ES2231382T3 - Metodo para la generacion de linfocitos precursores de vertebrados geneticamente modificados, y uso de los mismos para la produccion de proteinas de union heterologas. - Google Patents
Metodo para la generacion de linfocitos precursores de vertebrados geneticamente modificados, y uso de los mismos para la produccion de proteinas de union heterologas.Info
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Abstract
Un método para la generación de linfocitos de vertebrados que se pueden usar para la producción de cualquier proteína de unión o de un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, con la capacidad de unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno compuesto de dominios variables y regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a la membrana, cualquier proteína de unión artificial que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales, no derivables de receptores de antígenos o inmunoglobulinas heterólogas codificadas por la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, que comprende las etapas de: (a) modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, que (i) derivan de órganos linfoides primarios, y (ii) tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura,mediante la introducción de al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, y (b) efectuar la diferenciación de dichos linfocitos precursores genéticamente modificados en células de línea linfoide madura tanto in vitro como in vivo, generando de ese modo linfocitos capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, con la condición de que se excluya la producción in vivo en seres humanos.
Description
Método para la generación de linfocitos
precursores de vertebrados genéticamente modificados, y uso de los
mismos para la producción de proteínas de unión heterólogas.
La presente invención se refiere generalmente a
los campos de la ingeniería genética y de la producción de
anticuerpos. En particular, se refiere a la generación de linfocitos
precursores de vertebrados genéticamente modificados que tienen el
potencial para diferenciarse en más células de estirpe linfoide
maduras, y al uso de los mismos para la producción de cualquier
anticuerpo o proteína de unión heteróloga.
Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales
son reactivos eficaces tanto para el diagnóstico, la prevención como
la terapia de enfermedades (Glennie y Johnson, Immunol.
Today, 21, p. 403-410, 2000). Esto es
debido a su capacidad única para unirse muy específicamente a
epítopos particulares sobre moléculas diana (antígenos) vía sus
dominios variables y, al mismo tiempo, para mediar funciones
efectoras vía sus dominios de región constante (Frazer y Capra,
Fundamental Immunology, W.E. Paul (Ed.), Cuarta
Edición, p. 37-74, 1999) (Fig. 1). Esto permite
a los anticuerpos monoclonales identificar específicamente antígenos
únicos en mezclas complejas de macromoléculas, y dirigir funciones
efectoras hacia esas dianas.
Los anticuerpos (o inmunoglobulinas) constan de
dos glicoproteínas de cadena pesada (H) y de cadena ligera (L)
idénticas que están enlazadas vía enlaces de disulfuro (Fig. 1).
Cada una de las cadenas H y L comprende un dominio variable
N-terminal que varía entre diferentes anticuerpos, y
una región constante C-terminal que es idéntica en
diferentes anticuerpos que pertenecen al mismo isotipo de
inmunoglobulinas (Fig. 1). La combinación de los dominios variables
de la cadena H y de la cadena L genera la cavidad de unión del
anticuerpo al antígeno y determina su especificidad (o idiotipo),
mientras que las regiones constantes determinan su isotipo (Frazer y
Capra, s.a.). La variabilidad de las inmunoglobulinas resulta del
hecho de que los dominios V_{H} y V_{L} están codificados por
una multitud de segmentos génicos, que se denominan segmentos
génicos V (variable), D (diversidad; sólo presente en el locus de
cadena H), y J (unión) (Tonegawa, Nature, 302, p.
575-581, 1983) (Fig. 1). Durante la diferenciación
de los linfocitos B uno de los segmentos génicos V, D y J se
selecciona al azar en cada célula para el proceso de recombinación
específico del sitio de la recombinación V(D)J, que
ensambla los segmentos génicos, de forma que se generan nuevas
regiones codificantes para los dominios V_{H} o V_{L} (Grawunder
et al., Curr. Opin. Immunol., 10, p.
172-180, 1998). Debido a la multitud de segmentos
génicos V, D y J, y debido a la imprecisión en la unión de los
segmentos génicos, se puede generar un repertorio enorme de
diferentes especificidades de región V por los millones de
linfocitos B producidos por el sistema inmunitario cada día
(Melchers et al., Curr. Opin. Immunol., 7, p.
214-227, 1995).
Durante la evolución, se ha producido una ligera
divergencia de los genes de inmunoglobulinas entre especies
diferentes, de forma que las regiones constantes de los anticuerpos
difieren entre las especies. Como consecuencia, las inmunoglobulinas
de una especie a menudo son inmunógenas, si se introducen en el
sistema vascular de otra especie.
La inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales
xenogénicos limita por lo tanto su uso en la terapia de la
enfermedad de seres humanos, debido a que la exposición de los
pacientes a anticuerpos xenogénicos puede dar como resultado efectos
adversos, incluso toxicidad aguda, o simplemente puede conducir a la
neutralización y aclaramiento del anticuerpo aplicado, reduciendo de
ese modo su eficacia farmacológica (Clark, Immunol Today,
21, p. 397-402, 2000). Por el contrario, la
administración de anticuerpos totalmente humanos a pacientes
habitualmente no conduce a ninguna de las complicaciones mencionadas
anteriormente.
Los antisueros humanos o anticuerpos policlonales
humanos se han aislado ocasionalmente de la sangre de pacientes
individuales para el tratamiento o prevención de enfermedades raras
y habitualmente muy letales, como infecciones por el virus del
Ébola, o por ejemplo para el tratamiento de pacientes después de la
exposición a venenos de serpiente. Sin embargo, este enfoque, por
muchas razones, es poco práctico para el tratamiento de enfermedades
que afectan a poblaciones más grandes. Además, por razones éticas,
es imposible inmunizar a seres humanos con un antígeno dado con el
fin de producir anticuerpos monoclonales, debido a que las células
de la estirpe B en seres humanos que producen los anticuerpos
deseados se desarrollan y residen en órganos linfoides secundarios y
no se pueden obtener fácilmente. Además, muchos antígenos diana
potenciales para anticuerpos terapéuticos, en particular para la
terapia del cáncer, son proteínas humanas (Glennie y Johnson, s.a.).
En condiciones normales, los seres humanos no desarrollarán
anticuerpos frente a estas dianas. Por lo tanto, se han realizado
importantes esfuerzos en el pasado reciente por desarrollar
procedimientos para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos
humanos o humanizados sin la necesidad del sistema inmunitario del
ser humano.
El enfoque más simple usa técnicas estándares de
ingeniería genética para clonar los ADNc que codifican los dominios
variables de las cadenas H y L (dominios V_{H} y V_{L}) a partir
de un hibridoma que segrega un anticuerpo xenogénico de
especificidad deseada. Los ADNc de las regiones variables clonados
se clonan entonces en vectores de expresión de E. coli, de
levadura, de células de insectos o de células de mamíferos
apropiados que contienen genes humanos de región constante. Esto
permitirá la producción de anticuerpos monoclonales con los dominios
V_{H} y V_{L} xenogénicos fusionados a los dominios humanos de
las regiones constantes C_{H} y C_{L}, dando de ese modo como
resultado un anticuerpo humanizado. Sin embargo, este enfoque tiene
la desventaja de que la fusión de los dominios V_{H} y V_{L}
xenogénicos a las regiones constantes C_{H} y C_{L} humanas
puede dar como resultado una disminución de la afinidad o una
alteración de la especificidad. Además, los dominios V_{H} y
V_{L} heterólogos del anticuerpo humanizado aún son inmunogénicos
en seres humanos, debido a que las regiones de armazón de los
dominios V varían entre diferentes especies. Este problema se puede
esquivar en algunos casos injertando regiones individuales que
determinan la complementariedad (CDR), que median el contacto
directo con antígenos, sobre las regiones humanas de armazón de los
dominios variables de la cadena H y de la cadena L (Fiorentini et
al., Immunotechnology, 3, p.
45-59, 1997). Sin embargo, por razones desconocidas,
el injerto de CDR todavía da como resultado a menudo la generación
de anticuerpos inmunogénicos y/o la disminución/pérdida de afinidad
y de especificidad.
Por lo tanto, se han desarrollado en años
recientes dos enfoques diferentes y más eficaces para la generación
de inmunoglobulinas completamente humanas.
El primer método se basa en la expresión
(presentación) de regiones variables de una sola cadena (scFv) que
constan de un dominio V_{H} y V_{L} sobre la superficie de
bacteriófagos filamentosos de E. coli (Hoogenboom y Chames,
Immunol. Today, 21, p. 371-3818, 2000)
(véanse también los documentos EP 0.585.287 B1, EP 0.605.522 B1). Se
pueden construir librerías de presentación de fagos que contienen un
repertorio diverso de cadena V_{H} y V_{L}, y se pueden aislar
especificidades de scFv individuales a partir de tales librerías
mediante la unión de fagos recombinantes a antígeno inmovilizado
(McCafferty et al., Nature, 348, p.
552-554, 1990).
Las librerías de presentación de fagos para las
proteínas de unión a scFv derivadas de un repertorio humano natural
tienen el inconveniente de estar restringidas a especificidades
contenidas en ese repertorio, y por lo tanto muy a menudo no se
representan en estas librerías las especificidades para muchos
antígenos humanos. Aunque para obviar este problema se pueden usar
librerías de presentación de fagos combinatorias o sintéticas, un
inconveniente general de esta tecnología es que a menudo no se
pueden aislar proteínas de unión de elevada afinidad para un
antígeno dado. Por lo tanto, se han invertido esfuerzos sustanciales
en la construcción de librerías primarias muy grandes mediante
procedimientos de clonación por fuerza bruta o de recombinación
específica del sitio.
Se estima que las mejores librerías combinatorias
o sintéticas contienen 10^{9}-10^{11} sitios de
unión potencialmente diferentes y pueden producir especificidades de
unión en el intervalo de 1-200 nM (Hoogenboom y
Chames, s.a.). Sin embargo, mayores afinidades, en el intervalo
picomolar (10^{-12} M), que se pueden alcanzar durante la
maduración por afinidad de inmunoglobulinas en células B de centro
germinal in vivo, sólo se pueden generar empleando
procedimientos adicionales de ingeniería genética muy tediosos,
incluyendo el barajado de genes V, PCR con tendencia al error, el
uso de cepas mutadoras de E. coli, etc.
Cualquiera que sea el resultado de un proceso de
selección de librería de visualización de fago, eventualmente los
genes que codifican el sitio de unión de scFv necesitan ser
reclonados en vectores de expresión adecuados para inmunoglobulinas
humanas, y estos necesitan ser transferidos establemente a un
sistema de expresión celular que permita la producción a gran escala
de anticuerpos humanos, lo que es otro procedimiento caro y que
consume tiempo.
El segundo enfoque para la producción de
anticuerpos monoclonales totalmente humanos se basa en el uso de
ratones transgénicos que portan constructos para los locus génicos
de cadenas H y L de inmunoglobulinas humanas (Jakobovits, Curr.
Opin. Biotechnol., 6, p. 561-566, 1995).
Los transgenes de inmunoglobulina humana se reproducen eventualmente
en un antecedente genético que ya no permite el ensamblaje de los
genes del receptor del antígeno murino endógeno. En estos ratones,
el desarrollo de las células de estirpe B depende de la expresión de
las cadenas H y L de inmunoglobulinas a partir de constructos
transgénicos humanos, y las células de estirpe B de estos ratones
sólo son capaces de producir anticuerpos humanos. Hay tres
variaciones de esta técnica. En una, se usan los minilocus de
inmunoglobulina humana como transgenes, a partir de los cuales se
puede generar sólo un repertorio limitado de anticuerpos humanos
(Fiswild et al., Nat. Biotechnol., 14, p.
845-851, 1996) (véase también los documentos EP
0.546.073 B1, US 5.874.299, WO 92/03918). En una segunda variación,
se usan regiones grandes de los locus génicos de las cadenas IgH e
Ig\kappaL humanos que engloban la mayoría de los segmentos génicos
de región variable clonados en cromosomas artificiales de levadura.
En una tercera variación, se integran cromosomas humanos que
contienen todos los locus génicos de cadena H y cadena L de
inmunoglobulina humana en la línea germinal de ratones que generan
los así denominados animales transcromosómicos. Los ratones con
tales transgenes complejos desarrollan un repertorio de
inmunoglobulina humana prácticamente normal.
La inmunización de estos ratones transgénicos o
transcromosómicos da como resultado una respuesta inmunitaria
humoral que da como resultado la generación de anticuerpos
totalmente humanos. Este enfoque para generar anticuerpos humanos
tiene una ventaja importante con respecto a la tecnología de
librería de visualización de fagos: se pueden generar anticuerpos de
elevada afinidad por un antígeno dado, debido a que las
inmunoglobulinas humanas pueden sufrir una maduración de afinidad en
células B con centros germinales, lo que es un proceso normal en el
transcurso de una reacción inmunitaria.
Sin embargo, hay un inconveniente importante en
esta tecnología: primeramente, la generación de ratones transgénicos
o transcromosómicos es muy tediosa, difícil, consume tiempo y por lo
tanto es relativamente cara. Por ejemplo, el documento WO 92/03918
describe células B de un ratón transgénico que expresan anticuerpos
monoclonales humanos. A fin de lograr este ratón transgénico, se
transfectan huevos fertilizados con elementos exógenos introduciendo
transgenes de cadena IgH e IgL heterólogos mediante inyección
pronuclear. El procedimiento completo requiere la generación de al
menos cuatro razas diferentes de ratones: dos razas con
interrupciones seleccionadas dentro de los locus génicos de cadena
IgH e IgL endógenos, así como dos razas que tienen transgenes o
transcromosomas para parte o todos los locus génicos de cadena IgH e
IgL humanos. Además, estas cuatro razas de ratón se han de
reproducir juntas, dando como resultado ratones con un genotipo que
tiene interrupciones homocigóticas de ambos locus génicos de cadena
IgH e IgL endógenos y al mismo tiempo que tiene los transgenes
humanos que codifican ambas cadenas IgH e IgL heterólogas. La
generación de las diferentes razas de ratones transgénicos y ratones
con uno de sus genes inactivados, su selección sistemática y su
reproducción cruzada eventual es un procedimiento largo que
requerirá al menos dos años, incluso si cada etapa se optimiza
completamente. Por lo tanto, los marcos de tiempo prolongados
requeridos para el desarrollo de una raza de xenorratón deja poca
flexibilidad para diseñar diferentes razas de ratón que contengan
constructos transgénicos modificados. Por lo tanto, esta tecnología
no es adecuada para la modificación y mejora de anticuerpos
existentes (por ejemplo de su afinidad), debido a que esto
requeriría el largo procedimiento de generar una nueva raza de
ratones transgénicos para este anticuerpo. Por lo tanto, esta
tecnología está restringida básicamente a la generación de
novo de anticuerpos humanos.
Basándose en los factores mencionados
anteriormente, existe claramente la necesidad de una tecnología que
permita la producción de anticuerpos totalmente humanos que combine
las ventajas tanto del sistema de visualización de fagos (es decir,
velocidad y flexibilidad en la generación de anticuerpos humanos, y
la capacidad para modificar y mejorar las propiedades de anticuerpos
existentes), como de la tecnología de ratones transgénicos para
inmunoglobulinas humanas (es decir, la capacidad para obtener
anticuerpos de elevada afinidad debido a la maduración de afinidad
que aparece en el sistema inmunitario, y la producción de
anticuerpos con características estructurales naturales y
fisiológicas).
La presente invención proporciona medios y
métodos para generar linfocitos precursores de vertebrados que se
pueden usar para la producción de cualquier proteína de unión o de
un fragmento o fragmentos funcionales de la misma con la capacidad
para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo
cualquier anticuerpo heterólogo, receptor de antígeno compuesto de
dominios variables y regiones constantes que comprenden receptores
de células T e inmunoglobulinas unidas a la membrana, cualquier
proteína de unión artificial que presente funciones efectoras
inmunitarias de tipo salvaje como funciones efectoras artificiales o
modificadas no derivables de la línea germinal codificada por
inmunoglobulinas heterólogas o receptores de antígenos, y cualquier
fragmento o fragmentos funcionales de los mismos. En particular, la
invención proporciona medios y métodos para modificar genéticamente
linfocitos precursores de vertebrados, y para efectuar su
diferenciación en líneas celulares linfoides más maduras tanto in
vitro como in vivo, generando de ese modo linfocitos
capaces de producir a proteína de unión o un fragmento o fragmentos
funcionales de la misma, así como un método para la producción de
dicha proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de
la misma. Además, la presente invención proporciona linfocitos
precursores de vertebrados genéticamente modificados y células de
línea linfoide madura así como células inmortalizadas derivadas de
los mismos adecuadas para llevar a cabo los métodos según la
invención.
De este modo, los métodos de la presente
invención permiten una gran flexibilidad para la generación de
células de línea linfoide con el potencial de expresar simplemente
cualquier tipo de anticuerpo o proteína de unión, dentro de períodos
cortos de tiempo. Al mismo tiempo, la posibilidad de transplantar
estas células en hospedantes de vertebrados compatibles, en los que
las células participan en funciones inmunitarias específicas, tales
como maduración de afinidad, permite que se explote la selectividad
del sistema inmunitario para generar anticuerpos y proteínas de tipo
inmunoglobulínicas o incluso proteínas de unión artificiales de
afinidades de unión elevadas para cualquier compuesto o composición
antigénica dada.
La Figura 1 es una representación esquemática de
la estructura y genética de las inmunoglobulinas. Los anticuerpos o
inmunoglobulinas (Ig) son glicoproteínas que, en su forma monómera,
están compuestos de dos cadenas pesadas idénticas (IgH) y dos
cadenas ligeras idénticas (IgL) que están enlazadas covalentemente
mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena IgH comprende un dominio
variable N-terminal (V_{H}) y 3-4
dominios de región constante (C_{H} 1-3, o 4),
dependiendo del isotipo del anticuerpo. Además, los anticuerpos
contienen una región bisagra entre el primer y el segundo dominio
C_{H}, dotando de flexibilidad a los dos brazos de unión al
antígeno de la glicoproteína heterotetrámera. Las cadenas ligeras
constan de un solo dominio variable N-terminal
(V_{L}) y un dominio constante C-terminal
(C_{L}). La disposición de las dos cadenas IgH e IgL da como
resultado un anticuerpo monómero con forma de Y, con dos sitios de
unión altamente variables para el antígeno, que se forman mediante
la asociación de los dominios variables de las cadenas IgH e IgL.
Los dominios variables difieren en gran medida de las denominadas
regiones hipervariables, si las regiones V se comparan entre
diferentes anticuerpos. Esta variabilidad resulta del hecho de que
las regiones V no están codificadas por genes individuales, sino
que, en el caso de las regiones V_{H}, lo están por un número de
diferentes segmentos génicos V, D y J, a partir de los cuales cada
uno se selecciona al azar y entonces se recombinan para formar la
región codificante variable de las cadenas IgH (véase la parte
superior izquierda del dibujo). Este proceso se denomina
recombinación V(D)J y ocurre durante el desarrollo
temprano de las células B. Los locus génicos de la cadena IgL
contienen sólo un número de diferentes segmentos génicos V y J, a
partir de los cuales se generan las regiones codificantes para los
dominios variables mediante una reorganización al azar de V a J
(véase la parte superior derecha del dibujo). Los dominios de región
constante de los anticuerpos procedentes de la misma subclase
(isotipo) determinan las funciones defectoras del anticuerpo, y no
difieren entre anticuerpos diferentes. Sin embargo, en el transcurso
de una respuesta inmunitaria, se puede inducir a los linfocitos B
individuales a cambiar el isotipo del anticuerpo que se expresa. En
este caso, se produce un suceso de recombinación de ADN somática
entre regiones de canje (indicadas mediante un punto en la
representación gráfica de los genes de región constante en la parte
inferior del dibujo) localizadas en 5' de los diferentes genes de
región constante. Por ejemplo, la recombinación entre las regiones
de canje \mu y \varepsilon puede dar como resultado la
eliminación de todos los genes de región constante de C\mu a
C\gamma4, según se indica en el dibujo. Como resultado de esto, se
produce un acercamiento de la región codificante variable VDJ a una
región constante C\varepsilon, conduciendo a la expresión de un
anticuerpo de isotipo IgE.
La Figura 2 muestra el desarrollo de células B en
el ratón. La diferenciación de linfocitos B en el ratón se puede
subdividir en diferentes etapas que se pueden subdividir fenotípica
y genotípicamente. Las células precursoras B (preB) más
tempranamente asignadas que se pueden encontrar en la médula ósea de
ratones de tipo salvaje derivan de hemocitoblastos (HSC, izquierda),
que no expresan marcadores específicos de línea (que se designa como
LIN^{-}), pero que se caracteriza por la expresión en superficie
de antígeno 1 de hemocitoblasto (Sca-1). A partir de
esto, se generan células preB que habitualmente tienen
reordenamientos DJ_{H} en ambos alelos de cadena IgH, y que se
caracterizan por la expresión en superficie de B220 (un pan marcador
de células B) y un kit c. En esta etapa, todos los otros locus
génicos de Ig están aún habitualmente en la configuración de la
línea germinal (GL). Las células preB reordenadas DJ_{H} se
denominan células preB-I y se pueden expandir en
cultivo de tejido en condiciones específicas. El siguiente suceso de
reordenamiento en estas células implica uno de los segmentos génicos
V_{H} que se reordena a un elemento DJ_{H} preexistente. Si esto
conduce a un reordenamiento productivo en cualquier alelo de forma
que se pueda expresar una cadena \muH, estas células reciben una
señal proliferativa, se expanden y se diferencian en células
preB-II. Estas células pierden la expresión del
marcador de superficie c-kit, pero ganan la
expresión de CD25. Otro reordenamiento productivo en cualquiera de
los alelos de cadena IgL da como resultado la diferenciación a
células B inmaduras que expresan IgM unida a membrana. Estas células
B inmaduras, sin tratamiento, pueden abandonar la médula ósea,
migrar a órganos linfoides periféricos, en los que eventualmente
pueden encontrar un antígeno. En el transcurso de una respuesta
inmunitaria, estas células B se pueden diferenciar entonces en
células plasmáticas que segregan anticuerpos, durante lo cual puede
ocurrir otro proceso de recombinación de ADN (recombinación por
cambio de clase) en el locus de región constante de IgH, dando como
resultado el cambio de isotipo de anticuerpo que se segrega por las
células plasmáticas.
La Figura 3 es una vista esquemática del método
según la invención para la generación de linfocitos B precursores
humanizados (HupreB). Se pueden aislar células
preB-I reordenadas DJ_{H} murinas a partir de
hígado fetal de ratones de 14-19 días tras el coito,
o de la médula ósea de ratones adultos (Etapa 1). El cultivo a largo
plazo de estas células requiere condiciones de cultivo de tejido
especiales, incluyendo capas alimentadoras de células estrómicas y/o
la presencia de ciertos factores de crecimiento, tales como, por
ejemplo, IL-7 (interleuquina 7). En estas
condiciones, las células preB-I no se diferencian
más (Etapa 2). A fin de usar estas células para la producción de
anticuerpos heterólogos, se debe evitar que se realicen en estas
células otros reordenamientos de genes de Ig endógenos productivos.
Esto se puede lograr, por ejemplo, introduciendo una mutación o
mutaciones que actúan en cis en ambos alelos de los locus
génicos de cadena IgH e IgL (Etapa 3b), o, como alternativa,
introduciendo una mutación o mutaciones que actúan en trans
que impida la recombinación V(D)J adicional de genes
Ig, por ejemplo eliminando uno de los dos genes activadores de la
recombinación, RAG-1 o RAG-2 (Etapa
3a). Estas últimas células se pueden transducir entonces
establemente con retrovirus recombinantes capaces de mediar la
expresión de cadenas IgH e IgL xenogénicas, en este caso humanas
(Etapa 4a). Estos vectores retrovíricos también se pueden usar para
la transducción estable de aquellas células que tienen mutaciones
que actúan en cis en los locus génicos de Ig endógenos.
Además, las células preB que tienen mutaciones que actúan en
cis aún son competentes para los reordenamientos de genes de
Ig. Por lo tanto, es posible transfectar establemente estas células
con locus génicos de Ig de línea germinal heteróloga, que pueden
sufrir reordenamientos V(D)J, y a partir de las cuales
se pueden producir nuevos anticuerpos xenogénicos (Etapa 4b). Si los
genes de cadena IgH e IgL heterólogos o xenogénicos son de origen
humano, las células preB-I sólo tendrán el potencial
para la expresión de anticuerpos totalmente humanos, y por lo tanto
se denominan como células HupreB.
La Figura 4 es una representación esquemática que
ilustra la selección de los locus génicos endógenos usando vectores
de selección de genes positivos-negativos. Para la
selección de locus génicos endógenos, se clona una región genómica
de aproximadamente 1 kb en dirección 5' (brazo corto) de ese locus y
una región de aproximadamente 3 kb (brazo largo) en dirección 3' de
ese gen, en un vector de selección positivo-negativo
vacío. Como ejemplo, se representa la estrategia de selección para
un locus de cadena IgH reordenada DJ_{H}3. Este constructo se
transfecta en células preB-I, y la integración del
vector de selección mediante recombinación homóloga se selecciona y
se detecta eventualmente de forma sistemática. El marcador de
selección positiva permite la selección para la integración estable
del constructo en el genoma de la célula transfectada. La expresión
del marcador de selección negativa sería tóxica para la célula, y
las células sólo sobrevivirían si el marcador de selección negativa
se pierde con la integración estable, lo que ocurre mediante dos
sucesos de recombinación homóloga en el locus correcto. Se indican
mediante líneas cruzadas dos sitios posibles para la recombinación
homóloga entre el locus génico endógeno y el constructo de
selección. Si ocurre la integración del constructo mediante tales
sucesos de recombinación homóloga, el marcador de selección de
fármaco positivo sustituye a la región endógena localizada entre los
brazos corto y largo de homología. Si el marcador de selección
positiva está flanqueado por dos señales de recombinación loxP, como
se indica aquí, la expresión transitoria de cre recombinasa puede
mediar la eliminación del marcador de selección, de forma que se
puede usar el mismo constructo de selección para seleccionar el
segundo alelo del mismo locus génico.
La Figura 5a ilustra la estrategia de clonación
para la construcción de un vector de selección del locus génico de
cadena IgH. La estrategia de clonación detallada para la
construcción de un posible constructo de selección para los locus
génicos de cadena IgH murinos reordenados DJ_{H} se representa
aquí en el ejemplo de un locus génico reordenado
D_{FL16,1}-J_{H}4. Se pueden seleccionar otros
locus génicos de cadena IgH reordenados DJ_{H} con el mismo vector
de selección. Los sitios de restricción únicos se indican en el
locus génico endógeno (constructo superior), y se indican las
regiones de 1523 y 3215 pb que se clonan mediante PCR a partir de
ADN genómico en el vector de selección
positivo-negativo vacío
pBSL-flneo-DT4 (véase la Fig. 6b, se
escogió pBSL-flneo-DT4 como un
ejemplo de diversos vectores de selección vacíos diferentes). Los
cebadores de PCR para los brazos corto y largo se diseñan para que
contengan los sitios de restricción NotI y AscI para la clonación de
los fragmentos en los sitios de restricción único y compatible en
pBSL-flneo-DT4. La organización del
constructo de selección final se representa en la parte inferior, y
se indican las posiciones de los sitios de restricción
seleccionados.
La Figura 5b ilustra la estrategia de clonación
para la construcción de un vector de selección del locus génico de
cadena Ig\kappaL. Se representa aquí la estrategia de clonación
detallada para la construcción de un posible constructo de selección
para los locus génicos de cadena Ig\kappaL murinos diseñados para
la eliminación mediante selección de todos los segmentos génicos
J\kappa de línea germinal. Los sitios de restricción únicos se
indican en el locus génico endógeno (constructo superior), y se
indican las regiones de 739 y 3379 pb que se clonan mediante PCR a
partir de ADN genómico en el vector de selección
positivo-negativo vacío
pBSL-flneo-DT4 (véase la Fig. 6b, se
escogió pBSL-flneo-DT4 como un
ejemplo de diversos vectores de selección vacíos diferentes). Al
igual que en la Fig. 5a, los cebadores de PCR para los brazos corto
y largo se diseñan para que contengan los sitios de restricción NotI
y AscI para la clonación de los brazos corto y largo en sitios de
restricción compatibles de
pBSL-flneo-DT4. La organización del
constructo de selección final se representa en la parte inferior, y
se indican las posiciones de los sitios de restricción
seleccionados.
La Figura 5c ilustra la estrategia de clonación
para la construcción de un vector de selección del locus génico RAG.
Se representa aquí la estrategia de clonación detallada para la
clonación de un posible constructo de selección para el locus génico
RAG murino diseñado para la eliminación por selección del gen
RAG-1. El locus del gen RAG en el ratón está
localizado en el cromosoma 2 y contiene dos genes estrechamente
ligados, RAG-1 y RAG-2, que son
esenciales cada uno de ellos para los reordenamientos de genes Ig.
