado, es glicosilado preferiblemente con carbohidratos característicos de células de mamíferos, aunque también puede seguir modelos de glicoosilación fúngicos (tal como la levadura). Es aceptable la glicosilación característica de la expresión del NP a partir de líneas celulares o de fibroblastos, células de riñón, de pulmón, de piel, neurales, de hígado o de huesos, o de cualquier línea celular de mamíferos tal como el CHO o las células de riñón embriónicas.

Un mecanismo principal de la eliminación de la trombina in vivo es la formación de un complejo trombina-AT-III, que es ampliamente dependiente de las moléculas de tipo heparina de la superficie de las células. Es esperable que el sitio de unión de la heparina de la trombina mutante prevenga a la heparina de unirse y por tanto prolongue la vida media de la proteína. Clínicamente, esto reducirá la cantidad de proteína requerida para conseguir un efecto anti-trómbico. En esta realización el sitio de unión de la heparina es mutagenizado de modo que el NP ya no sea capaz de unirse a la heparina de forma sustancial. Esto es conseguido por eliminación, sustitución o inserción de uno o más residuos en al menos el conocido dominio de unión de la heparina (incluyendo los R89, R180, R245, K248 y K252). Los NPs resistentes incluyen sustituciones o inserciones que dan lugar a la introducción de un nuevo sitio de glicosilación unido por O- o N- (NXS/T) en la región de unión (por ejemplo R180N).

La Tabla 1 muestra que dos mutantes, implicando cada uno de ellos triples sustituciones de alanina, fueron resistentes a la inhibición mediada por heparina por AT-III, mostrando una actividad de coagulación de fibrinógeno mayor del 50% en presencia de heparina en comparación con el 18% para la trombina de tipo silvestre. Uno de estos mutantes, que implica la sustitución simultánea de R178, R180 y D183, mostró que no había reducción de la actividad procoagulante o anticoagulante. Se identificaron los mutantes óptimos por selección para aquellos que son más resistentes a la inhibición mediada por heparina, particularmente en presencia de antitrombina III. Las mutaciones de este tipo son combinadas de forma opcional con las variaciones descritas anteriormente, por ej., aquellas que muestran una reducción en la actividad procoagulante relativa a la actividad anticoagulante. Dichos NPs son administrados en combinación con heparina para conseguir un potente efecto anticoagulante donde el proceso anticoagulante es activado por el NP y la actividad procoagulante de la trombina endógena es inhibida por la inhibición mediada por heparina por el AT-III.

Preparación y Selección de los NPs

Los NPs óptimos que muestran una coagulación del fibrinógeno o un aPC modulado, una inhibición de la heparina reducida, una capacidad modificada para escindir el receptor de trombina de las plaquetas, y otras propiedades deseadas, son identificados por candidatos de selección frente los ensayos in vitro relevantes tal como se describe en el presente documento, y ensayando a continuación en animales del modo deseado seguido por determinación de la eficacia en modelos de trombosis o de sangrado. Puede utilizarse aPC exógeno como un control positivo. A continuación, de forma opcional, los NPs seleccionados son ensayados de forma directa en modelos animales en los que se ha demostrado que la infusión de aPC es eficaz, por ej., en conejo, hámster, o mandril. Estos ensayos son convencionales y ampliamente conocidos en el estado de la técnica. No se requiere experimentación indebida para preparar y ensayar otros NPs distintos de los específicamente descritos en el presente documento.

Los NPs de esta invención son fácilmente preparados por métodos conocidos en el estado de la técnica. En general, se prepara el ácido nucleico que codifica el NP por la PCR, síntesis in vitro, clonación o combinaciones de los tres, incluyendo en el caso en que sea necesario el sitio al que se dirige la mutagénesis del ácido nucleico que codifica la trombina. Es expresado en los sistemas in vitro o en células huésped recombinantes. Un método para la expresión es la síntesis basada en ribosomas que utiliza tRNAs dedicados (Benner, "TIBTECH" 12:158-163 [1994] y Robertson y col., "J. Am. Chem. Soc." 113:2722-2729 [1991]), pero normalmente, el ácido nucleico que codifica el NP (de forma general DNA) es insertado en un vector de expresión apropiado, las células huésped son transfectadas con el vector recombinante, las células huésped recombinantes se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado, y el NP de la secuencia de amino ácidos deseada es recuperado del cultivo de células recombinante por métodos cromatográficos o por otros métodos de purificación. También se encuentra dentro del alcance de esta invención la síntesis parcial del NP en cultivo de células recombinante o por métodos in vitro y a continuación ligado de los fragmentos de polipéptidos por la ligasa del péptido (síntesis proteolítica reversa).

\newpage

El ácido nucleico para la expresión del NP codifica de forma típica una preprotrombina que contiene la mutación deseada ya que esto permite la fácil expresión y procesamiento por métodos hasta ahora utilizados con trombina. Además, los métodos conocidos para la expresión recombinante de protrombina "sin domino gla-" son fácilmente adaptados para la preparación de los NPs de esta invención. Está dentro del alcance de esta invención el expresar el ácido nucleico que codifica los análogos de NP de cualquiera de (a) pretrombina-2 (alfa trombina) o pretrombina-1, (b) la secuencia de ambas cadenas de meizotrombina des 1 (que son expresadas tanto como una cadena única que se extiende desde el S156 [Degen y col.] a la terminación 3' del ácido nucleico que codifica la cadena B, o están sobreexpresados como ácidos nucleicos que codifican de forma separada el fragmento S156 y la cadena de trombina B), (c) trombina (que es expresada como una cadena única que codifica tanto las cadenas A y B, o está coexpresado en la misma célula como ácidos nucleicos que codifican de forma separada las cadenas A y B) o (d) la cadena de trombina B libre de la cadena A. Por "que codifica de forma separada" se significa que los ácidos nucleicos que codifican la cadena A y B están separados por al menos un codón de parada y, si es necesario, el ácido nucleico en el sentido de la corriente (normalmente la cadena B) comienza con un codón de inicio. Sin embargo, es de señalar, que los registros de expresión policistrónicos de las bacterias pueden no requerir un codón de inicio para la secuencia de codificación en el sentido de la corriente. En la patente U.S. 4.923.805 se describen vectores adecuados y células huésped para la expresión de las dos cadenas de forma independiente. Dichos sistemas de expresión heterodiméricos son generalmente mamíferos.

Los sistemas de expresión policistrónicos son útiles para la coexpresión de secuencias de células únicas que comprenden las dos cadenas de trombina descritas anteriormente. Estos sistemas son conocidos per se, y son particularmente útiles en el caso, como el presente, en que se desee hacer las cadenas A y B del NP de forma independiente en el cultivo de la célula y por consiguiente evitar cualquier necesidad de procesado post-traduccional. En este caso ambas cadenas son generalmente expresadas bajo la dirección de la misma secuencia de control de expresión (cuyas cadenas y secuencias de control de expresión pueden estar en el mismo vector o en uno diferente). Sin embargo, el ácido nucleico que codifica cada cadena contiene su propio codón de inicio tal como se requiere y, preferiblemente, cada ácido nucleico codifica su propia secuencia señal.

El NP es expresado de forma opcional como una preproteína de \alpha-trombina o las cadenas A y B separadamente, con lo que el NP es expresado como un precursor que es procesado al NP maduro y segregado a partir de la célula huésped. Las presecuencias o las secuencias de señal para uso en la presente invención incluyen la presecuencia nativa normalmente asociada con la fuente del gen de trombina, por ej. la presecuencia humana para preprotrombina, o las presecuencias que tienen secuencias de amino ácidos que son heterólogas por secuencia o origen a la señal de protrombina. Las presecuencias adecuadas incluyen aquellas de (a) proteasas microbianas tales como subtilisina, (b) proteasas de mamíferos tales como tripsina, quimotripsina, enzimas fibrinolíticas incluyendo la uroquinasa o el tPA, y factores de coagulación de la sangre tales como los Factores V, X, IX, VII, VIII o fibrinógeno, (c) citoquinas tales como gamma interferón o una interleukina, (d) factores de crecimiento tales como la hormona del crecimiento o el TGF-alfa, (e) polipéptidos o proteínas que tienen secuencias maduras N-terminales que son homólogas a las cadenas A o B de la trombina humana, (f) inmunoglobulinas, (g) receptores, (h) otras presecuencias de proteínas segregadas o unidas a membranas celulares o (i) presecuencias conocidas utilizadas para dirigir la secreción de protrombina de menor dominio gla (página 11, línea 30 - página 12, línea 21 de la patente WO 93/13208). Las secuencias de la señal son derivadas de forma opcional de o son homólogas a la célula huésped, o al menos la rama filogenético a la que pertenece la célula huésped. Por ejemplo, uno utilizaría de forma ordinaria una pre-secuencia de una proteína de levadura, tal como el factor de acoplamiento, en un sistema de expresión de una levadura, o de una bacteria, tal como el ST-II o la beta-lactamasa, en sistemas de cultivo de células bacterianas. Sería deseable seleccionar señales a partir de polipéptidos heterólogos que tienen residuo(s) N-terminal completo que son el mismo que las cadenas A o B de la trombina completa, y para usar aquellas señales con la cadena de trombina N-terminalmente homóloga. Son conocidas una amplia variedad de secuencias de señal adecuadas y pueden ser utilizadas en métodos para la preparación de los NPs descritos en la presente invención.

Las construcciones de ácido nucleico que codifican el NP segregado codificarán generalmente las cadenas de trombina A o B fusionadas a su N-terminal al término C normal de la misma o de diferentes secuencias de señal. Están divididas en vectores de expresión bajo el control de secuencias de control tales como promotores, operadores, intensificadores y secuencias de poliadenilación tal como se conoce de forma general en el estado de la técnica. Los vectores de expresión adecuados de construcción para los NPs segregados o expresados de forma protoplásmica de esta invención son una cuestión de rutina para los expertos en la materia, y se conseguirán utilizando las herramientas convencionales de la biología molecular, incluyendo la síntesis de ácido nucleico in vitro, la PCR, adapteros, ligasas, enzimas de restricción, plásmidos de expresión y lanzadera, auxiliares de transfección y similares, todos los cuales son asequibles de forma pública (y para la mayor parte de forma comercial).

Son bien conocidos los promotores o intensificadores adecuados, las secuencias de terminación y otras funcionalidades para uso en la expresión de NBP en células huésped recombinantes, al igual que las células huésped adecuadas para transfección con ácido nucleico que codifica el NP deseado, algunos de los cuales han sido mencionados anteriormente mientras que otros están descritos en la patente WO 93/13208 en la página 12, línea 21 - página 19, línea 5, y en la patente EP 319,312 B1, página 16, líneas 10-18 y en la Tabla II de la misma. Puede resultar óptimo el utilizar células huésped que sean capaces de glicosilar los NPs, que incluyen de forma típica células de mamíferos tales como células 293 de riñón embriónico, células COS, CHO, células BHK-21 y similares. Además, las células huésped son adecuadas por lo que han sido utilizadas hasta ahora para expresar las enzimas proteolíticas o los zimogenes en cultivos de células recombinantes, o las que son conocidas por expresar altos niveles de dichas enzimas o zimogenes en cultivos no recombinantes. En el último caso, si la enzima endógena o el zimogen es difícil de separar del NP entonces el gen endógeno deberá ser eliminado por recombinación homóloga o su expresión suprimida por cotransfección de la célula huésped con ácido nucleico que codifica una secuencia anti-sentido que es complementaria al RNA que codifica el polipéptido indeseado. En este caso las secuencias de control de expresión (por ej., promotor, intensificadores, etc.) utilizadas por el gen endógeno altamente expresado son utilizadas de forma óptima para controlar la expresión del NP.

