ES2239876A1 - Gene encoding a ribosome-inactivating protein, known as recombinant musarmin 4, expression in bacterial system, method of obtaining same and applications thereof - Google Patents

Gene encoding a ribosome-inactivating protein, known as recombinant musarmin 4, expression in bacterial system, method of obtaining same and applications thereof

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ES2239876A1 ES200301318A ES200301318A ES2239876A1 ES 2239876 A1 ES2239876 A1 ES 2239876A1 ES 200301318 A ES200301318 A ES 200301318A ES 200301318 A ES200301318 A ES 200301318A ES 2239876 A1 ES2239876 A1 ES 2239876A1
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Abstract

The invention relates to a gene encoding a ribosome-inactivating protein, known as recombinant musarmin 4, the expression of said protein in a bacterial system, the method of obtaining same and the applications thereof. More specifically, the invention relates to a method of obtaining the nucleotide sequence of the gene and the actual sequence that encodes a ribosome-inactivating protein known as recombinant musarmin 4. The invention relates to the aforementioned method, the polynucleotide sequence or gene, and the recombinant protein expressed in a bacterial vector. The invention can be used for the following applications: 1) the production of musarmin 4 or part thereof in micro-organisms and plants by expression of the musarmin 4 gene or part of same 2) the production, in micro-organisms and plants, of fusion proteins containing musarmin 4 or part thereof and a peptide or protein that directs the resulting fusion protein towards specific targets in human therapy, in particular, for cancer and AIDS 3) the production of fusion proteins containing musarmin 4 and a peptide or protein that directs the resulting fusion protein towards specific targets, which is intended to increase the resistance of plants to diseases caused by phytopathogenic fungi, plant viruses and animal predators 4) the construction of plants containing the musarmin 4 gene or part thereof, which are resistant to phytopathogenic fungi, plant viruses and animal predators and 5) the production of musarmin 4 or the larger and smaller derivatives thereof, for standard uses of ribosome-inactivating proteins (RIPs) as a toxic component in immunotoxins and conjugates, as direct-action antiviral proteins, particularly against the AIDS virus, or as antipathogenic agents against phytopathogenic fungi, plant viruses and animal predators.

Description

Proteína musarmina 4 recombinante, gen que la codifica, procedimiento de obtención y aplicaciones.Recombinant musarmine 4 protein, a gene that code, procurement procedure and applications.

Campo técnico de la invenciónTechnical Field of the Invention

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de las proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs) las cuales impiden el funcionamiento ribosómico de manera catalítica por inactivación del ácido ribonucléico y provocan apoptosis. De forma más específica, la presente invención se refiere a la estructura de un gen que codifica a una proteína inactivadora de ribosomas (RIP), a su expresión en la bacteria Escherichia coli que permite la producción de una nueva proteína inactivadora de ribosomas denominada musarmina 4 recombinante (rMu4) que muestra gran actividad antiribosómica y puede utilizarse para la construcción de conjugados químicos con otras moléculas, en particular proteínas, capaces de dirigir de manera específica o preferente a la musarmina 4 recombinante hacia los blancos correspondientes, que pueden ser células enfermas o relacionadas directa o indirectamente con el cáncer, el sida y otras patologías humanas y en general animales, y puede utilizarse también en la construcción de plantas resistentes a agentes patógenos y predadores.The present invention falls within the technical field of ribosome inactivating proteins (RIPs) which prevent ribosomal functioning catalytically by inactivation of ribonucleic acid and cause apoptosis. More specifically, the present invention relates to the structure of a gene that encodes a ribosome inactivating protein (RIP), its expression in the Escherichia coli bacteria that allows the production of a new ribosome inactivating protein called musarmin 4 recombinant (rMu4) that shows great antiribosomal activity and can be used for the construction of chemical conjugates with other molecules, in particular proteins, capable of specifically or preferentially directing recombinant musarmine 4 towards the corresponding targets, which can be diseased cells or directly or indirectly related to cancer, AIDS and other human and in general animal pathologies, and can also be used in the construction of plants resistant to pathogens and predators.

Estado de la técnica anterior a la invenciónState of the art prior to the invention

En el reino vegetal existen algunas especies que contienen actividades inhibidoras de la biosíntesis de proteínas en sistemas derivados de organismos eucariontes, que son de naturaleza proteica y carácter antiviral, que a la espera de una definición bioquímica precisa se conocen con el nombre de proteínas inactivadoras de ribosomas o RIPs (Gasperi-Campani y cols. Biochem.J. 186,439-441 [1980]; Gasperi-Campani y cols. J.Nat.Prod. 48, 446-454 [1985]; Ferreras y cols. Cell.Mol.Biol.35,89-95 [1989]; Merino y cols. J.Exp.Bot. 41, 67-70 [1990]); Girbés y cols., Cell.Mol.Biol. 42, 461-471 [1996]).In the plant kingdom there are some species that contain inhibitory activities of protein biosynthesis in systems derived from eukaryotic organisms, which are of a protein nature and antiviral nature, which, pending a precise biochemical definition, are known as inactivating proteins of ribosomes or RIPs (Gasperi-Campani et al. Biochem.J. 186 , 439-441 [1980]; Gasperi-Campani et al. J.Nat.Prod. 48 , 446-454 [1985]; Ferreras et al. Cell. Mol.Biol . 35 , 89-95 [1989]; Merino et al. J.Exp.Bot. 41 , 67-70 [1990]); Girbés et al., Cell.Mol.Biol. 42 , 461-471 [1996]).

El papel biológico de estas toxinas en la planta que las produce es totalmente desconocido (Roberts y Selitrennikoff Biosc.Rep. 6, 19-29 [1986]). Estas proteínas suelen ser inmunológica y químicamente diferentes unas de otras aunque guardan alguna homología secuencial en los aminoácidos del extremo amino-terminal, en: particular cuando las toxinas pertenecen a la misma familia botánica (Montecucchi y cols. Int.J.Peptide Protein Res. 33, 263-267 [1989]).The biological role of these toxins in the plant that produces them is totally unknown (Roberts and Selitrennikoff Biosc.Rep. 6 , 19-29 [1986]). These proteins are usually immunologically and chemically different from each other although they have some sequential homology in the amino-terminal amino acids, in particular when the toxins belong to the same botanical family (Montecucchi et al. Int.J. Peptide Protein Res. 33 , 263-267 [1989]).

En la actualidad se clasifica a las RIPs en tres categorías: RIPs de tipo 1, de tipo 2 y de tipo 4 (Citores y cols. FEBS Letters 329, 59-62 [1993]). Las RIPs de tipo 1 (vegetales y bacterianas) están formadas por una sola cadena polipeptídica que es la que presenta la actividad de inhibidor de síntesis de proteínas; las RIPs de tipo 2 (sólo vegetales hasta ahora) están formadas por dos cadenas polipeptídicas disimilares, una cadena inhibidora de síntesis de proteínas equivalente a las RIPs de tipo 1 que se denomina cadena A y una cadena con propiedades de lectina que se denomina cadena B; las RIPs de tipo 4 (sólo vegetales hasta ahora) están formadas por dímeros unidos por fuerzas no covalentes, siendo cada dímero una molécula de dos cadenas polipeptídicas, equivalente a una RIP de tipo 2. Las RIPs de tipo 2 y 4 pueden a su vez ser tóxicas como ricina, abrina, volkensina, viscumina y modeccina (Citores y cols. FEBS Letters 329, 59-62 [1993]), debido a que pueden atravesar las membranas celulares al reconocer y unirse a receptores de membrana plasmática y entrar en el citosol (Stirpe y cols., Biotechnology 10, 405-412 [1992]). Por otro lado las RIPs de tipo 2 y 4 pueden ser también no tóxicas para células humanas cultivadas y para ratones, ésto es, no tienen toxicidad alguna a las concentraciones utilizadas con las RIPs tóxicas tales como ricina, abrina, etc. Ejemplos de RIPs de tipo 2 no tóxicas son la nigrina 1 y la nigrina b (Girbés y cols., J. Biol. Chem. 268, 18195-18199 [1993]; Girbés y cols., Plant Mol. Biol. 22, 1181-1186 [1993]; Girbés y cols., Cell.Mol.Biol. 42, 461-471 [1996]). Sin embargo las RIPs no tóxicas nigrinas y ebulinas a altas concentraciones presentan una toxicidad parecida a la de ricina a muy bajas concentraciones (Citores y cols. Cell.Mol.Biol. 42, 473-476 [1996]. Las RIPs de tipo 1 son menos tóxicas para las mismas células y animales de ensayo que las de tipo 2 tóxicas, excepción hecha de los macrófagos (Stirpe y cols., Biotechnology 10, 405-412 [1992]), debido a que no pueden entrar por mediación de receptores de membrana.RIPs are currently classified into three categories: type 1, type 2 and type 4 RIPs (Citores et al. FEBS Letters 329 , 59-62 [1993]). Type 1 RIPs (vegetable and bacterial) are formed by a single polypeptide chain that is the one that exhibits the activity of protein synthesis inhibitor; Type 2 RIPs (vegetable only so far) are formed by two dissimilar polypeptide chains, a protein synthesis inhibitor chain equivalent to type 1 RIPs called chain A and a chain with lectin properties called chain B ; Type 4 RIPs (only vegetable so far) are formed by dimers joined by non-covalent forces, each dimer being a molecule of two polypeptide chains, equivalent to a type 2 RIP. Type 2 and 4 RIPs can in turn be toxic such as ricin, abrin, volkensin, viscumin and modeccin (Citores et al. FEBS Letters 329 , 59-62 [1993]), because they can pass through cell membranes by recognizing and binding to plasma membrane receptors and entering the cytosol (Stirpe et al., Biotechnology 10 , 405-412 [1992]). On the other hand, type 2 and 4 RIPs can also be non-toxic for cultured human cells and for mice, that is, they have no toxicity at the concentrations used with toxic RIPs such as ricin, abrin, etc. Examples of non-toxic Type 2 RIPs are nigrin 1 and nigrin b (Girbés et al., J. Biol. Chem. 268 , 18195-18199 [1993]; Girbés et al., Plant Mol. Biol . 22 , 1181 -1186 [1993]; Girbés et al., Cell.Mol.Biol. 42 , 461-471 [1996]). However, non-toxic Nigrine and Ebulin RIPs at high concentrations have a toxicity similar to that of ricin at very low concentrations (Citores et al. Cell.Mol.Biol. 42 , 473-476 [1996]. Type 1 RIPs are less toxic for the same cells and test animals as toxic type 2, except for macrophages (Stirpe et al., Biotechnology 10 , 405-412 [1992]), because they cannot enter through receptor mediation membrane.

Las cadenas polipeptídicas de las RIPs tienen una masa molecular (Mr) entre 20000 y 33000 y son de naturaleza básica. Las. cadenas A impiden el funcionamiento ribosómico de manera catalítica por inactivación del ácido ribonucléico (Roberts, y cols, Biosc. Rep 6, 19-29 [1986]; Stirpe, y Barbieri, FEBS Lett. 195, 1-8 [1986]; Olsnes, y Pihl, 

\hbox{en :}
Molecular Action of Toxins and Viruses (Cohen, P. and Van Heyningen, S. eds.) pp. 51-105, Elsevier, Amsterdam, New York [1982]; Barbieri, y Stirpe, Cancer Surv. 1, 489-520 [1982]; Stirpe, y cols., Biotechnology. 10, 405-412 [1992]; Citores L. y cols., FEBS Lett. 329, 59-62 [1993]; Girbés y cols., J. Biol. Chem. 268, 18195-18199 [1993]; Girbés y cols., Plant Mol. Biol. 22, 1181-1186 [1993]; Jimenez y Vázquez, Annu.Rev.Microbiol. 39, 649-672 [1985]). Las RIPs inhiben ribosomas de tipo eucariotico (Stirpe, y cols., Biotechnology. 10, 405-412 [1992]; Citores L. y cols., FEBS Lett. 329, 59-62 [1993]; Girbés y cols., J. Biol. Chem. 268, 18195-18199 [1993]; Girbés y cols., Plant Mol. Biol. 22, 1181-1186 [1993]). Sólo algunas RIPs inhiben los ribosomas bacterianos (Girbes y cols, J.Bacteriol. 175, 6721-6724 [1993]). La inactivación consiste en la liberación de una adenina del ARNr mayor del ribosoma (Endo y Tsurugi, J.Biol.Chem. 262, 8128-8130 [1987]; Stirpe y cols. Nucleic Acid Res. 16, 1349-1357 [1988]).The polypeptide chains of RIPs have a molecular mass (Mr) between 20,000 and 33,000 and are of a basic nature. The. A chains prevent catalytic ribosomal functioning by inactivation of ribonucleic acid (Roberts, et al., Biosc. Rep 6 , 19-29 [1986]; Stirpe, and Barbieri, FEBS Lett . 195 , 1-8 [1986]; Olsnes , and Pihl, 
 \ hbox {en:}
Molecular Action of Toxins and Viruses (Cohen, P. and Van Heyningen, S. eds.) Pp. 51-105, Elsevier, Amsterdam, New York [1982]; Barbieri, and Stirpe, Cancer Surv. 1 , 489-520 [1982]; Stirpe, et al., Biotechnology. 10 , 405-412 [1992]; Citores L. et al., FEBS Lett . 329 , 59-62 [1993]; Girbés et al., J. Biol. Chem. 268 , 18195-18199 [1993]; Girbés et al., Plant Mol. Biol. 22 , 1181-1186 [1993]; Jimenez and Vázquez, Annu.Rev.Microbiol. 39 , 649-672 [1985]). RIPs inhibit eukaryotic type ribosomes (Stirpe, et al., Biotechnology. 10 , 405-412 [1992]; Citores L. et al., FEBS Lett. 329 , 59-62 [1993]; Girbés et al., J Biol. Chem . 268 , 18195-18199 [1993]; Girbés et al., Plant Mol. Biol. 22 , 1181-1186 [1993]). Only some RIPs inhibit bacterial ribosomes (Girbes et al., J. Bacteriol. 175 , 6721-6724 [1993]). Inactivation consists in the release of an adenine from the major rRNA of the ribosome (Endo and Tsurugi, J.Biol.Chem. 262 , 8128-8130 [1987]; Stirpe et al. Nucleic Acid Res. 16 , 1349-1357 [1988] ).

Las RIPs poseen carácter antiviral contra virus animales y virus vegetales (Stirpe y cols., Biotechnology 10, 405-412 [1992]; Barbieri y cols., Biochim. Biophys. Acta 1154, 237-282 [1993]; Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad Sci.USA 91, 12208-12212 [1994]). Muy recientemente se ha encontrado que las RIPs poseen también per se carácter inactivador del virus ARN VIH-1 que es el agente etiológico del síndrome de inmunodefiencia adquirida [SIDA] (McGrath y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2844-2848 [1989]; Lee-Huang y cols. FEBS Lett. 272,12-18 [1990]; Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad Sci.USA 88,6570-6574 [1991]; Zarling y cols. Nature 347,92-95 [1990]; Olson y cols. AIDS Res.Hum.Retrov. 7, 1025-1030 [1991]; Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad Sci. USA 91, 12208-12212 [1994]). Los ensayos clínicos realizados con tricosantina (GLQ223) sobre enfermos de SIDA indican que la administración por infusiones repetidas de esta proteína antiviral inactivadora de ribosomas son seguras y relativamente bien toleradas y que promueven el incremento de la población de linfocitos CD4+ y CD8+ (Kahn y cols. Antimicrob. Agents CH. 38, 260-267 [1994]) y la disminución de la concentración de antígeno p24 (Byers y cols. AIDS 4, 1189-1196 [1990]). Por otro lado, la empresa Genelabs Technologies Inc. ha comunicado que va a acelerar el desarrollo de la tricosantina (GLQ223) para el SIDA y que ha iniciado discusiones con otras empresas con vistas a financiar el desarrollo y comercialización de la tricosantina (GLQ223) (AIDS Weekly 23 Mayo 1994).RIPs have antiviral character against animal viruses and plant viruses (Stirpe et al, Biotechnology 10, 405-412 [1992];. Barbieri et al, Biochim Biophys Acta 1154, 237-282 [1993];... Lee-Huang and cols. Proc. Natl. Acad Sci.USA 91 , 12208-12212 [1994]). Very recently it has been found that RIPs also have per se inactivating character of the HIV-1 RNA virus which is the etiologic agent of acquired immunodeficiency syndrome [AIDS] (McGrath et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 , 2844 -2848 [1989]; Lee-Huang et al. FEBS Lett. 272 , 12-18 [1990]; Lee-Huang et al. Proc. Natl. Acad Sci.USA 88 , 6570-6574 [1991]; Zarling et al. Nature 34 7.92-95 [1990]; Olson et al. AIDS Res.Hum.Retrov . 7 , 1025-1030 [1991]; Lee-Huang et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 91 , 12208- 12212 [1994]). Clinical trials conducted with tricosanthin (GLQ223) on AIDS patients indicate that administration by repeated infusions of this ribosome-inactivating antiviral protein is safe and relatively well tolerated and that it promotes an increase in the population of CD4 + and CD8 + lymphocytes (Kahn et al. Antimicrob. Agents CH . 38 , 260-267 [1994]) and decreased concentration of p24 antigen (Byers et al. AIDS 4 , 1189-1196 [1990]). On the other hand, Genelabs Technologies Inc. has reported that it will accelerate the development of tricosanthin (GLQ223) for AIDS and that it has initiated discussions with other companies with a view to financing the development and commercialization of tricosanthin (GLQ223) ( AIDS Weekly May 23, 1994 ).

El interés enorme de las RIPs reside en que se utilizan para los siguientes objetivos: 1) CONSTRUCCIÓN DE INMUNOTOXINAS PARA TERAPIA DEL CANCER (Vitetta y Uhr, Annu. Rev. Immunol. 3,197-212 [1985]; Frankel y cols. Annu.Rev.Med. 37, 125-142 [1986]; Koppel, Bioconj.Chem. 1, 13-23 [1990]; Lord, Plant Physiol. 85,1-3:, [1987]); 2) CONSTRUCCIÓN DE INMUNOTOXINAS PARA LA TERAPIA EXPERIMENTAL DEL SÍNDROME DE INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA, SIDA (Till y cols. Science 242, 1166-1168 [1988]; Ghetie y cols. Bioconj.Chem. 1, 24-31 [1990]); 3) UTILIZACIÓN DIRECTA COMO AGENTE ANTIVIRAL CONTRA EL VIH PARA LA TERAPIA EXPERIMENTAL DEL SÍNDROME DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA (McGrath y cols. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86, 2844-2848 [1989]; Lee-Huang y cols. FEBS Lett. 272,12-18 [1990]; Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad Sci. USA 88,6570-6574 [1991]; Zarling y cols. Nature 347, 92-95 [1990]; Olson y cols. AIDS Res. Hum. Retrov. 7 1025-1030 [1991]; Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad Sci. USA 91, 12208-12212 [1994]; Kahn y cols. Antimicrob. Agents CH. 38, 260-267 [1994]; AIDS Weekly 23 Mayo 1994); 4) como proteínas tóxicas para la creación de PLANTAS TRANSGÉNICAS RESISTENTES A VIRUS Y A HONGOS MEDIANTE LA INSERCIÓN DE GENES DE RIPs EN LAS PLANTAS CORRESPONDIENTES (Lodge y cols. Proc. Natl. Acad Sci. USA 90, 7089-7093 [1993]; Logemann y cols. Biotechnology 10, 305-308 [1992]; Zoubenko y cols., Nature Biotechnology, 15, 992-996 [1997]).The enormous interest of RIPs is that they are used for the following objectives: 1) CONSTRUCTION OF IMMUNOTOXINS FOR CANCER THERAPY (Vitetta and Uhr, Annu. Rev. Immunol. 3 , 197-212 [1985]; Frankel et al. Annu Rev. Med. 37 , 125-142 [1986]; Koppel, Bioconj.Chem . 1 , 13-23 [1990]; Lord, Plant Physiol . 85 , 1-3 :, [1987]); 2) CONSTRUCTION OF IMMUNOTOXINS FOR EXPERIMENTAL THERAPY OF THE ACQUIRED IMMUNODEFICIENCY SYNDROME, AIDS (Till et al. Science 242 , 1166-1168 [1988]; Ghetie et al. Bioconj.Chem. 1 , 24-31 [1990]); 3) DIRECT USE AS AN ANTIVIRAL AGENT AGAINST HIV FOR THE EXPERIMENTAL THERAPY OF THE HUMAN IMMUNODEFICIENCY SYNDROME (McGrath et al. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86 , 2844-2848 [1989]; Lee-Huang et al. FEBS Lett 272 , 12-18 [1990]; Lee-Huang et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 88 , 6570-6574 [1991]; Zarling et al. Nature 347 , 92-95 [1990]; Olson et al. . AIDS res Hum Retrovir 7 1025-1030 [1991];... Lee-Huang et al Proc Natl Acad Sci USA 91, 12208-12212 [1994];.... Kahn et al Antimicrob Agents CH 38,... 260-267 [1994]; AIDS Weekly May 23, 1994 ); 4) as toxic proteins for the creation of TRANSGENIC PLANTS RESISTANT TO VIRUSES AND FUNGI THROUGH THE INSERTING OF RIP GENES IN THE CORRESPONDING PLANTS (Lodge et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 90 , 7089-7093 [1993]; Logemann et al. Biotechnology 10 , 305-308 [1992]; Zoubenko et al., Nature Biotechnology , 15 , 992-996 [1997]).