Los marcos de lectura abierta (ORF) de ambos genes están codificados
por un único exón, pero un exón corto sin traducir, en dirección 3'
de cada elemento promotor (indicado mediante triángulos), se empalma
con un exón grande que contiene todos los ORF de RAG. Los sitios de
restricción únicos se indican en el locus génico endógeno
(constructo superior). Las regiones genómicas de 1078 y de 2950 pb
en dirección 5' y en dirección 3' del ORF de RAG-1,
respectivamente, se clonan mediante PCR a partir de ADN genómico en
el vector de selección positivo-negativo vacío
pBSL-flneo-DT4, según se indica
(véase la Fig. 6b, para
pBSL-flneo-DT4 que se escogió como
un ejemplo de diversos vectores de selección vacíos diferentes). Al
igual que en la Fig. 5a, los cebadores de PCR para los brazos corto
y largo se diseñan para que contengan los sitios de restricción NotI
y AscI para la clonación de los brazos corto y largo en sitios de
restricción compatibles de
pBSL-flneo-DT4. La organización del
constructo de selección final se representa en la parte inferior, y
se indican las posiciones de los sitios de restricción
seleccionados.
La Figura 6a muestra la estrategia de clonación
detallada para vectores positivos-negativos a base
de DT-\alpha y DT-\alpha
(tox176) para la selección de genes (etapas preparatorias). Un
prerrequisito para la generación de vectores de selección vacíos es
extender el sitio de clonación múltiple (MCS) de un plásmido de
clonación regular, como pBluescript, de forma que se añadan sitios
de restricción útiles adicionales al poliligador, que entonces se
puede usar para la inserción de los casetes de expresión para
marcadores de selección positivos y negativos, así como para
regiones genómicas requeridas para la selección de un locus génico
endógeno mediante recombinación homóloga. Se representa aquí la
inserción de un oligómero adicional con sitios de restricción
adicionales en el MCS de pBluescript, generando de ese modo el
plásmido pBSL con un poliligador extendido. Este constructo se usa
para insertar un promotor de \beta-actina
accionado por el casete de expresión para la toxina \alpha de
difteria de tipo salvaje o una versión atenuada de la misma,
representada como DT\alpha(tox176) (véase el ejemplo 5b,
etapa 2). Estos dos constructos con el sitio de clonación múltiple
extendido se denominan pBSL-DT4 (parte inferior,
izquierda) y pBSL-DT4tox176 (parte inferior,
derecha), respectivamente. Los casetes de expresión de la toxina de
difteria se clonan en pBSL usando los sitios de restricción XbaI y
BgIII, según se indica. Igualmente se indica un sitio de restricción
NheI de diagnóstico que es único para el casete de expresión de
Dttox176 atenuada.
La Figura 6b ilustra la estrategia de clonación
detallada para vectores positivos-negativos a base
de DT-\alpha y
DT-\alpha(tox176) para la selección de
genes (etapas de clonación finales). Se describe la clonación de
vectores de selección positivos-negativos vacíos,
que contienen neomicina, higromicina B o puromicina como marcadores
de selección positivos, y un casete de expresión de la toxina
\alpha de la difteria de tipo salvaje. Se pueden usar las mismas
estrategias de clonación para vectores que contienen un casete de
expresión para DT-\alpha(tox176) en su
lugar. Se indican las enzimas de restricción usadas para la
clonación de fragmentos y la linealización de constructos. Todos los
marcadores de selección positivos se diseñan para que estén
flanqueados por sitios loxP (flanqueados) que se pueden reconocer
mediante cre recombinasa. Aunque un casete de expresión de neomicina
flanqueado se puede reclonar a partir del vector existente
pGL2-neo (m)+ (DSM 14705), los casetes de expresión
de higromicina B flanqueados y de puromicina flanqueados necesitan
ser insertados en dos etapas. Para esto, se insertó un oligómero de
ADN sintético, que contiene dos sitios loxP separados mediante un
sitio MluI, en pBSL-DT4 a fin de generar
pBSL-DT4-2loxP, según se indica. En
una etapa final, los casetes de expresión para resistencia a
higromicina B y a puromicina se clonaron mediante PCR en el sitio
único de MluI de pBSL-DT4-2loxP.
La Figura 7a muestra la organización esquemática
de vectores de expresión retrovíricos para cadenas IgH humanas. Los
vectores retrovíricos recombinantes, que permiten la expresión de
proteínas de cadena IgH humanas, muestran un diseño modular que
contiene el promotor del locus de Ig y elementos potenciadores, así
como también regiones codificantes para los dominios de región
variable y constante de cadenas IgH. La orientación transcripcional
del casete de expresión de IgH es opuesta a la del elemento promotor
de 5'LTR retrovírico, a fin de conferir un patrón de expresión
específico de la célula B basándose en el promotor específico de Ig
y en los elementos potenciadores. El casete de expresión contiene un
promotor V_{H} murino, una secuencia líder (L) con exones VDJ que
codifican dominios variables de IGH, el potenciador de cadena pesada
del intrón murino (E\muH), exones que codifican las regiones
constantes de cadenas de IgH heterólogas, exones para las regiones
de expansión membránica de inmunoglobulinas, y elementos procedentes
del potenciador 3'\alpha de IgH murino. Las diferentes regiones
L-VDJ, e incluso las librerías de las regiones
L-VDJ, se pueden clonar en los sitios de restricción
únicos BamHI y HindIII del vector de expresión de IgH usando enzimas
de restricción que generan proyecciones compatibles. Debido al
diseño modular, los exones de región constante o los elementos
potenciadores se pueden sustituir usando técnicas de biología
molecular simples (según se indica).
La Figura 7b muestra la organización esquemática
de vectores de expresión retrovíricos para cadena Ig\kappaL
humanas. Al igual que los vectores representados en la Fig. 7a, los
vectores retrovíricos recombinantes que permiten la expresión de las
proteínas de cadena Ig\kappaL humanas, muestran un diseño modular
similar que contiene el promotor del locus específico de cadena IgL
y elementos potenciadores, así como también regiones codificantes
para los dominios de las regiones variable y constante de las
cadenas Ig\kappaL. La orientación transcripcional del casete de
expresión de Ig\kappaL es opuesta a la del elemento promotor 5'LTR
retrovírico, a fin de conferir un patrón de expresión específico a
la célula B basándose en el promotor específico de Ig y en los
elementos potenciadores. El casete de expresión contiene un promotor
V\kappa murino, una secuencia líder (L) con exones VJ que
codifican dominios variables de Ig\kappaL, el potenciador del
intrón \kappa murino (\kappaIE), exones que codifican la región
constante de las cadenas IgL heterólogas, y elementos procedentes
del potenciador 3' de Ig\kappa murino (\kappa3'E), según se
indica. Además, los vectores de expresión de cadena Ig\kappaL
retrovíricos contienen un casete de expresión completo de
puromicina, que permite la selección de células preB transducidas de
forma estable. Las diferentes regiones L-VJ, e
incluso las librerías de regiones L-VJ, se pueden
clonar en los sitios de restricción únicos BamHI y HindIII del
vector de expresión de IgH usando enzimas de restricción que generan
proyecciones compatibles. Debido al diseño molecular, los exones
modificados de la región constante o los elementos potenciadores se
pueden sustituir usando técnicas de biología molecular simples
(según se indica).
La Figura 8 ilustra el procedimiento para la
transducción retrovírica de células preB dependientes de células
estrómicas/IL7 murinas con vectores retrovíricos que codifican
cadenas IgH e IgL heterólogas. Se pueden transducir secuencialmente
líneas celulares preB dependientes de células estrómicas/IL7 que
proliferan a largo plazo con mutaciones que interfieren con los
reordenamientos de genes de Ig endógenos (véase la Fig. 3), con
vectores de expresión retrovíricos que codifican cadenas de IgL y
cadenas de IgH, según se indica. Después de la transducción sucesiva
con el primer constructo de cadena IgL heterólogo y después con el
constructo retrovírico que expresa la cadena IgH, las células tienen
el potencial para expresar anticuerpos heterólogos con la
diferenciación de las células tanto in vitro como in
vivo (véase la Fig. 10).
La Figura 9 es una vista esquemática de fuentes a
partir de las que se pueden aislar regiones que codifican los
dominios variables. Las regiones que codifican los dominios
variables se pueden aislar de muchas fuentes diferentes, según se
indica en esta figura. El diseño modular de los vectores
retrovíricos permite la clonación de vectores retrovíricos que
codifican, por ejemplo, sólo una única especificidad, por ejemplo a
partir de un anticuerpo monoclonal útil existente. Con la
transducción de estos vectores y el transplante de células
transducidas en ratones in vivo (véase la Fig. 10), entonces
se pueden someter a las especificidades individuales a una
maduración de afinidad. Como alternativa, las librerías VDJ y VJ
completas se pueden aislar de linfocitos de sangre periférica (PBL)
a partir de pacientes sanos, enfermos o inmunizados, y entonces se
pueden clonar en vectores de expresión retrovíricos de cadena IgH e
IgL. De hecho, incluso es posible generar repertorios de región
V_{H} y V_{L} completamente sintéticos que se pueden clonar en
vectores de expresión de Ig retrovíricos, que se pueden transducir
después de forma estable y se pueden seleccionar funcionalmente
in vivo (véase la Fig. 10).
La Figura 10 ilustra el transplante de HupreB en
ratones inmunodeficientes para la producción de anticuerpos
monoclonales completamente humanos. Las células HupreB, al igual que
las células preB murinas normales, se pueden transplantar en
hospedantes murinos, en los que son capaces de participar en
respuestas inmunitarias del hospedante. Si las células HupreB se
transplantan en hospedantes inmunodeficientes que carecen de células
B endógenas, los únicos anticuerpos que entonces se pueden producir
son anticuerpos heterólogos (humanos) a partir de las células HupreB
transplantadas. Hay muchas razas hospedantes diferentes que se
pueden usar para el transplante de células HupreB. Las razas que
carecen tanto de linfocitos B como T son, por ejemplo, las razas de
ratón deficientes de RAG-1 y RAG-2 y
razas de ratón scid. A fin de ser capaces de provocar una
respuesta inmunitaria dependiente de células T que implica
linfocitos B derivados de células HupreB transplantadas, se pueden
aislar poblaciones linfocíticas auxiliares T y se pueden
cotransplantar en estos ratones (lado izquierdo). Como alternativa,
las razas de ratones que carecen sólo de linfocitos B, como por
ejemplo ratones deficientes de J_{H}, se pueden reconstituir
mediante transplante con células HupreB solas (lado derecho). Una
vez que los compartimientos de linfocitos B y T periféricos están
reconstituidos después del transplante, estos ratones se pueden
inmunizar usando protocolos de inmunización convenientes frente a
cualquier antígeno deseado. Las células plasmáticas derivadas de
estos ratones se pueden entonces inmortalizar, por ejemplo mediante
fusión con mielocitos, a fin de producir células (hibridomas)
capaces de segregar permanentemente anticuerpos monoclonales
heterólogos (humanos) específicos para el compuesto o composición
inmunógena inyectada.
La Figura 11a ilustra la construcción de un
vector de expresión retrovírico para la expresión constitutiva del
gen anti-apoptótico bcl-2 (etapas
preparatorias). La eliminación de IL-7 de cultivos
de células preB que proliferan continuamente in vitro da como
resultado la diferenciación de las células preB, pero, al mismo
tiempo, también conduce a la inducción de la apoptosis. Esta
apoptosis se puede evitar mediante expresión constitutiva de un gen
anti-apoptótico como, por ejemplo,
bcl-2. Para la generación de un vector de expresión
retrovírico seleccionable para bcl-2, se clona
secuencialmente el ADNc de bcl-2 murino con un marco
de lectura abierta de higromicina B en un vector de expresión génico
dual pIRES. Este vector contiene secuencias de entrada ribosómicas
internas flanqueadas por dos sitios de clonación múltiples, en los
que se pueden clonar dos genes diferentes. Esto permite la expresión
simultánea de dos genes en células de mamíferos a partir de un único
promotor. Se indica la estrategia para la inserción del ORF de
bcl-2 y del gen marcador de selección de higromicina
B en pIRES para la generación de un vector
pBcl2-IRES-higroB.
La Figura 11b ilustra la construcción de un
vector de expresión retrovírico para la expresión constitutiva del
gen anti-apoptótico bcl-2 (etapa
final de clonación). Después del ensamblado del promotor CMV operado
por el casete de
bcl-2-IRES-higromicinaB,
se reclona el casete de expresión dual completo a partir del vector
pBcl2-IRES-higroB como un fragmento
SalI-ClaI en el vector de transferencia retrovírico
pLIB, según se representa. Esto genera el constructo retrovírico
recombinante
pLIB-Bcl2-IRES-higroB
que se puede usar para transducir establemente células preB y para
conferir expresión simultánea de bcl-2 y resistencia
a higromicina B.
La Figura 12a ejemplifica la construcción de
vectores de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas IgH
humanas (etapa preparatoria I). Los diversos promotores IgH y
elementos potenciadores, así como las regiones codificantes para los
diferentes dominios de región variable y de región constante, se
clonan secuencialmente en un vector de transferencia retrovírico
como, por ejemplo, el plásmido pLIB. Este plásmido contiene todos
los elementos requeridos para el empaquetamiento retrovírico y la
integración del provirus, es decir una 5'LTR, una señal de
empaquetamiento, y una 3'LTR, clonados en una estructura plasmídica
seleccionable de ampicilina, bacteriana, con un origen ColE1 de
replicación (según se indica). Se representan aquí las primeras
etapas de clonación para insertar un promotor V_{H}, el
potenciador del intrón de cadena pesada murino (E\muH), que
incluye regiones de unión de matriz flanqueantes (MAR) y el
potenciador 3'\alpha de cadena IgH (3'\alphaE). Se resaltan las
enzimas de restricción incorporadas en los términos de los
fragmentos amplificados mediante PCR, así como los sitios de enzimas
de restricción compatibles únicos en la estructura del plásmido, que
se pueden usar en las diversas etapas de clonación.
La Figura 12b ejemplifica la construcción de
vectores de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas IgH
humanas (etapa preparatoria II). El potenciador 3'\alpha de IgH
contiene cuatro regiones funcionales que, con la activación del
potenciador durante la diferenciación terminal de células B, se hace
sensible a la digestión mediante ADNasaI y por lo tanto se denominan
como regiones hipersensibles HS 1, 2, 3 y 4. Cada una de estas
regiones HS contribuye a la actividad potenciadora de 3'\alphaE,
pero la mayor parte de la actividad potenciadora la confiere las
regiones HS1,2. Aunque la región HS1,2 de 3'\alphaE sola es capaz
de llevar a cabo la expresión del gen formador hasta casi los mismos
niveles que toda la región de 3'\alphaE, puede ser deseable, para
algunos constructos de expresión de IgH retrovíricos, incluir otras
regiones funcionales de 3'\alphaE. Por lo tanto, se representa
aquí la clonación de las regiones HS3 y HS4 de 3'\alphaE. Se
resaltan las enzimas de restricción incorporadas en los términos de
los fragmentos de PCR genómicos, así como los sitios de enzimas de
restricción compatibles en la estructura plasmídica, que se pueden
usar en las diversas etapas de clonación.
La Figura 12c muestra la construcción de vectores
de expresión retrovíricos para la expresión de las cadenas IgH
humanas (etapa preparatoria III). Tras la clonación del promotor de
IgH y de los elementos potenciadores en un vector de transferencia
retrovírico, es necesario insertar a las regiones codificantes para
las cadenas IgH. A fin de ser capaces de expresar la unión a la
membrana, así como las formas segregadas de inmunoglobulinas, es
necesario incluir exones para las regiones que se extienden sobre la
membrana de las cadenas de IgH en los vectores de expresión
retrovíricos. Las regiones de extensión sobre la membrana difieren
significativamente entre diferentes isotipos tanto en longitud como
en secuencia primaria y en estructura de exón/intrón. Por lo tanto,
es necesario clonar las diferentes regiones que se extienden sobre
la membrana para las cadenas pesadas de IgM, IgG, IgA e IgE. Como un
ejemplo, se representa la clonación mediante PCR y la inserción de
las cuatro regiones respectivas diferentes que se extienden sobre la
membrana, en el plásmido pAB-3. Se pueden realizar
los mismos procedimientos de clonación con los vectores
pAB-4 y pAB5, que contienen versiones extendidas de
3'\alphaE de IgH. Se resaltan las enzimas de restricción
incorporadas en los términos de los fragmentos de PCR genómicos, así
como los sitios de enzimas de restricción compatibles en la
estructura plasmídica, que se pueden usar en las diversas etapas de
clonación.
La Figura 12d ilustra la construcción de vectores
de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas IgH humanas
(etapa preparatoria IV). Los linfocitos B humanos son capaces de
producir cuatro isotipos de IgG diferentes, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4,
que difieren ligeramente en la secuencia y que muestran diferentes
funciones efectoras fisiológicas. Se representa aquí la clonación de
los genes de región constante en un vector intermedio
pAB-3.2, que ya contiene los exones de IgG que se
extienden sobre la membrana. Se indica la organización de los
exones/intrones endógenos, incluyendo los exones que codifican las
regiones bisagra (H) para los diversos isotipos de IgG. Se indican
las enzimas de restricción incorporadas en los términos de
fragmentos de PCR genómicos, así como los sitios de enzimas de
restricción compatibles únicos en la estructura plasmídica, que se
pueden usar en las diversas etapas de clonación. Con la clonación de
un exón de dominio variable reordenado VDJ, estos constructos con
capaces de expresar cadenas de IgG completas (véase la Fig. 15).
La Figura 12e muestra la construcción de vectores
de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas IgH humanas
(etapa preparatoria V). Se representa aquí la clonación de genes de
región constante para los restantes isotipos de Ig humanos, IgM,
IgA1, IgA2 e IgE. De forma similar al procedimiento de clonación
para genes de región constante de IgG, representado en la Fig. 12d,
las regiones genómicas para estos isotipos se insertan como
fragmentos de PCR digeridos con NotI en sitios de restricción únicos
de NotI en dirección 5' de los exones respectivos que se extienden
sobre la membrana para estos isotipos. Se indica la organización de
exones/intrones endógenos, incluyendo los exones que codifican las
regiones bisagra (H) para los diversos isotipos de Ig. Se indican
las enzimas de restricción incorporadas en los términos de los
fragmentos de PCR genómicos, así como los sitios de enzimas de
restricción compatibles únicos en la estructura plasmídica, que se
pueden usar en las diversas etapas de clonación. Con la clonación de
un exón de dominio variable reordenado VDJ, estos constructos son
capaces de expresar cadenas de IgH completas del isotipo respectivo
(véase la Fig. 15).
La Figura 13a muestra la construcción de vectores
de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas de
Ig\kappaL humanas (etapa preparatoria I). De forma similar a la
construcción de vectores de expresión retrovíricos para cadenas IgH,
los vectores de expresión para cadenas Ig\kappaL requieren el
promotor específico del locus de cadena \kappaL y los elementos
potenciadores además de las regiones codificantes para las proteínas
de cadena \kappaL, que necesitan ser clonadas secuencialmente en
un vector de transferencia retrovírico. Partiendo del vector
retrovírico básico pLIB, primeramente se clona un promotor V\kappa
en pLIB, según se indica. A esto le sigue la inserción de un
producto de PCR que contiene el potenciador del intrón \kappa
humano (\kappaiE, con su región asociada a matriz en dirección 5',
MAR) y el gen de región constante de cadena \kappaL humana (lado
izquierdo del dibujo), o, como alternativa, la inserción de un
fragmento de PCR de fusión del \kappaiE de ratón con el gen de
región constante de cadena \kappaL humana (lado derecho del
dibujo), que se genera mediante una PCR única de extensión de
solapamiento (SOE). En ambos constructos, se inserta un producto de
PCR que contiene el potenciador \kappa3' murino (\kappa3'E). Se
indican las enzimas de restricción incorporadas en los términos de
los diversos fragmentos de PCR genómicos, así como los sitios de
enzimas de restricción compatibles únicos en la estructura
plasmídica, que se pueden usar en las diversas etapas de
clonación.
La Figura 13b ilustra la construcción de vectores
de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas de
Ig\kappaL humanas (etapa preparatoria II). Los constructos de
expresión retrovíricos para cadenas IgH e Ig\kappaL humanas se
transducirán secuencialmente en células preB, y por lo tanto es
deseable ser capaz de seleccionar células transducidas de forma
estable después de la primera vuelta de la transducción con vectores
que expresan la cadena de Ig\kappaL. Por esta razón, se inserta un
promotor SV40 accionado por el casete de expresión de puromicina en
los dos posibles intermedios vectoriales de transferencia
retrovíricos de cadena Ig\kappaL pAB-7.1 y
pAB-8.1, según se indica. Con la clonación de un
exón de dominio variable reordenado V\kappaJ\kappa en estos
vectores, estos constructos retrovíricos son capaces de expresar
cadenas de Ig\kappaL humanas (véase la Fig. 15).
La Figura 14a muestra la construcción de vectores
de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas Ig\lambdaL
humanas (etapa preparatoria I). Los constructos de expresión
retrovíricos para las cadenas Ig\lambdaL humanas se clonan
insertando primeramente un producto de PCR de fusión de un casete de
puromicina y un promotor V\lambda en pLIB (la fusión mediante PCR
se realiza mediante PCR de extensión por solapamiento única (SOE)
como se describe en la sección de ejemplos). En la siguiente etapa,
se inserta en el constructo, según se indica, un constructo de
fusión SOE-PCR de dos elementos potenciadores de
cadena \lambdaL murina, el potenciador
\lambda2-4 y \lambda3-1.
Finalmente, la región codificante de la región C\lambda1 humana se
inserta mediante clonación por PCR en este vector de clonación
retrovírico usando las enzimas de restricción indicadas. Con la
clonación de un exón de dominio variable reordenado
V\lambdaJ\lambda en estos vectores, estos constructos
retrovíricos son capaces de expresar cadenas de Ig\lambdaL humanas
(véase Fig. 15).
La Figura 14b ilustra la construcción de vectores
de expresión retrovíricos para la expresión de cadenas Ig\lambdaL
humanas (etapa preparatoria II). Se pueden usar otros genes de
región constante de cadena Ig\lambdaL humana para sustituir a la
región codificante C\lambda1 mediante clonación simple usando las
enzimas de restricción únicas MluI-NotI, según se
indica. Con la clonación de los exones de dominio variable
reordenados V\lambdaJ\lambda en estos vectores, estos
constructos retrovíricos son capaces de expresar los diferentes
isotipos de cadena Ig\lambdaL humana, según se indica (véase la
Fig. 15).
La Figura 15a muestra la inserción de genes de
región V en vectores de expresión de cadena IgH, Ig\kappaL e
Ig\lambdaL humana. Todos los constructos de expresión retrovíricos
para las cadenas IgH y L humanas que se han descrito hasta ahora no
contienen regiones codificantes para los dominios variables. Estos
se pueden aislar mediante clonación por PCR a partir de diversas
fuentes (véase, por ejemplo, la Fig. 9), y se pueden insertar en los
vectores retrovíricos como exones de región V que codifican una
especificidad individual, o como librerías que codifican
especificidades diferentes (que necesitan ser amplificadas mediante
PCR con pares de cebadores degenerados). Las regiones V se
amplifican mediante PCR junto con sus secuencias líder (L)
características, según se indica. Se indican las enzimas de
restricción que se pueden usar para la clonación de exones de región
variable. Este dibujo representa algunos vectores de expresión de
cadena IgH e IgL retrovíricos finales seleccionados. Debido al
diseño modular de estos vectores, se pueden usar diferentes regiones
codificantes y promotores y elementos potenciadores.
Afinidad: La fuerza de unión de un
receptor de antígeno (o de cualquier receptor) por su antígeno
conocido (o su ligando o pareja de unión), determinada mediante la
relación de velocidad de asociación a velocidad de disociación de la
interacción receptor-ligando.
Maduración de afinidad: Un proceso
inmunológico muy regulado de un antígeno llevado a cabo por la
mejora de las especificidades de unión de los anticuerpos producidos
por linfocitos B estimulados por antígenos en centros germinales. El
proceso está provocado por hipermutación somática en las regiones
codificantes para los dominios variables de anticuerpos acoplados
con la expansión selectiva y supervivencia de linfocitos B que
generan anticuerpos de mayor afinidad.
Anticuerpo: Un polipéptido glicosilado
producido por linfocitos B y células del plasma que comprende en su
forma monómera dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas
ligeras idénticas, estando cada una compuesta de un dominio variable
y uno (cadenas L) o varios (cadenas H) dominios de región constante.
Las dos cadenas H y las dos cadenas L se ensamblan en una molécula
de anticuerpo enlazada mediante disulfuros, con forma de Y
geométrica, que tiene dos dominios de unión formados por la
combinación de las regiones variables de las cadenas H y L.
Antígeno: Cualquier biomolécula o entidad
química que se puede unir a través de los dominios variables de las
inmunoglobulinas (o anticuerpos).
Receptor del antígeno: Los receptores de
antígenos están compuestos de dominios variables y regiones
constantes, teniendo los primeros la capacidad de unirse a los
antígenos, y las últimas la capacidad para mediar funciones
efectoras o transducir señales en células. Los receptores de
antígenos comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas
unidas a la membrana.
Proteína de unión artificial: Una proteína
de unión que contiene secuencias polipeptídicas (por ejemplo,
secuencias espaciadoras sintéticas) que no derivan de genes
naturales o de sus fragmentos.
Proteína de unión: El término más general
para cualquier tipo de polipéptido con la capacidad para unirse
selectivamente a un antígeno o ligando, con o sin funciones
efectoras adicionales. Las proteínas de unión incluyen proteínas de
unión artificiales, fragmentos de anticuerpos como, por ejemplo, un
fragmento variable de cadena única (scFv), y también productos de
fusión que combinan dominios de región variable y de región
constante de inmunoglobulinas y receptores de células T, o
viceversa. Además, una proteína de unión puede ser el producto de
fusión de dominios variables con partes funcionales de otras
moléculas receptoras. Inversamente, una proteína de unión puede ser
la fusión de un resto de unión procedente de un receptor relacionado
con TCR o no Ig, con dominios de región constante de receptores de
antígenos.
Que actúan en cis : Que tienen una
influencia sólo en elementos genéticos y en los locus génicos en la
proximidad o en el mismo alelo.
Región codificante: Un elemento genético
que tiene un marco de lectura abierta que se puede expresar en un
polipéptido.
Regiones que determinan la complementariedad
(CDR): Las regiones en la estructura tridimensional de un
dominio de receptor de antígeno variable que establece directamente
contacto con los antígenos. Las CDR son habitualmente las partes más
diversas de los receptores de antígenos.
Dominio: Un resto estructural de una
biomolécula que se caracteriza por una estructura tridimensional
particular (por ejemplo, los dominios de región variable o constante
de inmunoglobulinas, que están estructuralmente relacionados, tales
como los dominios de tipo Ig que se pueden encontrar en muchas
moléculas del sistema inmunitario, que pertenecen a la denominada
superfamilia de Ig).
Funciones efectoras: Funciones de regiones
constantes de inmunoglobulinas en el contexto del sistema
inmunitario, por ejemplo la capacidad para activar el complemento, o
para activar ciertas células inmunitarias mediante la unión a
receptores específicos para la región constante (receptores
F_{c}).
Endógeno: Propio de cierta célula u
organismo.
Potenciador: Un elemento genético que
puede estimular la actividad de elementos promotores a largas
distancias, independientemente de la orientación o de la
posición.
Epítopo: Una entidad estructural
tridimensional de un antígeno que es reconocida por una región de
unión variable de un anticuerpo.
Fragmento funcional (de un anticuerpo,
receptor de antígeno o de proteína de unión): Un fragmento
funcional derivable de un polipéptido dado seleccionado del grupo
que consta de anticuerpos, receptores de antígenos y proteínas de
unión, que comparte al menos una de las propiedades deseadas
inherentes a dicho polipéptido con respecto al campo específico de
aplicación. Por ejemplo, un fragmento funcional puede ser un
polipéptido u oligopéptido que mantiene la capacidad de dicho
polipéptido para unirse a ciertos antígenos y/o ligandos. Lo mismo
se aplica a los fragmentos que median funciones efectoras
específicas características para dicho polipéptido. Un ejemplo
adicional se refiere a fragmentos que son capaces de activar o
inhibir funciones efectoras inmunógenas y/o fisiológicas específicas
de anticuerpos, receptores de antígenos y de sistema
receptor-ligando regulares.
\newpage
Elementos genéticos: Genes, locus génicos,
o fragmentos de los mismos, como promotores, potenciadores y
regiones codificantes, solos o en cualquier combinación funcional o
no funcional.
