ES2214185T3 - Procedimiento para separar y ensayar lipoproteinas, un conjunto para ensayar dicho procedimiento y un sistema que incluye dicho conjunto. - Google Patents
Procedimiento para separar y ensayar lipoproteinas, un conjunto para ensayar dicho procedimiento y un sistema que incluye dicho conjunto.Info
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Abstract
Un conjunto para separar y ensayar lipoproteínas y determinar el grado de modificación de un componente predeterminado en un espécimen usando un patrón electroforético de una muestra estándar que contiene una lipoproteína que tiene el componente predeterminado y el patrón electroforético del espécimen que contiene una lipoproteína que tiene componente de una misma clase que el componente predeterminado, caracterizado porque comprende: un medio de preparación (201) de un patrón electroforético para realizar la electroforesis de la muestra estándar y el espécimen para fraccionar la lipoproteína de cada muestra, tiñendo después el respectivo componente predeterminado usando un reactivo para detectar el respectivo componente predeterminado tiñendo el respectivo componente predeterminado en la respectiva lipoproteína para preparar el respectivo patrón electroforético con el respectivo componente predeterminado visualizado; un medio de preparación (206) de un diagrama de forma de onda para explorar ópticamente el respectivo patrón electroforético con el respectivo componente predeterminado visualizado y convirtiendo el respectivo patrón electroforético en una forma de onda de densidad óptica para preparar el respectivo diagrama de forma de onda del respectivo componente predeterminado; y un medio para juzgar el grado de modificación del componente predeterminado (204) en el espécimen procesando matemáticamente los respectivos patrones electroforéticos; caracterizado porque el medio para juzgar el grado de modificación del componente predeterminado (204) comprende: un primer medio para determinar una distancia "a" desde un punto de aplicación de la muestra estándar hasta una posición central de una fracción correspondiente al componente predeterminado en la muestra estándar a partir del patrón electroforético del componente predeterminado de la muestra estándar; un segundo medio para determinar una distancia "b" desde un punto de aplicación del espécimen hasta una posición central de una fracción correspondiente al componente predeterminado en el espécimen a partir del patrón electroforético del componente predeterminado del espécimen; y un tercer medio para comparar la distancia "a" con la distancia "b" para determinar una movilidad relativa "z (= b/a)" del espécimen respecto de la muestra estándar, caracterizado porque el grado de modificación del componente predeterminado en el espécimen está siendo juzgado en base a la movilidad relativa "z".
Description
Procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas, un conjunto para ensayar dicho procedimiento y un
sistema que incluye dicho conjunto.
La presente invención se refiere a la separación
y ensayo de lípidos en una muestra tal como suero o plasma en el
campo de las investigaciones médicas, investigaciones biológicas y
similares. De manera más específica, la presente invención se
refiere a un procedimiento para separar y ensayar lipoproteínas
contenidas en el suero o en el plasma por medio de la
electroforesis; a un conjunto para llevar a cabo dicho
procedimiento; y a un sistema que incluye a dicho conjunto para
separar y ensayar lipoproteínas, usando la electroforesis para
estimar la modificación de lipoproteína por medio de la detección de
las anormalidades cuantitativas y cualitativas de apoproteína en la
lipoproteína.
La lipoproteína en el suero o en el plasma es un
complejo de lípidos y de proteínas, que incluye colesterol,
fosfolípidos y grasa neutra. Por lo tanto, una anormalidad de
lipoproteínas refleja una anormalidad del metabolismo de los
lípidos, que puede ser estimada por medio del procedimiento que
incluye la etapa de la separación de las lipoproteínas contenidas en
el suero o en el plasma y la realización de los análisis
cuantitativos y cualitativos de la fracción de proteína con respecto
a cualquier anormalidad de la misma. Para este propósito, dicho
procedimiento para separar y para ensayar lipoproteínas es una de
las pruebas clínicas más importantes para el diagnóstico y el
tratamiento de una enfermedad que afecte al metabolismo de los
lípidos, tal como la hiperlipemia, arteriosclerosis coronaria,
hipotiroidismo, enfermedad de hígado obstructiva, diabetes
melitus e insuficiencia renal.
