ES2233403T3 - Enzima litica. - Google Patents

Abstract

Proteína que presenta la actividad de una enzima lítica y que está en condiciones de disociar la pared de la célula o las sustancias que componen ésta, elegida del grupo compuesto de a) una proteína de Lysobacter enzymogenes, que comprende las secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID Nº 1, 5, 6 y 7, b) una proteína con una secuencia de aminoácido que es por lo menos un 90% idéntica con las secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID Nº 1, 5, 6 y 7, c) un derivado de la proteína citada en a) y b) que se caracteriza por modificaciones químicas de uno o varios aminoácidos.

Description

Enzima lítica.

La presente invención se refiere a una proteína con la actividad de una enzima lítica, un microorganismo que forma esta enzima, moléculas de ácido nucleico que codifican esta enzima, vectores que contienen esta molécula de ácido nucleico, células huésped que contienen estos vectores, anticuerpos contra esta enzima lítica, mezclas de proteínas que contienen esta enzima así como procedimientos para la preparación de la enzima lítica y su aplicación.

Una serie de microorganismos presenta la facultad de disolver las paredes de las células de otros organismos mediante la formación de enzimas líticas. Tienen especial importancia en cuanto a la formación de enzimas líticas las mixobacterias o bacterias deslizantes, en particular las bacterias de la especie lysobacter. Las mixobacterias se caracterizan por un amplio espectro de actividad frente a diversos organismos. Así, estas bacterias forman enzimas de fermento lítico así como enzimas líticas frente a bacterias gram-positivas o gram-negativas. También se ha podido observar actividad lítica frente a hongos, algas o quitina. Las clases de la especie lysobacter sólo tienen una capacidad parcial de producir enzimas contra bacterias gram-negativas. Sin embargo forman enzimas que pueden disociar quitina, de manera que se disuelven las levaduras y hongos que tienen una pared de la célula de quitina. Mitsutani, J. of National Fisheries University 45 (4) (1997), 165-257, pudo mostrar mediante Lysobacter LB1 buenos resultados de degradación de floraciones de algas y cianobacterias en lagos de agua dulce.

De la Lysobacter enzymogenes 495 se conocen hasta ahora tres proteasas diferentes. Una proteasa \alpha-lítica, una metalo-endopeptidasa \beta-lítica y una Lys-C-endoproteinasa. La proteasa \alpha-lítica, descrita en Epstein y Wensink, J. of Biol. Chem. 263 (32), 1988, 16586-16590, es una proteasa de serina, cuya característica es un resto de serina especialmente reactivo en el centro catalítico. La metalo-endopeptidasa \beta-lítica, descrita en Damaglou et al., Proceedings of the Canadian Federation Biological Society 15 (2), 1974, es una N-acetilmuramoil-l-alanin-amidasa, que hidroliza el enlace entre el polisacárido y el péptido. Junto con la proteasa \alpha-lítica se lisan con ella no solo las bacterias gram-positivas sino también las gram-negativas (Li et al., J. Bacteriol. 172 (11) (1990), 6506-6511. También es una serina-proteasa la Lys-C-endopeptidasa, que disocia los enlaces éster y amida en el lado carboxi de la lisina (Reichenbach en "Biotechnologie", Editorial VCH, Weinheim (1988), Capítulo 20, 674-696). De la L. enzymogenes AL-1 se conocen dos proteasas diferentes, que son la AL-1-proteasa 1, que disocia los puentes de pentaglicina en la pared de S. aureus y la acetilmuramil L-analina de M. lysodeikticus y de las paredes de las células de S. aureus (Tipper et al., Biochemistry 6 (1967), 906-920). Si bien la AL-1 proteasa 2 no disocia paredes de células, en cambio lo hace con diversas proteínas de alto carácter específico en el lado amino de la lisina (Hedges y Wolfe, J. Bacteriol. 120, 844-853 (1974), Extracelullar enzyme from Myxobacter AL1 that exhibits both \beta-1,4-glucanase and chitosanase activities).

La disgregación enzimática de células microbianas de diversas especies o de macromoléculas aisladas tales como quitina o celulosa se puede conseguir por lo tanto mediante una serie de diferentes preparados, en particular de enzimas. Los requisitos relativos a las enzimas se orientan fuertemente por el paso de reacción especial que se deba catalizar y de las restantes condiciones del entorno que dependan del proceso. Por eso resulta para las enzimas líticas siempre un campo de aplicación relativamente limitado. Por lo tanto existe una permanente necesidad de disponer de otras enzimas líticas.

El problema técnico que constituye la base de la presente invención consiste por lo tanto en poner a disposición otra enzima lítica que esté en condiciones de disociar células, en particular células microbianas, macromoléculas u otros materiales biológicos.

La invención resuelve este problema técnico mediante la puesta a disposición de una proteína de existencia aislada y esencialmente libre de otras sustancias, en particular de proteínas o péptidos, con la actividad de una enzima lítica que comprende por lo menos la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID Nº 1, 5, 6 y/o 7. La invención resuelve este problema también mediante la puesta a disposición de una de las proteínas antedichas con la actividad de una enzima lítica, donde la proteína presenta un peso molecular, determinado mediante HPLC y/o MALDI TOF (Matrix assisted laser desorption ionization, time of flight, Equipo: Hewlett Packard, G2025A LD-TOF System), de 15.000 a 20.000 Da, un óptimo de temperatura de 37ºC y un pH óptimo de 9,0 a 10,0. La invención se refiere naturalmente también a variantes mutantes o derivados de esta proteína, que aumentando o esencialmente conservando su actividad enzimática natural se caracterizan por la modificación química de los aminoácidos y/o por una secuencia de aminoácidos modificada.

Con relación a la presente invención se entiende por proteína con la actividad de una enzima lítica, una proteína, un péptido o un fragmento de péptido que esté en condiciones de disociar enzimáticamente materiales biológicos tales como células, en particular células microbianas, preferentemente células gram-positivas y/o gram-negativas así como eventualmente actinomicetos, nemátodos, hongos, levaduras, algas, celulosa, quitina y/o mureína, en particular disociar la pared de la célula o las sustancias que forman ésta en la estructura de la pared de la célula o de forma aislada, es decir descomponerla en unidades moleculares menores. Además de una proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº 1, 5, 6 y/o 7, la invención comprende naturalmente también enzimas líticas con desviaciones respecto a esta secuencia, donde estas desviaciones pueden representar supresiones, inversiones o inserciones de aminoácidos, también por aminoácidos raros o no-naturales, es decir sintéticos, o similares. La invención se refiere también a derivados de las proteínas antes citadas que se caracterizan por modificaciones químicas, por ejemplo, alquilación de uno o varios aminoácidos. La proteína objeto de la invención que presenta la actividad de una enzima lítica puede ser tanto de procedencia natural como sintética y eventualmente puede estar presente como proteína de fusión o péptido de fusión con péptidos o proteínas de otra actividad enzimática. La proteína conforme a la invención también puede estar presente como pro-proteína, pre-proteína o pre-proproteína, es decir que pueden estar previstas secuencias adicionales de aminoácidos, que sean necesarias para fines de transporte, localización y/o conformación, y que eventualmente ya no estén presentes en la proteína pura. Las diversas variantes y derivados de la proteína objeto de la invención presentan determinadas características comunes tales como su actividad enzimática, el peso molecular, su reactividad inmunológica y/o su conformación o propiedades físicas tales como el comportamiento de marcha en electroforesis de gel, su comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación, propiedades espectroscópicas, estabilidad, óptimo de pH, óptimo de temperatura o solubilidad.

