ES2221759T3 - Zace1: una metaloenzima humana. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) los restos aminoácidos de 367 a 430 de la SEQ ID NO:1, (b) los restos aminoácidos de 163 a 563 de la SEQ ID NO:1, (c) los restos aminoácidos de 52 a 563 de la SEQ ID NO:1, (d) los restos aminoácidos de 52 a 644 de la SEQ ID NO:1, (e) los restos aminoácidos de 52 a 648 de la SEQ ID NO:1, (f) los restos aminoácidos de 52 a 655 de la SEQ ID NO:1, (g) los restos aminoácidos de 52 a 662 de la SEQ ID NO:1, (h) los restos aminoácidos de 52 a 682 de la SEQ ID NO:1, (i) los restos aminoácidos de 52 a 694 de la SEQ ID NO:1, y (j) los restos aminoácidos de 1 a 694 de la SEQ ID NO:1, en el que el polipéptido aislado (a) se une de modo específico con un anticuerpo que se une de modo específico con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, o (b) muestra actividad dipeptidilcarboxipeptidasa.

Description

Zace1: Una metaloenzima humana.

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a una nueva proteína expresada por células humanas. En particular, la presente invención se refiere a un nuevo gen que codifica una metaloenzima, denominada "Zace1", y a moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de Zace1.

Antecedentes de la invención

La enzima conversora de angiotensina (ACE, "angiotensin-converting enzyme"; peptidil-dipeptidasa A; quininasa II (EC 3.4.15.1)) es una metalopeptidasa de cinc que desempeña un papel en la regulación de la presión sanguínea y la fertilidad. La ACE es bastante no específica y rompe los dipéptidos de una amplia gama de sustratos. En general, la ACE rompe un dipéptido C-terminal "A-B" de un polipéptido cuando A no es un resto prolina, y B no es un resto aspartato o glutamato. Por ejemplo, la ACE rompe un único dipéptido C-terminal de la angiotensina I para producir el potente vasopresor angiotensina II, y la ACE rompe el dipéptido C-terminal de la [des-Asp^{1}]angiotensina I para producir angiotensina III. La enzima también inactiva el péptido vasodilatador bradiquinina mediante la eliminación secuencial de dos dipéptidos C-terminales. Para un informe general de la enzima conversora de angiotensina, véase Corvol et al., Meth. Enzymol., 246:283 (1995); Corvol et al., J. Hypertension, 13(supl. 3):S3 (1995); Jackson y Garrison, "Renin and Angiotensin," en Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 9ª edición, Molinoff y Ruddon (eds.), pp. 733-758 (McGraw-Hill, 1996); Matsusaka e Ichikawa, Annu. Rev. Physiol., 59:395 (1997); y Zimmerman y Dunham, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 37:53 (1997).

La ACE es una ectoproteína escindible anclada a la membrana plasmática a través de un dominio transmembrana. La mayor parte de la forma unida a la membrana está expuesta de modo extracelular, y este dominio extracelular incluye al menos un sitio activo. Una forma soluble de la ACE circula por el plasma (véase, por ejemplo, Hooper y Turner, Biochem. Soc. Trans., 17:660 (1989)).

Se han identificado dos isoformas de ACE en tejidos de mamífero. La forma predominante se denomina ACE "somática", que tiene un peso molecular desde aproximadamente 150 kD a aproximadamente 180 kD, y se encuentra predominantemente en la superficie de las células endoteliales vasculares, células epiteliales y células neuroepiteliales. La otra isoforma se denomina ACE "germinal" o ACE de testículo (tACE), que tiene un peso molecular desde aproximadamente 90 kD a aproximadamente 110 kD, y se expresa en células posmeióticas y esperma. La ACE somática humana tiene dos dominios homólogos, comprendiendo cada uno un sitio catalítico y una región de unión a Zn^{2+}, mientras que la ACE de testículo humana contiene un sitio catalítico.

Cornell et al., J. Biol. Chem., 270:13613 (1995), describen la identificación de una ACE de insecto de un único dominio aparente (67 kDa) en embriones de Drosophila melanogaster, y utilizan el cDNA para la ACE somática humana como sonda heteróloga para clonar un cDNA a partir de un banco de cDNA de Drosophila.

Hubert et al., J. Biol. Chem., 266:15377 (1991), describen la estructura intrón-exón completa del gen de la ACE humana. El gen de la ACE humana contiene 26 exones, en los que el exón 1 al exón 26 se transcriben en el mRNA de la ACE somática, pero el exón 13 se elimina mediante escisión; el mRNA de la ACE germinal se transcribe desde el exón 13 al exón 26. Los exones 4-11 y 17-24 codifican los dos dominios homólogos (dominio N y dominio C) dentro de la ACE somática, y son muy similares en tamaño y estructura. Los tamaños de los intrones no se conservan. Puesto que la ACE somática y la tACE se transcriben a partir de un único gen, pueden estar implicados otros sitios de escisión u otros sitios de comienzo de la iniciación de la transcripción. Dentro del gen se encuentran dos promotores, que apoyan la iniciación a partir de sitios de inicio diferenciados bajo control diferente. El promotor de tACE se encuentra cadena arriba del extremo 5' del mRNA de la tACE, con un iniciador transcripcional.

Los inhibidores de la enzima conversora de angiotensina se utilizan para el tratamiento de la hipertensión de diversos trastornos, incluyendo la disfunción sistólica ventricular izquierda, el deterioro renal progresivo, la crisis renal por escleroderma, la insuficiencia cardíaca congestiva debida a una disfunción sistólica, y el tratamiento de la aterosclerosis (véase, por ejemplo, Brown y Vaughan, Circulation, 97:1411 (1998); Mancini, Am. J. Med., 105:40S (1998); Parmley, Am. J. Med., 105:27S (1998)). Existen al menos nueve inhibidores de ACE aprobados para utilizar en EEUU.

Los inhibidores de ACE pueden clasificarse en al menos tres grupos: (1) inhibidores que contienen sulfhidrilo relacionados, desde el punto de vista estructural, con el captopril (por ejemplo, fentiapril, pivalopril, zofenopril, alacepril), (2) inhibidores que contienen dicarboxilo relacionados, desde el punto de vista estructural, con el enalapril (por ejemplo, lisinopril, benazepril, quinapril, moexipril, ramipril, espirapril, perindopril, indolapril, pentopril, indalapril, cilazapril), y (3) inhibidores que contienen fósforo relacionados, desde el punto de vista estructural, con el fosinopril. Se buscan nuevas clases de inhibidores de la ACE que inhiban la ACE y otras metaloproteasas de cinc. Además también se buscan nuevos tipos de inhibidores de ACE que inhiban, de forma selectiva, la hidrólisis de ACE del N-acetil-seril-aspartil-lisil-prolilo (AcSDKP), un factor regulador en la hematopoyesis, sin que tengan efecto sobre el metabolismo de la angiotensina I o la bradiquinina.

Por tanto, existe una necesidad actual para la caracterización de nuevas formas de metalopeptidasas de cinc, y el uso de enzimas para identificar compuestos terapéuticamente útiles.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona una nueva metalopeptidasa, denominada "Zace1". La presente invención también proporciona polipéptidos de Zace1 y proteínas de fusión de Zace1, moléculas de ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos y proteínas, y métodos para utilizar estas moléculas de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos.

Descripción detallada de la invención 1. Descripción general

1

La Zace1 es una nueva metaloproteinasa de cinc que es un parálogo de la ACE de testículo. La ACE somática y la ACE de testículo (también denominada ACE germinal) son isoformas de la ACE que muestran actividades enzimáticas similares. La ACE somática endotelial humana tiene 1306 restos aminoácidos, incluyendo 14 restos cisteína y 17 sitios de glicosilación N-enlazados potenciales, pero ninguna región rica en Ser/Thr que indique sitios de glicosilación O-enlazados. Otras características de la ACE incluyen un péptido señal hidrófobo de 29 restos aminoácidos, y un dominio transmembrana de 17 restos aminoácidos. La ACE somática también contiene dos dominios heterólogos, denominados el "dominio N" y el "dominio C". La creencia actual es que estos dominios duplicados surgieron de la duplicación de un gen ancestral. La similitud de secuencia de aminoácidos global entre el dominio N y el dominio C de la ACE somática es aproximadamente 60%, pero es aproximadamente 89% con respecto a los 40 aminoácidos en cada dominio que incluye los restos de cada sitio activo. El número y posición relativos de los restos Cys en los dos dominios son idénticos. No existe similitud de secuencia, o existe muy poca, entre las porciones amino-terminal y carboxi-terminal de la ACE somática, y no existe similitud de secuencia, o existe muy poca, entre el tramo de restos que conectan los dominios N y C de la ACE somática. Cada uno de los dominios N y C contiene un motivo de unión al cinc His-Glu-Xaa-Xaa-His (HEXXH) que está presente en muchas metaloproteasas de cinc. Los dos restos His de este motivo dentro de la ACE somática proporcionan dos de los tres ligandos de coordinación con el cinc; el tercer ligando de coordinación con el cinc es un resto Glu cadena abajo del dominio C de la His C-terminal de HEXXH.

El cinc es esencial para la actividad catalítica de la ACE, y se predice que el ion cinc actúe directamente en la etapa catalítica de la hidrólisis del péptido mediante la polarización de la molécula de agua unida al cinc, que entonces inicia el ataque nucleófilo sobre el sustrato escindible de carbonilo. Por tanto, la ACE es un miembro de la rama de termolisina de las metaloproteasas de cinc. Los aniones monovalentes potencian la hidrólisis enzimática de algunos sustratos de la ACE, pero no de todos. Para algunos sustratos, un aumento concomitante del pH aumenta la cantidad de estimulación del anión monovalente (como cloruro).

La ACE germinal (ACE de testículo; tACE) tiene 732 restos aminoácidos, y se corresponde con el dominio C de la ACE somática. Por tanto, la tACE sólo tiene un sitio activo, un único motivo HEXXH, y un tercer ligando de coordinación con el cinc que es un resto Glu 23 restos cadena debajo del resto histidina C-terminal del motivo HEXXH. Los 67 restos aminoácidos N-terminales de la tACE son específicos de la tACE, y contienen un péptido señal que se diferencia del de la ACE somática, así como una región rica en Ser/Thr para la O-glicosilación. Los mRNA de la ACE somática y la tACE se transcriben a partir de un único gen.

La Zace1 contiene 694 restos aminoácidos, mientras que la tACE de mamífero contiene 732 restos aminoácidos. Cuando los polipéptidos Zace1 y tACE se alinean (con los huecos rellenos con restos insertados en Zace1 y tACE para proporcionar un alineamiento apropiado), la Zace1 muestra una coincidencia de la secuencia de aminoácidos de 53% con tACE. Los siete restos Cys muy conservados presentes en tACE y el dominio C de la ACE somática están presentes en Zace1 (en los restos 163, 169, 367, 385, 508, 551 y 563). Los bucles que se formarían por los pares de puentes disulfuro predichos de Zace1 (restos 163 a 169, restos 367 a 385, y restos 551 a 563) se corresponden con los tres bucles de 5, 17 y 11 restos que se encuentran en tACE. Además, Zace1 tiene dos restos Cys más, en las posiciones 51 y 204. El motivo de unión a cinc HEXXH está presente en los restos 398 a 402 de Zace1. Una signatura de la región de unión al cinc expandida de las metalopeptidasas de cinc tiene la siguiente secuencia: [GSTALIVN]-x-x-H-E-[LIVMFYW]-{DEHRKP}-H-x-[LIVMFYWGSPQ], en la que "x" es cualquier resto aminoácido, estando listados los restos aminoácidos aceptables entre paréntesis, y los restos aminoácidos inaceptables están listados entre corchetes (PROSITE nº de secuencia PS00142 de Release 15.0; Bairoch et al., Nucleic Acids Res., 25:217 (1997)). Esta signatura se encuentra dentro del polipéptido Zace1 en los restos aminoácidos 395 a 404 de la SEQ ID NO:1.

En Zace1, 23 restos separan la His C-terminal del motivo HEXXH y el motivo EX(I/V)X(D/S) conservado presente en los restos 426 a 430, en el que "(I/V)" indica que I o V puede estar presente, y "(D/S)" indica que D o S puede estar presente. Se predice que el dominio Glu en la posición 426 sea el tercer ligando de unión a cinc (o de coordinación con el cinc) dentro de Zace1. En la posición 430, la Zace1 tiene un resto serina sustituido por un resto ácido aspártico, que aparece en una posición correspondiente en ACE. El dominio transmembrana de Zace1 incluye los restos aminoácidos 663 a 684 de la SEQ ID NO:1.

Como se describió anteriormente, la presente invención proporciona polipéptidos aislados que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, al menos 80%, o al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos patrón seleccionada del grupo que consiste en: (a) los restos aminoácidos 367 a 430 de SEQ ID NO:1, (b) los restos aminoácidos 163 a 563 de la SEQ ID NO:1, (c) los restos aminoácidos 52 a 563 de la SEQ ID NO:1, (d) los restos aminoácidos 52 a 644 de la SEQ ID NO:1, (e) los restos aminoácidos 52 a 648 de la SEQ ID NO:1, (f) los restos aminoácidos 52 a 655 de la SEQ ID NO:1, (g) los restos aminoácidos 52 a 662 de la SEQ ID NO:1, (h) los restos aminoácidos 52 a 682 de la SEQ ID NO:1, (i) los restos aminoácidos 52 a 694 de la SEQ ID NO:1, y (j) los restos aminoácidos 1 a 694 de la SEQ ID NO:1, en los que el polipéptido aislado (i) se une de modo específico con un anticuerpo que se une de modo específico con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, o (ii) muestra actividad dipeptidil-carboxipeptidasa.

Los polipéptidos ilustrativos incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) los restos aminoácidos 367 a 430 de SEQ ID NO:1, (b) los restos aminoácidos 163 a 563 de la SEQ ID NO:1, (c) los restos aminoácidos 52 a 563 de la SEQ ID NO:1, (d) los restos aminoácidos 52 a 644 de la SEQ ID NO:1, (e) los restos aminoácidos 52 a 648 de la SEQ ID NO:1, (f) los restos aminoácidos 52 a 655 de la SEQ ID NO:1, (g) los restos aminoácidos 52 a 662 de la SEQ ID NO:1, (h) los restos aminoácidos 52 a 682 de la SEQ ID NO:1, (i) los restos aminoácidos 52 a 694 de la SEQ ID NO:1, y (j) los restos aminoácidos 1 a 694 de la SEQ ID NO:1. Este polipéptido puede ser una metalopeptidasa.

Otros ejemplos de polipéptidos incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que comprende el motivo "[GSTALIVN]-x-x-H-E-[LIVMFYW]-{DEHRKP}-H-x-[LIVMFYWGSPQ]", en la que "x" es cualquier resto aminoácido, estando listados los restos aminoácidos aceptables entre paréntesis, y los restos aminoácidos inaceptables están listados entre corchetes. Por ejemplo, un polipéptido ilustrativo comprende los restos aminoácidos 395 a 404 de la SEQ ID NO:1.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un polipéptido aislado, como se describe anteriormente, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende el motivo "X_{1}-X_{2}-X_{3}-H-E-X_{4}-X_{5}-H-X_{6}-X_{7}", en el que:

X_{1} se selecciona de G, S, T, A, L, I, V y N,

X_{2}, X_{3} y X_{4} son cualquier resto aminoácido,

X_{4} se selecciona de L, I, V, M, F, Y e W,

X_{5} es cualquier resto aminoácido excepto D, E, H, R, K o P, y

X_{7} se selecciona de L, I, V, M, F, Y, W, G, S, P y Q.

La presente invención proporciona también polipéptidos aislados que comprenden un dominio extracelular, en el que el dominio extracelular comprende los restos aminoácidos 52 a 662 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. Estos polipéptidos pueden comprender también un dominio transmembrana que reside en una posición carboxilo-terminal con relación al dominio extracelular, en el que el dominio transmembrana comprende los restos aminoácidos 663 a 684 de la SEQ ID NO:1. Estos polipéptidos también pueden comprender un dominio intracelular que reside en una posición carboxilo-terminal con relación al dominio transmembrana, en el que el dominio intracelular comprende los restos aminoácidos 685 a 694 de la SEQ ID NO:1. Estos polipéptidos también pueden incluir una secuencia secretora señal que reside en una posición amino-terminal con relación al dominio extracelular. La secuencia secretora señal la proporcionan los restos aminoácidos 1 a 51 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

La presente invención también incluye polipéptidos variantes de Zace1, en los que la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante comparte una coincidencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 seleccionada del grupo que consiste en una coincidencia de al menos 70%, una coincidencia de al menos 80%, una coincidencia de al menos 90%, una coincidencia de al menos 95%, o una coincidencia mayor que 95%, y en los que cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 es debida a una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Además, la presente invención contempla polipéptidos aislados, que consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) los restos aminoácidos 367 a 430 de SEQ ID NO:1, (b) los restos aminoácidos 163 a 563 de la SEQ ID NO:1, (c) los restos aminoácidos 52 a 563 de la SEQ ID NO:1, (d) los restos aminoácidos 52 a 644 de la SEQ ID NO:1, (e) los restos aminoácidos 52 a 648 de la SEQ ID NO:1, (f) los restos aminoácidos 52 a 655 de la SEQ ID NO:1, (g) los restos aminoácidos 52 a 662 de la SEQ ID NO:1, (h) los restos aminoácidos 52 a 682 de la SEQ ID NO:1, (i) los restos aminoácidos 52 a 694 de la SEQ ID NO:1, y (j) los restos aminoácidos 1 a 694 de la SEQ ID NO:1.

La presente invención también contempla los variantes alélicos y ortólogos de los polipéptidos de Zace1 descritos en la presente.

La presente invención también proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen, de forma específica, con estos polipéptidos. Los ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales murinos, anticuerpos humanizados derivados de anticuerpos monoclonales murinos, y anticuerpos monoclonales humanos. Los fragmentos de anticuerpos ilustrativos incluyen F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab, Fv, scFv, y las unidades de reconocimiento mínimas.

La presente invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) los restos aminoácidos 367 a 430 de SEQ ID NO:1, (b) los restos aminoácidos 163 a 563 de la SEQ ID NO:1, (c) los restos aminoácidos 52 a 563 de la SEQ ID NO:1, (d) los restos aminoácidos 52 a 644 de la SEQ ID NO:1, (e) los restos aminoácidos 52 a 648 de la SEQ ID NO:1, (f) los restos aminoácidos 52 a 655 de la SEQ ID NO:1, (g) los restos aminoácidos 52 a 662 de la SEQ ID NO:1, (h) los restos aminoácidos 52 a 682 de la SEQ ID NO:1, (i) los restos aminoácidos 52 a 694 de la SEQ ID NO:1, y (j) los restos aminoácidos 1 a 694 de la SEQ ID NO:1. Una molécula de ácido nucleico ilustrativa codifica los restos aminoácidos 1 694 de la SEQ ID NO:1.

La presente invención también incluye vectores y vectores de expresión que comprenden estas moléculas de ácidos nucleicos. Estos vectores de expresión pueden comprender un promotor de la transcripción y un terminador de la transcripción, en los que el promotor está unido operablemente con la molécula del ácido nucleico, y en los que la molécula del ácido nucleico está unida operablemente con el terminador de la transcripción. La presente invención también incluye células hospedantes recombinantes y virus recombinantes que comprenden estos vectores y vectores de expresión. Las células hospedantes ilustrativas incluyen células bacterianas, de levadura, fúngicas, de insecto, de mamífero y vegetales. Las células hospedantes recombinantes que comprenden estos vectores pueden utilizarse para producir polipéptidos de Zace1 mediante el cultivo de dichas células hospedantes recombinantes que comprenden el vector de expresión y que producen la proteína Zace1 y, opcionalmente, aislar la proteína de Zace1 de las células hospedantes recombinantes cultivadas.

La presente invención también incluye proteínas de fusión que comprenden un péptido o polipéptido de Zace1, y moléculas de ácidos nucleicos que codifican estas proteínas de fusión.

Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos uno de estos vectores de expresión o virus recombinantes que comprenden estos vectores de expresión. La presente invención incluye además composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable, y un polipéptido de Zace1 o anticuerpo de Zace1 descrito en la presente.

Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes después de hacer referencia a la siguiente descripción detallada.

2. Definiciones

En la descripción que sigue se utiliza una serie de términos con profusión. Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de la invención.

Tal como se utiliza en la presente, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos, como ácido desoxirribonucleico (DNA) o ácido ribonucleico (RNA), oligonucleótidos, fragmentos generados mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR), y fragmentos generados mediante uno cualquiera de acoplamiento, escisión, acción de endonucleasas, y acción de exonucleasas. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden estar compuestas de monómeros que son nucleótidos que aparecen en la naturaleza (como DNA y RNA), o análogos de los nucléotidos que aparecen en la naturaleza (por ejemplo, formas \alpha-enantiómeras de nucleótidos que aparecen en la naturaleza), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en los restos azúcar y/o en restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de los azúcares incluyen, por ejemplo, sustitución de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Además, el resto azúcar completo puede sustituirse por estructuras similares desde el punto de vista estérico y electrónico, como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos muy conocidos. Los monómeros de los ácidos nucleicos pueden enlazarse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de estos enlaces. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoanilidato, fosforoamidato y similares. La expresión "molécula de ácido nucleico" también incluye los llamados "ácidos nucleicos peptídicos", que comprenden bases de ácidos nucleicos que aparecen en la naturaleza o modificadas unidas a un esqueleto de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

La expresión "complemento de una molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria y orientación inversa, cuando se compara con una secuencia de nucleótidos de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria con 5' CCCGTGCAT 3'.

El término "contig" indica una molécula de ácido nucleico que tiene un tramo contiguo de secuencia idéntica o complementaria con otra molécula de ácido nucleico. Se dice que las secuencias contiguas "solapan" un tramo concreto de una molécula de ácido nucleico en su totalidad, o a lo largo de un tramo parcial de la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, un ejemplo de contigs de la secuencia del polinucleótido 5' ATGGAGCTT 3' son 5' AGCTTgagt 3' y 3' tcgacTACC 5'.

La expresión "secuencia de nucleótidos degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados, cuando se compara con una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo resto aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican, cada uno, Asp).

La expresión "gen estructural" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se transcribe en un RNA mensajero (mRNA), que entonces se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

La expresión "DNA genómico aislado" indica un DNA obtenido a partir del genoma de una célula que contiene exones, intrones y DNA no transcrito.

Una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el DNA genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de DNA que codifica un factor del crecimiento que se ha separado del DNA genómico de una célula es una molécula de DNA aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada de modo químico que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie concreta es más pequeña que la molécula de DNA completa de un cromosoma de esa especie.

Un "constructo de una molécula de ácido nucleico" es una molécula de ácido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se ha modificado a través de la intervención humana para que contenga segmentos de un ácido nucleico combinados y juxtapuestos en una disposición que no existe en la naturaleza.

Un "DNA lineal" indica moléculas de DNA no circulares que tiene extremos 5' y 3' libres. El DNA lineal puede prepararse a partir de moléculas de DNA circulares cerradas, como plásmidos, mediante digestión enzimática o ruptura física.

Un "DNA complementario (cDNA)" es una molécula de DNA monocatenaria que se forma a partir de un molde de mRNA mediante la enzima transcriptasa inversa. De forma típica, se emplea un cebador complementario con porciones del mRNA para el inicio de la transcripción inversa. Los expertos en la técnica también utilizan el término "cDNA" para indicar una molécula de DNA bicatenaria que consiste en esta molécula de DNA monocatenaria y su cadena de DNA complementaria. El término "cDNA" también se refiere a un clon de una molécula de cDNA sintetizado a partir de un molde de RNA.

Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. De forma típica, un promotor se localiza en la región no codificadora 5' de un gen, cerca del sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que actúan en el inicio de la transcripción a menudo se caracterizan por secuencias de nucleótidos consenso. Estos elementos promotores incluyen sitios de unión de la RNA-polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de la diferenciación (DSE; McGehee et al., Mol. Endocrinol., 7:551 (1993)), elementos de respuesta de AMP cíclico (CRE), elementos de respuesta del suero (SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol., 1:47 (1990)), elementos de respuesta de glucocorticoides (GRE), y sitios de unión para otros factores de la transcripción, como CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem., 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem., 269:25728 (1994)), SP1, proteína de unión al elemento de respuesta de cAMP (CREB; Loeken, Gene Expr., 3:253 (1993)) y factores octámeros (véase, en general, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4ª ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., 1987); y Lemaigre y Rousseau, Biochem. J., 303:1 (1994)). Si un promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de la transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. Por contraste, la velocidad de la transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. También se conocen los promotores reprimibles.

Un "promotor de núcleo" contiene secuencias de nucleótidos esenciales para la función promotora, incluyendo la caja TATA y el inicio de la transcripción. Mediante esta definición, un promotor de núcleo puede o no tener actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que pueden potenciar la actividad o conferir actividad específica de tejido.

Un "elemento regulador" es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor de núcleo. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se une con factores celulares, permitiendo la transcripción exclusiva o preferentemente en células, tejidos u orgánulos concretos. Estos tipos de elementos reguladores están asociados normalmente con genes que se expresan de una manera "específica de célula", "específica de tejido" o "específica de orgánulo".

Un "potenciador" es un tipo de elemento regulador que puede aumentar la eficacia de la transcripción, independientemente de la distancia u orientación del potenciador con relación al sitio de inicio de la transcripción.

Un "DNA heterólogo" indica una molécula de DNA, o una población de moléculas de DNA, que no existe de modo natural dentro de una célula hospedante dada. Las moléculas de DNA heterólogas de una célula hospedante concreta pueden contener DNA derivado de la especie de la célula hospedante (es decir, DNA endógeno), con la condición de que el DNA del hospedante se combine con un DNA que no es del hospedante (es decir, DNA exógeno). Por ejemplo, una molécula de DNA que contiene un segmento de DNA que no es del hospedante que codifica un polipéptido unido operablemente con un segmento de DNA del hospedante que comprende un promotor de la transcripción se considera una molécula de DNA heteróloga. A la inversa, una molécula de DNA heteróloga puede comprender un gen endógeno unido operablemente con un promotor exógeno. Como otra ilustración, una molécula de DNA que comprende un gen derivado de una célula de tipo salvaje se considera que es DNA heterólogo si esta molécula de DNA se introduce en una célula mutante que carece del gen de tipo salvaje.

