ES2238728T3 - Gen asociado al carcinoma de mama. - Google Patents
Gen asociado al carcinoma de mama.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA, SU UTILIZACION PARA EL DIAGNOSTICO TUMORAL, TERAPIA Y PREVENCION, PROCEDIMIENTO PARA DIAGNOSIS, TERAPIA Y PREVENCION DE TUMORES, ASI COMO ANTICUERPOS Y SU UTILIZACION.
Description
Gen asociado al carcinoma de mama.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica, a su empleo para el diagnóstico, terapia y
prevención de tumores, procedimiento para el diagnóstico, terapia y
prevención de tumores, así como anticuerpos y su empleo.
El crecimiento incontrolado de células tumorales
está provocado por una nueva muestra de la expresión de genes, los
cuales gobiernan el control del ciclo celular, la adhesión,
angiogénesis, invasividad y finalmente la formación de metástasis
(Pardee, Advances in Cancer Res. 65 (1994), 213-227;
Ponta et al., Biochem. Biophys. Acta 1198 (1994), 1:10). El
curso clínico de las enfermedades tumorales, como por ejemplo, el
cáncer de mama, se caracteriza por varios procesos moleculares
definidos como por ejemplo el crecimiento dependiente de estrógenos,
la resistencia al tamoxifen, la expresión del vimentin, el aumento
de la invasividad y finalmente la resistencia cruzada frente a un
gran número de medios quimioterapéuticos, la cual recibe a menudo el
nombre de resistencia a multidrogas (ver p. ej., Clarke et
al., J. Endocrinol. 122 (1989), 331.340; Sommers et al.,
Cancer Res. 53 (1992), 5190-5197; Sommers et
al., Cancer Res. 49 (1989), 4258-4263 y Saceda
et al., Mol. Endocrinol. 2 (1988),
1157-1162).
Es un objetivo central de la investigación
tumoral, identificar los genes que participan esencialmente en la
aparición y progresión de enfermedades tumorales y a base de estos
genes proporcionar nuevos medios para el diagnóstico, prevención o
terapia de tumores.
La presente invención describe la identificación,
clonación y caracterización del gen de un polipéptido, el cual
recibe el nombre de proteína "PAP" asociada a la progresión.
Esta proteína se expresa en la línea celular metastizante
MCF-7_{ADR} de carcinoma de mama humano, mientras
que en la línea celular MCF-7 de carcinoma de mama
no metastizante no se ha encontrado ninguna expresión. La proteína
PAP, el ácido nucleico que la codifica, así como los anticuerpos
dirigidos contra la proteína, son por todo ello apropiados como
agentes para el diagnóstico, terapia o prevención de enfermedades
tumorales, en particular del cáncer de mama.
Mediante la invención se proporciona una
composición farmacéutica, la cual se caracteriza porque como
componentes activos contiene:
- (A)
- un ácido nucleico, el cual comprende:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína representada en SEQ ID No 1,
- (b)
- una de las secuencias de (a) en el marco de la correspondiente secuencia de nucleótidos de la degeneración del código genético,
- (c)
- una secuencia hibridadora con las secuencias a partir de (a) o/y (b) en condiciones estrictas, o
- (d)
- un fragmento de por lo menos 20 nucleótidos de longitud, el cual contiene las secuencias de (a), (b) o/y (c),
- (B)
- un polipéptido o péptido que está codificado por un ácido nucleico según (A), o/y
- (C)
- un anticuerpo contra un polipéptido o péptido según (B).
Debe comprenderse en esta composición que en
condiciones estrictas de hibridación, tiene lugar una hibridación
también después del lavado a 55ºC, de preferencia a 62ºC y con
particular preferencia a 68ºC, en un tampón poco rico en sal (p.
ej., 0,2 x SSC, 0,1% de SCS) (ver también Sambrock et al.,
(1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual ("Clonado
molecular, un manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor
Laboratory Press).
En una forma de ejecución preferida, la
composición farmacéutica contiene además soportes, materias
auxiliares o aditivos farmacéuticos habituales.
La secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína representada en SEQ ID No 1, codifica una proteína con una
longitud de 157 aminoácidos, la cual corresponde a la secuencia de
nucleótidos B4B descritos por Ruegg et al., 1996 (B4B, a
Novel Growth-Arrest Gene, Is Expressed by a Subset
of Progenitor/Pre-B-Lymphocytes
Negative for Cytoplasmic \mu-Chain ("B4B un
nuevo gen para paralizar el crecimiento expresado por un subgrupo de
linfocitos progenitores/Pre-B, negativo para la
cadena \mu citoplasmática"), Am. Ass. Imm., 1996 pp
72-80), y presenta una homología para las proteínas
ya conocidas. En los ensayos efectuados por Ruegg et al.,
(ver más arriba) la expresión de la proteína B4B debe ocasionar un
paro en el crecimiento en las células Cos-7. Por
este motivo se propugna el empleo de la proteína B4B como un
potencial supresor tumoral.
