ES2237319B1 - Metodo de identificacion de pigmentos de una sola celula mediante espectrofotometria de imagen confocal en comunidades fototroficas. - Google Patents
Metodo de identificacion de pigmentos de una sola celula mediante espectrofotometria de imagen confocal en comunidades fototroficas.Info
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Abstract
Método de identificación de pigmentos de una sola célula mediante espectrofotometría de imagen confocal en comunidades fototróficas. La invención proporciona un método no invasivo para el análisis de una muestra que emite fluorescencia bajo excitación láser sin ningún marcaje previo, utilizando un microscopio láser confocal de barrido acoplado a un detector espectrofotómetro. El método permite la localización in vivo y en tres dimensiones de cada comunidad y el análisis directo in situ de los pigmentos fluorescentes de una célula individual, en muestras intactas gruesas. La relación entre estas dos determinaciones permite la identificación de los pigmentos, la posterior identificación de los grupos y especies presentes en la muestra, y el conocimiento del estado fisiológico de cada organismo particular. Es útil para la identificación de proliferaciones problemáticas de algas en ecosistemas acuáticos y aerofíticos.
Description
Método de identificación de pigmentos de una
sola célula mediante espectrofotometría de imagen confocal en
comunidades fototróficas.
Esta invención se relaciona con el campo de las
tecnologías medioambientales, y particularmente con la
identificación de organismos vivos fototróficos, es decir,
organismos que utilizan la luz como fuente de energía.
La identificación de una comunidad viva compleja
y la discriminación entre los grupos filogenéticos son
particularmente útiles en los campos de gestión de la acuicultura y
las ciencias involucradas en el estudio de los ecosistemas, como la
ecología, la ecofisiología, la oceanografía y la limnología. Dicha
identificación y discriminación puede usarse, por ejemplo, para
analizar la incidencia y para desarrollar estrategias de control
contra proliferaciones algales problemáticas que aparecen dentro de
los ecosistemas acuáticos y aerofíticos (organismos que viven en la
interfase aire y una estructura no viva como un edificio o una
pared) en condiciones naturales y artificiales. Desafortunadamente,
en el pasado ha sido difícil prever las comunidades complejas
problemáticas, debido principalmente a la ausencia de metodologías y
tecnologías apropiadas. La naturaleza de las muestras y la
necesidad de analizarlas sin previo aislamiento de los organismos,
son otros obstáculos importantes a superar. Los esfuerzos actuales
dependen típicamente de la evaluación microscópica, pero ésta tiene
limitaciones como las de ser laboriosa, generar datos variables,
requerir un programa intrusivo de muestreo con áreas de cobertura
limitada, y carecer de cobertura próxima a tiempo real. Como
alternativa a la evaluación microscópica, se han propuesto análisis
basados en medidas de absorbancia celular y/o fluorescencia (cfr.
J.J. Cullen et al., "Optical detection and assessment of
algal blooms", Limnol. Oceanogr. 1997, vol. 42, pp.
1223-39), pero estos análisis no están exentos de
limitaciones. Una limitación de discriminar algas por medidas de
absorbancia/fluorescencia es la necesidad de que los espectros
correspondientes a los grupos filogenéticos o especies implicados
deben ser suficientemente distintos. Además, los pigmentos algales
están distribuidos a menudo de forma heterogénea dentro de cada
célula, afectando a la medida de la absorción. Aunque los pigmentos
pueden ser extraídos, los procedimientos de extracción conllevan
los riesgos de presencia de artefactos en la preparación y la
eliminación del microambiente original del cromóforo. Otra
limitación conocida de diferenciar algas por medidas de
absorbancia/fluorescencia se relaciona con la necesidad de
aproximaciones empíricas sólidas para discriminar estadísticamente
tanto el componente algal de la señal compuesta para una masa dada
de agua, como un solo componente algal por si mismo (cfr. D.F.