Un "polipéptido" es un polímero de restos aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, tanto si se produce de forma natural como sintética. Los polipéptidos con menos de aproximadamente 10 restos aminoácidos se denominan habitualmente "péptidos".

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipéptidicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser añadidos a una proteína por la célula en la cual se produce la proteína, y variarán según el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente en términos de sus estructuras del esqueleto de aminoácidos; en general, los sustituyentes, como grupos carbohidratos, no se especifican, pero pueden no obstante estar presentes.

Un péptido o polipéptido codificado por una molécula de DNA que no es del hospedante es un péptido o polipéptido "heterólogo".

Un "elemento genético integrado" es un segmento de DNA que se ha incorporado en un cromosoma de una célula hospedante después de que ese elemento se ha introducido en la célula mediante manipulación humana. Dentro de la presente invención, los elementos genéticos integrados se derivan, de modo más habitual, de plásmidos linealizados que se introducen en las células mediante electroporación u otras técnicas. Los elementos genéticos integrados pasan de la célula hospedante original a su progenie.

Un "vector de clonación" es una molécula de ácido nucleico, como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse de modo autónomo en una célula hospedante. Los vectores de clonación, de forma típica, contienen uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácido nucleico de una manera determinable, sin pérdida de la función biológica esencial del vector, así como secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para utilizar en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores, de forma típica, incluyen genes que proporcionan resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina.

Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula hospedante. De forma típica, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. La expresión del gen se coloca, habitualmente, bajo el control de un promotor, y se dice que dicho gen está "unido operablemente" con el promotor. De forma similar, un elemento regulador y un promotor de núcleo están unidos operablemente si el elemento regulador modula la actividad del promotor del núcleo.

Un "hospedante recombinante" es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heteróloga, como un vector de clonación o un vector de expresión. En el presente contexto, un ejemplo de un hospedante recombinante es una célula que produce Zace1 a partir de un vector de expresión. Por contraste, la Zace1 puede ser producida por una célula que es una "fuente natural" de Zace1, y que carece del vector de expresión.

Los "transformantes de integración" son células hospedantes recombinantes, en las que el DNA heterólogo se ha integrado en el DNA genómico de las células.

Una "proteína de fusión" es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender al menos parte de un polipéptido de Zace1 condensado con un polipéptido que se une a una matriz de afinidad. Esta proteína de fusión proporciona un medio para aislar grandes cantidades de Zace1 utilizando cromatografía de afinidad.

El término "receptor" indica una proteína asociada a la célula que se une con una molécula bioactiva denominada "ligando". Esta interacción media en el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores pueden estar unidos a la membrana, pueden ser citosólicos o nucleares; monómeros (por ejemplo, el receptor de la hormona estimulante tiroidea, el receptor beta-adrenérgico) o multímeros (por ejemplo, el receptor PDGF, el receptor de la hormona del crecimiento, el receptor de IL-3, el receptor de GM-CSF, el receptor de G-CSF, el receptor de eritropoyetina, y el receptor de IL-6). Los receptores unidos a la membrana se caracterizan por una estructura de múltiples dominios que comprende un dominio de unión al ligando extracelular y un dominio efector intracelular que está implicado, de forma típica, en la transducción de la señal. En ciertos receptores unidos a la membrana, el dominio de unión al ligando extracelular y el dominio efector intracelular están localizados en polipéptidos separados que comprenden el receptor funcional completo.

En general, la unión del ligando al receptor produce un cambio conformacional en el receptor, que provoca una interacción entre el dominio efector y otra(s) molécula(s) en la célula, que, a su vez, conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los acontecimientos metabólicos que a menudo están ligados a interacciones receptor-ligando incluyen la transcripción de genes, la fosforilación, la desfosforilación, los aumentos en la producción de AMP cíclico, la movilización del calcio celular, la movilización de los lípidos de la membrana, la adhesión celular, la hidrólisis de lípidos de inositol y la hidrólisis de fosfolípidos.

La expresión "secuencia señal secretora" indica una secuencia de DNA que codifica un péptido (un "péptido secretor") que, como componente de un polipéptido mayor, dirige el polipéptido mayor a través de una vía secretora de la célula en la que se sintetiza. El polipéptido mayor se escinde, habitualmente, para eliminar el péptido secretor durante el tránsito a través de la vía secretora.

Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que está esencialmente exento de componentes celulares contaminantes, como carbohidratos, lípidos u otras impurezas proteicas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. De forma típica, una preparación de un polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma muy purificada, es decir, al menos aproximadamente 80% puro, al menos aproximadamente 90% puro, al menos aproximadamente 95% puro, más de 95% puro, o más de 99% puro. Una manera de demostrar que una preparación de proteínas concreta contiene un polipéptido aislado es mediante la aparición de una única banda después de una electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS)-poliacrilamida de la preparación de proteínas, y una tinción con azul brillante de Coomassie del gel. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, como dímeros o formas glicosiladas o derivatizadas de otra manera.

Las expresiones "amino-terminal" y "carboxilo-terminal" se utilizan en la presente para indicar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos términos se utilizan haciendo referencia a una secuencia o porción de un polipéptido concretas para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una secuencia concreta colocada carboxilo-terminal a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido se localiza cerca del extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no necesariamente en el extremo carboxilo terminal del polipéptido completo.

El término "expresión" indica la biosíntesis del producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural en mRNA y la traducción del mRNA en uno o más polipéptidos.

La expresión "variante de escisión" se utiliza en la presente para indicar formas alternativas de RNA transcrito a partir del gen. La variación de escisión surge de modo natural a través del uso de sitios de escisión alternativos dentro de una molécula de RNA transcrita o, de forma menos habitual, entre moléculas de RNA transcritas por separado, y puede producir varios mRNA transcritos a partir del mismo gen. Los variantes de escisión pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión "variante de escisión" también se utiliza en la presente para indicar un polipéptido codificado por un variante de escisión de un mRNA transcrito a partir de un gen.

Tal como se utiliza en la presente, el término "inmunomodulador" incluyen citoquinas, factores del crecimiento de células pluripotenciales, linfotoxinas, moléculas coestimuladoras, factores hematopoyéticos y análogos sintéticos de estas moléculas.

La expresión "pareja de complemento/anticomplemento" indica restos no idénticos que forman una pareja estable asociada de forma no covalente bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de una pareja de complemento/anticomplemento. Otros ejemplos de parejas de complemento/anticomplemento incluyen parejas de receptor/ligando, parejas de anticuerpo/antígeno (o hapteno o epitopo), parejas de polinucleótidos sentido/antisentido y similares. Cuando se desea la posterior disociación de la pareja de complemento/anticomplemento, la pareja de complemento/anticomplemento tiene una afinidad de unión preferiblemente menor que 10^{9} M^{-1}.

Un "anticuerpo antiidiotipo" es un anticuerpo que se une con el dominio de la región variable de una inmunoglobulina. En el presente contexto, un anticuerpo antiidiotipo se une con la región variable de un anticuerpo antiZace1 y, por tanto, un anticuerpo antiidiotipo imita un epitopo de Zace1.

Un "fragmento de anticuerpo" es una porción de un anticuerpo, como F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal antiZace1 se une con un epitopo de Zace1.

La expresión "fragmento de anticuerpo" también incluye un polipéptido sintético o genéticamente modificado que se une con un antígeno específico, como polipéptidos que consisten en la región variable de la cadena ligera, fragmentos "Fv" que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas de polipéptidos monocatenarias recombinantes en las que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera están conectadas por un conector peptídico ("proteínas scFv"), y unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los restos aminoácidos que imitan la región hipervariable.

Un "anticuerpo quimérico" es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y las regiones determinantes de la complementariedad derivadas de un anticuerpo de roedor, mientras que el resto de la molécula del anticuerpo deriva de un anticuerpo humano.

Los "anticuerpos humanizados" son proteínas recombinantes en las que las regiones determinantes de la complementariedad murinas de un anticuerpo monoclonal se han trasladado desde las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina murina hasta un dominio variable humano.

Tal como se utiliza en la presente, un "agente terapéutico" es una molécula o átomo que está conjugado con un resto anticuerpo para producir un conjugado que es útil para una terapia. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos o tintes, y radioisótopos.

Un "marcador detectable" es una molécula o átomo que puede conjugarse con un resto anticuerpo para producir una molécula útil para el diagnóstico. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos u otros restos marcadores.

La expresión "marcador de afinidad" se utiliza en la presente para indicar un segmento de polipéptido que puede unirse a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o detección del segundo polipéptido, o para proporcionar sitios de unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína para la cual se encuentra disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico puede utilizarse como marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad incluyen una región de polihistidina, la proteína A (Nilsson et al., EMBO J., 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol., 198:3 (1991)), la glutatión-S-transferasa (Smith y Johnson, Gene, 67:31 (1988)), el marcador de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7952 (1985)), la sustancia P, el péptido FLAG (Hopp et al., Biotechnology, 6:1204 (1988)), el péptido de unión a estreptavidina, u otro dominio de unión o epitopo antigénico. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification, 2:95 (1991). Moléculas de DNA que codifican marcadores de afinidad están disponibles en suministradores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo completo, en oposición a un fragmento de anticuerpo, que no está conjugado con un agente terapéutico. Los anticuerpos desnudos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, así como ciertos anticuerpos recombinantes, como anticuerpos quiméricos y humanizados.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "componente de anticuerpo" incluye un anticuerpo entero y un fragmento de anticuerpo.

Un "inmunoconjugado" es un conjugado de un componente de anticuerpo con un agente terapéutico o un marcador detectable.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "proteína de fusión de anticuerpo" indica una molécula recombinante que comprende un componente de anticuerpo y un componente de polipéptido de Zace1. Los ejemplos de una proteína de fusión de anticuerpo es una proteína que comprende un dominio catalítico de Zace1 y un dominio Fc o una región de unión al antígeno.

Un "polipéptido diana" o un "péptido diana" es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un epitopo, y que se expresa sobre una célula diana, como una célula tumoral, o una célula que porta un antígeno del agente infeccioso. Las células T reconocen epitopos peptídicos presentados por una molécula del complejo de histocompatibilidad principal a un polipéptido diana o péptido diana y, de forma típica, lisa la célula diana o recluta otras células inmunológicas hacia el sitio de la célula diana, destruyendo, con ello, la célula diana.

Un "péptido antigénico" es un péptido que se une a una molécula del complejo de histocompatibilidad principal para formar un complejo de MHC-péptido que es reconocido por una célula T induciendo, con ello, una respuesta de linfocitos citotóxicos tras la presentación a la célula T. Por tanto, los péptidos antigénicos son capaces de unirse a una molécula del complejo de histocompatibilidad principal apropiada e inducir una respuesta de células T citotóxicas, como la lisis celular o la liberación de citoquinas específicas contra la célula diana que se une o expresa el antígeno. El péptido antigénico puede unirse en el contexto de una molécula del complejo de histocompatibilidad principal de clase I o clase II, sobre una célula que presenta el antígeno o sobre una célula diana.

En eucariotas, la RNA-polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir mRNA. Una molécula de ácido nucleico puede diseñarse para que contenga un molde de RNA-polimerasa II, en el cual el transcripto de RNA tiene una secuencia que es complementaria con la de un mRNA específico. El transcripto de RNA se denomina un "RNA antisentido", y una molécula de ácido nucleico que codifica el RNA antisentido se denomina un "gen antisentido". Las moléculas de RNA antisentido son capaces de unirse a moléculas de mRNA, dando como resultado la inhibición de la traducción de mRNA.

Un "oligonucleótido antisentido específico de Zace1" o un "oligonucleótido antisentido Zace1" es un oligonucleótido que tiene una secuencia (a) capaz de formar un tríplex estable con una porción del gen Zace1, o (b) capaz de formar un dúplex estable con una porción de un trancripto de mRNA del gen Zace1.

Una "ribozima" es una molécula de ácido nucleico que contiene un centro catalítico. El término incluye enzimas de RNA, RNA de autoescisión, RNA de autorruptura, y moléculas de ácidos nucleicos que realizan estas funciones catalíticas. Una molécula de ácido nucleico que codifica una ribozima se denomina un "gen de ribozima".

Una "secuencia guía externa" es una molécula de ácido nucleico que dirige la ribozima endógena, RNasa P, hacia una especie concreta de mRNA intracelular, dando como resultado la ruptura del mRNA por la RNasa P. Una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia guía externa se denomina un "gen de secuencia guía externa".

La expresión "gen Zace1 variante" indica moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una modificación de la SEQ ID NO:1. Estos variantes incluyen polimorfismos que aparecen en la naturaleza de los genes Zace1, así como genes sintéticos que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

Como alternativa, los genes Zace1 variantes pueden identificarse mediante comparación de secuencia. Dos secuencias de aminoácidos tienen una "coincidencia de secuencia de aminoácidos de 100%" si los restos aminoácidos de las dos secuencias de aminoácidos son los mismos cuando se alinean para la máxima correspondencia. De forma similar, dos secuencias de nucleótidos tienen una "coincidencia de secuencia de nucleótidos de 100%" si los restos nucleótidos de las dos secuencias de nucleótidos son los mismos cuando se alinean para la máxima correspondencia. Las comparaciones de secuencias pueden realizarse utilizando programas de ordenador convencionales, como los incluidos en el paquete de ordenador bioinformático LASERGENE, producido por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Otros métodos para comparar dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos mediante la determinación del alineamiento óptimo son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc., 19987); Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", en Methods in Gene Biotechnology, pp. 123-151 (CRC Press, Inc., 1997); y Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2ª edición (Academic Press, Inc., 1998)). A continuación se describen métodos concretos para determinar la coincidencia de la secuencia.

Independientemente del método concreto utilizado para identificar un gen Zace1 variante o un polipéptido de Zace1 variante, un gen o polipéptido variante codificado por un gen variante puede caracterizarse funcionalmente por su capacidad de unirse de modo específico con un anticuerpo antiZace1, o mediante la actividad dipeptidasa (por ejemplo, dipeptidil-carboxipeptidasa) del polipéptido Zace1 variante.

La expresión "variante alélico" se utiliza en la presente para indicar una cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural a través de la mutación, y puede producir polimorfismo fenotípico dentro de poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (no se produce cambio en el polipéptido codificado), o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. La expresión "variante alélico" también se utiliza en la presente para indicar una proteína codificada por un variante alélico de un gen.

El término "ortólogo" indica un polipéptido o proteína obtenida a partir de una especie que es el homólogo funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencia entre ortólogos son el resultado de la especiación.

Los "parálogos" son proteínas diferenciadas pero relacionadas desde el punto de vista estructural fabricadas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen a través de la duplicación de genes. Por ejemplo, la \alpha-globulina, la \beta-globulina y la mioglobina son parálogos entre sí.

La presente invención incluye fragmentos funcionales de genes Zace1. Dentro del contexto de esta invención, un "fragmento funcional" de un gen Zace1 indica una molécula de ácido nucleico que codifica una porción de un polipéptido de Zace1 que tiene actividad peptidil-dipeptidasa, o se une de modo específico con un anticuerpo antiZace1.

El término "dipeptidil-peptidasa" indica una enzima que rompe dipéptidos del extremo amino terminal de un polipéptido, mientras que el término "dipeptidil-carboxipeptidasa" indica una enzima que rompe dipéptidos del extremo carboxilo terminal de un polipéptido.

Una "metalopeptidasa" es una péptido-hidrolasa que utiliza un metal en el mecanismo catalítico. De forma típica, las metalopeptidasas contienen un metal de transición fuertemente unido, como cinc o hierro. La enzima conversora de angiotensina (ACE) es un ejemplo de una metalopeptidasa de cinc. Las actividades enzimáticas de la ACE incluyen la ruptura del dipéptido carboxilo-terminal de la angiotensina I para producir la angiotensina II, la eliminación de dos dipéptidos carboxilo-terminales de la bradiquinina, la hidrólisis de la N-acetil-Ser-Gly-Lys-Pro en el enlace Gly-Lys, la ruptura de la amida tripeptídica carboxilo-terminal de la sustancia P, y la hormona liberadora de la hormona luteinizante, y un tripéptido amino-terminal de la hormona liberadora de la hormona luteinizante. En la presente se describen varios ejemplos de un sustrato de ACE artificial.

Debido a la imprecisión de los métodos analíticos convencionales, se entiende que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros son valores aproximados. Cuando dicho valor se expresa como "aproximadamente" X, se entiende que el valor indicado de X es preciso en \pm10%.

3. Producción de polinucleótidos de Zace1

Pueden obtenerse moléculas de ácidos nucleicos que codifican un gen Zace1 humano mediante la selección de un banco de cDNA o genómico humano utilizando sondas de polinucleótidos basadas en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1. Estas técnicas son convencionales y bien establecidas.

Como ilustración, una molécula de ácido nucleico que codifica un gen Zace1 humano puede aislarse a partir de un banco de cDNA. En este caso, la primera etapa sería preparar el banco de cDNA aislando RNA a partir de un tejido utilizando métodos muy conocidos por los expertos en la técnica. En general, las técnicas de aislamiento de RNA deben proporcionar un método para romper células, un medio para inhibir la degradación dirigida por RNasa del RNA, y un método para separar el RNA del DNA, las proteínas y los contaminantes polisacáridos. Por ejemplo, el RNA total puede aislarse congelando el tejido en nitrógeno líquido, triturando el tejido congelado con un mortero y una mano de mortero para lisar las células, extrayendo el tejido triturado con una disolución de fenol/cloroformo para eliminar las proteínas, y separando el RNA del resto de impurezas mediante precipitación selectiva con cloruro de litio (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3ª edición, pp. 4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons, 1995) ["Ausubel (1995)"]; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, pp. 33-41 (CRC Press, Inc., 1997) ["Wu (1997)"]). Como alternativa, el RNA total puede aislarse mediante la extracción del tejido triturado con isotiocianato de guanidio, extrayendo con disolventes orgánicos, y separando el RNA de los contaminantes utilizando centrifugación diferencial (véase, por ejemplo, Chirgwin et al., Biochemistry, 18:52 (1979); Ausubel (1995) en las páginas 4-1 a 4-6; Wu (1997) en las páginas 33-41).

Para construir un banco de cDNA debe aislarse poli(A)^{+} RNA a partir de una preparación de RNA total. El poli(A)^{+} RNA puede aislarse a partir de RNA total utilizando la técnica convencional de la cromatografía de oligo(dT)-celulosa (véase, por ejemplo, Aviv y Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:1408 (1972); Ausubel (1995) en las páginas 4-11 a 4-12).

Se sintetizan moléculas de cDNA bicatenario a partir de poli(A)^{+} RNA utilizando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Wu (1997) en las páginas 41-46). Además pueden utilizarse kits disponibles en el mercado para sintetizar moléculas de cDNA bicatenarias. Por ejemplo, estos kits se encuentran disponibles en Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI), y STRATAGENE (La Jolla, CA).

Diversos vectores de clonación resultan apropiados para la construcción de un banco de cDNA. Por ejemplo, puede prepararse un banco de cDNA en un vector derivado de un bacteriófago, como un vector \lambdagt10. Véase, por ejemplo, Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries en \lambdagt10 y \lambdagt11", en DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I, Glover (ed.), p. 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) en las páginas 47-52.

Como alternativa, pueden insertarse moléculas de cDNA bicatenario en un vector plásmido, como un vector PBLUESCRIPT (STRATAGENE; La Jolla, CA), un LAMDAGEM-4 (Promega Corp.) u otros vectores disponibles en el mercado. También pueden obtenerse vectores de clonación apropiados de la American Type Culture Collection (Manassas, VA).

Para amplificar las moléculas de cDNA clonadas, el banco de cDNA se inserta en un hospedante procariota, utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, un banco de cDNA puede introducirse en células DH5 E. coli competentes, que pueden obtenerse, por ejemplo, de Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD).

Un banco genómico humano puede prepararse por medios muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las páginas 307-327). El DNA genómico puede aislarse lisando tejido con el detergente Sarkosyl, digiriendo el lisado con proteinasa-K, eliminando los restos insolubles del lisado mediante centrifugación, precipitando el ácido nucleico del lisado utilizando isopropanol, y purificando el DNA resuspendido en un gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Los fragmentos de DNA que son adecuados para la producción de un banco genómico pueden obtenerse mediante el cizallamiento aleatorio de DNA genómico, o mediante la digestión parcial de DNA genómico con endonucleasas de restricción. Los fragmentos de DNA genómico pueden insertarse en un vector, como un bacteriófago o un vector cósmido, según técnicas convencionales, como el uso de la digestión con enzimas de restricción para proporcionar términales adecuados, el uso de un tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable de moléculas de DNA, y el acoplamiento con ligasas apropiadas. Las técnicas para esta manipulación son muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las páginas 307-327).

Como alternativa, pueden obtenerse bancos genómicos humanos a partir de fuentes comerciales, como Research Genetics (Huntsville, AL) y la American Type Culture Collection (Manassas, VA).

Un banco que contiene cDNA o clones genómicos puede seleccionarse con una o más sondas de polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos basada en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, utilizando métodos convencionales (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 6-1 a 6-11).

Los anticuerpos antiZace1, producidos como se describe a continuación, también pueden utilizarse para aislar secuencias de DNA que codifican genes Zace1 humanos a partir de bancos de cDNA. Por ejemplo, pueden utilizarse los anticuerpos para seleccionar bancos de expresión de \lambdagt11, o los anticuerpos pueden utilizarse para la inmunoselección después de la selección y traducción de híbridos (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 6-12 a 6-16; Margolis et al., "Screening \lambda expression libraries with antibody and protein probes", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª edición, Glover et al.(eds.), pp. 1-14 (Oxford University Press, 1995)).

La secuencia de un cDNA Zace1 o un fragmento genómico Zace1 puede determinarse utilizando métodos convencionales. Pueden utilizarse elementos promotores de un gen Zace1 para dirigir la expresión de genes heterólogos en animales transgénicos o pacientes tratados con terapia génica. La identificación de fragmentos genómicos que contienen un promotor o elemento regulador Zace1 puede lograrse utilizando técnicas bien establecidas, como análisis de delección (véase, en general, Ausubel (1995)).

La clonación de las secuencias flanqueantes 5' también facilita la producción de proteínas de Zace1 mediante "activación de genes", segú se describe en la patente de EEUU nº 5.641.670. Brevemente, la expresión de un gen Zace1 endógeno en una célula se altera introduciendo en el locus Zace1 un constructo de DNA que comprende al menos una secuencia diana, una secuencia reguladora, un exón, y un sitio donador de ruptura desapareado. La secuencia diana es una secuencia no codificadora 5' Zace1 que permite la recombinación homóloga del constructo con el locus Zace1 endógeno, con lo cual las secuencias dentro del constructo se unen operablemente con la secuencia codificadora Zace1 endógena. De esta manera, un promotor Zace1 endógeno puede sustituirse o suplementarse con otras secuencias reguladoras para proporcionar una expresión potenciada, específica de tejidos , o regulada de otra forma.

4. Producción de variantes del gen Zace1

La presente invención proporciona una diversidad de moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo moléculas de DNA y RNA, que codifican los polipéptidos de Zace1 descritos en la presente. Los expertos en la técnica reconocerán con facilidad que, a la vista de la degeneración del código genético, es posible una considerable variación de la secuencia entre estas moléculas de polinucleótidos. La SEQ ID NO:2 es una secuencia de nucleótidos degenerada que incluye todas las moléculas de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido Zace1 de SEQ ID NO:1. Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada de SEQ ID NO:2 también proporciona secuencias de RNA que codifican la SEQ ID NO:1, sustituyendo U por T.

La tabla 1 indica los códigos de una letra utilizados en la SEQ ID NO:2 para indicar posiciones de nucleótidos degenerados. Las "resoluciones" son los nucleótidos indicados por una letra del código. El "complemento" indica el código para el(los) nucleótido(s) complementario(s). Por ejemplo, el código Y indica C o T, y su complemento R indica A o G, siendo A complementario con T, y siendo G complementario con C.

TABLA 1

2

Los codones degenerados utilizados en la SEQ ID NO:2, que incluyen todos los codones posibles para un aminoácido concreto, se indican en la tabla 2.

TABLA 2

4

5

Cualquier experto en la técnica apreciará que se introduce algo de ambigüedad en la determinación de un codón degenerado, representativa de todos los posibles codones que codifican un aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar arginina (AGR), y el codón degenerado para la arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar serina (AGY). Una relación similar existe entre codones que codifican fenilalanina y leucina. Por tanto, algunos polinucleótidos incluidos en la secuencia degenerada pueden codificar secuencias de aminoácidos variantes, pero un experto en la técnica puede identificar con facilidad estas secuencias variantes haciendo referencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1. Las secuencias variantes pueden ensayarse con facilidad para determinar su funcionalidad, como se describe en la presente.

