ES2237319B1 - Metodo de identificacion de pigmentos de una sola celula mediante espectrofotometria de imagen confocal en comunidades fototroficas. - Google Patents

Abstract

Método de identificación de pigmentos de una sola célula mediante espectrofotometría de imagen confocal en comunidades fototróficas. La invención proporciona un método no invasivo para el análisis de una muestra que emite fluorescencia bajo excitación láser sin ningún marcaje previo, utilizando un microscopio láser confocal de barrido acoplado a un detector espectrofotómetro. El método permite la localización in vivo y en tres dimensiones de cada comunidad y el análisis directo in situ de los pigmentos fluorescentes de una célula individual, en muestras intactas gruesas. La relación entre estas dos determinaciones permite la identificación de los pigmentos, la posterior identificación de los grupos y especies presentes en la muestra, y el conocimiento del estado fisiológico de cada organismo particular. Es útil para la identificación de proliferaciones problemáticas de algas en ecosistemas acuáticos y aerofíticos.

Description

Método de identificación de pigmentos de una sola célula mediante espectrofotometría de imagen confocal en comunidades fototróficas.

Esta invención se relaciona con el campo de las tecnologías medioambientales, y particularmente con la identificación de organismos vivos fototróficos, es decir, organismos que utilizan la luz como fuente de energía.

Estado de la técnica anterior

La identificación de una comunidad viva compleja y la discriminación entre los grupos filogenéticos son particularmente útiles en los campos de gestión de la acuicultura y las ciencias involucradas en el estudio de los ecosistemas, como la ecología, la ecofisiología, la oceanografía y la limnología. Dicha identificación y discriminación puede usarse, por ejemplo, para analizar la incidencia y para desarrollar estrategias de control contra proliferaciones algales problemáticas que aparecen dentro de los ecosistemas acuáticos y aerofíticos (organismos que viven en la interfase aire y una estructura no viva como un edificio o una pared) en condiciones naturales y artificiales. Desafortunadamente, en el pasado ha sido difícil prever las comunidades complejas problemáticas, debido principalmente a la ausencia de metodologías y tecnologías apropiadas. La naturaleza de las muestras y la necesidad de analizarlas sin previo aislamiento de los organismos, son otros obstáculos importantes a superar. Los esfuerzos actuales dependen típicamente de la evaluación microscópica, pero ésta tiene limitaciones como las de ser laboriosa, generar datos variables, requerir un programa intrusivo de muestreo con áreas de cobertura limitada, y carecer de cobertura próxima a tiempo real. Como alternativa a la evaluación microscópica, se han propuesto análisis basados en medidas de absorbancia celular y/o fluorescencia (cfr. J.J. Cullen et al., "Optical detection and assessment of algal blooms", Limnol. Oceanogr. 1997, vol. 42, pp. 1223-39), pero estos análisis no están exentos de limitaciones. Una limitación de discriminar algas por medidas de absorbancia/fluorescencia es la necesidad de que los espectros correspondientes a los grupos filogenéticos o especies implicados deben ser suficientemente distintos. Además, los pigmentos algales están distribuidos a menudo de forma heterogénea dentro de cada célula, afectando a la medida de la absorción. Aunque los pigmentos pueden ser extraídos, los procedimientos de extracción conllevan los riesgos de presencia de artefactos en la preparación y la eliminación del microambiente original del cromóforo. Otra limitación conocida de diferenciar algas por medidas de absorbancia/fluorescencia se relaciona con la necesidad de aproximaciones empíricas sólidas para discriminar estadísticamente tanto el componente algal de la señal compuesta para una masa dada de agua, como un solo componente algal por si mismo (cfr. D.F. Millie et al., "Using absorbance and fluorescente spectra to discriminate microalgae", Eur. J. Phycol. 2002, vol. 37, pp. 313-22). Ha habido intentos para mejorar el uso de las técnicas de absorbancia/fluorescencia celulares, pero las técnicas mejoradas todavía no pueden analizar muestras tridimensionales (3D), un hecho que impide discriminar morfologías, medir los espectros de emisión en una área de un solo píxel y analizar muestras 3D sin alterarlas.