Millie et al., "Using absorbance and fluorescente spectra
to discriminate microalgae", Eur. J. Phycol. 2002, vol.
37, pp. 313-22). Ha habido intentos para mejorar el
uso de las técnicas de absorbancia/fluorescencia celulares, pero
las técnicas mejoradas todavía no pueden analizar muestras
tridimensionales (3D), un hecho que impide discriminar morfologías,
medir los espectros de emisión en una área de un solo píxel y
analizar muestras 3D sin alterarlas.
Los organismos fototróficos producen varios
tipos de pigmentos fotosintéticos, donde cada uno de ellos capta
fotones en un estrecho intervalo del espectro. Una fracción de la
energía absorbida por los pigmentos puede emitirse inmediatamente
en una longitud de onda más larga, fenómeno conocido como
fluorescencia. La fluorescencia emitida se origina principalmente
en los pigmentos subantena del fotosistema II (PSII) y es el
resultado de la incapacidad del fotosistema para usar toda la
energía absorbida. Puesto que la fotosíntesis y la fluorescencia
son procesos competitivos, los cambios en la actividad fotosintética
se reflejan en variaciones de la emisión de fluorescencia. Así, la
fluorescencia es un indicador de los procesos fotosintéticos en las
plantas, algas y cianobacterias, siendo una poderosa herramienta de
análisis que permite la descripción de una comunidad compleja por
lo que se refiere a su estado fisiológico, la energía de
transferencia, la evolución celular y la discriminación entre los
grupos filogenéticos.
Las técnicas de microscopía de fluorescencia han
permitido la descripción de la estructura y organización de las
muestras en dos dimensiones (2D). Estas técnicas se han usado para
estudiar microorganismos fotosintéticos y se han descrito varios
sistemas tanto a nivel microscópico (cfr. L. Ying et al.,
"Fluorescence emission and absorption spectra of single
Anabaena sp. strain PCC7120 cells", Photochemistry and
Photobioloqy 2002, vol. 76, pp. 310-3) como a
nivel macroscópico (cfr. H.K. Lichtenthaler et al.,
"Detection of vegetation stress via a new high resolution
fluorescence imaging system", J. Plant Physiology 1996,
vol. 148, pp. 559-612). Pero todas estas
metodologías no son lo bastante útiles cuando las muestras están
constituidas por comunidades complejas, como tapetes microbianos o
biofilms. En estos casos, sería deseable hacer una primera
prospección de la microestructura en 3D y una subsiguiente
localización in vivo de los organismos de interés dentro de
la muestra intacta.
Así pues, es muy deseable disponer de un nuevo
método para la identificación y la discriminación rápidas de
comunidades complejas, que supere algunas de las limitaciones de
los métodos conocidos en la técnica. En particular, sería útil que
este nuevo método fuese capaz de elucidar la localización 3D de cada
comunidad in vivo, y analizar los pigmentos fluorescentes de
una sola célula in situ, dentro de muestras intactas
gruesas.
Hasta la fecha, el microscopio láser confocal de
barrido ("confocal scanning laser microscope", CSLM) se ha
utilizado principalmente para obtener imágenes 3D de muestras con
una mínima preparación o alteración, dada la capacidad del CSLM
para utilizar excitaciones múltiples y detectar longitudes de onda a
distintas profundidades de foco. El CSLM permite apuntar a
elementos específicos dentro de la muestra, como moléculas,
estructuras (p.ej. superficies, matrices) y propiedades (p.ej. fase
de división celular). Algunos CSLMs comprenden un prisma
espectrofotométrico selectivo para la detección de la fluorescencia
de emisión, como el que describe y comercializa Leica Microsystems
(cfr. US 5.886.784). La combinación de un CSLM y la detección
espectrofotométrica se refiere aquí como "espectrofotometría de
imagen confocal" ("confocal imaging spectrophotometry",
CIS). Superando los CSLMs comunes, el aparato CIS tiene la ventaja
adicional de determinar la detección óptima y de separar los
espectros de emisión de los fluorocromos para evitar el
solapamiento (es decir, el solapamiento de canales de señal). La
presente invención proporciona una nueva aplicación del aparato
CIS.
