ES2227698T3 - Formulacion de lipidos inmunoestimuladores. - Google Patents
Formulacion de lipidos inmunoestimuladores.Info
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Abstract
SE EXPONE UNA FORMULACION FARMACEUTICA PARA ADMINISTRACION PARENTERAL O MUCOSA DE ANTIGENOS Y/O VACUNAS A HUMANOS Y ANIMALES, QUE COMPRENDE PREPARACIONES DE MONOGLICERIDOS QUE TIENEN AL MENOS UN CONTENIDO DE MONOGLICERIDOS DEL 80%, EN LAS QUE EL GRUPO ACILO CONTIENE DE 6 A 24 ATOMOS DE CARBONO, JUNTO CON ACIDOS GRASOS EN LOS QUE EL NUMERO DE ATOMOS DE CARBONO PUEDE VARIAR ENTRE 4 Y 22.
Description
Formulación de lípidos inmunoestimuladora.
La presente invención se refiere a una nueva
formulación farmacéutica para la administración de antígenos y/o
vacunas. La vía de administración preferida es a través de las
membranas mucosas, sin embargo, también puede usarse la
administración parenteral. La invención también se refiere al uso de
ciertos compuestos (como se definen más adelante) como adyuvantes o
vehículos en tal formulación.
Durante los últimos años se han producido un
número creciente de antígenos específicos a partir de diferentes
tipos de organismos (por ejemplo, células tumorales, bacterias,
virus y parásitos) usando técnicas de clonación. Sin embargo, estos
antígenos a menudo son inmunógenos débiles a pesar de su alta
especificidad.
Para obtener una buena protección después de la
vacunación, se necesitan sistemas estimuladores inmunes que puedan
potenciar y activar el sistema inmune contra esos antígenos
débiles. Tales sistemas estimuladores inmunes se denominan
adyuvantes.
Los adyuvantes, usados principalmente en el
momento actual en experimentos animales, incluyen un grupo muy
heterogéneo de substancias; substancias inorgánicas, emulsiones de
aceite, polímeros cargados, substancias neutras o substancias
procedentes de bacterias.
En el momento actual se están realizando grandes
esfuerzos en investigación y desarrollo para obtener un adyuvante
seguro con alta eficacia para usarse en seres humanos. Sin embargo,
actualmente no hay ningún adyuvante general para este fin.
Los hidróxidos de alumbre y los fosfatos de
alumbre fueron las dos primeras substancias inorgánicas que se
usaron en seres humanos. La respuesta inmune obtenida es el
resultado de una lenta desorción del antígeno precipitado en la
superficie de la partícula. Posteriormente se demostró que estas
sales de alumbre atraían células fagocíticas, ocasionando una
potenciación adicional de la respuesta inmune. Sin embargo, estas
sales no son seguras, ya que se ha notificado la formación de
granulomas (Slater et al, Br. J. Dermatol. (1982) Vol. 107,
pág. 103-108). Además, las sales de alumbre no se
pueden usar para todos los antígenos, ya que todos los antígenos no
se adsorben en la superficie.
En 1944, Freund introdujo su adyuvante que
constaba de una mezcla de aceite vegetal, aceite mineral,
detergentes y bacterias inactivadas. La potenciación obtenida se
debía parcialmente a la lenta liberación del antígeno desde la
emulsión de aceite. Sin embargo, el adyuvante de Freund no puede
usarse en seres humanos debido a la formación de granulomas, a la
inducción de reacciones autoinmunes y a la falta de
biodegradabilidad del aceite mineral. Además, el efecto es difícil
de controlar. Se ha aislado la substancia activa del adyuvante de
Freund, se ha determinado su estructura y se ha demostrado que es
N-acetil
muramil-L-alaninisoglutamato,
denominado a menudo muramil-dipéptido (MDP).
El efecto adyuvante dependiente del tamaño de las
partículas de polimetacrilato y poliestireno se examinó en ratones
(Kreuter et al, Vaccine, (1986) vol 4,
125-129) por medio del uso de ovoalbúmina (adsorbida
en las partículas) como antígeno modelo con un ensayo posterior de
la respuesta inmune. El tamaño de las partículas se varió entre 62
y 306 nm. El resultado fue que las partículas más pequeñas
potenciaban la respuesta inmune mejor que las de mayor tamaño. Las
partículas más pequeñas proporcionaron un efecto mejor que el
Al(OH)_{3} al 0,2%. Todas las preparaciones
indujeron una respuesta mayor en comparación con preparaciones
fluidas. En la bibliografía científica se conocen experimentos
similares en los que sistemas de partículas con menor tamaño dan
como resultado una mayor respuesta inmune en comparación con
partículas de mayor tamaño.
