ES2239545B1 - COMPETITIVE ELISA FOR THE DETECTION OF HYDROLYZED GLUTEN AND ITS APPLICATIONS. - Google Patents
COMPETITIVE ELISA FOR THE DETECTION OF HYDROLYZED GLUTEN AND ITS APPLICATIONS.Info
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Abstract
ELISA competitivo para la detección de gluten hidrolizado y sus aplicaciones. La presente invención consiste en un kit de ELISA competitivo para identificar gluten hidrolizado en alimentos y materias primas, y su uso. La ventaja que presenta este kit sobre otros es la de permitir la identificación de gluten hidrolizado.Competitive ELISA for the detection of hydrolyzed gluten and its applications. The present invention consists of a competitive ELISA kit to identify hydrolyzed gluten in foods and raw materials, and their use. The advantage of this kit over others is that it allows the identification of hydrolyzed gluten.
Description
ELISA competitivo para la detección de gluten hidrolizado y sus aplicaciones.Competitive ELISA for gluten detection Hydrolyzate and its applications.
Esta invención se relaciona, en general, con el análisis de alimentos para enfermos celiacos, y, en particular, se refiere a un procedimiento para la identificación de gluten hidrolizado en alimentos y materias primas, y en concreto a un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) competitivo, y a los kits que comprende dicho ELISA.This invention relates, in general, to the food analysis for celiac patients, and in particular refers to a procedure for the identification of gluten hydrolyzed in food and raw materials, and specifically a competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and to the kits comprising said ELISA.
Se está descubriendo, con el perfeccionamiento de técnicas diagnósticas y analíticas, que la Enfermedad Celiaca presenta una prevalencia muy elevada, de alrededor de 1 de cada 160 individuos (Fasano A. European and North American populations should be screened for coeliac disease. Gut 2003 Feb; 52(2): 168-9). El único tratamiento válido que tiene esta enfermedad, hasta el momento, es la supresión del gluten en la dieta del enfermo (Luchtefeld W, Burton MS, Donavon P. The importance of a gluten-free diet. Nurse Pract. 2003 Jul; 28(7 Pt 1): 47-9); y desde hace años se está trabajando en el desarrollo de alimentos especiales para celiacos, en los que esté controlada la ausencia de gluten. Por tanto, es muy importante el desarrollo que se lleve a cabo en cuanto a técnicas de detección y cuantificación de gluten, tanto en alimentos ya preparados como en las materias primas con las que se van a preparar. El gluten, que forma parte de un grupo de proteínas denominadas prolaminas, está compuesto por diversas proteínas y se encuentra en los cereales, siendo el de algunos de ellos tóxico para los celiacos, como es el caso del trigo (gliadinas), la cebada (hordeinas) y el centeno (secalinas). Gran parte de los alimentos para enfermos celiacos han sido sometidos a procesos de hidrólisis en su elaboración. El gluten se encuentra frecuentemente hidrolizado en productos tales como siropes, alimentos infantiles, cervezas, etc, no pudiéndose medir con exactitud usando el sistema ELISA-R5 tipo Sándwich (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May; 15 (5): 465-74). Dado que el ELISA-R5 Sándwich está diseñado para cuantificar gluten (gliadinas, hordeinas y secalinas) que se encuentre intacto, podría ser ideal el desarrollo de un sistema de ELISA-R5 Competitivo que sea capaz de detectar y cuantificar gluten hidrolizado incluso a nivel de muy pocos aminoácidos, necesitando simplemente que aparezca un solo epítopo en los fragmentos. La capacidad de necesitar tan sólo la existencia de un solo epítopo en los fragmentos hidrolizados seria la gran ventaja de la utilización de un ELISA-R5 Competitivo.Being discovered, the development of diagnostic and analytical techniques, that celiac disease has a very high prevalence, about 1 in 160 individuals (Fasano A. European and North American Populations Should be screened for celiac disease. Gut 2003 Feb. ; 52 (2): 168-9). The only valid treatment that this disease has, so far, is the suppression of gluten in the patient's diet (Luchtefeld W, Burton MS, Donavon P. The importance of a gluten-free diet. Nurse Pract . 2003 Jul; 28 ( 7 Pt 1): 47-9); and for years it is working on the development of special foods for celiacs, in which the absence of gluten is controlled. Therefore, the development that is carried out in terms of gluten detection and quantification techniques is very important, both in prepared foods and in the raw materials with which they are to be prepared. Gluten, which is part of a group of proteins called prolamines, is made up of various proteins and is found in cereals, some of them being toxic to celiacs, such as wheat (gliadins), barley ( hordeinas) and rye (secalinas). Much of the food for celiac patients has undergone hydrolysis processes in its preparation. Gluten is frequently hydrolyzed in products such as syrups, baby foods, beers, etc., and it cannot be measured accurately using the ELISA-R5 sandwich system (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low- level gluten determination in foods using a novel sandwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May; 15 (5): 465-74). Since the ELISA-R5 Sandwich is designed to quantify gluten (gliadins, hordeins and secaline) that is intact, it could be ideal to develop a Competitive ELISA-R5 system that is capable of detecting and quantifying hydrolyzed gluten even at the level of very few amino acids, simply needing a single epitope to appear in the fragments. The ability to need only the existence of a single epitope in the hydrolyzed fragments would be the great advantage of using a Competitive ELISA-R5.
La invención se enfrenta con el problema de proporcionar nuevos procedimientos y herramientas para la identificación de gluten en alimentos y materias primas.The invention faces the problem of provide new procedures and tools for Identification of gluten in food and raw materials.
La solución proporcionada por esta invención se basa en que es posible cuantificar, por primera vez, con gran exactitud prolaminas hidrolizadas, o más preferentemente parcialmente hidrolizadas, mediante un ELISA Competitivo basado en el anticuerpo monoclonal R5 utilizado en el ELISA-R5 Sándwich (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May; 15 (5): 465-74), y en el uso de un estándar de gliadinas nativas, hidrolizadas mediante una serie de enzimas proteólíticas, y, sorprendentemente, gliadinas no hidrolizadas, y obteniéndose en ambos casos unos valores de recuperación cuantitativa superiores a los del ELISA-R5 Sándwich convencional.The solution provided by this invention is based on the fact that it is possible to quantify, for the first time, with high accuracy hydrolyzed prolamines, or more preferably partially hydrolyzed, by means of a Competitive ELISA based on the R5 monoclonal antibody used in the ELISA-R5 Sandwich (Valdes I , Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sandwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May; 15 (5): 465-74), and in the use of a standard of native gliadins, hydrolysed by a series of proteolytic enzymes, and, surprisingly, non-hydrolyzed gliadins, and in both cases obtaining quantitative recovery values higher than those of the conventional ELISA-R5 Sandwich.
