ES2231382T3

ES2231382T3 - Metodo para la generacion de linfocitos precursores de vertebrados geneticamente modificados, y uso de los mismos para la produccion de proteinas de union heterologas.

Info

Publication number: ES2231382T3
Application number: ES01130805T
Authority: ES
Inventors: Ulf Grawunder; Georg Friedrich Melchers
Original assignee: 4ANTIBODY AG; 4-Antibody AG
Current assignee: 4ANTIBODY AG; 4-Antibody AG
Priority date: 2001-12-22
Filing date: 2001-12-22
Publication date: 2005-05-16
Anticipated expiration: 2021-12-22
Also published as: DE60106469D1; EP1321477B1; ATE279441T1; EP1321477A1; DK1321477T3; DE60106469T2

Abstract

Un método para la generación de linfocitos de vertebrados que se pueden usar para la producción de cualquier proteína de unión o de un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, con la capacidad de unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno compuesto de dominios variables y regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a la membrana, cualquier proteína de unión artificial que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales, no derivables de receptores de antígenos o inmunoglobulinas heterólogas codificadas por la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, que comprende las etapas de: (a) modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, que (i) derivan de órganos linfoides primarios, y (ii) tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura,mediante la introducción de al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, y (b) efectuar la diferenciación de dichos linfocitos precursores genéticamente modificados en células de línea linfoide madura tanto in vitro como in vivo, generando de ese modo linfocitos capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, con la condición de que se excluya la producción in vivo en seres humanos.

Description

Método para la generación de linfocitos precursores de vertebrados genéticamente modificados, y uso de los mismos para la producción de proteínas de unión heterólogas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a los campos de la ingeniería genética y de la producción de anticuerpos. En particular, se refiere a la generación de linfocitos precursores de vertebrados genéticamente modificados que tienen el potencial para diferenciarse en más células de estirpe linfoide maduras, y al uso de los mismos para la producción de cualquier anticuerpo o proteína de unión heteróloga.

Antecedentes de la invención

Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales son reactivos eficaces tanto para el diagnóstico, la prevención como la terapia de enfermedades (Glennie y Johnson, Immunol. Today, 21, p. 403-410, 2000). Esto es debido a su capacidad única para unirse muy específicamente a epítopos particulares sobre moléculas diana (antígenos) vía sus dominios variables y, al mismo tiempo, para mediar funciones efectoras vía sus dominios de región constante (Frazer y Capra, Fundamental Immunology, W.E. Paul (Ed.), Cuarta Edición, p. 37-74, 1999) (Fig. 1). Esto permite a los anticuerpos monoclonales identificar específicamente antígenos únicos en mezclas complejas de macromoléculas, y dirigir funciones efectoras hacia esas dianas.

Los anticuerpos (o inmunoglobulinas) constan de dos glicoproteínas de cadena pesada (H) y de cadena ligera (L) idénticas que están enlazadas vía enlaces de disulfuro (Fig. 1). Cada una de las cadenas H y L comprende un dominio variable N-terminal que varía entre diferentes anticuerpos, y una región constante C-terminal que es idéntica en diferentes anticuerpos que pertenecen al mismo isotipo de inmunoglobulinas (Fig. 1). La combinación de los dominios variables de la cadena H y de la cadena L genera la cavidad de unión del anticuerpo al antígeno y determina su especificidad (o idiotipo), mientras que las regiones constantes determinan su isotipo (Frazer y Capra, s.a.). La variabilidad de las inmunoglobulinas resulta del hecho de que los dominios V_{H} y V_{L} están codificados por una multitud de segmentos génicos, que se denominan segmentos génicos V (variable), D (diversidad; sólo presente en el locus de cadena H), y J (unión) (Tonegawa, Nature, 302, p. 575-581, 1983) (Fig. 1). Durante la diferenciación de los linfocitos B uno de los segmentos génicos V, D y J se selecciona al azar en cada célula para el proceso de recombinación específico del sitio de la recombinación V(D)J, que ensambla los segmentos génicos, de forma que se generan nuevas regiones codificantes para los dominios V_{H} o V_{L} (Grawunder et al., Curr. Opin. Immunol., 10, p. 172-180, 1998). Debido a la multitud de segmentos génicos V, D y J, y debido a la imprecisión en la unión de los segmentos génicos, se puede generar un repertorio enorme de diferentes especificidades de región V por los millones de linfocitos B producidos por el sistema inmunitario cada día (Melchers et al., Curr. Opin. Immunol., 7, p. 214-227, 1995).

Durante la evolución, se ha producido una ligera divergencia de los genes de inmunoglobulinas entre especies diferentes, de forma que las regiones constantes de los anticuerpos difieren entre las especies. Como consecuencia, las inmunoglobulinas de una especie a menudo son inmunógenas, si se introducen en el sistema vascular de otra especie.

La inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales xenogénicos limita por lo tanto su uso en la terapia de la enfermedad de seres humanos, debido a que la exposición de los pacientes a anticuerpos xenogénicos puede dar como resultado efectos adversos, incluso toxicidad aguda, o simplemente puede conducir a la neutralización y aclaramiento del anticuerpo aplicado, reduciendo de ese modo su eficacia farmacológica (Clark, Immunol Today, 21, p. 397-402, 2000). Por el contrario, la administración de anticuerpos totalmente humanos a pacientes habitualmente no conduce a ninguna de las complicaciones mencionadas anteriormente.

Los antisueros humanos o anticuerpos policlonales humanos se han aislado ocasionalmente de la sangre de pacientes individuales para el tratamiento o prevención de enfermedades raras y habitualmente muy letales, como infecciones por el virus del Ébola, o por ejemplo para el tratamiento de pacientes después de la exposición a venenos de serpiente. Sin embargo, este enfoque, por muchas razones, es poco práctico para el tratamiento de enfermedades que afectan a poblaciones más grandes. Además, por razones éticas, es imposible inmunizar a seres humanos con un antígeno dado con el fin de producir anticuerpos monoclonales, debido a que las células de la estirpe B en seres humanos que producen los anticuerpos deseados se desarrollan y residen en órganos linfoides secundarios y no se pueden obtener fácilmente. Además, muchos antígenos diana potenciales para anticuerpos terapéuticos, en particular para la terapia del cáncer, son proteínas humanas (Glennie y Johnson, s.a.). En condiciones normales, los seres humanos no desarrollarán anticuerpos frente a estas dianas. Por lo tanto, se han realizado importantes esfuerzos en el pasado reciente por desarrollar procedimientos para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos humanos o humanizados sin la necesidad del sistema inmunitario del ser humano.

El enfoque más simple usa técnicas estándares de ingeniería genética para clonar los ADNc que codifican los dominios variables de las cadenas H y L (dominios V_{H} y V_{L}) a partir de un hibridoma que segrega un anticuerpo xenogénico de especificidad deseada. Los ADNc de las regiones variables clonados se clonan entonces en vectores de expresión de E. coli, de levadura, de células de insectos o de células de mamíferos apropiados que contienen genes humanos de región constante. Esto permitirá la producción de anticuerpos monoclonales con los dominios V_{H} y V_{L} xenogénicos fusionados a los dominios humanos de las regiones constantes C_{H} y C_{L}, dando de ese modo como resultado un anticuerpo humanizado. Sin embargo, este enfoque tiene la desventaja de que la fusión de los dominios V_{H} y V_{L} xenogénicos a las regiones constantes C_{H} y C_{L} humanas puede dar como resultado una disminución de la afinidad o una alteración de la especificidad. Además, los dominios V_{H} y V_{L} heterólogos del anticuerpo humanizado aún son inmunogénicos en seres humanos, debido a que las regiones de armazón de los dominios V varían entre diferentes especies. Este problema se puede esquivar en algunos casos injertando regiones individuales que determinan la complementariedad (CDR), que median el contacto directo con antígenos, sobre las regiones humanas de armazón de los dominios variables de la cadena H y de la cadena L (Fiorentini et al., Immunotechnology, 3, p. 45-59, 1997). Sin embargo, por razones desconocidas, el injerto de CDR todavía da como resultado a menudo la generación de anticuerpos inmunogénicos y/o la disminución/pérdida de afinidad y de especificidad.

Por lo tanto, se han desarrollado en años recientes dos enfoques diferentes y más eficaces para la generación de inmunoglobulinas completamente humanas.

El primer método se basa en la expresión (presentación) de regiones variables de una sola cadena (scFv) que constan de un dominio V_{H} y V_{L} sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos de E. coli (Hoogenboom y Chames, Immunol. Today, 21, p. 371-3818, 2000) (véanse también los documentos EP 0.585.287 B1, EP 0.605.522 B1). Se pueden construir librerías de presentación de fagos que contienen un repertorio diverso de cadena V_{H} y V_{L}, y se pueden aislar especificidades de scFv individuales a partir de tales librerías mediante la unión de fagos recombinantes a antígeno inmovilizado (McCafferty et al., Nature, 348, p. 552-554, 1990).

Las librerías de presentación de fagos para las proteínas de unión a scFv derivadas de un repertorio humano natural tienen el inconveniente de estar restringidas a especificidades contenidas en ese repertorio, y por lo tanto muy a menudo no se representan en estas librerías las especificidades para muchos antígenos humanos. Aunque para obviar este problema se pueden usar librerías de presentación de fagos combinatorias o sintéticas, un inconveniente general de esta tecnología es que a menudo no se pueden aislar proteínas de unión de elevada afinidad para un antígeno dado. Por lo tanto, se han invertido esfuerzos sustanciales en la construcción de librerías primarias muy grandes mediante procedimientos de clonación por fuerza bruta o de recombinación específica del sitio.

Se estima que las mejores librerías combinatorias o sintéticas contienen 10^{9}-10^{11} sitios de unión potencialmente diferentes y pueden producir especificidades de unión en el intervalo de 1-200 nM (Hoogenboom y Chames, s.a.). Sin embargo, mayores afinidades, en el intervalo picomolar (10^{-12} M), que se pueden alcanzar durante la maduración por afinidad de inmunoglobulinas en células B de centro germinal in vivo, sólo se pueden generar empleando procedimientos adicionales de ingeniería genética muy tediosos, incluyendo el barajado de genes V, PCR con tendencia al error, el uso de cepas mutadoras de E. coli, etc.

Cualquiera que sea el resultado de un proceso de selección de librería de visualización de fago, eventualmente los genes que codifican el sitio de unión de scFv necesitan ser reclonados en vectores de expresión adecuados para inmunoglobulinas humanas, y estos necesitan ser transferidos establemente a un sistema de expresión celular que permita la producción a gran escala de anticuerpos humanos, lo que es otro procedimiento caro y que consume tiempo.

El segundo enfoque para la producción de anticuerpos monoclonales totalmente humanos se basa en el uso de ratones transgénicos que portan constructos para los locus génicos de cadenas H y L de inmunoglobulinas humanas (Jakobovits, Curr. Opin. Biotechnol., 6, p. 561-566, 1995). Los transgenes de inmunoglobulina humana se reproducen eventualmente en un antecedente genético que ya no permite el ensamblaje de los genes del receptor del antígeno murino endógeno. En estos ratones, el desarrollo de las células de estirpe B depende de la expresión de las cadenas H y L de inmunoglobulinas a partir de constructos transgénicos humanos, y las células de estirpe B de estos ratones sólo son capaces de producir anticuerpos humanos. Hay tres variaciones de esta técnica. En una, se usan los minilocus de inmunoglobulina humana como transgenes, a partir de los cuales se puede generar sólo un repertorio limitado de anticuerpos humanos (Fiswild et al., Nat. Biotechnol., 14, p. 845-851, 1996) (véase también los documentos EP 0.546.073 B1, US 5.874.299, WO 92/03918). En una segunda variación, se usan regiones grandes de los locus génicos de las cadenas IgH e Ig\kappaL humanos que engloban la mayoría de los segmentos génicos de región variable clonados en cromosomas artificiales de levadura. En una tercera variación, se integran cromosomas humanos que contienen todos los locus génicos de cadena H y cadena L de inmunoglobulina humana en la línea germinal de ratones que generan los así denominados animales transcromosómicos. Los ratones con tales transgenes complejos desarrollan un repertorio de inmunoglobulina humana prácticamente normal.

La inmunización de estos ratones transgénicos o transcromosómicos da como resultado una respuesta inmunitaria humoral que da como resultado la generación de anticuerpos totalmente humanos. Este enfoque para generar anticuerpos humanos tiene una ventaja importante con respecto a la tecnología de librería de visualización de fagos: se pueden generar anticuerpos de elevada afinidad por un antígeno dado, debido a que las inmunoglobulinas humanas pueden sufrir una maduración de afinidad en células B con centros germinales, lo que es un proceso normal en el transcurso de una reacción inmunitaria.

Sin embargo, hay un inconveniente importante en esta tecnología: primeramente, la generación de ratones transgénicos o transcromosómicos es muy tediosa, difícil, consume tiempo y por lo tanto es relativamente cara. Por ejemplo, el documento WO 92/03918 describe células B de un ratón transgénico que expresan anticuerpos monoclonales humanos. A fin de lograr este ratón transgénico, se transfectan huevos fertilizados con elementos exógenos introduciendo transgenes de cadena IgH e IgL heterólogos mediante inyección pronuclear. El procedimiento completo requiere la generación de al menos cuatro razas diferentes de ratones: dos razas con interrupciones seleccionadas dentro de los locus génicos de cadena IgH e IgL endógenos, así como dos razas que tienen transgenes o transcromosomas para parte o todos los locus génicos de cadena IgH e IgL humanos. Además, estas cuatro razas de ratón se han de reproducir juntas, dando como resultado ratones con un genotipo que tiene interrupciones homocigóticas de ambos locus génicos de cadena IgH e IgL endógenos y al mismo tiempo que tiene los transgenes humanos que codifican ambas cadenas IgH e IgL heterólogas. La generación de las diferentes razas de ratones transgénicos y ratones con uno de sus genes inactivados, su selección sistemática y su reproducción cruzada eventual es un procedimiento largo que requerirá al menos dos años, incluso si cada etapa se optimiza completamente. Por lo tanto, los marcos de tiempo prolongados requeridos para el desarrollo de una raza de xenorratón deja poca flexibilidad para diseñar diferentes razas de ratón que contengan constructos transgénicos modificados. Por lo tanto, esta tecnología no es adecuada para la modificación y mejora de anticuerpos existentes (por ejemplo de su afinidad), debido a que esto requeriría el largo procedimiento de generar una nueva raza de ratones transgénicos para este anticuerpo. Por lo tanto, esta tecnología está restringida básicamente a la generación de novo de anticuerpos humanos.

Basándose en los factores mencionados anteriormente, existe claramente la necesidad de una tecnología que permita la producción de anticuerpos totalmente humanos que combine las ventajas tanto del sistema de visualización de fagos (es decir, velocidad y flexibilidad en la generación de anticuerpos humanos, y la capacidad para modificar y mejorar las propiedades de anticuerpos existentes), como de la tecnología de ratones transgénicos para inmunoglobulinas humanas (es decir, la capacidad para obtener anticuerpos de elevada afinidad debido a la maduración de afinidad que aparece en el sistema inmunitario, y la producción de anticuerpos con características estructurales naturales y fisiológicas).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona medios y métodos para generar linfocitos precursores de vertebrados que se pueden usar para la producción de cualquier proteína de unión o de un fragmento o fragmentos funcionales de la misma con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, receptor de antígeno compuesto de dominios variables y regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a la membrana, cualquier proteína de unión artificial que presente funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje como funciones efectoras artificiales o modificadas no derivables de la línea germinal codificada por inmunoglobulinas heterólogas o receptores de antígenos, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos. En particular, la invención proporciona medios y métodos para modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, y para efectuar su diferenciación en líneas celulares linfoides más maduras tanto in vitro como in vivo, generando de ese modo linfocitos capaces de producir a proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, así como un método para la producción de dicha proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma. Además, la presente invención proporciona linfocitos precursores de vertebrados genéticamente modificados y células de línea linfoide madura así como células inmortalizadas derivadas de los mismos adecuadas para llevar a cabo los métodos según la invención.

De este modo, los métodos de la presente invención permiten una gran flexibilidad para la generación de células de línea linfoide con el potencial de expresar simplemente cualquier tipo de anticuerpo o proteína de unión, dentro de períodos cortos de tiempo. Al mismo tiempo, la posibilidad de transplantar estas células en hospedantes de vertebrados compatibles, en los que las células participan en funciones inmunitarias específicas, tales como maduración de afinidad, permite que se explote la selectividad del sistema inmunitario para generar anticuerpos y proteínas de tipo inmunoglobulínicas o incluso proteínas de unión artificiales de afinidades de unión elevadas para cualquier compuesto o composición antigénica dada.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática de la estructura y genética de las inmunoglobulinas. Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) son glicoproteínas que, en su forma monómera, están compuestos de dos cadenas pesadas idénticas (IgH) y dos cadenas ligeras idénticas (IgL) que están enlazadas covalentemente mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena IgH comprende un dominio variable N-terminal (V_{H}) y 3-4 dominios de región constante (C_{H} 1-3, o 4), dependiendo del isotipo del anticuerpo. Además, los anticuerpos contienen una región bisagra entre el primer y el segundo dominio C_{H}, dotando de flexibilidad a los dos brazos de unión al antígeno de la glicoproteína heterotetrámera. Las cadenas ligeras constan de un solo dominio variable N-terminal (V_{L}) y un dominio constante C-terminal (C_{L}). La disposición de las dos cadenas IgH e IgL da como resultado un anticuerpo monómero con forma de Y, con dos sitios de unión altamente variables para el antígeno, que se forman mediante la asociación de los dominios variables de las cadenas IgH e IgL. Los dominios variables difieren en gran medida de las denominadas regiones hipervariables, si las regiones V se comparan entre diferentes anticuerpos. Esta variabilidad resulta del hecho de que las regiones V no están codificadas por genes individuales, sino que, en el caso de las regiones V_{H}, lo están por un número de diferentes segmentos génicos V, D y J, a partir de los cuales cada uno se selecciona al azar y entonces se recombinan para formar la región codificante variable de las cadenas IgH (véase la parte superior izquierda del dibujo). Este proceso se denomina recombinación V(D)J y ocurre durante el desarrollo temprano de las células B. Los locus génicos de la cadena IgL contienen sólo un número de diferentes segmentos génicos V y J, a partir de los cuales se generan las regiones codificantes para los dominios variables mediante una reorganización al azar de V a J (véase la parte superior derecha del dibujo). Los dominios de región constante de los anticuerpos procedentes de la misma subclase (isotipo) determinan las funciones defectoras del anticuerpo, y no difieren entre anticuerpos diferentes. Sin embargo, en el transcurso de una respuesta inmunitaria, se puede inducir a los linfocitos B individuales a cambiar el isotipo del anticuerpo que se expresa. En este caso, se produce un suceso de recombinación de ADN somática entre regiones de canje (indicadas mediante un punto en la representación gráfica de los genes de región constante en la parte inferior del dibujo) localizadas en 5' de los diferentes genes de región constante. Por ejemplo, la recombinación entre las regiones de canje \mu y \varepsilon puede dar como resultado la eliminación de todos los genes de región constante de C\mu a C\gamma4, según se indica en el dibujo. Como resultado de esto, se produce un acercamiento de la región codificante variable VDJ a una región constante C\varepsilon, conduciendo a la expresión de un anticuerpo de isotipo IgE.

La Figura 2 muestra el desarrollo de células B en el ratón. La diferenciación de linfocitos B en el ratón se puede subdividir en diferentes etapas que se pueden subdividir fenotípica y genotípicamente. Las células precursoras B (preB) más tempranamente asignadas que se pueden encontrar en la médula ósea de ratones de tipo salvaje derivan de hemocitoblastos (HSC, izquierda), que no expresan marcadores específicos de línea (que se designa como LIN^{-}), pero que se caracteriza por la expresión en superficie de antígeno 1 de hemocitoblasto (Sca-1). A partir de esto, se generan células preB que habitualmente tienen reordenamientos DJ_{H} en ambos alelos de cadena IgH, y que se caracterizan por la expresión en superficie de B220 (un pan marcador de células B) y un kit c. En esta etapa, todos los otros locus génicos de Ig están aún habitualmente en la configuración de la línea germinal (GL). Las células preB reordenadas DJ_{H} se denominan células preB-I y se pueden expandir en cultivo de tejido en condiciones específicas. El siguiente suceso de reordenamiento en estas células implica uno de los segmentos génicos V_{H} que se reordena a un elemento DJ_{H} preexistente. Si esto conduce a un reordenamiento productivo en cualquier alelo de forma que se pueda expresar una cadena \muH, estas células reciben una señal proliferativa, se expanden y se diferencian en células preB-II. Estas células pierden la expresión del marcador de superficie c-kit, pero ganan la expresión de CD25. Otro reordenamiento productivo en cualquiera de los alelos de cadena IgL da como resultado la diferenciación a células B inmaduras que expresan IgM unida a membrana. Estas células B inmaduras, sin tratamiento, pueden abandonar la médula ósea, migrar a órganos linfoides periféricos, en los que eventualmente pueden encontrar un antígeno. En el transcurso de una respuesta inmunitaria, estas células B se pueden diferenciar entonces en células plasmáticas que segregan anticuerpos, durante lo cual puede ocurrir otro proceso de recombinación de ADN (recombinación por cambio de clase) en el locus de región constante de IgH, dando como resultado el cambio de isotipo de anticuerpo que se segrega por las células plasmáticas.

La Figura 3 es una vista esquemática del método según la invención para la generación de linfocitos B precursores humanizados (HupreB). Se pueden aislar células preB-I reordenadas DJ_{H} murinas a partir de hígado fetal de ratones de 14-19 días tras el coito, o de la médula ósea de ratones adultos (Etapa 1). El cultivo a largo plazo de estas células requiere condiciones de cultivo de tejido especiales, incluyendo capas alimentadoras de células estrómicas y/o la presencia de ciertos factores de crecimiento, tales como, por ejemplo, IL-7 (interleuquina 7). En estas condiciones, las células preB-I no se diferencian más (Etapa 2). A fin de usar estas células para la producción de anticuerpos heterólogos, se debe evitar que se realicen en estas células otros reordenamientos de genes de Ig endógenos productivos. Esto se puede lograr, por ejemplo, introduciendo una mutación o mutaciones que actúan en cis en ambos alelos de los locus génicos de cadena IgH e IgL (Etapa 3b), o, como alternativa, introduciendo una mutación o mutaciones que actúan en trans que impida la recombinación V(D)J adicional de genes Ig, por ejemplo eliminando uno de los dos genes activadores de la recombinación, RAG-1 o RAG-2 (Etapa 3a). Estas últimas células se pueden transducir entonces establemente con retrovirus recombinantes capaces de mediar la expresión de cadenas IgH e IgL xenogénicas, en este caso humanas (Etapa 4a). Estos vectores retrovíricos también se pueden usar para la transducción estable de aquellas células que tienen mutaciones que actúan en cis en los locus génicos de Ig endógenos. Además, las células preB que tienen mutaciones que actúan en cis aún son competentes para los reordenamientos de genes de Ig. Por lo tanto, es posible transfectar establemente estas células con locus génicos de Ig de línea germinal heteróloga, que pueden sufrir reordenamientos V(D)J, y a partir de las cuales se pueden producir nuevos anticuerpos xenogénicos (Etapa 4b). Si los genes de cadena IgH e IgL heterólogos o xenogénicos son de origen humano, las células preB-I sólo tendrán el potencial para la expresión de anticuerpos totalmente humanos, y por lo tanto se denominan como células HupreB.

La Figura 4 es una representación esquemática que ilustra la selección de los locus génicos endógenos usando vectores de selección de genes positivos-negativos. Para la selección de locus génicos endógenos, se clona una región genómica de aproximadamente 1 kb en dirección 5' (brazo corto) de ese locus y una región de aproximadamente 3 kb (brazo largo) en dirección 3' de ese gen, en un vector de selección positivo-negativo vacío. Como ejemplo, se representa la estrategia de selección para un locus de cadena IgH reordenada DJ_{H}3. Este constructo se transfecta en células preB-I, y la integración del vector de selección mediante recombinación homóloga se selecciona y se detecta eventualmente de forma sistemática. El marcador de selección positiva permite la selección para la integración estable del constructo en el genoma de la célula transfectada. La expresión del marcador de selección negativa sería tóxica para la célula, y las células sólo sobrevivirían si el marcador de selección negativa se pierde con la integración estable, lo que ocurre mediante dos sucesos de recombinación homóloga en el locus correcto. Se indican mediante líneas cruzadas dos sitios posibles para la recombinación homóloga entre el locus génico endógeno y el constructo de selección. Si ocurre la integración del constructo mediante tales sucesos de recombinación homóloga, el marcador de selección de fármaco positivo sustituye a la región endógena localizada entre los brazos corto y largo de homología. Si el marcador de selección positiva está flanqueado por dos señales de recombinación loxP, como se indica aquí, la expresión transitoria de cre recombinasa puede mediar la eliminación del marcador de selección, de forma que se puede usar el mismo constructo de selección para seleccionar el segundo alelo del mismo locus génico.

La Figura 5a ilustra la estrategia de clonación para la construcción de un vector de selección del locus génico de cadena IgH. La estrategia de clonación detallada para la construcción de un posible constructo de selección para los locus génicos de cadena IgH murinos reordenados DJ_{H} se representa aquí en el ejemplo de un locus génico reordenado D_{FL16,1}-J_{H}4. Se pueden seleccionar otros locus génicos de cadena IgH reordenados DJ_{H} con el mismo vector de selección. Los sitios de restricción únicos se indican en el locus génico endógeno (constructo superior), y se indican las regiones de 1523 y 3215 pb que se clonan mediante PCR a partir de ADN genómico en el vector de selección positivo-negativo vacío pBSL-flneo-DT4 (véase la Fig. 6b, se escogió pBSL-flneo-DT4 como un ejemplo de diversos vectores de selección vacíos diferentes). Los cebadores de PCR para los brazos corto y largo se diseñan para que contengan los sitios de restricción NotI y AscI para la clonación de los fragmentos en los sitios de restricción único y compatible en pBSL-flneo-DT4. La organización del constructo de selección final se representa en la parte inferior, y se indican las posiciones de los sitios de restricción seleccionados.

La Figura 5b ilustra la estrategia de clonación para la construcción de un vector de selección del locus génico de cadena Ig\kappaL. Se representa aquí la estrategia de clonación detallada para la construcción de un posible constructo de selección para los locus génicos de cadena Ig\kappaL murinos diseñados para la eliminación mediante selección de todos los segmentos génicos J\kappa de línea germinal. Los sitios de restricción únicos se indican en el locus génico endógeno (constructo superior), y se indican las regiones de 739 y 3379 pb que se clonan mediante PCR a partir de ADN genómico en el vector de selección positivo-negativo vacío pBSL-flneo-DT4 (véase la Fig. 6b, se escogió pBSL-flneo-DT4 como un ejemplo de diversos vectores de selección vacíos diferentes). Al igual que en la Fig. 5a, los cebadores de PCR para los brazos corto y largo se diseñan para que contengan los sitios de restricción NotI y AscI para la clonación de los brazos corto y largo en sitios de restricción compatibles de pBSL-flneo-DT4. La organización del constructo de selección final se representa en la parte inferior, y se indican las posiciones de los sitios de restricción seleccionados.

