ES2218693T3 - Proteina leptina porcina, secuencias de acido nucleico que la codifican y sus usos. - Google Patents
Proteina leptina porcina, secuencias de acido nucleico que la codifican y sus usos.Info
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Abstract
Polipéptido porcino con carácter específicamente adiposito, designado con el nombre de leptina y que se expresa en el tejido graso de cerdo. La expresión puede modificarse en cerdos obesos, o la expresión puede efectuarse en forma de una proteína de menor actividad biológica en cerdos más delgados. La invención describe el polipéptido porcino adiposito, las moléculas de ADN y ARN que codifican dicho polipéptido, sus procedimientos de preparación y sus anticuerpos específicos de polipéptido. También se describen, los procedimientos para determinar las tendencias de un cerdo a la obesidad a partir de las mediciones de los niveles del polipéptido adiposito en un fluido biológico o un extracto de tejido o por las mediciones del ARNm que codifica el polipéptido adiposito porcino en células del sujeto. Los procedimientos de evaluación de un agente relativo a la deposición de grasa en cerdos consisten en poner en contacto el agente con un adiposito in vitro y medir la cantidad del polipéptido adiposito porcino o ARNm producid por el adiposito. Los procedimientos de limitación de la deposición de grasa consisten en administrar leptina porcina o ADN de leptina porcina, y los procedimientos de regulación de la ingestión consisten en administrar leptina porcina o ADN de leptina porcina, o un anticuerpo dirigido contra la leptina porcina.
Description
Proteína leptina porcina, secuencias de ácido
nucleico que la codifican y sus usos.
Esta invención se refiere a un polipéptido de
porcino llamado leptina que se secreta por adipocitos o por otro
tipo de células y que tiene influencia sobre la ingesta y el
metabolismo energético, la deposición de grasa, y la ganancia de
peso en suidos. Además, esta invención se refiere a las secuencias
de nucleótidos que codifican el polipéptido leptina de porcino y a
los anticuerpos dirigidos contra el polipéptido leptina de
porcino.
El National Institutes of Health ha declarado la
obesidad un problema de salud pública y ha incitado a la industria
de alimentación animal a buscar métodos para evitar la deposición
de grasa de alimentos de animales. Además, el coste energético de
tener alimentos de animales convirtiendo energía alimentaria en
grasa en vez de en tejido magro proporciona un incentivo
considerable para desarrollar tecnología para facilitar la
producción eficaz de productos de carne magra y para ajustar con
exactitud el contenido de nutrientes de la dieta a las necesidades
de nutrientes del animal. Para combatir estos problemas de salud y
producción, son necesarios enfoques tanto profilácticos como
terapéuticos. En cuanto a los propósitos profilácticos sería útil
ser capaces de predecir y medir la propensión o susceptibilidad a la
excesiva deposición de grasa. En cuanto a los propósitos
terapéuticos, sería de gran beneficio meejorar los métodos actuales
de minimizar la deposición de energía alimentaria como grasa en el
adipocito. Hoy en día, no se han conseguido completamente ninguno de
estos objetivos deseados.
Las proteínas de genes que sólo se expresan (o
predominantemente) en tejido adiposo y por tanto el nivel de
expresión se puede relacionar con deposición de grasa, son el
principal objetivo de enfoques dirigidos hacia la predicción del
potencial del crecimiento de grasa y el control de la deposición de
grasa. Por ejemplo, un polipéptido adipocito específico de
mamífero, llamado p154, fue informado en la patente USP 5.268.295
de Serrero, que se incorpora en la presente patente únicamente como
referencia, como estar expresado en altas cantidades en líneas de
células adipogénicas tras la diferenciación celular y abunda en
patas grasas de ratones normales y genéticamente obesos. A día de
hoy, sin embargo, no se ha informado de proteínas adipocitas
específicas expresadas en diferentes niveles en suidos grasos
comparado con controles normales.
La leptina, la proteína producida por el gen de
la leptina (ob), posiblemente se relaciona con deposición de
grasa en suidos porque las investigaciones muestran que mutaciones
en ratones genéticamente obesos (ob/ob) que resultan en
excesiva deposición de grasa se asocian con expresiones alteradas
del gen de la leptina. Además, se ha identificado al menos un
polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y se
ha relacionado con el fenotipo graso (Zhang et al., 1994,
Nature 371:425). El gen de la leptina se expresa específicamente en
el adipocito terminalmente diferenciado (Maffei et al.,
1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92:6957; Leroy et al., 1996, J.
Biol.. Chem. 271(5):2365). Además, la leptina es un
regulador de la ingesta de alimento (Pellymounter et al.,
1995, Sci. 269:540; Halaas et al., 1995, Sci. 269:543;
Campfield et al., 1995, Sci. 269:546).
Aunque el gen de la leptina murina se ha clonado
posicionalmente y se ha informado de una secuencia de ADNc (Nature
371:425), no se dispone ni del ADNc ni del genoma de la leptina de
porcino. De este modo, el entendimiento obtenido con respecto al
metabolismo porcino no es accesible al sistema porcino. Además, no
se ha obtenido la proteína de porcino purificada biológicamente
activa (es decir, leptina).
La presente invención proporciona secuencias de
genes, péptidos y anticuerpos que permiten la predicción y
modulación de la deposición de grasa y la regulación de la ingesta
de alimento (es decir, apetito) en especies de porcino.
En un aspecto, esta invención se dirige a un
polipéptido secretado por adipositos porcinos, la proteína leptina
de porcino, sustancialmente libre de otras proteínas de porcino, o
sus derivados funcionales. La presente invención incluye un
polipéptido secretado por adipocitos porcinos de al menos
aproximadamente 8 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
representada en la Figura 1, preferentemente la secuencia de
aminoácidos representada en la Figura 2, aún más preferentemente,
la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 3, o sus
derivados funcionales.
La presente invención también se dirige a una
molécula de ADN de cadena sencilla o doble o una molécula de ARN que
consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos que codifica
el polipéptido antes referenciado o sus derivados funcionales,
estando la molécula de ADN o ARN sustancialmente libre de otras
secuencias de ADN o ARN porcino. La molécula de ADN es
preferentemente una molécula de ADN de cadena sencilla o doble que
tiene una secuencia de nucleótidos que consiste esencialmente en al
menos aproximadamente 20 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos
representada en la Figura 1, preferentemente, la secuencia de
nucleótidos representada en la Figura 2, aún más preferentemente la
secuencia de nucleótidos representada en la Figura 3 o una
secuencia complementaria de las secuencias de nucleótidos
representadas en las Figuras 1-3, sustancialmente
libre de otras secuencias de ADN porcino. La molécula de ARN es
preferentemente una secuencia ARNm que codifica el polipéptido
secretado por adipocitos porcinos, o sus derivados funcionales.