Dado que las proteínas son sustancias antigénicas poderosas, para poder abordar cualquier tipo de terapia con ellas es necesario disponer de una batería de dichas toxinas lo más amplia posible con el objeto de seleccionar la menos inmunorreactiva por un lado y por otro de poder substituir la toxina o la parte tóxica de la inmunotoxina según se van desarrollando anticuerpos neutralizantes en el paciente. Además no todas estas toxinas proteicas poseen la misma citotoxicidad (Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,6570-6574 [1991]).Since proteins are powerful antigenic substances, in order to address any type of therapy with them it is necessary to have a battery of such toxins as wide as possible in order to select the least immunoreactive on the one hand and on the other to be able to replace the toxin or the toxic part of the immunotoxin as neutralizing antibodies develop in the patient. In addition, not all of these protein toxins have the same cytotoxicity (Lee-Huang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 , 6570-6574 [1991]).

La utilización de los genes de RIPs monocatenarias para la: construcción de plantas transgénicas resistentes a virus (Lodge y cols. Proc. Natl. Acad Sci. USA 90, 7089-7093 [1993]) y a hongos (Logemann y cols. Biotechnology 10, 305-308 [1992]), confiere al gen de la cadena A de la ebulina una importancia especial en la lucha contra los virus vegetales y hongos fitopatogénicos por un lado y contra virus animales (McGrath y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2844-2848 [1989]; Lee-Huang y cols. FEBS Lett.272,12-18 [1990]; Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad Sci. USA 88,6570-6574 [1991]; Zarling y cols. Nature 347, 92-95 [1990]; Olson y cols. AIDS Res.Hum.Retrov. 7, 1025-1030 [1991]; Lee-Huang y cols. Proc. Natl. Acad Sci. USA 91, 12208-12212 [1994]; Kahn y cols. Antimicrob. Agents CH. 38, 260-267 [1994]; AIDS Weekly 23 Mayo 1994), por otro.The use of single-stranded RIP genes for: construction of transgenic plants resistant to viruses (Lodge et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 90 , 7089-7093 [1993]) and fungi (Logemann et al. Biotechnology 10 , 305-308 [1992]), gives the Ebulin A chain gene a special importance in the fight against plant viruses and phytopathogenic fungi on the one hand and against animal viruses (McGrath et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86 , 2844-2848 [1989]; Lee-Huang et al. FEBS Lett . 272 , 12-18 [1990]; Lee-Huang et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 88 , 6570-6574 [1991 ]; Zarling et al Nature 347, 92-95 [1990];. Olson et al Res.Hum.Retrov AIDS 7, 1025-1030 [1991];...... Lee-Huang et al Proc Natl Acad Sci USA 91 , 12208-12212 [1994]; Kahn et al. Antimicrob. Agents CH . 38 , 260-267 [1994]; AIDS Weekly May 23, 1994 ), on the other.

Muscari armeniacum Miller contiene proteínas inactivadoras de ribosomas de tipo 1 denominadas musarminas, de las cuales se ha elucidado su estructura y la de los genes que las codifican (Arias y cols., Int. J. Biochem. Cell Biol. 35, 61-78 [2003]). Muscari armeniacum Miller contains inactivating proteins of type 1 ribosomes called musarmines, from which its structure and that of the genes that encode them have been elucidated (Arias et al., Int. J. Biochem. Cell Biol . 35 , 61-78 [2003]).

El uso clínico de las RIPs está limitado por la dificultad para disponer de suficiente cantidad de proteína activa y homogénea, ya que las preparaciones vegetales de partida contienen, por lo general, una mezcla de isoformas. Las RIPs recombinantes pueden ser una solución al problema anterior, pues garantizan una composición fija; además, su potencial terapéutico se puede mejorar introduciendo cambios en su secuencia mediante mutagénesis in vitro.The clinical use of RIPs is limited by the difficulty of having sufficient amount of active and homogeneous protein, since the starting vegetable preparations generally contain a mixture of isoforms. Recombinant RIPs may be a solution to the above problem, as they guarantee a fixed composition; In addition, its therapeutic potential can be improved by introducing changes in its sequence through in vitro mutagenesis.

En la expresión heteróloga de las RIPs se han utilizado varios sistemas. Entre ellos, el más empleado es la bacteria Escherichia coli. Sin embargo, estas bacterias presentan también varios inconvenientes, como la imposibilidad de realizar en ellas las modificaciones post-traduccionales que tienen lugar en células eucariotas, la falta de un mecanismo eficiente para la liberación de la proteína al medio de cultivo, la capacidad limitada para formar puentes disulfuro y la posible contaminación de la proteína recombinante con endotoxinas bacterianas.Several systems have been used in the heterologous expression of RIPs. Among them, the most used is the bacterium Escherichia coli . However, these bacteria also have several drawbacks, such as the impossibility of making post-translational modifications that take place in eukaryotic cells, the lack of an efficient mechanism for releasing the protein to the culture medium, the limited capacity to form disulfide bridges and the possible contamination of the recombinant protein with bacterial endotoxins.

A lo largo de la última década, se han expresado en Escherichia coli multitud de RIPs de tipo 1 y algunas cadenas A y B de RIPs de tipo 2. En muchas ocasiones, el vector de expresión incluye un péptido señal que permite la traslocación de la proteína a través de la membrana citoplasmática, para acumularse en el periplasma, o ser secretada, finalmente, al medio. En el diseño de RIPs recombinantes, se ha recurrido a las secuencias señales de las proteínas ompA (Habuka y cols., J Biol Chem. 265, 10988-92 [1990]) y pectato liasa de Erwinia carotovora (pelB) (Nolan y cols., Gene 134, 223-227 [1993]).Over the last decade, a multitude of type 1 RIPs and some A and B chains of type 2 RIPs have been expressed in Escherichia coli . On many occasions, the expression vector includes a signal peptide that allows translocation of the protein through the cytoplasmic membrane, to accumulate in the periplasm, or finally be secreted into the environment. In the design of recombinant RIPs, the signal sequences of ompA proteins (Habuka et al., J Biol Chem. 265 , 10988-92 [1990]) and Erwinia carotovora (pelB) lycta pectate (Nolan et al. ., Gene 134 , 223-227 [1993]).

La purificación de estas proteínas se ha efectuado a partir de las distintas fracciones celulares de la bacteria. La obtención de las RIPs recombinantes a partir del periplasma reduce la posibilidad de ataque proteolítico; por otro lado, el entorno oxidante facilita que se establezcan puentes disulfuro, y la liberación del péptido señal genera el verdadero extremo amino terminal de la proteína. Sin embargo, a las ventajas anteriores se contrapone un bajo rendimiento (Makrides, Microbiol. Rev. 60, 512-538 [1996]). Algunas RIPs se han purificado a partir del medio de cultivo, como es el caso de la gelonina, de la que se ha logrado obtener 1 mg/ml de medio en una producción a gran escala en un fermentador (Nolan y cols., Gene 134, 223-227 [1993]). Las proteínas recombinantes localizadas en el medio presentan : características similares a las aisladas a partir del periplasma, con la ventaja adicional de que son más abundantes (Makrides, Microbiol. Rev. 60, 512-538 [1996]).The purification of these proteins has been carried out from the different cell fractions of the bacteria. Obtaining recombinant RIPs from periplasm reduces the possibility of proteolytic attack; on the other hand, the oxidizing environment facilitates the establishment of disulfide bridges, and the release of the signal peptide generates the true amino terminal end of the protein. However, low performance is contrasted with the above advantages (Makrides, Microbiol. Rev. 60 , 512-538 [1996]). Some RIPs have been purified from the culture medium, such as gelonin, from which 1 mg / ml of medium has been obtained in a large-scale production in a fermenter (Nolan et al., Gene 134 , 223-227 [1993]). Recombinant proteins located in the medium have: characteristics similar to those isolated from periplasm, with the additional advantage that they are more abundant (Makrides, Microbiol. Rev. 60 , 512-538 [1996]).

Por otra parte, la extracción de las RIPs recombinantes de la fracción soluble total proporciona aún mayor cantidad de proteína; así, se han llegado a purificar 85 mg/l de la cadena A de ricina de este extracto (Li y cols., Protein Expr. Purif. 3, 386-394 [1992]). Sin embargo, este método no está exento de inconvenientes, como la mayor susceptibilidad de la proteína al ataque de proteolítico y la imposibilidad de formarse enlaces disulfuro (Makrides, Microbiol. Rev. 60, 512-538 [1996]).On the other hand, extracting the recombinant RIPs from the total soluble fraction provides even more protein; thus, 85 mg / l of the ricin A chain of this extract have been purified (Li et al., Protein Expr. Purif . 3 , 386-394 [1992]). However, this method is not without its drawbacks, such as the increased susceptibility of the protein to proteolytic attack and the inability to form disulfide bonds (Makrides, Microbiol. Rev. 60 , 512-538 [1996]).

Pero, sin duda, el mayor rendimiento en la producción de proteínas recombinantes se logra cuando éstas se acumulan en forma de agregados insolubles, denominados cuerpos de inclusión, en donde, además, están bastante protegidas frente a la degradación por proteasas; por ejemplo, a partir de estos agregados se han obtenido 100 mg/l de la RIP PD-L4 (Del Vecchio Blanco y cols., FEBS Lett. 437, 241-245 [1998]). Las principales desventajas de este procedimiento surgen de la necesidad de solubilizar, y replegar posteriormente, la proteína, lo que dificulta la recuperación de RIPs activas.But, undoubtedly, the highest yield in the production of recombinant proteins is achieved when they accumulate in the form of insoluble aggregates, called inclusion bodies, where, in addition, they are quite protected against degradation by proteases; for example, from these aggregates 100 mg / l of the RIP PD-L4 (Del Vecchio Blanco et al., FEBS Lett. 437 , 241-245 [1998]) have been obtained. The main disadvantages of this procedure arise from the need to solubilize, and subsequently replicate, the protein, which makes it difficult to recover active RIPs.

Una de las mayores limitaciones de este sistema de expresión radica en la dificultad para producir aquellas RIPS que son activas sobre ribosomas de E.coli, ya que o resultan letales para la bacteria o bien frenan su crecimiento. En este grupo de proteínas se encuentran, entre otras, la MAP (Kataoka y cols., J. Biol. Chem. 266, 8426-8430 [1991]), PAP y la RIP de Dianthus sinensis (Cho y cols., Mol. Cells 10, 135-141 [2000]). Su producción en la fracción soluble es mínima: así, de MAP se logran recuperar 3,6 \mug/l medio (Habuka y cols., J. Biol. Chem. 264, 6629-6637 [1989]) y de PAP 1,7 mg/l (Kataoka y cols., FEBS Lett 320, 31-4 [1993]). Una estrategia para reducir el efecto tóxico consiste en restringir la expresión del gen de la RIP hasta que las células crezcan suficientemente, y secretar del citoplasma la proteína producida, tal y como se realizó con MAP; aun así, esta RIP siguió interfiriendo sobre el crecimiento de E.coli, por lo que sólo se lograron obtener 140 \mug/l de proteína a partir del medio de cultivo (Habuka y cols., J. Biol. Chem. 265, 10988-10992 [1990]). En otras ocasiones, se ha forzado la sobreexpresión de la RIP a temperaturas elevadas para lograr su agregación rápida en forma de cuerpos de inclusión, evitando su interacción con los ribosomas bacterianos; de este modo, se han producido 10-12 mg/1 de PAP (Rajamohan y cols., Protein Expr. Purif. 16, 359-368 [1999]).One of the major limitations of this expression system is the difficulty in producing those RIPS that are active on E. coli ribosomes, since they are lethal to the bacteria or slow their growth. In this group of proteins are, among others, MAP (Kataoka et al., J. Biol. Chem . 266 , 8426-8430 [1991]), PAP and the RIP of Dianthus sinensis (Cho et al., Mol. Cells 10 , 135-141 [2000]). Its production in the soluble fraction is minimal: thus, MAP is able to recover 3.6 µl / l medium (Habuka et al., J. Biol. Chem . 264 , 6629-6637 [1989]) and PAP 1, 7 mg / l (Kataoka et al., FEBS Lett 320 , 31-4 [1993]). A strategy to reduce the toxic effect is to restrict the expression of the RIP gene until the cells grow sufficiently, and secrete the protein produced from the cytoplasm, as was done with MAP; even so, this RIP continued to interfere with the growth of E.coli , so that only 140 µg / l of protein was obtained from the culture medium (Habuka et al., J. Biol. Chem. 265 , 10988 -10992 [1990]). On other occasions, overexpression of RIP has been forced at elevated temperatures to achieve rapid aggregation in the form of inclusion bodies, avoiding their interaction with bacterial ribosomes; thus, there have been 10 to 12 mg / 1 of PAP (Rajamohan et al., Protein Expr. Purif. 16, 359-368 [1999]).

Las RIPS recombinantes de tipo 1 y las cadenas A recombinantes de las RIPS diméricas mantienen la actividad N-glicosidasa de sus homólogas nativas, y presentan la misma capacidad que aquéllas para inhibir la síntesis proteica, o incluso pueden resultar ligeramente más activas, como la gelonina (Rosenblum y cols., J. Interferon Cytokine Res. 15, 547-555 [1995]). Esta propiedad se cumple también en el caso de que la correspondiente RIP de la planta contuviese restos glucídicos, con lo que se ha comprobado que la glicosilación no afecta la actividad in vitro de la cadena catalítica (Eck y cols., Eur. J. Biochem. 264, 775-784 [1999]). La citotoxicidad de las proteínas recombinantes en las distintas líneas celulares es también comparable a la de las RIPs nativas (den Hartog y cols., Eur. J.Biochem. 269, 1772-1779 [2001]). Estas RIPs mantienen, además, la misma estructura que las silvestres (Legname y cols., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1, 61-68 [1995]), y conservan algunas de sus características específicas, como la actividad anti-HIV en el caso de la PAP (Rajamohan y cols., Protein Expr. Purif. 16, 359-368 [1999]) o la capacidad abortiva, en el caso de la tricosantina (Zhu y cols., Int. J. Peptide Protein Res. 39, 77-81 [1992]).Type 1 recombinant RIPS and dimeric RIPS recombinant A chains maintain the N-glycosidase activity of their native counterparts, and have the same ability as those to inhibit protein synthesis, or may even be slightly more active, such as gelonin (Rosenblum et al., J. Interferon Cytokine Res. 15 , 547-555 [1995]). This property is also met in the event that the corresponding RIP of the plant contained glycidic residues, which has shown that glycosylation does not affect the in vitro activity of the catalytic chain (Eck et al., Eur. J. Biochem . 264, 775-784 [1999]). The cytotoxicity of recombinant proteins in different cell lines is also comparable to that of native RIPs (den Hartog et al., Eur. J. Biochem . 269 , 1772-1779 [2001]). These RIPs also maintain the same structure as the wild ones (Legname et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1 , 61-68 [1995]), and retain some of their specific characteristics, such as anti-HIV activity in the case of PAP (Rajamohan et al., Protein Expr. Purif . 16 , 359-368 [1999]) or abortive capacity, in the case of tricosanthin (Zhu et al., Int. J. Peptide Protein Res . 39 , 77-81 [1992]).

También se ha llevado a cabo la expresión de las cadenas B de algunas RIPs de tipo 2, como la ricina (Hussain y cols., FEBS Lett, 244, 383-387 [1989]) y la viscumina (Eck y cols., Eur. J. Biochem. 265, 788-797 [1999]), donde se ha detectado que la ausencia de YY restos glucídicos provoca cierta alteración en la actividad lectina.The expression of the B chains of some type 2 RIPs, such as ricin (Hussain et al., FEBS Lett, 244 , 383-387 [1989]) and viscumin (Eck et al., Eur) has also been carried out. . J. Biochem. 265, 788-797 [1999]), where it has been detected that the absence of sugar moieties YY causes some change in the lectin activity.

Se han empleado levaduras para obtener cadenas polipeptídicas glicosiladas o proteínas con puentes disulfuro. Tal es el caso de la cadena B de ricina, expresada en Saccharomyces cerevisiae, que se aisló como proteína soluble y replegada en una conformación activa (Richardson y cols., Biochim. Biophys. Acta 950, 385-394 [1988]). En este mismo sistema, la expresión de algunas RIPs de tipo 1, como la PAP (Hur y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8448-8452 [19951), o la cadena A de ricina (Frankel, A. y cols., Mol.Cell Biol. 9, 415-420 [1989]), resultó letal. Aprovechando este hecho, las Saccharomyces cerevisiae se han utilizado para analizar la importancia de aminoácidos concretos en la actividad de la RIP, mediante la selección de mutaciones que inactivan la toxina y permiten, así, el crecimiento de la levadura (Hur y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8448-8452 [1995]).Yeasts have been used to obtain glycosylated polypeptide chains or proteins with disulfide bridges. Such is the case of the B chain of ricin, expressed in Saccharomyces cerevisiae , which was isolated as a soluble protein and replicated in an active conformation (Richardson et al., Biochim. Biophys. Acta 950 , 385-394 [1988]). In this same system, the expression of some type 1 RIPs, such as PAP (Hur et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 , 8448-8452 [19951), or ricin A chain (Frankel, A. et al., Mol.Cell Biol . 9 , 415-420 [1989]), was lethal. Taking advantage of this fact, Saccharomyces cerevisiae have been used to analyze the importance of specific amino acids in the activity of RIP, by selecting mutations that inactivate the toxin and thus allow the growth of yeast (Hur et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 92 , 8448-8452 [1995]).