Centro germinal: Una estructura
histológica distinta en órganos linfoides periféricos (por ejemplo,
nódulos linfáticos o bazo) en las que se producen las interacciones
conocidas entre las células que presentan antígenos y las diferentes
poblaciones linfocíticas, dando como resultado la expansión
proliferativa de linfocitos reactivos a antígenos, así como la
maduración de afinidad y la recombinación por cambio de clase de
anticuerpos producidos mediante linfocitos B reactivos a
antígenos.
Configuración de línea germinal: La
configuración nativa de genes y de los locus génicos, tal como se
heredan de los progenitores, y tal como se pasarán a las siguientes
generaciones a través de la línea germinal. Los sucesos de
recombinación de ADN que suceden en células somáticas, como por
ejemplo la recombinación V(D)J en linfocitos, conduce
al rebarajado o pérdida de información genética en ciertos locus
génicos y por lo tanto a un cambio de los genes de la configuración
de línea germinal.
Heterólogo: Diferente de endógeno.
Anticuerpo humanizado: Un anticuerpo
artificial generado fusionando los dominios variables de anticuerpos
no humanos a dominios de región constante humanos.
Hibridoma: Una estirpe celular inmortal
que se ha generado mediante la fusión de una estirpe celular de
mieloma inmortal (incapaz de segregar anticuerpo) y una célula
plasmática mortal (que puede segregar grandes cantidades de
anticuerpos).
Idiotipo: La característica de unión
(especificidad) de un receptor de antígeno.
Isotipo: La característica estructural
conferida por la región constante de un receptor de antígeno que
determina sus funciones (efectoras).
Inmunoglobulina (Ig): Sinónimo de
anticuerpo.
Minilocus inmunoglobulínico: Un constructo
genético artificial que comprende unos pocos (es decir, un único
dígito) de segmentos génicos V, D y/o J, capaces de sufrir la
recombinación V(D)J, generando de ese modo un
repertorio oligoclonal limitado de regiones codificantes
variables.
Librería: Una colección de elementos
genéticos diferentes.
Anticuerpo monoclonal: Anticuerpo con una
especificidad definida determinada por la estructura única de la
región de unión a antígeno variable del anticuerpo.
Célula de mieloma: Una célula inmortal
derivada de una célula en la etapa de diferenciación de células del
plasma sin la capacidad para expresar proteínas inmunoglobulínicas
endógenas.
Anticuerpos policlonales: Una mezcla de
anticuerpos que tienen estructuras diferentes de las regiones
variables de unión a antígeno y, por lo tanto, lo más probable
diferentes especificidades de unión.
Linfocito preB: Un linfocito B precursor
se caracteriza por la expresión de factores específicos linfoides
implicados en la recombinación V(D)J (por ejemplo,
RAG-1, RAG-2), que habitualmente ha
iniciado la recombinación V(D)J en al menos un alelo
de cadena pesada inmunoglobulínica, pero que aún tiene los locus
génicos de cadena ligera en la configuración de línea germinal, y
por lo tanto no expresa anticuerpos completos.
Órganos linfoides primarios: Órganos en
los que los linfocitos se desarrollan a partir de hemocitoblastos en
ratones y en seres humanos, por ejemplo la médula ósea, el timo, y,
durante la vida fetal, el hígado.
Repertorio: Una colección de
especificidades (unión) diferentes.
Hipermutación somática: Un proceso en
células somáticas que da como resultado la introducción de puntos de
mutaciones en regiones específicas del genoma a una frecuencia
elevada (>10^{-4} mutaciones por par de base por división
celular).
Células estrómicas: Células adherentes
proliferativas derivadas de la médula ósea con la capacidad para
apoyar la proliferación de células preB en presencia de un factor o
factores de crecimiento adicionales de célula preB.
Que actúan en trans : Que tienen una
influencia sobre elementos genéticos y sobre los locus génicos
localizados en diferentes cromosomas.
\vskip1.000000\baselineskip
Transfección: El proceso de introducir
secuencias de ácido nucleico en células eucariotas, habitualmente
asociado con el uso de métodos químicos y físicos.
Transformación: El proceso de inmortalizar
una célula para el establecimiento de una línea celular
proliferativa de forma continua.
Transgén: Un elemento genético artificial
introducido en la línea germinal de los animales. Por lo tanto, el
transgén se hereda de una generación a la otra.
Transducción: El proceso de suministrar
ADN a células de mamíferos vía la producción de virus recombinantes.
Para esto, se transfecta una línea celular de empaquetamiento, que
expresa proteínas estructurales para partículas víricas, con un
constructo de ADN vírico recombinante que comprende los elementos
reguladores para empaquetar el constructo de ADN vírico en las
proteínas estructurales víricas. Por medio de esto, se producen
virus recombinantes que se pueden usar para infectar células diana
de mamíferos lo que conduce a la introducción de la información
genética clonada en el genoma vírico recombinante.
Recombinación V(D)J: Un
proceso de recombinación de ADN durante el cual uno de muchos
segmentos génicos V (variable), algunas veces D (diversidad) y J (de
unión) se ensamblan a una región codificante para los dominios
variables de receptores de antígenos.
Vector: Un constructo de ácido nucleico
generado artificialmente que se puede usar para transportar
elementos de ácidos nucleicos entre diferentes organismos y
especies, y que se puede usar además para propagar, amplificar y
mantener información genómica.
Xenogénico: Que deriva de una especie
diferente (a menudo usado como sinónimo de heterólogo).
Todas las referencias citadas en esta memoria
descriptiva se incorporan aquí con ella.
Según un primer aspecto, la presente invención
proporciona un método para la generación de linfocitos de
vertebrados que se pueden usar para la producción de cualquier
proteína de unión o de un fragmento o fragmentos funcionales de la
misma, con la capacidad de unirse selectivamente a un antígeno o
ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier
receptor de antígeno compuesto de dominios variables y regiones
constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas
unidas a la membrana, cualquier proteína de unión artificial que
muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones
efectoras modificadas o artificiales no derivables de receptores de
antígenos o inmunoglobulinas heterólogas codificadas por la línea
germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los
mismos, que comprende las etapas de:
- (a)
- modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, que
- (i)
- derivan de órganos linfoides primarios, y
- (ii)
- tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura, mediante la introducción de al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, y
- (b)
- efectuar la diferenciación de dichos linfocitos precursores genéticamente modificados en células de línea linfoide madura tanto in vitro como in vivo, generando de ese modo linfocitos capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, con la condición de que se excluya la producción in vivo en seres humanos.
A fin de lograr la producción a gran escala de
las proteínas de unión anteriores, o de los fragmentos funcionales
de la misma, se prefiere que los linfocitos terminalmente
diferenciados que produce los polipéptidos de interés estén
inmortalizados, o, como alternativa, que la información genética que
codifica los anticuerpos heterólogos o proteínas de unión se aísle y
se transfiera desde estas células a diferentes sistemas de
expresión, con lo que dicha información genética se puede mantener,
amplificar y/o usar para la producción de las inmunoglobulinas
respectivas o proteínas de tipo inmunoglobulínicas o de fragmentos
funcionales de los mismos.
La inmortalización de dichos linfocitos se puede
lograr preferiblemente:
- (a)
- fusionando a los mismos para inmortalizar células de mieloma para la generación de células de hibridoma;
- (b)
- infectando a los mismos con virus transformantes como, por ejemplo, el virus de leucemia murina de Abelson (A-MuLV); o
- (c)
- transfectando a los mismos con un constructo vectorial apropiado que asegure la expresión de al menos un oncogén transformante como, por ejemplo, v-abl, o el antígeno T grande de SV40, que, con la sobreexpresión, conduce a la inmortalización de células transfectadas de forma estable;
generando de ese modo linfocitos de
vertebrados capaces de producir permanentemente dicha proteína de
unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la
misma.
En una realización preferida, los linfocitos
precursores de vertebrados son capaces de expresar al menos un
componente de la maquinaria de recombinación V(D)J
linfoide y de originarse a partir de vertebrados con mandíbulas que
comprenden peces cartilaginosos, peces óseos, anfibios, reptiles,
pájaros, mamíferos que incluyen a cerdos, ovejas, vacuno, caballos y
roedores que incluyen a ratones, ratas, conejos y cobayas, siendo
preferidos los linfocitos (pre) B precursores murinos procedentes de
ratones.
Los linfocitos B precursores primarios en todas
las especies de vertebrados mandibulares, desde el ser humano hasta
el pez cartilaginoso evolutivamente más primitivo, no se
caracterizan solamente por la expresión de un conjunto específico de
marcadores de superficie celular (como la combinación de B220 y
c-kit en ratones), sino también por su potencial
para ensamblar los segmentos génicos que codifican los dominios
variables de anticuerpos para los cuales expresan los componentes
específicos linfoides de la maquinaria de recombinación
V(D)J, como RAG-1,
RAG-2 y TdT (desoxinucleotidiltransferasa terminal).
Aunque algunas especies, como los pájaros, tienen órganos linfoides
primarios diferentes (por ejemplo, la bolsa de Fabricio) en los que
se generan estos linfocitos B precursores, y a pesar del hecho de
que, además de la recombinación V(D)J, otras especies
también usen mecanismos diferentes para la diversificación de
anticuerpos, como la hipermutación somática (por ejemplo, la oveja)
o la conversión génica (por ejemplo, los conejos), los linfocitos B
precursores de todas las especies de vertebrados son capaces de
sufrir la recombinación V(D)J, y tienen el potencial
para diferenciarse en células de línea B más maduras, de forma que
se pueden expresar anticuerpos generados a partir de locus génicos
de inmunoglobulinas reordenados VDJ. Por lo tanto, si tales
linfocitos B precursores de vertebrados se aíslan o se generan y son
capaces de expresar anticuerpos endógenos, y si los elementos
genéticos que codifican todos o parte de los locus génicos
inmunoglobulínicos heterólogos se introducen establemente en estos
linfocitos, ganarán el potencial para producir anticuerpos
heterólogos y de este modo están englobados en la presente
invención.
El método según la invención hace uso de
linfocitos precursores B (preB) de vertebrados presentes en órganos
linfoides primarios. En el caso de ratones, estas células se pueden
aislar de hígado fetal o de la médula ósea de adultos, por ejemplo
mediante clasificación celular preparativa usando anticuerpos
marcados convenientemente, uniéndolos por ejemplo a los marcadores
de superficie celular B220 y c-kit en células preB
de ratón; como alternativa, se pueden hacer crecer selectivamente a
partir de suspensiones de células de la médula ósea o de hepatocitos
fetales murinos debido a su fuerte respuesta proliferativa tanto a
células alimentadoras (estrómicas) de la médula ósea como a factores
de crecimiento tales como interleuquina-7 e
interleuquina-3.
En términos de expresión de componentes linfoides
de la maquinaria de recombinación V(D)J, el potencial
para diferenciarse en células de línea linfoide madura y el
mecanismo genético para la diversificación de proteínas de
receptores de antígenos, los linfocitos de línea T son muy similares
a los linfocitos de línea B. Por lo tanto, se entenderá que los
métodos descritos aquí para la modificación genética de linfocitos
de precursores B, con el fin de producir anticuerpos o proteínas de
unión heterólogas, se puede aplicar igualmente a linfocitos de
precursores T. Por lo tanto, los presentes métodos descritos
principalmente con respecto al sistema de linfocitos preB murinos
también se pueden aplicar a todos los linfocitos precursores de
vertebrados procedentes de todos los vertebrados mandibulares como
se establece anteriormente. Se entenderá que el uso de cualquier
otro sistema linfocítico precursor para llevar a cabo los principios
de la presente invención sólo depende de la factibilidad para evitar
tanto la expresión de anticuerpos endógenos como para introducir
elementos genéticos heterólogos en estas células que codifican
anticuerpos o proteínas de unión heterólogas. Puesto que la
aplicabilidad general de estos principios será apreciada por los
expertos en la técnica, el concepto general subyacente en la
presente invención se describe principalmente con respecto al uso de
linfocitos de precursores B (preB) murinos.
En el ratón, el desarrollo a partir de
hemocitoblastos hasta células de plasma que segregan anticuerpos es
un proceso muy regulado, y, in vivo, depende del
reordenamiento ordenado de los segmentos génicos en los locus
génicos de receptores inmunoglobulínicos y la expresión regulada de
proteínas inmunoglobulínicas a partir de locus génicos de Ig
productivamente reordenados (Fig. 2). Habitualmente, los
reordenamientos ocurren primero en ambos alelos de los locus génicos
de cadena IgH, reordenándose primero los segmentos génicos D a
J_{H}, seguido de los reordenamientos génicos V_{H} a DJ_{H}
(Fig. 2). Si en un alelo ha ocurrido un reordenamiento
V_{H}DJ_{H} productivo, la cadena \muH se puede expresar sobre
la superficie celular como un receptor de células preB emparejado
con la cadena L sustituta (codificada por los genes \lambda_{5}
y V_{preB} específicos de células preB) (Karasuyama et al.,
Adv. Immunol., 63, 1-41, 1996). La
expresión de un receptor de células preB permite la diferenciación
de células preB hasta una etapa en la que se inician los
reordenamientos V_{L} hasta J_{L}, lo que ocurre habitualmente
primero en los alelos de cadena \kappaL y más tarde en los alelos
de cadena \lambdaL (Melchers et al., Ann. Rev.
Immunol., 12, p. 209-225, 1994). Si ha
ocurrido un reordenamiento de cadena IgL productivo, los anticuerpos
IgM unidos a membrana y/o IgD se pueden expresar mediante las
denominadas células B inmaduras. La estimulación de células B
maduras positivas a IgM/IgD, periféricas, con las señales
apropiadas, puede conducir a la recombinación de cambio de clase en
los alelos de cadena IgH que cambia el isotipo de los anticuerpos
expresados a cualquiera de los subtipos IgG, IgA, IgE (en ratones:
IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE, en seres humanos: IgG1, IgG2,
IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE) (Fig. 1).
Como ya se ha señalado anteriormente, las células
preB murinas adecuadas para llevar a cabo la invención se
caracterizan por llevar a cabo la expresión de los marcadores de
superficie B220 y c-kit, la expresión de al menos
uno de los genes de recombinación V(D)J linfoides
RAG-1 y RAG-2, y por la capacidad de
proliferar durante períodos de tiempo más prolongados en respuesta a
células estrómicas y/o IL7 o IL3 (Rolink et al., EMBO
J., 10, P. 327-336; 1991; Winkler et
al., Blood, 85, p. 2045-2051,
1995). Si se establecen líneas celulares preB y clones a partir de
ratones de tipo salvaje, habitualmente tienen reordenamientos
DJ_{H} tanto en los alelos de cadena IgH (Alt et al.,
EMBO J., 3, p. 1209-1219, 1984), o en
algunos casos reordenamientos V_{H}DJ_{H} no productivos (Fig.
2). Sin embargo, los reordenamientos de sus alelos de cadena IgH no
se requieren para establecer células de respuesta a células
estrómicas, a IL7 o a IL3 a partir de ratones con un fenotipo de
célula preB, puesto que estas células también se pueden establecer a
partir de razas de ratones mutantes que son deficientes en
recombinación V(D)J (Grawunder et al.,
International Immunology, 7, p.
1915-25, 1995). En cualquier circunstancia,
independientemente del potencial para los reordenamientos génicos de
Ig, las células preB retienen el potencial para diferenciarse en
células de línea B más maduras in vitro, y eventualmente en
células de plasma de isotipo cambiado (Rolink et al.,
Immunity, 5, p. 319-330, 1996).
Los clones y líneas celulares preB murinos que
proliferan a largo plazo se pueden establecer a partir de diversos
órganos linfoides de ratones, incluyendo el hígado fetal, sangre
fetal, bazo fetal y médula ósea de adulto, pero también a partir de
otros órganos fetales o de adultos que tienen células preB que
responden a células estrómicas, a IL7 o a IL3. especialmente en los
primeros años de vida (< 4 semanas de edad) (Rolink et
al., Blood, 81, p. 2290-2300,
1993).
Los ratones usados para la generación de las
células preB anteriormente mencionadas pueden ser ratones de tipo
salvaje, ratones quiméricos, ratones transplantados o razas de
ratones que tienen mutaciones que impiden la recombinación
V(D)J en los locus génicos de Ig murinos endógenos.
Las mutaciones mencionadas anteriormente pueden estar en cis,
incluyendo eliminaciones de o dentro de los segmentos génicos de
diversidad (D) de IgH, los segmentos génicos J de IgH (Chen et
al., Int. Immunol., 5, p. 647-656,
1993), la región constante de cadena \muH, incluyendo los dos
exones para el anclaje transmembránico \muH (Kitamura y Rajewsky,
Nature, 356, p. 154-156, 1992), los
segmentos génicos J de Ig\kappa e Ig\lambda, la región constante
de cadena \kappaL (C_{\kappa }) (Chen et al., EMBO
J., 12, p. 821-830, 1993), las regiones
constantes de cadena \lambdaL (C\lambda 1-4) y
los diversos potenciadores de cadena IgH y L, incluyendo el
potenciador de intrón de cadena pesada (E\muH), el potenciador del
intrón \kappa (\kappaiE), el potenciador 3'\kappa
(3'\kappaE), y los dos potenciadores \lambda
(E\lambda2-4 y E\lambda3-1).
Según la invención, las células preB que tienen
cualquiera de las mutaciones que actúan en cis anteriormente
mencionadas se pueden usar para la introducción de elementos
genéticos exógenos que comprenden parte o todos los locus génicos
inmunoglobulínicos especialmente humanos heterólogos en una
configuración no reordenada, es decir línea germinal. Tales células
preB genéticamente modificadas se pueden usar para la producción
de novo de especificidades de anticuerpos, debido a que las
nuevas especificidades sólo se generan con la recombinación
V(D)J en los locus génicos inmunoglobulínicos
genéticos heterólogos.
Como alternativa, las células preB adecuadas
también se pueden generar a partir de ratones incapaces de reordenar
locus génicos inmunoglobulínicos endógenos debido a mutaciones que
actúen en trans, como por ejemplo en genes activantes de
recombinación específica linfoide RAG-1 y
RAG-2 (Mombaerts et al., Cell,
68, p. 869-877, 1992; Shinkai et al.,
Cell, 68, p. 855-867, 1992), o en los
factores de reparación del ADN expresados ubícuamente Ku70, Ku86,
XRCC4, ADN ligasa IV, Artemis o la subunidad catalítica de la
proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs), que
están implicados en la unión del extremo de ADN no homóloga, y que
también se requieren para la recombinación V(D)J. Para
la producción de anticuerpos y proteínas de unión heterólogos en
células preB que tienen tales mutaciones que actúan en trans, se han
de usar constructos de expresión que no requieran los
reordenamientos de ADN de segmentos génicos V, (D) y J (véase más
abajo).
En el caso de mutaciones que actúan en cis
en el ratón, estas necesitan preferiblemente incluir mínimamente (a)
una mutación o mutaciones homocigóticas en los locus génicos de
cadena pesada inmunoglobulínica y de cadena \kappaL
inmunoglobulínica. En el caso de mutaciones que actúan en trans, es
suficiente una de las mutaciones homocigóticas anteriormente
mencionadas, en una estirpe celular preB dada, para impedir la
expresión de inmunoglobulinas endógenas que es un requisito
fundamental del método según la invención.
Los linfocitos precursores B que tienen
modificaciones genéticas que actúan en cis o trans que
interfieren con la expresión de inmunoglobulinas endógenas se pueden
aislar a partir de ratones que tienen mutaciones generadas
naturalmente (por ejemplo, ratones scid) o artificialmente.
Como alternativa, se pueden detectar sistemáticamente linfocitos
preB a partir de ratones de tipo salvaje para mutaciones en sus
alelos inmunoglobulínicos, evitando la expresión de anticuerpos
endógenos, por ejemplo reordenamientos DJ_{H} fuera del marco de
forma terminal en ambos alelos de cadena pesada. Las mutaciones que
cortan la expresión de anticuerpos murinos endógenos se pueden
introducir en hemocitoblastos o en células progenitoras tempranas, a
partir de los cuales se pueden generar células preB que proliferan a
largo plazo adecuadas con la diferenciación in vitro o in
vivo.
Como alternativa, los efectos genéticos citados
aquí anteriormente también se pueden introducir directamente en al
menos un alelo de los linfocitos precursores que se van a someter a
modificación genética. La inactivación de un alelo puede ser
suficiente para llevar a cabo la presente invención, puesto que se
pueden aislar clones mutados, que ya tienen ciertas mutaciones sobre
el otro alelo (mutaciones heterocigóticas), de forma que se
establece un locus génico mutado homocigóticamente dentro de las
células linfocíticas precursoras a usar según la invención.
Aunque se entenderá que la invención se puede
realizar con linfocitos precursores de tipo salvaje, en el método
según la invención se prefiere que dichos linfocitos precursores de
vertebrados estén desprovistos de su potencial para expresar
anticuerpos y/o receptores de antígenos endógenos o un fragmento o
fragmentos funcionales de los mismos, lo que se logra mediante
aislamiento/selección de linfocitos precursores de vertebrados que
son deficientes a la hora de expresar inmunoglobulinas endógenas o
fragmentos de las mismas, y/o introduciendo en dichos linfocitos
precursores de vertebrados al menos un constructo vectorial diseñado
para inactivar funcionalmente al menos un alelo de al menos un
elemento genético, que se selecciona del grupo que consta de:
- (a)
- las regiones codificantes del locus génico de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo todos o parte de los segmentos génicos V, D y J, y cualquiera de las regiones codificantes de los exones de la región constante de las cadenas pesadas \mu, \delta, \gamma, \varepsilon y \alpha, con o sin sus exones que se extienden sobre la membrana;
- (b)
- las regiones codificantes de los locus génicos de las cadenas ligeras \kappa y/o \lambda inmunoglobulínicas, que incluyen cualquiera de las regiones codificantes de segmentos génicos V y J, así como cualquiera de los exones de la región constante;
- (c)
- las regiones codificantes de los locus génicos \alpha, \beta, \gamma y \delta del receptor de células T, incluyendo todos o parte de los segmentos génicos V, D y J, y cualquiera de las regiones codificantes de los exones de la región constante \alpha, \beta, \gamma y \delta;
- (d)
- los elementos potenciadores del locus génico de cadena pesada inmunoglobulínica que actúan en cis, incluyendo el potenciador del intrón de cadena pesada y el potenciador 3'\alpha;
- (e)
- los elementos potenciadores del locus génico de cadena ligera inmunoglobulínica que actúan en cis, incluyendo el potenciador del intrón de cadena ligera \kappa (\kappaiE), el potenciador 3'\kappa, y los potenciadores \lambda2-4 y \lambda3-1;
- (f)
- los elementos potenciadores de los locus génicos del receptor de células T que actúan en cis, incluyendo los potenciadores \alpha, \beta, \gamma y \delta de TCR;
- (g)
- los genes activantes de la recombinación y que actúan en trans, RAG-1 y RAG-2, incluyendo sus elementos promotores y potenciadores, así como sus regiones codificantes; y
- (h)
- los genes de reparación del ADN que actúan en trans esenciales para la recombinación V(D)J, incluyendo Ku70, Ku86, la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs), ADN ligasa IV, XRCC4 y Artemis, incluyendo sus elementos promotores y potenciadores, así como las regiones codificantes de dichos genes.
Preferiblemente, los constructos vectoriales
anteriores incluyen vectores de selección génica que comprenden
regiones de homología de secuencia de ADN con dicho al menos un
elemento genético, que flanquea preferiblemente un marcador de
selección positiva que permite la selección de transfectantes
positivos. Por ejemplo, los vectores de selección adecuados
contienen dos regiones de elevada homología de secuencia (>99%),
o identidad de secuencia por el locus génico seleccionado,
preferiblemente que flanquea un marcador de selección positiva (tal
como un marcador de resistencia a antibiótico), de forma que un
suceso de cruzamiento doble en cada una de las regiones de homología
de secuencia da como resultado la integración seleccionada del
marcador de selección positiva y de este modo en la interrupción
seleccionada de un gen endógeno (Fig. 4a-c). Los
marcadores de selección positivos empleados en estos vectores de
selección pueden incluir casetes de expresión que confieren
resistencia a antibióticos como puromicina, higromicina B, neomicina
(G418), histidinol, ácido micofenólico, zeocina y similar.
Se prefiere que dichos vectores de selección
génica comprendan adicionalmente un par de secuencias de
reconocimiento del ADN para enzimas de recombinación de ADN
específicas de sitio, que flanquean al marcador de selección
positiva, que permiten la eliminación de dicho marcador de selección
positiva con la transfección y la expresión transitoria de
secuencias de ácido nucleico que codifica al menos una de las
enzimas estrechamente relacionadas con las recombinasas. Por
ejemplo, el marcador de selección positiva puede estar flanqueado
por las secuencias loxP o FLP reconocidas por la cre recombinasa o
por enzimas de FLP recombinasa, respectivamente (Kuhn y Schuwenk,
Curr. Opin. Immunol., 9, p. 183-188,
1997), permitiendo la eliminación específica del sitio del casete de
expresión del marcador de selección a partir del genoma de células
preB seleccionadas génicamente mediante transfección transitoria de
vectores de expresión de cre o flp recombinasa (Fig. 6a, b). Este
procedimiento permite el uso repetido de vectores de selección que
usan el mismo marcador de selección positiva.
En una realización preferida, dichos vectores
plasmídicos de selección génica comprenden adicionalmente un
marcador de selección negativa que permite la selección frente a
transfectantes en los que dichos vectores de selección génica se
integran al azar en el genoma mediante recombinación no homóloga.
Por ejemplo, los marcadores de selección negativos adecuados que
seleccionan frente a la integración al azar de constructos de
selección, pueden incluir casetes de expresión para el gen de
timidina quinasa del virus del herpes simple
(HSV-TK), para el gen de la toxina de difteria (DT)
(McCarrick et al., Transgenic Res., 2, p.
183-190, 1993), o para su versión atenuada Dttox176
(Maxwell et al., Mol. Cell. Biol., 7, p.
1576-1579, 1987). Estos marcadores de selección
negativos se sitúan en los constructos de selección, de forma que
una integración seleccionada del constructo de selección
positivo/negativo da como resultado la eliminación del marcador de
selección negativa (Fig. 6a, b). De este modo, solamente la
integración del vector de selección mediante recombinación homóloga
permitirá la supervivencia de las células, y - como consecuencia -
la selección de la selección e interrupción de parte de los locus
génicos endógenos mediante recombinación homóloga.
Se entenderá que se prefiere el uso de linfocitos
precursores de vertebrados carentes de su potencial para expresar
anticuerpos y/o receptores de antígenos endógenos, o fragmentos
funcionales de los mismos. Sin embargo, igualmente se pueden usar
según la invención linfocitos precursores de vertebrados con el
potencial para expresar anticuerpos y/o receptores de antígenos o un
fragmento o fragmentos funcionales de los mismos. Independientemente
de los antecedentes genéticos reales de los linfocitos precursores,
estas células se han sometido a modificación genética a fin de
permitir la producción de anticuerpos o de proteínas de unión
heterólogos. Se entenderá que dicha modificación se realizará
preferiblemente después de que se han identificado las células o
clones diana apropiados mediante selección y/o generación como se
describe anteriormente. Sin embargo, también es posible modificar
genéticamente las células antes de que sean incapaces de expresar
inmunoglobulinas endógenas o partes de las mismas. Además, puede
parecer incluso apropiado efectuar simultáneamente ambas etapas.
En consecuencia, en una realización adicional, se
prefiere que el al menos un elemento genético exógeno que codifica
una proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la
misma, usado para efectuar la modificación genética deseada, sea
portado sobre un constructor genético seleccionado del grupo que
consta de:
- (a)
- constructos de ADN retrovíricos recombinantes que comprenden secuencias promotoras, potenciadoras y de ácidos nucleicos codificantes ligadas operablemente para asegurar la expresión de al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos, o que es artificial;
- (b)
- constructos de ADN recombinantes a base de plásmidos que comprenden secuencias promotoras, potenciadoras y de ácidos nucleicos codificantes ligadas operablemente para asegurar la expresión de al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos, o que es artificial;
- (c)
- locus génicos de receptores de células T o de miniinmunoglobulinas recombinantes a base de plásmidos con segmentos génicos no reordenados V, D y J ligados operablemente para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de células T heterólogo, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;
- (d)
- cromosomas artificiales bacterianos, de levaduras o de vertebrados que comprenden todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos o de receptores de célula T en la configuración de línea germinal ligados operablemente para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de célula T heterólogo, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;
- (e)
- cromosomas artificiales bacterianos, de levaduras o de vertebrados que comprenden todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos o receptores de célula T heterólogos en un ordenamiento modificado diseñado para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo heterólogo o receptor de célula T, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;
- (f)
- elementos transcromosómicos que son fragmentos de cromosomas heterólogos que tienen todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos o de receptores de células T en la configuración de línea germinal que permiten la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo heterólogo o receptor de célula T, que es de tipo salvaje con respecto a la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;
en el que el al menos un elemento
genético exógeno codifica más preferiblemente un anticuerpo humano
nativo o modificado, una proteína de unión humana, un receptor de
antígeno humano, o un fragmento o fragmentos funcionales de los
mismos.