Así, un objeto de la presente invención lo constituye un "equipo" kit de ELISA Competitivo, en adelante kit de ELISA Competitivo de la presente invención, basado en el uso de un único anticuerpo monoclonal que reconoce un fragmento de gluten con uno o más epítopos relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad celiaca, preferentemente el anticuerpo monoclonal R5 (Osman AA, Uhlig HH, Valdes I, Amin M, Mendez E, Mothes T. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2001 Oct;13(10): 1189-93), y un estándar seleccionado entre el siguiente grupo: a) un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas nativas no hidrolizadas, preferentemente, el estándar EE "nativo" o b) de un "pool" de diferentes digestiones realizadas sobre un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas nativas, preferentemente, a partir del EE, con distintas enzimas proteolíticas, para la detección y cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) parcialmente hidrolizadas presentes como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido sometidos a tratamiento proteolítico.Thus, an object of the present invention is constitutes a "team" ELISA Competitive kit, hereinafter Competitive ELISA kit of the present invention, based on the use of a single monoclonal antibody that recognizes a fragment of gluten with one or more epitopes related to the toxicity of gluten in patients with celiac disease, preferably the monoclonal antibody R5 (Osman AA, Uhlig HH, Valdes I, Amin M, Mendez E, Mothes T. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2001 Oct; 13 (10): 1189-93), and a standard selected from the following group: a) a standard developed to from a set of non-hydrolyzed native gliadins, preferably, the "native" EE standard or b) of a "pool" of different digestions made on a standard made from a set of native gliadins, preferably, from the EE, with different enzymes proteolytic, for the detection and quantification of prolamines (gliadins, hordeins and secalins) partially hydrolyzed present as contaminants in food or raw materials, which They have undergone proteolytic treatment.
Por ello, otro objeto de la invención lo constituye el uso del "kit" de ELISA Competitivo de la presente invención para la identificación y cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas presentes como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido sometidos a tratamiento proteolítico, entre otros, los pertenecientes al siguiente grupo: siropes, alimentos infantiles (papillas sin gluten, papillas hidrolizadas, etc) y cervezas.Therefore, another object of the invention is constitutes the use of the "ELISA Competitive" kit present invention for the identification and quantification of Hydrolyzed prolamines (gliadins, hordeins and secalins) present as contaminants in food or raw materials, which have been undergoing proteolytic treatment, among others, belonging to the following group: syrups, baby food (gluten-free porridge, hydrolyzed porridge, etc.) and beers.
Lo más importante de dicho desarrollo es que, por una parte se resuelve el problema que existía hasta entonces para la correcta detección y cuantificación de gluten hidrolizado en alimentos que han pasado por procesos proteolíticos, y por otra parte es que el uso de un estándar de reconocimiento europeo (BE) da robustez al método, y el que se use en su estado nativo (sin ningún tipo de tratamiento enzimático) hace el método más reproducible y preciso.The most important thing about this development is that, on the one hand the problem that existed until then is solved for the correct detection and quantification of hydrolyzed gluten in foods that have gone through proteolytic processes, and another part is that the use of a European recognition standard (BE) gives robustness to the method, and that used in its native state (without any type of enzyme treatment) makes the method more reproducible and precise.
Así, un objeto de la presente invención lo constituye un kit de ELISA Competitivo, en adelante kit de ELISA Competitivo de la presente invención, basado en el uso de un único anticuerpo monoclonal que reconoce un fragmento de gluten con uno o más epítopos relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad celiaca, preferentemente el anticuerpo monoclonal R5 (Osman AA, Uhlig HH, Valdes I, Amin M, Mendez E, Mothes T. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2001 Oct;13(10): 1189-93), y un estándar seleccionado entre el siguiente grupo: a) un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas nativas no hidrolizadas, preferentemente, el estándar EE "nativo" o b) de un "pool" de diferentes digestiones realizadas sobre un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas nativas, preferentemente, a partir del EE, con distintas enzimas proteolíticas, para la detección y cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) parcialmente hidrolizadas presentes como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido sometidos a tratamiento proteolítico.Thus, an object of the present invention is It constitutes a Competitive ELISA kit, hereinafter ELISA kit Competitive of the present invention, based on the use of a single monoclonal antibody that recognizes a gluten fragment with one or more epitopes related to gluten toxicity in patients with celiac disease, preferably the R5 monoclonal antibody (Osman AA, Uhlig HH, Valdes I, Amin M, Mendez E, Mothes T. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins Eur J Gastroenterol Hepatol. 2001 Oct; 13 (10): 1189-93), and a standard selected among the following group: a) a standard developed from a set of non-hydrolyzed native gliadins, preferably the standard "Native" EE or b) of a "pool" of different digestions made on a standard made from a set of native gliadins, preferably, from the EE, with different proteolytic enzymes, for the detection and quantification of Prolamines (gliadins, hordeins and secaline) partially hydrolysates present as contaminants in food or materials premiums, which have undergone proteolytic treatment.