En la invención se incluye una molécula de ADN
como se describió anteriormente que es ADNc o ADN genómico,
preferentemente en la forma de un vehículo o plásmido de
expresión.
La presente invención también se dirige
anfitriones transformados o transfectados con las moléculas de ADN
anteriores, incluyendo un anfitrión procariota, preferentemente una
bacteria, anfitrión eucariota tal como una célula de levadura, o
una célula de mamífero.
Otra realización de esta invención es un
anticuerpo específico para un epitope del polipéptido secretado por
adipocitos porcinos, o sus derivados funcionales, tanto
policlónicos como monoclónicos.
Figura 1 representa la secuencia de nucleótidos
(SEC ID Nº1) del gen de la leptina de porcino y la traducción de
aminoácidos de las secuencias de códigos de la leptina de
porcino.
Figura 2 representa la secuencia de nucleótidos y
la traducción de aminoácidos (SEC ID Nº 2) de la región de código
del ADNc de la leptina completa de porcino (es decir, péptido señal
y proteína secretada).
Figura 3 representa la secuencia de nucleótidos
(SEC ID Nº 3) y la traducción de aminoácidos (SEC ID Nº 4) del ADNc
de la leptina de porcino que corresponde a la proteína leptina de
porcino secretada.
Figura 4 muestra una comparación de la secuencia
del ADNc de la leptina de porcino que corresponde a la proteína
leptina de porcino completa con la murina (SEC ID Nº 6) y
secuencias humanas (SEC ID Nº 5).
Figura 5 representa el análisis de Northern blot
del ARNm de leptina de porcino.
Figura 6 representa el aislamiento de un clon de
ADN genómico para leptina de porcino.
Figura 7 representa una electroforesis de gel
poliacrilamida de inducción y purificación en Escherichia
coli de proteína leptina de porcino.
La presente invención está dirigida a moléculas
de ADN y ARN que codifican un polipéptido secretado por adipocitos
porcinos, llamado "leptina", o sus derivados funcionales, y la
propia proteína leptina de porcino, o sus derivados funcionales. La
proteína leptina de porcino es útil para regular la ingestión de
alimento, el metabolismo energético, y la deposición de grasa en
suidos. Tales objetivos se pueden lograr administrando leptina de
porcino recombinada o purificada, alterando la expresión del gen de
la leptina de porcino o administrando un anticuerpo dirigido contra
la proteína leptina de porcino para lograr neutralización,
dependiendo del resultado deseado. El ADN, ARN, y la proteína
leptina de porcino, o sus derivados funcionales, y anticuerpos
específicos para la proteína se usan en ensayos para predecir el
potencial de deposición de grasa en suidos. Estas moléculas también
se pueden usar en el desarrollo de tecnología con valor comercial
para alterar la ingesta de alimento y regular la deposición de
grasa en suidos, y para ajustar el contenido nutritivo de la dieta
a las necesidades nutritivas del cerdo.
En su primer aspecto, la presente invención
proporciona un polipéptido secretado por adipocitos de porcinos
llamado "leptina". El término "polipéptido" como se usa
en la presente memoria pretende incluir no sólo la proteína leptina
de porcino, y sus derivados funcionales, sino también secuencias de
aminoácidos que tienen componentes adicionales, es decir,
secuencias de aminoácidos que tienen componentes adicionales tales
como un azúcar, como en un glicopéptido, u otras estructuras
proteicas modificadas conocidas en la técnica.
El polipéptido de esta invención tiene una
secuencia de aminoácidos como la representada en las Figuras 1 y 2,
y preferentemente como la representada en la Figura 3. También está
relacionado con el ámbito de la presente invención cualquier
péptido que tiene al menos aproximadamente 8 aminoácidos presentes
en la secuencia antes mencionada. Las secuencias de esta longitud
son útiles como antigénicos o para hacer conjugados inmunogénicos
con portadores para la producción de anticuerpos específicos para
varios epitopes de la proteína completa. Tales péptidos también son
útiles en la revisión de tales anticuerpos y en los métodos de la
presente invención dirigidos a detectar la proteína leptina en
muestras biológicas. Es bien conocido en la técnica que los péptidos
de aproximadamente 8 aminoácidos son útiles en la generación de
anticuerpos de proteínas más grandes de interés biológico.
El polipéptido de esta invención es
suficientemente grande para incluir un determinante antigénicamente
definido, o epitope, que se puede usar como un inmunogen para
producir anticuerpos contra la leptina de porcino o un derivado
funcional, y para probar tales anticuerpos. El polipéptido de esta
invención también puede existir unido covalentemente o no
covalentemente a otra molécula. Por ejemplo puede fusionarse (es
decir, una proteína de fusión) a uno o más polipétidos vía uno o
más enlaces peptídicos.
Una realización incluye el polipéptido
sustancialmente libre de otros péptidos de porcino. El polipéptido
de la presente invención puede purificarse bioquímicamente o
inmunoquímicamente a partir de células, tejidos, o un fluido
biológico. Alternativamente, el polipéptido se puede producir por
medio recombinante en una célula anfitriona procariota o
eucariota.
La expresión "sustancialmente libre de otros
polipéptidos de porcino" refleja el hecho que porque el gen del
polipéptido secretado por adipocitos porcinos de interés puede
clonarse, el polipéptido puede expresarse en un organismo
procariota o eucariota, si se desea. También son bien conocidos los
métodos para la síntesis de polipéptidos con la secuencia deseada
en soportes de fase sólida y su posterior separación del soporte.
Alternativamente, la proteína puede purificarse a partir de tejidos
o fluidos de suidos en los que está de manera natural por lo que se
extrae purificada a al menos 90 por ciento (basado en peso), e
incluso desde al menos 99 por ciento si se desea, de otros
polipéptidos de porcino y por lo tanto está sustancialmente libre
de ellos. Esto puede lograrse sometiendo el tejido o fluidos a
técnicas normales de purificación de proteína tal como columnas
inmunoadsorbentes que tienen anticuerpos monoclonales que
reaccionan contra la proteína. Alternativamente, la purificación a
partir de tales tejidos o fluidos puede lograrse por una
combinación de métodos normales, tales como precipitación con
sulfato amónico, cromatografía de exclusión molecular, y
cromatografía de intercambio iónico.