El sistema de vector-huésped debe ser seleccionado de modo que rinda el NP sustancialmente homogéneo, con lo que se evita la necesidad de purificar una única especie molecular de otras isoformas del NP. De este modo, si la célula es capaz de glicosilación, esencialmente todas las moléculas de NP deben ser glicosiladas. Además, las células huésped serán seleccionadas de forma óptima de modo que estén desprovistas (en el compartimiento de la célula relevante) de la actividad proteolítica que es capaz de rotura intra-cadena de las cadenas A o B de la trombina. Las células pueden ser seleccionadas de modo que no contengan proteasas, por ej., en el periplasmo, que se escindan después de la trombina B R62, R123, R73, o K154, todos los cuales son conocidos como sitios de degradación de la cadena B. Por ejemplo, es conocido que la E. coli y otras cepas microbianas poseen poca o ninguna actividad proteolítica periplásmica o extracelular (distinta de las peptidadasa de señal). Dichas células serán utilizadas de forma óptima en los sistemas de expresión en los que las cadenas A y B son expresadas en la misma célula huésped fusionada a las mismas o diferentes secuencias de señal. Las cadenas A y B son co-segregadas en el periplasmo o en el medio extracelular en donde se unen por un disulfuro. La ausencia de proteasas eliminadas ayuda a asegurar que el producto no se vuelve micro-heterogéneo como a la longitud de la cadena por las proteasas endógenas al huésped que actúan en el producto NP, pero naturalmente la secreción independiente de la cadena A y B no es dependiente del uso de dichas células. Además, o de forma alternativa, los residuos básicos de las cadenas A o B que son sitios para la rotura proteolítica son sustituidos con residuos diferentes de K o R. Por ejemplo, se ha descrito que el K154 es uno de los sitios escindidos en la conversión de gamma trombina (Colman y col., "Hemostasis y Thrombosis", p. 154 (1987)). La anterior Tabla 1 muestra que el K154 puede ser sustituido con A sin cambio significativo en la actividad. De este modo, el K154 puede ser sustituido con otro residuo distinto de R con el fin de conferir resistencia a la degradación proteolítica (además de cualesquiera otras variaciones sean deseadas). Esto también puede extender la vida in vivo del NP.

Las células recombinantes son cultivadas bajo condiciones convencionales y utilizando medios de cultivo convencionales hasta ahora utilizados con las células en cuestión. Estas condiciones y medios son ampliamente conocidos. Las células recientemente transfectadas pueden expresar los NPs de forma transitoria, pero se obtienen fácilmente transformantes estables de acuerdo con la práctica convencional utilizando la cotransformación con un gen seleccionado tal como DHFR o la sintetasa de glutamina y cultivos en serie en presencia de un agente de selección tal como metotrexato o sulfoximina de metionina, respectivamente. Los rendimientos de los NPs pueden diferir de forma sustancial a pesar de menores diferencias en el carácter de los sustituyentes o inserciones. En dichos casos, es deseable seleccionar para un sistema de expresión que rendirá una cantidad de trombina en el mismo sistema de expresión. Este es ocasionalmente útil para cultivar células a una temperatura menor que la usual de 37ºC, de forma típica aproximadamente entre 10ºC y 30ºC, de forma óptima aproximadamente entre 15ºC y 27ºC. Este es el caso tanto con células microbianas como de mamíferos.

El Np es expresado preferiblemente como un análogo de la cadena A y B de la trombina unido por un disulfuro, adecuadamente enlazado, o como el análogo sólo de la cadena B. En general, el NP será soluble en agua. Puede ser expresado en bacterias en la forma de cuerpos refráctiles, en cuyo caso el NP insoluble es recuperado y replegado utilizando métodos conocidos, por ej. disolución en clorhidrato de guanidinio seguido por la eliminación gradual del desnaturalizante. Los NPs directamente expresados de esta invención pueden tener una metionina N-terminal o un residuo de metionina bloqueado, aunque las células huésped pueden ser utilizadas de modo que eliminen por rotura dichos residuos de metionina N-terminal.

Si las cadenas A y B están fusionadas, por ejemplo cuando el NP es expresado como el análogo de \alpha-trombina, entonces puede requerirse el procesamiento proteolítico post-traduccional con el fin de activar el precursor zymogen al NP proteolíticamente activo. Dichos precursores son análogos a las protrombinas que se producen de forma natural o pueden ser fusiones de una o ambas cadenas de NP con un polipéptido heterólogo de trombina, como en el caso de las secuencias de señal. La activación proteolítica y/o el procesado se llevan a cabo en el propio cultivo de la célula huésped, o pueden ser realizados después de la recuperación del precursor de NP (con o sin intervención de la purificación del precursor de NP). Se utiliza el procesamiento proteolítico post-traduccional (tanto en el cultivo de la célula huésped como después de la recuperación inicial del precursor de NP) para eliminar cualquier secuencia de protrombina (o protrombina-heteróloga) que pueda ser fusionada por el N terminal a los NPs de la cadena A o B, o que sea insertada en cualquier otra parte en un precursor de NP (por ej., terminales de antígeno utilizados para facilitar la purificación). Los precursores de NP son hidrolizados por una enzima o enzimas que sean capaces de hacer las escisiones correctas sin hidrólisis excesiva o indeseable en las cadenas A o B de NP. Una enzima generalmente adecuada para eliminar la pro secuencia y activar la protrombina natural se encuentra en el veneno de Echis carinatus (víbora de apariencia escamosa). El Factor Xa también es útil para activar los precursores de NP. No se requiere activación proteolítica por la cadena B completa de NP o las cadenas A y B individuales completas coexpresadas.

La activación proteolítica del precursor de NP es facilitada por sustitución del dominio de activación de trombina (el sitio de rotura del Factor Xa) con otra secuencia reconocida y escindida por una proteasa diferente o por la propia trombina. Los sitios de activación sustituidos de forma adecuada para uso con los NPs de esta invención están descritos en la patente WO93/13208, página 9, línea 21 - página 10, línea 17. Tal como se señala en la patente WO93/13208, la sustitución del sitio de activación de la trombina en la protrombina con el sitio KEX2 de la levadura es atractivo debido a que la levadura puede expresar el KEX2 y por consiguiente rompe de forma endógena los precursores de trombina en el sitio de activación. Otras secuencias que son sustituidas de forma adecuada para el dominio de activación de la trombina están descritas en la Tabla 1 de la patente EP 319.312 B1. Estas son escindidas por las proteasas asociadas a la membrana de la célula como parte del procesamiento del cultivo de la célula de los NPs o de sus precursores.

La activación proteolítica puede ser acompañada en cualquier punto en la expresión o purificación del NP o de sus precursores, pero se lleva a cabo de forma típica después de la purificación de los precursores del NP a partir de las células y/o el sobrenadante del cultivo celular. Se deberá notar que los NPs que contienen un nuevo sitio dibásico resultante de una inserción o substitución de un residuo R o K en la secuencia de trombina pueden ser susceptibles de hidrólisis por enzimas que de otro modo no romperían la trombina natural, con lo que se reducirían los rendimientos de algún modo durante la expresión o la activación. En este caso, puede ser deseable seleccionar un sistema de expresión y/o una enzima de activación que tenga diferente especificidad por el sustrato de modo que reduzca la escisión adventicia.

Los rendimientos de NP a partir del cultivo de célula huésped recombinante variarán, dependiendo de un número de factores que incluyen las condiciones de cultivo y la naturaleza del NP. De forma optima, el rendimiento de NP por peso a partir del cultivo deberá ser mayor que aproximadamente la mitad (y preferiblemente mayor que el 75%) que la trombina de referencia.

Es posible utilizar de forma diagnóstica el medio condicionado concentrado, activado, conteniendo NP de las células recombinantes sin purificación adicional. Sin embargo, los NPs que se pretende tengan uso terapéutico deben ser aislados o purificados por métodos utilizados hasta ahora para la trombina u otras proteínas, por ej., electroforesis de SDS/natural o reductora, focalización isoeléctrica, electroforesis de gradiente de pH inmobilizado, precipitación de sal, fraccionamiento de disolvente (utilizando etanol por ejemplo) y cromatografía tal como filtración sobre gel, intercambio iónico (de catión o anión), afinidad de ligando (azul de cibacron F3GA o p-aminobenzamidina), inmunoafinidad, focalización cromatográfica, cromatografía de fase reversa o de interacción hidrofóbica. Los métodos adecuados están descritos en Colman y col., "Hemostasis y Thrombosis", p. 148 (1987) y en las referencias citadas en la misma, en la patente WO 93/13208 página 19, línea 33 - página 21, línea 25, y otras fuentes convencionales. La enzima activante (si la hay) puede ser inmovilizada o es eliminada en las subsiguientes etapas de purificación. De forma típica, se aislará el NP de modo que se elimine en las subsiguientes etapas de purificación. De forma típica, el NP será aislado de modo que sea > 95% puro en peso de proteína, y preferiblemente mayor que el 99% puro.

Los NPs o sus fragmentos son también preparados in vitro, especialmente si son relativamente pequeños, por ejemplo del orden de aproximadamente 30 residuos o menos. Sin embargo, los NPs intactos y mayores también son preparados por procedimientos in vitro. Por ejemplo, los NPs más pequeños son preparados por síntesis utilizando procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida tal como ha sido descrito por Merrifield "J. Am. Chem. Soc." 85:2149 (1963). A continuación éstos pueden ser ligados entre sí por el uso de ligasa de péptido (proteolisis reversa). Los métodos in vitro de síntesis de proteína también son utilizados para preparar los NPs sin la necesidad de cultivo de células recombinantes. Dichos métodos son útiles para las preparaciones a pequeña escala, y tienen la ventaja de reducir el posible efecto en los rendimientos de las proteasas de las células huésped. La síntesis de la proteína de NP in vitro tiene una ventaja adicional bastante sustancial ya que permite la introducción en el sitio específico en el NP de un residuo de amino ácido que se presente de forma natural (Benner, y Robertson y col., citados anteriormente). De acuerdo con ello, cuando en la presente invención se utilice el término "residuo de amino ácido" (en conexión con la modificación de trombina por sustitución o inserción, especialmente por un único amino ácido) será bien entendido que el amino ácido no está limitado por los residuos de origen natural asociados con los tRNAs naturales. Tal como ha señalado Robertson y col., el aminoacil tRNA es preparado de forma eficiente utilizando una variedad de residuos de amino ácidos que no se presentan de forma natural ("que no se presentan de forma natural" significa que no se encuentran de forma natural en proteínas, aunque el amino ácido puede encontrarse en los sistemas biológicos de la naturaleza). Debido a que el tRNA es seleccionado para ser incorporado a un codón no reconocido por ninguno e los tRNAs comunes implicados en la síntesis de proteínas, el residuo de amino ácido seleccionado que no se encuentra de forma natural es incorporado sólo en el sitio particular de la secuencia seleccionada de NP para el codón único. De este modo, es estos casos el NP es codificado por un ácido nucleico que tiene un codón sin sentido, por ej., UAG, en el sitio de inserción único deseado o en el sitio de sustitución. Los amino ácidos que no se encuentran de forma natural que son incorporados de forma adecuada son descritos por ejemplo en Greenstein y col., "Chemistry of the Amino Acids" Vols. 1-3, 1986. En general, se utilizarán los L-amino ácidos farmacológicamente inocuos que se encuentran en la naturaleza pero que ordinariamente no se incorporan en las proteínas. Dichos amino ácidos de forma típica estarán estructuralmente relacionados con un residuo que se presenta de forma natural que produce el efecto deseado a un sitio dado y que se utilizará para resolver de forma adicional y optimizar la propiedad deseada del NP.

Los NPs de esta invención también incluyen trombinas que han sido sustituidas por una mitad no peptídica, tanto para objetivos de preparación del NP para empezar con, o como una subsiguiente modificación, del NP preparado por sustitución, inserción o eliminación del amino ácido tal como se ha descrito en otra parte del presente documento. Los NPs per se son preparados por modificación covalente de la trombina o sus cadenas de componentes o subfragmentos. Debido a que se han determinado un número de los residuos clave implicados en la función procoagulante y anticoagulante de la trombina se encuentra dentro del alcance de esta invención el introducir una modificación covalente en dichos sitios que cumpla esencialmente el mismo objetivo que el correspondiente mutante dirigido al sitio con un residuo que se encuentre de forma natural. Por ejemplo, las cadenas laterales conteniendo carboxilo tales como el E229 son derivatizadas por reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R', en donde R y R' son grupos alquilo diferentes), o son amidadas por reacción con amoníaco o aminas sustituidas.

Las cadenas laterales básicas tales como las del R233 y K52 también son derivatizadas. Por ejemplo, los R233D y E son PCAs muy buenos en los que se ha sustituido una cadena lateral cargada positivamente con un cadena lateral cargada negativamente. Se consiguen cargas similares reversas por sustitución de una trombina R233 o K52 con ácido cloroacético. Los residuos de lisina son acetilados con anhídrido acético.

El triptófano es un amino ácido relativamente raro en la trombina. De acuerdo con ello, el W50 es un sitio atractivo para la modificación covalente post-traduccional debido a que es esperable que la sustitución en otros sitios sea menor que lo que pueda ser el caso con residuos más comunes. La reacción del W50 con un oxidante tal como un dador de halógeno, por ej., bromo, rendirá la estructura de la cadena secundaria

9

Esta reacción debe ser llevada a cabo en un disolvente acuoso y a concentraciones de halógeno menores.

