ES2234016T3 - Administracion de particulas de acido nucleico. - Google Patents
Administracion de particulas de acido nucleico.Info
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Abstract
PARTICULAS QUE COMPRENDEN UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO SON ADECUADAS PARA SER INYECTADAS SIN AGUJA, EN LA PIEL O EN TEJIDO MUCOSAL, SIN UN PORTADOR DE METAL.
Description
Administración de partículas de ácido
nucleico.
La presente invención se refiere de manera
general a métodos de administración de ADN. Más particularmente, la
invención tiene que ver con la administración in vivo y ex
vivo de moléculas de ácido nucleico en polvo a tejido de
mamífero utilizando técnicas de inyección sin aguja.
La terapia génica y la inmunización con ADN son
planteamientos prometedores para el tratamiento y la prevención de
enfermedades adquiridas y heredadas. Estas técnicas proporcionan la
transferencia de un gen deseado a un sujeto con la posterior
expresión in vivo del mismo. La transferencia de genes puede
ser llevada a cabo mediante la transfección de células o tejidos del
sujeto ex vivo y la reintroducción del material transformado
en el huésped. Alternativamente, los genes pueden ser administrados
directamente al receptor.
Se han desarrollado varios métodos para la
administración de genes en estos contextos. Por ejemplo, se han
desarrollado para la administración de genes sistemas basados en
virus que utilizan, por ejemplo, retrovirus, adenovirus y vectores
víricos adenoasociados. Sin embargo, estos sistemas poseen el riesgo
de la administración de virus competentes en cuanto a la
replicación. Por tanto, son deseables métodos no víricos para la
transferencia directa de genes a las células y tejidos
receptores.
Los métodos no víricos de transferencia de genes
se basan a menudo en mecanismos empleados por las células de
mamífero para la captación y el transporte intracelular de
macromoléculas. Por ejemplo, se han desarrollado métodos de
transferencia de genes mediados por receptores. La técnica utiliza
complejos entre ADN plasmídico y ligandos polipeptídicos que pueden
ser reconocidos por receptores de la superficie celular. Sin
embargo, los datos sugieren que este método puede permitir solamente
la expresión transitoria de genes y, por tanto, tiene solamente una
aplicación limitada.
Adicionalmente, se han desarrollado técnicas de
microinyección para la inyección directa de material genético a las
células. La técnica es, sin embargo, laboriosa y requiere
manipulaciones de células individuales. Por tanto, el método no es
apropiado para ser utilizado a gran escala.
Se ha descrito también la inyección directa de
soluciones que contienen ADN en el espacio intersticial para la
captación posterior por las células. Por ejemplo, la Publicación
Internacional Nº WO 90/11092, publicada el 4 de Octubre de 1990,
describe la administración de polinucleótidos aislados al interior
de células en las cuales los polinucleótidos aislados son
suministrados al espacio intersticial del tejido y posteriormente
captados por las células individuales para proporcionar un efecto
terapéutico. Tales métodos incluyen la inyección de las soluciones
que contienen ADN en el tejido utilizando agujas o cánulas
convencionales, y no son por tanto muy apropiados para terapias de
larga duración o para aplicaciones de campo o domésticas.
Se han desarrollado también sistemas biolísticos
de suministro de partículas (sistemas de bombardeo de partículas)
para la administración de genes a células vegetales. Tales técnicas
utilizan una "pistola de genes" para introducir micropartículas
revestidas con ADN, tales como metales revestidos con ADN, en las
células a velocidades elevadas. Los metales revestidos son
propulsados generalmente hacia el interior de las células utilizando
el estallido explosivo de un gas inerte tal como helio. Ver, por
ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.100.792 para Stanford y col. La
técnica permite la administración intracelular directa de pequeñas
cantidades de ADN.
Se necesitan generalmente microproyectiles de
partículas de tungsteno o de oro para conseguir una frecuencia de
transferencia de genes adecuada mediante tales técnicas de inyección
directa. En particular, estos materiales han sido seleccionados
sobre la base de su disponibilidad en tamaños de partícula definidos
de alrededor de 1 \mum de diámetro, además de tener una densidad
suficientemente elevada para alcanzar la cantidad de movimiento
requerida para penetrar la pared celular. Adicionalmente, los
metales utilizados son químicamente inertes para reducir la
probabilidad de oxidación explosiva de los polvos de los
microproyectiles finos, además de no ser reactivos con el ADN y los
demás componentes de las mezclas precipitantes, y presentan una baja
toxicidad para las células diana. Ver, por ejemplo, Particle
Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N., ed.,
Oxford University Press, New York, NY, páginas
10-11.
Sin embargo, existen pruebas de que la toxicidad
del tungsteno puede reducir la recuperación de los transformantes
estables. Adicionalmente, tales técnicas biolísticas no son
apropiadas para ser utilizadas con moléculas de ADN grandes, ya que
la precipitación de tales moléculas sobre los transportadores
metálicos puede dar lugar a configuraciones inestables que no
soportarán la fuerzas de cizallamiento de la administración con una
pistola de genes. Además, los transportadores de metal son retenidos
por los tejidos y/o por las células y pueden producir un
decoloramiento, además de otros varios efectos biológicos
indeseables, particularmente en el caso de la administración directa
a tejidos internos o en el tratamiento directo de las células
utilizando técnicas ex vivo. Por tanto, es probable que la
utilización de una pistola de genes para administrar partículas
metálicas revestidas con ADN sea problemática para una terapia
repetida, especialmente en mamíferos.
WO 94/23738 tiene que ver con micropartículas
adecuadas para la liberación controlada de un ácido nucleico a una
célula diana. Las micropartículas están compuestas por varios
componentes que incluyen un ácido nucleico, un material que estimula
la captación o el transporte al núcleo del ácido nucleico o la
expresión del ácido nucleico, y una matriz polimérica biodegradable
biocompatible específica. El material que estimula la captación, el
transporte o la expresión puede ser una glicoproteína o una
lipoproteína. La matriz polimérica encapsula al ácido nucleico.
Por consiguiente, permanece la necesidad de
proporcionar un método altamente eficaz para introducir ADN u otras
moléculas de ácido nucleico terapéuticamente relevantes en células
de tejidos de mamífero, método que evite los problemas comúnmente
encontrados con las técnicas anteriores de administración de
genes.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona la utilización de una molécula de ácido nucleico y de un
carbohidrato como único vehículo para la fabricación de un
medicamento en forma de partículas para ser utilizado en terapia
mediante la administración sin aguja a tejido cutáneo o mucosal, en
la cual
- -
- la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un inmunógeno,
- -
- secuencias control capaces de llevar a cabo la expresión de dicha secuencia de nucleótidos están unidas operativamente a la misma, y
- -
- dichas partículas tienen un tamaño que varía de 10 a 150 \mum y una densidad que varía de 0,8 a 3,0 g/cm^{3}.
La invención proporciona también una jeringa sin
aguja que contiene, como componente activo que va a ser
administrado, partículas como las definidas anteriormente.
