ES2236005T3 - Modulacion de acido abscisico. - Google Patents

Abstract

Un método para modular una respuesta al ácido abscísico (ABA) durante el desarrollo de la semilla, desarrollo del endospermo o maduración de la semilla en una planta, comprendiendo dicho método: introducir una construcción de ADN que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión en dicha planta por transformación, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida.

Description

Modulación de ácido abscísico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para la modificación genética de plantas, en particular para modular la respuesta de las plantas al ácido abscísico.

Antecedentes de la invención

El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona que tiene un papel regulador esencial en varios procesos fisiológicos. La fitohormona está implicada en el desarrollo embrionario, el letargo de la semilla, la transpiración y la adaptación al estrés medioambiental. El ABA regula muchos aspectos agronómicamente importantes del desarrollo de la planta incluyendo la síntesis de proteínas y lípidos de almacenamiento en la semilla así como la regulación del cierre de los estomas. El análisis de los promotores que responden a ABA reveló una diversidad de elementos reguladores de actuación cis potenciales.

Se conocen mutaciones en la biosíntesis de ABA en varias especies de plantas. Véase, por ejemplo, Leung y Giraudat (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:199-222, y las referencias allí citadas. En Arabidopsis, se han identificado varios loci de Arabidopsis insensibles a ácidos genéticamente diferenciados. Estos mutantes se seleccionaron basándose en la capacidad de las semillas para germinar en presencia de concentraciones inhibidoras de ABA. También se ha demostrado que las mutaciones afectan a varios aspectos adicionales del desarrollo de las semillas, incluyendo la acumulación de proteínas y lípidos de almacenamiento, degradación de la clorofila y la tolerancia a la desecación.

Hasta la fecha, se han caracterizado en plantas numerosos mutantes y genes. Se han clonado cinco loci mutacionalmente identificados que responden a ABA. Estos representan tres clases de proteínas. Las clases incluyen dos reguladores de la transcripción ortólogos del maíz (Viviparous 1-Vp1) y 3 insensible a ABA de Arabidopsis (ABI3), dos miembros muy homólogos de la familia de la proteína fosfatasa 2C, y una farnesil transferasa de Arabidopsis. Véase, por ejemplo, McCarty et al. (1991) Cell 66:895-905; Giraudat et al. (1992) Plant Cell 4:1251-1261; Leung et al. (1994) Science 264:1448-1452 ; Leung et al. (1997) Plant Cell 9:759-771; y Cuither et al. (1996) Science 273:1239-1241.

Durante la fase de maduración del desarrollo de la semilla, el embrión permanece quiescente en tejidos destinados a permanecer viables y la semilla seca adquiere tolerancia a la desecación. En maíz y otras gramíneas, esto incluye las células de la capa de aleurona del endospermo de la semilla. Los mutantes vivíparos del maíz tienen bloqueado el programa de maduración. De esta manera, el embrión mutante entra de forma precoz en el desarrollo de la plántula mientras está unido a la planta madre. Los nueve loci vivíparos caracterizados afectan a las primeras etapas de la biosíntesis de carotenoides y ácido abscísico. Los embriones vp1 muestran una sensibilidad reducida a ABA en cultivo. Se ha sugerido que el Vp1 inicial puede codificar un factor implicado en la percepción de ABA.

A nivel molecular, la maduración embrionaria se asocia con una amplia serie de activación de genes. Muchos de los genes expresados está regulados por la hormona ABA. Sin embargo, en general se desconocen los mecanismos moleculares de la acción de ABA.

El control del crecimiento mediado por ABA es una respuesta fundamental de las plantas a condiciones medioambientales adversas. Como se sabe poco sobre el mecanismo molecular del control del crecimiento mediado por ABA, se necesitan métodos para modular la respuesta de las plata a ABA, particularmente para incrementar el rendimiento.

Resumen de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para aumentar el rendimiento en plantas, particularmente en semillas de plantas. Los métodos implican la modulación de la percepción del ácido abscísico (ABA) y la transducción de señales en semillas en desarrollo. Los métodos son útiles para proteger a las plantas contra los efectos dañinos/perjudiciales del estrés y de las condiciones medioambientales adversas. Las composiciones comprenden construcciones genéticas de las que se sabe que afectan a la sensibilidad a ABA de una planta o una célula vegetal. Son de particular interés las secuencias asociadas a ABA. Estas secuencias incluyen mutantes, fragmentos y variantes de los mismos, así como secuencias de nucleótidos antisentido, para genes y mutantes implicados en la percepción y traducción de señales de ABA. Las secuencias de ADN pueden proporcionarse en construcciones para especificidad temporal, de desarrollo y de tejidos.

Las composiciones son útiles en métodos para aumentar el rendimiento en plantas en condiciones de estrés, particularmente estrés abiótico. De esta forma, se anulan los efectos perjudiciales del ABA sobre el crecimiento de la espiga y del grano.

Adicionalmente se proporcionan plantas transformadas, células vegetales, tejidos y semillas.

De acuerdo con la invención se proporciona un método para modular una respuesta al ácido abscísico (ABA) durante el desarrollo de la semilla, el desarrollo del endospermo o la maduración de la semilla en una planta, comprendiendo dicho método: introducir una construcción de ADN que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión dentro de dicha planta por transformación, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA.

La invención también proporciona:

- un método para prevenir los efectos perjudiciales del estrés sobre una semilla vegetal en desarrollo, una semilla vegetal en maduración o un endospermo en desarrollo, comprendiendo dicho método: introducir una construcción de ADN que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión en una planta por transformación, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida;

- una planta que tiene una construcción de ADN introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida;

- una célula vegetal que tiene una construcción de ADN introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida;

- un método para prevenir los efectos perjudiciales del estrés sobre una semilla vegetal en desarrollo, una semilla vegetal en maduración o un endospermo en desarrollo, comprendiendo dicho método:

introducir una construcción de ADN que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor tardío de grano/embrión en una planta, donde la planta tiene una pérdida de función por mutación de dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA, donde dicho promotor tardío de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida;

- una planta que tiene una construcción de ADN introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor tardío de grano/embrión, donde dicho promotor tardío de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida;

- una célula vegetal que tiene una construcción de ADN introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor tardío de grano/embrión, donde dicho promotor tardío de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida;

- la semilla transformada de una planta de la invención; y

- la progenie transformada de una planta de la invención.

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan métodos para modular la respuesta temprana de una planta al ácido abscísico (ABA), especialmente para aislar el rendimiento de cultivo anulando los efectos perjudiciales del ABA sobre el desarrollo de la semilla. En especial, la invención proporciona composiciones y métodos para evitar la señalización o la función de ABA. Las composiciones y métodos son útiles para evitar la función de ABA en un tejido y son una manera preferida en relación con el desarrollo para aislar el crecimiento de tejido reproductor femenino de las condiciones de estrés y medioambientalmente adversas.

Para los fines de la invención "respuesta temprana en plantas" se entiende el desarrollo de tejido reproductor, desarrollo de la semilla, desarrollo del endospermo, y maduración de la semilla. El ABA está implicado en muchos otros procesos fisiológicos y de desarrollo a lo largo del ciclo vital de las plantas, incluyendo el letargo de la semilla, la adaptación a estreses medioambientales abióticos, tales como el frío, sequía, salinidad, etc.; acumulación de reservas nutritivas, adquisición de tolerancia a la desecación, cierre de los estomas y similares. En las fases tempranas, la fitohormona ABA regula la maduración de la semilla y el mantenimiento del letargo del embrión. Después, en la etapa de inicio de la ontogénesis, ABA media varias respuestas adaptativas en relación con aspectos ambientales tales como la desecación, frío, estrés salino y otros estreses, y actúa como un regulador del crecimiento negativo. Generalmente, ABA impone un control del crecimiento bimodal regulando el potencial de la célula a crecer, posiblemente por control de la turgencia, e induciendo la parada del crecimiento mitótico en las plantas en concordancia con su función como regulador negativo del crecimiento.

La invención implica el control o modulación de la respuesta temprana de la planta a señal de ABA. Por "modulación" se entiende la regulación positiva o regulación negativa de la respuesta de la planta a ABA. Para los fines de la invención, generalmente la modulación es regulación negativa por la interrupción de la síntesis de ABA o la interrupción de la percepción y transducción de señales de ABA. Se reconoce que no es práctica la interrupción total de la función de ABA en las plantas, ya que ABA lleva a cabo muchas funciones útiles para el desarrollo de las plantas. Para los fines de la invención, generalmente es preferible impedir los efectos de ABA en el lugar final del efecto, es decir, las espigas y los granos en el caso de cultivo de cereales. De esta forma, la interrupción de la percepción de ABA o de la transducción de su señal proporciona una estrategia eficaz para aislar el crecimiento del tejido reproductor femenino del cereal de las condiciones de estrés.