La proteína o enzima objeto de la invención se caracteriza por su elevada actividad lítica frente a bacterias gram-negativas y una buena actividad lítica frente a bacterias gram-positivas. La enzima objeto de la invención tiene una estabilidad en una gama de valor pH desde pH 6 a pH 12, donde en una forma de realización preferida se obtiene una estabilidad de temperatura de 5 días a temperaturas hasta 37ºC. La enzima objeto de la invención se puede emplear ventajosamente para la disgregación de células. Naturalmente se puede prever también un tratamiento enzimático previo de fangos de depuradora mediante la enzima objeto de la invención, por ejemplo, para incrementar la transformación anaerobia en una torre de putrición. De acuerdo con la invención se pudo demostrar que los organismos presentes en el fango activado se podían lisar mediante la enzima objeto de la invención.

En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un microorganismo que forma la enzima lítica objeto de la invención, en particular la segrega en el medio extracelular. El microorganismo objeto de la invención es una bacteria gram-negativa, oxidasa-positiva, en forma de bastoncito, con una forma de vida rigurosamente aerobia. La actividad enzimática de la proteína objeto de la invención se situó sorprendentemente por encima de la de la enzima lítica de las cepas comparativas L. enzimogenes 495 y L. enzimogenes AL1. El microorganismo objeto de la invención puede aprovechar celobiosa y quitina pero no mannosa, xilosa, celulosa o carbometilcelulosa. El microorganismo objeto de la invención ya no puede seguir creciendo en una concentración de cloruro sódico del 7% o superior. Mediante el ensayo OF (ensayo de oxidación - fermentación según Hugh y Leifson, SüBmuth et al., 1987, "Biochemischmikrobiologisches Praktikum"), el organismo objeto de la invención se caracteriza como oxidativo-positivo y fermentativo-negativo, transcurriendo negativamente el ensayo Voges-Proskauer relativo al cambio de metabolismo de glucosa. El organismo objeto de la invención no forma sulfuro indol. El organismo objeto de la invención presenta vertidos deslizantes en forma de colonia en el borde de la colonia, donde incluso colonias más antiguas no presentan estrías ni aparecen solapadas. Después de dos semanas de incubación sobre una placa de medio nutriente se inicia la autólisis. Se puede observar movimiento de deslizamiento del microorganismo en dirección hacia un medio más rico en nutriente. El microorganismo objeto de la invención presenta una forma celular larga y esbelta, con una longitud de hasta 4 \mum, no pudiendo observarse ningún indicio de formación de flagelos. En una forma de realización especialmente referida de la invención la bacteria objeto de la invención presenta una actividad lítica muy buena frente a bacterias gram-positivas tales como Micrococcus luteus y Bacillus subtilis, una buena actividad lítica frente a la levadura Saccharomyces cerevisiae y actividad lítica frente a las bacterias gram-negativas Escherichia coli y Pseudomonas acidovorans. El microorganismo objeto de la invención y los procedimientos de degradación o disgregación se pueden emplear en una realización preferida en fangos activados o fangos pútridos.

En una realización de la invención ventajosa y especialmente preferida se trata, en el caso del organismo objeto de la invención antes citado, de una clase de la especie Lysobacter enzymogenes. En otra forma de realización preferida se trata, en el caso del microorganismo objeto de la invención, en particular de una especie depositada en la DSMZ en Braunschweig, bajo el número de acceso DSM 12887 o una bacteria derivada de ésta.

La presente invención se refiere también a un procedimiento para la preparación de la proteína objeto de la invención que presenta la actividad de una enzima lítica, para lo cual se cultiva un microorganismo objeto de la invención de la clase antes citada, y esto en unas condiciones que permitan la formación de la enzima objeto de la invención y preferentemente su segregación en el medio de cultivo extracelular, y donde se aísla del medio de cultivo la enzima así preparada. El procedimiento objeto de la invención se realiza ventajosamente en una forma de realización especialmente preferida con un valor pH de 5,75 a 10,0, en particular 7,5 a 8,0, muy preferentemente 7,6. En otra forma de realización preferida, el procedimiento objeto de la invención se lleva a cabo a un temperatura de 25 a 30ºC, en particular a 30ºC.

En estas condiciones, el organismo objeto de la invención forma otras dos enzimas líticas, concretamente una metalo-endopeptidasa \beta-lítica de L. enzymogenes con un peso molecular de 19.100 Da, determinado por cromatografía de gel, conocida por Damaglou et al., véase publicación ya indicada. La otra enzima que se forma es una proteasa \beta-lítica desconocida hasta ahora, que presenta un 83% de identidad de la secuencia del aminoácido con la proteasa \alpha-lítica conocida (véase Epstein y Wensink, véase publicación ya indicada) de L. enzymogenes 495, y cuya secuencia del aminoácido está representada parcialmente en la SEQ ID Nº 3. La invención se refiere también a esta proteasa \alpha-lítica y sus variantes y variaciones mutantes así como a las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteasa antes citada, los vectores que la contienen y las células transformadas con ella. Las tres enzimas antes citadas se pueden separar entre sí mediante la usual cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de gel.

La invención por lo tanto se refiere también a la enzima formada mediante el procedimiento objeto de la invención con la secuencia de la SEQ ID Nº 1, 5, 6 y/o 7, así como mezclas de esta enzima con por lo menos una, preferentemente ambas proteasas \alpha- y \beta-líticas antes citadas. Naturalmente quedan también incluidas en la invención las mezclas de por lo menos dos de las tres enzimas antes citadas, donde por lo menos una de las enzimas que participen representa una variante mutante o un derivado de la respectiva proteína de tipo salvaje.

En otra forma de realización preferida, la invención se refiere también a la preparación mediante técnica genética de las enzimas objeto de la invención con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nº 1, 3, 5, 6 y/o 7 o las mezclas que contengan por lo menos una de las otras dos enzimas respectivas, y los medios empleados para ello tales como moléculas de ácido nucleico, los vectores que contienen éstas, las células huésped que contienen éstos así como procedimientos para el cultivo de estas células huésped y para la obtención de enzimas a partir de las células huésped.

