ES2227518T3 - Ensayos de union basados en el magnetismo y que utiliza elementos de union marcados magneticamente. - Google Patents
Ensayos de union basados en el magnetismo y que utiliza elementos de union marcados magneticamente.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS Y A DISPOSITIVOS PARA LLEVAR A CABO ENSAYOS DE AGLUTINACION, EN DONDE LA ETIQUETA DETECTABLE ES UN MATERIAL QUE RESPONDE MAGNETICAMENTE. SE UTILIZAN FORMATOS DE ENSAYO COMPETITIVOS Y CON ELEMENTOS DIFERENTES ALTERNADOS, DIRECTOS E INDIRECTOS, PARA SEPARAR LA ETIQUETA MAGNETICAMENTE ACOPLABLE EN UNA FASE SOLIDA Y UNA FASE LIQUIDA SEGUN UNA PROPORCION RELATIVA A LA PRESENCIA O CANTIDAD DE LA SUSTANCIA DE ANALISIS QUE SE ENCUENTRA EN LA MUESTRA DE ENSAYO. LA CAPACIDAD DE RESPUESTA MAGNETICA DE LA ETIQUETA MAGNETICAMENTE ACOPLABLE EN UNA O EN LAS DOS FASES DA COMO RESULTADO EL QUE SE EJERZA UNA FUERZA EN LA ETIQUETA. SI SE DETERMINA EL ALCANCE DE LA FUERA O LA INFLUENCIA DE LA FUERZA EJERCIDA EN LA ETIQUETA, SE PUEDE DETERMINAR LA CANTIDAD DE SUSTANCIA DE ANALISIS EN LA MUESTRA DE ENSAYO.
Description
Ensayos de unión basados en el magnetismo y que
utiliza elementos de unión marcados magnéticamente.
Esta invención se refiere a un método para
determinar la presencia de analito en una muestra de prueba usando
un marcador detectable unido a un elemento de unión. En particular,
la invención se refiere al uso de materiales atraíbles
magnéticamente como el marcador detectable.
Los ensayos de diagnóstico han llegado a ser unos
medios indispensables para detectar analitos en muestras de prueba
utilizando la reacción mutua entre el analito y un elemento de unión
específico, tipificado por la inmunorreacción entre un antígeno y el
anticuerpo para dicho antígeno. Al detectar reacciones de unión, se
ha utilizado marcadores o señalizadores detectables unidos a
anticuerpos, que a su vez se unen a los analitos de interés. La
detección del complejo anticuerpo/analito marcado resultante, o del
anticuerpo marcado que permanece no unido, se utiliza para indicar
la presencia o cantidad del analito en la muestra de prueba.
Dos técnicas de ensayo de unión utilizadas
comúnmente son el radioinmunoensayo (RIA) y el inmunoensayo
enzimático (EIA), que emplean un elemento de unión marcado. RIA usa
un isótopo radiactivo como la sustancia rastreable unida a un
elemento de unión. Dado que el isótopo radiactivo puede ser
detectado en muy pequeñas cantidades, se puede usar para detectar o
cuantificar pequeñas cantidades de analito. Sin embargo, varios
inconvenientes sustanciales están asociados con RIA. Estos
inconvenientes incluyen las instalaciones especiales y extrema
precaución que se requieren al manejar materiales radioactivos, los
altos costos de tales reactivos y sus requisitos de desecho
únicos.
EIA usa una enzima como el marcador unido a un
elemento de unión, y se utiliza actividad enzimática para detectar
la inmunorreacción. Aunque EIA no tiene las mismas desventajas que
RIA, las técnicas EIA requieren típicamente la adición de materiales
de sustrato para provocar la reacción enzimática detectable. Los
sustratos enzimáticos también son frecuentemente inestables y se
tienen que preparar justo antes del uso o almacenarse bajo
refrigeración. Además, los marcadores enzimáticos pueden ser
difíciles de purificar y conjugar a elementos de unión, y pueden ser
inestables durante el almacenamiento a temperatura ambiente. Los
inmunoensayos enzimáticos también son insatisfactorios porque los
métodos requieren típicamente incubaciones complejas, múltiples
adiciones de líquido y múltiples pasos de lavado.
Más recientemente, se han desarrollado técnicas
de ensayo usando partículas sol metálicas como marcadores visuales.
En estas técnicas, se utiliza un metal (por ejemplo, oro, plata,
platino), un compuesto metálico, o una sustancia no metálica
recubierta con un metal o un compuesto metálico para formar una
dispersión acuosa de partículas. En general, el elemento de unión a
ser marcado se reviste sobre las partículas sol metálicas por
adsorción, y las partículas son capturadas o agregadas en presencia
de analito. Las partículas sol metálicas tienen la ventaja de
producir una señal que es visualmente detectable así como mensurable
con un instrumento, pero, a pesar de su utilidad, las partículas
inorgánicas tienen varios inconvenientes. Las partículas metálicas
son difíciles de medir cuantitativamente. Las partículas metálicas
también tienen una intensidad de color limitada, y por lo tanto,
limitada sensibilidad en algunos ensayos. Además, las superficies de
partículas coloidales metálicas inorgánicas, tal como oro, no
aceptan fácilmente la unión covalente de elementos de unión. Así,
durante el uso en un ensayo de unión, hay que tener cuidado para que
los elementos de unión adsorbidos no se quiten de las partículas
inorgánicas mediante la combinación del desplazamiento por otras
proteínas o agentes tensioactivos y las fuerzas de cizalladura que
acompañan a los pasos de lavado usados para quitar material no unido
específicamente. Las partículas sol pueden ser difíciles de recubrir
sin inducir agregado, pueden formar agregados en almacenamiento y
pueden formar agregados después de la adición de soluciones tampón o
sales. Además, tales marcadores particulados son difíciles de
concentrar, pueden formar agregados durante el uso y son difíciles
de dispersar.
Otros materiales marcadores incluyen sustancias
quimiluminiscentes y fluorescentes. También se han utilizado
partículas no metálicas, tales como partículas de selenio y látex
teñidas o de color como marcadores visuales.
El uso de partículas magnéticas en ensayos de
unión es conocido, pero antes de la presente invención, las
partículas magnéticas se han utilizado en general como medios para
quitar o secuestrar el componente analito de la muestra de prueba.
Por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 4.070.246 y
3.985.649 describen el uso de elementos de unión unidos a partículas
ferromagnéticas, por lo que el elemento de unión forma un complejo
con el analito de interés, y el complejo resultante se quita de la
mezcla de reacción por medio de un campo magnético.
Alternativamente, Hersh y otros (patente de Estados Unidos número
3.933.997) describen el uso de partículas magnéticas como un medio
de concentrar un material radioactivo en una sustancia de prueba.
Ebersole (patente de Estados Unidos número 4.219.335) describe el
uso de partículas magnéticas que tienen características capaces de
afectar a la resistencia eléctrica, donde una medición de
capacitancia revelará si las partículas están presentes en una
superficie.
EP 0 287 665 describe un inmunoensayo magnético
por láser donde el cuerpo marcador magnético residual se separa y
elimina por medio de un campo magnético. EP 0 287 665 también
describe un inmunoensayo magnético por láser donde el cuerpo marcado
magnético resultante a detectar se concentra en una posición de
detección predeterminada por medios magnéticos o lleguen a oscilar a
una frecuencia predeterminada por medios magnéticos.
La presente invención usa ventajosamente un
material atraíble magnéticamente como un marcador detectable en
ensayos de unión. Una medición de la fuerza ejercida en el marcador
por un campo magnético indica la presencia o cantidad de analito en
la muestra de prueba.
En resumen, el método implica incubar la muestra
de prueba con un reactivo de fase sólido y un reactivo marcado
magnéticamente. El reactivo de fase sólido incluye un primer
elemento de unión unido a una fase sólido, y el reactivo marcado
magnéticamente incluye un segundo elemento de unión unido a un
marcador atraíble magnéticamente. El primer elemento de unión se
selecciona para unir el analito o el segundo elemento de unión, y el
segundo elemento de unión se selecciona para unir el analito o el
primer elemento de unión, respectivamente, proporcionando por ello
formatos de ensayo tanto competitivo como intercalado. La reacción
de unión da lugar a una división del reactivo marcado magnéticamente
entre reactivo marcado magnéticamente no unido y reactivo marcado
magnéticamente que resulta unido a la fase sólido en proporción a la
cantidad de analito presente en la muestra de prueba. El reactivo
marcado magnéticamente no unido está separado del reactivo marcado
magnéticamente unido a la fase sólido. Posteriormente, se aplica un
campo magnético al reactivo marcado magnéticamente unido a la fase
sólido. La sensibilidad magnética del reactivo marcado
magnéticamente da lugar al ejercicio de una fuerza en el reactivo
marcado y la fase sólido. Determinando la magnitud de la fuerza
ejercida en la fase sólido, se determina la cantidad del analito en
la muestra de prueba.
La magnitud de la fuerza ejercida en el marcador
o la fase sólido por el campo magnético se puede determinar
observando un cambio de peso aparente del reactivo unido por unos
medios de balanza.
La presente invención también incluye
dispositivos para determinar la presencia o cantidad de un analito
en una muestra de prueba. Los dispositivos implican un recipiente de
reacción en el que se produce reactivo marcado magnéticamente
inmovilizado en proporción a la cantidad de analito en la muestra de
prueba; unos medios de separación para separar el reactivo marcado
magnéticamente inmovilizado del reactivo marcado magnéticamente
libre; unos medios de generador de campo magnético para la
aplicación de un campo magnético al reactivo marcado magnéticamente
libre y/o inmovilizado; y unos medios de medición para evaluar la
respuesta magnética del reactivo marcado magnéticamente libre y/o
inmovilizado al campo magnético. Los medios de generador de campo
magnético adecuados incluyen imanes tanto permanentes como
electroimanes.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un protocolo de ensayo que no requiere pasos de lavado
complejos.
Otro objeto de la presente invención es producir
procedimientos de ensayo más simples y más rápidos eliminando la
adición de sustratos o soluciones de disparo, incluyendo eliminar
incubaciones enzima-sustrato para desarrollo de
color, el cambio del sustrato fluorescente o el disparo de
quimiluminiscencia.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método de ensayo que no requiere la extracción
completa de reactivos de ensayo no unidos y componentes de la
muestra de prueba antes de la determinación del resultado del
ensayo.
