ES2238799T3 - Transferencia de arn-m. - Google Patents

Abstract

Utilización de una composición que comprende como mínimo un compuesto que comprende al menos un ARNm y al menos una proteína o un péptido catiónico, especialmente policatiónico, para la preparación de una vacuna.

Description

Transferencia de ARN-m.

La invención se refiere al uso de ARN-m para la preparación de una vacuna por transferencia de ARN-m particularmente en células.

En las décadas pasadas se han desarrollado una serie de métodos para transferir ácidos nucleicos a células y, especialmente, a organismos. En particular en los últimos años se han estudiado métodos para células eucarióticas. En este sentido los métodos que se adaptan al campo de la terapia genética tienen un interés particular.

La terapia genética es un procedimiento médico que trata un trastorno sustituyendo o contrarrestando los genes defectuosos. Una terapia de este tipo requiere grandes precauciones de seguridad con el fin de minimizar los riesgos y peligros para la persona tratada.

El enfoque común en la investigación en el campo de la terapia genética es el uso de ADN para introducir la información genética necesaria en la célula. Se conocen varios métodos útiles y comparativamente efectivos para suministrar el ADN a la célula, por ejemplo transfección de fosfato de calcio, transfección de polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, microinyección o lipofección. En especial la lipofección ha resultado ser una herramienta muy útil.

Un método especialmente aplicado en el campo de la terapia genética es el uso de ADN-virus como vehículos para el ADN. Los virus tienen la importante ventaja que son infecciosos por sí mismos. Por esta razón, no tienen ningún problema para penetrar en la célula. Por otro lado, trabajar con virus siempre entraña un cierto riesgo. No es posible excluir que los virus se extiendan incontroladamente en el organismo a pesar del hecho de que, obviamente, los virus utilizados se someten a ingeniería genética para excluir este riesgo dentro de lo posible.

Normalmente, el ADN proporcionado a la célula se integra en parte en el genoma de la célula transfectada. Esto podría ser un efecto deseable ya que posiblemente podría conllevar efectos de larga duración del ADN introducido. Por otro lado, la integración en el genoma acarrea un riesgo principal de la terapia genética. Debido a su integración, el ADN introducido puede causar una inserción en un gen intacto de la célula transfectada, es decir una mutación que trastorna la función de ese gen en particular. Debido a ello se puede destruir, por ejemplo, una enzima importante y la célula posiblemente pierda su viabilidad. Puesto que la integración en el genoma es un evento estadístico, solamente una parte de las células se muere debido a la integración del ADN suministrado que produce mutaciones letales de inserción. Por esta razón, las mutaciones letales de inserción no conducen a secuelas drásticas extremas para el organismo en general. Es más grave que debido a la mutación causada por la inserción del ADN puede darse el punto de arranque para el desarrollo de un cáncer. Por ejemplo, mediante la destrucción de un gen que codifica un factor de regulación de proliferación celular pueden aparecer divisiones ilimitadas. Tales células que presentan este tipo de proliferación anormal pueden tener como resultado una enfermedad cancerosa, con todas las malas consecuencias conocidas para el paciente en cuestión. Para ello sería suficiente que una única célula se convierta en una célula cancerosa que represente el punto de partida para el desarrollo del cáncer.

Cuando se trabaja con ADN es obligatorio conectar el gen a ser introducido con un promotor fuerte, por ejemplo el promotor viral CMV con el fin de conseguir un coeficiente de traducción suficiente. No se conocen con exactitud los riesgos potenciales de tales promotores, pero no es posible excluir la inserción de dichos promotores en el genoma de la célula tratada sin que se produzcan consecuencias fatales para la regulación de la expresión génica.

Otro aspecto peligroso del uso de ADN en la terapia genética es la inducción de anticuerpos anti-ADN patógenos en el organismo tratado causando una defensa inmunitaria fatal.

Debido a estas razones, en el pasado se hicieron diferentes consideraciones e intentos para eliminar los riesgos del ADN, especialmente de la inserción incontrolada de ADN, en el campo de la terapia genética. Una solución a este problema sería el uso de ARN en lugar de ADN como portador de la información genética.

En Fisher y col. (Biochemical Journal, Vol. 321, No. 1, 1997, páginas 49-58) se describe la transferencia a células de complejos formados por ARNm de luciferasa, ASOR-polilisina y un conjugado que se compone de una proteína de enlace de maltosa, el dominio de transmembrana de la toxina de difteria y una polilisina.

Dubes y col. (Protoplasma 96, 1978, páginas 209-223) revela la transfección y el refuerzo por protamina e histona utilizando ARN del virus de la polio y cultivos de cepas de la línea CLI de células hepáticas del chimpancé.

Murakami y col. (Gene 202 (1997) 23-29) informa sobre la construcción de dos tipos de vectores del retrovirus aviar capaces de replicación en base al virus del sarcoma de Rous (VSR). Se muestra que los genes exógenos pueden expresarse con un alto nivel mediante los vectores de retrovirus capaces de replicación con un lado de entrada interno ribosómico.

En WO 96/25508 (Rhone-Poulenc Rorer) se describen composiciones farmacéuticas útiles para la transfección de un ácido nucleico y caracterizados porque contienen, además de cualquier ácido nucleico, como mínimo un agente de transfección y un compuesto que provoca la condensación de dicho ácido nucleico. Este compuesto se deriva total o parcialmente de una histona, una nucleolina, una protamina y/o un derivado de las mismas. Además, se describe el uso de tales composiciones para transferir ácido nucleico in vivo e in vitro.