Diferentes especies pueden mostrar una "utilización preferente de codones". En general, véase Grantham et al., Nuc. Acids Res., 8:1893 (1980); Haas et al., Curr. Biol., 6:315 (1996); Wain-Hobson et al., Gene, 13:355 (1981); Grosjean y Fiers, Gene, 18:199 (1982); Holm, Nuc. Acids Res., 14:3075 (1986); Ikemura, J. Mol. Biol., 158:573 (1982); Sharp y Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev., 4:851 (1994); Kane, Curr. Opin. Biotechnol., 6:494 (1995); y Makrides, Microbiol. Rev., 60:512 (1996). Tal como se utiliza en la presente, la expresión "utilización preferente de codones" o "codones preferentes" es una expresión de la técnica que se refiere a codones de traducción de proteínas que se utilizan con mayor frecuencia en células de una especie concreta, favoreciendo, con ello, uno o unos pocos representantes de los posibles codones que codifican cada aminoácido (véase la tabla 2). Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede ser codificado por ACA, ACC, ACG o ACT, pero en células de mamífero el codón utilizado de modo más habitual es ACC; en otras especies, por ejemplo, células de insecto, de levadura, virus o bacterias, otros codones distintos de Thr pueden ser preferentes. Los codones preferentes para una especie concreta pueden introducirse en los polinucleótidos de la presente invención mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferentes en DNA recombinante puede, por ejemplo, potenciar la producción de la proteína haciendo que la traducción de la proteína sea más eficaz dentro de una especie o tipo celular concreto. Por tanto, la secuencia degenerada del codón indicada en la SEQ ID NO:2 actúa como molde para optimizar la expresión de los polinucleótidos en diversos tipos celulares y especies habitualmente utilizados en la técnica y descritos en la presente. Las secuencias que contienen codones preferentes pueden ensayarse y optimizarse para la expresión en diversas especies, y ensayarse para determinar su funcionalidad, según se describe en la presente.

La presente invención proporciona además moléculas de ácidos nucleicos y polipéptidos variantes que representan los homólogos de otras especies (ortólogos). Estas especies incluyen, pero no se limitan a especies de mamífero, ave, anfibio, reptil, pez, insecto y otros vertebrados e invertebrados. De interés particular son los polipéptidos de Zace1 de otras especies de mamífero, incluyendo polipéptidos de ratón, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos y de otros primates. Los ortólogos de la Zace1 humana pueden clonarse utilizando información y composiciones proporcionadas por la presente invención en combinación con técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un cDNA Zace1 puede clonarse utilizando mRNA obtenido a partir de un tejido o tipo celular que expresa el polipéptido de Zace1 descrito en la presente. Entonces se prepara un banco a partir de mRNA de un tejido o línea celular positivo.

Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en la SEQ ID NO: representa un único alelo de la Zace1 humana, y que se espera que se produzca una variación alélica y una escisión alternativa. Los variantes alélicos de esta secuencia pueden clonarse sondando cDNA o bancos genómicos de diferentes individuos según procedimientos convencionales. Los variantes alélicos de la secuencia de nucleótidos que aparece en la SEQ ID NO:1, incluyendo los que contienen mutaciones silenciosas y aquellos en los que las mutaciones producen cambios en la secuencia de aminoácidos, se encuentran dentro del alcance de la presente invención, así como las proteínas que son variantes alélicos de la SEQ ID NO:1. Las moléculas de cDNA generadas a partir de mRNA escindidos de modo alternativo, que mantienen las propiedades del polipéptido de Zace1, se incluyen dentro del alcance de la presente invención, así como los polipéptidos codificados por dichos cDNA y mRNA. Los variantes alélicos y variantes de escisión de estas secuencias pueden clonarse sondando cDNA o bancos genómicos de diferentes individuos o tejidos según procedimientos convencionales conocidos en la técnica.

Los polinucleótidos aislados que codifican el polipéptido de Zace1 de la SEQ ID NO:1 se hibridan con regiones con un tamaño similar de un polinucleótido relacionado (homólogo), o una secuencia complementaria con éstas, bajo condiciones rigurosas. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC menos que el punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. El T_{m} es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) en la cual 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente apareada. Unas condiciones rigurosas típicas son aquellas en las que la concentración salina es hasta aproximadamente 0,03 M y pH 7, y la temperatura es al menos aproximadamente 60ºC.

Un par de moléculas de ácidos nucleicos, como DNA-DNA, RNA-RNA y DNA-RNA, pueden hibridarse si las secuencias de nucleótidos tienen algún grado de complementariedad. Los híbridos pueden tolerar pares de bases desapareadas en la doble hélice, pero la estabilidad del híbrido está influida por el grado de desapareamiento. El T_{m} del híbrido desapareado disminuye en 1ºC por cada 1-1,5% de desapareamiento de pares de bases. Variando la rigurosidad de las condiciones de hibridación se puede controlar el grado de desapareamiento que estará presente en el híbrido. El grado de rigurosidad aumenta a medida que aumenta la temperatura de hibridación y disminuye la fuerza iónica del tampón de hibridación. Unas condiciones de hibridación rigurosas incluyen temperaturas de aproximadamente 5-25ºC menos que el T_{m} del híbrido, y un tampón de hibridación que tiene hasta 1 M Na^{+}. Pueden lograrse unos grados mayores de rigurosidad a menores temperaturas con la adición de formamida, que reduce la T_{m} del híbrido aproximadamente 1ºC por cada 1% de formamida en la disolución tampón. En general, estas condiciones rigurosas incluyen temperaturas de 20-70ºC, y un tampón de hibridación que contiene hasta 6x SSC y formamida al 0-50%. Puede lograrse un grado mayor de rigurosidad a temperaturas de 40-70ºC, con un tampón de hibridación que tiene hasta 4x SSC y formamida al 0-50%. Unas condiciones muy rigurosas incluyen, de forma típica, unas temperaturas de 42-70ºC, con un tampón de hibridación que tiene hasta 1x SSC y formamida al 0-50%. Pueden utilizarse diferentes grados de rigurosidad durante la hibridación y el lavado para lograr una máxima unión específica a la secuencia diana. De forma típica, los lavados después de la hibridación se realizan a grados mayores de rigurosidad para eliminar las sondas de polinucleótidos no hibridadas de los complejos hibridados.

Se pretende que las anteriores condiciones sean una guía, y se encuentra dentro de las capacidades de un experto en la técnica adaptar estas condiciones para utilizarlas con un híbrido de polipéptido concreto. El T_{m} para una secuencia diana específica es la temperatura (bajo condiciones definidas) en la cual 50% de la secuencia diana se hibrida con una secuencia sonda perfectamente apareada. Estas condiciones que influyen en el T_{m} incluyen el tamaño y contenido en pares de bases de la sonda de polinucleótidos, la fuerza iónica de la disolución de hibridación, y la presencia de agentes desestabilizantes en la disolución de hibridación. En la técnica se conocen numerosas ecuaciones para calcular el T_{m}, y son específicas para DNA, RNA e híbridos de DNA-RNA y secuencias sonda de polinucleótidos de longitud variable (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (Cold Spring Harbor Press, 1989); Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., 1987); Berger y Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 26:227 (1990)). Programas de análisis de secuencias, como OLIGO 6.0 (LSR, Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA), así como sitios en Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia concreta y calcular el T_{m} basándose en criterios definidos. Estos programas también pueden analizar una secuencia dada bajo condiciones definidas e identificar secuencias sonda adecuadas. De forma típica, la hibridación de secuencias de polinucleótidos más largas, >50 pares de bases, se realiza a temperaturas de aproximadamente 20-25ºC por debajo del T_{m} calculado. Para sondas menores, <50 pares de bases, la hibridación se realiza, de forma típica, en el T_{m} o 5-10ºC menos. Esto permite la velocidad máxima de hibridación para los híbridos de DNA-DNA y DNA-RNA.

La longitud de la secuencia de polinucleótidos influye en la velocidad y estabilidad de la formación de híbridos. Secuencias sonda más pequeñas, <50 pares de bases, alcanzan el equilibrio con secuencias complementarias con rapidez, pero pueden formar híbridos menos estables. Pueden utilizarse unos tiempos de incubación desde minutos a horas para lograr la formación de híbridos. Las secuencias sonda más largas alcanzan el equilibrio de una manera más lenta, pero forman complejos más estables incluso a temperaturas menores. Se deja que las incubaciones se realicen durante la noche o más. En general, las incubaciones se realizan durante un periodo igual a tres veces el tiempo Cot calculado. El tiempo Cot, el tiempo que tardan las secuencias de polinucleótidos en reasociarse, puede calcularse para una secuencia concreta mediante métodos conocidos en la técnica.

Las composición de pares de bases de la secuencia de polinucléotidos afecta a la estabilidad térmica del complejo híbrido, influyendo, con ello, en la elección de la temperatura de hibridación y la fuerza iónica del tampón de hibridación. Las parejas A-T son menos estables que las parejas G-C en disoluciones acuosas que contienen cloruro de sodio. Por tanto, cuanto mayor sea el contenido en G-C, más estable será el híbrido. Una distribución uniforme de restos G y C dentro de la secuencia también contribuye de modo positivo a la estabilidad del híbrido. Además, la composición en pares de bases puede manipularse para alterar el T_{m} de una secuencia dada. Por ejemplo, la 5-metildesoxicitidina puede sustituirse por desoxicitidina, y la 5-bromodeoxiuridina puede sustituirse por timidina para aumentar la T_{m}, mintras que la 7-desaza-2'-desoxiguanosina puede sustituirse por guanosina para reducir la dependencia en el T_{m}.

La concentración iónica del tampón de hibridación también afecta a la estabilidad del híbrido. Los tampones de hibridación contienen, en general, agentes bloqueantes como disolución de Denhardt (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), DNA de esperma de salmón desnaturalizado, tRNA, leche en polvo (BLOTTO), heparina o SDS, y una fuente de Na^{+}, como SSC (1x SSC: cloruro de sodio 0,15 M, citrato de sodio 15 mM) o SSPE (1x SSPE: NaCl 1,8 M, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,7). De forma típica, los tampones de hibridación contienen Na^{+} entre 10 mM-1 M. La adición de agentes desestabilizantes o desnaturalizantes como formamida, sales de tetraalquilamino, cationes de guanidio o cationes de tiocianato a la disolución de hibridación altera el T_{m} de un híbrido. De forma típica se utiliza la formamida a una concentración de hasta 50% para permitir que las incubaciones se realicen a unas temperaturas menores, más convenientes. La formamida también actúa para reducir el efecto de fondo no específico cuando se utilizan sondas de RNA.

Como ilustración, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de Zace1 variante puede hibridarse con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 a 42ºC durante la noche en una disolución que comprende formamida al 50%, 5x SSC, fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt (100x disolución de Denhardt: Ficoll 400 al 2% (p/v), polivinilpirrolidona al 2% (p/v), y albúmina de suero bovina al 2% (p/v)), sulfato de dextrano al 10%, y DNA de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado 20 \mug/ml. Un experto en la técnica puede imaginar variaciones de estas condiciones de hibridación. Por ejemplo, la mezcla de hibridación puede incubarse a una temperatura mayor, como aproximadamente 65ºC, en una disolución que no contiene formamida. Además, se encuentran disponibles disoluciones de hibridación premezcladas (por ejemplo, la disolución de hibridación EXPRESSHYB de CLONTECH Laboratories, Inc.), y la hibridación puede realizarse según las instrucciones del fabricante.

Después de la hibridación, las moléculas de ácidos nucleicos pueden lavarse para eliminar las moléculas de ácidos nucleicos no hibridadas bajo condiciones rigurosas, o bajo condiciones muy rigurosas. Unas condiciones de lavado rigurosas típicas incluyen un lavado en una disolución de 0,5x-2x SSC con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% a 55-65ºC. Esto es, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de Zace1 variante se hibridan con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 bajo condiciones de lavado rigurosas, en las que la rigurosidad del lavado es equivalente a 0,5x-2x SSC con SDS al 0,1% a 55-65ºC, incluyendo 0,5x SSC con SDS al 0,1% a 55ºC, o 2x SSC con SDS al 0,1% a 65ºC. Un experto en la técnica puede imaginar con facilidad condiciones equivalentes, por ejemplo, sustituyendo el SSC por SSPE en la disolución de lavado.

Unas condiciones de lavado muy rigurosas típicas incluyen un lavado en una disolución de 0,1x-0,2x SSC con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% a 50-65ºC. En otras palabras, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de Zace1 variante se hibridan con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 bajo condiciones de lavado muy rigurosas, en las que la rigurosidad del lavado es equivalente a 0,1x-0,2x SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC, incluyendo 0,1x SSC con SDS al 0,1% a 50ºC, o 0,2x SSC con SDS al 0,1% a 65ºC.

La presente invención también proporciona polipéptidos de Zace1 aislados que tienen una coincidencia de secuencia sustancialmente similar a los polipéptidos de la SEQ ID NO:1, o sus ortólogos. La expresión "coincidencia de secuencia sustancialmente similar" se utiliza en la presente para indicar polipéptidos que tienen al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% de coincidencia de secuencia con las secuencias que aparecen en la SEQ ID NO:1, o sus ortólogos.

El porcentaje de coincidencia de secuencia se determina mediante métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio., 48:603 (1986); y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1992). Brevemente, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar las puntuaciones de alineamiento utilizando una penalización de abertura de hueco de 10, una penalización de extensión de hueco de 1, y la matriz de puntuación "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (ibid.), como se muestra en la tabla 3 (los aminoácidos se indican mediante los códigos de una letra convencionales). Entonces se calcula el porcentaje de coincidencia como: ([número total de apareamientos idénticos]/[longitud de la secuencia más larga más el número de huecos introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias])(100).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Los expertos en la técnica apreciarán que existen muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineamiento de proteínas adecuado para estudiar el nivel de coincidencia compartido por una secuencia de aminoácidos descrita en la presente y la secuencia de aminoácidos de un variante de Zace1 putativo. El algoritmo FASTA es descrito por Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988), y por Pearson, Meth. Enzymol., 183:63 (1990). Brevemente, el FASTA primero caracteriza la similitud de la secuencia identificando regiones compartidas por la secuencia problema (por ejemplo, la SEQ ID NO:1) y una secuencia de ensayo que tienen la mayor densidad de coincidencia (si la variable ktup es 1) o parejas de coincidencias (si ktup=2), sin considerar las sustituciones, inserciones o deleciones conservativas de aminoácidos. Las diez regiones con mayor densidad de coincidencias entonces se vuelven a puntuar comparando la similitud de todos los aminoácidos apareados utilzando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones se "recortan" para incluir sólo los restos que contribuyen a la mayor puntuación. Si existen varias regiones con puntuaciones mayores que el valor de "corte" (calculado mediante una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor ktup), y después las regiones iniciales recortadas se estudian para determinar si las regiones pueden unirse para formar un alineamiento aproximado con huecos. Por último, las regiones de mayor puntuación de las dos secuencias de aminoácidos se alinean utilizando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math., 26:787 (1974)), que permite inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros ilustrativos para el análisis FASTA son: ktup=1, penalización de abertura de hueco=10, penalización de extensión de hueco=1, y matriz de sustitución=BLOSUM62. Estos parámetros pueden introducirse en un programa FASTA modificando el archivo de la matriz de puntuación ("SMATRIX"), como se explica en el apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol., 183:63 (1990).

El FASTA también puede utilizarse para determinar la coincidencia de secuencia de moléculas de ácidos nucleicos utilizando una proporción como se describió anteriormente. Para comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede variar entre uno y seis, preferiblemente entre cuatro y seis.

La presente invención incluye polipéptidos que tienen uno o más cambios conservativos de aminoácidos, comparados con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1. Esto es, pueden obtenerse variantes que contienen una o más sustituciones de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, en la cual un alquilaminoácido se sustituye por un alquilaminoácido en una secuencia de aminoácidos de Zace1, un aminoácido aromático se sustituye por un aminoácido aromático en una secuencia de aminoácidos de Zace1, un aminoácido que contiene azufre se sustituye por un aminoácido que contiene azufre en una secuencia de aminoácidos de Zace1, un aminoácido que contiene hidroxi se sustituye por un aminoácido que contiene hidroxi en una secuencia de aminoácidos de Zace1, un aminoácido ácido se sustituye por un aminoácido ácido en una secuencia de aminoácidos de Zace1, un aminoácido básico se sustituye por un aminoácido básico en una secuencia de aminoácidos de Zace1, o un aminoácido monocarboxílico dibásico se sustituye por un aminoácidos monocarboxílico dibásico en una secuencia de aminoácidos de Zace1. Entre los aminoácidos habituales, por ejemplo, una "sustitución conservativa de un aminoácido" se ilustra mediante una sustitución entre los aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina.

La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2.000 alineamentos locales múltiples de segmentos de secuencias de proteínas, que representan regiones muy conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1992)). Por consiguiente, las frecuencias de sustitución de BLOSUM62 pueden utilizarse para definir sustituciones de aminoácidos conservativas que pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar sustituciones de aminoácidos basadas únicamente en las propiedades químicas (como se analizó anteriormente), el lenguaje de "sustitución conservativa de aminoácidos" se refiere preferiblemente a una sustitución representada por un valor BLOSUM62 mayor que -1. Por ejemplo, una sustitución de un aminoácidos es conservativa si la sustitución se caracteriza por un valor BLOSUM62 de 0, 1, 2 ó 3. Según este sistema, las sustituciones conservativas de aminoácidos preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 ó 3), mientras que las sustituciones conservativas de aminoácidos más preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 ó 3).

Los variantes particulares de Zace1 se caracterizan porque tienen al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% de coincidencia de secuencia con la secuencia de aminoácidos correspondiente (es decir, la SEQ ID NO:1), mientras que la variación en la secuencia de aminoácidos es debida a una o más sustituciones conservativas de aminoácidos.

Los cambios conservativos de aminoácidos en un gen Zace1 pueden introducirse, por ejemplo, mediante sustitución de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1. Estos variantes de "aminoácidos conservativos" pueden obtenerse, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis de barrido de conectores, mutagénesis utilizando la reacción en cadena de polimerasa y similares (véase Ausubel (1995) en las páginas 8-10 a 8-22; y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press, 1991)). Un variante del polipéptido de Zace1 puede identificarse por su capacidad para unirse de modo específico a anticuerpos antiZace1.

Las proteínas de la presente invención también pueden comprender restos aminoácidos que no aparecen en la naturaleza. Los aminoácidos que no aparecen en la naturaleza incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietil-homocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. Se conocen varios métodos en la técnica para incorporar restos aminoácidos que no aparecen en la naturaleza a las proteínas. Por ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en el que las mutaciones sin sentido se suprimen utilizando tRNA supresores químicamente aminoacilados. Los métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar el tRNA son conocidos en la técnica. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se realiza, de forma típica, en un sistema exento de células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas disponibles en el mercado y otros reactivos. Las proteínas se purifican mediante cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc., 113:2722 (1991); Ellman et al., Methods Enzymol., 202:301 (1991); Chung et al., Science, 259:806 (1993); y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10145 (1993).

En un segundo método, la traducción se realiza en oocitos de Xenopus mediante microinyección de mRNA mutado y tRNA supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem., 271:19991 (1996)). En un tercer método, células de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que se va a sustituir (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del(los) aminoácidos(s) que no aparece(n) en la naturaleza deseado(s) (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido que no aparece en la naturaleza se incorpora en la proteína en lugar de su homólogo natural. Véase Koide et al., Biochem., 33:7470 (1994). Los restos aminoácidos que aparecen en la naturaleza pueden convertirse en especies que no aparecen en la naturaleza mediante modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con una mutagénesis específica dirigida a sitio para expandir aún más la gama de sustitución (Wynn y Richards, Protein Sci., 2:395 (1993)).

Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no son codificados por el código genético, aminoácidos que no aparecen en la naturaleza, y aminoácidos no naturales puede ser sustituido por los restos aminoácidos de Zace1.

Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden identificarse según procedimientos conocidos en la técnica, como mutagénesis específica dirigida a sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, Science, 244:1081 (1989); Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4498 (1991); Coombs y Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", en Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), pp. 259-311 (Academic Press, Inc., 1998)). En la última técnica, se introducen mutaciones de alanina individuales en cada resto de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se ensayan para determinar su actividad biológica para identificar restos aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también Hilton et al., J. Biol. Chem., 271:4699 (1996).

Tal como se analizó anteriormente, el análisis de la secuencia de aminoácidos indica que los siguientes aminoácidos desempeñan un papel en la actividad enzimática de Zace1: His^{398}, His^{402} y Glu^{426}. Aunque el análisis de la secuencia puede utilizarse para definir aún más el sitio activo de Zace1, los dominios que desempeñan un papel en la actividad de Zace1 también pueden determinarse mediante análisis físico de la estructura, según se determina mediante técnicas como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía, la difracción de electrones o el marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science, 255:306 (1992); Smith et al., J. Mol. Biol., 224:899 (1992); y Wlodaver et al., FEBS Lett., 309:59 (1992).

Pueden realizarse y ensayarse sustituciones múltiples de aminoácidos utilizando métodos conocidos de mutagénesis y barrido, como los descritos en Reidhaar-Olson y Sauer (Science, 241:53 (1988)), o Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2152 (1989)). Brevemente, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando el polipéptido funcional, y después secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permitibles en cada posición. Otros métodos que pueden utilizarse incluyen la presentación de fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem., 30:10832 (1991); Ladner et al., patente de EEUU nº 5.223.409; Huse, publicación internacional nº WO 92/06204, y la mutagénesis específica dirigida a región (Derbyshire et al., Gene, 46:145 (1986); y Ner et al., DNA, 7:127 (1988)).

Los variantes de las secuencias de polipéptidos y nucleótidos de Zace1 descritos también pueden generarse mediante barajadura de DNA, según se describe en Stemmer, Nature, 370:389 (1994); Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747 (1994); y la publicación internacional nº WO 97/20078. Brevemente, se generan moléculas de DNA variantes mediante recombinación homóloga in vitro mediante fragmentación aleatoria de un DNA de origen, seguido de un reensamblaje utilizando PCR, dando como resultado mutaciones puntuales introducidas aleatoriamente. Esta técnica puede modificarse utilizando una familia de moléculas de DNA de origen, como variantes alélicos o moléculas de DNA de diferentes especies, para introducir más variabilidad en el proceso. La selección de la actividad deseada, seguida de otras iteraciones de la mutagénesis y el ensayo, proporciona una rápida "evolución" de las secuencias seleccionando las mutaciones deseables mientras que se selecciona, de modo simultáneo, contra cambios perjudiciales.

Los métodos de mutagénesis, según se describen en la presente, pueden combinarse con métodos de selección automáticos de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados clonados en células hospedantes. Las moléculas de DNA mutagenizado que pueden codificar polipéptidos biológicamente activos, o polipéptidos que se unen con anticuerpos antiZace1, pueden recuperarse de las células hospedantes y secuenciarse con rapidez utilizando un equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de restos aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.

La presente invención también incluye "fragmentos funcionales" de polipéptidos de Zace1 y de moléculas de ácidos nucleicoa que codifican estos fragmentos funcionales. El análisis funcional de la secuencia de aminoácidos descrita en la presente puede realizarse utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, estudios sobre el truncamiento de cada uno o ambos terminales de los interferones han sido resumidos por Horisberger y Di Marco, Pharmac. Ther., 66:507 (1995). Además se describen técnicas convencionales para el análisis funcional de proteínas en, por ejemplo, Treuter et al., Molec. Gen. Genet., 240:113 (1993); Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", en Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pp. 65-72 (Nijhoff, 1987); Herschman, "The EGF Receptor", en Control of Animal Cell Proliferation, vol. 1, Boynton et al. (eds.), pp. 169-199 (Academic Press, 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem., 270:29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem., 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol., 50:1295 (1995); y Meisel et al., Plant Molec. Biol., 30:1 (1996).

Los fragmentos funcionales ilustrativos incluyen polipéptidos, que comprenden los restos aminoácidos 367 a 430 de SEQ ID NO:1, los restos aminoácidos 163 a 563 de SEQ ID NO:1, los restos aminoácidos 52 a 563 de SEQ ID NO:1, los restos aminoácidos 52 a 664 de SEQ ID NO:1, los restos aminoácidos 52 a 648 de SEQ ID NO:1, los restos aminoácidos 52 a 655 de SEQ ID NO:1, los restos aminoácidos 52 a 662 de SEQ ID NO:1, los restos aminoácidos 52 a 682 de SEQ ID NO:1, o los restos aminoácidos 52 a 694 de SEQ ID NO:1, y similares. Los fragmentos funcionales concretos de un polipéptido de Zace1 son formas solubles de Zace1 que carecen de dominio transmembrana. Las formas solubles de Zace1 ilustrativas incluyen polipéptidos que consisten en los restos aminoácidos 1 a 662 de SEQ ID NO:1, los restos aminoácidos 52 a 662 de SEQ ID NO:1, y similares.

La presente invención también contempla fragmentos funcionales de un gen Zace1 que tiene cambios en los aminoácidos, comparados con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. Un variante del gen Zace1 puede identificarse basándose en la estructura mediante la determinación del nivel de coincidencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, como se analizó anteriormente.

La presente invención también proporciona péptidos o fragmentos de polipéptidos que comprenden una porción que porta un epitopo de un polipéptido de Zace1 como se describe en la presente. Estos péptidos o fragmentos pueden comprender un "epitopo inmunogénico", que es una parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpos cuando se usa la proteína completa como inmunógeno. Los péptidos que portan epitopos inmunogénicos pueden identificarse utilizando métodos convencionales (véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998 (1983)).

Por contraste, los péptidos o fragmentos de polipéptidos pueden comprender un "epitopo antigénico", que es una región de una molécula de proteína a la cual puede unirse un anticuerpo de modo específico. Ciertos epitopos consisten en un tramo lineal o contiguo de aminoácidos, y la antigenicidad de dicho epitopo no está trastornada por agentes desnaturalizantes. En la técnica se sabe que péptidos sintéticos relativamente cortos que pueden imitar epitopos de una proteína pueden utilizarse para estimular la producción de anticuerpos contra la proteína (véase, por ejemplo, Sutcliffe et al, Science, 219:660 (1983)). Por consiguiente, los polipéptidos y péptidos que portan epitopos antigénicos de la presente invención son útiles para producir anticuerpos que se unen con los polipéptidos descritos en la presente.