Las condiciones de estrés medioambiental que siguen a la fertilización inhiben los acontecimientos tempranos en el establecimiento de la capacidad de perforación y puede disminuir el rendimiento. En los cereales, por ejemplo, el endospermo es la principal fuente de reservas almacenadas dentro de la semilla madura. La capacidad de almacenamiento se establece durante una etapa temprana del desarrollo de la semilla. Si se reconoce la implicación de ABA en respuestas tempranas de las plantas al estrés, la presente invención está dirigida a anular los efectos perjudiciales del ABA sobre el desarrollo de la semilla y a aumentar la naturaleza y cantidad de semillas y productos de semilla, especialmente cereales y granos. Véase Mambelli y Setter (1998) Physiologia Plantarum 104:266-72 y Tuberosa et al. (1998) Theor. Appli. Genet 744-55.

Como se ha indicado, la invención comprende introducir secuencias que modulan la percepción y transducción de señales de ABA dentro de una planta diana. Por "secuencias que modulan la percepción y transducción de señales de ABA" y "secuencias implicadas en la percepción y transducción de señales de ABA" se entienden mutantes y genes que interrumpen la síntesis de ABA o su percepción y transducción de señales. Estos mutantes, genes y secuencias que interrumpen la síntesis de ABA o su percepción o transducción de señales también se denominan aquí "secuencias asociadas a ABA". Dichas secuencias incluyen, pero no de forma limitante, mutantes insensibles o hipersensibles a ABA o secuencias antisentido correspondientes a los genes mutantes o de tipo silvestre. Los mutantes ABA son conocidos en la técnica e incluyen abi1-5, era1-3 (Cutler et al. (1996) Science 273:1239-41), gca1/8 (Benning et al. (1996) Proc. Workshop Abscisic Acid Signal Transduction in Arabidopsis, Madrid, p. 34), axr2 (Wilson et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 222:377-83), jar1 (Staswick et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6837-40), jin4 (Berger et al. (1996) Plant Physiol. 111:525-31), bri1 (Clouse et al. (1996) Plant Physiol. 111:671-78), sax(Arabidopsis thaliana); vp1 (McCarty et al. (1991) Cell 66:895-905 y Robichaud et al. (1986) J. Plant Physiol. 126:235-42), y rea1 (Sturaro et al. (1996) J. Exp. Bot. 47:755-62) (Zea mays); cool (Raskin et al. (1988) Planta 173:73-78) (Hordeum vulgare); aba1 (Bitoun et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220:234-39 y Leydecker et al. (1995) Plant Physiol. 107:1427-31) (Nicotiana plumbaginifolia); y similares. En la práctica de la invención pueden usarse estos y otros mutantes asociados a ABA.

Por "correspondiente" a un gen o secuencia se entiende que la secuencia es capaz de hibridar con el gen o la secuencia en la extensión necesaria para interrumpir la transcripción. Se reconoce que dependiendo de la secuencia asociada a ABA utilizada en la invención, puede preferirse la secuencia codificante o la secuencia antisentido. Sin embargo, la secuencia codificante también puede usarse para co-suprimir la expresión del gen diana. Por ejemplo, una estrategia incluye la expresión de genes mutantes, tales como abi1 o abi2, con un promotor temprano de grano/embrión para interrumpir de forma dominante la acción de ABA en tejidos durante etapas tempranas. Dicha estrategia no alterará la función posterior de ABA requerida en la maduración de la semilla. Como alternativa, los alelos de tipo silvestre de genes tales como Vp1 pueden regularse de forma negativa por co-supresión o estrategias antisentido para evitar la acción de ABA. En este último ejemplo, puede usarse un promotor temprano de grano/embrión para dirigir la expresión de una secuencia codificante para Vp1 (para co-suprimir) o dirigir la expresión de una secuencia antisentido para Vp1. Un tercer ejemplo incluye la transformación de una planta con un promotor del desarrollo del grano de periodo tardío que dirige a la secuencia de Vp1 de tipo silvestre. Después, esta planta transformada puede cruzarse con una planta mutante vp1. En este ejemplo, la incapacidad del mutante vp1 para ser inducido por ABA permite aislar los granos tempranos de los efectos perjudiciales. Al mismo tiempo, la construcción de ADN proporciona granos con capacidad de madurar normalmente. De esta manera, como se describe más adelante de forma más detallada, se dispone de varios genes diana candidatos para acoplarse con promotores con patrones de expresión limitados para proporcionar una mayor estabilidad de rendimiento frente a estrés abiótico.

El gen viviparous-1 (Vp1) del maíz se requiere para la expresión del programa de maduración en el desarrollo de la semilla. Vp1 es un nuevo factor de transcripción posiblemente implicado en la potenciación de una respuesta hormonal específica de la semilla. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de Vp1 se presentan en las SEC ID Nº: 1 y 2. Los mutantes vivíparos del maíz tienen bloqueado el programa de maduración. Como resultado, el embrión mutante se transforma precozmente en plántula mientras está unido a la planta madre. Se han identificado varios mutantes vivíparos. Otras características de un mutante vp1 que ha perdido su función incluyen, por ejemplo, un fenotipo insensible a ABA (es decir, una sensibilidad reducida a la inhibición de la germinación por ABA exógeno en cultivo) y/o un descenso en la activación del promotor Em. Está bien dentro de la experiencia en la técnica identificar mutaciones de Vp1 con pérdida de función que son útiles en los métodos de la presente invención. Por ejemplo, Hill et al. ((1996) Journal Biological Chemistry 7:3366) han identificado una función para la región ácida NH_{2}-terminal y el dominio BR1 altamente conservado de VP1 como esenciales para la función de VP1. Se conocen otros mutantes vp1. Véase, por ejemplo, Neill et al. (1986) Planta 169:87-96; McCarthy et al. (1991) Cell 66:895-905; Ribichaud et al. (1980) Dev. Genet. 1:325-330; Robichaud y Sussex (1987) Plant Physiol. 130:181-188; Robichaud et al. (1986) J. Plant. Physiol. 126:235-42 ; McCarthy et al. (1990) Physiol. Plant 81:267-72; y Eyster et al. (1931) Genetics 16:457-590; todos ellos incorporados aquí como referencia.

También se dispone de mutantes insensibles a ABA de Arabidopsis, ABI. Tales mutantes tienen defectos pleiotrópicos en el desarrollo de semillas, incluyendo menor sensibilidad a la inhibición por el ABA de la germinación en una expresión alterada de genes específicos de semillas. Véase Finkelstein et al. (1998) The Plant Cell 10:1043-1045; Leung et al. (1994) Science 264:1448-1452; Leung (1997) Plant Cell 9:759-711; Giraudat et al. (1992) Plant Cell 4:1251-1261; Myer et al. (1994) Science 264:1452-1455; Koornneef et al. (1989) Plant Physiol. 90:463-469; Nambara et al. (1992) Plant J. 2:435-441; Finkelstein y Somerville (1990) Plant Physiol. 94:1172-1179; Leung y Giraudat (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:199-222; Robinson y Hill (1999) Plant, Cell and Environment 22:117-123; y Rodríguez et al. (1998) FEBS Letters 421:185-190, y las referencias citadas en estos documentos, incorporándose todos ellos como referencia. Además, en las SEC ID Nº: 3-10 se indican las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de ABI1, ABI2, ABI3 y ABI4 de tipo silvestre. Otros mutantes asociados con ABA incluyen bri1 de Arabidopsis thaliana, cuya secuencia puede encontrarse en el Nº de acceso del Genbank AF017056 y Li et al. (1997) Cell 90:929-939, incorporándose ambos como referencia en este documento.

Un mutante abi de interés incluye, por ejemplo, abi1. abi1 es una mutación dominante en la parte estructural del gen ABI1. La mutación se ha caracterizado y comprende una transición de bases nucleotídicas de guanina a adenina y cambia la secuencia de ADN de GGC a GAC, haciendo de esta manera que el resto de glicina de tipo silvestre en la posición de aminoácidos 180 de la SEC ID Nº: 3 se reemplace por ácido aspártico (Meyer et al. (1994) Science 264:1452-1455). abi2 es otra mutación dominante de interés en los métodos de la invención. abi2 se caracteriza por una transición de GGC a GAC que conduce al reemplazo del resto de Gly en la posición de aminoácidos 168 de la SEC ID Nº: 6 por Asp (Rodríguez et al. (1998) FEBS Letters 421:18-190). Está bien dentro de la experiencia en la técnica identificar otras mutaciones (tanto dominantes como recesivas) en otras secuencias asociadas a ABA que sean útiles en los métodos de la presente invención.