Otras modificaciones covalentes de los NPs, o de la trombina para obtener los NPs de esta invención, será aparente para el experto en la materia. Las cadenas secundarias cuando la reacción es indeseada son protegidas por enmascaramiento de las mismas con anticuerpos dirigidos contra un epitope que incluye el residuo a proteger. Los reactivos para conseguir dichas modificaciones son bien conocidos y han sido ampliamente utilizados en los campos diagnóstico y preparativo. Ver T. Creighton, Proteins: Structure y Molecular Properties, 1983.

Las modificaciones covalentes también son útiles para conseguir objetivos diferentes de la preparación de los NPs que tienen una especificidad del sustrato segregado. Por ejemplo, los NPs se vuelven insolubles por reticulación de los mismos a una matriz insoluble en agua. Esto se consigue por reacción del NP y la matriz con un agente bifuncional que forma el reticulamiento covalente. Ejemplos de agentes adecuados son el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'- ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes de derivatización tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato rinden intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de la luz. De forma alternativa, el NP es inmovilizado en matrices insolubles en agua reactivas tales como los carbohidratos de cianógeno activados con bromo y los sustratos reactivos descritos en las patentes U.S. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440.

Los NPs también son modificados de forma covalente por unión del NP a varios polímeros no proteínaceos, por ej., polietilen glicol, polipropilen glicol o polioxialquilenos, de la forma establecida por ejemplo en las patentes U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

La vida media del NP circulante in vivo es alargada por conjugación del NP a un polímero que confiere una vida media extendida, tal como el polietilen glicol (PEG). El PEG es un polímero no inmunogénico, lineal, no cargado con tres moléculas de agua por unidad de óxido de etileno (Maxfield, y col., "Polymer" 16:505-509 (1975); Bailey, F. E. y col., in "Nonionic Surfactants", Schick, M. J., ed, pp. 794-821 (1967)). Se han conjugado varias enzimas terapéuticas al PEG para incrementar su vida media in vivo (Abuchowski, A. y col., "J. Biol. Chem." 252:3582-3586 (1977); Abuchowski, A. y col., "Cancer Biochem. Biophys." 7:175-186 (1984). Se ha descrito un conjugado de PEG-IL-2 (interleuquina-2) para incrementar la vida y la potencia circulatoria (Katre, N.V. y col., "Proc. Natl. Acad. Sci." 84:1487-1491 (1987); Goodson, R. y col., "Bio/Technology" 8:343- 346 (1990)). Ver también Abuchowski, A. y col., "J. Biol. Chem." 252:3578-3581 (1977). Cualquiera de los métodos de conjugación del PEG utilizado en estas referencias es aceptable para uso con los NPs de esta invención.

Finalmente, los NPs son modificados de forma covalente para uso en aplicaciones diagnósticas por reticulación de los mismos a grupos detectables utilizados hasta ahora en ensayos de diagnóstico tal como se describirá más completamente a continuación.

Usos para los NPs de esta Invención

Los NPs de esta invención son útiles en métodos terapéuticos, de diagnosis y preparatorios. Su uso dependerá de las propiedades que posean, tal como será aparente para un experto en la materia. Para la mayor parte, todos los NPs retendrán los epitopes inmunes de la trombina, de modo que sean útiles en lugar de la trombina en inmunoensayos para trombina, tanto si se encuentran como si no dentro de la definición de la PCA o del FCP utilizados en la presente invención o si no poseen ninguna actividad proteolítica. Además, los PCAs y los FCPs tienen usos terapéuticos especializados.

Los NPs anticoagulantes, en particular los PCAs, son útiles para mejorar o prevenir la coagulación indeseada. Son efectivos en activar el proceso de la proteína C endógena, sirviendo como un potente anticoagulante por generación de aPC endógena para inactivar el FVa y FVIIIa, e intensificar la fibrinolisis mediada por el tPA por inactivación del PAI-1. Las indicaciones clínicas para dichos NPs, y particularmente los PCAs, incluyen las enfermedades trombóticas o los estados tales como el shock séptico, la terapia adjuntiva en la trombolisis coronaria y la anginoplastia, el embolismo pulmonar, los ataques isquémicos transitorios y las apoplejías, la angina inestable, M.I., la trombosis venosa profunda y una variedad de trombosis arteriales y venosas. En un método para tratar el shock séptico se administra el NP anticoagulante a los pacientes en sepsis avanzada (gram negativo, gram positivo o fúngico), por ej., quienes muestran síntomas de fiebre alta, hipotensión, coagulación intravascular diseminada, insuficiencia renal y/o ARDS. Los NPs anticoagulantes especialmente los PCAs son útiles para cualquiera de las utilidades hasta ahora propuestas para el aPC. En este respecto, ver la patente EP 191 606 B1, página 13, línea 52, página 15, línea 32. De este modo, para aplicaciones terapéuticas, los NPs anticoagulantes y especialmente los PCAs son administrados a un mamífero, preferiblemente un humano, en una forma de dosis farmacéuticamente aceptable y en una dosis terapéuticamente efectiva. El NP anticoagulante es administrado de forma intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, o por vías intramuscular, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, tópica o de inhalación. Los NPs anticoagulantes también son administrados de forma adecuada por catéter para ejercer la anticoagulación local de forma primaria.

Los NPs anticoagulantes son útiles en la diagnosis de los trastornos de coagulación. Una parte sustancial de los estados de hipercoagulación encontrados en pacientes no puede ser adscrita a un defecto molecular particular. Muchos pacientes propensos a ataques de trombosis pueden sufrir de un error congénito en un componente del proceso de activación de la proteína C, pero actualmente es difícil diagnosticar dichos pacientes. Especialmente los PCA son útiles para proporcionar un diagnosis de un proceso de proteína C activado de forma defectuosa y el componente del proceso que es deficiente. En esta realización el sujeto no precisa estar en una necesidad inmediata de terapia anticoagulante pero puede ser conocido el haber estado sujeto a trombosis excesiva de origen desconocido. El NP anticoagulante tal como el PCA es administrado al paciente y el estado anticoagulante de la sangre del paciente es determinado después de que el PCA haya tenido tiempo de actuar. La dosis de PCA es sustancialmente la misma que la cantidad de PCA efectivo en pacientes normales en inducir anticoagulación detectable. El estado de anticoagulación del sujeto es medido a los sustancialmente mismos puntos de tiempo que aquellos en que la anticoagulación detectable es inducida en pacientes normales. Cualquier ensayo para la coagulación de la sangre es adecuado, por ej., aPTT y similares. Si el PCA no tiene éxito en una anticoagulación detectable de la sangre del paciente es probable que el paciente sufra de un defecto en el proceso de anticoagulación de la trombomodulina-proteína C. En un alcance adicional, la administración de TM soluble junto con PCA y la determinación de si cualquier proteína resuelve el defecto rendirá información sobre la localización de la deficiencia, es decir, si el TM y el NP inducen anticoagulación, pero la proteína C y el NP no lo hacen, uno puede concluir que el TM del sujeto es responsable del defecto.

Los NPs procoagulantes son terapéuticamente útiles como procoagulantes para cualquier objetivo. Por ejemplo, están impregnados en vendas, vendajes y similares, o de otro modo incluidos en formas de dosificación dirigidas a la administración tópica. El FCP también es efectivo como acelerante de la trombosis en el tratamiento trombótico de grandes tumores sólidos. El FCP es utilizado en lugar de la proteína de unión C4b, o los anticuerpos anti-aPC tal como se ha descrito en la patente U.S. 5.147.638, de forma óptima en combinación con un citoquina tal como la
TNF-\alpha o TNF-\beta, gamma interferón, IL-1, IL-2 y/o GM-CSF. La dosis de FCP será valorada para inducir la coagulación en tumores, pero para no producir coagulación significativa en ningún otro sitio. Las preformas de los NPs que son dependientes de la activación endógena también pueden ser utilizados en este método.

Las formas de dosis de los NPs de esta invención son aquellas que se utilizan de forma convencional con otros productos terapéuticos de tipo proteína. Los NPs serán estériles, de forma típica estarán dispuestos en envases adecuados para el acceso estéril (viales, por ejemplo, cerrados con tapones elastoméricos), e incluirán soportes farmacéuticamente aceptables que no sean tóxicos, incluyendo sales y solvatos. Ejemplos de dichos soportes incluyen intercambiadores iónicos, alumina, estearato de alúmina, lecitina, proteínas de suero tales como albúmina de suero humano, tampones tales como fosfatos, glicina, arginina, lisina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales de metales alcalinos, o electrolitos tales como sulfato de protamina, bifosfato disódico, bifosfato potásico, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, sustancias con una base de celulosa, y polietilen glicol. Los soportes para la formas tópicas o con una base de gel de los NPs incluyen polisacáridos tales como carboximetilcelulosa sódica o metilcelulosa, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno, polietilen glicol, y alcoholes de cera de madera. Pueden ser utilizadas las formas depot convencionales e incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nano-cápsulas, liposomas, plastificantes, formas de inhalación, pulverizadores nasales, y tabletas sublinguales. El NP será formulado de forma típica en dichos vehículos a una concentración de aproximadamente entre 1-150 micromolar o de entre 1-200 mg/mL. Será deseable incluir un antioxidante tal como ascorbato, particularmente si, tal como generalmente sucede, que el NP incluye un enlace disulfuro que une las cadenas A y B o un enlace disulfuro dentro de la cadena B. El pH de la formulación debe ser seleccionado para minimizar la desaminación y la autolisis, y generalmente estará entre aproximadamente 5 y 8. Las formulaciones serán preferiblemente liofilizadas, pero pueden ser preparadas y almacenadas como soluciones acuosas.

La dosis apropiada de NP anticoagulante para la prevención o tratamiento de trombosis dependerá de la cantidad de actividad procoagulante residual (si la hay), la localización y la naturaleza de la trombosis o de la trombosis esperada a tratar, la severidad y el curso del trastorno de coagulación, si el NP anticoagulante es administrado para la profilaxis o terapia, la naturaleza y el curso del tratamiento previo, la vida media del NP en la circulación, el uso de otros agentes terapéuticos o anticoagulantes, la localización de la administración del NP (dosis locales serán menores que dosis sistémicas), la respuesta del paciente al NP, si el NP requiere activación por el proceso de activación de la protrombina endógena (es decir, si el NP de la trombina es suministrado como la correspondiente protrombina o un fragmento inactivado del mismo) y otras consideraciones dentro de la discreción del médico que atiende al paciente. Ya que la PCA es una enzima activa, la cantidad requerida para el efecto anti-trómbico es bastante pequeña, en el intervalo de 5-10 nM (concentración final en plasma), y de hecho nuestros estudios en conejos muestran que el K52A PCA produce anticoagulación terapéutica a niveles de plasma que oscilan entre aproximadamente 3-9 nM, con resultados similares para el E229A PCA. Esto compara bastante favorablemente con otras macromoléculas anticoagulantes tales como hirudina (100-800 nM) o GS-522, un aptámero del DNA que se une a la trombina (2000-4000 nM; patente PCT US 92/01367). Nuestros estudios preliminares en mono sugieren que la dosis de PCA en primates oscilará aproximadamente entre 0,05 U/kg/min y 20 U/kg/min, dependiendo principalmente de la cantidad de actividad de rotura del fibrinógeno residual (que militará a favor de dosis menores para prevenir el consumo de fibrinógeno y la activación de las plaquetas) y la potencia de la actividad del aPC (el PCA que retiene una proporción sustancial de actividad de aPC de tipo silvestre será utilizado en el intervalo de dosis menores). 1 U es igual a la cantidad de actividad amidolítica del S-2238 en 1 unidad de NIH (actividad de coagulación) de trombina de tipo silvestre (Ejemplo 4).

No se espera que los NPs de esta invención sean inmunogénicos ya que en las realizaciones preferidas sólo se modificaron unos pocos residuos críticos (menos de aproximadamente 5), o son enmascarados con glicosilación. Este es particularmente el caso con sustituciones únicas (por ej. E229D) que son altamente conservadores. La vida media de ciertos NPs puede ser muy corta, requiriendo de ellos que sean utilizados como una infusión continua (la vida media del plasma de la trombina de tipo silvestre in vivo es probablemente extremadamente corta, en el intervalo de segundos). Sin embargo, esto puede ser clínicamente ventajoso en algunas circunstancias ya que prescindiría de la necesidad de que un inhibidor de trombina hubiera desarrollado un episodio de sangría en el paciente. Los PCAs tienen un efecto anticoagulante en primates sub-humanos y otros animales de aproximadamente entre 90 y 180 minutos después de la administración de dosis adecuadas, de modo que es factible el administrar PCAs por una inyección única o un breve infusión (por ej., 10 minutos). Sin embargo, la administración por infusión continua se encuentra también desnutro del alcance de esta invención.