Los polipéptidos y péptidos que portan epitopos antigénicos contienen preferiblemente al menos cuatro a diez aminoácidos, al menos diez a quince aminoácidos, o aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos de la SEQ ID NO:1. Estos polipéptidos y péptidos que portan epitopos pueden producirse fragmentando un polipéptido de Zace1, o mediante síntesis peptídica química, como se describe en la presente. Además, los epitopos pueden seleccionarse mediante presentación de fagos de bancos peptídicos aleatorios (véase, por ejemplo, Lane y Stephen, Curr. Opin. Immunol., 5:268 (1993); y Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol., 7:616 (1996)). Los métodos convencionales para identificar epitopos y producir anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epitopo se describen, por ejemplo, en Mole, "Epitope Mapping", en Methods in Molecular Biology, vol. 10, Manson (ed.), pp. 105-116 (The Humana Press, Inc., 1992); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), pp. 60-84 (Cambridge University Press, 1995); y Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, pp. 9.3.1-9.3.5 y pp. 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons, 1997).

Para cualquier polipéptido de Zace1, incluyendo los variantes y proteínas de fusión, un experto en la técnica puede generar, con facilidad, una secuencia de polinucleótido totalmente degenerada que codifica ese variante utilizando la información que aparece en las tablas 1 y 2 anteriores. Además, los expertos en la técnica pueden utilizar programas informáticos convencionales para diseñar variantes de Zace1 basándose en las secuencias de aminoácidos y nucleótidos descritas en la presente. Por consiguiente, la presente invención incluye un medio de lectura por ordenador codificado con una estructura de datos que proporciona al menos una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2. Las formas adecuadas de medios de lectura por ordenador incluyen medios magnéticos y medios de lectura óptica. Los ejemplos de medios magnéticos incluyen una unidad de disco duro o fijo, un chip de memoria de acceso aleatorio (RAM), un disquete, una cinta lineal digital (DLT), un disco de memoria asociada, y un disco ZIP. Los ejemplos de medios de lectura óptica son discos compactos (por ejemplo, un CD de memoria de sólo lectura (ROM), un CD de reescritura (RW), y un CD de regrabación), y discos de video/versátiles digitales (DVD) (por ejemplo, DVD-ROM, DVD-RAM y DVD+RW).

5. Producción de polipéptidos de Zace1

Los polipéptidos de la presente invención, incluyendo los polipéptidos de longitud completa, los fragmentos funcionales y las proteínas de fusión, pueden producirse en células hospedantes recombinantes siguiendo técnicas convencionales. Para expresar un gen Zace1, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido debe unirse operablemente a secuencias reguladoras que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión y, después, introducirse en una célula hospedante. Además de las secuencias reguladoras transcripcionales, como promotores y potenciadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras traduccionales y un gen marcador que es adecuado para la selección de células que portan el vector de expresión.

Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína extraña en células eucariotas contienen, de forma típica, (1) elementos de DNA procariota que codifican un origen de la replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos para proporcionar el crecimiento y la selección del vector de expresión en un hospedante bacteriano; (2) elementos de DNA eucariota que controlan el inicio de la transcripción, como un promotor; y (3) elementos de DNA que controlan el procesamiento de los transcriptos, como una secuencia de poliadenilación/terminación de la transcripción. Como se analizó anteriormente, los vectores de expresión también pueden incluir secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia secretora que dirige el polipéptido heterólogo hacia la vía secretora de una célula hospedante. Por ejemplo, un vector de expresión Zace1 puede comprender un gen Zace1 y una secuencia secretora derivada de cualquier gen secretado.

Las proteínas de Zace1 de la presente invención pueden expresarse en células de mamífero. Los ejemplos de células hospedantes de mamífero adecuadas incluyen células renales de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células renales embriónicas humanas (293-HEK; ATCC CRL 1573), células renales de cachorro de hámster (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células renales caninas (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL 61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet., 12:555, 1986)), células pituitarias de rata (GH1; ATCC CCL 82), células HeLa S3 (ATCC CCL 2.2.), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células renales de mono transformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650), y células embrionarias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).

Para un hospedante mamífero, las señales reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden derivarse de fuentes víricas, como adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de simio o similares, en los que las señales reguladoras están asociadas con un gen concreto que tiene un alto nivel de expresión. Las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales adecuadas también pueden obtenerse a partir de genes de mamífero, como genes de actina, colágeno, miosina y metalotioneína.

Las secuencias reguladoras transcripcionales incluyen una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis de RNA. Los promotores eucariotas adecuados incluyen el promotor del gen metalotioneína I de ratón (Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet., 1:273 (1982)), el promotor TK del virus Herpes (McKnight, Cell, 31:355 (1982)), el promotor temprano SV40 (Benoist et al., Nature, 290:304 (1981)), el promotor del virus del sarcoma Rous (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777 (1982)), el promotor del citomegalovirus (Foecking et al., Gene, 45:101 (1980)), y el promotor del virus del tumor mamario de ratón (véase, en general, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pp. 163-181 (John Wiley & Sons, Inc., 1996)).

Como alternativa, puede utilizarse un promotor procariota, como el promotor de la RNA-polimerasa del bacteriófago T3, para controlar la expresión del gen Zace1 en células de mamífero, si el promotor procariota está regulado por un promotor eucariota (Zhou et al., Mol. Cell. Biol., 10:4529 (1990); y Kaufman et al., Nucl. Acids. Res. 19:4485 (1991)).

Un vector de expresión puede introducirse en células hospedantes utilizando una diversidad de técnicas convencionales incluyendo la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por liposomas, el transporte mediado por microproyectiles, la electroporación y similares. Preferiblemente, las células transfectadas se seleccionan y propagan para proporcionar células hospedantes recombinantes que comprenden el vector de expresión integrado de modo estable en el genoma de la célula hospedante. Las técnicas para introducir vectores en células eucariotas y las técnicas para seleccionar estos transformantes estables utilizando un marcador seleccionable dominante se describen, por ejemplo, en Ausubel (1995), y en Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press,
1991).

Por ejemplo, un marcador seleccionable adecuado es un gen que proporciona resistencia al antibiótico neomicina. En este caso, la selección se realiza en presencia de un fármaco de tipo neomicina, como G-418 o similares. Los sistemas de selección también pueden emplearse para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado "amplificación". La amplificación se realiza cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente de selección, y después aumentando la cantidad de agente de selección para seleccionar las células que producen niveles altos de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable preferido es la dihidrofolato-reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicin-acetiltransferasa) también pueden utilizarse. Como alternativa, los marcadores que introducen un fenotipo alterado, como la proteína fluorescente verde, o proteínas de la superficie celular, como CD4, CD8, MHC de clase I, fosfatasa alcalina placentaria, pueden utilizarse para separar las células transfectadas de las células no transfectadas por medios como la tecnología de separación FACS o de separación de esferas magnéticas.

Los polipéptidos de Zace1 también pueden producirse cultivando células de mamífero utilizando un sistema de transporte vírico. Los ejemplos de virus para este fin incluyen adenovirus, herpesvirus, virus de vaccinia y virus adenoasociados (AAV). El adenovirus, un virus de DNA bicatenario, actualmente es el vector de transferencia de genes mejor estudiado para el transporte de ácidos nucleicos heterólogos (para un informe, véase Becker et al., Meth. Cell Biol., 43:161 (1994); y Douglas y Curiel, Science & Medicine, 4:44 (1997)). Las ventajas del sistema de adenovirus incluyen el alojamiento de insertos de DNA relativamente grandes, la capacidad de crecer hasta una alta valoración, la capacidad de infectar una amplia gama de tipos celulares de mamífero, y una flexibilidad que permite el uso con un gran número de vectores disponibles que contienen diferentes promotores.

Mediante la deleción de porciones del genoma del adenovirus, pueden alojarse insertos grandes (de hasta 7 kb) del DNA heterólogo. Estos insertos pueden incorporarse al DNA vírico mediante acoplamiento directo o mediante recombinación homóloga con un plásmido cotransfectado. Una opción es delecionar el gen E1 esencial del vector vírico, que da como resultado la incapacidad de replicarse, a menos que el gen E1 sea proporcionado por la célula hospedante. Las células 293 humanas infectadas con el vector de adenovirus (ATCC nº CRL-1573, 45504, 45505), por ejemplo, pueden cultivarse como células adherentes o en cultivos en suspensión a una densidad celular relativamente alta, para producir cantidades significativas de proteínas (véase Garnier et al., Cytotechnol., 15:145 (1994)).

La Zace1 también puede expresarse en otras células eucariotas superiores, como células de ave, fúngicas, de insecto, de levadura o vegetales. El sistema de baculovirus proporciona un medio eficaz para introducir genes Zace1 clonados en células de insecto. Los vectores de expresión adecuados se basan en el virus de la polihedrosis nuclear múltiple Autographa californica (AcMNPV), y contienen promotores muy conocidos como el promotor 70 de la proteína de choque térmico de Drosophila (hsp), el promotor del gen inmediato temprano del virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (ie-1), y el promotor 39K temprano retrasado, el promotor p10 de baculovirus, y el promotor de metalotioneína de Drosophila. Un segúndo método para fabricar baculovirus recombinantes utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow (Luckow et al., J. Virol., 67:4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se vende en el kit BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, PFASTBAC (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el DNA que codifica el polipéptido de Zace1 hacia el genoma de un baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande denominado "bácmido". Véase Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol., 71:971 (1990); Bonning et al., J. Gen. Virol., 75:1551 (1994); y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem., 270:1543 (1995). Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión dentro del marco con un DNA que codifica un marcador de epitopo en el extremos C- o N-terminal del polipéptido de Zace1 expresado, por ejemplo, un marcador de epitopo Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:7952 (1985)). Utilizando una técnica conocida en la técnica, un vector de transferencia que contiene un gen Zace1 se transforma en E. coli, y se seleccionan los bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo de baculovirus recombinantes. El DNA del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante entonces se aisla utilizando técnicas habituales.

El vector PFASTBAC ilustrativo puede modificarse hasta un grado considerable. Por ejemplo, el promotor de polihedrina puede eliminarse y sustituirse por el promotor de proteína básica de baculovirus (también conocido como promotor Pcor, p6.9 o MP), que se expresa de modo más temprano en la infección del baculovirus, y se ha demostrado que es ventajoso para expresar proteínas segregadas (véase, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol., 71:971 (1990); Bonning et al., J. Gen. Virol., 75:1551 (1994); y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem., 270:1543 (1995)). En estos constructos de vector de transferencia, puede utilizarse una versión corta o larga del promotor de proteína básica. Además, pueden construirse vectores de transferencia que sustituyen las secuencias señal secretoras de Zace1 nativas por secuencias señal secretoras derivadas de proteínas de insecto. Por ejemplo, una secuencia señal secretora de ecdisteroide-glucosiltransferasa (EGT), melitina de la abeja mielera (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), o baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) puede utilizarse en constructos para sustituir la secuencia señal secretora de Zace1 nativa.

El bácmido o virus recombinante se utiliza para transfectar células hospedantes. Las células hospedantes de insecto adecuadas incluyen líneas celulares derivadas de IPLB-Sf-21, una línea celular de ovario de pupa de Spodoptera frugiperda, como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE, y Sf21 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), así como células Schneider-2 de Drosophila, y la línea celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (patente de EEUU nº 5.300.435). Pueden utilizarse medios exentos de suero disponibles en el mercado para cultivar y mantener las células. Los medios adecuados son Sf900 II™ (Life Technologies) o ESF 921™ (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO™ (Life Technologies) para las células de T. ni. Cuando se utiliza un virus recombinante, las células se cultivan, de modo típico, desde una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 10^{5} células a una densidad de 1-2 x 10^{6} células, en cuyo momento se añade una cepa vírica recombinante con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 10, de forma más típica cerca de 3.

Se proporcionan técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus en Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors", en Methods in Molecular Biology, volumen 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), pp. 147-168 (The Humana Press, Inc., 1991); en Patel et al., "The baculovirus expression system", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª edición, Glover et al. (eds.), pp. 205-244 (Oxford University Press, 1995); en Ausubel (1995) en las páginas 16-37 a 16-57; en Richarson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc., 1995); y en Lucknow, "Insect Cell Expression Technology", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pp. 183-218 (John Wiley & Sons, Inc., 1996).

También pueden utilizarse células fúngicas, incluyendo células de levadura, para expresar los genes descritos en la presente. Las especies de levadura de particular interés a este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichia methanolica. Los promotores adecuados para la expresión en levaduras incluyen promotores de GAL1 (galactosa), PGK (fosfoglicerato-quinasa), ADH (alcohol-deshidrogenasa), AOX1 (alcohol-oxidasa), HIS4 (histidinol-deshidrogenasa) y similares. Se han diseñado muchos vectores de clonación de levaduras y pueden adquirirse con facilidad. Estos vectores incluyen vectores basados en YIp, como vectores YIp5, YRp, como vectores YRp17, YEp, como vectores YEp13 e YCp, y como YCp19. Los métodos para transformar células de S. cerevisiae con DNA exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de éstas se describen, por ejemplo, en Kawasaki, patente de EEUU nº 4.599.311; Kawasaki et al., patente de EEUU nº 4.931.373; Brake, patente de EEUU nº 4.870.008; Welch et al., patente de EEUU nº 5.037.743; y Murray et al., patente de EEUU nº 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan mediante el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, normalmente la resistencia a un fármaco o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente concreto (por ejemplo, leucina). Un sistema de vector preferido para utilizar en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vector POT1, descrito por Kawasaki et al. (patente de EEUU nº 4.931.373), que permite seleccionar células transformadas mediante el cultivo en medio que contiene glucosa. Otros promotores y terminadores adecuados para utilizar en levaduras incluyen los de los genes de enzimas glicolíticas (véase, por ejemplo, Kawasaki, patente de EEUU nº 4.599.311; Kingsman et al., patente de EEUU nº 4.615.974; y Bitter, patente de EEUU nº 4.977.092), y genes de alcohol-deshidrogenasa. Véase también las patentes de EEUU nº 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 y 4.661.454.

Los sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132:3459 (1986); y Cregg, patente de EEUU nº 4.882.279. Pueden utilizarse células de Aspergillus según los métodos de McKnight et al., patente de EEUU nº 4.935.349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum se describen en Sumino et al., patente de EEUU nº 5.162.228. Los métodos para transformar Neurospora se describen en Lambowitz, patente de EEUU nº 4.486.533.

Por ejemplo, el uso de Pichia methanolica como hospedante para la producción de proteínas recombinantes se describe en Raymond, patente de EEUU nº 5.716.808; Raymond, patente de EEUU nº 5.736.383; Raymond et al., Yeast, 14:11-23 (1998); y en las publicaciones internacionales nº WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Las moléculas de DNA para utilizar en la transformación de P. methanolica se preparan, habitualmente, como plásmidos circulares bicatenarios, que se linealizan preferiblemente antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador en el plásmido sean los de un gen de P. methanolica, como el gen de utilización del alcohol de P. methanolica, (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen los de los genes de la dihidroxiacetona-sintasa (DHAS), formiato-deshidrogenasa (FMD) y catalasa (CAT). Para facilitar la integración del DNA en el cromosoma del hospedante, se prefiere tener el segmento de expresión completo del plásmido flanqueado en ambos lados por secuencias de DNA del hospedante. Un marcador seleccionable preferido para utilizar en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, que codifica la fosforibosil-5-aminoimidazol-carboxilasa (AIRC, EC 4.1.1.21), y que permite a las células hospedantes ade2 crecer en ausencia de adenina. Para procesos industriales a gran escala, en los que resulta deseable minimizar el uso de metanol, se prefiere utilizar células hospedantes en las que ambos genes de utilización del metanol (AUG1 y AUG2) están delecionados. Para la producción de proteínas segregadas, se prefieren las células hospedantes deficientes en los genes de proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). Se utiliza la electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene DNA que codifica un polipéptido de interés en células de P. methanolica. Las células de P. methanolica pueden transformarse mediante electroporación utilizando un campo eléctrico pulsado de disminución exponencial, que tiene una potencia de campo desde 2,5 a 4,5 kV/cm, preferiblemente aproximadamente 3,75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) desde 1 a 40 milisegundos, más preferiblemente aproximadamente 20 milisegundos.

Los vectores de expresión también pueden introducirse en protoplastos vegetales, tejidos vegetales intactos, o células vegetales aisladas. Los métodos para introducir vectores de expresión en tejidos vegetales incluyen la infección directa o el cocultivo en tejido vegetal con Agrobacterium tumefaciens, el transporte mediado por microproyectiles, la inyección de DNA, la electroporación y similares. Véase, por ejemplo, Horsch et al., Science, 227:1229 (1985); Klein et al., Biotechnology, 10:268 (1992); y Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), pp. 67-88 (CRC Press, 1993).

Como alternativa, los genes Zace1 pueden expresarse en células hospedantes procariotas. Los promotores adecuados que pueden utilizarse para expresar los polipéptidos de Zace1 en un hospedante procariota son muy conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen promotores capaces de reconocer las T4, T3, Sp6 y T7-polimerasas, los promotores P_{R} y P_{L} del bacteriófago lambda, los promotores trp, recA, de choque térmico, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA y lacZ de E. coli, los promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, los promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla de pBR322, y el promotor CAT del gen de la cloranfenicol-acetil-transferasa. Los promotores procariotas se han analizado en Glick, J. Ind. Microbiol., 1:277 (1987); Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4ª edición (Benjamin Cummins, 1987); y Ausubel et al. (1995).

Los hospedantes procariotas preferidos incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Las cepas adecuadas de E. coli incluyen BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH41, DH5, DH51, DH51F', DH51MCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 y ER1647 (véase, por ejemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press, 1991)). Las cepas adecuadas de Bacillus subtilis incluyen BR151, YB886, MI119, MI120 y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", en DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press, 1985)).

Cuando se expresa un polipéptido de Zace1 en bacterias como E. coli, el polipéptido puede mantenerse en el citoplasma, de forma típica como gránulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso las células se lisan y los gránulos se recuperan y se desnaturalizan utilizando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede entonces volver a plegarse y dimerizarse diluyendo el desnaturalizante, como mediante diálisis contra una disolución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido de una diálisis contra una disolución salina tamponada. En el último caso, el polipéptido puede recuperarse a partir del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional rompiendo las células (por ejemplo, mediante sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando con ello la necesidad de una desnaturalización y replegamiento.

Los métodos para expresar proteínas en hospedantes procariotas son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª edición, Glover et al. (eds.), p. 15 (Oxford University Press, 1995); Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, p. 137 (Wiley-Liss, Inc., 1995); y Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), p. 101 (John Wiley & Sons, Inc., 1996)).

Se proporcionan métodos convencionales para introducir vectores de expresión en células bacterianas, de levadura, de insecto y vegetales en, por ejemplo, Ausubel (1995).

Los métodos generales para expresar y recuperar proteínas extrañas producidas por un sistema celular de mamífero se proporcionan, por ejemplo, en Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), p. 163 (Wiley-Liss, Inc., 1996). Las técnicas convencionales para recuperar proteínas producidas por un sistema bacteriano se proporcionan, por ejemplo, en Grisshamer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª edición, Glover et al. (eds.), pp. 59-92 (Oxford University Press, 1995). Los métodos establecidos para aislar proteínas recombinantes a partir de un sistema de baculovirus se describen en Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc., 1995).

Como alternativa, los polipéptidos de la presente invención pueden sintetizarse mediante síntesis de fase sólida exclusiva, métodos de fase sólida parciales, condensación de fragmentos, o síntesis en disolución clásica. Estos métodos de síntesis son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963); Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2ª edición) (Pierce Chemical Co., 1984); Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot., 3:3 (1986); Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, 1989); Fields y Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology, volumen 289 (Academic Press, 1997); y Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc., 1997)). Las variaciones en las estrategias de síntesis química totales, como "acoplamiento químico nativo" y "acoplamiento de proteínas expresadas", también son convencionales (véase, por ejemplo, Dawson et al., Science, 266:776 (1994); Hackeng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:7845 (1997); Dawson, Methods Enzymol., 287:34 (1997); Muir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6705 (1998); y Severinov y Muir, J. Biol. Chem., 273:16205 (1998)).

Los péptidos y polipéptidos de la presente invención comprenden al menos seis, preferiblemente al menos nueve, y más preferiblemente al menos 15 restos aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:1. Dentro de ciertas realizaciones de la invención, los polipéptidos comprenden 20, 30, 40, 50, 100 o más restos contiguos de la SEQ ID NO:1. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos y polipéptidos son útiles como sondas y cebadores de la reacción en cadena de polimerasa.

La presente invención contempla composiciones que comprenden un péptido o polipéptido descrito en la presente. Estas composiciones pueden comprender además un vehículo. El vehículo puede ser un vehículo orgánico o inorgánico convencional. Los ejemplos de vehículos incluyen agua, disolución tampón, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz y similares.

6. Producción de conjugados y proteínas de fusión de Zace1

Las proteínas de fusión de Zace1 pueden utilizarse para expresar Zace1 en un hospedante recombinante, y para aislar la Zace1 producida. Como se describe a continuación, unas proteínas de fusión de Zace1 concretas también tienen usos en el diagnóstico y terapia.

Un tipo de proteína de fusión comprende un péptido que guía un polipéptido de Zace1 desde una célula hospedante recombinante. Para dirigir un polipéptido de Zace1 hacia la vía secretora de una célula hospedante eucariota se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como un péptido señal, una secuencia conductora, una secuencia prepro o una secuencia pre) en el vector de expresión de Zace1. Mientras que la secuencia señal secretora puede derivarse de Zace1, una secuencia señal adecuada también puede derivarse de otra proteína segregada o sintetizada de novo. La secuencia señal secretora está unida operablemente con una secuencia que codifica Zace1 de forma que las dos secuencias están unidas en el marco de lectura correcto, y están colocadas para dirigir el polipéptido recién sintetizado hacia la vía secretora de la célula hospedante. Las secuencias señal secretoras se colocan, habitualmente, 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal secretoras pueden colocarse en otro lado de la secuencia de nucleótidos de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., patente de EEUU nº 5.037.743; Holland et al., patente de EEUU nº 5.143.830).

Aunque la secuencia señal secretora de Zace1 u otra proteína producida por células de mamífero (por ejemplo, una secuencia señal activadora del plasminógeno de tipo tisular, como se describe, por ejemplo, en la patente de EEUU nº 5.641.655) es útil para la expresión de Zace1 en hospedantes mamíferos recombinantes, se prefiere una secuencia señal de levadura para la expresión en células de levadura. Los ejemplos de secuencias señal de levadura adecuadas son las derivadas del factor \alpha de feromonas del apareamiento de levadura (codificadas por el gen MF\alpha1), invertasa (codificada por el gen SUC2) o fosfatasa ácida (codificada por el gen PHO5). Véase, por ejemplo, Romanos et al., "Expression of Cloned Genes in Yeast", en DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2ª edición, Glover y Hames (eds.), pp. 123-167 (Oxford University Press, 1995).

En células bacterianas a menudo resulta deseable expresar una proteína heteróloga como una proteína de fusión para disminuir la toxicidad, aumentar la estabilidad, y para potenciar la recuperación de la proteína expresada. Por ejemplo, Zace1 puede expresarse como una proteína de fusión que comprende un polipéptido de glutatión S-transferasa. Las proteínas de fusión de glutatión S-transferasa son típicamente solubles, y pueden purificarse con facilidad a partir de lisados de E. coli sobre columnas de glutatión inmovilizado. En planteamientos similares, una proteína de fusión de Zace1 que comprende un polipéptido de la proteína de unión de maltosa puede aislarse con una columna de resina de amilosa, mientras que una proteína de fusión que comprende el extremo C-terminal de un gen de la proteína A truncada puede purificarse utilizando IgG-sefarosa. Las técnicas establecidas para expresar un polipéptido heterólogo como una proteína de fusión en una célula bacteriana se describen, por ejemplo, en Williams et al., "Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies", en DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2ª edición, Glover y Hames (eds.), pp. 15-58 (Oxford University Press, 1995). Además se encuentran disponibles en el mercado sistemas de expresión. Por ejemplo, el sistema de purificación de proteína Xa PINPOINT (Promega Corporation, Madison, WI) proporciona un método para aislar una proteína de fusión que comprende un polipéptido que se biotinila durante la expresión con una resina que comprende avidina.

Los marcadores peptídicos que son útiles para aislar polipéptidos heterólogos expresados por células procariotas o eucariotas incluyen marcadores de polihistidina (que tienen afinidad por resinas quelantes de níquel), marcadores c-myc, proteína de unión de calmodulina (aislada con cromatografía de afinidad de calmodulina), sustancia P, el marcador RYIRS (que se une con anticuerpos antiRYIRS), el marcador Glu-Glu, y el marcador FLAG (que se une con anticuerpos antiFLAG). Véase, por ejemplo, Luo et al., Arch. Biochem. Biophys., 329:215 (1996); Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 23:67 (1996); y Zheng et al., Gene, 186:55 (1997). Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican estos marcadores peptídicos se encuentran disponibles, por ejemplo, en Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO).

Otra forma de proteína de fusión comprende un polipéptido de Zace1 y una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, de forma típica un fragmento F_{C}, que contiene dos o tres dominios de la región constante y una región bisagra, pero que carece de la región variable. Como ilustración, Chang et al., patente de EEUU nº 5.723.125, describe una proteína de fusión que comprende un interferón humano y un fragmento Fc de inmunoglobulina humana. El C-terminal del interferón está unido al N-terminal del fragmento Fc mediante un resto conector peptídico. Un ejemplo de un conector peptídico es un péptido que comprende, principalmente, una secuencia inerte de células T, que es inmunológicamente inerte. Un ejemplo de conector peptídico tiene la secuencia de aminoácidos: GGSGG SGGGG SGGGG S (SEQ ID NO:3). En esta proteína de fusión un resto Fc preferido es una cadena \gamma4 humana, que es estable en disolución y tiene poca o ninguna actividad activadora del complemento. Por consiguiente, la presente invención contempla una proteína de fusión de Zace1 que comprende un resto Zace1 y un fragmento Fc humano, en la que el C-terminal del resto Zace1 está unido al N-terminal del fragmento Fc mediante un conector peptídico, como un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3. El resto Zace1 puede ser una molécula de Zace1 o un fragmento de ésta. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender un fragmento de Zace1 que contiene el dominio catalítico (por ejemplo, un fragmento de Zace1 soluble) y un fragmento Fc (por ejemplo, un fragmento Fc humano).