Otros organismos eucariontes a los que se ha recurrido para la expresión de RIPs son las plantas, sistemas en los que es más factible lograr un procesamiento correcto de las prepro-RIPs, y la glicosilación se asemeja más a la de las proteínas nativas. Además, las células vegetales permiten la asociación adecuada de las cadenas polipeptídicas para originar estructuras complejas, así como el estudio del tráfico intracelular de estas proteínas (Frigerio y cols., J. Biol. Chem. 273, 14194-14199 [1998]; Di Cola y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 14726-14731 [2001]).Other eukaryotic organisms that have been used for the expression of RIPs are plants, systems in which it is more feasible to achieve correct processing of prepro-RIPs, and glycosylation is more similar to that of native proteins. In addition, plant cells allow the proper association of polypeptide chains to cause complex structures, as well as the study of intracellular trafficking of these proteins (Frigerio et al., J. Biol. Chem . 273 , 14194-14199 [1998]; Di Cola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 , 14726-14731 [2001]).

La expresión de RIPs en sistemas vegetales se ha empleado tanto para la generación de plantas resistentes a patógenos como para la producción a gran escala de estas proteínas. En el caso de las RIPs de semillas de cereales, como la RIP de la cebada (Logemann y cols., BioTechnology 10, 205-308 [1992]) y la RIP b-32 del maíz (Kim y cols., Molecular Breeding 5, 85-94 [1999]), se han alcanzado niveles altos de expresión en tabaco transgénico y en cultivo de arroz. Además, en estos casos, las plantas huésped se conservan fenotípicamente sanas. Finalmente, las RIPs también se pueden producir a partir de cultivos de células vegetales. Así, se han obtenido 30 mg/1 de cultivo briodina 1 activa en un cultivo de células de tabaco (Francisco y cols., Bioconjug. Chem. 8, 708-713 [1997]).The expression of RIPs in plant systems has been used both for the generation of pathogen-resistant plants and for the large-scale production of these proteins. In the case of cereal seed RIPs, such as barley RIP (Logemann et al., BioTechnology 10 , 205-308 [1992]) and RIP b-32 corn (Kim et al., Molecular Breeding 5 , 85-94 [1999]), high levels of expression have been achieved in transgenic tobacco and in rice cultivation. In addition, in these cases, the host plants remain phenotypically healthy. Finally, RIPs can also be produced from plant cell cultures. Thus, 30 mg / 1 of active briodine 1 culture have been obtained in a tobacco cell culture (Francisco et al., Bioconjug. Chem . 8 , 708-713 [1997]).

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

La presente invención, tal y como se indica en su enunciado, se refiere al procedimiento de obtención de la proteína recombinante musarmina 4 a partir de las fracciones soluble e insoluble de los extractos proteicos de Escherichia coli y a sus aplicaciones en el campo de la construcción de inmunotoxinas conteniendo la musarmina 4 recombinante, o un fragmento de la misma, para la terapia sobre células blanco.The present invention, as indicated in its statement, refers to the method of obtaining the recombinant musarmine 4 protein from the soluble and insoluble fractions of Escherichia coli protein extracts and their applications in the field of construction of immunotoxins containing recombinant musarmine 4, or a fragment thereof, for white cell therapy.

El procedimiento general para la obtención de la proteína recombinante y, como ejemplo de su utilización como inmunotoxina de la presente invención, la construcción de la inmunotoxina anti-CD105 humana, comprende varias operaciones divididas en 4 etapas:The general procedure for obtaining the recombinant protein and, as an example of its use as immunotoxin of the present invention, the construction of the human anti-CD105 immunotoxin, comprises several operations divided into 4 stages:

1^{era} etapa: Inserción del gen de musarmina 4 recombinante en el vector de expresión. A partir del DNA que codifica para la musarmina 4 se amplifica un fragmento menor que tras ser clonado y secuenciado se inserta en el vector de expresión bacteriano pET25 (+).1st stage: Insertion of the musarmine 4 gene recombinant in the expression vector. From the DNA that encodes for musarmine 4 a fragment smaller than after being cloned and sequenced it is inserted into the vector of bacterial expression pET25 (+).

2ª etapa: Expresión de la musarmina 4 recombinante en E. coli. Con el plásmido recombinante que contiene el gen de la musarmina 4 modificado se transforman dos cepas de E. coli y se induce la expresión de la proteína recombinante. Se selecciona la cepa más productiva y se aísla la musarmina 4 recombinante a partir de las fracciones soluble e insoluble mediante técnicas cromatográficas.2nd stage: Expression of recombinant musarmine 4 in E. coli . Two E. coli strains are transformed with the recombinant plasmid containing the modified musarmine 4 gene and expression of the recombinant protein is induced. The most productive strain is selected and recombinant musarmine 4 is isolated from the soluble and insoluble fractions by chromatographic techniques.

3ª etapa: Preparación de la inmunotoxina conteniendo la musarmina 4 recombinante y el anticuerpo 44G4 dirigido contra el antígeno de superficie CD105 humano. Se derivatizan con un agente ligante el anticuerpo monoclonal 44G4 y la musarmina 4 recombinante aislada de la fracción soluble. Se conjugan ambas proteínas y la inmunotoxina resultante se purifica por cromatografía y se caracteriza electroforéticamente.3rd stage: Preparation of immunotoxin containing recombinant musarmine 4 and 44G4 antibody directed against the human CD105 surface antigen. Be derivatize the 44G4 monoclonal antibody with a binding agent and recombinant musarmin 4 isolated from the soluble fraction. Be both proteins conjugate and the resulting immunotoxin is purified by chromatography and electrophoretically characterized.

4ª etapa: Estudio de la actividad de la musarmina 4 recombinante y de la inmunotoxina. Se analiza la actividad N-glicosidasa de las formas soluble e insoluble de la musarmina 4 recombinante, aisladas de las fracciones soluble e insoluble respectivamente, y se cuantifica la capacidad inhibidora de la síntesis proteínas de las mismas, así como de la musarmina 4 recombinante derivatizada y de la inmunotoxina. Por último, se cuantifica el efecto citotóxico de la inmunotoxina y la musarmina 4 recombinante sobre células de fibroblastos de ratón L929 parentales y transfectadas con el gen de CD105 humana.4th stage: Study of musarmin activity 4 recombinant and immunotoxin. Activity is analyzed N-glycosidase of the soluble and insoluble forms of recombinant musarmine 4, isolated from soluble fractions and insoluble respectively, and the inhibitory capacity is quantified of the protein synthesis thereof, as well as musarmine 4 derivatized recombinant and immunotoxin. Finally quantifies the cytotoxic effect of immunotoxin and musarmin 4 recombinant on parental L929 mouse fibroblast cells and transfected with the human CD105 gene.

Descripción de las figurasDescription of the figures Figura 1Figure 1 Análisis de la expresión de la musarmina 4 recombinante en las cepas BL21(DE3) y BL21(DE3) pLysS. Localización celular de la musarmina 4 recombinante en BL21(DE3) pLysSAnalysis of the expression of recombinant musarmine 4 in the strains BL21 (DE3) and BL21 (DE3) pLysS. Location recombinant musarmine 4 cell in BL21 (DE3) pLysS

Panel A (A): SDS-PAGE +2ME al 15% correspondiente a 10 \mul de extractos proteicos totales de colonias transformantes inducidas (1-6) o de colonias no transformadas (-). El triángulo negro marca la altura en el gel de la banda correspondiente a la musarmina 4 recombinante.Panel A (A): 15% SDS-PAGE + 2ME corresponding to 10 µl of total protein extracts from induced transforming colonies (1-6) or from non-transformed colonies (-) . The black triangle marks the height in the gel of the band corresponding to the recombinant musarmine 4.

Panel B (B): SDS-PAGE al 15% de 10 \mul del extracto proteico total (total), 50 \mug de la fracción soluble (soluble) y de una alícuota de los cuerpos de inclusión (c.incl.) de una colonia de BL21(DE3) pLysS recombinante inducida. Se incluye un control negativo (-). Las flechas y los números indican la posición y el tamaño (en kDa) de los marcadores (M).Panel B (B): 15% SDS-PAGE of 10 µl of the total (total) protein extract, 50 µg of the soluble (soluble) fraction and an aliquot of the inclusion bodies (c.incl.) Of a colony of recombinant BL21 (DE3) induced pLysS . A negative control (-) is included. The arrows and numbers indicate the position and size (in kDa) of the markers (M).

Panel C (C): Inmunoblot de las muestras anteriores con el policlonal frente a Musarmina 2 nativa. Se cargaron 5 \mul del extracto total de una colonia inducida (total) y de otra no inducida (t=0), una alícuota de los cuerpos de inclusión y 15 \mug de la fracción soluble.Panel C (C): Immunoblot of the previous samples with the polyclonal against native Musarmina 2 . 5 µl of the total extract of an induced (total) and an uninduced colony (t = 0), an aliquot of the inclusion bodies and 15 µg of the soluble fraction were charged.

Figura 2Figure 2 Purificación de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción solublePurification of recombinant musarmine 4 from the soluble fraction

Panel A (A): Purificación de musarmina 4 recombinante mediante CM-Sepharose FF. En el cromatograma la línea discontinua representa el gradiente salino y la barra horizontal señala las fracciones correspondientes a la musarmina 4 recombinante.Panel A (A): Purification of recombinant musarmine 4 by CM-Sepharose FF . In the chromatogram the dashed line represents the saline gradient and the horizontal bar indicates the fractions corresponding to recombinant musarmine 4.

Panel B (B): Purificación del pico anterior mediante Superdex 75. La barra horizontal señala las fracciones correspondientes a la musarmina 4 recombinante.Panel B (B): Purification of the anterior peak by Superdex 75 . The horizontal bar indicates the fractions corresponding to recombinant musarmine 4.

En la figura se muestran también las SDS-PAGE al 15%(p/v) en condiciones reductoras de 50 \mug de la muestra de partida o extracto soluble acidificado (sol.ac.), 30 \mug del pico de CM-Sepharose (CM) (Panel A), y 10 \mug del pico de Superdex 75 (Panel B). Las líneas y los números indican la posición y el tamaño (en kDa) de los marcadores. Se incluyen, asimismo, los western-blot (W.blot) con el policlonal anti-Mu2 nativa correspondientes a las muestras anteriores. Se cargaron 5 \mug de sol.ac. y de CM, y 2\mug de S-75.The figure also shows 15% SDS-PAGE (w / v) under reducing conditions of 50 µg of the starting sample or acidified soluble extract (sol.ac.), 30 µg of the CM-Sepharose peak (CM) ( Panel A ), and 10 µg of the Superdex 75 peak ( Panel B ). The lines and numbers indicate the position and size (in kDa) of the markers. Also included are western blots (W. bot) with the native anti-Mu2 polyclonal corresponding to the previous samples. 5 \ mug of sol.ac. and of CM, and 2 \ mug of S-75.

Figura 3Figure 3 Purificación de la musarmina 4 recombinante procedente de cuerpos de inclusión mediante cromatografía en CM-Sepharose FFPurification of recombinant musarmine 4 from inclusion bodies by chromatography on CM-Sepharose FF

Panel A (A): Perfil cromatográfico del proceso. La línea discontinua representa el gradiente salino y la barra horizontal señala las fracciones correspondientes a la musarmina 4 recombinante.Panel A (A): Chromatographic profile of the process . The dashed line represents the saline gradient and the horizontal bar indicates the fractions corresponding to recombinant musarmine 4.

Panel B (B): SDS-PAGE al 15% correspondiente a la purificación. Se cargaron 30 \mug de los cuerpos de inclusión de partida solubilizados (c.incl. inicial) y 30 \mug del pico correspondiente a la musarmina 4 recombinante en la cromatografía (c.incl.CM). Las líneas y los números indican la posición y el tamaño (en kDa) de los marcadores.Panel B (B): 15% SDS-PAGE corresponding to purification . 30 µg of the solubilized starting inclusion bodies (c.incl. Initial) and 30 µg of the peak corresponding to recombinant musarmine 4 were loaded on chromatography (c.incl.CM). The lines and numbers indicate the position and size (in kDa) of the markers.

Panel C (C): Inmunoblot con anti-musarmina 2 nativa de las muestras anteriores. Se cargaron 5 \mul de los cuerpos de inclusión iniciales y 2 \mug del pico purificado de CM-Sepharose.Panel C (C): Immunoblot with anti-musarmine 2 native to the previous samples . 5 µl of the initial inclusion bodies and 2 µg of the purified CM-Sepharose peak were loaded.

Figura 4Figure 4 Separación de la inmunotoxina (44G4-rMu4) formada por el anticuerpo monoclonal 44G4 y la musarmina 4 recombinante por filtración en Sephacryl S-200 HiloadImmunotoxin separation (44G4-rMu4) formed by monoclonal antibody 44G4 and musarmine 4 recombinant by filtration in Sephacryl S-200 Hiload

Las fracciones eluidas se registraron espectrofotométricamente a 280 nm.The eluted fractions were recorded spectrophotometrically at 280 nm.

A y B (Ve=135-150 ml) = polímero de anticuerpo y conjugado de alto peso molecular; C= conjugado de bajo peso molecular (Ve=150-170 ml); D= anticuerpo libre (Ve=170-190 ml); F= trímero de musarmina 4 recombinante (Ve=200-215 ml); G= dímero de musarmina 4 recombinante (Ve=215-235 ml); H= monómero de musarmina 4 recombinante (Ve=240-260 ml).A and B (Ve = 135-150 ml) = polymer of antibody and high molecular weight conjugate; C = conjugate of low molecular weight (Ve = 150-170 ml); D = antibody free (Ve = 170-190 ml); F = musarmine trimer 4 recombinant (Ve = 200-215 ml); G = musarmine dimer 4 recombinant (Ve = 215-235 ml); H = monomer of Recombinant musarmine 4 (Ve = 240-260 ml).

Las fracciones recogidas se indican mediante una barra horizontal.The collected fractions are indicated by a horizontal bar

Figura 5Figure 5 Electroforesis en condiciones no reductoras de las fracciones resultantes de la cromatografía de la inmunotoxina mAb 44G4-rMu4 en Sephacryl S-200Electrophoresis in non-reducing conditions of the fractions resulting from mAb immunotoxin chromatography 44G4-rMu4 in Sephacryl S-200

Se utilizaron geles de distintos porcentajes de acrilamida (indicados debajo de cada imagen), según el tamaño de las proteínas objeto de análisis. Las letras en negrita hacen referencia a las regiones del cromatograma (Figura 4). Los volúmenes de elución de estas fracciones, en el caso de las regiones C y D son: C= 150-170 ml, D_{1}=170-175 ml, D_{2}=175-180 ml, D_{3}=180-185 ml. Se analizaron 4 \mug de H (Panel C), 10 \,ugg de G, F (Panel B), 10 \mug del monoclonal 44G4, que se emplearon como referencia, y 20 \mug de cada una de las fracciones de D-B (Panel A). Las líneas y los números indican la posición y el tamaño (en kDa) de los marcadores.Gels of different percentages of acrylamide (indicated below each image) were used, depending on the size of the proteins under analysis. Bold letters refer to the regions of the chromatogram (Figure 4). The elution volumes of these fractions, in the case of regions C and D are: C = 150-170 ml, D 1 = 170-175 ml, D 2 = 175-180 ml, D 3 = 180-185 ml. 4 µg of H ( Panel C ), 10 µg of G, F ( Panel B ), 10 µg of monoclonal 44G4, which were used as reference, and 20 µg of each of the DB fractions were analyzed ( Panel A ). The lines and numbers indicate the position and size (in kDa) of the markers.

Figura 6Figure 6 Electroforesis en geles de acrilamida de la inmunotoxina mAb 44G4-rMu4Electrophoresis in mAb immunotoxin acrylamide gels 44G4-rMu4

Panel A (A): SDS-PAGE al 7,5% (p/v) en condiciones no. Se cargaron 35 \mug del conjugado. En el lado izquierdo de la fotografía, las flechas y números indican la posición y la estequeometría (mol rMu4:mol 44G4) de los distintos conjugados.Panel A (A): 7.5% SDS-PAGE (w / v) under conditions no . 35 µg of the conjugate was loaded. On the left side of the photograph, the arrows and numbers indicate the position and the stocheometry (mol rMu4: mol 44G4) of the different conjugates.

Panel B (B): SDS-PAGE al 18% (p/v) en condiciones reductoras. Se cargaron 15 \mug de la inmunotoxina (IT). Como referencia, se emplearon 10 \mug de 44G4 y 4\mug de musarmina 4 recombinante (rMu4). En ambos paneles, las líneas y números a la derecha de las imágenes indican la posición y tamaño (kDa) de los marcadores.Panel B (B): 18% SDS-PAGE (w / v) under reducing conditions . 15 µg of the immunotoxin (IT) was loaded. As a reference, 10 µg of 44G4 and 4 µg of recombinant musarmine 4 (rMu4) were used. In both panels, the lines and numbers to the right of the images indicate the position and size (kDa) of the markers.

Figura 7Figure 7 Actividad N-glicosidasa de la musarmina 4 recombinante sobre el rRNA de lisado de reticulocitos de conejoN-glycosidase activity of musarmine 4 recombinant on the reticulocyte lysate rRNA of rabbit

Cada calle corresponde a 7 \mug de RNA. (control -)=controles negativos, en los que no se ha incubado con toxina; (rMu4 soluble)=incubación del lisado con musarmina 4 recombinante purificada de fracción soluble; (rMu4 c.incl.solubiliz.)=incubación con musarmina 4 recombinante procedente de cuerpos de inclusión solubilizados y replegados; (SAP-S5)=controles positivos, en los que se ha realizado una incubación con saporina S5. Las flechas y números a la derecha de la imagen indican, respectivamente, la posición y tamaño (nº de bases) de los marcadores (M). Las flechas a la izquierda de la imagen señalan la liberación del fragmento diagnóstico tras el tratamiento con anilina ácida o marcan la altura de las bandas correspondientes a los rRNA 28S y 18S en el gel.Each street corresponds to 7 µg of RNA. (control -) = negative controls, in which it has not been incubated with toxin; (soluble rMu4) = incubation of lysate with musarmine 4 purified recombinant soluble fraction; (rMu4 c.incl.solubiliz.) = incubation with recombinant musarmine 4 from solubilized and folded inclusion bodies; (SAP-S5) = positive controls, in which performed an incubation with saporin S5. Arrows and numbers to the right of the image indicate, respectively, the position and size (number of bases) of the markers (M). The arrows to the left of the image indicate the release of the fragment diagnosis after treatment with acid aniline or mark height of the bands corresponding to rRNA 28S and 18S in the gel.

Figura 8Figure 8 Efecto de la inmunotoxina mAb 44G4-rMu4 sobre la viabilidad celular en fibroblastos de ratón L929Effect of immunotoxin mAb 44G4-rMu4 on the cell viability in L929 mouse fibroblasts

Panel A (A): Fibroblastos de ratón transfectados con S-endoglina humana (L929-S).Panel A (A): Mouse fibroblasts transfected with human S-endoglin (L929-S) .

Panel B (B): Línea parental de fibroblastos de ratón (L929).Panel B (B): Parental line of mouse fibroblasts (L929) .

La viabilidad celular está referida a los controles, realizados en ausencia de RIP y de inmunotoxina. Los valores son media de los datos provenientes de tres experimentos distintos \pm SEM. En cada experimento individual cada punto se analiza por triplicado.Cell viability refers to the controls, performed in the absence of RIP and immunotoxin. The values are average of the data coming from three experiments different ± SEM. In each individual experiment each point is analyze in triplicate.