El término "epítopos relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad celiaca" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a los epítopos pertenecientes al siguiente grupo: QQPFP, LQPFP, QLPYP, QLPTP, QQSFP, QQTFP, PQPFP, QQPYP, PQPFP (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May;15 (5): 465-74) y epítopos presentes en el recientemente descrito péptido 33-mer supuestamente tóxico para los enfermos celiacos (Lu Shan, \Phiyvind Molberg, Isabelle Parrot, Felix Hausch, Ferda Filiz, Gary M. Gray, Ludvig M. Sollid, Chaitan Khosla. Structural Basis for Gluten Intolerance in Celiac Sprue. Science 2002 Sep;297: 2275-2279).The term "epitopes related to gluten toxicity in patients with celiac disease" as used in the present invention refers to epitopes belonging to the following group: QQPFP, LQPFP, QLPYP, QLPTP, QQSFP, QQTFP, PQPFP, QQPYP, PQPFP (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sandwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May; 15 (5): 465-74 ) and epitopes present in the recently described 33-mer peptide supposedly toxic to celiac patients (Lu Shan, \ Phiyvind Molberg, Isabelle Parrot, Felix Hausch, Ferda Filiz, Gary M. Gray, Ludvig M. Sollid, Chaitan Khosla. Structural Basis for Gluten Intolerance in Celiac Sprue. Science 2002 Sep; 297: 2275-2279).
Un objeto específico de la presente invención lo constituye el kit de ELISA Competitivo de la presente invención en el que el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal R5 y el estándar seleccionado es el EE "nativo".A specific object of the present invention is constitutes the Competitive ELISA kit of the present invention in which the monoclonal antibody is the R5 monoclonal antibody and the Selected standard is the "native" EE.
Otro objeto específico de la presente invención lo constituye el kit de ELISA Competitivo de la presente invención en el que el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal R5 y el estándar seleccionado es un "pool" de diferentes digestiones realizadas sobre el EE con distintas enzimas proteolíticas, preferentemente con las enzimas pertenecientes al siguiente grupo: pepsina, tripsina/pepsina, tripsina y quimiotripsina.Another specific object of the present invention it is the Competitive ELISA kit of the present invention wherein the monoclonal antibody is the R5 monoclonal antibody and the selected standard is a "pool" of different digestions made on the EE with different enzymes proteolytic, preferably with enzymes belonging to next group: pepsin, trypsin / pepsin, trypsin and chymotrypsin
Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso del kit de ELISA Competitivo de la presente invención para la identificación y cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas presentes como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido sometidos a tratamiento proteolítico, entre otros, los pertenecientes al siguiente grupo: siropes, alimentos infantiles (papillas sin gluten, papillas hidrolizadas, etc) y cervezas.Another object of the present invention is constitutes the use of the Competitive ELISA kit of this invention for the identification and quantification of prolamins (gliadins, hordeins and secalins) hydrolysed present as contaminants in food or raw materials, which have been subjected to proteolytic treatment, among others, those belonging to next group: syrups, baby food (porridge without gluten, hydrolyzed porridge, etc.) and beers.
En resumen, las ventajas de este nuevo ELISA R5 Competitivo son:In summary, the advantages of this new ELISA R5 Competitive are:
a) La utilización como estándar de gliadinas completas, preferentemente el Estándar Europeo (en adelante, EE) de gliadinas "nativo", que está validado por el Prolamin Working Group, y recomendado para su utilización en ELISAs para la detección de gluten, se puede conseguir comercialmente y no requiere una preparación especial. Esta ventaja es la más relevante en el desarrollo de este ELISA Competitivo dado que puede universalizar su uso, de manera fiable y reproducible, resolviendo el problema de la búsqueda de un estándar hidrolizado representativo de todos los tipos de procesos que pueden sufrir las materias primas desde su origen hasta que llegan a formar parte de un producto final.a) The use as a standard of gliadins complete, preferably the European Standard (hereinafter, EE) of "native" gliadins, which is validated by the Prolamin Working Group, and recommended for use in ELISAs for gluten detection, can be achieved commercially and does not require A special preparation. This advantage is the most relevant in the development of this Competitive ELISA since it can universalize its use, in a reliable and reproducible way, solving the problem of the search for a representative hydrolyzed standard of all types of processes that raw materials can suffer from their origin until they become part of a final product.
b) También se puede usar como estándar un "pool" de digeridos enzimáticos del EE en el ELISA-R5 Competitivo con una eficacia similar a la del "nativo", con el inconveniente de que la preparación del "pool" de digeridos es más laboriosa y menos reproducible.b) A standard can also be used as a standard "pool" of EE enzymatic digestes in the ELISA-R5 Competitive with an efficiency similar to the of the "native", with the drawback that the preparation of Digested pool is more laborious and less reproducible.
c) La ventaja del ELISA-R5 Competitivo es que permite cuantificar en su totalidad fragmentos de prolaminas de trigo/cebada/centeno de alto o bajo peso molecular que contengan uno o más epítopos, en comparación con el ELISA-R5 Sándwich que está limitado a cuantificar fragmentos con más de dos epítopos.c) The advantage of ELISA-R5 Competitive is that it allows to quantify in its entirety fragments of high or low molecular weight wheat / barley / rye prolamines containing one or more epitopes, compared to the ELISA-R5 Sandwich that is limited to quantify fragments with more than two epitopes.
d) Dicha ventaja del ELISA-R5 Competitivo basado en el EE "nativo" respecto al ELISA-R5 Sándwich, se confirma en los altos valores obtenidos en alimentos que contienen gluten hidrolizado (siropes y cervezas) en comparación con los resultados obtenidos con el ELISA-R5 Sándwich que infravaloran la presencia de gluten, tóxico para los enfermos celiacos, en dichos alimentos (Figura 3).d) Said advantage of ELISA-R5 Competitive based on the "native" EE with respect to ELISA-R5 Sandwich, confirmed at high values obtained in foods containing hydrolyzed gluten (syrups and beers) compared to the results obtained with the ELISA-R5 Sandwich that underestimate the presence of gluten, toxic for celiac patients, in these foods (Figure 3).
Figura 1. SDS-PAGE (Izquierda) y Western-Blot R5 (derecha) de los resultados del EE "nativo" (Nat.) de las digestiones del EE de gliadinas, con Pepsina (P), Tripsina (T), Tripsina+Pepsina (T+P), Quimiotripsina (QT), y del Pool (preparado a partes iguales, P:T:T+P:QT:Nativo;1:1:1:1:1).Figure 1. SDS-PAGE (Left) and Western-Blot R5 (right) of EE results "native" (Nat.) of the digestions of the gliadin EE, with Pepsin (P), Trypsin (T), Trypsin + Pepsin (T + P), Chymotrypsin (QT), and the Pool (prepared equally, P: T: T + P: QT: Native; 1: 1: 1: 1: 1).