En otra variación, una proteína de fusión de Zace1 comprende una secuencia de IgG, un resto Zace1 unido covalentemente al extremo aminoterminal de la secuencia de IgG, y un péptido señal que está unido covalentemente al aminoterminal del resto Zace1, en la que la secuencia de IgG consiste en los siguientes elementos en el siguiente orden: una región bisagra, un dominio CH_{2}, y un dominio CH_{3}. Por consiguiente, la secuencia de IgG carce de dominio CH_{1}. El resto Zace1 muestra actividad Zace1, como se describe en la presente, como la capacidad para reaccionar con un sustrato. Este planteamiento general para producir proteínas de fusión que comprenden porciones de anticuerpo y de no anticuerpo se ha descrito en LaRochelle et al., documento EP 742830 (WO 95/21258).

Las proteínas de fusión que comprenden un resto Zace1 y un resto Fc puede utilizarse, por ejemplo, como herramienta de ensayo in vitro. Por ejemplo, la presencia de un sustrato de Zace1 en una muestra biológica puede detectarse utilizando una proteína de fusión de Zace1-inmunoglobulina, en la cual el resto Zace1 se utiliza para unir el sustrato, y una macromolécula, como la proteína A o un anticuerpo antiFc, se utiliza para unir la proteína de fusión al soporte sólido. Estos sistemas pueden utilizarse para identificar sustratos e inhibidores de Zace1.

Otros ejemplos de proteínas de fusión de anticuerpos incluyen polipéptidos que comprenden un dominio de unión de antígenos y un fragmento de Zace1 que contiene un dominio catalítico de Zace1. Estas moléculas pueden ser útiles para el transporte dirigido a tejidos concretos para beneficiarse de la actividad enzimática de Zace1.

La presente invención proporciona además una diversidad de otras fusiones de polipéptidos. Por ejemplo, un polipéptido de Zace1 (que se corresponde con el dominio C de la ACE somática) puede prepararse como una fusión a un dominio N de la ACE somática. La secuencia señal de Zace1 nativa también pueden intercambiarse, de modo recombinante, por la secuencia señal de la ACE somática o la tACE. De forma similar, el dominio transmembrana de Zace1 puede intercambiarse, de modo recombinante, por el de la ACE somática o la tACE. El dominio catalítico de Zace1 también pueden intercambiarse, de modo recombinante, por la correspondiente región de la ACE somática, tACE, termolisina u otra metaloproteasa de cinc. Por consiguiente, parte o todo(s) el(los) dominio(s) que confiere(n) una función biológica puede(n) intercambiarse entre una Zace1 de la presente invención y el(los) dominio(s) funcionalmente equivalente(s) de otro miembro de la familia, como tACE o ACE somática. Por ejemplo, la región desde His^{398} a Ser^{430} de Zace1 puede intercambiarse, de modo recombinante, por la correspondiente región de ACE somática, tACE, termolisina u otra metaloproteasa de cinc.

Las fusiones de polipéptidos pueden expresarse en células hospedantes recombinantes para producir una diversidad de análogos de fusión de Zace1. Un polipéptido de Zace1 puede condensarse con dos o más restos o dominios, como un marcador de afinidad para la purificación y un dominio de transporte dirigido. Las fusiones de polipéptidos también pueden comprender uno o más sitios de ruptura, en particular entre dominios. Véase, por ejemplo, Tuan et al., Connective Tissue Research, 34:1 (1996).

Las proteínas de fusión pueden prepararse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica preparando cada componente de la proteína de fusión, y conjugándolos de modo químico. Como alternativa, un polinucleótido que codifica ambos componentes de la proteína de fusión en el marco de lectura apropiado puede generarse utilizando técnicas conocidas, y expresarse mediante los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, parte o todo(s) el(los) dominio(s) que confiere(n) una función biológica puede(n) intercambiarse entre una Zace1 de la presente invención y el(los) dominio(s) funcionalmente equivalente(s) de otro miembro de la familia, como tACE o ACE somática. Estos dominios incluyen, pero no se limitan a la secuencia señal secretora, los motivos conservados (como los dominios HEXXH y EX(I/V)X(D/S)), y el dominio transmembrana o intracelular. Se espera que estas proteínas de fusión tengan un perfil funcional biológico que es el mismo o similar que los polipéptidos de la presente invención u otras proteínas de la familia de las metaloproteasas de cinc conocidas, dependiendo de la fusión construida. Los métodos generales para la ruptura enzimática y química de las proteínas de fusión se describen, por ejemplo, en Ausubel (1995) en las páginas 16-19 a 16-25.

La presente invención también contempla composiciones de Zace1 químicamente modificadas, en las que un polipéptido de Zace1 está conectado con un polímero. Los ejemplos de polipéptidos de Zace1 adecuados incluyen polipéptidos solubles que carecen de un dominio transmembrana funcional. De forma típica, el polímero es soluble en agua de forma que el conjugado de Zace1 no precipita en un medio acuoso, como un medio fisiológico. Un ejemplo de un polímero adecuado es uno que se ha modificado para que tenga un único grupo reactivo, como un éster activo para la acilación, o un aldehído para la alquilación. De esta forma, el grado de polimerización puede controlarse. Un ejemplo de un aldehído reactivo es polietilenglicolpropionaldehído, o monoalcoxi(C1-C10) o sus derivados de ariloxi (véase, por ejemplo, Harris et al., patente de EEUU nº 5.252.714). El polímero puede estar ramificado o no ramificado. Además puede utilizarse una mezcla de polímeros para producir los conjugados de Zace1.

Los conjugados de Zace1 utilizados para la terapia deben comprender, preferiblemente, restos de polímeros solubles en agua farmacéuticamente aceptables. Estos polímeros solubles en agua adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, monoalcoxi(C1-C10)-PEG, ariloxi-PEG, poli(N-vinilpirrolidona)PEG, tresil monometoxi PEG, propionaldehído de PEG, carbonato de bis-succinimidilo PEG, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico), dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos. Un PEG adecuado puede tener un peso molecular desde aproximadamente 600 a aproximadamente 60.000, incluyendo, por ejemplo, 5.000, 12.000, 20.000 y 25.000. Un conjugado de Zace1 también puede comprender una mezcla de estos polímeros solubles en agua.

Un ejemplo de un conjugado de Zace1 comprende un resto Zace1 y un resto poli(óxido de alquilo) unido al N-terminal del resto Zace1. El PEG es un poli(óxido de alquilo) adecuado. Como ilustración, la Zace1 puede modificarse con PEG, un proceso denominado "PEGilación". La PEGilación de Zace1 puede realizarse mediante cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, el documento EP 0154316; Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9:249 (1992); Duncan y Spreafico, Clin. Pharmacokinet., 27:290 (1994); y Francis et al., Int. J. Hematol., 68:1 (1998)). Por ejemplo, la PEGilación puede realizarse mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva. En un planteamiento alternativo, los conjugados de Zace1 se forman condensando PEG activado, en el que un grupo hidroxi o amino terminal de PEG se ha sustituido por un conector activado (véase, por ejemplo, Karasiewicz et al., patente de EEUU nº 5.382.657).

La PEGilación mediante acilación requiere, de modo típico, hacer reaccionar un derivado de éster activo de PEG con un polipéptido de Zace1. Un ejemplo de un éster de PEG activado es PEG esterificado con N-hidroxisuccinimida. Tal como se utiliza en la presente, el término "acilación" incluye los siguientes tipos de enlaces entre Zace1 y un polímero soluble en agua: amida, carbamato, uretano y similares. Los métodos para preparar Zace1 PEGilada mediante acilación comprenden, de modo típico, las etapas de (a) hacer reaccionar un polipéptido de Zace1 con PEG (como un éster reactivo de un derivado de aldehído de PEG) bajo condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen a Zace1, y (b) obtener el(los) producto(s) de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinan basándose en parámetros conocidos y resultados deseados. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción de PEG:Zace1, mayor será el porcentaje de producto Zace1 PEGilado.

El producto de la PEGilación mediante acilación es, de forma típica, un producto de Zace1 poliPEGilado, en el que los grupos \varepsilon-amino de la lisina están PEGilados mediante un grupo de enlace acilo. Un ejemplo de un enlace conector es una amida. De forma típica, la Zace1 resultante estará al menos 95% mono-, di- o tripegilada, aunque pueden formarse otras especies con mayor grado de PEGilación dependiendo de las condiciones de reacción. Las especies PEGiladas pueden separarse de los polipéptidos de Zace1 no conjugados utilizando métodos de purificación convencionales, como diálisis, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y similares.

La PEGilación mediante alquilación implica, en general, hacer reaccionar un derivado de aldehído terminal de PEG con Zace1 en presencia de un agente reductor. Los grupos PEG se unen al polipéptido preferiblemente a través de un grupo -CH_{2}-NH.

La derivatización a través de la alquilación reductora para producir un producto monoPEGilado aprovecha la ventaja de la reactividad diferenciada de los diferentes tipos de grupos amino primarios disponibles para la derivatización. De forma típica, la reacción se realiza a un pH que permite aprovechar la ventaja de las diferencias de pKa entre los grupos \varepsilon-amino de los restos lisina y el grupo \alpha-amino del resto N-terminal de la proteína. Mediante esta derivatización selectiva se controla la unión de un polímero soluble en agua que contiene un grupo reactivo, como un aldehído, a una proteína. La conjugación con el polímero se produce predominantemente en el N-terminal de la proteína sin una modificación significativa de otros grupos reactivos, como los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. La presente invención proporciona una preparación sustancialmente homogénea de los conjugados de monopolímeros de Zace1.

La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de una molécula de conjugado de monopolímero de Zace1 puede comprender las etapas de: (a) hacer reaccionar un polipéptido de Zace1 con un PEG reactivo bajo condiciones de alquilación reductora a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo \alpha-amino en el extremo amino terminal de la Zace1, y (b) obtener el(los) producto(s) de reacción. El agente reductor utilizado para la alquilación reductora debe ser estable en una disolución acuosa y preferiblemente ser capaz de reducir sólo la base de Schiff formada en el proceso inicial de la alquilación reductora. Los agentes reductores preferidos incluyen borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, dimetilaminoborano, trimetilaminoborano y piridinborano.

Para una población sustancialmente homogénea de conjugados de monopolímeros de Zace1, las condiciones de reacción de alquilación reductora son las que permiten la unión selectiva del resto polímero soluble en agua con el N-terminal de Zace1. Estas condiciones de reacción en general proporcionan las diferencias de pKa entre los grupos amino de la lisina y el grupo \alpha-amino del N-terminal. El pH también afecta a la proporción entre polímero y proteína que se va a utilizar. En general, si el pH es menor, un exceso grande de polímero a proteína será deseable, porque cuanto menos reactivo sea el grupo \alpha N-terminal, más polímero se necesita para lograr unas condiciones óptimas. Si el pH es mayor, no es necesario que la proporción polímero:Zace1 sea tan grande porque hay más grupos reactivos disponibles. De forma típica, el pH estará en el intervalo desde aproximadamente 3 a aproximadamente 9, o desde aproximadamente 3 a aproximadamente 6.

Otro factor a considerar es el peso molecular del polímero soluble en agua. En general, cuanto mayor sea el peso molecular del polímero, menos moléculas del polímero se unen a la proteína. Para reacciones de PEGilación, el peso molecular típico es desde aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDA, desde aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, o desde aproximadamente 12 kDa a aproximadamente 25 kDa. La proporción molar de polímero soluble en agua a Zace1 estará, en general, en el intervalo desde 1:1 a 100:1. De forma típica, la proporción molar del polímero soluble en agua y Zace1 será desde 1:1 a 20:1 para la poliPEGilación, y desde 1:1 a 5:1 para la monoPEGilación.

Los métodos generales para producir conjugados que comprenden un polipéptido y restos polímero soluble en agua son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Karasiewicz et al., patente de EEUU nº 5.382.657; Greenwald et al., patente de EEUU nº 5.738.846; Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther., 59:636 (1996); Monkarsh et al., Anal. Biochem., 247:434 (1997)).

7. Aislamiento de polipéptidos de Zace1

Los polipéptidos de la presente invención pueden purificarse hasta al menos una pureza de aproximadamente 80%, hasta al menos una pureza de aproximadamente 90%, hasta al menos una pureza de aproximadamente 95%, o hasta una pureza mayor que 95%, con respecto a las macromoléculas contaminantes, en particular otras proteínas y ácidos nucleicos, y estar exentos de agentes infecciosos y pirógenos. Los polipéptidos de la presente invención también pueden purificarse hasta un estado farmacéuticamente puro, que es más de 99,9% puro. Los polipéptidos purificados particulares están sustancialmente exentos de otros polipéptidos, en particular otros polipéptidos de origen animal.

Pueden utilizarse métodos de fraccionamiento y/o purificación convencionales para obtener preparaciones de Zace1 purificada a partir de fuentes naturales, polipéptidos de Zace1 sintéticos, y polipéptidos de Zace1 recombinantes y polipéptidos de fusión de Zace1 purificados a partir de células hospedantes recombinantes. En general puede utilizarse la precipitación con sulfato de amonio y la extracción de ácidos o caótropos para el fraccionamiento de muestras. Un ejemplo de las etapas de purificación puede incluir hidroxiapatito, exclusión molecular, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especiales y similares. Se prefieren los derivados de PEI, DEAE, QAE y Q. Los ejemplos de medios cromatográficos incluyen los medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo, como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen esferas de vidrio, resinas con una base de sílice, resinas celulósicas, esferas de agarosa, esferas de agarosa reticuladas, esferas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares, que son insolubles bajo las condiciones en las cuales se usan. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permiten la unión de las proteínas mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos carbohidrato.

Los ejemplos de la química de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida, y derivados de carboxilo y amino para la química de acoplamiento de carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son muy conocidos y se utilizan ampliamente en la técnica, y se encuentran disponibles en suministradores comerciales. La selección de un medio concreto para el aislamiento y purificación de polipéptidos es cuestión de diseño rutinario y está determinado, en parte, por las propiedades del soporte elegido. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, 1988); y Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press, 1996).

Los expertos en la técnica pueden diseñar otras variaciones en el aislamiento y purificación de Zace1. Por ejemplo, los anticuerpos antiZace1, obtenidos como se describe a continuación, pueden utilizarse para aislar grandes cantidades de proteína mediante purificación por inmunoafinidad.

Además, en la técnica son muy conocidos los métodos para unir enzimas, como Zace1, a sustratos unidos a medios soporte. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden aislarse aprovechando su homología con la ACE somática y la tACE. Estas enzimas pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando el inhibidor de ACE lisinopril [N-[(S)-1-carboxi-3-fenilpropil]-Lys-Pro] como ligando fijado a un soporte sólido. Pueden obtenerse mejores rendimientos de purificación utilizando un espaciador de 28 \ring{A}, en lugar de 14 \ring{A}, entre el ligando y el soporte sólido.

Los polipéptidos de la presente invención pueden aislarse aprovechando propiedades particulares. Por ejemplo, puede utilizarse una cromatografía de absorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina, incluyendo las que comprenden marcadores de polihistidina. Brevemente, en primer lugar se carga un gel con iones metálicos divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem., 3:1 (1985)). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán a esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ion metálico utilizado, y se eluyen mediante elución competitiva, bajando el pH o utilizando agentes quelantes fuertes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de proteínas glicosiladas mediante cromatografía de afinidad de lectina y cromatografía de intercambio iónico (M. Deutscher (ed.), Meth. Enzymol., 182:529 (1990)). En otras realizaciones de la invención puede construirse una fusión del polipéptido de interés y un marcador de afinidad (por ejemplo, proteína de unión a la maltosa, un dominio de inmunoglobulina) para facilitar la purificación.

Los polipéptidos de Zace1 o sus fragmentos también pueden prepararse a través de síntesis química, como se describió anteriormente. Los polipéptidos de Zace1 pueden ser monómeros o multímeros; pueden estar glicosilados o no glicosilados; pueden estar PEGilados o no PEGilados; y pueden o no incluir un resto aminoácido metionina inicial.

8. Análogos de Zace1 e inhibidores de Zace1

Una clase general de análogos de Zace1 son los variantes que tienen una secuencia de aminoácidos que es una mutación de la secuencia de aminoácidos descrita en la presente. Otra clase general de análogos de Zace1 la proporciona los anticuerpos antiidiotipo y sus fragmentos, como se describe a continuación. Además, pueden utilizarse anticuerpos recombinantes que comprenden dominios variables antiidiotipo como análogos (véase, por ejemplo, Monfardini et al., Proc. Assoc. Am. Physicians, 108:420 (1996)). Puesto que los dominios variables de los anticuerpos antiidiotipo de Zace1 imitan a la Zace1, estos dominios pueden proporcionar actividad enzimática Zace1. Los métodos para producir anticuerpos catalíticos antiidiotipo son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Joron et al., Ann. N Y Acad. Sci., 672:216 (1992); Friboulet et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 47:229 (1994); y Avalle et al., Ann. N Y Acad. Sci., 864:118 (1998)).

Otro planteamiento para identificar análogos de Zace1 lo proporciona el uso de bancos combinatorios. Los métodos para construir y seleccionar la presentación de fagos y otros bancos combinatorios se proporciónan, por ejemplo, en Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, 1996); Verdine, patente de EEUU nº 5.783.384; Kay et al., patente de EEUU nº 5.747.334; y Kauffman et al., patente de EEUU nº 5.723.323.

Un uso in vitro ilustrativo de Zace1 y sus análogos es la producción de angiotensina II marcada. Por ejemplo, la angiotensina I, marcada de modo radiactivo en su N-terminal, puede incubarse en presencia de Zace1 o un variante activo de Zace1. El producto de la reacción será angiotensina II marcada de modo radiactivo. Esta molécula marcada de modo radiactivo puede utilizarse para estudiar el metabolismo de la angiotensina II in vitro, o para observar la distribución tisular de la angiotensina II administrada in vivo.

La actividad de las moléculas de Zace1 de la presente invención puede medirse utlizando una diversidad de ensayos que miden la actividad catalítica de la enzima en presencia o ausencia de cinc, o que miden los efectos del cloruro u otros monoaniones sobre la actividad catalític de Zace1. Además, los polipéptidos de Zace1 pueden caracterizarse midiendo el contenido en cinc de estos polipéptidos. Los inhibidores de ACE marcados de modo radiactivo son útiles para detectar los sitios de unión de alta afinidad en miembros de la familia de las metaloproteasas de cinc. Una o más mutaciones de restos importantes o críticos putativos, junto con ensayos conocidos de la actividad ACE, permiten el análisis de los efectos mutacionales sobre la estructura, actividad enzimática y actividad inmunológica de Zace1. Además, los sustratos de ACE sintéticos y naturales de ACE pueden ser útiles para caracterizar polipéptidos de Zace1 variantes o mutados. Los estudios que examinan la interacción de Zace1 y los inhibidores competitivos de ACE también pueden emplearse para ensayar y caracterizar polipéptidos de Zace1. Estos ensayos son muy conocidos en la técnica. Como referencia general, véase Corvol et al., Meth. Enzymol., 246:283 (1995). Véase también Williams et al., J. Biol. Chem., 269:29430 (1994); Sturrock et al., Biochem., 35:9560 (1996); y Michaud et al., Molec. Pharmacol., 51:1070 (1997).

Como ilustracón, un variante de Zace1 puede ensayarse para determinar la actividad ACE utilizando hipuril-L-histidil-L-leucina (Hip-His-Leu) como sustrato (véase, por ejemplo, Sen et al., J. Biol. Chem., 268:25748 (1993)). En una versión de este ensayo, un polipéptido de ensayo solubilizado se incuba en tampón borato de sodio 0,4 M (pH 8,3) que contiene cloruro de sodio 300 mM durante aproximadamente 15 a 30 minutos a 37ºC en presencia de concentraciones variables de Hip-His-Leu (por ejemplo, 0,4 a 5 mM). La cantidad de His-Leu liberada por el polipéptido de ensayo se mide de modo fluorométrico. También puede utilizarse Hip-His-Leu para identificar inhibidores de Zace1 midiendo la supresión de la ruptura del sustrato.

Otros sustratos de ACE son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, Isaac et al., Biochem. J., 328:587 (1997), han demostrado que los polipéptidos que tienen Lys/Arg-Arg en el C-terminal son sustratos de alta afinidad por la tACE humana. Otro sustrato útil para medir la actividad ACE es [^{3}H]benzol-Phe-Ala-Pro (Howell et al., Am. J. Physiol., 258:L188 (1990)).

Los sistemas en fase sólida también pueden utilizarse para identificar un sustrato o inhibidor de un polipéptido de Zace1. Por ejemplo, un polipéptido de Zace1, que puede o no ser catalíticamente activo, o una proteína de fusión de Zace1 puede inmovilizarse sobre la superficie de un chip receptor de un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIACORE, Biacore AB, Uppsala, Suecia). El uso de este instrumento se describe, por ejemplo, en Karlsson, Immunol. Methods, 145:229 (1991); y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol., 234:554 (1993).

Brevemente, un polipéptido o proteína de fusión de Zace1 se une covalentemente, utilizando la química de amina o sulfhidrilo, a fibras de dextrano que están unidas a una película de oro dentro de una célula de flujo. Entonces se hace pasar una muestra de ensayo a través de la célula. Si un sustrato o inhibidor de Zace1 está presente en la muestra se unirá al polipéptido o proteína de fusión inmovilizada, provocando un cambio en el índice de refracción del medio, que se detecta como un cambio en la resonancia de plasmón de superficie de la película de oro. Este sistema permite la determinación de las velocidades de activación y desactivación, a partir de las cuales puede calcularse la afinidad de unión, y la evaluación de la estequiometría de unión, así como de los efectos cinéticos de la mutación de Zace1. Este sistema también puede utilizarse para estudiar las interacciones antígeno-anticuerpo, y las interacciones de otras parejas de complemento/anticomplemento.

Los polipéptidos de Zace1 también pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido, como esferas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas con una base de sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada o materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso. Los métodos para unir polipéptidos a soportes sólidos son conocidos en la técnica, e incluyen la química de aminas, la activación con bromuro de cianógeno, la activación con N-hidroxisuccinimida, la activación con epóxido, la activación con sulfhidrilo y la activación con hidrazida. El medio resultante, en general, se configura en forma de una columna, y los fluidos que contienen el sustato o el sustrato putativo se hacen pasar a través de la columna una o más veces para permitir que el sustrato se una al polipéptido de Zace1. El sustrato entonces se eluye utilizando cambios en la concentración salina, agentes caotrópicos (HCl de guanidina), o pH para romper la unión sustrato-Zace1.

Por consiguiente, los polipéptidos de la presente invención son útiles como dianas para identificar a los moduladores de la actividad proteasa de cinc. Más en concreto, los polipéptidos de Zace1 son útiles para seleccionar o identificar nuevos inhibidores de ACE. Los polipéptidos de Zace1 también pueden utilizarse como base para el diseño lógico de fármacos de moléculas inhibidoras. Estas moléculas inhibidoras recién identificadas pueden ser más específicas o más potentes que los inhibidores de ACE conocidos. Además, los inhibidores de Zace1 pueden mostrar un perfil de efectos secundarios más favorable que los inhibidores de ACE conocidos. Por ejemplo, la Zace1 puede contribuir a ciertos efectos secundarios indeseados de los inhibidores de ACE y, como tal, la Zace1 sería útil para identificar inhibidores de ACE más específicos.

Además, las moléculas inhibidoras identificadas utilizando polipéptidos de Zace1 como diana pueden modular diferentes actividades biológicas o fisiológicas que los inhibidores de ACE conocidos (por ejemplo, los inhibidores pueden ser eficaces para trastornos distintos de los relacionados con la presión sanguínea y la homeostasis de agua y sales). Los inhibidores de Zace1 pueden proporcionar una inhibición más amplia que sólo la inhibición de ACE (por ejemplo, estos inhibidores pueden modular a muchos miembros de la familia de las metaloproteasas). Debido a que la Zace1 se encuentra más cercana, desde el punto de vista de la homología, a la tACE que a la ACE somática, la Zace1 puede permitir la selección de inhibidores específicos de dominio (los que inhiben el sitio activo que se corresponde con el dominio C de la ACE somática). Por tanto, un inhibidor de Zace1 puede estar dirigido, de modo específico, a la angiotensina I y a los efectos mediados por bradiquinina, pero no tener efecto o tener un efecto mínimo sobre la regulación de la hematopoyesis. Los inhibidores de Zace1 pueden mejorar, de modo beneficioso, el estado del paciente con enfermedad cardiovascular, y la enfermedad vascular aterosclerótica en particular, o la enfermedad renal, y la nefropatía diabética en particular. Los efectos de los inhibidores de Zace1 puede medirse in vitro utilizando células cultivadas, o in vivo administrando moléculas de la invención reivindicada al modelo animal apropiado.

La medida de la actividad enzimática Zace1 también puede utilizarse para el diagnóstico. Por ejemplo, la medida de los niveles de actividad ACE sérica proporciona información útil para el diagnóstico de la sarcoidosis y la respuesta al tratamiento (Studdy, Lancet, 2(8104-8105):1331 (1978)).

9. Producción de anticuerpos contra proteínas de Zace1

Pueden obtenerse anticuerpos contra Zace1, por ejemplo, utilizando el producto de un vector de expresión de Zace1 o Zace1 aislada a partir de una fuente natural, como un antígeno. Los anticuerpos antiZace1 que se "unen de modo específico" a Zace1 son particularmente útiles. Se considera que los anticuerpos se unen de forma específica si los anticuerpos muestran al menos una de las dos propiedades siguientes: (1) los anticuerpos se unen a Zace1 con un nivel umbral de actividad de unión, y (2) los anticuerpos no producen una reacción cruzada significativa con los polipéptidos relacionados con Zace1.