Como técnica para fraccionar lipoproteínas en una
muestra, se conoce un procedimiento que usa técnicas
ultracentrífugas y electroforéticas. La electroforesis usa una
película de agarosa, una película de
celulosa-acetato o un gel de poliacrilamida (PAG)
como una lámina.
En la separación ultracentrífuga, las
lipoproteínas en el suero se pueden separar unas de otras con
respecto a sus respectivas gravedades específicas. Generalmente se
hace referencia a las fracciones resultantes como: Lipoproteína de
alta densidad (HDL); lipoproteína de baja densidad (LDL);
lipoproteína de muy baja densidad (VDL); y quilomicrón (CM),
respectivamente.
Con relación a la separación ultracentrífuga, sin
embargo, se tarda mucho más tiempo en preparar una muestra que va a
ser sometida a una máquina ultracentrífuga y en separar dicha
muestra. Además, incluso es necesario un fraccionamiento más fino de
la muestra para la separación más fina y detallada de las
lipoproteínas para percibir las condiciones de percepción durante la
separación. Por esta razón, es difícil realizar el procedimiento de
separar y ensayar lipoproteínas por medio de la ultracentrifugación
en un examen clínico como un trabajo rutinario para detectar
cualquier anormalidad en la fracción objeto de estudio o
caracterizar los resultados de la separación para una enfermedad
específica.
En la separación electroforética, por otra parte,
las lipoproteínas de la solución pueden ser fraccionadas
principalmente con respecto a la diferencia en sus movilidades
electroforéticas. En este caso, las condiciones de la separación de
lipoproteínas pueden ser percibidas de manera visual. Por esta
razón, a menudo en el examen de rutina, se usa la separación
electroforética en un procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas de una muestra. Se hace notar que los resultados tanto
del procedimiento electroforético como del ultracentrífugo para
separar las lipoproteínas muestran una buena correlación uno con
respecto al otro. Cuando se fracciona una lipoproteína usando la
técnica electroforética, la lipoproteína es separada en las
fracciones de \alpha (HDL), pre \beta (VLDL), \beta (LDL) y el
punto de origen (quilomicrón). Estas fracciones se corresponden con
las especies de lípidos visualizadas por una tinción de lípido tal
como rojo de grasa 7B para estimar la cantidad de lípido en cada
fracción. Por conveniencia de un experto en la técnica, el nombre de
cada fracción de lipoproteína obtenida por la separación
ultracentrífuga de la técnica anterior se describe entre el
paréntesis al lado de cada nombre de fracción de la electroforesis
anterior.
La estructura fundamental de la lipoproteína está
compuesta de una parte de núcleo formada de una grasa neutra
(triglicérido) y éster de colesterol, una sola membrana lípida
hidrofílica que convierte la parte del núcleo, y una o más
apoproteínas adheridas a la superficie de dicha membrana. El tipo de
la apoproteína se diferencia por cada fracción de lipoproteína. Esto
es, principalmente, las apoproteínas en el HDL son apoproteínas
A-I, A-II, A-IV,
C-I, C-II, C-III y
E. Las apoproteínas en VLDL son apoproteínas C-I,
C-II, C-III Y
B-100. Las apoproteínas en el LDL son apoproteínas
B-100. Las apoproteínas en quilomicrón son
apoproteínas A-I, A-II,
A-IV, C-I, C-II,
C-III, E y B-48. En el proceso
electroforético, la diferencia en el punto isoeléctrico de cada
apoproteína contenida en la lipoproteína se refleja como una
diferencia en la movilidad de cada fracción.