La presente invención está basada en el
sorprendente descubrimiento de que partículas sólidas de moléculas
de ácido nucleico con un diámetro medio nominal de al menos 10
\mum aproximadamente y que son por tanto más grandes que la célula
de mamífero media, pueden ser administradas a las células de un
tejido de mamífero para la transferencia de genes con una eficacia
elevada. El resultado es inesperado ya que se creía hasta ahora que
solamente pequeñas partículas metálicas revestidas con ADN, con un
tamaño mucho más pequeño que las células típicas de mamífero, podían
ser utilizadas adecuadamente como microproyectiles en las técnicas
biolísticas de administración de genes. Ver, por ejemplo,
Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994)
Yang, N., ed., Oxford University Press, New York, NY, páginas
10-11.
En la práctica de la invención, moléculas de
ácido nucleico en polvo son administradas utilizando técnicas de
inyección sin aguja. En particular, un nuevo sistema de
administración que utiliza una jeringa sin aguja para disparar
partículas sólidas de agentes terapéuticos en dosis controladas a y
a través de piel intacta, ha sido descrito recientemente en la
Publicación Internacional comúnmente asignada Nº WO 94/24263,
publicada el 27 de Octubre de 1994. La publicación describe una
jeringa sin aguja que suministra partículas farmacéuticas
arrastradas por un flujo de gas supersónico. La jeringa sin aguja
puede ser utilizada para la administración transdérmica de
compuestos y composiciones farmacológicas en polvo, para la
administración de material genético a células vivas (por ejemplo, en
terapia génica) y para la administración de agentes biofarmacéuticos
a la piel, el músculo, la sangre o la linfa. La jeringa sin aguja
puede ser utilizada también junto con cirugía para administrar
fármacos y agentes biológicos a las superficies de órganos, a
tumores sólidos y/o a cavidades quirúrgicas (por ejemplo, lechos
tumorales o cavidades después de la resección del tumor).
Por consiguiente, en una realización, partículas
sólidas compuestas por moléculas de ácido nucleico son administradas
a un tejido de mamífero para la transformación genética de las
células del tejido con los ácidos nucleicos suministrados. En un
alejamiento sustancial de las técnicas convencionales de bombardeo
de partículas, las partículas de ácido nucleico transferidas
utilizando el método de la presente invención no son suministradas
utilizando transportadores metálicos densos. Además, las moléculas
tienen un tamaño de partícula que es igual o mayor que el tamaño
medio de las células de mamífero.
Más particularmente, se preparan partículas
densificadas compuestas por moléculas de ácido nucleico
seleccionadas y un transportador carbohidrato para la administración
a un tejido de mamífero mediante una jeringa sin aguja que es capaz
de expeler las partículas a velocidades de administración
supersónicas de entre 1 Mach y 8 Mach. Las partículas tienen un
tamaño medio que es al menos de 10 \mum aproximadamente, donde un
tamaño de partícula óptimo es normalmente de al menos 10 a 15 \mum
aproximadamente (igual o mayor que el tamaño de una célula de
mamífero típica). Sin embargo, pueden suministrarse también
partículas de ácido nucleico que tengan tamaños medios de partícula
de hasta 150 \mum utilizando el presente método. La profundidad a
la que penetrarán las partículas suministradas en el tejido diana
depende del tamaño de las partículas (por ejemplo, el diámetro
nominal de las partículas asumiendo una geometría de la partícula
aproximadamente esférica), de la densidad de las partículas, de la
velocidad inicial a la cual la partícula impacta en la superficie
del tejido y de la densidad y la viscosidad cinemática del tejido. A
este respecto, las densidades óptimas de las partículas individuales
(por ejemplo, en contraste con la densidad del polvo en masa) para
utilización en la inyección sin aguja varían generalmente entre 0,8
y 3,0 g/cm^{3} aproximadamente, y las velocidades de inyección
varían generalmente entre 200 y 3.000 m/segundo aproximadamente.
La invención puede ser practicada in vivo
con el fin de proporcionar la administración dirigida de las
partículas de ácido nucleico, tal como la administración a la
epidermis (para aplicaciones de terapia génica) o a la capa del
stratum basal de la piel (para aplicaciones de inmunización
con un ácido nucleico). En estos aspectos, se seleccionan
características de la partícula y/o parámetros operativos del
dispositivo con el fin de proporcionar una administración específica
para un tejido. Un abordaje particular incluye la selección del
tamaño de la partícula, de la densidad y la velocidad inicial de la
partícula para proporcionar una densidad de la cantidad de
movimiento (por ejemplo, la cantidad de movimiento de la partícula
dividida por el área frontal de la partícula) de entre 2 y 10
kg/segundo/m aproximadamente, y más preferiblemente entre 4 y 7
kg/segundo/m aproximadamente. Tal control de la densidad de la
cantidad de movimiento permite la administración controlada de
manera precisa, selectiva de un tejido, de las partículas de ácido
nucleico.
En otros aspectos, la jeringa sin aguja es
utilizada para transfectar células o tejidos ex vivo con las
moléculas de ácido nucleico particulado, donde las células
transformadas son reintroducidas posteriormente en el huésped.
Éstas y otras realizaciones de la presente
invención se les ocurrirán fácilmente a las personas con experiencia
en la técnica a la luz de la descripción de la presente.
La Figura 1 es una representación pictórica de un
aparato de administración ex vivo que tiene una jeringa sin
aguja colocada sobre una placa de cultivo de tejidos que contiene
las células que van a ser transformadas con las preparaciones de
ácido nucleico particulado descritas en la presente.
La Figura 2 es un histograma que representa las
eficacias de transformación obtenidas utilizando el aparato de la
Figura 1 para suministrar partículas de ADN a una presión de 30 bar
sobre una distancia a la diana de 60 mm según se describe en el
Ejemplo.
La Figura 3 es una gráfica que representa las
eficacias de transformación obtenidas utilizando el aparato de la
Figura 1 para suministrar partículas de ADN a una presión de 30 bar
sobre un rango de distancias a la diana, según se describe también
en el Ejemplo.
La práctica de la presente invención empleará, a
no ser que se indique de otro modo, métodos convencionales de
biología molecular y técnicas de ADN recombinante que están dentro
de la experiencia en la técnica. Tales técnicas están explicadas con
todo detalle en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989);
Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover,
ed.); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning.
Debe indicarse que, según se utilizan en esta
especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas
singulares "un", "una" y "el", "la", incluyen
los referentes plurales a no ser que el contenido lo indique
claramente de otro modo. Así, por ejemplo, una referencia a "una
molécula de ácido nucleico" incluye una mezcla de dos o más
moléculas de ácido nucleico, una referencia a "un excipiente"
incluye mezclas de dos o más excipientes, y similares.
A no ser que se definan de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el
mismo significado que el que es conocido comúnmente por las personas
con experiencia habitual en la técnica a la que pertenece la
invención. Los términos siguientes serán definidos según se indica a
continuación.
"Administración de genes" se refiere a
métodos o sistemas para insertar de forma precisa ADN foráneo en
células huésped. Tales métodos pueden tener como resultado la
expresión del ADN transferido no integrado, la replicación
extracromosómica y la expresión de los replicones transferidos (por
ejemplo, episomas), o la integración del material genético
transferido en el ADN genómico de las células huésped.
Las secuencias de nucleótidos están presentes
generalmente en una molécula de ácido nucleico adecuada y son
administradas en forma de vectores. Por "vector" se indica
cualquier elemento genético, tal como un plásmido, un fago, un
transposón, un cósmido, un cromosoma, un virus, un virión, etc., que
es capaz de replicarse cuando está asociado con los elementos de
control apropiados y que puede transferir secuencias génicas entre
células.