La Figura 5c ilustra la estrategia de clonación para la construcción de un vector de selección del locus génico RAG. Se representa aquí la estrategia de clonación detallada para la clonación de un posible constructo de selección para el locus génico RAG murino diseñado para la eliminación por selección del gen RAG-1. El locus del gen RAG en el ratón está localizado en el cromosoma 2 y contiene dos genes estrechamente ligados, RAG-1 y RAG-2, que son esenciales cada uno de ellos para los reordenamientos de genes Ig. Los marcos de lectura abierta (ORF) de ambos genes están codificados por un único exón, pero un exón corto sin traducir, en dirección 3' de cada elemento promotor (indicado mediante triángulos), se empalma con un exón grande que contiene todos los ORF de RAG. Los sitios de restricción únicos se indican en el locus génico endógeno (constructo superior). Las regiones genómicas de 1078 y de 2950 pb en dirección 5' y en dirección 3' del ORF de RAG-1, respectivamente, se clonan mediante PCR a partir de ADN genómico en el vector de selección positivo-negativo vacío pBSL-flneo-DT4, según se indica (véase la Fig. 6b, para pBSL-flneo-DT4 que se escogió como un ejemplo de diversos vectores de selección vacíos diferentes). Al igual que en la Fig. 5a, los cebadores de PCR para los brazos corto y largo se diseñan para que contengan los sitios de restricción NotI y AscI para la clonación de los brazos corto y largo en sitios de restricción compatibles de pBSL-flneo-DT4. La organización del constructo de selección final se representa en la parte inferior, y se indican las posiciones de los sitios de restricción seleccionados.

La Figura 6a muestra la estrategia de clonación detallada para vectores positivos-negativos a base de DT-\alpha y DT-\alpha (tox176) para la selección de genes (etapas preparatorias). Un prerrequisito para la generación de vectores de selección vacíos es extender el sitio de clonación múltiple (MCS) de un plásmido de clonación regular, como pBluescript, de forma que se añadan sitios de restricción útiles adicionales al poliligador, que entonces se puede usar para la inserción de los casetes de expresión para marcadores de selección positivos y negativos, así como para regiones genómicas requeridas para la selección de un locus génico endógeno mediante recombinación homóloga. Se representa aquí la inserción de un oligómero adicional con sitios de restricción adicionales en el MCS de pBluescript, generando de ese modo el plásmido pBSL con un poliligador extendido. Este constructo se usa para insertar un promotor de \beta-actina accionado por el casete de expresión para la toxina \alpha de difteria de tipo salvaje o una versión atenuada de la misma, representada como DT\alpha(tox176) (véase el ejemplo 5b, etapa 2). Estos dos constructos con el sitio de clonación múltiple extendido se denominan pBSL-DT4 (parte inferior, izquierda) y pBSL-DT4tox176 (parte inferior, derecha), respectivamente. Los casetes de expresión de la toxina de difteria se clonan en pBSL usando los sitios de restricción XbaI y BgIII, según se indica. Igualmente se indica un sitio de restricción NheI de diagnóstico que es único para el casete de expresión de Dttox176 atenuada.

La Figura 6b ilustra la estrategia de clonación detallada para vectores positivos-negativos a base de DT-\alpha y DT-\alpha(tox176) para la selección de genes (etapas de clonación finales). Se describe la clonación de vectores de selección positivos-negativos vacíos, que contienen neomicina, higromicina B o puromicina como marcadores de selección positivos, y un casete de expresión de la toxina \alpha de la difteria de tipo salvaje. Se pueden usar las mismas estrategias de clonación para vectores que contienen un casete de expresión para DT-\alpha(tox176) en su lugar. Se indican las enzimas de restricción usadas para la clonación de fragmentos y la linealización de constructos. Todos los marcadores de selección positivos se diseñan para que estén flanqueados por sitios loxP (flanqueados) que se pueden reconocer mediante cre recombinasa. Aunque un casete de expresión de neomicina flanqueado se puede reclonar a partir del vector existente pGL2-neo (m)+ (DSM 14705), los casetes de expresión de higromicina B flanqueados y de puromicina flanqueados necesitan ser insertados en dos etapas. Para esto, se insertó un oligómero de ADN sintético, que contiene dos sitios loxP separados mediante un sitio MluI, en pBSL-DT4 a fin de generar pBSL-DT4-2loxP, según se indica. En una etapa final, los casetes de expresión para resistencia a higromicina B y a puromicina se clonaron mediante PCR en el sitio único de MluI de pBSL-DT4-2loxP.

La Figura 7a muestra la organización esquemática de vectores de expresión retrovíricos para cadenas IgH humanas. Los vectores retrovíricos recombinantes, que permiten la expresión de proteínas de cadena IgH humanas, muestran un diseño modular que contiene el promotor del locus de Ig y elementos potenciadores, así como también regiones codificantes para los dominios de región variable y constante de cadenas IgH. La orientación transcripcional del casete de expresión de IgH es opuesta a la del elemento promotor de 5'LTR retrovírico, a fin de conferir un patrón de expresión específico de la célula B basándose en el promotor específico de Ig y en los elementos potenciadores. El casete de expresión contiene un promotor V_{H} murino, una secuencia líder (L) con exones VDJ que codifican dominios variables de IGH, el potenciador de cadena pesada del intrón murino (E\muH), exones que codifican las regiones constantes de cadenas de IgH heterólogas, exones para las regiones de expansión membránica de inmunoglobulinas, y elementos procedentes del potenciador 3'\alpha de IgH murino. Las diferentes regiones L-VDJ, e incluso las librerías de las regiones L-VDJ, se pueden clonar en los sitios de restricción únicos BamHI y HindIII del vector de expresión de IgH usando enzimas de restricción que generan proyecciones compatibles. Debido al diseño modular, los exones de región constante o los elementos potenciadores se pueden sustituir usando técnicas de biología molecular simples (según se indica).

La Figura 7b muestra la organización esquemática de vectores de expresión retrovíricos para cadena Ig\kappaL humanas. Al igual que los vectores representados en la Fig. 7a, los vectores retrovíricos recombinantes que permiten la expresión de las proteínas de cadena Ig\kappaL humanas, muestran un diseño modular similar que contiene el promotor del locus específico de cadena IgL y elementos potenciadores, así como también regiones codificantes para los dominios de las regiones variable y constante de las cadenas Ig\kappaL. La orientación transcripcional del casete de expresión de Ig\kappaL es opuesta a la del elemento promotor 5'LTR retrovírico, a fin de conferir un patrón de expresión específico a la célula B basándose en el promotor específico de Ig y en los elementos potenciadores. El casete de expresión contiene un promotor V\kappa murino, una secuencia líder (L) con exones VJ que codifican dominios variables de Ig\kappaL, el potenciador del intrón \kappa murino (\kappaIE), exones que codifican la región constante de las cadenas IgL heterólogas, y elementos procedentes del potenciador 3' de Ig\kappa murino (\kappa3'E), según se indica. Además, los vectores de expresión de cadena Ig\kappaL retrovíricos contienen un casete de expresión completo de puromicina, que permite la selección de células preB transducidas de forma estable. Las diferentes regiones L-VJ, e incluso las librerías de regiones L-VJ, se pueden clonar en los sitios de restricción únicos BamHI y HindIII del vector de expresión de IgH usando enzimas de restricción que generan proyecciones compatibles. Debido al diseño molecular, los exones modificados de la región constante o los elementos potenciadores se pueden sustituir usando técnicas de biología molecular simples (según se indica).

La Figura 8 ilustra el procedimiento para la transducción retrovírica de células preB dependientes de células estrómicas/IL7 murinas con vectores retrovíricos que codifican cadenas IgH e IgL heterólogas. Se pueden transducir secuencialmente líneas celulares preB dependientes de células estrómicas/IL7 que proliferan a largo plazo con mutaciones que interfieren con los reordenamientos de genes de Ig endógenos (véase la Fig. 3), con vectores de expresión retrovíricos que codifican cadenas de IgL y cadenas de IgH, según se indica. Después de la transducción sucesiva con el primer constructo de cadena IgL heterólogo y después con el constructo retrovírico que expresa la cadena IgH, las células tienen el potencial para expresar anticuerpos heterólogos con la diferenciación de las células tanto in vitro como in vivo (véase la Fig. 10).

La Figura 9 es una vista esquemática de fuentes a partir de las que se pueden aislar regiones que codifican los dominios variables. Las regiones que codifican los dominios variables se pueden aislar de muchas fuentes diferentes, según se indica en esta figura. El diseño modular de los vectores retrovíricos permite la clonación de vectores retrovíricos que codifican, por ejemplo, sólo una única especificidad, por ejemplo a partir de un anticuerpo monoclonal útil existente. Con la transducción de estos vectores y el transplante de células transducidas en ratones in vivo (véase la Fig. 10), entonces se pueden someter a las especificidades individuales a una maduración de afinidad. Como alternativa, las librerías VDJ y VJ completas se pueden aislar de linfocitos de sangre periférica (PBL) a partir de pacientes sanos, enfermos o inmunizados, y entonces se pueden clonar en vectores de expresión retrovíricos de cadena IgH e IgL. De hecho, incluso es posible generar repertorios de región V_{H} y V_{L} completamente sintéticos que se pueden clonar en vectores de expresión de Ig retrovíricos, que se pueden transducir después de forma estable y se pueden seleccionar funcionalmente in vivo (véase la Fig. 10).

La Figura 10 ilustra el transplante de HupreB en ratones inmunodeficientes para la producción de anticuerpos monoclonales completamente humanos. Las células HupreB, al igual que las células preB murinas normales, se pueden transplantar en hospedantes murinos, en los que son capaces de participar en respuestas inmunitarias del hospedante. Si las células HupreB se transplantan en hospedantes inmunodeficientes que carecen de células B endógenas, los únicos anticuerpos que entonces se pueden producir son anticuerpos heterólogos (humanos) a partir de las células HupreB transplantadas. Hay muchas razas hospedantes diferentes que se pueden usar para el transplante de células HupreB. Las razas que carecen tanto de linfocitos B como T son, por ejemplo, las razas de ratón deficientes de RAG-1 y RAG-2 y razas de ratón scid. A fin de ser capaces de provocar una respuesta inmunitaria dependiente de células T que implica linfocitos B derivados de células HupreB transplantadas, se pueden aislar poblaciones linfocíticas auxiliares T y se pueden cotransplantar en estos ratones (lado izquierdo). Como alternativa, las razas de ratones que carecen sólo de linfocitos B, como por ejemplo ratones deficientes de J_{H}, se pueden reconstituir mediante transplante con células HupreB solas (lado derecho). Una vez que los compartimientos de linfocitos B y T periféricos están reconstituidos después del transplante, estos ratones se pueden inmunizar usando protocolos de inmunización convenientes frente a cualquier antígeno deseado. Las células plasmáticas derivadas de estos ratones se pueden entonces inmortalizar, por ejemplo mediante fusión con mielocitos, a fin de producir células (hibridomas) capaces de segregar permanentemente anticuerpos monoclonales heterólogos (humanos) específicos para el compuesto o composición inmunógena inyectada.

La Figura 11a ilustra la construcción de un vector de expresión retrovírico para la expresión constitutiva del gen anti-apoptótico bcl-2 (etapas preparatorias). La eliminación de IL-7 de cultivos de células preB que proliferan continuamente in vitro da como resultado la diferenciación de las células preB, pero, al mismo tiempo, también conduce a la inducción de la apoptosis. Esta apoptosis se puede evitar mediante expresión constitutiva de un gen anti-apoptótico como, por ejemplo, bcl-2. Para la generación de un vector de expresión retrovírico seleccionable para bcl-2, se clona secuencialmente el ADNc de bcl-2 murino con un marco de lectura abierta de higromicina B en un vector de expresión génico dual pIRES. Este vector contiene secuencias de entrada ribosómicas internas flanqueadas por dos sitios de clonación múltiples, en los que se pueden clonar dos genes diferentes. Esto permite la expresión simultánea de dos genes en células de mamíferos a partir de un único promotor. Se indica la estrategia para la inserción del ORF de bcl-2 y del gen marcador de selección de higromicina B en pIRES para la generación de un vector pBcl2-IRES-higroB.

La Figura 11b ilustra la construcción de un vector de expresión retrovírico para la expresión constitutiva del gen anti-apoptótico bcl-2 (etapa final de clonación). Después del ensamblado del promotor CMV operado por el casete de bcl-2-IRES-higromicinaB, se reclona el casete de expresión dual completo a partir del vector pBcl2-IRES-higroB como un fragmento SalI-ClaI en el vector de transferencia retrovírico pLIB, según se representa. Esto genera el constructo retrovírico recombinante pLIB-Bcl2-IRES-higroB que se puede usar para transducir establemente células preB y para conferir expresión simultánea de bcl-2 y resistencia a higromicina B.

La Figura 12a ejemplifica la construcción de vectores de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas IgH humanas (etapa preparatoria I). Los diversos promotores IgH y elementos potenciadores, así como las regiones codificantes para los diferentes dominios de región variable y de región constante, se clonan secuencialmente en un vector de transferencia retrovírico como, por ejemplo, el plásmido pLIB. Este plásmido contiene todos los elementos requeridos para el empaquetamiento retrovírico y la integración del provirus, es decir una 5'LTR, una señal de empaquetamiento, y una 3'LTR, clonados en una estructura plasmídica seleccionable de ampicilina, bacteriana, con un origen ColE1 de replicación (según se indica). Se representan aquí las primeras etapas de clonación para insertar un promotor V_{H}, el potenciador del intrón de cadena pesada murino (E\muH), que incluye regiones de unión de matriz flanqueantes (MAR) y el potenciador 3'\alpha de cadena IgH (3'\alphaE). Se resaltan las enzimas de restricción incorporadas en los términos de los fragmentos amplificados mediante PCR, así como los sitios de enzimas de restricción compatibles únicos en la estructura del plásmido, que se pueden usar en las diversas etapas de clonación.

La Figura 12b ejemplifica la construcción de vectores de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas IgH humanas (etapa preparatoria II). El potenciador 3'\alpha de IgH contiene cuatro regiones funcionales que, con la activación del potenciador durante la diferenciación terminal de células B, se hace sensible a la digestión mediante ADNasaI y por lo tanto se denominan como regiones hipersensibles HS 1, 2, 3 y 4. Cada una de estas regiones HS contribuye a la actividad potenciadora de 3'\alphaE, pero la mayor parte de la actividad potenciadora la confiere las regiones HS1,2. Aunque la región HS1,2 de 3'\alphaE sola es capaz de llevar a cabo la expresión del gen formador hasta casi los mismos niveles que toda la región de 3'\alphaE, puede ser deseable, para algunos constructos de expresión de IgH retrovíricos, incluir otras regiones funcionales de 3'\alphaE. Por lo tanto, se representa aquí la clonación de las regiones HS3 y HS4 de 3'\alphaE. Se resaltan las enzimas de restricción incorporadas en los términos de los fragmentos de PCR genómicos, así como los sitios de enzimas de restricción compatibles en la estructura plasmídica, que se pueden usar en las diversas etapas de clonación.

La Figura 12c muestra la construcción de vectores de expresión retrovíricos para la expresión de las cadenas IgH humanas (etapa preparatoria III). Tras la clonación del promotor de IgH y de los elementos potenciadores en un vector de transferencia retrovírico, es necesario insertar a las regiones codificantes para las cadenas IgH. A fin de ser capaces de expresar la unión a la membrana, así como las formas segregadas de inmunoglobulinas, es necesario incluir exones para las regiones que se extienden sobre la membrana de las cadenas de IgH en los vectores de expresión retrovíricos. Las regiones de extensión sobre la membrana difieren significativamente entre diferentes isotipos tanto en longitud como en secuencia primaria y en estructura de exón/intrón. Por lo tanto, es necesario clonar las diferentes regiones que se extienden sobre la membrana para las cadenas pesadas de IgM, IgG, IgA e IgE. Como un ejemplo, se representa la clonación mediante PCR y la inserción de las cuatro regiones respectivas diferentes que se extienden sobre la membrana, en el plásmido pAB-3. Se pueden realizar los mismos procedimientos de clonación con los vectores pAB-4 y pAB5, que contienen versiones extendidas de 3'\alphaE de IgH. Se resaltan las enzimas de restricción incorporadas en los términos de los fragmentos de PCR genómicos, así como los sitios de enzimas de restricción compatibles en la estructura plasmídica, que se pueden usar en las diversas etapas de clonación.

La Figura 12d ilustra la construcción de vectores de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas IgH humanas (etapa preparatoria IV). Los linfocitos B humanos son capaces de producir cuatro isotipos de IgG diferentes, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, que difieren ligeramente en la secuencia y que muestran diferentes funciones efectoras fisiológicas. Se representa aquí la clonación de los genes de región constante en un vector intermedio pAB-3.2, que ya contiene los exones de IgG que se extienden sobre la membrana. Se indica la organización de los exones/intrones endógenos, incluyendo los exones que codifican las regiones bisagra (H) para los diversos isotipos de IgG. Se indican las enzimas de restricción incorporadas en los términos de fragmentos de PCR genómicos, así como los sitios de enzimas de restricción compatibles únicos en la estructura plasmídica, que se pueden usar en las diversas etapas de clonación. Con la clonación de un exón de dominio variable reordenado VDJ, estos constructos con capaces de expresar cadenas de IgG completas (véase la Fig. 15).

La Figura 12e muestra la construcción de vectores de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas IgH humanas (etapa preparatoria V). Se representa aquí la clonación de genes de región constante para los restantes isotipos de Ig humanos, IgM, IgA1, IgA2 e IgE. De forma similar al procedimiento de clonación para genes de región constante de IgG, representado en la Fig. 12d, las regiones genómicas para estos isotipos se insertan como fragmentos de PCR digeridos con NotI en sitios de restricción únicos de NotI en dirección 5' de los exones respectivos que se extienden sobre la membrana para estos isotipos. Se indica la organización de exones/intrones endógenos, incluyendo los exones que codifican las regiones bisagra (H) para los diversos isotipos de Ig. Se indican las enzimas de restricción incorporadas en los términos de los fragmentos de PCR genómicos, así como los sitios de enzimas de restricción compatibles únicos en la estructura plasmídica, que se pueden usar en las diversas etapas de clonación. Con la clonación de un exón de dominio variable reordenado VDJ, estos constructos son capaces de expresar cadenas de IgH completas del isotipo respectivo (véase la Fig. 15).

La Figura 13a muestra la construcción de vectores de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas de Ig\kappaL humanas (etapa preparatoria I). De forma similar a la construcción de vectores de expresión retrovíricos para cadenas IgH, los vectores de expresión para cadenas Ig\kappaL requieren el promotor específico del locus de cadena \kappaL y los elementos potenciadores además de las regiones codificantes para las proteínas de cadena \kappaL, que necesitan ser clonadas secuencialmente en un vector de transferencia retrovírico. Partiendo del vector retrovírico básico pLIB, primeramente se clona un promotor V\kappa en pLIB, según se indica. A esto le sigue la inserción de un producto de PCR que contiene el potenciador del intrón \kappa humano (\kappaiE, con su región asociada a matriz en dirección 5', MAR) y el gen de región constante de cadena \kappaL humana (lado izquierdo del dibujo), o, como alternativa, la inserción de un fragmento de PCR de fusión del \kappaiE de ratón con el gen de región constante de cadena \kappaL humana (lado derecho del dibujo), que se genera mediante una PCR única de extensión de solapamiento (SOE). En ambos constructos, se inserta un producto de PCR que contiene el potenciador \kappa3' murino (\kappa3'E). Se indican las enzimas de restricción incorporadas en los términos de los diversos fragmentos de PCR genómicos, así como los sitios de enzimas de restricción compatibles únicos en la estructura plasmídica, que se pueden usar en las diversas etapas de clonación.

La Figura 13b ilustra la construcción de vectores de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas de Ig\kappaL humanas (etapa preparatoria II). Los constructos de expresión retrovíricos para cadenas IgH e Ig\kappaL humanas se transducirán secuencialmente en células preB, y por lo tanto es deseable ser capaz de seleccionar células transducidas de forma estable después de la primera vuelta de la transducción con vectores que expresan la cadena de Ig\kappaL. Por esta razón, se inserta un promotor SV40 accionado por el casete de expresión de puromicina en los dos posibles intermedios vectoriales de transferencia retrovíricos de cadena Ig\kappaL pAB-7.1 y pAB-8.1, según se indica. Con la clonación de un exón de dominio variable reordenado V\kappaJ\kappa en estos vectores, estos constructos retrovíricos son capaces de expresar cadenas de Ig\kappaL humanas (véase la Fig. 15).

La Figura 14a muestra la construcción de vectores de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas Ig\lambdaL humanas (etapa preparatoria I). Los constructos de expresión retrovíricos para las cadenas Ig\lambdaL humanas se clonan insertando primeramente un producto de PCR de fusión de un casete de puromicina y un promotor V\lambda en pLIB (la fusión mediante PCR se realiza mediante PCR de extensión por solapamiento única (SOE) como se describe en la sección de ejemplos). En la siguiente etapa, se inserta en el constructo, según se indica, un constructo de fusión SOE-PCR de dos elementos potenciadores de cadena \lambdaL murina, el potenciador \lambda2-4 y \lambda3-1. Finalmente, la región codificante de la región C\lambda1 humana se inserta mediante clonación por PCR en este vector de clonación retrovírico usando las enzimas de restricción indicadas. Con la clonación de un exón de dominio variable reordenado V\lambdaJ\lambda en estos vectores, estos constructos retrovíricos son capaces de expresar cadenas de Ig\lambdaL humanas (véase Fig. 15).

La Figura 14b ilustra la construcción de vectores de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas Ig\lambdaL humanas (etapa preparatoria II). Se pueden usar otros genes de región constante de cadena Ig\lambdaL humana para sustituir a la región codificante C\lambda1 mediante clonación simple usando las enzimas de restricción únicas MluI-NotI, según se indica. Con la clonación de los exones de dominio variable reordenados V\lambdaJ\lambda en estos vectores, estos constructos retrovíricos son capaces de expresar los diferentes isotipos de cadena Ig\lambdaL humana, según se indica (véase la Fig. 15).

La Figura 15a muestra la inserción de genes de región V en vectores de expresión de cadena IgH, Ig\kappaL e Ig\lambdaL humana. Todos los constructos de expresión retrovíricos para las cadenas IgH y L humanas que se han descrito hasta ahora no contienen regiones codificantes para los dominios variables. Estos se pueden aislar mediante clonación por PCR a partir de diversas fuentes (véase, por ejemplo, la Fig. 9), y se pueden insertar en los vectores retrovíricos como exones de región V que codifican una especificidad individual, o como librerías que codifican especificidades diferentes (que necesitan ser amplificadas mediante PCR con pares de cebadores degenerados). Las regiones V se amplifican mediante PCR junto con sus secuencias líder (L) características, según se indica. Se indican las enzimas de restricción que se pueden usar para la clonación de exones de región variable. Este dibujo representa algunos vectores de expresión de cadena IgH e IgL retrovíricos finales seleccionados. Debido al diseño modular de estos vectores, se pueden usar diferentes regiones codificantes y promotores y elementos potenciadores.

Definición de los términos usados en la memoria descriptiva

Afinidad: La fuerza de unión de un receptor de antígeno (o de cualquier receptor) por su antígeno conocido (o su ligando o pareja de unión), determinada mediante la relación de velocidad de asociación a velocidad de disociación de la interacción receptor-ligando.

Maduración de afinidad: Un proceso inmunológico muy regulado de un antígeno llevado a cabo por la mejora de las especificidades de unión de los anticuerpos producidos por linfocitos B estimulados por antígenos en centros germinales. El proceso está provocado por hipermutación somática en las regiones codificantes para los dominios variables de anticuerpos acoplados con la expansión selectiva y supervivencia de linfocitos B que generan anticuerpos de mayor afinidad.

Anticuerpo: Un polipéptido glicosilado producido por linfocitos B y células del plasma que comprende en su forma monómera dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, estando cada una compuesta de un dominio variable y uno (cadenas L) o varios (cadenas H) dominios de región constante. Las dos cadenas H y las dos cadenas L se ensamblan en una molécula de anticuerpo enlazada mediante disulfuros, con forma de Y geométrica, que tiene dos dominios de unión formados por la combinación de las regiones variables de las cadenas H y L.

Antígeno: Cualquier biomolécula o entidad química que se puede unir a través de los dominios variables de las inmunoglobulinas (o anticuerpos).

Receptor del antígeno: Los receptores de antígenos están compuestos de dominios variables y regiones constantes, teniendo los primeros la capacidad de unirse a los antígenos, y las últimas la capacidad para mediar funciones efectoras o transducir señales en células. Los receptores de antígenos comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a la membrana.

Proteína de unión artificial: Una proteína de unión que contiene secuencias polipeptídicas (por ejemplo, secuencias espaciadoras sintéticas) que no derivan de genes naturales o de sus fragmentos.

Proteína de unión: El término más general para cualquier tipo de polipéptido con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, con o sin funciones efectoras adicionales. Las proteínas de unión incluyen proteínas de unión artificiales, fragmentos de anticuerpos como, por ejemplo, un fragmento variable de cadena única (scFv), y también productos de fusión que combinan dominios de región variable y de región constante de inmunoglobulinas y receptores de células T, o viceversa. Además, una proteína de unión puede ser el producto de fusión de dominios variables con partes funcionales de otras moléculas receptoras. Inversamente, una proteína de unión puede ser la fusión de un resto de unión procedente de un receptor relacionado con TCR o no Ig, con dominios de región constante de receptores de antígenos.

Que actúan en cis : Que tienen una influencia sólo en elementos genéticos y en los locus génicos en la proximidad o en el mismo alelo.

Región codificante: Un elemento genético que tiene un marco de lectura abierta que se puede expresar en un polipéptido.

Regiones que determinan la complementariedad (CDR): Las regiones en la estructura tridimensional de un dominio de receptor de antígeno variable que establece directamente contacto con los antígenos. Las CDR son habitualmente las partes más diversas de los receptores de antígenos.

Dominio: Un resto estructural de una biomolécula que se caracteriza por una estructura tridimensional particular (por ejemplo, los dominios de región variable o constante de inmunoglobulinas, que están estructuralmente relacionados, tales como los dominios de tipo Ig que se pueden encontrar en muchas moléculas del sistema inmunitario, que pertenecen a la denominada superfamilia de Ig).

Funciones efectoras: Funciones de regiones constantes de inmunoglobulinas en el contexto del sistema inmunitario, por ejemplo la capacidad para activar el complemento, o para activar ciertas células inmunitarias mediante la unión a receptores específicos para la región constante (receptores F_{c}).

Endógeno: Propio de cierta célula u organismo.

Potenciador: Un elemento genético que puede estimular la actividad de elementos promotores a largas distancias, independientemente de la orientación o de la posición.

Epítopo: Una entidad estructural tridimensional de un antígeno que es reconocida por una región de unión variable de un anticuerpo.