Los inventores han encontrado sorprendentemente
un nuevo método para identificar señales fluorescentes en células
individuales basado en la combinación de la potencia del
microscopio láser confocal de barrido (CSLM) con las capacidades de
los métodos espectrofotométricos. El nuevo método permite la
identificación in vivo inequívoca del grupo taxonómico de
una célula individual, basándose en su señal de fluorescencia, sin
manipular las comunidades fototróficas.
Así, la invención proporciona un método no
invasivo para el análisis de una muestra utilizando un CSLM
acoplado a un detector espectrofotómetro que comprende los pasos
de: (i) seleccionar una área particular de la muestra; (ii) obtener
imágenes de barrido espectral de la fluorescencia de emisión
proveniente del área de muestra seleccionada a unos ajustes del
sistema seleccionados; y (iii) procesar dichas imágenes de barrido
espectral según algoritmos definibles para obtener un espectro de
fluorescencia de emisión de dicha área; donde la muestra emite
fluorescencia bajo una excitación láser, sin ningún marcaje previo
(es decir, sin la adición de compuestos químicos fluorescentes). Las
imágenes de barrido espectral son el resultado de la función de
barrido espectral (función "lambdascan") de los aparatos CIS,
como el comercializado por Leica Microsystems. Con la función de
barrido espectral, la señal de fluorescencia es captada en un
intervalo predefinido para cada sección, moviéndose a lo largo del
espectro. Cada medida individual se basa en la detección de imágenes
confocales reales. En una realización particular, el método de la
presente invención utiliza las variables seleccionadas
x-y-\lambda, es decir, el plano
óptico se registra a diferentes longitudes de onda. En otras
realizaciones particulares, el método utiliza las variables
x-z-\lambda,
x-y-\lambda-t (t
significa tiempo) y
x-y-\lambda-z. El
término "anchura de banda" como se usa aquí, significa el
intervalo de frecuencias transmitidas de una señal dada. Por
"pasos \lambda" se entiende aquí el número de imágenes
individuales detectadas en un intervalo específico de longitudes de
onda, desde una única sección óptica. Las imágenes se registran
dentro de un intervalo de longitudes de onda, que está limitado por
sus puntos de inicio y final. El "tamaño de paso \lambda" es
la magnitud (expresada en nm) entre los límites inferior y superior
del intervalo de longitudes de onda en los que se registra una
imagen.
El software adecuado suministrado con el aparato
específico CIS, controla el detector durante el barrido espectral y
ayuda en los cálculos, mediante algoritmos definibles, del espectro
de emisión después del barrido de una imagen. Así, el espectro de
fluorescencia de emisión del área seleccionada se obtiene
procesando dichas imágenes de barrido espectral.
En una realización más particular de la
invención, el área seleccionada corresponde sustancialmente a una
única célula. En otra realización particular, el área seleccionada
comprende al menos un pixel de organismos fototróficos. El término
"píxel", basado en las palabras "picture" y
"element", representa el elemento más pequeño,
indivisible, de una imagen en un sistema de dos dimensiones. En
esta descripción, tanto los puntos de la muestra de un espécimen
como los puntos de una imagen se califican como píxels. En una
realización más particular de la invención, los organismos
fototróficos se seleccionan del grupo que consiste en plantas,
algas, cianobacterias y sus mezclas. Las plantas y las algas pueden
ser macroscópicas o microscópicas. En otra realización particular,
la muestra tiene un grosor igual o menor que el grosor límite de
detección del microscopio láser confocal de barrido utilizado.