Otro objeto de la invención es permitir el uso de
elementos de unión que tienen bajas afinidades de unión.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
protocolo de ensayo en el que la separación de marcador no unido o
unido no específicamente del marcador unido específicamente se puede
ajustar automáticamente electrónicamente para que se adecue mejor
las afinidades de unión de los reactivos de unión utilizados en un
ensayo particular.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
aparato de ensayo que se autocalibra, usa desechables simples, tiene
pocas piezas móviles y tiene funciones que se prestan a control por
ordenador.
La figura 1 es una vista esquemática de la
detección asistida magnéticamente de reactivo marcado magnéticamente
usando unos medios de balanza o ponderación.
La figura 2 es una vista esquemática de unos
medios de balanza en uso para la detección asistida magnéticamente
de un reactivo marcado magnéticamente.
La figura 3 es una vista esquemática de la
detección asistida magnéticamente de un reactivo marcado
magnéticamente usando unos medios detectores ópticos.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 4 es una vista esquemática de unos
medios detectores ópticos en uso para la detección asistida
magnéticamente de un reactivo marcado magnéticamente.
La figura 5 ilustra la medición de la fuerza de
atracción de reactivo marcado magnéticamente no unido o libre.
La figura 6 ilustra los resultados de un ensayo
de unión usando un reactivo marcado magnéticamente como el marcador
detectable.
La figura 7 ilustra los resultados de un ensayo
de unión usando un reactivo marcado magnéticamente como el marcador
detectable, representados como una curva de inhibición.
La figura 8 ilustra el efecto del acercamiento y
extracción repetidos de un campo magnético de una fase sólido
conteniendo partículas magnéticas recubiertas con anticuerpo
capturadas por un anticuerpo inmovilizado.
La figura 9 ilustra un ciclo único del
acercamiento y extracción de un campo magnético de una fase sólido
conteniendo partículas magnéticas recubiertas con anticuerpo
capturadas por un anticuerpo inmovilizado.
La figura 10 ilustra la disminución de cambio de
peso debido a la presencia de anticuerpo libre durante la incubación
en un sistema como el ilustrado en la figura 9.
La figura 11 ilustra una curva de inhibición de
un inmunoensayo asistido magnéticamente.
La figura 12 ilustra una vista esquemática de los
medios de medición para la determinación de la intensidad de las
asociaciones entre elementos de unión complementarios.
La figura 13 ilustra una traza instrumental de
los cambios de peso que resultan del acercamiento de un imán a la
parte superior de un recipiente que contiene un reactivo marcado
magnéticamente inmovilizado.
Cuando se coloque un material magnéticamente
sensible bajo la influencia de un campo magnético, el material
tenderá a aproximarse o alejarse de la región donde el campo
magnético es más intenso. Por ejemplo, un material paramagnético,
tal como ferrita, será atraído al campo magnético, mientras que un
material diamagnético, tal como poliestireno, se alejará del campo
magnético. La fuerza de la respuesta o el movimiento de tal material
magnéticamente sensible se puede considerar como una medida de la
cantidad de material presente. La presente invención deriva del
descubrimiento sorprendente de que cuando se usa un material
magnéticamente sensible como un marcador en un ensayo de unión, es
posible detectar la presencia o cantidad del marcador libre o no
unido midiendo la fuerza agregada ejercida en los marcadores por un
campo magnético aplicado. Además, la intensidad de la fuerza
detectable tiene una relación definida a la cantidad del marcador
unido o libre atraíble magnéticamente, permitiendo por ello una
determinación de la presencia o cantidad del analito en la muestra
de prueba. El descubrimiento tiene varias consecuencias
importantes.
Los formatos de ensayos de unión heterogéneos
convencionales requieren lavado vigoroso de la fase sólido para
separar el reactivo marcado unido y no unido y suprimir la unión no
específica de materiales a la fase sólido. Tales pasos de lavado
complican el protocolo de ensayo y limitan el ensayo al uso de
elementos de pares de unión que tienen alta afinidad, es decir, una
resistencia de unión que resistirá tal manipulación física. En un
aspecto, la presente invención evita la necesidad de pasos de lavado
complejos en ensayos de unión porque el marcador no unido o unido no
específicamente se puede separar de la mezcla de reacción por la
aplicación de un primer campo magnético antes de la detección de
marcador unido específicamente por medio de un segundo campo
magnético. El alto grado de control posible sobre el campo magnético
permite el uso de un primer campo que es adecuado para separar
marcador libre o no unido específicamente de una mezcla de reacción
sin afectar al marcador unido específicamente. A su vez, esto
permite el uso de elementos de unión de menor afinidad cuya unión no
quedará afectada considerablemente por el primer campo
magnético.
En ensayos convencionales de aglutinación de
partículas, se puede usar elementos de unión de baja afinidad porque
varios lugares de unión en cada elemento pueden cooperar para dar
alta avidez, y la ausencia de pasos de lavado permite mantener las
asociaciones débiles simplificando al mismo tiempo el formato de
ensayo. La amplificación de señal resulta del hecho de que la
interacción de unos pocos lugares de unión puede producir la
agregación de elementos de unión varios órdenes de magnitud mayores
en tamaño y masa que los elementos originales, y por lo tanto
proporcionar un cambio macroscópico que se puede interpretar
visualmente. Por desgracia, los ensayos de aglutinación de
partículas a menudo son difíciles de interpretar, no producen
resultados cuantitativos, y no se prestan fácilmente a
automatización.
La presente invención evita estos problemas
colocando el marcador magnético en un campo magnético, y midiendo la
fuerza magnética ejercida en el marcador para proporcionar una
lectura cualitativa o cuantitativa del ensayo. El efecto de la
fuerza del campo magnético en el marcador mejora magnética la
detección del marcador magnético capturado o agregado a la vez que
suprime la interferencia no específica de sustancias no magnéticas.
Se han logrado mejoras de la fuera que se aproximan a tres órdenes
de magnitud mediante la aplicación de un campo magnético y la
detección del efecto de fuerza resultante en el marcador magnético
en dicho campo. En comparación con la detección de cambios de peso
debidos a reacciones de unión (por ejemplo, la detección del peso de
analito unido como se determina en análisis gravimétricos
convencionales) la presente invención proporciona mejoras de señal
en ensayos de unión de nueve órdenes de magnitud y es suficiente
para detectar concentraciones de analito en el rango femtomolar
(10^{-15} mol o una cuatrillonésima de mol).
En otro aspecto, la intensidad del campo
magnético se puede manipular exactamente, por ejemplo, por medio de
un imán electromagnético o un imán permanente móvil. Se puede elegir
la intensidad de campo que sea óptima para un ensayo particular y
los reactivos de unión seleccionados, de tal manera que se pueda
aplicar un campo suficiente para quitar marcador magnético no unido
y unido no específicamente sin perturbar las asociaciones formadas
entre los elementos de unión. Esto proporciona la oportunidad de
utilizar elementos de unión que tienen afinidades de unión más bajas
que las consideradas típicamente útiles en ensayos de unión.
En otro aspecto, la unión no específica de
sustancias extrañas a la fase sólido no interferirá con la
determinación del analito. Solamente se mide el efecto de fuerza del
marcador magnético en un campo magnético, en contraposición a
determinar el peso total del complejo de unión resultante o los
reactivos en la fase sólido.
En otro aspecto, se puede determinar fácilmente
pequeños niveles de fuerza usando medios de detección que incluyen,
aunque sin limitación, balanzas electrónicas, sensores ópticos,
dispositivos piezoeléctricos detectores de presión (incluyendo
dispositivos micromecánicos de silicio o chips electrónicos),
dispositivos de fibra vibradores y dispositivos de balancín en
voladizo (incluyendo los usados para detectar cambios de fuerza de
un microscopio de fuerza atómica). Esto permite ensayos muy
sensibles y elimina la necesidad de amplificación del marcador
necesaria en muchos ensayos convencionales.
En otro aspecto, estas ventajas permiten adaptar
fácilmente los ensayos para control por ordenador. Por lo tanto, la
presente invención es adecuada para sistemas automatizados.
En otro aspecto, la intensidad del campo
magnético se puede manipular exactamente para perturbar las
asociaciones formadas entre los elementos de unión. Así, la presente
invención también proporciona unos medios para evaluar las
afinidades de unión o constantes de asociación de elementos de
unión.
Antes de proseguir con la descripción de las
varias realizaciones de la presente invención, se definirán varios
términos usados en la presente memoria.
Las definiciones siguientes se pueden aplicar a
la presente invención.
El término "muestra de prueba", en el
sentido en que se usa aquí, se refiere a un material sospechoso de
contener el analito. La muestra de prueba se puede usar directamente
tal como se obtiene de la fuente o después de un pretratamiento para
modificar el carácter de la muestra. La muestra de prueba se puede
derivar de cualquier fuente biológica, tal como un fluido
fisiológico, incluyendo, sangre, saliva, fluido del cristalino
ocular, fluido espinal cerebral, sudor, orina, leche, líquido
ascítico, mucosa, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido
amniótico o análogos. La muestra de prueba se puede pretratar antes
del uso, tal como preparando plasma a partir de sangre, diluyendo
fluidos viscosos, y análogos; los métodos de tratamiento pueden
implicar la filtración, destilación, concentración, inactivación de
componentes interferentes, y la adición de reactivos tal como
soluciones tampón y reactivos de extracción. Además de los fluidos
fisiológicos, se puede usar otras muestras líquidas tal como agua,
productos alimenticios y análogos para la realización de ensayos
medioambientales o de producción de alimentos. Además, se puede usar
un material sólido sospechoso de contener el analito como la muestra
de prueba. En algunos casos puede ser beneficioso modificar una
muestra de prueba sólida para formar un medio líquido o para liberar
el analito.