Los NPs procoagulantes o anticoagulantes adecuados son administrados al paciente a un tiempo o durante una serie de tratamientos. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo del estado, el tratamiento es continuado hasta que se consiga el deseado efecto anticoagulante o procoagulante.

De acuerdo con otra realización de la invención, se mejora la efectividad de los compuestos de esta invención como procoagulantes o anticoagulantes por administración de los compuestos de forma seriada o simultáneamente con otro agente o procedimiento médico que sea efectivo para los objetivos relevantes. El PCA es útil conjuntamente con anticoagulantes conocidos tales como la heparina, los inhibidores del factor X, inhibidores de la agregación plaquetaria, y similares. También es útil conjuntamente con las terapias trombolíticas utilizando por ejemplo tPA, uroquinasa o estreptoquinasa, o con angioplastia de globo u otros procedimientos que ocasionen la rotura de los coágulos, el tratamiento de placas arterioescleróticas o la manipulación de o el contacto con el endotelismo vascular.

Los NPs de esta invención son útiles en la identificación de sustancias que se unen a sitios objetivos en la trombina (parejas de unión a la trombina, o "TBP". Son de particular interés las sustancias que se unen al dominio de activación del PC de la trombina pero no al dominio procoagulante, o vice-versa. En las realizaciones preferidas son capaces de unirse a la trombina e inhibir de forma sustancial la actividad procoagulante de la trombina sin inhibir de forma comparativa su función de activación del PC. Esto no significa que el TBP necesite dejar la función de activación del PC de la trombina enteramente no inhibida. Todo lo que es necesario en este caso es que el grado de inhibición de la activación del PC sea menor que el de la función procoagulante. De forma típica, el TBP inhibirá la actividad proteolítica de la trombina objetivo de modo que la relación de la activación del PC respecto a la actividad procoagulante sea menor que aproximadamente 0,5 o mayor que aproximadamente 2,0. Los TBPs son en general polímeros de una de las dos clases: polipéptidos y oligonucleótidos, pero son esencialmente ilimitados y pueden incluir cualquier sustancia, incluyendo moléculas de menos de un peso molecular de aproximadamente 1500. Los TBPs son utilizados en procedimientos diagnósticos, para marcar la trombina de forma indirecta o para separar la trombina de otras sustancias presentes en las muestras de ensayo. La facilidad de los TBP's para unirse a la trombina también es útil en métodos para la recuperación de la trombina a partir de mezclas contaminadas tales como los sobrenadantes de cultivos celulares de células que expresan la trombina recombinante (incluyendo los NPs de la secuencia de aminoácidos de la trombina de la presente invención). De forma típica, los NPs pueden ser utilizados en al menos un epitope de trombina reconocido por el anticuerpo utilizado en el inmunoensayo de trombina en cuestión, mientras que los TBPs son utilizados en lugar de los anticuerpos de la trombina. Los NPs también son útiles, en el caso en que sean apropiados, en los ensayos funcionales para ciertas propiedades individuales de la trombina, por ejemplo su actividad procoagulante siempre que el NP retenga la actividad procoagulante.

Los polipéptidos TBPs son, de forma típica, péptidos o proteínas que son capaces de unirse de forma específica a FCP pero que no son capaces de unirse de forma sustancial al PCA y vice-versa. De este modo, son inhibidores altamente específicos tanto de la función procoagulante como de la aPC de la trombina.

Los péptidos TBPs son obtenidos por el uso de métodos dirigidos in vitro de forma evolucionaria tales como los que utilizan fagos filamentosos para presentar secuencias de candidatos (conocidos de otro modo como muestra de fagos) y métodos similares conocidos per se que se basan en la generación sistemática y la selección de péptidos para la actividad. De forma típica se trata de moléculas bastante pequeñas, conteniendo del orden de 5 a 20 residuos. Los polipéptidos FCP y PCA de esta invención son útiles en la selección para cada péptido TBPs de la misma forma general en que son seleccionados para los oligonucleótidos TBPs.

Los anticuerpos TBPs son inmunoglobulinas, normalmente anticuerpos monoclonales, que son capaces de inhibir de forma específica la función procoagulante o aPC de la trombina. Los anticuerpos están aumentados frente a la composición de proteína que comprende una trombina de secuencia de referencia. Con el fin de obtener un anticuerpo anticoagulante la reserva de anticuerpos es adsorbida en un PCA, con lo que se recuperan los anticuerpos que no se han unido de forma sustancial (pero que demuestran inhibición de la coagulación). Estos anticuerpos se dirigirán necesariamente a los epitopes de rotura del fibrinógeno. Se utiliza una estrategia análoga para preparar un anticuerpo procoagulante.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son esencialmente idénticos en especificidad y afinidad. Los anticuerpos monoclonales incluyen híbridos y anticuerpos recombinantes (por ej., anticuerpos "humanizados") sea cual sea la especie de origen o la designación de la clase o la subclase de inmunoglobulina, así como los fragmentos de anticuerpos (por ej., Fab, F(ab')_{2}, y Fv). De este modo, los anticuerpos "monoclonales" son producidos por cualquier método particular que conduzca a una población sustancialmente homogénea. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados utilizando los métodos descritos por Kohler & Milstein, "Nature" 256:495 (1975), Coding, Monoclonal Antibodies: Principles y Practice págs. 59-103 (1986), Kozbor, "J. Immunol." 133:3001 (1984), o Brodeur, y col., MonoclonalAntibody Production Techniques y Applications, págs. 51-63 (1987), o pueden ser preparados por métodos de DNA recombinante. Cabilly, y col., patente U.S. No. 4.816.567.

En una realización preferida de la invención, el anticuerpo monoclonal tendrá una afinidad por la trombina de la secuencia de referencia de al menos aproximadamente 10^{9} moles/litro, tal como se ha determinado, por ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munson & Pollard, "Anal. Biochem." 107:220 (1980). También, el anticuerpo monoclonal inhibirá de forma típica la actividad procoagulante o anticoagulante de la trombina al menos aproximadamente un 50%, preferiblemente más de un 80%, y más preferiblemente más de un 90%, tal como se ha determinado, por ejemplo, por el ensayo de activación del PC o las determinaciones del tiempo de la trombina descritos en la presente invención.

El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y secuenciado utilizando los procedimientos convencionales (por ej., mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse de forma específica a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de murino). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA puede ser introducido en los vectores de expresión, que entonces son transfectados en células huésped tales como células COS de simian, células de ovario de hámster chino/CHO), o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes.

El DNA puede ser opcionalmente modificado con el fin de cambiar el carácter de la inmunoglobulina producida por su expresión. Por ejemplo, las formas humanizadas de anticuerpos de murino son producidas por sustitución de una región determinante de complementariedad (CDR) del dominio variable del anticuerpo de murino para la correspondiente región de un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, la región de la estructura (FR) de los residuos amino ácidos de los anticuerpos de murino son también sustituidos por los correspondientes residuos de amino ácidos en el anticuerpo humano. Las formas humanizadas de anticuerpos de murino también pueden ser producidas por sustitución de la secuencia de codificación para los dominios de la cadena constante pesada y ligera en lugar de las secuencias de murino homólogas. Morrison, y col., "PNAS" 81:6851 (1984).

Son bien conocidos los métodos de selección evolucionados para los oligonucleótidos que se unen a las proteínas objetivo (patente WO 92/14843; Ellington y col., "Nature" 355:850 (1992); Bock y col., "Nature" 355:564 (1992); Ellington y col., "Nature" 346:818 (1990); Tuerk y col., "Science" 249:505 (1990). Estos oligonucleótidos, comúnmente conocidos como aptámeros, contienen de forma general las bases usuales A, T, G, C o U o los derivadas de las mismas, y comprenden secuencias que unen a un sitio predeterminado en una proteína objetivo. En este caso, el FCP y el PCA son utilizados en los protocolos de selección negativo (ausencia de unión) y positivo (unión) para rendir los TBPs tales como aptámeros que son específicos para la inhibición tanto de coagulación como de la actividad de aPC. Un método de selección para los TBPs que inhiben la función procoagulante de la trombina (pero no interfiere de forma sustancial con su actividad anticoagulante) comprende (a) preparación de un grupo de parejas de unión de candidato (tal como anteriormente), (b) contactar los candidatos con la trombina que tiene actividad procoagulante (típicamente trombina de la secuencia de referencia), (c) aislamiento a partir de la trombina de aquellos candidatos que son capaces de unir a la trombina, (d) contactar los candidatos a partir de la etapa c) con un NP de trombina en el que la función de activación del PC ha sido mutado de forma sustancial fuera del NP, es decir, un FCP, y (e) recuperación de aquellos candidatos que se unen al FCP. De este modo el grupo de candidatos resultante ha sido enriquecido de forma específica en candidatos, o se ha seleccionado un candidato, que no se une a la trombina en los residuos mutados en el sitio de activación del PC. A continuación este grupo de candidatos es seleccionado de acuerdo con la actividad anticoagulante, por ej., por selección adicional para los TBPs que no se unen al PCA. Al final, esto enriquecerá el grupo o seleccionará el candidato TBPs que no une el sitio de activación del PC pero que se une a los residuos de trombina procoagulantes. Las etapas c) y d) son opcionalmente revertidas en cada alternativa.

Los TBPs que inhiben la función de activación de la proteína C de la trombina son seleccionados por un procedimiento análogo al enriquecimiento de los TBPs que tienen la capacidad de inhibir la función procoagulante tal como se ha descrito anteriormente, por ej., los TBPs son seleccionados de modo que se unan a la trombina pero que no se unan al FCP.

Las etapas de unión son conseguidas en la mayoría de los casos utilizando NP inmovilizado, de forma típica NP que ha sido absorbido a través de sus sustituyentes glicosilo o sus terminales N- o C- a un soporte insoluble de acuerdo con métodos conocidos (por ej., inmovilización de la azarosa de concanavalina A seguida por elusión con alfa-metil manósido; Bock y col., op cit).

Cuando los candidatos son mitades replicables, por ej., fagos u oligonucleótidos de aspecto filamentoso, se pueden interponer opcionalmente una o más etapas de amplificación del grupo de candidatos seleccionado o aislado entre las etapas c) y d). De forma ordinaria, los candidatos no son amplificados entre estas etapas. Además, es deseable repetir etapas a)-e) y, en la mayoría de los casos, interponer una etapa de amplificación entre las etapas e) y a). La amplificación (normalmente conseguida por PCR en el caso de los candidatos oligonucleótidos), es útil en el enriquecimiento de los grupos capaces de demostrar la función para los que han sido seleccionados.

El FCP y el PCA son particularmente útiles como intermedios en la preparación de los TBPs.

Para aplicaciones de diagnóstico, los TBPs o los NPs de esta invención son opcionalmente marcados con una mitad detectable. La mitad detectable puede ser cualquier sustituyente que sea capaz de producir, tanto directa como indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la mitad detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina; un marcador isotópico radioactivo, tal como, ^{125}I, ^{32}P, ^{14}C, o ^{3}H, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.

Puede utilizarse cualquier método conocido en el estado de la técnica para conjugar el TBP o el NP a la mitad detectable. Ver los métodos descritos supra y Hunter, y col., "Nature" 144:945 (1962); David, y col., "Biochemistry" 13:1014 (1974); Pain, y col., "J. Immunol. Meth." 40:219 (1981); y Nygren, J. "Histochem. and Cytochem." 30:407 (1982). Los TBPs de los oligonucleótidos son marcados en la forma convencional utilizada hasta ahora en el estado de la técnica de la investigación diagnóstica.