Una de estas proteínas es la proteína
CL-20 del conejo, la cual es inducida durante la
diferenciación de las células traqueales de conejo y se encuentra
con mucha frecuencia en los tejidos de placas epiteliales (Marvin,
J. Biol. Chem. 270 (1995), 28910-28916). La
expresión de la proteína CL-20 no depende de las
condiciones de crecimiento, sino que los retinoides que inhiben la
diferenciación de las placas epiteliales, reprimen la inducción de
la proteína CL-20.
Otra proteína homóloga a la PAP es la proteína de
la membrana epitelial de las ratas EMP-1 la cual se
encuentra principalmente en las zonas de proliferación y
diferenciación de las glándulas externas del estómago así como en
las células epiteliales de la región estomacal (Taylor et
al., J. Biol.. Chem. 270 (1995),
28824-28833).
Además, la PAP es homóloga a la proteína de
mielina periférica PMP22 del hombre, ratón y rata, en la que se
trata de una proteína estructural transmembránica asociada a la
mielina. La PMP22 es una proteína específica para la inhibición del
crecimiento, la cual impide la progresión del ciclo celular
(Hayasaka et al., BBRC 186 (1992), 827-831;
Edomi et al., Gene 126 (1993), 289-290;
Welcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991),
7195-7198; Spreyer et al., EMBO J. 10 (1991),
3661-3668).
A base de los datos de Ruegg et al., y la
homología con la proteína PMP22 responsable del mantenimiento del
estado de reposo celular, fue altamente sorprendente, que la
proteína PAP se expresara selectivamente en la línea celular
MCF-7_{ADR} metastizante fuertemente degenerada,
pero no en la línea celular MCF-7 menos
degenerada.
Además, la proteína PAP presenta una alta
homología con las proteínas hasta aquí no publicadas, cuyas
secuencias están almacenadas en el banco de genes. Estas proteínas
reciben el nombre de TMP de ratón ó respectivamente TMP humana y
tienen una identidad de aminoácidos del 76% ó respectivamente 95%
con la proteína PAP.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la
TMP de ratón están representadas en SEQ ID No 3 y 4 y las de la TMP
humana en SEQ ID No 5 y 6. La diferencia entre la PAP y la TMP
humana reside en particular en la región de aminoácidos
32-48.
Además, un objeto de la presente invención es el
empleo de un vector, el cual contiene por lo menos una copia de un
ácido nucleico como se ha definido antes o un fragmento del mismo,
para la transformación de una célula. Este ácido nucleico puede ser
p. ej., ADN, ADNc ó ARNm genómico. De preferencia se trata de una
molécula de ADN recombinante.
La invención se refiere también al empleo de un
vector el cual contiene un tramo de por lo menos 20 nucleótidos de
largo de la secuencia codificadora de la proteína el cual está
representado en SEQ ID No 1. De preferencia, este tramo posee una
secuencia de nucleótidos específica para la PAP. Estos ácidos
nucleicos son apropiados en particular para la obtención de ácidos
nucleicos antisentido terapéuticamente utilizables, los cuales de
preferencia tienen 50 nucleótidos de longitud.
El vector que contiene los ácidos nucleicos puede
ser replicado en eucariotas o procariotas. Puede ser un vector
integrable en el genoma de la célula anfitriona, p. ej., el
bacteriófago \lambda, ó un vector que es extracromosómico (p. ej.,
un plásmido). El vector según la invención puede obtenerse por
subclonación del ADN de la PAP en un vector base. Esta clase de
vectores base, en particular vectores con los elementos necesarios
para la expresión de proteínas son familiares al experto en la
especialidad.
En la clonación de un ácido nucleico que codifica
la PAP se obtiene un vector de expresión, el cual es conducido a una
célula anfitriona apropiada para la expresión en la cual aparece la
proteína según la invención. Las células anfitrionas preferidas son
los microorganismos como la E. coli o levaduras, pero también
células superiores, p. ej., células de mamíferos o de insectos. Son
vectores de expresión preferidos p. ej., los plásmidos,
bacteriófagos \lambda para procariotas, vectores de levaduras o
vectores víricos para células superiores, p. ej., SV40, vacunas,
baculovirus. Con respecto a la expresión de un ácido nucleico que
codifica la PAP, hay que remitirse en particular a los métodos
citados por Sambrook et al. (más arriba).
