ES2230586T3

ES2230586T3 - Proteina tab1 y asdn que la codifica.

Info

Publication number: ES2230586T3
Application number: ES97302808T
Authority: ES
Inventors: Kunihiro Matsumoto; Elsuke Nishida
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-04-24
Filing date: 1997-04-24
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2017-04-24
Also published as: DE69731682T2; DE69731682D1; EP0803571B1; US6140042A; ATE283356T1; US5989862A; EP0803571A2; EP0803571A3

Abstract

UN ADN QUE CODIFICA PARA LA PROTEINA TAB1 QUE POSEE ACTIVIDAD PARA ACTIVAR EL FACTOR TAK1 EN LA VIA DE SEÑALIZACION DE TGF {BE}, Y QUE POSEE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LA FIG. 1.

Description

Proteína TAB1 y ADN que la codifica.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a un gen que codifica la proteína TAB1, que forma parte de la vía de transducción de señal del Factor de Trasformación del Crecimiento \beta (TGF\beta).

2. Técnica relacionada

El TGF\beta es un factor multifuncional que regula varias funciones celulares. Como una de esas funciones, el TGF-\beta es responsable de la reparación y la reproducción de tejidos con diversos tipos de lesión.

La producción anormal de TGF-\beta en casos de lesión crónica, a veces da como resultado un imbalance entre la reparación y la reproducción de tejidos, y de este modo una fibrosis patológica. La fibrosis hepática se conoce como una enfermedad que resulta de un imbalance en la producción de TGF-\beta. En el hígado, el TGF-\beta acelera la producción de proteínas de matriz extracelular, que son responsables de la fibrosis, mientras que inhibe la síntesis de enzimas catabólicas de las proteínas de matriz extracelular, e induce los inhibidores de las enzimas catabólicas, y de esta forma actúa como un factor causal principal de la fibrosis hepática.

Uno de los miembros conocidos de la vía de transducción de señal, que pertenece a la superfamilia de TGF-\beta, es el sistema de Proteínas Quinasa Quinasa Quinasa Activadas por Mitógeno (MAPKKK).

La vía de MAPK es una vía de transducción de señal eucariótica conservada, que convierte las señales de receptor en varias funciones, y el sistema comprende 3 proteínas quinasa diferentes, específicamente la MAPKKK mencionada previamente, la MAPKK y la MAPK, siendo la MAPK activada a través de la fosforilación por MAPKK, y por su parte siendo la MAPKK activada por la MAPKKK (E. Nishida et al., Trends Biochem. Sci. Vol. 18, pag. 128 (1993); K.J. Blumer et al, op. cit. Vol. 19, pag. 236 (1994) ; R.J. David, op. cit. Vol. 19, pag. 470 (1994); C.J. Marchall, Cell, Vol. 80, pag. 179 (1995)).

La TAK1, que es un miembro de la familia de las MAPKKK, que funciona en las vías de transducción de señal, que pertenecen a la superfamilia de TGF-\beta, ha sido identificada por K. Yamaguchi (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)).

El TGF-\beta transduce la señal a través de un complejo heteromérico de receptores de TGF-\beta de tipo I y de tipo II, que son proteínas trasmembrana, que comprenden dominios de quinasa específicos de serina y de treonina citoplasmáticos (J.L. Wrana et al., Nature, Vol. 370, pag. 341 (1994); D.M. Kingsley et al., Genes Dev., Vol. 8, pag. 133 (1994)). Sin embargo, se conoce poco, en el nivel molecular, sobre los mecanismos de transducción de señal aguas abajo de los receptores de TGF-\beta, y el gen que codifica la proteína TAB1 no ha sido clonado todavía.

Sumario de la invención

La presente invención puede proporcionar un DNA aislado que codifica la proteína TAB1, que es un nuevo miembro descubierto en la vía de transducción de señal del receptor de TGF-\beta, y un gen que codifica dicha proteína. La presente invención además proporciona un método de escrutinio para inhibidores de la vía de transducción de señal de TGF-\beta. TAB1 se refiere a una proteína que se une a TAK1) (TAK1 Binding protein).

La presente invención proporciona un DNA aislado que codifica la proteína TAB1, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, un DNA aislado que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No: 5 modificada por sustitución, supresión y/o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, y que tiene las propiedades biológicas de la proteína TAB1; una proteína en la que el aminoácido 52 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 es arginina; un DNA que puede hibridarse con un DNA que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, bajo las condiciones de hibridación de 60ºC, 0,1 x SSC, dodecil-sulfato sódico al 0,1%, y que tiene las propiedades biológicas de la proteína TAB1; una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos de las posiciones de aminoácidos 21 a 504, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5; y un DNA aislado que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste en 68 aminoácidos de las posiciones de aminoácidos 437 a 504, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5.

La presente invención además proporciona un método para producir cualquiera de las proteínas o polipéptidos mencionados previamente, que comprende las etapas de, cultivar una célula hospedante trasformada por un vector de expresión, que comprende el DNA que codifica la proteína o el polipéptido, y recuperar la proteína o el polipéptido del cultivo.

La presente invención, todavía proporciona además, un método para inducir a células de mamífero a producir cualquiera de las proteínas o polipéptidos mencionados previamente, que comprende la etapa de introducir el DNA que codifica la proteína o el polipéptido, en células de mamífero.

La presente invención todavía proporciona además, un vector de expresión que comprende el DNA, y una célula hospedante trasformada por el vector de expresión.

La presente invención todavía proporciona además, un método para el escrutinio de inhibidores de la vía de transducción de señal de TGF-\beta.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra las regiones de la proteína TAK1 a las que se une la proteína TAB1. Las áreas sombreadas indican el dominio catalítico de TAK1.

La Figura 2 muestra la complementación de la supresión de Stel1, por la co-presencia de TAK1 y TAB1 en una cepa de supresión de Stel1, en la vía MAPK activada por feromonas de levaduras.