Como alternativas a una molécula de polipéptido
secretado por adipocitos porcinos nativa purificada o recombinada,
se pueden usar derivados funcionales de polipéptido secretado por
adipocitos porcinos. Como se usa en la presente memoria, el término
"derivado funcional" se refiere a cualquier "fragmento",
"variante", "análogo", o "derivado químico" del
polipéptido secretado por adipocitos porcinos que contiene al menos
una porción de la función del polipéptido secretado por adipocitos
porcinos que permite ser utilizado según la presente invención.
Un "fragmento" del polipéptido secretado por
adipocitos porcinos como se usa en la presente memoria se refiere a
cualquier fracción de la molécula, esto es, un péptido más
corto.
Una "variante" del polipéptido secretado por
adipocitos porcinos como se usa en la presente memoria se refiere a
una molécula sustancialmente similar a, o bien al péptido completo
o a un fragmento. Las variantes de péptidos pueden prepararse
convencionalmente por síntesis química directa de la variante del
péptido, usando métodos bien conocidos en la técnica.
Alternativamente, se pueden preparar variantes de secuencias de
aminoácidos del péptido por mutación en el ADN que codifica el
péptido sintetizado (usando de nuevo métodos bien conocidos en la
técnica). Tales variantes incluyen, por ejemplo, supresiones, o
inserciones o sustituciones, de restos de la secuencia de
aminoácidos. También se puede hacer cualquier combinación de
supresión, inserción, y sustitución para llegar al producto final,
siempre que el producto final posea la actividad deseada.
Obviamente, las mutaciones que se harán en el ADN que codifica la
variante del péptido no deben alterar el marco de lectura y
preferentemente no crearán regiones complementarias que pueden
producir estructuras de ARNm secundarias.
Un "análogo" del polipéptido secretado por
adipositos porcinos como se usa en la presente memoria se refiere a
una molécula no natural sustancialmente similar a, o bien la
molécula completa o a un fragmento.
Un "derivado químico" del polipéptido o
péptido secretado por adipocitos porcinos como se usa en la
presente memoria contiene medias químicas adicionales que
normalmente no son una parte del polipéptido. Se incluyen
modificaciones covalentes en el ámbito de esta invención. Tales
modificaciones pueden introducirse en la molécula haciendo
reaccionar restos de aminoácidos objetivo con un agente de
derivación orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas
laterales seleccionadas o los restos terminales.
El polipéptido de la presente invención está
codificado por una molécula de ácido nucleico, una cadena que tiene
la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1,
preferentemente como la mostrada en la Figura 2, y aún más
preferentemente como la mostrada en la Figura 3. La presente
invención se dirige a una secuencia de ADN que codifica el
polipéptido, o un derivado funcional, sustancialmente libre de
otras secuencias de ADN de porcino. Tal ADN puede ser de cadena
simple (es decir, cadena codificante, cadena no codificante o
secuencia de ADNc) o cadena doble. La secuencia de ADN debería tener
aproximadamente 20 o más nucleótidos para permitir hibridación a
otro polinucleótido. Para lograr mayor especificidad de hibridación,
caracterizado por la ausencia de hibridación a secuencias distintas
de las que codifican el polipéptido o un derivado funcional, se
prefiere una longitud de al menos aproximadamente 50
nucleótidos.
La presente invención también se dirige a una
molécula de ARN que comprende una secuencia de ARNm que codifica el
polipéptido de esta invención, o un derivado funcional.
La presente invención se dirige además a las
moléculas de ADN anteriores que son funcionales en sistemas de
expresión recombinante utilizados como anfitriones transfectados o
transformados con los vehículos y son capaces de expresar el
polipéptido. Tales anfitriones pueden ser procariotas o eucariotas.
El ADN se puede incorporar en el organismo anfitrión por
transformación, transducción, transfección, o un proceso
relacionado conocido en la técnica.
Además de una secuencia de ADN y ARNm que
codifica la molécula de polipéptido secretado por adipocitos
porcinos, se proporcionan métodos de expresión de las secuencias de
ácido nucleico. Además, las secuencias genéticas y los
oligonucleótidos de la invención permiten la identificación y
clonación de polipéptidos adipocitos adicionales, aún sin
descubrir, que tienen una secuencia homóloga a la del polipéptido
adipocito descrito en la presente memoria.
Las moléculas de ADN recombinante de la presente
invención se pueden producir a través de cualquiera de una variedad
de medios, tales como, por ejemplo, síntesis de ADN o ARN, o más
preferentemente, por aplicación de técnicas de ADN recombinante.
Las técnicas para sintetizar tales moléculas se describen en, por
ejemplo, Wu, R.,
et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978), que se incorpora en la presente memoria como referencia. Los procedimientos para formar moléculas recombinantes según los métodos antes descritos se describen en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), que se incorpora en la presente memoria como referencia.
et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978), que se incorpora en la presente memoria como referencia. Los procedimientos para formar moléculas recombinantes según los métodos antes descritos se describen en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), que se incorpora en la presente memoria como referencia.
Los oligonucleótidos que representan una porción
del polipéptido secretado por adipocitos porcinos son útiles para
revisar la presencia de genes que codifican tales proteínas y para
clonar genes del polipéptido secretado por adipocitos porcinos. Las
técnicas para sintetizar tales oligonucleótidos se describen en,
por ejemplo, Wu. R., et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec.
Biol. 21:101-141 (1978).
Un oligonucleótido apropiado, o grupo de
oligonucleótidos, que es capaz de codificar un fragmento del gen
del polipéptido secretado por adipocitos porcinos (o que es
complementario a tal oligonucleótido, o grupo de oligonucleótidos)
se identifica, sintetiza, y se producen híbridos mediante métodos
bien conocidos en la técnica, contra un ADN o, más preferentemente,
una preparación de ADNc que se produce a partir de células con la
capacidad de expresar el gen del polipéptido secretado por
adipocitos porcinos. Las moléculas de oligonucleótidos de cadena
simple complementarias a la secuencia "más probable" que
codifica el polipéptido secretado por adipocitos porcinos pueden
sintetizarse usando procedimientos que son bien conocidos por los
expertos normales en la técnica (véase por ejemplo, USP 5.268.295).
Además, puede lograrse la síntesis de ADN a través del uso de
sintetizadores automáticos. Las técnicas de hibridación de ácido
nucleico se describen en Sambrook et al. (supra).