Los organismos fototróficos producen varios tipos de pigmentos fotosintéticos, donde cada uno de ellos capta fotones en un estrecho intervalo del espectro. Una fracción de la energía absorbida por los pigmentos puede emitirse inmediatamente en una longitud de onda más larga, fenómeno conocido como fluorescencia. La fluorescencia emitida se origina principalmente en los pigmentos subantena del fotosistema II (PSII) y es el resultado de la incapacidad del fotosistema para usar toda la energía absorbida. Puesto que la fotosíntesis y la fluorescencia son procesos competitivos, los cambios en la actividad fotosintética se reflejan en variaciones de la emisión de fluorescencia. Así, la fluorescencia es un indicador de los procesos fotosintéticos en las plantas, algas y cianobacterias, siendo una poderosa herramienta de análisis que permite la descripción de una comunidad compleja por lo que se refiere a su estado fisiológico, la energía de transferencia, la evolución celular y la discriminación entre los grupos filogenéticos.

Las técnicas de microscopía de fluorescencia han permitido la descripción de la estructura y organización de las muestras en dos dimensiones (2D). Estas técnicas se han usado para estudiar microorganismos fotosintéticos y se han descrito varios sistemas tanto a nivel microscópico (cfr. L. Ying et al., "Fluorescence emission and absorption spectra of single Anabaena sp. strain PCC7120 cells", Photochemistry and Photobioloqy 2002, vol. 76, pp. 310-3) como a nivel macroscópico (cfr. H.K. Lichtenthaler et al., "Detection of vegetation stress via a new high resolution fluorescence imaging system", J. Plant Physiology 1996, vol. 148, pp. 559-612). Pero todas estas metodologías no son lo bastante útiles cuando las muestras están constituidas por comunidades complejas, como tapetes microbianos o biofilms. En estos casos, sería deseable hacer una primera prospección de la microestructura en 3D y una subsiguiente localización in vivo de los organismos de interés dentro de la muestra intacta.

Así pues, es muy deseable disponer de un nuevo método para la identificación y la discriminación rápidas de comunidades complejas, que supere algunas de las limitaciones de los métodos conocidos en la técnica. En particular, sería útil que este nuevo método fuese capaz de elucidar la localización 3D de cada comunidad in vivo, y analizar los pigmentos fluorescentes de una sola célula in situ, dentro de muestras intactas gruesas.

Explicación de la invención

Hasta la fecha, el microscopio láser confocal de barrido ("confocal scanning laser microscope", CSLM) se ha utilizado principalmente para obtener imágenes 3D de muestras con una mínima preparación o alteración, dada la capacidad del CSLM para utilizar excitaciones múltiples y detectar longitudes de onda a distintas profundidades de foco. El CSLM permite apuntar a elementos específicos dentro de la muestra, como moléculas, estructuras (p.ej. superficies, matrices) y propiedades (p.ej. fase de división celular). Algunos CSLMs comprenden un prisma espectrofotométrico selectivo para la detección de la fluorescencia de emisión, como el que describe y comercializa Leica Microsystems (cfr. US 5.886.784). La combinación de un CSLM y la detección espectrofotométrica se refiere aquí como "espectrofotometría de imagen confocal" ("confocal imaging spectrophotometry", CIS). Superando los CSLMs comunes, el aparato CIS tiene la ventaja adicional de determinar la detección óptima y de separar los espectros de emisión de los fluorocromos para evitar el solapamiento (es decir, el solapamiento de canales de señal). La presente invención proporciona una nueva aplicación del aparato CIS.

Los inventores han encontrado sorprendentemente un nuevo método para identificar señales fluorescentes en células individuales basado en la combinación de la potencia del microscopio láser confocal de barrido (CSLM) con las capacidades de los métodos espectrofotométricos. El nuevo método permite la identificación in vivo inequívoca del grupo taxonómico de una célula individual, basándose en su señal de fluorescencia, sin manipular las comunidades fototróficas.