Para la expresión de la PAP, los sistemas
apropiados contienen vectores apropiados, p. ej., el vector pcADN1
(invitrogen) mediante el cual el ADN que se expresa se encuentra
bajo el control del promotor citomegalovirus.
Otro objeto de la presente invención es una
célula la cual se caracteriza por estar transformada con un ácido
nucleico, el cual es
- (a)
- la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína representada en SEQ ID No 1
- (b)
- una de las secuencias de (a) en el marco de la secuencia de nucleótidos correspondiente a la degeneración del código genético, o
- (c)
- una secuencia de nucleótidos que contiene una homología de más del 95% con una secuencia de (a) o/y (b), con la condición de que la célula no es la célula Cos-7.
La célula puede ser tanto una célula eucariótica
como también una célula procariótica. Los procedimientos para la
transformación de células con ácidos nucleicos forman parte del
estado general actual de la técnica y por lo tanto no necesitan ser
aquí detallados.
Igualmente es un objeto de la presente invención,
el empleo de un polipéptido de PAP, con la secuencia de aminoácidos
representada en SEQ ID No 2, fragmentos de este polipéptido o
variantes del mismo, como inmunógeno para la obtención de
anticuerpos.
Con el término "variantes" deben
comprenderse las secuencias que se diferencian por substitución,
deleción o/y inserción de los aminoácidos individuales o fragmentos
cortos de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos representadas
en SEQ ID No 2.
Bajo el concepto "variante" están
comprendidas tanto las variaciones alélicas de PAP que se encuentran
en la naturaleza, así como las proteínas obtenidas mediante la
tecnología del ADN recombinante (en particular mediante mutagénesis
in vitro, con ayuda de oligonucleótidos sintetizados
químicamente), las cuales con respecto a su actividad biológica o/y
inmunológica corresponden esencialmente a la proteína representada
en SEQ ID No 2.
En una forma de ejecución preferida, la invención
se refiere al empleo de una composición farmacéutica para el
diagnóstico de tumores, con particular preferencia para el
diagnóstico de carcinomas mamarios. Particularmente preferido es
además el empleo como marcador de la progresión tumoral, cuya
expresión es correlativa con el avance del tumor o/y con el grado de
metástasis.
En una forma de expresión particularmente
preferida para el diagnóstico de tumores, la fuerza de expresión de
la proteína PAP va correlativa con el estadio del tumor, en
particular con la tendencia a la formación de metástasis.
Todavía otro objeto de la presente invención es
un procedimiento para el diagnóstico de tumores, en el cual se pone
en contacto un tejido procedente de un paciente, con una composición
farmacéutica según la invención, y se determina cualitativamente o/y
cuantitativamente la expresión de la proteína PAP. Esta
determinación puede efectuarse por ejemplo a nivel de ácidos
nucleicos mediante el empleo de sondas de hibridación de ácidos
nucleicos o mediante transcripción invertida/PCR ó respectivamente a
nivel de ácidos nucleicos mediante anticuerpos según métodos cito o
histoquímicos. Se prefiere particularmente el empleo de una
composición farmacéutica como marcador de la progresión tumoral para
la identificación de la agresividad de tumores, en particular
carcinomas de mama mediante la cuantificación de la expresión de la
PAP, por ejemplo después de una intervención quirúrgica o para el
control del transcurso en un tratamiento por quimioterapia.
Junto a los ácidos nucleicos y polipéptidos de
PAP son también apropiados los anticuerpos contra los polipéptidos o
fragmentos de los mismos como componentes de la composición
farmacéutica.
Particularmente apropiados son los anticuerpos
policlonales contra un polipéptido como el descrito más arriba, con
la condición de que el anticuerpo no esté dirigido contra la
secuencia peptídica CSDSLSYASEDALK ó la
CSHY-ANRDGTOQYHH ó un anticuerpo monoclonal contra
un polipéptido como se ha descrito más arriba. El de mayor
preferencia es un anticuerpo que se caracteriza porque está dirigido
contra una secuencia peptídica la cual corresponde a los aminoácidos
32 a 48, 49 a 62 ó 119 a 129, representados en la secuencia de
aminoácidos SEQ ID No 2.
La obtención de anticuerpos puede lograrse de
manera convencional mediante la inmunización de animales de ensayo
con la proteína PAP completa o fragmentos de la misma y a
continuación, recogida de los antisueros policlonales resultantes.
Según el método de Köhler y Milstein o sus desarrollos posteriores
pueden obtenerse a partir de las células productoras de anticuerpos
de los animales de ensayo de manera ya conocida mediante fusión
celular de los anticuerpos monoclonales. Igualmente pueden obtenerse
los anticuerpos monoclonales humanos según métodos ya conocidos.