El ARN por si mismo no es capaz de integrarse en el genoma. Por esta razón no se producirán mutaciones del ARN causadas por la inserción. Otra ventaja del uso del ARN es que el ARN puede traducirse directamente por el mecanismo de traducción de la célula. El paso de transcripción del ADN en ARNm que es necesario al utilizar ADN para la transfección no es necesario. Por esta razón, la información genética se traduce directamente y sin demora al producto génico deseado, por ejemplo una enzima. Hasta la fecha no se ha observado la aparición de anticuerpos anti-ARN que podrían causar problemas en lo que se refiere a sus aplicaciones clínicas.

Para asegurar que el ARN se identifique y traduzca correctamente dentro de la célula transfectada es necesario trabajar con un ARN que sea compatible con el sistema de traducción eucariótica. Mediante transfección de ARN mensajero (ARNm) que contiene una cabeza 5' y una cola poliA y posiblemente otras señales de traducción apropiadas, como por ejemplo un sitio de enlace ribosomal, queda asegurado que la información genética sea correctamente utilizada por la célula.

Una posibilidad de aplicación importante del ARN es la técnica antisentido. Aquí se transfiere a la célula un ARN complementario al ARNm diana. Debido a la complementariedad, ambos ARNs interactúan entre sí y con ello se inhibe la traducción del ARNm diana. Mediante esta tecnología se puede suprimir la expresión de una proteína especialmente no deseada.

Otro campo de aplicación importante de la transferencia de ARN son las llamadas ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN con una actividad enzimática que atacan de forma altamente específica a los objetivos deseados en la célula.

En resumen, el ARN sería una herramienta muy eficaz en el campo de la terapia genética y en el campo de la investigación molecular en general.

Hasta la fecha se había considerado que el ARN era muy problemático para su manipulación a nivel de laboratorio y clínico. Debido a que el ARN es susceptible a hidrólisis por ribonucleasas ubicuas no es estable en solución. Incluso contaminaciones insignificantes de ribonucleasas son suficientes para degradar por completo el ARN. Por esta razón, hasta la fecha las técnicas de terapia genética con ácidos nucleicos habían sido enfocadas hacia el ADN, que es mucho más fácil de manipular (Ref. 1).

No obstante, se ha demostrado que el ARN desnudo inyectado en la musculatura esquelética del ratón no conduce a expresión génica in vivo (Ref. 2) y que las células citotóxicas T pueden sensibilizarse in vivo con ARNm encapsulado de liposoma, que hasta la fecha sólo podía prepararse por un procedimiento extremadamente complicado
(Ref. 3).

Recientemente, Ying y col. han demostrado que una vacuna de ARN autorreplicante es potencialmente útil para el tratamiento de pacientes con cáncer (Ref. 23). La vacunación se basa en la introducción de un antígeno, en este caso la información genética (ADN o ARN) para un antígeno, en los organismos, especialmente en la célula. La información genética se traduce en el antígeno, es decir en un cierto péptido o proteína y, por lo tanto, se estimula una respuesta inmunitaria dirigida contra ese péptido o esa proteína. En lo que se refiere al tratamiento del cáncer, éste puede realizarse mediante la introducción de información genética de antígenos del cáncer, por ejemplo proteínas expresadas únicamente por células cancerosas. En este caso, estos antígenos del cáncer se expresan en el organismo y se provoca una respuesta inmunitaria que se dirige eficazmente contra las células cancerosas, eliminándolas. Debido a la extrema sensibilidad y escasa estabilidad del ARN, la inmunogenicidad de este ácido nucleico es, normalmente, muy reducida. Los autores del artículo arriba mencionado mejoraron la inmunogenicidad del ácido nucleico convirtiéndolo en "autorreplicante". Esto se consiguió mediante el uso de un gen codificador de una poliproteína ARN replicasa derivada del virus del bosque Semliki en combinación con un ARN codificador de un antígeno modelo.

La principal desventaja de la técnica de Ying y col. sería que la enzima viral ARN replicasa es necesaria para mejorar la eficacia del ARN introducido. Los efectos de esta enzima extraña en el organismo tratado son desconocidos. Esta enzima es capaz de replicar el ARN no específicamente, es decir replica el ARN de virus que pueden entrar en el organismo por infecciones normales al azar, aumentando así drásticamente el riesgo de infecciones peligrosas. Esto convierte la técnica de Ying y col. en un riesgo para su aplicación clínica.

Otra desventaja de la utilización de la replicasa es que las células transfectadas con esta enzima muestran apoptosis, es decir muerte celular, en el transcurso de aproximadamente 24 horas. Estas células de vida corta no son capaces de producir el producto genético deseado en cantidad suficiente. Esta es otra de las razones por las cuales esta técnica no es adecuada para aplicarla en el campo de la terapia genética, donde se han de conseguir expresiones del gen diana con una permanencia relativamente larga.

Por todo ello, la invención tiene como objetivo proporcionar una vía eficiente para introducir ARNm en las células, especialmente en organismos (vivos), que elimina los problemas arriba mencionados y que permiten su uso en la preparación de una vacuna. Este objetivo se alcanza por la reivindicación 1. Realizaciones especiales del objeto de la invención se describen en las subreivindicaciones 2 a 13. El texto de todas las reivindicaciones se incorpora así al contenido de la especificación por referencia.