Una "secuencia de nucleótidos" o una
"molécula de ácido nucleico" se refiere a secuencias de ADN y
ARN. El término abarca moléculas que incluyen cualquiera de los
análogos de bases conocidos del ADN y del ARN tales como, pero sin
limitarse a, 4-acetilcitosina,
8-hidroxi-N6-metiladenosina,
aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)
uracilo, 5-fluorouracilo,
5-bromouracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo,
5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,
inosina, N6-isopenteniladenina,
1-metiladenina,
1-metilpseudoiracilo,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina, N6-metiladenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxi-aminometil-2-tiouracilo,
beta-D-mannosilqueosina,
5'-metoxicarbonilmetiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
metiléster del ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina,
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, metiléster del ácido
N-uracil-5-oxiacético,
ácido uracil-5-oxiacético,
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y
2,6-diaminopurina.
Una "secuencia codificadora" o una secuencia
que "codifica" un polipéptido particular, es una secuencia de
ácido nucleico que es transcrita (en el caso del ADN) y traducida
(en el caso del ARNm) a un polipéptido in vitro o in
vivo cuando es colocada bajo el control de secuencias
reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora
están determinados convencionalmente por un codón de inicio en el
extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el
extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificadora puede incluir, pero
sin limitarse a, ADNc procedente de un ARNm procariótico o
eucariótico, secuencias de ADN genómico procedentes de ADN
procariótico o eucariótico e incluso secuencias de ADN sintético.
Una secuencia de terminación de la transcripción estará normalmente
situada 3' respecto a la secuencia codificadora.
El término "secuencias control" de ADN se
refiere colectivamente a secuencias promotoras, señales de
poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción,
dominios reguladores corriente arriba, orígenes de replicación,
lugares internos de entrada de ribosomas ("IRES"),
intensificadores y similares, que proporcionan colectivamente la
replicación, la transcripción y la traducción de una secuencia
codificadora en una célula receptora. No todas estas secuencias
control necesitan estar siempre presentes, siempre que el gen
seleccionado sea capaz de ser replicado, transcrito y traducido en
una célula receptora apropiada.
"Unidos operativamente" se refiere a una
disposición de elementos en la que los componentes así descritos
están configurados para que realicen su función habitual. De este
modo, las secuencias control unidas operativamente a una secuencia
codificadora son capaces de producir la expresión de la secuencia
codificadora. Las secuencias control no necesitan ser contiguas a la
secuencia codificadora, siempre que funcionen para dirigir la
expresión de la misma. Así, por ejemplo, pueden estar presentes
secuencias intermedias ya transcritas no traducidas entre una
secuencia promotora y la secuencia codificadora, y la secuencia
promotora puede seguir siendo considerada como "unida
operativamente" a la secuencia codificadora.
Por el término "aislada" cuando se hace
referencia a una secuencia de nucleótidos, o a una molécula de ácido
nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos, se quiere decir
que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de
otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. Así, la frase "una
molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido
particular", se refiere a una molécula de ácido nucleico que está
sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no
codifican el polipéptido objeto; sin embargo, la molécula puede
incluir algunas bases o restos adicionales que no afecten
nocivamente las características básicas de la composición.
El término "transfección" es utilizado para
referirse a la captación de ADN foráneo por una célula huésped, y
una célula huésped ha sido "transformada" como resultado de
haber sido transfectada. El ADN foráneo puede integrarse (unirse
covalentemente) o no al ADN cromosómico que constituye el genoma de
la célula. Por "célula huésped" o "célula huésped de
mamífero" se indica una célula que ha sido transfectada, o que es
capaz de ser transfectada, por una molécula de ácido nucleico que
contiene una secuencia de nucleótidos de interés. El término incluye
la progenie de la célula parental, independientemente de que la
progenie sea idéntica o no en morfología o en composición genética a
la célula parental original, siempre que la secuencia de nucleótidos
de interés esté presente en la célula.
El término administración "transdérmica"
incluye la administración transdérmica (o "percutánea") y la
administración transmucosal, esto es, la administración mediante el
pase de un fármaco o de un agente farmacéutico a través del tejido
cutáneo o mucosal. Ver, por ejemplo, Transdermal Drug Delivery:
Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft y Guy
(eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery:
Fundamentals and Applications, Robinson y Lee (eds.), Marcel
Dekker, Inc., (1987); y Transdermal Delivery of Drugs, Vols.
1-3, Kydonieus y Berner (eds.), CRC Press, (1987).
Aspectos de la invención que están descritos en la presente en el
contexto de administración "transdérmica", a no ser que se
especifique de otro modo, están destinados a ser aplicados a la
administración transdérmica y a la administración mucosal. Esto es,
debe suponerse que las composiciones, sistemas y métodos de la
invención, a no ser que se indique explícitamente de otro modo, son
igualmente aplicables a los modos de administración transdérmica y
transmucosal.
Las moléculas de ácido nucleico anteriores, solas
o en combinación con fármacos u otros agentes terapéuticos, son
preparadas típicamente como composiciones particulares que contienen
un carbohidrato como único vehículo (excipiente). Los
"vehículos" son normalmente materiales sustancialmente inertes
que no son tóxicos y que no interaccionan con los demás componentes
de la composición de manera nociva. Estos materiales pueden ser
utilizados para incrementar la cantidad de sólidos en composiciones
farmacéuticas particulares, tales como las preparadas utilizando
técnicas de deshidratación por aspersión o liofilización, según se
describe adicionalmente más adelante. El único material vehículo de
la presente invención es un carbohidrato. Ejemplos incluyen grados
farmacéuticos de dextrosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, manitol,
sorbitol, inositol, dextrano, almidón y celulosa. Pueden estar
presentes también agentes aditivos que sirven como estabilizantes e
incluyen crioprotectores y antioxidantes comúnmente disponibles.
Antes de describir con detalle la presente
invención, debe comprenderse que esta invención no está limitada a
formulaciones o parámetros de procesos particulares que pueden, por
supuesto, variar. Debe comprenderse también que la terminología
utilizada en la presente tiene solamente la finalidad de describir
realizaciones particulares de la invención, y no tiene la intención
de ser limitante.
Aunque en la práctica de la presente invención
pueden utilizarse varios métodos y materiales similares o
equivalentes a los descritos en la presente, los materiales y
métodos preferidos son los descritos en la presente.
Según se explicó anteriormente, la presente
invención permite la administración muy eficaz de partículas sólidas
de moléculas de ácido nucleico que tienen un diámetro medio nominal
de al menos 10 \mum aproximadamente, a tejidos y células de
mamífero. El método utiliza técnicas de transferencia de genes
biolísticas y permite además la administración de moléculas de ácido
nucleico sin la necesidad de transportadores metálicos.
Puede administrarse una amplia variedad de
moléculas de ácido nucleico utilizando los métodos de la invención.
Generalmente, las moléculas contienen regiones codificadoras con
secuencias control adecuadas u otras secuencias de nucleótidos
terapéuticamente relevantes. Las moléculas de ácido nucleico son
preparadas en forma de vectores que incluyen los elementos
necesarios para dirigir la transcripción y la traducción en una
célula huésped. Si se desea la expresión utilizando los enzimas del
huésped (tal como mediante la utilización de la ARN polimerasa
endógena), el gen o los genes estarán presentes en los vectores
unidos operativamente a secuencias control reconocidas por el
huésped particular, o incluso por células particulares dentro del
huésped. Así, elementos de control eucarióticos y de fagos estarán
presentes para la expresión en huéspedes mamífero. Tales secuencias
son conocidas en la técnica y se discuten más a fondo a
continuación.