Además, se prefiere que el al menos un elemento
genético exógeno codifique un receptor heterólogo o artificial capaz
de sufrir maduración de afinidad de la región de unión.
Para llevar a cabo la etapa de la modificación
genética, se pueden emplear varios procedimientos diferentes según
la invención, que se ejemplifican en lo sucesivo.
Un primer enfoque se basa en la introducción
estable de constructos de ADN plasmídicos recombinantes que
codifican partes de los locus génicos heterólogos de receptores de
antígenos en configuración no ordenada de línea germinal similar a
lo que se ha logrado tempranamente en el contexto de ratones
transgénicos. Estos locus génicos heterólogos de receptores de
antígenos pueden incluir segmentos génicos V, D y J de los locus
génicos de cadena H, \kappaL y \lambdaL inmunoglobulínicos, así
como segmentos génicos procedentes de cualquier locus génico
\alpha, \beta, \gamma o \delta del receptor de células T
(TCR).
Un segundo enfoque se refiere a la integración
estable de los locus génicos heterólogos de tamaño de megabases de
receptores de antígenos, que incluyen todos o partes de los locus
génicos inmunoglobulínicos y/o de TCR en configuración de línea
germinal, no ordenada, como fragmentos transcromosómicos, o clonados
en cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas
artificiales de levadura (YAC), o cromosomas artificiales de
vertebrados (VAC), que también se han realizado en el contexto de
ratones transgénicos (Green et al., Nat. Genet.,
7, p. 13-21, 1994; Tomizuka et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, p.
722-727, 2000).
Los elementos genéticos de ambos enfoques se han
de integrar establemente en células preB que tienen mutaciones que
actúan en cis en sus locus génicos de Ig murinos endógenos,
que sólo intervienen con el reordenamiento de los locus génicos de
Ig endógeno, pero que aún permite la generación de diversos
repertorios de anticuerpos a partir de locus génicos heterólogos no
reordenados y/o de línea germinal de receptores de antígenos. La
construcción de constructos de ADN que codifican los locus génicos
de Ig humanos reside en el conocimiento de la organización de todos
los locus génicos de Ig humanos y su secuencia de ADN casi
completamente publicada como resultado del proyecto de genoma
humano. Por ejemplo, el locus génico de cadena IgH humana está
localizado en el cromosoma 14q32.33 dentro de un intervalo de 1,25
Mpb. Contiene 123-129 (dependiendo de la variación
alélica) segmentos génicos V_{H} (41-47 de estos
funcionales), 27 segmentos génicos D y 6 segmentos génicos J_{H}
en dirección 5' del racimo génico de región constante. El locus
génico de cadena Ig\kappaL humana está localizado en el cromosoma
2p12, comprende 1,82 Mpb, y contiene 40 ó 76 (dependiendo del alelo)
segmentos génicos V\kappa (de los cuales 34 ó 64, respectivamente,
son funcionales), y 5 segmentos génicos J\kappa en dirección 5' de
una única región C\kappa. El locus de cadena Ig\lambdaL humana
está localizado en el cromosoma 22q11.2, se extiende 1,05 Mpb, y
contiene 70 ó 71 segmentos génicos V\lambda (31 ó 32 funcionales)
en dirección 5' de 7 a 11 segmentos génicos
J\lambda-C\lambda repetidos por tándems.
Los constructos de ADN que tienen una parte o
partes o todos los locus génicos inmunoglobulínicos o de receptores
de células T heterólogos de línea germinal que están presentes en
fragmentos transcromosómicos, o que se pueden clonar en constructos
vectoriales BAC, YAC o VAC, se pueden transferir establemente en
células preB diana que proliferan a largo plazo, usando
procedimientos de transferencia génica estándares, incluyendo por
ejemplo la electroporación, la transfección con fosfato de calcio o
DEAE-dextrano, la transferencia mediada por
liposoma, la fusión de protoplastos esféricos, la transferencia
balística, la microinyección, o la formación de
proteína-aducto específicos, o una combinación de
los mismos. Los transfectantes estables se pueden seleccionar en
virtud de marcadores de selección (de fármacos) apropiados incluidos
en la estructura vectorial de YAC, BAC y VAC, que comprenden genes
que confieren resistencia, por ejemplo, a puromicina, higromicina B,
neomicina (G418), histidinol, ácido micofenólico, zeocina y
similares.
Se puede usar un tercer enfoque conceptualmente
diferente para introducir elementos genéticos heterólogos que
codifican anticuerpos y proteínas de unión heterólogos,
preferiblemente humanos. Según este método alternativo, los
elementos genéticos heterólogos se transfieren establemente en
células preB murinas usando transducción retrovírica que se ha
descrito en el contexto de la terapia génica para enfermedades
heredadas usando hemocitoblastos como células diana (véase An Dong
Sung et al., J. Virol. 75(8),
3547-3555 (2001)). Los vectores de transferencia
retrovíricos sólo pueden acomodar 7-10 kb de ADN
extraño, lo que facilita significativamente la clonación de vectores
de expresión para anticuerpos y proteínas de unión heterólogas,
preferiblemente humanas. Por lo tanto, todas las propiedades de
anticuerpos y proteínas de unión heterólogos se pueden modificar
fácil y rápidamente mediante técnicas estándares de biología
molecular usando vectores de transferencia retrovíricos. Por el
contrario, la introducción de modificaciones en el contexto de un
sistema de ratón transgénico para la expresión de anticuerpos
heterólogos es un proceso muy tedioso y que consume tiempo, y por lo
tanto es prácticamente imposible. El uso de ratones transgénicos
para cambiar las funciones de anticuerpos heterólogos codificados
por transgenes requeriría la generación de varias razas de ratones
transgénicos nuevas, incluyendo su crianza en un antecedente
genético inmunodeficiente.
Los vectores de transferencia retrovíricos
recombinantes que codifican anticuerpos o proteínas de unión
heterólogos se pueden producir como clones que expresan
especificidades de unión monoclonales, o se pueden generar en forma
de librerías que codifican especificidades de unión policlonales.
Debido a que estos vectores retrovíricos no son suficientemente
grandes para incorporar regiones significativas de los locus génicos
de receptores de antígenos de línea germinal, las regiones
codificantes heterólogas necesitan contener ya segmentos génicos
reordenados V(D)J que codifican dominios variables en
combinación con regiones codificantes para las regiones constantes
de anticuerpos y proteínas de unión heterólogos. La expresión de
clones o librerías de vectores de expresión retrovíricos para
anticuerpos o proteínas de unión heterólogos no requiere por lo
tanto una maquinaria celular funcional para la recombinación
V(D)J, y por lo tanto se puede usar en conjunción con
linfocitos preB que tienen mutaciones que actúan en cis y/o
en trans que eliminan la expresión génica de inmunoglobulinas
endógenas, como ya se ha descrito anteriormente aquí.
Los vectores de expresión retrovíricos para
conferir la expresión de anticuerpos o proteínas de unión
heterólogos a células preB murinas se transfectan primeramente en
líneas celulares de empaquetamiento retrovíricas, de las que hay
disponibles comercialmente una amplia variedad que tienen la
capacidad de producir retrovirus recombinantes con un espectro
ecotrópico, anfotrópico o pantrópico de infectabilidad. Tales líneas
celulares de empaquetamiento se transfectan establemente con
constructos de expresión para los genes gag, pol y env
retrovíricos. La transfección de células de empaquetamiento
retrovíricas con vectores plasmídicos retrovíricos recombinantes que
codifican anticuerpos o proteínas de unión heterólogos dará como
resultado entonces la formación de retrovirus recombinantes capaces
de infectar células preB y de transducir de forma estable la
información genética heteróloga en líneas y clones de células preB
(Fig. 8). Los vectores de expresión retrovíricos usados en estos
métodos se construyen a partir de un vector de transferencia
retrovírico vacío comercialmente disponible que contiene los
elementos retrovíricos mínimamente requeridos, que incluyen una
5'-LTR, una señal de empaquetamiento Psi y una
3'-LTR (Fig. 11a).
Los vectores retrovíricos finales para la
expresión de anticuerpos o proteínas de unión heterólogos pueden
contener cualquiera de los siguientes elementos genéticos, ligados
operablemente de manera que se asegure la expresión de anticuerpos y
proteínas de unión heterólogos en células de línea B, seleccionados
de:
- (a)
- elementos promotores, incluyendo promotores constitutivos, como por ejemplo promotores CMV (citomegalovirus), SV40 (virus de simio 40), \beta-actina o PGK (fosfogliceratoquinasa), o promotores específicos de la línea B, como por ejemplo el promotor CD19 o los promotores génicos de cadena IgH e IgL;
- (b)
- exones de región variable (V) procedentes de cualquier locus génico de receptor de antígeno, incluyendo locus génicos inmunoglobulínicos y de TCR;
- (c)
- elementos potenciadores que permiten un nivel elevado y la expresión específica de línea B de anticuerpos o proteínas de unión heterólogos, como por ejemplo elementos potenciadores de los intrones E\muH o \kappaiE;
- (d)
- exones de región constante, incluyendo exones que codifican las formas segregadas y unidas a membrana de anticuerpos y proteínas de unión (Fig. 7a, b); y
- (e)
- cualquiera de los potenciadores génicos inmunoglobulínicos 3' de los locus génicos de cadena pesada y cadena ligera (es decir, los potenciadores 3'\alpha, 3'\kappa o \lambda3-1 y \lambda2-4), que se requieren para la hipermutación somática de los exones codificantes de región variable de los anticuerpos o proteínas de unión heterólogos (Fig. 7a, b).
Además, los casetes de expresión para los
marcadores de selección (de fármacos) apropiados, como por ejemplo
puromicina, higromicina B, neomicina (G418), histidinol, ácido
micofenólico, zeocina, o para genes informadores adecuados, como
EGFP (proteína fluorescente verde potenciada) y sus mutantes YFP
(proteína fluorescente amarilla), CFP (proteína fluorescente
ciánica), y BFP (proteína fluorescente azul), o RFP (proteína
fluorescente roja), pueden ser parte de los vectores retrovíricos
que permiten la selección o el aislamiento de células transducidas
de forma estable, respectivamente (Fig. 7b). La ordenación y la
presencia de estas regiones codificantes y elementos de control
necesitan ser diseñados cuidadosamente a fin de permitir la
expresión diferencial de las formas segregadas o unidas a membranas
de glicoproteínas de Ig heterólogas, así como la maduración de
afinidad accionada por antígenos de los anticuerpos y proteínas de
unión heterólogos en centros germinales in vivo. Si se desea,
los exones de dominio de región constante se pueden intercambiar
entre isotipos, o se pueden introducir mutaciones diseñadas que
afecten a las funciones efectoras de los anticuerpos heterólogos
expresados (Fig. 7a, b). Estos ejemplos no limitantes se mencionan a
fin de ilustrar que este sistema permite la modificación rápida de
simplemente cualquier región de los anticuerpos o proteínas de unión
heterólogos codificados retrovíricamente.
El exón que codifica los dominios variables
dentro de estos vectores retrovíricos recombinantes puede ser
monoclonal para la expresión de una especificidad dada, por ejemplo
de un anticuerpo existente cuya especificidad de unión a antígeno se
pretende modificar mediante maduración de afinidad después del
transplante de células preB establemente transducidas en hospedantes
murinos y la subsiguiente inmunización (Fig. 9). Además, el exón que
codifica los dominios variables puede derivarse a partir de una
librería de diversos reordenamientos V(D)J. Estas
librerías de región V se pueden aislar a partir de linfocitos B
heterólogos, preferiblemente humanos, mediante PCR usando pares de
cebadores degenerados amplificando una multitud de familias génicas
V_{H} diferentes y segmentos génicos J_{H} (Fig. 9). Los
linfocitos B pueden derivar de sujetos que se han inmunizado o no
(repertorio cebado frente a nuevo), o de pacientes que padecen una
enfermedad autoinmunitaria (repertorio autoinmunitario). Además, se
pueden construir librerías completamente sintéticas de dominios de
región V usando el ensamblaje in vitro de fragmentos génicos
específicos de dominio V que presentan secuencias nucleotídicas al
azar en regiones que corresponden a las regiones que determinan la
complementariedad (Fig. 9).
Las combinaciones de constructos retrovíricos
pueden ser transducidas simultánea o secuencialmente en células preB
permitiendo la expresión y secreción de inmunoglobulinas heterólogas
completas y de proteínas de unión dímeras con la diferenciación de
las células preB in vitro o in vivo (Fig. 8).
Las células preB de vertebrados, que se han
modificado genéticamente mediante cualquiera de los métodos
mencionados anteriormente, de forma que han ganado el potencial para
expresar anticuerpos o proteínas de unión heterólogos, necesitan ser
diferenciadas en células de línea B maduras y eventualmente en
células del plasma, de forma que los anticuerpos o proteínas de
unión heterólogos se puedan expresar y eventualmente segregar. Esto
se puede lograr mediante diferenciación en cultivo de tejido in
vitro, o con el transplante de células preB genéticamente
modificadas en hospedantes de vertebrados apropiados in vivo,
con la condición de que se excluya la producción in vivo en
seres humanos.
En consecuencia, se prefiere efectuar la
diferenciación in vitro de linfocitos B precursores de
vertebrados:
- (a)
- deteniendo la proliferación de dichos linfocitos precursores de vertebrados e induciendo la diferenciación en células de línea linfocítica madura cultivando a los mismos en ausencia de cualquier factor de crecimiento de linfocitos precursores; e
- (b)
- induciendo la diferenciación de linfocitos terminal mediante el cultivo adicional de dichas células en presencia de al menos uno de los siguientes componentes seleccionados de:
- (i)
- factores estimulantes solubles, relacionados con células T, que comprenden interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-5, interleuquina-6, interleuquina-10, interleuquina-13, TGF-\beta e IFN-\gamma;
- (ii)
- factores que activan los receptores coestimuladores de células B, que comprenden anticuerpos agonistas o ligandos recombinantes activos para CD40, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), receptores de complemento 1 (CD35) y 2 (CD21), LFA-1 (CD11a), LFA-3 (CD58), CD19, CD20, CD30, CD32, CD37, CD38, CD70, CD71, Ig\alpha (CD79\alpha), Ig\beta (CD79\beta), TAPA-1 (CD81), Fas (CD95), receptor 1 del TNF (p55, CD120a), receptor 2 del TNF (p75, CD120b), Ox-40 (CD134), y receptor de linfotoxina B; y
- (iii)
- factores mitógenos de células B, antígenos de tipo 1 independientes de células T, y otros activadores policlonales, incluyendo lipopolisacárido (LPS), lipoproteínas procedentes de bacterias gram negativas, polianiones, poli-dldC, mitógeno de fitolaca (PWM), y reactivos antiinmunoglobulínicos, y combinaciones de los mismos.
La diferenciación in vitro en cultivo de
tejidos se puede lograr mediante un proceso de dos etapas que
incluye (a) la eliminación de los factores de crecimiento de células
preB, como por ejemplo IL7 o IL3, del medio de cultivo de tejidos,
lo que detendrá la proliferación de células preB y al mismo tiempo
inducirá la diferenciación en células de un fenotipo de células B
maduras, y que incluye (b) la estimulación de las células B
diferenciadas mediante dichos estímulos relacionados con células T
y/o independientes de células T mitogénicos, de forma que se
inducirá la diferenciación terminal de células del plasma. La
diferenciación inicial de células preB en células con un fenotipo de
células B eliminando los factores de crecimiento de células preB se
logra mediante la inducción de la apoptosis. De este modo, es una
realización preferida el uso de células preB que sobreexpresen genes
antiapoptóticos, como por ejemplo bcl-2 o
bcl-x_{L}. Estos genes antiapoptóticos se pueden
introducir en células preB usando células preB que se han aislado de
animales transgénicos bcl-2 o
bcl-x_{L}, o transfectando o transduciendo células
preB con vectores de sobreexpresión para cualquiera de los genes
antiapoptóticos.
Como una alternativa a la diferenciación in
vitro de linfocitos precursores genéticamente modificados, estas
células también se pueden diferenciar in vivo con el
transplante en un hospedante no humano vertebrado adecuado, dando
como resultado la migración de estas células a órganos linfoides
secundarios y la diferenciación en células de línea linfoide más
maduras. Preferiblemente, dichos linfocitos se cotransplantan en
dicho hospedante con linfocitos auxiliares T cebados con antígenos o
naturales, en los que el término "cotransplantar" se ha de
entender que no está limitado al transplante simultáneo exactamente
al mismo tiempo. Según otra realización preferida, la diferenciación
in vivo es seguida de la inmunización de dicho hospedante con
al menos un compuesto o composición inmunógena deseada. En contraste
con el método descrito aquí, el transplante de hemocitoblastos CD34+
humanos genéticamente no modificados en ratones SCID (documento WO
01/87058) ni permite la generación de anticuerpos de alta afinidad
(debido a la falta de células T humanas compatibles) ni ninguna
flexibilidad en el tipo y propiedades de anticuerpos producidos
mediante estas células B.
Además, se prefiere que dicho hospedante
vertebrado sea un hospedante compatible que es deficiente con
respecto a la generación de células B endógenas, células T y/o
células NK (asesinas naturales), o una combinación de los
mismos.
Como ya se ha expuesto aquí anteriormente con
respecto a la selección de fuentes apropiadas para linfocitos
precursores de vertebrados, se prefiere que el hospedante vertebrado
se seleccione de vertebrados mandibulares que comprenden pez
cartilaginoso, pez óseo, anfibios, reptiles, pájaros, y mamíferos
que incluyen cerdos, oveja, vacuno, caballos y roedores que incluyen
a ratones, ratas, conejos y cobayas, siendo la especie hospedante
preferida los ratones.
Los hospedantes apropiados que sirven como
receptores para el transplante de linfocitos precursores de
vertebrados genéticamente modificados pueden ser de tipo salvaje con
respecto al desarrollo de los linfocitos, o pueden tener
preferiblemente cualquiera de las diversas mutaciones que actúan en
cis que inhiben los reordenamientos génicos de Ig murinos
endógenos. Estos pueden incluir mutaciones en elementos
potenciadores de los locus génicos de Ig, como los elementos
potenciadores E\muH y \kappaiE anteriormente mencionados,
eliminaciones dentro de las regiones codificantes del gen de Ig,
como los segmentos génicos D_{H}, J_{H} o J_{L} y las regiones
IgC que incluyen sus exones que se extienden por la membrana.
Además, se pueden usar hospedantes adecuados que tienen mutaciones
que actúan en trans que impiden selectivamente el desarrollo
de linfocitos B (y T), por ejemplo mutaciones en la línea o factores
de transcripción específicos de linfocitos o los genes
RAG-1 y RAG-2 requeridos para la
iniciación de la recombinación V(D)J (Mombaerts et
al., s.a.; Shinkai et al., s.a.).
Además, las mutaciones que actúan en trans, que
conducen a hospedantes inmunodeficientes, comprenden mutaciones en
los genes de reparación del ADN expresados ubícuamente también
requeridos para la recombinación V(D)J como Ku70,
Ku86, la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de
ADN (ADN-PKcs), XRCC4, ADN ligasa IV y Artemis. Los
hospedantes vertebrados con cualquiera de las modificaciones
mencionadas anteriormente que carecen de poblaciones de linfocitos B
solas, o ambos linfocitos B y T, se pueden transplantar entonces con
las células preB genéticamente modificadas, y en el caso de ratones
deficientes en células B y T, se pueden cotransplantar con
poblaciones de células auxiliares T histocompatibles. Las
poblaciones de células auxiliares T comprenden preferiblemente
célula auxiliar T natural, poblaciones de células T efectoras
cebadas con anticuerpos o células T de memoria, o cualquier
combinación de los mismos. El cotransplante de poblaciones de
células auxiliares T puede ocurrir simultáneamente, antes o después
del punto de tiempo real del transplante de células preB
genéticamente modificadas.
Los hospedantes murinos o vertebrados cuyas
poblaciones linfocíticas periféricas se han reconstituido parcial o
completamente mediante el transplante de células preB modificadas, y
el cotransplante opcional de poblaciones de células auxiliares T, se
pueden usar entonces para la inmunización con cualquier antígeno
deseado, a fin de disparar una respuesta inmunitaria a ese antígeno
y para estimular tales linfocitos que expresan la especificidad de
receptores heterólogos apropiada, lo que conduce a la expansión
proliferativa de clones de células B, a la maduración de afinidad de
los dominios de unión de los anticuerpos o proteínas de unión
heterólogos codificados, y a la diferenciación terminal en células
del plasma que segregan los anticuerpos o proteínas de unión
heterólogos.
Como es manifiesto a partir de lo anterior, un
aspecto adicional de la presente invención es proporcionar un método
para la producción de cualquier proteína de unión o un fragmento o
fragmentos funcionales de la misma con la capacidad de unirse
selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier
anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno compuesto de
dominios variables y regiones constantes que comprenden receptores
de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier
proteína de unión artificial que desarrolle funciones efectoras
inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o
artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores
antigénicos heterólogos codificados por la línea germinal, y
cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, de una
manera conocida per se, que implica las etapas de:
- (a)
- modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, que
- (i)
- derivan de órganos linfoides primarios, y
- (ii)
- tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura introduciendo al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma; o, como alternativa, usando linfocitos precursores de vertebrados genéticamente modificados, que
- (i)
- derivan de órganos linfoides primarios,
- (ii)
- tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura, y
- (iii)
- tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma;
- (b)
- efectuar la diferenciación de dichos linfocitos precursores genéticamente modificados en células de línea linfoide madura tanto in vitro como in vivo, generando de ese modo linfocitos de vertebrados genéticamente modificados y diferenciados capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento funcional de la misma; o, como alternativa, usar dichos linfocitos de vertebrados genéticamente modificados y diferenciados capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento funcional de la misma;
- (c)
- efectuar la expresión de la proteína de unión o de un fragmento o fragmentos funcionales de la misma; con la condición de que se excluya la producción in vivo en seres humanos.
En este contexto, se prefiere que cualquiera de
los métodos anteriores que impliquen la generación de linfocitos de
vertebrados genéticamente modificados y diferenciados sea seguido de
las etapas de:
- (a)
- aislar a partir de dichos linfocitos diferenciados el al menos un elemento genético exógeno, y
- (b)
- colocar dicho elemento o elementos genéticos en un contexto que permita la producción de dicha al menos una proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma.
A fin de lograr la producción a gran escala de la
inmunoglobulina deseada o de la proteína de tipo inmunoglobulina o
de un fragmento funcional de la misma, la información genética que
codifica los polipéptidos de interés se puede aislar a partir de
estas células y se puede transferir en diferentes sistemas de
expresión, con lo que se puede mantener la información genética, se
puede amplificar y/o se puede usar para la producción de la proteína
deseada o una parte de la misma.
Con más detalle, los marcos de lectura abierta
que representan las regiones codificantes de los anticuerpos o
proteínas de unión heterólogos se pueden aislar mediante métodos
estándares de biología molecular, incluyendo amplificación mediante
PCR con pares de cebadores específicos, y se pueden transferir en el
contexto de diferentes sistemas de expresión, permitiendo la
producción continua de los anticuerpos heterólogos o proteínas de
unión. Estos sistemas de expresión comprenden sistemas de
transcripción/traducción in vitro, sistemas de expresión
procariotas, como por ejemplo E. coli, o sistemas de
expresión de eucariotas, como la expresión en células de levaduras,
células de insectos, usando infección con vaculovirus, o células de
mamíferos.
La proteína de unión anteriormente mencionada, o
un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, pueden mostrar
una especificidad única y por lo tanto pueden ser monoclonales, o se
pueden codificar mediante más de una única especificidad y por lo
tanto pueden ser policlonales.
Según una realización preferida, dicha proteína
de unión o fragmento o fragmentos funcionales de la misma comparten
completa o parcialmente características estructurales y/o
funcionales de un anticuerpo, receptor de antígeno, o proteína de
unión humanos, puesto que se puede ensamblar en la base del
repertorio genético humano o partes del mismo.
Además, se prefiere que la proteína de unión o un
fragmento o fragmentos funcionales de la misma a producir se
seleccione del grupo que consta de:
- (a)
- anticuerpos que o bien están unidos a la membrana o bien se segregan, y que constan tanto de polipéptidos heterólogos de cadena pesada como de cadena ligera en la composición estequiométrica encontrada en anticuerpos naturales y que constan de cualquiera de los isotipos conocidos de cadena pesada (\mu, \delta, \gamma, \alpha, \varepsilon) y/o de cadena ligera (\kappa y \lambda);
- (b)
- anticuerpos con combinaciones de polipéptidos de cadena pesada y de cadena ligera que son completamente humanos con respecto a la secuencia de aminoácidos primaria;
- (c)
- anticuerpos híbridos que contienen polipéptidos heterólogos de cadena pesada o de cadena ligera procedentes de diferentes especies de vertebrados;
- (d)
- fragmentos de anticuerpos Fab, scFv y F(ab')2 segregados, que son completa o parcialmente heterólogos;
- (e)
- fragmentos de anticuerpos acoplados covalentemente vía péptidos ligadores, dando como resultado fragmentos de anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos;
- (f)
- receptores de células T del isotipo \alpha, \beta, \gamma y \delta, receptores de antígenos, y otras proteínas de unión con parecido estructural a proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas;
y fragmentos funcionales de los
mismos.
Según otro aspecto, la presente invención
proporciona linfocitos precursores de vertebrados genéticamente
modificados, que
- (a)
- derivan de órganos linfoides primarios y tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura,
- (b)
- tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno heterólogo compuesto de dominios variables y de regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial heteróloga que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores de antígenos heterólogos codificados mediante la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, y
- (c)
- tienen al menos un marcador de selección que está ligado operablemente a dicho al menos un elemento genético exógeno.
Según aún otro aspecto, la presente invención
proporciona células de línea linfoide madura, que
- (a)
- tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno heterólogo compuesto de dominios variables y de regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial heteróloga que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores de antígenos heterólogos codificados mediante la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, y
- (b)
- tienen al menos un marcador de selección que está ligado operablemente a dicho al menos un elemento genético exógeno.
Según un aspecto adicional, la presente invención
proporciona células inmortalizadas derivadas de células de línea
linfoide madura, que
- (a)
- tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno heterólogo compuesto de dominios variables y de regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial heteróloga que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores de antígenos heterólogos codificados mediante la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos,
- (b)
- tienen al menos un marcador de selección que está ligado operablemente a dicho al menos un elemento genético exógeno, y
- (c)
- produce dicha al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma.
Como se apreciará, los anticuerpos totalmente
humanos o humanizados, o fragmentos funcionales de los mismos, se
pueden usar en el diagnóstico, prevención y terapia de la enfermedad
humana en virtud de su capacidad para unirse con sus dominios de
región variable a antígenos específicos, y, además, por su capacidad
para mediar funciones efectoras inmunitarias vía sus dominios de
región constante. Algunos posibles usos de los anticuerpos
monoclonales humanos, que se pueden producir según la invención,
para el diagnóstico, prevención y terapia de la enfermedad humana se
detallan a continuación. Con fines de diagnóstico, los anticuerpos
monoclonales humanos se pueden usar para la identificación y
visualización de ciertas patologías mediante la introducción de
anticuerpos marcados en el sistema vascular de los pacientes, en el
que se puede detectar una enfermedad específica relacionada con
estructuras antigénicas (por ejemplo, expresada en ciertas células
patológicas). Las aplicaciones en la prevención de la enfermedad
humana incluyen anticuerpos con la capacidad para bloquear
interacciones de ciertos sistemas de ligando con receptores de
superficie celular en patologías (anticuerpos antagonistas), o por
el contrario imitar el efecto del ligando uniéndose a los receptores
de superficie celular (anticuerpos agonistas) en caso de ausencia
patológica de un ligando. Además, los anticuerpos monoclonales
humanos se pueden usar para bloquear las funciones de sustancias
tóxicas, o de patógenos, por ejemplo durante el envenenamiento,
inflamación e infecciones. En este contexto, los anticuerpos humanos
son de uso particular debido a que median el marcado de estas
sustancias y antígenos para la eliminación mediante células
especializadas del sistema inmunitario innato. Los anticuerpos
monoclonales humanos también se pueden usar para seleccionar
funciones inmunitarias para células cancerosas en virtud de la unión
específica a estructuras autoalteradas expresadas en la superficie
de células cancerígenas. En el caso de patologías autoinmunitarias,
los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser útiles además para
neutralizar o contrarrestar los efectos patológicos de factores
autoinmunitarios (autoanticuerpos, anticuerpos alérgicos). Los
anticuerpos monoclonales humanos son útiles de este modo para el
diagnóstico, prevención y terapia de la enfermedad humana, debido a
que se pueden introducir en el sistema vascular de los pacientes sin
provocar ningún efecto adverso, puesto que los anticuerpos son
constituyentes normales del plasma sanguíneo y de los componentes
fluidos de los seres humanos (por ejemplo, moco, saliva, fluido
linfático, etc.).