Modos de realizar la invenciónWays of carrying out the invention

Los varios aspectos de la invención se describen con el siguiente ejemplo que no intenta limitar en modo alguno la invención. El ejemplo se desglosa en las siguientes operaciones divididas en 4 etapas:The various aspects of the invention are described. with the following example that does not attempt to limit the invention. The example is broken down into the following operations divided into 4 stages:

1^{era} etapa: Inserción del gen de musarmina 4 en el vector de expresión.1st stage: Insertion of the musarmine 4 gene In the expression vector.

comprende las siguientes 14 operaciones:It comprises the following 14 operations:

a) Amplificación del ADNc que codifica a la musarmina 4 recombinante por técnicas de PCR.a) Amplification of the cDNA encoding the Recombinant musarmine 4 by PCR techniques.

b) Análisis por electroforesis en geles de agarosa del ADN amplificado por PCR que codifica a la musarmina 4 recombinante.b) Electrophoresis analysis in gels of PCR-amplified DNA agarose encoding musarmin 4 recombinant

c) Introducción en el vector de clonación del ADN que codifica a la cadena de la musarmina 4 recombinante.c) Introduction into the DNA cloning vector which encodes the recombinant musarmine 4 chain.

d) Transformación de células de Escherichia coli con el vector recombinante que contiene el ADN que codifica la musarmina 4 recombinante.d) Transformation of Escherichia coli cells with the recombinant vector containing the DNA encoding the recombinant musarmine 4.

e) Aislamiento y análisis de las colonias con plásmidos recombinantes del ADN que codifica a la musarmina 4 recombinante.e) Isolation and analysis of colonies with Recombinant plasmids of the DNA encoding musarmin 4 recombinant

f) Secuenciación de los plásmidos con inserto del ADN que codifica a la musarmina 4 recombinante.f) Sequencing of plasmids with insert of DNA encoding recombinant musarmine 4.

g) Producción del fragmento de ADN que codifica a la musarmina 4 recombinante digerido con las enzimas de restricción Nde I y Hind III.g) Production of the DNA fragment encoding recombinant musarmine 4 digested with restriction enzymes Nde I and Hind III.

h) Análisis y purificación del producto de digestión que codifica a la musarmina 4 recombinante por electroforesis en geles de agarosa.h) Analysis and purification of the product of digestion encoding recombinant musarmin 4 by agarose gel electrophoresis.

i) Producción del vector de expresión digerido con las enzimas NdeI y Hind III.i) Production of the digested expression vector with the enzymes NdeI and Hind III.

j) Análisis y purificación del producto de digestión del plásmido pET25(+) por electroforesis en geles de agarosa.j) Analysis and purification of the product of plasmid digestion pET25 (+) by electrophoresis in gels of agarose

k) Inserción del fragmento de ADN de la musarmina 4 recombinante en el vector de expresión pET25(+) digerido.k) Insertion of the DNA fragment of musarmine 4 recombinant in the digested expression vector pET25 (+).

l) Transformación de células de Escherichia coli con el vector recombinante que contiene el ADN que codifica la musarmina 4 recombinante.l) Transformation of Escherichia coli cells with the recombinant vector containing the DNA encoding the recombinant musarmine 4.

m) Aislamiento y análisis de las colonias con plásmidos recombinantes del ADN que codifica para la musarmina 4 recombinante.m) Isolation and analysis of colonies with recombinant plasmids of DNA encoding musarmin 4 recombinant

n) Transformación de células de Escherichia coli con el vector de expresión recombinante que contiene el ADN que codifica la musarmina. 4 recombinante.n) Transformation of Escherichia coli cells with the recombinant expression vector containing the DNA encoding musarmine. 4 recombinant.

2ª etapa: Expresión de la musarmina 4 recombinante en E. coli. con las operaciones siguientes:2nd stage: Expression of recombinant musarmine 4 in E. coli . with the following operations:

a) Estudio sobre la localización celular.a) Study on cell location.

b) Producción de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción soluble.b) Production of recombinant musarmine 4 a from the soluble fraction.

c) Purificación de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción soluble.c) Purification of recombinant musarmine 4 a from the soluble fraction.

d) Producción de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción insoluble.d) Production of recombinant musarmine 4 a from the insoluble fraction.

e) Purificación de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción insoluble.e) Purification of recombinant musarmine 4 a from the insoluble fraction.

3ª etapa: Preparación de la inmunotoxina 44G4-rmusarmina4.3rd stage: Preparation of immunotoxin 44G4-rmusramine4.

dividida en los siguientes pasos:divided into the following steps:

a) Derivatización del anticuerpo monoclonal 44G4.a) Derivatization of the monoclonal antibody 44G4.

b) Derivatización de la RIP musarmina 4 recombinante.b) Derivatization of RIP musarmine 4 recombinant

c) Reducción de la RIP y reacción de conjugación.c) RIP reduction and reaction of conjugation.

d) Determinación de la masa molecular relativa de la inmunotoxina 4G4-musarmina 4 recombinante por electroforesis en geles de poliacrilamida.d) Determination of the relative molecular mass of recombinant 4G4-musarmine 4 immunotoxin by electrophoresis in polyacrylamide gels.

e) Determinación de la relación molar por densitometría.e) Determination of the molar ratio by densitometry

4ª etapa: Estudio de la actividad de las toxinas e inmunotoxina.4th stage: Study of the activity of toxins and immunotoxin.

a) Estudio de la actividad inhibidora de la síntesis de proteínas en lisado de reticulocitos de conejo dirigida por mensajero exógeno.a) Study of the inhibitory activity of protein synthesis in directed rabbit reticulocyte lysate by exogenous messenger.

b) Actividad N-glicosidasa de las proteínas inactivadoras de ribosomas.b) N-glycosidase activity of the inactivating ribosome proteins.

c) Cultivo de células animales.c) Culture of animal cells.

d) Efecto citotóxico de la inmunotoxina 44G4-musarmina 4 recombinante y la musarmina 4 recombinante.d) Cytotoxic effect of immunotoxin 44G4-recombinant musarmine 4 and musarmine 4 recombinant

Ejemplo Example

Primera etapaFirst stage

Inserción del gen de musarmina 4 en el vector de expresiónInsertion of the musarmine 4 gene into the expression vector a) Amplificación del ADNc que codifica a la musarmina 4 recombinante por técnicas de PCRa) Amplification of the cDNA encoding musarmin 4 recombinant by PCR techniques

El ADNc que codifica el marco de lectura completo de la musarmina 4 y el 5'UTR insertado en el vector de clonación pUC18 (Amersham Pharmacia Biotech) se amplificó utilizando como cebadores dos oligonucleótidos sintéticos:The cDNA encoding the complete reading frame of musarmin 4 and 5'UTR inserted in the cloning vector pUC18 (Amersham Pharmacia Biotech) was amplified using as primers two synthetic oligonucleotides:

1-. Oligonucleótido del extremo 5' diseñado a partir del aminoácido 21 de la proteína codificada por el gen de la musarmina 4 con un extremo 5' que introduce el sitio de corte de la enzima Nde I y 9 nucleótidos más complementarios a la secuencia del gen:one-. 5 'end oligonucleotide designed to from amino acid 21 of the protein encoded by the gene of the musarmina 4 with a 5 'end that introduces the cutting site of the Nde I enzyme and 9 nucleotides more complementary to the sequence of the gene:

5'ATC GTC GCC CAT ATG GCC GGC CAA GAC TTT CTT ACG GTG 3'5'ATC GTC GCC CAT ATG GCC GGC CAA GAC TTT CTT ACG GTG 3 '

2-. Oligonucleótido del extremo 3' antisentido y complementario a la, secuencia posterior al codón de terminación del gen de la musarmina 4 que incluye la secuencia de corte de la enzima Hind III:2-. 3 'antisense end oligonucleotide and complementary to the, sequence following the termination codon of the musarmine 4 gene that includes the cutting sequence of the Hind III enzyme:

5'AGT GAA AGG TGG CCT AAC GCA TCA AGC TTA AG 3'5'AGT GAA AGG TGG CCT AAC GCA TCA AGC TTA AG 3'

La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen de 100 \mul que contenía 100 ng de plásmido, 10 mM Tris\cdotHCl (pH 8,6), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl_{2}, 0,2 mM 5'desoxirribonucleótidos trifosfato (5'dATP, 5'dGTP, 5'dCTP, 5'dTTP), 0,5 \muM de cebadores y 5 unidades de Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech). Se realizaron 20 ciclos de las siguientes incubaciones: 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 55ºC y 1 minuto 10 segundos a 72ºC. Finalizados estos ciclos de incubaciones se concluyó la reacción incubando 10 minutos a 72ºC y enfriándola a 15ºC.The PCR reaction was carried out in one volume. 100 µl containing 100 ng plasmid, 10 mM Tris • HCl (pH 8.6), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM 5'deoxyribonucleotides triphosphate (5'dATP, 5'dGTP, 5'dCTP, 5'dTTP), 0.5 µM of primers and 5 units of Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech). 20 cycles of the following incubations: 45 seconds at 95 ° C, 45 seconds at 55 ° C and 1 minute 10 seconds at 72 ° C. Finished these incubation cycles The reaction was terminated by incubating 10 minutes at 72 ° C and cooling to 15 ° C

b) Análisis por electroforesis en geles de agarosa del ADN amplificado por PCR que codifica a la musarmina 4 recombinanteb) Analysis by electrophoresis in agarose gels of PCR amplified DNA encoding musarmin 4 recombinant

Para analizar el producto de PCR obtenido en la reacción anterior se realizó un gel que contenía un 1,5% de agarosa en un tampón acuoso de Tris\cdotacetato 40 mM pH 8, EDTA (etilen diamino tetra-acético) 1 mM. A 100 \mul de muestra se le añadieron 20 \mul de una solución que contenía 30% de glicerol y 0,025% de azul de bromofenol. Las muestras se colocaron en el gel y se desarrolló la electroforesis a 70 voltios hasta que el azul de bromofenol recorrió aproximadamente ¾ de la longitud del gel. A continuación se realizó la tinción con una solución que contenía 0,25 \mug/ml de bromuro de etidio durante aproximadamente 30 minutos con agitación. Las bandas de ADN se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta de 254-312 nm. Se obtuvo un único fragmento de ADN de 0,867 kb. El producto de PCR se purificó cortando la banda correspondiente y mediante el sistema QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad de fragmento purificado se cuantificó en un gel de agarosa preparado como se indicó anteriormente. El ADN recuperado de este modo se guardó a -20ºC hasta su utilización.To analyze the PCR product obtained in the previous reaction was performed a gel containing 1.5% agarose in an aqueous buffer of 40 mM Tris? pH 8, EDTA (ethylene tetra-acetic diamino) 1 mM. At 100 µl of sample 20 µl of a solution containing 30% of glycerol and 0.025% bromophenol blue. The samples were placed in the gel and electrophoresis developed at 70 volts until bromophenol blue traveled approximately ¾ of the length of the gel. Staining was then performed with a solution that contained 0.25 µg / ml ethidium bromide during approximately 30 minutes with stirring. DNA bands are visualized in an ultraviolet light transilluminator of 254-312 nm. A single DNA fragment of 0.867 kb. The PCR product was purified by cutting the band corresponding and through the QIAquick Gel Extraction Kit system (QIAGEN) following the manufacturer's instructions. The amount of purified fragment was quantified on an agarose gel prepared as stated above. The DNA recovered in this way is Store at -20ºC until use.

c) Introducción en el vector de clonación del ADN que codifica a las cadena de la musarmina 4 recombinantec) Introduction into the DNA cloning vector that encodes the recombinant musarmine 4 chain

El fragmento de ADN purificado se introdujo en el vector de clonación pUCl8 de utilizando el sistema "Sure Clone Ligation Kit" de Amersham Pharmacia Biotech. La reacción se realizó siguiendo las instrucciones de los fabricantes y llevando a cabo la reacción de ligación en 20 \mul durante 2 horas a 16ºC.The purified DNA fragment was introduced into the pUCl8 cloning vector using the "Sure Clone system Ligation Kit "by Amersham Pharmacia Biotech. The reaction is performed following the manufacturers instructions and leading to carry out the ligation reaction in 20 µl for 2 hours at 16 ° C.

d) Transformación de células de Escherichia coli con el vector recombinante que contiene el ADN que codifica la musarmina 4 recombinanted) Transformation of Escherichia coli cells with the recombinant vector containing the DNA encoding the recombinant musarmine 4

La transformación se realizó incubando 100 \mul de células competentes XL1-Blue (Stratagene) con 8 \mul de la reacción de ligación anterior. Todo el proceso se realizó siguiendo las instrucciones del manufacturador. Las células transformadas se sembraron en placas que contenían medio LB-agar (1% bactotriptona, 0,5% de extracto de levadura, 1% NaCl y 2% agar), 100 \mug/ml ampicilina, 1,6 mM IPTG y 40 \mug/ml X-gal. Las placas se incubaron a 37ºC durante 20 horas.The transformation was performed by incubating 100 µl of competent XL1-Blue cells (Stratagene) with 8 \ mul of the previous ligation reaction. The whole process is performed following the manufacturer's instructions. The cells transformed were seeded in plates containing medium LB-agar (1% bactotriptone, 0.5% extract of yeast, 1% NaCl and 2% agar), 100 µg / ml ampicillin, 1.6 mM IPTG and 40 µg / ml X-gal. The plates were incubated at 37 ° C for 20 hours

e) Aislamiento y análisis de las colonias con plásmidos recombinantes del ADN que codifica a la musarmina 4 recombinantee) Isolation and analysis of plasmid colonies recombinant DNA encoding musarmin 4 recombinant

Se analizaron las colonias blancas de células transformantes mediante técnicas de PCR utilizando cebadores específicos. De aquéllas que rindieron una amplificación del tamaño adecuado se purificó el plásmido recombinante mediante el sistema QIAprep spin Miniprep kit (QIAGEN). A continuación los plásmidos purificados se digirieron con las endonucleasas de restricción Bam HI y Sac I (Boehringer Mannheim), que liberan el inserto. La reacción se realizó en las condiciones que indica el manufacturador y los productos se analizaron en un gel del 1% de agarosa/TAE. La tinción del gel con bromuro de etidio permitió visualizar los fragmentos de ADN y se eligieron los plásmidos con un inserto del tamaño adecuado.White colonies of cells were analyzed transformants using PCR techniques using primers specific. Of those that yielded an amplification of the size suitable the recombinant plasmid was purified by the system QIAprep spin Miniprep kit (QIAGEN). Next the plasmids purified were digested with Bam restriction endonucleases HI and Sac I (Boehringer Mannheim), which release the insert. The reaction was carried out under the conditions indicated by the manufacturer and the products were analyzed on a 1% agarose / TAE gel. The staining of the gel with ethidium bromide allowed visualization of the DNA fragments and plasmids with an insert of the appropriate size.

f) Secuenciación de los plásmidos con inserto del ADN que codifica a la musarmina 4 recombinantef) Sequencing of plasmids with DNA insert that encodes recombinant musarmine 4

Los plásmidos recombinantes correspondientes al gen de la musarmina 4 recombinante se secuenciaron de forma automática en ambos sentidos en el Servicio de Secuenciación de ADN del Centro de Investigaciones Biológicas (Madrid). (Secuencia 1).The recombinant plasmids corresponding to Recombinant musarmine 4 gene were sequenced Automatic in both directions in the DNA Sequencing Service from the Biological Research Center (Madrid). (Sequence one).

g) Producción del fragmento de ADN que codifica a la musarmina 4 recombinante digerido con las enzimas de restricción Nde I y Hind IIIg) Production of the DNA fragment encoding the recombinant musarmine 4 digested with restriction enzymes Nde I and Hind III

Se digirieron 100 \mug del plásmido que contenía el ADN que codifica para la musarmina 4 recombinante en un volumen de 100 \mul que contenía 30 unidades de NdeI, 10 mM Tris-HCl pH=8, 5mM MgCl_{2}, 100 mM NaCl, 1 mM 2-Mercaptoetanol. La reacción se realizó durante 6h a 37ºC. 10 \mul de la mezcla de reacción se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa como se indicó anteriormente. Tras calentar la mezcla restante durante 20 minutos a 65ºC para inactivar la enzima de restricción se añadieron 5 unidades de Hind III y la reacción se realizó a 37ºC durante 12 horas.100 µg of the plasmid was digested that it contained the DNA encoding recombinant musarmine 4 in a 100 µl volume containing 30 units of NdeI, 10 mM Tris-HCl pH = 8.5mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM 2-Mercaptoethanol. The reaction was carried out for 6h at 37 ° C. 10 µl of the reaction mixture was analyzed by electrophoresis in an agarose gel as indicated above. After heating the remaining mixture for 20 minutes at 65 ° C to inactivate the restriction enzyme 5 units of Hind were added III and the reaction was carried out at 37 ° C for 12 hours.

h) Análisis y purificación del producto de digestión que codifica a la musarmina 4 recombinante por electroforesis en geles de agarosah) Analysis and purification of the digestion product that encodes recombinant musarmin 4 by electrophoresis in gels of agarose

Para analizar el producto de la digestión obtenido en la reacción anterior se realizó un gel que contenía un 1,5% de agarosa en un tampón acuoso de Tris\cdotacetato 40 mM, EDTA (etilen diamino tetra-acético) 1 mM. A 100 \mu1 de muestra se le añadieron 25 g1 de una solución que contenía 30% de glicerol y 0,025% de azul de bromofenol. Las muestras se colocaron en el gel y se desarrolló la electroforesis a 60 voltios hasta que el azul de bromofenol recorrió aproximadamente ¾ de la longitud del gel. A continuación se realizó la tinción con una solución que contenía 0,25 \mug/ml de bromuro de etidio durante aproximadamente 30 minutos con agitación. Las bandas de ADN se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta de 254-312 nm. El fragmento de ADN correspondiente a 0,827 kb se purificó del gel utilizando el sistema comercial QIAquick Gel Extraction Kit de QIAGEN. La cantidad de fragmento purificado se cuantificó en un gel de agarosa preparado como se indicó anteriormente. El ADN recuperado de este modo se guarda a - 20ºC hasta su utilización.To analyze the product of digestion obtained in the previous reaction, a gel containing a 1.5% agarose in an aqueous buffer of 40 mM Tris? EDTA (ethylene diamino tetraacetic) 1 mM. At 100 µg of sample was added 25 g1 of a solution that It contained 30% glycerol and 0.025% bromophenol blue. The samples were placed on the gel and electrophoresis was developed to 60 volts until bromophenol blue traveled approximately ¾ of the gel length. Then staining was performed with a solution containing 0.25 µg / ml ethidium bromide for approximately 30 minutes with stirring. DNA bands they were visualized in an ultraviolet light transilluminator of 254-312 nm. The DNA fragment corresponding to 0.827 kb was purified from the gel using the commercial system QIAquick Gel Extraction Kit by QIAGEN. The amount of fragment purified was quantified on an agarose gel prepared as indicated above. DNA recovered in this way is stored at - 20ºC until use.

i) Producción del vector de expresión digerido con las enzimas Nde I y Hind IIIi) Production of the digested expression vector with the Nde I and Hind III enzymes

Se digirieron 7,5 \mug del plásmido pET25(+) (Novagen) en un volumen de 100 \mul que contenía 3 unidades de Ndel y de HindIIl, 10 mM Tris-HCl pH 8,5 mM MgCl_{2}, 100 mM NaCl, 1 mM 2-Mercaptoetanol. La reacción se realizó durante 5h a 37ºC.7.5 µg of plasmid pET25 (+) was digested (Novagen) in a volume of 100 µl containing 3 units of Ndel and HindIIl, 10 mM Tris-HCl pH 8.5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol. The reaction was performed for 5h at 37 ° C.