Así, la invención proporciona un método no invasivo para el análisis de una muestra utilizando un CSLM acoplado a un detector espectrofotómetro que comprende los pasos de: (i) seleccionar una área particular de la muestra; (ii) obtener imágenes de barrido espectral de la fluorescencia de emisión proveniente del área de muestra seleccionada a unos ajustes del sistema seleccionados; y (iii) procesar dichas imágenes de barrido espectral según algoritmos definibles para obtener un espectro de fluorescencia de emisión de dicha área; donde la muestra emite fluorescencia bajo una excitación láser, sin ningún marcaje previo (es decir, sin la adición de compuestos químicos fluorescentes). Las imágenes de barrido espectral son el resultado de la función de barrido espectral (función "lambdascan") de los aparatos CIS, como el comercializado por Leica Microsystems. Con la función de barrido espectral, la señal de fluorescencia es captada en un intervalo predefinido para cada sección, moviéndose a lo largo del espectro. Cada medida individual se basa en la detección de imágenes confocales reales. En una realización particular, el método de la presente invención utiliza las variables seleccionadas x-y-\lambda, es decir, el plano óptico se registra a diferentes longitudes de onda. En otras realizaciones particulares, el método utiliza las variables x-z-\lambda, x-y-\lambda-t (t significa tiempo) y x-y-\lambda-z. El término "anchura de banda" como se usa aquí, significa el intervalo de frecuencias transmitidas de una señal dada. Por "pasos \lambda" se entiende aquí el número de imágenes individuales detectadas en un intervalo específico de longitudes de onda, desde una única sección óptica. Las imágenes se registran dentro de un intervalo de longitudes de onda, que está limitado por sus puntos de inicio y final. El "tamaño de paso \lambda" es la magnitud (expresada en nm) entre los límites inferior y superior del intervalo de longitudes de onda en los que se registra una imagen.

El software adecuado suministrado con el aparato específico CIS, controla el detector durante el barrido espectral y ayuda en los cálculos, mediante algoritmos definibles, del espectro de emisión después del barrido de una imagen. Así, el espectro de fluorescencia de emisión del área seleccionada se obtiene procesando dichas imágenes de barrido espectral.

En una realización más particular de la invención, el área seleccionada corresponde sustancialmente a una única célula. En otra realización particular, el área seleccionada comprende al menos un pixel de organismos fototróficos. El término "píxel", basado en las palabras "picture" y "element", representa el elemento más pequeño, indivisible, de una imagen en un sistema de dos dimensiones. En esta descripción, tanto los puntos de la muestra de un espécimen como los puntos de una imagen se califican como píxels. En una realización más particular de la invención, los organismos fototróficos se seleccionan del grupo que consiste en plantas, algas, cianobacterias y sus mezclas. Las plantas y las algas pueden ser macroscópicas o microscópicas. En otra realización particular, la muestra tiene un grosor igual o menor que el grosor límite de detección del microscopio láser confocal de barrido utilizado.

En otra realización, los ajustes del sistema para obtener los datos de la muestra de la fluorescencia de emisión, provenientes del área seleccionada de la muestra, se fijan con el objetivo de minimizar el fotoblanqueo. El fotoblanqueo es la pérdida de intensidad de fluorescencia de emisión de la muestra debida a la destrucción de las sustancias fluorescentes por una iluminación intensa. En particular, el tamaño de paso \lambda se fija entre 5 y 40 nm, y la anchura de banda se fija desde 360 a 800 nm. En otra realización particular, el rendimiento y el ajuste se mantienen constantes. El valor de rendimiento ("gain value") modifica la amplificación de la señal detectada y, por consiguiente, el brillo y el contraste de la imagen cambian. El valor de ajuste ("offset value") define un valor umbral y, por tanto, sólo aquellas señales que están por encima del valor umbral son detectadas y representadas en la imagen. Por último, la longitud de onda de excitación láser se fija en uno o más de los siguientes valores: 351 nm (láser UV Ar), 364 nm (láser UV Ar), 458 nm (láser Ar), 476 nm (láser Ar), 488 nm (láser Ar), 514 nm (láser Ar), 543 nm (láser HeNe) y 633 nm (láser HeNe).

En otra realización, los datos de la muestra se procesan según algoritmos definibles que proporcionan gráficos de dos dimensiones de la media de la intensidad de fluorescencia versus las longitudes de onda de fluorescencia de emisión.