Con respecto a la primera característica, los anticuerpos se unen de forma específica si se unen a un polipéptido, péptido o epitopo de Zace1 con una afinidad de unión (K_{a}) de 10^{6} M^{-1} o mayor, preferiblemente 10^{7} M^{-1} o mayor, más preferiblemente 10^{8} M^{-1} o mayor, y lo más preferible 10^{9} M^{-1} o mayor. Un experto en la técnica puede determinar con facilidad la afinidad de unión de un anticuerpo, por ejemplo, mediante un análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci., 51:660 (1949)).

Con respecto a la segunda característica, los anticuerpos no producen una reacción cruzada significativa con las moléculas polipeptídicas relacionadas, por ejemplo, si detectan Zace1, pero no con polipéptidos conocidos actualmente utilizando un análisis de la transferencia Western convencional. Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos son enzimas conversoras de la angiotensina conocidas, como ACE somática y tACE humanas. Puede utilizarse una diversidad de ensayos conocidos por los expertos en la técnica para detectar anticuerpos que se unen de modo específico con proteínas o péptidos de Zace1. Se describen ejemplos de ensayos, por ejemplo, en Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Los ejemplos representativos de estos ensayos incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (ELISA), ensayo de la transferencia de puntos o Western, ensayo de inhibición o competición, y ensayo de "sandwich". Además, pueden seleccionarse anticuerpos para su unión a proteínas o polipéptidos de Zace1 de tipo salvaje frente a mutantes.

Los anticuerpos antiZace1 pueden producirse utilizando péptidos y polipéptidos que portan epitopos antigénicos de Zace1. Los péptidos y polipéptidos que portan epitopos antigénicos de la presente invención contienen una secuencia de al menos nueve, preferiblemente entre 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contenidos en la SEQ ID NO:1. Sin embargo, también son útiles péptidos o polipéptidos que comprenden una porción mayor de una secuencia de aminoácidos de la invención, que contienen desde 30 a 50 aminoácidos, o cualquier longitud hasta e incluyendo la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido de la invención, para inducir anticuerpos que se unen a Zace1. Resulta deseable que la secuencia de aminoácidos del péptido que porta el epitopo se seleccione para proporcionar una solubilidad sustancial en disolventes acuosos (es decir, la secuencia incluye restos relativamente hidrófilos, mientras que los restos hidrófobos preferiblemente se evitan). Además, también pueden resultar deseables las secuencias de aminoácidos que contienen restos prolina para la producción de anticuerpos.

Como ilustración, se identificaron sitios antigénicos potenciales en Zace1 utilizando el método de Jameson-Wolf, Jameson y Wolf, CABIOS, 4:181 (1988), implementado por el programa PROTEAN (versión 3.14) de LASERGENE (DNASTAR, Madison, WI). En este análisis se utilizaron parámetros por defecto.

El método de Jameson-Wolf predice determinantes antigénicos potenciales combinando seis subrutinas principales para la predicción estructural de proteínas. De forma breve, el método Hopp-Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3824 (1981), se utilizó en primer lugar para identificar secuencias de aminoácidos que representan áreas de mayor hidrofilicidad local (parámetro: siete restos promediados). En la segunda etapa se utilizó el método de Emini, Emini et al., J. Virology, 55:836 (1985), para calcular las probabilidades de superficie (parámetro: umbral de decisión de superficie (0,6) = 1). En tercer lugar, se utilizó el método Karplus-Schultz, Karplus y Schultz, Naturwissenschaften, 72:212 (985), para predecir la flexibilidad de la cadena del esqueleto (parámetro: umbral de flexibilidad (0,2) = 1). En la cuarta y quinta etapa del análisis se aplicaron las predicciones de la estructura secundaria a los datos utilizando los métodos de Chou-Fasman, Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition", en Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), pp. 549-586 (Plenum Press, 1990); y Garnier-Robson, Garnier et al., J. Mol. Biol., 120:97 (1987) (parámetros de Chou-Fasman: tabla de conformación = 64 proteínas; umbral de la región \alpha = 103; umbral de la región \beta = 105; parámetros de Garnier-Robson: constantes de decisión \alpha y \beta = 0). En la sexta subrutina, los parámetros de flexibilidad y los factores de accesibilidad de hidropatía/disolvente se combinaron para determinar un valor de contorno de superficie, denominado el "índice antigénico". Por último, se aplicó una función de ampliación de pico al índice antigénico, que amplía los picos de superficie principales añadiendo 20%, 40%, 60% o 80% del valor del pico respectivo para tomar en cuenta la otra energía libre derivada de la movilidad de las regiones de superficie con relación a las regiones interiores. Este cálculo no se aplicó, sin embargo, a cualquier pico principal que reside en la región helicoidal, puesto que las regiones helicoidales tienden a ser menos flexibles.

Los resultados de este análisis indican que las siguientes secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 proporcionan péptidos antigénicos adecuados: aminoácidos 28 a 34 ("péptido antigénico 1"), aminoácidos 39 a 56 ("péptido antigénico 2"), aminoácidos 85 a 92 ("péptido antigénico 3"), aminoácidos 117 a 125 ("péptido antigénico 4"), aminoácidos 132 a 147 ("péptido antigénico 5"), aminoácidos 233 a 245 ("péptido antigénico 6"), aminoácidos 376 a 394 ("péptido antigénico 7"), aminoácidos 512 a 523 ("péptido antigénico 8"), aminoácidos 580 a 586 ("péptido antigénico 9"), aminoácidos 635 a 649 ("péptido antigénico 10"), y aminoácidos 655 a 662 ("péptido antigénico 11"). La presente invención contempla el uso de uno cualquiera de los péptidos antigénicos 1 a 11 para generar anticuerpos contra Zace1. La presente invención también contempla polipéptidos que comprenden al menos uno de los péptidos antigénicos 1 a 11.

Los anticuerpos policlonales contra una proteína de Zace1 recombinante o contra Zace1 aislada a partir de fuentes naturales pueden prepararse utilizando métodos muy conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pp. 1-5 (Humana Press, 1992); y Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª edición, Glover et al. (eds.), p. 15 (Oxford University Press, 1995). La inmunogenicidad de un polipéptido de Zace1 puede aumentarse a través del uso de un adyuvante, como alúmina (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, como fusiones de Zace1 o una porción de ésta con un polipéptido de inmunoglobulina o con la proteína de unión a la maltosa. El inmunógeno del polipéptido puede ser una molécula de longitud completa o una porción de ésta. Si la porción polipeptídica es "de tipo hapteno", esta porción puede unirse o enlazarse, de forma ventajosa, con un vehículo macromolecular (como la hemocianina de lapa de agujero (KLH), la albúmina de suero bovina (BSA), o el toxoide del tétanos) para la inmunización.

Aunque los anticuerpos policlonales se producen, de forma típica, en animales como caballos, vacas, perros, pollos, ratas, ratones, conejos, cobayas, cabras u ovejas, un anticuerpo antiZace1 de la presente invención también puede derivarse de un anticuerpos de primate subhumano. Las técnicas generales para producir anticuerpos diagnóstica y terapéuticamente útiles en babuinos pueden encontrarse, por ejemplo, en Goldenberg et al., publicación de patente internacional nº WO 91/11465, y en Losman et al., Int. J. Cancer, 46:310 (1990).

Como alternativa pueden generarse anticuerpos antiZace1 monoclonales. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de roedores contra antígenos específicos mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, volumen 1, pp. 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons, 1991) ["Coligan"]; Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies agains proteins expressed in E. coli", en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª edición, Glover et al. (eds.), p. 93 (Oxford University Press, 1995)).

De forma breve, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando ratones con una composición que comprende un producto del gen Zace1, verificando la presencia de la producción de anticuerpos retirando una muestra de suero, retirando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que producen anticuerpos contra el antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos contra el antígeno, y aislando los anticuerpos a partir de los cultivos de hibridoma.

Ademas, un anticuerpo antiZace1 de la presente invención puede derivarse a partir de un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos se obtienen a partir de ratones transgénicos que se han modificado para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a una exposición antigénica. En esta técnica, se introducen elementos del locus de la cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivadas de líneas de células pluripotenciales embrionarias que contienen rupturas dirigidas de los loci de la cadena ligera y la cadena pesada endógenos. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los ratones pueden utilizarse para producir hibridomas que segregan anticuerpos humanos. Los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, en Green et al., Nature Genet., 7:13 (1994); Lonberg et al., Nature, 368:856 (1994); y Taylor et al., Int. Immun., 6:579 (1994).

Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse a partir de cultivos de hibridoma mediante una diversidad de técnicas bien establecidas. Estas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con proteína A y sefarosa, cromatografía de exclusión molecular, y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, volumen 10, pp. 79-104 (The Humana Press, Inc., 1992)).

Para usos particulares, puede resultar deseable preparar fragmentos de anticuerpos antiZace1. Estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo. Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpos mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante métodos convencionales. Como ilustración, pueden producirse fragmentos de anticuerpos mediante ruptura enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')_{2}. Este fragmento puede romperse aún más utilizando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes 3,5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de ruptura puede realizarse utilizando un grupo bloqueante para los grupos sulfihidrilo que se producen como resultado de la ruptura de los enlaces disulfuro. Como alternativa, una ruptura enzimática utilizando pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Goldenberg, patente de EEUU nº 4.331.647; Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 89:230 (1960); Porter, Biochem. J., 73:119 (1959); Edelman et al., en Methods in Enzymology, volumen 1, p. 422 (Academic Press, 1967); y en Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10-2.10.4.

Otros métodos para romper anticuerpos, como la separación de las cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, la posterior ruptura de los fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas también pueden utilizarse, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas V_{H} y V_{L}. Esta asociación puede ser no covalente, como se describe en Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2659 (1972). Como alternativa, las cadenas variables pueden enlazarse mediante un enlace disulfuro intermolecular, o entrecruzarse mediante productos químicos como glutaraldehído (véase, por ejemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 12:437 (1992)).

Los fragmentos Fv pueden comprender cadenas V_{H} y V_{L} que están conectadas por un conector peptídico. Estas proteínas de unión al antígeno monocatenarias (scFv) se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de DNA que codifican los dominios V_{H} y V_{L} que están conectados mediante un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión que posteriormente se introduce en una célula hospedante, como E. coli. Las células hospedantes recombinantes sintetizan una única cadena polipeptídica con un péptido conector que actúa como puente entre los dos dominios V. Los métodos para producir scFv se describen, por ejemplo, en Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97 (1991) (véase también Bird et al., Science, 242:423 (1988); Ladner et al., patente de EEUU nº 4.946.778; Pack et al., Bio/Technology, 11:1271 (1993); y Sandhu (supra)).

Como ilustración, un scFv puede obtenerse exponiendo linfocitos a un polipéptido de Zace1 in vitro, y seleccionando bancos de presentación de anticuerpos en vectores de fagos o similares (por ejemplo, mediante el uso de una proteína o péptido de Zace1 inmovilizado o marcado). Los genes que codifican genes polipéptidos que tienen dominios de unión al polipéptido de Zace1 potenciales pueden obtenerse seleccionando bancos peptídicos aleatorios presentados a fagos (presentación a fagos), o a bacterias, como E. coli. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos pueden obtenerse mediante una serie de modos, como a través de mutagénesis aleatoria y síntesis de polinucleótidos aleatoria. Estos bancos de presentación de péptidos aleatorios pueden utilizarse para seleccionar péptidos que interaccionan con una diana conocida que puede ser una proteína o un polipéptido, como un ligando o un receptor, una macromolécula biológica o sintética, o sustancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para crear y seleccionar estos bancos de presentación de péptidos aleatorios son conocidas en la técnica (Ladner et al., patente de EEUU nº 5.223.409; Ladner et al., patente de EEUU nº 4.946.778; Ladner et al., patente de EEUU nº 5.403.484; Ladner et al., patente de EEUU nº 5.571.698; y Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc., 1996)), y los bancos de presentación de péptidos aleatorios y los kits para seleccionar dichos bancos están disponibles en el mercado, por ejemplo en CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA), y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Los bancos de presentación de péptidos aleatorios pueden seleccionarse utilizando las secuencias de Zace1 descritas en la presente para identificar proteínas que se unen a la Zace1.

Otra forma de fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de la complementariedad (CDR). Los péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimas") pueden obtenerse construyendo genes que codifican las CDR de un anticuerpo de interés. Estos genes se preparan, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir de RNA de células que producen el anticuerpo (véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), p. 166 (Cambridge University Press, 1995); y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), p. 137 (Wiley-Liss, Inc., 1995)).

Como alternativa, un anticuerpo antiZace1 puede derivarse a partir de un anticuerpo monoclonal "humanizado". Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo regiones determinantes de la complementariedad de ratón a partir de las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano. Los restos típicos de anticuerpos humanos entonces se sustituyen en las regiones de marco de trabajo de los homólogos murinos. El uso de componentes de anticuerpos derivados de anticuerpos monoclonales humanizados obvia los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes murinas. Las técnicas generales para clonar dominios variables de inmunoglobulina murina se describen, por ejemplo, en Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833 (1989). Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados se describen, por ejemplo, en Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 12:437 (1992); Singer et al., J. Immun., 150:2844 (1993); Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc., 1995); Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pp. 399-434 (John Wiley & Sons, Inc., 1996); y en Queen et al., patente de EEUU nº 5.693.762 (1997).

Pueden prepararse anticuerpos antiidiotipo policlonales inmunizando animales con anticuerpos o fragmentos de anticuerpos antiZace1, utilizando técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", en Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson, (ed.), pp. 1-12 (Humana Press, 1992). Véase, también, Coligan en las páginas 2.4.1-2.4.7. Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos antiidiotipo monoclonales utilizando anticuerpos o fragmentos de anticuerpos antiZace1 como inmunógenos con las técnicas descritas anteriormente. Como otra alternativa, pueden prepararse anticuerpos antiidiotipo humanizados o anticuerpos antiidiotipo de primate subhumano utilizando las técnicas descritas anteriormente. Los métodos para producir los anticuerpos antiidiotipo se describen, por ejemplo, en Irie, patente de EEUU nº 5.208.146; Greene et al., patente de EEUU nº 5.637.677; y Varthakavi y Minocha, J. Gen. Virol., 77:1875 (1996).

10. Uso de secuencias de nucleótidos de Zace1 para detectar la expresión de genes y la estructura de genes

Pueden utilizarse moléculas de ácidos nucleicos para detectar la expresión de un gen Zace1 en una muestra biológica. Las moléculas sonda pueden ser DNA, RNA, oligonucleótidos y similares. Tal como se utiliza en la presente, el término "porción" se refiere desde al menos ocho nucleótidos hasta al menos 20 o más nucleótidos. Las sondas preferidas se unen con regiones del gen Zace1 que tienen una baja similitud de secuencia con regiones comparables en otras proteínas, como otras enzimas conversoras de angiotensina.

En un ensayo básico, una molécula sonda monocatenaria se incuba con RNA, aislado a partir de una muestra biológica, bajo condiciones de temperatura y fuerza iónica que estimulan el apareamiento de bases entre la sonda y la especie de RNA de Zace1 diana. Después de separar la sonda no unida de las moléculas hibridadas se detecta la cantidad de híbridos.

Los métodos de hibridación de detección de RNA bien establecidos incluyen el análisis de la transferencia Northern y la hibridación de transferencia de puntos/ranuras (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 4-1 a 4-27; y Wu et al. (eds.), "Analysis of Gene Expression at the RNA Level", en Methods in Gene Biotechnology, pp. 225-239 (CRC Press, Inc., 1997)). Las sondas de ácidos nucleicos pueden marcarse de modo detectable con radioisótopos como ^{32}P o ^{35}S. Como alternativa, el RNA de Zace1 puede detectarse con un método de hibridación no radiactivo (véase, por ejemplo, Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes (Humana Press, Inc., 1993)). De forma típica, las detección no radiactiva se logra mediante conversión enzimática de sustratos cromogénicos o quimioluminiscentes. Los restos no radiactivos ilustrativos incluyen biotina, fluoresceína y digoxigenina.

Las sondas de oligonucleótidos de Zace1 también son útiles para el diagnóstico in vivo. Como ilustración, pueden administrarse oligonucleótidos marcados con ^{18}F a un sujeto y visualizarse mediante tomografía de emisión de positrones (Tavitian et al., Nature Medicine, 4:467 (1998)).

Numerosos procedimientos de diagnóstico aprovechan la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para aumentar la sensibilidad de los métodos de detección. Las técnicas convencionales para realizar la PCR son muy conocidas (véase, en general, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc., 1991); White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc., 1993); Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc., 1996); Hanausek y Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc., 1998); Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc., 1998); y Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc., 1998).

Preferiblemente, los cebadores de PCR se diseñan para amplificar una porción del gen Zace1 que tiene una baja similitud de secuencia con una región comparable en otras proteínas, como otras enzimas conversoras de angiotensina.

Una variación de la PCR para ensayos de diagnóstico en la PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR). En la técnica de la RT-PCR, el RNA se aisla a partir de una muestra biológica, se transcribe de forma inversa para producir cDNA, y el cDNA se incuba con cebadores Zace1 (véase, por ejemplo, Wu et al. (eds.), "Rapid Isolation of Specific cDNA or Genes by PCR", en Methods in Gene Biotechnology, pp. 15-28 (CRC Press, Inc., 1997)). Entonces se realiza la PCR y los productos se analizan utilizando técnicas convencionales.

Los productos de la amplificación de la PCR pueden detectarse utilizando una diversidad de planteamientos. Por ejemplo, los productos de PCR pueden fraccionarse mediante electroforesis en gel, y visualizarse mediante tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, los productos de la PCR fraccionados pueden transferirse a una membrana, hibridarse con una sonda de Zace1 marcada de modo detectable, y estudiarse mediante autorradiografía. Otros planteamientos alternativos incluyen el uso de trifosfatos de ácido desoxirribonucleico marcados con digoxigenina para proporcionar una detección mediante quimioluminiscencia, y el ensayo colorimétrico C-TRAK.

Otro planteamiento para la detección de la expresión de Zace1 es la tecnología de ciclación de sondas (CPT), en la que un DNA diana monocatenario se une con un exceso de sonda quimérica de DNA-RNA-DNA para formar un complejo, la porción de RNA se rompe con RNAsa H, y la presencia de la sonda quimérica rota se detecta (véase, por ejemplo, Beggs et al., J. Clin. Microbiol, 34:2985 (1996); Bekkaoui et al., Biotechniques, 20:240 (1996)). Otros métodos para la detección de secuencias Zace1 pueden utilizar planteamientos como la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA), la amplificación cooperativa de moldes mediante hibridación cruzada (CATCH), y la reacción de la cadena de ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Marshall et al., patente de EEUU nº 5.686.272 (1997); Dyer et al., J. Virol. Methods, 60:161 (1996); Ehricht et al., Eur. J. Biochem., 243:358 (1997); y Chadwick et al., J. Virol. Methods, 70:59 (1998)). Otros métodos convencionales son conocidos por los expertos en la técnica.

Las sondas y cebadores de Zace1 también pueden utilizarse para detectar y localizar la expresión de genes Zace1 en muestras de tejido. Los métodos para dicha hibridación in situ son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Choo (ed.), In Situ Hybridization Protocols (Humana Press, Inc., 1994); Wu et al. (eds.), "Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH)", en Methods in Gene Biotechnology, pp. 259-278 (CRC Press, Inc., 1997); y Wu et al. (eds.), "Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH)", en Methods in Gene Biotechnology, pp. 279-289 (CRC Press, Inc., 1997). Diversos otros planteamientos de diagnóstico son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc., 1991); Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc., 1996); y Elles, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc., 1996)). Las muestras de ensayo adecuadas incluyen sangre, orina, saliva, tejido de biopsia y material de autopsia.

Se han descubierto polimorfismos clínicamente significativos del gen ACE humano (véase, por ejemplo, Matsusaka e Ichikawa, Annu. Rev. Physiol., 59:395 (1997)). Un polimorfismo asociado con el intrón 16 está asociado con niveles plasmáticos e intracelulares de ACE, así como un mayor riesgo de infarto de miocardio. Los polimorfismos de ACE también están asociados con la progresión hacia la insuficiencia renal crónica en nefropatía de IgA, y nefropatía diabética (Marre et al., Diabetes, 43:384 (1994); Yoshida et al., J. Clin. Invest., 96:2162 (1995)). Otras mutaciones del gen ACE están asociadas con el riesgo de desarrollar una enfermedad cardiovascular (Raynolds y Perryman, patente de EEUU nº 5.800.990).

Las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos de Zace1 pueden utilizarse para determinar si los cromosomas de un sujeto contienen una mutación en el gen Zace1. Las aberraciones cromosómicas detectables en el locus del gen Zace1 incluyen, pero no se limitan a aneuploidía, cambios en el número de copias del gen, inserciones, deleciones, cambios en el sitio de restricción y redisposiciones. De particular interés con las alteraciones genéticas que inactivan el gen Zace1.

Las aberraciones asociadas con el locus Zace1 pueden detectarse utilizando moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención empleado técnicas de la genética molecular, como análisis del polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP), el análisis de repetición de tándem corto (STR) empleando técnicas de PCR, análisis del sistema de amplificación-mutación refractaria (ARMS), detección de polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP), métodos de ruptura de RNasa, electroforesis en gradiente de gel desnaturalizante, análisis del desapareamiento asistido por fluorescencia (FAMA) y otras técnicas de análisis genético conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc., 1991); Marian, Chest, 108:255 (1995); Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc., 1996); Elles (ed.), Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc., 1996); Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press, 1996); Birren et al. (eds.), Genome Analysis, vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998); Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons, 1998); y Richards y Ward, "Molecular Diagnostic Testing", en Principles of Molecular Medicine, pp. 83-88 (Humana Press, Inc., 1998)).

El ensayo de truncamiento de proteínas también es útil para detectar la inactivación de un gen en el que las mutaciones de terminación de la traducción producen sólo porciones de la proteína codificada (véase, por ejemplo, Stoppa-Lyonnet et al., Blood, 91:3920 (1998)). Según este planteamiento, el RNA se aisla a partir de una muestra biológica y se utiliza para sintetizar cDNA. Entonces se utiliza la PCR para amplificar la secuencia diana Zace1 y para introducir un promotor de la RNA-polimerasa, una secuencia de inicio de la traducción, y un triplete ATG dentro del marco. Los productos de la PCR se transcriben utilizando una RNA-polimerasa, y los transcriptos se traducen in vitro con un sistema de lisado de reticulocitos acoplado a T7. Los productos de la traducción entonces se fraccionan mediante SDS-PAGE para determinar las longitudes de los productos de la traducción. El ensayo de truncamiento de proteínas se describe, por ejemplo, en Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, pp. 9.11.1-9.11.18 (John Wiley & Sons, 1998). El truncamiento de la proteína también puede examinarse comparando la proteína de Zace1 aislada a partir de un sujeto con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la presente.

La localización en el cromosoma del gen Zace1 puede lograrse utilizando cartografiado de híbridos de radiación, que es una técnica genética de células somáticas desarrollada para construir mapas contiguos de alta resolución de cromosomas de mamífero (Cox et al., Science, 250:245 (1990)). El conocimiento parcial o total de una secuencia de un gen permite diseñar cebadores de PCR adecuados para utilizar con paneles de cartografiado de híbridos de radiación cromosómicos. Los paneles de cartografiado de híbridos de radiación se encuentran disponibles en el mercado y cubren el genoma humano completo, como el Panel Stanford G3 RH y el pante GeneBridge 4 RH (Research Genetics, Inc., Hunstville, AL). Estos paneles permiten la localización cromosómica rápida basada en PCR y la ordenación de genes, sitios de secuencia marcada y otros marcadores polimórficos y no polimórficos dentro de una región de interés. Esto incluye establecer las distancias físicas directamente proporcionales entre los genes de interés recién descubiertos y los marcadores previamente cartografiados.

La presente invención también contempla kits para realizar un ensayo de diagnóstico para detectar la expresión del gen Zace1 o para detectar mutaciones en el gen Zace1. Estos kits comprenden sondas de ácidos nucleicos, como moléculas de ácidos nucleicos bicatenarios, así como moléculas de ácidos nucleicos monocatenarios. Las moléculas sonda pueden ser DNA, RNA, oligonucleótidos y similares. Los kits pueden comprender cebadores de ácidos nucleicos para realizar la PCR. Un kit comprenderá al menos un recipiente que comprende un cebador o sonda de Zace1. El kit también puede comprender un segundo recipiente que comprende uno o más reactivos capaces de indicar la presencia de secuencias Zace1. Los ejemplos de estos reactivos indicadores incluyen los marcadores detectables, como marcadores radiactivos, fluorocromos, agentes quimioluminiscentes y similares. Un kit también puede comprender un medio para indicar al usuario que las sondas y cebadores de Zace1 se utilizan para detectar la expresión del gen Zace1. Por ejemplo, unas instrucciones escritas pueden indicar que las moléculas de ácidos nucleicos adjuntas pueden utilizarse para detectar una molécula de ácido nucleico que codifica Zace1, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una secuencia de nucleótidos que codifica Zace1. El material escrito puede aplicarse directamente al recipiente, o el material escrito puede proporcionarse en forma de un inserto en el paquete.

11. Uso de anticuerpos antiZace1 para detectar Zace1

Pueden utilizarse anticuerpos contra Zace1 para marcar las células que expresan la Zace1, para aislar la Zace1 o porciones de ésta mediante purificación por afinidad, para ensayos de diagnóstico para determinar los niveles en circulación de polipéptidos de Zace1, para detectar o cuantificar la Zace1 como marcador de una patología o enfermedad subyaciente, en métodos analíticos que emplean FACS, para la selección de bancos de expresión, para generar anticuerpos antiidiotípicos, y como anticuerpos neutralizantes o como antagonistas para bloquear los efectos de la Zace1 in vitro e in vivo. Los marcadores o marcas directos adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores de fluorescencia, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; los marcadores o marcas indirectos pueden incluir el uso de biotina-avidina u otras parejas de complementos/anticomplementos como intermedios. Los anticuerpos en la presente también pueden estar directa o indirectamente conjugados a fármacos, toxinas, radionúclicos y similares, y estos conjugados se utilizan para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico in vivo. Además, los anticuerpos contra Zace1 o sus fragmentos pueden utilizanse in vitro para detectar Zace1 desnaturalizada o sus fragmentos en ensayos, por ejemplo, ensayos de la transferencia Western u otros ensayos conocidos en la técnica.