En un modo alternativo de clonar el gen del
polipéptido secretado por adipocitos porcinos, se prepara una
librería de vectores de expresión clonando ADN o, más
preferentemente, ADNc (a partir de una célula con capacidad de
expresar el polipéptido secretado por adipocitos porcinos) en un
vector de expresión. Después la librería se revisa para encontrar
miembros con capacidad de expresar una proteína que se una al
anticuerpo del polipéptido antiadipocitos porcinos, y que tiene una
secuencia de nucleótidos con capacidad para codificar polipéptidos
que tienen la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido
secretado por adipocitos porcinos, o sus fragmentos. En esta
realización, el ADN, o más preferentemente ADNc, se extrae y
purifica a partir de una célula con capacidad de expresar la
proteína polipéptido secretado por adipocitos porcinos. El ADNc
purificado se fragmenta (por cizallamiento, digestión endonucleasa,
etc.) para producir un fondo de fragmentos de ADN o ADNc. Después
los fragmentos de ADN o ADNc de este fondo se clonan en vectores de
expresión para producir una librería genómica de vectores de
expresión cuyos miembros contienen cada uno un único fragmento
clonado de ADN o ADNc.
Un "vector de expresión" es un vector que
(debido a la presencia de secuencias control de transcripción y/o
traducción apropiada) es capaz de expresar una molécula de ADN (o
ADNc) que se ha clonado en un vector y de ese modo produce un
polipéptido o proteína. Los vectores de expresión de la presente
invención pueden ser tanto procariotas como eucariotas. Ejemplos de
vectores de expresión procariotas adecuados incluyen pASK75
(Biometra) o pET
21a-d (Novagen). Ejemplos de vectores de expresión eucariotas adecuados incluyen pcDNA3 o pRc/RSV (In Vitrogen, Inc.).
21a-d (Novagen). Ejemplos de vectores de expresión eucariotas adecuados incluyen pcDNA3 o pRc/RSV (In Vitrogen, Inc.).
Una secuencia de ADN que codifica el polipéptido
secretado por adipocitos porcinos de la presente invención, o sus
derivados funcionales, se puede recombinar con el vector ADN de
acuerdo con las técnicas convencionales tales como las descritas
por Sambrook, et al. (supra).
Una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, se
dice que es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene
secuencias de nucleótidos que contienen información reguladora por
transcripción y traducción y tales secuencias están "unidas
operativamente" a secuencias de nucleótidos que codifican el
polipéptido. Una unión operativa es una unión en la que las
secuencias reguladoras de ADN y la secuencia de ADN deberían
expresarse y conectarse de tal modo que permitan la expresión del
gen.
La naturaleza exacta de las regiones reguladoras
que necesitan expresión génica pueden variar de un organismo a otro,
pero en general incluyen una región promotora que, en procariotas,
contiene tanto el promotor (que dirige la iniciación de la
transcripción del ARN) como las secuencias de ADN que, cuando se
transcriben a ARN, indicarán el inicio de la síntesis proteica. Un
promotor es una molécula de ADN o ARN de cadena doble que es capaz
de unirse a ARN polimerasa y promover la transcripción de la
secuencia de ácido nucleico "unido operativamente". Las
secuencias promotoras de la presente invención pueden ser tanto
procariotas, como eucariotas, o virus. Sin embargo, se prefieren
promotores fuertes. Los promotores adecuados son represibles, y más
preferentemente, constitutivos. Ejemplos de promotores eucariotas
adecuados incluyen la tetraciclina (TetA) promotor de pASK75 y
T7lac de pET21. Ejemplos de promotores eucariotas adecuados
incluyen alfa actina o beta actina. Ejemplos de promotores víricos
adecuados incluyen sarcoma de Rous o citomegalovirus.
También se proporciona un anticuerpo específico
para un epitope del polipéptido secretado por adipocitos porcinos, y
el uso de tal anticuerpo para detectar la presencia de, o medir la
cantidad o concentración del polipéptido, un derivado funcional, en
una célula, un extracto de célula o tejido, o un fluido biológico.
Como se usa en la presente memoria, el término "epitope" se
refiere a la porción de cualquier molécula capaz de unirse mediante
un anticuerpo que también puede ser reconocido por tal anticuerpo.
Los epitopes o los "determinantes antigénicos" normalmente
consisten en grupos de moléculas con superficies químicamente
activas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y
tienen características estructurales específicas de tres dimensiones
así como características de carga específicas. Se dice que un
anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de
reaccionar específicamente con la molécula para de ese modo unir la
molécula al anticuerpo.
El polipéptido secretado por adipocitos porcinos
de la presente invención, o un derivado funcional, que
preferentemente tiene al menos aproximadamente 8 aminoácidos se usa
como un antígeno para inducir un anticuerpo policlónico o un
anticuerpo monoclónico (mAb). Como se usa en la presente memoria, un
"antígeno" es una molécula o una porción de una molécula capaz
de unirse a un epitope de tal antígeno. Un antígeno puede tener un,
o más de un epitope. La reacción específica anteriormente referida
pretende indicar que el antígeno reaccionará, de un modo altamente
selectivo, con sus correspondientes anticuerpos y no con multitud
de otros anticuerpos que pueden ser producidos por otros
antígenos.
El término "anticuerpo" pretende incluir
anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), y
anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos policlonales son poblaciones
heterogéneas de moléculas de anticuerpos que derivan de suero de
animales inmunizados con un antígeno. Los anticuerpos monoclonales
son sustancialmente una población heterogénea de anticuerpos de
epitopes antígenos específicos. Se puede obtener mAbs por métodos
conocidos por los expertos en la técnica. (Véase, por ejemplo Kohler
y Milstein, Nature 256:495-497 (1975) y la patente
U.S. nº 4.376.110; de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol.
Methods, 35:1-21 (1980); y Hartlow, E. et
al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988).
Los anticuerpos quiméricos son diferentes
porciones de moléculas que derivan de diferentes especies animales,
tales como los que tienen una región variable que deriva de un mAb
de porcino y una región constante de inmunoglobulina murina. Los
anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción son
conocidos en la técnica (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851:6855 (1984); Boulianne
et al., Nature 312:643-646 (1984); Neuberger
et al., Nature 314:268-270 (1985); Liu et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443
(1987); Better et al., Science 240:1041-1043
(1988)). Esas referencias se incorporan en la presente memoria como
referencia.
El término "anticuerpo" también pretende
incluir tanto moléculas intactas como sus fragmentos, tales como,
por ejemplo, Fab y F(ab')_{2}, que son capaces de unirse a
un antígeno. Fab y fragmentos F(ab')_{2} carecen de
fragmento Fc de anticuerpo intacto, se despejan más rápidamente de
la circulación, y pueden tener menos tejidos no específicos unidos
que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med.
24:316-325 (1983)). Tales fragmentos se producen
normalmente por división proteolítica, usando enzimas tales como
papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir
fragmentos F(ab')_{2}).