El método de la presente invención proporciona la localización in vivo y en tres dimensiones de cada comunidad y el análisis directo de los pigmentos fluorescentes de una célula individual in situ, en muestras intactas gruesas. La relación entre estas dos determinaciones permite la identificación de los pigmentos, la posterior identificación de los grupos y especies presentes en la muestra, y el conocimiento del estado fisiológico de cada organismo particular. En resumen, las principales mejoras conseguidas con el nuevo método son: (i) el análisis de píxels fluorescentes individuales o múltiples; (ii) la localización 3D in vivo; (iii) el análisis directo in situ de pigmentos fluorescentes de una única célula en muestras gruesas sin aislamiento previo; (iv) el establecimiento de la relación entre las propiedades fluorescentes y la posición dentro del ensamblaje microbiano específico; (v) la posible aplicación de ocho longitudes de onda de excitación para obtener espectros de una única célula, proporcionando una detección de alta resolución y una detallada información de la muestra; (vi) el acceso rápido a información estadística sobre el número de células y las propiedades espectrales de una comunidad; (vii) la discriminación de las células con señales fluorescentes particulares dentro de la colonia y la correlación con los estados individuales de las células; y (viii) la libre elección de la longitud de onda de emisión, que permite el descubrimiento de nuevas señales de pigmentos.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes realizaciones particulares y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativas de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig 1. muestra el análisis espectrofotométrico del biofilm BF1 in vivo de la catacumba romana de St. Callistus. La Fig. 1A. muestra la proyección 3D pseudocolor de foco extendido en planos x-y y la vista ortogonal en la dirección z del biofilm (49 secciones ópticas). En las Figs. 1B-D. se representan los perfiles espectrales in vivo derivados de \lambda_{exc} de 488, 514 y 543 nm, y el error estándar (n = 5 células).

La Fig 2. muestra el análisis espespectrofotométrico del biofilm BF2 in vivo de la catacumba romana Domitilla. La Fig. 2A. muestra la proyección 3D pseudocolor de foco extendido en planos x-y y la vista ortogonal en la dirección z del biofilm (66 secciones ópticas). En las Figs. 2B-D. se representan los perfiles espectrales in vivo derivados de \lambda_{exc} de 488, 514 y 543 nm, y el error estándar (n = 5 células).

Exposición detallada de modos de realización Funcionamiento del aparato CIS

Se llevó a cabo el análisis CSLM con un microscopio Leica TCS-SP2 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Manheim, Alemania) usando cualquiera de los objetivos Plan-Apochromatic 63x (NA 1.32, aceite) o 100x (NA 1.4, aceite) (intervalo de aumento 1-4). El barrido espectral se realizó usando las líneas de 351 y 364 nm de un láser UV de Ar; las líneas 458, 476, 488 y 514 nm de un láser de Ar; la línea 543 nm de un láser de HeNe verde y la línea 633 nm de un láser de HeNe rojo. El Leica TCS-SP2 usa una detección espectrofotométrica que permite al sistema realizar diferentes barridos desde 360 a 800 nm del espectro utilizando una rendija motorizada situada delante del fotomultiplicador. Aunque el aparato CIS podría adquirir imágenes espectrales de 5 nm de tamaño de paso entre 360-800 nm, cada secuencia de imágenes (es decir, el barrido espectral o la función "lambda-scan" del sistema) se obtuvo mediante el barrido de la misma sección óptica x-y usando como tamaño de paso 20 nm para la detección (coordenada \lambda de un conjunto de datos x-y-\lambda) para evitar el fotoblanqueo. La detección de la emisión se colocó 4-9 nm más lejos de la longitud de onda de excitación para evitar reflejos del haz de láser.

Los barridos se realizaron utilizando como filtro separador del haz, el filtro substrato (para UV) o el filtro dicroico triple (488/543/633). La serie de datos x, y, \lambda. fue adquirida en la posición z en la que la fluorescencia era máxima. Se midió el ruido de fondo en áreas sin muestra y, después, se usó para corregir los espectros primarios en las secciones finas. El láser impactaba perpendicularmente en la muestra y, para evitar la interferencia con la radiación de fondo (luz en el laboratorio o luz de fuentes de excitación), las imágenes se captaron en la oscuridad. El rendimiento y el contraste eran los mismos para cada campo en cada longitud de onda de excitación y no se alteraron a lo largo del proceso de barrido.