Los NPs marcados son utilizados en la detección por ejemplo de proteínas que se unen a la trombina, por ej. anticuerpos. Además, los NPs no marcados están unidos a anticuerpos anti-analitos (tanto de forma covalente como por inmunoadsorción) o a receptores de unión a analitos y son utilizados en sí mismos como marcadores por virtud de su capacidad para romper los péptidos marcados que son fácilmente detectados por métodos de fluorescencia o colorimétricos. Los receptores típicos a los que se unen los NPs no marcados incluyen macromoléculas de la superficie de las células, por ej., LFA-1, VLA-4, mac-1, I-CAM1, I-CAM2, I-CAM3 o V-CAM1. Los anticuerpos típicos a los que están unidos los NPs no marcados incluyen anticuerpos dirigidos contra las proteínas que participan en la cascada de coagulación de la sangre así como los antígenos de las células epiteliales, los antígenos de tumores u otras macromoléculas de la superficie de las células. Son bien conocidos métodos adecuados para la conjugación de proteínas o para el marcaje de proteínas y son convenientemente aplicados a la conjugación o marcaje de los NPs. Por ejemplo, la cadena B del NP está fusionada a su N-terminal o hasta el C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina o al C-terminal del dominio extracelular de un receptor de la superficie de la célula.

Los TBPs o NPs de la presente invención son utilizados de forma opcional en técnicas de inmunoensayo conocidas, tales como los ensayos de unión competitivos, los ensayos sándwich directos e indirectos, y los ensayos de inmunosupresión. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp,147-158 (1987).

Los ensayos de unión competitivos se basan en la capacidad de un estándar marcado (que puede ser trombina, o una parte reactiva de la misma tal como un NP marcado de esta invención) para competir con la trombina de la muestra de ensayo para unirse con una cantidad limitada de TBP. La cantidad de trombina en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad del estándar que se une al TBP. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, el TBP se insolubiliza de forma general antes o después de la competición, de modo que el estándar y el analito que se unen al TBP de forma conveniente son separados del estándar y del analito que permanecen sin unir.

Los ensayos sándwich implican el uso de dos TBPs, cada uno de ellos capaz de unirse a una parte objetivo diferente, o epitope, de la trombina. En un ensayo sándwich, el analito de la muestra de ensayo es unida por un primer TBP que es inmovilizado en un soporte sólido, y a continuación un segundo TBP se une al analito, formando así un complejo insoluble de tres partes. David & Greene, patente U.S. No. 4.376.110. El segundo anticuerpo puede ser en sí mismo marcado con una mitad detectable (ensayos de sándwich directo) o puede ser medido utilizando un anticuerpo anti-TBP que es marcado con una mitad detectable (ensayo de sándwich directo). Por ejemplo, un tipo de ensayo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso la mitad detectable es una enzima.

Los TBPs y NPs de esta invención también son útiles para técnicas de determinación por la imagen, en donde se administra a un huésped un TBP o un NP marcado con una mitad detectable, preferiblemente en el flujo sanguíneo, y se ensaya la presencia y la localización del TBP o del NP marcado en el huésped.

El material de ejemplificación que se muestra a continuación se ofrece solo por vía de la ilustración y no pretende limitar la invención de ninguna manera. Todas las patentes y las referencias de la literatura citadas en la presente invención son expresamente incorporadas por referencia.

Ejemplo 1 1.1 Construcción de Vectores de Expresión para la Producción de Protrombina Humana Recombinante

Se aislaron los pares de bases 1869 enteros de la secuencia que codifica la protrombina humana más los 12 pares de bases de la secuencia 5' no traducida y las 97 bases de la secuencia 3' no traducida en un fragmento de SmaI a XbaI a partir de un clon de cDNA de protrombina humana, BS(KS)-hFII (obtenida de Ross T. A. MacGillivray, Dept of Biochemistry, Univ of British Columbia, Vancouver, Canada). Este fragmento se clonó en el vector de expresión eucariótico, pRc/CMV (Invitrogen Corp, San Diego, CA). Se digirió el pRc/CMV con Hind III y las terminaciones ranuradas en 3' fueron truncados por relleno con el fragmento Klenow de la polimerasa I del DNA de E. coli. El vector fue además digerido con XbaI y ligado con el SmaI al fragmento XbaI conteniendo la secuencia de codificación de la protrombina. La construcción resultante, pRc/CMV-hPT, contiene la secuencia de codificación de la protrombina flanqueada por las secuencias requeridas para la transcripción de nivel elevado en las células de mamíferos: el promotor a partir del gen más inmediato del citomegalovirus humano y las secuencias de terminación de la transcripción y las señales de poliadenilación a partir del gen de la hormona del crecimiento bovina. Este clon también contiene el gen \beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina y el origen de ColE1 de replicación del bacteriofago filamentoso, f1 para la producción del DNA de hebra única en E. coli infectada con el fago de ayuda defectivo, M13KO7 (Vieira y Messing, 1987). Este vector puede ser utilizado para la expresión de la protrombina humana en células de mamíferos transfectadas, aunque la presencia del gen de la fosfotransferasa de neomicina significa que pueden seleccionarse líneas celulares permanentemente transfectadas para la expresión a gran escala por resistencia al antibiótico, G418.

1.2 Estrategia de Mutagénesis para Identificar Residuos Funcionales en la Superficie de la Trombina

Nuestra estrategia de mutagénesis fue diseñada para escasear sistemáticamente la superficie de la \alpha-trombina humana para identificar residuos importantes para la coagulación del fibrinógeno, la activación de la proteína C dependiente de la trombomodulina y la inhibición de la coagulación de heparina/antitrombina III y el aptámero de trombina. Se diseñó la estrategia para maximizar las oportunidades de identificar residuos funcionales mientras se minimizan las oportunidades para la interrupción no específica de la conformación de la proteína. Fueron de especial interés para la mutación los amino ácidos polares y cargados (R, K, D, E, H, S, T, Q, N, Y, W) ya que dichos residuos son capaces de participar en los enlaces de hidrógeno y en las interacciones electrostáticas que probablemente son importantes para la unión de los ligandos cargados. En segundo lugar, solo los residuos cargados y polares que son altamente expuestos al disolvente en la superficie de la \alpha-trombina fueron seleccionados para la mutación. Se establecieron como objetivos los residuos de superficie accesible al disolvente ya que estos residuos son asequibles para las interacciones con ligandos y son más tolerantes de la variación de secuencia (Bowie y col., 1990). Se determinó la accesibilidad fraccional (Rose y col., 1985) a una sonda de disolvente de radio 1,4 \ring{A} para cada residuo en la trombina en la estructura del cristal de 2,3 \ring{A} de \alpha-trombina humana complejada con el inhibidor hirudina (Rydel y col., 1990) y se seleccionaron para la mutación los 70 residuos polares y cargados con una accesibilidad fraccional de >35%. Sólo un único residuo, el R36a, se excluyó de esta lista. El R36a está localizado en la unión entre las cadenas A y B de la \alpha-trombina y es requerido para el procesamiento de la protrombina hasta la madurez, cadena dos, de la \alpha-trombina. Sin embargo, se añadieron varios residuos a la lista, incluyendo cinco residuos (R20, K65, H66, R68, K77) localizados en el exo-sitio de unión presumible al fibrinógeno y dos residuos (R98, W249) en el sitio putativo de unión a la heparina. De este modo, se sustituyeron un total de 76 residuos con alanina por mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. Se utilizó la alanina para todas las sustituciones debido a que la alanina es compatible tanto con las estructuras secundarias \alpha- como \beta- (Klapper, 1977), toleradas tanto en las localizaciones expuestas como en las enterradas en las proteínas (Klapper, 1977; Rose y col., 1985) y la no polaridad y el tamaño pequeño de su cadena lateral asegura que la sustitución con alanina es menos probable que rompa la conformación de proteína. Se hicieron múltiples sustituciones de forma simultánea cuando dos o tres residuos objetivo se agruparon juntos. En los casos en que dichos múltiples mutantes mostraron un fenotipo funcional, entonces los residuos individuales fueron subsecuentemente sustituidos de forma individual. La lista completa de mutantes de sustitución de la alanina se incluyó en la tabla 1. El sistema de numeración para los residuos en \alpha-trombina humana en la utilizada previamente (Wu y col., 1991), cuando los residuos en la cadena B se numeraron de forma consecutiva (1-259). Los residuos en la cadena A también se numeraron de forma consecutiva (1a-36a) pero se indexaron con un capa inferior "a" para indicar identidad con la cadena A.

1.3 Construcción de Sustituciones de Alanina en Protrombina Humana por Mutagénesis dirigida por Oligonucleótidos

Se introdujeron sustituciones de alanina en los genes de la protrombina humana por mutagénesis dirigida por oligonucleótidos en un modelo de DNA de hebra única (Zoller y Smith, 1982). Se generó un modelo de DNA de hebra única conteniendo uracilo en una cepa de E. Coli dut-ung- (CJ236) (Kunkel y col., 1987) permitiendo la selección frente a la hebra modelo no mutante en cepas ung+ de E. coli después de la extensión y la unión del prímero oligonucleótido mutagénico. Se sintetizaron los primeros de oligonucleótidos sintéticos que codifican las sustituciones de alanina flanqueadas por regiones de 12 nucleótidos complementarios a la hebra de codificación de la protrombina en un sintetizador en fase sólida de Applied Biosystems Inc. Utilizando la química de fosfoamidita. Se hibridaron los prímeros fosforilados con el modelo pRc/CMV-hPT, extendido por la polimerasa de DNA T7 y se ligaron a la hebra nuevamente sintetizada por la ligasa de DNA T4. Se utilizó el DNA heteroduplex para transformar la cepa de E. coli dut^{+}ung^{+}, el azul de XL1, para seleccionar frente la hebra parenteral conteniendo uracilo. Se secuenció el DNA de única hebra a partir de los transformantes individuales utilizando la terminación de la cadena dideoxy y la Sequenase 2,0 (United States Biochemical) para confirmar la identidad de cada mutación. Se utilizaron 500 ml de cultivos de cada mutante pRc/CMV-hPT en azul de XL1 para producir el DNA del plásmido por transfección de las células COS-7 cultivadas. Se aisló aproximadamente 1 mg de DNA del plásmido circular cerrado utilizando el kit de preparación de plásmido QIAGEN Maxi. Se prepara el DNA que codifica los otros NPs descritos en la presente invención del mismo modo utilizando un modelo apropiado.

Ejemplo 2 2,1 Expresión y Activación de las Protrombinas Recombinantes para los Ensayos de Expresión Transitorio

Se introdujeron de forma separada construcciones de protrombina recombinantes (10-20 \mug) conteniendo el cDNA de la protrombina no modificada (para la trombina de tipo silvestre), la trombina mutada a S205A (para un control negativo), y los diferentes mutantes, en 10^{6} células COS-7 crecidas en un pocillo de 35 mm, por el método de transfección DEAE-dextrano (Adams y Rose, 1985). Dos días después de la transfección, se lavó la monocapa de células dos veces con PBS y se añadió 1 ml de suero libre del medio de DMET sobre la monocapa y se incubó a 37ºC durante 24 h (de forma ocasional fue ventajoso el cultivar a temperaturas por debajo de aproximadamente 30ºC, en particular 27ºC, cuando no se detectó expresión o era pobre a 37ºC, es decir, Mt 11, 12, 13, 34, 35, 14,5 y 37c). A continuación se separó el medio acondicionado, se centrifugó para eliminar cualquier célula de restos y se concentró 20 veces por ultrafiltración con Centricon-30. Se activaron 50 \mul de este concentrado con 1,5 \mug de veneno de Echis carinatus a 37ºC durante 45 min. Se analizaron 25 \mul del medio acondicionado concentrado antes y después de la activación del veneno por la técnica de manchas Western utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra la trombina humana. El nivel de expresión de las trombinas varía entre 0,12 y 2,0 \mug de trombina por 10^{6} células, tal como se estimó tanto por el análisis Western como por el ensayo amidolítico.

2.1a Cuantificación de Protrombinas Recombinantes en un Medio de Cultivo de Células Acondicionadas por Manchas de Segmentos

Se determinó la concentración de proteína en la trombina por análisis cuantitativo de las manchas Western utilizando un aparato de manchas de fragmentos a vacío Schleicher y Schuell Minifold II. Se activó la protrombina en un medio acondicionado concentrado 20 veces y estándares de protrombina purificada (American Diagnostica) tal como se ha descrito anteriormente. Se diluyeron las muestras y los estándares con PBS y se ajustó a la misma concentración de medio acondicionado a partir de células falsamente transfectadas. Se aspiraron alícuotas de 100 \mul duplicadas conteniendo aproximadamente 50 ng de protrombina activada, y alícuotas duplicadas de estándares de protrombina activada, purificada (1-200 ng), a través de un filtro de nitrocelulosa de 0,45 \mum en un aparato de manchas de segmentos. Cada segmento se lavó dos veces con alícuotas de 200 \mul de PBS. Se lavó el filtro dos veces con PBS y inactivó con leche desnatada no grasa al 5% en PBS (Carnation). Se incubó el segmento con 11 \mug/ml de inmunoglobulinas policlonales de conejo frente a protrombina humana (Dako) en leche desnatada no grasa al 5% en PBS. Se lavó el segmento con PBS conteniendo un 0,05% de Tween-20 y se incubaron con 1 \muCi/ml de F(ab')_{2} auxiliar marcado con S^{35} dirigido frente a inmunoglobulinas de conejo (Amersham). Se lavó la mancha con PBS conteniendo un 0,05% de Tween-20 y se determinó la radiactividad de cada posición por barrido utilizando un detector de imágenes radioanalítico Ambis 4000. Se determinó la concentración de trombina de cada muestra a partir de la curva estándar que fue lineal en un intervalo de entre 1-200 ng de protrombina.