Fragmento funcional (de un anticuerpo, receptor de antígeno o de proteína de unión): Un fragmento funcional derivable de un polipéptido dado seleccionado del grupo que consta de anticuerpos, receptores de antígenos y proteínas de unión, que comparte al menos una de las propiedades deseadas inherentes a dicho polipéptido con respecto al campo específico de aplicación. Por ejemplo, un fragmento funcional puede ser un polipéptido u oligopéptido que mantiene la capacidad de dicho polipéptido para unirse a ciertos antígenos y/o ligandos. Lo mismo se aplica a los fragmentos que median funciones efectoras específicas características para dicho polipéptido. Un ejemplo adicional se refiere a fragmentos que son capaces de activar o inhibir funciones efectoras inmunógenas y/o fisiológicas específicas de anticuerpos, receptores de antígenos y de sistema receptor-ligando regulares.

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Elementos genéticos: Genes, locus génicos, o fragmentos de los mismos, como promotores, potenciadores y regiones codificantes, solos o en cualquier combinación funcional o no funcional.

Centro germinal: Una estructura histológica distinta en órganos linfoides periféricos (por ejemplo, nódulos linfáticos o bazo) en las que se producen las interacciones conocidas entre las células que presentan antígenos y las diferentes poblaciones linfocíticas, dando como resultado la expansión proliferativa de linfocitos reactivos a antígenos, así como la maduración de afinidad y la recombinación por cambio de clase de anticuerpos producidos mediante linfocitos B reactivos a antígenos.

Configuración de línea germinal: La configuración nativa de genes y de los locus génicos, tal como se heredan de los progenitores, y tal como se pasarán a las siguientes generaciones a través de la línea germinal. Los sucesos de recombinación de ADN que suceden en células somáticas, como por ejemplo la recombinación V(D)J en linfocitos, conduce al rebarajado o pérdida de información genética en ciertos locus génicos y por lo tanto a un cambio de los genes de la configuración de línea germinal.

Heterólogo: Diferente de endógeno.

Anticuerpo humanizado: Un anticuerpo artificial generado fusionando los dominios variables de anticuerpos no humanos a dominios de región constante humanos.

Hibridoma: Una estirpe celular inmortal que se ha generado mediante la fusión de una estirpe celular de mieloma inmortal (incapaz de segregar anticuerpo) y una célula plasmática mortal (que puede segregar grandes cantidades de anticuerpos).

Idiotipo: La característica de unión (especificidad) de un receptor de antígeno.

Isotipo: La característica estructural conferida por la región constante de un receptor de antígeno que determina sus funciones (efectoras).

Inmunoglobulina (Ig): Sinónimo de anticuerpo.

Minilocus inmunoglobulínico: Un constructo genético artificial que comprende unos pocos (es decir, un único dígito) de segmentos génicos V, D y/o J, capaces de sufrir la recombinación V(D)J, generando de ese modo un repertorio oligoclonal limitado de regiones codificantes variables.

Librería: Una colección de elementos genéticos diferentes.

Anticuerpo monoclonal: Anticuerpo con una especificidad definida determinada por la estructura única de la región de unión a antígeno variable del anticuerpo.

Célula de mieloma: Una célula inmortal derivada de una célula en la etapa de diferenciación de células del plasma sin la capacidad para expresar proteínas inmunoglobulínicas endógenas.

Anticuerpos policlonales: Una mezcla de anticuerpos que tienen estructuras diferentes de las regiones variables de unión a antígeno y, por lo tanto, lo más probable diferentes especificidades de unión.

Linfocito preB: Un linfocito B precursor se caracteriza por la expresión de factores específicos linfoides implicados en la recombinación V(D)J (por ejemplo, RAG-1, RAG-2), que habitualmente ha iniciado la recombinación V(D)J en al menos un alelo de cadena pesada inmunoglobulínica, pero que aún tiene los locus génicos de cadena ligera en la configuración de línea germinal, y por lo tanto no expresa anticuerpos completos.

Órganos linfoides primarios: Órganos en los que los linfocitos se desarrollan a partir de hemocitoblastos en ratones y en seres humanos, por ejemplo la médula ósea, el timo, y, durante la vida fetal, el hígado.

Repertorio: Una colección de especificidades (unión) diferentes.

Hipermutación somática: Un proceso en células somáticas que da como resultado la introducción de puntos de mutaciones en regiones específicas del genoma a una frecuencia elevada (>10^{-4} mutaciones por par de base por división celular).

Células estrómicas: Células adherentes proliferativas derivadas de la médula ósea con la capacidad para apoyar la proliferación de células preB en presencia de un factor o factores de crecimiento adicionales de célula preB.

Que actúan en trans : Que tienen una influencia sobre elementos genéticos y sobre los locus génicos localizados en diferentes cromosomas.

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Transfección: El proceso de introducir secuencias de ácido nucleico en células eucariotas, habitualmente asociado con el uso de métodos químicos y físicos.

Transformación: El proceso de inmortalizar una célula para el establecimiento de una línea celular proliferativa de forma continua.

Transgén: Un elemento genético artificial introducido en la línea germinal de los animales. Por lo tanto, el transgén se hereda de una generación a la otra.

Transducción: El proceso de suministrar ADN a células de mamíferos vía la producción de virus recombinantes. Para esto, se transfecta una línea celular de empaquetamiento, que expresa proteínas estructurales para partículas víricas, con un constructo de ADN vírico recombinante que comprende los elementos reguladores para empaquetar el constructo de ADN vírico en las proteínas estructurales víricas. Por medio de esto, se producen virus recombinantes que se pueden usar para infectar células diana de mamíferos lo que conduce a la introducción de la información genética clonada en el genoma vírico recombinante.

Recombinación V(D)J: Un proceso de recombinación de ADN durante el cual uno de muchos segmentos génicos V (variable), algunas veces D (diversidad) y J (de unión) se ensamblan a una región codificante para los dominios variables de receptores de antígenos.

Vector: Un constructo de ácido nucleico generado artificialmente que se puede usar para transportar elementos de ácidos nucleicos entre diferentes organismos y especies, y que se puede usar además para propagar, amplificar y mantener información genómica.

Xenogénico: Que deriva de una especie diferente (a menudo usado como sinónimo de heterólogo).

Todas las referencias citadas en esta memoria descriptiva se incorporan aquí con ella.

Descripción detallada de la invención

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para la generación de linfocitos de vertebrados que se pueden usar para la producción de cualquier proteína de unión o de un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, con la capacidad de unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno compuesto de dominios variables y regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a la membrana, cualquier proteína de unión artificial que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de receptores de antígenos o inmunoglobulinas heterólogas codificadas por la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, que comprende las etapas de:

(a): modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, que

(i): derivan de órganos linfoides primarios, y

(ii): tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura, mediante la introducción de al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, y

(b): efectuar la diferenciación de dichos linfocitos precursores genéticamente modificados en células de línea linfoide madura tanto in vitro como in vivo, generando de ese modo linfocitos capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, con la condición de que se excluya la producción in vivo en seres humanos.

A fin de lograr la producción a gran escala de las proteínas de unión anteriores, o de los fragmentos funcionales de la misma, se prefiere que los linfocitos terminalmente diferenciados que produce los polipéptidos de interés estén inmortalizados, o, como alternativa, que la información genética que codifica los anticuerpos heterólogos o proteínas de unión se aísle y se transfiera desde estas células a diferentes sistemas de expresión, con lo que dicha información genética se puede mantener, amplificar y/o usar para la producción de las inmunoglobulinas respectivas o proteínas de tipo inmunoglobulínicas o de fragmentos funcionales de los mismos.

La inmortalización de dichos linfocitos se puede lograr preferiblemente:

(a): fusionando a los mismos para inmortalizar células de mieloma para la generación de células de hibridoma;

(b): infectando a los mismos con virus transformantes como, por ejemplo, el virus de leucemia murina de Abelson (A-MuLV); o

(c): transfectando a los mismos con un constructo vectorial apropiado que asegure la expresión de al menos un oncogén transformante como, por ejemplo, v-abl, o el antígeno T grande de SV40, que, con la sobreexpresión, conduce a la inmortalización de células transfectadas de forma estable;

generando de ese modo linfocitos de vertebrados capaces de producir permanentemente dicha proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma.

En una realización preferida, los linfocitos precursores de vertebrados son capaces de expresar al menos un componente de la maquinaria de recombinación V(D)J linfoide y de originarse a partir de vertebrados con mandíbulas que comprenden peces cartilaginosos, peces óseos, anfibios, reptiles, pájaros, mamíferos que incluyen a cerdos, ovejas, vacuno, caballos y roedores que incluyen a ratones, ratas, conejos y cobayas, siendo preferidos los linfocitos (pre) B precursores murinos procedentes de ratones.

Los linfocitos B precursores primarios en todas las especies de vertebrados mandibulares, desde el ser humano hasta el pez cartilaginoso evolutivamente más primitivo, no se caracterizan solamente por la expresión de un conjunto específico de marcadores de superficie celular (como la combinación de B220 y c-kit en ratones), sino también por su potencial para ensamblar los segmentos génicos que codifican los dominios variables de anticuerpos para los cuales expresan los componentes específicos linfoides de la maquinaria de recombinación V(D)J, como RAG-1, RAG-2 y TdT (desoxinucleotidiltransferasa terminal). Aunque algunas especies, como los pájaros, tienen órganos linfoides primarios diferentes (por ejemplo, la bolsa de Fabricio) en los que se generan estos linfocitos B precursores, y a pesar del hecho de que, además de la recombinación V(D)J, otras especies también usen mecanismos diferentes para la diversificación de anticuerpos, como la hipermutación somática (por ejemplo, la oveja) o la conversión génica (por ejemplo, los conejos), los linfocitos B precursores de todas las especies de vertebrados son capaces de sufrir la recombinación V(D)J, y tienen el potencial para diferenciarse en células de línea B más maduras, de forma que se pueden expresar anticuerpos generados a partir de locus génicos de inmunoglobulinas reordenados VDJ. Por lo tanto, si tales linfocitos B precursores de vertebrados se aíslan o se generan y son capaces de expresar anticuerpos endógenos, y si los elementos genéticos que codifican todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos heterólogos se introducen establemente en estos linfocitos, ganarán el potencial para producir anticuerpos heterólogos y de este modo están englobados en la presente invención.

El método según la invención hace uso de linfocitos precursores B (preB) de vertebrados presentes en órganos linfoides primarios. En el caso de ratones, estas células se pueden aislar de hígado fetal o de la médula ósea de adultos, por ejemplo mediante clasificación celular preparativa usando anticuerpos marcados convenientemente, uniéndolos por ejemplo a los marcadores de superficie celular B220 y c-kit en células preB de ratón; como alternativa, se pueden hacer crecer selectivamente a partir de suspensiones de células de la médula ósea o de hepatocitos fetales murinos debido a su fuerte respuesta proliferativa tanto a células alimentadoras (estrómicas) de la médula ósea como a factores de crecimiento tales como interleuquina-7 e interleuquina-3.

En términos de expresión de componentes linfoides de la maquinaria de recombinación V(D)J, el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura y el mecanismo genético para la diversificación de proteínas de receptores de antígenos, los linfocitos de línea T son muy similares a los linfocitos de línea B. Por lo tanto, se entenderá que los métodos descritos aquí para la modificación genética de linfocitos de precursores B, con el fin de producir anticuerpos o proteínas de unión heterólogas, se puede aplicar igualmente a linfocitos de precursores T. Por lo tanto, los presentes métodos descritos principalmente con respecto al sistema de linfocitos preB murinos también se pueden aplicar a todos los linfocitos precursores de vertebrados procedentes de todos los vertebrados mandibulares como se establece anteriormente. Se entenderá que el uso de cualquier otro sistema linfocítico precursor para llevar a cabo los principios de la presente invención sólo depende de la factibilidad para evitar tanto la expresión de anticuerpos endógenos como para introducir elementos genéticos heterólogos en estas células que codifican anticuerpos o proteínas de unión heterólogas. Puesto que la aplicabilidad general de estos principios será apreciada por los expertos en la técnica, el concepto general subyacente en la presente invención se describe principalmente con respecto al uso de linfocitos de precursores B (preB) murinos.

En el ratón, el desarrollo a partir de hemocitoblastos hasta células de plasma que segregan anticuerpos es un proceso muy regulado, y, in vivo, depende del reordenamiento ordenado de los segmentos génicos en los locus génicos de receptores inmunoglobulínicos y la expresión regulada de proteínas inmunoglobulínicas a partir de locus génicos de Ig productivamente reordenados (Fig. 2). Habitualmente, los reordenamientos ocurren primero en ambos alelos de los locus génicos de cadena IgH, reordenándose primero los segmentos génicos D a J_{H}, seguido de los reordenamientos génicos V_{H} a DJ_{H} (Fig. 2). Si en un alelo ha ocurrido un reordenamiento V_{H}DJ_{H} productivo, la cadena \muH se puede expresar sobre la superficie celular como un receptor de células preB emparejado con la cadena L sustituta (codificada por los genes \lambda_{5} y V_{preB} específicos de células preB) (Karasuyama et al., Adv. Immunol., 63, 1-41, 1996). La expresión de un receptor de células preB permite la diferenciación de células preB hasta una etapa en la que se inician los reordenamientos V_{L} hasta J_{L}, lo que ocurre habitualmente primero en los alelos de cadena \kappaL y más tarde en los alelos de cadena \lambdaL (Melchers et al., Ann. Rev. Immunol., 12, p. 209-225, 1994). Si ha ocurrido un reordenamiento de cadena IgL productivo, los anticuerpos IgM unidos a membrana y/o IgD se pueden expresar mediante las denominadas células B inmaduras. La estimulación de células B maduras positivas a IgM/IgD, periféricas, con las señales apropiadas, puede conducir a la recombinación de cambio de clase en los alelos de cadena IgH que cambia el isotipo de los anticuerpos expresados a cualquiera de los subtipos IgG, IgA, IgE (en ratones: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE, en seres humanos: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE) (Fig. 1).

Como ya se ha señalado anteriormente, las células preB murinas adecuadas para llevar a cabo la invención se caracterizan por llevar a cabo la expresión de los marcadores de superficie B220 y c-kit, la expresión de al menos uno de los genes de recombinación V(D)J linfoides RAG-1 y RAG-2, y por la capacidad de proliferar durante períodos de tiempo más prolongados en respuesta a células estrómicas y/o IL7 o IL3 (Rolink et al., EMBO J., 10, P. 327-336; 1991; Winkler et al., Blood, 85, p. 2045-2051, 1995). Si se establecen líneas celulares preB y clones a partir de ratones de tipo salvaje, habitualmente tienen reordenamientos DJ_{H} tanto en los alelos de cadena IgH (Alt et al., EMBO J., 3, p. 1209-1219, 1984), o en algunos casos reordenamientos V_{H}DJ_{H} no productivos (Fig. 2). Sin embargo, los reordenamientos de sus alelos de cadena IgH no se requieren para establecer células de respuesta a células estrómicas, a IL7 o a IL3 a partir de ratones con un fenotipo de célula preB, puesto que estas células también se pueden establecer a partir de razas de ratones mutantes que son deficientes en recombinación V(D)J (Grawunder et al., International Immunology, 7, p. 1915-25, 1995). En cualquier circunstancia, independientemente del potencial para los reordenamientos génicos de Ig, las células preB retienen el potencial para diferenciarse en células de línea B más maduras in vitro, y eventualmente en células de plasma de isotipo cambiado (Rolink et al., Immunity, 5, p. 319-330, 1996).

Los clones y líneas celulares preB murinos que proliferan a largo plazo se pueden establecer a partir de diversos órganos linfoides de ratones, incluyendo el hígado fetal, sangre fetal, bazo fetal y médula ósea de adulto, pero también a partir de otros órganos fetales o de adultos que tienen células preB que responden a células estrómicas, a IL7 o a IL3. especialmente en los primeros años de vida (< 4 semanas de edad) (Rolink et al., Blood, 81, p. 2290-2300, 1993).

Los ratones usados para la generación de las células preB anteriormente mencionadas pueden ser ratones de tipo salvaje, ratones quiméricos, ratones transplantados o razas de ratones que tienen mutaciones que impiden la recombinación V(D)J en los locus génicos de Ig murinos endógenos. Las mutaciones mencionadas anteriormente pueden estar en cis, incluyendo eliminaciones de o dentro de los segmentos génicos de diversidad (D) de IgH, los segmentos génicos J de IgH (Chen et al., Int. Immunol., 5, p. 647-656, 1993), la región constante de cadena \muH, incluyendo los dos exones para el anclaje transmembránico \muH (Kitamura y Rajewsky, Nature, 356, p. 154-156, 1992), los segmentos génicos J de Ig\kappa e Ig\lambda, la región constante de cadena \kappaL (C_{\kappa }) (Chen et al., EMBO J., 12, p. 821-830, 1993), las regiones constantes de cadena \lambdaL (C\lambda 1-4) y los diversos potenciadores de cadena IgH y L, incluyendo el potenciador de intrón de cadena pesada (E\muH), el potenciador del intrón \kappa (\kappaiE), el potenciador 3'\kappa (3'\kappaE), y los dos potenciadores \lambda (E\lambda2-4 y E\lambda3-1).

Según la invención, las células preB que tienen cualquiera de las mutaciones que actúan en cis anteriormente mencionadas se pueden usar para la introducción de elementos genéticos exógenos que comprenden parte o todos los locus génicos inmunoglobulínicos especialmente humanos heterólogos en una configuración no reordenada, es decir línea germinal. Tales células preB genéticamente modificadas se pueden usar para la producción de novo de especificidades de anticuerpos, debido a que las nuevas especificidades sólo se generan con la recombinación V(D)J en los locus génicos inmunoglobulínicos genéticos heterólogos.

Como alternativa, las células preB adecuadas también se pueden generar a partir de ratones incapaces de reordenar locus génicos inmunoglobulínicos endógenos debido a mutaciones que actúen en trans, como por ejemplo en genes activantes de recombinación específica linfoide RAG-1 y RAG-2 (Mombaerts et al., Cell, 68, p. 869-877, 1992; Shinkai et al., Cell, 68, p. 855-867, 1992), o en los factores de reparación del ADN expresados ubícuamente Ku70, Ku86, XRCC4, ADN ligasa IV, Artemis o la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs), que están implicados en la unión del extremo de ADN no homóloga, y que también se requieren para la recombinación V(D)J. Para la producción de anticuerpos y proteínas de unión heterólogos en células preB que tienen tales mutaciones que actúan en trans, se han de usar constructos de expresión que no requieran los reordenamientos de ADN de segmentos génicos V, (D) y J (véase más abajo).

En el caso de mutaciones que actúan en cis en el ratón, estas necesitan preferiblemente incluir mínimamente (a) una mutación o mutaciones homocigóticas en los locus génicos de cadena pesada inmunoglobulínica y de cadena \kappaL inmunoglobulínica. En el caso de mutaciones que actúan en trans, es suficiente una de las mutaciones homocigóticas anteriormente mencionadas, en una estirpe celular preB dada, para impedir la expresión de inmunoglobulinas endógenas que es un requisito fundamental del método según la invención.

Los linfocitos precursores B que tienen modificaciones genéticas que actúan en cis o trans que interfieren con la expresión de inmunoglobulinas endógenas se pueden aislar a partir de ratones que tienen mutaciones generadas naturalmente (por ejemplo, ratones scid) o artificialmente. Como alternativa, se pueden detectar sistemáticamente linfocitos preB a partir de ratones de tipo salvaje para mutaciones en sus alelos inmunoglobulínicos, evitando la expresión de anticuerpos endógenos, por ejemplo reordenamientos DJ_{H} fuera del marco de forma terminal en ambos alelos de cadena pesada. Las mutaciones que cortan la expresión de anticuerpos murinos endógenos se pueden introducir en hemocitoblastos o en células progenitoras tempranas, a partir de los cuales se pueden generar células preB que proliferan a largo plazo adecuadas con la diferenciación in vitro o in vivo.

Como alternativa, los efectos genéticos citados aquí anteriormente también se pueden introducir directamente en al menos un alelo de los linfocitos precursores que se van a someter a modificación genética. La inactivación de un alelo puede ser suficiente para llevar a cabo la presente invención, puesto que se pueden aislar clones mutados, que ya tienen ciertas mutaciones sobre el otro alelo (mutaciones heterocigóticas), de forma que se establece un locus génico mutado homocigóticamente dentro de las células linfocíticas precursoras a usar según la invención.

Aunque se entenderá que la invención se puede realizar con linfocitos precursores de tipo salvaje, en el método según la invención se prefiere que dichos linfocitos precursores de vertebrados estén desprovistos de su potencial para expresar anticuerpos y/o receptores de antígenos endógenos o un fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, lo que se logra mediante aislamiento/selección de linfocitos precursores de vertebrados que son deficientes a la hora de expresar inmunoglobulinas endógenas o fragmentos de las mismas, y/o introduciendo en dichos linfocitos precursores de vertebrados al menos un constructo vectorial diseñado para inactivar funcionalmente al menos un alelo de al menos un elemento genético, que se selecciona del grupo que consta de:

(a): las regiones codificantes del locus génico de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo todos o parte de los segmentos génicos V, D y J, y cualquiera de las regiones codificantes de los exones de la región constante de las cadenas pesadas \mu, \delta, \gamma, \varepsilon y \alpha, con o sin sus exones que se extienden sobre la membrana;

(b): las regiones codificantes de los locus génicos de las cadenas ligeras \kappa y/o \lambda inmunoglobulínicas, que incluyen cualquiera de las regiones codificantes de segmentos génicos V y J, así como cualquiera de los exones de la región constante;

(c): las regiones codificantes de los locus génicos \alpha, \beta, \gamma y \delta del receptor de células T, incluyendo todos o parte de los segmentos génicos V, D y J, y cualquiera de las regiones codificantes de los exones de la región constante \alpha, \beta, \gamma y \delta;

(d): los elementos potenciadores del locus génico de cadena pesada inmunoglobulínica que actúan en cis, incluyendo el potenciador del intrón de cadena pesada y el potenciador 3'\alpha;

(e): los elementos potenciadores del locus génico de cadena ligera inmunoglobulínica que actúan en cis, incluyendo el potenciador del intrón de cadena ligera \kappa (\kappaiE), el potenciador 3'\kappa, y los potenciadores \lambda2-4 y \lambda3-1;

(f): los elementos potenciadores de los locus génicos del receptor de células T que actúan en cis, incluyendo los potenciadores \alpha, \beta, \gamma y \delta de TCR;

(g): los genes activantes de la recombinación y que actúan en trans, RAG-1 y RAG-2, incluyendo sus elementos promotores y potenciadores, así como sus regiones codificantes; y

(h): los genes de reparación del ADN que actúan en trans esenciales para la recombinación V(D)J, incluyendo Ku70, Ku86, la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs), ADN ligasa IV, XRCC4 y Artemis, incluyendo sus elementos promotores y potenciadores, así como las regiones codificantes de dichos genes.

Preferiblemente, los constructos vectoriales anteriores incluyen vectores de selección génica que comprenden regiones de homología de secuencia de ADN con dicho al menos un elemento genético, que flanquea preferiblemente un marcador de selección positiva que permite la selección de transfectantes positivos. Por ejemplo, los vectores de selección adecuados contienen dos regiones de elevada homología de secuencia (>99%), o identidad de secuencia por el locus génico seleccionado, preferiblemente que flanquea un marcador de selección positiva (tal como un marcador de resistencia a antibiótico), de forma que un suceso de cruzamiento doble en cada una de las regiones de homología de secuencia da como resultado la integración seleccionada del marcador de selección positiva y de este modo en la interrupción seleccionada de un gen endógeno (Fig. 4a-c). Los marcadores de selección positivos empleados en estos vectores de selección pueden incluir casetes de expresión que confieren resistencia a antibióticos como puromicina, higromicina B, neomicina (G418), histidinol, ácido micofenólico, zeocina y similar.

Se prefiere que dichos vectores de selección génica comprendan adicionalmente un par de secuencias de reconocimiento del ADN para enzimas de recombinación de ADN específicas de sitio, que flanquean al marcador de selección positiva, que permiten la eliminación de dicho marcador de selección positiva con la transfección y la expresión transitoria de secuencias de ácido nucleico que codifica al menos una de las enzimas estrechamente relacionadas con las recombinasas. Por ejemplo, el marcador de selección positiva puede estar flanqueado por las secuencias loxP o FLP reconocidas por la cre recombinasa o por enzimas de FLP recombinasa, respectivamente (Kuhn y Schuwenk, Curr. Opin. Immunol., 9, p. 183-188, 1997), permitiendo la eliminación específica del sitio del casete de expresión del marcador de selección a partir del genoma de células preB seleccionadas génicamente mediante transfección transitoria de vectores de expresión de cre o flp recombinasa (Fig. 6a, b). Este procedimiento permite el uso repetido de vectores de selección que usan el mismo marcador de selección positiva.

En una realización preferida, dichos vectores plasmídicos de selección génica comprenden adicionalmente un marcador de selección negativa que permite la selección frente a transfectantes en los que dichos vectores de selección génica se integran al azar en el genoma mediante recombinación no homóloga. Por ejemplo, los marcadores de selección negativos adecuados que seleccionan frente a la integración al azar de constructos de selección, pueden incluir casetes de expresión para el gen de timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK), para el gen de la toxina de difteria (DT) (McCarrick et al., Transgenic Res., 2, p. 183-190, 1993), o para su versión atenuada Dttox176 (Maxwell et al., Mol. Cell. Biol., 7, p. 1576-1579, 1987). Estos marcadores de selección negativos se sitúan en los constructos de selección, de forma que una integración seleccionada del constructo de selección positivo/negativo da como resultado la eliminación del marcador de selección negativa (Fig. 6a, b). De este modo, solamente la integración del vector de selección mediante recombinación homóloga permitirá la supervivencia de las células, y - como consecuencia - la selección de la selección e interrupción de parte de los locus génicos endógenos mediante recombinación homóloga.

Se entenderá que se prefiere el uso de linfocitos precursores de vertebrados carentes de su potencial para expresar anticuerpos y/o receptores de antígenos endógenos, o fragmentos funcionales de los mismos. Sin embargo, igualmente se pueden usar según la invención linfocitos precursores de vertebrados con el potencial para expresar anticuerpos y/o receptores de antígenos o un fragmento o fragmentos funcionales de los mismos. Independientemente de los antecedentes genéticos reales de los linfocitos precursores, estas células se han sometido a modificación genética a fin de permitir la producción de anticuerpos o de proteínas de unión heterólogos. Se entenderá que dicha modificación se realizará preferiblemente después de que se han identificado las células o clones diana apropiados mediante selección y/o generación como se describe anteriormente. Sin embargo, también es posible modificar genéticamente las células antes de que sean incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas o partes de las mismas. Además, puede parecer incluso apropiado efectuar simultáneamente ambas etapas.

En consecuencia, en una realización adicional, se prefiere que el al menos un elemento genético exógeno que codifica una proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, usado para efectuar la modificación genética deseada, sea portado sobre un constructor genético seleccionado del grupo que consta de:

(a): constructos de ADN retrovíricos recombinantes que comprenden secuencias promotoras, potenciadoras y de ácidos nucleicos codificantes ligadas operablemente para asegurar la expresión de al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos, o que es artificial;

(b): constructos de ADN recombinantes a base de plásmidos que comprenden secuencias promotoras, potenciadoras y de ácidos nucleicos codificantes ligadas operablemente para asegurar la expresión de al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos, o que es artificial;

(c): locus génicos de receptores de células T o de miniinmunoglobulinas recombinantes a base de plásmidos con segmentos génicos no reordenados V, D y J ligados operablemente para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de células T heterólogo, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;

(d): cromosomas artificiales bacterianos, de levaduras o de vertebrados que comprenden todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos o de receptores de célula T en la configuración de línea germinal ligados operablemente para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de célula T heterólogo, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;

(e): cromosomas artificiales bacterianos, de levaduras o de vertebrados que comprenden todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos o receptores de célula T heterólogos en un ordenamiento modificado diseñado para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo heterólogo o receptor de célula T, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;

(f): elementos transcromosómicos que son fragmentos de cromosomas heterólogos que tienen todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos o de receptores de células T en la configuración de línea germinal que permiten la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo heterólogo o receptor de célula T, que es de tipo salvaje con respecto a la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;

en el que el al menos un elemento genético exógeno codifica más preferiblemente un anticuerpo humano nativo o modificado, una proteína de unión humana, un receptor de antígeno humano, o un fragmento o fragmentos funcionales de los mismos.