Las secuencias de nucleótidos adecuadas para ser
utilizadas en los métodos de administración de la presente invención
son cualquier secuencia de nucleótidos terapéuticamente relevante
que codifique un inmunógeno. La invención es por tanto utilizada
para administrar una secuencia de nucleótidos capaz de proporcionar
inmunidad, por ejemplo una secuencia inmunogénica que sirva para
producir una respuesta humoral y/o celular en un sujeto.
Para inmunizaciones con un ácido nucleico,
vectores de expresión que codifiquen un antígeno pueden ser
administrados a un sujeto con el fin de producir respuestas inmunes
humorales y/o celulares hacia los antígenos codificados por el
vector. En particular, se han descrito respuestas inmunes humorales,
celulares citotóxicas y protectoras producidas por la inyección
intramuscular directa de ADNs que codifican antígenos. Tang y col.
(1992) Nature 358:152; Davis y col. (1993) Hum.
Molec. Genet. 2:1847; Ulmer y col. (1993) Science
258:1745; Wang y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:4156; Eisenbraun y col. (1993) DNA Cell
Biol. 12:791; Fynan y col. (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:12476; Fuller y col. (1994) AIDS Res.
Human Retrovir. 10:1433; y Raz y col. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91:9519.
A continuación se describen más a fondo modos de
llevar a cabo la invención.
Las secuencias de nucleótidos seleccionadas para
ser utilizadas en la presente invención pueden derivarse de fuentes
conocidas, por ejemplo, mediante el aislamiento de las mismas a
partir de células que contienen un gen deseado o una secuencia de
nucleótidos deseada, utilizando técnicas estándar. De manera
similar, las secuencias de nucleótidos pueden ser generadas
sintéticamente utilizando modos estándar de síntesis de
polinucleótidos que son bien conocidos en la técnica. Ver, por
ejemplo, Edge y col. (1981) Nature 292:756; Nambair y
col. (1984) Science 223:1299; Jay y col. (1984) J.
Biol. Chem. 259:6311. Generalmente, pueden prepararse
oligonucleótidos sintéticos mediante el método del fosfotriéster
según está descrito por Edge y col. (supra) y Duckworth y
col. (1981) Nucleic Acids Res. 9:1691, o mediante el
método de las fosforamiditas según está descrito por Beaucage y col.
(1981) Tet. Letts. 22:1859 y Matteucci y col. (1981)
J. Am. Chem. Soc. 103:3185. Pueden prepararse también
oligonucleótidos sintéticos utilizando sintetizadores de
oligonucleótidos automatizados comercialmente disponibles. Pueden
por tanto diseñarse secuencias de nucleótidos con codones apropiados
para una secuencia de aminoácidos particular. En general, se
seleccionarán los codones preferidos para la expresión en el huésped
deseado. La secuencia completa es ensamblada a partir de
oligonucleótidos solapantes preparados mediante métodos estándar y
que son ensamblados para dar una secuencia codificadora completa.
Ver, por ejemplo, Edge y col. (supra); Nambair y col.
(supra) y Jay y col. (supra).
Un método particularmente conveniente para
obtener secuencias de ácido nucleico para ser utilizadas en la
presente es mediante medios recombinantes. De este modo, una
secuencia de nucleótidos deseada puede ser escindida de un plásmido
portador de la misma utilizando enzimas de restricción y
procedimientos estándar. El corte del ADN específico de un sitio se
realiza mediante tratamiento con el enzima (o enzimas) de
restricción adecuado bajo condiciones que son conocidas generalmente
en la técnica, y los particulares de las cuales están especificados
por los fabricantes de enzimas de restricción comercialmente
disponibles. Si se desea, puede realizarse la separación de los
fragmentos cortados por tamaños mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida o en el gel de agarosa utilizando técnicas
estándar.
Los fragmentos cortados con enzimas de
restricción pueden hacerse de extremos romos mediante tratamiento
con el fragmento grande de la ADN polimerasa I (Klenow) de E.
coli en presencia de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato
(dNTPs) utilizando técnicas estándar. El fragmento Klenow rellena
los salientes de hebra sencilla 5' pero digiere las hebras sencillas
protuberantes 3', aunque estén presentes los cuatro dNTPs. Si se
desea, puede realizarse una reparación selectiva proporcionando
solamente uno, o varios, dNTPs seleccionados dentro de las
limitaciones dictadas por la naturaleza del saliente. Después del
tratamiento con Klenow, la mezcla puede ser extraída con, por
ejemplo, fenol/cloroformo y precipitada con etanol. El tratamiento
bajo condiciones apropiadas con nucleasa S1 o con
BAL-31 tiene como resultado la hidrólisis de
cualquier porción de hebra sencilla.
Una vez que se han preparado o aislado las
secuencias codificadores de las proteínas deseadas, tales secuencias
pueden ser clonadas en cualquier vector o replicón adecuado. Los
expertos en la técnica conocen numerosos vectores de clonaje y la
selección de un vector de clonaje apropiado es cuestión de elección.
Las ligaduras a otras secuencias se realizan utilizando
procedimientos estándar conocidos en la técnica.
Las secuencias de nucleótidos seleccionadas
pueden ser colocadas bajo el control de secuencias reguladoras tales
como un promotor, un sitio de unión de ribosomas y, opcionalmente,
un operador (referidas colectivamente en la presente como elementos
de "control"), de tal manera que la secuencia que codifica la
proteína deseada sea transcrita a ARN en el tejido del huésped
transformado por un vector que contenga esta construcción de
expresión. La secuencia codificadora puede contener o no un péptido
señal o una secuencia líder.
La elección de los elementos de control dependerá
del huésped que esté siendo transformado y del de tipo de
preparación utilizada. Por tanto, si se va a utilizar la maquinaria
de transcripción y traducción endógena del huésped para expresar las
proteínas, se utilizarán elementos de control compatibles con el
huésped particular. A este respecto, se conocen en la técnica varios
promotores para ser utilizados en sistemas de mamífero e incluyen,
pero no se limitan a, promotores derivados de SV40, CMV, HSV, RSV,
MMTV, T7, T3, entre otros. De manera similar, se conocen promotores
útiles con enzimas procarióticos e incluyen los promotores de tac,
spa, trp, trp-lac,
\lambda-p_{L}, T7, phoA, además de otros.
Además de las secuencias control, puede ser
deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de
la expresión de las secuencias de proteína codificadas por las
secuencias de nucleótidos administradas. Los expertos en la técnica
conocen las secuencias reguladoras y ejemplos de las mismas incluyen
aquéllas que hacen que la expresión de una secuencia codificadora
sea activada o desactivada en respuesta a un estímulo químico o
físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Pueden
estar también presentes en el vector otros tipos de elementos
reguladores, por ejemplo secuencias intensificadoras.