Los plásmidos que llevan elementos genéticos
usados según la presente invención se han depositado según el
Tratado de Budapest con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen (DMSZ) en Braunschweig, Alemania, el 17 de Diciembre de
2001, con los siguientes números de acceso:
Plásmido | Número de Acceso |
pBS-DT4 | DSM 14703 |
pPGK-hygro | DSM 14704 |
pGL2neo(m)+ | DSM 14705 |
pBS-DT4-tox176 | DSM 14706 |
Los procedimientos experimentales siguientes
describen métodos detallados para la generación de anticuerpos
monoclonales humanos usando células preB murinas que se han
modificado genéticamente a fin de conferirles el potencial para la
producción de anticuerpos humanos. Se describen ejemplos
seleccionados de métodos según lo siguiente que permiten las
modificaciones genéticas de células preB murinas, de forma que ya no
se pueden expresar anticuerpos endógenos, pero que los anticuerpos
humanos se pueden producir a partir de constructos de expresión
retrovíricos heterólogos establemente suministrados. Además, se
presentan detalles experimentales relacionados con el transplante de
estas células preB murinas genéticamente modificadas en hospedantes
murinos apropiados, así como también métodos relacionados con la
inmunización de estos ratones transplantados, el aislamiento de
células secretoras de anticuerpos, y su establecimiento como líneas
celulares de hibridomas que segregan anticuerpos humanos
monoclonales inmortales. Aunque los métodos proporcionados son
completos y suficientes para la producción de anticuerpos
monoclonales heterólogos, especialmente humanos, usando células preB
murinas, que están modificadas genéticamente, los métodos no se
deben observar como limitación sino más bien como ilustración.
Las células precursoras B murinas que responden a
células estrómicas y a IL7 se encuentran en el hígado fetal de fetos
de ratón en el día 15-18
post-coitum, en la médula ósea de ratones
adultos, así como en el bazo de animales neonatos (< 3 semanas)
(Rolink et al., Blood, 81,
2290-2300, 1993). A fin de aislar estas células
preB, los ratones se sacrificaron mediante asfixia por CO_{2}, y
los órganos respectivos se retiraron en condiciones estériles. Las
células totales de médula ósea se obtuvieron retirando el fémur y la
tibia, abriendo los huesos en ambos extremos con tijeras estériles y
lavando la médula con 2-5 ml de disolución salina
tamponada con fosfato (PBS) usando una jeringuilla desechable de 5
ml y una aguja de calibre 25 ó 26. El bazo o el hígado fetal
aislados, preparados también en condiciones estériles, se sitúan en
una rejilla de acero de malla 200 en una cápsula de Petri con
5-10 ml de PBS. Los órganos se cortan en trozos y se
aplastan suavemente a través de la rejilla metálica con el émbolo de
una jeringuilla plástica de 5 ml. Las suspensiones celulares se
lavan una vez mediante centrifugación (200 g, 10 min., 4ºC) y se
resuspenden en 10-20 ml de PBS. Todas las
preparaciones celulares se llevan a cabo con disoluciones enfriadas
con hielo, y las suspensiones celulares se mantienen en hielo hasta
que se transfieren al cultivo de tejidos.
El establecimiento de clones de células preB
individuales se realiza limitando la disolución en placas de 96
pocillos revestidas con células estrómicas murinas
ST-2 (Ogawa et al., EMBO J., 7,
1337-1343, 1988) o PA-6 (Kodama
et al., J. Cell. Physiol., 118,
233-240, 1984) irradiadas con radiación \gamma con
3000 rad, semiconfluentes, que se hicieron crecer en medio especial
para células estrómicas (véase más abajo). Para limitar la
colocación en placas de la disolución, se pueden usar poblaciones de
células totales de órganos, o, como alternativa, células de línea B
positivas con marcadores superficiales B220^{+} o CD19^{+}
enriquecidas mediante clasificación celular activada por perlas
fluorescentes o magnéticas (FACS o MACS) usando anticuerpos
comerciales específicos para estos marcadores.
El cultivo a largo plazo de células preB murinas
se realiza en un medio especial libre de suero, que contiene 100
unidades de interleuquina-7 (IL-7)
recombinante (véase más abajo). Las colonias individuales de células
preB se desarrollan en alimentadores de células estrómicas en
condiciones de dilución limitante en 6-7 días de
cultivo a 37ºC, en una incubadora humidificada en una atmósfera de
10% de CO_{2}. Las colonias individuales de células preB se
transfieren inicialmente a placas de 24 pocillos y después se
expanden secuencialmente en matraces de cultivo de tejido de 25
cm^{2} y eventualmente 75 cm^{2}, siempre prerrevestidos con
células estrómicas irradiadas con radiación \gamma de 3000 rad.
Después de la expansión inicial, es necesario mantener las
densidades de células preB entre 1 x 10^{5} y 2 x 10^{6} células
preB/ml de medio de cultivo de tejido, que requiere subcultivar las
células cada dos o tres días.
Medio de cultivo de tejido libre de suero
especial (Iscove y Melchers, J. Exp. Med., 147,
923-933, 1978) requerido para el establecimiento de
células preB murinas dependientes de IL-7, de
células estrómicas, que proliferan a largo plazo (formulación para 1
litro de medio):
- \bullet
- 11 g de polvo DMEM (sin bicarbonato)
- \bullet
- 10 ml de HEPES 1 M, pH 7,3
- \bullet
- 33,3 ml de disolución al 7,5% de NaHCO_{3}
- \bullet
- 8 ml de disolución madre de aminoácidos que contiene:
- L-alanina | 600 mg |
- L-asparagina | 520 mg |
- L-aspartato | 720 mg |
- L-glutamato | 1800 mg |
- L-prolina | 960 mg |
- Piruvato sódico | 2640 mg |
+ 1,6 ml de disolución madre de Biotin/vitamin B12 que contiene | |
- Vitamina B12 | 5,0 mg |
- D-biotina | 5,0 mg |
\hskip0,5cmdisuelto en 20 ml + 10 \mul de HCl 1 M
\hskip0,5cmtodos los componentes disueltos en 240 ml de H_{2}O ultrapura
- \bullet
- 4 ml de disolución madre de cisteína que contiene
- L-cisteína | 1,4 g |
\hskip0,5cmdisuelta en 150 ml de H_{2}O, 50 ml de HCl 1 M
- \bullet
- 5 ml de disolución al 10% de BSA (seroalbúmina bovina)
- \bullet
- 0,15 ml de disolución madre de transferrina humana compuesta de:
- 10 ml de disolución a.) y 80 \mul de disolución b.) | |
a.) 1 g de transferrina humana disuelta en 10 ml de DMEM (1,3 g/100 ml de H_{2}O) + 100 \mul de HEPES | |
{}\hskip0,4cm 1 M, pH 7,3 | |
b.) 440 mg de FeCl_{3}x6H_{2}O + 185 ml de H_{2}O + 200 \mul de HCl 1 M |
- \bullet
- 5 ml de disolución madre de lípido de haba de soja
\begin{minipage}[t]{155mm}- 20 mg de lípidos de haba de soja mezclados con 45 ml de DMEM (1,3 g/100 ml de H_{2}O) + 5 ml de BSA al {}\hskip1,78mm 10%. Ultrasonidos 3 x 15 minutos en agua con hielo\end{minipage} |
- \bullet
- 20 ml de kanamicina (5000 \mug/ml)
- \bullet
- 30 \mul de 2-mercaptoetanol (1,43 M)
- \bullet
- 10^{5} U de interleuquina-7 (IL7) de ratón recombinante
Todos los componentes se disuelven en un volumen
final de 1000 ml de H_{2}O ultrapura, triplemente destilada,
filtrada en estéril y mantenida a 4ºC hasta su uso.
Es necesario que las células alimentadoras de
células estrómicas ST-2 o PA-6 se
hagan crecer en un medio especial que contiene poco suero, según lo
siguiente (formulación para 1 litro):
- \bullet
- 17,7 g de polvo de IMDM (sin bicarbonato)
- \bullet
- 3 g de NaHCO_{3}
- \bullet
- 10 ml de 100x aminoácidos no esenciales (GIBCO-BRL)
- \bullet
- 10 ml de 100x penicilina/estreptomicina (GIBCO-BRL)
- \bullet
- 1 ml de disolución de insulina porcina 5 mg/ml
- \bullet
- 1 ml de 2-mercaptoetanol 50 mM
- \bullet
- 3 ml de primatona al 10% (ultrafiltrada para excluir proteínas >10 kD) (fuente: Quest International, Naarden, Países Bajos)
- \bullet
- 20 ml de suero fetal de ternera
Todos los componentes se disolvieron en un
volumen final de 1000 ml de H_{2}O ultrapura, triplemente
destilada, filtrada en estéril y mantenida a 4ºC hasta su uso.
Las células preB murinas dependientes de células
estrómicas y de IL7, que proliferan a largo plazo, retienen su
potencial para diferenciarse en células de línea B más maduras
(Rolink et al., EMBO J., 10,
327-336, 1991), lo que se puede lograr in
vitro. Esta diferenciación se puede realizar en dos etapas
induciendo primeramente la diferenciación a células con un fenotipo
de células B inmaduras y, en segundo lugar, induciendo la
diferenciación a células con un fenotipo de células del plasma que
segregan anticuerpos.
La primera etapa de diferenciación se alcanza
eliminando la IL7 de las células preB en presencia continua de
células estrómicas. Para ello, las células preB se recogen de
cultivos proliferantes, se lavan tres veces con medio de cultivo de
células preB libre de suero, que carece de IL7, y se colocan en
placas a una densidad de 1-2 x 10^{6} células/ml
sobre células estrómicas recientes, irradiadas con radiación
\gamma de 3000 rad, en ausencia de IL7. En un período de tres
días, la célula preB detiene su proliferación y diferenciación en
células con un fenotipo de células B inmaduras. Los cambios
fenotípicos incluyen, por ejemplo, la pérdida de la expresión
c-kit, \lambda_{5} y V_{preB}, y la ganancia
de la expresión de CD25 y CD40. En células preB procedentes de
ratones de tipo salvaje, esta diferenciación se acompaña además por
reordenamientos V_{H} a DJ_{H} secuenciales en los locus génicos
de cadena IgH seguido de reordenamientos V_{L} a J_{L} en los
locus génicos de cadena IgL, lo que puede dar como resultado la
expresión de anticuerpo IgM unido a la superficie en las células de
línea B diferenciadas (Rolink et al., EMBO J.,
10, 327-336, 1991). Sin embargo, se ha de
señalar que el reordenamiento ordenado de los segmentos génicos IgH
y L no es un prerrequisito para la diferenciación fenotípica de
estas células preB in vitro (Grawunder et al., Int.
Immunol., 7, 1915-1925, 1995).
La segunda etapa de diferenciación se puede
lograr estimulando a las células privadas de IL7 con un anticuerpo
anti-CD40 agonista o con LPS en combinación con
citoquinas, como por ejemplo IL4, IL5, IL10 o
TGF-\beta. Este tratamiento inducirá la
proliferación, la recombinación de cambio de clase a diversos
isotipos génicos de Ig (dependiendo de la combinación de citoquinas
empleadas) y eventualmente la diferenciación a células del plasma
que segregan anticuerpos. En el caso de, por ejemplo, la
estimulación anti-CD40/IL4, las células se lavan
tres veces en medio de cultivo de tejido de células preB, se colocan
en placas sobre células estrómicas recientes, irradiadas con
radiación \gamma de 3000 rad subconfluentes, en presencia de 100
U/ml de IL4 y 5 \mug/ml de anticuerpo monoclonal
anti-CD40 durante 4-6 días. Las
células de la etapa de células del plasma proliferantes, grandes, se
pueden identificar y separar mediante clasificación celular activada
por fluorescencia (FACS), basándose en su gran tamaño, lo que da
como resultado valores de dispersión hacia delante aumentados de
forma notable.
La diferenciación in vitro de células preB
de tipo salvaje habitualmente está acompañada por la pérdida de
cantidades sustanciales de células debido a la retirada del factor
de crecimiento inducida por apoptosis. Este problema se puede obviar
mediante la sobreexpresión de genes antiapoptóticos, como
bcl-2 o bcl-x_{L} en estas células
((Rolink et al., J. Exp. Med., 178,
1263-1270, 1993). Esto se puede lograr aislando
células preB a partir de ratones que contienen una línea B expresada
específicamente mediante un transgén bcl-2 (Strasser
et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 166,
175-181, 1990), o transduciendo un vector
retrovírico recombinante que codifica bcl-2 en
células preB murinas dependientes de células estrómicas y de IL7,
que proliferan a largo plazo (véase más abajo).
Un prerrequisito para la transducción estable de
genes en células preB murinas dependientes de células estrómicas y
de IL7, que proliferan a largo plazo, es la construcción de un
vector de transferencia retrovírico recombinante que contiene un
casete de expresión para un gen de interés. Los vectores de
transferencia retrovíricos constan de secuencias de repetición
terminal largas 5' y 3' (LTR) retrovíricas que flanquean a una señal
de empaquetamiento retrovírica, Psi(+), un sitio de clonación
múltiple (MCS) en el que se pueden insertar secuencias heterólogas,
y elementos de control plasmídicos bacterianos requeridos para la
replicación y mantenimiento del vector en E. coli. Un ejemplo
para un vector de transferencia retrovírico vacío es el plásmido
pLIB (Clontech) comercialmente disponible (Fig. 11a).
A fin de construir un vector de expresión
retrovírico que contenga el gen antiapoptótico
bcl-2, se aplica una estrategia para la coexpresión
del ADNc de bcl-2 murino y del marcador de selección
de fármaco de higromicina B ligando la expresión de
bcl-2 y de la higromicina B usando una secuencia de
entrada ribosómica interna (IRES), que permite la expresión
simultánea de dos constructos, que se puede seleccionar con el
antibiótico farmacéutico higromicina B se seleccionarán
simultáneamente células para la expresión del gen antiapoptótico
bcl-2. La generación del vector retrovírico para la
expresión acoplada de los ADNc de bcl-2 y de
higromicina B transcurre en dos etapas: primeramente el ensamblaje
del casete de expresión
promotor-bcl-2-IRES-higromicina
B, y en segundo lugar la clonación de este casete en el MCS del
vector de transferencia retrovírico pLIB (Fig. 11 a+b).
Tanto el ADNc de bcl-2 murino
como el marco de lectura abierta (ORF) para el marcador de
resistencia a fármacos de higromicina B se clonan en el vector
CMV-promotor-IRES comercialmente
disponible (Clontech), pIRES. Para esto, el ORF de higromicina B se
amplifica a partir de pPGK-hygro plasmídico (SEQ ID
NO. 1)
mediante reacción en cadena de
polimerasa (PCR) usando un par de cebadores que contienen sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción adicionales (indicados en
letras mayúsculas) para endonucleasas de restricción XbaI y NotI
(también se añaden 2-4 nucleótidos al azar 5' de la
secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción, debido a que
la mayoría de las enzimas de restricción no digieren eficazmente al
ADN, si la secuencia de reconocimiento está localizada directamente
en el extremo de los fragmentos de ADN amplificados por PCR. Estos
nucleótidos flanqueantes están indicados en letras minúsculas, a fin
de resaltar los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción.
Las secuencias en dirección 3', o 3' de los sitios de restricción
resaltados, corresponden a secuencias de ADN del fragmento a
amplificar. Este modo de presentación de las secuencias de cebadores
se mantiene en toda la descripción de los ejemplos experimentales.
Una PCR con cebadores P001 y P002 amplificará un fragmento de ADN de
1017 pares de bases (pb) que contiene sitios de reconocimiento
únicos para endonucleasas de restricción XbaI y NotI en los extremos
del fragmento. El fragmento de PCR se digiere doblemente entonces
con las enzimas de restricción XbaI y NotI, y entonces se clona
direccionalmente en el plásmido pIRES digerido doble XbaI/NotI, a
fin de generar el constructo plasmídico pIRES-hygroB
(Fig. 11a). El ORF del ADNc de bcl-2\alpha murino
se aísla y se amplifica a partir de ARNm de bazo de ratón mediante
reacción en cadena de polimerasa acoplada con transcriptasa inversa
(RT-PCR) usando los siguientes cebadores diseñados
basándose en las secuencias publicadas de
NCBI-Genbank M16506 y L31532 (el cebador P003 se une
a la posición 1821-53 de M16506, y el cebador P004
se une a la posición 506-535 de
L31532):
que contienen sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción (en letras mayúsculas) para
NheI y MluI. Seguidamente se clona direccionalmente un producto de
PCR digerido doble NheI/NotI, que tiene un tamaño de 699 pb, en el
vector pIRES-hygroB digerido doble NheI/MluI a fin
de generar
pBcl2-IRES-hygroB.
Debido a la falta de sitios de enzimas de
restricción compatibles en el sitio de clonación múltiple del vector
de transferencia retrovírico vacío pLIB y el vector de expresión
bcl-2/higromicina B dual,
pBcl2-IRES-hygroB, el casete de
expresión completo para
Bcl-2-IRES-higromicina
B, incluyendo el promotor CMV constitutivo y el sitio de
poliadenilación, se clona en pLIB usando PCR con sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción apropiados. Para esto, el
casete de expresión
CMV-bcl2-IRES-higromicina
B se amplifican mediante PCR con
pBcl2-IRES-hygroB como el molde de
PCR usando los cebadores:
que contienen sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción para SalI y ClaI (en letras
mayúsculas). Seguidamente se clona direccionalmente un producto de
PCR digerido doble SalI/ClaI, de 3714 pb, en el vector pLIB digerido
doble SalI/ClaI generando de ese modo un vector de transferencia
retrovírico
pLIB-bcl2-IRES-hygroB
que permite la expresión acoplada de bcl-2 y de
higromicina
B.
Una de las maneras para transferir de forma
estable elementos genéticos en células preB murinas es usar la
transducción retrovírica (Fig. 8). Para este procedimiento, se
transfecta transitoria o establemente un constructo de ADN
recombinante, que contiene secuencias retrovíricas necesarias para
el empaquetamiento de un genoma retrovírico (5'LTR, señal de
empaquetamiento Psi(+), 3'LTR), así como las secuencias heterólogas
o genes de interés, en una línea celular de empaquetamiento que
expresa constitutivamente los genes requeridos para la producción de
partículas retrovíricas.
Para la transducción de células preB murinas
dependientes de células estrómicas y de IL7, se puede usar la línea
celular de empaquetamiento retrovírico ecotrópica GPE (Markowitz
et al., J. Virol., 62, p.
1120-1124, 1988), que da como resultado normalmente
una transducción estable de células preB a eficacias de
50-80%. Esta línea celular de empaquetamiento
ecotrópica, en conjunción con vectores de transferencia retrovíricos
(recombinantes), sólo producirá retrovirus deficientes en la
replicación (recombinantes) capaces de transducir células murinas.
Para la transfección transitoria de la línea celular de
empaquetamiento GPE ecotrópica, se usa la transfección estándar con
fosfato de calcio, según se detalla a continuación:
Las células GPE se hicieron crecer en medio con
bajo contenido en suero y a base de IMDM, usado también para las
células estrómicas ST-2 y PA-6 y
descrito en el ejemplo 1. Un día antes de la transfección, las
células de empaquetamiento GPE adherentes se cosechan mediante
tripsinización y se siembran a una confluencia del 50% en medio
reciente, con bajo contenido en suero y a base de IMDM, y se
cultivan a 37ºC en 10% de CO_{2}. Al siguiente día, se transfectan
20 \mug de ADN retrovírico por matraz de cultivo de tejidos T75
(75 cm^{2}) de células GPE, usando la precipitación estándar con
fosfato de calcio. Después de 24 horas tras la transfección, las
células GPE transfectadas se pueden usar para la transducción de
retrovirus recombinantes en células preB.
Se pueden usar dos métodos de forma
intercambiable para la transducción de los retrovirus recombinantes
producidos mediante células GPE transfectadas: el primer método se
basa en la infección de células preB con el sobrenadante del cultivo
celular acondicionado. Para ello, el medio de cultivo celular
procedente de células GPE transfectadas se sustituye 24 horas
después de la transfección y se cosecha después de otras 24 horas de
cultivo celular. Los retrovirus recombinantes que contienen el
sobrenadante de cultivo celular se añaden entonces a los cultivos de
células preB proliferantes a relaciones de 1:8 (vol) hasta 1:1 (vol)
en presencia de 8 \mug/ml de polibreno, y se continúa la
incubación durante 3-6 horas a 37ºC. Seguidamente,
las células se cosechan, se retira el medio que contiene
polibreno/retrovirus, y las células se colocan en placas a una
densidad de 1-2 x 10^{5} sobre células estrómicas
recientes, irradiadas con radiación \gamma de 3000 rad, en medio
de células preB que contienen 100 U de IL7r. Las células preB
transducidas retrovíricamente se cosechan entonces 24 horas más
tarde.
El segundo método se basa en el cocultivo de
células preB con retrovirus recombinante transfectado que produce
células GPE. Para ello, las células preB de fase log se cosechan y
se resuspenden en medio de cultivo de células preB reciente que
contiene 100 U de IL7r y 8 \mug/ml de polibreno a una densidad de
2-4 x 10^{5} células, y se colocan en placas sobre
células GPE transfectadas 24 horas tras la transfección con
constructos retrovíricos. Las células preB se cocultivan durante 6
horas a 37ºC, seguidamente se cosechan y se colocan en placas sobre
células estrómicas recientes, irradiadas con radiación \gamma de
3000 rad, en medio de células preB que contiene 100 U de IL7r para
su recuperación. Las células preB retrovíricamente transducidas se
cosechan entonces y se pueden utilizar 24 horas más tarde.
La primera etapa para la generación de
anticuerpos heterólogos, preferiblemente humanos, a partir de
células precursoras B murinas es la inactivación de las cadenas IgH
e IgL murinas endógenas, lo que se puede lograr, entre otros
métodos, por ejemplo, seleccionando genes dentro del locus génico de
inmunoglobulina en células preB. En teoría, se necesitaría inactivar
los tres locus génicos inmunoglobulínicos murinos, es decir los
locus génicos de cadenas IgH, Ig\kappaL e Ig\lambdaL. Sin
embargo, el locus génico de cadena \lambdaL murino comprende sólo
tres agrupamientos V-J-C funcionales
con un segmento génico cada uno, y en las cadenas \lambdaL hay
solamente una diversidad muy limitada. Además, menos del 5% de
células B murinas expresan los locus génicos de cadena \lambdaL.
Por lo tanto, en términos prácticos, es suficiente inactivar los
locus génicos de cadenas IgH y \kappaL murinos endógenos a fin de
asegurarse de que, con la transferencia de los genes o locus génicos
de cadenas IgH e Ig\kappaL heterólogos, la inmensa mayoría de
células B (>95%) producidas a partir de células preB expresará
anticuerpos heterólogos.
Generalmente, la forma más controlada para
inactivar los locus génicos de cadenas IgH y \kappaL endógenos es
usar la selección de genes (véase más abajo). Sin embargo, en el
caso del locus génico de cadena IgH, se puede aplicar otro
método:
Las células preB murinas dependientes de IL7 de
células estrómicas, que proliferan a largo plazo, tienen los
reordenamientos DJ_{H} en ambos alelos de cadena pesada. Debido a
la imprecisión en el proceso de unión de D a J_{H}, estos
reordenamientos DJ_{H} pueden suceder de forma que los segmentos
génicos D se pueden leer en los tres marcos de lectura posibles con
relación al marco de lectura fijo del segmento génico J_{H}. Estos
marcos de lectura se han denominado arbitrariamente marcos de
lectura I, II y III (Kaartinen y Mäkelä, Immunol. Today,
6, p. 324-330, 1985). La mayoría de los
segmentos génicos D contienen codones de parada, si una unión
DJ_{H} ocurre en el marco de lectura III (Kaartinen y Mäkelä,
s.a.), de forma que una cadena H funcional nunca se puede expresar a
partir de tal alelo de cadena pesada.
Por lo tanto, estadísticamente casi 1/9 (11,1%)
de todas las células preB dependientes de IL7, de células
estrómicas, tienen reordenamientos DJ_{H} en el marco de lectura
III con una parada que codifica ambos alelos de cadena IgH. Estas
células preB se pueden aislar subclonando en condiciones de dilución
limitante y detectando sistemáticamente los reordenamientos no
funcionales deseados. Para asegurar el aislamiento de clones
estables, es necesario detectar sistemáticamente los reordenamientos
para dos reordenamientos génicos DJ_{H}4 no funcionales, que no se
pueden invertir mediante reordenamientos secundarios debido a que el
último segmento génico J_{H} se ha usado. Tales clones se pueden
usar para la inactivación adicional seleccionada de los alelos de
cadena \kappaL.
Se presentan como ejemplos dos ejemplos de
métodos que dan como resultado la inactivación seleccionada de genes
de ambos locus génicos de cadena IgH e Ig\kappaL endógenos para
muchas mutaciones que actúan en cis que conducirían de forma
similar a células preB sin el potencial para expresar proteínas de
cadena IgH e Ig\kappaL endógenas (Fig. 5a, b). Para ambas
estrategias de selección, primero es necesario construir vectores de
selección génica positivos-negativos vacíos que
contienen sitios de clonación únicos que permitan la inserción de
secuencias de ADN homólogas al locus génico diana, un posible
marcador de selección de fármacos, como neomicina o puromicina,
flanqueado por sitios loxP, y un marcador de selección negativa,
como la toxina de la difteria, o la timidina quinasa del virus del
herpes simple (HSV-tk), que seleccionará frente a
la integración al azar del vector de selección génica en el genoma
de las células. La presencia de un marcador de selección positiva
flanqueado por loxP (flanqueado) permitirá la selección génica
secuencial de ambos alelos en el mismo clon celular usando el mismo
antibiótico, debido a que, después de la selección con éxito del
primer alelo, se puede eliminar el marcador de resistencia a
antibiótico de las células con la expresión transitoria de cre
recombinasa que elimina cualquier secuencia nucleotídica localizada
entre los sitios de reconocimiento de loxP cognatos. Los vectores de
selección positivos-negativos vacíos se construyen
según lo siguiente (Fig. 6a, b).
Etapa
1
Se hibridan dos oligómeros de ADN sintéticos
complementarios:
mezclando 100 pmoles de cada
oligómero en 50 \mul de 50 mM de Tris/HCl, 100 mM de NaCl, pH 8,0.
La mezcla se desnaturaliza entonces durante 2 minutos a 95ºC y se
enfría lentamente desde 65ºC hasta temperatura ambiente en 20
minutos. Esto generará el siguiente ligador de ADN de doble hebra
con proyecciones compatibles XhoI y KpnI (indicadas en letras
mayúsculas):
El ligador de ADN sintético hibridado se liga
entonces en pBluescriptSK(+) (Stratagene) comercialmente disponible
linealizado con XhoI-KpnI, dando como resultado el
plásmido pBSL que contiene un sitio de clonación múltiple extendido
(MCS+, véase la Fig. 6a) requerido para las siguientes etapas de
clonación.
Etapa
2
Como marcador de selección negativa que permita
la selección frente a la integración cromosómica al azar de
constructos de selección génica, se puede usar un casete de
expresión para la toxina \alpha de la difteria (McCarrick et
al., s.a.), o su versión atenuada, la toxina \alpha de la
difteria (DT-\alphatox176) (Maxwell et
al., s.a.), bajo control de un promotor constitutivo de
\beta-actina. Aunque habitualmente se usan otros
marcadores de selección negativos, como el gen de timidina quinasa
del virus del herpes simple (HSV-tk), en
experimentos de selección génica con embriocitos indiferenciados de
ratón, se ha demostrado que la toxina \alpha de la difteria y su
mutante atenuado tox176 son eficaces para la selección génica en
células somáticas (Grawunder et al., Mol. Cell.
2, p. 477-484, 1998). Los casetes de
expresión de la toxina de la difteria se aíslan como fragmentos
BglII-XbaI de 2,1 kb a partir de plásmidos
pBS-DT4 (SEQ ID NO. 2), o
pBS-DT4tox176 (SEQ ID NO. 3; véase la Fig. 6a), y se
ligan en el pBSL linealizado con BglII-NheI, dando
como resultado plásmidos pBSL-DT4 y pBSLDT4tox176,
respectivamente (véase la Fig. 6a).