El término "elemento de unión", en el
sentido en que se usa aquí, se refiere a un elemento de un par de
unión, es decir, dos moléculas diferentes donde una de las moléculas
se une específicamente a la segunda molécula mediante medios
químicos o físicos. Además de los elementos de pares de unión
antígeno y anticuerpo conocidos, otros pares de unión incluyen, como
ejemplos sin limitación, biotina y avidina, hidratos de carbono y
lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, secuencias de
péptidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras,
cofactores de enzima y enzimas, inhibidores enzimáticos y enzimas,
una secuencia de péptidos y un anticuerpo específico para la
secuencia o la proteína completa, ácidos poliméricos y bases,
colorantes y aglutinantes proteínicos, péptidos y aglutinantes
específico de proteína (por ejemplo, ribonucleasa, péptido S y
proteína S ribonucleasa), azúcar y ácido borónico, y moléculas
similares que tienen una afinidad que permite su asociación en un
ensayo de unión. Además, los pares de unión pueden incluir elementos
que son análogos del elemento de unión original, por ejemplo un
análogo de analito o un elemento de unión hecho por técnicas
recombinantes o ingeniería molecular. Si el elemento de unión es un
inmunorreactivo, puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, antígeno,
hapteno, o su complejo, y si se utiliza un anticuerpo, puede ser un
anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína recombinante o
anticuerpo, un anticuerpo quimérico, una mezcla(s) o sus
fragmento(s), así como una mezcla de un anticuerpo y otros
elementos de unión. Los detalles de la preparación de tales
anticuerpos, péptidos y nucleótidos y su idoneidad para uso como
elementos de unión en un ensayo de unión son conocidos por los
expertos en la materia.
El término "analito" o "analito de
interés", en el sentido en que se usa aquí, se refiere al
compuesto o composición a detectar o medir y que tiene al menos un
epitopo o sitio de unión. El analito puede ser cualquier sustancia
para la que existe un elemento de unión natural o para la que se
puede preparar un elemento de unión. Los analitos incluyen, aunque
sin limitación, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos,
microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas,
esteroides, vitaminas, drogas (incluyendo las administradas a
efectos terapéuticos así como las administradas para fines
ilícitos), y metabolitos de o anticuerpos para alguna de las
sustancias anteriores. El término "analito" también incluye
cualquier sustancia antigénica, haptenos, anticuerpos,
macromoléculas y sus
combinaciones.
combinaciones.
El término "análogo de analito", en el
sentido en que se usa aquí, se refiere a una sustancia que reacciona
transversalmente con un elemento de unión específico de analito,
aunque pueda hacerlo en mayor o menor medida que el analito
propiamente dicho. El análogo de analito puede incluir un analito
modificado así como una porción fragmentada o sintética de la
molécula de analito, a condición de que el análogo de analito tenga
al menos un sitio epitópico en común con el analito de interés. Un
ejemplo de un análogo de analito es una secuencia de péptidos
sintéticos que duplica al menos un epitopo del analito de molécula
entera de manera que el análogo de analito se pueda unir a un
elemento de unión específico de analito.
El término "reactivo marcado
magnéticamente", en el sentido en que se usa aquí, se refiere a
una sustancia que implica un marcador atraíble magnéticamente unido
a un elemento de unión. La unión puede quedar afectada por medios de
unión covalente o no covalente, brazos de enlace, etc, pero el
método de unión no es crítico para la presente invención. A la
aplicación de un campo magnético, el marcador atraíble
magnéticamente permite que el reactivo produzca una respuesta
detectable que estará relacionada directa o indirectamente con la
cantidad de analito en la muestra de prueba. El elemento de unión
componente del reactivo se puede seleccionar para unir directamente
el analito o para unir indirectamente el analito por medio de un
elemento de unión específico auxiliar, que se describe con más
detalle más adelante. Los reactivos magnéticamente marcados incluyen
elementos de unión que se unen a un marcador atraíble magnéticamente
antes, durante o después de la incubación con la muestra de prueba
y/u otros reactivos de ensayo. Los términos "elemento de unión
unido a una partícula atraíble magnéticamente", "elemento de
unión unido a un material magnético", "elemento de unión unido
a un marcador magnético", "elemento de unión unido a un
marcador magnéticamente sensible" y términos similares son
intercambiables y se utilizan para hacer referencia a la principal
característica de los reactivos marcados magnéticamente de la
presente invención, es decir, el marcador produce una respuesta
detectable cuando se pone cerca de un campo magnético.
La selección de una composición particular de
material marcador magnético no es crítica para la presente
invención, pero se aplican varios requisitos. El material atraíble
magnéticamente debe unir, transportar o ser modificable para unirse
a un elemento de unión que a su vez se unirá a otro reactivo de
ensayo o un componente presente en la muestra de prueba. El marcador
debe ser magnéticamente atraíble, preferiblemente a una magnitud que
permite la rápida extracción o separación de reactivo marcado
magnéticamente no unido y la producción de una fuerza magnética
detectable después de la exposición a un campo magnético. A los
efectos de la presente invención, un material es magnéticamente
sensible si queda influenciado por la aplicación de un campo
magnético, por ejemplo, es atraído o repelido o tiene
susceptibilidad o inducción magnéticas detectables. Se puede formar
varios diferentes reactivos marcados magnéticamente variando el
componente marcador o el elemento de unión componente del reactivo.
Los expertos en la materia apreciarán que la elección implica
consideración del analito a detectar y la optimización deseada de la
técnica de ensayo.
El término "fase sólido", en el sentido en
que se usa aquí, se refiere a cualquier material al que se une el
analito, complejos de analito o reactivos de ensayo y del que se
pueden separar reactivos de ensayo no reaccionados, muestra de
prueba o soluciones de prueba. La separación del reactivo marcado
magnéticamente unido y no unido puede implicar la extracción
completa del reactivo marcado magnéticamente no unido de la mezcla
de reacción y/o del reactivo marcado magnéticamente que se
inmoviliza en la fase sólido. En otra realización, la separación de
reactivo marcado magnéticamente unido y no unido puede implicar el
secuestro del reactivo marcado magnéticamente no unido del que
resulta inmovilizado en la fase sólido de tal manera que el reactivo
marcado magnéticamente no unido permanezca en la mezcla de reacción
pero no produzca considerablemente una respuesta detectable cuando
el reactivo marcado magnéticamente unido se ponga cerca de un campo
magnético. En realizaciones alternativas, se observa la respuesta a
un campo magnético del reactivo marcado magnéticamente no unido o
unido. En una realización alternativa, se observa la respuesta a un
campo magnético de reactivos marcados magnéticamente no unidos y
unidos.
El término "elemento de unión auxiliar", en
el sentido en que se usa aquí, se refiere a cualquier elemento de un
par de unión que es utilizado en el ensayo además de los elementos
de unión del reactivo marcado magnéticamente o fase sólido. Se puede
usar uno o varios elementos de unión auxiliares en un ensayo. Por
ejemplo, un elemento de unión auxiliar puede ser capaz de unir el
reactivo marcado magnéticamente al analito de interés, en los casos
en que el analito propiamente dicho no se podría unir directamente
al reactivo marcado magnéticamente. El elemento de unión auxiliar
específico se puede incorporar al dispositivo de ensayo o se puede
añadir al dispositivo como una solución de reactivo separada.
Se comercializa una amplia variedad de materiales
atraíbles magnéticamente, adecuados para ser utilizados como
marcadores magnéticos en la presente invención, o las técnicas de
producción están documentadas en la técnica. Una amplia variedad de
materiales magnéticos cumple también las características requeridas
del marcador atraíble magnéticamente.
En general, la fuerza de atracción o de repulsión
o respuesta magnética relativa del material, es la principal
propiedad magnética de importancia. Los materiales atraíbles
magnéticamente incluyen materiales ferromagnéticos, ferrimagnéticos,
paramagnéticos y superparamagnéticos. El término
"ferromagnético" se usa generalmente para describir materiales
que son atraídos a un imán en alto grado y que se magnetizan
típicamente permanentemente después de la exposición a un campo
magnético. Los materiales ferromagnéticos también pueden ser de
tamaño de partícula reducido de tal manera que cada una de las
partículas sea un dominio único. En este estado de subdivisión, el
material ferromagnético se puede denominar
"superparamagnético", caracterizado por la ausencia de
magnetización mensurable permanente. Los materiales repelidos
magnéticamente adecuados incluyen materiales diamagnéticos
incluyendo, aunque sin limitación, polímeros orgánicos tal como
poliestireno.
Los materiales atraíbles magnéticamente adecuados
incluyen metales (por ejemplo, hierro, níquel, cobalto, cromo y
manganeso), elementos de la serie lantánido (por ejemplo, neodimio,
erbio), aleaciones (por ejemplo, aleaciones magnéticas de aluminio,
níquel, cobalto, cobre), óxidos (por ejemplo, Fe_{3}O_{4},
\gamma-Fe_{3}O_{4}, CrO_{2}, CoO, NiO_{2},
Mn_{2}O_{3}), materiales compuestos (por ejemplo, ferritas) y
soluciones sólidas (por ejemplo, magnetita con óxido férrico). Los
materiales magnéticos preferidos implican magnetita, óxido férrico
(Fe_{3}O_{4}) y óxido ferroso (Fe_{2}O_{3}).
Las composiciones de partículas adecuadas
incluyen, aunque sin limitación, los tipos de partículas específicos
indicados en la Tabla 1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los marcadores magnéticos formados como matriz o
partículas compuestas pueden incluir opcionalmente recubrimientos
adicionales o capas de materiales magnéticos o no magnéticos o sus
mezclas. Las composiciones de matriz se pueden hacer por
cualesquiera medios adecuados incluyendo la polimerización del
material atraíble magnéticamente con el monómero seleccionado o el
hinchamiento del material de matriz con la introducción del material
atraíble magnéticamente en poros dentro de la matriz. La matriz
puede incluir materiales orgánicos e inorgánicos tal como vidrio,
celulosa, materiales poliméricos sintéticos, agarosa, etc. Los
materiales poliméricos adecuados incluyen, aunque sin limitación,
polímeros de estireno, estirenos sustituidos, derivados de
naftaleno, ácidos acrílicos y metacrílicos, acrilamida y
metacrilamida, policarbonato, poliésteres, poliamidas, polipirrol,
ácidos aminoaromáticos, aldehídos, materiales proteináceos (tal como
gelatina y albúmina), polisacáridos (incluyendo almidón y dextrano)
y copolímeros de materiales poliméricos. El polímero también se
puede usar en mezcla con un relleno inerte o puede incluir un
material absorbente.
En general, las partículas magnéticas utilizadas
en la presente invención son de forma sustancialmente esférica,
aunque otras formas son adecuadas y pueden ser ventajosas en algunas
circunstancias. Otras formas posibles incluyen placas, varillas,
barras y formas irregulares.
