ES2231601T3 - Metodo para la seleccion de reactivos y componentes en fase solida en ensayos de union especifica libres de productos finales de glicosilacion avanzados. - Google Patents

Abstract

Método para la selección y/o control de calidad de un reactivo o un componente recubierto de fase sólida para utilizarlos en un ensayo para la detección o medida de un producto final de glicosilación avanzado (AGE) utilizando como mínimo un compañero de unión AGE, caracterizados en que, tanto el mencionado reactivo como el mencionado componente de fase sólida son sometidos a test sobre su contenido en AGE y siendo tal reactivo o componente recubierto de fase sólida solamente seleccionado de forma que no reaccione con el compañero de unión AGE utilizado para realizar el ensayo.

Description

Método para la selección de reactivos y componentes en fase sólida en ensayos de unión específica libres de productos finales de glicosilación avanzados.

La presente invención se refiere al campo de la detección y medición de los productos finales de glicosilación avanzados (AGEs), en particular a métodos de selección y/o control de calidad de reactivos o componentes de fase sólida cubiertos apropiados para los ensayos AGE.

Reduciendo los azúcares, por ejemplo, glucosa o grupos carbonilo, se ha demostrado que no reaccionan enzimáticamente con los grupos amino de proteínas para formar unas series diversas de fracciones unidas a proteínas a menudo con propiedades de unión cruzada y fluorescencia. Estos compuestos, llamados productos finales de glicación avanzados o de glicosilación avanzados ("AGEs"), han estado implicados en la alternancia funcional y estructural de las proteínas durante el envejecimiento y en ciertas enfermedades, por ejemplo, en la diabetes a largo término. Varias AGEs se han identificado en la base de síntesis de novo y procedimientos de aislamiento de tejidos.

En un primer paso, la glucosa y otros azúcares reductores se unen de una forma no enzimática a los grupos amino de proteínas de un modo dependiente de la concentración. Durante este periodo, estos aductos Amadori iniciales pueden experimentar reacciones secundarias subyacentes del tipo redisposiciones, deshidrataciones y unión cruzada con otros grupos de proteínas para acumularse como una familia de estructuras complejas referidas como AGEs.

El progreso sustancial ha sido dirigido hacia la elucidación de los papeles biológico y clínico significativos de productos finales de glicosilación avanzados. El conocimiento aceptado generalmente ahora que muchas de las condiciones hasta ahora atribuidas al proceso de envejecimiento o a los efectos patológicos de las enfermedades tales como diabetes, son atribuibles al menos en parte a la formación, acumulación y/o actividad de AGEs in vivo.

Debido a que estas reacciones secundarias aparecen lentamente, las proteínas pueden acumular cantidades significativas de productos Amadori antes de acumular una cantidad medible de AGEs in vivo. Estos AGEs pueden modificar receptores, todos los otros constituyentes de membrana o la actividad enzimática. Éstos pueden causar unión cruzada a proteínas, que a su vez puede reducir la integridad estructural y/o funcional de órganos o partes de órganos, así por último reduciendo o deteriorando la función de los órganos.

El procedimiento de glicosilación avanzado es particularmente notorio en que éste particularmente ocasiona proteínas con largas vidas medias, tales como colágeno bajo condiciones de concentración de azúcar relativamente elevada, tal como en la diabetes mellitus. Numerosos estudios han sugerido que AGEs desarrolla un papel importante en la alteración estructural y funcional que ocurre en las proteínas durante el envejecimiento y la enfermedad crónica.

La reacción no enzimática entre la glucosa y los grupos amino libres en las proteínas lleva a un amino estable, el aducto 1-desoxi cetosil, conocido como el producto Amadori. Este, por ejemplo, se ha visto que aparece con la hemoglobina, en donde una redisposición del amino terminal de la cadena de hemoglobina mediante reacción con la glucosa forma un aducto y proporciona un producto conocido como hemoglobina A_{1c}. También se ha visto que ocurren reacciones similares con una variedad de otras proteínas corporales, tales como cristalino, colágeno y proteínas del nervio (ver Bunn, H. F., et al., Biochem Biophys Res Commun (1975) 103-9; Koenig, R. J., et al., J Biol Chem (1977) 2992-7; Monnier and Cerami, Maillard Reaction in Food and Nutrition, ed. Waller, G. A., American Chemical Society (1983) 431-448; and Monnier and Cerami, Clinics in Endocrinology and Metabolism 11 (1982) 431-452).

Además, los productos finales de glicosilación avanzados apuntan a formarse más rápidamente en tejidos diabéticos, galactosémicos y otros tejidos enfermos que en tejidos normales.

También es conocido que los procesos de oxidación, por ejemplo tal como se encuentra bajo condiciones conocidas como "estrés oxidativo" apoyan los procesos de formación de AGE (Nawroth, P P., et al., Med Klin (1999) 29-38).

La "familia" de AGEs incluye especies que se pueden aislar y caracterizar por estructuras químicas, algunos siendo bastante estables, mientras que otros son inestables o reactivos. La reacción entre los azúcares reductores y los grupos reactivos de proteínas pueden iniciar el proceso de glicosilación avanzado. Este proceso normalmente empieza con una reacción reversible entre el azúcar reductor y el grupo susceptible en una proteína por ejemplo, para formar una base de Schiff, que prosigue a la redisposición para proporcionar el producto de redisposición de Amadori unido de forma covalente. Una vez formado, el producto de Amadori experimenta otras redisposiciones no enzimáticas y reacciones para producir el compuesto modificado AGE.

Los intentos iniciales para desarrollar anticuerpos anti-AGE frente a estructuras AGE específicas o frente proteínas AGE producidas in vitro conducen a antisueros no apropiados para la detección de AGEs formados in vivo (Nakayama et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 162 (1989) 740-745; Horiuchi et al., J. Biol. Checo., 266 (1991) 7329-7332).

Yoshinori, Y., resumen de la patente Japan vol. 2000, no. 16, 8 May 2001 (2001-05-08) & JP 2001 004624 A (A & T:KK), 12 January 2001 (2001-01-12), revela un inmunoensayo para AGE basado en perlitas de látex sensibilizadas con un anticuerpo que específicamente reconoce AGE.

En WO 96121450 así como en US 5,318,982 se revelan métodos para inhibir la unión cruzada no enzimática (envejecimiento de las proteínas).

En WO 93/13421 para los anticuerpos de primera vez se describen que reconocen y se unen a los AGEs derivados in vivo. Estos anticuerpos see han usado para inmunoensayo competitivos. Los detalles de la metodología no se proporcionan.

US 5.610.076 describe la detección específica de estructuras AGE que llevan hemoglobina (Hb-AGE). La mejora descrita en esta patente reside en el pre-tratamiento de muestras con detergente y/o reactivos caotrópicos. Los efectos positivos de tal pre-tratamiento se explican mediante exposición de los epítopos Hb-AGE que de otro modo no serían accesibles a los anticuerpos anti-AGE. BSA-AGE se usa como antígeno en un inmunoensayo competitivo dirigidos y cubriendo directamente la fase sólida de la placa micro-titulada.