Debido a que la arteriosclerosis es una causa de
enfermedad en los adultos, tal como la arteriosclerosis coronaria,
resulta un problema importante en la medicina fundamental y en la
medicina clínica evitar o tratar la arteriosclerosis. En particular,
debido al incremento reciente en el número de pacientes de
arteriosclerosis de edades jóvenes, y debido a que los pacientes con
diabetes son propensos a sufrir de arteriosclerosis, se requiere una
gestión más estricta de los lípidos en el suero. Por ejemplo, por
medio de la investigación epidemiológica dirigida por el Instituto
Framingham y otros similares, se ha aclarado que el valor de
colesterol en el suero, especialmente el valor del colesterol en la
lipoproteína de baja densidad (LDL) es considerada como un factor de
los más importantes de la arteriosclerosis que es una causa de las
enfermedades arteriales coronarias.
La causa del colesterol en LDL que causa la
arteriosclerosis es que se espuma un macrófago cogiendo el LDL
modificado a través de un receptor particular, y el resto se adhiere
sobre la pared vascular. Por lo tanto, es necesario el examen por
selección del LDL modificado.
Aquí, el "LDL modificado" es un nombre
genérico de LDL modificado de manera variada tal como LDL oxidado,
LDL acetil, LDL sacarizado y LDL MDA (LDL malondialdehído). Además,
el término "modificación" que se usa en la presente memoria
significa una modificación en un sentido amplio como el normalmente
usado por un experto en la técnica para la modificación de lípidos o
proteínas. Por ejemplo, para un componente de lipoproteína contenido
en una muestra de sangre, incluye no sólo la modificación causada
por los cambios en el entorno físico o químico en vivo tal como la
anomalía metabólica de lípido en el cuerpo, sino también la
modificación causada por cambios en el entorno físico o químico
in vitro tras el muestreo, lo que será obvio para una persona
experta en la técnica sin describir ejemplos prácticos.
En general, se dice que el LDL de pequeña
densidad es propenso a ser oxidado. Por lo tanto, como el examen por
selección del LDL modificado, se han intentado varios procedimientos
para detectar la relación de LDL de pequeña densidad en la
lipoproteína. Por ejemplo, existe un procedimiento por medio del
proceso electroforético usando PAG que tiene un predeterminado
tamaño de poro y un alto efecto de tamiz molecular. De acuerdo con
el procedimiento anterior, la lipoproteína es separada por medio del
efecto de tamiz molecular de PAG, primero se separan las partículas
más pequeñas (las que tienen la movilidad mayor) HDL, y después se
separan el LDL, VLDL y quilomicrón en orden. De manera específica,
en el fraccionamiento de lipoproteína por medio del proceso
electroforético, la lipoproteína se fracciona de acuerdo con la
diferencia en los tamaños de las partículas contenidas en las
lipoproteínas, más que en la diferencia en los puntos isoeléctricos
de las partículas contenidas en las lipoproteínas.
Para detectar la relación de LDL de pequeña
densidad usando el proceso electroforético PAG, hay un procedimiento
que usa una distancia relativa entre cada una de las fracciones con
respecto a la posición de la fracción VLDL. En este procedimiento,
se lleva a cabo una electroforesis usando gel de poliacrilamida,
donde la distancia electroforética de migración desde la posición
central de la fracción VLDL a la posición central de la fracción LDL
se define como "x", y la distancia electroforética de migración
desde la posición central de la fracción VLDL a la posición central
de la fracción HDL se define como "y", se determina una
distancia electroforética relativa de migración (valor Rf o valor
Rm) por medio de la relación (x/y) de estas distancias. El valor
obtenido se compara con un valor obtenido para una muestra normal
estándar en la que el LDL no es de pequeña densidad. Aquí, el valor
normal quiere decir un valor obtenido por medio del mismo
procedimiento para la lipoproteína en el que el LDL no es de
pequeña
densidad.
densidad.