La invención se basa en los resultados sorprendentes encontrados por los inventores de que el ARNm puede transferirse eficazmente a las células provocando una respuesta inmunitaria si el ARNm se asocia o enlaza con una proteína o un péptico catiónico y formar así un complejo. El uso de protamina como proteína policatiónica de enlace del ácido nucleico es especialmente efectivo. También es posible emplear otros péptidos o proteínas catiónicos como poli-L-lisina o histona.

Las protaminas son pequeñas proteínas básicas (catiónicas) con pesos moleculares de aproximadamente 4.200 Da. Se encuentran estrechamente asociadas con los ADNs de espermatozoides de peces. Casi dos tercios de los residuos de aminoácido de las protaminas son básicos y estos residuos básicos se encuentran, normalmente, agrupados, cuatro o cinco en una secuencia.

En los años sesenta y setenta se investigó el efecto de proteínas básicas como la protamina sobre la infectividad de los virus. Se mostró que las proteínas básicas provocaban una sensibilización de las células con relación a la infectividad de ARN viral (Ref. 21 y 22). En 1978 se mostró que la protamina forma un complejo con ARNt bicatenario (Ref. 9). Estos resultados de la investigación no se consideraron importantes en el campo de la terapia
genética.

Los inventores han demostrado ahora claramente el efecto protector de las proteínas básicas como la protamina sobre la estabilidad crítica del ARN monocatenario, especialmente el ARNm. En base a estos resultados se empleó una composición para la transferencia de ARNm a las células, donde el ARNm se transfiere en forma de un complejo o de una estructura asociada comparable entre como mínimo un ARNm y como mínimo un péptido o una proteína catiónica, especialmente policatiónica. La formación de complejos por interacciones esencialmente iónicas tiene el efecto decisivo de estabilizar el ARNm y prevenir su degradación. Así, la información genética se suministra a la célula sin pérdidas drásticas de eficacia, lo que hace normalmente imposible la transferencia de ARN funcional a las células.

En general, todos los péptidos o proteínas catiónicas, especialmente policatiónicas, serían apropiados para su utilización en la preparación como vacuna en un complejo con ARNm. En particular muestran buenos resultados los péptidos o proteínas que enlazan con el ácido nucleico. En una realización preferente, los péptidos catiónicos/básicos son cortos y tienen una longitud de hasta 100 aminoácidos. No obstante, la invención incluye la utilización de péptidos o proteínas más largos. Los péptidos o proteínas útiles se obtienen, preferentemente, por purificación de péptidos o proteínas de origen natural o expresados de manera recombinante, debido a que se dispone comúnmente de tales sustancias. Otra posibilidad es producir las sustancias por síntesis química. Especialmente adecuadas son protaminas, poli-L-lisina e histonas.

Los efectos secundarios de estas proteínas o péptidos, especialmente con vistas a la terapia genética, son insignificantes debido a que los péptidos o proteínas arriba mencionados no son inmunogénicos. Por esta razón, el tratamiento de un paciente con dichos péptidos o proteínas no provoca ninguna respuesta inmunitaria contra la composición administrada, que comprende ARNm y el péptido o la proteína catiónica.

El complejo que comprende el ARNm y el péptido o la proteína catiónica se administra, preferentemente, en los espacios subaracnoideos, nódulos linfáticos periféricos, tejidos tumorales y/o tejidos cartilaginosos. Se obtuvieron resultados especialmente prometedores con la administración en tejidos cartilaginosos. En una realización de la invención el complejo se administra en tejidos auditivos, especialmente en el pabellón auricular. La aplicabilidad en tejidos auditivos tiene una importancia particular ya que los métodos convencionales tales como transferencia de ácido nucleico mediada por liposomas no es posible en tejidos auditivos.

Para suministrar el ARNm en el complejo a la célula, especialmente al organismo por ejemplo animal o humano, existen diferentes posibilidades. En realizaciones preferentes, el compuesto se administra por inyección, particularmente por inyección intradérmica, intramuscular, intravenosa, subcutánea y/o intranasal.

El ARNm a transferir codifica al menos un antígeno. Tras la transferencia del ácido nucleico se traduce el antígeno codificado por el mecanismo de traducción de la célula transfectada. Este antígeno provoca una respuesta inmunitaria en el organismo. Esta respuesta se puede utilizar para tratar una determinada enfermedad, por ejemplo para el tratamiento de tumores o cáncer. Como antígeno se elige una proteína o un péptido específico de las células diana a eliminar. Otra posibilidad es suministrar a la célula información genética para más de un antígeno. Preferentemente se transfieren colecciones de ARNm con el fin de obtener una fuerte respuesta inmunitaria. La invención comprende claramente la transferencia de información genética que codifica, por ejemplo, enzimas u otros péptidos o proteínas o colecciones de los mismos. Además, la invención comprende el suministro de ARN antisentido o colecciones del mismo a la célula.

En una realización preferente de la invención se obtiene la colección de ARNm mediante la preparación de una librería de ARN obtenido de, por ejemplo, tejido tumoral. La colección de ARNs-m puede construirse mediante librerías fraccionadas o no de ARN.