Además, se prefiere que el al menos un elemento genético exógeno codifique un receptor heterólogo o artificial capaz de sufrir maduración de afinidad de la región de unión.

Para llevar a cabo la etapa de la modificación genética, se pueden emplear varios procedimientos diferentes según la invención, que se ejemplifican en lo sucesivo.

Un primer enfoque se basa en la introducción estable de constructos de ADN plasmídicos recombinantes que codifican partes de los locus génicos heterólogos de receptores de antígenos en configuración no ordenada de línea germinal similar a lo que se ha logrado tempranamente en el contexto de ratones transgénicos. Estos locus génicos heterólogos de receptores de antígenos pueden incluir segmentos génicos V, D y J de los locus génicos de cadena H, \kappaL y \lambdaL inmunoglobulínicos, así como segmentos génicos procedentes de cualquier locus génico \alpha, \beta, \gamma o \delta del receptor de células T (TCR).

Un segundo enfoque se refiere a la integración estable de los locus génicos heterólogos de tamaño de megabases de receptores de antígenos, que incluyen todos o partes de los locus génicos inmunoglobulínicos y/o de TCR en configuración de línea germinal, no ordenada, como fragmentos transcromosómicos, o clonados en cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC), o cromosomas artificiales de vertebrados (VAC), que también se han realizado en el contexto de ratones transgénicos (Green et al., Nat. Genet., 7, p. 13-21, 1994; Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, p. 722-727, 2000).

Los elementos genéticos de ambos enfoques se han de integrar establemente en células preB que tienen mutaciones que actúan en cis en sus locus génicos de Ig murinos endógenos, que sólo intervienen con el reordenamiento de los locus génicos de Ig endógeno, pero que aún permite la generación de diversos repertorios de anticuerpos a partir de locus génicos heterólogos no reordenados y/o de línea germinal de receptores de antígenos. La construcción de constructos de ADN que codifican los locus génicos de Ig humanos reside en el conocimiento de la organización de todos los locus génicos de Ig humanos y su secuencia de ADN casi completamente publicada como resultado del proyecto de genoma humano. Por ejemplo, el locus génico de cadena IgH humana está localizado en el cromosoma 14q32.33 dentro de un intervalo de 1,25 Mpb. Contiene 123-129 (dependiendo de la variación alélica) segmentos génicos V_{H} (41-47 de estos funcionales), 27 segmentos génicos D y 6 segmentos génicos J_{H} en dirección 5' del racimo génico de región constante. El locus génico de cadena Ig\kappaL humana está localizado en el cromosoma 2p12, comprende 1,82 Mpb, y contiene 40 ó 76 (dependiendo del alelo) segmentos génicos V\kappa (de los cuales 34 ó 64, respectivamente, son funcionales), y 5 segmentos génicos J\kappa en dirección 5' de una única región C\kappa. El locus de cadena Ig\lambdaL humana está localizado en el cromosoma 22q11.2, se extiende 1,05 Mpb, y contiene 70 ó 71 segmentos génicos V\lambda (31 ó 32 funcionales) en dirección 5' de 7 a 11 segmentos génicos J\lambda-C\lambda repetidos por tándems.

Los constructos de ADN que tienen una parte o partes o todos los locus génicos inmunoglobulínicos o de receptores de células T heterólogos de línea germinal que están presentes en fragmentos transcromosómicos, o que se pueden clonar en constructos vectoriales BAC, YAC o VAC, se pueden transferir establemente en células preB diana que proliferan a largo plazo, usando procedimientos de transferencia génica estándares, incluyendo por ejemplo la electroporación, la transfección con fosfato de calcio o DEAE-dextrano, la transferencia mediada por liposoma, la fusión de protoplastos esféricos, la transferencia balística, la microinyección, o la formación de proteína-aducto específicos, o una combinación de los mismos. Los transfectantes estables se pueden seleccionar en virtud de marcadores de selección (de fármacos) apropiados incluidos en la estructura vectorial de YAC, BAC y VAC, que comprenden genes que confieren resistencia, por ejemplo, a puromicina, higromicina B, neomicina (G418), histidinol, ácido micofenólico, zeocina y similares.

Se puede usar un tercer enfoque conceptualmente diferente para introducir elementos genéticos heterólogos que codifican anticuerpos y proteínas de unión heterólogos, preferiblemente humanos. Según este método alternativo, los elementos genéticos heterólogos se transfieren establemente en células preB murinas usando transducción retrovírica que se ha descrito en el contexto de la terapia génica para enfermedades heredadas usando hemocitoblastos como células diana (véase An Dong Sung et al., J. Virol. 75(8), 3547-3555 (2001)). Los vectores de transferencia retrovíricos sólo pueden acomodar 7-10 kb de ADN extraño, lo que facilita significativamente la clonación de vectores de expresión para anticuerpos y proteínas de unión heterólogas, preferiblemente humanas. Por lo tanto, todas las propiedades de anticuerpos y proteínas de unión heterólogos se pueden modificar fácil y rápidamente mediante técnicas estándares de biología molecular usando vectores de transferencia retrovíricos. Por el contrario, la introducción de modificaciones en el contexto de un sistema de ratón transgénico para la expresión de anticuerpos heterólogos es un proceso muy tedioso y que consume tiempo, y por lo tanto es prácticamente imposible. El uso de ratones transgénicos para cambiar las funciones de anticuerpos heterólogos codificados por transgenes requeriría la generación de varias razas de ratones transgénicos nuevas, incluyendo su crianza en un antecedente genético inmunodeficiente.

Los vectores de transferencia retrovíricos recombinantes que codifican anticuerpos o proteínas de unión heterólogos se pueden producir como clones que expresan especificidades de unión monoclonales, o se pueden generar en forma de librerías que codifican especificidades de unión policlonales. Debido a que estos vectores retrovíricos no son suficientemente grandes para incorporar regiones significativas de los locus génicos de receptores de antígenos de línea germinal, las regiones codificantes heterólogas necesitan contener ya segmentos génicos reordenados V(D)J que codifican dominios variables en combinación con regiones codificantes para las regiones constantes de anticuerpos y proteínas de unión heterólogos. La expresión de clones o librerías de vectores de expresión retrovíricos para anticuerpos o proteínas de unión heterólogos no requiere por lo tanto una maquinaria celular funcional para la recombinación V(D)J, y por lo tanto se puede usar en conjunción con linfocitos preB que tienen mutaciones que actúan en cis y/o en trans que eliminan la expresión génica de inmunoglobulinas endógenas, como ya se ha descrito anteriormente aquí.

Los vectores de expresión retrovíricos para conferir la expresión de anticuerpos o proteínas de unión heterólogos a células preB murinas se transfectan primeramente en líneas celulares de empaquetamiento retrovíricas, de las que hay disponibles comercialmente una amplia variedad que tienen la capacidad de producir retrovirus recombinantes con un espectro ecotrópico, anfotrópico o pantrópico de infectabilidad. Tales líneas celulares de empaquetamiento se transfectan establemente con constructos de expresión para los genes gag, pol y env retrovíricos. La transfección de células de empaquetamiento retrovíricas con vectores plasmídicos retrovíricos recombinantes que codifican anticuerpos o proteínas de unión heterólogos dará como resultado entonces la formación de retrovirus recombinantes capaces de infectar células preB y de transducir de forma estable la información genética heteróloga en líneas y clones de células preB (Fig. 8). Los vectores de expresión retrovíricos usados en estos métodos se construyen a partir de un vector de transferencia retrovírico vacío comercialmente disponible que contiene los elementos retrovíricos mínimamente requeridos, que incluyen una 5'-LTR, una señal de empaquetamiento Psi y una 3'-LTR (Fig. 11a).

Los vectores retrovíricos finales para la expresión de anticuerpos o proteínas de unión heterólogos pueden contener cualquiera de los siguientes elementos genéticos, ligados operablemente de manera que se asegure la expresión de anticuerpos y proteínas de unión heterólogos en células de línea B, seleccionados de:

(a): elementos promotores, incluyendo promotores constitutivos, como por ejemplo promotores CMV (citomegalovirus), SV40 (virus de simio 40), \beta-actina o PGK (fosfogliceratoquinasa), o promotores específicos de la línea B, como por ejemplo el promotor CD19 o los promotores génicos de cadena IgH e IgL;

(b): exones de región variable (V) procedentes de cualquier locus génico de receptor de antígeno, incluyendo locus génicos inmunoglobulínicos y de TCR;

(c): elementos potenciadores que permiten un nivel elevado y la expresión específica de línea B de anticuerpos o proteínas de unión heterólogos, como por ejemplo elementos potenciadores de los intrones E\muH o \kappaiE;

(d): exones de región constante, incluyendo exones que codifican las formas segregadas y unidas a membrana de anticuerpos y proteínas de unión (Fig. 7a, b); y

(e): cualquiera de los potenciadores génicos inmunoglobulínicos 3' de los locus génicos de cadena pesada y cadena ligera (es decir, los potenciadores 3'\alpha, 3'\kappa o \lambda3-1 y \lambda2-4), que se requieren para la hipermutación somática de los exones codificantes de región variable de los anticuerpos o proteínas de unión heterólogos (Fig. 7a, b).

Además, los casetes de expresión para los marcadores de selección (de fármacos) apropiados, como por ejemplo puromicina, higromicina B, neomicina (G418), histidinol, ácido micofenólico, zeocina, o para genes informadores adecuados, como EGFP (proteína fluorescente verde potenciada) y sus mutantes YFP (proteína fluorescente amarilla), CFP (proteína fluorescente ciánica), y BFP (proteína fluorescente azul), o RFP (proteína fluorescente roja), pueden ser parte de los vectores retrovíricos que permiten la selección o el aislamiento de células transducidas de forma estable, respectivamente (Fig. 7b). La ordenación y la presencia de estas regiones codificantes y elementos de control necesitan ser diseñados cuidadosamente a fin de permitir la expresión diferencial de las formas segregadas o unidas a membranas de glicoproteínas de Ig heterólogas, así como la maduración de afinidad accionada por antígenos de los anticuerpos y proteínas de unión heterólogos en centros germinales in vivo. Si se desea, los exones de dominio de región constante se pueden intercambiar entre isotipos, o se pueden introducir mutaciones diseñadas que afecten a las funciones efectoras de los anticuerpos heterólogos expresados (Fig. 7a, b). Estos ejemplos no limitantes se mencionan a fin de ilustrar que este sistema permite la modificación rápida de simplemente cualquier región de los anticuerpos o proteínas de unión heterólogos codificados retrovíricamente.

El exón que codifica los dominios variables dentro de estos vectores retrovíricos recombinantes puede ser monoclonal para la expresión de una especificidad dada, por ejemplo de un anticuerpo existente cuya especificidad de unión a antígeno se pretende modificar mediante maduración de afinidad después del transplante de células preB establemente transducidas en hospedantes murinos y la subsiguiente inmunización (Fig. 9). Además, el exón que codifica los dominios variables puede derivarse a partir de una librería de diversos reordenamientos V(D)J. Estas librerías de región V se pueden aislar a partir de linfocitos B heterólogos, preferiblemente humanos, mediante PCR usando pares de cebadores degenerados amplificando una multitud de familias génicas V_{H} diferentes y segmentos génicos J_{H} (Fig. 9). Los linfocitos B pueden derivar de sujetos que se han inmunizado o no (repertorio cebado frente a nuevo), o de pacientes que padecen una enfermedad autoinmunitaria (repertorio autoinmunitario). Además, se pueden construir librerías completamente sintéticas de dominios de región V usando el ensamblaje in vitro de fragmentos génicos específicos de dominio V que presentan secuencias nucleotídicas al azar en regiones que corresponden a las regiones que determinan la complementariedad (Fig. 9).

Las combinaciones de constructos retrovíricos pueden ser transducidas simultánea o secuencialmente en células preB permitiendo la expresión y secreción de inmunoglobulinas heterólogas completas y de proteínas de unión dímeras con la diferenciación de las células preB in vitro o in vivo (Fig. 8).

Las células preB de vertebrados, que se han modificado genéticamente mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, de forma que han ganado el potencial para expresar anticuerpos o proteínas de unión heterólogos, necesitan ser diferenciadas en células de línea B maduras y eventualmente en células del plasma, de forma que los anticuerpos o proteínas de unión heterólogos se puedan expresar y eventualmente segregar. Esto se puede lograr mediante diferenciación en cultivo de tejido in vitro, o con el transplante de células preB genéticamente modificadas en hospedantes de vertebrados apropiados in vivo, con la condición de que se excluya la producción in vivo en seres humanos.

En consecuencia, se prefiere efectuar la diferenciación in vitro de linfocitos B precursores de vertebrados:

(a): deteniendo la proliferación de dichos linfocitos precursores de vertebrados e induciendo la diferenciación en células de línea linfocítica madura cultivando a los mismos en ausencia de cualquier factor de crecimiento de linfocitos precursores; e

(b): induciendo la diferenciación de linfocitos terminal mediante el cultivo adicional de dichas células en presencia de al menos uno de los siguientes componentes seleccionados de:

(i): factores estimulantes solubles, relacionados con células T, que comprenden interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-5, interleuquina-6, interleuquina-10, interleuquina-13, TGF-\beta e IFN-\gamma;

(ii): factores que activan los receptores coestimuladores de células B, que comprenden anticuerpos agonistas o ligandos recombinantes activos para CD40, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), receptores de complemento 1 (CD35) y 2 (CD21), LFA-1 (CD11a), LFA-3 (CD58), CD19, CD20, CD30, CD32, CD37, CD38, CD70, CD71, Ig\alpha (CD79\alpha), Ig\beta (CD79\beta), TAPA-1 (CD81), Fas (CD95), receptor 1 del TNF (p55, CD120a), receptor 2 del TNF (p75, CD120b), Ox-40 (CD134), y receptor de linfotoxina B; y

(iii): factores mitógenos de células B, antígenos de tipo 1 independientes de células T, y otros activadores policlonales, incluyendo lipopolisacárido (LPS), lipoproteínas procedentes de bacterias gram negativas, polianiones, poli-dldC, mitógeno de fitolaca (PWM), y reactivos antiinmunoglobulínicos, y combinaciones de los mismos.

La diferenciación in vitro en cultivo de tejidos se puede lograr mediante un proceso de dos etapas que incluye (a) la eliminación de los factores de crecimiento de células preB, como por ejemplo IL7 o IL3, del medio de cultivo de tejidos, lo que detendrá la proliferación de células preB y al mismo tiempo inducirá la diferenciación en células de un fenotipo de células B maduras, y que incluye (b) la estimulación de las células B diferenciadas mediante dichos estímulos relacionados con células T y/o independientes de células T mitogénicos, de forma que se inducirá la diferenciación terminal de células del plasma. La diferenciación inicial de células preB en células con un fenotipo de células B eliminando los factores de crecimiento de células preB se logra mediante la inducción de la apoptosis. De este modo, es una realización preferida el uso de células preB que sobreexpresen genes antiapoptóticos, como por ejemplo bcl-2 o bcl-x_{L}. Estos genes antiapoptóticos se pueden introducir en células preB usando células preB que se han aislado de animales transgénicos bcl-2 o bcl-x_{L}, o transfectando o transduciendo células preB con vectores de sobreexpresión para cualquiera de los genes antiapoptóticos.

Como una alternativa a la diferenciación in vitro de linfocitos precursores genéticamente modificados, estas células también se pueden diferenciar in vivo con el transplante en un hospedante no humano vertebrado adecuado, dando como resultado la migración de estas células a órganos linfoides secundarios y la diferenciación en células de línea linfoide más maduras. Preferiblemente, dichos linfocitos se cotransplantan en dicho hospedante con linfocitos auxiliares T cebados con antígenos o naturales, en los que el término "cotransplantar" se ha de entender que no está limitado al transplante simultáneo exactamente al mismo tiempo. Según otra realización preferida, la diferenciación in vivo es seguida de la inmunización de dicho hospedante con al menos un compuesto o composición inmunógena deseada. En contraste con el método descrito aquí, el transplante de hemocitoblastos CD34+ humanos genéticamente no modificados en ratones SCID (documento WO 01/87058) ni permite la generación de anticuerpos de alta afinidad (debido a la falta de células T humanas compatibles) ni ninguna flexibilidad en el tipo y propiedades de anticuerpos producidos mediante estas células B.

Además, se prefiere que dicho hospedante vertebrado sea un hospedante compatible que es deficiente con respecto a la generación de células B endógenas, células T y/o células NK (asesinas naturales), o una combinación de los mismos.

Como ya se ha expuesto aquí anteriormente con respecto a la selección de fuentes apropiadas para linfocitos precursores de vertebrados, se prefiere que el hospedante vertebrado se seleccione de vertebrados mandibulares que comprenden pez cartilaginoso, pez óseo, anfibios, reptiles, pájaros, y mamíferos que incluyen cerdos, oveja, vacuno, caballos y roedores que incluyen a ratones, ratas, conejos y cobayas, siendo la especie hospedante preferida los ratones.

Los hospedantes apropiados que sirven como receptores para el transplante de linfocitos precursores de vertebrados genéticamente modificados pueden ser de tipo salvaje con respecto al desarrollo de los linfocitos, o pueden tener preferiblemente cualquiera de las diversas mutaciones que actúan en cis que inhiben los reordenamientos génicos de Ig murinos endógenos. Estos pueden incluir mutaciones en elementos potenciadores de los locus génicos de Ig, como los elementos potenciadores E\muH y \kappaiE anteriormente mencionados, eliminaciones dentro de las regiones codificantes del gen de Ig, como los segmentos génicos D_{H}, J_{H} o J_{L} y las regiones IgC que incluyen sus exones que se extienden por la membrana. Además, se pueden usar hospedantes adecuados que tienen mutaciones que actúan en trans que impiden selectivamente el desarrollo de linfocitos B (y T), por ejemplo mutaciones en la línea o factores de transcripción específicos de linfocitos o los genes RAG-1 y RAG-2 requeridos para la iniciación de la recombinación V(D)J (Mombaerts et al., s.a.; Shinkai et al., s.a.).

Además, las mutaciones que actúan en trans, que conducen a hospedantes inmunodeficientes, comprenden mutaciones en los genes de reparación del ADN expresados ubícuamente también requeridos para la recombinación V(D)J como Ku70, Ku86, la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs), XRCC4, ADN ligasa IV y Artemis. Los hospedantes vertebrados con cualquiera de las modificaciones mencionadas anteriormente que carecen de poblaciones de linfocitos B solas, o ambos linfocitos B y T, se pueden transplantar entonces con las células preB genéticamente modificadas, y en el caso de ratones deficientes en células B y T, se pueden cotransplantar con poblaciones de células auxiliares T histocompatibles. Las poblaciones de células auxiliares T comprenden preferiblemente célula auxiliar T natural, poblaciones de células T efectoras cebadas con anticuerpos o células T de memoria, o cualquier combinación de los mismos. El cotransplante de poblaciones de células auxiliares T puede ocurrir simultáneamente, antes o después del punto de tiempo real del transplante de células preB genéticamente modificadas.

Los hospedantes murinos o vertebrados cuyas poblaciones linfocíticas periféricas se han reconstituido parcial o completamente mediante el transplante de células preB modificadas, y el cotransplante opcional de poblaciones de células auxiliares T, se pueden usar entonces para la inmunización con cualquier antígeno deseado, a fin de disparar una respuesta inmunitaria a ese antígeno y para estimular tales linfocitos que expresan la especificidad de receptores heterólogos apropiada, lo que conduce a la expansión proliferativa de clones de células B, a la maduración de afinidad de los dominios de unión de los anticuerpos o proteínas de unión heterólogos codificados, y a la diferenciación terminal en células del plasma que segregan los anticuerpos o proteínas de unión heterólogos.

Como es manifiesto a partir de lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención es proporcionar un método para la producción de cualquier proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma con la capacidad de unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno compuesto de dominios variables y regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial que desarrolle funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores antigénicos heterólogos codificados por la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, de una manera conocida per se, que implica las etapas de:

(a): modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, que

(i): derivan de órganos linfoides primarios, y

(ii): tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura introduciendo al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma; o, como alternativa, usando linfocitos precursores de vertebrados genéticamente modificados, que

(i): derivan de órganos linfoides primarios,

(ii): tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura, y

(iii): tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma;

(b): efectuar la diferenciación de dichos linfocitos precursores genéticamente modificados en células de línea linfoide madura tanto in vitro como in vivo, generando de ese modo linfocitos de vertebrados genéticamente modificados y diferenciados capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento funcional de la misma; o, como alternativa, usar dichos linfocitos de vertebrados genéticamente modificados y diferenciados capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento funcional de la misma;

(c): efectuar la expresión de la proteína de unión o de un fragmento o fragmentos funcionales de la misma; con la condición de que se excluya la producción in vivo en seres humanos.

En este contexto, se prefiere que cualquiera de los métodos anteriores que impliquen la generación de linfocitos de vertebrados genéticamente modificados y diferenciados sea seguido de las etapas de:

(a): aislar a partir de dichos linfocitos diferenciados el al menos un elemento genético exógeno, y

(b): colocar dicho elemento o elementos genéticos en un contexto que permita la producción de dicha al menos una proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma.

A fin de lograr la producción a gran escala de la inmunoglobulina deseada o de la proteína de tipo inmunoglobulina o de un fragmento funcional de la misma, la información genética que codifica los polipéptidos de interés se puede aislar a partir de estas células y se puede transferir en diferentes sistemas de expresión, con lo que se puede mantener la información genética, se puede amplificar y/o se puede usar para la producción de la proteína deseada o una parte de la misma.

Con más detalle, los marcos de lectura abierta que representan las regiones codificantes de los anticuerpos o proteínas de unión heterólogos se pueden aislar mediante métodos estándares de biología molecular, incluyendo amplificación mediante PCR con pares de cebadores específicos, y se pueden transferir en el contexto de diferentes sistemas de expresión, permitiendo la producción continua de los anticuerpos heterólogos o proteínas de unión. Estos sistemas de expresión comprenden sistemas de transcripción/traducción in vitro, sistemas de expresión procariotas, como por ejemplo E. coli, o sistemas de expresión de eucariotas, como la expresión en células de levaduras, células de insectos, usando infección con vaculovirus, o células de mamíferos.

La proteína de unión anteriormente mencionada, o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, pueden mostrar una especificidad única y por lo tanto pueden ser monoclonales, o se pueden codificar mediante más de una única especificidad y por lo tanto pueden ser policlonales.

Según una realización preferida, dicha proteína de unión o fragmento o fragmentos funcionales de la misma comparten completa o parcialmente características estructurales y/o funcionales de un anticuerpo, receptor de antígeno, o proteína de unión humanos, puesto que se puede ensamblar en la base del repertorio genético humano o partes del mismo.

Además, se prefiere que la proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma a producir se seleccione del grupo que consta de:

(a): anticuerpos que o bien están unidos a la membrana o bien se segregan, y que constan tanto de polipéptidos heterólogos de cadena pesada como de cadena ligera en la composición estequiométrica encontrada en anticuerpos naturales y que constan de cualquiera de los isotipos conocidos de cadena pesada (\mu, \delta, \gamma, \alpha, \varepsilon) y/o de cadena ligera (\kappa y \lambda);

(b): anticuerpos con combinaciones de polipéptidos de cadena pesada y de cadena ligera que son completamente humanos con respecto a la secuencia de aminoácidos primaria;

(c): anticuerpos híbridos que contienen polipéptidos heterólogos de cadena pesada o de cadena ligera procedentes de diferentes especies de vertebrados;

(d): fragmentos de anticuerpos Fab, scFv y F(ab')2 segregados, que son completa o parcialmente heterólogos;

(e): fragmentos de anticuerpos acoplados covalentemente vía péptidos ligadores, dando como resultado fragmentos de anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos;

(f): receptores de células T del isotipo \alpha, \beta, \gamma y \delta, receptores de antígenos, y otras proteínas de unión con parecido estructural a proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas;

y fragmentos funcionales de los mismos.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona linfocitos precursores de vertebrados genéticamente modificados, que

(a): derivan de órganos linfoides primarios y tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura,

(b): tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno heterólogo compuesto de dominios variables y de regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial heteróloga que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores de antígenos heterólogos codificados mediante la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, y

(c): tienen al menos un marcador de selección que está ligado operablemente a dicho al menos un elemento genético exógeno.

Según aún otro aspecto, la presente invención proporciona células de línea linfoide madura, que

(a): tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno heterólogo compuesto de dominios variables y de regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial heteróloga que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores de antígenos heterólogos codificados mediante la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, y

(b): tienen al menos un marcador de selección que está ligado operablemente a dicho al menos un elemento genético exógeno.

Según un aspecto adicional, la presente invención proporciona células inmortalizadas derivadas de células de línea linfoide madura, que

(a): tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno heterólogo compuesto de dominios variables y de regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial heteróloga que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores de antígenos heterólogos codificados mediante la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos,

(b): tienen al menos un marcador de selección que está ligado operablemente a dicho al menos un elemento genético exógeno, y

(c): produce dicha al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma.

Como se apreciará, los anticuerpos totalmente humanos o humanizados, o fragmentos funcionales de los mismos, se pueden usar en el diagnóstico, prevención y terapia de la enfermedad humana en virtud de su capacidad para unirse con sus dominios de región variable a antígenos específicos, y, además, por su capacidad para mediar funciones efectoras inmunitarias vía sus dominios de región constante. Algunos posibles usos de los anticuerpos monoclonales humanos, que se pueden producir según la invención, para el diagnóstico, prevención y terapia de la enfermedad humana se detallan a continuación. Con fines de diagnóstico, los anticuerpos monoclonales humanos se pueden usar para la identificación y visualización de ciertas patologías mediante la introducción de anticuerpos marcados en el sistema vascular de los pacientes, en el que se puede detectar una enfermedad específica relacionada con estructuras antigénicas (por ejemplo, expresada en ciertas células patológicas). Las aplicaciones en la prevención de la enfermedad humana incluyen anticuerpos con la capacidad para bloquear interacciones de ciertos sistemas de ligando con receptores de superficie celular en patologías (anticuerpos antagonistas), o por el contrario imitar el efecto del ligando uniéndose a los receptores de superficie celular (anticuerpos agonistas) en caso de ausencia patológica de un ligando. Además, los anticuerpos monoclonales humanos se pueden usar para bloquear las funciones de sustancias tóxicas, o de patógenos, por ejemplo durante el envenenamiento, inflamación e infecciones. En este contexto, los anticuerpos humanos son de uso particular debido a que median el marcado de estas sustancias y antígenos para la eliminación mediante células especializadas del sistema inmunitario innato. Los anticuerpos monoclonales humanos también se pueden usar para seleccionar funciones inmunitarias para células cancerosas en virtud de la unión específica a estructuras autoalteradas expresadas en la superficie de células cancerígenas. En el caso de patologías autoinmunitarias, los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser útiles además para neutralizar o contrarrestar los efectos patológicos de factores autoinmunitarios (autoanticuerpos, anticuerpos alérgicos). Los anticuerpos monoclonales humanos son útiles de este modo para el diagnóstico, prevención y terapia de la enfermedad humana, debido a que se pueden introducir en el sistema vascular de los pacientes sin provocar ningún efecto adverso, puesto que los anticuerpos son constituyentes normales del plasma sanguíneo y de los componentes fluidos de los seres humanos (por ejemplo, moco, saliva, fluido linfático, etc.).