Casi todos los sistemas usados actualmente para
potenciar la respuesta inmune contra antígenos son partículas o
forman partículas junto con el antígeno. En el libro "Vaccine
Design - the subunit and adjuvant approach" (Ed: Powell &
Newman, Plenum Press, 1995) se describen todos los adyuvantes
conocidos tanto con respecto a su actividad inmunológica como con
respecto a sus características químicas. Como se describe en el
libro, más del 80% de los adyuvantes ensayados actualmente son
partículas o polímeros que conjuntamente con los antígenos (en la
mayoría de los casos proteínas) forman partículas. El tipo de
adyuvantes que no forman partículas constituyen un grupo de
substancias que actúan como substancias señal inmunológicas y que en
condiciones normales constan de las substancias que se forman por
el sistema inmune como consecuencia de la activación inmunológica
después de la administración de sistemas adyuvantes
particulados.
Usando sistemas particulados como adyuvantes, los
antígenos se asocian o se mezclan con una matriz que tiene la
característica de biodegradarse lentamente. Cuando se usan tales
sistemas de matriz, es de gran importancia que la matriz no forme
metabolitos tóxicos. Realizando la selección desde este punto de
vista, el tipo principal de matrices que pueden usarse son
principalmente substancias que proceden de un cuerpo. Con estos
antecedentes, sólo hay unos pocos sistemas disponibles que cumplen
estas demandas: polímeros de ácido láctico,
poli-aminoácidos (proteínas), carbohidratos, lípidos
y polímeros biocompatibles con baja toxicidad. También pueden usarse
combinaciones de estos grupos de substancias procedentes de un
cuerpo o combinaciones de substancias procedentes de un cuerpo y
polímeros biocompatibles. Las substancias preferidas son lípidos,
ya que presentan estructuras que hacen que sean biodegradables y
además son la parte más importante en todas las membranas
biológicas.
Los lípidos se caracterizan como polares o no
polares. Los lípidos que tienen mayor importancia en la presente
invención son los lípidos polares, ya que tienen la capacidad de
formar sistemas de partículas en agua. Otra forma de definir estos
lípidos es como anfífilos, debido a su estructura química con una
parte hidrófoba y una parte hidrófila en la molécula, siendo útiles
de esta manera como substancias tensioactivas. Son ejemplos de
grupos principales de lípidos polares monoglicéridos, ácidos
grasos, fosfolípidos y glicoesfingolípidos. Estos grupos
principales pueden caracterizarse adicionalmente dependiendo de la
longitud de la cadena acilo y el grado de saturación de la cadena
acilo. Como el número de átomos de carbono en la cadena acilo puede
estar en el intervalo de 6 a 24 y el número de enlaces insaturados
puede variar, hay un número casi infinito de combinaciones en
relación con la composición química del lípido.
Los sistemas lipídicos particulados pueden
dividirse adicionalmente en los diferentes grupos descritos en la
bibliografía científica, tales como liposomas, emulsiones,
cubosomas, cocleatos y micelas.
En varios sistemas, los lípidos pueden formarse
espontáneamente, o pueden forzarse para formar sistemas estables.
Sin embargo, en ciertas circunstancias, tienen que introducirse
otras substancias tensioactivas para conseguir estabilidad. Tales
sistemas tensioactivos pueden ser de carácter no lipídico, pero
poseen las características de los lípidos polares que tienen partes
hidrófobas e hidrófilas en su estructura molecular.
Otro factor que se ha demostrado que tiene
importancia es que los lípidos presentan diferentes fases
físico-químicas, habiéndose demostrado en diferentes
sistemas de ensayo que estas fases potencian la captación de
substancias biológicas después de la administración a las membranas
mucosas.
En la inmunología clásica y en combinación con la
vacunación contra diferentes tipos de agentes infecciosos, por
ejemplo bacterias, virus o parásitos, el dogma prevalente ha sido
administrar la vacuna por vía subcutánea o intramuscular. Sin
embargo, la investigación ha demostrado durante los últimos años
que el cuerpo tiene un sistema inmunológico muy eficaz que reside en
la mucosa. Se ha demostrado que se pueden administrar vacunas por
vía oral, nasal, rectal y vaginal. De la misma forma que para la
inmunización clásica, se ha demostrado que en el caso de la
vacunación en la mucosa también se necesita potenciar la respuesta
inmunológica por medio de la adición de adyuvantes.