Por consiguiente, la presente invención contempla el uso de anticuerpos antiZace1 para seleccionar muestras biológicas in vitro para la presencia de Zace1. En un tipo de ensayo in vitro, los anticuerpos antiZace1 se utilizan en fase líquida. Por ejemplo, la presencia de Zace1 en una muestra biológica puede ensayarse mezclando la muestra biológica con una cantidad traza de Zace1 marcada y un anticuerpo antiZace1 bajo condiciones que estimulan la unión entre Zace1 y su anticuerpo. Los complejos de Zace1 y antiZace1 en la muestra pueden separarse de la mezcla de reacción poniendo en contacto el complejo con una proteína inmovilizada que se une con el anticuerpo, como un anticuerpo Fc o la proteína A de Staphylococcus. La concentración de Zace1 en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de Zace1 marcada unida al anticuerpo, y está relacionada directamente con la cantidad de Zace1 marcada libre. Las muestras biológicas ilustrativas incluyen sangre, orina, salina, tejido de biopsia y material de autopsia.

Como alternativa, pueden realizarse ensayos in vitro, en los que el anticuerpo antiZace1 se une a un vehículo en fase sólida. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a un polímero, como aminodextrano, para unir el anticuerpo a un soporte insoluble como una esfera revestida con polímero, una placa o un tubo. A los expertos en la técnica les resultaran fácilmente evidentes otros ensayos in vitro adecuados.

En otro planteamiento, los anticuerpos antiZace1 pueden utilizarse para detectar Zace1 en secciones de tejido preparadas a partir de un especimen de biopsia. Esta detección inmunoquímica puede utilizarse para determinar la abundancia relativa de Zace1, y para determinar la distribución de Zace1 en el tejido estudiado. Las técnicas de inmunoquímica general están bien establecidas (véase, por ejemplo, Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application", en Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.), pp. 115-138 (IRL Press, 1987); Coligan en las páginas 5.8.1-5.8.8; Ausubel (1995) en las páginas 14.6.1 a 14.6.13 (Wiley Interscience, 1990); y Manson (ed.), Methods In Molecular Biology, vol. 10: Immunochemical Protocols (The Humana Press, Inc., 1992)).

La detección inmunoquímica puede realizarse poniendo en contacto una muestra biológica con un anticuerpo antiZace1, y después poniendo en contacto la muestra biológica con una molécula marcada de modo detectable que se une al anticuerpo. Por ejemplo, la molécula marcada de modo detectable puede comprender un resto anticuerpo que se une a un anticuerpo antiZace1. Como alternativa, el anticuerpo antiZace1 puede conjugarse con avidina/estreptavidina (o biotina), y la molécula marcada de modo detectable puede comprender biotina (o avidina/estreptavidina). Numerosas variaciones de esta técnica básica son muy conocidas por los expertos en la técnica.

Como alternativa, un anticuerpo antiZace1 puede conjugarse con un marcador detectable para formar un inmunoconjugado antiZace1. Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente o oro coloidal. Los métodos para fabricar y detectar estos inmunoconjugados marcados de modo detectable son muy conocidos por los expertos en la técnica, y se describen con más detalle a continuación.

El marcador detectable puede ser un radioisótopo que se detecta mediante autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para este fin de la presente invención son ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S y ^{14}C.

Los inmunoconjugados antiZace1 también pueden marcarse con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo marcado de modo fluorescente se determina exponiendo el inmunoconjugado a la luz de una longitud de onda adecuada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de marcaje fluorescente incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeriterina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

Como alternativa, los inmunoconjugados antiZace1 pueden marcarse de modo detectable mediante el acoplamiento de un componente de anticuerpo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del inmunoconjugado marcado de forma quimioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el desarrollo de la reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscente incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato.

De forma similar, un compuesto bioluminiscente puede utilizarse para marcar inmunoconjugados antiZace1 de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos, en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para el marcaje incluyen luciferina, luciferasa y aequorina.

Como alternativa, los inmunoconjugados antiZace1 pueden marcarse de modo detectable mediante la unión de un componente de un anticuerpo antiZace1 a una enzima. Cuando el conjugado antiZace1-enzima se incuba en presencia del sustrato apropiado, el resto enzima reacciona con el sustrato para producir un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Los ejemplos de enzimas que pueden utilizarse para marcar de forma detectable inmunoconjugados poliespecíficos incluyen \beta-galactosidasa, glucosa-oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina.

Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados que pueden emplearse según la presente invención. La unión de restos marcadores a anticuerpos antiZace1 puede realizarse utilizando técnicas convencionales conocidas en la técnica. La metodología típica a este respecto se describe en Kennedy et al., Clin. Chim. Acta, 70:1 (1976); Schurs et al., Clin. Chim. Acta, 81:1 (1977); Shih et al., Intl. J. Cancer, 46:1101 (1990); Stein et al., Cancer Res., 50:1330 (1990); y Coligan, supra.

Además, la conveniencia y versatilidad de la detección inmunoquímica puede potenciarse utilizando anticuerpos antiZace1 que se han conjugado con avidina, estreptavidina y biotina (véase, por ejemplo, Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology, vol. 184 (Academic Press, 1990); y Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", en Methods in Molecular Biology, vol. 10, Manson (ed.), pp. 149-162 (The Humana Press, Inc., 1992).

Los métodos para realizar inmunoensayos están bien establecidos. Véase, por ejemplo, Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), pp. 180-208 (Cambridge University Press, 1995); Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y Lennox (eds.), pp. 107-120 (Wiley-Liss, Inc., 1995), y Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc., 1996).

La presente invención también contempla kits para realizar un ensayo de diagnósitco inmunológico para detectar la expresión del gen Zace1. Estos kits comprenden al menos un recipiente que comprende un anticuerpo antiZace1 o un fragmento de anticuerpo. Un kit también puede comprender un segundo recipiente que comprende uno o más reactivos capaces de indicar la presencia del anticuerpo de Zace1 o los fragmentos de anticuerpos. Los ejemplos de estos reactivos indicadores incluyen marcadores detectables como un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente, oro coloidal y similares. Un kit también puede comprender un medio para indicar al usuario que los anticuerpos de Zace1 o los fragmentos de anticuerpos se utilizan para detectar una proteína de Zace1. Por ejemplo, unas instrucciones escritas pueden indicar que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo adjunto puede utilizarse para detectar Zace1. El material escrito puede aplicarse directamente al recipiente, o el material escrito puede proporcionarse en forma de un inserto en el paquete.

12. Conjugados bioactivos de anticuerpos y polipéptidos de Zace1

La presente invención incluye anticuerpos o polipéptidos que están conjugados directa o indirectamente con fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, que pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico in vivo. Por ejemplo, los polipéptidos o anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para identificar o tratar tejidos u órganos que expresan una molécula anticomplementaria correspondiente (sustrato, receptor o antígeno, respectivamente, por ejemplo). De modo más específico, los polipéptidos de Zace1 o los anticuerpos antiZace1, o sus fragmentos o porciones bioactivos, pueden acoplarse a moléculas detectables o citotóxicas y administrarse a un mamífero que tiene células, tejidos u órganos que expresan la molécula anticomplementaria.

Las moléculas detectables adecuadas pueden unirse directa o indirectamente al polipéptido o anticuerpo, e incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas pueden unirse directa o indirectamente al polipéptido o anticuerpo, e incluyen toxinas bacterianas o vegetales (por ejemplo, la toxina de la difteria, la exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina y similares), así como radionúclidos terapéuticos, como yodo-131, renio-188 o itrio-90 (unidos directamente al polipéptido o anticuerpo, o unidos indirectamente a través de un resto quelante, por ejemplo). Los polipéptidos o anticuerpos también pueden conjugarse a fármacos citotóxicos, como adriamicina. Para la unión indirecta a una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica puede conjugarse con un miembro de una pareja complementaria/anticomplementaria, mientras que el otro miembro se une a la porción del anticuerpo o polipéptido. Para estos fines, la biotina/estreptavidina es un ejemplo de pareja complementaria/anticomplementaria.

En otro aspecto de la invención, las proteínas de fusión de polipéptido-toxina o las proteínas de fusión de anticuerpo-toxina pueden utilizarse para la inhibición o ablación dirigida de células o tejidos (por ejemplo, para tratar células o tejidos cancerosos). Como alternativa, si el polipéptido tiene múltiples dominios funcionales (es decir, un dominio de activación o un dominio de unión a un sustrato y/o ligando, más un dominio de transporte dirigido), una proteína de fusión que incluya sólo el dominio de transporte dirigido puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a un tipo de célula o tejido de interés. En los casos en los que la proteína de fusión que sólo contiene un dominio incluye una molécula complementaria, la molécula anticomplementaria puede conjugarse con una molécula detectable o citotóxica. Estas proteínas de fusión de dominio-molécula complementaria, por tanto, representan un vehículo de transporte dirigido genérico para el transporte específico de célula/tejido de conjugados de moléculas anticomplementarias-detectables/citotóxicas genéricas.

En otra realización, las proteínas de fusión de Zace1-citoquina o las proteínas de fusión de antiZace1-citoquina pueden utilizarse para potenciar la muerte in vivo de tejidos diana, si el polipéptido de Zace1 o el anticuerpo antiZace1 se dirige a la célula diana hiperproliferativa. Por ejemplo, Hornick et al., Blood, 89:4437 (1997), describen proteínas de fusión que permiten el transporte dirigido de una citoquina hasta un sitio de acción deseado, proporcionando con ello una concentración local elevada de citoquina. Las citoquinas adecuadas para este fin incluyen la interleuquina-2 y el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), y otros inmunomoduladores, por ejemplo. Los polipéptidos de Zace1 o los anticuerpos antiZace1 adecuados se dirigen a una célula o tejido indeseado (es decir, una célula epitelial vascular hiperproliferativa o una célula transformada). Este polipéptido o anticuerpo puede conjugarse con un radionúclido y, en concreto, con un radionúclido de emisiones \beta, para reducir la reestenosis o la masa de células transformadas. Este planteamiento terapéutico plantea menos peligro para los médicos que administran la terapia radiactiva. Por ejemplo, las cintas impregnadas con iridio-192 colocadas en pacientes con vasos con un implante de estenosis hasta que se administra la dosis de radiación requerida mostraron un menor crecimiento del tejido en el vaso y un mayor diámetro luminal que el grupo control, que recibió cintas placebo. Además, la revascularización y trombosis del implante de estenosis fueron significativamente menores en el grupo de tratamiento. Se predicen resultados similares con el transporte dirigido de un conjugado bioactivo que contiene un radionúclido, como se describe en la presente.

Los conjugados de polipéptido o anticuerpo bioactivos descritos en la presente pueden administrarse por vía intravenosa, intraarterial o intraductal, o pueden introducirse localmente en el sitio de acción previsto. Las vías de administración adecuadas de proteínas terapéuticas se describen a continuación.

13. Usos terapéuticos de polipéptidos que tienen actividad Zace1

La presente invención incluye el uso de proteínas, polipéptidos y péptidos que tienen actividad Zace1 (como polipéptidos de Zace1 (por ejemplo, formas solubles de Zace1), análogos de Zace1 (por ejemplo, anticuerpos antiidiotipo antiZace1) y proteínas de fusión de Zace1) a un sujeto que carece de una cantidad adecuada de este polipéptido. Por contraste, los antagonistas de Zace1 (por ejemplo, anticuerpos antiZace1) pueden utilizarse para tratar un sujeto que produce un exceso de Zace1.

El sistema de calicreína-quinina (contacto) modula el sistema de renina-angiotensina-aldosterona, prostaglandinas, vasopresinas, equilibrio de sodio-agua, hemodinámica renal y presión sanguínea. Stadnicki et al., FASEB J., 12:325 (1998) han demostrado que un inhibidor reversible de la calicreína plasmática disminuye la inflamación intestinal crónica en un modelo experimental con relación a la enfermedad de Crohn. Una de las acciones de la calicreína es romper el quininógeno de alto peso molecular para producir bradiquinina, un péptido que estimula la vasodilatación, aumenta la permeabilidad vascular e influye en la motilidad intestinal y la secreción de electrolitos (véase, por ejemplo, Bhoola et al., Pharmacol. Rev., 44:1 (1992)). La inhibición de la calicreína por el inhibidor reversible, por tanto, debería disminuir los niveles de actividad de la bradiquinina, lo cual es coherente con las pruebas de que las quininas median en la inflamación gastrointestinal asociada con la enfermedad del intestino inflamatoria, como la enfermedad de Crohn (véase, por ejemplo, Bachvarov et al., Gastroenterology, 115:1045 (1998)).

La ACE también disminuye la actividad de la bradiquinina rompiendo el péptido. Por consiguiente, una disminución en la actividad ACE debe correlacionarse con un aumento de la actividad bradiquinina. Los estudios han demostrado que la actividad ACE sérica disminuye significativamente en ciertos pacientes que tienen una enfermedad de Crohn activa (véase, por ejemplo, Silverstein et al., Am. J. Clin. Pathol., 75:175 (1981); Sommer et al., Enzyme, 35:181 (1986)). Tomadas conjuntamente, estas observaciones indican que la ACE puede utilizarse para tratar trastornos asociados con la inflamación, como la enfermedad del intestino inflamatoria.

La presente invención, por tanto, incluye el uso de polipéptidos que tienen actividad Zace1 (por ejemplo, polipéptidos de Zace1, fragmentos funcionales de Zace1, anticuerpos antiidiotipo antiZace1, etc.) para tratar una enfermedad del intestino inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa). Más en general, la presente invención incluye el uso de polipéptidos que tienen actividad Zace1 para tratar enfermedades asociadas con la inflamación, como artritis y enterocolitis, dos trastornos que se han tratado con un inhibidor de calicreína (véase, por ejemplo, DeLa Cadena et al., FASEB J., 9:446 (1995); Stadnicki et al., Dig. Dis. Sci., 41:912 (1996)). Los métodos para la identificación de sujetos adecuados para este tratamiento son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Rakel (ed.), Conn's 1999 Current Therapy (W.B. Saunders Company, 1999)).

En general, la dosificación de la Zace1 administrada (o el análogo o proteína de fusión de Zace1) variará dependiendo de factores como la edad, peso, altura, sexo, trastorno médico general e historia médica previa del paciente. De forma típica, resulta deseable proporcionar al recipiente con una dosificación de Zace1 que está en el intervalo desde aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal del paciente), aunque también puede administrarse una dosificación menor o mayor según sean las circunstancias.

La administración de una molécula que tiene actividad Zace1 a un sujeto puede ser por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, mediante perfusión a través de un catéter regional, o mediante inyección intralesional directa. La administración regional resulta particularmente útil para el tratamiento de una enfermedad del intestino inflamatoria. Cuando se administran proteínas terapéuticas mediante inyección, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante una única dosis o múltiples dosis intravenosas en embolada.

Otras vías de administración incluyen la vía oral, de membranas mucosas, pulmonar y transcutánea. La administración oral resulta adecuada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinoides, microesferas de policianoacrilato y sistemas basados en lípidos (véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), pp. 255-288 (Plenum Press, 1997)). La viabilidad de la administración intranasal se ejemplifica mediante una vía de administración de insulina (véase, por ejemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug. Deliv. Rev., 35:199 (1999)). Pueden prepararse partículas secas o líquidas que comprenden Zace1 e inhalarse con la ayuda de dispersadores de polvo seco, generadores de aerosol líquido o nebulizadores (por ejemplo, Pettit y Gombotz, TIBTECH, 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 35:235 (1999)). Este planteamiento se ilustra mediante el sistema de gestión de la diabetes AERX, que es un inhalador electrónico portátil que administra insulina aerosolizada hacia los pulmones. Los estudios han demostrado que proteínas tan grandes como 48.000 kDa han sido administradas a través de la piel a concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonido de baja frecuencia, que ilustra la viabilidad de la administración transcutánea (Mitragotri et al., Science, 269:850 (1995)). La administración transdérmica utilizando electroporación proporciona otro medio para administrar una molécula que tiene activadad Zace1 (Potts et al., Pharm. Biotechnol., 10:213 (1997)).

Una composición farmacéutica que comprende una proteína, polipéptido o péptido que tiene actividad Zace1 puede formularse según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en los que las proteínas terapéuticas se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si un paciente receptor puede tolerar su administración. La disolución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados, como dextrosa al 5% en agua, son muy conocidos por los expertos en la técnica. Las formulaciones también pueden incluir uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponantes, albúmina para evitar la pérdida de proteínas sobre superficies de viales, etc. Los métodos de formulación son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company, 1995).

Para fines de terapia, las moléculas que tienen actividad Zace1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de una proteína, polipéptido o péptido que tiene actividad Zace1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, los síntomas habituales de la enfermedad de Crohn incluyen diarrea crónica con dolor abdominal, fiebre, anorexia, pérdida de peso y una masa derecha-inferior de cuadrante. Un agente utilizado para tratar la enfermedad de Crohn es fisiológicamente significativo si su presencia alivia al menos uno de estos síntomas.

Una composición farmacéutica que comprende Zace1 (o un análogo o proteína de fusión de Zace1) puede prepararse en forma líquida, en un aerosol o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran mediante disoluciones inyectables y suspensiones orales. Los ejemplos de formas sólidas incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. Esta última forma se ilustra mediante implantes y bombas miniosmóticas (Bremer et al., Pharm. Biotechnol., 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), pp. 95-123 (CRC Press, 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), pp. 239-254 (Plenum Pres, 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), pp. 93-117 (Plenum Press, 1997)).

Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto por la vía de administración intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutánea, u oral, y la vía de administración intranasal o mediante inhalación. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten en una o más bicapas lipídicas que rodean un compartimiento acuoso (véase, en general, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 12 (supl. 1):S61 (1993); Kim, Drugs, 46:618 (1993); y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), pp. 3-24 (CRC Press, 1995)). Los liposomas son similares en su composición a las membranas celulares y, como resultado, los liposomas pueden administrarse de forma segura y son biodegradables. Dependiendo del método de preparación, los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares, y los liposomas pueden variar en tamaño, con unos diámetros que varían desde 0,02 \mum a más de 10 \mum. Una diversidad de agentes pueden encapsularse en los liposomas: una parte de agentes hidrófobos en las bicapas, y una parte de agentes hidrófilos dentro del(los) espacio(s) acuoso(s) interno(s) (véase, por ejemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey, 1987); y Ostro et al., American J. Hosp. Pharm., 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño del liposoma, el número de bicapas, la composición lipídica, así como las características de carga y superficie de los liposomas.

Los liposomas pueden adsorberse prácticamente a cualquier tipo de célula, y después liberar lentamente el agente encapsulado. Como alternativa, un liposoma absorbido puede ser endocitado por células que son fagocíticas. Después de la endocitosis se produce la degradación intralisosómica de los lípidos liposómicos y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 446:368 (1985)). Después de la administración intravenosa, los liposomas pequeños (0,1 a 1,0 \mum), de forma típica, son recogidos por las células del sistema reticuloendotelial, localizado principalmente en el hígado y bazo, en los que los liposomas mayores que 3,0 \mum se depositan en el pulmón. Esta captación preferente de liposomas pequeños por las células del sistema reticuloendotelial se ha utilizado para administrar agentes quimioterapéuticos a macrófagos y a tumores del hígado.

El sistema reticuloendotelial puede evitarse mediante varios métodos, incluyendo la saturación con grandes dosis de partículas de liposomas, o la inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta, 802:428 (1984)). Además, la incorporación de fosfolípidos derivatizados con glicolípidos o polietilenglicol a las membranas de los liposomas ha demostrado que produce una captación significativamente reducida del sistema reticuloendotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993)).

Los liposomas también puede prepararse para que se dirijan a células u órganos concretos variando la composición de fosfolípidos, o insertando receptores o ligados en los liposomas. Por ejemplo, se han utilizado liposomas preparados con un elevado contenido en un tensioactivo no iónico para dirigirlos al hígado (Hayakawa et al., patente japonesa 04-244.018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull., 16:960 (1993)). Estas formulaciones se preparan mezclando fosfatidilcolina de soja, \alpha-tocoferol y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla al vacío, y después reconstituyendo la mezcla con agua. Se ha demostrado que una formulación de liposomas de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) también se dirige al hígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull., 20:881 (1997)).

Como alternativa, diversos ligandos de transporte dirigido pueden unirse a la superficie del liposoma, como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, carbohidratos, vitaminas y proteínas de transporte. Por ejemplo, los liposomas pueden modificarse con derivados de galactosil-lípidos de tipo ramificado para dirigirse a receptores de asialoglicoproteína (galactosa), que se expresan exclusivamente sobre la superficie de células renales (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull., 20:259 (1997)). De forma similar, Wu et al., Hepatology, 27:772 (1998), han demostrado que el marcaje de liposomas con asialofetuína conduce a una semivida plasmática del liposoma más corta y a un gran aumento en la captación de liposomas marcados con asialofetuína por los hepatocitos. Por otra parte, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados de galactosil-lípidos de tipo ramificado puede inhibirse mediante una preinyección de asialofetuína (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull., 20:259 (1997)). Los liposomas de albúmina de suero humana poliaconitilados proporcionan otro planteamiento para el transporte dirigido de liposomas hasta las células hepáticas (Kamps et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:11681 (1997)). Además, Geho et al., patente de EEUU nº 4.603.044, describen un sistema de administración de vesículas de liposomas dirigidos a hepatocitos, que tiene especificidad por los receptores hepatobiliares asociados con las células metabólicas especializadas del hígado.

En un planteamiento más general para el transporte dirigido a tejidos, las células diana se premarcan con anticuerpos biotinilados específicos para un ligando expresado por la célula diana (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 32:99 (1998)). Después de la eliminación plasmática del anticuerpo libre se administran los liposomas conjugados con estreptavidina. En otro planteamiento, los anticuerpos de transporte dirigido se unen directamente a los liposomas (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 32:99 (1998)).

Los polipéptidos que tienen actividad Zace1 pueden encapsularse dentro de liposomas utilizando técnicas convencionales de microencapsulación de proteínas (véase, por ejemplo, Anderson et al., Infect. Immun., 31:1099 (1981); Anderson et al., Cancer Res., 50:1853 (1990); y Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1063:95 (1991); Alving et al., "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", en Liposome Technology, 2ª edición, vol. III, Gregoriadis (ed.), p. 317 (CRC Press, 1993); Wassef et al., Meth. Enzymol., 149:124 (1987)). Como se indicó anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una diversidad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados lipídicos de polietilenglicol (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993)).

Las microesferas de polímeros degradables se han diseñado para mantener unos elevados niveles sistémicos de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables como poli(láctido-co-glicólido) (PLG), polianhídridos, poli(orto-ésteres), polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en los que las proteínas se atrapan en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem., 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), pp. 51-93 (CRC Press, 1995); Roskos y Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), pp. 45-92 (Plenum Press, 1997); Bartus et al., Science, 281:1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology, 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:548 (1998)). Las nanoesferas revestidas con polietilenglicol (PEG) también proporcionan vehículos para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol., 10:167 (1997)).

La presente invención también contempla polipéptidos químicamente modificados que tienen actividad Zace1 y antagonistas de Zace1, en los que un polipéptido se une a un polímero, como se analizó anteriormente.

Los expertos en la técnica pueden diseñar otras formas de dosificación, como se muestra, por ejemplo, en Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5ª edición (Lea & Febiger, 1990); Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company, 1995); y en Ranada y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press, 1996).

Como ilustración, las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse como un kit que comprende un recipiente que comprende una molécula que tiene actividad Zace1 o un antagonista de Zace1 (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de Zace1). Pueden proporcionarse polipéptidos terapéuticos en forma de una disolución inyectable para dosis únicas o múltiples, o como un polvo estéril que se reconstituye antes de la inyección. Como alternativa, este kit puede incluir un dispensador de polvo seco, un generador de aerosol líquido o un nebulizador para la administración de un polipéptido terapéutico. Este kit puede comprender, además, información escrita sobre indicaciones y uso de la composición farmacéutica. Además, esta información puede incluir una indicación de que la composición de Zace1 está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida a la Zace1.

14. Usos terapéuticos de las secuencias de nucleótidos de Zace1

La presente invención incluye el uso de secuencias de nucleótidos de Zace1 para proporcionar la Zace1 a un sujeto que necesite dicho tratamiento. Además, puede proporcionarse un vector de expresión terapéutico que inhiba la expresión del gen Zace1, como una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de secuencia guía externa.

Existen numerosos planteamientos para introducir un gen Zace1 en un sujeto, incluyendo el uso de células hospedantes recombinantes que expresan Zace1, el transporte de un ácido nucleico desnudo que codifica la Zace1, el uso de un vehículo de lípidos catiónicos con una molécula de ácido nucleico que codifica la Zace1, y el uso de virus que expresan Zace1, como retrovirus recombinantes, virus adenoasociados recombinantes, adenovirus recombinantes y virus del Herpes simplex recombinantes (véase, por ejemplo, Mulligan, Science, 260:926 (1993); Rosenberg et al., Science, 242:1575 (1988); LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Wolff et al., Science, 247:1465 (1990); Breakfield y Deluca, The New Biologist, 3:203 (1991)). En un planteamiento ex vivo, por ejemplo, las células se aislan a partir de un sujeto, se transfectan con un vector que expresa un gen Zace1, y después se transplantan al sujeto.