Como inmunógenos preferidos están los péptidos
que derivan de los dominios extracelulares de PAP (ver figura 2).
Los péptidos particularmente preferidos derivan de regiones que
corresponden a los aminoácidos 32-48,
49-62 ó 119-129 de SEQ ID No 2.
Estos péptidos se copulan de preferencia de acuerdo con métodos ya
conocidos, con un soporte, p. ej., la hemocianina del Keyhole Limpet
(Snipes et al., J. Cell. Biol. 117 (1992), 225.238). Los
conjugados resultantes se emplean para la inmunización de animales
del ensayo, p. ej., conejos.
Otro objeto de la presente invención es un
anticuerpo contra la proteína PAP ó una variante de la misma, de
preferencia un anticuerpo el cual no muestra ninguna reacción
cruzada con las proteínas homólogas como EMP-1,
PMP22 y CL-20. Particularmente preferido es el
anticuerpo dirigido contra una secuencia de péptidos, la cual
corresponde a los aminoácidos 32 a 48, 49 a 62 ó 119 a 129 la cual
corresponde a la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No
2.
Otro objeto de la invención es el empleo de los
anticuerpos descritos más arriba en un procedimiento inmunológico de
una inmunoprecipitación, un Western Blot, un ensayo inmunológico
competitivo o un ensayo sandwich.
Todavía, otro objeto de la invención es el empleo
de un polipéptido o un fragmento del mismo el cual está codificado
por:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos que codifican la proteína representada por SEQ ID No 1,
- (b)
- una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de (a) en el marco de la degeneración del código genético, o bien
- (c)
- una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de más del 95% con una secuencia de (a) ó/y (b), para la obtención de un anticuerpo mediante el empleo de una biblioteca de anticuerpos de exposición de fagos.
Con este procedimiento es posible la
identificación y obtención de un anticuerpo contra la proteína PAP
exclusivamente con métodos de la tecnología del ADN recombinante sin
el empleo de animales o células (primarias) obtenidas de
animales.
Los pasos que necesitan consumir trabajo y tiempo
indispensables en una obtención "clásica" de anticuerpos, como
p. ej., la inmunización de los animales de ensayo, no precisan de
tratamientos de refuerzo o fusión celular, ni ciclos de selección
de clones individuales.
Los resultados expuestos crean además la
suposición para un diagnóstico seleccionado, de enfermedades que
están unidas causalmente con modificaciones de la actividad PAP.
Estas investigaciones pueden efectuarse con ayuda de sondas
específicas de ácidos nucleicos para la detección a nivel de ácidos
nucleicos es decir, a nivel de genes y transcriptos, o con ayuda de
anticuerpos contra la PAP para la detección a nivel de
proteínas.
La invención se describe con más detalle mediante
los siguientes ejemplos, figuras y protocolos de secuencias, entre
los que se muestran:
Figura 1. Una comparación de las secuencias de
aminoácidos entre la PAP humana (1), la TMP humana (2) y de ratón
(3), la EMP-1 de ratas (4), la CL-20
de conejo (5), la humana (6) de ratón (7) y de ratas (8) PMP 22,
Figura 2 Un pronóstico de la topología de la PAP
en una capa doble de lípido. El círculo lleno significa una
potencial posición de la N-glicosilación,
SEQ ID No. 1 Una secuencia de ácidos nucleicos,
la cual contiene la información genética que codifica la PAP,
SEQ ID No. 2 La secuencia de aminoácidos de la
PAP,
SEQ ID No. 3 La secuencia de ácidos nucleicos
del ADNc de la TMP de ratón,
SEQ ID No. 4 La secuencia de aminoácidos de la
TMP de ratón,
SEQ ID No. 5 La secuencia de ácidos nucleicos
del ADNc de la TMP humana y
SEQ ID No. 6 La secuencia de aminoácidos de la
TMP humana.
Las líneas celulares MCF-7 y
MCF-7_{ADR} son líneas celulares de carcinoma de
mama humano (Thompson et al., J. Cell. Physiol. 150 (1992),
534-544 y Fairchild et al., Cancer Res. 47
(1987), 5141-5148.
La línea celular MCF-7 no es
metastizante, expresa el receptor de estrógenos, muestra el
crecimiento dependiente de estrógeno en el ratón inmunodeprimido y
ninguna expresión del Vimentin. La línea celular
MCF-7_{ADR} deriva de la MCF-7 y
se seleccionó por su resistencia contra la adriamicina. Es
metastizante, muestra una resistencia a múltiples drogas, ninguna
expresión del receptor de estrógeno así como un crecimiento
dependiente de estrógeno en el ratón inmunodeprimido.