De la misma manera que dentro de la inmunología
clásica en la que se administran vacunas (antígenos) por vía
parenteral, dentro de la inmunización en la mucosa hay una gran
interés en dirigir la respuesta inmunológica hacia el desarrollo de
una respuesta humoral y/o celular. Si se obtiene una respuesta
humoral, sería importante la dirigir la respuesta de tal forma que
se obtuviera una cierta clase de anticuerpos. Para conseguir tal
objetivo, pueden añadirse agentes estimuladores inmunes específicos
a la formulación de antígenos y adyuvantes.
Se dispone de diferentes tipos de substancias
estimuladoras inmunes. Un tipo se representa por proteínas, por
ejemplo, fitohemaglutinina [PHA], concanavalina A (Con A),
enterotoxina A de staphylococcus (SEA) o diferentes tipos de
interferones o interleuquinas. Otro tipo de substancias se
representa por MDP, como se ha mencionado anteriormente. Otros
grupos pueden caracterizarse como derivados de lípidos, ya que
muestran estructuras moleculares que son anfífilas. Un ejemplo de
tal substancia se denomina monofosforil lípido (MPL). Otra
substancias similar es la saponina Quil A. En el libro "Vaccine
Design - the subunit and adjuvant approach", como se ha descrito
anteriormente, se describen varias substancias que pueden
clasificarse dentro de estas categorías.
Sería extremadamente valioso poder realizar los
procedimientos de inmunización de manera más eficaz dirigiendo la
respuesta inmunológica hacia una cierta clase o subclase de
anticuerpos y/o poder inducir una respuesta fuerte de células T
contra los antígenos.
Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que la
administración parenteral o en la mucosa de una composición de
vacuna que contiene el siguiente adyuvante con antígenos mezclados
mejora la respuesta inmune contra los antígenos mezclados. Dicho
adyuvante para administración parenteral o en la mucosa de
antígenos y/o vacunas a un animal comprende
i) un monoglicérido que tiene una pureza de al
menos un 80% p/p, teniendo el monoglicérido la fórmula
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}H_{2} ---
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}H ---
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}H_{2}
en la que R se selecciona entre H y
un grupo acilo que contiene de 6 a 24 átomos de carbono, con la
condición de que dos de los grupos R sean H,
y
ii) un ácido graso con 6 a 24 átomos de carbono,
siendo la cadena acilo del ácido graso saturada o insaturada, y
iii) agua,
y donde la concentración de i) es de 0,1 g a 50 g
por 100 ml de agua, y la concentración de ii) es de 1 g a 50 g por
100 ml de agua, y donde la administración del adyuvante a un ser
humano o animal induce una respuesta inmune en el ser humano o
animal a un antígeno administrado al ser humano o animal.
En una realización preferida el grupo acilo del
monoglicérido puede contener de 8 a 20 átomos de carbono y, en una
realización más preferida, el grupo acilo puede contener de 14 a 20
átomos de carbono. El grupo acilo también puede contener enlaces
insaturados.
El grupo acilo normalmente se pone en la primera
o tercera posición R, es decir, el primer o tercer grupo -C(=O)-
del esqueleto de glicerol. Sin embargo, normalmente hay una
migración de acilo entre la primera o tercera posición y la segunda
posición, obteniéndose aproximadamente un 90% en la primera o
tercera posición y aproximadamente un 10% en la segunda
posición.
En la presente invención, se usa
1-monoglicérido destilado de Danisco Ingredients
(Dinamarca) con una pureza mayor del 80%, preferiblemente mayor del
90% y más preferiblemente mayor del 95%. El contenido de diglicérido
es de un 3% como máximo y el contenido de triglicéridos y de ácidos
grasos es menor que el 1,0%. Los monoglicéridos de acuerdo con la
invención normalmente contienen más de un 80% de un ácido graso
específico, preferiblemente más de un 90%.
En una realización de la invención la cadena
acilo del ácido graso puede contener de 8 a 20 átomos de carbono, y
en otra realización la cadena acilo puede contener entre 14 y 20
átomos de carbono.