En general, el diámetro del marcador magnético es
del orden de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1.000 micras
(\mum). El tamaño del marcador magnético es típicamente inferior a
diez micras, pero el tamaño no es crítico para la presente
invención.
En una realización posible, las partículas
magnéticas se podrían seleccionar de manera que tengan una gravedad
específica de modo que tiendan a estar suspendidas dentro de la
mezcla de reacción mejorando por ello la reactividad del elemento de
unión. Las pequeñas partículas magnéticas con un diámetro medio de
menos de aproximadamente 0,03 \mum (300 \ring{A}) se pueden
mantener en solución por agitación térmica y no sedimentar
espontáneamente. En realizaciones alternativas, las partículas
magnéticas se podrían seleccionar de manera que tengan una gravedad
específica de modo que tiendan a sedimentar en la mezcla de reacción
mejorando por ello la reactividad del elemento de unión con el
reactivo inmovilizado en la fase sólido. Las partículas magnéticas
grandes que tienen un diámetro medio superior a 10 micras pueden
responder a campos magnéticos débiles. Se puede usar marcadores
grandes o densos pero pueden requerir que la mezcla de reacción se
mueva o agite durante los pasos de incubación para inhibir la
sedimentación de las partículas. En otra realización, las partículas
magnéticas se seleccionan de manera que permanezcan dispersadas en
la mezcla de reacción durante un tiempo suficiente para permitir las
necesarias reacciones de unión sin necesidad de unos medios
agitadores o mezcladores.
Como apreciarán los expertos en la materia, la
composición, la forma, el tamaño y la densidad del material atraíble
magnéticamente puede variar ampliamente. Los atributos deseados del
marcador se determinan empíricamente y el marcador se selecciona
dependiendo de factores como el analito de interés y el protocolo de
ensayo deseado.
Al formar el reactivo marcado magnéticamente, la
unión del elemento de unión al material magnéticamente atraíble se
puede lograr por cualquier medio de unión adecuado incluyendo
adsorción, unión covalente, entrecruzamiento (químicamente o
mediante elementos de unión) o una combinación de tales medios de
unión. Donde el elemento de unión se une covalentemente al marcador
atraíble magnéticamente, el enlace covalente se puede formar entre
un componente y una forma químicamente activa del otro componente,
por ejemplo, se puede introducir un éster activo tal como
n-hidroxisuccinimida en un componente y dejar
reaccionar con una amina libre en el otro componente para formar un
acoplamiento covalente de los dos. Otros ejemplos incluyen, aunque
sin limitación, la introducción de maleimida sobre un componente que
después se deja reaccionar con radicales sulfhidrilo endógenos o
introducidos en el otro componente, o la oxidación de grupos
carbohidrato endógenos o introducidos en un componente para formar
aldehídos que pueden reaccionar con aminas libres o hidrazidas en el
otro componente. Se comercializan muchos reactivos para llevar a
cabo tales modificaciones y enlaces. También se dispone de reactivos
de enlace homobifuncionales y heterobifunccionales adecuados para
obtener tales conjugaciones. Los reactivos adecuados y las técnicas
de conjugación son conocidos por los expertos en la materia. En otra
realización, donde el marcador atraíble magnéticamente incluye un
recubrimiento de polímero o matriz, el polímero se puede seleccionar
de manera que contenga, o pueda estar provisto de, grupos reactivos
adecuados tal como azida, bromoacetil, amino, hidroxilo, sulhidrilo,
epóxido, grupos carboxílicos u otros para facilitar la unión del
elemento de unión.
Los grupos de acoplamiento y los agentes de
acoplamiento o enlace se seleccionan de manera que la actividad de
unión del elemento de unión no se modifique sustancialmente o
destruya a la unión con el marcador. La cantidad de elemento de
unión que se puede unir al marcador atraíble magnéticamente depende
de su concentración, las condiciones usadas, y la cantidad y
naturaleza de los grupos funcionales disponibles en el marcador
atraíble magnéticamente o el agente de acoplamiento.
El material de fase sólido y reactivos de fase
sólido implican en general materiales no porosos incluyendo, sin
limitación, polímeros de estireno, estirenos sustituidos, derivados
de naftaleno, ácidos acrílicos y metacrílicos, acrilamida y
metacrilamida, policarbonato, poliésteres, poliamidas, polipirrol,
polipropileno, látex, politetrafluoroetileno. Poliacrilonitrilo,
policarbonato, vidrio o materiales similares, ácidos
aminoaromáticos, aldehídos, materiales proteináceos (tal como
gelatina y albúmina), polisacáridos (incluyendo almidón y dextrano)
y copolímeros de materiales poliméricos. Tales materiales están
típicamente en forma de partículas, perlas, tubos, rodajas, cintas,
lámina, placas o cavidades. Así, la fase sólido puede ser el
"recipiente de reacción" en el que tiene lugar el ensayo de
unión, por ejemplo, una cavidad de microtítulo, o puede ser un
material contenido dentro del recipiente de reacción, por ejemplo,
una perla dentro de un tubo de prueba.
El material de fase sólido también podría ser
cualquier material cromatográfico, bíbulo, poroso o capilar
adecuado. En la presente invención, el material de fase sólido puede
incluir, aunque sin limitación, una fibra de vidrio, almohadilla de
celulosa o nylon para uso en un dispositivo de ensayo de flujo
pasante que tiene una o varias capas conteniendo uno o varios de los
reactivos de ensayo: una varilla de inmersión para un ensayo de
inmersión y lectura; una tira de prueba para técnicas
cromatográficas (por ejemplo, papel o fibra de vidrio) o de capa
cromatográfica fina (por ejemplo, nitrocelulosa) en las que uno o
todos los reactivos se contienen en zonas separadas de una tira
única de material de fase sólido; o un material absorbente conocido
por los expertos en la materia.
Como otros ejemplos, se puede usar materiales
naturales, sintéticos o naturales modificados sintéticamente, como
un material de fase sólido incluyendo polisacáridos, por ejemplo,
materiales de celulosa, tal como papel, y derivados de celulosa tal
como acetato de celulosa y nitrocelulosa; sílice; partículas de
silicio; materiales inorgánicos tal como alúmina desactivada, u otro
material inorgánico finamente dividido dispersado uniformemente en
una matriz polimérica porosa, con polímeros tal como cloruro de
vinilo, polímero de cloruro de vinilo con propileno, y polímero de
cloruro de vinilo con acetato de vinilo; tela, tanto natural (por
ejemplo, algodón) como sintética (por ejemplo, nylon); geles porosos
tal como gel de sílice, agarosa, dextrano, y gelatina; películas
poliméricas tal como poliacrilatos; membranas de unión de proteínas;
y análogos.
El material de fase sólido deberá tener
resistencia razonable o se le puede dotar de resistencia por medio
de un soporte, y no deberá interferir con la producción de una señal
detectable. Además, se apreciará que el material de fase sólido es
típicamente no magnético o que su contribución magnética al ensayo
es corregible.
La fase sólido tiene en general un elemento de
unión inmovilizado sobre o en su superficie para permitir la
inmovilización de otro reactivo de ensayo o el analito. Además, el
elemento de unión inmovilizado se puede seleccionar para unir
directamente el analito o para unir indirectamente el analito por
medio de un elemento de unión auxiliar específico.
No es crítico para la presente invención que el
reactivo inmovilizado se una directamente a la fase sólido. El
elemento de unión se puede unir a otro material donde dicho material
está físicamente atrapado o retenido e inmovilizado dentro de la
fase sólido por un medio físico, químico o bioquímico. Por ejemplo,
se puede unir un elemento de unión específico de analito a
micropartículas insolubles que después son retenidas por un material
poroso. Los medios de unir un reactivo a las micropartículas abarcan
tanto medios covalentes como no covalentes. Se prefiere en general
que el elemento de unión se una a las micropartículas por medios
covalentes. Por "retenido" se entiende que las micropartículas,
una vez en el material poroso, no son capaces de movimiento
sustancial a posiciones distintas de dentro del material poroso. Las
micropartículas las pueden seleccionar los expertos en la materia de
cualquier tipo adecuado de material incluyendo poliestireno,
polimetilmetacrilato, poliacrilamida, polipropileno, látex,
politetrafluoroetileno, poliacrilonitrilo, policarbonato, vidrio o
materiales similares.
Los reactivos de fase sólido o los elementos de
unión inmovilizados en una fase sólido incluyen elementos de unión
que se unen a la fase sólido antes, durante o después de la
incubación con la muestra de prueba y/u otros reactivos de ensayo.
En la mayoría de las realizaciones, sin embargo, el reactivo
inmovilizado se une o liga a la fase sólido antes de contactar la
fase sólido con la muestra de prueba. Para simplificar la
descripción siguiente, la fase sólido se describirá principalmente
implicando una estructura de cavidad de plástico como una cuba de
reacción conteniendo al menos el elemento de unión inmovilizado
necesario para el rendimiento del ensayo de unión deseado.
Los métodos y dispositivos de la presente
invención se pueden aplicar a cualquier forma de ensato adecuado que
implique elementos de par de unión incluyendo, aunque sin
limitación, los elementos de unión descritos anteriormente. Los
ejemplos siguientes se referirán típicamente a ensayos de unión de
anticuerpo/antígeno para simplificar la descripción.
Se han descrito en la literatura varios ensayos
competitivos e intercalados por lo que un reactivo marcado se divide
entre una fase líquido y una fase sólido en proporción a la
presencia del analito en la muestra de prueba. La presente invención
es aplicable a formatos de ensayo competitivo. Se une un primer
elemento de unión a un marcador atraíble magnéticamente, formando
por ello un reactivo marcado magnéticamente, antes, durante o
después de la incubación del elemento de unión con la muestra de
prueba. En un ensayo posible, el analito en la muestra de prueba y
un análogo de analito magnéticamente marcado compiten por la unión a
un elemento de par de unión unido a una fase sólido.
Alternativamente, el elemento de unión unido a la fase sólido puede
ser un análogo de analito seleccionado para competir con el analito
para unión a un elemento magnéticamente marcado del par de unión. La
proporción de reactivo marcado magnéticamente que se une a la fase
sólido está relacionado inversamente con la cantidad de analito en
la muestra de prueba.