2.2 Ensayo Amidolítico

Se llevó a cabo la hidrólisis por trombina del sustrato cromogénico S-2238 tal como se ha descrito previamente (Wu y col., 1991). Se construyó una curva estándar con trombina de plasma en donde 1 \mug de trombina da una velocidad de hidrólisis de 1220,5 mOD/min en 300 \mul de 100 \muM S-2238. Se utilizaron 20 \mul de una dilución a un tercio de un medio acondicionado activado de veneno para la medición de la velocidad de hidrólisis de 300 \mul de S-2238 100 \muM.

2.3 Fibrinógeno Coagulación

Se utilizó la cantidad de medio acondicionado activado de veneno que da 335 mOD/min (equivalente a 0,27 \mug de trombina de plasma) en el ensayo amidolítico del Ejemplo 2.2 en la coagulación de fibrinógeno. La mezcla de reacción contuvo 20 \mul de medio acondicionado y 180 \mul de tampón de selección conteniendo 20 mM de Tris acetato de pH 7,5, 140 mM de NaCl, 5 mM de KCI, 1 mM de MgCl_{2}, 1 mM de CaCl_{2}. Se inició la reacción por adición de 50 \mul de fibrinógeno humano a 2 mg/ml recién diluido en un tampón de selección a partir de una reserva de 10 mg/ml preparada en calcio libre de PBS. Se midió el tiempo en segundos con un fibrómetro a partir de la adición de fibrinógeno a la formación del segmento. Se utiliza una curva de manchas estándar de trombina en plasma para convertir los tiempos de manchado en mg/ml equivalentes de trombina de plasma. Los resultados se expresaron como % de la actividad de tipo silvestre.

2.4 Activación de la proteína C

Se prepararon lisados de células a partir de trombomodulina humana recombinante de expresión de células TMnc al nivel de 504 \pm 34 fmoles/10^{6} células (Tsiang y col., 1992) tal como se ha descrito previamente (Tsiang y col., 1990). Se rompieron aproximadamente 8 x 10^{6} células en 800 \mul, dando una concentración de trombomodulina de \approx 5 nM en el lisado. Los lisados de control fueron preparados de forma similar a partir de líneas celulares CV-1 de referencia no trasnfectadas que no expresan el TM. La proteína C de plasma humano comercialmente disponible contiene para cada pmole de proteína C \approx 0,005-0,02 pmoles de protrombina contaminante. Para solventar este problema, se trataron en primer lugar 444 pmoles de proteína C con 10 \mug de veneno de Echis carinatus durante 30 min a 37ºC para convertir la protrombina contaminante en trombina que a continuación se inactivó por valoración con el inhibidor de trombina PPACK (D- Phe-Pro-Arg-Chloromethil Ketone). A continuación se utilizó este procesado del veneno y la proteína C valorada por PPACK en el ensayo de activación de la proteína C (Tsiang y col., 1990). La mezcla del ensayo contuvo una cantidad de medio acondicionado activado del veneno correspondiente a una cantidad estándar de actividad amidolítica de S-2238 (8,5 mOD/min), 20 \mul de lisado de células de TMnc y 887 nM de proteína C en un volumen total de 50 \mul. Se incubó esta mezcla a 37ºC durante 1 h y se finalizó por adición de antitrombina III y heparina. Para la activación de proteína C independiente de trombomodulina, se omitió el lisado de TMnc y se sustituyeron 2 mM de CaCl_{2} con 5 mM de Na_{2} EDTA en la mezcla del ensayo. Se determinó la proteína V activada generada por hidrólisis del sustrato cromogénico S-2366. Los valores sin tratar de la Tabla 1a reflejan la corrección del mismo modo que en el Ejemplo 2.3. Se expresó la actividad de activación de la proteína C como un % de la actividad del tipo silvestre.

2.5 Inhibición de la Coagulación de la Antitrombina III Dependiente de la Heparina

Se utilizó una cantidad de medio activado de veneno equivalente a una velocidad de hidrólisis del S-2238 de 370 mOD/min en cada ensayo. Se ajustó el volumen de la muestra a 15 \mul con un medio concentrado 20 veces transfectado de forma simulada, mezclado con 135 \mul de un tampón de selección y pre-calentado a 37ºC. Se midió el tiempo de coagulación inmediatamente después de la adición simultánea de 50 \mul de 2 mg/ml de fibrinógeno y 50 \mul de 650 nM de AT-III con o sin 0,1 U/ml de heparina, a la mezcla de muestras. Se expresó la sensibilidad de la inhibición de la inhibición de coagulación de la AT-III a la heparina en % de la actividad de coagulación residual en presencia de heparina en relación con el control sin heparina.

Ejemplo 3 3.1 Expresión Estable de trombinas recombinantes

Se introdujeron construcciones de protrombina recombinante linearizadas a partir del Ejemplo 1 (10 \mug) en células BHK-21 utilizando el método de transfección de fosfato cálcico (Graham y Van der Eb, 1973; Parker y Stark, 1979). Se seleccionaron los clones en medios de cultivo conteniendo el antibiótico, G418 y se determinaron los niveles de expresión por la actividad amidolítica y las manchas del análisis Western.

3.2 Producción del Medio Acondicionado para la Purificación de Proteína.

Se sembró cada clon de BHK-21 deseado que expresa la protrombina recombinante con botellas de cilindros de 850 cm^{2} y se crecieron en DMEM completo conteniendo un 10% de FCS (5 x 10^{6} células por 200 mL por cilindro de botella). Dos días más tarde, después de que las células alcanzaran confluencia, se añadieron gránulos de micro-soporte, Cytodex 2 (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) para recubrir la monocapa de células. Tres días más tarde, después de que los gránulos fueran cubiertos por células que crecieron sobre los mismos, se lavaron las células con PBS y suero libre de DMEM conteniendo 5 \mug/mL de insulina, 5 \mug/mL de transferrina, 5 \mug/mL de fetuina y se añadieron 10 \mug/mL de vitamina K sobre las células para la secreción de la protrombina. Se separó el medio acondicionado una vez, 3 días más tarde y una vez más 6 días después.

En un procedimiento alternativo, en lugar de utilizar gránulos de micro-soporte para expandir el área de la superficie de crecimiento, cada clon de BHK-21 deseado se sembró en 1700 cm^{2} de botellas de cilindro de superficie extendida en el mismo medio de cultivo que se ha descrito anteriormente (5 x 10^{6} células por 200 mL por botella de cilindro). Cuatro días más tarde, después de que las células alcanzaran confluencia, se lavaron las células dos veces con PBS (en lugar de 3 veces) y se añadió el mismo medio libre de suero (150 mL) sobre las células para la expresión de la protrombina. Se separó el medio acondicionado 3 veces, una vez cada 4 días después (150 mL), una segunda vez 8 días después (150 mL) y una tercera vez 11 días después (100 mL). Se filtró el medio acondicionado a través de un papel Whatman Nº 1 utilizando un embudo Buckner para eliminar los restos de células y, en el primer método, los gránulos desprendidos.

3.3 Concentración del Medio y Diálisis

Se concentró el medio libre de suero conteniendo protrombina con un sistema de filtración de flujo tangencial (Pellicon^{R}, Millipore, Bedlford, MA). Se pre-acondicionó la membrana de celulosa de unión de proteínas bajas del filtro de flujo tangencial (tipo PLCC, 5 pies cuadrados, MWCO. 10 000) siguiendo las instrucciones del fabricante. Durante la concentración, se utilizó una presión de 20-25 psi en el lado de la alimentación, y una presión de 3-4 psi en el lado del retenido. La velocidad de flujo del retenido fue de 150-200 mL/min. Cuando se concentró el medio (retenido) a \approx 500-600 mL, éste se dializó 7 - 8 veces frente 1000-1200 mL del tampón de diálisis (fosfato potásico 0,1 M; pH 7,5) a través del mismo filtro. De forma breve, se añadió el tampón de diálisis al concentrado del medio con una buena mezcla por circulación de la mezcla en el sistema de filtración durante aproximadamente 2-3 min (fuera de permeación). A continuación se concentró la mezcla hasta 500 - 600 mL. Después de repetir la diálisis anterior 7 - 8 veces, se sustituyó más del 99,9% del medio por el tampón de la diálisis.

3.4 Purificación de la Protrombina

A continuación se filtró el dializado final a través de un filtro desechable estéril (Nalgene, Rochester, NY) y se cargó en una columna de intercambio aniónico de flujo rápido de (2,6 x 7) cm de DEAE- sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se eluyó el pico de protrombina entre 0,35-0,45 M de fosfato potásico utilizando un gradiente de 0,1-0,7 M. Se determinaron las alícuotas de fracciones conteniendo protrombina tanto por el ensayo amidolítico después de la activación del veneno de Echis carinatus soluble (Sigma, St. Louis, MO) y SDS-PAGE. Se agruparon las fracciones activas y se dializaron frente HEPES 0,02 M, NaCl 0,1 M, pH 8,0 a 4ºC durante la noche. Después de la diálisis se concentraron las fracciones de protrombina agrupadas hasta 10-15 ml a través de una membrana PM30 utilizando una célula agitada (Amicon, Beverly, MA).

3.5 Purificación de los NPs

Se procesó el NP de la protrombina hasta NP por el veneno de Echis carinatus que se pre-adsorbió en Amberlite CG50 (ICN Biomedicals, Irvine, CA) y se inmovilizó de forma opcional en gránulos de Affi-Gel 10 (Bio Rad, Richmond, CA). La activación del veneno del NP de la protrombina se llevó a cabo con buena rotación durante 50 min a 37ºC. Se separaron los gránulos de veneno por centrifugación seguido por filtración a través de un filtro de 0,45 \mum. El filtrado fue cargado de forma inmediata en una columna de intercambio catiónico de (2,6 x 7) cm Amberlite CG50 (200-400 mesh). Se eluyó el NP a 0,4 M como un pico único utilizando un gradiente de NaCl de 0,1-1,0 M. Se agruparon las fracciones del NP en base a su actividad amidolítica y al SDS-PAGE (gel teñido y manchas Western). A continuación se concentraron las fracciones de NP agrupadas hasta 8-10 mL mediante la utilización de células agitadas con una membrana PM30, y se dializaron frente a NaCl 0,1M, HEPES 0,02 M, pH 8,0. Se caracterizó el NP purificado con respecto al tiempo de coagulación del plasma de actividad amidolítica, la activación de la proteína C, y la agregación plaquetaria. También se determinó su pureza y actividad específica. Finalmente se almacenó la preparación de NP a -80ºC en alícuotas de 0,5 mL en tubo de polipropileno estéril.

3.6 Anticoagulación In Vivo Utilizando NP

Las formulaciones analizadas se especifican a continuación.

100

Se administró cada una de las formulaciones por administración intravenosa a conejos blancos N.Z. a través de una cánula fijada situada en una vena central a una velocidad de infusión de aproximadamente 13 mL/hora (14,3 U/kg/min para el tipo silvestre y 11,7 U/kg/min para K52A). Debido a la naturaleza trombótica potencial de las formulaciones de prueba, se pensó que la infusión en una vena periférica (por ej., la vena del oído marginal) podía causar trombosis local e isquemia debido a una alta concentración local del artículo ensayado. Mediante el acceso a la circulación central (por ej., el SVC a través de la vena yugular) esta complicación sería minimizada debido a las altas velocidades de flujo intravascular y a la rápida distribución del compuesto infundido. Esta aproximación ha sido previamente utilizada en mandriles utilizando la trombina humana (J. Clin. Invest., 92:2003-12, 1993).

La infusión de la formulación E fue a través de una vena del oído marginal ya que esta ruta de administración ha demostrado ser segura y efectiva.