Tales mutantes indicados anteriormente se denominan "mutantes asociados a ABA". Por "mutantes asociados a ABA" se entienden genes y secuencias que rompen la señalización y/o percepción de ABA en una planta. Utilizando las secuencias anteriores, pueden aislarse secuencias relacionas de otras plantas, incluyendo cereales. En algunos casos, puede ser beneficioso usar la secuencia asociada a ABA que corresponde a una secuencia de la planta diana de interés. Por ejemplo, para uso en maíz, puede preferirse el homólogo de maíz de la secuencia asociada con ABA, o una secuencia correspondiente al homólogo de maíz.

La invención utiliza las secuencias asociadas con ABA para controlar la respuesta de la planta a ABA. Generalmente, será beneficioso bloquear la señalización o percepción de ABA para prevenir una pérdida de rendimiento. Utilizando las secuencias asociadas con ABA, secuencias codificantes y secuencias antisentido, puede controlarse la expresión y percepción de ABA en una planta. Como se describe con más detalle mas adelante, tales secuencias pueden introducirse en las plantas de interés por métodos recombinantes.

Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden usarse para aislar secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras plantas y más particularmente cereales. De esta manera, pueden usarse métodos tales como PCR, hibridación y similares para identificar tales secuencias basándose en su homología de secuencia con las secuencias asociadas con ABA conocidas en la técnica. Pueden aislarse secuencias basándose en su identidad de secuencia con la secuencia asociada a ABA entera o fragmentos de la misma.

En una estrategia de PCR, pueden diseñarse cebadores oligonucleotídicos para uso en reacciones de PCR para amplificar secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. En la técnica se conocen generalmente métodos para diseñar cebadores de PCR y de clonación por PCR y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Véase también Innis et al., eds (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero sin limitación, métodos que usan cebadores por parejas, cebadores anidados, cebadores monoespecíficos, cebadores degenerados, cebadores con especificidad génica, cebadores con especificidad de vector, cebadores parcialmente desacoplados y similares.

En las técnicas de hibridación, todo parte de una secuencia de nucleótidos conocida se usa como sonda que hibrida selectivamente con otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico o fragmentos de ANDc clonados (es decir bibliotecas genómicas o de ADNc) procedentes de una planta elegida. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden marcarse con un grupo detectable tal como ^{32}P o cualquier otro marcador detectable. De esta manera, por ejemplo, pueden obtenerse sondas para hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basándose en las secuencias asociadas con ABA de la invención. En la técnica se conocen generalmente métodos para la preparación de sondas para hibridación y para la construcción de ADNc y bibliotecas genómicas y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Por ejemplo, puede usarse una secuencia asociada con ABA entera, o una o mas porciones de la misma, como sonda capaz de hibridar específicamente con secuencias y ARN mensajeros correspondientes. Para conseguir una hibridación específica en una diversidad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de interés y que, preferiblemente, tienen una longitud de al menos aproximadamente 10 nucleótidos, aún mas preferiblemente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos. Tales sondas pueden usarse para amplificar secuencias correspondientes a partir de una planta elegida por PCR. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales a partir de una planta deseada o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en una planta. Las técnicas de hibridación incluyen selección de hibridación de bibliotecas de ADN cultivadas (placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

La hibridación de tales secuencias puede realizarse en condiciones rigurosas. Por "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" se entienden condiciones en las cuales una sonda hibridará con su secuencia diana en un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces mayor con respecto al nivel de fondo). Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la rigurosidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, pueden identificarse secuencias diana que son complementarias al 100% con la sonda (sondeo homólogo). Como alternativa, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir algún desacoplamiento en las secuencias de forma que se detecten grados menores de similitud (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda tiene una longitud menor de aproximadamente 1000 nucleótidos, preferiblemente menor de 500 nucleótidos.

Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal sea menor que una concentración de ion Na de aproximadamente 1,5 M, típicamente una concentración de ion de Na de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura es de al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). La duración de la hibridación generalmente es menor de aproximadamente 24 horas, normalmente de aproximadamente 4 a 12. También pueden conseguirse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Las condiciones de baja rigurosidad ilustrativas incluyen hibridación con una solución tampón de formamida al 30-35%, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato sódico) al 1% a 37ºC y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SCC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a una temperatura de 50 a 55ºC. Las condiciones de rigurosidad moderada ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 40-45%, NaCl 1,0 M, SDS al 1% a 37ºC y un lavado en 0,5X a 1X SSC a 55-60ºC. Las condiciones de alta rigurosidad ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC y un lavado en 0,1X SSC a una temperatura de 60 a 65ºC.

La especificidad es típicamente la función de los lavados después de la hibridación, siendo los factores críticos la resistencia iónica y la temperatura de la solución final de lavado. Para híbridos de ADN-ADN, la T_{m} puede aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: T_{m} = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La T_{m} es la temperatura (con una resistencia iónica definida y un pH) a la que un 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda ajustada perfectamente. La T_{m} se reduce en aproximadamente 1ºC para cada 1% de desacoplamiento; de esta manera, la T_{m}, y la hibridación y/o las condiciones de lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad = 90%, la T_{m} puede reducirse 10ºC. Generalmente, se seleccionan condiciones rigurosas de manera que sean aproximadamente 5ºC menores que el punto de fusión térmica (T_{m}) para la secuencia específica y su complementaria a una intensidad iónica y un valor de pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4ºC menos que el punto de fusión térmica (T_{m}); las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10ºC menos que el punto de fusión térmica (T_{m}); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20ºC menos que el punto de fusión térmica (T_{m}). Usando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y la T_{m} deseada, los especialistas habituales entenderán que se describen intrínsecamente las variaciones en la rigurosidad de la hibridación y/o soluciones de lavado. Si el grado deseado de desacoplamiento produce una T_{m} de menos de 45ºC (solución acuosa) o 32ºC (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC de forma que pueda usarse una temperatura superior. En Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I Capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al., eds (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) puede encontrarse una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos. Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

De esta manera, la presente invención incluye las "secuencias asociadas a ABA correspondientes" aisladas que modulan la respuesta de las plantas a ABA y que hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias asociadas con ABA descritas en este documento, o con fragmentos de las mismas. Tales secuencias tendrán una homología de al menos aproximadamente un 40% a un 50%, una homología de aproximadamente un 60%, 65% o 70%, e incluso una homología de al menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor con las secuencias descritas. Es decir, la identidad de secuencia de las secuencias puede variar, compartiendo una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 40% a un 50%, de aproximadamente un 60%, 65% o 70%, e incluso al menos de aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más.

Las secuencias asociadas con ABA de la invención pueden utilizarse con promotores específicos de tejidos o del desarrollo para alterar la función de ABA en un tejido o de una manera específica para el desarrollo. Los promotores de interés particular incluyen promotores preferidos para semillas, particularmente promotores tempranos de grano/embrión y promotores tardíos de grano/embrión.

El desarrollo del grano después de la polinización se divide en aproximadamente 3 fases primarias. La fase de retraso del crecimiento del grano se produce de aproximadamente 0 a 10-12 días después de la polinización. Durante esta fase, el grano no crece significativamente en masa, sino que más bien se están realizando acontecimientos bastante importantes que determinarán la vitalidad del grano (es decir, el número de células). La fase lineal de relleno del grano se produce de aproximadamente 10-12 a aproximadamente 40 DAP (días después de la polinización). Durante esta fase de desarrollo del grano, el grano alcanza casi toda su masa final y se producen diversos productos de almacenamiento (es decir, almidón, proteína, aceite). Finalmente, se produce la fase de maduración desde aproximadamente 40 DAP hasta la recolección. Durante esta fase del desarrollo del grano, el grano se vuelve quiescente y comienza a secarse en la preparación durante un largo periodo de letargo antes de la germinación. Como se define en este documento, los "promotores tempranos de grano/embrión" son promotores que están durante la primera fase del desarrollo (es decir, de aproximadamente 0 a aproximadamente 12 DAP). Los "promotores tardíos de grano/embrión", como se define en este documento, están presentes de aproximadamente 12 DAP hasta la maduración. La elección del promotor dependerá de la secuencia asociada con ABA utilizada.

Los promotores tempranos de grano/embrión incluyen, por ejemplo, cim1, un promotor específico de grano entero y de polen que es activo 5 DAP. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/11177, que se incorpora en este documento como referencia. Otros promotores tempranos de grano/embrión incluyen los promotores preferidos de semilla end1, que es activo 7-10 DAP, y end2, que es activo 9-14 DAP en la semilla entera y activo 10 DAP en el endospermo y el pericarpio. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/12733, incorporado en este documento como referencia. Otros promotores tempranos de grano/embrión que encuentran uso en los métodos de la presente invención incluyen el promotor preferido de semilla lpt2 (SEC ID Nº: 13) que es activo de 6 a 24 DAP (Patente de Estados Unidos Nº 5.525.716, incorporada en este documento como referencia).