La presente invención también es aplicable a
ensayos intercalados. Se une un primer elemento de unión a un
marcador atraíble magnéticamente antes, durante o después de la
incubación del elemento de unión con la muestra de prueba. Un
segundo elemento de unión, que está unido a la fase sólido para
formar un reactivo de fase sólido, se selecciona para unir
directamente o indirectamente el analito de interés. El reactivo
marcado magnéticamente resulta inmovilizado en la fase sólido por la
unión del analito que tiene unido el reactivo de fase sólido. Así,
la proporción de reactivo marcado magnéticamente que se une a la
fase sólido está directamente relacionada con la cantidad de analito
en la muestra de prueba.
Los formatos de ensayo pueden implicar
opcionalmente el uso de elementos de unión auxiliares para unir
indirectamente el analito al reactivo marcado magnéticamente o al
reactivo de fase sólido. Además, los protocolos de ensayo pueden
implicar incubar todos los reactivos junto con la muestra de prueba
o en una secuencia especificada, y durante un período de tiempo
adecuado con unión de analito. Después de la incubación, el reactivo
marcado magnéticamente no unido se separa del reactivo marcado
magnéticamente unido. El reactivo marcado magnéticamente no unido
puede ser eliminado completamente de la mezcla de reacción.
Alternativamente, el reactivo marcado magnéticamente no unido puede
ser secuestrado de dicho reactivo marcado magnéticamente que se
inmoviliza en la fase sólido de tal manera que no tenga efecto
sustancial en la medición asistida magnéticamente del reactivo
marcado magnéticamente inmovilizado.
En los métodos de ensayo de la presente
invención, la respuesta del reactivo marcado magnéticamente a la
influencia de un campo magnético se explota para proporcionar una
medición cualitativa o cuantitativa de la magnitud de unión entre
los elementos del par de unión. La presencia de un analito media la
captura del elemento de unión marcado magnéticamente por el elemento
de unión inmovilizado en la fase sólido. Típicamente, el reactivo
marcado magnéticamente no capturado/unido en la fase sólido se
separa de la fase sólido por la aplicación de un campo magnético que
es suficiente para alejar de la fase sólido el reactivo marcado
magnéticamente sin unir, pero no unido.
El cambio del peso aparente del reactivo marcado
magnéticamente inmovilizado después de la aplicación de un campo
magnético se detecta por unos medios de pesaje.
La secuencia siguiente de pasos ejemplifica una
forma de ensayo intercalado usando la detección asistida
magnéticamente de un reactivo marcado magnéticamente:
1) Se une un primer elemento de unión, específico
para el analito, a un marcador atraíble magnéticamente, formando por
ello un reactivo marcado magnéticamente;
2) Se une un segundo elemento de unión,
específico para un segundo sitio de unión en el analito, a una fase
sólido, formando por ello un elemento de unión inmovilizado o
reactivo de fase sólido;
3) Se pone en contacto la muestra de prueba con
el elemento de unión inmovilizado por lo que el analito se une a la
fase sólido por medio del elemento de unión específico de
analito;
4) Se pone en contacto la fase sólido con el
reactivo marcado magnéticamente por lo que el reactivo marcado
magnéticamente resulta inmovilizado en la fase sólido uniendo el
analito capturado (la proporción de reactivo marcado magnéticamente
que resulta unido a la fase sólido está directamente relacionada con
la cantidad de analito en la muestra de prueba);
5) Se quita de la fase sólido el reactivo marcado
magnéticamente no unido;
6) Se pone la fase sólido en un platillo de
pesaje de una microbalanza, y la balanza se pone a cero;
7) Se expone la fase sólido a un campo magnético
de tal manera que se ejerza una fuerza magnética en el reactivo
marcado magnéticamente inmovilizado en la fase sólido, y la
influencia de dicha fuerza en el reactivo magnético capturado se
manifiesta como una desviación de la lectura de cero de la balanza;
y
8) El grado de la desviación mensurable de la
balanza proporciona una medida directa de la cantidad de las
micropartículas magnéticas capturadas en la fase sólido.
Los reactivos no magnéticos inmovilizados y los
componentes de la muestra de prueba no tienen influencia en esta
medición.
La figura 1 ilustra una vista esquemática de la
medición asistida magnéticamente de la unión de un reactivo marcado
magnéticamente a una fase sólido. La fase sólido, por ejemplo, una
cavidad (20) contiene el reactivo marcado magnéticamente
inmovilizado (10) después del formato de ensayo seleccionado. La
fase sólido se pone o fija a un medio de soporte (30). El medio de
soporte descansa sobre un medio de balanza (50). En una microbalanza
típica, la balanza tiene un platillo (40) que recibirá el soporte.
Una vez que la balanza recibe el soporte, o una vez que el soporte
recibe la fase sólido, la balanza se puede poner a equilibrio (a
cero).
En la figura 2, se introduce un imán (60) en la
proximidad de la cavidad, por lo que el campo magnético ejerce una
fuerza en el reactivo marcado magnéticamente inmovilizado en la fase
sólido. La fuerza ejercida en el reactivo marcado magnéticamente se
manifiesta como un cambio evidente del peso de la fase sólido que se
registra en la escala del medio de balanza (50). En general, el imán
se fija a un medio de brazo (70) que permite ajustes delicados de la
aproximación y del alejamiento del imán de la fase sólido.
El campo magnético se puede prever por medio de
un imán magnético permanente o un electroimán y se puede aplicar
intermitente o continuamente. Se puede usar un imán electromagnético
de manera que el campo magnético se puede activar y desactivar en
vez de requerir el movimiento del imán o de la fase sólido. Un
electroimán puede ser controlado por ordenador, proporcionando por
ello ajustes finos de la intensidad del campo magnético. Además, se
puede usar un electroimán para generar un campo magnético alterno
que puede tener la ventaja adicional de hacer la mezcla del reactivo
marcado magnéticamente en la mezcla de reacción si se desea tal
mezcla.
La figura 3 ilustra una vista esquemática de unos
medios alternativos para la medición de la unión de un reactivo
marcado magnéticamente a la fase sólido. La fase sólido, por
ejemplo, una tira de material curvable (25), contiene el reactivo
marcado magnéticamente inmovilizado (10) después de la reacción de
unión seleccionada. La fase sólido se soporta en un medio de
fundamento (45). Los medios de detección incluyen un balancín en
voladizo (35) que contacta la fase sólido para detectar cualquier
movimiento de la fase sólido. La detección se lleva a cabo por medio
de una fuente de luz láser (80) y unos medios detectores ópticos
(50). La luz coherente del láser se refleja del balancín en voladizo
sobre el detector óptico. Cualquier desviación de la posición del
balancín en voladizo da lugar a un desplazamiento de la posición o
deflexión de la luz reflejada que choca en el detector óptico,
produciendo por ello un cambio en su salida. Cuanto mayor es la
distancia recorrida por la luz, mayor es la sensibilidad de tales
medios de medición.
En la figura 4, un imán (60) está colocado cerca
del material curvable, por lo que el campo magnético ejerce una
fuerza en el reactivo marcado magnéticamente inmovilizado en la fase
sólido. La fuerza ejercida en la fase sólido producirá un
desplazamiento del material o una distorsión en la forma del
material. El grado de desplazamiento o distorsión de la posición
original de la fase sólido se puede observar por los medios de
detección.
La figura 5(a) ilustra vistas esquemáticas
de otros medios para la determinación de la reacción de unión
detectando la fuerza ejercida en el reactivo marcado magnéticamente
no unido. La fase sólido, por ejemplo, una cavidad (10), contiene
reactivo marcado magnéticamente (20) del que al menos una porción se
inmoviliza en la cavidad siguiendo el formato de ensayo
seleccionado. La fase sólido se pone o fija a unos medios de balanza
(50). En este ejemplo, el equilibrio tiene un platillo (40) que
recibirá la cavidad. Una vez que la balanza recibe la cavidad, la
balanza se puede poner en equilibrio (a cero). En la figura
5(b), se introduce un imán (60) en la proximidad de la
superficie del contenido de la cavidad, por lo que el campo
magnético ejerce una fuerza en el reactivo marcado magnéticamente.
Bajo la influencia de dicha fuerza, el reactivo marcado
magnéticamente no unido (25) migra a la interface
aire-líquido donde la atracción magnética es más
intensa debido a la mayor proximidad del imán. El reactivo marcado
magnéticamente unido resiste el movimiento por debajo de este nivel
de intensidad del campo magnético y permanece unido mediante el
analito a la parte inferior de la cavidad. El reactivo marcado
magnéticamente en la interface aire-líquido se
escurre hacia arriba contra la tensión superficial de la superficie
del líquido, produciendo un cambio en el peso aparente de la fase
sólido que se registra como un cambio de la lectura en la escala de
los medios de balanza (50). Cuanto más se aproxima el imán a la
cavidad, mayor es la cantidad de reactivo libre en la interface
aire-líquido y la mayor intensidad del campo
magnético da lugar a un mayor cambio en el peso aparente de la fase
sólido. A medida que aumente la intensidad del campo magnético, se
superará la asociación más débil de reactivo marcado magnéticamente
unido no específicamente con la parte inferior de la cavidad,
separándolo por lo tanto del reactivo marcado magnéticamente unido
específicamente.
El método ilustrado en la figura 5 también se
puede utilizar para determinar la resistencia de la asociación entre
elementos de unión. Cuando el material magnético se aproxima más a
la cavidad, la intensidad creciente de la fuerza de atracción
magnética en la parte inferior de la cavidad comienza a sacar
reactivo marcado magnéticamente unido específicamente de la parte
inferior de la cavidad en la interface de
aire-líquido donde hace una mayor contribución a la
fuerza agregada ascendente en la cavidad. Un método para determinar
la resistencia de la asociación entre elementos de unión se describe
con más detalle más adelante.
Dado que la presente invención implica la
evaluación de la respuesta magnética del marcador, los varios
métodos de detección son fácilmente adaptables a una operación
automatizada. En el sentido en que se usa aquí, el término
"automatizado" no pretende excluir la posibilidad de que
algunas operaciones de ensayo se puedan llevar a cabo
manualmente.