Análisis de fluorescencia

De los datos anteriores, la intensidad media de fluorescencia ("mean fluorescence intensity", MFI) de las series de datos x-y-\lambda. se obtuvo usando el software Leica Confocal, versión 2.0. Se utilizó la función región de interés ("region of interest", ROI) del software para determinar la señal espectral de una área seleccionada de la imagen captada. Una ROI también puede especificarse para determinar el espectro de cada muestra y el software presenta la intensidad media de todos los píxels dentro de la ROI versus la longitud de onda. Para las soluciones de los pigmentos, se analizaron ROIs de 1000 \mum^{2} (n = 10 regiones). Para el análisis de los biofilms, se fijaron ROIs de 1 \mum^{2}, tomadas de la región fluorescente del tilacoide dentro de la célula, en cada serie de imágenes x-y-\lambda. Se obtuvieron barridos espectrales (lambdascans) de biofilms (n = 5 células por cada especie presente en el biofilm) para cada longitud de onda de excitación (\lambda_{exc}) en por lo menos tres experimentos independientes. Se procesaron los datos numéricos con Microsoft Excel® 97 ó 2000. Se calculó la media y el error estándar, para todas las regiones o células examinadas en cada \lambda_{exc}. Los máximos de los pigmentos correspondieron a su intervalo de dispersión en las diferentes \lambda_{exc}.

Calibraciones mediante pigmentos puros

Los pigmentos extraídos muestran variaciones en los espectros de fluorescencia cuando se comparan con los pigmentos in vivo, por eso se realizó un control con pigmentos puros para compararlos con los estudios publicados.

Los pigmentos liposolubles, clorofilas (Chls) a y b, obtenidas de Spinacia oleracea y la xantofila (Xant) de Medicago sativa (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se disolvieron en etanol puro. Los pigmentos hidrosolubles como R-ficoeritrina (R-PE) de Porphyra tenera y C-ficocianina (C-PE) de Spirulina sp. se disolvieron en agua destilada filtrada. La solución patrón de aloficocianina-XL (APC-XL) de Mastigocladus laminosus estaba disuelta en sulfato de amonio (60%) y fosfato de potasio (el pH = 7) (Sigma-Aldrich) con una concentración final de 38 mM. Cuatrocientos \mul de cada solución del pigmento a una concentración final de 1 mg/ml se transfirieron a cámaras de 8 pocillos con fondo de vidrio (Nunc Laboratorio-Tek™, Nalge Nunc International, Roskilde, Dinamarca).

Los espectros de los pigmentos puros (Tabla 1) se correlacionaron bien con los espectros publicados de pigmentos extraídos. Los datos son la media \pm error estándar (n = 10 regiones) a partir de tres experimentos independientes llevados a cabo en las mismas condiciones experimentales. El asterisco significa presencia de un hombro. Los intervalos de emisión máxima de la Chl a (672.4 \pm 2.9 nm) y la Chl b (662.4 \pm 2.1 nm) se solaparon parcialmente. El máximo de fluorescencia de C-PE se localizó alrededor de 577.2 \pm 2.2 nm, con un hombro alrededor de 660.1 \pm 3 nm. Este hombro podría corresponder a otra ficobiliproteina contaminante presente en el estándar. El pico de fluorescencia máxima de C-PC, localizado a 656.1 \pm 4.3 nm, parecía ligeramente desplazado con respecto a las referencias publicadas. Sin embargo, se reflejan cambios en el máximo de fluorescencia de la C-PC en la literatura, dependiendo del método de extracción utilizado. La C-PC extraída de biomasa fresca mostró un gran máximo a 615 nm mientras que en las muestras secas se observó un máximo adicional a 652 nm.

TABLA 1 \lambda_{max} y hombros para diferentes pigmentos puros mediante espectrofotometría de imagen confocal en todas las \lambda_{exc}

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Tanto la C-PC como la Xant presentaron una débil fluorescencia como ya era conocido. Mientras la débil fluorescencia de la Xant era de esperar porque la principal ruta de desexcitación ocurre a través de la transición al estado del triplete, que no es fluorescente, no se pudo explicar la razón para esta baja fluorescencia en la C-PC pura. El máximo de fluorescencia para la aloficocianina-entrecruzada (APC-XL) estaba a 676.2 \pm 2.4 nm. La estructura especial de APC-XL, que impedía la disociación de la molécula en soluciones diluidas, probablemente afectó al máximo de emisión y no pudo relacionarse con el material de campo. Por otro lado, este máximo coincidía con un tipo específico de APC previamente descrita. Otras formas de baja energía comunes de APC tienen el máximo de fluorescencia cerca de 680 nm, que es similar a la emisión de los ficobilisomas intactos mientras que la APC de las cianobacterias presentó un máximo de emisión a 660 nm.