Depósito de material biológico

Los plásmidos que llevan elementos genéticos usados según la presente invención se han depositado según el Tratado de Budapest con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DMSZ) en Braunschweig, Alemania, el 17 de Diciembre de 2001, con los siguientes números de acceso:

Plásmido	Número de Acceso
pBS-DT4	DSM 14703
pPGK-hygro	DSM 14704
pGL2neo(m)+	DSM 14705
pBS-DT4-tox176	DSM 14706

Los procedimientos experimentales siguientes describen métodos detallados para la generación de anticuerpos monoclonales humanos usando células preB murinas que se han modificado genéticamente a fin de conferirles el potencial para la producción de anticuerpos humanos. Se describen ejemplos seleccionados de métodos según lo siguiente que permiten las modificaciones genéticas de células preB murinas, de forma que ya no se pueden expresar anticuerpos endógenos, pero que los anticuerpos humanos se pueden producir a partir de constructos de expresión retrovíricos heterólogos establemente suministrados. Además, se presentan detalles experimentales relacionados con el transplante de estas células preB murinas genéticamente modificadas en hospedantes murinos apropiados, así como también métodos relacionados con la inmunización de estos ratones transplantados, el aislamiento de células secretoras de anticuerpos, y su establecimiento como líneas celulares de hibridomas que segregan anticuerpos humanos monoclonales inmortales. Aunque los métodos proporcionados son completos y suficientes para la producción de anticuerpos monoclonales heterólogos, especialmente humanos, usando células preB murinas, que están modificadas genéticamente, los métodos no se deben observar como limitación sino más bien como ilustración.

Ejemplos Ejemplo 1 Establecimiento de células precursoras B murinas, que proliferan a largo plazo, con el potencial para diferenciarse en células de línea B maduras

Las células precursoras B murinas que responden a células estrómicas y a IL7 se encuentran en el hígado fetal de fetos de ratón en el día 15-18 post-coitum, en la médula ósea de ratones adultos, así como en el bazo de animales neonatos (< 3 semanas) (Rolink et al., Blood, 81, 2290-2300, 1993). A fin de aislar estas células preB, los ratones se sacrificaron mediante asfixia por CO_{2}, y los órganos respectivos se retiraron en condiciones estériles. Las células totales de médula ósea se obtuvieron retirando el fémur y la tibia, abriendo los huesos en ambos extremos con tijeras estériles y lavando la médula con 2-5 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una jeringuilla desechable de 5 ml y una aguja de calibre 25 ó 26. El bazo o el hígado fetal aislados, preparados también en condiciones estériles, se sitúan en una rejilla de acero de malla 200 en una cápsula de Petri con 5-10 ml de PBS. Los órganos se cortan en trozos y se aplastan suavemente a través de la rejilla metálica con el émbolo de una jeringuilla plástica de 5 ml. Las suspensiones celulares se lavan una vez mediante centrifugación (200 g, 10 min., 4ºC) y se resuspenden en 10-20 ml de PBS. Todas las preparaciones celulares se llevan a cabo con disoluciones enfriadas con hielo, y las suspensiones celulares se mantienen en hielo hasta que se transfieren al cultivo de tejidos.

El establecimiento de clones de células preB individuales se realiza limitando la disolución en placas de 96 pocillos revestidas con células estrómicas murinas ST-2 (Ogawa et al., EMBO J., 7, 1337-1343, 1988) o PA-6 (Kodama et al., J. Cell. Physiol., 118, 233-240, 1984) irradiadas con radiación \gamma con 3000 rad, semiconfluentes, que se hicieron crecer en medio especial para células estrómicas (véase más abajo). Para limitar la colocación en placas de la disolución, se pueden usar poblaciones de células totales de órganos, o, como alternativa, células de línea B positivas con marcadores superficiales B220^{+} o CD19^{+} enriquecidas mediante clasificación celular activada por perlas fluorescentes o magnéticas (FACS o MACS) usando anticuerpos comerciales específicos para estos marcadores.

El cultivo a largo plazo de células preB murinas se realiza en un medio especial libre de suero, que contiene 100 unidades de interleuquina-7 (IL-7) recombinante (véase más abajo). Las colonias individuales de células preB se desarrollan en alimentadores de células estrómicas en condiciones de dilución limitante en 6-7 días de cultivo a 37ºC, en una incubadora humidificada en una atmósfera de 10% de CO_{2}. Las colonias individuales de células preB se transfieren inicialmente a placas de 24 pocillos y después se expanden secuencialmente en matraces de cultivo de tejido de 25 cm^{2} y eventualmente 75 cm^{2}, siempre prerrevestidos con células estrómicas irradiadas con radiación \gamma de 3000 rad. Después de la expansión inicial, es necesario mantener las densidades de células preB entre 1 x 10^{5} y 2 x 10^{6} células preB/ml de medio de cultivo de tejido, que requiere subcultivar las células cada dos o tres días.

Medio de cultivo de tejido libre de suero especial (Iscove y Melchers, J. Exp. Med., 147, 923-933, 1978) requerido para el establecimiento de células preB murinas dependientes de IL-7, de células estrómicas, que proliferan a largo plazo (formulación para 1 litro de medio):

\bullet: 11 g de polvo DMEM (sin bicarbonato)

\bullet: 10 ml de HEPES 1 M, pH 7,3

\bullet: 33,3 ml de disolución al 7,5% de NaHCO_{3}

\bullet: 8 ml de disolución madre de aminoácidos que contiene:

- L-alanina	600 mg
- L-asparagina	520 mg
- L-aspartato	720 mg
- L-glutamato	1800 mg
- L-prolina	960 mg
- Piruvato sódico	2640 mg
+ 1,6 ml de disolución madre de Biotin/vitamin B12 que contiene
- Vitamina B12	5,0 mg
- D-biotina	5,0 mg

\hskip0,5cm

disuelto en 20 ml + 10 \mul de HCl 1 M

\hskip0,5cm

todos los componentes disueltos en 240 ml de H_{2}O ultrapura

\bullet: 4 ml de disolución madre de cisteína que contiene

- L-cisteína

1,4 g

\hskip0,5cm

disuelta en 150 ml de H_{2}O, 50 ml de HCl 1 M

\bullet: 5 ml de disolución al 10% de BSA (seroalbúmina bovina)

\bullet: 0,15 ml de disolución madre de transferrina humana compuesta de:

- 10 ml de disolución a.) y 80 \mul de disolución b.)
	a.) 1 g de transferrina humana disuelta en 10 ml de DMEM (1,3 g/100 ml de H_{2}O) + 100 \mul de HEPES
	{}\hskip0,4cm 1 M, pH 7,3
	b.) 440 mg de FeCl_{3}x6H_{2}O + 185 ml de H_{2}O + 200 \mul de HCl 1 M

\bullet: 5 ml de disolución madre de lípido de haba de soja

\begin{minipage}[t]{155mm}- 20 mg de lípidos de haba de soja mezclados con 45 ml de DMEM (1,3 g/100 ml de H_{2}O) + 5 ml de BSA al {}\hskip1,78mm 10%. Ultrasonidos 3 x 15 minutos en agua con hielo\end{minipage}

\bullet: 20 ml de kanamicina (5000 \mug/ml)

\bullet: 30 \mul de 2-mercaptoetanol (1,43 M)

\bullet: 10^{5} U de interleuquina-7 (IL7) de ratón recombinante

Todos los componentes se disuelven en un volumen final de 1000 ml de H_{2}O ultrapura, triplemente destilada, filtrada en estéril y mantenida a 4ºC hasta su uso.

Es necesario que las células alimentadoras de células estrómicas ST-2 o PA-6 se hagan crecer en un medio especial que contiene poco suero, según lo siguiente (formulación para 1 litro):

\bullet: 17,7 g de polvo de IMDM (sin bicarbonato)

\bullet: 3 g de NaHCO_{3}

\bullet: 10 ml de 100x aminoácidos no esenciales (GIBCO-BRL)

\bullet: 10 ml de 100x penicilina/estreptomicina (GIBCO-BRL)

\bullet: 1 ml de disolución de insulina porcina 5 mg/ml

\bullet: 1 ml de 2-mercaptoetanol 50 mM

\bullet: 3 ml de primatona al 10% (ultrafiltrada para excluir proteínas >10 kD) (fuente: Quest International, Naarden, Países Bajos)

\bullet: 20 ml de suero fetal de ternera

Todos los componentes se disolvieron en un volumen final de 1000 ml de H_{2}O ultrapura, triplemente destilada, filtrada en estéril y mantenida a 4ºC hasta su uso.

Ejemplo 2 Diferenciación in vitro por pasos de células precursoras B murinas en células de plasma que segregan anticuerpos

Las células preB murinas dependientes de células estrómicas y de IL7, que proliferan a largo plazo, retienen su potencial para diferenciarse en células de línea B más maduras (Rolink et al., EMBO J., 10, 327-336, 1991), lo que se puede lograr in vitro. Esta diferenciación se puede realizar en dos etapas induciendo primeramente la diferenciación a células con un fenotipo de células B inmaduras y, en segundo lugar, induciendo la diferenciación a células con un fenotipo de células del plasma que segregan anticuerpos.

La primera etapa de diferenciación se alcanza eliminando la IL7 de las células preB en presencia continua de células estrómicas. Para ello, las células preB se recogen de cultivos proliferantes, se lavan tres veces con medio de cultivo de células preB libre de suero, que carece de IL7, y se colocan en placas a una densidad de 1-2 x 10^{6} células/ml sobre células estrómicas recientes, irradiadas con radiación \gamma de 3000 rad, en ausencia de IL7. En un período de tres días, la célula preB detiene su proliferación y diferenciación en células con un fenotipo de células B inmaduras. Los cambios fenotípicos incluyen, por ejemplo, la pérdida de la expresión c-kit, \lambda_{5} y V_{preB}, y la ganancia de la expresión de CD25 y CD40. En células preB procedentes de ratones de tipo salvaje, esta diferenciación se acompaña además por reordenamientos V_{H} a DJ_{H} secuenciales en los locus génicos de cadena IgH seguido de reordenamientos V_{L} a J_{L} en los locus génicos de cadena IgL, lo que puede dar como resultado la expresión de anticuerpo IgM unido a la superficie en las células de línea B diferenciadas (Rolink et al., EMBO J., 10, 327-336, 1991). Sin embargo, se ha de señalar que el reordenamiento ordenado de los segmentos génicos IgH y L no es un prerrequisito para la diferenciación fenotípica de estas células preB in vitro (Grawunder et al., Int. Immunol., 7, 1915-1925, 1995).

La segunda etapa de diferenciación se puede lograr estimulando a las células privadas de IL7 con un anticuerpo anti-CD40 agonista o con LPS en combinación con citoquinas, como por ejemplo IL4, IL5, IL10 o TGF-\beta. Este tratamiento inducirá la proliferación, la recombinación de cambio de clase a diversos isotipos génicos de Ig (dependiendo de la combinación de citoquinas empleadas) y eventualmente la diferenciación a células del plasma que segregan anticuerpos. En el caso de, por ejemplo, la estimulación anti-CD40/IL4, las células se lavan tres veces en medio de cultivo de tejido de células preB, se colocan en placas sobre células estrómicas recientes, irradiadas con radiación \gamma de 3000 rad subconfluentes, en presencia de 100 U/ml de IL4 y 5 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD40 durante 4-6 días. Las células de la etapa de células del plasma proliferantes, grandes, se pueden identificar y separar mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), basándose en su gran tamaño, lo que da como resultado valores de dispersión hacia delante aumentados de forma notable.

La diferenciación in vitro de células preB de tipo salvaje habitualmente está acompañada por la pérdida de cantidades sustanciales de células debido a la retirada del factor de crecimiento inducida por apoptosis. Este problema se puede obviar mediante la sobreexpresión de genes antiapoptóticos, como bcl-2 o bcl-x_{L} en estas células ((Rolink et al., J. Exp. Med., 178, 1263-1270, 1993). Esto se puede lograr aislando células preB a partir de ratones que contienen una línea B expresada específicamente mediante un transgén bcl-2 (Strasser et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 166, 175-181, 1990), o transduciendo un vector retrovírico recombinante que codifica bcl-2 en células preB murinas dependientes de células estrómicas y de IL7, que proliferan a largo plazo (véase más abajo).

Ejemplo 3 Clonación de un constructo de expresión retrovírico para la sobreexpresión de Bcl2 murino

Un prerrequisito para la transducción estable de genes en células preB murinas dependientes de células estrómicas y de IL7, que proliferan a largo plazo, es la construcción de un vector de transferencia retrovírico recombinante que contiene un casete de expresión para un gen de interés. Los vectores de transferencia retrovíricos constan de secuencias de repetición terminal largas 5' y 3' (LTR) retrovíricas que flanquean a una señal de empaquetamiento retrovírica, Psi(+), un sitio de clonación múltiple (MCS) en el que se pueden insertar secuencias heterólogas, y elementos de control plasmídicos bacterianos requeridos para la replicación y mantenimiento del vector en E. coli. Un ejemplo para un vector de transferencia retrovírico vacío es el plásmido pLIB (Clontech) comercialmente disponible (Fig. 11a).

A fin de construir un vector de expresión retrovírico que contenga el gen antiapoptótico bcl-2, se aplica una estrategia para la coexpresión del ADNc de bcl-2 murino y del marcador de selección de fármaco de higromicina B ligando la expresión de bcl-2 y de la higromicina B usando una secuencia de entrada ribosómica interna (IRES), que permite la expresión simultánea de dos constructos, que se puede seleccionar con el antibiótico farmacéutico higromicina B se seleccionarán simultáneamente células para la expresión del gen antiapoptótico bcl-2. La generación del vector retrovírico para la expresión acoplada de los ADNc de bcl-2 y de higromicina B transcurre en dos etapas: primeramente el ensamblaje del casete de expresión promotor-bcl-2-IRES-higromicina B, y en segundo lugar la clonación de este casete en el MCS del vector de transferencia retrovírico pLIB (Fig. 11 a+b).

(a) Construcción del casete de expresión promotor-bcl-2-IRES-higromicina B

Tanto el ADNc de bcl-2 murino como el marco de lectura abierta (ORF) para el marcador de resistencia a fármacos de higromicina B se clonan en el vector CMV-promotor-IRES comercialmente disponible (Clontech), pIRES. Para esto, el ORF de higromicina B se amplifica a partir de pPGK-hygro plasmídico (SEQ ID NO. 1)

1

mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando un par de cebadores que contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adicionales (indicados en letras mayúsculas) para endonucleasas de restricción XbaI y NotI (también se añaden 2-4 nucleótidos al azar 5' de la secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción, debido a que la mayoría de las enzimas de restricción no digieren eficazmente al ADN, si la secuencia de reconocimiento está localizada directamente en el extremo de los fragmentos de ADN amplificados por PCR. Estos nucleótidos flanqueantes están indicados en letras minúsculas, a fin de resaltar los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Las secuencias en dirección 3', o 3' de los sitios de restricción resaltados, corresponden a secuencias de ADN del fragmento a amplificar. Este modo de presentación de las secuencias de cebadores se mantiene en toda la descripción de los ejemplos experimentales. Una PCR con cebadores P001 y P002 amplificará un fragmento de ADN de 1017 pares de bases (pb) que contiene sitios de reconocimiento únicos para endonucleasas de restricción XbaI y NotI en los extremos del fragmento. El fragmento de PCR se digiere doblemente entonces con las enzimas de restricción XbaI y NotI, y entonces se clona direccionalmente en el plásmido pIRES digerido doble XbaI/NotI, a fin de generar el constructo plasmídico pIRES-hygroB (Fig. 11a). El ORF del ADNc de bcl-2\alpha murino se aísla y se amplifica a partir de ARNm de bazo de ratón mediante reacción en cadena de polimerasa acoplada con transcriptasa inversa (RT-PCR) usando los siguientes cebadores diseñados basándose en las secuencias publicadas de NCBI-Genbank M16506 y L31532 (el cebador P003 se une a la posición 1821-53 de M16506, y el cebador P004 se une a la posición 506-535 de L31532):

2

que contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (en letras mayúsculas) para NheI y MluI. Seguidamente se clona direccionalmente un producto de PCR digerido doble NheI/NotI, que tiene un tamaño de 699 pb, en el vector pIRES-hygroB digerido doble NheI/MluI a fin de generar pBcl2-IRES-hygroB.

(b) Construcción de un vector de transferencia que expresa Bcl-2 retrovírico

Debido a la falta de sitios de enzimas de restricción compatibles en el sitio de clonación múltiple del vector de transferencia retrovírico vacío pLIB y el vector de expresión bcl-2/higromicina B dual, pBcl2-IRES-hygroB, el casete de expresión completo para Bcl-2-IRES-higromicina B, incluyendo el promotor CMV constitutivo y el sitio de poliadenilación, se clona en pLIB usando PCR con sitios de reconocimiento de enzimas de restricción apropiados. Para esto, el casete de expresión CMV-bcl2-IRES-higromicina B se amplifican mediante PCR con pBcl2-IRES-hygroB como el molde de PCR usando los cebadores:

3

que contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción para SalI y ClaI (en letras mayúsculas). Seguidamente se clona direccionalmente un producto de PCR digerido doble SalI/ClaI, de 3714 pb, en el vector pLIB digerido doble SalI/ClaI generando de ese modo un vector de transferencia retrovírico pLIB-bcl2-IRES-hygroB que permite la expresión acoplada de bcl-2 y de higromicina B.

Ejemplo 4 Transducción retrovírica de células preB murinas dependientes de células estrómicas y de IL7, que proliferan a largo plazo

Una de las maneras para transferir de forma estable elementos genéticos en células preB murinas es usar la transducción retrovírica (Fig. 8). Para este procedimiento, se transfecta transitoria o establemente un constructo de ADN recombinante, que contiene secuencias retrovíricas necesarias para el empaquetamiento de un genoma retrovírico (5'LTR, señal de empaquetamiento Psi(+), 3'LTR), así como las secuencias heterólogas o genes de interés, en una línea celular de empaquetamiento que expresa constitutivamente los genes requeridos para la producción de partículas retrovíricas.

Para la transducción de células preB murinas dependientes de células estrómicas y de IL7, se puede usar la línea celular de empaquetamiento retrovírico ecotrópica GPE (Markowitz et al., J. Virol., 62, p. 1120-1124, 1988), que da como resultado normalmente una transducción estable de células preB a eficacias de 50-80%. Esta línea celular de empaquetamiento ecotrópica, en conjunción con vectores de transferencia retrovíricos (recombinantes), sólo producirá retrovirus deficientes en la replicación (recombinantes) capaces de transducir células murinas. Para la transfección transitoria de la línea celular de empaquetamiento GPE ecotrópica, se usa la transfección estándar con fosfato de calcio, según se detalla a continuación:

(a) Transfección transitoria de la línea celular de empaquetamiento retrovírica ecotrópica GPE

Las células GPE se hicieron crecer en medio con bajo contenido en suero y a base de IMDM, usado también para las células estrómicas ST-2 y PA-6 y descrito en el ejemplo 1. Un día antes de la transfección, las células de empaquetamiento GPE adherentes se cosechan mediante tripsinización y se siembran a una confluencia del 50% en medio reciente, con bajo contenido en suero y a base de IMDM, y se cultivan a 37ºC en 10% de CO_{2}. Al siguiente día, se transfectan 20 \mug de ADN retrovírico por matraz de cultivo de tejidos T75 (75 cm^{2}) de células GPE, usando la precipitación estándar con fosfato de calcio. Después de 24 horas tras la transfección, las células GPE transfectadas se pueden usar para la transducción de retrovirus recombinantes en células preB.

(b) Transducción retrovírica de células preB usando el sobrenadante del cultivo de células GPE transfectadas o el cocultivo con células GPE transfectadas

Se pueden usar dos métodos de forma intercambiable para la transducción de los retrovirus recombinantes producidos mediante células GPE transfectadas: el primer método se basa en la infección de células preB con el sobrenadante del cultivo celular acondicionado. Para ello, el medio de cultivo celular procedente de células GPE transfectadas se sustituye 24 horas después de la transfección y se cosecha después de otras 24 horas de cultivo celular. Los retrovirus recombinantes que contienen el sobrenadante de cultivo celular se añaden entonces a los cultivos de células preB proliferantes a relaciones de 1:8 (vol) hasta 1:1 (vol) en presencia de 8 \mug/ml de polibreno, y se continúa la incubación durante 3-6 horas a 37ºC. Seguidamente, las células se cosechan, se retira el medio que contiene polibreno/retrovirus, y las células se colocan en placas a una densidad de 1-2 x 10^{5} sobre células estrómicas recientes, irradiadas con radiación \gamma de 3000 rad, en medio de células preB que contienen 100 U de IL7r. Las células preB transducidas retrovíricamente se cosechan entonces 24 horas más tarde.

El segundo método se basa en el cocultivo de células preB con retrovirus recombinante transfectado que produce células GPE. Para ello, las células preB de fase log se cosechan y se resuspenden en medio de cultivo de células preB reciente que contiene 100 U de IL7r y 8 \mug/ml de polibreno a una densidad de 2-4 x 10^{5} células, y se colocan en placas sobre células GPE transfectadas 24 horas tras la transfección con constructos retrovíricos. Las células preB se cocultivan durante 6 horas a 37ºC, seguidamente se cosechan y se colocan en placas sobre células estrómicas recientes, irradiadas con radiación \gamma de 3000 rad, en medio de células preB que contiene 100 U de IL7r para su recuperación. Las células preB retrovíricamente transducidas se cosechan entonces y se pueden utilizar 24 horas más tarde.

Ejemplo 5 Inactivación de locus génicos de cadena pesada y de cadena ligera inmunoglobulínicos endógenos en células precursoras B murinas que proliferan a largo plazo

La primera etapa para la generación de anticuerpos heterólogos, preferiblemente humanos, a partir de células precursoras B murinas es la inactivación de las cadenas IgH e IgL murinas endógenas, lo que se puede lograr, entre otros métodos, por ejemplo, seleccionando genes dentro del locus génico de inmunoglobulina en células preB. En teoría, se necesitaría inactivar los tres locus génicos inmunoglobulínicos murinos, es decir los locus génicos de cadenas IgH, Ig\kappaL e Ig\lambdaL. Sin embargo, el locus génico de cadena \lambdaL murino comprende sólo tres agrupamientos V-J-C funcionales con un segmento génico cada uno, y en las cadenas \lambdaL hay solamente una diversidad muy limitada. Además, menos del 5% de células B murinas expresan los locus génicos de cadena \lambdaL. Por lo tanto, en términos prácticos, es suficiente inactivar los locus génicos de cadenas IgH y \kappaL murinos endógenos a fin de asegurarse de que, con la transferencia de los genes o locus génicos de cadenas IgH e Ig\kappaL heterólogos, la inmensa mayoría de células B (>95%) producidas a partir de células preB expresará anticuerpos heterólogos.

(a) Aislamiento de células preB con alelos IgH no funcionales irreversiblemente de origen natural

Generalmente, la forma más controlada para inactivar los locus génicos de cadenas IgH y \kappaL endógenos es usar la selección de genes (véase más abajo). Sin embargo, en el caso del locus génico de cadena IgH, se puede aplicar otro método:

Las células preB murinas dependientes de IL7 de células estrómicas, que proliferan a largo plazo, tienen los reordenamientos DJ_{H} en ambos alelos de cadena pesada. Debido a la imprecisión en el proceso de unión de D a J_{H}, estos reordenamientos DJ_{H} pueden suceder de forma que los segmentos génicos D se pueden leer en los tres marcos de lectura posibles con relación al marco de lectura fijo del segmento génico J_{H}. Estos marcos de lectura se han denominado arbitrariamente marcos de lectura I, II y III (Kaartinen y Mäkelä, Immunol. Today, 6, p. 324-330, 1985). La mayoría de los segmentos génicos D contienen codones de parada, si una unión DJ_{H} ocurre en el marco de lectura III (Kaartinen y Mäkelä, s.a.), de forma que una cadena H funcional nunca se puede expresar a partir de tal alelo de cadena pesada.

Por lo tanto, estadísticamente casi 1/9 (11,1%) de todas las células preB dependientes de IL7, de células estrómicas, tienen reordenamientos DJ_{H} en el marco de lectura III con una parada que codifica ambos alelos de cadena IgH. Estas células preB se pueden aislar subclonando en condiciones de dilución limitante y detectando sistemáticamente los reordenamientos no funcionales deseados. Para asegurar el aislamiento de clones estables, es necesario detectar sistemáticamente los reordenamientos para dos reordenamientos génicos DJ_{H}4 no funcionales, que no se pueden invertir mediante reordenamientos secundarios debido a que el último segmento génico J_{H} se ha usado. Tales clones se pueden usar para la inactivación adicional seleccionada de los alelos de cadena \kappaL.

(b) Generación de constructos de selección para los locus de cadena IgH e Ig\kappaL murinos

Se presentan como ejemplos dos ejemplos de métodos que dan como resultado la inactivación seleccionada de genes de ambos locus génicos de cadena IgH e Ig\kappaL endógenos para muchas mutaciones que actúan en cis que conducirían de forma similar a células preB sin el potencial para expresar proteínas de cadena IgH e Ig\kappaL endógenas (Fig. 5a, b). Para ambas estrategias de selección, primero es necesario construir vectores de selección génica positivos-negativos vacíos que contienen sitios de clonación únicos que permitan la inserción de secuencias de ADN homólogas al locus génico diana, un posible marcador de selección de fármacos, como neomicina o puromicina, flanqueado por sitios loxP, y un marcador de selección negativa, como la toxina de la difteria, o la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-tk), que seleccionará frente a la integración al azar del vector de selección génica en el genoma de las células. La presencia de un marcador de selección positiva flanqueado por loxP (flanqueado) permitirá la selección génica secuencial de ambos alelos en el mismo clon celular usando el mismo antibiótico, debido a que, después de la selección con éxito del primer alelo, se puede eliminar el marcador de resistencia a antibiótico de las células con la expresión transitoria de cre recombinasa que elimina cualquier secuencia nucleotídica localizada entre los sitios de reconocimiento de loxP cognatos. Los vectores de selección positivos-negativos vacíos se construyen según lo siguiente (Fig. 6a, b).