Tales promotores tempranos de grano/embrión pueden usarse con genes o mutantes en la ruta de percepción/trans-
ducción de señales para ABA. De esta manera, ciertos genes mutantes tales como abi1 o abi2 unidos operativamente a un promotor temprano de grano/embrión alterarían de manera dominante la acción de ABA en tejidos antes de la última función de ABA requerida en la maduración de las semillas. Como alternativa, un promotor temprano de grano/embrión puede unirse operativamente a una secuencia de nucleótidos de tipo silvestre (cosupresión) o antisentido de una secuencia asociada con ABA. El promotor temprano de grano/embrión se utilizaría para alterar la acción de ABA en tejidos antes de la maduración de la semilla.

Los promotores tardíos de grano/embrión incluyen, por ejemplo, promotores de genes de oleosina. Véase, por ejemplo, Plant et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25:193-205; Keddie et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:327-40; Keddie et al. (1992) Plant Mol. Biol. 19:443-53; y Hong et al. (1997) 34:549-55; incorporados en este documento como referencia. Véanse también los Nº de acceso del Genbank U71381 (SEC ID Nº: 11), AF134411 (SEC ID Nº:12), y la Patente de Estados Unidos Nº 5.977.436, que contienen secuencias promotoras de oleosina de Glycine max, Brassica juncea y Arabidopsis thaliana, respectivamente. Todas estas referencias se incorporan en este documento como referencia. Otros promotores tardíos de grano/embrión incluyen smilps, un promotor específico de embrión que es activo 13-14 DAP y cz19B1, un promotor específico de grano entero que es activo 13-40 DAP. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/11177, que se incorpora en este documento como referencia. El promotor preferido de semilla a13 es activo 24-40 días después de la floración y también puede usarse en los métodos de la invención. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/40710, que se incorpora en este documento como referencia.

Pueden usarse promotores tardíos de grano, tales como los de los genes de oleosina, para dirigir la expresión de un alelo Vp1 de tipo silvestre. Tales plantas después pueden cruzarse con una planta que tiene un mutante vp1. En este ejemplo, la incapacidad del alelo mutante vp1 de complementarse por ABA aislaría los granos tempranos de efectos perjudiciales. El producto del gen Vp1 aparece en una fase muy temprana en el desarrollo del grano. En presencia de ABA, VP1 se vuelve eficaz. El gen modificado por ingeniería genética suministrado por el parental transgénico proporcionaría a los granos la capacidad de madurar normalmente. Como se usa en este documento, una "secuencia asociada a ABA endógeno" se define como cualquier secuencia asociada a ABA no introducida en la planta por un suceso de transformación.

Tales genes asociados a ABA pueden utilizarse para controlar los efectos del estrés sobre la planta. Por lo tanto, la acumulación de reservas nutritivas en la adquisición de la tolerancia a la desecación está asociada con la expresión de series específicas de ARNm. El ABA exógeno puede inducir precozmente transcritos que codifican proteínas de almacenamiento o proteínas abundantes en la última fase de la embriogénesis (LEA) que se considera que participan en la tolerancia a la desecación en embriones cultivados. De esta forma, la expresión tardía de genes ABA puede acoplarse con proteínas del almacenamiento de semillas transgénicas para aumentar las reservas nutritivas en las semillas.

Por "introducción" de secuencias que modulan la percepción de ABA y la transducción de señales en una planta diana se entiende un método de transformación genética. Por "transformación estable" se entiende que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y puede heredarse por su progenie.

Los alelos de tipo silvestre de genes tales como Vp1 pueden regularse negativamente con promotores tempranos por cosupresión o estrategias antisentido. Se reconoce que con estas secuencias de nucleótidos, pueden construirse construcciones antisentido complementarias a al menos una porción del ARN mensajero (ARNm) para las secuencias asociadas con ABA. Se construyen nucleótidos antisentido para hibridar con el ARNm correspondiente. Pueden realizarse modificaciones de las secuencias antisentido siempre que las secuencias hibriden e interfieran con la expresión del ARNm correspondiente. De esta manera, pueden usarse construcciones antisentido que tengan un 70%, preferiblemente un 80% y mas preferiblemente un 85% de similitud de secuencia con las secuencias antisentido correspondientes. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para interrumpir la expresión del gen diana. En general, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos o más.

En la técnica se conocen métodos para suprimir la expresión génica en plantas usando secuencias de nucleótidos en la orientación con sentido. Los métodos generalmente implican transformar plantas con una construcción de ADN que comprende un promotor que dirige la expresión en una planta unido operativamente a al menos una porción de una secuencia de nucleótidos que corresponde al transcrito del gen endógeno (es decir, una secuencia asociada a ABA). Típicamente, tal secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia substancial con la secuencia del transcrito del gen endógeno, preferiblemente una identidad de secuencia mayor de aproximadamente un 65%, más preferiblemente una identidad de secuencia mayor de aproximadamente un 85%, y aún más preferiblemente una identidad de secuencia mayor de aproximadamente un 95%. Véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.283.184 y 5.034.323; incorporadas en este documento como referencia.

Se reconoce que en la invención pueden usarse fragmentos y/o variantes de los genes asociados con ABA. De esta manera, la presente invención incluye fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos asociadas con ABA y proteínas codificadas por las mismas. Por "fragmento" se entiende una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de aminoácidos y, por lo tanto, la proteína codificada por la misma. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína activa y, por lo tanto, actúan para modular las respuestas a ABA. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación generalmente no codifican proteínas o fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica. De esta manera, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar desde al menos aproximadamente 20 nucleótidos, desde aproximadamente 50 nucleótidos, desde aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa de la invención.

Por "variantes" se entienden secuencias substancialmente similares. En el caso de secuencias de nucleótidos naturales, pueden identificarse variantes tales como estas con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como, por ejemplo, con técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación como se indica mas adelante. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos obtenidas sintéticamente, tales como las generadas, por ejemplo, por el uso de mutagénesis de localización dirigida. Generalmente, las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de la invención tendrán una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 40%, 50%, 60%, 65% o 70%, generalmente de al menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, preferiblemente de al menos aproximadamente un 90%, 92%, 94%, 95%, 96% o 97%, y mas preferiblemente de al menos aproximadamente un 98%, un 99% o más de identidad de secuencia con esa secuencia de nucleótidos particular como se determina por programas de alineación de secuencias descritos en otras partes de este documento usando parámetros por defecto.

En la técnica son bien conocidos métodos para alinear secuencias con fines comparativos. De esta manera, la determinación del porcentaje de identidad entre 2 secuencias cualesquiera puede realizarse usando un algoritmo matemático. Son ejemplos no limitantes de tales algoritmos matemáticos el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de homología local de Smith et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Para determinar la identidad de secuencia pueden utilizarse aplicaciones informáticas de estos algoritmos matemáticos para comparar secuencias. Tales aplicaciones incluyen, pero sin limitación: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, versión 8 (disponible en Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Pueden realizarse alineaciones usando estos programas utilizando los parámetros por defecto. El programa CLUSTAL se describe bien por Higgins et al., (1988) Gene 73:237-244 (1988), Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Con el programa ALIGN puede usarse una tabla de peso de restos PAM120, una penalización de longitud de huecos de 12, y una penalización de huecos de 4, cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa BLASTN, puntuación =100, longitud de palabra =12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Pueden realizarse búsquedas de proteína BLAST con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, puede usarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda repetida que detecte relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST y PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTX para proteínas). Véase http://www.ncbi.hlm.nih.gov. La alineación también puede realizarse manualmente por inspección.

A menos que se indique otra cosa, los valores de identidad/similitud de secuencias proporcionados en este documento se refieren al valor obtenido usando la versión 10 de GAP usando los siguientes parámetros: % de identidad usando un peso de hueco de 50 y un peso de longitud de 3; % de similitud usando un peso de hueco de 12 y un peso de longitud de 4, o cualquier programa equivalente. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, genera una alineación que tiene emparejamientos de restos de nucleótidos o aminoácidos idénticos y una alta identidad de secuencias en porcentaje en comparación con la alineación correspondiente generada por el programa preferido.

GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsh (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de acoplamientos y minimiza el número de huecos. GAP considera todas las alineaciones posibles y posiciones de huecos y crea la alineación con el mayor número de bases emparejadas y los menores huecos. Esto permite proporcionar una penalización de creación de huecos y una penalización de extensión de huecos en unidades de bases emparejadas. GAP debe proporcionar un valor del número de emparejamientos con penalización por huecos para cada hueco que inserta. Si se elige una penalización de extensión de huecos mayor de cero, GAP además debe proporcionar un valor, para cada hueco insertado, de la longitud del hueco por la penalización de la extensión de huecos. Los valores de penalización de creación de huecos por defecto y los valores de penalización de extensión de huecos en la versión 10 del paquete de software de Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos, la penalización de creación de huecos por defecto es 50, mientras que la penalización de extensión de huecos por defecto es 3. Las penalizaciones de creación de huecos y de extensión de huecos pueden expresarse como un número entero seleccionado entre el grupo de enteros compuesto por 0 a 200. De esta manera, por ejemplo, las penalizaciones de creación de huecos y de extensión de huecos pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o
mayor.

GAP representa un miembro de la familia de las mejores alineaciones. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP presenta cuatro cálculos de valor para las alineaciones: calidad, relación, identidad y similitud. La calidad es la medida maximizada para alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida por el número de bases en el segmento mas corto. El porcentaje de identidad es el porcentaje de los símbolos que coinciden realmente. El porcentaje de similitud es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que se cruzan entre huecos se ignoran. Se puntúa una similitud cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de similitud. La matriz de puntuación usada en la versión 10 del paquete de software de Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (Véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

Por proteína "variante" se entiende una proteína derivada de la proteína nativa por deleción (denominada truncación) o adición de uno o más aminoácidos al extremo N y/o C terminal de la proteína nativa; deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; o substitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Tales variantes pueden deberse, por ejemplo, a polimorfismo genético o manipulación humana.

Las proteínas de la invención pueden alterarse de diversas formas incluyendo substituciones, deleciones, truncaciones e inserciones de aminoácidos. En la técnica se conocen generalmente métodos para tales manipulaciones. En la técnica son bien conocidos métodos de mutagénesis y alteraciones de las secuencias de nucleótidos. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Patente de Estados Unidos Nº 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas en estos documentos. En el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado en este documento como referencia pueden encontrarse pautas para substituciones de aminoácidos apropiadas que no afecten a la actividad biológica de la proteína de interés. Pueden preferirse substituciones conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido por otro que tenga propiedades similares.

De esta manera, los genes y las secuencias de nucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias naturales como formas mutantes. De manera similar, las proteínas de la invención incluyen tanto proteínas naturales como variaciones y formas modificadas de las mismas. Tales variantes continuarán con la actividad deseada. Evidentemente, las mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica la variante no deben sacar a la secuencia de la fase de lectura y preferiblemente no crearán regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Véase la publicación de la solicitud de Patente EP Nº 75.444.

No es de esperar que las deleciones, inserciones y substituciones de las secuencias de proteínas incluidas en esta invención produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la substitución, deleción o inserción antes de hacerla, un especialista en la técnica apreciará que el efecto se evaluará por ensayos de selección rutinarios.

Las secuencias de nucleótidos y las proteínas variantes también incluyen secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como barajado de ADN. Con tal procedimiento, pueden manipularse una o más secuencias codificantes asociadas a ABA diferentes para crear una nueva proteína asociada a ABA que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia substancial y pueden recombinarse de forma homóloga in vitro o in vivo. En la técnica se conocen estrategias para tal barajado de ADN. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las Patentes de Estados Unidos Nº 5.605.793 y 5.837.458.

Las secuencias asociadas con ABA de la invención se proporcionan en cassettes de expresión para la expresión en las plantas de interés. El cassette incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' unidas operativamente a una secuencia asociada con ABA de la invención. Por "unida operativamente" se entiende una unión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, donde la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. En general, unida operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se unen son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en la misma fase de lectura. El cassette también puede contener al menos un gen adicional para cotransformar a un organismo. Como alternativa, el gen o genes adicionales pueden proporcionarse en múltiples cassettes de expresión.

Tal cassette de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de interés bajo la regulación de la transcripción de las regiones reguladoras. El cassette de expresión también puede contener genes marcadores selectivos.

El cassette de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de inicio de la transcripción y la traducción, una secuencia de ADN de la invención y una región de terminación de la transcripción y la traducción funcional en plantas. La región de inicio de la transcripción, el promotor, puede ser nativo o análogo o extraño o heterólogo para el hospedador vegetal. Además, el promotor puede ser la secuencia natural o, como alternativa, una secuencia sintética. Por "extraño" se entiende que la región de inicio de la transcripción no se encuentra en la planta nativa en la que se introduce dicha región de inicio de la transcripción. Como se usa en este documento, un gen quimérico comprende una secuencia codificante unida operativamente a una región de inicio de la transcripción que es heteróloga a la secuencia codificante. Aunque puede ser preferible expresar las secuencias usando promotores heterólogos, pueden usarse las secuencias del promotor nativo. De esta manera, se altera el fenotipo de la planta o la célula vegetal.

La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN unida operativamente de interés, o puede proceder de cualquier otra fuente. En el plásmido Ti de A. tumefaciens, están disponibles regiones de terminación convenientes, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, el gen o los genes pueden optimizarse para aumentar la expresión en la planta transformada. Es decir, los genes pueden sintetizarse usando codones preferidos en plantas para mejorar la expresión. En la técnica se dispone de métodos para sintetizar genes preferidos en plantas. Véanse, por ejemplo, las Patente de Estados Unidos Nº 5.380.831 y 5.436.391, incorporadas en este documento como referencia.

Se conocen otras modificaciones de secuencia para mejorar la expresión génica en un hospedador celular. Éstas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales de sitios de ayuste exón-intrón, repeticiones de tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión de genes. El contenido de G-C de la secuencia puede ajustarse a niveles medios para un hospedador celular dado, como se calcula haciendo referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedadora. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias de horquilla previstas.

Los cassettes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias líder 5' en la construcción del cassette de expresión. Tales secuencias líder pueden actuar para mejorar la traducción. En la técnica se conocen líderes de traducción e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, líder de EMCV (región no codificante 5' de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) PNAS USA 86:6126-6130); líderes de potivirus, por ejemplo, el líder de TEV (virus del jaspeado del tabaco) (Allison et al. (1986); líder de MDMV (virus del mosaico enanizante del tabaco); Virology 154:9-20), y proteína de unión a la cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP), (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder no traducido del ARNm de la proteína de cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (ARN 4 de AMV) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pág. 237-256); y líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Véase también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. También pueden utilizarse otros métodos que se sabe que aumentan la traducción, por ejemplo, intrones y similares.

En la preparación del cassette de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, cuando sea apropiado, en la fase de lectura apropiada. Para este fin, pueden emplearse adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN o pueden utilizarse otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de sitios de restricción o similares. Para este fin, pueden utilizarse mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, templado, y resubstituciones, por ejemplo transiciones y transversiones.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledóneas o dicotiledóneas, a las que está destinada la transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en células vegetales y la posterior inserción en el genoma de una planta incluyen microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-344), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.563.055; Patente de Estados Unidos Nº 5.981.840), transferencia directa de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, Sandford et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.945.050; Tomes et al. (1995) "Direct ADN Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y MacCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Véase también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:763-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes, Patente de Estados Unidos Nº 5.240.855; Buising et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.322.783 y 5.324.646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlín) (maíz); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.736.369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pág. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por filamentos); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz a través de Agrobacterium tumefaciens); incorporándose todos ellos en este documento como referencia.

Las células que se han transformado pueden desarrollarse hasta plantas de acuerdo con formas convencionales. Véase, por ejemplo, Mc Cormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas después pueden dejarse crecer, polinizarse con la misma cepa trasformada o con cepas diferentes, e identificarse el híbrido resultante que tenga la expresión constitutiva de las características fenotípicas deseadas identificadas. Pueden dejarse crecer dos o más generaciones para asegurar que se mantiene de forma estable y se hereda la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada y después pueden recogerse las semillas para asegurar que se ha conseguido la expresión constitutiva de las características fenotípicas deseadas.

La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie vegetal incluyendo, pero sin limitación, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero sin limitación, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente las especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo común (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria italica), mijo dedo (Eleusina coracana), girasol (Helianthus annuus), cartamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camelia sinensis), banana (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higos (Picus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mnagifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.

Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechugas (Lactuca sativa), habas verdes (Phaseolus vulgaris), fríjoles (Paseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.) y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) y melón (C. melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hidrangea (Macrophylla hydrangea), hibiscus (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), poinsettia (Euphorbia pulcherrima) y crisantemos. Las coníferas que pueden emplearse en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como el pino taeda (Pinus taeda), pino ayucahuite (Pinus elliotti), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino contorta (Pinus contorta), y pino Monterey (pino radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziessi); tsuga del Canadá (Tsuga canadensis); picea blanca (Picea glauca); secoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto de navidad (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y cedro amarrillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cartamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), más preferiblemente maíz y plantas de soja, y aún más preferiblemente plantas de maíz.