Figura 2. Curvas utilizando como estándar el EE "nativo" o el "pool" para la cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas, en un ELISA Competitivo basado en el anticuerpo monoclonal R5.Figure 2. Curves using the EE as standard "native" or the "pool" for the quantification of prolamins (gliadins, hordeins and secalins) hydrolyzed, in an ELISA Competitive based on the R5 monoclonal antibody.
Figura 3. Valores superiores de gliadinas obtenidos con el ELISA-R5 Competitivo en el análisis de alimentos que tienen gliadinas hidrolizadas (siropes y cervezas) respecto al ELISA-R5 Sándwich.Figure 3. Higher values of gliadins obtained with the Competitive ELISA-R5 in the analysis of foods that have hydrolyzed gliadins (syrups and beers) with respect to the ELISA-R5 Sandwich.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.The following examples illustrate the invention and they should not be considered in a limiting sense of it.
Para el diseño de un ELISA Competitivo (Crowther J R (1995) ELISA, theory and practice. Methods in Molecular Biology, vol 42, pp 35-50. New Jersey: Humana Press Inc.) que sea capaz de detectar y cuantificar fragmentos pequeños de prolaminas hidrolizadas presentes en determinados alimentos como siropes, cervezas, alimentos infantiles, etc, existen dos problemas que hay que afrontar:For the design of a Competitive ELISA (Crowther JR (1995) ELISA, theory and practice. Methods in Molecular Biology , vol 42, pp 35-50. New Jersey: Humana Press Inc.) that is capable of detecting and quantifying small fragments of Hydrolyzed prolamines present in certain foods such as syrups, beers, baby foods, etc., there are two problems that must be addressed:
a) El primero de ellos es seleccionar qué tipo de estándar hidrolizado debería usarse, que sea similar al de las gliadinas hidrolizadas en los alimentos, para detectar prolaminas hidrolizadas, y con el que realizar la curva estándar. Por este motivo hemos diseñado estándares basados en el Estándar de Referencia Europeo de Gliadinas, a partir de ahora EE, (Ref.: IRMM-480: Klein C, Franchini F, Schimmel H. Towards a certified reference material for "Gliadin from European Wheat": study design and methodological approaches. Proceedins of the 17^{th} Meeting. Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity 2002 Oct; 113-117) digerido con enzimas proteolíticas, y un "pool" de estos digeridos, y el propio EE "nativo".a) The first one is to select what type Standard hydrolyzate should be used, which is similar to that of gliadins hydrolyzed in food, to detect prolamines hydrolyzed, and with which to perform the standard curve. For this reason we have designed standards based on the Standard of European Reference of Gliadinas, from now on EE, (Ref .: IRMM-480: Klein C, Franchini F, Schimmel H. Towards a certified reference material for "Gliadin from European Wheat ": study design and methodological approaches. Proceedins of the 17th Meeting. Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity 2002 Oct; 113-117) digested with enzymes proteolytic, and a "pool" of these digested, and the EE itself "native".
b) El segundo de ellos es qué anticuerpo usar para que sea capaz de detectar pequeños fragmentos hidrolizados, incluso hasta un nivel de pocos aminoácidos (4-5 aa). Hemos seleccionado el anticuerpo monoclonal R5 porque tiene la ventaja de su gran capacidad de reconocer numerosos epítopos relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad celiaca (QQPFP, LQPFP, QLPYP, QLPTP, QQSFP, QQTFP, PQPFP, QQPYP y PQPFP) (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May;15 (5): 465-74), que aparecen muy repetidos en las prolaminas, y cuya secuencia es muy corta, pudiendo ser el idóneo para reconocer fragmentos digeridos hasta incluso a nivel de pocos aminoácidos.b) The second of them is what antibody to use to be able to detect small hydrolyzed fragments, even to a level of few amino acids (4-5 aa). We have selected the R5 monoclonal antibody because it has the advantage of its great ability to recognize numerous epitopes related to gluten toxicity in patients with celiac disease (QQPFP, LQPFP, QLPYP, QLPTP, QQSFP, QQTFP, PQPFP, QQPYP and PQPFP) (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sandwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May; 15 (5): 465-74), which they appear very repeated in prolamines, and whose sequence is very short, being able to recognize digested fragments even at the level of few amino acids.
Para comprobar que las digestiones del EE habían funcionado tal y como se esperaba se llevaron a cabo dos tipos de análisis, primero se realizó un SDS-PAGE, con el fin de observar el perfil de bandas que se obtenían en las distintas digestiones por separado, en un "pool" de dichas digestiones y en el EE nativo, y si realmente estaba digerido el material y a qué nivel, y segundo un Western-Blot R5 (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May; 15(5): 465-74) para comprobar si los fragmentos obtenidos eran susceptibles de ser reconocidos por el anticuerpo R5 con el que posteriormente se iba a desarrollar el ELISA Competitivo (Figura 1). En ella se puede observar a la izquierda el patrón de péptidos que presentan las distintas muestras analizadas mediante un gel SDS-PAGE. En el carril de la izquierda se ve el patrón que presenta el EE nativo (Nat), donde se puede observar la zona con bandas más oscuras, correspondientes a las fracciones de gliadinas, en las columnas situadas a continuación hacia la derecha se puede apreciar como el tratamiento enzimático al que se le ha sometido provoca un cambio en el perfil peptídico de dicho EE, en mayor o menor grado, quedando demostrado que las distintas digestiones habían actuado sobre el mismo, degradándolo en mayor o menor medida. Cuando se completó el estudio realizando un Western Blot con el anticuerpo monoclonal R5, se observó (a la derecha en la Figura 1) que aún estando hidrolizados, los péptidos que se generaban presentaban inmunorreactividad frente a dicho anticuerpo, observándose también el grado distinto de hidrólisis que obtenido según las enzimas usadas para ello, todo eso nos empujó a pensar en el anticuerpo monoclonal R5 como idóneo para el desarrollo de este ELISA Competitivo.To verify that the EE digestions had worked as expected, two types of analyzes were carried out, an SDS-PAGE was first performed, in order to observe the profile of bands that were obtained in the different digestions separately, in a "pool" of these digestions and in the native EE, and if the material was actually digested and at what level, and secondly a Western-Blot R5 (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low- level gluten determination in foods using a novel sandwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May; 15 (5): 465-74) to check if the fragments obtained were capable of being recognized by the R5 antibody with which subsequently the Competitive ELISA was to be developed (Figure 1). In it you can see on the left the pattern of peptides that present the different samples analyzed by means of an SDS-PAGE gel. In the left lane you can see the pattern presented by the native EE (Nat), where you can see the area with darker bands, corresponding to the gliadin fractions, in the columns below to the right you can see how the enzymatic treatment to which it has been subjected causes a change in the peptide profile of said EE, to a greater or lesser degree, being demonstrated that the different digestions had acted on it, degrading it to a greater or lesser extent. When the study was completed by performing a Western Blot with the R5 monoclonal antibody, it was observed (on the right in Figure 1) that even being hydrolyzed, the peptides that were generated presented immunoreactivity against said antibody, also observing the different degree of hydrolysis that obtained according to the enzymes used for it, all that pushed us to think of the R5 monoclonal antibody as ideal for the development of this Competitive ELISA.