Etapa 1

Extensión del sitio de clonación múltiple de SK(+)

Se hibridan dos oligómeros de ADN sintéticos complementarios:

4

mezclando 100 pmoles de cada oligómero en 50 \mul de 50 mM de Tris/HCl, 100 mM de NaCl, pH 8,0. La mezcla se desnaturaliza entonces durante 2 minutos a 95ºC y se enfría lentamente desde 65ºC hasta temperatura ambiente en 20 minutos. Esto generará el siguiente ligador de ADN de doble hebra con proyecciones compatibles XhoI y KpnI (indicadas en letras mayúsculas):

5

El ligador de ADN sintético hibridado se liga entonces en pBluescriptSK(+) (Stratagene) comercialmente disponible linealizado con XhoI-KpnI, dando como resultado el plásmido pBSL que contiene un sitio de clonación múltiple extendido (MCS+, véase la Fig. 6a) requerido para las siguientes etapas de clonación.

Etapa 2

Inserción de casetes de expresión para toxina \alpha de la difteria de tipo salvaje o atenuada como un marcador de selección negativa frente a la integración al azar de constructos de selección

Como marcador de selección negativa que permita la selección frente a la integración cromosómica al azar de constructos de selección génica, se puede usar un casete de expresión para la toxina \alpha de la difteria (McCarrick et al., s.a.), o su versión atenuada, la toxina \alpha de la difteria (DT-\alphatox176) (Maxwell et al., s.a.), bajo control de un promotor constitutivo de \beta-actina. Aunque habitualmente se usan otros marcadores de selección negativos, como el gen de timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-tk), en experimentos de selección génica con embriocitos indiferenciados de ratón, se ha demostrado que la toxina \alpha de la difteria y su mutante atenuado tox176 son eficaces para la selección génica en células somáticas (Grawunder et al., Mol. Cell. 2, p. 477-484, 1998). Los casetes de expresión de la toxina de la difteria se aíslan como fragmentos BglII-XbaI de 2,1 kb a partir de plásmidos pBS-DT4 (SEQ ID NO. 2), o pBS-DT4tox176 (SEQ ID NO. 3; véase la Fig. 6a), y se ligan en el pBSL linealizado con BglII-NheI, dando como resultado plásmidos pBSL-DT4 y pBSLDT4tox176, respectivamente (véase la Fig. 6a).

Etapa 3

Inserción de marcadores de selección de fármacos positivos flanqueados por loxP en pBSL-DT4 y pBSLDT4tox176 para la generación de vectores de selección génica vacíos

La siguiente etapa para la generación de vectores de selección génica positivos/negativos es la inserción de un marcador de selección de fármacos positivos en el vector pBSL-DT4 o pBSL-DT4tox176, en dirección 5' del casete de expresión de la difteria. Como ejemplos representativos se presenta la inserción de los casetes de expresión de neomicina, puromicina e higromicina B flanqueados por los sitios loxP en dirección 5' del casete de expresión de la toxina \alpha de la difteria en pBSL-DT4. Sin embargo, se debe observar que se pueden aplicar estrategias de clonación idénticas al vector pBSL-DT4tox176, que contiene la versión atenuada de la toxina \alpha de la difteria. Además, se pueden usar otros marcadores de selección de fármacos positivos que confieren resistencia, por ejemplo, a histidinol, ácido micofenólico, bleomicina, o zeocina.

En cada caso, el casete del marcador de selección antibiótica positivo estará flanqueado por sitios loxP que se pueden reconocer mediante la enzima cre recombinasa, y que se puede usar para eliminar el marcador de selección de fármaco localizado entre los sitios loxP con la transfección transitoria de un vector de expresión de cre recombinasa, para uso secuencial del mismo marcador de selección.

i) Inserción de un casete de resistencia a neomicina flanqueado

Se puede aislar un casete de resistencia a neomicina flanqueado por los sitios loxP como un fragmento de ADN digerido con Bsp120I-XbaI de 1497 pb a partir del plásmido pGL2neo(m)+ (SEQ ID NO. 4), y se puede ligar en pBSL-DT4 linealizado con NotI-XbaI para generar el vector de selección vacío pBSL-flneo-DT4.

ii) Clonación de los casetes de puromicina e higromicina B flanqueados (Fig. 6b)

Debido a que los marcadores de selección antibiótica flanqueados distintos de neomicina se encuentran raramente, una etapa esencial para la inserción de marcadores de puromicina o higromicina B flanqueados con loxP en pBSL-DT4 es la etapa preparatoria de la inserción de dos sitios loxP. Esto se puede lograr insertando en oligómeros de ADN sintéticos hibridados con pBSL-DT4. Los sitios de loxP sintéticos están contenidos en los siguientes dos oligos de ADN complementarios:

6

Estos dos oligómeros de ADN se hibridan como se describe en el ejemplo 5(b), etapa 1, dando como resultado un fragmento de ADN de doble hebra que contiene dos sitios loxP separados mediante un sitio de restricción MluI único. Además, los oligómeros de ADN sintéticos hibridados contienen dos proyecciones de hebra sencilla 5'-CTAG, que se pueden ligar directamente en proyecciones de sitios de restricción compatibles (generadas, por ejemplo, mediante enzimas de restricción SpeI, NheI, XbaI o AvrII).

El fragmento de ADN que contiene el sitio loxP doble hibridado se liga entonces en pBSL-DT4 linealizado con SpeI dando como resultado el vector pBSL-DT4-2loxP (Fig. 6b).

Los casetes de expresión para resistencia a puromicina o higromicina B se pueden amplificar mediante PCR usando plásmidos pPur (Clontech) o pPGK-hygro (SEQ ID NO. 1), como moldes de PCR, respectivamente. Los cebadores usados para amplificación mediante PCR del casete de expresión de puromicina de 1366 pares de bases a partir de pPur (que contiene el ORF de puromicina bajo control del promotor temprano del virus de simio 40) son:

7

Ambos cebadores contienen sitios de reconocimiento para la endonucleasa de restricción MluI (indicada en mayúsculas), de forma que el producto de PCR resultante se puede clonar usando esta enzima de restricción.

Después de la digestión con MluI del producto de PCR aislado, el fragmento del marcador de puromicina se liga en pBSL-DT4-2loxP linealizado con MluI que genera el vector de selección vacío pBSL-flpur-DT4 (Fig. 6b).

Los cebadores usados para la amplificación mediante PCR del casete de expresión de higromicina B de 2007 pb, procedente de pPGK-hygro (SEQ ID NO. 1; que contiene el ORF de higromicina B bajo control del promotor de fosfoglicerato quinasa) son:

8

Ambos cebadores contienen sitios de reconocimiento para la endonucleasa de restricción MluI (indicada en mayúsculas), de forma que el producto de PCR resultante se puede digerir y ligar usando esta enzima de restricción.

Después de la digestión con MluI del producto de PCR aislado, el fragmento del marcador de higromicina B se liga en pBSL-DT4-2loxP linealizado con MluI que genera el vector de selección vacío pBSL-flhyg-DT4 (Fig. 6b).

Etapa 4

Clonación de vectores de selección finales para locus génicos de cadena IgH y \kappaL murinos, así como para el gen RAG1

Como ejemplos representativos para la clonación de vectores de selección para locus génicos endógenos, se describen las estrategias de clonación para vectores de selección génica útiles para la mutación dirigida que actúa en cis de los locus génicos de cadena IgH e Ig\kappaL endógenos, y para la mutación que actúa en trans del gen RAG1 en células preB murinas.

i) Construcción de vectores de selección de cadena IgH (Fig. 5a)

La inactivación del locus génico de cadena IgH murino endógeno en células preB se puede lograr generando muchas eliminaciones dirigidas que actúan en cis diferentes en ambos alelos de cadena IgH. Una de las eliminaciones que inactivan IgH es, por ejemplo, la eliminación de todos los segmentos génicos D_{H} y J_{H}, que se describe aquí como una de las posibilidades para hacer que los alelos de IgH endógenos sean incapaces de producir inmunoglobulinas endógenas. Se presenta aquí la construcción del vector de selección usando un constructo de selección de neomicina "flanqueado" como un ejemplo (véase la Fig. 5a). Para la clonación de vectores de selección génica que contienen otro constructo de selección antibiótica positivo, como por ejemplo puromicina o higromicina B, se pueden aplicar estrategias similares.

Las células preB murinas dependientes de IL7, de células estrómicas, habitualmente tienen reordenamientos DJ_{H} en ambos alelos (véase anteriormente). Es necesario tener en cuenta este hecho para el diseño de vectores de selección. Independientemente del tipo de reordenamiento DJ_{H}, las secuencias de ADN que intervienen los segmentos génicos variables y el agrupamiento de segmento génico D, así como las secuencias de intervención entre el agrupamiento génico J_{H} y la región codificante C\mu, aún están presentes en ambos alelos de IgH en todas las células preB. Por lo tanto, los vectores de selección para alelos reordenados DJ_{H} tienen que contener regiones de homología en dirección 5' del elemento D localizado más hacia 5' (D_{FL16,1}) y en dirección 3' del segmento génico J_{H} localizado más hacia 3' (J_{H}4).

En la Fig. 5a se representa la organización genómica de un posible alelo reordenado D_{FL16,1}-J_{H4} con secuencias de ADN genómicas circundantes. Como estrategia general para la selección génica, se clona una región corta de homología de secuencia de ADN (1-1,5 kb), localizada en dirección 5' de la región o gen a eliminar, en un sitio de reconocimiento de enzima de restricción único en dirección 5' de un marcador de selección positiva "flanqueado" (aquí NotI), y se clona una región más larga de homología de secuencia de ADN (>2,5 kb), localizado en dirección 3' de la región o gen a eliminar, en un sitio de reconocimiento de enzima de restricción único localizado entre el marcador de selección positiva "flanqueado" y el casete de expresión de la toxina \alpha de la difteria (Fig. 5a) (aquí AscI). Por lo tanto, sólo se evita la expresión del marcador de selección negativa (toxina \alpha de la difteria), si ocurre la recombinación homóloga en la región larga de homología de secuencia de ADN del vector de selección y el locus génico endógeno, de forma que el casete de expresión DT-\alpha se perderá con la integración dirigida del vector de selección en el ADN cromosómico. Si ocurre posteriormente la recombinación homóloga en el brazo de homología corto, la región localizada entre el doble cruzamiento será sustituida por el marcador de selección de fármaco positivo. De este modo, el uso de la selección antibiótica en células preB transfectadas con el constructo de selección da como resultado la selección fuerte de la integración seleccionada del vector de selección mediante recombinación homóloga dando como resultado la eliminación del locus génico endógeno.

Se puede amplificar mediante PCR una región corta de homología en dirección 5' del elemento D localizado más hacia 5' (D_{FL16,1}) a partir de ADN genómico de ratón usando los siguientes cebadores diseñados en base a la secuencia AF018146 publicada de NCBI-Genbank:

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Se indican en mayúsculas los nucleótidos de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción NotI anejos con fines de clonación. Los cebadores amplificarán un fragmento de PCR genómico de 1465 pb que se puede digerir con una enzima de restricción NotI y se puede ligar en pBSL-flneo-DT4 linealizado con NotI generando pBSL-5'J_{H}-flneo-DT4 (Fig. 5a). La región larga de homología de secuencia en dirección 3' del agrupamiento de segmento génico J_{H}, q también comprende el potenciador del intrón de la cadena pesada E\muH, se puede amplificar mediante PCR a partir de ADN genómico de ratón usando los siguientes cebadores diseñados basándose en el archivo de secuencia J00440 publicado de NCBI-Genbank (los nucleótidos del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción AscI anejo se indican en letras mayúsculas):

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Los cebadores amplificarán un fragmento de PCR genómico de 3215 pb a partir de ADN genómico de ratón que se puede digerir con la enzima de restricción AscI y se puede ligar en pBSL-5'J_{H}-flneo-DT4 linealizado con AscI generando el vector de selección J_{H} final pBSL-5'J_{H}-flneo-3'J_{H}-DT4 que se puede usar para eliminar todos los segmentos génicos D_{H} y J_{H} restantes en las células preB reordenadas DJ_{H} (Fig. 5a).

ii) Construcción de los vectores de selección de cadena \kappaL (Fig. 5b)

Al igual que en el caso del locus de cadena IgH, los locus génicos de cadena \kappaL se pueden inactivar mediante varias mutaciones que actúan en cis, incluyendo por ejemplo eliminaciones de todos los segmentos génicos J_{\kappa }, el potenciador del intrón de la cadena \kappaL (\kappaiE), la región de cadena \kappaL constante (C_{\kappa }), o el potenciador 3'\kappa (3'\kappaE). Como ejemplo, se describen aquí constructos de selección y métodos que se pueden usar para la eliminación dirigida de todos los segmentos génicos J_{\kappa }. Además, la construcción de los constructos de selección descrita aquí se presenta sólo para constructos de selección que contienen un marcador de resistencia a neomicina "flanqueado". La clonación de los constructos de selección que contienen los casetes de expresión de puromicina o higromicina B "flanqueados" se realiza de manera análoga. Se amplifica mediante PCR una región corta de homología en dirección 5' de la agrupación de segmento génico J_{\kappa }, a partir de ADN genómico de ratón usando los siguientes cebadores diseñados según la entrada V00777 publicada de NCBI-Genbank (se presentan en letras mayúsculas los nucleótidos del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción de NotI anejo con fines de clonación):

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El cebador P019 se une a la posición 1-30 y el cebador P020 a la posición 711-738 de la entrada V00777 de NCBI-Genbank. El fragmento de PCR de 738 pb resultante se digiere con la enzima de restricción NotI y se liga en el vector de selección vacío linealizado con NotI pBSL-flneo-DT4 generando pBSL-5'J_{\kappa }-flneo-DT4 (Fig. 5b). La región larga de homología de secuencia de ADN en dirección 3' del agrupamiento de segmento génico J_{\kappa }, que comprende el \kappaiE y la región de cadena \kappaL constante (C_{\kappa }), se amplifica mediante PCR a partir de ADN genómico de ratón usando los siguientes cebadores diseñados basándose en la entrada V00777 publicada de NCBI-Genbank (se dan en letras mayúsculas los nucleótidos del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción AscI anejo):

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El cebador P021 se unirá a la posición 2129-2158, y el cebador P022 a la posición 5456-5483 de la secuencia V00777 de NCBI-Genbank. El fragmento de PCR de 3379 pb resultante se digiere con la enzima de restricción AscI y se liga en el vector linealizado con AscI pBSL-5'J_{\kappa }-flneo-DT4 generando pBSL-5'J_{\kappa }-flneo-3'J_{\kappa }-DT4 (Fig. 5b).

iii) Generación de un vector de selección del locus de RAG (Fig. 5c)

Como una alternativa para inactivar el potencial de célula preB para expresar inmunoglobulinas endógenas introduciendo mutaciones que actúan en cis dentro de los locus génicos de cadena IgH e Ig\kappaL, las células preB también se pueden hacer incapaces para el reordenamiento de sus genes de Ig endógenos, introduciendo mutaciones que actúan en trans. Esto se puede lograr, por ejemplo, seleccionando uno de los dos genes activantes de la recombinación (RAG) que son esenciales para los reordenamientos génicos de Ig. Las células preB murinas con eliminaciones en el gen RAG-1 o el gen RAG-2 serán incapaces de reordenar segmentos génicos de inmunoglobulina y por lo tanto serán incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas.

Como ejemplo, se describe la construcción de un vector de selección que permite la eliminación completa del ORF del gen RAG-1. Se amplifica un brazo corto de homología de secuencia de ADN de alrededor de 1 kb de secuencia genómica en dirección 5' de la región codificante de RAG-1, mediante el siguiente par de cebadores diseñados basándose en la secuencia AC084753 publicada de NCBI-Genbank:

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Se resaltan en mayúsculas los sitios de clonación de NotI anejos al extremo 5' de cada cebador, y se usan para la clonación de un fragmento de PCR de 1095 pb que contiene la región genómica en dirección 5' del marco de lectura abierta de RAG-1 (Fig. 5c). El producto de PCR se digiere con NotI y se liga en el sitio de NotI único de un vector de selección positivo-negativo, por ejemplo pBSL-flneo-DT4. Se aísla un clon plasmídico que contiene el brazo corto de homología en dirección 5' de la región codificante de RAG-1, en orientación correcta, y se diseña pBSL-5'R1-flneo-DT4.

Para la clonación del brazo largo de un constructo de selección para el gen RAG-1, se amplifica una región genómica de aproximadamente 3 kb directamente en dirección 3' de la región codificante de RAG-1 (Fig. 5c) mediante el siguiente par de cebadores, diseñados basados en la secuencia AC084753 de Genbank:

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Se añaden las secuencias de reconocimiento para la enzima de restricción AscI al extremo 5' de cada cebador, y se usan para la clonación del fragmento de PCR largo de 2954 pb que contiene el brazo largo de homología de secuencia de ADN en dirección 3' del marco de lectura abierta de RAG-1. Después de la digestión con AscI, este producto de PCR se clona en el sitio de restricción de AscI del vector pBSL-5'R1-flneo-DT4. Se aísla un clon plasmídico que contiene el brazo largo de homología en dirección 3' de la región codificante de RAG-1, en la orientación correcta, y se diseña como pBSL-5'R1-flneo-3'R1-DT4 (Fig. 5c) y se puede usar directamente para la eliminación dirigida del gen RAG-1 endógeno en células preB.

Etapa 5

Selección de los locus génicos endógenos en células preB murinas dependientes de IL7, de células estrómicas, que proliferan a largo plazo

Para la eliminación seleccionada secuencial de ambos alelos de un locus endógeno génico, se pueden aplicar dos estrategias diferentes. Una estrategia es utilizar vectores de selección con dos marcadores de selección positivos diferentes para la selección de los dos alelos diferentes. Como alternativa, otra estrategia es usar el mismo constructo de selección dos veces para la selección secuencial de ambos alelos endógenos. Sin embargo, en el caso de esta última estrategia, la selección del primer alelo ha de ser seguida por la expresión transitoria de un vector para cre recombinasa en células preB, lo que conducirá a la eliminación permanente del marcador de selección de fármaco flanqueado por el sitio loxP, de forma que se puede usar la misma selección de fármaco antibiótico para la segunda selección del otro alelo.

Como un ejemplo, se describe el procedimiento experimental para la selección secuencial de ambos alelos de un gen endógeno según la primera estrategia, es decir usando vectores de selección con dos marcadores de resistencia a antibióticos diferentes (puromicina e higromicina B).

Para seleccionar un locus génico en el primer alelo, se transfectan 20 \mug de vector de selección linealizado con un marcador de resistencia a puromicina en 10^{7} células preB resuspendidas en PBS mediante electroporación a 350 V con una capacitancia de 960 \muF usando un electroporador BioRad y una cubeta electroporadora de 0,4 cm. Las células se colocan entonces en placas en medio de crecimiento de IL7 a una densidad de 5 x 10^{4} células/pocillo en cultivos de placas de 96 pocillos revestidas con una capa subconfluente de células estrómicas ST-2 resistentes a puromicina irradiadas con 3000 rad. Se añade puromicina 30 horas después de la transfección, a una concentración final de 2 \mug/ml. Las colonias resistentes a puromicina se aíslan 7-10 días después de la transfección y se expanden en células estrómicas ST-2 recientes, resistentes a puromicina, e irradiadas, bajo selección continua con 2 \mug/ml de puromicina. Los clones de células preB resistentes a puromicina individuales se analizan para la integración seleccionada del vector de selección en un alelo mediante PCR estándar y análisis de hibridación de transferencia southern genómica. Los clones de células preB con una integración seleccionada del vector seleccionado en un alelo se transfectan nuevamente, esta vez con 20 \mug de vector de selección linealizado que contiene un marcador de resistencia a higromicina B en las mismas condiciones como se describen anteriormente. Las células preB transfectadas se colocan entonces en placas en medio de crecimiento de IL7, a una densidad de 5 x 10^{4} células/pocillo, en cultivos de placas de 96 pocillos revestidos con una placa subconfluente de células estrómicas ST-2 con resistencia doble a puromicina e higromicina B, irradiadas con 3000 rad. Los clones de células preB doblemente resistentes se seleccionan 30 horas tras la transfección mediante adición de 2 \mug/ml de puromicina y 400 \mug/ml de higromicina B. Las colonias doblemente resistentes a puromicina e higromicina B se aíslan 7-10 días después de la transfección, y se expanden en células estrómicas ST-2 doblemente resistentes a puromicina/higromicina B, irradiadas, recientes, en selección continua con 2 \mug/ml de puromicina y 400 \mug/ml de higromicina B. Los clones de células preB doblemente resistentes a puromicina/higromicina B individuales se analizan para determinar la integración seleccionada del vector de selección en el segundo alelo nuevamente mediante análisis de PCR y/o de transferencia southern genómica estándar.

Los clones de células preB doblemente resistentes a puromicina/higromicina B, con dos alelos seleccionados, se pueden transfectar entonces de forma transitoria con un vector de expresión constitutivo de cre recombinasa a fin de repetir experimentos de selección génica sobre otros locus génicos y alelos. Esto se puede realizar transfectando de forma transitoria células preB con 20 \mug de vector de expresión superenrollado de cre recombinasa mediante electroporación como se describe anteriormente. Las células transfectadas de forma transitoria se colocan entonces en placas en condiciones de dilución limitante en medio de crecimiento de IL-7 en varias placas de 96 pocillos sobre células estrómicas ST-2 subconfluentes, irradiadas con 3000 rad. Después de 7 días de cultivo, se coloca replicadamente en placas un conjunto de 48 clones sobre células estrómicas ST-2 normales para el cultivo continuo, y sobre células ST-2 resistentes individualmente a puromicina o a higromicina B bajo la selección respectiva. Previamente los clones de células preB doblemente resistentes a puromicina/higromicina B, que se hicieron sensibles a ambos antibióticos, han sufrido igualmente la eliminación mediada por cre recombinasa de ambos marcadores de resistencia flanqueados con loxP. Una vez que se ha verificado mediante análisis de transferencia southern la eliminación mediada por cre recombinasa de los dos marcadores de resistencia, los clones se pueden someter a los procedimientos de selección génica adicional para otros locus génicos endógenos y alelos.

Ejemplo 6 Construcción de constructos de expresión retrovíricos para polipéptidos inmunoglobulínicos humanos

A fin de reprogramar las células preB dependientes de IL7, de células estrómicas, murinas para la producción de inmunoglobulinas humanas, se pueden usar nuevos vectores de expresión retrovíricos que codifican polipéptidos de anticuerpos humanos. Se describen métodos para la generación de vectores retrovíricos recombinantes que permiten la expresión regulada de las proteínas de cadena IgH y L humanas, dependiendo de la etapa de diferenciación de las células B, primero como inmunoglobulinas unidas a la membrana y después como inmunoglobulinas segregadas. Se debe observar que se puede clonar cualquier tipo de proteína de unión heteróloga en estos vectores retrovíricos que permiten la expresión de cualquier tipo de proteína de unión heteróloga y humana. La descripción de la clonación de vectores de transferencia retrovíricos, para la expresión de cadenas IgH e IgL humanas descritas aquí, se debería observar por lo tanto a título de ilustración y no como exclusión. Los vectores retrovíricos recombinantes pueden acomodar hasta 7-10 kb de secuencias de ADN heterólogas, lo que requiere el diseño de constructos separados para glicoproteínas de cadena IgH y L incluyendo todos los elementos de control, potenciadores y promotores específicos de tipo celular y de etapa de diferenciación requeridos, así como señales de división de genes de Ig endógenos. Estos elementos de control son necesarios para asegurar la expresión apropiada, la deposición de membrana y la secreción de inmunoglobulinas, su maduración de afinidad, en las diversas etapas de diferenciación de las células B, así como un nivel elevado de secreción de anticuerpos heterólogos en células plasmáticas. Los constructos retrovíricos individuales para las cadenas IgH y L se pueden cotransducir en células preB con lo que los constructos se integran establemente en el genoma de las células preB infectadas. Si se usan células preB murinas que carecen del potencial para expresar inmunoglobulinas endógenas (véase la descripción anterior), entonces sólo se expresarán anticuerpos o proteínas de unión heterólogos o humanos en células de línea B con la diferenciación de las células preB transducidas de forma retrovírica.

(a) Generación de constructos retrovíricos para la expresión regulada de cadenas de IgH

Debido a que los constructos retrovíricos para las diversas proteínas de cadena IgH y L se transducirán eventualmente en células murinas, los elementos del promotor y del potenciador que controlan la expresión de Ig tendrán origen murino a fin de averiguar las interacciones óptimas con factores de transcripción murinos específicos de la línea D.

El vector de partida a partir del cual se generan los constructos de expresión retrovíricos es el vector de clonación retrovírico vacío pLIB (Clontech) (Fig. 12a). La generación de un vector de expresión retrovírico recombinante para cadenas pesadas inmunoglobulínicas humanas es un proceso de clonación de múltiples etapas que implica la clonación secuencial de los elementos del promotor y del potenciador, así como las regiones codificantes de las diversas regiones variable y constante de anticuerpos humanos en el vector de clonación retrovírico vacío pLIB. En una primera etapa, se clona mediante PCR un promotor V_{H} murino en el sitio de restricción único ClaI del sitio de clonación múltiple de pLIB. Esto se realiza mediante amplificación por PCR de un elemento promotor V_{H} de ratón a partir de ADN genómico de ratón usando los siguientes cebadores diseñados basándose en el número de acceso X71119 de la base de datos publicada de NCBI-Genbank.

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Estos cebadores amplificarán mediante PCR un fragmento promotor V_{H} de 394 pb que contendrá sitios de reconocimiento de enzimas de restricción para ClaI (ATCGAT) en sus extremos 5' y 3', debido a que se incorporan en los extremos 5' de los cebadores P027 y P028. Además de los sitios ClaI en ambos cebadores, el cebador inverso P028 contiene un sitio de restricción BamHI adicional (GGATCC, subrayado) que introduce otro sitio de restricción único en el producto de PCR (véase la Fig. 12a), que se requerirá para etapas adicionales de clonación. Después de la digestión con la enzima de restricción ClaI del fragmento PCR, el fragmento PCR del promotor V_{H} amplificado, que incluye el nuevo sitio BamHI, se liga en el vector pLIB linealizado con ClaI. Los productos de ligamiento que contienen el promotor V_{H} en la orientación deseada (opuesta a la orientación transcripcional del promotor de 5'LTR) se identifican mediante digestiones con enzima de restricción de diagnóstico y secuenciamiento de ADN, y se denominan pAB-1 (Fig. 12a).

La segunda etapa es la clonación del potenciador de la cadena pesada del intrón murino (E\muH) con sus regiones de unión a matriz flanqueantes (MAR) en el vector retrovírico pAB-1. El elemento potenciador E\muH, con sus MAR flanqueantes es necesario para la expresión eficaz de proteínas inmunoglobulínicas en células de línea B. La clonación del elemento potenciador E\muH se realiza amplificando un fragmento de PCR de 983 pb a partir de ADN genómico de ratón usando los siguientes cebadores diseñados según la secuencia J00440 publicada de NCBI-Genbank:

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Los sitios de restricción (BamHI/HindIII para p029, y NotI para P030), anejos al extremo 5' de cada cebador, se resaltan con letras mayúsculas. El producto de PCR se puede digerir entonces con enzimas de restricción BamHI y NotI, y se liga direccionalmente en el vector retrovírico linealizado con BamHI/NotI pAB1, dando como resultado el vector pAB-2. El cebador de sentido p029 contiene la secuencia para un sitio HindIII adicional (subrayado), que dará lugar a un sitio de reconocimiento de enzima de restricción único en pAB-2, requerido para las etapas posteriores de clonación.