La composición de vacuna de acuerdo con la
invención puede comprender excipientes farmacéuticos adicionales
seleccionados entre uno o varios de los siguientes grupos:
conservantes y agentes para controlar la presión osmótica, agentes
de control del pH, disolventes orgánicos, agentes hidrófobos,
inhibidores de enzimas, polímeros de absorción de agua,
tensioactivos y promotores de la absorción, agentes antioxidantes y
similares.
La composición de vacuna de acuerdo con la
invención puede comprender cualquier antígeno seleccionado entre
todos los antígenos relevantes para los seres humanos o animales,
incluyendo animales marinos. Son ejemplos antígenos de bacterias
patógenas y no patógenas, virus, parásitos y células tumorales.
Esta solicitud describe lípidos que, cuando se
mezclan con antígenos, potencian la actividad inmune contra los
antígenos funcionando de esta manera como un adyuvante en diversas
formulaciones de vacuna. Especialmente, la invención comprende el
uso de una formulación para la vacunación de la mucosa que puede
activarse inmunológicamente por medio de la administración nasal,
oral, vaginal o rectal. La invención también comprende el uso del
sistema lipídico para administración parenteral. El uso de un
adyuvante tal como el descrito en la presente invención, que puede
usarse tanto para administración parenteral como para
administración en la mucosa, no se limita a los seres humanos. Es
igualmente importante el uso dentro del campo veterinario para la
inmunización de, por ejemplo, vacas, cerdos y pollos. Además, hay un
interés grande y creciente en la aplicación de vacunas tanto
parenterales como mucosas en el campo de la cría de peces. En este
área, la administración puede realizarse por medio de la
incorporación de la formulación en el alimento. Además, puede
dejarse que los peces naden durante un periodo de tiempo limitado
en la formulación de vacuna que contiene los antígenos y los
adyuvantes, inmunizándose de esta manera por la vía mucosa a través
de las branquias.
En la bibliografía científica hay informes que
muestran cómo potenciar la captación de una substancia
biológicamente activa después de la administración en la mucosa
junto con ciertos lípidos. Como ejemplo, Li & Mitra (Pharm.Res.
vol 13:1, 1996) describen la administración de insulina mezclada
con fosfolípidos en forma de liposomas en el pulmón. Demuestran que
el efecto depende de la longitud de la cadena acilo y la carga de
la partícula. La longitud óptima era de 10 átomos de carbono y la
carga preferiblemente positiva. Eran eficaces incluso las
partículas cargadas negativamente, pero los sistemas neutros eran
inferiores.
De la misma forma, de Haan et al (Vaccine,
13:2, 155-62, 1995) describen una mezcla de
liposomas y el antígeno hemaglutinina. La mezcla se administró por
vía nasal a ratas, y posteriormente pudo detectarse una respuesta
inmunológica positiva. Gupta et al (Vaccine, 14:23,
219-25, 1995) describen que una mezcla de toxoide
diftérico junto con un sistema de liposomas no basado en
fosfolípidos administrado por vía parenteral a conejos produce una
respuesta inmune que estaba al mismo nivel que el producto
comercializado que era toxoide diftérico adsorbido en alumbre.
Varios informes científicos también demuestran
que se obtienen buenas respuestas inmunológicas después de la
administración a la mucosa de liposomas en los que está incluido o
adsorbido el antígeno.
Ciertos estudios in vitro realizados sobre
una línea celular humana obtenida a partir de un cáncer de colon
(Caco-2), demuestran que puede observarse el mejor
efecto de penetración, ensayado con la substancia modelo manitol,
con una longitud de cadena de 10 átomos de carbono. En este caso,
los lípidos constaban de las sales de ácidos grasos. La mezcla
obtenida de estos lípidos forma micelas con agua (Lindmark et
al, J. Pharm. Exp. Ther. 275, 958-65, 1995).
Los liposomas constan de fosfolípidos y se
formulan por un proceso relativamente largo y engorroso que, entre
otras cosas, implica disolventes orgánicos. Además, los
fosfolípidos son caros.
Como se describe más adelante en la presente
invención, puede obtenerse una respuesta inmunológica similar
mezclando sólo el antígeno con una formulación de lípidos que
contiene lípidos menos complicados que tienen un precio
substancialmente menor y que pueden formularse en una base comercial
de una manera muy sencilla.
Otros sistemas que son similares en alguna medida
a la presente invención son formulaciones basadas en triglicéridos.