La reacción de los anticuerpos y los polipéptidos
de la presente invención se detectan por métodos de inmunoensayo
bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Hartlow et
al. supra). Los anticuerpos, o fragmentos de
anticuerpos, útiles en la presente invención pueden usarse para
detectar cuantitativamente o cualitativamente la presencia de
células que expresan la proteína polipéptido secretado por
adipocitos porcinos. Esto puede lograrse por técnicas de
inmunofluorescencia empleando un anticuerpo marcado
fluorescentemente asociado a un microscopio, citometría de flujo, o
detección fluorimétrica.
Los anticuerpos (o sus fragmentos) útiles en la
presente invención pueden emplearse histológicamente, como en
microscopía inmunofluorescente o inmunoelectrónica, para detección
in situ del polipéptido secretado por adipocitos porcinos.
La detección in situ puede lograrse tomando una muestra
histológica de un cerdo, y proporcionando un anticuerpo marcado de
la presente invención a tal muestra. El anticuerpo (o fragmento) se
proporciona preferentemente por aplicación o por revestimiento del
anticuerpo marcado (o fragmento) a una muestra biológica. A través
del uso de tal procedimiento, es posible determinar no sólo la
presencia del polipéptido adipocito porcino sino también su
distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención,
los expertos normales en la técnica percibirán rápidamente que se
pueede modificar cualquiera de la amplia variedad de métodos
histológicos (tales como procedimientos de teñido) para lograr tal
detección in situ.
Tales ensayos para polipéptido secretado por
adipocitos porcinos normalmente incluyen incubar una muestra
biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido,
recolectado en fresco o células cultivadas que contienen células
adipogénicas o adipocitos, en presencia de un anticuerpo marcado
detectable capaz de identificar el polipéptido secretado por
adipocitos porcinos, y de detectar el anticuerpo por cualquiera del
número de técnicas bien conocidas en la técnica, tales como
inmunoensayo de enzimas (EIA o ELISA) o radioinmunoensayo
(RIA).
Las moléculas de anticuerpo de la presente
invención también pueden adaptarse para utilizarse en un ensayo
inmunométrico, también conocido como ensayo
"dos-sitios" o "sándwich". En un ensayo
inmunométrico normal, se une una cantidad de anticuerpo sin marcar
(o fragmento de anticuerpo) a un soporte sólido (es decir,
cualquier soporte capaz de unir antígenos o anticuerpos) y se añade
una cantidad de anticuerpo soluble marcado para detectarse para
permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario
formado entre fase sólida, anticuerpo, antígeno, y anticuerpo
marcado.
La actividad de unirse de un lote de anticuerpos
dados al polipéptido secretado por adipocitos porcinos puede
determinarse según métodos bien conocidos. Los expertos en la
técnica serán capaces de determinar las condiciones de ensayo
operativas y óptimas para cada determinación empleando
experimentación rutinaria.
Los anticuerpos se pueden usar en una columna de
inmunoafinidad para purificar el polipéptido secretado por
adipocitos porcinos de la invencióón por un procedimiento de un
etapa, usando métodos conocidos en la técnica.
Un cerdo que es susceptible a la deposición de
grasa puede tratarse con la proteína adipocito porcino según la
presente invención para limitar tal deposición de grasa. Este
tratamiento puede llevarse a cabo en conjunción con otras terapias
anti-adipogénicas. Un régimen normal para tratar
suidos con propensión a deposición de grasa comprende la
administración de una cantidad eficaz de polipéptido secretado por
adipocitos porcinos administrado a lo largo de un periodo de
tiempo.
El polipéptido secretado por adipocitos porcinos
de la presente invención puede administrarse por cualquier método
que logre los propósitos buscados, preferentemente para alterar la
ingesta de alimento o limitar la deposición de grasa en un sujeto.
Por ejemplo, la administración puede ser por varias vías
parenterales incluyendo, pero no limitándose a, vías subcutánea,
intravenosa, intradérmica, intramuscular, e intraperitoneal.
Alternativamente, o simultáneamente, la administración puede ser
por la vía oral lo cual puede lograrse por el uso de productos
alimentarios genéticamente alterados, en los que se ha insertado y
expresado el gen de la leptina de porcino. La administración
parenteral puede ser por inyección en bolo o por perfusión gradual
en el tiempo tal como por un implante de un dispositivo de
liberación osmótica. Las preparaciones para administración
parenteral incluyen disoluciones estériles acuosas o no acuosas,
suspensiones, y emulsiones, que pueden contener agentes o
excipientes auxiliares que son conocidos en la técnica. También se
pueden preparar composiciones farmacéuticas tales como tabletas y
cápsulas según métodos rutinarios.
Se entiende que la dosis administrada de
polipéptido secretado por adipocitos porcinos depende de la edad, el
sexo, la salud, y el peso del receptor, tipo de tratamiento
simultáneo, si hay alguno, frecuencia del tratamiento, y la
naturaleza del efecto deseado. La dosis más preferente se adaptará
al sujeto individual, tal como se comprende y determinará un
experto en la técnica. La dosis total requerida para cada
tratamiento puede administrarse por múltiples dosis o en una única
dosis. El polipéptido secretado por adipocitos porcinos de la
presente invención puede administrarse sólo o junto con otras
terapias dirigidas a la regulación de deposición de grasa.
En una realización preferente, la concentración
de polipéptido secretado por adipocitos porcinos o ARNm de la
presente invención se mide en una preparación celular, un extracto
de tejido o un fluido biológico del sujeto como un método para
determinar la susceptibilidad o propensión del sujeto a la
deposición de grasa. La susceptibilidad del sujeto a la deposición
de grasa está relacionada con el nivel de polipéptido secretado por
adipocitos porcinos o su ARNm. Además, se usarán los polimorfismos
de fragmentos de longitud reducida en el gen de secretado por
adipocitos porcinos para predecir el potencial de deposición de
grasa.
Se describe la evaluación de la eficacia de una
droga u otro agente, dirigido a aumentar o disminuir la ingesta de
alimento, por medición de la capacidad de la droga o del agente de
estimular o suprimir la producción del polipéptido secretado por
adipocitos porcinos, o del ARNm de esta invención por una célula o
un línea celular capaz de producir tales polipéptidos o ARNms. Las
células preferentes son células de una línea celular adipogénica.
Los anticuerpos, ADNc sonda o ribosonda de la presente invención
son útiles en el método de evaluación de estas drogas u otros
agentes en el que pueden usarse para determinar la cantidad de
polipéptido de secretado por adipocitos porcinos o ARNms usando uno
de los inmunoensayos antes mencionados.