Seguidamente, se añade un fragmento de ADN, que contiene el potenciador 3'\alpha murino, al constructo pAB-2. Se sabe que el potenciador 3'\alpha se requiere para la expresión óptima y de nivel elevado y para la secreción de anticuerpos en la etapa de diferenciación de células plasmáticas. Se sabe que el potenciador 3'\alpha contiene cuatro sitios de hipersensibilidad de ADNasaI (HS1, HS2, HS3 y HS4) que comprenden diversos sitios de unión para factores de transcripción específicos de células B tardías/células del plasma. En ensayos de genes informadores se demostró que HS1 y 2, que están localizados en un fragmento de ADN genómico de 0,6 kb, confiere al menos 80% de la actividad del potenciador 3'\alpha con poca contribución de HS3 y 4 que son altamente homólogos en secuencia de ADN.

Los cuatro componentes del potenciador 3'\alpha, HS1, 2, 3 y 4, constituyen una denominada región de control del locus (LCR) que es capaz de regular la actividad transcripcional de un locus génico dado independientemente de las secuencias de ADN flanqueantes. Por lo tanto, un vector de expresión retrovírico básico para cadenas pesadas inmunoglobulínicas debería contener al menos las regiones HS1,2 del potenciador 3'\alpha que se pueden amplificar mediante PCR a partir de ADN genómico de ratón usando cebadores diseñados según la entrada de secuencia X96607 publicada de NCBI-Genbank (en mayúsculas se resaltan las secuencias de reconocimiento para sitios de enzimas de restricción adicionales requeridos para la clonación del fragmento del PCR o de etapas de clonación posteriores):

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Además de los sitios SalI terminales 5' (GTCGAC) en cada uno de los cebadores, el cebador P031 de sentido contiene un sitio MluI adicional (subrayado), y el cebador P028 inverso contiene un sitio XhoI adicional (subrayado). Los cebadores P031 y P032 amplificarán un fragmento de PCR de 644 pb que se puede digerir con la enzima de restricción SalI y que se puede ligar en el vector linealizado con SalI pAB-2. Mediante digestión con enzima de restricción para diagnóstico y mediante secuenciación de ADN se determina un clon con el inserto en la orientación deseada (véase la Fig. 12b), y se denomina pAB-3 (Fig. 12b).

Opcionalmente, los componentes adicionales del potenciador 3'\alpha, HS3 y 4, se pueden incluir en los constructos de vectores retrovíricos para la expresión de IgH. Para ello, se puede amplificar mediante PCR un fragmento de 466 pb que comprende la región HS4 del potenciador 3'\alpha, a partir de ADN genómico de ratón como un molde usando los siguientes cebadores diseñados según la entrada de secuencia S74166 publicada de NCBI-Genbank:

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En mayúsculas se resaltan los sitios de enzimas de restricción anejas a los términos 5' de cada cebador. Además de los sitios de restricción de XhoI (CTCGAG) presentes en ambos cebadores, el cebador P034 inverso contiene un sitio de restricción SphI adicional (GCATGC, subrayado) que contiene un sitio de restricción único adicional requerido para fines posteriores de clonación. La amplificación mediante PCR con el par de cebadores P033 y P034 en ADN de ratón genómico dará como resultado un fragmento de PCR de 466 pb que se puede digerir con la enzima de restricción XhoI, y que entonces se puede ligar en el vector linealizado con XhoI pAB-3. El clon con el inserto HS4 en la orientación deseada se determina mediante digestión con enzima de restricción de diagnóstico y secuenciamiento de ADN, y se denomina como constructo vectorial pAB-4 (Fig. 12b). El fragmento del último potenciador 3'\alpha, HS3, se puede amplificar mediante PCR usando ADN genómico de ratón como molde, con los siguientes cebadores diseñados según la entrada de secuencia X96607 publicada de NCBI-Genbank (nuevamente se resaltan en mayúsculas las secuencias de reconocimiento para la enzima de restricción SphI):

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La región HS3 del potenciador 3'\alpha amplificada mediante PCR se digiere con la enzima de restricción SphI y se liga en el vector linealizado con SphI, pAB-4, a fin de generar pAB-5. Se puede usar cualquiera de los vectores pAB-3, 4 ó 5 para insertar las regiones codificantes para cadenas pesadas de inmunoglobulinas heterólogas (Fig. 12b).

Cada uno de los isotipos inmunoglobulínicos humanos se puede expresar como una inmunoglobulina de superficie unida a membrana, o como un anticuerpo segregado, que se regula mediante sucesos de corte y empalme alternativos que mantienen o eliminan los exones que se extienden sobre la membrana a partir del transcrito de ARNm. Aunque cada isotipo inmunoglobulínico tiene su propia región codificante para los exones que se extienden sobre la membrana, las regiones membranales de todos los anticuerpos IgG, IgA e IgE humanos son virtualmente idénticas para los subtipos individuales. Por lo tanto, se pueden emplear los mismos exones de membranas de IgG para el anclamiento a la membrana de anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, se usa un conjunto diferente de exones para IgA1 e IgA2, y se requieren cada uno de los diferentes exones para cada uno de los anticuerpos IgE e IgM.

Por lo tanto, la siguiente etapa en el procedimiento de clonación con respecto a la generación de constructos de expresión de Ig retrovíricos recombinantes es la inserción de las regiones que se extienden sobre la membrana para anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE humanos en cualquiera de los vectores pAB-3, 4 ó 5. Como ejemplo representativo, se describen los procedimientos de clonación posteriores para el constructo retrovírico básico pAB-3 que contiene los elementos del promotor V_{H}, el potenciador E\muH y el potenciador 3'\alphaE mínimo (HS1,2) (Fig. 12c).

La región que se extiende sobre la membrana, de cadena \muH, está codificada por dos exones, \muM1 y \muM2, localizados 1,85 kb en dirección 3' de los exones C_{\mu }H_{1}-C_{\mu }H_{4} de la región constante C_{\mu }H. Los exones \muM1 y \muM2, que incluyen el sitio de poliadenilación endógeno, están contenidos en un fragmento genómico de 773 pb que se puede amplificar a partir de ADN genómico de ratón mediante PCR usando los siguientes cebadores diseñados basándose en la secuencia contigua NT_010168 publicada de NCBI-Genbank:

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Los sitios de restricción MluI anejos al extremo 5' de cada cebador se resaltan en letras mayúsculas. El producto de PCR resultante se puede digerir con la enzima de restricción MluI, y el fragmento de 773 pb resultante se liga en el vector linealizado con MluI pAB-3. Un clon que contiene los exones \muM1 y \muM2 en orientación correcta y la secuencia de ADN según se verifica mediante cartografía de enzima de restricción y mediante secuenciación de ADN, se denomina constructo pAB-3.1 (Fig. 12c).

La deposición sobre membrana de anticuerpos IgG se puede lograr, por ejemplo, mediante los exones que se extienden sobre membrana del gen IgG_{1}. La región que se extiende sobre la membrana de IgG_{1} está codificada por dos exones localizados 1,25 kb en dirección 3' de los exones C_{\gamma 1}H que se extienden una región de 1,9 kb. A fin de acortar el intrón entre \gamma1M1 y \gamma1M2, se usa un enfoque de PCR de extensión por solapamiento (SOE), mediante el cual los dos exones se fusionan a un fragmento de PCR más pequeño. Generalmente, la fusión de los dos productos se puede lograr si el cebador inverso del producto de PCR en dirección 5' y el cebador de sentido del producto de PCR en dirección 3' muestran una complementariedad de apenas 30-40 pb. Estas regiones de complementariedad perfecta se pueden añadir como 15-20 nucleótidos a los extremos 5' del cebador inverso y los cebadores directos usados para la amplificación de los productos de PCR en dirección 5' y en dirección 3', respectivamente. Sin embargo, en el caso de la fusión de los dos exones \gamma1M1 y \gamma1M2, por coincidencia, están presentes dos secuencias completamente idénticas de 28 pb, 78 pb en dirección 3' de \gamma1M1 y 256 pb en dirección 5' del exón \gamma1M2. Estas secuencias se pueden usar para generar un fragmento de PCR más corto mediante SOE-PCR que contiene tanto el exón \gamma1M1 como \gamma1M2 para la región que se extiende sobre membrana de las cadenas \gammaH. Por lo tanto, se realizan dos PCR en paralelo sobre ADN genómico humano usando los siguientes cebadores diseñados basándose en la secuencia AL122127 publicada de NCBI-Genbank. Se amplifica un fragmento de PCR de 315 pares de bases, que contiene el exón 1 que se extiende sobre la membrana \gamma1 (\gamma1M1) a partir de ADN genómico humano usando los cebadores:

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uniéndose el cebador P039 a la posición 9710-9741, y uniéndose el cebador P040 a la posición 9435-9462 de la entrada de secuencias AL122127 de NCBI-Genbank.

Un fragmento de PCR de 555 pares de bases, que contiene el exón 2 de extensión sobre la membrana (\gamma1M2) se puede amplificar a partir de ADN genómico humano usando los cebadores:

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uniéndose el cebador P041 a la posición 8137-8164, y uniéndose el cebador P042 a la posición 7624-7654 de la entrada de secuencia AL122127 de NCBI-Genbank. Los dos productos de PCR se pueden fusionar entonces a un producto de fusión mediante PCR de 822 pb mezclando 1/100 del producto de PCR del exón \gamma1M1 con 1/100 del producto de PCR del exón \gamma1M2, y repitiendo una PCR con cebadores de sentido e inversos P039 y P042. Además de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción MluI, presentes en ambos cebadores P039 y P042 (resaltados en mayúscula), que se requieren para la clonación del producto de PCR mediante fusión por SOE, el cebador P042 contiene adicionalmente la secuencia de complementariedad de una señal de poliadenilación artificial (subrayada) que permite la terminación transcripcional correcta del transcrito inmunoglobulínico en el vector de expresión inmunoglobulínico retrovírico final. El fragmento de PCR de señal \gamma1M1\mu1M2-polyA, de 832 pb, se digiere entonces con la enzima de restricción MluI y se liga en el vector pAB-3. Un clon con la orientación correcta del inserto verificada mediante cartografía de enzima de restricción y secuenciación de ADN se denomina clon pAB-3.2 (Fig. 12c).

La clonación de la región codificante que se extiende sobre la membrana \alpha1 se puede lograr mediante PCR amplificando a partir de ADN genómico humano un fragmento que contiene el exón individual para \alpha1M que incluye su sitio polyA endógeno. Los siguientes cebadores se pueden usar para esta amplificación mediante PCR, diseñados según la entrada de secuencias M60193 publicada de NCBI-Genbank:

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Ambos cebadores contenían sitios de clonación de MluI añadidos al extremo 5' de cada cebador (resaltado en mayúsculas), y amplificará un producto de PCR de 768 pares de bases que se puede digerir con la enzima de restricción MluI que entonces se liga en pAB-3 linealizado con MluI. Un clon con la orientación correcta del inserto verificada mediante cartografía de enzima de restricción y secuenciación de ADN se denomina clon pAB-3.3.

Para la expresión de anticuerpos IgE unidos a membrana, la región que se extiende sobre la membrana para las cadenas \varepsilon_{1}H, que están codificadas por dos exones, \varepsilon_{1}M1 y \varepsilon_{1}M2, se clona mediante PCR. Para ello, se amplifica un producto de PCR de 858 pb a partir de ADN genómico humano usando los siguientes cebadores diseñados según la entrada de secuencia X63693 publicada de NCBI-Genbank:

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Ambos cebadores contienen sitios de clonación de MluI añadidos al extremo 5' de cada cebador (resaltado en letras mayúsculas) dando como resultado un producto de PCR de 858 pb que se puede digerir con la enzima de restricción MluI. Además, el cebador inverso P046 se diseña para que contenga la secuencia de complementariedad de una señal polyA artificial (subrayada) que asegura la terminación apropiada de la transcripción de ARNm en el constructo de expresión final. El fragmento de PCR digerido con MluI se liga en pAB-3 linealizado con MluI. Un clon con la orientación correcta del inserto verificada mediante cartografía de enzima de restricción y secuenciación de ADN se denomina clon pAB-3.4.

Tras la clonación de los diversos exones que se extienden sobre membrana para los isotipos IgG, IgA, IgM e IgE, se han de insertar los exones para las diversas regiones constantes humanas en constructos retrovíricos pAB-3.1 a 3.4. Para ello, los fragmentos de ADN que codifican los exones de región constante se clonan en el sitio de reconocimiento de enzima de restricción NotI único de cada uno de los constructos pAB-3.1 a 4.

En la Fig. 12d se representa la clonación de los vectores de expresión retrovíricos para todos los isotipos de cadena H inmunoglobulínicos, \gamma1, \gamma2, \gamma3 y \gamma4. Los siguientes cebadores se pueden usar para la amplificación mediante PCR de los cuatro subtipos de cadena pesada de IgG diferentes usando ADN genómico humano como molde de la PCR:

Para \gamma1 (cebadores diseñados según la secuencia AL122127 publicada de NCBI-Genbank):

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Para \gamma2 (cebadores diseñados según la secuencia J00230 publicada de NCBI-Genbank):

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Para \gamma3 (cebadores diseñados según la secuencia AL122127 publicada de NCBI-Genbank):

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Para \gamma4 (cebadores diseñados según la secuencia K01316 publicada de NCBI-Genbank):

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En cada caso, los productos de PCR de 1788 pb para \gamma_{1}H, de 1959 pb para \gamma_{2}H, de 2374 pb para \gamma_{3}H, y de 1820 pb para \gamma_{4}H, se pueden digerir con la enzima de restricción NotI, con lo que el fragmento digerido se liga en pAB-3.2 linealizado con NotI (Fig. 12d). Los constructos que contienen los insertos en la orientación correcta y sin ninguna mutación, según se determina mediante cartografía de enzima de restricción y secuenciación de ADN, se denominan pAB-3.2-G1, pAB-3.2-G2, pAB-3.2-G3 y pAB-3.2-G4, respectivamente.

Para la clonación de los exones de región constante que codifican a las cadenas \muH, \alpha1H, \alpha2H y \varepsilonH, se emplean métodos idénticos (Fig. 12e). Los siguientes cebadores se usan para la amplificación mediante PCR de los diferentes isotipos de IgH usando como molde ADN genómico humano:

Para \muH (cebadores diseñados según la secuencia AB019441 publicada de NCBI-Genbank):

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Para \alpha_{1}H y \alpha_{2}H (cebadores diseñados según las secuencias J00220 y J00221 publicada de NCBI-Genbank):

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Para \varepsilonH (cebadores diseñados según la secuencia L00022 publicada de NCBI-Genbank):

31

En cada caso, los productos de PCR de 2229 pb para \muH, de 1667 pb para \alpha_{1}H y \alpha_{2}H, y de 1908 pb para \varepsilonH, se pueden digerir con la enzima de restricción NotI y se pueden ligar en pAB-3.1, pAB-3.3 y pAB-3.4, respectivamente, linealizados con NotI (Fig. 12e). Los constructos que contienen los insertos en orientación correcta y sin ninguna mutación, según se determina mediante cartografía de enzima de restricción y secuenciación de ADN, se denominan pAB-3.1-M, pAB-3.3-A1, pAB-3.3-A2, y pAB-3.4-E, respectivamente.

Los diferentes constructos de expresión de cadena H retrovíricos, controlados por los elementos promotores y potenciadores de cadena IgH naturales, aún requieren la inserción de una región codificante de dominio variable, que se presentará después de la descripción de los métodos para la clonación de vectores de expresión de cadena IgL retrovíricos, debido a que se presentarán estrategias similares para expresar especificidades únicas o diversas para ambos constructos de expresión de cadena IgH e IgL retrovíricos completos.

(b) Generación de constructos retrovíricos para la expresión regulada de cadenas Ig\kappaL

De forma similar a los constructos diseñados para la expresión de la cadena IgH, los constructos retrovíricos diseñados para la expresión específica de etapa de diferenciación de cadenas Ig\kappaL requieren la presencia del promotor específico del locus de cadena \kappaL definido y de los elementos potenciadores. Estos incluyen un promotor V\kappa, el potenciador del intrón de cadena ligera \kappa (\kappaiE) y los elementos potenciadores \kappa3' (\kappa3'E). La clonación secuencial de estos elementos se puede lograr según lo siguiente (Fig. 13a, b).

Se amplifica mediante PCR un promotor V\kappa de ratón como un fragmento de PCR de 290 pb a partir de ADN genómico de ratón usando los siguientes cebadores (diseñados según la entrada de secuencia X52768 publicada de NCBI-Genbank):

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Los sitios de restricción añadidos al extremo 5' de cada cebador se resaltan en letras mayúsculas. Además de los sitios ClaI presentes en los extremos 5' de ambos cebadores, el cebador inverso P062 contiene un sitio de restricción BamHI adicional (GGATCC, subrayado) que introduce otro sitio de restricción único en el producto de PCR que se usará para posteriores fines de clonación. Después de la digestión con la enzima de restricción ClaI del fragmento de PCR, el promotor V_{\kappa } amplificado se liga en el vector pLIB linealizado con ClaI. Los productos de ligamiento que contienen el promotor V_{\kappa } en la orientación deseada (opuesta a la orientación transcripcional del promotor de 5'LTR) se identifican mediante cartografía de enzima de restricción de diagnóstico y secuenciación de ADN, dando lugar al constructo pAB-6 (Fig. 13a).

El \kappaiE y la región codificante para el dominio constante de cadena \kappaL están localizados en estrecha proximidad en ambos locus génicos de cadena \kappaL de seres humanos y de ratón, y el potenciador parece que funciona entre especies. Por lo tanto, se describen los procedimientos de clonación opcionales para dos vectores de expresión retrovíricos diferentes que codifican cadenas \kappaL, utilizando uno el potenciador del intrón \kappa (\kappaiE) humano, y utilizando el otro el potenciador del intrón \kappa murino. Se debe observar que ambos constructos se pueden usar de forma intercambiable. La clonación del constructo que contiene el \kappaiE humano se puede lograr amplificando un fragmento de PCR a partir de ADN genómico humano que contiene tanto el \kappaiE humano como el exón C\kappa humano que incluye un MAR localizado en 5', usando los siguientes cebadores (diseñados basándose en la entrada de secuencia AF017732 publicada de NCBI-Genbank):

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Nuevamente se resaltan en letras mayúsculas sitios de restricción adicionales añadidos al extremo 5' de cada cebador (BamHI en el cebador P063 y NotI en P064). El cebador P063 contiene la secuencia para un sitio de restricción de MluI adicional usado en etapas de clonación posteriores. Los cebadores de PCR amplifican un fragmento de 2359 pb que se puede digerir con BamHI y NotI, y que entonces se puede clonar direccionalmente en pAB-6 linealizado con BamHI-NotI generando el constructo retrovírico pAB-7 (Fig. 13a).

Para el constructo que utiliza el \kappaiE murino, se fusiona un producto de PCR, que contiene el \kappaiE murino, a un producto de PCR que contiene la región C\kappa humana mediante el enfoque de SOE-PCR descrito previamente. Para ello, se realiza primeramente en paralelo la amplificación mediante PCR del \kappaiE murino y de la región C\kappa humana, mostrando el cebador inverso de \kappaiE y el cebador directo de la región C\kappa una región de 36 pb de complementariedad. En la segunda PCR, que se usa para fusionar estos dos productos de PCR, se mezcla 1/100 de cada reacción de PCR y se amplifica con el cebador directo de \kappaiE (P065) y el cebador inverso de región C\kappa (P064), dando como resultado la fusión de los dos productos de PCR en la región de complementariedad terminal de 36 pb.

Los siguientes cebadores se pueden usar para la amplificación del \kappaiE murino (diseñado basándose en la entrada de secuencia V00777 publicada de NCBI-Genbank), usando como molde un ADN genómico de ratón:

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Los siguientes cebadores se pueden usar para la amplificación de la región C\kappa humana (diseñados basándose en la entrada de secuencia AF017732 publicada de NCBI-Genbank), usando como molde un ADN genómico humano:

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Las regiones de complementariedad terminal en los cebadores P066 y P067 están subrayadas, las cuales median la fusión de los dos productos PCR en una segunda PCR llevada a cabo con los cebadores P065 y P064 y una mezcla de los dos primeros productos de PCR como molde. El producto de PCR de fusión \kappaiE murino con C\kappa humano resultante, de 1524 pb, se puede digerir con BamHI y NotI y entonces se clona direccionalmente en el vector pAB-6 linealizado con BamHI-NotI generando el vector pAB-8 (Fig. 13a).

Seguidamente, el \kappa3'E murino se clona en dirección 3' de las regiones C\kappa humanas tanto en pAB-7 como pAB-8 generando los constructos pAB-7.1 y pAB-8.1, respectivamente. Los cebadores usados para la amplificación mediante PCR para el \kappa3'E a partir de ADN genómico de ratón son los siguientes (diseñados basándose en la entrada de secuencia X15878 publicada de NCBI-Genbank):

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Ambos cebadores contienen sitios de restricción SalI (resaltados en letras mayúsculas), de forma que el producto de PCR de 827 pb se puede clonar en los sitios de restricción de SalI compatibles de pAB-7 y pAB-8. Los clones vectoriales que tienen el inserto en la orientación correcta y con la secuencia de ADN correcta, según se determina mediante cartografía de enzima de restricción y secuenciación de ADN, se denominan pAB-7.1 y pAB-8.1 (Fig. 13a).

En una siguiente etapa de clonación, se clona un marcador de resistencia a puromicina, bajo control de un promotor constitutivo de SV40, en los constructos de expresión de cadena \kappaL retrovíricos. Se prefiere la inclusión de un casete de expresión para resistencia a puromicina, debido a que ambos constructos retrovíricos de cadena IgH e IgL necesitan ser cotransducidos establemente en células preB murinas a fin de permitir la expresión de anticuerpos heterólogos completos. A fin de aumentar la eficacia de la cotransfección retrovírica, los constructos de cadena IgL retrovíricos se transducen primeramente, y las células transducidas establemente se seleccionan para determinar la integración de los constructos de cadena IgL usando selección de puromicina. Una transducción secundaria de los vectores retrovíricos de cadena IgH dará lugar entonces a células con el potencial para la producción de anticuerpos en cada célula que se transduce con un vector retrovírico de cadena IgH.

El casete de expresión de puromicina se puede clonar a partir del vector de resistencia a puromicina pPur (Clontech) mediante SOE-PCR eliminando algunos sitios de enzimas de restricción internos indeseados y añadiendo sitios de clonación de ClaI adecuados a los extremos del fragmento de PCR amplificado.

Los cebadores usados para la PCR de fusión mediante SOE son:

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Primeramente, se realizan dos amplificaciones mediante PCR en paralelo con pares de cebadores P070/P071 y P072/P073 usando el mismo molde de pPur para las PCR. El cebador inverso P071 y el cebador directo P072 se diseñan para que contengan una región de complementariedad perfecta de 36 pb (subrayada), que permitirá la fusión de los dos productos de PCR mediante una segunda PCR usando alícuotas de los fragmentos de PCR previos en una amplificación adicional mediante PCR que usa los cebadores P070 y P073 solos. Los últimos cebadores contienen sitios de restricción de ClaI (en mayúsculas) que permiten la clonación del casete de expresión de puromicina resultante, de 1351 pb, en sitios de ClaI compatibles de pAB-7.1 y pAB-8.1. Esto genera constructos retrovíricos pAB-7.1 Pur y pAB-8.1 Pur, respectivamente (Fig. 13b), que son los constructos en los que se pueden insertar las regiones VJ_{\kappa } individuales o las librerías de región VJ_{\kappa } que codifican dominios variables únicos o diversos de cadenas \kappaL, respectivamente. El procedimiento para la clonación de los exones de región variable se presentará a continuación junto con la clonación de las regiones variables de cadena H y de cadena \lambdaL, también después de que se haya descrito la clonación de los vectores de expresión retrovíricos para cadenas \lambdaL heterólogas humanas.

(c) Generación de constructos retrovíricos para la expresión regulada de cadenas Ig\lambdaL

En algunos casos es deseable producir anticuerpos heterólogos que contienen cadenas \lambdaL en lugar de cadenas \kappaL. Aunque puede ser suficiente sustituir la región codificante C\kappa humana en los constructos retrovíricos pAB-7.1Pur y pAB-8.1Pur con cualquiera de las regiones codificantes C\lambda humanas, sólo se logrará un patrón perfecto de expresión de cadena \lambdaL endógena controlando la expresión de las cadenas \lambdaL mediante los elementos del promotor específico del locus génico de cadena \lambdaL y del potenciador. Esto es particularmente cierto en el sistema murino, en el que el reordenamiento y la expresión de genes de cadena \kappaL precede al reordenamiento y a la expresión de las cadenas \lambdaL durante la diferenciación de células B.

Los elementos potenciadores específicos del locus génico de cadena \lambdaL murina son el potenciador \lambda2-4 y el potenciador \lambda3-1, que están localizados próximos a los exones de región constante C\lambda2, C\lambda4, y C\lambda1, C\lambda3, y regulan la expresión de los isotipos de cadena ligera \lambda2, \lambda4, y \lambda1, \lambda3, respectivamente.

Como en el caso de los constructos de expresión retrovíricos de cadena kL (véase anteriormente), los vectores de expresión retrovíricos de cadena \lambdaL se diseñan para que contengan un casete de expresión génico de resistencia a puromicina. Por lo tanto, en la primera etapa de clonación, se fusiona un casete de expresión de puromicina controlado por el promotor SV40 a un promotor V\lambda mediante SOE-PCR usando como moldes, para la amplificación mediante PCR, ADN genómico de ratón y pAB-7.1Pur, respectivamente. Los cebadores para las dos reacciones paralelas mediante SOE-PCR son los siguientes (con los cebadores P076 y P077 específicos del promotor V\lambda diseñados basándose en la entrada de secuencias publicadas de base de datos NCBI-Genbank J00591):

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Al igual que para las PCR de fusión mediante SOE descritas anteriormente, las primeras dos amplificaciones mediante PCR se realizan en paralelo, es decir el casete de expresión de puromicina con los cebadores P074 y P075 en pAB-7.1Pur como molde, y el promotor V\lambda con los cebadores P076 y P077 en ADN genómico de ratón como molde. Entonces cada alícuota de volumen 1/100 de las primeras PCR paralelas se mezclan y se amplifican nuevamente con los cebadores P074 y P077. El casete de expresión de puromicina se fusiona de ese modo al extremo 5' del promotor V\lambda debido a la complementariedad perfecta diseñada de 36 pb en el cebador inverso P075 y el cebador de sentido P076 (subrayado) que se usa para la primera ronda de PCR en paralelo.

Ambos cebadores P074 y P077 contienen sitios de restricción de ClaI que se pueden usar para clonar el producto de fusión mediante PCR en pLIB linealizado con ClaI. También se incorpora en el cebador inverso P077 un sitio de restricción MluI adicional (subrayado) dando lugar a un sitio MluI único adicional 3' del promotor V\lambda requerido para las siguientes etapas de clonación. Un clon vectorial con el fragmento de PCR de fusión de puromicina-promotor V\lambda insertado en pLIB en la orientación correcta, y con la secuencia correcta de ADN, según se verifica mediante cartografía de enzima de restricción y secuenciación de ADN, se denomina vector pAB-9 (Fig. 14a).