US 5.698.197 describe un anticuerpo monoclonal (4G9) reactivo con AGEs formados in vivo. En una realización este anticuerpo se usa en un ELISA de tipo sándwich para detectar Apo-B-AGE, IgG-AGE, colágeno-AGE, AGE-péptidos y proteínas en suero así como péptidos AGE en orina y proteínas. Con el fin de realizar estos anticuerpos monoclonales 4G9 de ensayos de tipo sándwich AGE o un fragmento inmunoreactivo de los mismos cubre directamente la fase sólida. Los ajustes del inmunoensayo competitivo también se describen usando 4G9. BSA-AGE se usa y cubre la fase sólida de tales ensayos.

Un ensayo comercialmente viable -entre otras cosas- requiere que los resultados generados usando tales ensayos sean reproducibles de laboratorio a laboratorio, así como de un lote a otro lote. La estabilidad del reactivo o del kit durante la carga y/o almacenamiento son también criterios muy importantes para la seguridad y el uso rutinario de los ensayos AGE.

A pesar del progreso significativo obtenido en la generación de anticuerpos (monoclonales) apropiados de reacción cruzada entre los AGEs producidos in vitro y los formados in vivo, y a pesar del uso ventajoso de agentes que exponen epítopos AGE, ningún ensayo AGE comercial no viable ha sido disponible.

Como ya se ha mencionado, AGEs son marcas de procesos patológicos, por ejemplo tal como los causados por diabetes o condiciones de estrés oxidativo. Por lo tanto, los ensayos de rutina reproducibles y confiables se necesitan urgentemente. Todos los ensayos AGE conocidos en el campo, por ejemplo, a partir de la literatura de patentes mencionadas anteriormente, hacen uso del recubrimiento directo de tanto un material de AGE proteína producida in vitro o de un anticuerpo monoclonal anti-AGE. A pesar de los enormes esfuerzos, no ha sido posible establecer más allá ensayos de rutina basados en estos logros.

Fue por lo tanto un objetivo de la presente invención identificar y definir las razones para los problemas encontrados en referencia a los métodos del campo, para desarrollar logros que ayudan a superar estos problemas y a mejorar los métodos para detectar o medir AGEs. Tales mejoras por supuesto pueden también usarse en ensayos para detectar o cuantificar anticuerpos a AGEs.

La tarea a solucionar fue bastante significativa desde que varios problemas son conocidos en el campo del que hay gran variabilidad de lote a lote, una elevada reacción de fondo y una estabilidad de kit debería ser mencionada específicamente. Especialmente la estabilidad del componente de la fase sólida usado en un ensayo para AGEs es más complejo y más crítico.

Se ha encontrado sorprendentemente que los reactivos y/o los componentes de fase sólida cubiertos usados en los ensayos de unión AGE así como los reactivos usados para la elaboración pueden también estar "contaminadas" con AGEs. En otras palabras, los reactivos y/o componentes de fase sólida contienen AGE, o contienen estructuras que llevan a la formación de AGE, en un grado variable. Tales contaminantes AGE interfieren en el ensayo para AGE.

Los métodos desarrollados se usan para seleccionar los reactivos o específicamente para seleccionar los componentes en fase sólida apropiados para ensayos de unión AGE, que están libres de AGE y así se pueden usar en ensayos de unión a AGE mejorados para la detección y medición de AGE.

Se ha encontrado sorprendentemente que es posible proporcionar reactivos libres de AGE y/o componente de fase sólida para los ensayos de unión AGE usando los métodos descritos aquí. La selección y/o control de calidad de reactivos apropiados y componente de fase sólida cubierto es ahora posible.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona nuevos métodos y logros técnicos para solucionar los problemas encontrados más allá con los ensayos de unión AGE. Se revelan métodos que permiten la selección y/o asegurar la calidad de los reactivos apropiados o componentes de fase sólida, que no interfieren con la unión AGE del compañero de unión AGE usado en un ensayo para la detección o mediciones de AGEs.

La invención se refiere a un método para la selección y/o asegurar la calidad de un reactivo o un componente de fase sólida cubierto usado en un ensayo para la detección o medición de un producto final de glicosilación avanzado (AGE) empleando al menos un compañero de unión AGE, caracterizado en que, dichos reactivos o dichos componentes de fase sólida se ensayan para el contenido AGE y tan sólo tal reactivo o componente de fase sólida cubierto se selecciona, que no es reactivo con el compañero de unión AGE usado para realizar el ensayo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención en una primera realización va dirigida a un método para la selección y/o asegurar la calidad de un reactivo o un componente de fase sólida cubierto usado en un ensayo para la detección o medición de un producto final de glicosilación avanzado (AGE) usando al menos un compañero de unión AGE, caracterizado en que, dicho reactivo o dicho componente de fase sólida se ensaya para ver el contenido AGE y sólo un reactivo o componente de fase sólida se selecciona, que no sea reactivo con el compañero de unión AGE usado para realizar el ensayo.

Un reactivo en el sentido de la presente invención es una biomolécula usada en un ensayo AGE que puede padecer procedimientos que llevan a productos finales de glicosilación avanzados (AGEs), por ejemplo, un componente de tampón del tipo una proteína estabilizante, un compañero de unión AGE, así como un miembro de un par de unión específico usado para elaborar el componente de fase sólida. Tal como se revela anteriormente, proteínas especialmente son sometidas a procesos que conducen a AGEs. Es por lo tanto especialmente preferido que las proteínas usadas como componente de tampón y para el cubrimiento o bloqueo de la unión inespecífica de la fase sólida mientras que producir el componente en fase sólida son ensayados para el contaminante AGE. Los reactivos libres de AGE, o al menos esencialmente libres de AGE se seleccionan y se usan.

El término "materiales en fase sólida" se usa para describir los materiales de vehículo o fase sólida usados de forma rutinaria en los ensayos de unión. Tales materiales comprenden entre otros placas microtituladas, tubos o perlas de varios de naturaleza polimérica del tipo por ejemplo de vidrio, látex o materiales plásticos, membranas usadas en dispositivos de química seca, así como materiales vehículos poliméricos del tipo carbohidratos, polipéptidos (sintéticos).

En el sentido de esta invención se prefiere entender que el término usado "componente en fase sólida" comprende cualquiera de los materiales en fase sólida mencionados anteriormente cubiertos con al menos un miembro de un par de unión específico. Los expertos entendidos apreciarán que existen muchas vías para producir tales componentes en fase sólida, esto es, para cubrir los miembros de un par de unión específico para llevar materiales y opcionalmente para bloquear reacciones inespecíficas no deseadas empleando además reactivos bloqueantes, del tipo por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA). Es más preferido para entender los componentes en fase sólida como la fase sólida cubierta en su etapa final, esto es, en una forma empaquetada y estable en que es proporcionada al cliente. El término "seleccionado" se usa para enfatizar que debido a diferentes procedimientos en la producción y condiciones de almacenamiento es necesario para escoger lotes apropiados de reactivos o componentes de fase sólida con el fin de producir confiadamente ensayos AGE.