El cultivo de estas líneas celulares tiene lugar
en el medio esencial mínimo mejorado (IMEM; Gibco, Grand Island, NY)
con 5% de suero fetal de ternera (Gibco). Las células se cultivaron
a 37ºC y en una atmósfera con un 5% de CO_{2}.
La exposición diferencial de la reacción en
cadena de la polimerasa (DD-PCR) se efectuó mediante
métodos ya conocidos (ver Liang y Pardee, Science 275 (1992),
967-970; Liang et al., Cancer Res. 52 (1992),
6966-6968 y Liang et al., Nucleic Acids Res.
21 (1993), 3269-3275) con el empleo del
kit-map de ARN (GenHunter Corp., Brookine, MA) según
las prescripciones del fabricante.
A partir de las células MCF-7 y
MCF-7_{ADR} se aisló la totalidad del ARN de
acuerdo con el método de Chomczynski y Sacchi (Anal. Biochem. 162
(1987), 156-159) mediante el empleo del Sistema de
Aislamiento Total del ARN (Promega Corp., Madison, WI). La
separación de las contaminaciones del ADN de las muestras de ARN se
efectuó mediante la incubación con DNasa I exenta de RNasa mediante
el empleo del Kit Message-Clean (GenHunter Corp.,
Brookline, MA) mediante incubación durante 30 minutos a 37ºC.
La totalidad del ARN exento de ADN (0,2 \mug)
de las células MCF-7 y MCF-7_{ADR}
se empleó como matriz para la síntesis de la primera cadena de ADNc
en presencia de 10 \muM de un cebador de anclaje T_{12}MG,
T_{12}MC, T_{12}MA y T_{12}MT (en donde M está degenerado tres
veces para G, A y C), tampón de transcriptasa inversa 1 X (125 mM de
Tris-Cl, pH 8,3; 188 mM de KCl; 7,5 mM de
MgCl_{2}; 25 mM de ditiotreitol) y 250 \muM de mezcla de dNTP.
La solución se calentó durante 5 minutos a 65ºC, se enfrió a 37ºC
durante 10 minutos y a continuación se añadieron 200 U de
transcriptasa invertida de Leukaemiavirus de ratón Moloney (MMLV).
Después de una hora de incubación a 37ºC se interrumpió la reacción
mediante incubación a 95ºC durante 5 minutos.
La PCR se efectuó en una solución de reacción, la
cual contenía volúmenes de 0,1 de la mezcla para la transcripción
inversa, 10 mM del correspondiente cebador de anclaje T_{12}MN, 2
\muM 10-mero del cebador con la secuencia
arbitrariamente seleccionada, tampón de PCR 1X (100 mM de
Tris-Cl, pH 8,4; 500 mM de KCl; 15 mM de MgCl_{2};
0,01% de gelatina), 25 \muM de dNTP, 10
\muCi[\alpha-^{35}S] de dATP y 10 U de
polimerasa de ADN de Amplitaq (Perkin Elmer, Norwalk, CT). La PCR se
efectuó con un total de 40 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 40ºC
durante 2 minutos, a 72ºC durante 30 segundos y finalmente 5 minutos
a 72ºC.
Después de la adición de tampón de carga a 3,5
\mul de muestra en cada caso, se calentaron los productos de la
PCR durante 2 minutos a 80ºC y a continuación se aplicaron sobre un
gel desnaturalizado de secuenciación con el 5% de poliacrilamida
para electroforesis. El gel seco se analizó autoradiográficamente
para detectar los genes expresados diferencialmente.
Se recortaron del gel seco las bandas
identificadas en dos reacciones DD-PCR
independientes, las cuales corresponden a genes diferencialmente
expresados. El ADNc fue eluido a partir del gel mediante
ablandamiento del trozo de gel en 100 \mul de H_{2}O durante 10
minutos y subsiguiente ebullición durante 15 minutos. El ADNc fue
aislado mediante precipitación con etanol en presencia de 3M de
acetato de sodio y 50 \mug de glicógeno como soporte, y extraído
en 10 \mul de H_{2}O. Se reamplificaron 4 \mul del ADNc eluido
en una segunda PCR. Para ello se emplearon los mismos cebadores 5' y
3' y las condiciones descritas más arriba, además de que se
emplearon concentraciones de dNTP de 20 \muM y la mezcla de
reacción no contenía ningún radioisótopo.
Los fragmentos de la PCR amplificados obtenidos
de esta forma fueron separados mediante un gel de agarosa al 1,5%,
se purificaron, y se emplearon como sondas para el análisis Northern
del ARN de MCF-7 y
MCF-7_{ADR}.