También se puede usar un medio magnético para
separar el reactivo marcado magnéticamente no unido o libre del
reactivo unido o inmovilizado. Por ejemplo, el reactivo marcado
magnéticamente no unido se puede quitar de la mezcla de reacción
introduciendo una sonda magnética en la mezcla de reacción y sacando
después la sonda con reactivo marcado magnéticamente no unido que es
atraído a dicha sonda. En otra realización, el reactivo marcado
magnéticamente no unido puede ser sacado de la mezcla de reacción
colocando un imán fuera del recipiente de reacción y moviendo el
imán a lo largo del fondo y/o pared del recipiente, sacando por lo
tanto el reactivo marcado magnéticamente no unido de la mezcla de
reacción o alejándolo de dicho reactivo inmovilizado en la fase
sólido. El reactivo marcado magnéticamente no unido puede ser
eliminado completamente de la mezcla de reacción y la fase sólido o
se puede alejar del reactivo marcado magnéticamente inmovilizado de
tal manera que el reactivo libre no influya en la detección del
reactivo marcado magnéticamente unido. En otra realización, se puede
colocar unos medios magnéticos cerca de la superficie de la mezcla
de reacción de tal manera que el reactivo marcado magnéticamente no
unido sea secuestrado en la interface de aire/líquido de la mezcla
de reacción, separando por lo tanto el reactivo marcado
magnéticamente no unido del reactivo inmovilizado. En otra
realización, el reactivo no unido se puede alejar del reactivo
marcado magnéticamente inmovilizado y retener de manera adecuada de
tal manera que el reactivo no unido se retarde de manera que vuelva
al área de la fase sólido en la que se inmoviliza el reactivo
unido.
Los ejemplos siguientes describen ensayos que se
realizaron según la presente invención así como un dispositivo para
llevar a cabo los ensayos.
Se introdujo un soporte de plástico en el
receptáculo de platillo de una balanza electrónica (Mettler AE 163;
Mettler Instrument Corporation, Heightson, NJ). El soporte tenía un
agujero en la pieza transversal superior que recibiría una sola
cavidad de microtítulo (tiras de módulo de ocho cavidades separadas
Nunc; Nunc Incorporated, Naperville, IL) de manera que la parte
inferior de la cavidad se extendiese por debajo de la parte inferior
de la pieza transversal. Se colocó un imán fijo de
neodimio-hierro-boro (Racoma
Incorporated, Boonton, NJ) en el extremo de una barra de plástico
unida a la etapa mecánica de un microscopio de manera que el
movimiento de la etapa mecánica permitiese la colocación exacta y
reproducible del imán debajo de la parte inferior de la cavidad de
microtítulo suspendida.
Las partículas paramagnéticas eran partículas de
poliestireno/vinilo/COOH/magnetita (Bang's Laboratories,
Incorporated, Carmel, IN) suministradas como una suspensión a 10%
(p/v). Esta suspensión se diluyó a diez veces su volumen con agua a
una concentración de 10 miligramos de partículas por mililito. Se
pipetaron alícuotas de 5-40 microlitros
(50-400 \mug de partículas) a la cavidad de
mitrotítulo que se introdujo en el soporte. La suspensión de
partículas se diluyó otras diez veces su volumen para obtener otro
conjunto de alícuotas conteniendo 5-40 microgramos
de partículas para evaluar la respuesta de menores cantidades de
partículas. Se colocó una cantidad medida de partículas magnéticas
en la cavidad de mitrotítulo, y la balanza se puso a cero con el
imán retirado.
Para medir la fuerza generada al acercar el imán
a las partículas magnéticas en la cavidad, el imán se colocó
aproximadamente dos milímetros por debajo de la parte inferior de la
cavidad y se aproximó a la parte inferior de la cavidad en una serie
de pequeños movimientos incrementales. La lectura de la balanza se
observó después de cada movimiento, y se registró la última lectura
obtenida antes de que el imán tocase la parte inferior de la
cavidad. Usando este procedimiento, se observó un factor de mejora
medio de más de 700, y el efecto parecía sustancialmente lineal
hasta al menos 20 microgramos de partículas magnéticas como ilustran
los datos presentados en la tabla 2.
Se utilizaron los reactivos y muestras siguientes
en un ensayo de unión:
El reactivo marcado magnéticamente era una
micropartícula paramagnética recubierta con estreptavidina (Advanced
Magnetics, Cambridge, MA; diámetro medio de una micra, con
5x10^{8} partículas por mg, suministrada como una suspensión de 5
mg/ml). La capacidad de unión de las partículas era 3,2 microgramos
de biotina por mililitro de suspensión. Las muestras de prueba
contenían varias concentraciones de biotina en una solución salina
fosfato tamponada.
La fase sólido implicaba cavidades de microtítulo
de poliestireno separadas (tiras de módulo de microcavidad de 8
cavidades Nunc) que se habían recubierto con albúmina sérica bovina
biotinilada (biotina-BSA; Sigma Chemical Company,
St. Louis, MO; 8,9 moles de biotina por mol de BSA). La
biotina-BSA se disolvió en salina fosfato tamponada
(PBS), pH 7,2 a una concentración de 50 microgramos/mililitro, y se
pipetaron alícuotas (100 \mul) a cada cavidad. Después de la
incubación durante una hora a 37ºC, la solución se sacó de las
cavidades y sustituyó por 400 microlitros de 1% BSA (no biotinilado)
en PBS como un recubrimiento superior. Se continuó la incubación a
37ºC durante 45 minutos más. Las cavidades se vaciaron después y
lavaron con PBS usando una botella de lavado. El resultado general
de este procedimiento era inmovilizar moléculas de biotina en la
parte inferior de las cavidades de microtítulo (como
biotina-BSA) e inactivar las cavidades a unión no
específica adicional de la proteína por recubrimiento con BSA no
biotinilada.
En primer lugar, se combinó el reactivo marcado
magnéticamente con la muestra de prueba, formando por ello una
mezcla de reacción que se incubó durante una hora a 37ºC. Se
transfirió una alícuota (80 \mul) de cada mezcla de reacción a la
fase sólido, donde se incubó más durante una hora a 37ºC para
efectuar unión de avidina-biotina. El reactivo
marcado magnéticamente no unido se extrajo de la mezcla de reacción
por medio de atracción magnética.
Una vez combinada, la biotina libre de la muestra
de prueba pasó a unirse a los sitios de unión de biotina disponibles
en los radicales de avidina de las partículas magnéticas recubiertas
con avidina, inhibiendo por lo tanto la captura siguiente del
reactivo marcado magnéticamente por la biotina inmovilizada en la
parte inferior de la cavidad. El grado de inhibición dependía de la
concentración de la biotina libre en la muestra de prueba. Así, la
cantidad de reactivo marcado magnéticamente que se unió por la fase
sólido era inversamente proporcional a la cantidad de biotina en la
muestra de prueba.
La respuesta magnética del reactivo marcado
magnéticamente unido a la parte inferior de cada cavidad se
determinó usando un aparato sustancialmente como se describe en el
ejemplo 1, anterior. El cambio de peso debido a la respuesta
magnética del reactivo marcado magnéticamente inmovilizado en cada
cavidad se registró en función de la cantidad de biotina libre de la
muestra de prueba presente durante la incubación.
La figura 6 ilustra los resultados del ensayo.
Los medios de balanza detectaron un menor cambio de fuerza, de 12
miligramos a cero miligramos, cuando la concentración de biotina
libre en la muestra de prueba se incrementó de 0
nanogramos/mililitro a 125 nanogramos/mililitro (80 \mul en
ensayo). Así, cuando se incrementaba la cantidad de biotina libre en
una muestra de prueba, disminuía proporcionalmente la cantidad de
reactivo marcado magnéticamente que se unía a la fase sólido, y
había una disminución correspondiente del cambio de peso aparente de
dicho reactivo unido a la aplicación de un campo magnético.
La figura 7 ilustra los resultados del ensayo
representados como una inhibición porcentual del peso magnéticamente
mejorado del reactivo marcado magnéticamente capturado que resulta
de la presencia de biotina libre en la muestra de prueba. Se observó
una inhibición de cincuenta por ciento a una concentración de
biotina libre de 40 nanogramos/mililitro. A partir de estos
resultados, se determinó que la configuración de ensayo
proporcionaba un ensayo para biotina libre en la muestra de prueba
con una sensibilidad en el rango femtomolar.
Para explorar más el potencial del concepto de
ensayo con marcador magnético asistido, se utilizó una microbalanza
electrónica Cahn modelo D-200 (Cahn Instrument
Incorporated, Cerritos, CA). Esta balanza consta de un balancín
conectado al rotor de un motor eléctrico. El movimiento del
balancín, como resultado de la presencia de un peso en una de los
platillos colgantes, se detecta con un dispositivo óptico de
colocación, y se envía al motor suficiente corriente para volver el
balancín a su posición original. La magnitud de esta corriente es
convertida por la circuitería electrónica de la balanza a una
lectura del peso.
Se diseñó y montó un aparato para colocar
exactamente un imán fijo a partir de tres tablas de colocación de
precisión (Daedal Division of Parker Hannifin Corporation, Harrison
City, PA). Dos tablas se ajustaron micrométricamente y usaron para
colocar el imán en las direcciones X e Y horizontales. La tercera
tabla, montada verticalmente, se movió en un micromotor paso a paso
para controlar el movimiento del imán en la dirección vertical o Z
(Compumoter Division of Parker Hannifin Corporation, Rohnert Park,
CA). A la tabla Z se unió un imán fijo (Racoma 35; Recoma, Inc.,
Boonton, NJ) con un soporte que puso el imán dentro de un recinto
que rodeaba los platillos de la balanza para proteger los platillos
de las corrientes de aire. El movimiento del motor se controló por
circuitería de microprocesador conectada con un ordenador. La
aceleración, la velocidad y la distancia de movimiento, así como la
posición final, se programaron en el ordenador de tal manera que los
movimientos repetitivos complejos se pudiesen ejecutar
automáticamente. El movimiento de una pulgada (2,54 cm) formaba
100.000 micropasos, y eran posibles los movimientos controlados de
un micropaso.