Los ensayos para medir la susceptibilidad de un
cerdo a la deposición de grasa se describen basándose en la
medición, a partir de un tejido o fluido del sujeto, de la cantidad
de las secuencias de ARNm presentes que codifican el polipéptido
secretado por adipocitos porcinos, o un derivado funcional,
preferentemente usando un ensayo de hibridación
ARN-ADN. La susceptibilidad a la deposición de
grasa está relacionada con la cantidad de tales secuencias de ARNm
presente. Para tales ensayos, la fuente de las secuencias de ARNm es
preferentemente células adipogénicas de cerdo. La técnica
preferente para medir la cantidad de ARNm es un ensayo de
hibridación usando ARN (por ejemplo, Ribonuclease Protection Assay)
o ADN (por ejemplo, Northern o Slot Blot Assays) de la secuencia de
bases complementaria.
Los ensayos de detección de ácido nucleico,
especialmente los ensayos de hibridación, pueden basarse en
cualquier característica de la molécula de ácido nucleico, tal como
su tamaño, secuencia, susceptibilidad a digestión por endonucleasas
de restricción, etc. La sensibilidad de tales ensayos puede
aumentarse alterando el modo en el que la detección se informa o
señala al observador. Así, por ejemplo, la sensibilidad del ensayo
puede aumentarse a través del uso de reactivos marcados para ser
detectados. Con este propósito se han usado una amplia variedad de
tales marcadores. Kourilsky et al. (U.S. Pat. Nº 4.581.333)
describe el uso de enzimas marcadas para aumentar la sensibilidad
en el ensayo de detección. Se describen marcadores radioisótopos en
Falkow et al. (U.S. Pat. Nº 4.358.535), y en Berninger (U.S.
Pat. Nº 4.446.237). También se han usado marcadores fluorescentes
(Albarella et al. EP 144.914), marcadores químicos (Sheldon
III et al. U.S. Pat. Nº 4.582.789), bases modificadas
(Miyoshi et al., EP 119.448), etc, en un esfuerzo por
mejorar la eficacia con la que se puede observar la detección.
Un método para reducir la limitación de
sensibilidad a la concentración de ácido nucleico es amplificar
selectivamente el ácido nucleico cuya detección se desea antes de
llevar a cabo el ensayo. Las metodologías de ADN recombinante
capaces de amplificar fragmentos purificados de ácido nucleico
llevan tiempo siendo reconocidas. Normalmente, tales metodologías
implican la introducción del fragmento del ácido nucleico en el
vector de ADN o de ARN, la amplificación clonal del vector, y la
recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Se
proporcionan ejemplos de tales metodologías en Cohen et al.
(U.S. Pat. Nº 4.237.224), Maniatis, T., et al., etc.
Recientemente, se ha descrito un método in
vitro enzimático que es capaz de aumentar la concentración de
tales moléculas de ácido nucleico deseadas. A este método se le ha
llamado "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR"
(Mullis, K. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
51:263-273 (1986); Erlich H. et al., EP
50.424; EP 84.796, EP 258.017, EP 237.362; Mullis, K., EP 201.184;
Mullis K. et al., U.S. Pat. Nº 4.683.202; Erlich, H., U.S.
Pat. Nº 4.582.788; y Saiki, R. et al., U.S. Pat. Nº
4.683.194). La reacción en cadena de la polimerasa proporciona un
método para aumentar selectivamente la concentración de una
secuencia particular de ácido nucleico incluso cuando esa secuencia
no se ha purificado previamente y está presente sólo en una copia
única en una muestra particular. El método se puede usar para
amplificar ADN tanto de cadena simple como doble. La esencia del
método implica el uso de dos sondas de oligonucleótidos que actúan
como cebadores para la plantilla, la polimerasa actúa como mediador
en la replicación de la molécula de ácido nucleico deseada.
Habiendo descrito ya la invención de modo
general, lo mismo se entenderá más rápidamente a través de la
referencia de los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo
de ilustración, y no pretenden limitar la presente invención, a
menos que se especifique.
Se amplificó la porción supuesta secretada del
producto del gen de la leptina de porcino a partir de ARNm de tejido
adiposo usando la reacción en cadena de la
polimerasa-transcriptasa inversa. Se llevaron a cabo
cuatro reacciones de síntesis de ADNc separadas usando
1-2 \mug de ARN total de tejido adiposo de
porcino o 1-2 \mug de poli A + ARNm, 150 pmol de
hexámero al azar, 500 nM dNTP, 200 U de MMLV Rnasa H^{-}
transcriptasa inversa (Life Technologies, Inc.) en 20 \mul del
tampón suministrado. Las reacciones se incubaron durante 1 hora a
37ºC y terminaron por calentamiento a 70ºC durante 10 minutos. El
producto de ADNc de leptina se amplificó mediante PCR usando los
siguientes oligonucleótidos cebadores degenerados con enlaces de
sitios de restricción para BamHI/Bsa I y EcoRI/Eco47 III,
respectivamente:
5'-GGATCCGGTCTCAGGCC
GTGCC(C/T)ATCCA(A/G)AAAGTC-3'
5'-GAATTCAGCGCTGCA(C/T)(C/T)CAGGGCT(G/A)A(G/C)(G/A)TC-3'
Estos oligonucleótidos cebadores se diseñaron a
partir de una alineación de secuencia múltiple de las secuencias de
ADNc de ratón y humano. Se añadió aproximadamente 100 ng de ADNc de
tejido adiposo como plantilla a 50 \mul de reacciones PCR hechas
en el tampón fabricado con 100 pmol de cada cebador y 2,5 U de Taq
ADN polimerasa (Life Technologies, Inc.). Se llevó a cabo una
amplificación en tres etapas bajo las siguientes condiciones;
etapa
1-95ºC, 3 minutos; 52ºC, 1 minuto, 72ºC, 1 minuto, 1 ciclo; etapa 2-94ºC, 45 s; 52ºC, 45s, 72ºC, 1 minuto, 4 ciclos; etapa 3-94ºC, 45 s; 55ºC, 30 s, 72ºC, 1 minuto, 28 ciclos. La plantilla de ADNc de tres de cada cuatro reacciones de ADNc produjeron un producto de 466 pb.
1-95ºC, 3 minutos; 52ºC, 1 minuto, 72ºC, 1 minuto, 1 ciclo; etapa 2-94ºC, 45 s; 52ºC, 45s, 72ºC, 1 minuto, 4 ciclos; etapa 3-94ºC, 45 s; 55ºC, 30 s, 72ºC, 1 minuto, 28 ciclos. La plantilla de ADNc de tres de cada cuatro reacciones de ADNc produjeron un producto de 466 pb.