Con el fin de efectuar la expresión de un gen Zace1, se construye un vector de expresión en el que una secuencia de nucleótidos que codifica un gen Zace1 está unida operablemente con un promotor de núcleo, y opcionalmente con un elemento regulador, para controlar la transcripción del gen. Los requerimientos generales de un vector de expresión se describieron anteriormente.

Como alternativa, un gen Zace1 puede administrarse utilizando vectores víricos recombinantes, incluyendo, por ejemplo, vectores adenovíricos (por ejemplo, Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498 (1993); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215 (1994); Li et al., Hum. Gene Ther., 4:403 (1993); Vincent et al., Nat. Genet., 5:130 (1993); y Zabner et al., Cell, 75:207 (1993)), vectores víricos asociados a adenovirus (Flotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10613 (1993)), alfavirus como el virus de la selva Semliki y el virus Sindbis (Hertz y Huang, J. Vir., 66:857 (1992); Raju y Huang, J. Vir., 65:2501 (1991); y Xiong et al., Science, 243:1188 (1989)), vectores víricos de Herpes (por ejemplo, patente de EEUU nº 4.769.331, 4.859.587, 5.288.641 y 5.328.688), vectores de parvovirus (Koering et al., Hum. Gene Therapy, 5:457 (1994)), vectores del virus de la viruela (Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 193:653 (1993); Panicali y Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4927 (1982)), poxvirus, como el virus de la viruela de canario o el virus de vaccinia (Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:317 (1989), y Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 569:86 (1989)), y retrovirus (por ejemplo, Baba et al., J. Neurosurg., 79:729 (1993); Ram et al., Cancer Res., 53:83 (1993); Takamiya et al., J. Neurosci. Res., 33:493 (1992); Vile y Hart, Cancer Res., 53:962 (1993); Vile y Hart, Cancer Res., 53:3860 (1993); y Anderson et al., patente de EEUU nº 5.399.346). Dentro de diversas realizaciones, el vector vírico en sí mismo o una partícula vírica que contiene el vector vírico puede utilizarse en los métodos y composiciones descritos a continuación.

Como ilustración de un sistema, el adenovirus, un virus de DNA bicatenario, es un vector de transferencia de genes bien caracterizado para el transporte de una molécula de ácido nucleico heteróloga (para un informe, véase Becker et al., Meth. Cell Biol., 43:161 (1994); Douglas y Curiel, Science & Medicine, 4:44 (1997)). El sistema de adenovirus ofrece diversas ventajas, incluyendo: (i) la capacidad de alojar insertos de DNA relativamente grandes, (ii) la capacidad de cultivarse hasta una valoración alta, (iii) la capacidad para infectar un amplio espectro de tipos celulares de mamíferos, y (iv) la capacidad para ser utilizado con muchos promotores diferentes, incluyendo promotores regulables, específicos de tejidos y ubicuos. Además, los adenovirus pueden administrarse mediante inyección intravenosa, porque los virus son estables en la corriente sanguínea.

Utilizando vectores de adenovirus en los que porciones del genoma del adenovirus están delecionadas, los insertos se incorporan en el DNA vírico mediante acoplamiento directo o mediante recombinación homóloga con un plásmido cotransfectado. En un ejemplo de sistema, el gen E1 esencial se deleciona del vector vírico, y el virus no se replica a menos que la célula hospedante proporcione el gen E1. Cuando se administra por vía intravenosa a animales intactos, el adenovirus se dirige principalmente al hígado. Aunque el sistema de transporte adenovírico con una deleción del gen E1 no puede replicarse en células hospedantes, el tejido del hospedante expresará y procesará una proteína heteróloga codificada. Las células hospedantes también segregan la proteína heteróloga si el gen correspondiente incluye una secuencia señal secretora. Las proteínas segregadas entran en la circulación desde el tejido que expresa el gen heterólogo (por ejemplo, el hígado muy vascularizado).

Además, los vectores adenovíricos que contienen diversas deleciones de genes víricos pueden utilizarse para reducir o eliminar las respuestas inmunológicas al vector. Estos adenovirus tienen E1 delecionado y, además, contienen deleciones de E2A o E4 (Lusky et al., J. Virol., 72:2022 (1998); Raper et al., Human Gene Therapy, 9:671 (1998)). También se ha indicado que la deleción de E2b reduce las respuestas inmunológicas (Amalfitano et al., J. Virol., 72:926 (1998)). Mediante la deleción del genoma completo del adenovirus, pueden introducirse insertos muy grandes de DNA heterólogo. La generación de los llamados adenovirus "débiles", en los que todos los genes víricos están delecionados, resulta particularmente ventajoso para la inserción de grandes insertos de DNA heterólogo (para un informe, véase, Yeh y Perricaudet, FASEB J., 11:615 (1997)).

Pueden obtenerse cepas de mayor valoración de virus recombinantes capaces de expresar un gen terapéutico a partir de células de mamífero infectadas utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, puede prepararse un virus del herpes simplex recombinante en células Vero, como se describe en Brandt et al., J. Gen. Virol., 72:2043 (1991); Herold et al., J. Gen. Virol., 75:1211 (1994); Visalli y Brandt, Virology, 185:419 (1991); Grau et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 30:2474 (1989); Brandt et al., J. Virol. Meth., 36:209 (1992); y Brown y MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Humana Press, 1997).

Como alternativa, un vector de expresión que comprende un gen Zace1 puede introducirse en las células de un sujeto mediante lipofección in vivo utilizando liposomas. Pueden utilizarse lípidos catiónicos sintéticos para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413 (1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8027 (1988)). El uso de la lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. Los liposomas pueden utilizarse para dirigir la transfección a tipos celulares particulares, que es particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, como el páncreas, hígado, riñón y cerebro. Los lípidos puede acoplarse de modo químico a otras moléculas para el transporte dirigido. Pueden acoplarse de modo químico a los liposomas péptidos dirigidos (por ejemplo, hormonas o neurotransmisores), proteínas, como anticuerpos, o moléculas no peptídicas.

La electroporación es otra vía de administración alternativa. Por ejemplo, Aihara y Miyazaki, Nature Biotechnology, 16:867 (1998), han demostrado el uso de la electroporación in vivo para la transferencia de genes al músculo.

En un planteamiento alternativo para la terapia génica, un gen terapéutico puede codificar un RNA antisentido de Zace1 que inhibe la expresión de Zace1. Las secuencias adecuadas para las moléculas antisentido pueden derivarse de las secuencias de nucleótidos de Zace1 descritas en la presente.

Como alternativa, puede construirse un vector de expresión en el que un elemento regulador está unido operablemente con una secuencia de nucleótidos que codifica una ribozima. Las ribozimas pueden diseñarse para expresar actividad endonucleasa, que se dirige a cierta secuencia diana en la molécula de mRNA (véase, por ejemplo, Draper y Macejak, patente de EEUU nº 5.496.698; McSwiggen, patente de EEUU nº 5.525.468; Chowrira y McSwiggen, patente de EEUU nº 5.631.359; y Robertson y Goldberg, patente de EEUU nº 5.225.337). En el contexto de la presente invención, las ribozimas incluyen secuencias de nucleótidos que se unen con el mRNA de Zace1.

En otro planteamiento, pueden construirse vectores de expresión en los que un elemento regulador dirige la producción de transcriptos de RNA capaces de estimular la ruptura mediada por RNasa P de moléculas de mRNA que codifican un gen Zace1. Según este planteamiento, una secuencia guía externa puede construirse para dirigir la ribozima endógena RNasa P a una especie concreta de mRNA intracelular, que posteriormente roto por la ribozima celular (véase, por ejemplo, Altman et al., patente de EEUU nº 5.168.053; Yuan et al., Science, 263:1269 (1994); Pace et al., publicación internacional nº WO 96/18733; George et al., publicación internacional nº WO 96/21731; y Werner et al., publicación internacional nº Wo 97/33991). Preferiblemente, la secuencia guía externa comprende de diez a quince nucleótidos de la secuencia complementarios con el mRNA de Zace1, y una secuencia de nucleótidos 3'-NCCA, en la que N es preferiblemente una purina. Los transcriptos de la secuencia guía externa se unen a la especie de mRNA diana mediante la formación de pares de bases entre el mRNA y las secuencias guía externa complementarias, estimulando, con ello, la ruptura del mRNA por la RNasa P en el nucleótido localizado en el extremo 5' de la región de bases apareadas.

En general, la dosificación de una composición que comprende un vector terapéutico que tiene una secuencia de ácidos de nucleótidos de Zace1, como un virus recombinante, variará dependiendo de factores como la edad, peso, altura, sexo, trastorno médico general e historia médica previa del sujeto. Las vías de administración adecuadas de vectores terapéuticos incluyen la inyección intravenosa, la inyección intraarterial, la inyección intraperitoneal, la inyección intramuscular, la inyección intratumoral, y la inyección a una cavidad que contiene un tumor. Como ilustración, Horton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1553 (1999), demostraron que la inyección intramuscular de DNA de plásmido que codifica interferón-\alpha produce potentes efectos antitumorales sobre tumores primarios y metastáticos en un modelo murino.

Una composición que comprende vectores víricos, vectores no víricos o una combinación de vectores víricos y no víricos de la presente invención puede formularse según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en las que los vectores o virus se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se indicó anteriormente, se dice que una composición, como disolución salina tamponada con fosfato, es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si su administración es tolerada por un sujeto receptor. Otros vehículos adecuados con muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company, 1995); y Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7ª ed. (MacMillan Publishing Co., 1985)).

Para los fines de terapia, un vector de expresión de genes terapéuticos, o un virus recombinante que comprende dicho vector, y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de un vector de expresión (o virus) y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia produce un cambio detectable en la fisiología de un sujeto receptor. Por ejemplo, los síntomas comunes de la enfermedad de Crohn incluyen diarrea crónica con dolor abdominal, fiebre, anorexia, pérdida de peso y una masa derecha-inferior de cuadrante. Un agente utilizado para tratar la enfermedad de Crohn es fisiológicamente significativo si su presencia alivia al menos uno de estos síntomas.

Cuando el sujeto que se trata con un vector de expresión de un gen terapéutico o un virus recombinante es un ser humano, entonces la terapia es preferiblemente una terapia génica de células somáticas. Es decir, el tratamiento preferido de un ser humano con un vector de expresión de un gen terapéutico o un virus recombinante no supone introducir en las células una molécula de ácido nucleico que puede formar parte de una línea germinal humana y ser pasada a sucesivas generaciones (es decir, una terapia génica de línea germinal humana).

15. Producción de ratones transgénicos

Pueden modificarse ratones transgénicos para que sobreexpresen el gen Zace1 en todos los tejidos o bajo el control de un elemento regulador específico de tejidos o preferido por tejidos. Estos sobreproductores de Zace1 pueden utilizarse para caracterizar el fenotipo que resulta de la sobreexpresión, y los animales transgénicos pueden servir de modelos para una enfermedad humana provocada por un exceso de Zace1. Los ratones transgénicos que sobreexpresan la Zace1 también proporcionan modelos biorreactores para la producción de Zace1 en la leche o sangre de animales mayores. Los métodos para producir ratones transgénicos son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", en Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), pp. 111-124 (Academic Press, Ltd., 1994); Monastersky y Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press, 1995); y Abbud y Nilson, "Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice", en Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernández y Hoeffler (eds.), pp. 367-397 (Academic Press, Inc., 1999)).

Por ejemplo, un método para producir un ratón transgénico que expresa un gen Zace1 puede empezar con machos fértiles adultos (sementales) (B6C3f1, 2-8 meses (Taconic Farms, Germantown, NY)), machos vasectomizados (inútiles) (B6D2f1, 2-8 meses (Taconic Farms)), hembras fértiles prepúberes (donantes) (B6C3f1, 4-5 semanas (Taconic Farms)), y hembras fértiles adultas (receptoras) (B6D2f1, 2-4 meses (Taconic Farms)). Las donantes se aclimatan durante una semana y después se inyectan con aproximadamente 8 IU/ratón de gonadotrofina de suero de yegua preñada (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) por vía intraperitoneal, y 46-47 horas después se inyectan 8 IU/ratón de gonadotropina coriónica humana (hCG (Sigma)) por vía intraperitoneal para inducir la superovulación. Las donantes se cruzan con los sementales después de las inyecciones de hormonas. La ovulación se produce, en general, a las 13 horas de la inyección de hCG. La copulación se confirma por la presencia de un tapón vaginal a la mañana siguiente del acoplamiento.

Los huevos fertilizados se recogen bajo un ámbito quirúrgico. Los oviductos se recogen y los huevos se liberan en placas de análisis de orina que contienen hialuronidasa (Sigma). Los huevos se lavan una vez con hialuronidasa, y dos veces en medio W640 de Whitten (descrito, por ejemplo, en Menino y O'Claray, Biol. Reprod., 77:159 (1986); y Dienhart y Downs, Zygote, 4:129 (1996)), que se ha incubado con CO_{2} al 5%, O_{2} al 5% y N_{2} al 90% a 37ºC. Los huevos entonces se conservan en un incubador a 37ºC/CO_{2} al 5% hasta la microinyección.

Se linealizan de diez a veinte microgramos de DNA del plásmido que contiene una secuencia codificadora de Zace1, se purifican en gel y se resuspenden en Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 0,25 mM (pH 8,0), a una concentración final de 5-10 nanogramos por microlitro para la microinyección. Por ejemplo, las secuencias que codifican Zace1 pueden codificar un polipéptido que comprende los restos aminoácidos de la SEQ ID NO:1, o un fragmento de ésta.

El DNA del plásmido se microinyecta en los huevos recogidos contenidos en una gota de medio W640 cubierto con aceite mineral equilibrado para CO_{2} tibio. El DNA se introduce en una aguja de inyección (extraído de un capilar de vidrio de borosilicato de DI 0,75 mm y DE 1 mm) y se inyecta en huevos individuales. Cada huevo se penetra con la aguja de inyección en uno o ambos pronúcleos haploides.

Se inyectan picolitros de DNA en los pronúcleos, y la aguja de inyección se retira sin que se ponga en contacto con los nucleolos. El procedimiento se repite hasta que se inyectan todos los núcleos. Los huevos microinyectados con éxito se trasladan a una placa de cultivo de tejidos de órganos con medio W640 pregasificado para su conservación durante la noche en un incubador a 37ºC/CO_{2} al 5%.

Al día siguiente, los embriones de dos células se trasladan a las receptoras seudopreñadas. Las receptoras se identifican mediante la presencia de tapones de copulación, después de copular con los inútiles vasectomizados. Las receptoras se anestesian, se afeita el flanco izquierdo dorsal y se trasladan a un microscopio quirúrgico. Se realiza una pequeña incisión en la piel y a través de la pared muscular en mitad del área abdominal delimitada por la caja torácica, los cuartos traseros y la pata trasera, a mitad de camino entre la rodilla y el bazo. Los órganos reproductores se exteriorizan sobre un pequeño trapo quirúrgico. La almohadilla de grasa se estira sobre el trapo quirúrgico y se unen unas pinzas para comprimir los vasos para bebés (Roboz, Rockville, MD) a la almohadilla de grasa y se dejan colgando sobre la espalda del ratón, evitando que los órganos vuelvan a introducirse.

Con una pipeta de transferencia fina que contiene aceite mineral seguido de W640 y burbujas de aire alternantes, se trasladan 12-17 embriones de dos células sanos de la inyección del día anterior a la receptora. Se localiza la ampolla hinchada y, tomando el oviducto entre la ampolla y la bolsa, se realiza una muesca en el oviducto con una aguja de 28 g cerca de la bolsa, teniendo cuidado para no rasgar la ampolla ni la bolsa.

La pipeta se introduce en la muesca del oviducto, y los embriones se expulsan, dejando que la primera burbuja de aire escape de la pipeta. La almohadilla de grasa se empuja con cuidado hacia el interior del peritoneo, y se deja que los órganos reproductores se introduzcan en el interior. La pared peritoneal se cierra con una sutura y la piel se cierra con una grapa para heridas. Los ratones se recuperan en un calentador deslizante a 37ºC durante un mínimo de cuatro horas.

Las receptoras se vuelven a introducir en las jaulas por parejas y se permite una gestación de 19-21 días. Después del nacimiento, se deja un periodo de posparto de 19-21 días antes del destete. Se determina el sexo de los animales destetados y se colocan en jaulas según su sexo, y se corta una biopsia de 0,5 cm (utilizada para determinar el genotipo) de la cola con una tijeras limpias.

Se prepara el DNA genómico a partir de los cortes de la cola utilizando, por ejemplo, un kit QIAGEN DNEASY siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA genómico se analiza mediante PCR utilizando cebadores diseñados para amplificar un gen Zace1 o un gen marcador seleccionable que se introdujo en el mismo plásmido. Después de confirmar que los animales son transgénicos, se retrocruzan para producir una raza endogámica colocando una hembra transgénica con un macho de tipo salvaje, o un macho transgénico con una o dos hembras de tipo salvaje. A medida que los cachorros nacen y se destetan, se separan los sexos y se cortan las colas para determinar el genotipo.

Para comprobar la expresión de un transgén en un animal vivo se realiza una hepatectomía parcial. Se realiza una preparación quirúrgica del abdomen superior directamente por debajo del proceso cifoide. Utilizando una técnica estéril se realiza una pequeña incisión de 1,5-2 cm por debajo del esternón y se exterioriza el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Utilizando seda 4-0, se realiza un nudo alrededor del lóbulo inferior asegurándolo fuera de la cavidad corporal. Se emplean unas pinzas atraumáticas para sujetar el nudo mientras se coloca un segundo lazo de Dexon absorbible (American Cyanamid, Wayne, NJ) de forma proximal al primer nudo. Se realiza un corte distal desde el nudo Dexon y se colocan aproximadamente 100 mg de tejido de hígado excisionado en una placa Petri estéril. La sección de hígado excisionado se traslada a un tubo de fondo redondo de polipropileno de 14 ml y se congela en el acto en nitrógeno líquido y después se conserva en hielo seco. El sitio quirúrgico se cierra con una sutura y grapas para heridas, y la jaula del animal se coloca en una almohadilla de calentamiento a 37ºC durante 24 horas de modo posoperatorio. El animal se inspecciona a diario de modo posoperatorio y las grapas para heridas se retiran 7-10 días después de la cirugía. El nivel de expresión de mRNA de Zace1 se estudia para cada ratón transgénico utilizando un ensayo de hibridación de disolución de RNA o una reacción en cadena de polimerasa.

Además de producir ratones transgénicos que sobreexpresan Zace1, resulta útil modificar ratones transgénicos para que presenten una expresión anormalmente baja del gen o no expresen el gen. Estos ratones transgénicos proporcionan modelos útiles para enfermedades asociadas a una falta de Zace1. Como se analizó anteriormente, la expresión del gen Zace1 puede inhibirse utilizando genes antisentido, genes de ribozimas, o genes de secuencia guía externa. Para producir ratones transgénicos que infraexpresen el gen Zace1, estas secuencias inhibidoras se dirigen al mRNA de Zace1. Los métodos para producir ratones transgénicos que tienen una expresión anormalmente baja de un gen concreto son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Wu et al., "Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies", en Methods in Gene Biotechnology, pp. 205-224 (CRC Press, 1997)).

Un planteamiento alternativo para producir ratones transgénicos que tienen poca o ninguna expresión del gen Zace1 es generar ratones que tienen al menos un alelo Zace1 normal sustituido por un gen Zace1 no funcional. Un método para diseñar un gen Zace1 no funcional es insertar otro gen, como un gen marcador seleccionable, dentro de una molécula de ácido nucleico que codifica Zace1. Los métodos convencionales para producir los denominados "ratones eliminados" son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", en Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), pp. 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994); y Wu et al., "New Strategies for Gene Knockout", en Methods in Gene Biotechnology, pp. 339-365 (CRC Press, 1997)).

<110> ZymoGenetics, Inc.

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<120> Zace1: una metaloenzima humana

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<130> 98-79PC

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<160> 3

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<170> FastSEQ para Windows versión 3.0

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<210> 1

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<211> 694

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

7

8

9

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<210> 2

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<211> 2082

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Esta secuencia degenerada codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

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<221> variación

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<222> (1)...(2082)

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<223> N es cualquier nucleótido

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<400> 2

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10

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<210> 3

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Conector peptídico

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<400> 3

11

Claims (22)

1. Un polipéptido aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a) los restos aminoácidos de 367 a 430 de la SEQ ID NO:1,

(b) los restos aminoácidos de 163 a 563 de la SEQ ID NO:1,

(c) los restos aminoácidos de 52 a 563 de la SEQ ID NO:1,

(d) los restos aminoácidos de 52 a 644 de la SEQ ID NO:1,

(e) los restos aminoácidos de 52 a 648 de la SEQ ID NO:1,

(f) los restos aminoácidos de 52 a 655 de la SEQ ID NO:1,

(g) los restos aminoácidos de 52 a 662 de la SEQ ID NO:1,

(h) los restos aminoácidos de 52 a 682 de la SEQ ID NO:1,

(i) los restos aminoácidos de 52 a 694 de la SEQ ID NO:1, y

(j) los restos aminoácidos de 1 a 694 de la SEQ ID NO:1,

en el que el polipéptido aislado (a) se une de modo específico con un anticuerpo que se une de modo específico con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, o (b) muestra actividad dipeptidil-carboxipeptidasa.

2. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en el que el polipéptido aislado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia.

3. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en el que el polipéptido aislado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia.

4. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en el que el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) los restos aminoácidos de 367 a 430 de la SEQ ID NO:1, (b) los restos aminoácidos de 163 a 563 de la SEQ ID NO:1, (c) los restos aminoácidos de 52 a 563 de la SEQ ID NO:1, (d) los restos aminoácidos de 52 a 644 de la SEQ ID NO:1, (e) los restos aminoácidos de 52 a 648 de la SEQ ID NO:1, (f) los restos aminoácidos de 52 a 655 de la SEQ ID NO:1, (g) los restos aminoácidos de 52 a 662 de la SEQ ID NO:1, (h) los restos aminoácidos de 52 a 682 de la SEQ ID NO:1, (i) los restos aminoácidos de 52 a 694 de la SEQ ID NO:1, y (j) los restos aminoácidos de 1 a 694 de la SEQ ID NO:1.

5. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en el que el polipéptido es una metalopeptidasa.

6. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende el motivo "X_{1}-X_{2}-X_{3}-H-E-X_{4}-X_{5}-H-X_{6}-X_{7}", en el que

X_{1} se selecciona de G, S, T, A, L, I, V y N,

X_{2}, X_{3} y X_{4} son cualquier resto aminoácido,

X_{4} se selecciona de L, I, V, M, F, Y e W,

X_{5} es cualquier resto aminoácido excepto D, E, H, R, K o P, y

X_{7} se selecciona de L, I, V, M, F, Y, W, G, S, P y Q.

7. El polipéptido aislado de la reivindicación 6, en el que el polipéptido comprende los restos aminoácidos de 395 a 404 de la SEQ ID NO:1.

8. Un polipéptido aislado, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido comparte una coincidencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 seleccionada del grupo que consiste en una coincidencia de al menos 70%, una coincidencia de al menos 80%, una coincidencia de al menos 90%, una coincidencia de al menos 95%, o una coincidencia mayor que 95%, y en el que cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 es debida a una o más sustituciones de aminoácidos conservativas.

9. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

10. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) los restos aminoácidos de 367 a 430 de la SEQ ID NO:1, (b) los restos aminoácidos de 163 a 563 de la SEQ ID NO:1, (c) los restos aminoácidos de 52 a 563 de la SEQ ID NO:1, (d) los restos aminoácidos de 52 a 644 de la SEQ ID NO:1, (e) los restos aminoácidos de 52 a 648 de la SEQ ID NO:1, (f) los restos aminoácidos de 52 a 655 de la SEQ ID NO:1, (g) los restos aminoácidos de 52 a 662 de la SEQ ID NO:1, (h) los restos aminoácidos de 52 a 682 de la SEQ ID NO:1, (i) los restos aminoácidos de 52 a 694 de la SEQ ID NO:1, y (j) los restos aminoácidos de 1 a 694 de la SEQ ID NO:1.

11. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 10, en la que la molécula de ácido nucleico codifica los restos aminoácidos de 1 a 694 de la SEQ ID NO:1.

12. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 11.

13. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 11, un promotor de la transcripción, y un terminador de la transcripción, en el que el promotor está unido operablemente con la molécula del ácido nucleico, y en el que la molécula del ácido nucleico está unida operablemente con el terminador de la transcripción.

14. Una célula hospedante recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 13, en la que la célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en bacterias, células de levadura, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero y células vegetales.

15. Un método para utilizar el vector de expresión de la reivindicación 13 para preparar un polipéptido que comprende los restos aminoácidos de 1 a 694 de la SEQ ID NO:1, que comprende cultivar células hospedantes recombinantes que comprenden el vector de expresión y que producen el polipéptido.

16. El método de la reivindicación 15, que comprende además aislar el polipéptido de las células hospedantes recombinantes cultivadas.

17. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une de modo específico con el polipéptido de la reivindicación 4.

18. Un método para detectar en una muestra biológica la presencia de un polipéptido que comprende los restos aminoácidos de 1 a 694 de la SEQ ID NO:1, que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de la reivindicación 17, en el que el contacto se realiza bajo condiciones que permiten la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a la muestra biológica, y (b) detectar cualquiera del anticuerpo unido o fragmento de anticuerpo unido.

19. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la reivindicación 4.

20. Un anticuerpo antiidiotipo, o un fragmento de anticuerpo antiidiotipo, que se une de modo específico con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 17.

21. El anticuerpo antiidiotipo, o un fragmento de anticuerpo antiidiotipo de la reivindicación 20, en el que el anticuerpo antiidiotipo, o el fragmento de anticuerpo antiidiotipo, posee actividad dipeptidil-carboxipeptidasa.

22. Un polipéptido aislado que comprende al menos 15 restos aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, en el que el polipéptido (a) se une de modo específico con un anticuerpo que se une de modo específico con un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, o (b) muestra actividad dipeptidil-carboxipeptidasa.