La Figura 3 muestra los resultados de una electroforesis en una fotografía, que muestra los resultados de un experimento in vitro, que indica el reforzamiento de la actividad de TAK1 por TAB1.

La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de TAB1, con una inserción parcial de la secuencia de TAK1 para comparación.

La Figura 5 es un diagrama de la electroforesis, que muestra la expresión del mRNA que codifica TAB1 en varios órganos y tejidos.

La Figura 6 es un diagrama de un inmunoblot, que muestra la asociación de TAB1 y TAK1 en células de mamífero.

La Figura 7 contiene un gráfico, que muestra el aumento de la actividad quinasa de TAK1 por TAB1 en células de mamífero (arriba), y un diagrama de una trasferencia (blot), que muestra cantidades de producción comparables de TAK1 y de KN-MPK2.

La Figura 8 es un gráfico, que muestra el aumento de expresión de un gen reportero de luciferasa, por la co-presencia de TAK1 y TAB1 en células de mamífero estimuladas con TGF-\beta.

La Figura 9 es un gráfico, que muestra la inhibición de la expresión del gen reportero de luciferasa inducido por TGF-\beta, por una TAB1 que carece del extremo C (TAB1 (1-418)).

Descripción detallada

La proteína TAB1 codificada por un DNA según la invención, tiene la característica de activar la TAK1, mediante su unión a TAK1, en la vía de transducción de señal del factor de trasformación de crecimiento-\beta (TGF-\beta). Esta y otras características se describen en detalle en los Ejemplos 2 a 4 y 6 a 10.

La proteína TAB1 codificada por el DNA de la invención, tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5), derivada de la secuencia de nucleótidos del cDNA clonado mediante el método descrito en los Ejemplos 1 y 5. Sin embargo, es bien conocido que existen proteínas con actividad biológica, cuya secuencia de aminoácidos ha sido modificada por una sustitución, supresión y/o adición de uno o más aminoácidos, y que mantienen las propiedades biológicas de la proteína natural. De este modo, la presente invención abarca DNA que codifican proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos modificadas por una sustitución, supresión y/o adición de uno o más aminoácidos, en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, y que tienen las propiedades biológicas de la proteína TAB1.

Una de sus realizaciones es una proteína en la que el aminoácido 52 de la secuencia de aminoácidos mostrada en al SEQ ID NO: 5 es arginina.

También se sabe que una vez que el DNA que codifica una proteína específica se ha clonado, el DNA puede utilizarse como una sonda para el escrutinio de una biblioteca de DNA de órganos o tejidos diferentes del órgano o tejido del que se ha obtenido la proteína, o de una biblioteca de DNA de otra especie, para obtener DNA que codifica una proteína con propiedades biológicas similares, aunque teniendo diferente secuencia de aminoácidos. Así, la presente invención también abarca proteínas codificadas por DNA que puede hibridarse con el DNA que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, bajo condiciones de hibridación de 60ºC, 0,1 x SSC, dodecil-sulfato sódico al 0,1%, y que tiene las propiedades biológicas de la proteína TAB1.

Un ejemplo de una proteína modificada codificada por el DNA según la invención, es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos de las posiciones de aminoácidos 21 a 504, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5. Este polipéptido tiene las propiedades de activar la actividad quinasa de TAK1, después de su unión a TAK1.

Otro ejemplo de una proteína modificada codificada por el DNA según la invención, es una proteína de fusión entre la proteína o el polipéptido previamente mencionado y otra proteína, que tiene una actividad biológica de TAB1.

Las proteínas o polipéptidos codificados por el DNA de la invención pueden imitar las funciones fisiológicas reales de TGF-\beta mediante, por ejemplo, activar la TAK1, que es importante en la vía de transducción de señal de TGF-\beta, así como inhibir la unión entre TAK1 y TAB1 mediante su unión a TAK1, y son por lo tanto útiles para métodos de escrutinio de sustancias que actúan como agonistas o antagonistas contra la supresión del crecimiento celular, la inmunosupresión y la diferenciación ósea.

El DNA que codifica una proteína de la invención es, por ejemplo, el DNA que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5. Dicho DNA puede obtenerse, por ejemplo, mediante el método descrito en los Ejemplos 1 y 5, y tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. Sin embargo, el DNA que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 no necesariamente tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, ya que puede consistir en otros codones que codifican los mismos aminoácidos. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos derivada de seres humanos mostrada en la SEQ ID NO: 1, puede alterarse para incluir un codón que es traducido eficazmente en microorganismos tales como bacterias o levaduras, y esto puede llevarse a cabo utilizando una técnica bien conocida, tal como mutagénesis específica de lugar con un cebador.

El DNA según la invención, que codifica una proteína o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos modificada por una sustitución, supresión y/o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, puede prepararse por métodos bien conocidos, tales como mutagénesis específica de lugar o PCR, utilizando un DNA con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 como molde. Alternativamente, puede obtenerse un DNA que codifica una proteína o un polipéptido, en el que la secuencia de aminoácidos modificada es más corta que la proteína natural, por ejemplo, introduciendo un codón de iniciación de la traslación y/o un codón de terminación de la traslación en un DNA natural, tal como un cDNA. La introducción de estos codones puede llevarse a cabo mediante mutagénesis específica de lugar o PCR. Alternativamente, puede conseguirse escindiendo un DNA natural, tal como un cDNA, con una enzima de restricción apropiada, y añadiendo el oligonucleótido deseado si fuera necesario.

Puede obtenerse un DNA que puede hibridarse con el DNA que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 de la invención, y que codifica una proteína que tiene una propiedad biológica de TAB1, mediante el escrutinio de una biblioteca de DNA genómico preparada, por ejemplo, de los diversos órganos y tejidos mencionados en el Ejemplo 6, incluyendo el corazón, el cerebro, la placenta, el hígado, el músculo esquelético, el riñón, el páncreas, el bazo, el timo, la próstata, los testículos, los ovarios, el intestino delgado, el colon, los leucocitos de sangre periférica, etc., utilizando la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 de la invención, o de una de sus partes, como sonda. La biblioteca de DNA no se limita a una derivada de seres humanos, y puede derivarse de otros animales, tales como ratas, ratones, conejos, cabras, ovejas, vacas o cerdos.