Sin embargo, estos sistemas se definen científicamente como
emulsiones de triglicéridos en las que se usan tensioactivos para
la estabilización. Como estabilizadores normalmente se usan
fosfolípidos o cualquier otro tipo de molécula anfífila tal como
Tween®. Además, el aspecto de tales emulsiones normalmente es
blanquecino, indicando un tamaño de las gotitas de aceite de
aproximadamente 1 \mum. Es bien conocido para la persona
especialista en la técnica que estos tensioactivos son excelentes
adyuvantes. De esta manera, las propiedades adyuvantes de las
emulsiones de aceite se deben principalmente a las características
del tensioactivo y no a las características de la composición de
triglicéridos.
En el documento PCT/DK94/00062 se describe una
formulación para la administración tópica de antígenos y/o vacunas a
mamíferos a través de las membranas mucosas. Dicha solicitud
describe en los ejemplos que la única formulación que mejora la
respuesta inmune es una combinación de glicéridos de ácido
caprílico/cáprico con monoéster de polioxietileno sorbitano (Tween
20®).
Como se ilustra en la presente invención, se
demuestra que una combinación entre un monoglicérido y un ácido
graso puede estimular al sistema inmune para que produzca
anticuerpos e induzca inmunidad protectora. Además, la presente
invención demuestra que la formulación descrita puede producir altas
titulaciones de anticuerpo por administración parenteral.
De esta manera, fue sorprendente descubrir que la
administración de antígenos y/o vacunas a un animal a través de la
vía mucosa o por vía parenteral usando una formulación que
comprende monoglicéridos y/o ácidos grasos como sistema lipídico
particulado puede mejorar la respuesta inmunológica hacia los
antígenos y/o vacunas administradas. Los monoglicéridos se
seleccionan entre el grupo con la fórmula general de
1-acil-glicérido, donde el número de
carbonos en la cadena acilo puede variar entre 6 y 24,
preferiblemente entre 8 y 20. La cadena acilo puede ser saturada o
insaturada. La concentración del monoglicérido puede estar en el
intervalo de 0,1 a 50 g por 100 ml de agua, preferiblemente en el
intervalo de 1 a 20 gramos por 100 ml de agua. La concentración de
ácidos grasos puede estar en el intervalo de 0,1 - 50 gramos por
100 ml de formulación, preferiblemente en el intervalo de 1 a 20 g
por 100 ml de agua. Cuando se formulan conjuntamente monoglicéridos
y ácidos grasos, la relación en porcentaje del monoglicérido en el
ácido graso puede variar entre un 1 y un 99%, preferiblemente entre
un 10 y un 90%.
La invención también se refiere a una composición
de vacuna que contiene, en 100 g de la composición final:
de 0,1 a 50 g de un monoglicérido i)
de 1 a 50 g de un ácido graso ii)
de 0,01 a 90 g del componente de antígeno
de 0,01 a 99 g de agua
de 0,01 a 99 g de PBS o solución salina
La composición de vacuna de acuerdo con la
invención también puede comprender otros adyuvantes.
En ninguna parte de la técnica anterior se ha
sugerido una potenciación de la respuesta inmunológica después de
la administración de monoglicéridos y/o ácidos grasos junto con
antígenos y/o vacunas.
La presente invención describe que mezclas de
antígenos con lípidos relevantes estimulan al cuerpo para que
genere inmunidad protectora. Otra ventaja de la presente invención
es el sencillo proceso de formulación y, en comparación con la
inclusión, en el proceso no se pierde nada de material (antígeno).
Como ejemplo, puede mencionarse que en el proceso de inclusión en
liposomas, la recuperación normalmente es del 10 al 20%. El resto se
pierde en el proceso.
Ciertos informes bibliográficos como los
descritos anteriormente demuestran que mezclando liposomas y
antígeno, se detecta una respuesta inmune después de la
administración en la mucosa.
Sin embargo, los ejemplos de esta invención
descritos más adelante demuestran que el sistema puede
simplificarse incluso por más por medio del uso de lípidos que son
más estables, más baratos y que pueden formularse en partículas de
una forma más conveniente y simplificada.
La invención se ejemplifica por los siguientes
ejemplos que demuestran que el principio de
co-administración de antígenos, la administración de
substancias estimuladoras inmunes asociadas o en combinación con
partículas, funciona como un adyuvante.
Se produjo una suspensión de
mono-oleína añadiendo 3 g de
mono-oleína a 50 ml de una solución de
Pluronic-127® al 0,6% en solución salina tamponada
con fosfato de pH 7,4, después de lo cual la mezcla se sonicó con
un sonicador con sonda durante 4 minutos. La suspensión blanquecina
obtenida contenía partículas con un tamaño máximo de
aproximadamente 2 \mum, determinado por microscopía óptica.