Las plantas de interés particular incluyen plantas de grano que proporcionan semillas de interés, plantas de semillas para la producción de aceite y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de cereales tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas con semillas para la obtención de aceite incluyen algodón, soja, cartamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen judías y guisantes. Las judías incluyen guar, algarrobilla, fenogreco, soja, fríjol, fríjol carita, fríjol mungo, haba de lima, haba fava, lentejas, garbanzos, etc.

Los siguientes ejemplos se ofrecen de forma ilustrativa y no limitante.

Parte experimental Transformación y Regeneración de Plantas Transgénicas Ejemplo 1 Transformación y Regeneración de Plantas Transgénicas de Maíz

Embriones inmaduros de maíz de plantas donantes de invernadero se bombardean con un plásmido que contiene la secuencia ABI3 unida de forma operativa a un promotor temprano del grano/embrión más un plásmido que contiene el gen marcador selectivo PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37) que confiere resistencia al herbicida Bialaphos.

La transformación se realiza como sigue. Todas las fórmulas de los medios se proporcionan a continuación.

Preparación del Tejido Diana

Se esteriliza la superficie de las espigas con lejía Chlorox al 30% más detergente Micro al 0,5% durante 20 minutos, y se lavan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se cortan y se sitúan con el eje del embrión hacia abajo (el escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, en medio 560Y durante 4 horas y después se alinean en los 2,5 cm de la zona diana preparados para el bombardeo.

Preparación del ADN

Se obtiene un vector plasmídico que comprende la secuencia ABI3 unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión. Este ADN plasmídico más el ADN plasmídico que contiene un marcador selectivo PAT se precipitan en gránulos de tungsteno de 1,1 \mum (diámetro medio) usando un procedimiento de precipitación con CaCl_{2} como sigue:

100 \mul de partículas de tungsteno preparadas en agua

10 \mul (1\mug) de ADN en tampón Tris-EDTA (1 \mug total)

100 \mul de CaCl_{2} 2,5 M

10 \mul de espermidina 0,1 M.

Cada reactivo se añade de forma secuencial a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene en el agitador vorticial multitubo. La mezcla final se sonica brevemente y se deja incubar durante 10 minutos en agitación vorticial constante. Tras el periodo de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se retira el líquido, se lavan con 500 ml de etanol al 100% y se centrifugan durante 30 segundos. Se retira el líquido otra vez y se añaden 105 \mul de etanol al 100% al sedimento final de partículas de tungsteno. Para el bombardeo con pistola de partículas, las partículas de tungsteno/ADN se sonican brevemente y se disponen 10 \mul en el centro de cada macrosoporte y se deja que se sequen durante aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.

Tratamiento con la Pistola de Partículas

Las placas de muestra se bombardean al nivel nº 4 en una pistola de partículas nº HE34-1 y nº HE34-2. Todas las muestras reciben un único disparo a 650 PSI, cogiendo un total de diez alícuotas de cada tubo partículas preparadas/ADN.

Tratamiento Posterior

Tras el bombardero, los embriones se mantienen en medio 560Y durante 2 días, después se transfieren a medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialaphos, y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los callos clónicos resistentes a la selección se transfieren a medio 288J para iniciar la regeneración de las plantas. Tras la maduración somática del embrión (2-4 semanas), se transfieren los embriones somáticos bien desarrollados a medio para la germinación y se transfieren a la cámara de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 días después, las plántulas en desarrollo se transfieren a medio 272V sin hormona en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas están bien establecidas. Después, las plantas se transfieren a insertos en bandejas (equivalentes a macetas de 2,5 pulgadas (6,35 cm) que contienen substrato de siembra, y se dejan crecer durante 1 semana en una cámara de cultivo, posteriormente se dejan crecer durante 1-2 semanas más en el invernadero, y después se transfieren a macetas clásicas 600 (6,06 litros) y se cultivan hasta la madurez. Las plantas se controlan y se evalúan.

Medios de Bombardeo y de Cultivo

El medio de bombardeo (560Y) contiene 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 120,0 g/l de sacarosa, 1,0 mg/l de 2,4-D y 2,88 g/l de L-prolina (enrasado con H_{2}O desionizada después del ajuste a pH 5,8 con KOH); 2,0 g/l de Gelrite (añadido tras enrasar con H_{2}O desionizada); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (añadido tras esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) contiene 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30,0 g/l de sacarosa, y 2,0 mg/l de 2,4-D (enrasado con H_{2}O desionizada después del ajuste a pH 5,8 con KOH); 3,0 g/l de Gelrite (añadido tras enrasar con H_{2}O desionizada); y 0,85 mg/l de nitrato de plata y 3,0 mg/l de bialaphos (ambos añadidos tras esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente).

El medio de regeneración de las plantas (288J) contiene 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 0,5 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl y 0,40 g/l de glicina enrasado con H_{2}0 desionizada depurada) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l de mioinositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarosa y 1,0 ml/l de ácido abscísico 0,1 mM (enrasado con H_{2}O desionizada depurada después de ajustar a pH 5,6); 3,0 g/l de Gelrite (añadido tras enrasar con H_{2}O desionizada); y 1,0 mg/l de ácido indolacético y 3,0 mg/l de bialaphos (añadido tras esterilizar el medio y enfriar a 60ºC). El medio sin hormonas (272V) contiene 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0,100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl, y 0,40 g/l de glicina enrasado con H_{2}0 desionizada depurada), 0,1 g/l de mioinositol y 40,0 g/l de sacarosa (enrasado con H_{2}O desionizada depurada después de ajustar a pH 5,6) y 6 g/l de bacto-agar (añadido tras completar el volumen con H_{2}O desionizada depurada), esterilizado y enfriado a 60ºC.

Ejemplo 2 Transformación mediada por Agrobacterium

Para la transformación del maíz mediada por Agrobacterium con una secuencia ABI3 unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión, se emplea preferiblemente el método de Zhao (Patente de Estados Unidos Nº 5.981.840 y publicación de patente PCT WO98/32326; cuyo contenido se incorpora aquí como referencia). En resumen, se aíslan embriones inmaduros de maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium, siendo capaz la bacteria de transferir la secuencia ABI3 unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa, los embriones inmaduros preferiblemente se sumergen en una suspensión de Agrobacterium para el inicio de la inoculación. Los embriones se cocultivan durante un periodo de tiempo con Agrobacterium (etapa 2: la etapa de co-cultivo). Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido tras la etapa de la infección. Después de este periodo de co-cultivo, se contempla una etapa opcional de "reposo". En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en presencia de al menos un antibiótico que se sabe que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para plantas transformadas (etapa 3: etapa de reposo). Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido con antibióticos, pero sin un agente selectivo, para eliminar Agrobacterium y para proporcionar una fase de reposo para las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados se cultivan en medio que contiene un agente selectivo y se recuperan los callos transformados en crecimiento (etapa 4: la etapa de selección). Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido con un agente selectivo, lo que tiene como resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. Entonces, el callo regenera las plantas (etapa 5: la etapa de regeneración) y, preferiblemente, los callos que crecen en medio selectivo se cultivan en medio sólido para regenerar las plantas.

Ejemplo 3 Transformación de Embriones de Soja

Se bombardean embriones de soja con un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos ABI3 unida de forma operativa a un promotor temprano de embrión/grano como sigue. Para inducir embriones somáticos, se cultivan cotiledones de 3-5 mm de longitud diseccionados a partir de semillas inmaduras con la superficie esterilizada del cultivar de soja A2872, en luz u oscuridad, a 26ºC en un medio de agar apropiado durante un periodo de seis a diez semanas. Después se escinden los embriones somáticos que producen embriones secundarios y se ponen en un medio líquido apropiado. Después de repetir la selección para grupos de embriones somáticos que se multiplican como embriones en fase globular tempranos, las suspensiones se mantienen como se describe a continuación.

Los cultivos en suspensión embriogénicos de soja pueden mantenerse en 35 ml de medio líquido en un agitador rotatorio a 150 rpm, a 26ºC con luz fluorescente con un programa de 16:8 horas de día/noche. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de medio líquido.

Los cultivos en suspensión embriogénicos de soja después pueden transformarse por el método de bombardeo con una pistola de partículas (Klein et al. (1987) Nature (Londres) 327:70-73, Patente de Estados Unidos Nº 4.945.050). En estas transformaciones puede usarse un instrumento PDS1000/HE de Du Pont Biolistic (actualización de helio).

Un gen marcador selectivo que puede usarse para facilitar la transformación de la soja es un transgén compuesto por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), el gen de la higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179-1988) y la región 3' del gen de la nopalina sintasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. El cassette de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos ABI3 unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión puede aislarse como un fragmento de restricción. Este fragmento después puede insertarse en un único sitio de restricción del vector que lleva el gen marcador.