En una realización especialmente preferente de la invención, la ayuda para introducir antígenos codificantes de ARNm en la célula es estimulando células T citotóxicas, por ejemplo. Esto se consigue presentando péptidos antigénicos en conexión con complejos MHC clase I en la superficie de células que presentan antígenos las cuales han sido transfectadas con ARNm. Este método de provocar una respuesta inmunitaria es similar a la estimulación por patógenos virales. Simultáneamente se consigue una respuesta inmunitaria humoral mediante la estimulación de células pro T debido a la inmunización con ARNm. De esta forma, la inmunización con ARNm conduce a la posibilidad de tratar desde infecciones virales hasta cánceres. En especial el tratamiento del cáncer se puede realizar por inmunización con una librería de ARN sin fraccionar y/o fraccionada obtenida a partir de tejidos tumorales. Esto es posible incluso en caso de que la cantidad de muestra de tejido tumoral sea muy pequeña ya que se puede generar una librería de ADNc que se puede amplificar y almacenar si es necesario. A partir de esta librería de ADNc se puede transcribir el ARN in vitro en grandes cantidades que se pueden utilizar para vacunas según la inven-
ción.

En una realización especialmente preferente de la invención el ARNm, utilizado como parte de una composición para la preparación de una vacuna, comprende secuencias, especialmente en 5' y/o 3' terminal, que no se traducen dentro de la célula. Estas secuencias adicionales son especialmente preferentes para conseguir una mayor estabilización del ARNm. En las aplicaciones clínicas, esta estabilización mayor del ARN puede ser deseable.

Por ejemplo, para aumentar la eficacia de la traducción del ARNm transferido podría ser ventajoso utilizar un ARNm que comprende como mínimo un sitio de entrada ribosomal interno (IRES). Secuencias de este tipo activan la entrada y el enlace del ARNm en el ribosoma, con lo cual se aumenta el coeficiente de traducción.

En una realización preferente de la invención, el ARN transferido comprende dos o más genes, por ejemplo un gen codificador de un antígeno y un gen codificador de un factor, por ejemplo una citoquina, que estimula la respuesta inmunitaria o coestimula receptores superficiales. En lo referente a tales ARNs multifuncionales, los IRES podrían emplearse como componentes muy apropiados cuando se construyen los correspondientes vectores.

En comparación con la transfección mediante ADN los inventores demostraron que la transferencia de ARN mediante el método según la invención es mucho más efectiva. Se demostró que aproximadamente 1 \mug de ARN por 30 g de peso vivo es efectivo para provocar una respuesta en células T citotóxicas específicas en ratones, mientras que eran necesarios 50 \mug de ADN por 30 g de peso vivo para provocar el mismo efecto. El método de la invención tiene, por lo tanto, la considerable ventaja de necesitar mucho menos material genético para obtener el efecto deseado, con lo que se reducen los costes.

Por esta razón, la invención comprende un complejo formado por como mínimo un péptido o una proteína catiónica y como mínimo un ARNm, y que se utiliza para la preparación de una vacuna. En cuanto a las características de este complejo nos remitimos a la descripción arriba dada.

Como mínimo un compuesto según la invención tal como se describe más arriba forma parte de una composición utilizada para la preparación de una vacuna. Los demás ingredientes de la composición son, preferentemente, soluciones tampón y/u otros componentes que refuerzan la estabilidad del ARNm. De preferencia, la composición comprende como mínimo un inhibidor de ARNasa. Los inhibidores ARNasa pueden obtenerse comercialmente y se utilizan ampliamente en la práctica en laboratorios. Un ejemplo de inhibidor de ARNasa adecuado es el inhibidor ARNasa de placenta humana. También es posible estabilizar el ARN mediante otros tratamientos, por ejemplo en condiciones salinas especiales tal como conocen los expertos en la técnica.

Además, la composición puede comprender como mínimo un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La producción de la composición farmacéutica se lleva a cabo de acuerdo con procedimientos estándar. Debido a la estabilidad del ARN precipitado es posible almacenar el ARN en estado seco. De forma previa a la transferencia del ARN según la invención, el ARN se disuelve, por ejemplo, en una solución apropiada que comprende además al menos el péptido o la proteína básica y preferentemente comprende además componentes estabilizadores, por ejemplo al menos un inhibidor de ARNasa.

De acuerdo con la invención, el complejo se utiliza en la producción de una composición farmacéutica para la estimulación de una respuesta inmunitaria. Según se subrayó más arriba, la composición se utiliza para introducir la información genética para un antígeno en la célula provocando una respuesta inmunitaria dirigida contra el antígeno determinado. Por ejemplo, en el tratamiento del cáncer esto podría ser una estrategia muy eficaz para vencer la enfermedad. También en el campo de las infecciones como el SIDA, la hepatitis o la malaria el uso de la composición farmacéutica promete buenos resultados.

Ejemplos

En las figuras 1 a 4, a las que se hace referencia en la siguiente descripción, se muestran las características según se enumeran aquí.

Figura 1 Inducción de actividad específica CTL (linfocitos T citotóxicos) de \beta-Gal. Se inmunizaron ratones B6 vía i.p. (intraperitoneal) con 10^{5}células Hela K^{b} electroporadas con ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n}.Se estimularon células del bazo in vitro con el péptido sintético ICPMYARV correspondiente a la secuencia de aminoácido 497-504 de E. coli \beta-galactosidasa. La actividad CTL se determinó en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr 5 días después de la re-estimulación in vitro. Los objetivos eran células Hela K^{b}, células Hela K^{b} transfectadas con ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n}y células Hela K^{b} incubadas con péptido sintético ICPMYARV.