Etapa
3
La siguiente etapa para la generación de vectores
de selección génica positivos/negativos es la inserción de un
marcador de selección de fármacos positivos en el vector
pBSL-DT4 o pBSL-DT4tox176, en
dirección 5' del casete de expresión de la difteria. Como ejemplos
representativos se presenta la inserción de los casetes de expresión
de neomicina, puromicina e higromicina B flanqueados por los sitios
loxP en dirección 5' del casete de expresión de la toxina \alpha
de la difteria en pBSL-DT4. Sin embargo, se debe
observar que se pueden aplicar estrategias de clonación idénticas al
vector pBSL-DT4tox176, que contiene la versión
atenuada de la toxina \alpha de la difteria. Además, se pueden
usar otros marcadores de selección de fármacos positivos que
confieren resistencia, por ejemplo, a histidinol, ácido
micofenólico, bleomicina, o zeocina.
En cada caso, el casete del marcador de selección
antibiótica positivo estará flanqueado por sitios loxP que se pueden
reconocer mediante la enzima cre recombinasa, y que se puede usar
para eliminar el marcador de selección de fármaco localizado entre
los sitios loxP con la transfección transitoria de un vector de
expresión de cre recombinasa, para uso secuencial del mismo marcador
de selección.
Se puede aislar un casete de resistencia a
neomicina flanqueado por los sitios loxP como un fragmento de ADN
digerido con Bsp120I-XbaI de 1497 pb a partir del
plásmido pGL2neo(m)+ (SEQ ID NO. 4), y se puede ligar en
pBSL-DT4 linealizado con NotI-XbaI
para generar el vector de selección vacío
pBSL-flneo-DT4.
Debido a que los marcadores de selección
antibiótica flanqueados distintos de neomicina se encuentran
raramente, una etapa esencial para la inserción de marcadores de
puromicina o higromicina B flanqueados con loxP en
pBSL-DT4 es la etapa preparatoria de la inserción de
dos sitios loxP. Esto se puede lograr insertando en oligómeros de
ADN sintéticos hibridados con pBSL-DT4. Los sitios
de loxP sintéticos están contenidos en los siguientes dos oligos de
ADN complementarios:
Estos dos oligómeros de ADN se hibridan como se
describe en el ejemplo 5(b), etapa 1, dando como resultado un
fragmento de ADN de doble hebra que contiene dos sitios loxP
separados mediante un sitio de restricción MluI único. Además, los
oligómeros de ADN sintéticos hibridados contienen dos proyecciones
de hebra sencilla 5'-CTAG, que se pueden ligar
directamente en proyecciones de sitios de restricción compatibles
(generadas, por ejemplo, mediante enzimas de restricción SpeI, NheI,
XbaI o AvrII).
El fragmento de ADN que contiene el sitio loxP
doble hibridado se liga entonces en pBSL-DT4
linealizado con SpeI dando como resultado el vector
pBSL-DT4-2loxP (Fig. 6b).
Los casetes de expresión para resistencia a
puromicina o higromicina B se pueden amplificar mediante PCR usando
plásmidos pPur (Clontech) o pPGK-hygro (SEQ ID NO.
1), como moldes de PCR, respectivamente. Los cebadores usados para
amplificación mediante PCR del casete de expresión de puromicina de
1366 pares de bases a partir de pPur (que contiene el ORF de
puromicina bajo control del promotor temprano del virus de simio 40)
son:
Ambos cebadores contienen sitios de
reconocimiento para la endonucleasa de restricción MluI (indicada en
mayúsculas), de forma que el producto de PCR resultante se puede
clonar usando esta enzima de restricción.
Después de la digestión con MluI del producto de
PCR aislado, el fragmento del marcador de puromicina se liga en
pBSL-DT4-2loxP linealizado con MluI
que genera el vector de selección vacío
pBSL-flpur-DT4 (Fig. 6b).
Los cebadores usados para la amplificación
mediante PCR del casete de expresión de higromicina B de 2007 pb,
procedente de pPGK-hygro (SEQ ID NO. 1; que contiene
el ORF de higromicina B bajo control del promotor de fosfoglicerato
quinasa) son:
Ambos cebadores contienen sitios de
reconocimiento para la endonucleasa de restricción MluI (indicada en
mayúsculas), de forma que el producto de PCR resultante se puede
digerir y ligar usando esta enzima de restricción.
Después de la digestión con MluI del producto de
PCR aislado, el fragmento del marcador de higromicina B se liga en
pBSL-DT4-2loxP linealizado con MluI
que genera el vector de selección vacío
pBSL-flhyg-DT4 (Fig. 6b).
Etapa
4
Como ejemplos representativos para la clonación
de vectores de selección para locus génicos endógenos, se describen
las estrategias de clonación para vectores de selección génica
útiles para la mutación dirigida que actúa en cis de los
locus génicos de cadena IgH e Ig\kappaL endógenos, y para la
mutación que actúa en trans del gen RAG1 en células preB
murinas.
La inactivación del locus génico de cadena IgH
murino endógeno en células preB se puede lograr generando muchas
eliminaciones dirigidas que actúan en cis diferentes en ambos
alelos de cadena IgH. Una de las eliminaciones que inactivan IgH es,
por ejemplo, la eliminación de todos los segmentos génicos D_{H}
y J_{H}, que se describe aquí como una de las posibilidades para
hacer que los alelos de IgH endógenos sean incapaces de producir
inmunoglobulinas endógenas. Se presenta aquí la construcción del
vector de selección usando un constructo de selección de neomicina
"flanqueado" como un ejemplo (véase la Fig. 5a). Para la
clonación de vectores de selección génica que contienen otro
constructo de selección antibiótica positivo, como por ejemplo
puromicina o higromicina B, se pueden aplicar estrategias
similares.
Las células preB murinas dependientes de IL7, de
células estrómicas, habitualmente tienen reordenamientos DJ_{H} en
ambos alelos (véase anteriormente). Es necesario tener en cuenta
este hecho para el diseño de vectores de selección.
Independientemente del tipo de reordenamiento DJ_{H}, las
secuencias de ADN que intervienen los segmentos génicos variables y
el agrupamiento de segmento génico D, así como las secuencias de
intervención entre el agrupamiento génico J_{H} y la región
codificante C\mu, aún están presentes en ambos alelos de IgH en
todas las células preB. Por lo tanto, los vectores de selección para
alelos reordenados DJ_{H} tienen que contener regiones de
homología en dirección 5' del elemento D localizado más hacia 5'
(D_{FL16,1}) y en dirección 3' del segmento génico J_{H}
localizado más hacia 3' (J_{H}4).
En la Fig. 5a se representa la organización
genómica de un posible alelo reordenado
D_{FL16,1}-J_{H4} con secuencias de ADN
genómicas circundantes. Como estrategia general para la selección
génica, se clona una región corta de homología de secuencia de ADN
(1-1,5 kb), localizada en dirección 5' de la región
o gen a eliminar, en un sitio de reconocimiento de enzima de
restricción único en dirección 5' de un marcador de selección
positiva "flanqueado" (aquí NotI), y se clona una región más
larga de homología de secuencia de ADN (>2,5 kb), localizado en
dirección 3' de la región o gen a eliminar, en un sitio de
reconocimiento de enzima de restricción único localizado entre el
marcador de selección positiva "flanqueado" y el casete de
expresión de la toxina \alpha de la difteria (Fig. 5a) (aquí
AscI). Por lo tanto, sólo se evita la expresión del marcador de
selección negativa (toxina \alpha de la difteria), si ocurre la
recombinación homóloga en la región larga de homología de secuencia
de ADN del vector de selección y el locus génico endógeno, de forma
que el casete de expresión DT-\alpha se perderá
con la integración dirigida del vector de selección en el ADN
cromosómico. Si ocurre posteriormente la recombinación homóloga en
el brazo de homología corto, la región localizada entre el doble
cruzamiento será sustituida por el marcador de selección de fármaco
positivo. De este modo, el uso de la selección antibiótica en
células preB transfectadas con el constructo de selección da como
resultado la selección fuerte de la integración seleccionada del
vector de selección mediante recombinación homóloga dando como
resultado la eliminación del locus génico endógeno.
Se puede amplificar mediante PCR una región corta
de homología en dirección 5' del elemento D localizado más hacia 5'
(D_{FL16,1}) a partir de ADN genómico de ratón usando los
siguientes cebadores diseñados en base a la secuencia AF018146
publicada de NCBI-Genbank:
Se indican en mayúsculas los nucleótidos de los
sitios de reconocimiento de enzimas de restricción NotI anejos con
fines de clonación. Los cebadores amplificarán un fragmento de PCR
genómico de 1465 pb que se puede digerir con una enzima de
restricción NotI y se puede ligar en
pBSL-flneo-DT4 linealizado con NotI
generando
pBSL-5'J_{H}-flneo-DT4
(Fig. 5a). La región larga de homología de secuencia en dirección 3'
del agrupamiento de segmento génico J_{H}, q también comprende el
potenciador del intrón de la cadena pesada E\muH, se puede
amplificar mediante PCR a partir de ADN genómico de ratón usando los
siguientes cebadores diseñados basándose en el archivo de secuencia
J00440 publicado de NCBI-Genbank (los nucleótidos
del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción AscI anejo se
indican en letras mayúsculas):
Los cebadores amplificarán un fragmento de PCR
genómico de 3215 pb a partir de ADN genómico de ratón que se puede
digerir con la enzima de restricción AscI y se puede ligar en
pBSL-5'J_{H}-flneo-DT4
linealizado con AscI generando el vector de selección J_{H} final
pBSL-5'J_{H}-flneo-3'J_{H}-DT4
que se puede usar para eliminar todos los segmentos génicos D_{H}
y J_{H} restantes en las células preB reordenadas DJ_{H} (Fig.
5a).
Al igual que en el caso del locus de cadena IgH,
los locus génicos de cadena \kappaL se pueden inactivar mediante
varias mutaciones que actúan en cis, incluyendo por ejemplo
eliminaciones de todos los segmentos génicos J_{\kappa }, el
potenciador del intrón de la cadena \kappaL (\kappaiE), la
región de cadena \kappaL constante (C_{\kappa }), o el
potenciador 3'\kappa (3'\kappaE). Como ejemplo, se describen
aquí constructos de selección y métodos que se pueden usar para la
eliminación dirigida de todos los segmentos génicos J_{\kappa }.
Además, la construcción de los constructos de selección descrita
aquí se presenta sólo para constructos de selección que contienen un
marcador de resistencia a neomicina "flanqueado". La clonación
de los constructos de selección que contienen los casetes de
expresión de puromicina o higromicina B "flanqueados" se
realiza de manera análoga. Se amplifica mediante PCR una región
corta de homología en dirección 5' de la agrupación de segmento
génico J_{\kappa }, a partir de ADN genómico de ratón usando los
siguientes cebadores diseñados según la entrada V00777 publicada de
NCBI-Genbank (se presentan en letras mayúsculas los
nucleótidos del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción de
NotI anejo con fines de clonación):
El cebador P019 se une a la posición
1-30 y el cebador P020 a la posición
711-738 de la entrada V00777 de
NCBI-Genbank. El fragmento de PCR de 738 pb
resultante se digiere con la enzima de restricción NotI y se liga en
el vector de selección vacío linealizado con NotI
pBSL-flneo-DT4 generando
pBSL-5'J_{\kappa
}-flneo-DT4 (Fig. 5b). La región
larga de homología de secuencia de ADN en dirección 3' del
agrupamiento de segmento génico J_{\kappa }, que comprende el
\kappaiE y la región de cadena \kappaL constante (C_{\kappa
}), se amplifica mediante PCR a partir de ADN genómico de ratón
usando los siguientes cebadores diseñados basándose en la entrada
V00777 publicada de NCBI-Genbank (se dan en letras
mayúsculas los nucleótidos del sitio de reconocimiento de enzimas de
restricción AscI anejo):
El cebador P021 se unirá a la posición
2129-2158, y el cebador P022 a la posición
5456-5483 de la secuencia V00777 de
NCBI-Genbank. El fragmento de PCR de 3379 pb
resultante se digiere con la enzima de restricción AscI y se liga en
el vector linealizado con AscI pBSL-5'J_{\kappa
}-flneo-DT4 generando
pBSL-5'J_{\kappa
}-flneo-3'J_{\kappa
}-DT4 (Fig. 5b).
Como una alternativa para inactivar el potencial
de célula preB para expresar inmunoglobulinas endógenas
introduciendo mutaciones que actúan en cis dentro de los
locus génicos de cadena IgH e Ig\kappaL, las células preB también
se pueden hacer incapaces para el reordenamiento de sus genes de Ig
endógenos, introduciendo mutaciones que actúan en trans. Esto se
puede lograr, por ejemplo, seleccionando uno de los dos genes
activantes de la recombinación (RAG) que son esenciales para los
reordenamientos génicos de Ig. Las células preB murinas con
eliminaciones en el gen RAG-1 o el gen
RAG-2 serán incapaces de reordenar segmentos génicos
de inmunoglobulina y por lo tanto serán incapaces de expresar
inmunoglobulinas endógenas.
Como ejemplo, se describe la construcción de un
vector de selección que permite la eliminación completa del ORF del
gen RAG-1. Se amplifica un brazo corto de homología
de secuencia de ADN de alrededor de 1 kb de secuencia genómica en
dirección 5' de la región codificante de RAG-1,
mediante el siguiente par de cebadores diseñados basándose en la
secuencia AC084753 publicada de NCBI-Genbank:
Se resaltan en mayúsculas los sitios de clonación
de NotI anejos al extremo 5' de cada cebador, y se usan para la
clonación de un fragmento de PCR de 1095 pb que contiene la región
genómica en dirección 5' del marco de lectura abierta de
RAG-1 (Fig. 5c). El producto de PCR se digiere con
NotI y se liga en el sitio de NotI único de un vector de selección
positivo-negativo, por ejemplo
pBSL-flneo-DT4. Se aísla un clon
plasmídico que contiene el brazo corto de homología en dirección 5'
de la región codificante de RAG-1, en orientación
correcta, y se diseña
pBSL-5'R1-flneo-DT4.
Para la clonación del brazo largo de un
constructo de selección para el gen RAG-1, se
amplifica una región genómica de aproximadamente 3 kb directamente
en dirección 3' de la región codificante de RAG-1
(Fig. 5c) mediante el siguiente par de cebadores, diseñados basados
en la secuencia AC084753 de Genbank:
Se añaden las secuencias de reconocimiento para
la enzima de restricción AscI al extremo 5' de cada cebador, y se
usan para la clonación del fragmento de PCR largo de 2954 pb que
contiene el brazo largo de homología de secuencia de ADN en
dirección 3' del marco de lectura abierta de RAG-1.
Después de la digestión con AscI, este producto de PCR se clona en
el sitio de restricción de AscI del vector
pBSL-5'R1-flneo-DT4.
Se aísla un clon plasmídico que contiene el brazo largo de homología
en dirección 3' de la región codificante de RAG-1,
en la orientación correcta, y se diseña como
pBSL-5'R1-flneo-3'R1-DT4
(Fig. 5c) y se puede usar directamente para la eliminación dirigida
del gen RAG-1 endógeno en células preB.
Etapa
5
Para la eliminación seleccionada secuencial de
ambos alelos de un locus endógeno génico, se pueden aplicar dos
estrategias diferentes. Una estrategia es utilizar vectores de
selección con dos marcadores de selección positivos diferentes para
la selección de los dos alelos diferentes. Como alternativa, otra
estrategia es usar el mismo constructo de selección dos veces para
la selección secuencial de ambos alelos endógenos. Sin embargo, en
el caso de esta última estrategia, la selección del primer alelo ha
de ser seguida por la expresión transitoria de un vector para cre
recombinasa en células preB, lo que conducirá a la eliminación
permanente del marcador de selección de fármaco flanqueado por el
sitio loxP, de forma que se puede usar la misma selección de fármaco
antibiótico para la segunda selección del otro alelo.
Como un ejemplo, se describe el procedimiento
experimental para la selección secuencial de ambos alelos de un gen
endógeno según la primera estrategia, es decir usando vectores de
selección con dos marcadores de resistencia a antibióticos
diferentes (puromicina e higromicina B).
Para seleccionar un locus génico en el primer
alelo, se transfectan 20 \mug de vector de selección linealizado
con un marcador de resistencia a puromicina en 10^{7} células preB
resuspendidas en PBS mediante electroporación a 350 V con una
capacitancia de 960 \muF usando un electroporador BioRad y una
cubeta electroporadora de 0,4 cm. Las células se colocan entonces en
placas en medio de crecimiento de IL7 a una densidad de 5 x 10^{4}
células/pocillo en cultivos de placas de 96 pocillos revestidas con
una capa subconfluente de células estrómicas ST-2
resistentes a puromicina irradiadas con 3000 rad. Se añade
puromicina 30 horas después de la transfección, a una concentración
final de 2 \mug/ml. Las colonias resistentes a puromicina se
aíslan 7-10 días después de la transfección y se
expanden en células estrómicas ST-2 recientes,
resistentes a puromicina, e irradiadas, bajo selección continua con
2 \mug/ml de puromicina. Los clones de células preB resistentes a
puromicina individuales se analizan para la integración seleccionada
del vector de selección en un alelo mediante PCR estándar y análisis
de hibridación de transferencia southern genómica. Los clones de
células preB con una integración seleccionada del vector
seleccionado en un alelo se transfectan nuevamente, esta vez con 20
\mug de vector de selección linealizado que contiene un marcador
de resistencia a higromicina B en las mismas condiciones como se
describen anteriormente. Las células preB transfectadas se colocan
entonces en placas en medio de crecimiento de IL7, a una densidad de
5 x 10^{4} células/pocillo, en cultivos de placas de 96 pocillos
revestidos con una placa subconfluente de células estrómicas
ST-2 con resistencia doble a puromicina e
higromicina B, irradiadas con 3000 rad. Los clones de células preB
doblemente resistentes se seleccionan 30 horas tras la transfección
mediante adición de 2 \mug/ml de puromicina y 400 \mug/ml de
higromicina B. Las colonias doblemente resistentes a puromicina e
higromicina B se aíslan 7-10 días después de la
transfección, y se expanden en células estrómicas
ST-2 doblemente resistentes a puromicina/higromicina
B, irradiadas, recientes, en selección continua con 2 \mug/ml de
puromicina y 400 \mug/ml de higromicina B. Los clones de células
preB doblemente resistentes a puromicina/higromicina B individuales
se analizan para determinar la integración seleccionada del vector
de selección en el segundo alelo nuevamente mediante análisis de PCR
y/o de transferencia southern genómica estándar.
Los clones de células preB doblemente resistentes
a puromicina/higromicina B, con dos alelos seleccionados, se pueden
transfectar entonces de forma transitoria con un vector de expresión
constitutivo de cre recombinasa a fin de repetir experimentos de
selección génica sobre otros locus génicos y alelos. Esto se puede
realizar transfectando de forma transitoria células preB con 20
\mug de vector de expresión superenrollado de cre recombinasa
mediante electroporación como se describe anteriormente. Las células
transfectadas de forma transitoria se colocan entonces en placas en
condiciones de dilución limitante en medio de crecimiento de
IL-7 en varias placas de 96 pocillos sobre células
estrómicas ST-2 subconfluentes, irradiadas con 3000
rad. Después de 7 días de cultivo, se coloca replicadamente en
placas un conjunto de 48 clones sobre células estrómicas
ST-2 normales para el cultivo continuo, y sobre
células ST-2 resistentes individualmente a
puromicina o a higromicina B bajo la selección respectiva.
Previamente los clones de células preB doblemente resistentes a
puromicina/higromicina B, que se hicieron sensibles a ambos
antibióticos, han sufrido igualmente la eliminación mediada por cre
recombinasa de ambos marcadores de resistencia flanqueados con loxP.
Una vez que se ha verificado mediante análisis de transferencia
southern la eliminación mediada por cre recombinasa de los dos
marcadores de resistencia, los clones se pueden someter a los
procedimientos de selección génica adicional para otros locus
génicos endógenos y alelos.
A fin de reprogramar las células preB
dependientes de IL7, de células estrómicas, murinas para la
producción de inmunoglobulinas humanas, se pueden usar nuevos
vectores de expresión retrovíricos que codifican polipéptidos de
anticuerpos humanos. Se describen métodos para la generación de
vectores retrovíricos recombinantes que permiten la expresión
regulada de las proteínas de cadena IgH y L humanas, dependiendo de
la etapa de diferenciación de las células B, primero como
inmunoglobulinas unidas a la membrana y después como
inmunoglobulinas segregadas. Se debe observar que se puede clonar
cualquier tipo de proteína de unión heteróloga en estos vectores
retrovíricos que permiten la expresión de cualquier tipo de proteína
de unión heteróloga y humana. La descripción de la clonación de
vectores de transferencia retrovíricos, para la expresión de cadenas
IgH e IgL humanas descritas aquí, se debería observar por lo tanto a
título de ilustración y no como exclusión. Los vectores retrovíricos
recombinantes pueden acomodar hasta 7-10 kb de
secuencias de ADN heterólogas, lo que requiere el diseño de
constructos separados para glicoproteínas de cadena IgH y L
incluyendo todos los elementos de control, potenciadores y
promotores específicos de tipo celular y de etapa de diferenciación
requeridos, así como señales de división de genes de Ig endógenos.
Estos elementos de control son necesarios para asegurar la expresión
apropiada, la deposición de membrana y la secreción de
inmunoglobulinas, su maduración de afinidad, en las diversas etapas
de diferenciación de las células B, así como un nivel elevado de
secreción de anticuerpos heterólogos en células plasmáticas. Los
constructos retrovíricos individuales para las cadenas IgH y L se
pueden cotransducir en células preB con lo que los constructos se
integran establemente en el genoma de las células preB infectadas.
Si se usan células preB murinas que carecen del potencial para
expresar inmunoglobulinas endógenas (véase la descripción anterior),
entonces sólo se expresarán anticuerpos o proteínas de unión
heterólogos o humanos en células de línea B con la diferenciación de
las células preB transducidas de forma retrovírica.
Debido a que los constructos retrovíricos para
las diversas proteínas de cadena IgH y L se transducirán
eventualmente en células murinas, los elementos del promotor y del
potenciador que controlan la expresión de Ig tendrán origen murino a
fin de averiguar las interacciones óptimas con factores de
transcripción murinos específicos de la línea D.
El vector de partida a partir del cual se generan
los constructos de expresión retrovíricos es el vector de clonación
retrovírico vacío pLIB (Clontech) (Fig. 12a). La generación de un
vector de expresión retrovírico recombinante para cadenas pesadas
inmunoglobulínicas humanas es un proceso de clonación de múltiples
etapas que implica la clonación secuencial de los elementos del
promotor y del potenciador, así como las regiones codificantes de
las diversas regiones variable y constante de anticuerpos humanos en
el vector de clonación retrovírico vacío pLIB. En una primera etapa,
se clona mediante PCR un promotor V_{H} murino en el sitio de
restricción único ClaI del sitio de clonación múltiple de pLIB. Esto
se realiza mediante amplificación por PCR de un elemento promotor
V_{H} de ratón a partir de ADN genómico de ratón usando los
siguientes cebadores diseñados basándose en el número de acceso
X71119 de la base de datos publicada de
NCBI-Genbank.
Estos cebadores amplificarán mediante PCR un
fragmento promotor V_{H} de 394 pb que contendrá sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción para ClaI (ATCGAT) en sus
extremos 5' y 3', debido a que se incorporan en los extremos 5' de
los cebadores P027 y P028. Además de los sitios ClaI en ambos
cebadores, el cebador inverso P028 contiene un sitio de restricción
BamHI adicional (GGATCC, subrayado) que introduce otro sitio de
restricción único en el producto de PCR (véase la Fig. 12a), que se
requerirá para etapas adicionales de clonación. Después de la
digestión con la enzima de restricción ClaI del fragmento PCR, el
fragmento PCR del promotor V_{H} amplificado, que incluye el nuevo
sitio BamHI, se liga en el vector pLIB linealizado con ClaI. Los
productos de ligamiento que contienen el promotor V_{H} en la
orientación deseada (opuesta a la orientación transcripcional del
promotor de 5'LTR) se identifican mediante digestiones con enzima de
restricción de diagnóstico y secuenciamiento de ADN, y se denominan
pAB-1 (Fig. 12a).
La segunda etapa es la clonación del potenciador
de la cadena pesada del intrón murino (E\muH) con sus regiones de
unión a matriz flanqueantes (MAR) en el vector retrovírico
pAB-1. El elemento potenciador E\muH, con sus MAR
flanqueantes es necesario para la expresión eficaz de proteínas
inmunoglobulínicas en células de línea B. La clonación del elemento
potenciador E\muH se realiza amplificando un fragmento de PCR de
983 pb a partir de ADN genómico de ratón usando los siguientes
cebadores diseñados según la secuencia J00440 publicada de
NCBI-Genbank:
Los sitios de restricción (BamHI/HindIII para
p029, y NotI para P030), anejos al extremo 5' de cada cebador, se
resaltan con letras mayúsculas. El producto de PCR se puede digerir
entonces con enzimas de restricción BamHI y NotI, y se liga
direccionalmente en el vector retrovírico linealizado con BamHI/NotI
pAB1, dando como resultado el vector pAB-2. El
cebador de sentido p029 contiene la secuencia para un sitio HindIII
adicional (subrayado), que dará lugar a un sitio de reconocimiento
de enzima de restricción único en pAB-2, requerido
para las etapas posteriores de clonación.
Seguidamente, se añade un fragmento de ADN, que
contiene el potenciador 3'\alpha murino, al constructo
pAB-2. Se sabe que el potenciador 3'\alpha se
requiere para la expresión óptima y de nivel elevado y para la
secreción de anticuerpos en la etapa de diferenciación de células
plasmáticas. Se sabe que el potenciador 3'\alpha contiene cuatro
sitios de hipersensibilidad de ADNasaI (HS1, HS2, HS3 y HS4) que
comprenden diversos sitios de unión para factores de transcripción
específicos de células B tardías/células del plasma. En ensayos de
genes informadores se demostró que HS1 y 2, que están localizados en
un fragmento de ADN genómico de 0,6 kb, confiere al menos 80% de la
actividad del potenciador 3'\alpha con poca contribución de HS3 y
4 que son altamente homólogos en secuencia de ADN.
Los cuatro componentes del potenciador
3'\alpha, HS1, 2, 3 y 4, constituyen una denominada región de
control del locus (LCR) que es capaz de regular la actividad
transcripcional de un locus génico dado independientemente de las
secuencias de ADN flanqueantes. Por lo tanto, un vector de expresión
retrovírico básico para cadenas pesadas inmunoglobulínicas debería
contener al menos las regiones HS1,2 del potenciador 3'\alpha que
se pueden amplificar mediante PCR a partir de ADN genómico de ratón
usando cebadores diseñados según la entrada de secuencia X96607
publicada de NCBI-Genbank (en mayúsculas se resaltan
las secuencias de reconocimiento para sitios de enzimas de
restricción adicionales requeridos para la clonación del fragmento
del PCR o de etapas de clonación posteriores):
Además de los sitios SalI terminales 5' (GTCGAC)
en cada uno de los cebadores, el cebador P031 de sentido contiene un
sitio MluI adicional (subrayado), y el cebador P028 inverso contiene
un sitio XhoI adicional (subrayado). Los cebadores P031 y P032
amplificarán un fragmento de PCR de 644 pb que se puede digerir con
la enzima de restricción SalI y que se puede ligar en el vector
linealizado con SalI pAB-2. Mediante digestión con
enzima de restricción para diagnóstico y mediante secuenciación de
ADN se determina un clon con el inserto en la orientación deseada
(véase la Fig. 12b), y se denomina pAB-3 (Fig.
12b).
Opcionalmente, los componentes adicionales del
potenciador 3'\alpha, HS3 y 4, se pueden incluir en los
constructos de vectores retrovíricos para la expresión de IgH. Para
ello, se puede amplificar mediante PCR un fragmento de 466 pb que
comprende la región HS4 del potenciador 3'\alpha, a partir de ADN
genómico de ratón como un molde usando los siguientes cebadores
diseñados según la entrada de secuencia S74166 publicada de
NCBI-Genbank:
En mayúsculas se resaltan los sitios de enzimas
de restricción anejas a los términos 5' de cada cebador. Además de
los sitios de restricción de XhoI (CTCGAG) presentes en ambos
cebadores, el cebador P034 inverso contiene un sitio de restricción
SphI adicional (GCATGC, subrayado) que contiene un sitio de
restricción único adicional requerido para fines posteriores de
clonación. La amplificación mediante PCR con el par de cebadores
P033 y P034 en ADN de ratón genómico dará como resultado un
fragmento de PCR de 466 pb que se puede digerir con la enzima de
restricción XhoI, y que entonces se puede ligar en el vector
linealizado con XhoI pAB-3. El clon con el inserto
HS4 en la orientación deseada se determina mediante digestión con
enzima de restricción de diagnóstico y secuenciamiento de ADN, y se
denomina como constructo vectorial pAB-4 (Fig. 12b).