Como se ha descrito anteriormente, un objeto del
procedimiento de la técnica primera para separar y ensayar las
lipoproteínas por medio del proceso electroforético PAG es
determinar la relación de LDL de pequeña densidad en la
lipoproteína, donde se determina una distancia de migración relativa
de la fracción de LDL con respecto tanto a la fracción de VLDL como
a la fracción de HDL tras la electroforesis. La distancia de
migración relativa refleja la diferencia en los tamaños de las
partículas, pero no refleja las anomalías cualitativas o las
anomalías cuantitativas de las apoproteínas específicas teniendo
cada una de ellas diferentes tipos o diferente número de
apoproteínas. De manera especial, el fraccionamiento de
lipoproteínas utilizando la electroforesis PAG no es preferible para
hacer una comparación entre la fracción LDL normal que no ha sido
modificada y la fracción LDL modificada en la que la apoproteína
B-100 está sometida a alguna modificación. Por otra
parte, una apoproteína en la lipoproteína es directamente
responsable de un metabolismo de lípidos en el cuerpo, de forma que
la detección de una anormalidad de la apoproteína puede ser muy útil
desde un punto de vista clínico.
El documento de los Estados Unidos número
4.909.920 describe un aparato para determinar los componentes
relativos de una muestra líquida, comprendiendo una base, una lámina
de aplicación colocada de manera longitudinal sobre dicha base, un
medio de soporte de electroforesis extraíble asegurado en una
posición sobre una superficie superior de dicha lámina de
aplicación, una lámina de muestra colocada sobre la mencionada base
que tiene al menos dos muestras líquidas, pocillos que tienen
líquido que va a ser muestreado situado en su interior, en el que
dicha lámina de muestra está separada de dicha lámina de aplicación,
un medio robótico para aplicar de manera simultánea al menos dos
muestras líquidas desde dichos al menos dos pocillos de muestras
líquidas de dicha lámina de muestra a dicho medio de soporte,
mientras dicho medio de soporte está en dicha posición sobre la
mencionada lámina de aplicación y un medio para aplicar la corriente
de electroforesis a dicho medio de soporte, mientras dicho medio de
soporte es mantenido continuamente en dicha posición sobre la
mencionada lámina de aplicación. Además, el documento de los Estados
Unidos US 4.909.920 describe un procedimiento para determinar los
componentes relativos de una muestra líquida en dicho aparato.
El documento EP 0 806 659 A1 describe un aparato
para aplicar la electroforesis a una muestra y para después de esto
la exploración en el modo visible o en el modo fluorescente, bajo el
control de un procesador central para proporcionar la densitometría
de exploración de la muestra sometida a la electroforesis, y
realizando in situ la exploración en el modo
fluorescente.
Warnick y colaboradores, en Clin. Chem. 39/6,
1993, 1122, Resumen número 0011, describe una comparación de un
sistema controlado por ordenador automatizado (REP) para la
electroforesis de LDL-CH con el procedimiento de
cuantificación beta (BQ) para el análisis
LDL-CH.
Lynch y colaboradores, en Austr. J. Med. Science
19/4, 1998, páginas 123 a 126 describe un procedimiento
electroforético para la cuantificación clínica rutinaria de lípidos
usando "geles de agarosa en colesterol REP de perfil 15' "
(Laboratorios Helena).
Para resolver los problemas descritos
anteriormente, y para determinar de una manera sencilla un grado de
modificación de lipoproteína que refleje cualquier anormalidad
cualitativa o cuantitativa de apoproteínas en la lipoproteína,
especialmente de LDL modificado, en base a su diferente punto
isoeléctrico en comparación con uno normal, un primer objeto de la
presente invención es proporcionar un procedimiento para separar y
ensayar la lipoproteína en una muestra tal como el suero o el plasma
de seres humanos o de mamíferos.
Un segundo objeto de la presente invención es
proporcionar un conjunto para realizar dicho procedimiento
novedoso.
Un tercer objeto de la presente invención es
proporcionar un sistema que incluya a dicho conjunto y de manera
opcional un dispositivo de cálculo para controlar el conjunto.