Por supuesto, los reactivos elaborados para comprender AGE, por ejemplo un material antígeno AGE o un material estándar AGE no está sometido al procedimiento de selección tal como se describe y reivindica.

Preferiblemente, un componente de fase sólido cubierto para su uso en el ensayo AGE, que está libre de AGE se selecciona de acuerdo con métodos de la presente invención. Es además preferido para seleccionar adicionalmente el componente en fase sólida también estar libre de grupos carbonilo reactivos.

El término "seguridad de la calidad" se usa para indicar que un producto, por ejemplo un reactivo o un componente de fase sólida se asegura, por ejemplo con respecto a su cantidad relativa de contaminación AGE.

El método para la selección o seguridad de la calidad se basa en utilizar al menos un compañero de unión AGE. Los patrones de unión AGE típicos comprenden antisuero policlonal y anticuerpos monoclonales, por ejemplo tal como se describe en WO 93113421; US 5,61 0,076 o US 5,698,197.

Se prefiere el uso de ensayos de unión específicos basados en un anticuerpo anti-AGE policlonal o monoclonal en la valoración de un AGE en una muestra y el uso de los principios del mismo ensayo o similar en un método de selección o seguridad de la calidad.

Tal como se indica anteriormente, los ensayos de unión son bien conocidos por los expertos en el campo. Su uso fecha de hace alrededor de 30 años (Engvall E. and Perlmann P. (1971); Immunochemistry 8, 871; van Weemen, B.K. and Schuurs A.H.W.M. (1971), FEBS letters 15, 232). Desde que se ha hecho un enorme progreso y los métodos para llevar a cabo ensayos de unión específicos así como aplicaciones prácticas del mismo se han convertido de conocimiento general por aquellos entendidos en el campo. Los métodos y procedimientos resumidos en los libros de texto relacionados se incluyen aquí a modo de referencia y solo pocos ejemplos se pueden mencionar específicamente: "Practice and theory of enzyme immunoassays" de P. Tijssen (1990) Elsevier Science Publishers B.V.; y varias ediciones de "Methods in Enzymology", Colowick S.P., Caplan N.4., Eds., Academic Press, que tratan de métodos de detección inmunológicos, por ejemplo, Volúmenes 70, 73, 74, 84, 92 y 121.

Los ensayos de unión pueden conseguirse por muchas vías diferentes. Ejemplos bien conocidos por ejemplo, son homogéneos o heterogéneos, competitivos y ensayos de tipo sándwich. Una gran variedad de métodos de detección es conocido y sólo unos pocos ejemplos deben ser mencionados específicamente, esto es, inmunoensayos de enzimas (EIAs), radio inmunoensayos (RIAs), inmunoensayos de polarización de la fluorescencia (FPIAs), inmunoensayos (electro)quimio-luminiscentes ((E)CLIAs) y ensayos turbidimétricos.

Más preferidos son los ensayos de unión comprendiendo al menos un miembro de un par de unión inmunológico. En una realización preferida comprende un AGE y un anticuerpo anti-AGE. Especialmente preferidos son las estructuras AGE químicamente definidas y anticuerpos hacia éstos. Los ensayos de unión de la fase sólida se usan para la determinación de AGE que requiere que un compañero del par de unión AGE se una directamente o indirectamente a la fase sólida.

Con el fin de unir directamente o indirectamente un miembro de un par de unión específico AGE a una fase sólida, el uso de un antígeno/anticuerpo, o sistemas hapteno/anticuerpo o del sistema avidina/biotina o estreptavidina/biotina es preferido. Más preferiblemente el sistema estreptavidina/biotina se usa. En una realización preferida el componente de fase sólida comprende avidina o estreptavidina como miembro de un par de unión del tipo hapteno AGE-independiente. También es preferido el uso de tal componente en fase sólida en combinación con material biotinilado comprendiendo la estructura AGE bajo investigación.

El término anticuerpo se debería entender como comprendiendo anticuerpos policlonales, monoclonales y quiméricos, patrones de unión del tipo anticuerpo obtenidos por ejemplo, mediante el desarrollo de fagos o métodos de química combinatoria así como variantes inmunoreactivas o fragmentos del mismo.

De acuerdo con procedimientos estándar ensayos de unión AGE se pueden construir para detectar una variedad de estructuras AGE, por ejemplo, usando antisuero policlonal obtenido contra proteínas "AGEed" in vitro. Preferiblemente los ensayos AGE se forman para detectar específicamente sólo una o muy pocas de las estructuras AGE caracterizadas químicamente preferibles. Tales ensayos preferiblemente hacen uso de al menos un componente bien caracterizado en el sistema AGE-antígeno. Preferiblemente tanto si la estructura AGE se caracteriza químicamente o el anticuerpo usado es monoespecífico o monoclonal.

Los problemas conocidos a partir del campo se han investigado. Se ha encontrado, cuando se analizan varios tipos de componentes en fase sólida, que las fases sólidas cubiertas obtenidas de acuerdo con procedimientos estándar o a partir de diferentes fuentes comerciales proporcionando además una señal de fondo fuerte y variable) en los ensayos AGE.

Muchos logros estándar diferentes generalmente usados para mejorar los inmunoensayos, del tipo variación de las condiciones de tampón, variación de la estequiometría de ambos antígenos AGE biotinilados así como anticuerpos anti-AGE se han aplicado con el fin de, por ejemplo, reducir el problema de fondo. Ninguno de estos procedimientos de rutina concluyó para los ensayos AGE investigados y una reacción de fondo variable y elevada persistió.

Finalmente, se investigó si el problema de fondo podría resultar de las estructuras AGE en el componente de fase sólida usado en tales ensayos. Con el fin de ensayar la contaminación AGE del componente de fase sólida, los experimentos de competición se han formado esencialmente usando los siguientes tres componentes del ensayo: fase sólida cubierta de estreptavidina, antígeno AGE sintético, y anticuerpo AGE específico.

Estos experimentos confirman sorprendentemente que los componentes en fase sólida por si mismos en un grado variable contienen estructuras AGE o "AGE-contaminantes". Este hallazgo sorprendente fue clave para la invención. Se han desarrollado métodos que lo hacen ahora más factible que los materiales apropiados o componentes de fase sólida cubiertos se seleccionan. Tal como se describe posteriormente, se ha hecho posible establecer procesos de producción para el componente en fase sólida que están esencialmente libres de AGE. Preferiblemente los componentes de fase sólida no son reactivos con el compañero de unión AGE usado. Los reactivos usados en la elaboración de un componente del kit del tipo tampones o componentes de fase sólida preferiblemente se seleccionan para estar libres de reducir grupos carbonilo que de otro modo llevarían a la formación de (interferencias) AGE.

Desde que se conocen una variedad de diferentes estructuras AGE, la selección de un reactivo apropiado o componente de fase sólida se basa preferiblemente en el uso del mismo compañero de unión específico de AGE también usado en el ensayo para la detección y medición de la AGE. Tal como se menciona, los reactivos o el componente de fase sólida no reactivo con el compañero de unión AGE usado en el ensayo para AGE se seleccionan.