Se construye un vector de expresión de tal manera
que la secuencia codificadora particular esté situada en el vector
con las secuencias control apropiadas y, opcionalmente, con las
secuencias reguladoras apropiadas, de tal manera que la colocación y
la orientación de la secuencia codificadora con respecto a las
secuencias control permita que la secuencia codificadora sea
transcrita bajo el "control" de las secuencias control (esto
es, la ARN polimerasa que se une a la molécula de ADN en las
secuencias control transcribe la secuencia codificadora). Puede ser
deseable una modificación de las secuencias que codifican la
proteína de interés particular para conseguir este objetivo. Por
ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia
con el fin de que esté unida a las secuencias control con la
orientación apropiada; esto es, para mantener el marco de lectura.
Las secuencias control y otras secuencias reguladoras pueden ser
ligadas a la secuencia codificadora antes de la inserción en un
vector. Alternativamente, la secuencia codificadora puede ser
clonada directamente en un vector de expresión que contenga ya las
secuencias control y un sitio de restricción apropiado.
Una vez obtenidas y/o construidas, las moléculas
de ácido nucleico son preparadas para su administración en forma
particulada. Un método común para preparar agentes biofarmacéuticos
particulados, tales como ácidos nucleicos, es la liofilización
(desecación-congelación). La liofilización se
refiere a una técnica para eliminar la humedad de un material e
implica una congelación rápida a una temperatura muy baja, seguido
por una deshidratación rápida mediante sublimación a alto vacío.
Esta técnica produce típicamente partículas porosas de baja densidad
que tienen una estructura de matriz abierta. Tales partículas son
químicamente estables, pero son rápidamente reconstituidas
(desintegradas y/o llevadas a solución) cuando son introducidas en
un entorno acuoso.
Otro método para proporcionar preparaciones de
ácido nucleico particulado que puede ser utilizado con estas y otras
biomoléculas delicadas o sensibles al calor es la deshidración por
aspersión. La deshidratación por aspersión se refiere a la
atomización de una solución de uno o más sólidos utilizando un
pulverizador, un disco giratorio u otro dispositivo, seguido por la
evaporación del solvente de las pequeñas gotas. Más particularmente,
la deshidratación por aspersión implica la combinación de una
preparación líquida altamente dispersada (por ejemplo, una solución,
una suspensión, una emulsión o similares) con un volumen adecuado de
aire caliente para producir la evaporación y el secado de las
pequeñas gotas de líquido. Los agentes farmacéuticos deshidratados
por aspersión se caracterizan en general por ser partículas
esféricas homogéneas que son frecuentemente huecas. Tales partículas
tienen una baja densidad y presentan una rápida velocidad de
solución.
Los sólidos particulados de baja densidad
producidos por las técnicas de liofilización y deshidratación por
aspersión son ideales para redisolución para administración parental
en solución mediante jeringas o catéteres. Sin embargo, tales
partículas no son útiles para ser administradas con una jeringa sin
aguja en forma sólida. Por consiguiente, para los fines del presente
método, las preparaciones son densificadas con el fin de
proporcionar partículas que incluyan moléculas de ácido nucleico que
son mucho más adecuadas para la administración utilizando una
jeringa sin aguja (por ejemplo, partículas sustancialmente sólidas
que tienen un tamaño de 50 \mum aproximadamente y una densidad de
al menos 0,9 a 1,5 g/cm^{3} aproximadamente). En particular, las
partículas de retícula abierta o de estructura hueca proporcionadas
por la deshidratación por aspersión o por la liofilización pueden
ser condensadas sin calentamiento ni cizallamiento para proporcionar
materiales densos que pueden ser triturados o reducidos de tamaño de
otro modo para producir partículas farmacéuticas con características
de tamaño y densidad adecuadas para la administración mediante
inyección sin aguja.
Los ácidos nucleicos para ser administrados de
acuerdo con la invención son preparados inicialmente en una
formulación adecuada para deshidratación por aspersión o
liofilización. Tales formulaciones requieren generalmente solamente
una solución en la que los ácidos nucleicos sean estables para
congelación y liofilización y un vehículo carbohidratado
(excipiente) para el procedimiento de deshidratación que sea
aceptable para administración parenteral. A este respecto, pueden
añadirse a la formulación excipientes carbohidratados adecuados con
el fin de proporcionar una masa suficiente para una dosis
individual, facilitando la medida de las dosis mediante procesos
prácticos, por ejemplo en peso o volumen. Las dosificaciones típicas
pueden ser de 0,5 mg aproximadamente a 5 mg aproximadamente,
preferiblemente de 1 mg aproximadamente a 2 mg aproximadamente. Los
excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, trehalosa,
glucosa, dextrosa, sacarosa y manitol. Pueden utilizarse aminoácidos
tales como glicina y su sal clorhidrato como tampones así como
tampones fosfato, lactato o citrato, entre otros. Adicionalmente,
cualquier composición conocida para la estabilización del ADN será
útil en las presentes formulaciones. Las composiciones pueden
incluir opcionalmente agentes aditivos tales como crioprotectores,
antioxidantes o similares. El ajuste de las composiciones para
incrementar la estabilidad física y química de las diferentes
formulaciones de ácido nucleico particulado proporcionadas en la
presente está dentro de la experiencia habitual en la técnica.
Un procedimiento particular para la
estabilización durante el reprocesamiento de las formulaciones de
ácido nucleico incluye la utilización de aditivos que son combinados
con la solución antes de la congelación para la liofilización con el
fin de hacer que los ácidos nucleicos se enrollen o aglomeren y
proporcionen por tanto el material genético como una fase
discontinua en las partículas por lo demás microscópicamente
homogéneas. En tales formulaciones, el ingrediente de carga sería la
fase continua del sólido secado, de tal manera que sería menos
probable que cualquier trituración antes de la compresión, la
densificación por compresión y la retrituración (según se describe
con detalle más adelante), y cualquier rozamiento de las partículas
durante el proceso de determinación de los tamaños mediante
clasificación con un tamiz o con aire, la aceleración o la
inyección, rompiera los ácidos nucleicos de cadena larga. La
homogeneidad de las partículas con respecto al contenido de ácido
nucleico es crítica debido al potencial de segregación por tamaños
durante el almacenamiento o la inyección.
La condensación de los polvos deshidratados por
aspersión o liofilizados se realiza mediante compactación en una
prensa adecuada (por ejemplo, una prensa hidráulica, una prensa de
tabletas o una prensa rotatoria), en la que los polvos son
comprimidos de 1.000 a 24.000 libras/pulgada cuadrada
aproximadamente (por ejemplo, de 0,5 a 12 toneladas/pulgada cuadrada
o de 7 a 170 MPa) durante un tiempo adecuado. Si se desea, la
compactación puede ser llevada a cabo bajo vacío. El material
compactado resultante es posteriormente vuelto a triturar
groseramente hasta que se rompa visualmente. Posteriormente el
tamaño de las partículas es reducido hasta un tamaño medio de 20 a
50 \mum aproximadamente con una densidad individual de las
partículas de 0,9 a 1,5 g/cm^{3} aproximadamente. La reducción del
tamaño de las partículas puede ser realizada utilizando métodos bien
conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a,
trituración con un molino de rulos, trituración con un molino de
bolas, trituración con un molino de martillos o por impacto,
trituración por rozamiento, cribado, sonicación o combinaciones de
los mismos. Los parámetros de compresión y de clasificación por
tamaños de las partículas variarán, por supuesto, dependiendo del
material de partida utilizado, del tamaño y la densidad deseados
para las partículas diana y consideraciones similares. La densidad
de las partículas puede ser fácilmente determinada utilizando
técnicas de cuantificación conocidas tales como picnometría con
helio y similares.