La relación del factor de mejora magnética a la
cantidad de reactivo marcado magnéticamente se confirmó usando la
balanza Cahn. Se pipetó una alícuota de diez microlitros de una
suspensión conteniendo partículas paramagnéticas (100 \mug/ml;
como se describe en el Ejemplo 1 anterior) sobre el platillo de
balanza, se equilibró la balanza, el imán se puso cerca del platillo
y se observó el cambio de lectura. Después, se añadieron alícuotas
adicionales de diez microlitros, y se repitió el proceso hasta que
se hubo añadido un total de 100 microlitros. La Tabla 3 ilustra la
relación entre la cantidad de reactivo marcado magnéticamente en la
cavidad y la fuerza ejercida en el reactivo (medida como un aumento
de peso) por el campo magnético: a medida que aumentaba la cantidad
de reactivo magnético, aumentaba linealmente la desviación de la
balanza debida al movimiento del imán.
Se demostró un inmunoensayo de inhibición
asistido magnéticamente usando los reactivos siguientes:
El reactivo marcado magnéticamente constaba de
partículas paramagnéticas (Advanced Magnetics) recubiertas con
anticuerpo dirigido contra IgG de ratón (cadena pesada y ligera)
como una suspensión de un miligramo/mililitro (5x10^{8}
partículas/ml).
La fase sólido implicó las cavidades de una placa
de microtítulo que había sido recubierto con IgG de ratón (100
microlitros de una solución de 50 \mug/ml, en una solución tampón
de carbonato a 1%, pH 8,6). La fase sólido se recubrió después con
1% BSA en PBS.
Las muestras de prueba (80 microlitros) contenían
varias concentraciones de IgG de ratón libre en una solución
tamponada PBS.
Se incubó el reactivo marcado magnéticamente con
el anticuerpo inmovilizado en la fase sólido en ausencia de IgG de
ratón libre. El reactivo marcado magnéticamente se unió a la fase
sólido y resistió la extracción después de la aplicación de un campo
magnético. Se demostró que la unión del reactivo marcado
magnéticamente era específico para el anticuerpo de ratón
inmovilizado, porque se extrajo el mismo reactivo marcado
magnéticamente por la aplicación del mismo campo magnético cuando se
incubó con una fase sólido que había sido recubierta con BSA
solamente.
solamente.
Después de la incubación de reactivo marcado
magnéticamente con el anticuerpo de ratón libre, se inhibió la unión
siguiente de la IgG antirratón marcada magnéticamente a la IgG de
ratón recubierta en la parte inferior de la cavidad. La cantidad de
reactivo marcado magnéticamente restante unido a la fase sólido,
después de la separación magnética del reactivo marcado
magnéticamente no unido, se midió colocando la cavidad en un
platillo de balanza, poniendo a cero la balanza, y moviendo después
el imán a posición.
La figura 8 ilustra el efecto de aproximar
primero y alejar después repetidas veces el imán de la proximidad de
la parte inferior de la cavidad en la que no había IgG de ratón
libre durante la incubación, es decir, sin inhibición de la unión de
reactivo marcado magnéticamente al anticuerpo inmovilizado en la
parte inferior de la cavidad; donde (a) muestra la mejora magnética
de peso al acercamiento del campo magnético y (b) muestra el retorno
al punto cero a la retirada del campo magnético. La figura 9 ilustra
el registro de un ciclo único de la aplicación y extracción del
campo magnético en estas condiciones, que produjo un cambio de peso
aparente de 5,8 miligramos.
La presencia de IgG de ratón libre (a una
concentración de 2,5 \mug/ml), durante la incubación, produjo una
disminución del efecto observado del campo magnético. Como se
ilustra en la figura 10, la incubación del reactivo marcado
magnéticamente con IgG de ratón libre a una concentración de 2,5
microgramos/mililitro dio lugar a un cambio del peso aparente de
cero a 2,8 miligramos (obsérvese el cambio en unidades del eje
vertical de la figura 9). El efecto de la presencia de varias
concentraciones de IgG de ratón libre durante la incubación se
determinó como inhibición porcentual del valor obtenido en la
ausencia de IgG de ratón libre.
La figura 11 ilustra los resultados representados
en función de la concentración de IgG de ratón libre frente a la
inhibición porcentual del cambio de peso. Los datos ilustran una
curva de inhibición clásica con inhibición de 50% resultante de la
presencia de IgG de ratón libre a una concentración de un
microgramo/mililitro.
El experimento siguiente se realizó para medir la
afinidad de unión entre un par dado de elementos de unión. El método
implicaba el uso de cavidades de microtítulo, que se había cortado
para proporcionar una pared de cavidad de altura reducida de
aproximadamente cinco milímetros, y unos medios magnéticos que se
acercaban a las cavidades desde arriba.
Se midió la resistencia de la asociación entre el
reactivo marcado magnéticamente capturado y la fase sólido. Se
inmovilizó IgG de ratón en la cavidad, se colocó en la cavidad una
suspensión de partículas magnéticas recubiertas con anticuerpo IgG
antirratón y se incubó la mezcla de reacción para que pudiese tener
lugar la unión.
Se movió un campo magnético en pasos discretos a
proximidad con la parte superior de la cavidad, produciendo por ello
una serie controlada de aumentos en la fuerza de atracción
ascendente ejercida en el anticuerpo marcado magnéticamente en la
cavidad. La figura 12 ilustra el procedimiento, donde 12(a)
ilustra el reactivo marcado magnéticamente, del que parte se
inmoviliza en la fase sólido como resultado de una reacción de
unión, y la lectura de la balanza antes del acercamiento de un campo
magnético a la fase sólido. El movimiento inicial (50.000
micropasos) del campo magnético hacia la superficie de la suspensión
hizo que el anticuerpo marcado magnéticamente que no se unió al
anticuerpo inmovilizado, migrase a la interface
aire-líquido de la suspensión. Cuando el imán se
aproximó más a la superficie (en movimientos de 5.000 micropasos),
hubo un aumento correspondiente de la fuerza de atracción en las
partículas libres dando lugar a una disminución observable del peso
del recipiente con cada movimiento discreto, como se ilustra en
12(b). Las partículas libres recogidas en la interface
ejercieron una fuerza ascendente contra la tensión superficial de la
superficie del líquido, produciendo por ello una disminución
observable en el peso aparente de la cavidad. La disminución de peso
se determinó por una balanza sustancialmente según el método
descrito en el ejemplo 1 anterior. El anticuerpo marcado
magnéticamente que se unió al anticuerpo inmovilizado en la parte
inferior de la cavidad también ejerció una fuerza ascendente en el
campo magnético. Sin embargo, la fuerza ejercida por el reactivo
unido era inferior a la ejercida por el reactivo libre en la
superficie debido a la mayor distancia del reactivo unido del imán.
Cuando se aproximó el imán a la parte superior de la cavidad,
haciendo por ello que aumentase la fuerza ascendente en el
anticuerpo marcado magnéticamente, el anticuerpo marcado
magnéticamente que se unió al elemento de unión inmovilizado en la
parte inferior de la cavidad comenzó a disociarse de la parte
inferior de la cavidad y a migrar a la superficie del líquido, como
se ilustra en 12(c).
La figura 13 ilustra la medición de la fuerza de
asociación del reactivo marcado magnéticamente y la fase sólido.
Durante la aproximación inicial de 50.000 micropasos 13(a)
del imán hacia la parte superior de la cavidad, el campo de
atracción magnética era relativamente débil, y las disminuciones del
peso aparente resultaron de la mayor fuerza ascendente ejercida en
el anticuerpo marcado magnéticamente libre que se recogió en la
superficie de aire-líquido. Cuando el imán se
aproximó más a la superficie (en movimientos de 5.000 micropasos),
hubo un aumento correspondiente de la fuerza de atracción en las
partículas libres, dando lugar a una disminución observable en el
peso del recipiente con cada movimiento discreto, como se ilustra en
13(b). No se observó cambio de peso cuando el imán se paró
entre movimientos, indicando que no se producía cambio en la
posición de las partículas entre los cambios de intensidad del campo
magnético.
Cuando se aproximó el imán a la parte superior de
la cavidad, el anticuerpo marcado magnéticamente que se unió al
elemento de unión inmovilizado en la parte inferior de la cavidad
comenzó a disociarse y a migrar a la superficie del líquido. Cuando
las partículas disociadas llegaron a la superficie del líquido,
estaban en una región de mayor fuerza de atracción magnética, y por
lo tanto, estas partículas ejercían una mayor fuerza ascendente en
la cavidad. Esta disociación forzada del anticuerpo marcado
magnéticamente de la parte inferior de la cavidad, y la siguiente
migración a la superficie del líquido, se manifestó como una
disminución gradual del peso de la cavidad entre movimientos del
imán. El cambio del peso aparente se consideró una desviación de la
traza de peso de la horizontal entre movimientos 13(b) del
imán. Cuando se sacó el imán en una serie de movimientos discretos
13(c) de la proximidad de la cavidad, los cambios de peso
aparente entre movimientos volvieron a cero.
Cuando el imán se avanzó de nuevo hacia la misma
cavidad 13(d), no hubo cambios de peso aparentes entre los
movimientos del imán. Estas apariciones demostraron que todo el
reactivo marcado magnéticamente que se disociaría de la parte
inferior de la cavidad bajo un nivel dado de fuerza magnética ya se
había disociado durante el primer acercamiento del campo magnético.
Así, los cambios adicionales del peso aparente se debían a cambios
de la fuerza del campo magnético cuando el imán se movía, sin
contribución debido a la desasociación adicional del reactivo
marcado magnéticamente de la parte inferior de la cavidad.
Los resultados demostraron que las constantes de
asociación entre elementos de unión se pueden determinar
cuantitativamente por medio de mediciones de reactivo marcado
magnéticamente asistidas magnéticamente. La intensidad de atracción
del campo magnético necesaria para superar la asociación de los
elementos de unión es una medida directa de la constante de
asociación entre los elementos de unión.
Se incubó un recipiente recubierto con BSA con
una suspensión de partículas magnéticas recubiertas con IgG
antirratón. Las mediciones de respuesta magnética (realizadas
sustancialmente según el método descrito en el ejemplo 5 anterior)
revelaron una disminución de tres miligramos en el peso cuando los
medios magnéticos se aproximaron a la parte superior del recipiente.
Un recipiente que contenía la misma cantidad de partículas
magnéticas recubiertas con IgG antirratón, pero que también contenía
IgG de ratón inmovilizada (recubierta con BSA), exhibió un cambio de
peso inferior a un miligramo, indicando por lo tanto que suficiente
reactivo marcado magnéticamente había sido capturado por el
anticuerpo inmovilizado en la parte inferior de la cavidad
disminuyendo en dos tercios la medición de respuesta magnética
debida a las partículas magnéticas no unidas que habían migrado a la
superficie del líquido.