La presente invención también se refiere a un vector de expresión, que comprende un DNA mencionado previamente y una célula hospedante trasformada con él. El vector de expresión diferirá dependiendo de la célula hospedante. Las células hospedantes utilizadas según la invención, pueden proceder de organismos procarióticos o eucarióticos. Los organismos procarióticos utilizados pueden ser bacterias, por ejemplo microorganismos pertenecientes al género Escherichia, tales como la Escherichia coli, microorganismos pertenecientes al género Bacillus tales como el Bacillus subtilis, etc., y los organismos eucarióticos pueden ser organismos eucarióticos inferiores, tales como los hongos filamentosos o las levaduras.

Los hongos filamentosos incluyen microorganismos pertenecientes al género Aspergillus, tales como el Aspergillus Níger y el Aspergillus orizae, y microorganismos pertenecientes al género Penicillium, mientras que las levaduras pueden ser microorganismos pertenecientes al género Saccharomyces, tales como el Saccharomyces cerevisiae.

Los organismos eucarióticos superiores que pueden utilizarse, incluyen diversas células de animales y plantas, por ejemplo, células animales inmortalizadas en cultivo, tales como células COS, células CHO, células NIH3T3, etc. Pueden también utilizarse células de insecto, tales como Sf9, Sf12, etc.

El vector de expresión de la invención incluye, además del DNA que codifica una proteína o un polipéptido de la invención, secuencias de regulación de la expresión, tales como promotores, que son funcionantes en la célula hospedante.

Promotores para bacterias, por ejemplo, E. coli, incluyen T3 y T7, mientras que promotores para levaduras incluyen promotores de genes de enzimas glicolíticas, tales como el promotor GAL1 y el promotor GAL4. El promotor para células animales puede ser un promotor viral, tal como el promotor de CMV o el promotor SV40.

La trasformación de la célula hospedante por un vector de expresión, el cultivo de la célula hospedante, y la recolección y la purificación de la proteína o el polipéptido de la invención del cultivo, pueden conseguirse según métodos convencionales. Por ejemplo, el aislamiento y la purificación de la proteína o el polipéptido del cultivo, puede conseguirse utilizando cualquier medio convencional para aislar y purificar proteínas y polipéptidos, tales como precipitación con sulfato amónico, filtración en gel o HPLC de fase inversa, solos o en combinación.

La presente invención también se refiere a un método de escrutinio para inhibidores de la vía de transducción de señal de TGF-\beta. Una muestra que contiene inhibidores de la vía de transducción de señal de TGF-\beta se pone en contacto con, o se introduce en, células que expresan una proteína con una actividad biológica de TAB1 y TAK1 (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)), y la actividad de TAK1 es entonces medida. La proteína o el polipéptido con actividad biológica de TAB1 y TAK1 puede también fusionarse con otra proteína, y las células que las expresan pueden ser células de levadura o células de mamífero. Este sistema de escrutinio puede construirse según el método descrito en los Ejemplos 1, 2, 3, 4, 7, 8 y 9.

La muestra que contiene inhibidores de la vía de transducción de señal de TGF-\beta, se pone en contacto con o se introduce en el sistema de escrutinio construido, y se mide la actividad quinasa de la TAK1. El método para medir la actividad quinasa de TAK1 puede ser la medida de la actividad quinasa de la TAK1 en si misma, o la medida de la actividad quinasa de la MAPKK o la MAPK, que están aguas abajo de la TAK1 en la vía de transducción de señal, y que son activadas por la TAK1. La actividad de un gen diana en la vía de la MAPK, o de un gen reportero bajo el control del promotor del gen diana, puede también medirse, basándose en la cantidad de mRNA o forma expresada del gen.

El método de escrutinio de los inhibidores de la vía de transducción de señal de TGF-\beta según la invención, permite el escrutinio de sustancias que inhiben la unión entre TAB1 y TAK1, y puede por lo tanto servir como un medio de terapia para enfermedades que incluyen la producción anormal de TGF-\beta.

Ejemplos

La presente invención será explicada ahora con más detalle, a través de los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

El análisis de la vía dependiente de TAK1, que funciona para la transducción de señal de TGF-\beta se realizó utilizando un sistema de 2 híbridos en levadura (S. Freids et al., Trend Genet. 10, 286 (1994)), y se visualizó una proteína que tiene interacción directa con TAK1.

Primero, se construyó un vector de expresión uniendo el gen de TAK1 y un gen que codifica el dominio de unión a DNA de LexA. El pLexA-TAK1\Delta contiene la secuencia de codificación TAK1\DeltaN (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)), insertada en marco en el pBTM116 (A.B. Vojtek et al., Cell, Vol. 74, pag. 205 (1993)). Se utilizó un sistema de 2 híbridos en levadura, para identificar una proteína codificada en una biblioteca de cDNA de cerebro humano, y que interactúa con TAK1\DeltaN.

Los dos híbridos se expresaron en Saccharomyces cerevisiae L40 (LYS2:LexA-HIS3), que contenía una construcción reportera integrada con un lugar de unión para la proteína LexA, localizado aguas arriba de la región de codificación HIS3 de levadura. La interacción entre las dos proteínas híbridas produce la transactivación de la construcción reportera, permitiendo el crecimiento de la levadura en ausencia de histidina (SC-His).

La proteína de fusión LexA-TAK1\DeltaN confiere la expresión de HIS3 en una cantidad suficiente para permitir el crecimiento, sin requerir histidina exógena. Sin embargo, puede conseguirse auxotropía de histidina, cultivando las células en presencia de 3-aminotriazol (3-AT) 40 mM, que es un inhibidor químico del producto del gen HIS3, imidazol glicerol deshidrogenasa (G.M. Kishore et al., Annu. Rev. Biochem. Vol. 57, pag. 627 (1988)).