Por tanto, el método puede ser utilizado para
obtener partículas de ácido nucleico con un tamaño que varía desde
10 a 150 \mum y más preferiblemente de 20 a 60 \mum; y con una
densidad de partícula que varía desde 0,8 a 3,0 g/cm^{3} y
preferiblemente de 0,9 a 1,5 g/cm^{3}.
Después de la formación, las preparaciones de
ácido nucleico particulado son administradas al tejido de mamífero
utilizando una jeringa sin aguja. Una jeringa sin aguja para ser
utilizada en la presente está descrita de manera general en la
Publicación Internacional comúnmente asignada Nº WO 94/24263,
publicada el 27 de Octubre de 1994. La jeringa contiene una boquilla
tubular alargada que tiene una membrana (o membranas) rompible que
cierra inicialmente el paso a través de la boquilla y está dispuesta
sustancialmente adyacente al extremo corriente arriba de la
boquilla. Las partículas de ácido nucleico que van a ser
administradas están dispuestas de manera adyacente a la membrana
rompible y son administradas utilizando un medio energizante que
aplica una presión gaseosa a la parte corriente arriba de la
membrana suficiente para hacer estallar la membrana y producir un
flujo de gas supersónico (que contiene las partículas farmacéuticas)
a través de la boquilla para la administración desde el extremo
corriente abajo de la misma. Las partículas pueden ser por tanto
administradas con la jeringa sin aguja a velocidades de
administración de entre 1 Mach y 8 Mach que son fácilmente
obtenibles después del estallido de la membrana rompible.
Otra configuración de la jeringa sin aguja
incluye generalmente los mismos elementos que los descritos
anteriormente, excepto en que en lugar de tener las partículas
farmacéuticas retenidas dentro de un flujo de gas supersónico, el
extremo corriente abajo de la boquilla está provisto de un diafragma
biestable que se mueve entre una posición de reposo "invertida"
(en la cual el diafragma presenta una concavidad en la cara
corriente abajo para contener las partículas de ácido nucleico) y
una posición "evertida" activa (en la cual el diafragma es
convexo hacia afuera en la cara corriente abajo como resultado de
una onda de choque supersónica que ha sido aplicada a la cara
corriente arriba del diafragma). De esta manera, las partículas
contenidas en la concavidad del diafragma son expulsadas a una
velocidad inicial supersónica del dispositivo para la administración
transdérmica de las mismas a una superficie cutánea o mucosal
diana.
La administración transdérmica utilizando las
configuraciones de jeringa sin aguja anteriormente descritas se
lleva a cabo con partículas que tienen un tamaño aproximado que
varía generalmente entre 10 y 150 \mum. El tamaño óptimo de las
partículas es normalmente de al menos 10 a 15 \mum aproximadamente
(el tamaño de una célula típica). Pueden administrarse también con
el dispositivo partículas de ácido nucleico mayores de 250 \mum
aproximadamente, siendo la limitación superior el punto en el cual
el tamaño de las partículas causaría un daño adverso a la piel. La
distancia real a la cual penetrarán las partículas administradas
depende del tamaño de las partículas (por ejemplo, del diámetro
nominal de las partículas asumiendo una geometría más o menos
esférica de las partículas), de la densidad de las partículas, de la
velocidad inicial a la cual la partícula impacta sobre la superficie
de la piel y de la densidad y la viscosidad cinemática de la piel. A
este respecto, las densidades de las partículas para ser utilizadas
en la inyección sin aguja varían entre 0,8 y 3,0 g/cm^{3},
preferiblemente entre 0,9 y 1,5 g/cm^{3} y las velocidades de
inyección varían generalmente entre 200 y 3.000 m/segundo.
Una característica particularmente exclusiva de
la jeringa sin aguja es la capacidad para controlar estrechamente la
profundidad de penetración de las partículas administradas,
permitiendo de este modo la administración dirigida de los ácidos
nucleicos a diferentes lugares. Por ejemplo, pueden seleccionarse
las características de la partícula y/o los parámetros de operación
del dispositivo con el fin de proporcionar profundidades de
penetración inferiores a 1 mm aproximadamente para administración
intradérmica, o de 1-2 mm aproximadamente para
administración subcutánea. Un procedimiento incluye la selección del
tamaño de la partícula, de la densidad de la partícula y de la
velocidad inicial para proporcionar una densidad de la cantidad de
movimiento (por ejemplo, la cantidad de movimiento de la partícula
dividida por el área frontal de la partícula) de entre 2 y 10
kg/segundo/m aproximadamente, y más preferiblemente de entre 4 y 7
kg/segundo/m aproximadamente. Tal control de la densidad de la
cantidad de movimiento permite la administración controlada con
precisión, selectiva de un tejido, de los ácidos nucleicos
particulados.
Las composiciones que contienen una cantidad
terapéuticamente eficaz de las moléculas de ácido nucleico en polvo
descritas en la presente, pueden ser administradas a cualquier
tejido de mamífero adecuado mediante las jeringas sin aguja
anteriormente descritas. Por ejemplo, las composiciones pueden ser
administradas a músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula
ósea, timo, corazón, linfa, sangre, cartílago óseo, páncreas, riñón,
vesícula biliar, estómago, intestino, testículo, ovario, útero,
recto, sistema nervioso, ojo y a tejido glandular y conectivo. Las
moléculas de ácido nucleico son administradas preferiblemente a, y
expresadas en, células terminalmente diferenciadas; sin embargo, las
moléculas pueden ser administradas también a células no
diferenciadas o parcialmente diferenciadas tales como las células
madre de la sangre y los fibroblastos de la piel.
Las composiciones en polvo son administradas al
sujeto que va a ser tratado de una manera compatible con la
formulación de la dosificación y en una cantidad que sea
profilácticamente y/o terapéuticamente eficaz. La cantidad de la
composición a administrar, generalmente en el rango de 0,5 \mug/kg
a 100 \mug/kg de molécula de ácido nucleico por dosis, depende del
sujeto que vaya a ser tratado. La cantidad exacta necesaria variará
dependiendo de la edad y de la condición general del individuo a
tratar, de la gravedad de la condición que esté siendo tratada y de
la secuencia o secuencias de nucleótidos particulares seleccionadas,
del lugar de administración así como de otros factores. La cantidad
eficaz apropiada puede ser fácilmente determinada por una persona
con experiencia en la técnica.
Por tanto, una "cantidad terapéuticamente
eficaz" de las presentes composiciones de moléculas de ácido
nucleico en polvo será suficiente para ocasionar la prevención de la
enfermedad o de los síntomas de la condición, y estará dentro de un
rango relativamente amplio que puede ser determinado mediante
ensayos de rutina.
A continuación están los Ejemplos de Referencia
que se ofrecen solamente con fines ilustrativos y no tienen la
intención de limitar de ningún modo el ámbito de la presente
invención.
Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión
con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades,
temperaturas, etc.), pero debe tenerse en cuenta, por supuesto, que
puede haber algún error y alguna desviación experimental.
Ejemplo de referencia
1
El siguiente experimento fue realizado para
investigar la posibilidad de utilizar ADN liofilizado como
alternativa a partículas metálicas revestidas con ADN en la
transferencia biolística de material genético. En particular,
plásmidos de ADN en polvo así como partículas de tungsteno
revestidas con ADN como controles fueron administrados ex
vivo a células HT1080, fibroblastos humanos masculinos,
utilizando un aparato con una jeringa sin aguja según sigue.