Se aisló el poliA+ARN a partir de la totalidad
del ARN mediante el empleo del sistema de aislamiento del ARNm poliA
T-tractIII (Promega Corp., Madison, WI). Huellas
paralelas de poliA+ARN de células MCF-7 y
MCF-7_{ADR} (1 \mug de cada línea celular)
fueron separadas según el tamaño, sobre un gel desnaturalizado de
Agarosa 1% y formaldehido, y a continuación se traspasaron sobre una
membrana de nylon cargada positivamente (Boehringer Mannheim GmbH,
Mannheim) mediante transferencia capilar en 20 X SSC. Después de una
reticulación mediante UV (Stratagene UV-Stratalinker
1800) las membranas se hibridaron con los productos de la
DD-PCR marcados con
[\alpha-^{32}P]dCTP, los cuales habían
sido obtenidos mediante el método de marcado de ADN "cebado al
azar", y marcados hasta una actividad específica de 2 x 10^{8}
dpm/\mug con el empleo del sistema de marcado de ADN Rediprime
(Amersham, Braunschweig). La hibridación previa (5 horas) y la
hibridación (durante la noche) con sondas radiactivas se efectuó en
formamida 50%, 5% de SSC, solución 5 X de Denhardt, 1% de SDS y 100
\mug/ml de ADN de esperma desnaturalizada de salmón a 42ºC. Las
membranas fueron lavadas con 1 X SSC, 0,1% de SDS a temperatura
ambiente durante 15 minutos, lavadas 2 X, seguido de lavados con
0,25 X SSC, 0,1% de SDS a 55-60ºC durante 15 a 30
minutos. A continuación, se analizaron las membranas
autoradiograficamente.
Los correspondientes productos de la
DD-PCR en los cuales pudo comprobarse una expresión
diferencial del ARNm, se subclonaron mediante el sistema de
clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA) en el vector
PCR-II. Los fragmentos subclonados fueron aislados
mediante el empleo del kit de plásmido Quiagen (Quiagen, Hilden) y
se utilizaron de nuevo como sondas para el análisis Northern para la
verificación de la expresión diferencial del ARNm.
Los fragmentos subclonados, los cuales derivan de
ARNm expresados diferencialmente, fueron secuenciados en el vector
de clonación TA, mediante el empleo del kit de secuenciado de ciclo
Dye-Terminator (Applied Biosystems GmbH, Foster
City, CA). Los datos de la secuencia de nucleótidos fueron
analizados para determinar la homología con genes conocidos en los
bancos de datos Genbank y EMBL mediante el empleo del programa de
ordenador BLAST.
De esta manera pudo ser identificada junto a 10
conocidas especies de ARNm, una nueva especie de ARNm, la cual se
expresa diferencialmente en la línea celular
MCF-7ADR.
Para obtener la totalidad del ADNc de este nuevo
ARNm, se empleó un fragmento DD-PCR subclonado de
556 bp de largo, como sonda para el muestreo de un banco de ADNc de
corazón humano (Clontech, Palo Alto, CA) el cual había sido obtenido
en un vector lambda gt10. De esta manera se aisló un clon de ADNc de
aproximadamente 2 kb, del cual se secuenciaron las dos cadenas y se
compararon con el fragmento clonado de DD-PCR.
Para la identificación de la región 5' del ADNc
se efectuó una PCR RACE (amplificación rápida de los extremos del
ADNc) de acuerdo con el método descrito por Frohmann
(PCR-Meth. Appl. 4 (1994), 40-58) y
Schaefer (Anal. Biochem. 227 (1995), 255-273), con
las modificaciones de Kato et al. (Gene 150 (1994),
243-250). El producto 5' RACE PCR de 1 kb de largo
obtenido de esta manera se secuenció y se comparó con el clon del
DNAc obtenido del muestreo del banco de DNAc.
La secuencia de nucleótidos resultante del ADNc
completo se comparó con las secuencias de ADN conocidas del banco de
genes y el banco de datos EMBL.
Como se comprobó con el análisis Northern Blot,
el nuevo ARNm identificado se expresa exclusivamente en la línea
celular MCF-7_{ADR}. Por ello, los ADNc y la
proteína codificada por ellos recibió el nombre de "proteína
asociada a la progresión" (PAP). Las secuencias de nucleótidos y
amino-ácidos de la PAP están detalladas en la SEQ ID No. 1 y 2. La
secuencia de nucleótidos contiene 2786 nt con un marco abierto de
lectura de 471 nt (157 aminoácidos) el cual empieza con un codon de
iniciación ATG en la posición 219 y termina con un codon TAA de
interrupción en la posición 692. Una potencial señal de
N-glicosilación en la región de los aminoácidos
43-45 se identificó con el aminoácido 43 como
posible receptor del grupo del azúcar. Una potencial posición de
acilación mediante la adición covalente de miristato fue
identificado en la posición 39 de los aminoácidos. Una posible
posición de fosforilación para la
Serin-treonina-quinasa
caseinaquinasa II fue identificada en la posición 48.