Se procedió a la realización de un ELISA Competitivo basado en el anticuerpo monoclonal R5 de cantidades controladas de cada uno de los estándares preparados. Representadas las curvas obtenidas con los estándares de las distintas digestiones, así como el "pool" de digeridos con "nativo", y el nativo original, se observó, que todas las curvas eran muy similares y próximas, incluyendo las más digeridas y el "nativo" sin digerir (Figura 2). Por lo tanto, se puede concluir que el EE "nativo" puede ser usado perfectamente como estándar para el desarrollo del ELISA-R5 Competitivo (Figura 2).An ELISA was carried out Competitive based on the monoclonal antibody R5 of quantities controlled of each of the prepared standards. Represented the curves obtained with the standards of the different digestions, as well as the "pool" of digested with "native", and the original native, it was observed, that all the curves were very similar and upcoming, including the most digested and the "native" undigested (Figure 2). Therefore, you can conclude that the "native" EE can be used perfectly as standard for the development of ELISA-R5 Competitive (Figure 2).
Al evaluar el nuevo prototipo de ELISA-R5 Competitivo se pensó en la posibilidad de realizar el proceso usando tanto el EE "nativo", como estándar para la curva del ELISA, como el "pool" de digeridos, con el fin de dilucidar cuál seria el más apropiado, dado que como se observa en la Figura 2 dan ambos unas curvas casi solapadas. Hay que tener en cuenta que la utilización como estándar del EE de gliadinas "nativo", que está validado por el Prolamin Working Group, y recomendado para su utilización en ELISAs para la detección de gluten, se puede conseguir comercialmente y no requiere una preparación especial, mientras que un estándar de un "pool" de digeridos enzimáticos del EE presenta el inconveniente de que la preparación del "pool" de digeridos es más laboriosa y menos reproducible.When evaluating the new prototype of ELISA-R5 Competitive thought about the possibility of perform the process using both the "native" EE, as standard for the ELISA curve, such as the "pool" of digested, with the in order to elucidate which would be the most appropriate, since as observed in Figure 2 both give almost overlapping curves. There is to take into account that the use as standard of the EE of "native" gliadins, which is validated by the Prolamin Working Group, and recommended for use in ELISAs for gluten detection, can be achieved commercially and not requires special preparation while a standard of a EE pool of enzymatic digestes presents the disadvantage that the preparation of the digested pool is more laborious and less reproducible.
Entonces, con las distintas soluciones de las muestras de cada digestión y de sus controles nativos se prepararon unas muestras a concentraciones conocidas de gliadinas (5, 12.5, 25 y 50 partes por millón, teóricas), con el fin de comprobar el grado de recuperación que se obtenía usando el EE tanto "nativo" como el "pool" (ver Tabla 1 y 2, respectivamente). Se obtuvo un rendimiento alto, unos valores muy elevados de recuperación entre los valores teóricos de las muestras cuantificadas (en el caso de las digestiones con Pepsina, Tripsina, y el "pool" de digeridos más nativo), valores que se encuentran entre el 90.2-96% (Tabla 1), y cuando se evalúan usando como estándar un pool de digeridos enzimáticos del EE, se obtienen unos valores cuantitativos, aunque sobrestiman ligeramente las muestras (Tabla 2).Then, with the different solutions of the samples of each digestion and its native controls were prepared samples at known concentrations of gliadins (5, 12.5, 25 and 50 parts per million, theoretical), in order to check the degree of recovery that was obtained using the EE both "native" as the "pool" (see Table 1 and 2, respectively). High performance was obtained, very high values high recovery between the theoretical values of the samples quantified (in the case of digestions with Pepsin, Trypsin, and the most native digested pool), values found between 90.2-96% (Table 1), and when evaluated using as standard a pool of enzymatic digested from the EE, it they obtain quantitative values, although they slightly overestimate the samples (Table 2).
Además se usó el ELISA-R5 Sándwich con el fin de comprobar el resultado que daban las muestras nativas y digeridas por cada uno de los dos sistemas. Los resultados obtenidos en el análisis de estas muestras teóricas rindieron los porcentajes de recuperación que se muestra en la Tabla 3.In addition, ELISA-R5 was used Sandwich in order to check the result given by the native and digested samples by each of the two systems. The results obtained in the analysis of these theoretical samples yielded the percentages of recovery shown in the Table 3.
Estos datos obtenidos con el ELISA-R5 Competitivo son cuantitativos y contrastan con los valores de entre el 70-80% de recuperación obtenidos usando el ELISA-R5 Sándwich (que no permite cuantificar péptidos con un solo epítopo).These data obtained with the Competitive ELISA-R5 are quantitative and contrast with values between 70-80% recovery obtained using the ELISA-R5 Sandwich (not allows quantifying peptides with a single epitope).