j) Análisis y purificación del producto de digestión del plásmido pET25(+) por electroforesis en geles de agarosaj) Analysis and purification of the digestion product of the plasmid pET25 (+) by electrophoresis in agarose gels

Para analizar el producto de digestión obtenido en la reacción anterior se realizó un gel que contenía un 1% de agarosa como se indicó anteriormente. Se obtuvo un único fragmento de ADN de 5,4 kb. El producto de digestión se purificó del gel de agarosa como se indicó anteriormente con el sistema comercial QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). La cantidad de plásmido purificado se cuantificó en un gel de agarosa preparado como se indicó anteriormente. El ADN recuperado de este modo se guarda a -20ºC hasta su utilización.To analyze the digestion product obtained in the previous reaction, a gel containing 1% of agarose as indicated above. A single fragment was obtained of 5.4 kb DNA. The digestion product was purified from the gel agarose as indicated above with the commercial system QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). The amount of plasmid purified was quantified on an agarose gel prepared as indicated above. The DNA recovered in this way is stored at -20ºC until use.

k) Inserción del fragmento de ADN de la musarmina 4 recombinante en el vector de expresión pET25(+) digeridok) Insertion of the DNA fragment of musarmine 4 recombinant in the digested pET25 (+) expression vector

La reacción se llevó a cabo en 12 \mul de volumen que contenía 3 unidades de T4 DNA ligase (Amersham Pharmacia Biotech), 50 ng de vector digerido, 55 ng del fragmento de la musarmina 4 recombinante, 66 mM Tris-HCl pH=7,6, 6,6 mM MgCl_{2}, 10 mM DTT, 66 ATP. La reacción se llevó a cabo durante 16 horas a 16ºC.The reaction was carried out in 12 µl of volume containing 3 units of T4 DNA ligase (Amersham Pharmacia Biotech), 50 ng of digested vector, 55 ng of the fragment of recombinant musarmine 4, 66 mM Tris-HCl pH = 7.6, 6.6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 66 ATP. The reaction was carried out. for 16 hours at 16 ° C.

l) Transformación de células de Escherichia coli con el vector recombinante que contiene el ADN que codifica la musarmina 4 recombinantel) Transformation of Escherichia coli cells with the recombinant vector containing the DNA encoding the recombinant musarmine 4

La transformación se realizó incubando 66 \mul de células competentes XL1-Blue (Stratagene) con 8 \mul de la reacción de ligación anterior. Todo el proceso se realizó siguiendo la instrucciones del manufacturador. Las células transformadas se sembraron en placas que contenían medio LB-agar (1% bactotriptona, 0,5% de extracto de levadura, 1% NaCl y 2% agar) y 100 \mug/ml ampicilina. Las placas se incubaron a 37ºC durante 20 horas.The transformation was performed by incubating 66 µl of competent XL1-Blue cells (Stratagene) with 8 \ mul of the previous ligation reaction. The whole process is performed following the manufacturer's instructions. The cells transformed were seeded in plates containing medium LB-agar (1% bactotriptone, 0.5% extract of yeast, 1% NaCl and 2% agar) and 100 µg / ml ampicillin. Plates they were incubated at 37 ° C for 20 hours.

m) Aislamiento y análisis de las colonias con plásmidos recombinantes del ADN que codifica para la musarmina 4 recombinantem) Isolation and analysis of plasmid colonies recombinant DNA coding for musarmin 4 recombinant

Se analizaron las colonias blancas de células transformantes mediante técnicas de PCR utilizando cebadores específicos del vector de expresión. De aquéllas que rindieron una amplificación del tamaño adecuado se purificó el plásmido recombinante mediante el sistema QIAprep Spin Miniprep Kit de QIAGEN.White colonies of cells were analyzed transformants using PCR techniques using primers specific expression vector. Of those who rendered a amplification of the appropriate size the plasmid was purified recombinant using the QIAprep Spin Miniprep Kit system QIAGEN

n) Transformación de células de Escherichia coli con el vector de expresión recombinante que contiene el ADN que codifica la musarmina 4 recombinanten) Transformation of Escherichia coli cells with the recombinant expression vector containing the DNA encoding the recombinant musarmine 4

La transformación se realizó incubando 1 ml de células BL21(DE3)pLysS y BL21(DE3) (Novagen) resuspendidas en medio TSS (medio LB suplementado con 10% (p/v) de PEG 3350, 5%(v/v) DMSO, 50 mM MgCl_{2} pH=6,5) con 70 ng del vector de expresión recombinante anterior. Tras incubar las células durante 1 hora a 4ºC se calentaron durante 2 minutos a 42ºC y volvieron a enfriarse a 4ºC. Se añadió 1 ml de medio LB y se incubaron durante 45 minutos a 37ºC en un incubador orbital a 250 rpm. Las células transformadas se sembraron en placas que contenían medio LB-agar (1% bactotriptona, 0,5% de extracto de levadura, 1% NaCl y 2% agar) y 100 \mug/ml ampicilina y 34 \mug/ml de cloranfenicol. Las placas se incubaron a 37ºC durante 20 horas.The transformation was performed by incubating 1 ml of BL21 (DE3) pLysS and BL21 (DE3) (Novagen) cells resuspended in TSS medium (LB medium supplemented with 10% (w / v) of PEG 3350, 5% (v / v) DMSO, 50 mM MgCl2 pH = 6.5) with 70 ng of previous recombinant expression vector. After incubating the cells for 1 hour at 4 ° C they were heated for 2 minutes at 42 ° C and cooled again to 4 ° C. 1 ml of LB medium was added and incubated for 45 minutes at 37 ° C in a 250 orbital incubator rpm Transformed cells were seeded on plates containing LB-agar medium (1% bactotriptone, 0.5% extract of yeast, 1% NaCl and 2% agar) and 100 µg / ml ampicillin and 34 / mug / ml of chloramphenicol. Plates were incubated at 37 ° C for 20 hours.

Segunda etapaSecond stage

Expresión de la musarmina 4 recombinante en E. coli Expression of recombinant musarmine 4 in E. coli a) Estudio sobre la localización celulara) Study on cell location

Se seleccionaron 3 colonias transformantes de cada cepa, y se indujo la expresión de la proteína musarmina 4 recombinante durante 4h a 37ºC, tal y como describe el manual de instrucciones de los l0 fabricantes del plásmido de expresión. Las fracciones proteicas totales de las bacterias inducidas se analizaron por electroforesis (Figura 1, Panel A), y así se comprobó la presencia de una proteína con Mr en torno a 29 kDa, que no aparecía en las bacterias sin plásmido.3 transforming colonies of each strain, and the expression of musarmine 4 protein was induced recombinant for 4h at 37 ° C, as described in the manual of instructions from the 10 manufacturers of the expression plasmid. The total protein fractions of induced bacteria are analyzed by electrophoresis (Figure 1, Panel A), and this was verified the presence of a protein with Mr around 29 kDa, which does not appeared in bacteria without plasmid.

Del mismo modo, se observó que la cantidad relativa de proteína y recombinante expresada resultaba similar en ambas cepas. Teniendo en cuenta lo anterior, y ante la mayor facilidad para lisar las, bacterias que poseen lisozima endógena, se optó por la cepa BL21(DE3) pLysS para llevar a cabo la expresión y el posterior aislamiento de la musarmina 4 recombinante.Similarly, it was observed that the amount relative protein and recombinant expressed was similar in both strains Given the above, and before the major Ease to lyse, bacteria that possess endogenous lysozyme, se opted for strain BL21 (DE3) pLysS to carry out the expression and subsequent isolation of musarmine 4 recombinant

Con el fin de averiguar la localización de la proteína en las bacterias pLysS transformantes inducidas, se procedió a su fraccionamiento, y las fracciones soluble e insoluble se estudiaron por electroforesis (Figura 1, Panel B),. Se observó que la proteína recombinante de 29 kDa se localizaba tanto en la fracción soluble como en la fracción insoluble. Esta proteína era reconocida por un policlonal anti-musarmina 2 nativa (Arias y cols, Int. J. Biochem. Cell Biol. 35, 61-78 [2003]), lo que confirmó que la proteína recombinante se correspondía con musarmina 4 recombinantec (Figura 1, Panel C). En el experimento se empleó como control negativo el extracto total de las mismas bacterias transformadas pero no inducidas (t=0), en el se detectó una pequeña expresión basal.In order to find out the location of the protein in the induced transforming pLysS bacteria, it was fractionated, and the soluble and insoluble fractions were studied by electrophoresis (Figure 1, Panel B). It was observed that the 29 kDa recombinant protein was located both in the soluble fraction and in the insoluble fraction. This protein was recognized by a native anti-musarmine 2 polyclonal (Arias et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 , 61-78 [2003]), which confirmed that the recombinant protein corresponded with recombinant musarmine 4 ( Figure 1, Panel C). In the experiment, the total extract of the same transformed but not induced bacteria (t = 0) was used as a negative control, in which a small basal expression was detected.

A continuación, una vez confirmada la presencia de musarmina 4 recombinantec en las dos fracciones celulares, se procedió a su aislamiento a partir de ambos extractos.Then, once the presence is confirmed of recombinant musarmine 4 in the two cell fractions, proceeded to its isolation from both extracts.

Producción y purificación de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción solubleProduction and purification of recombinant musarmine 4 a from the soluble fraction b) Producción de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción solubleb) Production of recombinant musarmine 4 from the soluble fraction

Se inoculan 500 ml de medio LB con 200 \mug/ml de ampicilina y 34 \mu/ml de cloranfenicol con una colonia de la cepa BL21(DE3)pLysS recombinante que contiene el plásmido pET25+Musarmina4, y se incuba durante 11 horas a 27ºC con agitación orbital de 250 rpm. Cuando la absorbancia alcanza 0,8 se añade IPTG (isopropiltio-\beta-galactósido) a una concentración final de 1mM y se incuba en las mismas condiciones durante 5 horas más.500 ml of LB medium is inoculated with 200 µg / ml of ampicillin and 34 / ml of chloramphenicol with a colony of the strain BL21 (DE3) recombinant pLysS containing the plasmid pET25 + Musarmina4, and incubated for 11 hours at 27 ° C with 250 rpm orbital agitation. When the absorbance reaches 0.8 it add IPTG (isopropylthio-? -galactoside) a  a final concentration of 1mM and incubated therein conditions for 5 more hours.

Se enfría el medio durante 15 minutos a 4ºC y se centrifuga a 5000xg durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento se resuspende en 20 ml de 20 mM fosfato monosódico pH=6,6 mediante agitación fuerte. Las células resuspendidas se congelan a -80ºC durante 30 minutos, se descongelan a 37ºC y se incuban a 25ºC durante 15 minutos. Se somete la solución a tratamiento por ultrasonidos con 3 ciclos de 10 segundos con intervalos de 10 segundos entre cada ciclo y a continuación se centrifuga a 27000 xg durante 25 minutos a 4ºC. El sobrenadante constituye la fracción proteica soluble total.The medium is cooled for 15 minutes at 4 ° C and centrifuge at 5000xg for 10 minutes at 4 ° C. The sediment is resuspend in 20 ml of 20 mM monosodium phosphate pH = 6.6 by strong agitation Resuspended cells freeze at -80 ° C for 30 minutes, thaw at 37 ° C and incubate at 25 ° C during 15 minutes. The solution is subjected to treatment by ultrasound with 3 cycles of 10 seconds with intervals of 10 seconds between each cycle and then centrifuged at 27000 xg for 25 minutes at 4 ° C. The supernatant constitutes the fraction total soluble protein.

c) Purificación de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción solublec) Purification of recombinant musarmine 4 from of the soluble fraction

El extracto proteico anterior se acidifica con Acido Acético glacial hasta pH 5. A continuación se somete a centrifugación a 27000xg durante 25 minutos a 4ºC. El sobrenadante se carga sobre una columna de 27 ml de CM-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia; Biotech) equilibrada previamente con Acetato sódico 20 mM pH 5. Tras lavar la columna con el mismo tampón se eluye mediante un gradiente 0 salino en el tampón de equilibrado. Se realiza en dos tramos: desde 0 a 70 mM de NaCl a lo largo de 3 volúmenes de columna, y de 70 a 180 mM de NaCl a lo largo de 19 volúmenes de columna (Figura 2, Panel A). Posteriormente, se despegan las proteínas más básicas pasando 3 volúmenes de columna del tampón de equilibrado con 1 M de NaCl. Tras analizar las fracciones recogidas por Western blotting usando un anticuerpo policlonal de conejo específico de la musarmina 3 nativa se seleccionan las fracciones que reaccionan y se mezclan. Posteriormente se concentra el extracto proteico resultante mediante una membrana YM-10 en el sistema de ultrafiltración AMICON hasta un volumen de 5 ml y se filtra a través de una membrana Millipore Type HA de 0,45 \mum.The above protein extract is acidified with Glacial Acetic Acid up to pH 5. It is then subjected to centrifugation at 27000xg for 25 minutes at 4 ° C. The supernatant loaded onto a 27 ml column of CM-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia; Biotech) previously balanced with 20 mM sodium acetate pH 5. After washing the column with it buffer is eluted by a gradient or saline in the buffer of balanced. It is carried out in two sections: from 0 to 70 mM of NaCl at length of 3 column volumes, and 70 to 180 mM NaCl at 19 column volumes (Figure 2, Panel A). Subsequently, the most basic proteins are detached by passing 3 column volumes of the equilibration buffer with 1 M NaCl. After analyze the fractions collected by Western blotting using a native rabbit polyclonal 3 polyclonal antibody the fractions that react are selected and mixed. Subsequently the resulting protein extract is concentrated by  a YM-10 membrane in the ultrafiltration system AMICON up to a volume of 5 ml and filtered through a membrane Millipore Type HA of 0.45 µm.

La muestra se separa por cromatografía en una columna de Superdex 75 HiLoad 26/60 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con tampón Fosfato monosódico 5mM pH 7,5 y NaCl 140 mM. La elución se realiza con el mismo tampón de equilibrado a un flujo de 2 ml/min.The sample is separated by chromatography on a Superdex 75 HiLoad column 26/60 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 5mM monosodium phosphate buffer pH 7.5 and 140 mM NaCl. Elution is performed with the same equilibration buffer at one flow 2 ml / min.

Se recogen las fracciones correspondientes al pico de mayor absorbancia que contiene la musarmina 4 recombinante, se dializan frente a agua tipo 1 y se liofilizan (Figura 2, Panel B). Al final del proceso de purificación, se obtuvieron 10 mg de musarmina 4 recombinante soluble por litro de medio de cultivo.Fractions corresponding to the highest absorbance peak that contains recombinant musarmine 4, they are dialyzed against water type 1 and lyophilized (Figure 2, Panel B). At the end of the purification process, 10 mg of Recombinant soluble musarmine 4 per liter of culture medium.

Producción y purificación de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción insolubleProduction and purification of recombinant musarmine 4 a from the insoluble fraction d) Producción de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción insolubled) Production of recombinant musarmine 4 from the insoluble fraction

Se inocularon 500 ml de medio LB con 200 \mug/ml de ampicilina y 34 \mug/ml de cloranfenicol con una colonia de la cepa BL21(DE3)pLysS recombinante que contenía el plásmido pET25+Musarmina4, y se incubó durante 11 horas a 27ºC con agitación orbital de 250 rpm. Cuando la absorbancia alcanza 0,8 se añade IPTG (isopropiltio-\beta-galactosido) a una concentración final de 1mM y se incuba durante 6 horas más a 37ºC con agitación orbital de 250 rpm.500 ml of LB medium was inoculated with 200 µg / ml ampicillin and 34 µg / ml chloramphenicol with one strain colony BL21 (DE3) pLysS recombinant which it contained plasmid pET25 + Musarmina4, and it was incubated for 11 hours at 27 ° C with 250 rpm orbital agitation. When the absorbance reaches 0.8 IPTG is added (isopropylthio-? -galactoside) a  a final concentration of 1mM and incubate for another 6 hours at 37 ° C with 250 rpm orbital agitation.

Se enfrió el medio durante 15 minutos a 4ºC y se centrifugó a 5000xg durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento se resuspendió en 20 ml de Tris 10 mM pH 8, NaCl 140 mM mediante agitación fuerte. Las células resuspendidas se congelaron a -80ºC durante 30 minutos, se descongelaron a 37ºC y se incubaron a 25ºC durante 15 minutos. Se sometió la solución a tratamiento por ultrasonidos con 3 ciclos de 10 segundos con intervalos de 10 segundos entre cada ciclo y a continuación se centrifugó a 27000xg durante 25 minutos a 4ºC. El sedimento constituye la fracción insoluble total.The medium was cooled for 15 minutes at 4 ° C and was centrifuged at 5000xg for 10 minutes at 4 ° C. The sediment is resuspended in 20 ml of 10 mM Tris pH 8, 140 mM NaCl by strong agitation Resuspended cells were frozen at -80 ° C for 30 minutes, they were thawed at 37 ° C and incubated at 25 ° C during 15 minutes. The solution was subjected to treatment by ultrasound with 3 cycles of 10 seconds with intervals of 10 seconds between each cycle and then centrifuged at 27000xg for 25 minutes at 4 ° C. The sediment constitutes the fraction Total insoluble.

e) Purificación de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción insolublee) Purification of recombinant musarmine 4 from of the insoluble fraction

La solubilización de la fracción insoluble total se realizó según el procedimiento descrito por Rajamohan y cols. Protein Expr. Purif. 16, 359-368 [1999].The solubilization of the total insoluble fraction was performed according to the procedure described by Rajamohan et al. Protein Expr. Purif . 16 , 359-368 [1999].

Se lavó el sedimento resuspendiéndolo en 50 ml de 0,5 M NaCl y 2% Triton X-100, posteriormente se centrifugó a 27000xg durante 10 minutos a 4ºC y se repitió el lavado anterior. Tras la centrifugación se realizaron dos lavados más, pero esta vez con 0,5 M NaCl exclusivamente y finalmente otros dos lavados con agua tipo I.The sediment was washed by resuspending it in 50 ml of 0.5 M NaCl and 2% Triton X-100, subsequently centrifuged at 27000xg for 10 minutes at 4 ° C and the previous wash. After centrifugation two washes were performed more, but this time with 0.5 M NaCl exclusively and finally others two washes with type I water.

El sedimento se solubilizó con 10 ml de CTAB 1,5%, Tris 50 mM pH 8 durante 14 horas a 25ºC en agitación constante. Seguidamente se centrifugó durante 20 minutos a 27000xg y 25ºC.The sediment was solubilized with 10 ml of CTAB 1.5%, 50 mM Tris pH 8 for 14 hours at 25 ° C under stirring constant. It was then centrifuged for 20 minutes at 27000xg and 25 ° C.