Se halló que la adición de IgG de ratón libre,
durante la incubación del reactivo marcado magnéticamente y la fase
sólido, inhibía la unión del reactivo marcado magnéticamente a la
IgG de ratón inmovilizada en la parte inferior de la cavidad,
permitiendo por ello que el reactivo marcado magnéticamente no unido
migrase a la superficie del líquido bajo la influencia del campo
magnético y presentase una mayor respuesta magnética. De esta forma,
inmunoensayos de inhibición parecidos al representado en la figura
11 podían ser supervisados por el cambio de peso aparente producido
por levitación de partículas magnéticas, es decir, detección de
reactivo marcado magnéticamente no unido. Dado que la atracción
magnética cae rápidamente con la distancia (como antes se mostró en
la figura 7), el movimiento del reactivo marcado magnéticamente
libre más próximo al imán mejora en gran medida su influencia con
relación al del reactivo unido marcado magnéticamente. Esto permite
una determinación del grado relativo de la unión de reactivo marcado
magnéticamente sin precisar la extracción del reactivo marcado
magnéticamente libre de la cavidad.
Se construyó un recipiente de fase sólido de
manera que incluyese dos cavidades o depresiones, de tamaños
diferentes, que se conectaron por un canal estrecho. Las cavidades
se llenaron de una suspensión de partículas magnéticas. Bajo la
influencia de un campo magnético aplicado desde encima de la cavidad
más grande, las partículas magnéticas formaron un punto en la
superficie del líquido dentro de la cavidad más grande. Desplazando
el imán desde encima de la cavidad más grande a encima de la cavidad
más pequeña (a la vez que se mantiene el campo magnético), las
partículas se hicieron migrar a través del canal a lo largo de la
superficie del líquido hasta que las partículas se suspendieron
sobre la cavidad más pequeña. La extracción del campo magnético hizo
después que las partículas magnéticas cayesen a la parte inferior de
la cavidad más pequeña. Esto ilustró solamente uno de muchos métodos
posibles por los que el reactivo marcado magnéticamente libre puede
ser separado físicamente de reactivo marcado magnéticamente unido a
un elemento de unión inmovilizado en una fase sólido por la
influencia de un campo magnético.
Un método de ensayo alternativo puede implicar el
uso de una fase sólido particulada. El reactivo marcado
magnéticamente puede implicar un elemento de unión conjugado a un
marcador magnético que tiene un diámetro medio de 0,05 micras o
menos. El reactivo marcado magnéticamente se puede mezclar con una
cantidad de partículas no magnéticas más grandes (por ejemplo,
micropartículas de poliestireno, diámetro de 5,0 micras) para formar
una mezcla de reacción. Un elemento de par de unión inmovilizado en
la superficie de las partículas no magnéticas hace que el reactivo
marcado magnéticamente se una a las partículas más grandes en
presencia del analito.
Después de una reacción de unión, la aplicación
de un campo magnético hace que el reactivo marcado magnéticamente no
unido migre rápidamente hacia los medios magnéticos. El reactivo
marcado magnéticamente unido a las partículas no magnéticas más
masivas migra a una velocidad mucho más lenta en el campo magnético,
proporcionando por ello la discriminación entre reactivo marcado
magnéticamente unido y libre. Después de la separación del reactivo
marcado magnéticamente no unido, dicho reactivo marcado
magnéticamente unido a las partículas no paramagnéticas se somete a
análisis usando los métodos de medición de marcador magnético
asistidos magnéticamente antes descritos.
Claims (15)
1. Un método para determinar la presencia o
cantidad de un analito en una muestra de prueba, incluyendo los
pasos de:
a) incubar la muestra de prueba con un reactivo
de fase sólido y un reactivo marcado magnéticamente, donde dicho
reactivo de fase sólido incluye un primer elemento de unión unido,
antes o durante o después de la incubación de dicha primera unión
con la muestra de prueba, a una fase sólido y donde dicho reactivo
marcado magnéticamente incluye un segundo elemento de unión unido,
antes o durante o después de la incubación de dicha segunda unión
con la muestra, a un marcador atraíble magnéticamente, donde dicho
primer elemento de unión une el analito o dicho segundo elemento de
unión, y dicho segundo elemento de unión une el analito o dicho
primer elemento de unión, respectivamente, dividiendo por lo tanto
dicho reactivo marcado magnéticamente entre reactivo marcado
magnéticamente no unido y reactivo marcado magnéticamente unido a
dicha fase sólido en proporción a la cantidad de analito presente en
la muestra de prueba;
b) separar reactivo marcado magnéticamente no
unido de reactivo marcado magnéticamente unido a dicha fase
sólido;
c) aplicar un campo magnético a dicho reactivo
marcado magnéticamente unido a dicha fase sólido; y
d) determinar la magnitud de la fuerza ejercida
en dicha fase sólido por dicho reactivo marcado magnéticamente unido
en dicho campo magnético como una medida de la cantidad del analito
en la muestra de prueba, caracterizado porque
la magnitud de la fuerza ejercida en dicha fase
sólido por dicho campo magnético se detecta determinando un cambio
de peso aparente del reactivo unido en el campo magnético, siendo
detectado dicho cambio de peso por unos medios de balanza.
2. El método según la reivindicación 1, donde la
muestra de prueba se incuba secuencialmente con dicha fase sólido y
dicho reactivo marcado magnéticamente.
3. El método según la reivindicación 1, donde la
muestra de prueba se incuba simultáneamente con dicha fase sólido y
dicho reactivo marcado magnéticamente.
4. Un método para determinar la presencia o
cantidad de un analito en una muestra de prueba, incluyendo los
pasos de:
a) incubar la muestra de prueba con un reactivo
de fase sólido y un reactivo marcado magnéticamente, donde dicho
reactivo de fase sólido incluye un primer elemento de unión unido,
antes o durante o después de la incubación de dicha primera unión
con la muestra de prueba, a una fase sólido y donde dicho reactivo
marcado magnéticamente incluye un segundo elemento de unión unido,
antes o durante o después de la incubación de dicha segunda unión
con la muestra de prueba, a un marcador atraíble magnéticamente,
donde dicho primer elemento de unión une el analito o dicho segundo
elemento de unión, y dicho segundo elemento de unión une el analito
o dicho primer elemento de unión, respectivamente, dividiendo por lo
tanto dicho reactivo marcado magnéticamente entre reactivo marcado
magnéticamente no unido y reactivo marcado magnéticamente unido a
dicha fase sólido en proporción a la cantidad de analito presente en
la muestra de prueba;
b) separar reactivo marcado magnéticamente no
unido de reactivo marcado magnéticamente unido a dicha fase
sólido;
c) aplicar un campo magnético a dicho reactivo
marcado magnéticamente no unido; y
d) determinar la magnitud de la fuerza ejercida
en dicho reactivo marcado magnéticamente no unido en dicho campo
magnético como una medida de la cantidad del analito en la muestra
de prueba, caracterizado porque
la magnitud de la fuerza ejercida en dicho
reactivo marcado magnéticamente no unido por dicho campo magnético
se detecta determinando un cambio de peso aparente de la fase sólido
en el campo magnético, siendo detectado dicho cambio de peso por
unos medios de balanza.
5. El método según la reivindicación 4, donde la
muestra de prueba se incuba secuencialmente con dicha fase sólido y
dicho reactivo marcado magnéticamente.
6. El método según la reivindicación 4, donde la
muestra de prueba se incuba simultáneamente con dicha fase sólido y
dicho reactivo marcado magnéticamente.
7. Una unidad de ensayo para determinar la
presencia o cantidad de un analito en una muestra de prueba,
incluyendo:
un recipiente de reacción en el que se produce
reactivo marcado magnéticamente libre e inmovilizado en proporción a
la cantidad de analito en la muestra de prueba;
unos medios de separación para separar dicho
reactivo marcado magnéticamente inmovilizado de reactivo marcado
magnéticamente libre;
unos medios de generador de campo magnético para
la aplicación de un campo magnético a dicho reactivo marcado
magnéticamente inmovilizado; y
unos medios de balanza para evaluar el cambio de
peso aparente de dicho reactivo marcado magnéticamente
inmovilizado.
8. El dispositivo de ensayo según la
reivindicación 7, donde dichos medios de generador de campo
magnético incluyen un imán permanente y unos medios de
colocación.
9. El dispositivo de ensayo según la
reivindicación 7, donde dichos medios de generador de campo
magnético incluyen un electroimán.
10. El dispositivo de ensayo según la
reivindicación 7, donde dichos medios de balanza son una balanza
electrónica.
11. Una unidad de ensayo para determinar la
presencia o cantidad de un analito en una muestra de prueba,
incluyendo:
un recipiente de reacción en el que se produce
reactivo marcado magnéticamente libre e inmovilizado en proporción a
la cantidad de analito en la muestra de prueba;
unos medios de separación para separar reactivo
marcado magnéticamente libre de reactivo marcado magnéticamente
inmovilizado;
unos medios de generador de campo magnético para
la aplicación de un campo magnético a dicho reactivo marcado
magnéticamente libre; y
unos medios de balanza para evaluar el cambio de
peso de dicho reactivo marcado magnéticamente libre a la aplicación
de dicho campo magnético.
12. El dispositivo de ensayo según la
reivindicación 11, donde dichos medios de generador de campo
magnético incluyen un imán permanente y unos medios de
colocación.
13. El dispositivo de ensayo según la
reivindicación 11, donde dichos medios de generador de campo
magnético incluyen un electroimán.
14. El dispositivo de ensayo según la
reivindicación 11, donde dichos medios de balanza son una balanza
electrónica.
15. Una unidad de ensayo para determinar la
presencia o cantidad de un analito en una muestra de prueba,
incluyendo:
un recipiente de reacción en el que se produce
reactivo marcado magnéticamente libre e inmovilizado en proporción a
la cantidad de analito en la muestra de prueba;
unos medios de generador de campo magnético para
la aplicación de un campo magnético a dicho reactivo marcado
magnéticamente libre e inmovilizado; y
unos medios de balanza para evaluar el cambio de
peso aparente de dicho reactivo marcado magnéticamente libre e
inmovilizado respectivamente, después de la aplicación de dicho
campo magnético.
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