A 50 \mul de una suspensión de partículas de oro de 1 \mum a 60 mg/ml se le añaden (en orden): 5 \mul de ADN (1 \mug/\mul), 20 \mul de espermidina (0,1 M) y 50 \mul de CaCl_{2} (2,5 M). Después, la preparación de partículas se agita durante tres minutos, se centrifuga en una microcentrífuga durante 10 segundos y se elimina el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN después se lavan una vez con 400 \mul de etanol al 70% y se resuspenden en 40 \mul de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas puede sonicarse tres veces durante un segundo cada vez. Después, en cada disco de macrosoporte se cargan cinco microlitros de las partículas de oro cubiertas con ADN.

Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas se ponen en una placa petri vacía de 60x15 mm y se retira el líquido residual del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, normalmente se bombardean aproximadamente 5-10 placas de tejido. La presión de rotura de membrana se fija a 1100 psi (7582,14 kPa), y la cámara se somete a un vacío de 28 pulgadas de mercurio (1,63 atm). El tejido se pone a aproximadamente 3,5 pulgadas (8,9 cm) de la pantalla de retención y se bombardea tres veces. Tras el bombardeo, el tejido puede dividirse a la mitad y ponerse de nuevo en el líquido y cultivarse como se ha descrito anteriormente.

De cinco a siete días después del bombardeo, puede cambiarse el medio líquido por medio fresco, y once a doce días después del bombardeo por medio fresco que contiene higromicina a 50 mg/ml. Estos medios selectivos pueden cambiarse semanalmente. De siete a ocho semanas después del bombardeo puede observarse tejido verde transformado que se desarrolla a partir de grupos embriogénicos no transformados y necróticos. El tejido verde aislado se retira y se inocula en matraces individuales para generar nuevos cultivos embriogénicos en suspensión transformados, propagados clonalmente. Cada nueva línea puede tratarse como un suceso de transformación independiente. Después, estas suspensiones pueden subclonarse y mantenerse como grupos de embriones inmaduros o regenerarse en plantas completas por maduración y germinación de embriones somáticos individuales.

Ejemplo 4 Transformación de Tejido de Meristemo de Girasol

Se transforman tejidos de meristemo de girasol con un casete de expresión que contiene la secuencia ABI3 unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión como se indica a continuación (véase también la Patente Europea número EP 0 486233, incorporada aquí como referencia, y Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant Science 103:199-207). Se descascaran semillas maduras de girasol (Helianthus annuus L.) usando una desgranadora de trigo sencilla. Se esteriliza la superficie de las semillas durante 30 minutos con una solución de lejía Clorox al 20% con la adición de dos gotas de Tween 20 por cada 50 ml de solución. Las semillas se lavan dos veces con agua destilada estéril.

Se preparan explantes de eje embrionario de escisión por medio de una modificación de procedimientos descritos por Schrammeijer et al. (Schrammeijer et al. (1990) Plant Cell Rep. 9: 55-60). Las semillas se embeben en agua destilada durante 60 minutos siguiendo el procedimiento de esterilización de la superficie. Después se arrancan los cotiledones de cada semilla, produciendo una fractura limpia en el plano del eje embrionario. Tras la escisión del ápice de la raíz, los explantes se dividen en dos longitudinalmente entre las hojas primordiales. Las dos mitades se sitúan, con la superficie de corte hacia arriba, en medio GBA que consta de elementos minerales de Murashige y Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant., 15:473-497), adiciones de vitaminas de Shepard (Shepard (1980) en Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), 40 mg/l de sulfato de adenina, 30 g/l de sacarosa, 0,5 mg/l de 6-bencil aminopurina (BAP), 0,25 mg/l de ácido indol-3-acético (IAA), 0,1 mg/l de ácido giberélico (GA_{3}), pH 5,6, y 8 g/l de Phytagar.

Los explantes se someten a bombardeo con microproyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium (Bidney et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Para este tratamiento se ponen de treinta a cuarenta explantes en un círculo en el centro de una placa de 60 x 20 mm. Aproximadamente 4,7 mg de microproyectiles de tungsteno de 1,8 mm se resuspenden en 25 ml de tampón TE estéril (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y se usan alícuotas de 1,5 ml por bombardeo. Cada placa se bombardea dos veces a través de una pantalla de nytex de 150 mm colocada aproximadamente a 2 cm de las muestras en un equipo de aceleración de partículas PDS 1000®.

En todos los experimentos de transformación se usan Agrobacterium tumefaciens de la cepa EHA105 desarmadas. En la cepa EHA105 de Agrobacterium se introduce un vector plasmídico binario compuesto por el cassette de expresión que contiene el gen ABI3 unido de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión por congelación-descongelación como describen Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187. Este plásmido además contiene un gen marcador selectivo por kanamicina (es decir nptII). Las bacterias para los experimentos de transformación de plantas se cultivan durante toda la noche (28ºC y en continua agitación a 100 rpm) en medio líquido YEP (10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de bactopeptona y 5 g/l de NaCl, pH 7,0) con los antibióticos apropiados requeridos para el mantenimiento de la cepa bacteriana y del plásmido binario. La suspensión se usa cuando alcanza una DO_{600} de aproximadamente 0,4 a 0,8. Las células de Agrobacterium se sedimentan y resuspenden a una DO_{600} de 0,5 en un medio de inoculación que contiene MES 12,5 mM, pH 5,7, 1 g/l de NH_{4}Cl y 0,3 g/l de MgSO_{4}.

Los explantes recién bombardeados se ponen en una suspensión de Agrobacterium, se mezclan y se dejan sin en reposo durante 30 minutos. Los explantes después se transfieren a medio GBA y se co-cultivan, con la superficie cortada hacia abajo, a 26ºC y días de 18 horas. Tras tres días de co-cultivo, los explantes se transfieren a 374B (medio GBA que carece de reguladores de crecimiento y con un reducido nivel del sacarosa del 1%) complementado con 250 mg/l de cefotaxima y 50 mg/l de sulfato de kanamicina. Los explantes se cultivan durante dos a cinco semanas en medio de selección y después se transfieren a medio 374B nuevo carente de kanamicina durante una a dos semanas de desarrollo continuado. Los explantes que diferencian áreas de crecimiento resistentes a antibiótico que no han producido brotes adecuados para la escisión se transfieren a medio GBA que contiene 250 mg/l de cefotaxima para un segundo tratamiento de 3 días con fitohormonas. En muestras de hojas de brotes verdes resistentes a kanamicina se ensaya por ELISA la presencia de NPTII y por medio de un ensayo de modulación de respuesta a ABA en la planta se determina la presencia de expresión del transgén.

Los brotes NPTII positivos se injertan en el rizoma de plántulas de girasol cultivadas in vitro Pioneer® híbrido 6440. Se germinan semillas con la superficie esterilizada en medio 48-0 (mitad de la concentración de sales de Murashige y Skoog, sacarosa al 0,5%, Gelrite al 0,3%, pH 5,6) y se dejan crecer en las condiciones descritas para el cultivo de explantes. Se retira la porción superior de la plántula, se hace una sección vertical de 1 cm en el hipocotilo y se inserta el brote transformado en el corte. El área completa se envuelve con parafilm para asegurar el brote. Las plantas injertadas pueden transferirse al suelo tras una semana de cultivo in vitro. Los injertos en el suelo se mantienen en condiciones de humedad alta seguidas de una aclimatación lenta al ambiente de invernadero. Los sectores transformados de las plantas T_{0} (generación parental) maduradas en el invernadero se identifican, por ejemplo, por ELISA para NPTII de extractos de hojas mientras que las semillas transgénicas recogidas de plantas T_{0} positivas para NPTII se identifican ensayando una modulación de la respuesta de la planta a ABA.

Ejemplo 5

Se generan plantas transgénicas de maíz por los métodos del ejemplo 1 usando una construcción de ADN que contiene una secuencia Vp1 de tipo silvestre (SEC ID Nº: 1) unida operativamente al promotor de oleosina. El plásmido además contiene el marcador selectivo PAT (Wohlleben et al. (1998) Gene 70:25-37). Como se describe en el Ejemplo 1, se aíslan plantas que contienen la construcción de ADN oleosina:Vp1 incorporada de forma estable.