El Clon 123 es un pequeño plásmido de \sim11 kb
que contiene el gen marcador de la
\beta-galactosidasa, de tal manera que puede
medirse la transformación transitoria con el indicador cromogénico
X-Gal. Los plásmidos fueron agrupados con un
excipiente carbohidratado, trehalosa. La trehalosa fue seleccionada
como excipiente debido a sus propiedades estabilizantes (Colaco y
col. (1992) Bio/Technology 10:1009). La trehalosa fue
disuelta en agua destilada y esterilizada por filtración antes de
añadir el ADN a la solución. Se prepararon tres soluciones
diferentes de ADN-azúcar con las proporciones
mostradas a continuación en la Tabla 1.
Las soluciones de plásmido/azúcar fueron
posteriormente liofilizadas (utilizando CO_{2} sólido e
isopropanol para congelar la solución antes de la deshidratación con
vacío), y el sólido de ADN-trehalosa liofilizado fue
triturado para formar micropartículas utilizando un mortero y una
mano de ágata.
Como control, se prepararon partículas de
tungsteno revestidas con ADN mediante el revestimiento de
microproyectiles de tungsteno (19,35 x 10^{3} kb\cdotm^{-3})
de 1,014 \mum de diámetro medio (M-17,
GTE/Sylvania, Towanda, PA, EE.UU.) con cuarenta microgramos de ADN
plasmídico del clon 123, dando cinco cargas útiles de 8 \mug de
ADN, utilizando un derivado de métodos conocidos para el
revestimiento de micropartículas. Potter y col. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81:7161; Klein y col. (1987)
Nature 327:70 y Williams y col. (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:2726.
Más particularmente, antes del revestimiento, las
partículas de tungsteno fueron esterilizadas y llevadas a
suspensión. Una muestra de 50 mg de microproyectiles de tungsteno de
1,048 \mum (diámetro medio) (M-17, GTE/Sylvania,
Towanda, PA, EE.UU.) fue pesada en un tubo Eppendorf de 1,5 cc y
esterilizada posteriormente en etanol (EtOH) 100%. Con el fin de
dispersar los microproyectiles (romper los agregados de partículas),
la solución esterilizada fue sonicada completamente poniendo en
contacto el exterior del tubo Eppendorf con la sonda de un
sonicador. Las partículas de tungsteno dispersadas fueron
centrifugadas y se retiró el sobrenadante. Las partículas de
tungsteno fueron resuspendidas en 1 cc de agua destilada estéril y
centrifugadas durante dos ciclos, y posteriormente almacenadas en 1
cc de agua destilada estéril hasta el revestimiento.
El ADN plasmídico fue absorbido en los
microproyectiles de tungsteno mediante la adición de 20 \mul del
ADN (1 mg/ml) a 40 \mul de la suspensión de partículas de
tungsteno preparada anteriormente. La suspensión fue agitada en
vórtex para asegurar la mezcla adecuada de los reactivos.
Posteriormente se añadieron los reactivos siguientes, en el orden
dado, con agitación con vórtex después de cada adición: 253 \mul
de CaCl_{2} (2,5 M); 50 \mul de espermidina (0,10 M, almacenada
congelada) y 207 \mul de H_{2}O destilada estéril. La mezcla
final fue agitada en vórtex durante 10 minutos a 4ºC. Los
microproyectiles de tungsteno revestidos con ADN fueron luego
centrifugados a 500 G durante 5 minutos. Después de la
centrifugación, se retiró cuidadosamente todo el sobrenadante y se
añadieron 100 \mul de EtOH 70%. Las partículas revestidas fueron
centrifugadas de nuevo, se retiró todo el sobrenadante y la
preparación final se resuspendió en 30 \mul en EtOH 100%.
El método anterior tuvo como resultado cantidades
adecuadas de partículas de tungsteno revestidas con ADN para
permitir de 4 a 5 administraciones con la jeringa sin aguja. Las
cantidades de los reactivos anteriormente indicadas pueden ser, por
supuesto, variadas con el fin de proporcionar cargas de ADN
diferentes de acuerdo con métodos conocidos. El volumen y la
concentración molar (M) de las soluciones madre utilizadas para
revestir el tungsteno con ADN se presentan a continuación en la
Tabla 2.
Para la transformación, se sembraron placas de
cultivo de 6 cm de diámetro con 5 x 10^{5} células HT1080,
fibroblastos humanos masculinos, 24 horas antes de la transfección.
Se prepararon dos placas replicadas para cada uno de los
tratamientos y se prepararon también dos placas control
negativo.
Las micropartículas y las partículas de tungsteno
revestidas fueron administradas posteriormente a las células
utilizando una jeringa sin aguja según se describió anteriormente.
La jeringa incluía una cámara reservorio de 4,5 ml con una válvula
de tipo émbolo, un reservorio de gas helio, una boquilla de 2 Mach y
una lámina de Mylar de 12 \mum perforada a mano en diafragmas de 6
mm de diámetro.
En particular, los diafragmas de Mylar fueron
esterilizados primeramente colocándolos individualmente entre piezas
de papel de filtro, apilados uno encima del otro, envueltos en papel
aluminio y sellados completamente con cinta de autoclave para
asegurar que no entrara agua en la pila de papel de filtro/diafragma
durante el proceso de autoclavado. Ésta fue colocada dentro de un
vaso de precipitados cubierto con papel de aluminio y colocada en la
cámara del autoclave.
Se utilizaron en el casete de membranas dos
diafragmas de Mylar de 12 \mum de 6 mm de diámetro. Un miligramo y
medio miligramo de cargas útiles del polvo de ADN liofilizado fueron
cargados en la membrana inferior del casete. Esta carga útil fue
cubierta posteriormente con las otras piezas del casete y con el
diafragma restante. Se utilizaron solamente las preparaciones 2 y 3
en el experimento debido a la dificultad para pesar con precisión
masas pequeñas. Otros cinco casetes fueron cargados cada uno con 5
\mul de la suspensión de partículas de ADN/tungsteno. Todas las
cantidades anteriores daban una masa de 8 \mug de ADN
aproximadamente que eran administrados en cada disparo,
independientemente de la formulación de partículas utilizada.
Con referencia ahora a la Figura 1, se ensambló
un aparato de administración (2) que contenía una jeringa sin aguja
(4) cargada con un casete como el descrito anteriormente. La jeringa
sin aguja (4) estaba colocada en un soporte anular (6) utilizando
una pinza para tubos estándar (8) con el fin de mantener la jeringa
en posición con relación a una placa de cultivo (10) sembrada con
las células HT1080 (12). La distancia entre el extremo corriente
abajo (14) de la jeringa sin aguja (4) y las células (14) de la
placa de cultivo (10) fue medida para poner una distancia a la
diana, generalmente indicada como (d). Con el fin de optimizar los
parámetros para la administración del ADN liofilizado, la distancia
a la diana (d) fue variada sobre una presión constante de
administración, o bien se varió la presión de administración sobre
una distancia a la diana constante. En particular, las preparaciones
de ADN fueron disparadas desde una distancia a la diana que variaba
desde 20 a 60 mm utilizando presiones del gas conductor helio que
variaban de 30 a 50 bar.