Se produjo una suspensión de micelas cargadas
negativamente de mono-oleato mezclando 0,5 g de
ácido oleico con 5 ml de NaOH 0,35 M y se sonicó con un sonicador
con sonda durante 5 segundos. Posteriormente, se añadieron 3 g de
mono-oleína y 50 ml de NaCl al 0,9%, después de lo
cual la mezcla se sonicó con sonda durante 4 minutos. El contenido
de monoéster del mono-oleato fue mayor del 95%,
conteniendo la cadena acilo un 92% de oleato y un 6% de ácido
linoleico. El pH se ajustó a 8,3. La solución homogénea
completamente transparente obtenida contenía partículas con un
tamaño inferior de aproximadamente 0,2 \mum, determinado por
inspección visual. Se sabe que si se obtiene una solución
transparente, el tamaño de las partículas está por debajo de
aproximadamente 0,2 \mum, indicando un aspecto azulado ligeramente
opalescente un tamaño de aproximadamente 0,2 - 0,5 \mum e
indicando un aspecto blanquecino un tamaño superior a
aproximadamente 0,8 \mum.
Se produjo una suspensión de micelas cargadas
positivamente de mono-oleína mezclando 0,5 g de
lauril-amina y 3,5 ml de HCl 0,5 M seguido de
sonicación durante 5 segundos. Posteriormente, se añadieron 3 g de
mono-oleína y 50 ml de agua y después la mezcla se
sonicó con sonda durante 4 minutos. El pH se ajustó a un valor
comprendido entre 4 y 5 usando HCl 0,5 M. La solución homogénea
completamente transparente obtenida contenía partículas con un
tamaño inferior a aproximadamente 0,2 \mum.
Una mezcla de partículas de acuerdo con el
ejemplo 1 y toxoide diftérico se administró por vía subcutánea a
ratones seguido de un refuerzo después de 21 días. Después de 30
días, se obtuvieron muestras de sangre que se ensayaron con
respecto a los anticuerpos IgG contra la toxina diftérica así como
con respecto a las titulaciones de neutralización (NT) usando
células Vero. Se reunió el suero de los grupos de alumbre (n=5) y
monooleína (n=5) y se analizó. Los ratones que recibieron un
refuerzo nasal y respondieron (= 3 de 5) se ensayaron de manera
individual. En la tabla 1 se muestran las titulaciones de IgG y las
titulaciones de neutralización en unidades arbitrarias. Los
resultados demostraron que tanto las titulaciones de IgG como las
titulaciones de anticuerpo protector estaban al mismo nivel en
comparación con el grupo de control que recibió el producto
comercializado que comprendía toxoide diftérico adsorbido en
alumbre (Al(PO_{4})_{3}). También se observa que
las altas titulaciones de IgG siempre estaban acompañadas por altas
titulaciones de neutralización, lo que indica que la formulación no
destruye los sitios antigénicos que son importantes para la
inmunidad protectora.
Se prepararon partículas de acuerdo con el
ejemplo 2 con una concentración final de monoglicérido de 200 mM y
de ácido graso de 200 mM. Se mezcló toxoide diftérico (2,9 \mul,
4,4 mg/ml) con 200 \mul de la suspensión de micelas y se
administró por vía subcutánea a ratones seguido de un refuerzo
subcutáneo después de 21 días. Tanto la dosis primaria como la
dosis de refuerzo del toxoide fueron de 10 \mug. Después de 30
días, se obtuvieron muestras de sangre que se ensayaron con
respecto a los anticuerpos IgG contra la toxina diftérica. El
resultado demostró (tabla 2) que las titulaciones de IgG
arbitrarias con respecto a la formulación con
mono-oleína (MO) y ácido oleico (C18:1) estuvieron
al mismo nivel en comparación con el grupo de control que recibió
el producto comercializado actualmente que comprendía toxoide
diftérico adsorbido en alumbre (Al(PO_{4})_{3}).
Las otras combinaciones de monoglicéridos y ácidos grasos
proporcionaron respuestas ligeramente decrecientes que se
correlacionaban con la reducción de la longitud de la cadena acilo
(M12 = lauril-1-glicerato; M10 =
cáprico-1-glicerato; C12 = ácido
láurico; C10 = ácido cáprico; C8 = ácido caprílico). N.D. = No
realizado; indica que sólo había cinco ratones en estos grupos.