Se aíslan plantas de maíz que tienen una mutación con pérdida de función en vp1 como se describe en Eyster et al. (1931) Genetics 16:574-590, incorporada en este documento como referencia. Estas plantas se caracterizan porque tienen una sensibilidad reducida a ABA. Se cruzan plantas transgénicas de maíz que tienen la construcción de ADN oleosina:Vp1 incorporada de forma estable con la planta de maíz que tiene la mutación de pérdida de función vp1. La progenie resultante se retrocruza para producir una planta que tiene el siguiente genotipo: vp1/vp1; oleosina:Vp1/oleosina:Vp1. Esta planta se aislará de los efectos perjudiciales de ABA en el embrión temprano y se le suministrará VP1 en el desarrollo tardío de grano/embrión, permitiendo que los granos maduren normalmente.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los especialistas en la técnica a los que corresponde esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en este documento como referencia como si se indicara específica e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora como referencia.

Aunque la invención mencionada anteriormente se ha describo con algún detalle por medio de ilustraciones y ejemplos con el propósito de mejorar la comprensión, será obvio que pueden ponerse en práctica determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Helentjaris, Tim

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<120> Modulación de Acido Abscísico

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<130> 35718/205302

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<150> US 60/166.080

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<151> 1999-11-17

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 13

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 2456

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (0) ... (0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADNc de vp1 (Nº de Acceso del Genbank M60214)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (73) ... (2148)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 691

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

5

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 1981

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (0) ... (0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADNc de ABI1 (Nº de Acceso del Genbank X77116)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (432) ... (1736)

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 3

7

8

9

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<210> 4

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<211> 434

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

10

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<210> 5

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<211> 1470

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0) ... (0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADNc de ABI2 (Nº de Acceso del Genbank Y08965)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (51) ... (1322)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 423

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 2868

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (0) ... (0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADNc de ABI3 (Nº de Acceso del Genbank X68141)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (406) ... (2568)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

15

16

17

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 720

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

20

21

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<210> 9

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<211> 1500

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (0) ... (0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADNc de ABI4 (Nº de Acceso del Genbank AF040959)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (151) ... (1137)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

22

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0) ... (0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Promotor de oleosina (Nº de Acceso del Genbank U71381)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>11

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 940

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Brassica juncea

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0) ... (0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Promotor de oleosina (Nº de Acceso del Genbank AF134411)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>12

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 807

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

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<222> (0) ... (0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Promotor de lpt2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400>13

29

Claims (43)

1. Un método para modular una respuesta al ácido abscísico (ABA) durante el desarrollo de la semilla, desarrollo del endospermo o maduración de la semilla en una planta, comprendiendo dicho método:

introducir una construcción de ADN que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión en dicha planta por transformación, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modulación comprende una respuesta reducida a ABA.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA es:

a) una secuencia de nucleótidos como se establece en la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7 ó 9;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se establece en SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 ó 10;

c) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% con las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7 ó 9, donde la expresión de dicha secuencia disminuye la respuesta a ABA;

d) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la complementaria de la SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7 ó 9, donde la expresión de dicha secuencia de nucleótidos disminuye la respuesta a ABA y dichas condiciones rigurosas comprenden la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,1x SSC a una temperatura de 60ºC a 65ºC;

e) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia antisentido de la secuencia de nucleótidos de a), b), c), o d); o,

f) una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7 ó 9, donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico reduce la respuesta a ABA.

4. Un método para prevenir los efectos perjudiciales del estrés sobre una semilla de planta en desarrollo, una semilla de planta en maduración o un endospermo en desarrollo, comprendiendo dicho método:

introducir una construcción de ADN que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión en una planta por transformación, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida.

5. El método de la reivindicación 4, donde la expresión de dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA modula una respuesta a ABA.

6. El método de la reivindicación 5, donde dicha modulación es una reducción en la respuesta a ABA.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA es como se define en la reivindicación 3.

8. El método de la reivindicación 2 ó 6, donde dicha secuencia unida comprende una secuencia antisentido de una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA.

9. El método de la reivindicación 2 ó 6, donde dicha secuencia unida es una secuencia mutante implicada en la percepción y transducción de señales de ABA y comprende una secuencia seleccionada del grupo compuesto por abi1 y abi2.

10. El método de la reivindicación 1 ó 4, en el que dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA corresponde a una secuencia de la planta.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicha planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.

12. El método de la reivindicación 11, donde dicha monocotiledónea es un cereal.

13. El método de la reivindicación 12, donde dicho cereal es maíz.

14. El método de la reivindicación 2 ó 6, que comprende además reproducir la planta en la que se ha introducido dicha construcción de ADN por transformación.

15. Una planta que tiene una construcción de ADN introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida.

16. La planta de la reivindicación 15, donde la expresión de dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA modula una respuesta a ABA.

17. La planta de la reivindicación 16, donde dicha modulación reduce una respuesta a ABA.

18. La planta de la reivindicación 16, donde dicha secuencia está implicada en la percepción y transducción de señales de ABA y es una secuencia codificante.

19. La planta de la reivindicación 15, donde dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 u 8 a 10.

20. La planta de la reivindicación 15, donde dicha construcción de ADN está integrada de forma estable en el genoma de la planta.

21. Una célula vegetal que tiene introducida de forma estable una construcción de ADN que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida.

22. La célula vegetal de la reivindicación 21, donde la expresión de dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA modula una respuesta a ABA.

23. La célula vegetal de la reivindicación 22, donde dicha modulación reduce una respuesta a ABA.

24. La célula vegetal de la reivindicación 21, donde dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA es una secuencia codificante.

25. La célula vegetal de la reivindicación 21, donde dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA es como se define en una cualquier de las reivindicaciones 3 u 8 a 10.

26. Un método para prevenir los efectos perjudiciales del estrés sobre una semilla de la planta en desarrollo, una semilla de la planta en maduración o un endospermo en desarrollo, comprendiendo dicho método:

introducir una construcción de ADN que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor temprano de grano/embrión en una planta por transformación, donde la planta tiene una mutación con pérdida de función para dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA, donde dicho promotor temprano de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida.

27. El método de la reivindicación 26, que además comprende reproducir la planta en la que se ha introducido dicha construcción de ADN por transformación con una segunda planta que tiene una mutación con pérdida de función para dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA y aislar la progenie.

28. El método de la reivindicación 26, donde dicha modulación comprende una reducción de la respuesta a ABA.

29. El método de la reivindicación 26, donde dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA es:

a) una secuencia de nucleótidos indicada en la SEC. ID. Nº: 1 ó 7;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 u 8;

c) una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 70% con la SEC ID Nº: 1 ó 7; y, donde dicha secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% con la SEC ID Nº: 1 codifica un polipéptido que tiene actividad VP1 y dicha secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% con la SEC ID Nº: 7 codifica un polipéptido que tiene actividad ABI3;

d) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la complementaria de la SEC ID Nº: 1 ó 7, donde dicha secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la complementaria de la SEC ID Nº: 1 codifica un polipéptido que tiene actividad VP1, y dicha secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la complementaria de la SEC ID Nº: 7 codifica un polipéptido que tiene actividad ABI3, y dichas condiciones rigurosas comprenden la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,1xSSC a una temperatura de 60ºC a 65ºC; o,

e) una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 1 ó 7, donde dicha molécula de ácido nucleico que tiene al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 1 codifica un polipéptido que tiene actividad VP1, y dicha molécula de ácido nucleico que tiene al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº:7 codifica un polipéptido que tiene actividad ABI3.

30. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, donde dicho promotor tardío de grano/embrión es un promotor de oleosina.

31. Una planta que tiene una construcción de ADN introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor tardío de grano/embrión, donde dicho promotor tardío de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida.

32. La planta de la reivindicación 31, que además comprende una mutación con pérdida de función en una secuencia endógena implicada en la percepción y transducción de señales de ABA.

33. La planta de la reivindicación 32, donde dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA es como se define en la reivindicación 29.

34. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, donde dicho promotor tardío de grano/embrión es un promotor de oleosina.

35. Una célula vegetal que tiene una construcción de ADN introducida de forma estable que comprende una secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA unida de forma operativa a un promotor tardío de grano/embrión, donde dicho promotor tardío de grano/embrión es heterólogo con respecto a dicha secuencia unida.

36. La célula vegetal de la reivindicación 35, que además comprende una mutación con pérdida de función en una secuencia endógena implicada en la percepción y transducción de señales de ABA.

37. La célula vegetal de la reivindicación 35, donde dicha secuencia implicada en la percepción y transducción de señales de ABA es como se define en la reivindicación 29.

38. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 ó 31 a 34, donde dicha planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.

39. La planta de la reivindicación 38, donde dicha monocotiledónea es el maíz.

40. La semilla transformada de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, 31 a 34, 38 ó 39.

41. La progenie transformada de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, 31 a 34, 38 ó 39.

42.- La célula vegetal transformada de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25 ó 35 a 37, donde dicha célula vegetal es de una monocotiledónea o una dicotiledónea.

43. La célula vegetal transformada de la reivindicación 42, donde dicha monocotiledónea es maíz.