En otra realización, los ajustes del sistema
para obtener los datos de la muestra de la fluorescencia de
emisión, provenientes del área seleccionada de la muestra, se fijan
con el objetivo de minimizar el fotoblanqueo. El fotoblanqueo es la
pérdida de intensidad de fluorescencia de emisión de la muestra
debida a la destrucción de las sustancias fluorescentes por una
iluminación intensa. En particular, el tamaño de paso \lambda se
fija entre 5 y 40 nm, y la anchura de banda se fija desde 360 a 800
nm. En otra realización particular, el rendimiento y el ajuste se
mantienen constantes. El valor de rendimiento ("gain value")
modifica la amplificación de la señal detectada y, por consiguiente,
el brillo y el contraste de la imagen cambian. El valor de ajuste
("offset value") define un valor umbral y, por tanto, sólo
aquellas señales que están por encima del valor umbral son
detectadas y representadas en la imagen. Por último, la longitud de
onda de excitación láser se fija en uno o más de los siguientes
valores: 351 nm (láser UV Ar), 364 nm (láser UV Ar), 458 nm (láser
Ar), 476 nm (láser Ar), 488 nm (láser Ar), 514 nm (láser Ar), 543
nm (láser HeNe) y 633 nm (láser HeNe).
En otra realización, los datos de la muestra se
procesan según algoritmos definibles que proporcionan gráficos de
dos dimensiones de la media de la intensidad de fluorescencia
versus las longitudes de onda de fluorescencia de
emisión.
El método de la presente invención proporciona
la localización in vivo y en tres dimensiones de cada
comunidad y el análisis directo de los pigmentos fluorescentes de
una célula individual in situ, en muestras intactas gruesas.
La relación entre estas dos determinaciones permite la
identificación de los pigmentos, la posterior identificación de los
grupos y especies presentes en la muestra, y el conocimiento del
estado fisiológico de cada organismo particular. En resumen, las
principales mejoras conseguidas con el nuevo método son: (i) el
análisis de píxels fluorescentes individuales o múltiples; (ii) la
localización 3D in vivo; (iii) el análisis directo in
situ de pigmentos fluorescentes de una única célula en muestras
gruesas sin aislamiento previo; (iv) el establecimiento de la
relación entre las propiedades fluorescentes y la posición dentro
del ensamblaje microbiano específico; (v) la posible aplicación de
ocho longitudes de onda de excitación para obtener espectros de una
única célula, proporcionando una detección de alta resolución y una
detallada información de la muestra; (vi) el acceso rápido a
información estadística sobre el número de células y las
propiedades espectrales de una comunidad; (vii) la discriminación
de las células con señales fluorescentes particulares dentro de la
colonia y la correlación con los estados individuales de las
células; y (viii) la libre elección de la longitud de onda de
emisión, que permite el descubrimiento de nuevas señales de
pigmentos.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí
como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes realizaciones particulares y figuras se proporcionan a
modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativas de la
presente invención.
La Fig 1. muestra el análisis
espectrofotométrico del biofilm BF1 in vivo de la catacumba
romana de St. Callistus. La Fig. 1A. muestra la proyección 3D
pseudocolor de foco extendido en planos x-y y la
vista ortogonal en la dirección z del biofilm (49 secciones
ópticas). En las Figs. 1B-D. se representan los
perfiles espectrales in vivo derivados de \lambda_{exc} de
488, 514 y 543 nm, y el error estándar (n = 5 células).
La Fig 2. muestra el análisis
espespectrofotométrico del biofilm BF2 in vivo de la
catacumba romana Domitilla. La Fig. 2A. muestra la proyección 3D
pseudocolor de foco extendido en planos x-y y la
vista ortogonal en la dirección z del biofilm (66 secciones
ópticas). En las Figs. 2B-D. se representan los
perfiles espectrales in vivo derivados de \lambda_{exc} de
488, 514 y 543 nm, y el error estándar (n = 5 células).