Bajos niveles de contaminante AGE por ejemplo, de componente de fase sólida cubierto son tolerables. Tal material aún se llama esencialmente no reactivo, tal como la contaminación no influencia el resultado del ensayo, significativamente. Los niveles tolerables varían dependiendo del par de unión AGE usado así como dependiente de la sensibilidad del sistema de ensayo requerido. El término "no reactivo" se usa para describir que un contenido tolerablemente bajo, no, o al menos esencialmente no se ha encontrado contenido AGE (o con otras palabras contaminación AGE) usando los métodos de acuerdo con la presente invención o con métodos y procedimientos equivalentes a los mismos. Se prefiere, que ninguna contaminación AGE o esencialmente que ninguna contaminación AGE estuviera presente. Es más preferido que ningún AGE esté presente en el material o en el componente de fase sólida seleccionado.

Los métodos y procedimientos tal como se describen aquí y se ejemplifican en la sección ejemplos permiten la producción, selección y control de calidad de los reactivos apropiados o componentes de fase sólida cubiertos para su uso en ensayos mejorados, por ejemplo, en ensayos AGE comercialmente viables. Tales ensayos AGE cumplen los requerimientos esenciales, especialmente en los términos de laboratorio a laboratorio, variabilidad de lote a lote y estabilidad a largo término. Mientras que una variedad de métodos y técnicas se pueden designar con el fin de asesorar el contenido de AGE de los reactivos, y/o componente de fase sólida cubierta, es preferible usar un método para la selección y/o seguridad de calidad de un reactivo o un componente de fase sólida cubierto usado en un ensayo para la detección o medición de un producto final de glicosilación avanzado (AGE) empleando al menos un compañero de unión AGE, que se caracteriza en que, dicho reactivo o componente en fase sólida es ensayado para ver el contenido de AGE y sólo tal reactivo o componente en fase sólida cubierto se selecciona, que es esencialmente no reactivo con el compañero de unión AGE usado para realizar el ensayo.

Es bien conocido que la calidad y especialmente la sensibilidad de la mayoría de los ensayos de unión dependen fuertemente de la proporción de señal a la de fondo. Con otras palabras, la señal más específica y el fondo del sistema más bajo, son el mejor ensayo.

En una realización preferida, el método para la selección y seguridad de la calidad se caracteriza en que dicha selección o dicha seguridad de la calidad se hace mediante análisis y cálculo de la señal a artefactos en el ensayo de unión AGE.

La medición de la señal específica AGE (=señal positiva) se realiza usando el antígeno AGE y el compañero de unión AGE del mismo modo que se intenta o se recomienda para el producto comercial. Las señales de fondo del sistema se determinan mediante realización de todos los pasos del ensayo del mismo modo pero omitiendo el primer miembro del par de unión AGE.

En el caso de un ensayo de tipo sándwich, la señal positiva, por ejemplo, se mide a partir de un sándwich inmunológico formado entre un primer anticuerpo anti-AGE, un antígeno AGE o un material estándar (esto es una molécula llevando AGE) y un segundo anticuerpo anti-AGE en donde uno de estos anticuerpos es detectable directamente o indirectamente o marcado. La señal positiva se define como el resultado obtenido usando el estándar más alto de un producto comercial correspondiente cuando se realiza el ensayo de acuerdo con las instrucciones. En el caso que no se proporcione material estándar con el ensayo, la concentración AGE usada para asegurar la señal positiva se elige para igualar al superior y del rango medido intencionado o dado. El valor para el fondo del sistema se obtiene usando reactivos idénticos omitiendo el antígeno AGE. El anticuerpo de captura en un ensayo de sándwich preferiblemente es biotinilado e indirectamente unido a un componente de fase sólida comprendiendo matrices de avidina o estreptavidina.

En el caso del diseño de un ensayo competitivo el antígeno AGE preferiblemente se une indirectamente al componente en fase sólida. Más preferido el antígeno AGE está biotinilado y se une indirectamente a una fase sólida comprendiendo avidina o estreptavidina. En tal formato de ensayo competitivo la señal de fondo es definida como la señal obtenida usando el reactivo de unión AGE, por ejemplo, un anticuerpo anti-AGE marcado con peroxidasa de acuerdo con las instrucciones del ensayo pero sin adición de antígeno AGE unido indirectamente y sin adición de cualquier antígeno rival. De este modo se determina el trasfondo del sistema. La señal positiva se obtiene usando la unión indirectamente, por ejemplo, antígeno biotinilado y antígeno no competitivo (por ejemplo, se usa un 4-calibrador como muestra). La señal para la tasa artefacto en tal ensayo competitivo se calcula por división de la señal positiva del sistema mediante la señal de fondo. Un ejemplo para tal cálculo se puede encontrar en el Ejemplo 2.

Además se prefiere que la señal positiva específica AGE se obtiene en dicho ensayo de unión es al menos 5 veces mayor que comparado con el trasfondo del sistema, esto es que la proporción de señal a la señal de fondo es al

\hbox{menos
5.}

Es aún más preferido que la señal específica AGE en un ensayo de unión AGE sea al menos 10 veces mayor que comparado con el fondo del sistema.

Es más preferido usar un ensayo competitivo indirecto AGE con el fin de seleccionar la calidad apropiada de un componente de fase sólida cubierto.

La señal para la proporción de fondo es una vía para seleccionar un reactivo apropiado y especialmente para seleccionar un componente de fase sólida cubierto apropiado. Se ha encontrado además que también es posible verificar la contaminación AGE mediante un tipo diferente de experimento de competición.

Usando anticuerpos anti-AGE se ha encontrado que algunos reactivos así como el estado del campo de componentes de fase sólida cubiertos reaccionan con estos anticuerpos. También se ha encontrado que es posible competir al menos parte de la señal de fondo encontrada con reactivos críticos o componente en fase sólida mediante el uso de un reactivo que es conocido por contener la estructura AGE bajo investigación. Estos hallazgos demuestran que tales reactivos críticos o fases sólidas cubiertas parecen llevar la misma o al menos similar estructura AGE tal como la estructura AGE bajo investigación. Esta es una evidencia de corte claro de la existencia de contaminantes AGE en tanto unos pocos de los reactivos críticos y/o componentes de fase sólida ensayados.

Se ha encontrado sorprendentemente que experimentos de tipo competitivo similares como aquellos usados para identificar los contaminantes AGE como fuente principal de problemas de los ensayos AGE son muy útiles con el fin de seleccionar o asegurar la calidad de un material o un componente de fase sólida cubierto.

Preferiblemente, el método se caracteriza en que, en un ensayo AGE de tipo competitivo la señal de fondo de un reactivo o un componente de fase sólida cubierto no se puede reducir significativamente mediante el antígeno AGE específico bajo investigación. En este método el mismo antígeno AGE que el contenido en el material estándar proporcionado con este ensayo y se usa el mismo anticuerpo.