Figura 2 Ensayo de protección de degradación de ARN. La flecha indica 0,5 \mug de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n}desnudo o ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} condensado con protamina, respectivamente. El ARN se incubó con suero bovino fetal 2,5% en un tampón de vacunación a temperatura ambiente. Durante el tiempo indicado se tomaron muestras, se trataron con inhibidor de ARNasa, se congelaron a -70ºC y se analizaron en gel de agarosa al 1%.

Figura 3 Inducción de actividad CTL específica de \beta-Gal. Se inmunizaron ratones BALB/c según se describió con un condensado ARN protamina Unifectin encapsulado o con ARN condensado con protamina. 30 \mug de ARN protamina-\betaglacZ\betag\alpha_{n} + Unifectin se inyectaron por vía intravenosa (a) o subcutánea (b) y 30 \mug de ARN protamina-\betagfp\betag\alpha_{n} + Unifectin se inyectaron por vía intravenosa como control (c). Utilizando el pabellón auricular (i.e.), se inyectaron una vez 30 \mug de ARN protamina-\betaglacZ\betag\alpha_{n} (d), 1\mug de ARN protamina-\betaglacZ\betag\alpha_{n}(e), 30 \mug de ARN protamina-\betagfp\betag\alpha_{n} como control (f) y 30 \mug de ARN de la librería protamina P13.1 (g), respectivamente. Se estimularon dos veces in vitro células del bazo con el péptico sintético TPHPARIGL correspondiente al H2^{d} epitopo de E. coli \beta-Gal (secuencia de aminoácido 876-884). La actividad de CTL se determinó en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr 5 días después de la re-estimulación in vitro. Los objetivos eran células P13.1 (transfectadas H-2^{d} lacZ) y células P815 (H-2^{d}).

Figura 4 Inducción de actividad CTL específica \beta-Gal. Se inmunizaron i.e. ratones BALB/c con 30 \mug de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n}no protegido (a) o con 30 \mug de plásmido de ADN pCMV\beta (b) según se describe en la referencia 10. Se inmunizaron i.e. ratones control con 30 \mug de ARN \betagfp\betag\alpha_{n} no protegido (c) o con 30 \mug de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} tratado con ARNasa (d). Se estimularon células del pabellón auricular dos veces in vitro con el péptido sintético TPHPARIGL. Se determinó la actividad CTL en un ensayo de liberación de ^{51}Cr estándar 5 días después de la re-estimulación in vitro. Los objetivos eran células P13.1 (transfectadas H-2^{d} lacZ) y células P815 (H-2^{d}). La respuesta inmunitaria humoral IgG anti-\beta-Gal se detectó por ELISA partiendo de sueros dos semanas después de la inmunización.

Se estimaron valores medios superiores a OD_{490} de sueros diluidos 1:100 a 1:800. Se inmunizaron ratones una vez i.e. con 30 \mug de plásmido de ADN pCMV\beta, 30 \mug de ARN \betaggfp\betag\alpha_{n}, 30 \mug de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n}sin proteger o 30 \mug de ARN protamina-\betaglacZ\betag\alpha_{n}.

Métodos y resultados Síntesis de ARN y plásmidos

Se prepararon transcritos de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n}coronados para vacunación que contenían secuencias \beta-globina de Xenopus laevis mediante transcripción in vitro con Sp6-Cap-Scribe (Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y a partir del plásmido linealizado SpjC-\betaglacZ\betag\alpha_{n}(se cortó un fragmento de HindIII-BamHI que contenía el gen lacZ de un plásmido pCH110 (Pharmacia) y se insertó en los sitios HindIII y BgIII del plásmido pSpjc-1 que fue amablemente facilitado por J. Lord, Warwick, UK). Para un control negativo se preparó un ARN \betaggfp\betag\alpha_{n} del plásmido pT7TS-\betaggfp\betag\alpha_{n} linealizado que contenía el gen gfp de Aequoria victoria con T7 Cap-Scribe (Boehringer Mannheim; se excindió el fragmento del gen gfp de pCFP (Clontech) y se insertó en los sitios EcoRV y SpeI del plásmido pT7TS, que fue puesto a disposición amablemente por P.A. Krieg, Austin, Texas, EE.UU). Los transcritos P13.1 de la librería de ARN se prepararon a partir de una librería de ADNc linealizado de células P13.1 con T3-Cap-Scribe (Boehringer Mannheim). La librería de ADNc se construyó a partir de células P13.1 utilizando el kit de síntesis ZAP-cDNA (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Antes de la transcripción in vitro se extrajeron dos veces todos los plásmidos linealizados con fenolcloroformo y se precipitaron con etanol/acetato de sodio.

Los transcritos de ARN se trataron con ADNasa (2 U/\mug de ADN-molde, Boehringer Mannheim) a 37ºC durante 15 minutos y se extrajeron con fenol/cloroformo. Finalmente se precipitó el ARN con etanol/acetato de sodio, se solubilizó en agua tratada con DEPC y se almacenó a -80ºC hasta su utilización.

Inmunizaciones con ácidos nucleicos

La protamina (base libre, grado IV del salmón) y los derivados de protamina (fosfato de protamina y sulfato de protamina) se compraron de Sigma. El liposoma catiónico Unifectin (cuya estructura se indica abajo) se obtuvo de A. Surovoy, Tübingen.