Los resultados se muestran en las Figuras 2A, 2B y 3. Cada figura representa los resultados con un conejo. La Figure 2A muestra que la trombina de tipo silvestre causa un consume de fibrinógeno sustancial y una anticoagulación excesiva. Por el contrario, la Figura 2B demuestra que el K52A PCA es capaz de actividad anticoagulante en el intervalo normal (el área sombreada en las Figuras), que posee una persistencia de acción clínicamente útil, y que no causa consumo de fibrinógeno. La Figura 3 muestra la vida-media de eliminación y reversibilidad.

3.7 Activación de la Proteína C por los PCAs en Presencia o Ausencia de TM

El ensayo de activación de la proteína C está descrito en el Ejemplo 2.4. A diferencia del Ejemplo 2.4, no hay necesidad de pretratar la reserve de proteína XC con veneno y PPACK porque no hay veneno en la trombina recombinante purificada para activar la protrombina contaminante en la reserva de proteína C. La trombina, trombomodulina y la proteína C se utilizaron a las concentraciones indicadas en la Figura 6. Se incubó la reacción durante 1 hora a 37ºC y se valoró para determinar la actividad del aPC utilizando el sustrato cromogénico S-2366. Este experimento demuestra que los PCAs K52A y E229A permanecen dependientes de la trombomodulina.

Ejemplo 4 Demostración de la Anticoagulación Reversible en Monos Cynomolgus Utilizando el Activador 2 de la Proteína C (PCA 2) (E229A) y K52A PCA

Se formuló el PCA 2 preparado tal como se ha descrito en el Ejemplo 3.4 y 3.5 en una solución acuosa isotónica estéril en un volumen total de 10 mL. Se infundió de forma intravenosa la solución de PCA 2 durante 10 min en una vena periférica de monos cynomolgus machos adultos a una velocidad de 60 mL/hr en un volumen total de 10 mL. Se controló la velocidad de infusión por uso de una bomba de infusión. Se administraron dos concentraciones: (1) 1,5 \mug/kg/min (2 U/kg/min) y (2) 4,5 \mug/kg/min (6 U/kg/min). (1 U se ha definido anteriormente en el texto).

Se tomaron muestras de sangre por punción de una vena periférica en los siguientes puntos de tiempo: inmediatamente antes del inicio de la infusión t = 0 y a intervalos después del inicio de la infusión t = 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150 min. Las muestras fueron de un volumen aproximado de 2 mL y se recogieron en citrato. Se obtuvo el plasma a partir de la sangre entera durante 10 minutos. Se monitorizó la anticoagulación por medición del aPTT en un fibrómetro. Se determinaron los niveles de fibrinógeno a partir de los ensayos de coagulación utilizando plasma deficiente en fibrinógeno.

La Figura 4 ilustra los resultados de la infusión individual en monos con las dos dosis de PCA 2. Ambas dosis dieron lugar a la prolongación del tiempo de coagulación más allá del intervalo terapéutico anticipado (región sombreada) sin consumo de fibrinógeno indicando que el PCA 2 estaba falto de actividad procoagulante detectable in vivo. El efecto fue reversible, con el retorno del aPTT al valor normal aproximadamente 170 minutos después de que se detuviera la infusión. La reversibilidad del efecto sugiere que los factores de coagulación no se consumieron durante la infusión, otra indicación de que el PCA 2 no tenía actividad procoagulante detectable in vivo. El análisis de las cinéticas de la reversión sugiere una vida media para la eliminación de aproximadamente 50 minutos. Se cree que este grado de persistencia es clínicamente útil.

En un estudio separado, se preparó 2 U/kg/min de K52A PCA y se infundió durante 10 minutos tal como se ha descrito anteriormente y se comparó con 2 U/kg/min de E229A PCA en el Ejemplo anterior. Los resultados se muestran en la Fig. 5. Aunque los niveles de fibrinógeno con K52A PCA a 2 U/kg/min no cambiaron, se infundió el K52A PCA sustancialmente bajo las mismas condiciones, pero a una sobredosis de 12 U/kg/min, dando lugar a un control de aPTT >10x y a una caída en el fibrinógeno de <10%. 12 U/kg/min fue una sobredosis para monos a pesar del hecho de que es bien tolerado por conejos a esta dosis (supra). De este modo, las dosis en los monos serán generalmente menores que en conejos.

Se ensayó el consumo de plaquetas y los tiempos de sangría y los resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

101

Estos datos demuestran que la función de las plaquetas fue preservada y los tiempos de sangría permanecieron inalterados, en contraste con los resultados observados con los inhibidores de gpIIb/IIIa o los inhibidores de trombina.

Ejemplo 5 5.1 Expresión y Uso Sólo del NP de cadena B

A la vista de nuestras observaciones de que las sustituciones en la cadena A de la trombina tienen un efecto insignificante en la hidrólisis del S-2238, FC o PA serán útiles para utilizar solo la cadena B del PCA como un anticoagulante o solo la cadena B del FCP como un procoagulante. La cadena B del FCP o del PCA se obtuvo a partir de las dos cadenas modelo por reducción del enlace de unión disulfuro y replegamiento (Hageman y col., Arch. Biochem. Biophys. 171:327-336 [1975]). Sin embargo, preferiblemente, se obtiene la cadena B por expresión sólo del ácido nucleico que codifica la cadena B del NP. Un vector de expresión para la cadena B del PCA o del FCP es derivada de vectores construidos para la expresión de la protrombina, la pretrombina 1, la pretrombina 2 (cadena única de \alpha-trombina) por eliminación de la secuencia que interviene entre el codón que codifica el carboxilo terminal del péptido señal y el residuo terminal amino de la cadena de trombina B (11). Las eliminaciones se consiguieron por mutagénesis dirigida por los oligonucleótidos utilizando oligonucleótidos sintetizados químicamente que codifican la eliminación como prímeros en un modelo de DNA de única hebra tal como se ha descrito para la construcción de la sustitución de ala de los NPs. De forma opcional, el codón para el C44 es mutagenizado para codificar A o S.

5.2 Expresión de Pretrombina-1 y Pretrombina-2 como Proteínas de Fusión del GST en E. coli

Se expresaron la pretrombina-1 (residuo terminal amino S156, Degen y col. números de residuo) y pretrombina-2 (residuo terminal amino T272, Degen y col. números de residuo) como proteínas de fusión solubles con S-transferasa de la glutationa (GST) en el compartimiento citoplásmico de E. coli. El vector de expresión utilizado fue el pGEX-5X-1 (Pharmacia LKB Biotechnology) que contiene el origen de replicación pBR322 por propagación en E. coli, el gen de \beta-lactamasa que codifica para la resistencia al antibiótico ampicilina para mantener la presencia del plásmido y el gen Iac 19 gene que codifica la proteína represor lac para la expresión basal de amortiguación de la proteína de fusión. La expresión es mediada por el promotor tac, que es inducible por el IPTG, proximal al sitio de unión del ribosoma y al codón de inicio de la traducción del gen de GST. La secuencia que codifica los 221 amino ácidos del GST es seguida por una secuencia (IEGR) que codifica un sitio de rotura proteolítica para el Factor Xa o el veneno de Echis carinatus que puede ser utilizado para romper la mitad de CST a partir de la proteína de fusión, y una secuencia de poli-unión que contenga sitios de la enzima de restricción únicos para la inserción de secuencias de codificación para ser fusionadas a la secuencia de codificación del GST.

Para la Pretrombina-1, se diseñaron los prímeros de la PCR para amplificar la secuencia de nucleótidos que codifica la pretrombina-1 a partir del S156 (Degen y col. números de residuo) al terminal carboxilo de la cadena de trombina B. El final 5' de la secuencia de codificación de la pretrombina-1 se modificó por la adición de una secuencia que codifica seis residuos de histidina consecutivos que pueden ser utilizados como una marca de afinidad para la purificación de las proteínas de fusión en matrices de quelación de Ni^{2+} y la adición de una secuencia que codifica un sitio de endocucleasa de restricción del EcoRI. Se modificó el prímero 3' para insertar una secuencia que codifica un sitio de la endonucleasa de restricción del XhoI en el lado 3' del codón de parada. Para la pretrombina-2, se utiliza el mismo prímero de la PCR 3' aunque el prímero de la PCR 5' se diseñó para fusionar la secuencia de la pretrombina 2 que empieza en el residuo T272 (Degen y col. números de residuo) para las seis marcas de afinidad de la histidina y el sitio de restricción del EcoRI. Se utilizaron los prímeros de la PCR para amplificar las secuencias modificadas que codifican la pretrombina 1 y la pretrombina 2 utilizando el clon cDNA de la protrombina, BS(KS)-hFII como un modelo. Se clonaron los fragmentos amplificados en los sitios EcoRI y XhoI en pGEX-5X-1 en configuración con la secuencia de codificación del GST. Se utilizaron las construcciones resultantes para transformar la cepa de E. coli JM 105 (ATCC 47016).

Se hicieron crecer los cultivos en fase estacionaria de JM 105 conteniendo GST-pretrombina-1 y GST-pretrombina-2 toda la noche a 37ºC en 25 ml de medio Luria-Bertani (LB) conteniendo 200 \mug/ml de ampicilina con agitación a 250 rpm. Se inocularon 200 ml del medio con 4 ml de cultivo de fase estacionaria y se incubaron a 37ºC con agitación a 250 rpm hasta que las células alcanzaron un crecimiento de fase exponencial (O.D. a 600 nm = 0,6 -1,2). Se disminuyó la temperatura de incubación hasta 17ºC y después de 1 hora, se añadió IPTG hasta una concentración final de 1 mM y se continuó la incubación durante 24 horas. Se separaron las células bacterianas por centrifugación a 5000 g, se lavaron con TrisCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. Se suspendieron las células en 20 ml de TrisCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, se rompieron por sonicación durante 3-4 minutos (factor de utilización del 50%), se añadió Triton X-100 a una concentración final del 1% y se mezcló el extracto a 80 rpm durante 60 minutos a 4ºC. Se separó el material insoluble por centrifugación a 10.000g. Se expresó la GST-pretrombina-1 y la GST-pretrombina-2 en la fracción soluble a un rendimiento de aproximadamente 5 mg/litro de cultivo tal como se valoró por el ensayo de manchas Western utilizando un anticuerpo monoclonal (EST-1) dirigido contra la \alpha-trombina humana. Se procesaron las proteínas de fusión GST-pretrombina-1 y GST-pretrombina-2 hasta la \alpha-trombina completa por incubación con 30 \mug/ml de veneno de Echis carinatus en TrisCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 a 37ºC durante 30 minutos o más. Se visualiza el procesado de las proteínas de fusión hasta fragmento del mismo tamaño que las cadenas A- y B- de la \alpha-trombina humana por el sistema de manchas Western siguiendo las condiciones de reducción bajo el SDS-PAGE. Con el procesado, se valoró la actividad amidolítica frente al substrato peptídico cromogénico específico de la trombina (S-2238) por incubación de 200 ng de las proteínas de fusión GST-pretrombina-1 o GST-pretrombina-2 procesadas con S-2238 100 \muM en TrisCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 a 37ºC durante 10 minutos. Se detectó solo actividad amidolítica en muestras después del procesado con veneno de Echis carinatus.

Se purificaron las proteínas de fusión GST-pretrombina-1 y GST-pretrombina-2 por cromatografía de afinidad en glutationa-sefarona 4B (Pharmacia). Se aplicaron los extractos bacterianos a una columna de 1 ml de glutationa-sefarosa 4B, se cerró la columna y se mezcló durante 40 minutos. Se secó la columna y se lavó con TrisCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 más un 1% de Triton X-100, se lavó con TrisCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 y se eluyó con alícuotas de 1 ml de TrisCl 50 mM, pH 8,0 conteniendo glutationa 10 mM. Las proteínas de fusión GST-pretrombina-1 y GST-pretrombina-2 eluídas por glutationa 10 mM fueron aproximadamente un 50% puras tal como se valoró por teñido por SDS-PAGE con azul de coomassie.

Los NPs de esta invención son producidos del mismo modo que la pretrombina-1 o la pretrombina-2 en este ejemplo, y son procesados hasta su acabado, el NP activado tal como se describe en la presente invención, excepto que las construcciones son mutagenizadas para introducir el cambio de secuencia deseado en el vector de expresión antes de la expresión en JM 105.