El reactivo a ser investigado está cubierto con el mismo material en fase sólida que aquel usado en la elaboración del componente de fase sólida cubierto. Este recubrimiento se realizó mediante adsorción directa de acuerdo con procedimientos rutinarios. Con el fin de seleccionar un reactivo apropiado para lote o componente en fase sólida apropiado, los pasos del ensayo se realizaron tal como se requieren para conducir un ensayo competitivo AGE. No obstante, ningún recubrimiento indirecto con un antígeno AGE se elaboró. En su lugar, el componente de fase sólida cubierto o el material de fase sólida cubierto con el reactivo a ensayar se usa directamente y el potencial competitivo del material estándar AGE se investigó.

En una realización preferida la concentración más elevada del material estándar se suministró en el ensayo AGE o la concentración AGE concordante con el punto más alto de rango de medición en que este material crítico o fase de cubierta sólida se debe usar, no reduce significativamente el fondo en tal ensayo AGE de tipo competitivo.

Preferiblemente para un ensayo de ELISA con una señal positiva en el rango de 1000 mE (unidades de mili absorbancia) la reducción en el fondo por el calibrador más alto AGE usado en este ensayo es \leq 100 mE.

Por lo tanto, se prefiere además seleccionar reactivos o componentes de fase sólida en un método de ELISA con una señal positiva de \geq 1000 mE, caracterizada en que, que menos de 100 mE y aún más preferiblemente menos de 50 mE de señal total de fondo puede competir con el antígeno AGE analizado tal como se contiene en el estándar más alto proporcionado o correspondiente al punto más alto de rango de medición reivindicado.

Hablando de forma más general, los componentes en fase sólida cubiertos se seleccionan para que sea inferior de 10% o aún más preferiblemente inferior al 5% de la señal positiva total tal como se obtiene en un ensayo AGE de tipo competitivo indirecto sin ningún antígeno compitiendo, son debidos a una contaminación AGE de la fase sólida. Tal contaminación se mide preferiblemente como una reducción en la señal de fondo mediante ayuda de los ensayos de tipo competitivo descritos anteriormente.

La presente invención proporciona además otro método de asegurar la calidad de un reactivo. En este método se usa el ensayo AGE tal como se describe (cf. anterior o ejemplo 4). La preparación de un reactivo crítico es asegurado como una muestra. Los reactivos se diluyen a 50 \mug/ml tratados con proteinasa K y ensayados tal como se describe. Preferiblemente se seleccionan reactivos que contienen menos de 10 ng/ml AGE (esto es, menos de 10ng por 50 \mug). Más preferidos son los reactivos libres de AGE, esto es, los que no contienen un nivel detectable de AGE se seleccionan.

Los componentes en fase sólida en los ensayos de unión, especialmente en los inmunoensayos, se producen normalmente por recubrimiento de un miembro de un par de unión específico a una fase sólida. Esta cubierta sigue los procedimientos estándar tal como se describen en el campo.

En general la fase sólida a la que el miembro de un par de unión específico está cubierta se lava entre una y cinco veces. Opcionalmente, no obstante, tal paso de lavado se puede omitir. También es bien conocido en el campo que en la mayoría de los casos es muy ventajoso usar reactivos adicionales para bloquear sitios pegadizos y/o para estabilizar el par de unión cubierto mediante bloqueo y/o reactivo estabilizante. Frecuentemente usados son, por ejemplo, BSA, caseína, dextrano, azúcares y/o detergentes. Normalmente una solución reactiva cubriendo ambos efectos deseados se emplea.

Es obvio, que con los métodos en la mano y proporcionando la presente invención es ahora posible seleccionar los reactivos más apropiados para el establecimiento de ensayos de unión AGE. Es una realización preferida de acuerdo con la presente invención, que al menos uno de los reactivos usados para la elaboración de un componente de fase sólida cubierto es un reactivo libre de AGE que se selecciona de acuerdo con los métodos de la presente invención. Especialmente preferido es el miembro de un par de unión específico que está cubierto con la fase sólida está libre de AGE.

Preferido es un procedimiento para la producción de un componente de fase sólida que está libre de un producto final de glicosilación avanzado (AGE) para su uso en un ensayo para medir dicho AGE, caracterizado en que, los reactivos usados para cubrir están libres de AGE.

Los reactivos usados para cubrir son muy críticos para la calidad de un componente de fase sólida cubierto. No obstante, también los reactivos contenidos en la solución post-cubrimiento, que se usa para prevenir la unión inespecífica y que también puede contener compuestos estabilizantes por ejemplo el miembro de un par de unión específico ya cubierto a la fase sólida debería estar libre de AGE. Es por lo tanto preferido, que la solución bloqueante o estabilizante esté libre de AGE.

También se ha encontrado ventajoso para evitar azúcares o sustancias comprendiendo un grupo carbonilo reducido en las soluciones de reactivo, especialmente en las soluciones de reactivo usadas para la elaboración de un componente en fase sólida de un ensayo AGE. También las composiciones de reactivos contenidas en tal kit, por ejemplo tampones de incubación, preferiblemente están libres de azúcares. En otra realización preferida el componente en fase sólida por lo tanto se produce usando soluciones de reactivos libres de azúcares, especialmente los reactivos usados como método de bloqueo y/o estabilización de dicho componente en fase sólida se seleccionan para estar libres de azúcares o otras especies de carbonilo reactivas. Libre de azúcares se debe entender por describir una concentración de azúcar no interferente. Preferiblemente, las concentraciones de azúcar están por debajo de 0,1%, o reactivos están esencialmente libres de azúcares reductores.

En general, los grupos carbonilo reductores, especialmente las funciones carbonilo en las moléculas de azúcar o los grupos carbonilo aún más reactivos químicamente de moléculas del tipo glioxal o metil glioxal, se han encontrado críticas en la elaboración de una composición de reactivo, por ejemplo, del tipo un tampón de incubación, y especialmente en la elaboración de un componente de fase sólido cubierto para un ensayo AGE.

Los reactivos y componentes en fase sólida se ensayan fácilmente para las funciones carbonilo reducidas mediante métodos de detección rutinarios. La detección más conveniente del grupo carbonilo reducido se realiza mediante la reacción de oxima tal como se describe en Pure Appl. Checo. (1979) 1803-1814 o por procedimientos enzimáticos más sensibles. Preferiblemente un reactivo o un componente en fase sólida se selecciona para que no contenga cantidades medibles de azúcares reductores. Más preferido es un reactivo o un componente en fase sólida cubierto se ensaya para los grupos carbonilo reducidos usando la alcohol deshidrogenada de hígado de caballo y NADH como sustrato. Los cambios en NADH se miden y correlacionan con la cantidad de grupos carbonilo reducidos presentes de acuerdo con los procedimientos rutinarios. En el caso de los pocillos microtitulados el producto de la reacción se transfiere a las cubetas de UV apropiadas y se miden.

Un procedimiento para la producción de una fase sólida libre de AGE preferiblemente al menos hace uso de una solución estabilizante o bloqueante que está libre de grupos carbonilo reducidos.

Preferiblemente también los reactivos y soluciones usadas para cubrir el miembro de un par de unión específico a la fase sólida están libres de grupos carbonilo reducidos.