El sobrenadante se separó por cromatografía de exclusión molecular en una columna de Sephadex G-50 (263 ml de lecho) (Amersham Pharmacia Biotech) previamente equilibrada con 20 mM fosfato sódico pH 6,6, 140 mM NaCl usando el mismo tampón y a un flujo de 1 ml/min. Las fracciones correspondientes a la proteína se recogen y se centrifugan a 27000xg durante 5 min a 4ºC y el sobrenadante se aplica a una columna de CM-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) (27m1 de lecho) previamente equilibradal. con el tampón anterior. Tras aplicar la muestra se lavó la columna con el mismo tampón y se eluyó la proteína mediante un gradiente salino, utilizando como fase A fosfato monosódico 20 mM pH=6,6 NaCl 140 mM y como fase B fosfato monosódico 20 mM pH=6,6 NaCl 1M, a un flujo de 3 ml/min. El gradiente consiste en dos tramos lineales de 1 y 28 volúmenes de columna, en los que se alcanzan concentraciones del tampón B de 15% (255mM NaCl) y 100% (1M NaCl), respectivamente (Figura 3). Se recogen las fracciones correspondientes al pico de mayor absorbancia que contiene la musarmina 4 recombinante, se dializan frente a agua tipo 1 y se liofilizan. El rendimiento global de la purificación de musarmina 4 recombinante a partir de cuerpos de inclusión fue de 50 mg de proteína por cada litro de medio.The supernatant was separated by chromatography of Molecular exclusion on a Sephadex G-50 column (263 ml of bed) (Amersham Pharmacia Biotech) previously equilibrated with 20 mM sodium phosphate pH 6.6, 140 mM NaCl using the same buffer and at a flow of 1 ml / min. Fractions corresponding to the protein are collected and centrifuged at 27000xg for 5 min at 4 ° C and the supernatant is applied to a CM-Sepharose Fast Flow column (Amersham Pharmacia Biotech) (27m1 bed) previously balanced. with the previous buffer. After applying the sample, the column was washed with the same buffer and the protein was eluted by a saline gradient, using as phase A monosodium phosphate 20 mM pH = 6.6 NaCl 140 mM and as phase B 20 mM monosodium phosphate pH = 6.6 1M NaCl, at a flow of 3 ml / min The gradient consists of two linear sections of 1 and 28 column volumes, in which concentrations of the buffer B of 15% (255mM NaCl) and 100% (1M NaCl), respectively (Figure 3). Fractions corresponding to the peak of greater absorbance that contains recombinant musarmine 4, is they dialyze against type 1 water and lyophilize. Overall performance  of purification of recombinant musarmine 4 from bodies Inclusion was 50 mg of protein per liter of medium.

Tercera etapaThird stage

Preparación de la inmunotoxina 44G4-rMusarmina4Immunotoxin Preparation 44G4-rMusarmina4 a) Derivatización del anticuerpo monoclonal 44G4a) Derivatization of the 44G4 monoclonal antibody

El procedimiento experimental se basa en el utilizado por Thorpe y cols., Breast Cancer Res. Treat. 36, 237-251 [1995]. El anticuerpo monoclonal 44G4 (7,5 mg) se disuelve en borato sódico 50 mM pH=9, a una concentración de 2-4 mg/ml. A continuación, se le añade SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-propionate) (disuelto en etanol puro a 4 mg/ml) en un exceso molar de 2 respecto al anticuerpo; la mezcla se agita vigorosamente y se deja reaccionar 1 hora a 28ºC.The experimental procedure is based on that used by Thorpe et al., Breast Cancer Res. Treat . 36 , 237-251 [1995]. The 44G4 monoclonal antibody (7.5 mg) is dissolved in 50 mM sodium borate pH = 9, at a concentration of 2-4 mg / ml. Next, SPDP (N-succinimidyl-3- (2-pyridylthio) -propionate) (dissolved in pure ethanol at 4 mg / ml) is added in a molar excess of 2 to the antibody; The mixture is stirred vigorously and allowed to react for 1 hour at 28 ° C.

Posteriormente, la muestra se somete a una cromatografía de exclusión en Sephadex G-25 (d=1,6cm, h=26,8 cm, V_{1}=54 ml) para eliminar el exceso de reactivo y la N-hidroxisuccinimida originada. La separación se lleva a cabo a temperatura ambiente, empleando como tampón PBS pH=7,5, a un flujo de 0,8 ml/min. Se recoge el primer pico, que contiene el anticuerpo derivatizado, se cuantifica y se conserva a 4ºC hasta su utilización. El número de moles de agente ligante introducidos por mol de anticuerpo es de 1,8.Subsequently, the sample is subjected to a exclusion chromatography on Sephadex G-25 (d = 1.6cm, h = 26.8 cm, V1 = 54 ml) to remove excess reagent and the N-hydroxysuccinimide originated. The separation is carried out at room temperature, using as PBS buffer pH = 7.5, at a flow rate of 0.8 ml / min. The first one is collected peak, which contains the derivatized antibody, is quantified and keep at 4 ° C until use. The number of moles of agent Binder introduced per mole of antibody is 1.8.

b) Derivatización de la RIP musarmina 4 recombinanteb) Derivatization of recombinant musarmine 4 RIP

17 mg de la proteína musarmina 4 recombinante extraída de la fracción soluble se disuelven en borato sódico 50 mM pH=9 a 4-5 mg/ml. El procedimiento para su derivatización es análogo al descrito para el anticuerpo. En este caso se utiliza el cociente óptimo determinado de manera experimental que resultó de 2 moles de SPDP por mol de musarmina 4 recombinante, resultando una relación final de agente ligante unido por molécula de musarmina 4 recombinante de 1,8.17 mg of recombinant musarmine 4 protein extracted from the soluble fraction are dissolved in 50 mM sodium borate pH = 9 to 4-5 mg / ml. The procedure for your derivatization is analogous to that described for the antibody. In this case the optimal ratio determined in a way is used experimental result of 2 moles of SPDP per mole of musarmine 4 recombinant, resulting in a final binding agent binding relationship per recombinant musarmine 4 molecule of 1.8.

c) Reducción de la RIP y reacción de conjugación.c) Reduction of RIP and conjugation reaction.

Una vez derivatizados el anticuerpo y la RIP, ésta se reduce para poder liberar grupos sulfhidrilos que puedan iniciar la conjugación: en primer lugar, las RIPs se concentran en una membrana de ultrafiltración YM-10 hasta un volumen inferior a 2,5 ml. Más tarde, se lleva a cabo su reducción a temperatura ambiente con DTT 50 mM final durante 30 minutos.Once the antibody and RIP are derivatized, it is reduced to be able to release sulfhydryl groups that can initiate conjugation: first, the RIPs concentrate on a YM-10 ultrafiltration membrane up to a volume less than 2.5 ml. Later, its reduction to ambient temperature with final 50 mM DTT for 30 minutes.

Los productos originados se cargan en una columna de Sephadex G-25 (V_{1}=54 ml), previamente equilibrada con PBS a un flujo de 0,8 ml/min. El pico de proteína eluido en el volumen de exclusión- se recoge sobre el anticuerpo derivatizado en agitación, y la mezcla se mantiene durante 16 horas a temperatura ambiente. En esta reacción, el número de moles de -SH de la RIP derivatizada excede más de 6 veces al número de moles de SH del anticuerpo derivatizado.Originated products are loaded in a column of Sephadex G-25 (V1 = 54 ml), previously equilibrated with PBS at a flow rate of 0.8 ml / min. Protein peak eluted in the exclusion volume - is collected on the antibody stirring derivatized, and the mixture is maintained for 16 hours at room temperature. In this reaction, the number of moles of -SH of the derivatized RIP exceeds more than 6 times the number of moles of SH of derivatized antibody.

Finalizada la conjugación, la inmunotoxina se centrifuga a 20400xg durante 5 minutos a 4ºC, para eliminar la fracción de inmunoconjugado que haya podido precipitar, y el sobrenadante se concentra hasta un volumen de 2 ml. A continuación, la muestra se aplica a una columna de Sephacryl S-200 Hiload 26/60 (Pharmacia) (V_{1}=380 ml), a la que se aplicó un flujo de 1-2 ml/min., previamente equilibrada con PBS pH=7,5 y a temperatura ambiente (Figura 4).After the conjugation, the immunotoxin is centrifuge at 20400xg for 5 minutes at 4 ° C, to remove the fraction of immunoconjugate that may have precipitated, and the Supernatant is concentrated to a volume of 2 ml. Then, the sample is applied to a Sephacryl column S-200 Hiload 26/60 (Pharmacia) (V1 = 380 ml), a which was applied a flow of 1-2 ml / min., previously equilibrated with PBS pH = 7.5 and at room temperature (Figure 4).

Cuando concluye la purificación, se estudian electroforéticamente las diferentes zonas del cromatograma y se juntan las fracciones correspondientes a la inmunotoxina de bajo peso molecular (Zona C) (Figura 5) y se determina su concentración espectrofotometricamente. Por último, la inmunotoxina se distribuye en alícuotas y se conserva a -80ºC.When purification concludes, they are studied electrophoretically the different areas of the chromatogram and it combine the fractions corresponding to the low immunotoxin molecular weight (Zone C) (Figure 5) and its concentration is determined spectrophotometrically Finally, the immunotoxin is distributed in aliquots and stored at -80 ° C.

Con este procedimiento se consiguieron 2,51 mg de inmunotoxina 44G4-musarmina 4 recombinante, lo que supuso un rendimiento del 26% dado como el porcentaje de anticuerpo recuperado.With this procedure 2.51 mg of recombinant 44G4-musarmin 4 immunotoxin, which assumed a yield of 26% given as the percentage of antibody recovered.

d) Determinación de la masa molecular relativa de la inmunotoxina 44G4-musarmina 4 recombinante por electroforesis en geles de poliacrilamidad) Determination of the relative molecular mass of the recombinant 44G4-musarmin 4 immunotoxin by polyacrylamide gels electrophoresis

La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida, en presencia de dodecil sulfato sódico, (SDS-PAGE) se realiza siguiendo el protocolo para sistemas discontinuos, descrito por Laemmli, Nature 227, 680-685 [1970]. Se emplea un aparato "MiniVE vertical electrophoresis system" de Hoefer con minigeles de 0,75 x 80 x 100 mm, o bien un aparato "Mighty-Small II" (Hoefer) con minigeles de 0,5 x 70 x 80 mm.Protein electrophoresis in polyacrylamide gels, in the presence of sodium dodecyl sulfate, (SDS-PAGE) is performed following the protocol for discontinuous systems, described by Laemmli, Nature 227 , 680-685 [1970]. A "MiniVE vertical electrophoresis system" device from Hoefer with 0.75 x 80 x 100 mm minigeles is used, or a "Mighty-Small II" (Hoefer) device with 0.5 x 70 x 80 mm minigeles.

El porcentaje total de acrilamida (%T) en los geles separadores varía según los tamaños de las proteínas que se intentan separar.The total percentage of acrylamide (% T) in the separating gels vary according to the sizes of the proteins that are They try to separate.

Por ejemplo, para proteínas cuyas Mr se encuentran en el rango de 80-220 kDa como las inmunotoxinas se recurre a geles del 7,5% T, y si se trabaja con proteínas de tamaños comprendidos entre 14 y 60 kDa como las RIPs, se utilizan geles del 15%T.For example, for proteins whose Mr is found in the range of 80-220 kDa as the Immunotoxins use 7.5% T gels, and if working with proteins of sizes between 14 and 60 kDa such as RIPs, 15% T gels are used.

Los geles separadores del 15% (15% T, 2,7%C) están formados por una mezcla de acrilamida 14,6% (p/v), bis-acrilamida 0,4% (p/v), Tris-HCl 375 mM pH=8,8, SDS 0,1% (p/v), persulfato amónico 0,05% (p/v) y TEMED 0,05% (v/v). En los geles separadores con otro porcentaje varía sólo la proporción de acrilamida y bisacrilamida respecto al anterior, pero se mantiene el grado de entrecruzamiento (%C) [=g bisacrilamida/(g bisacrilamida + g acrilamida)x100]. Por otra parte, el gel compactador se compone de acrilamida 3,9%, bis-acrilamida 0,1%, Tris-HCl 125 mM pH=6,8, SDS 0,1%, persulfato amónico 0,05% y TEMED 0,08%.15% separating gels (15% T, 2.7% C) they are formed by a mixture of acrylamide 14.6% (w / v), bis-acrylamide 0.4% (w / v), Tris-HCl 375 mM pH = 8.8, 0.1% SDS (w / v), 0.05% (w / v) ammonium persulfate and FEAR 0.05% (v / v). In separating gels with another percentage only the proportion of acrylamide and bisacrylamide varies with respect to above, but the degree of crosslinking is maintained (% C) [= g bisacrylamide / (g bisacrylamide + g acrylamide) x100]. For other  part, the compactor gel is composed of 3.9% acrylamide, 0.1% bis-acrylamide, 125 mM Tris-HCl pH = 6.8, SDS 0.1%, ammonium persulfate 0.05% and TEMED 0.08%.

Las electroforesis se pueden llevar a cabo en condiciones reductoras o no reductoras. En el primer caso, las muestras se incuban durante 5 minutos a 100ºC en tampón de carga de electroforesis (Tris-HCl 62,5 mM pH=6,8, SDS 2% (p/v), glicerol 10% (v/v), 2-Mercaptoetanol 5% (v/v) y azul de bromofenol 0,025%). Cuando la electroforesis se realiza en condiciones no reductoras, se disuelven en un tampón de carga igual al anterior en el que se prescinde de 2- Mercaptoetanol.Electrophoresis can be carried out in reducing or non-reducing conditions. In the first case, the samples are incubated for 5 minutes at 100 ° C in loading buffer of electrophoresis (Tris-HCl 62.5 mM pH = 6.8, SDS 2% (w / v), glycerol 10% (v / v), 2-Mercaptoethanol 5% (v / v) and bromophenol blue 0.025%). When electrophoresis is performed in non-reducing conditions, dissolve in an equal loading buffer to the previous one in which 2- Mercaptoethanol is dispensed with.

Las muestras se aplican en los pocillos, y se desarrolla la electroforesis a temperatura ambiente con una intensidad de corriente constante de 25 mA por gel, utilizando un tampón compuesto por Tris-HCl 25 mM pH=8,3, glicina 192 mM y SDS 0,1% (p/v). La electroforesis se da por concluida cuando el frente marcado por el azul de bromofenol alcanza el final del gel.Samples are applied in the wells, and are develops electrophoresis at room temperature with a constant current intensity of 25 mA per gel, using a buffer composed of 25 mM Tris-HCl pH = 8.3, glycine 192 mM and 0.1% SDS (w / v). Electrophoresis is terminated when the front marked by bromophenol blue reaches the end of the gel.

La tinción se realiza durante 1 hora en una solución de Coomassie Brillant blue R-250 0,125% (p/v), metanol 50% (v/v) y ácido acético 10% (v/v) y, posteriormente, el gel se destiñe con ácido acético 10% (v/v) y metanol 40% (v/v). Ambos procesos se llevan a cabo en agitación.Staining is done for 1 hour in a Coomassie Brillant blue R-250 solution 0.125% (w / v), 50% methanol (v / v) and 10% acetic acid (v / v) and, subsequently, the gel is stained with 10% acetic acid (v / v) and 40% methanol (v / v). Both processes are carried out in agitation.

En la determinación del peso molecular relativo se utilizan marcadores de masa molecular conocida. Para geles del 15%, estos marcadores son: seroalbúmina bovina (BSA) (68 kDa), L-glutamato deshidrogenasa (54 kDa), alcohol deshidrogenasa (37 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa) e inhibidor de tripsina (20,1 kDa). En el caso de geles del 7,5% se emplean: miosina (205 kDa), \beta-galactosidasa (116 kDa), fosforilasa b (97,4 kDa) y fructosa 6-fosfato quinasa (87,2 kDa). La M_{r} se determina por interpolación.In the determination of relative molecular weight markers of known molecular mass are used. For gels of 15%, these markers are: bovine serum albumin (BSA) (68 kDa), L-glutamate dehydrogenase (54 kDa), alcohol dehydrogenase (37 kDa), carbonic anhydrase (29 kDa) and inhibitor of trypsin (20.1 kDa). In the case of 7.5% gels, the following are used: myosin (205 kDa), β-galactosidase (116 kDa), phosphorylase b (97.4 kDa) and fructose 6-phosphate kinase (87.2 kDa). The M_ {r} is determined by interpolation.

Las fracciones correspondientes a los conjugados de bajo peso (Zona C) se caracterizaron por electroforesis (Figura 6). En ausencia de reductor aparece un conjunto de bandas que provienen de las distintas estequiometrías RIP:Ab (1:1, 2:1, 3:1 y 4:1). Entre los distintos conjugados, predominan aquéllos de composición 1:1 (el mayoritario) y 2:1; por otra parte, se ha comprobado que la presencia del anticuerpo libre es mínima (Figura 6, Panel A). En condiciones reductoras, la inmunotoxina mAb 44G4-musarmina 4 recombinante rinde tres bandas. La superior, de Mr=50kDa, corresponde a la cadena pesada del anticuerpo, la central corresponde a la RIP musarmina 4 recombinante de 28 kDa y la inferior (en torno a 25 kDa) corresponde a la cadena ligera del anticuerpo (Figura 6, Panel B).The fractions corresponding to the conjugates Low weight (Zone C) were characterized by electrophoresis (Figure 6). In the absence of reducer a set of bands appears that they come from the different RIP stoichiometries: Ab (1: 1, 2: 1, 3: 1 and 4: 1). Among the various conjugates, those of 1: 1 composition (the majority) and 2: 1; on the other hand, it has proven that the presence of free antibody is minimal (Figure 6, Panel A). Under reducing conditions, the mAb immunotoxin Recombinant 44G4-musarmine 4 yields three bands. The upper, of Mr = 50kDa, corresponds to the heavy chain of the antibody, the central corresponds to the musarmine RIP 4 28 kDa recombinant and lower (around 25 kDa) corresponds to the antibody light chain (Figure 6, Panel B).

e) Determinación de la relación molar por densitometríae) Determination of the molar ratio by densitometry

La relación molar RIP/anticuerpo se ha determinado mediante un análisis densitométrico. Para ello, se realiza una electroforesis del conjugado en un gel de poliacrilamida al 15% en condiciones reductoras y el gel se tiñe con Coomassie Blue. Una vez desteñido, se fotografía con una cámara digital Kodak. La densitometría de la imagen se efectúa con el programa Scion Image (Scion Corporation), con el que la intensidad de cada banda se traduce en el valor del área bajo la curva que marca su contorno en el densitograma.The RIP / antibody molar ratio has determined by a densitometric analysis. To do this, it performs an electrophoresis of the conjugate on a gel 15% polyacrylamide under reducing conditions and the gel is stained with Coomassie Blue. Once faded, it is photographed with a camera Kodak digital. The densitometry of the image is carried out with the Scion Image program (Scion Corporation), with which the intensity of each band translates into the value of the area under the curve that Mark your contour on the densitogram.

En el gel se incluyen cantidades conocidas de cada uno de los componentes del conjugado, que servirán como patrones. Para cada uno de ellos se calcula la intensidad relativa de la banda por unidad de masa, dada como el valor del área bajo la curva de intensidad (en unidades^{2}) por cada \mug de proteína. La cantidad (en \mug) de cada uno de los integrantes de la inmunotoxina se halla relacionando el área del pico correspondiente con el cociente u^{2}/\mug obtenido para su referente interno. Por último, conocidas las masas relativas de las proteínas, se puede calcular la relación molar RIP/anticuerpo, que en este caso resultó de 1,45 moles musarmina 4 recombinante:moles 15 44G4.Known amounts of each of the conjugate components, which will serve as patterns. For each of them the relative intensity is calculated of the band per unit of mass, given as the value of the area under the intensity curve (in units2) for each \ mug of protein. The quantity (in \ mug) of each of the members of the immunotoxin is relating the area of the peak corresponding with the quotient u2 / \ mug obtained for its internal reference Finally, known the relative masses of proteins, you can calculate the molar ratio RIP / antibody, which in this case it was 1.45 moles recombinant musarmin 4: moles 15 44G4. 