Las levaduras se trasformaron utilizando un plásmido bait, junto con un plásmido de pez que contiene el clon de la biblioteca de expresión de cDNA de cerebro humano, unido al gen que codifica el dominio de activación de GAL4 (GAD). Se obtuvo un clon positivo de cDNA de TAB1 que codifica la proteína, a partir de alrededor de 1 x 10^{6} células trasformadas. La proteína de fusión GAD expresada por este DNA aislado, se denominará de aquí en adelante como GAD-TAB1.

Ejemplo 2

Una serie de quimeras de supresión de LexA-TAK1, se analizó mediante el método de 2 híbridos, para determinar el lugar en TAK1 que es responsable de la interacción con TAB1. Se utilizó un vector de expresión que codifica la TAK1 completa o su construcción de supresión, fusionada con el dominio de unión a DNA de LexA, para trasformación simultánea de la cepa reportera de levadura L40, junto con pGAD-TAB1. Se preparó el DNA que codifica cada una de las construcciones de supresión de TAK1, a partir de DNA que codifica la TAK1 completa.

El plásmido pGAD-TAB1 previamente mencionado, se obtuvo mediante clonación del cDNA de TAB1 en el lugar EcoR1 de pBS (W.O. Bullock et al., Biotechniques, Vol. 5, pag. 376 (1987)). La interacción entre las proteínas fusionadas expresadas por este plásmido, se indica por la capacidad de la cepa de levadura para crecer en una placa de medio SC-HIS, que contiene 3-AT 40 mM. Los resultados se muestran en la Figura 1. La parte derecha de este gráfico indica si la TAK1 o su forma de supresión interactuaban con TAB1 (+) o no (-). Estos resultados demuestran que la TAB1 interactúa con el dominio N-terminal de la TAK1.

Ejemplo 3

Una proteína que interactúa con TAK1, puede contener tanto la región de control aguas arriba, y la diana aguas abajo. Si la TAB1 juega un papel en la activación de la TAK1, entonces se esperaría que su expresión simultánea influenciara la actividad de la TAK1 en levaduras. Los presentes inventores han descrito un sistema para ensayar la actividad de la MAPKKK de mamíferos, en una vía MAPK inducida por feromonas en una levadura (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995); K. Irie et al., Science, Vol. 265, pag. 1716 (1994)). Una forma activada de la TAK1 (TAK1\DeltaN) puede sustituir la actividad MAPKKK de Stel1.

Específicamente, la vía MAPK activada por feromonas, consiste en las quinasas Stel1, Ste7, y Fus3 o Kss1, que corresponden a MAPKKK, MAPKK y MAPK respectivamente. Estas proteín-quinasas de levadura actúan secuencialmente para transducir señales al factor de trascripción Stel2, después de lo cual Stel2 por su parte activa la trascripción de genes de apareamiento específico, tales como FUS1 (I. Herskowitz, Cell, Vol. 80, pag. 187 (1995); D.E. Levin et al., Curr. Opin. Cell Biol., Vol. 7, pag. 197 (1995); J. Schultz et al., Jr. Curr. Opin. Gene Dev., Nº 5, pag. 31 (1995)).

El gen reportero FUS1p::HIS3 comprende la secuencia activadora aguas arriba FUS1, ligada al marco de lectura abierto de HIS3, y la señal de actividad de la cepa his3\DeltaFUS1p::HIS3 puede monitorizarse por la capacidad de las células de crecer en medio SC-His (Fenotipo His^{+})

La cepa his3\Deltaste11\DeltaFUS1p::HIS3STE7^{P368} (sustitución por prolina de la serina-368) tiene un fenotipo His^{-} (K. Irie et al., Science, Vol. 265, pag. 1716 (1994))

La expresión de TAK1\DeltaN en esta cepa confiere un fenotipo His^{+} (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)). De este modo, la forma activada de TAK1 puede sustituir la actividad de Ste11 de una forma dependiente de Ste7^{P368}. Sin embargo, la expresión de la TAK1 de longitud completa, no complementa la mutación ste11\Delta, lo que sugiere que la levadura no tiene el factor de activación putativo para la TAK1 (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)).

La construcción GAD-TAB1 se ensayó para su capacidad de complementar la mutación ste11\Delta, en presencia de TAK1, utilizando la vía MAPK de levadura. Específicamente, la cepa de levadura SY1984-P (his3\Deltaste11\DeltaFUS1p:: HIS3STE7^{P368}), se trasformó con pNV11-HU11 (TAK1\DeltaN) + pGAD10 (GAD) (Clontech), pNV11-HU11F (TAK1) + pGAD10, pNV11-HU11F + pGAD-TAB1 o pNV11 + pGAD-TAB, y las células trasformadas se sembraron sobre placas de SC-His y se incubaron a 30ºC.

La cepa previamente mencionada SY1984-P es SY1984 (his3\Deltaste11FUS1p::HIS3), trasformada por el plásmido pNC318-p368 que contiene STE7^{P368}, bajo el control del promotor CYC1 (K. Irie et al., Science, Vol. 265, pag. 1716 (1994)). Los plásmidos mencionados previamente pNV11-HU11 y pNV11-HU11F respectivamente, expresan la forma acortada TAK1\DeltaAN (aminoácidos 21-579) y la TAK1 de longitud completa, bajo el control del promotor TDH3 (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)).

Los resultados se muestran en la Figura 2. El panel izquierdo indica si la cepa de levadura ensayada expresaba TAK1\DeltaAN o TAK1, y si la GAD-TAB1 se expresaba simultáneamente o no. El panel derecho muestra el crecimiento de las células sobre las placas de SC-His. Cada uno de los parches representa los resultados de una trasformación independiente.

Las células trasformadas simultáneamente con GAD-TAB1 y TAK1, restauraban el efecto de la supresión de Stel1. Esto indica que la TAB1 refuerza la función de TAK1.