El fragmento del último potenciador 3'\alpha, HS3, se puede
amplificar mediante PCR usando ADN genómico de ratón como molde, con
los siguientes cebadores diseñados según la entrada de secuencia
X96607 publicada de NCBI-Genbank (nuevamente se
resaltan en mayúsculas las secuencias de reconocimiento para la
enzima de restricción SphI):
La región HS3 del potenciador 3'\alpha
amplificada mediante PCR se digiere con la enzima de restricción
SphI y se liga en el vector linealizado con SphI,
pAB-4, a fin de generar pAB-5. Se
puede usar cualquiera de los vectores pAB-3, 4 ó 5
para insertar las regiones codificantes para cadenas pesadas de
inmunoglobulinas heterólogas (Fig. 12b).
Cada uno de los isotipos inmunoglobulínicos
humanos se puede expresar como una inmunoglobulina de superficie
unida a membrana, o como un anticuerpo segregado, que se regula
mediante sucesos de corte y empalme alternativos que mantienen o
eliminan los exones que se extienden sobre la membrana a partir del
transcrito de ARNm. Aunque cada isotipo inmunoglobulínico tiene su
propia región codificante para los exones que se extienden sobre la
membrana, las regiones membranales de todos los anticuerpos IgG, IgA
e IgE humanos son virtualmente idénticas para los subtipos
individuales. Por lo tanto, se pueden emplear los mismos exones de
membranas de IgG para el anclamiento a la membrana de anticuerpos
IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, se usa un conjunto diferente de exones para
IgA1 e IgA2, y se requieren cada uno de los diferentes exones para
cada uno de los anticuerpos IgE e IgM.
Por lo tanto, la siguiente etapa en el
procedimiento de clonación con respecto a la generación de
constructos de expresión de Ig retrovíricos recombinantes es la
inserción de las regiones que se extienden sobre la membrana para
anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE humanos en cualquiera de los
vectores pAB-3, 4 ó 5. Como ejemplo representativo,
se describen los procedimientos de clonación posteriores para el
constructo retrovírico básico pAB-3 que contiene los
elementos del promotor V_{H}, el potenciador E\muH y el
potenciador 3'\alphaE mínimo (HS1,2) (Fig. 12c).
La región que se extiende sobre la membrana, de
cadena \muH, está codificada por dos exones, \muM1 y \muM2,
localizados 1,85 kb en dirección 3' de los exones C_{\mu
}H_{1}-C_{\mu }H_{4} de la región constante
C_{\mu }H. Los exones \muM1 y \muM2, que incluyen el sitio de
poliadenilación endógeno, están contenidos en un fragmento genómico
de 773 pb que se puede amplificar a partir de ADN genómico de ratón
mediante PCR usando los siguientes cebadores diseñados basándose en
la secuencia contigua NT_010168 publicada de
NCBI-Genbank:
Los sitios de restricción MluI anejos al extremo
5' de cada cebador se resaltan en letras mayúsculas. El producto de
PCR resultante se puede digerir con la enzima de restricción MluI, y
el fragmento de 773 pb resultante se liga en el vector linealizado
con MluI pAB-3. Un clon que contiene los exones
\muM1 y \muM2 en orientación correcta y la secuencia de ADN
según se verifica mediante cartografía de enzima de restricción y
mediante secuenciación de ADN, se denomina constructo
pAB-3.1 (Fig. 12c).
La deposición sobre membrana de anticuerpos IgG
se puede lograr, por ejemplo, mediante los exones que se extienden
sobre membrana del gen IgG_{1}. La región que se extiende sobre la
membrana de IgG_{1} está codificada por dos exones localizados
1,25 kb en dirección 3' de los exones C_{\gamma 1}H que se
extienden una región de 1,9 kb. A fin de acortar el intrón entre
\gamma1M1 y \gamma1M2, se usa un enfoque de PCR de extensión por
solapamiento (SOE), mediante el cual los dos exones se fusionan a un
fragmento de PCR más pequeño. Generalmente, la fusión de los dos
productos se puede lograr si el cebador inverso del producto de PCR
en dirección 5' y el cebador de sentido del producto de PCR en
dirección 3' muestran una complementariedad de apenas
30-40 pb. Estas regiones de complementariedad
perfecta se pueden añadir como 15-20 nucleótidos a
los extremos 5' del cebador inverso y los cebadores directos usados
para la amplificación de los productos de PCR en dirección 5' y en
dirección 3', respectivamente. Sin embargo, en el caso de la fusión
de los dos exones \gamma1M1 y \gamma1M2, por coincidencia, están
presentes dos secuencias completamente idénticas de 28 pb, 78 pb en
dirección 3' de \gamma1M1 y 256 pb en dirección 5' del exón
\gamma1M2. Estas secuencias se pueden usar para generar un
fragmento de PCR más corto mediante SOE-PCR que
contiene tanto el exón \gamma1M1 como \gamma1M2 para la región
que se extiende sobre membrana de las cadenas \gammaH. Por lo
tanto, se realizan dos PCR en paralelo sobre ADN genómico humano
usando los siguientes cebadores diseñados basándose en la secuencia
AL122127 publicada de NCBI-Genbank. Se amplifica un
fragmento de PCR de 315 pares de bases, que contiene el exón 1 que
se extiende sobre la membrana \gamma1 (\gamma1M1) a partir de
ADN genómico humano usando los cebadores:
uniéndose el cebador P039 a la
posición 9710-9741, y uniéndose el cebador P040 a la
posición 9435-9462 de la entrada de secuencias
AL122127 de
NCBI-Genbank.
Un fragmento de PCR de 555 pares de bases, que
contiene el exón 2 de extensión sobre la membrana (\gamma1M2) se
puede amplificar a partir de ADN genómico humano usando los
cebadores:
uniéndose el cebador P041 a la
posición 8137-8164, y uniéndose el cebador P042 a la
posición 7624-7654 de la entrada de secuencia
AL122127 de NCBI-Genbank. Los dos productos de PCR
se pueden fusionar entonces a un producto de fusión mediante PCR de
822 pb mezclando 1/100 del producto de PCR del exón \gamma1M1 con
1/100 del producto de PCR del exón \gamma1M2, y repitiendo una PCR
con cebadores de sentido e inversos P039 y P042. Además de los
sitios de reconocimiento de enzimas de restricción MluI, presentes
en ambos cebadores P039 y P042 (resaltados en mayúscula), que se
requieren para la clonación del producto de PCR mediante fusión por
SOE, el cebador P042 contiene adicionalmente la secuencia de
complementariedad de una señal de poliadenilación artificial
(subrayada) que permite la terminación transcripcional correcta del
transcrito inmunoglobulínico en el vector de expresión
inmunoglobulínico retrovírico final. El fragmento de PCR de señal
\gamma1M1\mu1M2-polyA, de 832 pb, se digiere
entonces con la enzima de restricción MluI y se liga en el vector
pAB-3. Un clon con la orientación correcta del
inserto verificada mediante cartografía de enzima de restricción y
secuenciación de ADN se denomina clon pAB-3.2 (Fig.
12c).
La clonación de la región codificante que se
extiende sobre la membrana \alpha1 se puede lograr mediante PCR
amplificando a partir de ADN genómico humano un fragmento que
contiene el exón individual para \alpha1M que incluye su sitio
polyA endógeno. Los siguientes cebadores se pueden usar para esta
amplificación mediante PCR, diseñados según la entrada de secuencias
M60193 publicada de NCBI-Genbank:
Ambos cebadores contenían sitios de clonación de
MluI añadidos al extremo 5' de cada cebador (resaltado en
mayúsculas), y amplificará un producto de PCR de 768 pares de bases
que se puede digerir con la enzima de restricción MluI que entonces
se liga en pAB-3 linealizado con MluI. Un clon con
la orientación correcta del inserto verificada mediante cartografía
de enzima de restricción y secuenciación de ADN se denomina clon
pAB-3.3.
Para la expresión de anticuerpos IgE unidos a
membrana, la región que se extiende sobre la membrana para las
cadenas \varepsilon_{1}H, que están codificadas por dos exones,
\varepsilon_{1}M1 y \varepsilon_{1}M2, se clona mediante
PCR. Para ello, se amplifica un producto de PCR de 858 pb a partir
de ADN genómico humano usando los siguientes cebadores diseñados
según la entrada de secuencia X63693 publicada de
NCBI-Genbank:
Ambos cebadores contienen sitios de clonación de
MluI añadidos al extremo 5' de cada cebador (resaltado en letras
mayúsculas) dando como resultado un producto de PCR de 858 pb que se
puede digerir con la enzima de restricción MluI. Además, el cebador
inverso P046 se diseña para que contenga la secuencia de
complementariedad de una señal polyA artificial (subrayada) que
asegura la terminación apropiada de la transcripción de ARNm en el
constructo de expresión final. El fragmento de PCR digerido con MluI
se liga en pAB-3 linealizado con MluI. Un clon con
la orientación correcta del inserto verificada mediante cartografía
de enzima de restricción y secuenciación de ADN se denomina clon
pAB-3.4.
Tras la clonación de los diversos exones que se
extienden sobre membrana para los isotipos IgG, IgA, IgM e IgE, se
han de insertar los exones para las diversas regiones constantes
humanas en constructos retrovíricos pAB-3.1 a 3.4.
Para ello, los fragmentos de ADN que codifican los exones de región
constante se clonan en el sitio de reconocimiento de enzima de
restricción NotI único de cada uno de los constructos
pAB-3.1 a 4.
En la Fig. 12d se representa la clonación de los
vectores de expresión retrovíricos para todos los isotipos de cadena
H inmunoglobulínicos, \gamma1, \gamma2, \gamma3 y \gamma4.
Los siguientes cebadores se pueden usar para la amplificación
mediante PCR de los cuatro subtipos de cadena pesada de IgG
diferentes usando ADN genómico humano como molde de la PCR:
Para \gamma1 (cebadores diseñados según la
secuencia AL122127 publicada de NCBI-Genbank):
Para \gamma2 (cebadores diseñados según la
secuencia J00230 publicada de NCBI-Genbank):
Para \gamma3 (cebadores diseñados según la
secuencia AL122127 publicada de NCBI-Genbank):
Para \gamma4 (cebadores diseñados según la
secuencia K01316 publicada de NCBI-Genbank):
En cada caso, los productos de PCR de 1788 pb
para \gamma_{1}H, de 1959 pb para \gamma_{2}H, de 2374 pb
para \gamma_{3}H, y de 1820 pb para \gamma_{4}H, se pueden
digerir con la enzima de restricción NotI, con lo que el fragmento
digerido se liga en pAB-3.2 linealizado con NotI
(Fig. 12d). Los constructos que contienen los insertos en la
orientación correcta y sin ninguna mutación, según se determina
mediante cartografía de enzima de restricción y secuenciación de
ADN, se denominan pAB-3.2-G1,
pAB-3.2-G2,
pAB-3.2-G3 y
pAB-3.2-G4, respectivamente.
Para la clonación de los exones de región
constante que codifican a las cadenas \muH, \alpha1H, \alpha2H
y \varepsilonH, se emplean métodos idénticos (Fig. 12e). Los
siguientes cebadores se usan para la amplificación mediante PCR de
los diferentes isotipos de IgH usando como molde ADN genómico
humano:
Para \muH (cebadores diseñados según la
secuencia AB019441 publicada de NCBI-Genbank):
Para \alpha_{1}H y \alpha_{2}H (cebadores
diseñados según las secuencias J00220 y J00221 publicada de
NCBI-Genbank):
Para \varepsilonH (cebadores diseñados según la
secuencia L00022 publicada de NCBI-Genbank):
En cada caso, los productos de PCR de 2229 pb
para \muH, de 1667 pb para \alpha_{1}H y \alpha_{2}H, y de
1908 pb para \varepsilonH, se pueden digerir con la enzima de
restricción NotI y se pueden ligar en pAB-3.1,
pAB-3.3 y pAB-3.4, respectivamente,
linealizados con NotI (Fig. 12e). Los constructos que contienen los
insertos en orientación correcta y sin ninguna mutación, según se
determina mediante cartografía de enzima de restricción y
secuenciación de ADN, se denominan
pAB-3.1-M,
pAB-3.3-A1,
pAB-3.3-A2, y
pAB-3.4-E, respectivamente.
Los diferentes constructos de expresión de cadena
H retrovíricos, controlados por los elementos promotores y
potenciadores de cadena IgH naturales, aún requieren la inserción de
una región codificante de dominio variable, que se presentará
después de la descripción de los métodos para la clonación de
vectores de expresión de cadena IgL retrovíricos, debido a que se
presentarán estrategias similares para expresar especificidades
únicas o diversas para ambos constructos de expresión de cadena IgH
e IgL retrovíricos completos.
De forma similar a los constructos diseñados para
la expresión de la cadena IgH, los constructos retrovíricos
diseñados para la expresión específica de etapa de diferenciación de
cadenas Ig\kappaL requieren la presencia del promotor específico
del locus de cadena \kappaL definido y de los elementos
potenciadores. Estos incluyen un promotor V\kappa, el potenciador
del intrón de cadena ligera \kappa (\kappaiE) y los elementos
potenciadores \kappa3' (\kappa3'E). La clonación secuencial de
estos elementos se puede lograr según lo siguiente (Fig. 13a,
b).
Se amplifica mediante PCR un promotor V\kappa
de ratón como un fragmento de PCR de 290 pb a partir de ADN genómico
de ratón usando los siguientes cebadores (diseñados según la entrada
de secuencia X52768 publicada de NCBI-Genbank):
Los sitios de restricción añadidos al extremo 5'
de cada cebador se resaltan en letras mayúsculas. Además de los
sitios ClaI presentes en los extremos 5' de ambos cebadores, el
cebador inverso P062 contiene un sitio de restricción BamHI
adicional (GGATCC, subrayado) que introduce otro sitio de
restricción único en el producto de PCR que se usará para
posteriores fines de clonación. Después de la digestión con la
enzima de restricción ClaI del fragmento de PCR, el promotor
V_{\kappa } amplificado se liga en el vector pLIB linealizado con
ClaI. Los productos de ligamiento que contienen el promotor
V_{\kappa } en la orientación deseada (opuesta a la orientación
transcripcional del promotor de 5'LTR) se identifican mediante
cartografía de enzima de restricción de diagnóstico y secuenciación
de ADN, dando lugar al constructo pAB-6 (Fig.
13a).
El \kappaiE y la región codificante para el
dominio constante de cadena \kappaL están localizados en estrecha
proximidad en ambos locus génicos de cadena \kappaL de seres
humanos y de ratón, y el potenciador parece que funciona entre
especies. Por lo tanto, se describen los procedimientos de clonación
opcionales para dos vectores de expresión retrovíricos diferentes
que codifican cadenas \kappaL, utilizando uno el potenciador del
intrón \kappa (\kappaiE) humano, y utilizando el otro el
potenciador del intrón \kappa murino. Se debe observar que ambos
constructos se pueden usar de forma intercambiable. La clonación del
constructo que contiene el \kappaiE humano se puede lograr
amplificando un fragmento de PCR a partir de ADN genómico humano que
contiene tanto el \kappaiE humano como el exón C\kappa humano
que incluye un MAR localizado en 5', usando los siguientes cebadores
(diseñados basándose en la entrada de secuencia AF017732 publicada
de NCBI-Genbank):
Nuevamente se resaltan en letras mayúsculas
sitios de restricción adicionales añadidos al extremo 5' de cada
cebador (BamHI en el cebador P063 y NotI en P064). El cebador P063
contiene la secuencia para un sitio de restricción de MluI adicional
usado en etapas de clonación posteriores. Los cebadores de PCR
amplifican un fragmento de 2359 pb que se puede digerir con BamHI y
NotI, y que entonces se puede clonar direccionalmente en
pAB-6 linealizado con BamHI-NotI
generando el constructo retrovírico pAB-7 (Fig.
13a).
Para el constructo que utiliza el \kappaiE
murino, se fusiona un producto de PCR, que contiene el \kappaiE
murino, a un producto de PCR que contiene la región C\kappa humana
mediante el enfoque de SOE-PCR descrito previamente.
Para ello, se realiza primeramente en paralelo la amplificación
mediante PCR del \kappaiE murino y de la región C\kappa humana,
mostrando el cebador inverso de \kappaiE y el cebador directo de
la región C\kappa una región de 36 pb de complementariedad. En la
segunda PCR, que se usa para fusionar estos dos productos de PCR, se
mezcla 1/100 de cada reacción de PCR y se amplifica con el cebador
directo de \kappaiE (P065) y el cebador inverso de región
C\kappa (P064), dando como resultado la fusión de los dos
productos de PCR en la región de complementariedad terminal de 36
pb.
Los siguientes cebadores se pueden usar para la
amplificación del \kappaiE murino (diseñado basándose en la
entrada de secuencia V00777 publicada de
NCBI-Genbank), usando como molde un ADN genómico de
ratón:
Los siguientes cebadores se pueden usar para la
amplificación de la región C\kappa humana (diseñados basándose en
la entrada de secuencia AF017732 publicada de
NCBI-Genbank), usando como molde un ADN genómico
humano:
Las regiones de complementariedad terminal en los
cebadores P066 y P067 están subrayadas, las cuales median la fusión
de los dos productos PCR en una segunda PCR llevada a cabo con los
cebadores P065 y P064 y una mezcla de los dos primeros productos de
PCR como molde. El producto de PCR de fusión \kappaiE murino con
C\kappa humano resultante, de 1524 pb, se puede digerir con BamHI
y NotI y entonces se clona direccionalmente en el vector
pAB-6 linealizado con BamHI-NotI
generando el vector pAB-8 (Fig. 13a).
Seguidamente, el \kappa3'E murino se clona en
dirección 3' de las regiones C\kappa humanas tanto en
pAB-7 como pAB-8 generando los
constructos pAB-7.1 y pAB-8.1,
respectivamente. Los cebadores usados para la amplificación mediante
PCR para el \kappa3'E a partir de ADN genómico de ratón son los
siguientes (diseñados basándose en la entrada de secuencia X15878
publicada de NCBI-Genbank):
Ambos cebadores contienen sitios de restricción
SalI (resaltados en letras mayúsculas), de forma que el producto de
PCR de 827 pb se puede clonar en los sitios de restricción de SalI
compatibles de pAB-7 y pAB-8. Los
clones vectoriales que tienen el inserto en la orientación correcta
y con la secuencia de ADN correcta, según se determina mediante
cartografía de enzima de restricción y secuenciación de ADN, se
denominan pAB-7.1 y pAB-8.1 (Fig.
13a).
En una siguiente etapa de clonación, se clona un
marcador de resistencia a puromicina, bajo control de un promotor
constitutivo de SV40, en los constructos de expresión de cadena
\kappaL retrovíricos. Se prefiere la inclusión de un casete de
expresión para resistencia a puromicina, debido a que ambos
constructos retrovíricos de cadena IgH e IgL necesitan ser
cotransducidos establemente en células preB murinas a fin de
permitir la expresión de anticuerpos heterólogos completos. A fin de
aumentar la eficacia de la cotransfección retrovírica, los
constructos de cadena IgL retrovíricos se transducen primeramente, y
las células transducidas establemente se seleccionan para determinar
la integración de los constructos de cadena IgL usando selección de
puromicina. Una transducción secundaria de los vectores retrovíricos
de cadena IgH dará lugar entonces a células con el potencial para la
producción de anticuerpos en cada célula que se transduce con un
vector retrovírico de cadena IgH.
El casete de expresión de puromicina se puede
clonar a partir del vector de resistencia a puromicina pPur
(Clontech) mediante SOE-PCR eliminando algunos
sitios de enzimas de restricción internos indeseados y añadiendo
sitios de clonación de ClaI adecuados a los extremos del fragmento
de PCR amplificado.
Los cebadores usados para la PCR de fusión
mediante SOE son:
Primeramente, se realizan dos amplificaciones
mediante PCR en paralelo con pares de cebadores P070/P071 y
P072/P073 usando el mismo molde de pPur para las PCR. El cebador
inverso P071 y el cebador directo P072 se diseñan para que contengan
una región de complementariedad perfecta de 36 pb (subrayada), que
permitirá la fusión de los dos productos de PCR mediante una segunda
PCR usando alícuotas de los fragmentos de PCR previos en una
amplificación adicional mediante PCR que usa los cebadores P070 y
P073 solos. Los últimos cebadores contienen sitios de restricción de
ClaI (en mayúsculas) que permiten la clonación del casete de
expresión de puromicina resultante, de 1351 pb, en sitios de ClaI
compatibles de pAB-7.1 y pAB-8.1.
Esto genera constructos retrovíricos pAB-7.1 Pur y
pAB-8.1 Pur, respectivamente (Fig. 13b), que son los
constructos en los que se pueden insertar las regiones VJ_{\kappa
} individuales o las librerías de región VJ_{\kappa } que
codifican dominios variables únicos o diversos de cadenas \kappaL,
respectivamente. El procedimiento para la clonación de los exones de
región variable se presentará a continuación junto con la clonación
de las regiones variables de cadena H y de cadena \lambdaL,
también después de que se haya descrito la clonación de los vectores
de expresión retrovíricos para cadenas \lambdaL heterólogas
humanas.
En algunos casos es deseable producir anticuerpos
heterólogos que contienen cadenas \lambdaL en lugar de cadenas
\kappaL. Aunque puede ser suficiente sustituir la región
codificante C\kappa humana en los constructos retrovíricos
pAB-7.1Pur y pAB-8.1Pur con
cualquiera de las regiones codificantes C\lambda humanas, sólo se
logrará un patrón perfecto de expresión de cadena \lambdaL
endógena controlando la expresión de las cadenas \lambdaL mediante
los elementos del promotor específico del locus génico de cadena
\lambdaL y del potenciador. Esto es particularmente cierto en el
sistema murino, en el que el reordenamiento y la expresión de genes
de cadena \kappaL precede al reordenamiento y a la expresión de
las cadenas \lambdaL durante la diferenciación de células B.
Los elementos potenciadores específicos del locus
génico de cadena \lambdaL murina son el potenciador
\lambda2-4 y el potenciador
\lambda3-1, que están localizados próximos a los
exones de región constante C\lambda2, C\lambda4, y C\lambda1,
C\lambda3, y regulan la expresión de los isotipos de cadena ligera
\lambda2, \lambda4, y \lambda1, \lambda3,
respectivamente.
Como en el caso de los constructos de expresión
retrovíricos de cadena kL (véase anteriormente), los vectores de
expresión retrovíricos de cadena \lambdaL se diseñan para que
contengan un casete de expresión génico de resistencia a puromicina.
Por lo tanto, en la primera etapa de clonación, se fusiona un casete
de expresión de puromicina controlado por el promotor SV40 a un
promotor V\lambda mediante SOE-PCR usando como
moldes, para la amplificación mediante PCR, ADN genómico de ratón y
pAB-7.1Pur, respectivamente. Los cebadores para las
dos reacciones paralelas mediante SOE-PCR son los
siguientes (con los cebadores P076 y P077 específicos del promotor
V\lambda diseñados basándose en la entrada de secuencias
publicadas de base de datos NCBI-Genbank
J00591):
Al igual que para las PCR de fusión mediante SOE
descritas anteriormente, las primeras dos amplificaciones mediante
PCR se realizan en paralelo, es decir el casete de expresión de
puromicina con los cebadores P074 y P075 en
pAB-7.1Pur como molde, y el promotor V\lambda con
los cebadores P076 y P077 en ADN genómico de ratón como molde.
Entonces cada alícuota de volumen 1/100 de las primeras PCR
paralelas se mezclan y se amplifican nuevamente con los cebadores
P074 y P077. El casete de expresión de puromicina se fusiona de ese
modo al extremo 5' del promotor V\lambda debido a la
complementariedad perfecta diseñada de 36 pb en el cebador inverso
P075 y el cebador de sentido P076 (subrayado) que se usa para la
primera ronda de PCR en paralelo.
Ambos cebadores P074 y P077 contienen sitios de
restricción de ClaI que se pueden usar para clonar el producto de
fusión mediante PCR en pLIB linealizado con ClaI. También se
incorpora en el cebador inverso P077 un sitio de restricción MluI
adicional (subrayado) dando lugar a un sitio MluI único adicional 3'
del promotor V\lambda requerido para las siguientes etapas de
clonación. Un clon vectorial con el fragmento de PCR de fusión de
puromicina-promotor V\lambda insertado en pLIB en
la orientación correcta, y con la secuencia correcta de ADN, según
se verifica mediante cartografía de enzima de restricción y
secuenciación de ADN, se denomina vector pAB-9 (Fig.
14a).
A continuación, se amplifican mediante PCR los
dos elementos potenciadores murinos \lambda2-4E y
\lambda3-1E a partir de ADN genómico de ratón,
seguido nuevamente de la fusión de ambas secuencias mediante
SOE-PCR. Se pueden usar los siguientes cebadores
(basándose en las entradas de secuencias publicadas de
NCBI-Genbank X54550 y X54608, respectivamente):
Al igual que en el enfoque previo, primero se
amplifican dos fragmentos de PCR en paralelo con el par de cebadores
P078/P079 y P080/P081 usando como molde ADN genómico de ratón, y, en
una segunda ronda de PCR, se usan alícuotas de estos productos de
PCR como un molde y se fusionan mediante amplificación por PCR con
los cebadores P078 y P081 debido a la complementariedad de 36 pb de
los cebadores P079 y P080 (subrayada).
El producto de fusión de PCR de 1513 pb
resultante se puede digerir con las enzimas de restricción NotI y
EcoRI (incorporándose los respectivos sitios de reconocimiento en
los cebadores P078 y P081; resaltados en letras mayúsculas), y se
clona direccionalmente en pAB-9 linealizado con
NotI/EcoRI. Un clon vectorial con la secuencia de ADN correcta,
según se verifica mediante cartografía de enzima de restricción y
secuenciación de ADN, se denomina vector pAB-10 (Fig
14a). Las regiones de complementariedad en cebadores P079 y P080 se
diseñan para que contengan un sitio XhoI único adicional (resaltado
en letras mayúsculas), a fin de permitir la eliminación separada de
cada uno de los elementos potenciadores, si así se desea.
En una siguiente etapa, cualquiera de las
regiones C\lambda humanas se clona en el constructo retrovírico
pAB-10 usando los siguientes cebadores (diseñados
basándose en las secuencias D870223 y D87017 publicadas de
NCBI-Genbank):
Estos cebadores son capaces de amplificar
cualquiera de las regiones C\lambda humanas funcionales como
fragmentos de PCR de 1094 pb si se usa como molde un ADN genómico
humano. Los cebadores P082 y P083 contienen sitios de restricción
para ClaI y NotI, respectivamente, permitiendo la digestión doble
con ClaI-NotI de los fragmentos de PCR y su
ligamiento direccional en pAB-10 a fin de generar
(dependiendo de la región C\lambda amplificada)
pAB-11-\lambda1,
pAB-11-\lambda2,
pAB-11-\lambda3, o
pAB-11-\lambda7 (Fig. 14b).
Para la generación de un vector de expresión
retrovírico de cadena Ig\lambdaL completa, se ha de clonar un exón
de región variable reordenado V\lambdaJ\lambda en los sitios
únicos MluI e HindIII de los diversos constructos
pAB-11, que se describe en la siguiente sección,
junto con la generación de vectores de expresión retrovíricos de
cadena IgH e Ig\kappaL completa.
Los constructos de expresión retrovíricos para
las diferentes cadenas IgH e IgL humanas descritos hasta ahora
contienen todas las regiones codificantes y los elementos de control
para la expresión de anticuerpos humanos, con la excepción de las
regiones codificantes para los dominios variables. Por ejemplo se
pueden clonar diversos repertorios (librerías) de exones que
codifican dominios de región variable a partir de ADN genómico de
linfocitos de sangre periférica humana que contienen linfocitos B
con diversos reordenamientos de ADN V_{H}DJ_{H} y
V_{L}J_{L}. Estas regiones codificantes para los dominios
variables necesitan contener un exón líder común, localizado 5' de
cada exón reordenado V_{H}DJ_{H} y V_{L}J_{L} (Fig. 15), que
se requiere para el transporte apropiado de cadenas IgH e IgL a
través del retículo endoplasmático, la estructura trans de golgi y
eventualmente a la superficie celular. Se han descrito cebadores
degenerados que se unen a la mayoría de las secuencias líderes de
las secuencias líder de región variable IgH, Ig\kappaL e
Ig\lambdaL humanas, y se usan en combinación con cebadores
degenerados que amplifican los diversos segmentos génicos J_{H} y
J_{L} humanos para la clonación de las regiones codificantes
variables V_{H}DJ_{H} o V_{L}J_{L}. Los sitios de
reconocimiento para enzimas de restricción usadas para la clonación
direccional del los productos de PCR (véase la Fig. 15) están
añadidos al extremo 5' de los cebadores degenerados, y se resaltan
en mayúsculas. Se indican en paréntesis las posiciones en los
cebadores degenerados, que pueden contener más de un solo
nucleótido.