Los productos PCR se prepararon por ligación del
vector de expresión de la proteína pASK75 (Biometra Inc.) por
digestión completa con Eco47III y digestión parcial con Bsa I. Los
productos PCR digeridos por la enzima de restricción se purificaron
por elecroforesis en el gel de agarosa de bajo punto de fusión y se
eliminó un producto de 437 pb del gel y se ligó al vector. Las
ligaciones se transformaron en E. coli
XL1-Blue (Stratagene Inc.) y se colocaron en placas
LB que contenían 50 \mug/ml de ampicilina para selección
plásmatica. Se aislaron doce colonias de E. coli que
contenían el ADNc de leptina de porcino, y se aisló ADN plasmático
para secuenciación de ADN.
En la Figura 1 se representa la secuencia de
nucleótidos del gen de la leptina de porcino que contiene 5.917
pares de bases, y la traducción de aminoácidos de las secuencias
que codifican la leptina. En la Figura 2 se representa la secuencia
de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del ADNc completo de
leptina de porcino (es decir, péptido señal y proteínas secretadas)
que comprende 501 pares de bases y 167 aminoácidos. En la Figura 3
se representa la secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos del ADNc de leptina de porcino que corresponde sólo a
la proteína secretada y que comprende 435 pares de bases y 145
aminoácidos.
Tal y como se representa en la Figura 4 hubo un
83% de coincidencia entre la secuencia de ADNc del cerdo y del
ratón.
Se usó ADNc de leptina de porcino como una sonda
para la detección de la longitud total del ARNm. El Dr. M. Spurlock
de Purina Mills Inc proporcionó un northern blot que contenía poli
A + ARNm adiposo de porcino y adiposo de bovino así como ARN total
ob/ob adiposo de ratón. Se híbrido el blot con un ADNc de
leptina marcado [^{32}P] dCTP en una disolución de hibridación
(HY, 0,9 M NaCl, 0,09 M citrato sódico, 0,05% de ficoll, 0,05%
polivinilpirolidona, 0,05% BSA, 0,5% SDS, 0,1% pirofosfato sódico,
10 mM EDTA y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón expuesto a
ultrasonido a 60ºC durante 15 horas. Se lavó el blot hasta una
astringencia final de 0,2X SSC (0,03 M NaCl,
\hbox{0,003
M} citrato sódico), 0,1% SDS a 60ºC y se expuso a película de
rayos-X. Se detectó un ARNm de leptina de 3.090 pb
en porcino y en tejido adiposo de bovino y se detectó un ARNm de
leptina de 3.240 pb en tejido adiposo de ratón ob/ob. Como se
muestra en la Figura 5, las calles 1 y 2 contienen el poli A + ARNm
adiposo de porcino, la calle 3 contiene el ARN total adiposo de un
control de ratón y las calles 4 y 5 contienen ARN total adiposo de
un ratón ob/ob, y la calle 6 contiene el poli A + ARNm
adiposo de bovino.
El ADNc de leptina de porcino también se usó para
revisar una librería de ADN genómico de porcino. Específicamente,
previamente se construyó una librería genómica de porcino que
contiene 4,64 x 10^{5} recombinantes en SuperCos 1 (Stratagene,
Inc) y se revisó para buscar leptina de porcino. Específicamente,
se prehibridizaron dos grupos de filtros réplica durante 2 horas a
60ºC. Los filtros se hibridizaron durante la noche con la sonda
marcada [^{-32}P]dCTP a
\hbox{5 x 10 ^{5} } cpm
por ml de disolución de hibridación a 65ºC. Los filtros se lavaron
consecutivamente en 2X SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M citrato sódico), 0,5%
SDS; 1X SSC, 0,5% SDS; y 0,2X SSC 0,5% SDS con cada lavado a 60ºC
durante 30 minutos. Los clones positivos que mostraron señales en
ambos filtros replicados se recuperaron de las placas de agar y se
aislaron colonias individuales mediante una segunda placa de
réplica de baja densidad y una etapa de hibridación. Se aisló un
cósmido llamado Obg-361 que hibridizó a la sonda
ADNc ob de porcino y que esencialmente tenía el mismo patrón
de digestión de enzima de restricción que el encontrado en el ADN
genómico de porcino.
La Figura 6 muestra el aislamiento del cósmido
Obg-361. Específicamente, las calles
1-4 son un gel de agarosa que contiene marcadores de
masa molécula Kb ladder (calle 1), cósmido Obg-361
digerido con Eco RI (calle 2) y Hind III (calle 3) y marcadores de
masa molecular bioltinilado lambda/Hind III (calle 4).
El análisis Southern blot del gel en las calles
2-4 se sondó con el ADNc de leptina de porcino
indica que los fragmentos EcoRI (calle 5) y los fragmentos Hind III
(calle 6) contienen secuencias de leptina. La calle 7 es con
marcadores de masa molecular lambda/Hind III.
El ADN genómico de porcino digerido con BAM HI
(calle 8), EcoRI (calle 9) y Hind III (calle 10) e hibridizado con
un fragmento Bsa I (300 pb) del ADNc de leptina de porcino mostró
bandas equivalentes que contienen secuencias de leptinas que
indican que el gen de leptina de porcino se aisló en cósmido
Obg-361.
El fragmento Hind III con 5.917 pb se subclonó a
Bluescript II SK + (Stratagene Inc.). Se determinaron ambas cepas
de la secuencia usando deleciones progresivas de nido usando
exonucleasa III y nucleasa Mung Bean. Se llevaron a cabo reacciones
secuenciales con sequenasa V2.0. Esta secuencia tenía 5.917 pb de
longitud y contenía la región de codificación completa en dos exones
(Figura 1). Hubo coincidencia de nucleótidos de 78,6% entre el
cerdo y el humano así como una coincidencia de nucleótidos de 71,2%
entre las secuencias de código de cerdo y ratón. La zona de unión
de los dos exones se confirmó por la secuencia de ADNc. En la
Figura 2 se muestra la secuencia de ADNc de la secuencia codificante
de la proteína. Las secuencias de 501 pb codifican 166 restos de
aminoácidos de polipéptido leptina con una predicción de masa
molecular de 18.334 Da.
Se obtuvo un clon usando el proceso descrito
anteriormente, Obg H3-15, se depositó con la
American Type Culture Collection (ATCC), 12.301 Parklawn Drive,
Rockville, Md., 20.852-1776, el 11 de julio, 1996, y
se ha llamado ATCC Nº 97.653. Este microorganismo se depositó bajo
las condiciones del Tratado de Budapest del International
Recognition of Deposit of Microorganisms con el propósito del
proceso de patente. Todas las restricciones en la disponibilidad al
público del material así depositado serán irrevocablemente
eliminadas tras la concesión de la patente. Este depósito se
mantendrá durante un periodo de tiempo de 30 años a partir de la
fecha de depósito o 5 años después de la última petición de
material, cualquiera que sea el tiempo que pase.