Ejemplo 4

Para determinar si la actividad TAK1 está aumentada en las levaduras que expresan TAB1, se utilizó un vector de expresión de DNA que contenía TAK1, que portaba el epítopo C-terminal derivado de hemaglutinina (HA), y un mutante de TAK1 inactivo catalíticamente [TAK1-K63W, en la que la lisina en la posición 63 del lugar de unión a ATP está reemplazada con triptófano (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995))], para trasformar células de levadura en ausencia y en presencia del gen TAB1.

La secuencia de DNA que codifica un epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal específico de HA, 12CA5, se unió en marco con la secuencia de codificación de TAK1 y con el extremo C de TAK1-K63W, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Todas las construcciones fueron expresadas por el promotor TDH. El plásmido de expresión de TAB1, pGAP-HTH9M expresa los 68 aminoácidos C-terminales. El YEpGAP112 es un plásmido multicopia TRP1, que contiene el promotor TDH3 [H. Banno et al., Mol. Cell Biol. 13, 475 (1993)].

Una secuencia que codifica los 68 aminoácidos C-terminales de TAB1 se amplificó mediante PCR, utilizando el cebador 5': 5'-GAGAATTCATGCGGCAAAGC-3' (SEQ ID NO: 2), que contiene el lugar EcoRI y el codón ATG, y el cebador 3': 5'-GGGTCGACTACGGTGC-3' (SEQ ID NO: 3), que contiene el lugar SalI. Un fragmento EcoRI-SalI de 240 pares de bases, producido por PCR, se insertó en el hueco EcoRI-SalI del YEpGAP112, para construir pGAD-HTH9M.

Los resultados se muestran en la Figura 3. Como se describió previamente, la cepa de levadura SY1984 se trasformó con el plásmido mencionado anteriormente, que codifica para TAK1-HA, y el plásmido que codifica TAK1-K63W, y el vector vacío YEpGAP112(-) o pGAP-HTH9M, que codifican TAB1, se insertaron adicionalmente en las células trasformadas. La TAK1-HA(-) o la TAK1-K63W-HA(KN) se inmunoprecipitaron de cada uno de los extractos celulares, y los inmunoprecipitados se sometieron a ensayos de quinasa in vitro. Específicamente, 60 ml de cultivo de células de levadura se dejaron crecer hasta una densidad óptica de 0,8 a 600 nm, y se preparó un extracto celular con una solución de tampón citolítica (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)), y después se separaron mediante centrifugación a 100.000 g durante 30 minutos.

El sobrenadante se sometió después a inmunoprecipitación, con un anticuerpo contra HA. Esto es, una parte (300 \mul) del sobrenadante, se mezcló con 2 \mul de anticuerpo y 90 \mul de Proteína A-Sepharosa, y el inmunocomplejo se lavó 3 veces con una solución de tampón citolítica, y se utilizó para el ensayo de quinasa (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)). El análisis de inmunoblot de cada inmunoprecipitado, con el anticuerpo monoclonal específico de HA, 12CA5, demostró que se recuperaba aproximadamente la misma cantidad de TAK1-HA o TAK1-K63W-HA en cada muestra. Esto sugiere que la expresión de TAB1 no afecta la cantidad de expresión de
TAK1.

La TAK1 inmunoprecipitada se analizó, basándose en la capacidad para activar el recombinante XMEK2 (SEK1), siendo la actividad del recombinante XMEK2 (SEK1) analizada en base a su capacidad de fosforilar la (KN)p38 (MPK2) catalíticamente inactiva (K. Yamaguchi et al., Science, Nº 270, pag. 2008 (1995)). Después de la electroforesis, se detectó la fosforilación de la (KN)p38 (MPK2) mediante autorradiografía. Ningún extracto exhibía un valor en el ensayo de quinasa sin el extracto de la enzima. Este nivel corresponde a la actividad basal de XMEK2. El experimento se realizó al menos 3 veces, dando los mismos resultados cada vez.

Los resultados se muestran en la Figura 3. Los resultados del ensayo de quinasa para TAK1-HA y TAK1-K36W-TAK1, indican que la TAB1 aumenta la actividad quinasa de la TAK1. El aumento de actividad no se observó para los inmunocomplejos de las células que expresan TAK1-K63WKN y TAB1, lo que indica que la actividad quinasa observada era atribuible a TAK1. Estos resultados demuestran que la TAB1 activa la actividad quinasa de la TAK1, uniéndose directamente al dominio catalítico de la TAK1.

Ejemplo 5

Para obtener la secuencia de codificación completa de la TAB1, se escrutó una biblioteca de riñón humano, utilizando como sonda la anteriormente mencionada secuencia parcial de cDNA de TAB1, obtenida del sistema de 2 híbridos en levadura. Dos clones independientes portaban el cDNA de 3,1 kb, que contiene un marco de lectura abierto (ORF) único, que comienza en el codón de metionina inicial, que se corresponde con el consenso Kozak. El extremo 5' se identificó mediante el método RACE, utilizando 5'-RACE-Ready cDNA (Clontech).

La secuencia de nucleótidos N-terminal propuesta de la secuencia de codificación (CCAAATGG), corresponde al consenso Kozak (M. Kozak, J. Cell Biol. Vol. 108, pag. 229 (1989)), y el codón ATG no está presente ante él.

La secuencia de nucleótidos de la TAB1, se determinó mediante el método de terminación de cadena de didesoxinucleótidos. Se dedujo la secuencia de aminoácidos, a partir de la secuencia de nucleótidos del cDNA de longitud completa de la TAB1. Como resultado, se obtuvieron dos clones diferentes, con citosina y adenina como nucleótido en la posición 185, respectivamente. El clon con citosina en el nucleótido 185 codifica serina como aminoácido 52, y el clon con adenina como nucleótido 185 codifica arginina como aminoácido 52.