Después de la transformación, las células fueron
incubadas durante 2 días, teñidas, y posteriormente se realizaron
ensayos transitorios con X-Gal para determinar las
eficacias de transformación utilizando métodos previamente
descritos. Murray, E.J. (ed.) (1991) Methods in Molecular
Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, Vol. 7, Humana
Press, Clifton, New Jersey. Específicamente, la eficacia de
transformación fue determinada contando el número de células teñidas
de azul. Los parámetros de administración y los resultados de la
transformación están representados a continuación en la Tabla 3. El
efecto del estallido fue evaluado desde 1 punto para un efecto
bastante pequeño (siendo el diámetro de la zona de células muertas
de 5-8 mm aproximadamente) hasta cinco puntos para
un efecto muy grande (siendo el diámetro de la zona de células
muertas mayor de 30 mm). Como puede observarse, la transformación
por la preparación en polvo de plásmido/trehalosa de la presente
invención estaba en el mismo orden que la observada con las
partículas metálicas.
Según se muestra en la Figura 2, se observaron
resultados de transformación óptimos con la preparación particulada
de plásmido/trehalosa cuando se administró utilizando una presión de
30 bar a una distancia de la diana de 60 mm. Más particularmente, la
Figura 2 proporciona una comparación directa de la eficacia de
transformación obtenida mediante la administración de la preparación
de ácido nucleico particulado (preparaciones 2 y 3) con
administraciones históricas y contemporáneas de partículas de
tungsteno revestidas con ADN. Con referencia ahora a la Figura 3,
los datos obtenidos para administraciones a 30 bar están
representados en una gráfica que presenta la eficacia de
transformación como función de la distancia a la diana. Como puede
observarse, no se alcanzó la distancia óptima a la diana para las
preparaciones números 2 y 3 (referidas como F#2 y F#3,
respectivamente); sin embargo, la eficacia de transformación aumentó
sustancialmente al incrementar las distancias a la diana. Además,
cuando las administraciones se llevaron a cabo a la máxima distancia
analizada (60 mm), las eficacias de transformación obtenidas con las
formulaciones de ADN particulado (F#2 y F#3) eran apreciablemente
mejores que las observadas con los controles de tungsteno revestido
con ADN.
En las Figs. 2 y 3 se aplican las abreviaturas
siguientes (que no se definieron anteriormente):
| B/P | Recuento de Células Azules por Placa | |
| TCC | Control de Tungsteno Contemporáneo | |
| THC | Control de Tungsteno Histórico |
Además, en la Fig. 3, los puntos representados
gráficamente son según sigue:
| \bullet | F#2 | |
| \blacksquare | F#3 | |
| \blacktriangle | Tungsteno (el punto está oscurecido, a d = 20) |
Ejemplo de referencia
2
Los estudios siguientes fueron llevados acabo
para determinar la capacidad para administrar una composición de
ácido nucleico en polvo a un sujeto de ensayo in vivo
utilizando los métodos de la invención.
Construcción del Vector Plasmídico: Se utilizó la
construcción del vector pGREEN-1, que contiene el
gen de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) bajo el control de un
promotor de CMV, de tal manera que la expresión génica podía ser
determinada directamente mediante microscopía UV de secciones
histológicas procedentes de muestras del tejido tratado.
Composiciones de Ácido Nucleico en Polvo: Se
preparó una composición de ácido nucleico en polvo según sigue. Se
formó una mezcla combinando el vector plasmídico
pGREEN-1 con el azúcar trehalosa para obtener una
composición ADN-azúcar de 1 \mug:1 mg (p/p). Esta
composición fue liofilizada, comprimida, triturada y tamizada
posteriormente utilizando las técnicas anteriormente descritas en la
presente. La composición de ácido nucleico condensado resultante
tenía un tamaño medio de partícula que variaba de
38-75 \mum aproximadamente.
Administraciones: Se trataron ratones C57BL/10
con 1 mg de la composición particulada mediante la inyección sin
aguja. La composición fue administrada a una superficie de la piel
diana preparada adecuadamente, y se tomaron secciones histológicas
del sitio diana 24 horas después de la administración. La expresión
de GFP fue determinada directamente utilizando microscopía UV. Como
resultado de las administraciones, se vio expresión de GFP en el
tejido cutáneo tratado, confirmando la administración in vivo
con éxito de la composición de ácido nucleico en polvo a la piel
diana, y la transfección posterior de las células huésped y la
expresión del gen de GFP por las mismas.
En otro estudio, plásmidos que contenían un
casete de expresión de la hormona del crecimiento humana (hGH) o de
la \beta-galactosidasa
(\beta-Gal) fueron liofilizados con el excipiente
trehalosa para formar formulaciones de ácido nucleico que fueron
comprimidas, trituradas y tamizadas posteriormente utilizando las
técnicas anteriormente descritas. Las composiciones de ácido
nucleico condensado resultantes tenían un tamaño medio de partícula
que variaba de 38-75 \mum aproximadamente.
Cerdos hembra (que pesaban 20-25
kg) fueron anestesiados con halotano y se rasuró la piel del vientre
para poner de manifiesto un sitio diana apropiado. Las composiciones
anteriores de ácido nucleico en polvo fueron administradas
individualmente al sitio diana preparado en dosis de 0,1 \mug
(hGH) o 1 \mug (\beta-Gal) mediante un
dispositivo de inyección sin aguja (presión de administración de 60
bar). Se tomaron biopsias de los sitios diana 24 horas después del
tratamiento, y secciones histológicas fueron analizadas para
determinar la expresión de la hormona de crecimiento humana o de
\beta-Gal. Aunque no se observó expresión de hGH
dentro de los límites de detección del ensayo, se observó un grado
moderado de expresión de \beta-Gal en los sitios
tratados. La falta de expresión detectable de hGH en este estudio es
debida, presumiblemente, a la baja densidad de carga del ácido
nucleico (0,1 \mug) en la composición.
Claims (10)
1. Utilización de una molécula de ácido nucleico
y de un carbohidrato como único vehículo para la fabricación de un
medicamento en forma de partículas para utilización en terapia
mediante la administración sin aguja a tejido cutáneo o mucosal, en
la que
- -
- la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un inmunógeno,
- -
- secuencias control capaces de llevar a cabo la expresión de dicha secuencia de nucleótidos están unidas operativamente a la misma, y
- -
- dichas partículas tienen un tamaño que varía de 10 a 150 \mum y una densidad que varía de 0,8 a 3,0 g/cm^{3}.
2. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, en la que dicha molécula de ácido nucleico es una secuencia de
ADN.
3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en la que dicha molécula de ácido nucleico es un plásmido.
4. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que dicho carbohidrato es
trehalosa.
5. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que dichas partículas tienen un
tamaño que varía de 20 a 60 \mum.
6. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que dichas partículas tienen una
densidad que varía de 0,9 a 1,5 g/cm^{3}.
7. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que dicha secuencia de
nucleótidos codifica un antígeno capaz de producir una respuesta
inmune humoral.
8. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que dicha secuencia de
nucleótidos codifica un antígeno capaz de producir una respuesta
inmune celular.
9. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que dichas partículas son
administradas a una densidad de cantidad de movimiento de entre 2 y
10 kg/segundo/m.
10. Un jeringa sin aguja que contiene, como
componente activo que va a ser administrado, partículas como las
definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
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