Los cebadores directos para la amplificación
mediante PCR de dominios de variable de la cadena pesada de Ig
humana, que incluye las secuencias líderes a partir de ADN genómico
humano de linfocitos B periféricos, son los siguientes:
Un cebador directo para la amplificación de
dominios de variable de cadena ligera Ig\kappa humana, que incluye
una secuencia líder a partir de ADN genómico humano de linfocitos B
periféricos, es el siguiente:
Un cebador directo para la amplificación de
dominios de variable de cadena ligera Ig\lambda humana, que
incluye una secuencia líder a partir de ADN genómico humano de
linfocitos B periféricos, es el siguiente:
Obsérvese que en lugar de un sitio de
reconocimiento de enzima de restricción BamHI añadido al extremo 5'
de los cebadores P084-P087 con fines de clonación,
se puede usar un sitio de reconocimiento para la enzima de
restricción BglII (compárese con la Fig. 15), debido a que BglII
genera las mismas proyecciones compatibles, como BamHI. En el caso
de la clonación de regiones V\lambdaJ\lambda, el cebador directo
P088 contiene un sitio MluI, debido a que el constructo retrovírico
que acepta el fragmento ya contiene sitios de restricción internos
de BamHI. Como alternativa, se puede usar un cebador similar a P088
que contiene un sitio AscI que produce las mismas proyecciones CGCG
como la enzima de restricción MluI.
Los cebadores inversos para la amplificación de
todos los seis segmentos génicos de cadena J de IgH humana son los
siguientes. Los sitios de HindIII, resaltados en mayúsculas, se
añaden a los extremos 5' de los cebadores que incluyen algunos
nucleótidos flanqueantes con fines de clonación.
Un cebador inverso para la amplificación mediante
PCR de exones de región variable que contienen los segmentos génicos
J_{H}1, J_{H}4, y J_{H}5, usando ADN genómico, a partir de
linfocitos B humanos, es el siguiente:
Un cebador inverso degenerado, para la
amplificación de exones de región variable que contienen segmentos
génicos J_{H}2, J_{H}3, y J_{H}6, usando ADN genómico,
procedente de linfocitos B humanos, es el siguiente:
Un cebador degenerado inverso para la
amplificación de exones de región variable \kappa que contienen
los segmentos génicos J\kappa1-4 humanos usando
ADN genómico a partir de linfocitos B humanos es el siguiente:
Un cebador inverso para la amplificación de
exones de región variable \kappa que contienen el segmento génico
J\kappa5 humano usando ADN genómico a partir de linfocitos B
humanos es el siguiente:
Un cebador degenerado inverso para la
amplificación mediante PCR de exones Ig\lambdaL de región variable
que contienen los segmentos génicos J\lambda1-3
usando ADN genómico a partir de linfocitos B humanos es el
siguiente:
Un cebador inverso para la amplificación mediante
PCR de exones Ig\lambdaL de región variable que contienen
J\lambda7 usando ADN genómico a partir de linfocitos B humanos es
el siguiente:
Para la amplificación mediante PCR y clonación de
los exones de dominio variable que contienen segmentos génicos
reordenados V_{H}DJ_{H} y V_{L}J_{L} con los cebadores
descritos anteriormente P084-P094, se usan
cantidades equimolares de cebadores, si se indica más de un cebador
directo o inverso para una región variable particular. En el caso de
la clonación de regiones variables para cadenas H y \kappaL, los
fragmentos de PCR se digieren con BamHI y HindIII, y se clonan
direccionalmente en vectores doblemente digeridos con BamHI/HindIII
para la expresión de la cadena IgH e Ig\kappaL. En el caso de la
clonación de regiones variables para cadenas \lambdaL, los
fragmentos de PCR se digieren con MluI y HindIII, y se clonan
direccionalmente en los vectores doblemente digeridos con
MluI/HindIII para la expresión de la cadena Ig\lambdaL.
En el Ejemplo 3 se ha descrito con detalle la
transducción retrovírica de células preB murinas dependientes de
células estrómicas y de IL7. Para la transducción secuencial de
constructos de expresión retrovíricos que codifican cadenas IgH e
IgL, se usan protocolos idénticos para la transfección de células de
empaquetamiento ecotrópicas y las condiciones para infectar
retrovirus recombinantes en células preB. La única diferencia es que
se transducen secuencialmente dos constructos de expresión
retrovíricos mediante el protocolo esquematizado a continuación.
Las células preB dependientes de células
estrómicas y de IL7 se infectan primeramente con el sobrenadante
procedente de células de empaquetamiento GPE que se han transfectado
transitoriamente con el constructo retrovírico que codifica cadenas
IgL heterólogas. Como se describe anteriormente, los vectores de
expresión de cadena IgL contienen adicionalmente un marcador de
resistencia a puromicina. Por lo tanto, se pueden seleccionar
células establemente transducidas mediante la adición de 2 \mug/ml
de puromicina al medio de cultivo de tejido 24 horas después de la
transducción. Las células transducidas se cultivan y se expanden
durante un período adicional de 48 horas en medio que contiene
puromicina. Las células preB no transducidas serán eliminadas debido
a la selección por puromicina, y se obtendrá una población
transducida de cadena IgL del 100% de células preB después de 48
horas de cultivo.
En este punto, las células se incuban con el
sobrenadante de la estirpe celular de empaquetamiento ecotrópica GPE
que se ha transfectado transitoriamente con vectores retrovíricos
que codifican cadenas IgH heterólogas. Estas células se mantienen
entonces en cultivos durante un período adicional de 24 horas con lo
que detienen la proliferación debido a la expresión de cadenas
pesadas de inmunoglobulinas heterólogas. Las células se cosechan
entonces y se pueden usar para el transplante de ratones
inmunodeficientes, en los que estas células pueden reconstituir
compartimientos de línea B, y en los que son capaces de participar
en una respuesta inmunitaria dando lugar a células secretoras de
anticuerpos heterólogos.
Las células preB dependientes de células
estrómicas y de IL7, que expresan cadenas IgH y L heterólogas a
partir de vectores de expresión retrovíricos transducidos de forma
estable se inyectan intravenosamente en ratones JHT carentes de
células B, o junto con células auxiliares T de CD4^{+} en ratones
deficientes de CB17 SCID, RAG-1 o
RAG-2, de forma que las células transplantadas
pueden acumular respuestas inmunitarias dependientes o
independientes de células T con la estimulación antigénica de los
ratones transplantados.
Para ello, se irradian subletalmente a ratones de
1,5 a 3 meses con irradiación \gamma de 300-600
rad, y 4-6 horas después de la irradiación los
ratones son inyectados intravenosamente con 5 x 10^{6} a 10^{7}
células preB resuspendidas en PBS. En caso de transplante adicional
de células auxiliares T CD4^{+}, las células CD4^{+} se aíslan
de nódulos linfáticos cervicales, axilares, mesentéricos e
inguinales reunidos de ratones singénicos mediante agotamiento de
células B y células T CD8^{+} mediante uso de Dynaperlas
revestidas con anticuerpo Ig antirratón de oveja (Milan Analytica
AG, La Roche, Suiza). Se coinyectan 10^{6} de estas células
auxiliares T CD4^{+} rutinariamente de pureza mayor de 90% con
células preB. Se deja que las poblaciones celulares reconstituyan
los compartimientos de células B y T de los hospedantes
transplantados, durante 6 semanas después del transplante.
Las inmunizaciones de ratones inmunodeficientes
transplantados y reconstituidos con células HupreB y células
auxiliares T se realizan esencialmente como se describe en Harlow y
Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p.
150-173, 1988. En resumen, se disuelven
10-50 \mug de antígeno en 250 \mul de PBS y se
mezclan vigorosamente con 250 \mul de adyuvante de Freund
completo, y la mezcla de antígeno con adyuvante se inyecta
intraperitonealmente. Después de dos semanas, a los ratones se les
reinyecta intraperitonealmente con 5-20 \mug de
antígeno, esta vez mezclado con adyuvante de Freund incompleto.
Después de 10 días de la primera inyección recordatoria, los ratones
se analizan para buscar anticuerpos heterólogos en el suero
específicos de antígenos. Los que mejor responden se les reinyecta
nuevamente cuatro semanas después con 5-20 \mug de
antígeno en adyuvante de Freund incompleto, tanto intraperitoneal
como intravenosamente. 3 días más tarde, se aíslan las células del
bazo a partir de los ratones y se usan para la generación de células
de hibridoma que segregan anticuerpos monoclonales específicos de
antígenos homólogos.
Las células HupreB dependientes de células
estrómicas y de IL7 también se pueden diferenciar en células que
segregan anticuerpos completamente en cultivo de tejido in
vitro. Para ello, primero se diferencian cultivos de células
HupreB que proliferan de forma continua en células B positivas
inmunoglobulínicas de superficie mediante la retirada de IL7 del
medio de cultivo de tejido, y el cultivo continuado en células
estrómicas irradiadas durante dos a tres días. La ausencia de
factores de crecimiento en el medio da como resultado la detención
de la proliferación y la inducción de la diferenciación lo que se
acompaña por la inducción de apoptosis, excepto que se exprese un
gen antiapoptótico, como bcl-2, en las células que
se diferencian.
Las células diferenciadas se cosechan entonces y
se vuelven a colocar en placas sobre células estrómicas irradiadas
recientes, por ejemplo en presencia de 100 U/ml de rIL4 y 20
\mug/ml de un anticuerpo monoclonal anti-CD40
agonista. En 5-6 días de cultivo, las células se
diferencian en células proliferantes grandes de fenotipo celular
plasmático, que son capaces de segregar grandes cantidades de
anticuerpos a partir de los locus génicos de Ig heterólogos, y que
se pueden usar para la generación de clones de células de hibridoma
que segregan anticuerpos monoclonales heterólogos.
Para la inmortalización de células plasmáticas
derivadas de células HupreB, bien con la diferenciación in
vitro (Ejemplo 11), o después de la inmunización de ratones
transplantados (Ejemplo 10), es necesario que las células
plasmáticas se fusionen con una estirpe celular de mieloma inmortal.
Las estirpes celulares de mielomas se usan para la fusión celular
que carece de la expresión del gen HGPRT, implicado en la ruta de
rescate de biosíntesis nucleotídica. Aunque estas células crecen
indefinidamente en medio de cultivo de tejido regular, morirán si la
síntesis nucleotídica de novo se bloquea por adición de, por
ejemplo, el fármaco aminopterina al medio de cultivo de tejido. Por
el contrario, las células que expresan el gen HGPRT pueden
sobrevivir un bloque de síntesis nucleotídica de novo
mediante aminopterina, especialmente si se suplementan timidina e
hipoxantina adicionales, debido a que el producto génico HGPRT puede
utilizar estas sustancias para la síntesis de nucleótidos de
pirimidina y de purina, respectivamente. De este modo, en medio de
selección HAT (que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina),
sólo esas células sobreviven y proliferan, que resultan de una
fusión de la célula plasmática que segrega anticuerpos mortales pero
HGPRT^{+}, y la inmortal pero HGPRT, y por lo tanto célula mieloma
sensible a aminopterina. Estas células se denominan células
hibridomas y, si se subclonan, segregarán un anticuerpo monoclonal
de la especificidad codificada por la pareja de fusión de la célula
plasmática.
Para la generación de células hibridomas, se usan
células plasmáticas procedentes del hígado de ratones inmunizados
transplantados con células HupreB, o células plasmáticas generadas
in vitro mediante estimulación anti-CD40 e
IL4. En cada caso, se genera una suspensión celular homogénea y se
lava dos veces con medio IMDM sin ningún suplemento, mediante etapas
repetidas de centrifugación (500 g, 5 minutos) y de resuspensión. Se
combinan, se mezclan y se centrifugan nuevamente a 500 g durante 5
minutos 5 x 10^{6} células de mieloma (Sp2/0 Köler y Milstein,
Eur. J. Immunol., 6, p. 511-519, 1976;
o X63Ag8.653 Kearney et al., J. Immunol., 123,
p. 1548-1550, 1979) y 5 x 10^{7} células de bazo
(o 5 x 10^{7} células de plasma diferenciadas in vitro). Se
añade lentamente al pelete celular 1 ml de una dilución 1:500 de
polietilenglicol (PEG) al 50% en medio IMDM, mientras las células se
resuspenden mediante golpecitos suaves. Después de 2 minutos de
incubación, se añaden lentamente 10 ml de medio DMEM sin
suplementos, y las células se centrifugan eventualmente a 500 g
durante 5 minutos. Después de la eliminación del sobrenadante, el
pelete celular se resuspende en 1 litro de medio de cultivo de
crecimiento de células estrómicas basado en IMDM (descrito en el
ejemplo 1), que contiene 100 U/ml de IL6 recombinante y 1x de
suplemento HAT concentrado. Las células se distribuyen en 50 placas
de cultivo de tejido de 96 pocillos, y se incuban a 37ºC hasta que
se pueden identificar los clones de hibridoma individuales y se
pueden aislar para la expansión y caracterización posterior en
cultivo de tejido.
Claims (25)
1. Un método para la generación de linfocitos de
vertebrados que se pueden usar para la producción de cualquier
proteína de unión o de un fragmento o fragmentos funcionales de la
misma, con la capacidad de unirse selectivamente a un antígeno o
ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier
receptor de antígeno compuesto de dominios variables y regiones
constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas
unidas a la membrana, cualquier proteína de unión artificial que
muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones
efectoras modificadas o artificiales, no derivables de receptores de
antígenos o inmunoglobulinas heterólogas codificadas por la línea
germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los
mismos, que comprende las etapas de:
- (a)
- modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, que
- (i)
- derivan de órganos linfoides primarios, y
- (ii)
- tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura, mediante la introducción de al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, y
- (b)
- efectuar la diferenciación de dichos linfocitos precursores genéticamente modificados en células de línea linfoide madura tanto in vitro como in vivo, generando de ese modo linfocitos capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma, con la condición de que se excluya la producción in vivo en seres humanos.
2. El método de la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de inmortalizar los linfocitos
diferenciados:
- (a)
- fusionando los mismos a células de mieloma para la generación de células de hibridoma;
- (b)
- infectando a los mismos con virus transformantes; o
- (c)
- transfectando a los mismos con un constructo vectorial apropiado que asegure la expresión de al menos un oncogén transformante;
generando de ese modo linfocitos de
vertebrados capaces de producir permanentemente dicha proteína de
unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la
misma.
3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que los linfocitos precursores de vertebrados son capaces de
expresar al menos un componente de la maquinaria de recombinación
V(D)J linfoide y de originarse a partir de vertebrados
con mandíbulas que comprenden peces cartilaginosos, peces óseos,
anfibios, reptiles, pájaros, mamíferos que incluyen a cerdos,
ovejas, vacuno, caballos y roedores que incluyen a ratones, ratas,
conejos y cobayas, siendo preferidos los linfocitos (pre)B
precursores murinos procedentes de ratones.
4. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dichos linfocitos precursores de
vertebrados están desprovistos de su potencial para expresar
anticuerpos y/o receptores de antígenos endógenos o un fragmento o
fragmentos funcionales de los mismos, lo que se logra mediante
aislamiento/selección de linfocitos precursores de vertebrados que
son deficientes a la hora de expresar inmunoglobulinas endógenas o
fragmentos de las mismas, y/o introduciendo en dichos linfocitos
precursores de vertebrados al menos un constructo vectorial diseñado
para inactivar funcionalmente al menos un alelo de al menos un
elemento genético, que se selecciona del grupo que consta de:
- (a)
- las regiones codificantes del locus génico de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, incluyendo todos o parte de los segmentos génicos V, D y J, y cualquiera de las regiones codificantes de los exones de la región constante de las cadenas pesadas \mu, \delta, \gamma, \varepsilon y \alpha, con o sin sus exones que se extienden sobre la membrana;
- (b)
- las regiones codificantes de los locus génicos de las cadenas ligeras \kappa y/o \lambda inmunoglobulínicas, que incluyen cualquiera de las regiones codificantes de segmentos génicos V y J, así como cualquiera de los exones de la región constante;
- (c)
- las regiones codificantes de los locus génicos \alpha, \beta, \gamma y \delta del receptor de células T, incluyendo todos o parte de los segmentos génicos V, D y J, y cualquiera de las regiones codificantes de los exones de la región constante \alpha, \beta, \gamma y \delta;
- (d)
- los elementos potenciadores del locus génico de la cadena pesada de las inmunoglobulinas que actúan en cis, incluyendo el potenciador del intrón de la cadena pesada y el potenciador 3'\alpha;
- (e)
- los elementos potenciadores del locus génico de la cadena ligera de las inmunoglobulinas que actúan en cis, incluyendo el potenciador del intrón de la cadena ligera \kappa (\kappaiE), el potenciador 3'\kappa, y los potenciadores \lambda2-4 y \lambda3-1;
- (f)
- los elementos potenciadores de los locus génicos del receptor de células T que actúan en cis, incluyendo los potenciadores \alpha, \beta, \gamma y \delta de TCR;
- (g)
- los genes activantes de la recombinación y que actúan en trans, RAG-1 y RAG-2, incluyendo sus elementos promotores y potenciadores, así como sus regiones codificantes; y
- (h)
- los genes de reparación del ADN que actúan en trans esenciales para la recombinación V(D)J, incluyendo Ku70, Ku86, la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs), ADN ligasa IV, XRCC4 y Artemis, incluyendo sus elementos promotores y potenciadores, así como las regiones codificantes de dichos genes.
5. El método según la reivindicación 4, en el que
dichos constructos vectoriales incluyen vectores de selección génica
que comprenden regiones de homología de secuencia de ADN con dicho
al menos un elemento genético que permite la recombinación homóloga,
que flanquea preferiblemente un marcador de selección positiva que
permite la selección de transfectantes positivos.
6. El método según la reivindicación 5, en el que
dichos vectores de selección génica comprenden adicionalmente un par
de secuencias de reconocimiento del ADN para enzimas de
recombinación de ADN específicas de sitio, que flanquean al marcador
de selección positiva, que permite la eliminación de dicho marcador
de selección positiva con la transfección y la expresión transitoria
de secuencias de ácido nucleico que codifica al menos una de las
enzimas estrechamente relacionadas con las recombinasas.
7. El método según la reivindicación 5 ó 6, en el
que dichos vectores plasmídicos de selección génica comprenden
adicionalmente un marcador de selección negativa que permite la
selección frente a transfectantes, en los que dichos vectores de
selección génica se integran al azar en el genoma mediante
recombinación no homóloga.
8. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho al menos un elemento
genético exógeno, que codifica una proteína de unión o un fragmento
o fragmentos funcionales de la misma, es transportado sobre un
constructo genético seleccionado del grupo que consta de:
- (a)
- constructos de ADN retrovíricos recombinantes que comprenden secuencias promotoras, potenciadoras y de ácidos nucleicos codificantes ligadas operablemente para permitir la expresión de al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos, o que es artificial;
- (b)
- constructos de ADN recombinantes a base de plásmidos que comprenden secuencias promotoras, potenciadoras y de ácidos nucleicos codificantes ligadas operablemente para permitir la expresión de al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos, o que es artificial;
- (c)
- locus génicos de receptor de células T o de miniinmunoglobulinas recombinantes a base de plásmidos con segmentos génicos no reordenados V, D y J ligados operablemente para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de células T heterólogo, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;
- (d)
- cromosomas artificiales bacterianos, de levaduras o de vertebrados que comprenden todos o parte de los locus génicos de inmunoglobulinas o de receptores de célula T en la configuración de línea germinal ligados operablemente para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de célula T heterólogo, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;
- (e)
- cromosomas artificiales bacterianos, de levaduras o de vertebrados que comprenden todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos o receptores de célula T heterólogos en un ordenamiento modificado diseñado para permitir la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de célula T heterólogo, o un fragmento funcional de los mismos, que es de tipo salvaje o que tiene una mutación o mutaciones diseñadas en la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos;
- (f)
- elementos transcromosómicos que son fragmentos de cromosomas heterólogos que tienen todos o parte de los locus génicos inmunoglobulínicos o de receptores de células T en la configuración de línea germinal que permiten la recombinación V(D)J y la expresión subsiguiente de al menos un anticuerpo o receptor de célula T heterólogo, que es de tipo salvaje con respecto a la secuencia o secuencias primarias de aminoácidos.
9. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el al menos un elemento genético
exógeno codifica un anticuerpo humano nativo o modificado, una
proteína de unión humana, un receptor de antígeno humano, o un
fragmento o fragmentos funcionales de los mismos.
\newpage
10. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el al menos un elemento genético
exógeno codifica un receptor heterólogo o artificial capaz de sufrir
maduración de afinidad de la región de unión.
11. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la diferenciación de
linfocitos B precursores de vertebrados se efectúa in
vitro:
- (a)
- deteniendo la proliferación de dichos linfocitos precursores de vertebrados e induciendo la diferenciación en células de línea linfocítica madura cultivando en ausencia de cualquier factor de crecimiento de linfocitos precursores; e
- (b)
- induciendo la diferenciación de linfocitos terminal mediante el cultivo adicional de dichas células en presencia de al menos uno de los siguientes componentes seleccionados de:
- (i)
- factores estimulantes solubles, relacionados con células T, que comprenden interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-5, interleuquina-6, interleuquina-10, interleuquina-13, TGF-\beta e IFN-\gamma;
- (ii)
- factores que activan los receptores coestimuladores de células B, que comprenden anticuerpos agonistas o ligandos recombinantes activos para CD40, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), receptores de complemento 1 (CD35) y 2 (CD21), LFA-1 (CD11a), LFA-3 (CD58), CD19, CD20, CD30, CD32, CD37, CD38, CD70, CD71, Ig\alpha (CD79\alpha), Ig\beta (CD79\beta), TAPA-1 (CD81), Fas (CD95), receptor 1 del TNF (p55, CD120a), receptor 2 del TNF (p75, CD120b), Ox-40 (CD134), y receptor de linfotoxina \beta; y
- (iii)
- factores mitógenos de células B, de antígenos de tipo 1 independientes de células T, y otros activadores policlonales, incluyendo lipopolisacárido (LPS), lipoproteínas procedentes de bacterias gram negativas, polianiones, poli-dldC, mitógeno de fitolaca (PWM), y reactivos antiinmunoglobulínicos;
y combinaciones de los
mismos.
12. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha diferenciación in
vivo se efectúa con el transplante de dichos linfocitos
precursores genéticamente modificados en hospedantes de vertebrados
apropiados.
13. El método según la reivindicación 12, en el
que dichos linfocitos se cotransplantan en dicho hospedante con
linfocitos auxiliares T cebados con antígenos o naturales.
14. El método según la reivindicación 12 ó 13, en
el que dicha diferenciación in vivo es seguida de la
inmunización de dicho hospedante con al menos un compuesto o
composición inmunógena deseada.
15. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en el que dicho hospedante vertebrado es
un hospedante compatible que es deficiente con respecto a la
generación de células B endógenas, células T y/o células NK
(asesinas naturales), o una combinación de los mismos.
16. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, en el que el hospedante vertebrado se
selecciona de vertebrados mandibulares que comprenden pez
cartilaginoso, pez óseo, anfibios, reptiles, pájaros, y mamíferos
que incluyen cerdos, oveja, vacuno, caballos y roedores que incluyen
a ratones, ratas, conejos y cobayas, siendo la especie hospedante
preferida los ratones.
17. Método para la producción de cualquier
proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la
misma con la capacidad de unirse selectivamente a un antígeno o
ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier
receptor de antígeno compuesto de dominios variables y regiones
constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas
unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial que
desarrolle funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o
funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de
inmunoglobulinas o receptores antigénicos heterólogos codificados
por la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos
funcionales de los mismos, de una manera conocida per se, que
implica las etapas de:
- (a)
- modificar genéticamente linfocitos precursores de vertebrados, que
- (i)
- derivan de órganos linfoides primarios, y
- (ii)
- tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura introduciendo al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma; o, como alternativa, usando linfocitos precursores de vertebrados genéticamente modificados, que
- (i)
- derivan de órganos linfoides primarios,
- (ii)
- tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura, y
\vskip1.000000\baselineskip
- (iii)
- tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión o un fragmento funcional de la misma;
- (b)
- efectuar la diferenciación de dichos linfocitos precursores genéticamente modificados en células de línea linfoide madura ya sea in vitro o in vivo, generando de ese modo linfocitos de vertebrados genéticamente modificados y diferenciados capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento funcional de la misma; o, como alternativa, usar dichos linfocitos de vertebrados genéticamente modificados y diferenciados capaces de producir dicha proteína de unión o un fragmento funcional de la misma;
- (c)
- efectuar la expresión de la proteína de unión o de un fragmento o fragmentos funcionales de la misma; con la condición de que se excluya la producción in vivo en seres humanos.
18. El método según la reivindicación 1 ó 17, en
el que la etapa (b) es seguida de las etapas de:
- (a)
- aislar a partir de dichos linfocitos diferenciados el al menos un elemento genético exógeno, y
- (b)
- colocar dicho elemento o elementos genéticos en un contexto que permita la producción de dicha al menos una proteína de unión o un fragmento o fragmentos funcionales de la misma.
19. El método según la reivindicación 17 ó 18, en
el que dicha proteína de unión, o un fragmento o fragmentos
funcionales de la misma, muestra una especificidad única y por lo
tanto es monoclonal.
20. El método según la reivindicación 17 ó 18, en
el que dicha proteína de unión, o un fragmento o fragmentos
funcionales de la misma, muestra más de una única especificidad y
por lo tanto es policlonal.
21. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en el que dicha proteína de unión o
fragmento o fragmentos funcionales de la misma comparten completa o
parcialmente características estructurales y/o funcionales de un
anticuerpo, receptor de antígeno, o proteína de unión humanos,
puesto que se puede ensamblar en la base del repertorio genético
humano o partes del mismo.
22. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 21, en el que la proteína de unión o un
fragmento o fragmentos funcionales de la misma a producir se
selecciona del grupo que consta de:
- (a)
- anticuerpos que o bien están unidos a la membrana o bien se segregan, y que constan tanto de polipéptidos heterólogos de la cadena pesada como de cadena ligera en la composición estequiométrica encontrada en anticuerpos naturales y que constan de cualquiera de los isotipos conocidos de la cadena pesada (\mu, \delta, \gamma, \alpha, \varepsilon) y/o de cadena ligera (\kappa y \lambda);
- (b)
- anticuerpos con combinaciones de polipéptidos de la cadena pesada y de cadena ligera que son completamente humanos con respecto a la secuencia de aminoácidos primaria;
- (c)
- anticuerpos híbridos que contienen polipéptidos heterólogos de la cadena pesada o de cadena ligera procedentes de diferentes especies de vertebrados;
- (d)
- fragmentos de anticuerpos Fab, scFv y F(ab')2 segregados, que son completa o parcialmente heterólogos;
- (e)
- fragmentos de anticuerpos acoplados covalentemente vía péptidos ligadores, dando como resultado fragmentos de anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos;
- (f)
- receptores de células T del isotipo \alpha, \beta, \gamma y \delta, receptores de antígenos, y otras proteínas de unión con parecido estructural a proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas;
y fragmentos funcionales de los
mismos.
23. Linfocitos precursores genéticamente
modificados, que
- (a)
- derivan de órganos linfoides primarios y tienen el potencial para diferenciarse en células de línea linfoide madura,
- (b)
- tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno heterólogo compuesto de dominios variables y de regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial heteróloga que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores de antígenos heterólogos codificados mediante la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, y
- (c)
- tienen al menos un marcador de selección que está ligado operablemente a dicho al menos un elemento genético exógeno.
24. Células de línea linfoide madura, que
- (a)
- tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno heterólogo compuesto de dominios variables y de regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial heteróloga que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores de antígenos heterólogos codificados mediante la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos, y
- (b)
- tienen al menos un marcador de selección que está ligado operablemente a dicho al menos un elemento genético exógeno.
25. Células inmortalizadas derivadas de células
de línea linfoide madura, que
- (a)
- tienen al menos un elemento genético exógeno que codifica al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma con la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno o ligando, incluyendo cualquier anticuerpo heterólogo, cualquier receptor de antígeno heterólogo compuesto de dominios variables y de regiones constantes que comprenden receptores de células T e inmunoglobulinas unidas a membrana, cualquier proteína de unión artificial heteróloga que muestre funciones efectoras inmunitarias de tipo salvaje o funciones efectoras modificadas o artificiales no derivables de inmunoglobulinas o receptores de antígenos heterólogos codificados mediante la línea germinal, y cualquier fragmento o fragmentos funcionales de los mismos,
- (b)
- tienen al menos un marcador de selección que está ligado operablemente a dicho al menos un elemento genético exógeno, y
- (c)
- produce dicha al menos una proteína de unión heteróloga o fragmento funcional de la misma.
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EP1285577A4 (en) * | 2000-05-15 | 2007-05-09 | Sonoko Habu | CHIMERIC MOUSE HAVING IMMUNITY CREATED BY USE OF HUMAN CD34 POSITIVE CELLS AND USE THEREOF |
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2001
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