La secuencia de nucleótidos del clon con citosina como nucleótido 158 se muestra en la SEQ NO: 1, y su secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 4 y en la SEQ ID NO: 5. La secuencia de nucleótidos del clon con adenina como nucleótido 185 se muestra en la SEQ ID NO: 4, y su secuencia de aminoácidos se muestra también en la SEQ ID NO: 6.

El cDNA del clon con citosina como nucleótido 185 se subclonó en los lugares EcoRI y SmaI de pBS, para preparar el plásmido TABI-f-4, mientras que el cDNA del clon con adenina como nucleótido 185 se subclonó en el lugar EcoRI de pBS, para preparar el plásmido pBS-TAB1. La E. coli que contenía el plásmido pBS-TAB1 se denominó Escherichia coli HB101 (pBS-TAB1), y se depositó en el Instituto Nacional de la Agencia de Biociencias y Tecnología Humana de Tecnología y Ciencia Industrial, el 19 de abril de 1996, como FERM BP-5508. La E. coli que contenía el plásmido TABI-f-4 se denominó Escherichia coli DH5\alpha (TABI-f-4), y se depositó en el Instituto Nacional de la Agencia de Biociencias y Tecnología Humana de Tecnología y Ciencia Industrial, el 19 de julio de 1996 como FERM BP-5599.

Los siguientes experimentos se llevaron a cabo utilizando el clon que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

En la Figura 4, A = Ala, C = Cys, D = Asp, E = Glu, F = Phe, G = Gly, H = His, I = Ile, K = Lys, L = Leu, M = Met, N = Asn, P = Pro, Q = Gln, R = Arg, S = Ser, T = Thr, V = Val, W = Trp e Y = Tyr. Los 68 aminoácidos C-terminales de la GAD-TAB1, aislados utilizando el sistema de 2 híbridos en levadura, están recuadrados.

La secuencia N-terminal de la TAK1 está alineada, para mostrar la región con similitud con el mismo segmento de la TAK1. Los aminoácidos idénticos y conservados con respecto a los de la TAK1, están marcados con asteriscos y puntos, respectivamente.

El ORF sugería una proteína de 504 aminoácidos que tiene un tamaño molecular de 55 kDa, sin clara similitud con ninguna proteína conocida, y sin ningún motivo que indique una función biológica.

Ejemplo 6

Los patrones de expresión del mRNA de la TAB1 en diferentes células humanas, se analizó mediante transferencia Northern. Blots de tejidos humanos (Clontech), de mRNA aislado de 16 tejidos, se hibridaron con cDNA de TAB1 marcada con ^{32}P, y se sometieron a autorradiografía. Los resultados se muestran en la Figura 5. Cada una de las carreras contenía 2 \mug de mRNA. La sonda se marcó con [\alpha-^{32}P]-dCTP, utilizando un Multiprime Labeling Kit (Amersham), y se hidridó como se describió en H. Shibuya et al., Nature, Vol. 357, pag. 700 (1992). Se detectó un producto principal de trascripción de alrededor de 3,5 kb en todos los tejidos analizados.

Ejemplo 7

Para confirmar la asociación de la TAB1 y la TAK1 en tejidos de mamíferos, se utilizaron un vector de expresión que produce TAK1 marcada en el epítopo HA (HA-TAK1) (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)), y un vector de expresión que produce TAB1 marcada en el epítodo Myc (Myc-TAB1), para transfección transitoria de osteoblastos murinos MC3T3-E1 (S. Ohta et al., FEBS Lett., Vol. 314, pag. 356 (1992)). El último plásmido se obtuvo de la siguiente manera.

El cDNA de TAB1 de longitud completa se subclonó en el vector pCS2MT, que contiene 6 copias del epítopo Myc (LEQK-LISEEDLN) (anotación de secuencia de aminoácidos de una sola letra), reconocido por el anticuerpo monoclonal específico de Myc, 9E10 (D.L. Turner et al., Genes Dev., Vol. 8, pag. 1434 (1994)). En el plásmido así obtenido, pCS2MT-TAB1, la etiqueta del epítopo Myc está ligada en marco con la secuencia de DNA correspondiente al extremo N de TAB1. El pCSA2MT-TAB1 se digirió con BamHI y XbaI. El fragmento se aisló y se insertó en el lugar EcoRI-XbaI del vector de expresión de mamíferos pEF. Este plásmido produce la expresión de TAB1, con el promotor del factor 1\alpha de elongación humano (EF1\alpha).

El extracto celular se sometió a inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal específico de HA, 12CA5 (carrera 2 en la Figura 6), el anticuerpo monoclonal específico de Myc, 9E10 (carrera 3 en la Figura 6), o una IgG no inmune de control (carrera 4 en la Figura 6). El inmunocomplejo se lavó y se separó mediante SDS-PAGE, y después se trasfirió a nitrocelulosa para inmunoblotting, utilizando el anticuerpo específico de Myc (carreras superiores en la Figura 6) y el anticuerpo específico de HA (carreras inferiores en la Figura 6).

Los extractos celulares se sometieron inmediatamente después a análisis de inmunoblot (carrera 1 de la Figura 6). Como muestra la Figura 6, se detectó una cantidad considerable de Myc-TAB1 en cada inmunoprecipitación, indicando que la TAK1 puede ser inmunoprecipitada con la TAB1. Un experimento de blotting recíproco de la proteína inmunoprecipitada con el anticuerpo específico de HA, confirmó la asociación de la TAB1 y la TAK1. Estos experimentos indican que la TAB1 puede asociarse con la TAK1 en células de mamífero, al igual que en levaduras.

Ejemplo 8

Se investigó si la sobreexpresión de la TAB1 puede activar la acitividad quinasa de la TAK1. Células MC3T3-E1 se transfectaron transitoriamente con HA-TAK1 en presencia (+) o ausencia (-) de Myc-TAB1. Las células se trataron (+) o no se trataron (-) con 20 ng/ml de TGF-\beta1 durante 10 minutos, y después se inmunoprecipitó la HA-TAK1 de la forma descrita en el Ejemplo 3, después de lo cual se analizó la actividad quinasa. Específicamente, una parte del inmunoprecipitado se utilizó para inmunoblot con anticuerpo específico de HA. Los resultados se muestran en la Figura 7.