Por lo tanto la invención se refiere en una forma de realización preferida por lo menos a una molécula de ácido nucleico aislada, codificando por lo menos una proteína con la actividad de una enzima lítica, en particular por lo menos una de las enzimas antes citadas, elegida del grupo compuesto por

a)

Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína, comprendiendo una o varias secuencias de aminoácidos, elegidas de entre el grupo compuesto por las SEQ ID Nº 1, 3, 4, 6 y 7, o sus secuencias complementarias;

b)

Moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID Nº 2 ó 4, o su secuencia complementaria;

c)

Moléculas de ácido nucleico que están contenidas en el microorganismo depositado en la DSMZ con el Nº DSM 12887, y que hibridizan con la secuencia de a) o b);

d)

Moléculas de ácido nucleico que hibridizan con una de las moléculas de ácido nucleico citadas en a), b) ó c), donde la enzima lítica codificada por estas moléculas de ácido nucleico presenta preferentemente una secuencia de aminoácidos, que es por lo menos en un 90% idéntica a la secuencia del aminoácido indicada en la SEQ ID Nº 1, 3, 5, 6 ó 7; y

e)

Moléculas de ácido nucleico que debido a la degeneración del código genético difieren de la secuencia indicada en a), b), c) o d).

En una forma de realización especialmente preferida de la invención, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN o una molécula de ARN. La molécula de ácido nucleico objeto de la invención puede ser de procedencia natural o sintética y también puede presentar nucleótidos insólitos. La molécula de ácido nucleico objeto de la invención es convenientemente una molécula de ácido nucleico procedente del microorganismo antes citado, especialmente depositado en el DSMZ con el Nº DSM 12887. Mediante técnicas de biología molecular usuales, como las que se describen en Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, NJ, existe la posibilidad de introducir en la molécula de ácido nucleico objeto de la invención diversas clases de mutaciones, con lo cual se produce la síntesis de proteínas con propiedades biológicas eventualmente modificadas. La presente invención por lo tanto se refiere también a variantes, variaciones, derivados o modificaciones de la secuencia de ácido nucleico antes citada, donde esta variante puede consistir en adiciones, supresiones, inversiones o sustituciones de nucleótidos aislados o varios. Naturalmente quedan también incluidos en la invención las variantes o derivatizaciones de los propios nucleóticos. La invención se refiere también a estructuras quiméricas de las secuencias de ácido nucleico objeto de la invención así como de otras secuencias de ácido nucleico, que se fusionan a las secuencias que codifican conforme a la invención, preferentemente en trama de lectura, codificando de esta manera una proteína de fusión o un péptido de fusión. De acuerdo con la invención se incluyen también las mutantes de supresión en las que por supresiones progresivas del extremo 5' o del extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico codificante se producen moléculas de ácido nucleico que dan lugar a la síntesis de proteínas correspondientemente acortadas. Las moléculas de ácido nucleico objeto de la invención se pueden fusionar también para formar moléculas de ácido nucleico cuyos péptidos codificados pueden dar lugar a una determinada conformación, localización y/o a un transporte selectivo en compartimientos o zonas extracelulares del organismo huésped.

En relación con la presente invención se entiende bajo el concepto de hibridización una hibridización en condiciones de hibridización convencionales, preferentemente en condiciones rigurosas como las que se describen en Sambrook et al., véase publicación ya indicada.

Las moléculas de ácido nucleico objeto de la invención pueden servir para la identificación, clonación y aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifiquen enzimas líticas en los organismos más diversos. Como sonda de hibridización de esta clase se pueden emplear por ejemplo moléculas de ácido nucleico que presenten exactamente o principalmente la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID Nº 2 ó 4, o partes de estas secuencias. En cuanto a los fragmentos empleados como sonda de hibridización se puede tratar también de fragmentos sintéticos, que se han preparado mediante técnicas usuales de síntesis y cuya secuencia coincide en lo esencial con la de una molécula de ácido nucleico objeto de la invención. La invención comprende naturalmente también oligonucleótidos, por ejemplo con una longitud mínima de 10, preferentemente 15 y muy preferentemente mínimo 40 nucleótidos, que hibridizan con las moléculas de ácido nucleico objeto de la invención y que se pueden emplear por ejemplo como cebadores para reacciones PCR o como sondas de clonación.

Las moléculas que hibridizan con las moléculas de ácido nucleico objeto de la invención comprenden por lo tanto fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácido nucleico antes descritas, que codifican una proteína conforme a la invención. Se entiende en este caso por fragmentos, partes conformes a la invención de la molécula de ácido nucleico que sean suficientemente largas para codificar una de las proteínas descritas. La expresión, variante alélica, significa a este respecto que las secuencias de esta molécula se diferencian de la molécula de ácido nucleico antes descrita por una o varias posiciones, pero sin embargo siguen teniendo un alto grado de homología con estas secuencias. De acuerdo con la invención se entiende por alto grado de homología una identidad de secuencia mínima del 40%, en particular una identidad mínima del 60%, muy preferentemente superior al 80% y muy especialmente preferente superior al 90%. Naturalmente existe la posibilidad de modificar, mediante métodos de técnica genética, la actividad o el perfil de actividad de la proteína objeto de la invención, por ejemplo la especificidad del substrato, y en particular de mejorarla o incrementarla.

Las proteínas objeto de la invención con la actividad de una enzima lítica presentan en forma de realización preferida una identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido indicada en la SEQ ID Nº 1, 3, 5, 6 y/o 7, mínima del 80%, preferentemente 85%, muy preferentemente superior al 90%, 95%, 97% y 99% a nivel de aminoácido.

En otra forma de realización preferida, la invención se refiere a vectores que contengan las moléculas de ácido nucleico antes citadas. En relación con la presente invención se entiende por vectores los plásmidos, virus, bacteriófagos, cósmidos u otros vectores. En otra forma de realización preferida, la invención prevé que las moléculas de ácido nucleico objeto de la invención estén combinadas en el vector objeto de la invención de forma operativa con elementos reguladores, de tal manera que sea posible la transcripción y síntesis de un ARN trasladable a células pro- y/o eucarióticas. Las moléculas de ácido nucleico objeto de la invención se combinan preferentemente en unidad de transcripción con secuencias de ácido nucleico 5'-reguladoras, que también se designan como promotores, y que permiten una expresión en una célula huésped. De acuerdo con la invención se puede prever en otra forma de realización preferida el empleo de otros elementos reguladores, que estén por ejemplo presentes en la zona 5' y/o en la zona 3' de la molécula de ácido nucleico objeto de la invención que codifica, por ejemplo Enhancer o señales de terminación de la transcripción.

Los vectores de expresión objeto de la invención permiten la preparación de proteínas conforme a la invención en diversos huéspedes, por ejemplo en Escherichia coli.

Los vectores objeto de la invención pueden presentar naturalmente también una o varias unidades funcionales, por ejemplo secuencias, que provoquen la estabilización del vector en el organismo huésped, un origen de replicación bacteriano, un marcador de selección o secuencias similares.

También se puede prever el disponer en un vector diferentes unidades de transcripción y/o diferentes unidades de traslación. Por ejemplo, de acuerdo con la invención está previsto disponer las zonas codificantes para las proteínas objeto de la invención con las secuencias de SED ID Nº 1, 3, 5, 6 y/o 7, eventualmente junto con la secuencia codificante para la metalo-endopeptidasa \beta-lítica, en unidad de transcripción en un vector, donde estas dos o tres secuencias codificadoras están dispuestas respectivamente junto con los correspondientes elementos reguladores unidos operativamente.