Dichos resultados avalan la validez del método de cuantificación de prolaminas hidrolizadas, mediante un ELISA Competitivo en el que se usa como estándar el EE "nativo" y el anticuerpo monoclonal R5, para el análisis de alimentos (siropes, alimentos infantiles (papillas hidrolizadas, papillas sin gluten) y cervezas, entre otros, y materias primas, tales como los almidones de trigo, que pueden venir contaminados con prolaminas de trigo (gliadinas) que se encuentren parcialmente hidrolizadas.These results support the validity of the method for quantification of hydrolyzed prolamines, using an ELISA Competitive in which the "native" EE and the standard are used as standard R5 monoclonal antibody, for food analysis (syrups, baby food (hydrolyzed porridge, gluten-free porridge) and beers, among others, and raw materials, such as starches of wheat, which may come contaminated with wheat prolamines (gliadins) that are partially hydrolyzed.
Además, se realizó un estudio sobre la sensibilidad del método y el límite de detección, y se obtuvieron los siguientes valores:In addition, a study on the sensitivity of the method and the limit of detection, and were obtained the following values:
- \circ\ circ
- Sensibilidad del método: 1.22 ng/ml de gliadinas (0.12 mg/100 g, ó 1.2 partes por millón de gliadinas).Method sensitivity: 1.22 ng / ml gliadins (0.12 mg / 100 g, or 1.2 parts per million gliadins).
- \circ\ circ
- Límite de detección teórico: 0.3 ng/ml de gliadinas (0.03 mg/100 g, ó 0.3 partes por millón de gliadinas).Theoretical detection limit: 0.3 ng / ml gliadins (0.03 mg / 100 g, or 0.3 parts per million gliadins).
- \circ\ circ
- Dilución de trabajo mínima de la muestra: 1:25 (extraída de la siguiente forma 0.250 mg/10 ml de etanol 60%).Minimum working dilution of the Sample: 1:25 (extracted as follows 0.250 mg / 10 ml of 60% ethanol).
Se usaron para el experimento un total de 40 siropes y 25 cervezas diferentes, y fueron extraídas las prolaminas usando el siguiente procedimiento:A total of 40 were used for the experiment syrups and 25 different beers, and prolamines were extracted using the following procedure:
Lo primero fue pesar un total de 250 mg de cada una de las muestras y llevarlas a un volumen de 10 ml de Etanol 60%. Esto se preparó en tubos de polipropileno de 12 ml, que se pusieron en un agitador rotatorio durante 1 hora a temperatura ambiente y a una velocidad de unas 60 rpm, tras la extracción de las gliadinas con el Etanol 60%, se procedió a centrifugar durante 10 minutos a 3500 rpm las muestras, para recoger posteriormente con el sobrenadante obtenido. Dicho sobrenadante fue recogido en tubos limpios de 10 ml, y posteriormente se pasó a analizar las muestras por ambos sistemas de ELISA, el Competitivo (para prolaminas hidrolizadas) y el tipo Sándwich (para prolaminas intactas), observándose las diferencias que se muestran en la Figura 3, donde se reflejan únicamente alguna de las muestras analizadas. En cualquier caso los valores de prolaminas contenidas en las muestras fueron siempre iguales o superiores cuando se analizaban las muestras por el ELISA Competitivo, siendo más notables las diferencias en las muestras de cervezas, que presentaban mayor nivel de hidrólisis.The first thing was to weigh a total of 250 mg of each one of the samples and bring them to a volume of 10 ml of ethanol 60% This was prepared in 12 ml polypropylene tubes, which were put on a rotary shaker for 1 hour at temperature ambient and at a speed of about 60 rpm, after the extraction of gliadins with 60% Ethanol, centrifuged for 10 minutes at 3500 rpm samples, to collect later with the supernatant obtained. Said supernatant was collected in tubes 10 ml clean, and then the samples were analyzed for both ELISA systems, the Competitive (for prolamins hydrolyzed) and the sandwich type (for intact prolamins), observing the differences shown in Figure 3, where Only some of the samples analyzed are reflected. In In any case, the prolamin values contained in the samples were always equal or superior when analyzing the samples by the Competitive ELISA, the most notable being differences in beer samples, which presented a higher level of hydrolysis.
A continuación se describen los Materiales y Métodos utilizados para la realización de los ejemplos de la invención.The Materials and Methods used to perform the examples of the invention.
Se trata de una mezcla de 30 variedades de trigo diferentes, representando las diferentes composiciones de gliadinas que pueda haber entre distintas variedades, con el fin de que se pueda usar como referencia a nivel europeo. Se trata de un material que está a disponible a través del Prolamin Working Group (Van Eckert R. The PWG gliadin, a new reference material. Proceedins of the 16^{th} Meeting. Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity 2001 Nov; 25-28).It is a mixture of 30 wheat varieties different, representing the different compositions of gliadins that there may be between different varieties, in order to Can use as a reference at European level. It is a material which is available through the Prolamin Working Group (Van Eckert R. The PWG gliadin, a new reference material. Proceedins of the 16th Meeting. Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity 2001 Nov; 25-28).
Se pesaron 6 mg de gliadina de estándar europeo (EE) y se disolvieron en 6 ml de etanol 60% (1 mg/ml). De acuerdo con el factor 0.86 (corrección según determinación de nitrógeno por Kjendals) Una vez preparado se procedió a ajustarlo a una concentración 1 mg/ml reales secando la cantidad de 581.4 \mul y resuspendiéndolo en 500 µl en cada una de las alícuotas que se preparan para las digestiones posteriores a las que será sometido. (Concentración final: 4 g/100g, ó 40.000 partes por millón (ppm) de gliadinas).6 mg of gliadin of European standard (EE) were weighed and dissolved in 6 ml of 60% ethanol (1 mg / ml). According to factor 0.86 (correction according to Kjendals nitrogen determination ) Once prepared, it was adjusted to a real 1 mg / ml concentration by drying the amount of 581.4 µl and resuspended in 500 µl in each of the aliquots that were They prepare for the subsequent digestions to which they will be subjected. (Final concentration: 4 g / 100g, or 40,000 parts per million (ppm) of gliadins).