El ADNc de la PAP es miembro de una familia de
genes. Una comparación de las secuencias de aminoácidos de miembros
de esta familia de genes está representada en la figura 1. La mayor
similitud la tiene la PAP humana con la proteína
CL-20 del conejo, y con la proteína de la rata
EMP-1 (identidad del 77% ó respectivamente del 76%)
seguido de la proteína PMP-22 del hombre, ratón y
rata (identidad del 41%, 43% y 41%).
Además se comprobó que la PAP tiene una gran
similitud con proteínas hasta ahora no publicadas, las cuales se
conocen con los nombres de proteína de membrana, asociada al tumor,
de ratón (TMP de ratón, banco de genes U25633, SEQ ID NO. 3/4) y
proteína de membrana, asociada al tumor, humana, banco de genes
U43916 SEQ ID NO. 5/6). La TMP de ratón tiene una longitud de 160
aminoácidos de los cuales 39 aminoácidos son diferentes a la PAP
(identidad 76%). La TMP humana tiene una longitud de 157 aminoácidos
de los cuales 7 aminoácidos son distintos a la PAP (identidad
95%).
Basándose en las gráficas de hidrofobicidad de
apoyo del ordenador y el pronóstico de la estructura secundaria, se
puede proponer un modelo para la hipotética topología de la PAP
(figura 2).
En consecuencia, la PAP contiene 4 dominios
hidrófobos potencialmente transmembránicos y 2 dominios
potencialmente extracelulares (aminoácidos 29-63 ó
respectivamente 118-130)
En la región del primer dominio extracelular, en
particular en el dominio de los aminoácidos 32-48,
están las más grandes diferencias de la PAP con la TMP humana (5
aminoácidos).
Para investigar la expresión de la PAP específica
en tejidos, se investigó la distribución del
ARNm-PAP en diferentes tejidos humanos mediante el
análisis de Northern Blot, empleando múltiples Northern Blots de
tejidos (Clontech, Palo Alto, CA).
Con ello se comprobó que el
ARNm-PAP se expresa en la mayor parte de tejidos
humanos. El ARNm-PAP sin embargo, falta en los
leucocitos periféricos de la sangre y se expresa solamente muy
débilmente en el cerebro. Además el ARNm-PAP falta
en distintas líneas celulares de linfoma y de leucemia, como por
ejemplo HL 60 (leucemia promielocitaria), K562 (leucemia mieloide
crónica), Molt-4 (leucemia
linfoblas-toide), Raji (linfoma de Burkitt) y HeLa
(carcinoma cervi-cal). En células SW480 se comprobó
sin embargo una fuerte expresión del ARNm-PAP
(adenocarcinoma colorrectal) y en células de melanoma G361.
El ADNc-PAP se subclonó en el
sitio EcoRV del vector de expresión pcADN1 (Invitrogen, San Diego,
CA) corriente adelante a partir del promotor del Cytomegalovirus. El
vector original sin la inserción ADNc fue empleado como control
negativo. El ADN recombinante se purificó mediante una columna de
Quiagen (Quiagen, Hilton, DE) y se cuantificó mediante la
determinación de la absorción a 260 nm.
Las células COS las cuales crecieron
exponencialmente en DMEM con el 10% de suero fetal de ternera, se
trataron con tripsina, se lavaron con solución salina tamponada con
fosfato y se centrifugaron a 800 g. Se resuspendieron 1,5 x 10^{6}
células en 200 \mul de solución salina tamponada con fosfato con 5
\mug del vector de ADN. Las células se enfriaron durante 5 minutos
con hielo, se pasaron a una cubeta de electroporación (Biorad,
Herkules, CA) con una rendija de 4 mm, y se sometieron a 300 V y 125
microfaradios, a una electroporación.
Las células transfectadas se enfriaron durante 5
minutos con hielo, se repartieron en siete cápsulas de cultivo de 35
mm con 2 ml de DMEM y 10% de suero fetal de ternera y se cultivaron
durante 48 horas. A continuación se lavaron las células con solución
salina tamponada con tris, se fijaron en DMEM con 2% de
paraformaldehido durante 30 minutos, se lavaron con solución salina
tamponada con tris y se permeabilizaron durante 30 minutos en
solución salina tamponada con tris con 0,1% de saponina. Los sitios
de unión inespecíficos se bloquearon durante 30 minutos a
temperatura ambiente en solución salina tamponada con tris, 2% de
albúmina de suero de vaca, 1% de gelatina de piel de cerdo (tipo A
Sigma), 2% de suero de cabra y 0,1% de saponina. Las células se
diluyeron con anticuerpos anti PAP (ejemplo 7), 1:500 en tampón de
bloqueo con 0,02% de saponina, y se incubaron durante la noche a
4ºC. A continuación, se añadió inmunoglobulina anti conejo de cabra,
marcada con isotio-cianato de fluoresceína, 1:200 en
tampón de bloqueo diluido con 0,02% de saponina. Después de lavar
con solución salina tamponada con tris se aplicaron las células
sobre un portaobjetos y se hizo visible la reactividad inmunológica
mediante microscopía confocal con un Biorad
MRC-600-scanner juntamente con un
microscopio de fluorescencia Zeiss Axiophot. Como control negativo
se empleó suero preinmunológico (1:500) como antisuero primario.