En otra forma de realización preferida de la invención, ésta se refiere a las células huésped que contienen de forma transitoria o estable las moléculas de ácido nucleico objeto de la invención o los vectores objeto de la invención.

En relación con la presente invención se entiende por célula huésped un organismo que contenga la molécula de ácido nucleico o los vectores objeto de la invención, y que eventualmente puede sintetizar la proteína codificada por el ácido nucleico objeto de la invención. La invención se refiere en forma preferente a células huésped procarióticas o eucarióticas, por ejemplo Escherichia coli, Lysobacter enzymogenes o levadura. Las células huéspedes objeto de la invención se caracterizan preferentemente por el hecho de que la molécula de ácido nucleico objeto de la invención que ha sido introducida es, o bien heteróloga con respecto a la célula transformada, es decir que de forma natural no aparece en esta célula, o no lo hace en combinación con los elementos reguladores empleados, y/o aparece en otro lugar en el genoma y/o en otro número de copias de forma natural.

La invención se refiere por lo tanto a un procedimiento para la preparación de por lo menos una de las proteínas antes citadas que tenga la actividad de una enzima lítica, donde se cultiva una célula huésped de la clase antes citada en condiciones que permitan la formación de por lo menos una de las proteínas objeto de la invención, y se aísle del medio de cultivo la proteína o mezcla de proteína formada. La presente invención se refiere por tanto también a proteínas o mezclas de proteínas obtenidas de acuerdo con este procedimiento.

La transformación de un organismo huésped con la molécula de ácido nucleico objeto de la invención se puede realizar empleando métodos usuales, tal como se describen por ejemplo en Sambrook et al., véase publicación ya indicada.

La invención también se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales que reaccionan específicamente con una de las proteínas objeto de la invención, en particular que la reconocen y fijan.

Por último, la invención se refiere también a procedimientos para la disgregación de material biológico, en particular células o macromoléculas, para lo cual se incuba una bacteria conforme a la invención y/o una proteína o mezcla de proteínas conforme a la invención, de la clase antes citada, con el material biológico que se trata de disgregar, en particular las células, y se disgrega el material biológico. Existe naturalmente también la posibilidad de reforzar la disgregación de células descrita mediante otras medidas del procedimiento, por ejemplo mediante el empleo de agentes químicos y/o de campos eléctricos.

La invención se refiere también a un procedimiento para la degradación de fangos de depuradora, para lo cual se añaden bacterias y/o proteínas o mezclas de proteínas de la presente invención a los fangos de depuradora, y se incuban. Esta clase de tratamiento enzimático previo de los fangos de depuradora mejora la transformación anaerobia, por ejemplo en una torre de putrición, ya que los organismos del fango activado se lisan. De acuerdo con la invención se puede prever también el empleo de microorganismos conforme a la invención en procedimientos para el tratamiento de superficies con contaminación microbiana, por ejemplo productos alimenticios o sustancias para la construcción, con el objetivo de liberarlas de microorganismos indeseables. Con los microorganismos objeto de la invención se pueden además transformar residuos de fermentación, en particular se pueden degradar, por ejemplo, sustancias en forma de partículas pasando a sustancias solubles. Por último, el microorganismo objeto de la invención se puede emplear en procedimientos de disgregación de células, por ejemplo para aplicaciones bioquímicas o similares.

La enzima líquida también se puede emplear como aditivo en detergentes, especialmente para matar bacterias en la gama de temperaturas inferior a 40ºC.

En la medida en que se empleen bacterias para la disgregación de material biológico, se prefieren temperaturas de 25 a 30ºC, preferentemente 30ºC, así como valores pH entre 5,75 y 10,0, preferentemente 7,7.

En el caso de que se emplee la enzima objeto de la invención con la secuencia de SEQ ID Nº 1, 5, 6 y/o 7, se preferirá un valor pH de 5,0 a 12,5, preferentemente de 9,0 a 10,0 y una gama de temperaturas de 30 a 40ºC, preferentemente 37ºC.

La invención se describe con mayor detalle sirviéndose de los ejemplos de realización y de las figuras correspondientes.

Las figuras muestran:

Figura 1 una curva de crecimiento del organismo objeto de la invención así como una representación gráfica de su actividad autolítica,

Figura 2 y 3 una representación gráfica del desarrollo del número de células en el caso de incubación conjunta del organismo objeto de la invención y M. luteus, E. coli o S. cerevisiae en agua (figura 2) y en un medio (figura 3),

Figura 4 los resultados de una cromatografía monoQ de una fermentación con los microorganismos objeto de la invención en el medio,

Figura 5 en forma gráfica, las actividades de la enzima objeto de la invención (de cromatografía monoQ) frente a células M. luteus y Lysobacter,

Figura 6 los resultados de una filtración de gel (fracciones 24 y 25),

Figura 7 en forma gráfica, las actividades de la enzima objeto de la invención (procedente de la filtración de gel), frente a células M. luteus y Lysobacter,

Figura 8 granjas de lisis sobre fango activado, del microorganismo objeto de la invención en contraste con las dos cepas comparativas L. enzymogenes 495 y L. enzymogenes AL1,

Figura 9 los resultados de la filtración de gel (fracciones 21 y 22), y

Figura 10 en forma gráfica, las actividades de la enzima con actividad \alpha-lítica frente a células M. luteus y Lysobacter.

Los protocolos de secuencia que figuran a continuación forman parte de la presente doctrina.

SEQ ID Nº 1: 39 aminoácidos de la zona N-terminal de la enzima hallada procedente del microorganismo objeto de la invención.

SEQ ID Nº 2: la secuencia de ácido nucleico derivada de la SEQ ID Nº 1,

SEQ ID Nº 3: 18 aminoácidos de la zona N-terminal de una proteasa \alpha-lítica procedente del microorganismo objeto de la invención,

SEQ ID Nº 4: la secuencia de ácido nucleico derivada de la SEQ ID Nº 3,

SEQ ID Nº 5: 5 aminoácidos de la enzima hallada procedente del microorganismo objeto de la invención,

SEQ ID Nº 6: 7 aminoácidos de la enzima hallada procedente del microorganismo objeto de la invención,

SEQ ID Nº 7: 4 aminoácidos de la enzima hallada procedente del microorganismo objeto de la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento del microorganismo

Se efectuó una selección por organismos, que forman enzimas líticas extracelulares. La selección se realizó de la forma siguiente:

La selección se realizó mediante cápsulas de Petri, que presentan respectivamente tres campos independientes entre sí. En una primera fase de selección se cargaron los tres campos de la cápsula de Petri con células de Micrococcus-luteus pasadas por autoclave, células de Saccharomyces-cerevisiae pasadas por autoclave y células de Escherichia coli pasadas por autoclave, como nutriente. Las cepas de microorganismos que se trataba de investigar se inocularon respectivamente sobre cada uno de los campos antes descritos y se dejaron crecer. Para los siguientes pasos de selección descritos a continuación se emplearon respectivamente sólo aquellas cepas que presentaban buena actividad lítica con el nutriente indicado del paso de selección anterior.