Por supuesto, los procedimientos combinando el ensayo para AGE y grupos carbonilo están también dentro del alcance de la presente invención. En tal un procedimiento por ejemplo los materiales críticos, por ejemplo la preparación del miembro par de unión a ser cubierto se ensayan para ver la contaminación AGE y el reactivo post-cubrimiento (=bloqueo o estabilización) se ensaya para los grupos carbonilo. También es concebible para ensayar los reactivos, así como un componente en fase sólida para ambos contenidos en AGE y carbonilo.

Un método preferido de control de calidad para un componente en fase sólida cubierto comprende ambos el ensayo para la contaminación AGE y el ensayo para la presencia de grupos carbonilo reducidos.

Se describe en la presente invención un procedimiento para la producción de un componente de fase sólida que esté libre de producto final de glicosilación avanzado (AGE) para su uso en un ensayo para medir dicho AGE, comprendiendo los pasos de

a)

cubrir el material de fase sólida con un miembro de un par de unión específico que está libre de AGE,

b)

lavar el componente en fase sólida y

c)

añadir una solución de bloqueo o estabilizante libre de AGE y libre de grupos carbonilo reducidos.

Otro procedimiento hace uso de miembro de par de unión libre de AGE y libre de grupos carbonilo reducidos y de una solución post-cubierta libre de grupos carbonilo reducidos.

Además es un procedimiento en donde el miembro del par de unión es avidina o estreptavidina.

Más preferiblemente, la avidina o estreptavidina se polimeriza tal como se describe en EP 331 127.

Un componente en fase sólida cubierto como se produce de acuerdo con un procedimiento tal como se describe anteriormente se describe en esta invención.

Con el componente en fase sólida, tal como se produce de acuerdo con los procedimientos descritos en el campo, los principales problemas se han encontrado usando el mismo en los ensayos de unión AGE. Tal como se demuestra en los ejemplos dados, tales problemas pueden ser ahora superados y el componente en fase sólida proporcionado que está libre de contaminante AGE.

El ensayo de la estabilidad de estrés es una vía independiente de asegurar la calidad de un componente de fase sólida cubierto y representa un método alternativo de acuerdo con la invención. El componente de fase sólida tal como se produce de acuerdo con los procedimientos descritos se han encontrado que son bastante estables bajo condiciones rutinarias de almacenamiento. Por ejemplo se pueden conservar a 4ºC durante 12 meses. También son estables bajo las condiciones de almacenamiento de estrés de 37ºC durante tres semanas. Bajo almacenamiento no se forman estructuras AGE no interfirientes.

Un componente de fase sólida cubierta estable para su uso en un ensayo AGE se describe en la invención.

El uso de un componente de fase sólida libre de AGE en ensayos de unión específica para la detección o medición de un antígeno AGE es además descrito en la invención.

Los ensayos de unión AGE se pueden basar en cualquier compañero de unión capaz de unirse a estructuras AGE. Tales patrones de unión pueden, por ejemplo ser receptores capaces de unirse a AGEs, por ejemplo, tal como se describe en WO 95129692. Es, no obstante preferido, el uso de patrones de unión inmunológicas en un ensayo de unión AGE. En una realización preferida el componente en fase sólida libre de AGE se usan en un ensayo de unión específica para la detección o medición de antígeno AGE.

En una realización preferida de esta invención, un kit de ensayo comercial apropiado para su uso en la práctica médica, clínica, o investigación se puede preparar. De acuerdo con las técnicas del ensayo descritas anteriormente, tales kits contendrán al menos un componente en fase sólida libre de AGE así como al menos un miembro de un par de unión AGE. Una realización preferida es: Un kit de ensayo para la detección o medición de AGEs en una muestra comprendiendo al menos (a) un componente en fase sólida libre de AGE esencialmente (b) un reactivo conteniendo un antígeno AGE y (c) un compañero de unión unido al AGE de dicho reactivo conteniendo AGE. Tal kit puede también contener una estructura AGE en forma de material estándar o control positivo. Los kits de acuerdo con la presente invención pueden adicionalmente contener "reactivos periféricos" tales como tampones, estabilizantes, sustratos de enzimas, etc.

En una realización preferida el componente en fase sólida usado en un kit de ensayo tal como se describe anteriormente es una placa micro-titulada (o placa microtitulada compuesta de tiras). Preferiblemente tal placa microtitulada está cubierta con estreptavidina y un compañero de un par de unión AGE se usa en una forma biotinilada.

Un kit de ensayo utilizable en esta invención en otra realización preferida comprende un componente en fase sólida seleccionado de un grupo consistente de placas microtituladas, tubos de ensayo, tiras de ensayo y perlitas de ensayo cubiertas con avidina o estreptavidina. Preferiblemente este material en fase sólida es una placa microtitulada o consiste de micro-partículas, especialmente de micropartículas magnéticas cubiertas con estreptavidina polimerizada.

Los siguientes ejemplos, referencias, y figuras se proporcionan para ayudar al entendimiento de la presente invención, el verdadero alcance del cual se lista en las reivindicaciones indexadas.

Figura 1 AGE-CML en muestras clínicas

Los valores para CML-AGE -medidos usando un componente en fase sólida libre de AGE- en muestras recogidas de voluntarios sanos y de pacientes bajo tratamiento de diálisis se muestran.

Ejemplo 1

Los pocillos cubiertos de las placas micro-tituladas (o tiras) para un ensayo AGE competitivo, indirecto.

Para todos los experimentos las tiras F8 microtituladas de calidad Maxisorp (Nunc GmbH, Wiesbaden, Alemania) se usaron como material de fase sólida.

Calidad 1

Tiras cubiertas de estreptavidina, calidad estándar, Roche producto no. 1302540.

Calidad 2

Tiras cubiertas de estreptavidina, calidad de alta afinidad, Roche producto no. 1965905.

Calidad 3 y 4

El cubrimiento se realizó con TRSA-Bi (=albúmina de suero bovino tratada con calor en una forma biotinilada) y estreptavidina de unión cruzada homogéneamente (de acuerdo con EP 0 331 127). Tras 18 h a temperatura ambiente, los pocillos se vaciaron y rellenaron con la solución post-recubrimiento: Dextran T4010 g/l (en 10 mM tampón de fosfato potásico, pH 7,2) para la calidad 3 y Dextran T40 10 g/l más BSA (3 g/l) en el mismo tampón para la calidad 4. Tras 30 min las placas se vaciaron completamente, se secaron durante 3 h a 25ºC, 5% humedad relativa y se sellaron en una bolsa hermética y se conservó a 4 a 8ºC.

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Calidad 5

1. Recubrimiento

30 mg de estreptavidina polimerizada (= SA-poli), producida tal como se describe en PE 0 331 127, se disuelve en 1 l 40 mM de tampón de fosfato de potasio, pH 7,4. Los pocillos de polistirol de placas microtituladas con elevada capacidad de unión (NUNC Maxisorp®) se rellenarán con 300 \mul de esta solución y se incubaron durante 18 h a temperatura ambiente y la solución se eliminó acto seguido.

Materiales Greiner Makrolon 600, o materiales en fase sólida unidos fuertemente Costar también se han ensayado y se vio que trabajan igual de bien.