Se repitió el mismo procedimiento que en el
ejemplo 4, con la diferencia de que la dosis de refuerzo se
administró por vía nasal en lugar de por vía subcutánea. La dosis
de toxoide diftérico fue de 10 \mug tanto en la inmunización
primaria como en la administración nasal de refuerzo. En el mismo
experimento, se demostró que se obtenía una respuesta a la dosis
cuando se administraron 3 cantidades diferentes de lípidos (véase
la tabla 3). En la tabla 4 se observa la titulación arbitraria de
IgG. Además del efecto de respuesta a la dosis en el que se ven
menores titulaciones de IgG a menores concentraciones de lípidos,
también se ve una mayor variabilidad con respecto a la respuesta en
los grupos que reciben dosis menores. Esta variabilidad no se
observa a mayores niveles de dosificación, lo que indica que no
sólo se ve un efecto adyuvante con respecto a la obtención de altas
titulaciones, sino también con respecto a la reducción de la
variabilidad de la respuesta.
Se ensayaron dos formulaciones de lípidos
diferentes. Las composiciones se ven en la tabla 5.
Las formulaciones se administraron a ratones por
vía s.c. o por vía nasal con un refuerzo después de 3 semanas por
vía s.c. o por vía nasal. Se tomaron muestras de sangre después de
otra semana. En la tabla 6 se ven las titulaciones arbitrarias de
IgG.
Los resultados de la tabla 6 demuestran que para
conseguir una buena respuesta después de la administración primaria
así como la administración de refuerzo por vía nasal, se prefieren
las composiciones B.
Una mezcla de mono-oleína (200
mM) y ácido caprílico (200 mM) se mezcló con virus de la influenza
inactivado con formalina (cepa SDA/94) y se administró por vía s.c.
en la primera ocasión a ratones seguido de un refuerzo nasal tres
semanas después. La dosis fue de 0,05 \mug de hemaglutinina (HA),
se tomaron muestras de sangre tres semanas después de la dosis de
refuerzo y se ensayaron con respecto a las titulaciones de
aglutinación (HI) frente a HA. Los resultados (tabla 7) demostraron
que las titulaciones de HI en el grupo que había recibido el virus
junto con los adyuvantes estaban a un nivel mayor en comparación con
el grupo que había recibido el virus en PBS.
Se mezclaron micelas de acuerdo con el ejemplo 2
con partículas de rotavirus inactivadas con formalina y
posteriormente se administraron a ratones hembra. Después de tres
inmunizaciones, los ratones se preñaron y posteriormente los
ratones recién nacidos se expusieron por vía nasal al rotavirus
vivo. La cifras indican los animales que adquirieron protección
después de la exposición en comparación con el número total de
animales en ese grupo. Los resultados de esta exposición se ven en
la tabla 8.
Como puede verse por los resultados, hay una
buena protección tanto después de tres administraciones
intramusculares como después de una inmunización intramuscular
primaria seguida de dos administraciones nasales.
Para evaluar la toxicidad de las formulaciones de
lípidos, éstas se administraron en la cavidad nasal de ratas,
posteriormente las ratas se sacrificaron y la mucosa nasal se
preparó para microscopía óptica, microscopia de fluorescencia y
microscopia electrónica de barrido (SEM). Se ensayaron
formulaciones de acuerdo con el ejemplo 1 y el ejemplo 2. Sólo la
suspensión de mono-oleína/pluronic mostró cambios
minoritarios en la superficie de la mucosa usando la SEM. No
pudieron detectarse efectos con microscopia óptica ni con
microscopía de fluorescencia. Las micelas que contenían
mono-oleína y ácido oleico no pudieron provocar
ningún cambio en las membranas mucosas.
Las células Caco-2, que son una
línea celular humana procedente de cáncer de colon, pueden hacerse
crecer como una monocapa epitelial. Estas células frecuentemente se
usan para examinar la capacidad de diferentes substancias de
influir sobre el transporte de substancias biológicas a través de
células epiteliales y en varios sistemas experimentales se ha
demostrado que proporcionan una buena correlación con los datos
in vivo con respecto a la captación desde el intestino a la
corriente sanguínea. Como substancias marcadoras para el transporte
a través de las células se usa Na-fluoresceína o
manitol. Los experimentos realizados con las formulaciones de
lípidos de acuerdo con esta invención mostraron un transporte
aumentado a través de las células Caco-2 a
concentraciones no tóxicas.