A continuación, se amplifican mediante PCR los dos elementos potenciadores murinos \lambda2-4E y \lambda3-1E a partir de ADN genómico de ratón, seguido nuevamente de la fusión de ambas secuencias mediante SOE-PCR. Se pueden usar los siguientes cebadores (basándose en las entradas de secuencias publicadas de NCBI-Genbank X54550 y X54608, respectivamente):

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Al igual que en el enfoque previo, primero se amplifican dos fragmentos de PCR en paralelo con el par de cebadores P078/P079 y P080/P081 usando como molde ADN genómico de ratón, y, en una segunda ronda de PCR, se usan alícuotas de estos productos de PCR como un molde y se fusionan mediante amplificación por PCR con los cebadores P078 y P081 debido a la complementariedad de 36 pb de los cebadores P079 y P080 (subrayada).

El producto de fusión de PCR de 1513 pb resultante se puede digerir con las enzimas de restricción NotI y EcoRI (incorporándose los respectivos sitios de reconocimiento en los cebadores P078 y P081; resaltados en letras mayúsculas), y se clona direccionalmente en pAB-9 linealizado con NotI/EcoRI. Un clon vectorial con la secuencia de ADN correcta, según se verifica mediante cartografía de enzima de restricción y secuenciación de ADN, se denomina vector pAB-10 (Fig 14a). Las regiones de complementariedad en cebadores P079 y P080 se diseñan para que contengan un sitio XhoI único adicional (resaltado en letras mayúsculas), a fin de permitir la eliminación separada de cada uno de los elementos potenciadores, si así se desea.

En una siguiente etapa, cualquiera de las regiones C\lambda humanas se clona en el constructo retrovírico pAB-10 usando los siguientes cebadores (diseñados basándose en las secuencias D870223 y D87017 publicadas de NCBI-Genbank):

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Estos cebadores son capaces de amplificar cualquiera de las regiones C\lambda humanas funcionales como fragmentos de PCR de 1094 pb si se usa como molde un ADN genómico humano. Los cebadores P082 y P083 contienen sitios de restricción para ClaI y NotI, respectivamente, permitiendo la digestión doble con ClaI-NotI de los fragmentos de PCR y su ligamiento direccional en pAB-10 a fin de generar (dependiendo de la región C\lambda amplificada) pAB-11-\lambda1, pAB-11-\lambda2, pAB-11-\lambda3, o pAB-11-\lambda7 (Fig. 14b).

Para la generación de un vector de expresión retrovírico de cadena Ig\lambdaL completa, se ha de clonar un exón de región variable reordenado V\lambdaJ\lambda en los sitios únicos MluI e HindIII de los diversos constructos pAB-11, que se describe en la siguiente sección, junto con la generación de vectores de expresión retrovíricos de cadena IgH e Ig\kappaL completa.

Ejemplo 7 Clonación de exones de región variable V_{H}DJ_{H} o V_{L}J_{L} en constructos de expresión de cadena IgH y L retrovíricos

Los constructos de expresión retrovíricos para las diferentes cadenas IgH e IgL humanas descritos hasta ahora contienen todas las regiones codificantes y los elementos de control para la expresión de anticuerpos humanos, con la excepción de las regiones codificantes para los dominios variables. Por ejemplo se pueden clonar diversos repertorios (librerías) de exones que codifican dominios de región variable a partir de ADN genómico de linfocitos de sangre periférica humana que contienen linfocitos B con diversos reordenamientos de ADN V_{H}DJ_{H} y V_{L}J_{L}. Estas regiones codificantes para los dominios variables necesitan contener un exón líder común, localizado 5' de cada exón reordenado V_{H}DJ_{H} y V_{L}J_{L} (Fig. 15), que se requiere para el transporte apropiado de cadenas IgH e IgL a través del retículo endoplasmático, la estructura trans de golgi y eventualmente a la superficie celular. Se han descrito cebadores degenerados que se unen a la mayoría de las secuencias líderes de las secuencias líder de región variable IgH, Ig\kappaL e Ig\lambdaL humanas, y se usan en combinación con cebadores degenerados que amplifican los diversos segmentos génicos J_{H} y J_{L} humanos para la clonación de las regiones codificantes variables V_{H}DJ_{H} o V_{L}J_{L}. Los sitios de reconocimiento para enzimas de restricción usadas para la clonación direccional del los productos de PCR (véase la Fig. 15) están añadidos al extremo 5' de los cebadores degenerados, y se resaltan en mayúsculas. Se indican en paréntesis las posiciones en los cebadores degenerados, que pueden contener más de un solo nucleótido.

Los cebadores directos para la amplificación mediante PCR de dominios de variable de la cadena pesada de Ig humana, que incluye las secuencias líderes a partir de ADN genómico humano de linfocitos B periféricos, son los siguientes:

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Un cebador directo para la amplificación de dominios de variable de cadena ligera Ig\kappa humana, que incluye una secuencia líder a partir de ADN genómico humano de linfocitos B periféricos, es el siguiente:

42

Un cebador directo para la amplificación de dominios de variable de cadena ligera Ig\lambda humana, que incluye una secuencia líder a partir de ADN genómico humano de linfocitos B periféricos, es el siguiente:

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Obsérvese que en lugar de un sitio de reconocimiento de enzima de restricción BamHI añadido al extremo 5' de los cebadores P084-P087 con fines de clonación, se puede usar un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BglII (compárese con la Fig. 15), debido a que BglII genera las mismas proyecciones compatibles, como BamHI. En el caso de la clonación de regiones V\lambdaJ\lambda, el cebador directo P088 contiene un sitio MluI, debido a que el constructo retrovírico que acepta el fragmento ya contiene sitios de restricción internos de BamHI. Como alternativa, se puede usar un cebador similar a P088 que contiene un sitio AscI que produce las mismas proyecciones CGCG como la enzima de restricción MluI.

Los cebadores inversos para la amplificación de todos los seis segmentos génicos de cadena J de IgH humana son los siguientes. Los sitios de HindIII, resaltados en mayúsculas, se añaden a los extremos 5' de los cebadores que incluyen algunos nucleótidos flanqueantes con fines de clonación.

Un cebador inverso para la amplificación mediante PCR de exones de región variable que contienen los segmentos génicos J_{H}1, J_{H}4, y J_{H}5, usando ADN genómico, a partir de linfocitos B humanos, es el siguiente:

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Un cebador inverso degenerado, para la amplificación de exones de región variable que contienen segmentos génicos J_{H}2, J_{H}3, y J_{H}6, usando ADN genómico, procedente de linfocitos B humanos, es el siguiente:

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Un cebador degenerado inverso para la amplificación de exones de región variable \kappa que contienen los segmentos génicos J\kappa1-4 humanos usando ADN genómico a partir de linfocitos B humanos es el siguiente:

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Un cebador inverso para la amplificación de exones de región variable \kappa que contienen el segmento génico J\kappa5 humano usando ADN genómico a partir de linfocitos B humanos es el siguiente:

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Un cebador degenerado inverso para la amplificación mediante PCR de exones Ig\lambdaL de región variable que contienen los segmentos génicos J\lambda1-3 usando ADN genómico a partir de linfocitos B humanos es el siguiente:

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Un cebador inverso para la amplificación mediante PCR de exones Ig\lambdaL de región variable que contienen J\lambda7 usando ADN genómico a partir de linfocitos B humanos es el siguiente:

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Para la amplificación mediante PCR y clonación de los exones de dominio variable que contienen segmentos génicos reordenados V_{H}DJ_{H} y V_{L}J_{L} con los cebadores descritos anteriormente P084-P094, se usan cantidades equimolares de cebadores, si se indica más de un cebador directo o inverso para una región variable particular. En el caso de la clonación de regiones variables para cadenas H y \kappaL, los fragmentos de PCR se digieren con BamHI y HindIII, y se clonan direccionalmente en vectores doblemente digeridos con BamHI/HindIII para la expresión de la cadena IgH e Ig\kappaL. En el caso de la clonación de regiones variables para cadenas \lambdaL, los fragmentos de PCR se digieren con MluI y HindIII, y se clonan direccionalmente en los vectores doblemente digeridos con MluI/HindIII para la expresión de la cadena Ig\lambdaL.

Ejemplo 8 Transducción secuencial de vectores de expresión retrovíricos para cadenas IgH y L heterólogas en células preB murinas genéticamente modificadas

En el Ejemplo 3 se ha descrito con detalle la transducción retrovírica de células preB murinas dependientes de células estrómicas y de IL7. Para la transducción secuencial de constructos de expresión retrovíricos que codifican cadenas IgH e IgL, se usan protocolos idénticos para la transfección de células de empaquetamiento ecotrópicas y las condiciones para infectar retrovirus recombinantes en células preB. La única diferencia es que se transducen secuencialmente dos constructos de expresión retrovíricos mediante el protocolo esquematizado a continuación.

Las células preB dependientes de células estrómicas y de IL7 se infectan primeramente con el sobrenadante procedente de células de empaquetamiento GPE que se han transfectado transitoriamente con el constructo retrovírico que codifica cadenas IgL heterólogas. Como se describe anteriormente, los vectores de expresión de cadena IgL contienen adicionalmente un marcador de resistencia a puromicina. Por lo tanto, se pueden seleccionar células establemente transducidas mediante la adición de 2 \mug/ml de puromicina al medio de cultivo de tejido 24 horas después de la transducción. Las células transducidas se cultivan y se expanden durante un período adicional de 48 horas en medio que contiene puromicina. Las células preB no transducidas serán eliminadas debido a la selección por puromicina, y se obtendrá una población transducida de cadena IgL del 100% de células preB después de 48 horas de cultivo.

En este punto, las células se incuban con el sobrenadante de la estirpe celular de empaquetamiento ecotrópica GPE que se ha transfectado transitoriamente con vectores retrovíricos que codifican cadenas IgH heterólogas. Estas células se mantienen entonces en cultivos durante un período adicional de 24 horas con lo que detienen la proliferación debido a la expresión de cadenas pesadas de inmunoglobulinas heterólogas. Las células se cosechan entonces y se pueden usar para el transplante de ratones inmunodeficientes, en los que estas células pueden reconstituir compartimientos de línea B, y en los que son capaces de participar en una respuesta inmunitaria dando lugar a células secretoras de anticuerpos heterólogos.

Ejemplo 9 Transplante de células precursoras B murinas, que proliferan a largo plazo, en ratones, para la producción de anticuerpos heterólogos

Las células preB dependientes de células estrómicas y de IL7, que expresan cadenas IgH y L heterólogas a partir de vectores de expresión retrovíricos transducidos de forma estable se inyectan intravenosamente en ratones JHT carentes de células B, o junto con células auxiliares T de CD4^{+} en ratones deficientes de CB17 SCID, RAG-1 o RAG-2, de forma que las células transplantadas pueden acumular respuestas inmunitarias dependientes o independientes de células T con la estimulación antigénica de los ratones transplantados.

Para ello, se irradian subletalmente a ratones de 1,5 a 3 meses con irradiación \gamma de 300-600 rad, y 4-6 horas después de la irradiación los ratones son inyectados intravenosamente con 5 x 10^{6} a 10^{7} células preB resuspendidas en PBS. En caso de transplante adicional de células auxiliares T CD4^{+}, las células CD4^{+} se aíslan de nódulos linfáticos cervicales, axilares, mesentéricos e inguinales reunidos de ratones singénicos mediante agotamiento de células B y células T CD8^{+} mediante uso de Dynaperlas revestidas con anticuerpo Ig antirratón de oveja (Milan Analytica AG, La Roche, Suiza). Se coinyectan 10^{6} de estas células auxiliares T CD4^{+} rutinariamente de pureza mayor de 90% con células preB. Se deja que las poblaciones celulares reconstituyan los compartimientos de células B y T de los hospedantes transplantados, durante 6 semanas después del transplante.

Ejemplo 10 Inmunización de ratones a los que se les injerta células preB

Las inmunizaciones de ratones inmunodeficientes transplantados y reconstituidos con células HupreB y células auxiliares T se realizan esencialmente como se describe en Harlow y Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 150-173, 1988. En resumen, se disuelven 10-50 \mug de antígeno en 250 \mul de PBS y se mezclan vigorosamente con 250 \mul de adyuvante de Freund completo, y la mezcla de antígeno con adyuvante se inyecta intraperitonealmente. Después de dos semanas, a los ratones se les reinyecta intraperitonealmente con 5-20 \mug de antígeno, esta vez mezclado con adyuvante de Freund incompleto. Después de 10 días de la primera inyección recordatoria, los ratones se analizan para buscar anticuerpos heterólogos en el suero específicos de antígenos. Los que mejor responden se les reinyecta nuevamente cuatro semanas después con 5-20 \mug de antígeno en adyuvante de Freund incompleto, tanto intraperitoneal como intravenosamente. 3 días más tarde, se aíslan las células del bazo a partir de los ratones y se usan para la generación de células de hibridoma que segregan anticuerpos monoclonales específicos de antígenos homólogos.

Ejemplo 11 Estimulación in vitro de células HupreB para la diferenciación en células de plasma que segregan anticuerpos

Las células HupreB dependientes de células estrómicas y de IL7 también se pueden diferenciar en células que segregan anticuerpos completamente en cultivo de tejido in vitro. Para ello, primero se diferencian cultivos de células HupreB que proliferan de forma continua en células B positivas inmunoglobulínicas de superficie mediante la retirada de IL7 del medio de cultivo de tejido, y el cultivo continuado en células estrómicas irradiadas durante dos a tres días. La ausencia de factores de crecimiento en el medio da como resultado la detención de la proliferación y la inducción de la diferenciación lo que se acompaña por la inducción de apoptosis, excepto que se exprese un gen antiapoptótico, como bcl-2, en las células que se diferencian.

Las células diferenciadas se cosechan entonces y se vuelven a colocar en placas sobre células estrómicas irradiadas recientes, por ejemplo en presencia de 100 U/ml de rIL4 y 20 \mug/ml de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 agonista. En 5-6 días de cultivo, las células se diferencian en células proliferantes grandes de fenotipo celular plasmático, que son capaces de segregar grandes cantidades de anticuerpos a partir de los locus génicos de Ig heterólogos, y que se pueden usar para la generación de clones de células de hibridoma que segregan anticuerpos monoclonales heterólogos.

Ejemplo 12 Fusión de células de mieloma con células plasmáticas derivadas de células HupreB para la generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos

Para la inmortalización de células plasmáticas derivadas de células HupreB, bien con la diferenciación in vitro (Ejemplo 11), o después de la inmunización de ratones transplantados (Ejemplo 10), es necesario que las células plasmáticas se fusionen con una estirpe celular de mieloma inmortal. Las estirpes celulares de mielomas se usan para la fusión celular que carece de la expresión del gen HGPRT, implicado en la ruta de rescate de biosíntesis nucleotídica. Aunque estas células crecen indefinidamente en medio de cultivo de tejido regular, morirán si la síntesis nucleotídica de novo se bloquea por adición de, por ejemplo, el fármaco aminopterina al medio de cultivo de tejido. Por el contrario, las células que expresan el gen HGPRT pueden sobrevivir un bloque de síntesis nucleotídica de novo mediante aminopterina, especialmente si se suplementan timidina e hipoxantina adicionales, debido a que el producto génico HGPRT puede utilizar estas sustancias para la síntesis de nucleótidos de pirimidina y de purina, respectivamente. De este modo, en medio de selección HAT (que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina), sólo esas células sobreviven y proliferan, que resultan de una fusión de la célula plasmática que segrega anticuerpos mortales pero HGPRT^{+}, y la inmortal pero HGPRT, y por lo tanto célula mieloma sensible a aminopterina. Estas células se denominan células hibridomas y, si se subclonan, segregarán un anticuerpo monoclonal de la especificidad codificada por la pareja de fusión de la célula plasmática.

Para la generación de células hibridomas, se usan células plasmáticas procedentes del hígado de ratones inmunizados transplantados con células HupreB, o células plasmáticas generadas in vitro mediante estimulación anti-CD40 e IL4. En cada caso, se genera una suspensión celular homogénea y se lava dos veces con medio IMDM sin ningún suplemento, mediante etapas repetidas de centrifugación (500 g, 5 minutos) y de resuspensión. Se combinan, se mezclan y se centrifugan nuevamente a 500 g durante 5 minutos 5 x 10^{6} células de mieloma (Sp2/0 Köler y Milstein, Eur. J. Immunol., 6, p. 511-519, 1976; o X63Ag8.653 Kearney et al., J. Immunol., 123, p. 1548-1550, 1979) y 5 x 10^{7} células de bazo (o 5 x 10^{7} células de plasma diferenciadas in vitro). Se añade lentamente al pelete celular 1 ml de una dilución 1:500 de polietilenglicol (PEG) al 50% en medio IMDM, mientras las células se resuspenden mediante golpecitos suaves. Después de 2 minutos de incubación, se añaden lentamente 10 ml de medio DMEM sin suplementos, y las células se centrifugan eventualmente a 500 g durante 5 minutos. Después de la eliminación del sobrenadante, el pelete celular se resuspende en 1 litro de medio de cultivo de crecimiento de células estrómicas basado en IMDM (descrito en el ejemplo 1), que contiene 100 U/ml de IL6 recombinante y 1x de suplemento HAT concentrado. Las células se distribuyen en 50 placas de cultivo de tejido de 96 pocillos, y se incuban a 37ºC hasta que se pueden identificar los clones de hibridoma individuales y se pueden aislar para la expansión y caracterización posterior en cultivo de tejido.

Claims

1. Un método para la generación de linfocitos de vertebrados que se pueden usar para la producción de cualquier proteína de unión o de un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, con la capacidad de unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno compuesto de dominios variables y regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a la membrana, cualquier proteína de unión artificial que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales, no derivables de receptores de antígenos o inmunoglobulinas heterólogas codificadas por la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, que comprende las etapas de:

(a): modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, que

(i): derivan de órganos linfoides primarios, y

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de inmortalizar los linfocitos diferenciados:

(a): fusionando los mismos a células de mieloma para la generación de células de hibridoma;

(b): infectando a los mismos con virus transformantes; o

(c): transfectando a los mismos con un constructo vectorial apropiado que asegure la expresión de al menos un oncogén transformante;

3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que los linfocitos precursores de vertebrados son capaces de expresar al menos un componente de la maquinaria de recombinación V(D)J linfoide y de originarse a partir de vertebrados con mandíbulas que comprenden peces cartilaginosos, peces óseos, anfibios, reptiles, pájaros, mamíferos que incluyen a cerdos, ovejas, vacuno, caballos y roedores que incluyen a ratones, ratas, conejos y cobayas, siendo preferidos los linfocitos (pre)B precursores murinos procedentes de ratones.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichos linfocitos precursores de vertebrados están desprovistos de su potencial para expresar anticuerpos y/o receptores de antígenos endógenos o un fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, lo que se logra mediante aislamiento/selección de linfocitos precursores de vertebrados que son deficientes a la hora de expresar inmunoglobulinas endógenas o fragmentos de las mismas, y/o introduciendo en dichos linfocitos precursores de vertebrados al menos un constructo vectorial diseñado para inactivar funcionalmente al menos un alelo de al menos un elemento genético, que se selecciona del grupo que consta de:

(a): las regiones codificantes del locus génico de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, incluyendo todos o parte de los segmentos génicos V, D y J, y cualquiera de las regiones codificantes de los exones de la región constante de las cadenas pesadas \mu, \delta, \gamma, \varepsilon y \alpha, con o sin sus exones que se extienden sobre la membrana;

(d): los elementos potenciadores del locus génico de la cadena pesada de las inmunoglobulinas que actúan en cis, incluyendo el potenciador del intrón de la cadena pesada y el potenciador 3'\alpha;

(e): los elementos potenciadores del locus génico de la cadena ligera de las inmunoglobulinas que actúan en cis, incluyendo el potenciador del intrón de la cadena ligera \kappa (\kappaiE), el potenciador 3'\kappa, y los potenciadores \lambda2-4 y \lambda3-1;

5. El método según la reivindicación 4, en el que dichos constructos vectoriales incluyen vectores de selección génica que comprenden regiones de homología de secuencia de ADN con dicho al menos un elemento genético que permite la recombinación homóloga, que flanquea preferiblemente un marcador de selección positiva que permite la selección de transfectantes positivos.

6. El método según la reivindicación 5, en el que dichos vectores de selección génica comprenden adicionalmente un par de secuencias de reconocimiento del ADN para enzimas de recombinación de ADN específicas de sitio, que flanquean al marcador de selección positiva, que permite la eliminación de dicho marcador de selección positiva con la transfección y la expresión transitoria de secuencias de ácido nucleico que codifica al menos una de las enzimas estrechamente relacionadas con las recombinasas.

7. El método según la reivindicación 5 ó 6, en el que dichos vectores plasmídicos de selección génica comprenden adicionalmente un marcador de selección negativa que permite la selección frente a transfectantes, en los que dichos vectores de selección génica se integran al azar en el genoma mediante recombinación no homóloga.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho al menos un elemento genético exógeno, que codifica una proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, es transportado sobre un constructo genético seleccionado del grupo que consta de:

(a): constructos de ADN retrovíricos recombinantes que comprenden secuencias promotoras, potenciadoras y de ácidos nucleicos codificantes ligadas operablemente para permitir la expresión de al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos, o que es artificial;

(b): constructos de ADN recombinantes a base de plásmidos que comprenden secuencias promotoras, potenciadoras y de ácidos nucleicos codificantes ligadas operablemente para permitir la expresión de al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos, o que es artificial;

(c): locus génicos de receptor de células T o de miniinmunoglobulinas recombinantes a base de plásmidos con segmentos génicos no reordenados V, D y J ligados operablemente para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de células T heterólogo, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;

(d): cromosomas artificiales bacterianos, de levaduras o de vertebrados que comprenden todos o parte de los locus génicos de inmunoglobulinas o de receptores de célula T en la configuración de línea germinal ligados operablemente para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de célula T heterólogo, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;

(e): cromosomas artificiales bacterianos, de levaduras o de vertebrados que comprenden todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos o receptores de célula T heterólogos en un ordenamiento modificado diseñado para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de célula T heterólogo, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;

(f): elementos transcromosómicos que son fragmentos de cromosomas heterólogos que tienen todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos o de receptores de células T en la configuración de línea germinal que permiten la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de célula T heterólogo, que es de tipo salvaje con respecto a la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el al menos un elemento genético exógeno codifica un anticuerpo humano nativo o modificado, una proteína de unión humana, un receptor de antígeno humano, o un fragmento o fragmentos funcionales de los mismos.

\newpage

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el al menos un elemento genético exógeno codifica un receptor heterólogo o artificial capaz de sufrir maduración de afinidad de la región de unión.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la diferenciación de linfocitos B precursores de vertebrados se efectúa in vitro:

(a): deteniendo la proliferación de dichos linfocitos precursores de vertebrados e induciendo la diferenciación en células de línea linfocítica madura cultivando en ausencia de cualquier factor de crecimiento de linfocitos precursores; e

(ii): factores que activan los receptores coestimuladores de células B, que comprenden anticuerpos agonistas o ligandos recombinantes activos para CD40, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), receptores de complemento 1 (CD35) y 2 (CD21), LFA-1 (CD11a), LFA-3 (CD58), CD19, CD20, CD30, CD32, CD37, CD38, CD70, CD71, Ig\alpha (CD79\alpha), Ig\beta (CD79\beta), TAPA-1 (CD81), Fas (CD95), receptor 1 del TNF (p55, CD120a), receptor 2 del TNF (p75, CD120b), Ox-40 (CD134), y receptor de linfotoxina \beta; y

(iii): factores mitógenos de células B, de antígenos de tipo 1 independientes de células T, y otros activadores policlonales, incluyendo lipopolisacárido (LPS), lipoproteínas procedentes de bacterias gram negativas, polianiones, poli-dldC, mitógeno de fitolaca (PWM), y reactivos antiinmunoglobulínicos;

y combinaciones de los mismos.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha diferenciación in vivo se efectúa con el transplante de dichos linfocitos precursores genéticamente modificados en hospedantes de vertebrados apropiados.

13. El método según la reivindicación 12, en el que dichos linfocitos se cotransplantan en dicho hospedante con linfocitos auxiliares T cebados con antígenos o naturales.

14. El método según la reivindicación 12 ó 13, en el que dicha diferenciación in vivo es seguida de la inmunización de dicho hospedante con al menos un compuesto o composición inmunógena deseada.

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicho hospedante vertebrado es un hospedante compatible que es deficiente con respecto a la generación de células B endógenas, células T y/o células NK (asesinas naturales), o una combinación de los mismos.

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que el hospedante vertebrado se selecciona de vertebrados mandibulares que comprenden pez cartilaginoso, pez óseo, anfibios, reptiles, pájaros, y mamíferos que incluyen cerdos, oveja, vacuno, caballos y roedores que incluyen a ratones, ratas, conejos y cobayas, siendo la especie hospedante preferida los ratones.

17. Método para la producción de cualquier proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma con la capacidad de unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno compuesto de dominios variables y regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial que desarrolle funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores antigénicos heterólogos codificados por la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, de una manera conocida per se, que implica las etapas de:

(a): modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, que

(i): derivan de órganos linfoides primarios, y

(i): derivan de órganos linfoides primarios,

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(b): efectuar la diferenciación de dichos linfocitos precursores genéticamente modificados en células de línea linfoide madura ya sea in vitro o in vivo, generando de ese modo linfocitos de vertebrados genéticamente modificados y diferenciados capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento funcional de la misma; o, como alternativa, usar dichos linfocitos de vertebrados genéticamente modificados y diferenciados capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento funcional de la misma;

18. El método según la reivindicación 1 ó 17, en el que la etapa (b) es seguida de las etapas de:

19. El método según la reivindicación 17 ó 18, en el que dicha proteína de unión, o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, muestra una especificidad única y por lo tanto es monoclonal.

20. El método según la reivindicación 17 ó 18, en el que dicha proteína de unión, o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, muestra más de una única especificidad y por lo tanto es policlonal.

21. El método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que dicha proteína de unión o fragmento o fragmentos funcionales de la misma comparten completa o parcialmente características estructurales y/o funcionales de un anticuerpo, receptor de antígeno, o proteína de unión humanos, puesto que se puede ensamblar en la base del repertorio genético humano o partes del mismo.

22. El método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que la proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma a producir se selecciona del grupo que consta de:

(a): anticuerpos que o bien están unidos a la membrana o bien se segregan, y que constan tanto de polipéptidos heterólogos de la cadena pesada como de cadena ligera en la composición estequiométrica encontrada en anticuerpos naturales y que constan de cualquiera de los isotipos conocidos de la cadena pesada (\mu, \delta, \gamma, \alpha, \varepsilon) y/o de cadena ligera (\kappa y \lambda);

(b): anticuerpos con combinaciones de polipéptidos de la cadena pesada y de cadena ligera que son completamente humanos con respecto a la secuencia de aminoácidos primaria;

(c): anticuerpos híbridos que contienen polipéptidos heterólogos de la cadena pesada o de cadena ligera procedentes de diferentes especies de vertebrados;

y fragmentos funcionales de los mismos.

23. Linfocitos precursores genéticamente modificados, que

24. Células de línea linfoide madura, que

25. Células inmortalizadas derivadas de células de línea linfoide madura, que