En el segundo paso de selección se emplearon cápsulas de Petri con células vivas de Micrococcus-luteus, células vivas de Saccharomyces-cerevisiae y células vivas de Escherichia coli. En un tercer paso de selección, se empleó fango de depuradora no pasado por autoclave (ciclo 2º nivel de putrición), células vivas de Saccharomyces-cerevisiae y leche descremada, mientras que en el 4º paso de selección se emplearon fangos de depuradora pasados por autoclave (ciclo 2º nivel de putrición), fango de depuradora no pasado por autoclave (ciclo 1º nivel de putrición), y fango de depuradora pasado por autoclave (ciclo 1º nivel de putrición). Una vez completados estos cuatro pasos de selección, se separaron ocho elementos aislados de alta actividad lítica, y se siguió empleando el elemento aislado de mayor actividad
lítica.

Se pudo aislar una cepa especialmente activa con la designación cepa 752, que procede de un campo de pasto de ovejas en la Selva Negra. Este elemento aislado mostró frente a las dos bacterias gram-positivas que se ensayaron, Micrococcus luteus y Bacillus subtilis, una excelente actividad lítica, y frente a la levadura Saccharomyces-cerevisiae buena actividad lítica y también frente a las bacterias gram-negativas, Escherichia coli y Pseudomonas acidovorans. El organismo apareció en dos formas de colonias diferentes, concretamente una colonia blanca con crecimiento mucilaginoso sobre agar de leche descremada, formándose granjas de lisis, así como una colonia de color amarillento, que también mostró un crecimiento deslizante, si bien este crecimiento no era mucilaginoso. En este último caso no se pudo observar la formación de granjas de lisis sobre bacterias de nutrientes. Las investigaciones morfológicas y las fisiológicas metabólicas mostraron que se trataba de una bacteria gram-negativa, oxidasa positiva, en forma de bastoncito, que tiene una vida rigurosamente aerobia. Se pueden aprovechar celobiosa, quitina, glucosa, maltosa, malato y \beta-hidroxibutirato, pero no mannosa, xilosa, carboximetilcelulosa, celulosa, arabinosa o L-histidina. Igualmente se pudo observar la capacidad de hidrólisis de gelatina, ADN, Tween® 80 y esculina. El organismo es además catalasa-positivo, ureasa negativo y ADH negativo. Se lisa mediante KOH al 3%. En el caso de concentraciones de cloruro sódico iguales o superiores al 7%, la cepa que se ha aislado no puede crecer. El ensayo OF mostró un metabolismo oxidativo-positivo y fermentativo-negativo, mientras que el ensayo de Voges-Proskauer para el metabolismo de glucosa fue negativo. El organismo no formó ni sulfuro ni indol. Se pudo observar una hidrólisis muy intensa de caseína, y el ensayo del citrato (ensayo de agar) y la hemolisis de sangre de oveja fueron positivos.

Las investigaciones morfológicas mostraron que se trata de una bacteria en forma de bastoncito, con una anchura de 0,5 a 0,7 \mum y una longitud de 1,5 a 4,0 \mum. Se pudieron observar ramificaciones deslizantes en el borde de la colonia, pero las colonias más antiguas no mostraron ni surcos ni aparecieron solapadas. Después de dos semanas de incubación se inicia la autólisis sobre la placa del medio; se pudo observar un movimiento de deslizamiento en dirección hacia el medio más rico en nutriente. El organismo que se ha aislado aparece en forma de colonias blancas y amarillas, y no hay ningún indicio de formación de flagelos o formación de esporas. La secuenciación parcial del 16S ADNr muestra una coincidencia cien por cien con la de Lysobacter enzymogenes. Se trata por lo tanto probablemente de una subespecie de Lysobacter enzymogenes, pero que presenta sin embargo especialmente diferencias macroscópicas respecto a las especies Lysobacter enzymogenes 495 (ATCC 29487) y Lysobacter enzymogenes AL1 (ATCC 27796), o bien un microorganismo funcional o morfológicamente semejante a esta especie.

El microorganismo que se aisló se depositó en el DSMZ el 22 de junio de 1999 en Braunschweig, Alemania, con el Nº DSM 12887.

Ejemplo 2 Condiciones de fermentación

El organismo se deja crecer sobre medio PC (5,0 g de caseinpeptona, 2,5 g de extracto de levadura, agua destilada hasta 1.000 ml, pH 7,7. Añadiendo 5,0 g de glucosa se puede incrementar el número máximo de células vivas alcanzado, aumentando la formación de enzima aproximadamente en un 15%. La enzima que se ha formado es autolítica y es inducida por el propio organismo.

El elemento aislado del microorganismo pasa al cabo de una fase de retardo de unas 8 horas a una fase de crecimiento de 9 horas, con tasas de crecimiento de 0,15 h^{-1}. Después de una fase estacionaria con una duración máxima de 30 minutos comienza la fase de autólisis, y después de otros 7 días de tiempo de fermentación ya no se puede comprobar en el reactor ninguna célula viva (figura 1). Al comienzo de la fase autolítica, el valor pH sube a unos valores superiores a pH 8. Si se controla desde el exterior el valor pH bajándolo a valores inferiores a pH 8, no se observa lisis, y el número de células así como la actividad enzimática se mantiene constante a lo largo de los días. Añadiendo fosfato se puede acelerar la autólisis del organismo.

La cepa que ha sido aislada muestra un crecimiento óptimo para un valor pH de 7,7, estando capacitada la cepa aislada para reducir el valor pH al comienzo del crecimiento a un valor pH 7,7, o a elevarlo si el valor pH existente difiere del óptimo. Por lo tanto la tolerancia del pH está entre los valores de pH 5,75 y pH 10,0.

La temperatura de crecimiento más conveniente para la cepa aislada está en unas temperaturas de 25 a 30ºC, con un valor óptimo en 30ºC, habiéndose podido observar en la cepa aislada que incluso a 33ºC se limita notablemente el crecimiento, y a partir de 40ºC deja de haber crecimiento. El organismo hallado es por lo tanto inocuo para el hombre debido a esta sensibilidad a las temperaturas.

Para alcanzar un rendimiento enzimático máximo resulta especialmente ventajosa la fermentación en el reactor de paletas de hélice. Naturalmente existe también la posibilidad de formar enzimas en el reactor de caldera con agitador. La actividad autolítica máxima se obtuvo con una aportación de potencia de 1,1 kW/m^{3} con una tasa de gasificación de 2 litros aire/min. en el reactor de paletas de hélice. Una aportación menor de potencia se puede compensar con una aportación mayor de aire, que a su vez contribuye no sólo a un mejor abastecimiento de oxígeno sino también a mejorar el mezclado.

Ejemplo 3 Investigaciones relativas a la actividad lítica de la cepa de bacterias aislada

Se realizaron las siguientes investigaciones relativas a la actividad lítica mediante la bacteria aislada.