La actividad se da en número de veces de incremento, relativa a la cantidad de HA-TAK1 de células no estimuladas, y se expresa como media \pm SEM de al menos 3 experimentos (gráfico superior en la Figura 7). La HA-TAK1 no fosforila directamente a la KH-p38(MPK2) (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)). El panel medio es una autorradiografía que muestra la fosforilación de KN-p38(MPK2). El panel inferior muestra un análisis de inmunoblot de cada uno de los precipitados con el anticuerpo monoclonal específico de HA 12CA5, en el que se ve que se recuperaba aproximadamente la misma cantidad de TAK-HA de cada muestra. Los datos mostrados en los paneles medio e inferior son de experimentos típicos.

Los ensayos in vitro de la inmunoprecipitación de TAK1, sugieren que la actividad de la TAK1 estaba estimulada en células transfectadas con la TAB1, incluso en ausencia de TGF-\beta. La activación de la TAK1 por la sobreexpresión de la TAB1, era comparable a la activación observada en las células estimuladas con TGF-\beta que expresaban solamente HA-TAK1.

Ejemplo 9

La TGF-\beta produce un rápido aumento de la cantidad de mRNA que codifica el inhibidor 1 del factor de activación del plasminógeno (PAI1) (M. R. Keeton et al., J. Biol. Chem., Vol. 266, pag. 23048 (1991)). La sobreexpresión de la forma activada de TAK1 (TAK1\DeltaN), da como resultado la activación constitutiva de un gen reportero que contiene el gen de la luciferasa bajo el control del promotor del gen PAI-1 inducido por TGF-\beta (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)). Investigamos si la sobreexpresión de la TAB1 lleva a la activación del gen reportero de luciferasa.

Células MvLu se transfectaron transitoriamente mediante el método del fosfato cálcico (H. Shibuya et al., Nature, Vol. 367, pag. 700 (1982)), utilizando un plásmido reportero p800neoLUC (M. Abe et al., Analyt. Biochem., Vol. 216, pag. 276 (1994)), y el plásmido pEF-TAB1, que expresa TAB1, o el plásmido de expresión que codifica TAK1 (K. Yamaguchi et al., Science, Vol 279, pag. 2008 (1995)). El plásmido pEF-TAB1 contiene la secuencia de codificación completa de la TAB1, bajo el control del promotor EF1á, y se construyó escindiendo pEF con EcoRI, e insertando el fragmento EcoRI del plásmido TABI-f-4.

El plásmido TABI-f-4 se construyó subclonando el cDNA de la TAB1 en los lugares EcoRI y SmaI de pBS. Las células se incubaron durante 20 horas con y sin 30 ng/ml de TGF-\beta1 humana, se preparó un extracto, y se analizó la luciferasa (H. Shibuya et al., Mol. Cell Biol., Vol. 14, pag. 5812 (1994)). La actividad luciferasa se compensaba basada en la expresión de \beta-galactosidasa.

Específicamente, la eficiencia de la transfección se compensaba mediante transfección simultánea con el vector pX\varepsilonX-\beta-Gal (A.D. Jonson et al., Gene, Vol. 147, pag. 223 (1994)), en todos los experimentos de luciferasa reportera. La medida de \beta-galactosidasa se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Clontech), utilizando el lisado de células preparado para la medida de luciferasa. La actividad luciferasa se dio como número de veces de incremento, con respecto a la actividad de las células no estimuladas, transfectadas con el vector. Todas las medidas de transfección y luciferasa se realizaron al menos 5 veces, con triplicados para cada experimento.

Los resultados se muestran en la Figura 8. Aquí, KN indica la TAK1-K63W, catalíticamente inactiva. Los datos se expresan como media \pm SEM de la actividad luciferasa de triplicados, en un experimento representativo. La sobreexpresión de ambas, TAK1 y TAB1, inducía la expresión del gen reportero, incluso en ausencia de TGF-\beta, pero la sobreexpresión solo de TAK1 o TAB1, no tenía virtualmente ningún efecto sobre la cantidad constitutiva de actividad luciferasa. Estos resultados experimentales indican que la TAB1 refuerza la actividad de la TAK1 en células de mamífero.

Aunque la sobreexpresión de la mutante TAK1-K63W inhibía la actividad lucíferasa estimulada por TGF-\beta (K. Yamaguchi et al., Science, Vol 270, pag. 2008 (1995)), esto es presumiblemente debido al secuestro de elementos esenciales en la vía. Por otra parte, la sobreexpresión de la TAB1 reduce el efecto inhibidor de la TAK1-K63W, lo que sugiere la posibilidad de que la TAB1 sea absorbida por la sobreexpresión de la TAK1-K63W.

Ejemplo 10

Los 68 aminoácidos C-terminales de la TAB1 [TAB1 (437-504)] eran suficientes para unirse y activar a la TAK1, lo que sugiere que el dominio N-terminal de la TAB1 realiza un papel regulador sobre la función de la TAB1. Para analizar esta posibilidad, se construyó una forma acortada de TAB1, que carecía del dominio de unión a la TAK1 C-terminal [TAB1 (1-418)]. Células MvLu se transfectaron transitoriamente con el reportero p800neoLUC, y con un vector de expresión que codifica la TAB1 (1-418) o la TAB1 (longitud completa), en las cantidades mostradas en la Figura 8, y estos se complementaron con el vector de control pEF.

El vector de expresión que codifica la TAB1 (1-418), se construyó de la siguiente manera. El fragmento EcoRI-HincII de 1,3 kb del plásmido TABI-f-4 (que contiene la región N-terminal de TAB1, con los aminoácidos 1-418), se subclonó en el vector pKT10, para construir pKT10-TAB1 (1-418). El pEF se escindió con EcoRI y SalI, y el fragmento EcoRI-SalI de pKT10-TAB1 (1-418) se insertó allí, para construir pEF-TAB1 (1-418).