1

Se incubó por completo una mezcla protamina:ARN en proporción 1:2 en 100 \mul de una solución tampón de vacunación (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4) a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se preparó ARN-Unifectin encapsulado en una mezcla liposoma:protamina:ARN en proporción 2:1:1, después de lo cual se añadió Unifectin 10 minutos después de la incubación de protamina-ARN en 60 \mul de una solución tampón de vacunación a temperatura ambiente. Se inyectaron 100 \mul de la solución de vacunación i.p. (intraperitoneal), i.v. (intravenosa), s.c. (subcutánea) e i.m. (intramuscular). Se prepararon controles de plásmido de ADN y ARN desnudos en 100 \mul de una solución tampón de vacunación tratada con DEPC y se aplicó de inmediato. Se inyectaron 50 \mul de la solución de vacunación en cada pabellón auricular de ratones anestesiados (Metofane, Janssen).

Elisa

Se obtuvieron muestras de sangre de la vena de la cola de ratones. Se prepararon sueros y se recubrieron placas ELISA (Greiner) durante la noche con \beta-galactosidasa (Sigma) en un tampón PBS a 4ºC. Después de lavar con Tween-20/PBS 0,05% se bloquearon las placas con PBS/albúmina de suero bovino al 1% durante 1 hora a 37ºC. Los sueros se diluyeron en Tween-20/PBS 0,05% y se aplicaron sobre las placas durante 1 h a 37ºC. Después de otros pasos de lavado, se marcaron los anticuerpos enlazados con una inmunoglobulina (Sigma) IgG anti-ratón de cabra peroxidasa-conjugada. Las placas se lavaron y desarrollaron con ácido 5-aminosalicílico (Sigma) en un tampón fosfato y se leyeron a 490 nm.

Cultivo celular y ensayo de liberación ^{51}Cr

Se preparó un cultivo celular P 815 y P13.1 (Ref. 18) en \alpha-MEM conteniendo FCS 10%, 2-ME, L-glutamina y antibióticos. 7-9 días después de la inmunización de ratones, se retiraron los bazos receptores y los esplenocitos se re-estimularon con péptido \beta-Gal sintético TPHRARIGL (ICPMYARV para la técnica Hela-K^{b}) a 50-100 mM. Se generaron líneas CTL (linfocito T citotóxico) mediante la re-estimulación semanal con células de bazo irradiadas singénicas y péptidos sintéticos según se describe en la Referencia 19. Se ensayó la lisis de las células diana en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr durante 5 horas según se describe anteriormente en la Referencia 20. En caso dado, se pulsaron las células diana con péptidos durante el período de marcaje con ^{51}Cr. Después de la incubación del efector y de las células diana en placas de 96 pocillos de fondo redondo durante 5 horas, se retiraron 50 \mul de 200 \mul del sobrenadante del cultivo y se midió la radiactividad en un contador de escintilación en formato microplaca (1450 microbeta * Plus) utilizando escintilación en fase sólida (Luma Plate-96, Packard). Se determinó el porcentaje de liberación específica a partir de la cantidad de ^{51}Cr liberado en el medio (A), corregido en cuanto a la liberación espontánea (B) y se comparó con el contenido total de ^{51}Cr de las células diana lisadas con el Triton-X-100 1% (C):% de lisis específica = 100 (A-B)/(C-B).

Ensayo de protección contra la degradación de ARN

Se incubaron 0,5 \mug de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} durante 5 minutos en 5 \mul de tampón de vacunación que contenía 0,25 \mug de protamina. En un momento dado se añadieron 0,5 \mul del tampón de vacunación que contenía un 5% de suero bovino fetal y se incubaron a temperatura ambiente. Tras un período de tiempo determinado se extrajeron muestras y se mezclaron con 2 \mul de un tampón de vacunación que contenía 10 U de inhibidor ARNasa (Sigma) y se congelaron a -70ºC. Se añadieron 4 \mul de tampón de vacunación tratado con DEPC que contenía 10 U de proteinasa-K y 4 \mul de tampón de vacunación tratado con DEPC que contenía un 20% de SDS y se cargó con un colorante. Las muestras se analizaron en gel de agarosa al 1% en un tampón tris-acetato-EDTA tratado con DEPC.

Para estudiar la eficacia de las vacunas basadas en ARN un vector de plásmido se sometió a ingeniería para transcripción in vitro de ARN lacZ (ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n}) que contenía una estructura de cabeza, una cola poli(A) y estaba flanqueada en los extremos 5' y 3' por regiones no traducidas (UTRs) de \beta-globina de Xenopus laevis para aumentar la expresión de proteína citosólica (Referencias 4 y 5).

Para tener acceso a su potencial inmunogénico, se sometieron a electroporesis células Hela-K^{b} (Ref. 6) con ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n}(como sigue: ajustes para Impulsor de Genes (Bio Rad): voltaje: 850 V, capacitancia: 50 \muF, Corriente: 50 mA, resistencia: \infty\Omega. Las células (0,5 ml) se colocaron sobre hielo durante 5 minutos y se transfirieron a 9,5 ml de un medio completo \alpha-MEM y se incubaron a 37ºC durante la noche) y se inyectaron i.p. en ratones B6 (H2^{b}). Se observó una respuesta CTL específica contra \beta-Gal tras la estimulación de células de bazo in vitro con el péptido sintético ICPMYARV correspondiente al epitopo presentado K^{b} de E. coli \beta-galactosidasa (secuencia de aminoácido 497-504) (Ref. 7), ésta era comparable a la inducción CTL después de inmunización con células dendríticas transfectadas de ARN in vitro (Ref. 8) (Fig. 1).