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Cuarta etapaQuarter stage

Estudio de la actividad de las toxinas e inmunotoxinaStudy of the activity of toxins and immunotoxin a) Estudio de la actividad inhibidora de la síntesis de proteínas en lisado de reticulocitos de conejo dirigida por mensajero exógenoa) Study of the inhibitory activity of the synthesis of proteins in rabbit reticulocyte lysate directed by exogenous messenger

La capacidad inhibidora de las RIPs y de sus conjugados se estudia en un sistema acelular de síntesis de proteínas, el lisado de reticulocitos de conejo, preparado en el laboratorio del prof. Girbés, siguiendo el protocolo de Pelham y Jackson,. Eur. J. Biochem. 67, 247-256 [1976]. Se comparan las cantidades de proteína sintetizada en presencia de distintas concentraciones de RIP o conjugado con la producida en ausencia de las toxinas (control), que supone el 100% de la síntesis proteica. Cada concentración se analiza por duplicado, como mínimo, y en el experimento se incluyen, al menos, cuatro controles en los que la toxina es sustituida por agua. La contribución de las señales inespecíficas se calcula haciendo una medida de una muestra no tratada con toxina, en la que se omite la incubación a la temperatura a la que tiene lugar la síntesis. Este valor (blanco) se resta de los valores de las demás medidas.The inhibitory capacity of RIPs and their conjugates is studied in an acellular system of protein synthesis, the lysate of rabbit reticulocytes, prepared in the laboratory of prof. Girbés, following the protocol of Pelham and Jackson ,. Eur. J. Biochem . 67 , 247-256 [1976]. The amounts of protein synthesized in the presence of different concentrations of RIP or conjugate are compared with that produced in the absence of toxins (control), which accounts for 100% of protein synthesis. Each concentration is analyzed in duplicate, at a minimum, and at least four controls in which the toxin is replaced by water are included in the experiment. The contribution of nonspecific signals is calculated by measuring a sample not treated with toxin, in which incubation at the temperature at which the synthesis takes place is omitted. This value (white) is subtracted from the values of the other measures.

La actividad de las toxinas en estos sistemas se caracteriza por su IC_{50}, que se define como la concentración de RIP o de inmunotoxina (referida a la RIP) que causa el 50% de inhibición de la síntesis proteica. Este valor se obtiene mediante regresión lineal de la función que relaciona el porcentaje de síntesis con el logaritmo de la concentración de la proteína estudiada.The activity of toxins in these systems is characterized by its IC_ {50}, which is defined as the concentration of RIP or immunotoxin (referred to RIP) that causes 50% of inhibition of protein synthesis. This value is obtained by linear regression of the function that relates the percentage of synthesis with the logarithm of the protein concentration studied.

En el ensayo con la inmunotoxina, ésta se reduce previamente con DTT 50 mM, a 37ºC durante 30 minutos, para separar los componentes del conjugado y que la RIP pueda ejercer su efecto.In the immunotoxin assay, it is reduced previously with 50 mM DTT, at 37 ° C for 30 minutes, to separate the components of the conjugate and that the RIP can exercise its effect.

Con este método, la tasa de síntesis proteica en el lisado se calcula tomando como referencia la producción de luciferasa de Photinus pyralis (luciérnaga americana), enzima sintetizada gracias a un sistema acoplado de transcripción-traducción del cDNA que la codifica (Langer y cols., Anal. Biochem. 243, 150-153 [1996]). Este cDNA está clonado en un plásmido ("Luciferase T7 control DNA", Promega), bajo el control del promotor de la T7 RNA polimerasa.With this method, the protein synthesis rate in the lysate is calculated taking as reference the production of Photinus pyralis luciferase (American firefly), an enzyme synthesized thanks to a coupled transcription-translation system of the coding cDNA (Langer et al. , Anal. Biochem . 243 , 150-153 [1996]). This cDNA is cloned into a plasmid ("Luciferase T7 control DNA", Promega), under the control of the T7 RNA polymerase promoter.

A su vez, la cantidad de luciferasa generada se relaciona con su actividad, fácilmente medible. Esta enzima cataliza la oxidación de la luciferina, y el proceso va acompañado de la emisión de una ráfaga de luz en todas las longitudes de onda, que decae rápidamente.In turn, the amount of luciferase generated is It relates to your activity, easily measurable. This enzyme catalyzes the oxidation of luciferin, and the process is accompanied of the emission of a burst of light at all wavelengths, It decays quickly.

La intensidad de la luz emitida es proporcional a la concentración de luciferasa en el rango de 10^{-16}M a 10^{-8}M.The intensity of the emitted light is proportional to Luciferase concentration in the range of 10-16 M at 10-8 M.

La reacción de síntesis de proteínas se lleva a cabo en un volumen total de 10 \mul, que contiene 5 \mul de lisado, 4 U de T7 RNA polimerasa, 6,4 U de inhibidor de RNasas, 0,25 \mug de plásmido con el gen de la luciferasa clonado, 0,5 \mul de tampón x20 (NTPs 8 mM cada uno; espermidina 4 mM; Tris-HCl pH=7,8 200 mM; KCl 560 mM; MgCl_{2} 20 mM; aminoácidos 40 \muM cada uno), agua tipo I estéril hasta, 8 \mul y 2 \mul de toxina.The protein synthesis reaction takes out in a total volume of 10 µl, which contains 5 µl of lysate, 4 U of T7 RNA polymerase, 6.4 U of RNase inhibitor, 0.25 mug plasmid with the cloned luciferase gene, 0.5 µl buffer x20 (8 mM NTPs each; 4 mM spermidine; Tris-HCl pH = 7.8 200 mM; 560 mM KCl; MgCl2 20 mM; amino acids 40 µM each), sterile type I water up to, 8 mul and 2 mul of toxin.

En primer lugar, se prepara una única mezcla de reacción con todos los componentes indicados excepto la toxina. Esta preparación se incuba durante 10 minutos a 30ºC para que finalice la traducción de los mRNAs endógenos del lisado y se liberen los ribosomas que están unidos a través de los mensajeros formando polisomas ("run-off").First, a single mixture of reaction with all the indicated components except the toxin. This preparation is incubated for 10 minutes at 30 ° C so that finish the translation of the endogenous lRNAs of the lysate and release the ribosomes that are attached through the messengers forming polysomes ("run-off").

El proceso anterior se detiene poniendo la mezcla en hielo.The above process stops putting the mixture in ice.

A continuación, se añaden a cada tubo con toxina 8 \mul de la mezcla anterior, y se incuba durante 30 minutos a 30ºC para que se realice la biosíntesis de la luciferasa. Transcurrido este tiempo, la reacción se bloquea con 25 \mul de agua a temperatura ambiente, que se mezclan por pipeteo. Inmediatamente, se extraen 25 \mul de esta mezcla y se juntan con 25 \mul de reactivo de luciferina (Promega) a temperatura ambiente, contenidos en viales de vidrio.Next, they are added to each tube with toxin 8 µl of the above mixture, and incubate for 30 minutes at 30 ° C for luciferase biosynthesis. After this time, the reaction is blocked with 25 µl of water at room temperature, which are mixed by pipetting. Immediately, 25 µl of this mixture is extracted and combined with 25 µl of luciferin reagent (Promega) at temperature environment, contained in glass vials.

La emisión se detecta con un luminómetro 1254-001 Luminova, de Bio-Orbit, sensible al rango de espectro de 185 a 680 nm. La medida se realiza durante 10 segundos tras una espera inicial de 2 segundos, tiempo en que se estabiliza el tubo fotomultiplicador del aparato.The emission is detected with a luminometer 1254-001 Luminova, from Bio-Orbit, sensitive to the spectrum range from 185 to 680 nm. The measurement is made for 10 seconds after an initial wait of 2 seconds, time in that the photomultiplier tube of the apparatus is stabilized.

El resultado es dado en "unidades relativas de luz", queThe result is given in "relative units of light ", which

ProteínaProtein IC_{50} (ng/ml)IC 50 (ng / ml) IC_{50} (M de RIP)IC_ {50} (M of RIP) musarmina 4 recombinante solublerecombinant musarmine 4 soluble 1.41.4 0,5x10^{-10} M0.5x10 -10 M musarmina 4 recombinante insolublerecombinant musarmine 4 insoluble 8.28.2 2,8x10^{-10} M2.8 x 10-10 M musarmina 4 recombinante derivatizadarecombinant musarmine 4 derivatized 44 1,4x10^{-10} M1.4x10 -10 M 44G4-musarmina 4 recombinante44G4-musarmine 4 recombinant 2525 8,9x10^{-10} M8.9x10 -10 M

corresponde a la intensidad de luz liberada por una muestra durante un período determinado.corresponds to the light intensity released by a sample over a period determined.

En la tabla se resumen los valores de los IC_{50} de la musarmina 4 recombinante aislada de la fracción soluble, de la fracción insoluble, derivatizada con SPDP y formando parte de la inmunotoxina con el anticuerpo monoclonal 44G4.The table summarizes the values of the IC 50 of recombinant musarmine 4 isolated from the fraction soluble, of the insoluble fraction, derivatized with SPDP and forming part of the immunotoxin with the 44G4 monoclonal antibody.

b) Actividad N-glicosidasa de las proteínas inactivadoras de ribosomasb) N-glycosidase activity of the inactivating ribosome proteins

La actividad N-glicosidasa de las RIPs recombinantes se comprueba con la aparición del llamado "fragmento de Endo" (Endo y cols., J. Biol. Chem. 262, 5908-5912 [1987]).The N-glycosidase activity of the recombinant RIPs is checked with the appearance of the so-called "Endo fragment" (Endo et al., J. Biol. Chem. 262 , 5908-5912 [1987]).

En primer lugar, se incuban 70 \mul de lisado de reticulocitos de conejo con 0,4 \mug de la RIP, durante 15 minutos a 37ºC, en una solución con un volumen total de 80 \mul que contiene 20 mM Tris-HCl (pH=7,8), 50 mM KCl, 5 mM DTT y 2mM de acetato de magnesio. La reacción se detiene añadiendo 2 \mul de EDTA 0,5 M pH=8 y 500 \mul de 0,5% SDS/ 50 mM Tris-HCl pH=7,6. El RNA se extrae 3 veces con 500 \mul de fenol saturado con Tris-HCl 10 mM pH=7,8 1mM EDTA; a continuación, se precipita con 2,5 vol. de etanol absoluto frío y 0,1 vol de acetato sódico 3 M pH=5,2, y se mantiene 2 horas a -80ºC. El RNA precipitado se recupera por centrifugación a 13000xg durante 30 minutos a 4ºC. El sedimento se lava con etanol al 70% frío, se deja secar al aire y, finalmente, se disuelve en 10 \mul de agua/DEPC.First, 70 µl of lysate are incubated of rabbit reticulocytes with 0.4 µg of the RIP, for 15 minutes at 37 ° C, in a solution with a total volume of 80 µl containing 20 mM Tris-HCl (pH = 7.8), 50 mM KCl, 5 mM DTT and 2mM magnesium acetate. The reaction stops adding 2 µl of 0.5 M EDTA pH = 8 and 500 µl of 0.5% SDS / 50 mM Tris-HCl pH = 7.6. RNA is extracted 3 times with 500  µl of phenol saturated with 10 mM Tris-HCl pH = 7.8 1mM EDTA; then precipitate with 2.5 vol. of ethanol Absolute cold and 0.1 vol of 3M sodium acetate pH = 5.2, and maintained 2 hours at -80 ° C. The precipitated RNA is recovered by centrifugation at 13000xg for 30 minutes at 4 ° C. The sediment is washed with ethanol 70% cold, let it air dry and finally dissolve in 10 \ mul of water / DEPC.

Para provocar la liberación del fragmento diagnóstico, la muestra se incuba con 1 vol. de anilina 2 M pH=4,5 durante 10 minutos a 0ºC, en oscuridad. El proceso se para por dilución con 200 \mul de agua/DEPC, y la anilina se retira realizando dos extracciones con 200 \mul de éter. El RNA se recupera por precipitación con etanol, según se ha descrito con anterioridad, y su concentración se determina por medida espectrofotométrica tras ser resuspendido en agua/DEPC.To cause fragment release diagnosis, the sample is incubated with 1 vol. 2M aniline pH = 4.5 for 10 minutes at 0 ° C, in darkness. The process stops by dilution with 200 µl of water / DEPC, and the aniline is removed performing two extractions with 200 µl of ether. RNA is recovered by ethanol precipitation, as described with beforehand, and its concentration is determined by measure spectrophotometric after being resuspended in water / DEPC.

La electroforesis del RNA se realiza en condiciones desnaturalizantes, en un gel de poliacrilamida al 5% [4,85% (p/v) de acrilamida y 0,15% (p/v) de bisacrilamida] con urea 7M, preparado según Sallustio y Stanley, J Biol Chem. 265, 582-588 [1990]. En cada pocillo se aplican 7 \mug de RNA disueltos en tampón de carga (sacarosa 130 mg/ml, urea 7M, TBEx1, azul de bromofenol 0,4 \mug/ml), que se han hervido previamente durante 90 segundos. Para desarrollar la electroforesis, se utiliza como tampón de cámara TBE, y se aplica una intensidad de corriente fija de 12 mA durante 130 minutos. Finalmente, el gel se tiñe con bromuro de etidio (0,5 \mug/ml) durante 20 minutos y el RNA se visualiza con luz ultravioleta.RNA electrophoresis is performed under denaturing conditions, on a 5% polyacrylamide gel [4.85% (w / v) acrylamide and 0.15% (w / v) bisacrylamide] with 7M urea, prepared according to Sallustio and Stanley, J Biol Chem . 265 , 582-588 [1990]. 7 µg of RNA dissolved in loading buffer (sucrose 130 mg / ml, urea 7M, TBEx1, bromophenol blue 0.4 µg / ml) are applied to each well, which has been boiled previously for 90 seconds. To develop electrophoresis, it is used as a TBE chamber buffer, and a fixed current intensity of 12 mA is applied for 130 minutes. Finally, the gel is stained with ethidium bromide (0.5 µg / ml) for 20 minutes and the RNA is visualized with ultraviolet light.

En la Figura 7 se observa la aparición del fragmento diagnóstico en las muestras incubadas con las musarminas, y tratadas, a continuación, con anilina. Esta actividad es común tanto a la proteína aislada de fracción soluble como a la obtenida de cuerpos de inclusión.Figure 7 shows the appearance of diagnostic fragment in samples incubated with musarmines, and then treated with aniline. This activity is common. both to the isolated protein of soluble fraction and to that obtained of inclusion bodies.

c) Cultivo de células animalesc) Animal cell culture

Los cultivos celulares de L929 (parentales y transfectadas con S-endoglina CD105) se mantienen en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternera y con los antibióticos penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml); en el caso de la línea transfectada (L929-S), al medio de cultivo se añaden 400 \mug/ml de geneticina.L929 cell cultures (parental and transfected with S-endoglin CD105) are maintained in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum and with the antibiotics penicillin (100 U / ml) and streptomycin (100 mug / ml); in the case of the transfected line (L929-S), 400 are added to the culture medium ug / ml of geneticin.

Las células se incuban a 37ºC bajo atmósfera de 5% en CO_{2} en un incubador Heraeus BB16. Estas líneas celulares crecen en monocapa y tienen un tiempo de duplicación de aproximadamente 24 horas. Antes de que adquieran confluencia, las células se subcultivan, para lo cual es necesario despegarlas del soporte mediante tripsinización en condiciones estériles. Se procede de la siguiente manera: en primer lugar, se retira el medio con una pipeta y se añade un volumen suficiente de tripsina/EDTA (0,05% tripsina y 0,02% EDTA en medio HBSS), que cubra la monocapa celular. A continuación, el frasco se introduce en el incubador a 37ºC durante aproximadamente 5 minutos; después, se bloquea la tripsinización añadiendo un volumen apropiado de medio con suero, en el que se resuspenden las células. Se centrifugan durante 5 minutos a 300xg en una centrífuga ALC 4236, y se resuspende el sedimento de células en el medio adecuado. Seguidamente, se calcula la concentración de las suspensiones mediante el recuento de células en una cámara de Neubauer, en la que se añade una dilución al 50% (v/v) de éstas en azul de Trypan, un colorante que tiñe sólo las células inviables. Por último, se realizan las siembras a una concentración aproximada de 1x10^{4} células/ml, y el medio se renueva cada 3-4 días, cuando se observa un descenso en su pH.The cells are incubated at 37 ° C under an atmosphere of 5% in CO2 in a Heraeus BB16 incubator. These cell lines they grow in monolayer and have a doubling time of approximately 24 hours Before they become confluent, the cells are subcultured, for which it is necessary to detach them from the support by trypsinization under sterile conditions. Be proceeds as follows: first, the medium is removed with a pipette and a sufficient volume of trypsin / EDTA is added (0.05% trypsin and 0.02% EDTA in HBSS medium), which covers the monolayer mobile. Then the bottle is introduced into the incubator to 37 ° C for about 5 minutes; then, the trypsinization by adding an appropriate volume of medium with serum, in the one that resuspend the cells. They are centrifuged for 5 minutes at 300xg in an ALC 4236 centrifuge, and the sediment is resuspended cells in the right medium. Next, the concentration of suspensions by cell count in a Neubauer chamber, in which a 50% dilution is added (v / v) of these in Trypan blue, a dye that dyes only unviable cells. Finally, plantings are performed at a approximate concentration of 1x10 4 cells / ml, and the medium is Renew every 3-4 days, when a decrease in pH

Toda manipulación de las células se lleva a cabo en condiciones de esterilidad en una campana de flujo vertical HVR 2448 de Holten LamiAir.All cell manipulation is carried out in sterile conditions in an HVR vertical flow hood 2448 by Holten LamiAir.

d) Efecto citotóxico de la inmunotoxina 44G4-musarmina 4 recombinante y la musarmina 4 recombinanted) Cytotoxic effect of immunotoxin 44G4-recombinant musarmine 4 and musarmine 4 recombinant

Para determinar la viabilidad celular se utiliza un método colorimétrico basado en la reducción y rotura de la sal de tetrazolio WST-1 por las deshidrogenasas mitocondriales de las células viables. Como producto de esta reacción se genera formazán, un compuesto coloreado y soluble en el medio de cultivo celular, que se cuantifica espectrofotométricamente.To determine cell viability is used a colorimetric method based on salt reduction and breakage of tetrazolium WST-1 by dehydrogenases mitochondrial viable cells. As a product of this reaction is generated formazan, a colored compound and soluble in the cell culture medium, which is quantified spectrophotometrically.

En este ensayo se utiliza una placa de 96 pocillos, en cada uno de los cuales se añaden 3x10^{3} células resuspendidas en 0,1 ml del medio de cultivo apropiado. Las células se incuban durante 24 horas y, después, se sustituye el medio por otros 0,1 ml/pocillo de medio fresco.In this test a 96 plate is used wells, in each of which 3x103 cells are added resuspended in 0.1 ml of the appropriate culture medium. The cells they are incubated for 24 hours and then the medium is replaced by another 0.1 ml / well of fresh medium.

Posteriormente, se lleva a cabo la adición de 5 \mul/pocillo de las toxinas y conjugados correspondientes, diluidos en medio sin suero, y la placa se incuba durante 3 horas más. A continuación, se retira el contenido de los pocillos, se lava cada uno con 100 \mul de medio sin suero y se vuelven a llenar con 100 \mul de medio con suero.Subsequently, the addition of 5 is carried out µl / well of the corresponding toxins and conjugates, diluted in serum-free medium, and the plate is incubated for 3 hours plus. Then, the contents of the wells are removed, wash each with 100 µl of serum-free medium and return to fill with 100 µl of medium with serum.