Se llevó a cabo el análisis CSLM con un
microscopio Leica TCS-SP2 (Leica Microsystems
Heidelberg GmbH, Manheim, Alemania) usando cualquiera de los
objetivos Plan-Apochromatic 63x (NA 1.32, aceite) o
100x (NA 1.4, aceite) (intervalo de aumento 1-4).
El barrido espectral se realizó usando las líneas de 351 y 364 nm
de un láser UV de Ar; las líneas 458, 476, 488 y 514 nm de un láser
de Ar; la línea 543 nm de un láser de HeNe verde y la línea 633 nm
de un láser de HeNe rojo. El Leica TCS-SP2 usa una
detección espectrofotométrica que permite al sistema realizar
diferentes barridos desde 360 a 800 nm del espectro utilizando una
rendija motorizada situada delante del fotomultiplicador. Aunque el
aparato CIS podría adquirir imágenes espectrales de 5 nm de tamaño
de paso entre 360-800 nm, cada secuencia de imágenes
(es decir, el barrido espectral o la función
"lambda-scan" del sistema) se obtuvo mediante
el barrido de la misma sección óptica x-y usando
como tamaño de paso 20 nm para la detección (coordenada \lambda
de un conjunto de datos
x-y-\lambda) para evitar el
fotoblanqueo. La detección de la emisión se colocó
4-9 nm más lejos de la longitud de onda de
excitación para evitar reflejos del haz de láser.
Los barridos se realizaron utilizando como
filtro separador del haz, el filtro substrato (para UV) o el filtro
dicroico triple (488/543/633). La serie de datos x, y, \lambda.
fue adquirida en la posición z en la que la fluorescencia era
máxima. Se midió el ruido de fondo en áreas sin muestra y, después,
se usó para corregir los espectros primarios en las secciones
finas. El láser impactaba perpendicularmente en la muestra y, para
evitar la interferencia con la radiación de fondo (luz en el
laboratorio o luz de fuentes de excitación), las imágenes se
captaron en la oscuridad. El rendimiento y el contraste eran los
mismos para cada campo en cada longitud de onda de excitación y no
se alteraron a lo largo del proceso de barrido.
De los datos anteriores, la intensidad media de
fluorescencia ("mean fluorescence intensity", MFI) de las
series de datos x-y-\lambda. se
obtuvo usando el software Leica Confocal, versión 2.0. Se utilizó
la función región de interés ("region of interest", ROI) del
software para determinar la señal espectral de una área
seleccionada de la imagen captada. Una ROI también puede
especificarse para determinar el espectro de cada muestra y el
software presenta la intensidad media de todos los píxels dentro de
la ROI versus la longitud de onda. Para las soluciones de
los pigmentos, se analizaron ROIs de 1000 \mum^{2} (n = 10
regiones). Para el análisis de los biofilms, se fijaron ROIs de 1
\mum^{2}, tomadas de la región fluorescente del tilacoide dentro
de la célula, en cada serie de imágenes
x-y-\lambda. Se obtuvieron
barridos espectrales (lambdascans) de biofilms (n = 5 células por
cada especie presente en el biofilm) para cada longitud de onda de
excitación (\lambda_{exc}) en por lo menos tres experimentos
independientes. Se procesaron los datos numéricos con Microsoft
Excel® 97 ó 2000. Se calculó la media y el error estándar, para
todas las regiones o células examinadas en cada \lambda_{exc}. Los
máximos de los pigmentos correspondieron a su intervalo de
dispersión en las diferentes \lambda_{exc}.
Los pigmentos extraídos muestran variaciones en
los espectros de fluorescencia cuando se comparan con los pigmentos
in vivo, por eso se realizó un control con pigmentos puros
para compararlos con los estudios publicados.