Para una inyección directa de ARN a ratones se utilizó protamina para condensar y proteger el ARN de la degradación por ARNasa. La protamina es una pequeña proteína de origen natural rica en arginina (Ref. 9). Según se muestra en la Figura 2, el complejo ARN protamina es menos sensible a la actividad ARNasa en suero bovino fetal 2,5% (después de una incubación de 60 minutos pudo verse ARN de longitud completa sin degradar) si se compara con el ARN desnudo que se degradó en minutos.

Para generar una respuesta CTL específica in vivo, se encapsularon 30 \mug de condensado ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} protamina con un liposoma catiónico llamado Unifectin por un procedimiento muy sencillo y se inyectaron por vía intravenosa y subcutánea en ratones BALB/c. Se obtuvo una respuesta CTL específica contra \beta-Gal (Fig. 3a, b) después de estimulación in vitro con células P13.1 (H2^{d}, transfectadas lacZ). Se inmunizaron ratones de control por vía intravenosa con 30 \mug de condensado ARN \betaggfp\betag\alpha_{n}protamina Unifectin encapsulado, que codifica el gen gfp de Aequoria victoria (Fig. 3c). La inyección intramuscular o intraperitoneal de ARN encapsulado en liposoma falló en dar un CTL específico (datos no mostrados). Estos resultados refuerzan la importancia de la elección del sitio de inyección más adecuado para que tenga éxito una vacunación con ácido nucleico.

Se investigó la eficacia de la vacunación con ARN utilizando el pabellón auricular como sitio de inyección (i.e.). La inyección en el pabellón auricular de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} condensado protamina Unifectin encapsulado no genera un CTL específico (datos no mostrados), mientras que una simple inyección de 30 \mug de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} condensado protamina sin liposoma activó una respuesta CTL específica que se recordó después de la estimulación in vitro mediante el uso de un péptido sintético correspondiente al epitopo H2^{d} \beta-Gal TPHPARIGL (secuencia de aminoácido 876-884) (Ref. 11) (Fig. 3d). Era suficiente una cantidad de sólo 1 \mug de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} condensado protamina (una cantidad de ácido nucleico pequeña si se compara con el protocolo regular para la vacunación de ADN en ratones que supone, como mínimo, 50 \mug de ADN (referencias 12 y 13)) para el cebado de CTL in vivo (Fig. 3e). Los ratones de control, inmunizados i.e. con 30 \mug de ARN \betaggfp\beta\alpha_{n} condensado protamina no desarrollaron CTL anti-\beta-Gal (Fig. 3f). Después de demostrar que es posible obtener CTL in vivo dirigida contra una sola proteína codificada por una población de ARN homogéneo se investigó el supuesto de que una mezcla de ARNm compleja podría activar también CTL específica de antígeno. Anteriormente se había mostrado que el ARN transcrito in vitro desde una librería de ADNc podía ser absorbido por células dendríticas (DC) in vitro y que las DC con carga de ARN conducían a respuestas CTL in vivo (Ref. 8). La posibilidad de activar una respuesta CTL dirigida contra \beta-Gal mediante el empleo de una mezcla compleja de ARN se evaluó utilizando el ARN transcrito in vitro desde una librería de ADNc de células P13.1 (H2^{d}, transfectadas de lacZ). La inmunización (i.e.) con ARN de la librería P13.1 condensado protamina, por ejemplo, condujo a una respuesta CTL específica contra \beta-Gal (Fig. 3g). Esto es notable puesto que se puede esperar solamente una cantidad pequeña del ARN codificador de lacZ en los 30 \mug del ARN total no fraccionado de P13.1.

Para probar si la protección de ARN por protamina es esencial para el cebado in vivo de CTL se inmunizaron ratones i.e. con 30 \mug de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} sin proteger inmediatamente después de la preparación (Fig. 4a). Inesperadamente, la inmunización con ARN desnudo también generó una respuesta CTL específica \beta-Gal que era todavía más fuerte que, por ejemplo, la inyección i.e. de 30 \mug de plásmido de ADN pCMV\beta desnudo (Fig. 4b). Por el contrario, la inyección de ARN \betaggfp\betag\alpha_{n} sin proteger, así como ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} tratado con ARNasa, no inducía a una CTL específica \beta-Gal (Fig. 4c, Fig. 4d). Además, la inyección de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} no protegido almacenado durante 1 hora a temperatura ambiente en un tampón que no estaba especialmente libre de ARNasa, no inducía CTL (datos no mostrados). El desarrollo de inmunidad humoral se probó mediante ensayo de placa ELISA \beta-Gal utilizando sueros 2 semanas después de la inmunización. Los anticuerpos IgG, específicos para \beta-Gal podían detectarse en el suero de ratones inmunizados i.e. bien con 30 \mug de ADN de plásmido pCMV\beta, 30 \mug de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} no protegido o 30 \mug de ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} condensado protamina. Como control se utilizó suero de ratones inyectados i.e. con ARN \betaggfp\betag\alpha_{n}(Fig. 4e).