A continuación, las células se incubaron durante 20 horas con y sin 30 ng/ml de TGF-\beta1 humana, y se midió la actividad luciferasa en el lisado celular. Los valores se expresaron como número de veces de incremento de la inducción en términos de porcentaje, con respecto a las células de control transfectadas con pEF. La no inducción de luciferasa con TGF-\beta (inducción de 1 vez de incremento), corresponde a 0%. Todas las medidas de transfección y luciferasa se realizaron al menos 3 veces, y se llevo a cabo una serie de 3 de cada uno de los experimentos. Los datos se expresan como la media \pm SEM de las actividades luciferasa de triplicados, en un experimento representativo.

Los resultados se muestran en la Figura 9. La sobreexpresión de la TAB1 (1-418) en células MvLu, suprimía la actividad del gen reportero inducido por estimulación con TGF-\beta. Por lo tanto, la TAB1 (1-418) actúa como un inhibidor negativo dominante sobre la expresión de genes inducida por TGF-\beta. Estos resultados indican que la TAB1 juega un papel en la señalización de TGF-\beta.

El mecanismo de inducción de la activación de la TAK1 por TAK1, se cree que es que, la unión de la TAB1 a la TAK1 induce los cambios conformacionales necesarios para la activación. Como la eliminación de los 20 aminoácidos N-terminales de la TAK1 produce activación constitutiva de la proteín-quinasa, esto sugiere que el dominio N-terminal esconde el dominio catalítico, inhibiendo de esta forma la actividad quinasa (K. Yamaguchi et al., Science, Vol. 270, pag. 2008 (1995)). La TAB1 puede eliminar el domino de control negativo de la TAK1 de su dominio catalítico. El extremo C de la TAB1, que funciona como el lugar de unión de la TAK1, contiene una región rica en serina y treonina, similar a la región encontrada en el extremo N de la TAK1. Por tanto, la TAB1 es probablemente un factor intermedio de señalización importante entre el TGF-\beta y la MAPKKK TAK1.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE

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(A): NOMBRE: CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

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(B): CALLE: 5-1, UKIMA 5-CHOME

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(C): CIUDAD: KITA-KU

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(D): ESTADO: TOKIO 115

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(E): PAÍS: JP

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): NINGUNO

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(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: LA PROTEÍNA TAB1 Y EL DNA QUE LA CODIFICA

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

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(iv): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: PC compatible con IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1,0, Versión #1,25 (EPO)

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(v): DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

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: NÚMERO DE SOLICITUD: EP 97302808.7

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(vi): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: JP 126282/96

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICITUD: 04-ABRIL-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: JP 300856/96

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICITUD: 28-OCTUBRE-1996

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(viii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/752891

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE SOLICITUD: 20-NOVIEMBRE-1996

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1560 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (DNA sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAATTCAT GCGGCAAAGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(4) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (DNA sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTCGACTA CGGTGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1560 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(6) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 504 residuos de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): NÚMERO DE HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

6

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(7) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 504 residuos de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

8

Claims

1. Un DNA aislado que codifica la proteína TAB1, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5.

2. Un DNA aislado que codifica la proteína TAB1, que tiene una secuencia de aminoácidos modificada por una sustitución, supresión y/o adición de uno o más aminoácidos, en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, y que se une a la TAK1.

3. Un DNA aislado que codifica la proteína TAB1, que tiene una secuencia de aminoácidos modificada por una sustitución, supresión y/o adición de uno o más aminoácidos, en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, y que se une y activa a la TAK1.

4. Un DNA que puede hibridarse con un DNA que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, bajo condiciones de hibridación de 60ºC, 0,1 x SSC, dodecil-sulfato sódico al 0,1%, y que codifica una proteína que se une a la TAK1.

5. Un DNA que puede hibridarse con un DNA que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, bajo condiciones de hibridación de 60ºC, 0,1 x SSC, dodecil-sulfato sódico al 0,1%, y que codifica una proteína que se une y activa a la TAK1.

6. Un DNA aislado que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos, que consiste en los aminoácidos de las posiciones de aminoácidos 21 a 504, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5.

7. Un DNA aislado que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos, que consiste en los 68 aminoácidos de las posiciones de aminoácidos 437 a 504, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5.

8. Un DNA aislado, según las reivindicaciones 2 y 3, en el que el aminoácido 52 de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5, es arginina.

9. Un DNA que codifica una proteína de fusión, que comprende una proteína o polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un método para producir una proteína o polipéptido, que comprende las etapas de:

: cultivar una célula hospedante trasformada por un vector de expresión que comprende DNA, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y

: recuperar dicha proteína o polipéptido del cultivo.

11. Un método según la reivindicación 10, en el que dicha célula hospedante en una célula de mamífero o una célula de levadura.

12. Un método para inducir a células de mamífero a producir una proteína o polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende la etapa de introducir el DNA que codifica dicha proteína o polipéptido dentro de las células de mamífero, in vitro.

13. La utilización del DNA que codifica la proteína o polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la fabricación de un agente para inducir a células de mamífero a producir dicha proteína o polipéptido.

14. Un vector de expresión que comprende el DNA, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

15. Una célula hospedante trasformada por un vector de expresión, según la reivindicación 14.

16. Una célula hospedante según la reivindicación 15, en la que dicha célula hospedante es una célula de mamífero o una célula de levadura.

17. Un método para escrutar inhibidores de las vías de señalización de TGF-\beta, caracterizada por (A) poner en contacto una muestra que contiene inhibidores de la vía de señalización de TGF-\beta, introduciéndola o no en células que expresan de forma recombinante una proteína o polipéptido TAB1, codificada por un DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y la proteína TAK1, y (B) medir la actividad quinasa de la proteína TAK1.