Las investigaciones se realizaron con organismos nutrientes frescos y térmicamente inactivados, tanto en agua como en un medio PC a 30ºC, en el matraz agitador con chicanas.

La actividad de la enzima se determinó por procedimiento fotométrico, como disminución porcentual del enturbiamiento causado por las bacterias lisadas, a 500 nm.

Las investigaciones mostraron que las bacterias gram-positivas inactivadas térmicamente con una densidad de células de 10^{10} KBE/ml (unidades que forman colonia) se pudieron lisar totalmente en 24 horas. Las células B. subtilis vivas con la misma densidad se disolvieron en aproximadamente 30 horas, mientras que las células vivas M. luteus se disolvieron en 60 horas. La velocidad de lisis se pudo reducir a pocas horas si la cepa objeto de la invención estaba acondicionada, es decir si antes del inicio de la investigación ya estaba líticamente activa. Por lo tanto, si después de una lisis ya efectuada se añadían otras bacterias frescas para lisar que no tuvieran tratamiento previo, se pudieron obtener unos tiempos de lisis notablemente más reducidos. Esto puede deberse a que debido al acondicionamiento ya se habían formado las enzimas líticas necesarias y su efecto podía iniciarse inmediatamente.

Para la lisis de bacterias gram-positivas térmicamente inactivadas no constituye ninguna diferencia si las bacterias que se trata de lisar se habían recogido en agua bidestilada, en agua del grifo o en el medio íntegro. En cambio el medio ejerció una influencia considerable en la autólisis de la cepa objeto de la invención propiamente dicha. Si las bacterias se recogían en agua potable, la autólisis no se inició hasta al cabo de varias semanas, mientras que en el medio completo ya se pudo observar autólisis incluso al cabo de tan sólo 20 horas de fermentación (figura 2 y 3).

Sin estar limitados por la teoría, cabe imaginar que la presencia de ácidos grasos tenga importancia para la eficacia lítica, especialmente frente a bacterias gram-negativas. Los ácidos grasos no ramificados muestran mayor influencia sobre la eficacia lítica que los ramificados. Posiblemente los ácidos grasos incrementan la permeabilidad de las paredes de las células de las bacterias que se tratan de lisar, con lo cual se facilita el ataque de las proteasas. En las investigaciones con bacterias para lisar lavadas en agua sin presencia de ácidos grasos se pudo observar que no se podía realizar ninguna lisis de bacterias gram-negativas y ninguna autolisis. La comparación de los momentos de disminución del número de células de las diversas bacterias para lisar, muestra, tal como se ve en las figuras 2 y 3, que las bacterias gram-positivas se lisan durante la fase de crecimiento de la especie objeto de la invención, mientras que la disminución de las células E. coli se observa durante la fase autolítica de la especie objeto de la invención. La lisis de las células de levadura tiene lugar a lo largo de 9 días.

Ejemplo 4 Caracterización de la enzima formada mediante la SEQ ID Nº 1

Las investigaciones siguientes se realizaron con extracto bruto reconcentrado. Para obtener el extracto bruto se terminó la fermentación con la cepa nueva hallada en medio PC después de 40 horas, ya que en este momento es cuando se encontraba presente la máxima concentración de enzimas (véase la figura 1). Las células se separaron en una centrifugadora Beckman (J2-21M/E, Beckman, Munich) a 15.000 g y a continuación se filtro estérilmente el residuo mediante un módulo de fibras huecas de 0,2 \mum (Firma Microdyn, Wuppertal). El extracto exento de células se reconcentró a través de una membrana de ultrafiltración 5 kD (Firma Sartorius, Göttingen) desde 16 l a 100 ml. Para las investigaciones de estabilidad, el extracto bruto se diluyó 1/20 con tampón 50 mM Tris-HCl.

La determinación del óptimo de valor pH se realizó respectivamente en 20 mM de tampón de citrato (pH 4,0 a 6,5), tris-HCl (pH 7,0 a 9,5) y tris-NaOH (pH 10,0 a 13,0) a lo largo de 5 días.

El valor óptimo del pH está en 9,0 a 10,0, pudiéndose observar todavía una actividad superior al 50% para valores pH de 5,0 a 12,5, y una actividad superior al 10% para un valor pH de 4,5 a 13,0. La pérdida de actividad en entorno ácido es reversible y se puede compensar mediante un retamponado.

En la enzima que se aisló se determinó una temperatura óptima de 37ºC. A esta temperatura, las enzimas se mantienen estables incluso a lo largo de varios días. A 55ºC la actividad es ligeramente inferior para una incubación de 1 hora, y después de una incubación de 1 día sin embargo solamente alcanza ya el 20% de la actividad original.

La actividad de la enzima solamente se redujo para una concentración de cloruro sódico o KCl superior a 100 mM, y para una concentración de sal 1 M había disminuido a la mitad.

La enzima se inactiva mediante una proteasa de B. licheniformis. El fenilmetilsulfonil-fluoruro (PMSF), un inhibidor de las serina-proteasas, no influye en la actividad autolítica. En condiciones anaerobias, desciende la actividad lítica frente a bacterias gram-negativas.

Ejemplo 5 Aislamiento de la enzima lítica mediante la SEQ ID Nº 1

Una representación pura de la enzima lítica se realizó de la forma siguiente.

Mediante el extracto bruto reconcentrado en el ejemplo 4 se efectuó primeramente una cromatografía de intercambio de iones mediante una FPLC (Fast Protein Liquid Chromatographie, Firma Pharmacia, Freiburg) a 40ºC. Para ello se empleó una columna monoQ HR10/10 que representa un intercambiador de aniones fuerte, y que presenta un tamaño de partículas de 10 \mum y grupos combinantes -CH_{2}-N-(CH_{3})_{3}. Como eluyente A se empleó 50 mM Tris-HCl (pH 9,0). El eluyente B fue 50 mM Tris-HCl con 1,0 M NaCl (pH 9,0). Los tamaños de fracción fueron de 1 ml. El programa de separación se deducirá de las tablas siguientes.

Programas de separación para la cromatografía de intercambio de iones

min.	Concentración eluyente B	Velocidad de flujo
0 – 2	0%	1,0 ml/min
2 – 14	0 - 30%	1,0 ml/min
14 – 24	30 - 100%	1,0 ml/min
24 – 27	100%	1,0 ml/min
27 – 50	100 - 0%	1,0 ml/min
30 – 35	0%	1,0 ml/min

Sobre la columna se aplicaron 2 ml del extracto bruto diluido 1/3 en tampón Tris-HCl, que se había obtenido, tal como ya se ha mencionado, mediante reconcentración por medio de ultrafiltración de una fermentación del microorganismo objeto de la invención en medio íntegro.

La figura 4 muestra una típica cromatografía monoQ de una muestra de una fermentación con la cepa hallada en el medio PC, es decir una muestra de extracto bruto reconcentrado según el ejemplo 4. La figura 5 muestra las actividades enzimáticas de las distintas fracciones obtenidas frente a M. luteus y Lysobacter. Las fracciones 24 y 25, que mostraron intensa actividad autolítica, es decir actividad frente a bacterias gram-negativas y escasa actividad frente a bacterias gram-positivas (figura 5), se reunieron para una cromatografía de gel.