Para tratar de encontrar el estándar adecuado se realizaron primero unas cinéticas de digestiones del EE de gliadinas con las siguientes enzimas:To try to find the right standard is first performed a kinetics of digestion of the EE of gliadins with the following enzymes:
- \circ\ circ
- Digestión con Pepsina (P). Se prepara a una concentración de 1 mg de pepsina/ml de ácido fórmico 1% (pH 2.5). Se incuba a una relación enzima:Estándar Europeo de 1:200, a Temperatura ambiente (26ºC) durante 18 horas.Digestion with Pepsin (P). Be prepares at a concentration of 1 mg pepsin / ml formic acid 1% (pH 2.5). It is incubated at an enzyme ratio: European Standard of 1: 200, at room temperature (26 ° C) for 18 hours.
- \circ\ circ
- Digestión con Tripsina (T). Se prepara a una concentración de 2 mg de tripsina/ml de bicarbonato amónico 50 mM (pH 8.5). Se incuba a una relación enzima:Estándar Europeo de 1:100, a Temperatura ambiente (26ºC) durante 18 horas.Digestion with Trypsin (T). Be Prepare at a concentration of 2 mg trypsin / ml of bicarbonate 50 mM ammonium (pH 8.5). Incubate at an enzyme ratio: Standard European 1: 100, at room temperature (26ºC) for 18 hours.
- \circ\ circ
- Tripsina seguido de Pepsina (T/P), combinando de forma sucesiva las condiciones mencionadas en los puntos anteriores.Trypsin followed by Pepsin (T / P), successively combining the conditions mentioned in the previous points.
- \circ\ circ
- Digestión con Quimiotripsina (QT). Se prepara a una concentración de 2 mg de tripsina/ml de bicarbonato amónico 50 mM (pH 8.5). Se incuba a una relación enzima:Estándar Europeo de 1:100, a Temperatura ambiente (26ºC) durante 18 horas.Digestion with Chymotrypsin (QT). It is prepared at a concentration of 2 mg trypsin / ml of 50 mM ammonium bicarbonate (pH 8.5). It is incubated in a relationship Enzyme: European Standard of 1: 100, at room temperature (26ºC) for 18 hours
Se añadieron 2.5 \mul de enzima sobre todas las alícuotas, con sus soluciones correspondientes de EE (1 mg/ml) volumen final 500 \mul Los reactivos (ácido fórmico, bicarbonato amónico) se eliminaron de las muestras por medio de liofilización.2.5 µl of enzyme was added over all the aliquots, with their corresponding EE solutions (1 mg / ml) final volume 500 µl Reagents (formic acid, bicarbonate ammonium) were removed from the samples by lyophilization
Una vez realizadas todas las digestiones "overnight" 18h del estándar de referencia europeo de gliadinas, se realizó un "pool", mezclando todos los digeridos y el EE nativo tal como se indica a continuación:Once all the digestions have been made "overnight" 18h of the European reference standard of gliadinas, a "pool" was made, mixing all the digested and the native EE as indicated below:
Se tomaron volúmenes iguales de cada una de las digestiones llevadas a cabo sobre el EE de gliadinas, y además se añadió una parte más de EE nativo (P+T+T/P+QT+Nativo), quedando en la relación 1:1:1:1:1.Equal volumes were taken from each of the digestions carried out on the EE of gliadins, and also added one more part of native EE (P + T + T / P + QT + Native), remaining in The 1: 1: 1: 1: 1 ratio.
Se prepararon a concentraciones teóricas conocidas de gliadinas (5, 12.5, 25 y 50 partes por millón, teóricas) todos los digeridos y nativos, con el fin de analizarlos por los dos sistemas en paralelo, el Competitivo nuevo y el Sándwich tradicional. Además se usó el ELISA-R5 Sándwich con el fin de comprobar el resultado que daban las muestras nativas y digeridas por cada uno de los dos sistemas.They were prepared at theoretical concentrations known gliadins (5, 12.5, 25 and 50 parts per million, theoretical) all digested and native, in order to analyze them by the two systems in parallel, the new Competitive and the Sandwich traditional. In addition, the ELISA-R5 Sandwich was used with in order to check the result given by the native samples and digested by each of the two systems.
Para la muestra de 50 ppm se diluye la solución de etanólica del EE a 1 mg/ml (real, 40.000 ppm) con etanol 60%, hay que realizar una dilución 1:800 de la solución de partida. Se preparan las de 25 y 12.5 en diluciones seriadas a Y2 en etanol 60%, y la de 5 ppm 1/2.5 con respecto a la de 12.5.For the 50 ppm sample, the solution is diluted EE ethanol at 1 mg / ml (actual, 40,000 ppm) with 60% ethanol, a 1: 800 dilution of the starting solution must be made. Be prepare 25 and 12.5 in serial dilutions to Y2 in ethanol 60%, and that of 5 ppm 1 / 2.5 with respect to that of 12.5.
1. - Tapizado de la placa ELISA1. - ELISA plate upholstery
Finalmente se llegó a la conclusión de que la mejor concentración para el tapizado de la placa de ELISA era de 0.125 \mug gliadinas EE/ mLFinally it was concluded that the best concentration for the upholstery of the ELISA plate was of 0.125? Gliadin EE / mL
- A.TO.
- Se prepara la solución de recubrimiento a partir de la solución de EE (a 1mg/ml), haciendo una dilución 1:8000 en tampón de recubrimiento.Be Prepare the coating solution from the EE solution (at 1mg / ml), making a 1: 8000 dilution in buffer covering.
- B.B.
- Se echan 100 \muL de la solución de recubrimiento/pocillo, 12.5ng de gliadinas EE/100 \mul.Be pour 100 µL of the coating / well solution, 12.5ng of gliadins EE / 100 \ mul.
- C.C.
- Se incuba a 4ºC durante toda la noche.Be incubate at 4 ° C overnight.
2. - Lavado de la placa (3 veces con solución de lavado, PBS + Tween20 0.5%).2. - Washing the plate (3 times with solution of wash, PBS + Tween20 0.5%).
3. - Bloqueo de la placa: PBS + Tween20 (0.5%) + 2% BSA (albúmina de suero bovino) \rightarrow Solución de Bloqueo (SB).3. - Plate lock: PBS + Tween20 (0.5%) + 2% BSA (bovine serum albumin) → Blocking Solution (SB).
- A.TO.