Los pigmentos liposolubles, clorofilas (Chls)
a y b, obtenidas de Spinacia oleracea y la
xantofila (Xant) de Medicago sativa (Sigma, St. Louis, MO,
EE.UU.) se disolvieron en etanol puro. Los pigmentos hidrosolubles
como R-ficoeritrina (R-PE) de
Porphyra tenera y C-ficocianina
(C-PE) de Spirulina sp. se disolvieron en
agua destilada filtrada. La solución patrón de
aloficocianina-XL (APC-XL) de
Mastigocladus laminosus estaba disuelta en sulfato de amonio
(60%) y fosfato de potasio (el pH = 7)
(Sigma-Aldrich) con una concentración final de 38
mM. Cuatrocientos \mul de cada solución del pigmento a una
concentración final de 1 mg/ml se transfirieron a cámaras de 8
pocillos con fondo de vidrio (Nunc
Laboratorio-Tek™, Nalge Nunc International,
Roskilde, Dinamarca).
Los espectros de los pigmentos puros (Tabla 1)
se correlacionaron bien con los espectros publicados de pigmentos
extraídos. Los datos son la media \pm error estándar (n = 10
regiones) a partir de tres experimentos independientes llevados a
cabo en las mismas condiciones experimentales. El asterisco
significa presencia de un hombro. Los intervalos de emisión máxima
de la Chl a (672.4 \pm 2.9 nm) y la Chl b (662.4
\pm 2.1 nm) se solaparon parcialmente. El máximo de fluorescencia
de C-PE se localizó alrededor de 577.2 \pm 2.2 nm,
con un hombro alrededor de 660.1 \pm 3 nm. Este hombro podría
corresponder a otra ficobiliproteina contaminante presente en el
estándar. El pico de fluorescencia máxima de C-PC,
localizado a 656.1 \pm 4.3 nm, parecía ligeramente desplazado con
respecto a las referencias publicadas. Sin embargo, se reflejan
cambios en el máximo de fluorescencia de la C-PC en
la literatura, dependiendo del método de extracción utilizado. La
C-PC extraída de biomasa fresca mostró un gran
máximo a 615 nm mientras que en las muestras secas se observó un
máximo adicional a 652 nm.
Tanto la C-PC como la Xant
presentaron una débil fluorescencia como ya era conocido. Mientras
la débil fluorescencia de la Xant era de esperar porque la
principal ruta de desexcitación ocurre a través de la transición al
estado del triplete, que no es fluorescente, no se pudo explicar la
razón para esta baja fluorescencia en la C-PC pura.
El máximo de fluorescencia para la
aloficocianina-entrecruzada (APC-XL)
estaba a 676.2 \pm 2.4 nm. La estructura especial de
APC-XL, que impedía la disociación de la molécula en
soluciones diluidas, probablemente afectó al máximo de emisión y no
pudo relacionarse con el material de campo. Por otro lado, este
máximo coincidía con un tipo específico de APC previamente
descrita. Otras formas de baja energía comunes de APC tienen el
máximo de fluorescencia cerca de 680 nm, que es similar a la
emisión de los ficobilisomas intactos mientras que la APC de las
cianobacterias presentó un máximo de emisión a 660 nm.
Los biofilms están constituidos por poblaciones
o comunidades de microorganismos que se adhieren a superficies
ambientales. Estos microorganismos normalmente están inmersos en un
polisacárido extracellular que ellos mismos sintetizan. Se
seleccionaron dos biofilms aerofíticos en las observaciones de CSLM
para probar el método con comunidades naturales complejas. Los
biofilms, que fueron descritos y identificados, contenían
diferentes grupos filogenéticos (Cyanobacteria y Bacillariophyta).
El primer biofilm (BF1), obtenido de la catacumba de St. Callistus
(Roma, Italia), estaba formado principalmente por Scytonema
julianum y Leptolyngbya sp. El segundo biofilm (BF2),
obtenido de la catacumba Domitilla (Roma, Italia), estaba formado
por la Bacillariophyta Diadesmis gallica y una cianobacteria
no identificada del grupo de las Chroococcales. Ambos biofilms se
obtuvieron de superficies iluminadas artificialmente. Se separaron
los fragmentos de biofilms de sus substratos (yeso, mortero o
espeleotemas) o, raramente, se tomaron junto con pequeños pedazos
de su soporte. Los biofilms se mantuvieron en una capa de 2 mm de
10% de medio BG11 agarizado (1%, Merck), y se procesaron durante la
primera semana. Los biofilms y cultivos se montaron en cámaras con
fondo de vidrio Nunc Lab-Tek™. Las muestras se
procesaron a temperatura ambiente en la oscuridad.