Las células se incuban durante 72 horas y, transcurrido ese tiempo, se añaden 10 \mul/pocillo del reactivo WST-1. Se deja desarrollar el color durante 1 hora, tras lo cual se procede a la medida con un lector de E.L.I.S.A. (Pasteur Diagnostic, mod. LP400/560) utilizando un filtro que permita medir a 450 nm (muestra) y a 620 nm (referencia). La lectura final es la diferencia entre ambas A_{final} = A_{450} - A_{620}.The cells are incubated for 72 hours and, after that time, 10 µl / well of the reagent is added WST-1 The color is allowed to develop for 1 hour, after which the measure is carried out with a reader of E.L.I.S.A. (Pasteur Diagnostic, mod. LP400 / 560) using a filter that allow measuring at 450 nm (sample) and at 620 nm (reference). The final reading is the difference between both A_ {final} = A_ {450} - A_ {620}.

Cada concentración de proteínas se ensaya en tres pocillos. A cada punto se le resta la contribución de la absorbancia del medio de cultivo y del WST-1 (blanco).Each protein concentration is tested in three wells. The absorbance contribution is subtracted from each point of the culture medium and of the WST-1 (white).

En cada experimento, se emplean como controles, al menos, 6 pocillos en los que se ha seguido el procedimiento anterior, a excepción del tratamiento con la toxina. Los valores de la absorbancia de estos. pocillos se tomarán como 100% de viabilidad celular.In each experiment, they are used as controls, at least 6 wells in which the procedure has been followed above, except for the toxin treatment. The values of the absorbance of these. wells will be taken as 100% of cell viability

La inmunotoxina 44G4-musarmina 4 recombinante causa el 50% de la muerte celular en L929-S a una concentración de 1,5x 10^{-9} M, y es 3 órdenes de magnitud más tóxica para estas células que la toxina aislada, que presenta un IC_{50}= 1,4x 10^{-6} M (Figura 8). Por otra parte, el inmunoconjugado es inocuo en fibroblastos de ratón no transfectados con endoglina humana manteniéndose prácticamente el 100% de la viabilidad celular cuando las células se tratan con 1,4 x 10^{-7} M de inmunotoxina. Por lo tanto, esta inmunotoxina es altamente específica sobre las células blanco. Asimismo, en la línea parental, la conjugación con el anticuerpo disminuye la toxicidad de la musarmina recombinante, que aislada provocaría el 50% de muerteThe 44G4-musarmine 4 immunotoxin recombinant causes 50% of cell death in L929-S at a concentration of 1.5 x 10-9 M, and is 3 orders of magnitude more toxic to these cells than the toxin isolated, which has an IC 50 = 1.4 x 10-6 M (Figure 8). By Moreover, the immunoconjugate is harmless in mouse fibroblasts. not transfected with human endoglin while practically maintaining 100% cell viability when cells are treated with 1.4 x 10-7 M immunotoxin. Therefore, this immunotoxin is highly specific on white cells. Also, on the line parental, conjugation with the antibody decreases the toxicity of recombinant musarmine, which isolated would cause 50% of death

IC50IC50 ProteínaProtein L929L929 L929-SL929-S 44G4-musarmina 4 recombinante44G4-musarmine 4 recombinant >10^{-7} M> 10-7 M 1,5x 10^{-9} M1.5x 10-9 M musarmina 4 recombinantemusarmina 4 recombinant 2,2x10^{-6} M2.2x10-6 M 1,4x10^{-6} M1.4x10-6 M

celular a una concentración de 2,2 x 10^{-6} M. Actividad (IC_{50}) de la inmunotoxina 44G4-musarmina 4 recombinante y la musarmina 4 recombinante libre en distintas líneas celulares:cell at a concentration of 2.2 x 10-6 M. Activity (IC 50) of immunotoxin 44G4-recombinant musarmine 4 and musarmine 4 free recombinant in different lines cell phones:

En la tabla se resumen los valores de los IC_{50} de la musarmina 4 recombinante y de la inmunotoxina con el anticuerpo monoclonal 44G4 sobre las líneas celulares L929 y L929-S transfectada con el gen de la proteína CD105 humana.The table summarizes the values of the IC 50 of recombinant musarmine 4 and immunotoxin with 44G4 monoclonal antibody on L929 cell lines and L929-S transfected with the CD105 protein gene human

<110> Girbés Juan, Tomás<110> Girbés Juan, Tomás 

\hskip1cm
Barriuso Magdaleno, Begoña 
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Barriuso Magdaleno, Begoña 

\hskip1cm
Antolín Martín, Pilar 
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Antolin Martin, Pilar 

\hskip1cm
Arias Vallejo, Francisco J 
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Arias Vallejo, Francisco J 

\hskip1cm
Muñoz Martínez, Raquel 
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Muñoz Martínez, Raquel 

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<120> GEN QUE CODIFICA A UNA PROTEÍNA INACTIVADORA DE RIBOSOMAS DENOMINADA MUSARMINA 4 RECOMBINANTE, EXPRESIÓN EN SISTEMA BACTERIANO, PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE LA MUSARMINA 4 RECOMBINANTE Y APLICACIONES DE DICHA PROTEÍNA DE UTILIDAD EN LA TERAPIA DIRIGIDA A CÉLULAS BLANCO Y EN LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS RESISTENTES A HONGOS, VIRUS Y PREDADORES.<120> GEN CODING A PROTEIN INACTIVATOR OF RIBOSOMES NAME MUSARMINA 4 RECOMBINANT, EXPRESSION IN BACTERIAL SYSTEM, PROCEDURE FOR OBTAINING THE RECOMBINANT MUSARMINE 4 AND APPLICATIONS OF SUCH PROTEIN OF UTILITY IN THERAPY DIRECTED TO WHITE CELLS AND IN PRODUCTION FROM PLANTS RESISTANT TO FUNGI, VIRUSES AND PREDATORS. 

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<130> Musarmina 4 recombinante<130> Recombinant musarmin 4 

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<140><140> 

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<141><141> 

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<160> 2<160> 2 

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1<170> PatentIn Ver. 2.1 

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 1<210> 1 

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 832<211> 832 

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> ADN<212> DNA 

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<213> MUSCARI ARMENIACUM<213> MUSCARI ARMENIACUM 

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<220><220> 

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<221> CDS<221> CDS 

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<222> (4)..(828)<222> (4) .. (828) 

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<400> 1<400> 1 

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip

99

1010 

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<210> 2<210> 2 

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<211> 275<211> 275 

         \vskip0.400000\baselineskip\ vskip0.400000 \ baselineskip

<212> PRT<212> PRT 

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<213> MUSCARI ARMENIACUM<213> MUSCARI ARMENIACUM 

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<400> 2<400> 2

11eleven

1212

Claims (31)

1. Proteína inactivadora de ribosomas denominada musarmina 4 recombinante, caracterizada por la secuencia de aminoácidos SEQ ID nº 2.1. Ribosome inactivating protein called recombinant musarmine 4, characterized by the amino acid sequence SEQ ID No. 2. 2. Gen que codifica la proteína inactivadora de ribosomas denominada musarmina 4 recombinante de la reivindicación 1, caracterizado por la secuencia de nucleótidos SEQ ID nº 1.2. A gene encoding the ribosome inactivating protein called recombinant musarmine 4 of claim 1, characterized by the nucleotide sequence SEQ ID No. 1. 3. Gen que codifica la proteína inactivadora de ribosomas denominada musarmina 4 recombinante de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizado por ser un polinucleótido obtenido por síntesis química.3. A gene encoding the ribosome inactivating protein called recombinant musarmine 4 according to claim 2, characterized in that it is a polynucleotide obtained by chemical synthesis. 4. Gen que codifica la proteína inactivadora de ribosomas denominada musarmina 4 recombinante de acuerdo a las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado por ser un polinucleótido que contiene la secuencia o parte de la secuencia SEQ ID nº 1.4. A gene encoding the ribosome inactivating protein called recombinant musarmine 4 according to claims 2 and 3, characterized in that it is a polynucleotide containing the sequence or part of the sequence SEQ ID No. 1. 5. Gen de acuerdo a la reivindicación 4, caracterizado por una secuencia de ADN que codifica la musarmina 4 recombinante y otras proteínas funcionalmente activas.5. A gene according to claim 4, characterized by a DNA sequence encoding recombinant musarmin 4 and other functionally active proteins. 6. Gen de acuerdo a la reivindicación 5, caracterizado por una secuencia de ADN que codifica la musarmina 4 recombinante y a péptidos y proteínas con propiedades de unión a ligandos específicos.6. A gene according to claim 5, characterized by a DNA sequence encoding recombinant musarmin 4 and peptides and proteins with specific ligand binding properties. 7. Gen de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado por una secuencia de ADN que codifica la musarmina 4 recombinante y a péptidos y proteínas con propiedades de unión a ligandos que son antígenos de superficie de células cancerosas.7. A gene according to claim 6, characterized by a DNA sequence encoding recombinant musarmin 4 and peptides and proteins with ligand binding properties that are surface antigens of cancer cells. 8. Gen de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado por una secuencia de ADN que codifica la musarmina 4 recombinante y a péptidos y proteínas con propiedades de unión a ligandos que son antígenos de superficie celular de células infectadas por virus, en particular el virus responsable del SIDA.8. A gene according to claim 6, characterized by a DNA sequence encoding recombinant musarmin 4 and peptides and proteins with ligand binding properties that are cell surface antigens of virus-infected cells, in particular the virus responsible for AIDS. 9. Procedimiento para la obtención del gen que codifica la proteína inactivadora de ribosomas musarmina 4 recombinante que comprende las etapas: a) amplificación del ADNc que codifica a la musarmina 4 recombinante por técnicas de PCR; b) análisis por 14 electroforesis en geles de agarosa del ADN amplificado por PCR que codifica a la musarmina 4 recombinante; c) introducción en el vector de clonación del ADN que codifica a la cadena de la musarmina 4 recombinante; d) transformación de células de Escherichia coli con el vector recombinante que contiene el ADN que codifica a la musarmina 4 recombinante; e) aislamiento y análisis de las colonias con plásmidos recombinantes del ADN que codifica a la musarmina 4 recombinante; f) secuenciación de los plásmidos con inserto del ADN que codifica a la musarmina 4 recombinante.9. Method for obtaining the gene encoding recombinant musarmine 4 ribosome inactivating protein comprising the steps: a) amplification of the cDNA encoding recombinant musarmine 4 by PCR techniques; b) analysis by 14 agarose gel electrophoresis of the PCR amplified DNA encoding recombinant musarmin 4; c) introduction into the DNA cloning vector encoding the recombinant musarmin 4 chain; d) transformation of Escherichia coli cells with the recombinant vector containing the DNA encoding the recombinant musarmine 4; e) isolation and analysis of the colonies with recombinant plasmids of the DNA encoding the recombinant musarmine 4; f) sequencing of plasmids with DNA insert encoding recombinant musarmin 4. 10. Procedimiento de expresión del gen que codifica la musarmina 4 recombinante caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) producción del fragmento de ADN que codifica para la musarmina recombinante digerido con las enzimas de restricción Nde I y Hind III; b) inserción del fragmento de ADN de la musarmina 4 recombinante en el vector de expresión pET25(+) digerido; c) transformación de células de Escherichia coli con el vector recombinante que contiene el ADN que codifica la musarmina 4 recombinante; d) aislamiento y análisis de las colonias con plásmidos recombinantes del ADN que codifica para la musarmina 4 recombinante; e) transformación de células de E. coli con el vector de expresión recombinante que contiene el ADN que codifica la musarmina 4 recombinante; f) producción y purificación de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción soluble citoplasmática; g) producción de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción insoluble de los cuerpos de inclusión citoplasmáticos; h) purificación de la musarmina 4 recombinante a partir de la fracción insoluble por renaturalización de los cuerpos de inclusión con un detergente y replegamiento por cromatografía de filtración en gel y posterior purificación por cromatografía de intercambio iónico.10. Method of expression of the gene encoding recombinant musarmine 4 characterized in that it comprises the following steps: a) production of the DNA fragment encoding recombinant musarmine digested with restriction enzymes Nde I and Hind III; b) insertion of the recombinant musarmine 4 DNA fragment into the digested expression vector pET25 (+); c) transformation of Escherichia coli cells with the recombinant vector containing the DNA encoding the recombinant musarmine 4; d) isolation and analysis of the colonies with recombinant plasmids of the DNA encoding the recombinant musarmin 4; e) transformation of E. coli cells with the recombinant expression vector containing the DNA encoding the recombinant musarmine 4; f) production and purification of recombinant musarmine 4 from the soluble cytoplasmic fraction; g) production of recombinant musarmine 4 from the insoluble fraction of cytoplasmic inclusion bodies; h) Purification of recombinant musarmine 4 from the insoluble fraction by renaturing the inclusion bodies with a detergent and refolding by gel filtration chromatography and subsequent purification by ion exchange chromatography. 11. Procedimiento de obtención de la proteína inactivadora de ribosomas denominada musarmina 4 recombinante, que consiste en la inserción del gen de la musarmina 4 de acuerdo a las reiv. 2-8, en un vector de expresión e introducción del vector en una célula adecuada.11. Procedure for obtaining protein ribosome inactivator called recombinant musarmine 4, which It consists of inserting the musarmine 4 gene according to the reiv. 2-8, in an expression and introduction vector of the vector in a suitable cell. 12. Procedimiento de acuerdo a la reiv. 11 en que la célula transformada es un microorganismo.12. Procedure according to reiv. 11 in what The transformed cell is a microorganism. 13. El microorganismo obtenido por el procedimiento de la reiv. 12.13. The microorganism obtained by the reiv. procedure 12. 14. Procedimiento de acuerdo a la reiv 11, en que la célula transformada es una célula eucarionte.14. Procedure according to clause 11, in which The transformed cell is a eukaryotic cell. 15. La célula huésped obtenida por el procedimiento de la reiv. 14.15. The host cell obtained by the reiv. procedure 14. 16. Utilización del gen de acuerdo a las reiv 2-8, que codifica la proteína inactivadora de ribosomas musarmina 4, en la obtención de proteínas de fusión denominadas inmunotoxinas recombinantes, con afinidad por blancos específicos para la terapia del cáncer y SIDA por medio de los procedimientos de las reiv 10, 11, 12 y 14.16. Use of the gene according to reiv 2-8, which encodes the inactivating protein of Musarmin 4 ribosomes, in obtaining fusion proteins called recombinant immunotoxins, with white affinity specific to cancer and AIDS therapy through procedures of riv 10, 11, 12 and 14. 17. Utilización del gen de acuerdo a las reiv 2-8, que codifica la proteína inactivadora de ribosomas musarmina 4, en la obtención de plantas transgénicas resistentes a hongos fitopatogénicos, virus animales y predadores animales.17. Use of the gene according to reiv 2-8, which encodes the inactivating protein of musarmin ribosomes 4, in obtaining transgenic plants resistant to phytopathogenic fungi, animal viruses and predators animals. 18. Utilización de la proteína denominada musarmina 4 recombinante, obtenida por la expresión del gen de las reiv 2-8, en la inactivación "in vitro" de ribosomas de cualquier origen sensibles a la proteína.18. Use of the protein called recombinant musarmine 4, obtained by the expression of the gene of reiv 2-8, in the " in vitro " inactivation of ribosomes of any protein-sensitive origin. 19. Utilización de la proteína denominada musarmina 4 recombinante, obtenida por la expresión del gen de las reiv 2-8, en la inactivación "in vitro" del ácido ribonucléico de mamíferos.19. Use of the protein called recombinant musarmine 4, obtained by the expression of the gene of reiv 2-8, in the " in vitro " inactivation of mammalian ribonucleic acid. 20. Utilización de la proteína denominada musarmina 4 recombinante, obtenida por la expresión del gen de las reiv 2-8, en la inactivación del ácido ribonucléico de plantas.20. Use of the protein called recombinant musarmin 4, obtained by the expression of the gene of the reiv 2-8, in the inactivation of ribonucleic acid of plants. 21. Utilización de la proteína denominada musarmina 4 recombinante, obtenida por la expresión del gen de las reiv 2-8, en la construcción de inmunotoxinas. y conjugados con otras especies químicas destinados a inhibir la biosíntesis de proteínas por inactivación de ribosomas de organismos eucariontes.21. Use of the protein called recombinant musarmin 4, obtained by the expression of the gene of the reiv 2-8, in the construction of immunotoxins. Y conjugated with other chemical species intended to inhibit the protein biosynthesis by inactivation of ribosomes of eukaryotic organisms 22. Utilización de la proteína denominada musarmina 4 recombinante, obtenida por la expresión del gen de las reiv 2-8, en la construcción de inmunotoxinas y conjugados con otras especies químicas destinados a promover la apoptosis de las células blanco y de las células dependientes de ellas.22. Use of the protein called recombinant musarmin 4, obtained by the expression of the gene of the reiv 2-8, in the construction of immunotoxins and conjugated with other chemical species intended to promote apoptosis of white cells and cells dependent on they. 23. Utilización de la proteína denominada musarmina 4 recombinante, obtenida por la expresión del gen de las reiv 2-8, en la fabricación de medicamentos útiles en el tratamiento de los distintos tipos de cáncer.23. Use of the protein called recombinant musarmin 4, obtained by the expression of the gene of the reiv 2-8, in the manufacture of useful medicines in the treatment of different types of cancer. 24. Utilización de la proteína denominada musarmina 4 recombinante, obtenida por la expresión del gen de las reiv 2-8, en la fabricación de medicamentos útiles en el tratamiento de enfermedades de mamíferos provocadas o mantenidas por virus y en particular los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y de la hepatitis C.24. Use of the protein called recombinant musarmin 4, obtained by the expression of the gene of the reiv 2-8, in the manufacture of useful medicines in the treatment of diseases of mammals caused or maintained by viruses and in particular viruses from the human immunodeficiency (HIV) and hepatitis C. 25. Utilización de la proteína denominada musarmina 4 recombinante, obtenida por la expresión del gen de las reiv 2-8, en la fabricación de medicamentos útiles en el tratamiento de enfermedades de mamíferos y plantas en que dichas proteínas se empleen modificadas químicamente por alquilación y/o tiolación.25. Use of the protein called recombinant musarmin 4, obtained by the expression of the gene of the reiv 2-8, in the manufacture of useful medicines in the treatment of diseases of mammals and plants in which said proteins are chemically modified by alkylation and / or thiolation. 26. Una composición para el tratamiento terapéutico que comprende como ingrediente activo una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado, inmunotoxina o proteína obtenido por expresión del gen de las reiv 2-8, sola o como parte de una mezcla.26. A composition for treatment therapeutic comprising as active ingredient a quantity therapeutically effective of a conjugate, immunotoxin or protein obtained by expression of the gene of reiv 2-8, alone or as part of a mixture. 27. La composición de la reiv 26, que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.27. The composition of reiv 26, which comprises a pharmaceutically acceptable vehicle. 28. La composición de las reiv 26,27 para su utilización en el tratamiento de las enfermedades neoplásicas.28. The composition of reiv 26.27 for its use in the treatment of neoplastic diseases. 29. La composición de las reiv 26,27 para su utilización en el tratamiento contra la neovasculatura. tumoral.29. The composition of reiv 26.27 for its use in the treatment against neovasculature. tumor. 30. La composición de las reiv 26,27 para su utilización en el tratamiento contra la angiogénesis asociada a enfermedades distintas de las neoplásicas.30. The composition of reiv 26.27 for its use in the treatment against angiogenesis associated with diseases other than neoplastic. 31. Composición de acuerdo a reiv 26-30, en la que el brazo de conexión química es N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionato o cualquier otro reactivo aceptable y con la misma finalidad.31. Composition according to reiv 26-30, in which the chemical connection arm is N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) -propionate or any other acceptable reagent and for the same purpose.
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