Ejemplo 6 Agregación Plaquetaria por el PCA 2 (E229A) y la Trombina de Tipo Silvestre

Aunque se ha demostrado que el PCA 2 es deficiente en la coagulación del fibrinógeno, otra función procoagulante importante de la trombina es la estimulación de la agregación plaquetaria como resultado de la rotura de un receptor de transmembrana en la superficie de la plaqueta. Con el fin de demostrar que el PCA 2 también es defectuoso en esta función procoagulante de la trombina, se llevaron a cabo estudios de agregación plaquetaria comparando diferentes concentraciones de PCA 2 y trombina de tipo silvestre.

Se llevaron a cabo estudios de agregación plaquetaria comparando la trombina PCA-2 de tipo Silvestre con plasma rico en plaquetas humano citrado (PRP) utilizando un agregómetro de canal dual Chrono-Log (modelo 560-VS, Chrono-Log Corp, Havertown PA). Se recogió sangre humana recién obtenido (4,5 mL) es tubos Vacutainer estériles (Becton Dickenson, Rutherford, NJ) conteniendo 0,5 mL de citrato sódico 129 mM. Se separó el PRP de la sangre citrada por centrifugación. El agregómetro se hizo funcionar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió \alpha-trombina humana recombinante al PRP pre-calentado (37ºC for 2 min) a concentraciones finales oscilantes entre 0,12 nM - 0,49 nM para el tipo silvestre y 0,74 nM - 71,89 nM para el PCA 2. Se monitorizó la agregación plaquetaria estimulada por la adición de trombina al PRP por el incremento a la vista de la transmisión registrada en un registrador de gráficos para hasta 5 minutos. Se cuantificó la extensión de la agregación plaquetaria por medición del área bajo la curva 1,5 min después de la adición de la trombina. Se representó la extensión de la agregación plaquetaria (cm^{2}) frente a la concentración de la trombina (Figura 7).

Se estimó la CE50 (concentración requerida para la mitad de la estimulación máxima) para la estimulación de la agregación para la trombina de tipo silvestre y el PCA2 a partir del gráfico. El PCA 2 (EC50 = 30,8 nM) es 8 veces menos efectivo que la trombina de tipo silvestre (EC50 = 3,9 nM) en la estimulación de la agregación plaquetaria y por esto es defectuosa en esta actividad procoagulante así como en coagular el fibrinógeno.

Bibliografía

Adams, G. A. y col., Mol. Cell. Biol. 5, 1442-1448, 1985.

Bowie J. U. y col., Science. 247, 1306-1310, 1990.

Dreyfus, M., y col., N. Eng. J. Med. 325, 1565-1568, 1991.

Graham, F.L., y Vand der Eb, A., J. Virology. 52, 456-467, 1973.

Gruber, A., y col., Circulation. 82, 578-585, 1991.

Gruber, A., y col., Circulation. 84, 2454-2462, 1991a.

Hirsh, J., N. Eng. J. Med. 324, 1865-1875, 1991.

Hirsh, J., N. Eng. J. Med. 324, 1565-1574, 1991a.

Klapper, M. H., Biochem. Biophys. Res. Comm. 78, 1018-1024, 1977.

Kunkel T. A. y col., Meth. Enzymol. 154, 367-382, 1987.

LaVallie, E. R., y col., Biotechnology, 11, 187-193, 1993.

Maggi, A., y col., Haemostasis. 17, 329-335, 1987.

Parker, B.A. y Stark, G.R., J. Virol. 31, 360-369, 1979.

Pescador, R., y col., Thrombosis Res. 53, 197-201, 1989.

Rose G. D. y col., Science. 229, 834-838, 1985.

Rydel T. J. y col., Science. 249, 277-280, 1990.

Smith, D. B. y col., Gene, 67, 31-40, 1988.

Stader, J. A. y col., Meth. Enzymol. 185,166-187, 1990.

Studier, F. W. y col., Meth. Enzymol. 185, 60-89, 1990.

Tabor, S. y Richardson, C.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 4767-4771, 1987.

Tailor y col., J. Clin. Invest. 79, 918-925, 1987.

Tsiang, M., y col., Biochemistry 29, 10602-10612, 1990.

Tsiang, M., Lentz, S. R., y Sadler, J. E. J. Biol. Chem. 267, 6164-6170, 1992.

Vieira, J. y Messing, J., Meth. Enzymol. 153, 3-11, 1987.

Wells, J. A. Biochemistry, 29, 8509-8517, 1990.

Wu, Q., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6775-6779, 1991.

Zoller, M. J. y Smith, M., Nucleic Acids Res. 10, 6487-6493, 1982.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: GILEAD SCIENCES, INC.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS POLIPÉPTIDOS Y TERAPIA DE COAGULACIÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: GILEAD SCIENCES, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 353 LAKESIDE DRIVE

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: FOSTER CITY

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: CALIFORNIA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CODIGO: 94404

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA DEL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: Disco magnético flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: compatible con PC de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Patente en Publicación #1,0, Versión #1,25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FECHA DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US94/13104

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-NOV-1994

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FECHA DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/338,368

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-NOV-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

AGENTE/INFORMACIÓN DEL AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: HENSLEY, MAX D.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 27.043

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCÍA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 190,2F

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 415-574-3000

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415-578-9264

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC DE ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 885 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1.,885

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID NO: 1:

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC DE ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 295 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID NO: 2:

12

Claims (40)

1. Un nuevo polipéptido (NP) proteolíticamente activo que tiene al menos aproximadamente el 80% de homología de la secuencia de amino ácidos con referencia a la secuencia de trombina y tiene una relación de actividad activantes de la proteína para la actividad coagulante del fibrinógeno que es mayor que aproximadamente dos veces la se la trombina de la secuencia de referencia, en la que al menos un residuo de amino ácido ha sido sustituido por al menos uno de los siguientes residuos de amino ácidos de la trombina, o al menos uno de los siguientes residuos amino ácidos de la trombina ha sido eliminado, o un residuo amino ácido ha sido insertado de forma inmediatamente adyacente a la menos uno de los siguientes residuos de amino ácidos de la trombina: W50, D51 R93, E94, R98, D122, R123, E124, S128, Q131, E169, K174, D175, S176, T177, D183, D193, K196, A200, N216, W227, E229, D232, R233, D234, G235, K236, Y237, F239, o W249, siempre que, sin embargo, el NP no sea la trombina K174E o la trombina desP48P49W50.

2. El NP de la reivindicación 1 en donde el NP está seleccionado entre una trombina en donde uno o más de los residuos W50, S176, T177, D193, K196, W227, E229, D232, R233, D234, K236, Y237 o F239 han sido sustituidos, eliminados, otro residuo ha sido insertado adyacente al mismo.

3. El NP de la reivindicación 2 en donde el W50 ha sido eliminado u otro residuo seleccionado entre el siguiente grupo ha sido sustituido del mismo o insertado inmediatamente adyacente al mismo: G, A, V, I, L, S, T, D, N, E, Q, C, K, M, F, Y, P, R, y H.

4. El NP de la reivindicación 2 en donde el K 196 ha sido eliminado u otro residuo seleccionado entre el grupo siguiente ha sido sustituido del mismo o insertado inmediatamente adyacente al mismo: G, A, V, I, L, S, T, D, N, E, Q, C, M, F, Y, P, W, R, y H.

5. El NP de la reivindicación 2 en donde el D193 o el D234 ha sido eliminado u otro residuo seleccionado entre el siguiente grupo ha sido sustituido del mismo o insertado inmediatamente adyacente al mismo: G, A, V, I, L, S, T, N, E, Q, C, K, M, F, Y, P, W, R, y H.

6. El NP de la reivindicación 2 en donde los residuos W50 y K52, E229 y W50, R233 y W50, R233 y K52, o R233 y E229 son sustituidos o eliminados.

7. El NP de la reivindicación 2 en donde el E229 es eliminado u otro residuo seleccionado entre el grupo siguiente ha sido sustituido del mismo o insertado de forma inmediatamente adyacente al mismo: G, A, V, I, L, S, T, D, N, Q, C, K, M, F, Y, P, W, R, y H.

8. El NP de la reivindicación 2 en donde la sustitución, eliminación o inserción se ha realizado sólo en la cadena A o B.

9. El NP de la reivindicación 2 en donde el R233 es eliminado u otro residuo seleccionado entre el grupo siguiente ha sido sustituido del mismo o insertado de forma inmediatamente adyacente al mismo: G, A, V, I, L, S, T, D, N, E, Q, C, K, M, F, Y, P, W, y H.

10. El NP de la reivindicación 2 en donde los residuos D193, K196 y K52 son sustituidos o eliminados.

11. El NP de la reivindicación 2 en donde el residuo es sustituidos y la sustitución es con alanina.

12. El NP de la reivindicación 2 en donde 2 o 3 de los residuos son sustituidos.

13. El NP de la reivindicación 2 que comprende la cadena B libre de la cadena A.

14. El NP de la reivindicación 2 que comprende la cadena A y B.

15. El NP de la reivindicación 1 que posee más de aproximadamente 2 veces la actividad proteolítica residual de la trombina de referencia cuando se mide por hidrólisis del S-2238 en presencia de inhibición de AT-III dependiente de heparina.

16. El NP de la reivindicación 2 en donde es sustituido un residuo del sitio de unión de la heparina.

17. El NP de la reivindicación 16 en donde el residuo es R89, R180, R245, K248 o K252.

18. El NP de la reivindicación 2 que es K52A,R233A NP, E229D NP, E229F NP, E229S NP, E229W NP, E229Y NP, R233N NP, R233D NP, R233F NP, W50C NP, W50E NP, o W50K NP.

19. El NP de la reivindicación 1 en donde la trombina ha sido sustituida en el residuo W227, el W227 ha sido eliminado u otro residuo ha sido insertado inmediatamente adyacente al W227.

20. El NP de la reivindicación 2 en donde el residuo es E229 o R233.

21. El NP de la reivindicación 1 en donde el residuo está dentro de aproximadamente 10 Angstroms del C\alpha del E229 o R233.

22. El NP de la reivindicación 2 en donde la arginina ha sido sustituida por E229.

23. Un ácido nucleico que codifica el NP de la reivindicación 1.

24. Un vector replicable que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 23.

25. Una célula recombinante que comprende el vector de la reivindicación 24.

26. Un método que comprende el cultivo de la célula de la reivindicación 25 y la recuperación del NP a partir del cultivo celular.

27. El método de la reivindicación 26 en donde el NP es expresado en el cultivo celular como un polipéptido soluble.

28. El método de la reivindicación 26 en donde el NP es expresado en el cultivo celular como sólo la cadena B.

29. El método de la reivindicación 26 en donde el ácido nucleico codifica las secuencias A y B cada una de las cuales está independientemente ligada al ácido nucleico que codifica una secuencia de señal y el ácido nucleico está coexpresado en la misma célula huésped.

30. Una composición farmacéutica que comprende un NP proteolíticamente activo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 junto con un soporte farmacéuticamente aceptable.

31. Una composición farmacéutica para uso en un método para el tratamiento de las enfermedades trombóticas o los estados que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un NP proteolíticamente activo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

32. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 31 en donde el NP posee más de aproximadamente dos veces la actividad proteolítica residual de la trombina de referencia cuando se mide por hidrólisis del S-2238 en presencia de inhibición del AT-III dependiente de la heparina.

33. Un NP proteolíticamente activo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para uso en terapia.

34. Un NP proteolíticamente activo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para uso en el tratamiento de enfermedades o estados trombóticos.

35. El uso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o estados trombóticos de un NP proteolíticamente activo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

36. El uso de acuerdo con la reivindicación 35 en donde el NP posee más de aproximadamente dos veces la actividad proteolítica residual de la trombina de referencia cuando se midió por hidrólisis del S-2238 en presencia de inhibición del AT-III dependiente de heparina.

37. El uso de acuerdo con la reivindicación 35 en donde la enfermedad o estado trombótico es cirugía de bypass cardíaco, trombolisis coronaria y angioplastia, embolismo pulmonar, ataques isquémicos pasajeros, apoplejía, angina inestable o trombosis venosa profunda.

38. El uso de acuerdo con la reivindicación 35 en donde el NP es defectuoso en actividad de coagulación del fibrinógeno detectable.

39. El uso de acuerdo con la reivindicación 35 en donde el NP retiene al menos aproximadamente el 5% de actividad activante de la proteína C de la trombina de tipo silvestre.

40. El uso de acuerdo con la reivindicación 35 en donde el NP es K52A,R233A NP, E229D NP, E229F NP, E229S NP, E229W NP, E229Y NP, R233D NP, R233N NP, R233F NP, W50C NP, W50E NP, o W50K NP.