Preparación y análisis de biofilms

Los biofilms están constituidos por poblaciones o comunidades de microorganismos que se adhieren a superficies ambientales. Estos microorganismos normalmente están inmersos en un polisacárido extracellular que ellos mismos sintetizan. Se seleccionaron dos biofilms aerofíticos en las observaciones de CSLM para probar el método con comunidades naturales complejas. Los biofilms, que fueron descritos y identificados, contenían diferentes grupos filogenéticos (Cyanobacteria y Bacillariophyta). El primer biofilm (BF1), obtenido de la catacumba de St. Callistus (Roma, Italia), estaba formado principalmente por Scytonema julianum y Leptolyngbya sp. El segundo biofilm (BF2), obtenido de la catacumba Domitilla (Roma, Italia), estaba formado por la Bacillariophyta Diadesmis gallica y una cianobacteria no identificada del grupo de las Chroococcales. Ambos biofilms se obtuvieron de superficies iluminadas artificialmente. Se separaron los fragmentos de biofilms de sus substratos (yeso, mortero o espeleotemas) o, raramente, se tomaron junto con pequeños pedazos de su soporte. Los biofilms se mantuvieron en una capa de 2 mm de 10% de medio BG11 agarizado (1%, Merck), y se procesaron durante la primera semana. Los biofilms y cultivos se montaron en cámaras con fondo de vidrio Nunc Lab-Tek™. Las muestras se procesaron a temperatura ambiente en la oscuridad.

Las imágenes de foco extendido ("extended focus", es decir, la imagen se divide en tres marcos que representan la proyección de intensidad máxima de fluorescencia para los planos x-y, x-z e y-z) de los dos biofilms estratificados mostraron una distribución diferencial de los microorganismos en profundidad en el biofilm (Fig. 1A y 2A). Se muestran los espectros de emisión para 488, 514 y 543 nm de \lambda_{exc} para cada biofilm (Fig. 1 B-D y 2B-D).

La Fig. 1A muestra una proyección 3D pseudocolor de foco extendido en planos x-y y ortogonal en la dirección z del biofilm (49 secciones ópticas). La imagen representa la autofluorescencia máxima emitida en el intervalo de 590-775 nm cuando se excitó a 543 nm. El volumen bajo observación fue de 465.03 x 465.03 x 398.73 \mum^{3}. Paso en z: 0.4 \mum. Factor de aumento: 1. Grosor: 19.54 \mum. Las Figs. 1B-D muestran los perfiles espectrales in vivo derivados de 488, 514 y 543 nm \lambda_{exc} y el error estándar (n = 5 células). MFI significa intensidad media de fluorescencia. Las diferencias obtenidas en los perfiles de fluorescencia de emisión obtenidos en el biofilm indicaban la presencia de diferentes especies de cianobacterias. Leptolyngbya sp. se representa con una línea continua y Scytonema julianum con una línea discontinua. Factor de aumento: 2.

Según los datos obtenidos, en el biofilm BF1, los filamentos delgados de Leptolyngya sp. se orientaron horizontalmente encima del ancho Scytonema julianum (Fig. 1A). Ambas cianobacterias tenían un \lambda_{max} a 658.4 \pm 3 nm amplio, del solapamiento de la Chl a y las ficobiliproteinas (Fig. 1B-D). Además, Leptolyngybya sp., pero no S. julianum, presentó un pico de emisión (579.7 \pm 3.8 nm) atribuible a la presencia de C-PE (Fig. 2B-D).

La Fig. 2A muestra secciones ópticas a 66 x-y del biofilm estratificado, que consiste en dos estratos, la capa superior compuesta por colonias de Diadesmis gallica y la capa inferior formadas por colonias de Chroococcales. El volumen bajo observación fue de 75.82 x 75.82 x 98.51 \mum^{3}. Paso en z: 0.1 \mum. Factor de aumento: 3.86. Grosor: 6.6 µm. La imagen representa la autofluorescencia máxima emitida en el intervalo de 590-775 nm cuando se excitó a 543 nm. Las Figs. 2B-D muestran los perfiles espectrales in vivo derivados de \lambda_{exc} de 488, 514 y 543 nm, y el error estándar (n = 5 células). La diferencia de los perfiles de emisión obtenidos en el biofilm indican la presencia de grupos diferentes de algas y cianobacterias. Chroococcal se representa con una línea continua y Diadesmis gallica con una línea discontinua. En este biofilm se observó una gran disminución de fluorescencia en la \lambda_{exc} 543 nm, atribuible al fotoblanqueo después de sucesivos barridos espectrales. Factor de aumento: 2.