- Se añaden 280 \mul de SB/pocillo en la placa de ELISA.Be add 280 µL of SB / well in the ELISA plate.
- B.B.
- Se incuba en estufa, a 37ºC, durante 1 hora.Be incubate in an oven, at 37 ° C, for 1 hour.
4. - Preparación de las muestras y la curva estándar de gliadinas.4. - Sample preparation and curve Gliadin standard.
Una vez establecida la concentración del tapizado, se ajustaron las concentraciones de partida de los distintos digeridos para realizar la curva estándar usando un total de 8 puntos de estándares. Quedando de la siguiente forma los distintos estándares: S_{1} 2.5 \mug/ml a S_{8} 0.152 ng/ml.Once the concentration of the upholstered, the starting concentrations of the different digested to perform the standard curve using a total of 8 standard points. Remaining as follows the different standards: S_ {1} 2.5 \ mug / ml to S_ {8} 0.152 ng / ml
- a)to)
- Para el primer punto de la curva estándar (S1) (2.5 \mug gliadina/ml) se diluye la solución de gliadina del EE a 1:400 en PBS + Tween20 (0.5%) + 1% BSA, (SD).For the first point of the standard curve (S1) (2.5 gliadin / ml) The solution of gliadin from the EE is diluted to 1: 400 in PBS + Tween20 (0.5%) + 1% BSA, (SD).
- b)b)
- El resto de los puntos de la curva estándar (8 en total), se obtienen a partir de la primera solución (S1) por dilución seriada con factor 1/4. Como sigue:He rest of the points of the standard curve (8 in total), are obtained at from the first solution (S1) by serial dilution with factor 1/4. As follows:
Las muestras se analizan a diluciones a partir de 1:25 en SD. Las diluciones siempre se preparan el doble de concentradas de la que finalmente se desea analizar*. Dilución 1:25 y 1:50, si son necesarias diluciones más elevadas pueden prepararse a partir de estas anteriores por dilución 1:2.Samples are analyzed at dilutions from from 1:25 in SD. Dilutions are always prepared twice as much concentrated of which you finally want to analyze *. Dilution 1:25 and 1:50, if higher dilutions are necessary they can be prepared from these above by dilution 1: 2.
*Nota: Al calcular la concentración de gliadinas en las muestras debe tenerse en cuenta que estas antes de aplicarse a la placa de ELISA se preincuban con el conjugado, mezclándolos 1:1 (v/v) de modo que en el ensayo las muestras quedan diluidas al doble que la dilución preparada inicialmente.* Note: When calculating the concentration of gliadins in the samples, it should be taken into account that these before being applied to the ELISA plate are pre-incubated with the conjugate, mixing them 1: 1 (v / v) so that in the test the samples remain diluted twice the dilution initially prepared .
5. - Preparación del anticuerpo R5 conjugado:5. - Preparation of antibody R5 conjugate:
Como conjugado se utiliza el anticuerpo monoclonal R5 conjugado con peroxidasa diluido 1:166667. La dilución del anticuerpo conjugado se prepara justo antes de la preincubación con las muestras.The antibody is used as a conjugate monoclonal R5 conjugated with peroxidase diluted 1: 166667. The dilution of the conjugated antibody is prepared just before the preincubation with samples.
6. - Preincubación de las muestras y la curva estándar con el conjugado.6. - Preincubation of samples and curve standard with conjugate.
Las muestras y el anticuerpo conjugado ya diluidos se mezclan v/v para preincubarlos antes de aplicarlos en la placa de ELISA.Samples and conjugate antibody already diluted mix v / v to pre-incubate before applying them in ELISA plate.
Se mezclan 0.3 ml de las muestras diluidas y los estándares con 0.3 ml del anticuerpo conjugado diluido 1:166667. Se incuba a temperatura ambiente agitando constantemente en el agitador orbital a la mínima velocidad.0.3 ml of the diluted samples are mixed and the standards with 0.3 ml of the conjugate antibody diluted 1: 166667. Be incubate at room temperature constantly stirring in the Orbital shaker at minimum speed.
Las concentraciones finales de los estándares quedan así:The final concentrations of the standards they look like this:
La dilución del conjugado queda en 1:333334The dilution of the conjugate is 1: 333334
7. - Aplicación de las muestras y la curva estándar en la placa.7. - Application of samples and curve Standard on the plate.
Se aplican por duplicado en la placa de ELISA 100 µl de cada mezcla preincubada y se incuba 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda y en oscuridad.They are applied in duplicate on the ELISA plate 100 µl of each pre-incubated mixture and incubate 1 hour at temperature environment in a humid chamber and in darkness.
8. - Se lava la placa 6 veces con solución de lavado.8. - Wash the plate 6 times with a solution of washed.
9. - Aplicación de la solución sustrato (TMB-plus).9. - Application of the substrate solution (TMB-plus).
Se añaden 100 \mul de la solución sustrato con TMB-plus en cada pocillo de la placa de ELISA. Se incuba durante 13 - 15 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad.100 µl of the substrate solution is added with TMB-plus in each well of the ELISA plate. Be incubate for 13-15 minutes at room temperature and in darkness.
10. - Parada de la reacción.10. - Stop the reaction.
La reacción se para echando 50 \mul/pocillo de solución de parada (H_{2}SO_{4} 2.5 M).The reaction is stopped by pouring 50 µl / well of stop solution (H2SO4 2.5M).
11. - Lectura.11. - Reading.
Se lee la absorbancia en un lector de placas ELISA a 450 nm.The absorbance is read on a plate reader ELISA at 450 nm.
Claims (5)
- a)to)
- un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas completas no hidrolizadas, preferentemente, el estándar EE "nativo", oa standard made from a set of complete gliadins not preferably hydrolyzed, the "native" EE standard, or
- b)b)
- un estándar consistente en un "pool" de diferentes digestiones realizadas sobre el EE con distintas enzimas proteolíticas.a standard consisting of a "pool" of different digestions made on the EE with different proteolytic enzymes.
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| ELENA BAZZIGALUPPI et al. Comparison of Tissue Traniglutaminase- Specific Antibody Assay with Established Antibody Measurements for Coeliac Disea. Journal Autoinmunity, 1999, 12, páginas 51-56. * |
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