2. Lavado

Todos los pocillos se rellenaron con 300 \mul de tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 7,2 conteniendo 0,0025% (p/v) Thesit (W. Kolb AG, Hedingen, Switzerland:"Sympatens-AL/090 P") y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se vació y el procedimiento de lavado se repitió una vez de nuevo.

3. Post-recubrimiento

Todos los pocillos se rellenaron con 300 \mul de albúmina de suero bovino (Roche Diagnostica GmbH, product no. 1 726 536), 3 g/l en 50 mM de tampón de fosfato potásico, pH 7,2 y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La solución se extrajo por succión.

4. Secado

Las placas se secaron durante 4 h en una cámara climática a 25ºC con un 5% de humedad relativa. Tras lo que las placas se sellaron en una cubierta hermética y se conservó a 4-8ºC.

TABLA 1

1

Ejemplo 2 Determinación AGE-CML 1. Preparación y biotinilación de albúmina sérica bovina AGE modificada

Albúmina sérica bovina (BSA, Calbiochem, nº de orden 12657) se sometió a glicosilación avanzada in vitro. Con este fin, BSA (50 mg/ml en 50 mmol/l fosfato de potasio, 150 mmol/l de cloruro sódico, 20 \mumol/l de sulfato de cobre, pH 7,4) fue incubada en presencia de D-glucosa (0,5 mol/l) durante 3 semanas a 35ºC. La D-glucosa se eliminó por diálisis extensiva contra un tampón de fosfato de potasio 50 mmol/l, cloruro sódico 100 mmol/l, pH 7,5.

La biotinilación de la BSA-AGE se realizó en un tampón fosfato de potasio 100 mmol/l, cloruro sódico 100 mmol/l, pH 8,0 utilizando un D-Biotinoil-[epsilon]-aminocaproato de N-hidroxisuccinimida en una proporción experimental de 10:1. La reacción se detuvo después de 90 minutos mediante la adición de monocloruro de lisina para resultar en una concentración final de 10 mM. El exceso de marcador se eliminó por diálisis contra fosfato de potasio 50 mmol/l, cloruro sódico 150 mmol/l, pH 7,5. El producto biotinilado se denominó "Bi-BSA-AGE".

2. Reactivos y soluciones utilizados en el método ELISA

2.1. Tampón de incubación: Se utilizó un tampón de incubación de ensayo Roche FM (Nº de orden 565 440).

2.2. Bi-BSA-AGE: Este AGE-antígeno biotinilado se diluyó hasta 1 \mug/ml en tampón de incubación.

2.3. Patrones: Ácido 6-(N-carboximetilamino)caproico (=CML), y sal disódica (MW 233), se utilizaron como material compañero. Se prepararon soluciones de 0/ 6,25/ 12,5/ 25/ 50/ 100 ng/ml en tampón de incubación. (la solución con 0 CML es también denominada calibrador 0.)

2.4. Conjugado: Anti-CML monoclonal, clon 4G9, conjugado con peroxidasa de rábano se diluyó a 90 mU/ml en tampón de incubación.

2.5. Medio de lavado: Una solución conteniendo TRIS/HCL 10 mmol/l, NaCL 150 mmol/l, N-metilisotiazolon 0,001% (peso/volumen), 2-cloracetamida 0,01% (peso/volumen), Tween-20 0,05% (peso/ volumen), pH 7,4 se utilizó como tampón de lavado.

2.6. Sustrato: Ácido 2,2'-azino-bis-[3-etilbenzo-tiazolina-6-sulfónico. Roche Biochemicals, Nº de orden 1 684 302 se utilizó como sustrato.

2.7. Placa de microtitulación: Los componentes de fase sólida SA-recubiertos 1-5 producidos de acuerdo con el ejemplo.1.

3. Método ELISA

3.1. Unión de Bi-BSA-AGE (solución 2.2): Se añaden 100 \mul/ pocillo y se incuban en movimiento durante 1 hora a temperatura ambiente.

3.2. Lavar 3 veces mediante el medio de lavado (300 \mul de solución 1,5 por pocillo). Especialmente después del último paso de lavado, la placa se sacude minuciosamente (del revés) en papel de filtro para eliminar todo el líquido sobrante.

3.3. Incubación simultánea de la muestra y el conjugado:

El ensayo se realiza utilizando determinaciones dobles. 50 \mul de muestra desconocida, patrón o muestra control, respectivamente, se pipetean por cada pocillo, inmediatamente después 50 \mul de conjugado (solución 2.4) se añade por cada pocillo y la mezcla se incuba en movimiento durante 1 hora a temperatura ambiente.

3.4. Lavar 3 veces tal y como se indica anteriormente.

3.5. Incubación del sustrato: Se añaden 100 \mul de sustrato (solución 2.6) por pocillo y se incuban en movimiento durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente.

3.6. Se mide la absorbancia mediante un fotómetro para placas de microtitulación a 405 nm. Se calculan los valores promedio de las determinaciones dobles o múltiples y el contenido en CML de las muestras es conocido a partir de la curva de calibración y los resultados son mostrados en las Tablas 2 y 3.

TABLA 2

3

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TABLA 3

4

(*= absorbancia del patrón 0 con Bi-BSA-AGE/absorbancia de patrón 0 sin Bi-BSA-AGE)

Como parece obvio a partir de la Tabla 2, CML es capaz de competir con Bi-BSA-AGE por los sitios de unión del anticuerpo monoclonal 4G9.

Sin embargo, fueron detectadas destacadas diferencias al comparar las señales de fondo y de competición en placas de diversas calidades recubiertas de estreptavidina. En la Tabla 3 se proporcionan los valores de absorbancia sin adición de AGE-albúmina sérica bovina biotinilada. Altos y variables niveles de actividad de fondo han sido detectados en las placas producidas de acuerdo con los procedimientos descritos. Esta reactividad de fondo puede ser eliminada de forma efectiva por competición mediante la adición de CML. Esto implica que el componente de fase sólida ofrecido en las calidades de 1 - 4 se encuentra contaminado por estructuras AGE.

Las notables ventajas del nuevo material (Nº. 5 en las Tablas 2 y 3) se hacen obvias a partir de las tasas señal/ruido que se obtienen a partir de comparar los valores del calibrador 0 sin Bi-BSA-AGE y con Bi-BSA-AGE. Mientras que la nueva calidad de fase sólida de los experimentos mencionados arriba resulta en una tasa señal/ruido de 60 los otros ejemplos conocidos de la práctica exhiben tasas de señal/ruido que oscilan entre 1,5 y 3,2.

Ejemplo 3 Estabilidad del nuevo componente de fase sólida recubierto de estreptavidina

Pocillos de microtitulación de calidad 5, que fueron guardados durante 3 semanas a 4 - 8ºC, temperatura ambiente, o a 37ºC, respectivamente, fueron comparados en el ensayo AGE-CML. La señal específica se midió utilizando Bi-BSA-AGE, mientras que la señal inespecífica se detectó utilizando solamente tampón en lugar de antígeno biotinilado.

TABLA 4

5

La competición global utilizando Bi-BSA-AGE fue comparable: 61% o 62%, respectivamente, después de las dos condiciones de almacenamiento mostradas. Con placas almacenadas a 4ºC se obtuvieron resultados similares.