El análisis CSLM reveló dos capas en el biofilm BF2: Diadesmis gallica (Bacillariophyta) estaba principalmente concentrada en la parte superior del biofilm mientras la Chroococcal no identificada formaba una capa discontinua en la parte inferior (Fig. 2A). D. gallica de 3 \mum de diámetro, presentó menos fluorescencia que la cianobacteria. Su \lambda_{max}, a 676.2 \pm 5 nm (Fig. 2B-D), no coincidía con la \lambda_{max} de los otros grupos debido a la presencia de Chl c. Para evitar el fotoblanqueo, causado cuando estas células fueron excitadas consecutivamente con diferente \lambda_{exc}, se usaron diferentes campos ópticos para obtener los espectros de emisión en todas las \lambda_{exc}. La Chroococcal no identificada presentó la misma forma espectral que Leptolyngbya sp.

La Tabla 2 muestra los resultados de la emisión de fluorescencia adquirida de los biofilms después de la excitación a cuatro longitudes de onda (\lambda_{exc}) (351, 488, 514 y 543 nm). Cada valor \lambda_{max} se obtuvo a partir de 5 células.

TABLA 2 Comparación de \lambda_{max} para cada \lambda_{exc} de los dos biofilms aerofíticos

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Diferencias en la intensidad media de fluorescencia (MFI)

En los biofilms, las cianobacterias presentaron la mayor MFI en el intervalo 640-740 nm a cualquiera de las \lambda_{exc} cuando se comparan con las Bacillariophyta (Fig. 1B-D y 2B-D). Las cianobacterias también presentaron una alta MFI a 577-580 nm \lambda_{max}, debido a la C-PE.

Cada pigmento fotosintético presente en las especies absorbe la luz de una cierta longitud de onda, pero en general, los pigmentos captan fotones de un amplio intervalo de longitudes de onda cuando se excitan a las longitudes de onda de 351-633 nm. Sólo en el 364 nm (UV) y el 458 nm (azul) \lambda_{exc} se observó una respuesta de emisión más pequeña en todos los microorganismos. En el caso de las cianobacterias, esto indica que la eficiencia mínima de los fotorreceptores está en 430-460 nm.

Claims (11)

1. Método no invasivo para el análisis de una muestra utilizando un microscopio láser confocal de barrido acoplado a un detector espectrofotómetro que comprende los pasos de:

(i) seleccionar una área particular de la muestra;

(ii) obtener imágenes de barrido espectral de la fluorescencia de emisión proveniente del área de muestra seleccionada a unos ajustes del sistema seleccionados; y

(iii) procesar dichas imágenes de barrido espectral según algoritmos definibles para obtener un espectro de fluorescencia de emisión de dicha área;

donde la muestra emite fluorescencia bajo una excitación láser, sin ningún marcaje previo.

2. Método según la reivindicación 1, donde las imágenes de barrido espectral son imágenes x-y-\lambda.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el área seleccionada corresponde sustancialmente a una única célula.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el área seleccionada comprende al menos un píxel de organismos fototróficos.

5. Método según la reivindicación 4, donde los organismos fototróficos se seleccionan del grupo que consiste en plantas, algas, cianobacterias y sus mezclas.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde los ajustes del sistema se seleccionan para minimizar el fotoblanqueo.

7. Método según la reivindicación 6, donde el tamaño de paso \lambda se fija entre 5 y 40 nm, y la anchura de banda se fija desde 360 a 800 nm.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el rendimiento y el contraste se mantienen constantes.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la longitud de onda de excitación láser se fija en uno o más de los siguientes valores: 351 nm (láser UV Ar), 364 nm (láser UV Ar), 458 nm (láser Ar), 476 nm (láser Ar), 488 nm (láser Ar), 514 nm (láser Ar), 543 nm (láser HeNe) y 633 nm (láser HeNe).

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde los algoritmos del paso (iii) proporcionan gráficos de dos dimensiones de la media de la intensidad de fluorescencia versus las longitudes de onda de fluorescencia de emisión.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la muestra tiene un grosor igual o menor que el grosor límite de detección del microscopio láser confocal de barrido utilizado.