La secuencia del polipéptido codificada por el
ADNc de leptina de porcino se sintetizó y purificó usando el
sistema Strep-Tag (Biometra, Inc.). El plásmido
pASK contiene la secuencia líder ompA para la secreción de la
proteína en el espacio periplasmático de E. coli así como al
terminal carboxilo de diez aminoácidos que se une a estreptavidina
para afinidad cromatográfica. La síntesis de la proteína leptina de
porcino por la cadena XL1-Blue de E. coli se
indujo con 200 \mug/l de anhidrotetraciclina y las células se
cultivaron durante 3 h. Se aislaron las proteínas en el espacio
interplasmático por choque osmótico suspendiendo las células en 100
mM Tris-HCl pH 8,0, 500 ml sacarosa, 1 mM EDTA y
0,02% NaN_{3} durante 30 m a 4ºC. Las células se extrajeron por
centrifugación y la proteína leptina de porcino se purificó a partir
de proteínas periplasmáticas por cromatografía de afinidad con
estreptavidina, como se representa en la Figura 5.
Específicamente, la Figura 7 muestra
electroforesis en gel de poliacrilamida de la inducción y
purificación de la proteína leptina de porcino en E. coli.
Los marcadores de masa molecular se localizan en la calle 1. La
calle 2 contiene proteína total de XL-1 Blue y
línea celular pASK/Ob antes (calle 3) y después (calle 4) de
inducción con anhidrotetraciclina. En la calle 6 se localiza la
afinidad de proteína leptina de porcino purificada.
Los anticuerpos policlónicos y monoclónicos se
producen con la proteína leptina de porcino recombinante. Las
técnicas usadas para producir, revisar, detectar, y/o cuantificar
anticuerpos para la leptina de porcino se discuten extensamente en
"Antibodies: a Laboratory Manual" (Harlow et al., 1988,
Cold Spring Harbor laboratory). Todos los medios o componentes que
intervienen, ratón o cepas de células (es decir, ratón BALB/C,
células de mieloma sp2/0, macrofagos JA744A.1, etc) están
comercialmente disponibles.
Se inyecta proteína leptina de porcino purificada
en conejos para la producción de anticuerpos policlónicos.
Específicamente, cada conejo recibe inyecciones subcutáneas
repetitivas con antígeno en adyuvante completo de Freund seguido de
al menos una inyección de bolo de aproximadamente 200 \mug a 1 mg.
Cuando la concentración en el suero de los conejos inmunizados es
suficientemente alta cuando se comprueba usando la leptina de
porcino como antígeno, el suero de conejo se cultiva como el
antisuero policlonal para leptina de porcino.
Se inyecta proteína leptina de porcino purificada
a ratones BALB/C para la producción de anticuerpos monoclonales.
Específicamente, a cada ratón se inyecta aproximadamente 50 \mug
de proteína leptina de porcino con adyuvantes Ribi's
S-TDCM (RIBI Immuno Chem Research, Inc., Hamilton,
Montana). El número de inyecciones depende de la concentración del
anticuerpo en el suero de los ratones inmunizados como se determina
mediante ELISA usando leptina de porcino como antígeno. En el
transcurso de la producción de anticuerpos monoclonales contra la
proteína leptina de porcino, se usan los bazos de los ratones
inmunizados para preparar células del bazo. Se hacen células
hibridoma fusionando las células del bazo con células de mieloma
sp2/0 (tratadas con un medio que contiene
8-azaguanina) en la presencia de 50% PEG- 1500. Las
células hibridoma se incuban en un medio seleccionado HAT
(hipoxantina, aminopterina, y timidina). La revisión posterior de
clones positivos usan leptina recombinante de porcino como antígeno
en la metodología ELISA. Los clones positivos que producen
anticuerpos fuertes de anti leptina de porcino son caracterizados
por especificidad, subtipo, afinidad, sitios de unión, etc.
Cuando se necesitan grandes cantidades de
anticuerpo purificado, se cultivan los clones positivos a gran
escala y se purifica el anticuerpo del cultivo sobrenadante, o se
inyecta en la cavidad intraperitoneal de ratones BALB/C para la
producción de ascitis. El último procedimiento requiere
aproximadamente 1-2 x 10^{6} células hibridoma por
ratón, y normalmente dura aproximadamente 7-14 días.
Después se purifican grandes cantidades de anticuerpo de la ascitis
mediante precipitación de sulfato amónico y cromatografía de
intercambio iónico (por ejemplo, DEAE-Trisacryl
M.)
Habiendo ya descrito completamente esta
invención, los expertos en la técnica apreciarán lo mismo que puede
llevarse a cabo con un amplio intervalo de parámetros,
concentraciones, y condiciones equivalentes sin separarse del
espíritu y ámbito de la invención y sin excesiva
experimentación.
Claims (12)
1. Una molécula de ADN aislada, de cadena simple
o doble, que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido, la leptina, secretado por adipocitos porcinos, que
tiene la secuencia de aminoácidos de
SEC ID NO:4, o el complemento de la molécula de ADN.
SEC ID NO:4, o el complemento de la molécula de ADN.
2. Un vector de expresión, que comprende la
molécula de ADN de la reivindicación 1.
3. El vector de la reivindicación 2, en el que el
vector es un plásmido.
4. Una célula anfitriona transformada o
transfectada con el plásmido de la reivindicación 3.
5. Una molécula de ARNm aislada que codifica un
polipéptido leptina secretado por adipocitos porcinos, la molécula
de ARNm codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID
NO:3.
6. La molécula de ADN de la reivindicación 1 que
consta de la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:3.
7. Una célula anfitriona transformada o
transfectada con el vector de la reivindicación 2.
8. Una molécula de ARNm aislada, que consta de
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, la
leptina, secretado por adipocitos porcinos, que tiene la secuencia
de aminoácidos de SEC ID NO:4.
9. Un vector de expresión, que comprende la
molécula de ADN de la reivindicación 6.
10. El vector de la reivindicación 9, en el que
el vector es un plásmido.
11. Una célula anfitriona transformada o
transfectada con el vector de la reivindicación 9.
12. Una célula anfitriona transformada o
transfectada con el plásmido de la reivindicación 10.
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| US08/692,922 US6277592B1 (en) | 1996-07-31 | 1996-07-31 | Porcine leptin protein, nucleic acid sequences coding therefor and uses thereof |
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