Para la filtración del gel se empleó una columna Superose 12 HR 10/30 (Firma Pharmacia Freiburg), instalada en el sistema Smart (HPLC, LKB \mu Separation Unit, de Pharmacia).

El material de la columna era Dextran con 12% de agarosa de reticulación transversal y tamaños de partícula de 13 a 15 \mum. La filtración se realizó a 4ºC, siendo el volumen de aplicación de la muestra de 1 ml, el volumen de la fracción de 250 \mul y la velocidad de paso de 0,4 ml/min. La extinción se midió a 214 nm, 256 nm y 280 nm. Como eluyente se empleó un tampón 150 mM de dicarbonato de hidrógeno y amonio, con un valor pH de 8,5. Como patrones se emplearon ferritina, catalasa, BSA, citocromo C y vitamina B_{12}.

La figura 6 muestra el resultado de una filtración de gel mediante una columna de Superose 12 de las fracciones 24 y 25 de la cromatografía de intercambio de iones antes citada (compárese con la figura 4).

La figura 7 muestra las actividades enzimáticas de las fracciones obtenidas frente a células M. luteus y Lysobacter, en las distintas fracciones de las filtraciones de gel representadas en la figura 6 (muestra empleada: fracciones 24 y 25 de la cromatografía de intercambio de iones).

En las fracciones 28 a 32 se pudo observar una actividad claramente superior a la de las fracciones restantes, que presentaban como máximo una actividad de lisis del 12%. En las fracciones 29, 30 y 31, la actividad autolítica fue respectivamente del 65%. Estos volúmenes de muestra equivalen a un tamaño de molécula de aproximadamente 15.000 a 20.000 Da. Por lo tanto se reunieron y se aplicaron las enzimas sobre una membrana PVDF (ProBlot, de PE Biosystems).

Ejemplo 6 Secuenciación del aminoácido

Para determinar la secuencia de proteínas se utilizó el Sequenzator 473 A (de Applied Biosystems), que determina la secuencia del aminoácido mediante la degradación Edman. Los ciclos y los productos químicos se utilizaron siguiendo las instrucciones de los fabricantes.

La enzima lítica estuvo presente en una concentración elevada, de manera que mediante la degradación Edman se pudieron secuenciar las secuencias de aminoácido N-terminales. Para esto se procedió con enzimas depuradas mediante monoQ y Superose 12. La secuencia determinada de 39 aminoácidos está representada en la SEQ ID Nº 1. El aminoácido no determinado de la posición 11 es probablemente Cys, ya que el secuenciador no reconoce Cys. Otras secuencias de aminoácidos de esta enzima están representadas en las SEQ ID Nº 5, 6 y 7. Estas secuencias de aminoácidos proceden del ámbito interno de la enzima. En la posición 2 de la SEQ ID Nº 5 se encuentra probablemente un F (Phe) o D (Asp) y en la posición 3 de la SEQ ID Nº 6, un E (Glu) o C (Cys).

La secuencia que se determinó se comparó con secuencias de proteína conocidas hasta la fecha, no encontrándose ninguna homología con proteínas conocidas hasta ahora, como por ejemplo Lysobacter. Mediante la secuencia de aminoácido determinada de la SEQ ID Nº 1 y de la secuencia de nucleótidos derivadas de ésta (SEQ ID Nº 2) existe la posibilidad de emplear una sonda de nucleóticos mediante la cual se puede clonar el gen completo para la proteína hallada, que se puede utilizar para la preparación de la proteína siguiendo técnicas genéticas.

La depuración e identificación de la nueva proteína se repitió y confirmó a intervalos de varios meses, a partir de diferentes fermentaciones. La mayor coincidencia en la secuencia del aminoácido se pudo comprobar con un 39% respecto a una peptidil-lis-metaloendopeptidasa de Pleurotus ostreatus, en un fragmento de 31 aminoácidos. Las enzimas de la familia metaloendopeptidasa se caracterizan por una elevada estabilidad de temperatura, la resistencia frente a los agentes desnaturalizadores y una actividad a lo largo de una amplia gama de pH, lo que coincide con las indicaciones relativas a la presente enzima.

Ejemplo 7 Determinación del peso molecular

La determinación del peso molecular mediante MALDI TOF se efectuó mediante una matriz de ácido sinapínico al vacío. Se añadieron 2 \mul de ácido sinapínico a 1 \mul de solución de proteína.

Los parámetros fueron los siguientes:

Campo de masa:	100.000 Da	Ion Optics:	28,0/7,0 kV
Filtro de masa	5.000 Da	Detector:	-4,75 kV
Intervalos de datos:	4,0 nsec	Digitalizador:	1.000 mVFS
Polaridad:	Positiva	Filtro:	ninguno

La enzima lítica depurada y secuenciada de la presente especie Lysobacter enzymogenes presenta según la determinación MALDI TOF un peso molecular de 18.538 Da.

Ejemplo 8 Aplicación para disgregación de células

La enzima formada conforme a la invención presenta una actividad lítica muy intensa frente a bacterias gram-negativas y buena actividad lítica frente a bacterias gram-positivas. La enzima se puede emplear para la disgregación de células, por ejemplo también para el tratamiento enzimático previo de fangos de depuradora para incrementar la conversión anaerobia, por ejemplo en una torre de putrición. Las investigaciones realizadas con fango activado muestran que los organismos del fango activado se lisan, tal como está representado en la figura 8.

La figura 8 muestra con detalle las granjas de lisis sobre fango activado de la cepa aislada conforme a la invención (abajo en el centro) (DSM 12887), a diferencia de las dos cepas comparativas L. enzymogenes 495 (arriba a la izquierda) (DSM 2043) y L. enzymogenes AL1 (arriba a la derecha) (DSM 1895).

Ejemplo 9 Identificación, aislamiento y secuenciación del aminoácido de una proteasa \alpha-lítica (SEQ ID Nº 3) de la cepa objeto de la invención

Mediante el extracto bruto obtenido en el ejemplo 4 por reconcentración mediante ultrafiltración desde una fermentación de la cepa de nuevo hallazgo en medio íntegro, diluida, se efectuó una cromatografía de intercambio de iones tal como está descrita en el ejemplo 5. La cromatografía de intercambio de iones se realizó con 2 ml del extracto bruto diluido 1/3 en tampón, que procedía de una fermentación terminada al cabo de 40 horas de la cepa objeto de la invención en medio íntegro sin adición de bacterias nutrientes, de manera que la enzima lítica estuvo presente en máxima concentración.

La figura 4 muestra una típica cromatografía monoQ de una muestra de una fermentación con Lysobacter en medio PC, donde en la figura 5 están representadas las actividades enzimáticas frente a células M. luteus y Lysobacter, en las fracciones de la cromatografía monoQ representada en la figura 4.