Tal y como se puede observar a partir de la Tabla 4, la señal inespecífica (sin Bi-BSA-AGE) incrementó ligeramente bajo stress de almacenamiento a 37ºC durante 3 semanas, aunque no llegó a alcanzar valores críticos de señal de fondo. Los elevados valores de señal de fondo observados con los otros componentes de fase sólida recubiertos 1 - 4 como conocidos a partir de la experiencia (cf.: Ejemplos 1 y 2) son muy diferentes aún cuando son comparados con los componentes de fase sólida recubiertos sometidos a estrés. La tasa señal/ruido después del stress de almacenamiento se ha revelado con un valor de 17 en comparación con los valores de 1,5 a 3,2 para el material conocido a partir de la experiencia.

Se sabe que la estabilidad bajo condiciones de "estrés" de almacenamiento durante 3 semanas a 37ºC es equivalente al de las condiciones de almacenamiento a 4ºC durante como mínimo 12 meses. En otras palabras el nuevo material de fase sólida, aún después de un almacenamiento a 37ºC durante 3 semanas (equivalente a un almacenamiento a largo plazo a 4ºC) es drásticamente mejor que los materiales de fase sólida producidos de acuerdo con los procedimientos estándar (cf. Componentes de fase sólida 1 - 4 en el Ejemplo 2). El nuevo componente de fase sólida se caracteriza también por presentar una tasa de señal/ruido > 10 aún después de un largo tiempo bajo condiciones de estrés de almacenamiento.

Ejemplo 4 Medición de CML-AGE en muestras clínicas

Los pocillos de una placa de microtitulación recubierta de estreptavidina son incubados con Bi-BSA-AGE (a una concentración de 1 \mug/ml con tampón de incubación). 100 \mul/pocillo son incubados a temperatura ambiente durante 1 hora. Cualquier Bi-BSA-AGE no unida es eliminada por medio de lavado de los pocillos con 3 x 300 \mul de solución de lavado.

Muestra y anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa son co-incubados. A cada pocillo se añaden 50 \mul de muestra pretratada con proteinasa K, o material patrón, inmediatamente seguidos por 50 \mul de solución conjugada preparada según se describe en el ejemplo 2. Esta mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Los reactivos que no se unen son eliminados por medio de lavado, como se describe anteriormente.

La proteinasa K funciona bajo un amplio rango de concentraciones y tiempos de incubación. Resultados óptimos son obtenidos a través del ajuste de las condiciones para el pretratamiento con proteinasa K para que encajen con el contenido de proteína de la muestra utilizada.

En el caso de que la muestra sea CSF, el pretratamiento con proteinasa K se realiza incubando 60 \mul de muestra con 5 \mul de solución de proteinasa K (a una concentración final de 1 mg/ml). Los reactivos son mezclados y incubados durante 3 horas a 37ºC. Para inhibir la actividad de la proteinasa K se añaden 65 \mul de PMSF (a una concentración final de 1 mM) y la mezcla de reactivos es luego incubada durante 30 a 60 minutos. A partir de entonces, la muestra de CSF pretratada está preparada para la determinación AGE-CML.

En el caso de que se utilice suero como muestra, el pretratamiento con proteinasa K se realiza incubando 10 \mul de la muestra con 100 \mul de solución de proteinasa K (a una concentración final de 1 mg/ml). Los reactivos se mezclan y se incuban durante 3 horas a 37ºC. Para inhibir la actividad de la proteinasa K se añaden 100 \mul de PMSF (a una concentración final de 1 mM) y la mezcla de reactivos es posteriormente incubada de 30 a 60 minutos. A partir de este momento, la muestra de suero pretratada está lista para la determinación AGE-CML.

La unión de la peroxidasa se detecta mediante una reacción estándar con sustrato. Se añaden 100 \mul de solución de sustrato por pocillo y se incuban durante 30 minutos aproximadamente a temperatura ambiente. La actividad de la peroxidasa se mide a través del cambio de sustrato a una longitud de onda de 405 nm.

Durante todos los pasos de la incubación la mezcla de reacción en los pocillos de la placa de microtitulación es suavemente agitada mediante un dispositivo de agitación de placas.

La concentración de AGE-CML en las muestras es extrapolada a partir de la curva patrón de acuerdo con procedimientos estándar.

Muestras de suero procedentes de ocho controles sanos y de ocho pacientes sometidos a diálisis debido a complicaciones renales diabéticas, han sido medidos utilizando una placa de microtitulación producida de acuerdo con la presente invención. Los resultados se resumen en la Tabla 5 y se ilustran en la Figura 1. Se puede apreciar que en los pacientes diabéticos se miden unos niveles más elevados de AGE-CML.

TABLA 5

6

7

Listado de referencias

Bunn, H. F., et al., Biochem Biophys Res Commun (1975)103-9.

Engvall, E. and Perlman, P., Immunochemistry (1971) 871-4.

Horiuchi, S., et al., J Biol Chem (1991) 7329-32.

Koenig, R. J., et al., J Biol Chem (1977) 2992-7.

Monnier, V. M. and Cerami, A., Clinics in Endocrinology and Metabolism (1982) 431-52.

Monnier and Cerami, Maillard Reaction in Food and Nutrition, ed. Waller, G. A., American Chemical Society (1983) 431-448.

Nakayama et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 162 (1989) 740-745.

Nawroth, P. P., et al., Med Klin (1999) 29-38

Pure Appl Chem (1979) 1803-1814.

Tijssen, P. (1990) Elsevier Science Publishers B.V.

van Weemen, B.K. and Schuurs A.H.W.M. (1971), FEBS Ietters 15, 232

"Methods in Enzymology", Colowick S.P., Captan NO., Eds., Academic Press, Volumes 70, 73, 74, 84, 92 and 121.

EP 0 331 127

US 5,610,076

US 5,698,197

WO 93/13421

WO 95/29692

Claims (5)

1. Método para la selección y/o control de calidad de un reactivo o un componente recubierto de fase sólida para utilizarlos en un ensayo para la detección o medida de un producto final de glicosilación avanzado (AGE) utilizando como mínimo un compañero de unión AGE, caracterizados en que, tanto el mencionado reactivo como el mencionado componente de fase sólida son sometidos a test sobre su contenido en AGE y siendo tal reactivo o componente recubierto de fase sólida solamente seleccionado de forma que no reaccione con el compañero de unión AGE utilizado para realizar el ensayo.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado en que, además dicha selección o dicho control de calidad se realizan calculando la tasa de señal/ruido en un ensayo de unión AGE.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado en que, la señal específica de AGE obtenida en el mencionado ensayo de unión es como mínimo 5 veces superior en comparación con la señal de fondo del sistema.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado en que, además dicha selección o dicho control de calidad se realizan utilizando un inmunoensayo competitivo para AGE.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado en que, en un ensayo AGE de tipo competitivo la señal de fondo de un reactivo o componente recubierto de fase sólida no puede ser reducida de forma significativa por el antígeno AGE específico bajo investigación.