Claims (26)
1. Un adyuvante para uso en una vacuna,
conteniendo el adyuvante
- i)
- un monoglicérido que tiene una pureza de al menos un 80% p/p, teniendo el monoglicérido la fórmula
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}H_{2} ---
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}H ---
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}H_{2}
- en la que R se selecciona entre H y un grupo acilo que contiene de 6 a 24 átomos de carbono, con la condición de que dos de los grupos R sean H, y
- ii)
- un ácido graso con 6 a 24 átomos de carbono, siendo la cadena acilo del ácido graso saturada o insaturada, y
- iii)
- agua,
y donde la concentración de i) es de 0,1 g a 50 g
por 100 ml de agua, y la concentración de ii) es de 1 g a 50 g por
100 ml de agua, y donde la administración del adyuvante a un ser
humano o animal induce una respuesta inmune en el ser humano o
animal a un antígeno administrado al ser humano o animal.
2. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación
1, donde la vacuna contiene un componente antigénico.
3. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación
1, donde la pureza del monoglicérido i) es de al menos un 90%.
4. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación
1, donde la pureza del monoglicérido i) es de al menos un 95%.
5. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación
1, donde el grupo acilo del monoglicérido i) contiene de 8 a 20
átomos de carbono.
6. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación
1, donde el grupo acilo del monoglicérido i) contiene de 14 a 20
átomos de carbono.
7. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación
1, donde el grupo acilo del ácido graso ii) contiene de 8 a 20
átomos de carbono.
8. Un adyuvante de acuerdo con la reivindicación
1, donde el grupo acilo del ácido graso ii) contiene de 14 a 20
átomos de carbono.
9. Una composición de vacuna que comprende un
adyuvante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-8 y una cantidad inmunogénica de un componente
antigénico.
10. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 9, donde el componente antigénico es capaz de causar
la formación de una respuesta inmune en animales incluyendo seres
humanos y animales marinos.
11. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 9 ó 10, donde el componente antigénico se selecciona
entre el grupo compuesto por antígenos de bacterias patógenas y no
patógenas, virus, parásitos y células tumorales.
12. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que
contiene, en 100 g de la composición final:
de 0,1 a 50 g de un monoglicérido i)
de 1 a 50 g de un ácido graso ii)
de 0,01 a 90 g del componente de antígeno
de 0,01 a 99 g de agua y
de 0,01 a 99 g de PBS o solución salina.
13. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde la
composición comprende excipientes farmacéuticos adicionales
seleccionados entre el grupo compuesto por conservantes, agentes
para controlar la presión osmótica, agentes de control del pH,
disolventes orgánicos, inhibidores enzimáticos, polímeros de
absorción de agua, promotores de la absorción y agentes
antioxidantes.
14. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-13, donde la
composición comprende adyuvantes adicionales.
15. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-14, donde la
composición está en una forma adecuada para administración
parenteral o en la mucosa.
16. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 15, donde la composición está en una forma adecuada
para administración en la mucosa de la nariz, boca, vagina, recto o
intestino.
17. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 15, donde la composición está en una forma adecuada
para administración en la mucosa de la nariz.
18. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-17, donde el
componente antigénico se selecciona entre el grupo compuesto por
toxoide diftérico, virus de la influenza y rotavirus.
19. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-18, donde la
pureza del monoglicérido i) del adyuvante es de al menos un
90%.
20. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-19, donde la
pureza del monoglicérido i) del adyuvante es de al menos un
95%.
21. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-20, donde el
grupo acilo del monoglicérido i) del adyuvante contiene de 8 a 20
átomos carbono.
22. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-21, donde el
grupo acilo del monoglicérido i) del adyuvante contiene de 14 a 20
átomos carbono.
23. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-22, donde el
grupo acilo del ácido graso ii) del adyuvante contiene de 8 a 20
átomos de carbono.
24. Una composición de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 9-23, donde el
grupo acilo del ácido graso ii) del adyuvante contiene de 14 a 20
átomos de carbono.
25. Uso de un adyuvante de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1-8, para la producción de
una composición farmacéutica para potenciar una respuesta inmune
contra un antígeno en un animal incluyendo un ser humano.
26. Uso de una composición de vacuna de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 9-24 para la
producción de una composición farmacéutica para inmunizar a un ser
humano o un animal.
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