Los anticuerpos antipéptido se obtuvieron contra
péptidos sintéticos de los primeros y segundos bucles extracelulares
de PAP:
Péptido 1:
Cys^{49}-Ser-Asp-Ser-Leu-Ser-Tyr-Ala-Ser-Glu-Asp-Ala-Leu-Lys^{62}-COOH
Péptido 2:
His^{119}-Tyr-Ala-Asn-Arg-Asp-Gly-Thr-Gln-Tyr-His^{129}-COOH
Los péptidos se copularon con hemocianina de
Keyhole-Limpet mediante métodos ya conocidos (Snipes
et al., (1992), ver más arriba). Los conjugados se emplearon
para la inmunización de conejos con el coadyuvante completo de
Freund. A continuación siguió un reforzamiento de la inmunización en
dos semanas de intervalo durante un total de 4 veces con 500 \mug
de péptido y coadyuvante incompleto de Freund. Se extrajo sangre de
los animales inmunizados y se aisló el suero. Se analizó la
actividad del suero inmunológico mediante un análisis ELISA de fase
sólida (ejemplo 6).
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Boehringer Mannheim GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Sandhofer Strasse
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Mannheim-Waldhof
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 68305
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo gen asociado al carcinoma de mama
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- LECTURA DEL ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA DE SOFTWARE: PatentIn Release #1,0 versión #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2786 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: bicatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLÉCULA: ADNa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- PROCEDENCIA INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON(ES): PAP humana
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 219.689
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ. ID. NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTEÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 157 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ. ID. NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTEÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2614 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: bicatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- PROCEDENCIA INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON(ES): TMP de ratón
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 90..569
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ. ID. NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTEÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 160 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ. ID. NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTEÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 756 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: bicatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- PROCEDENCIA INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON(ES): TMP de ratón
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1.471
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ. ID. NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTEÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 157 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6
Claims (7)
1. Empleo de una composición, la cual comprende
como componente activo:
(A) un ácido nucleico, el cual comprende
- (a)
- una secuencia de nucleótidos codificadora de la proteína, representada en SEQ ID No 1
- (b)
- una secuencia de nucleótidos correspondiente a una secuencia de (a) en el marco de la degeneración del código genético,
- (c)
- una secuencia hibridadora con las secuencias de (a), ó (b) en condiciones restrictivas, ó
- (d)
- un fragmento, de por lo menos 20 nucleótidos de longitud, de las secuencias de (a), (b) ó (c),
(B) un péptido o polipéptido ("PAP")
asociado a la progresión, el cual está codificado por un ácido
nucleico según (A), ó
(C) un anticuerpo contra un péptido o polipéptido
según (B), para la obtención de un medio para el diagnóstico de
carcinomas de mama, adenocarcinomas colorrectales o melanomas en
donde la expresión del péptido o polipéptido PAP va correlacionada
con el estadio del tumor.
2. Empleo, según la reivindicación 1, para el
diagnóstico de carcinomas de mama.
3. Empleo, según la reivindicación 1, como
marcador de la progresión de un tumor.
4. Empleo, según una de las reivindicaciones 1 a
3,
caracterizado porque
para el diagnóstico de un tejido procedente de un
paciente se pone el tejido en contacto con una composición según la
reivindicación 1 ó 2, y se determina la expresión del péptido o
polipéptido PAP, cualitativa o/y cuantitativamente.
5. Empleo según la reivindicación 4,
caracterizado porque
la fuerza de la expresión del péptido o
polipéptido de la PAP va correlacionada con la formación de
metástasis en los tejidos.
6. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a
5,
caracterizado porque
el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
7. Empleo de un anticuerpo según la
reivindicación 6,
caracterizado porque
está dirigido contra una secuencia peptídica que
corresponde a los aminoácidos 32-48,
49-62 ó 119-129 de la secuencia de
aminoácidos representadas en SEQ ID No. 2.
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EP96114098 | 1996-09-03 | ||
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