Las imágenes de foco extendido ("extended
focus", es decir, la imagen se divide en tres marcos que
representan la proyección de intensidad máxima de fluorescencia
para los planos x-y, x-z e
y-z) de los dos biofilms estratificados mostraron
una distribución diferencial de los microorganismos en profundidad
en el biofilm (Fig. 1A y 2A). Se muestran los espectros de emisión
para 488, 514 y 543 nm de \lambda_{exc} para cada biofilm (Fig. 1
B-D y 2B-D).
La Fig. 1A muestra una proyección 3D pseudocolor
de foco extendido en planos x-y y ortogonal en la
dirección z del biofilm (49 secciones ópticas). La imagen
representa la autofluorescencia máxima emitida en el intervalo de
590-775 nm cuando se excitó a 543 nm. El volumen
bajo observación fue de 465.03 x 465.03 x 398.73 \mum^{3}. Paso
en z: 0.4 \mum. Factor de aumento: 1. Grosor: 19.54 \mum. Las
Figs. 1B-D muestran los perfiles espectrales in
vivo derivados de 488, 514 y 543 nm \lambda_{exc} y el error
estándar (n = 5 células). MFI significa intensidad media de
fluorescencia. Las diferencias obtenidas en los perfiles de
fluorescencia de emisión obtenidos en el biofilm indicaban la
presencia de diferentes especies de cianobacterias.
Leptolyngbya sp. se representa con una línea continua y
Scytonema julianum con una línea discontinua. Factor de
aumento: 2.
Según los datos obtenidos, en el biofilm BF1,
los filamentos delgados de Leptolyngya sp. se orientaron
horizontalmente encima del ancho Scytonema julianum (Fig.
1A). Ambas cianobacterias tenían un \lambda_{max} a 658.4 \pm 3
nm amplio, del solapamiento de la Chl a y las
ficobiliproteinas (Fig. 1B-D). Además,
Leptolyngybya sp., pero no S. julianum, presentó un
pico de emisión (579.7 \pm 3.8 nm) atribuible a la presencia de
C-PE (Fig. 2B-D).
La Fig. 2A muestra secciones ópticas a 66
x-y del biofilm estratificado, que consiste en dos
estratos, la capa superior compuesta por colonias de Diadesmis
gallica y la capa inferior formadas por colonias de
Chroococcales. El volumen bajo observación fue de 75.82 x 75.82 x
98.51 \mum^{3}. Paso en z: 0.1 \mum. Factor de aumento: 3.86.
Grosor: 6.6 µm. La imagen representa la autofluorescencia máxima
emitida en el intervalo de 590-775 nm cuando se
excitó a 543 nm. Las Figs. 2B-D muestran los
perfiles espectrales in vivo derivados de \lambda_{exc} de
488, 514 y 543 nm, y el error estándar (n = 5 células). La
diferencia de los perfiles de emisión obtenidos en el biofilm
indican la presencia de grupos diferentes de algas y cianobacterias.
Chroococcal se representa con una línea continua y Diadesmis
gallica con una línea discontinua. En este biofilm se observó
una gran disminución de fluorescencia en la \lambda_{exc} 543 nm,
atribuible al fotoblanqueo después de sucesivos barridos
espectrales. Factor de aumento: 2.