Mediante la cromatografía de intercambio de iones se pudo conseguir una buena depuración. Las fracciones 21 y 22, con una actividad lítica comparativamente alta frente a bacterias gram-positivas de la figura 4, se reunieron y se depuraron a través de una columna de Superose 12. La actividad lítica frente a L. enzymogenos fue en todas las fracciones mayor que frente a M. luteus.

La figura 9 muestra el resultado de una filtración de gel con una columna Superose 12 por las fracciones 21 y 22 de la cromatografía de intercambio de iones antes citada.

La figura 10 muestra actividades enzimáticas frente a células M. luteus y Lysobacter en las fracciones de la filtración de gel representada en la figura 9.

La secuencia de los aminoácidos se determinó mediante un secuenciador automático mediante degradación Edman, pudiendo identificarse los N terminales de 18 aminoácidos. La muestra no se alquilizó antes de la secuenciación, por lo que no se pudo reconocer una cisteína. La posición de aminoácido 17 que no se identificó podría por lo tanto ser cisteína. Existe un alto nivel de homología secuencial del 83% con respecto a la proteasa \alpha-lítica de Lysobacter encymogenes (Epstein y Wensik, J. of Biol. Chem., 263 (32) (1988), 16586-16590). La secuencia de aminoácidos de la enzima \alpha-lítica presente se muestra en la SEQ ID Nº 3, y la secuencia de ácido nucleico derivada de aquella en la SEQ ID Nº 4. Esta última se puede emplear para aislar el gen completo.

<110> Fraunhofer-Ges. zur Förderung der angewandten Forschung e.V.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Enzima lítica de Lysobacter enzymogenes

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 23395

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\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 19929485.2-41 (DE)

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<151> 1999-06-28

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Lysobacter enzymogenes

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Val Pro Asn Gly Val Asn Tyr Val Gly Xaa Thr Ser Ala Arg Thr}

\sac{Ser Xaa Ala Gly Gln Ala Val Xaa Gln Ala Arg Xaa Tyr Xaa Glu Asn}

\sac{Ala Lys Gly Tyr Leu Asn Gly}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Lysobacter enzymogenes

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcngtncana ayggngtnaa ytaygtnggn nnnacntcng cnmgnacntc nnnngcnggn

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cangcngtnn nncargcncg nnnntaynnn garaargcna arggntayyt naayggn

\hfill

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Lysobacter enzymogenes

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asn Ile Val Gly Leu Ile Glu Tyr Ser Ile Asn Asn Ala Ser Leu}

\sac{Xaa Ser}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Lysobacter enzymogenes

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcnaanatng tnggnctnat ngantannnn atnaanaang cnnnnctn

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

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<212> PRT

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<213> Lysobacter enzymogenes

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PÉPTIDOS

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<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe o Asp

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Xaa Trp Asn Ala}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

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<213> Lysobacter enzymogenes

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> PEPTIDE

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<222> (3)

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<223> Xaa es Glu o Cys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\sa{Phe Ala Xaa Asn Thr Pro Phe}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Lysobacter enzymogenes

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Thr Thr Trp}

Claims (14)

1. \global\parskip0.920000\baselineskip

   1. Proteína que presenta la actividad de una enzima lítica y que está en condiciones de disociar la pared de la célula o las sustancias que componen ésta, elegida del grupo compuesto de

   a)

   una proteína de Lysobacter enzymogenes, que comprende las secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID Nº 1, 5, 6 y 7,

   b)

   una proteína con una secuencia de aminoácido que es por lo menos un 90% idéntica con las secuencias de aminoácidos representadas en las SEQ ID Nº 1, 5, 6 y 7,

   c)

   un derivado de la proteína citada en a) y b) que se caracteriza por modificaciones químicas de uno o varios aminoácidos.

2. 2. Proteína según la reivindicación 1, donde la proteína presenta un peso molecular determinado mediante cromatografía HPLC de 15.000 a 20.000 Da, un valor óptimo de temperatura de 37ºC y un valor óptimo de pH de 9,0 a 10,0.
3. 3. Mezcla de por lo menos dos proteínas que presentan respectivamente la actividad de enzimas líticas y que están en condiciones de disociar la pared de la célula o las sustancias que componen ésta, donde se elige una proteína de una de las reivindicaciones 1 ó 2 y por lo menos una proteína más del grupo compuesto por la metalo-endopeptidasa \beta-lítica del Lysobacter enzymogenes y una proteasa \alpha-lítica del Lysobacter enzymogenes, con una secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID Nº 3 o una variante mutante o un derivado de ésta.
4. 4. Bacteria con la facultad de formar y/o segregar una enzima lítica según una de las reivindicaciones 1 ó 2, en particular depositada en el DSMZ con el Nº DSM 12887.
5. 5. Molécula de ácido nucleico que codifica una enzima lítica según una de las reivindicaciones 1 ó 2, comprendiendo una secuencia de ácido nucleico, elegida del grupo compuesto de

   a)

   una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido según las SEQ ID Nº 1, 5, 6 y/o 7, o su secuencia complementaria,

   b)

   una secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID Nº 2 o su secuencia complementaria,

   c)

   una secuencia de ácido nucleico que hibridiza con una de las secuencias según a) o b), o su secuencia complementaria, y

   d)

   una secuencia de ácido nucleico que debido a la degeneración del código genético difiere de la secuencia en a), b) o c).

6. 6. Vector, conteniendo una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5.
7. 7. Vector según la reivindicación 6, donde la molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente con elementos reguladores que aseguran la transcripción y síntesis de un ARN trasladable en células pro-y/o eucarióticas.
8. 8. Célula huésped, conteniendo un vector, según una de las reivindicaciones 6 ó 7.
9. 9. Procedimiento para la preparación de una proteína que presenta la actividad de una enzima lítica y está en condiciones de disociar la pared de la célula o las sustancias que constituyen ésta, en particular una proteína según una de las reivindicaciones 1 ó 2, donde se cultiva una célula huésped según la reivindicación 8 en unas condiciones que permiten la síntesis de la proteína y se aísla la proteína de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.
10. 10. Procedimiento para la preparación de una proteína que presenta la actividad de una enzima lítica y que está en condiciones de disociar la pared de la célula o las sustancias que constituyen ésta, en particular una proteína según una de las reivindicaciones 1 ó 2, donde se cultiva una bacteria según la reivindicación 4 en unas condiciones que permiten la síntesis de la proteína y se aísla la proteína de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.
11. 11. Proteína preparada según uno de los procedimientos de las reivindicaciones 9 ó 10.
12. 12. Anticuerpo, que reconoce y fija específicamente una proteína según una de las reivindicaciones 1, 2 u 11.
13. 13. Procedimiento para la disgregación de material biológico, en particular de células o macromoléculas, donde al material biológico que se trata de disgregar se le añade una bacteria según la reivindicación 4, una proteína según una de las reivindicaciones 1, 2 u 11 o/y una mezcla de proteínas según la reivindicación 3, y se incuba en condiciones que permiten la disgregación del material biológico.
14. 14. Utilización de una proteína según una de las reivindicaciones 1, 2 u 11 para el tratamiento enzimático previo de fangos de depuradora.