Estos resultados permitieron llegar a conclusiones durante el desarrollo de la vacuna que eran completamente inesperadas, especialmente en lo que se refiere a la vacunación terapéutica contra el cáncer. Aunque no es probable que la sorprendente eficacia del ARN desnudo de reciente preparación para la vacunación promueva su utilización en una determinación clínica, parece que el ARN protamina protegido tiene todas las ventajas de la vacunación con ADN pero sin el riesgo intrínseco de la integración del ADN en el genoma y la inducción de anticuerpos anti-ADN patógenos (Ref. 14). Antígenos del tumor que ya son conocidos podrían utilizarse como vacunas de ARN multi-epitópicas sin tener en cuenta la expresión de HLA en la vacuna (como se requiere para las vacunas de péptido (Ref. 15)). Además, debido a que las poblaciones de ARN heterogéneas conducen a una respuesta CTL específica de antígeno, el ARN puede prepararse a partir de una librería de ADNc establecida a partir de una pequeña muestra de un tumor (Ref. 8). Está técnica parece abrir un camino para inducir inmunidad contra ciertos tipos de cáncer en pacientes en los que no se han identificado antígenos de rechazo del tumor, aunque conlleva el riesgo potencial de una vacuna derivada de un tumor, que induce a la autoinmunidad igual que cualquier otro complejo, tal como gp96 (Ref. 16).

La inmunización a través del pabellón auricular mostraba una gran eficacia. Se ensayó tejido del pabellón auricular 24 horas después de la inyección con ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} condensado protamina para la expresión del gen lacZ mediante coloración por X-gal. La intensidad de la expresión de \beta-gal era fuerte y no se podía distinguir de la de un plásmido ADN pCMV-\beta de control (datos no mostrados). Además es necesario aclarar la razón por la cual a expresión del ARN que se produce tan fácilmente de forma inmunogénica (RT-PCR confirmó que el ARN \betaglacZ\betag\alpha_{n} estaba presente en el pabellón auricular durante más de 48 horas después de la inyección (datos no mostrados)). Una posibilidad es que el ARN transduce las células dendríticas directamente in vivo. Ciertamente es una ventaja que la absorción in vivo de ARN sea mediada sin necesidad de adyuvante o vehículos de transfección tales como liposomas catiónicos, que con frecuencia causan una toxicidad latente a altas dosis. Los liposomas catiónicos son altamente tóxicos para los macrófagos e inducen a una caída de la producción de, como mínimo, dos inmunomoduladores por macrófagos activados (Ref. 17). La protamina protectora del ARN no parece ser inmunogénica ya que no se detectaron anticuerpos IgG específicos de protamina en el suero de ratones (datos no mostrados). Para fines prácticos, el ARN puede almacenarse precipitado y solubilizarse directamente antes de la vacunación en tampones de transfección que contienen protamina.

Los resultados de la invención se pueden resumir como sigue. Para estudiar la eficacia de vacunas basadas en ARN se transcribió in vitro ARN que codifica el antígeno modelo \beta-galactosidasa (\beta-Gal) desde un gen lacZ flanqueado por secuencias estabilizadoras 5' y 3' de \beta-globina de Xenopus laevis y se protegió de la degradación por ARNasa mediante condensación con protamina, péptido policatiónico. Se inyectó en ratones BALB/c (H2^{d}) el complejo ARN-péptido condensado encapsulado en liposoma, el complejo ARN-péptido condensado sin liposoma o desnudo y el ARN no protegido. Todos los preparados condujeron a la expresión de proteína en el tejido local, la activación de linfocitos T citotóxicos anti-\beta-Gal restringidos de H-2 (CTL) y la producción de anticuerpos IgG reactivos contra \beta-Gal. Las CTL activadas por ARN eran incluso más eficientes en la lisis de células diana transfectadas de lacZ que las CTL activadas por un vector de expresión eucariótica de ADN lacZ. La inmunización con ARN transcrito desde una librería de ADNc de una línea celular P13.1 de expresión \beta-gal condujo de nuevo a CTLs específicas \beta-Gal y a la inducción de IgG. Así, tanto el ARN desnudo como el especialmente protegido pueden utilizarse para provocar una respuesta inmunitaria específica, donde el ARN protegido es estable in vitro durante un período de tiempo más largo. Las vacunas de ARN se pueden producir en grandes cantidades y tienen las mismas grandes ventajas que las vacunas de ADN pero carecen del efecto potencialmente nocivo de la integración del ADN en el genoma.

Referencias

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Claims (13)

1. Utilización de una composición que comprende como mínimo un compuesto que comprende al menos un ARNm y al menos una proteína o un péptido catiónico, especialmente policatiónico, para la preparación de una vacuna.

2. Utilización de una composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la composición no comprende ningún adyuvante o vehículo de transfección.

3. Utilización de una composición según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el péptido o la proteína es un péptido o una proteína que enlaza un ácido nucleico, particularmente protamina, poli-L-lisina y/o una histona.

4. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el ARNm codifica como mínimo un antígeno.

5. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque comprende como mínimo un factor para estabilizar todavía más el ARNm.

6. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el ARNm comprende secuencias, especialmente en el extremo terminal 5' y/o 3', que en esencia no se pueden traducir durante la expresión.

7. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el ARNm comprende como mínimo un sitio de entrada ribosomal interno.

8. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el ARNm es una colección de ARNs-m.

9. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque se trata de una composición farmacéutica que comprende preferentemente como mínimo un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 9 para la producción de una vacuna para el tratamiento de enfermedades infecciosas, especialmente infecciones víricas.

11. Utilización de una composición según la reivindicación 10 para la preparación de una vacuna para el tratamiento del SIDA, la hepatitis o la malaria.

12. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 9, para la preparación de una vacuna para la estimulación de una respuesta inmunitaria.

13. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de una vacuna para el tratamiento del cáncer.