El análisis CSLM reveló dos capas en el biofilm
BF2: Diadesmis gallica (Bacillariophyta) estaba
principalmente concentrada en la parte superior del biofilm
mientras la Chroococcal no identificada formaba una capa
discontinua en la parte inferior (Fig. 2A). D. gallica de 3
\mum de diámetro, presentó menos fluorescencia que la
cianobacteria. Su \lambda_{max}, a 676.2 \pm 5 nm (Fig.
2B-D), no coincidía con la \lambda_{max} de los
otros grupos debido a la presencia de Chl c. Para evitar el
fotoblanqueo, causado cuando estas células fueron excitadas
consecutivamente con diferente \lambda_{exc}, se usaron
diferentes campos ópticos para obtener los espectros de emisión en
todas las \lambda_{exc}. La Chroococcal no identificada presentó
la misma forma espectral que Leptolyngbya sp.
La Tabla 2 muestra los resultados de la emisión
de fluorescencia adquirida de los biofilms después de la excitación
a cuatro longitudes de onda (\lambda_{exc}) (351, 488, 514 y 543
nm). Cada valor \lambda_{max} se obtuvo a partir de 5
células.
En los biofilms, las cianobacterias presentaron
la mayor MFI en el intervalo 640-740 nm a
cualquiera de las \lambda_{exc} cuando se comparan con las
Bacillariophyta (Fig. 1B-D y 2B-D).
Las cianobacterias también presentaron una alta MFI a
577-580 nm \lambda_{max}, debido a la
C-PE.
Cada pigmento fotosintético presente en las
especies absorbe la luz de una cierta longitud de onda, pero en
general, los pigmentos captan fotones de un amplio intervalo de
longitudes de onda cuando se excitan a las longitudes de onda de
351-633 nm. Sólo en el 364 nm (UV) y el 458 nm
(azul) \lambda_{exc} se observó una respuesta de emisión más
pequeña en todos los microorganismos. En el caso de las
cianobacterias, esto indica que la eficiencia mínima de los
fotorreceptores está en 430-460 nm.
Claims (11)
1. Método no invasivo para el análisis de una
muestra utilizando un microscopio láser confocal de barrido
acoplado a un detector espectrofotómetro que comprende los pasos
de:
(i) seleccionar una área particular de la
muestra;
(ii) obtener imágenes de barrido espectral de la
fluorescencia de emisión proveniente del área de muestra
seleccionada a unos ajustes del sistema seleccionados; y
(iii) procesar dichas imágenes de barrido
espectral según algoritmos definibles para obtener un espectro de
fluorescencia de emisión de dicha área;
donde la muestra emite fluorescencia bajo una
excitación láser, sin ningún marcaje previo.
2. Método según la reivindicación 1, donde las
imágenes de barrido espectral son imágenes
x-y-\lambda.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde el área seleccionada
corresponde sustancialmente a una única célula.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde el área seleccionada
comprende al menos un píxel de organismos fototróficos.
5. Método según la reivindicación 4, donde los
organismos fototróficos se seleccionan del grupo que consiste en
plantas, algas, cianobacterias y sus mezclas.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde los ajustes del sistema
se seleccionan para minimizar el fotoblanqueo.
7. Método según la reivindicación 6, donde el
tamaño de paso \lambda se fija entre 5 y 40 nm, y la anchura de
banda se fija desde 360 a 800 nm.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde el rendimiento y el
contraste se mantienen constantes.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde la longitud de onda de
excitación láser se fija en uno o más de los siguientes valores: 351
nm (láser UV Ar), 364 nm (láser UV Ar), 458 nm (láser Ar), 476 nm
(láser Ar), 488 nm (láser Ar), 514 nm (láser Ar), 543 nm (láser
HeNe) y 633 nm (láser HeNe).
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde los algoritmos del paso
(iii) proporcionan gráficos de dos dimensiones de la media de la
intensidad de fluorescencia versus las longitudes de onda de
fluorescencia de emisión.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde la muestra tiene un
grosor igual o menor que el grosor límite de detección del
microscopio láser confocal de barrido utilizado.
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