Los anteriores objetivos se consiguen por medio
de los procedimientos de acuerdo con las reivindicaciones 13 y 20,
los conjuntos de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 6, los medios
de registro de acuerdo con las reivindicaciones 18 y 27 y los
sistemas de acuerdo con las reivindicaciones 19 y 28. Desarrollos
adicionales de la invención se exponen en las reivindicaciones
dependientes.
En los conjuntos de acuerdo con la presente
invención, la muestra estándar puede ser un suero estándar que no
contenga lipoproteína modificada, el espécimen puede ser un suero,
la muestra de indicador puede ser un suero almacenado añadiendo un
estabilizador, y el primer componente predeterminado puede ser un
lípido.
En los procedimientos de acuerdo con la presente
invención, la muestra estándar puede ser un suero estándar que no
contenga lipoproteína modificada, el espécimen puede ser un suero,
la muestra de indicador puede ser un suero almacenado añadiendo un
estabilizador, y el primer componente predeterminado puede ser un
lípido.
Cuando se usa un aparato electroforético de
lámina de agarosa en el procedimiento para separar y ensayar
lipoproteína y el conjunto que se vaya a usar para realizar dicho
procedimiento de acuerdo con la presente invención, se usa una
película delgada de agarosa para la lámina.
De manera alternativa, también se puede usar una
película delgada caracterizada por comprender una mezcla de agarosa
y agar (se hace referencia en este documento de aquí en adelante a
dicha lámina como el gel de agarosa). Esta lámina de agarosa en
forma de agarosa o en forma de gel de agarosa se prepara de manera
preferible a partir de una solución usando en un intervalo de
concentración de 0,4% (p/p) a 1,2% (p/p), de manera más preferible
0,5% (p/p) a 0,8% (p/p) respecto a la solución de tampón. Además, la
tensión aplicada durante la electroforesis es preferiblemente de 200
a 500 V cuando se usa una película delgada de agarosa de 120 mm de
longitud, 130 mm de anchura y 500 micrómetros de grosor de película.
Además, adicionalmente es preferible que una lámina caracterizada
porque comprenda gel de agarosa contenga albúmina de suero bovino
(BSA) de entre 0,01 a 0,5% (P/P).
En lugar de usar el anterior gel de agarosa, se
puede usar un aparato electroforético que use una lámina basada en
el acetato de celulosa, agar y similares o un aparato
electroforético de capilar.
Los anteriores objetos y otros objetos, efectos,
características y ventajas de la presente invención serán más
aparentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones
de la misma tomada junto con los dibujos que la acompañan.
La figura 1 es un patrón electroforético
esquemático de lipoproteína en el suero obtenido por medio de una
electroforesis, que explica el principio de la presente
invención;
La figura 2 es un diagrama esquemático para
explicar un sistema para separar y para ensayar la lipoproteína y
que comprende un aparato electroforético, un densitómetro y un
ordenador, aplicado a un procedimiento para separar y ensayar
lipoproteína de acuerdo con la presente invención;
La figura 3 es un diagrama de flujo para explicar
un proceso de preparación de patrón electroforético por medio de la
electroforesis aplicada a un procedimiento para separar y para
ensayar lipoproteína de acuerdo con la presente invención;
La figura 4 es un diagrama esquemático de una
pantalla de configuración de la condición de medida visualizada
sobre una CRT proporcionada en un sistema para separar y ensayar
lipoproteína de acuerdo con la presente invención;
La figura 5 es un diagrama de bloque para
explicar la configuración de un densitómetro y un ordenador
proporcionado en un sistema para separar y ensayar lipoproteína de
acuerdo con la presente invención;
La figura 6 es un diagrama esquemático que
muestra una pantalla CRT para la introducción de las condiciones
necesarias para la pantalla fijando la posición de aplicación, como
un ejemplo de pantalla visualizada en el CRT proporcionado en un
sistema para separar y ensayar lipoproteína de acuerdo con la
presente invención;
La figura 7 es un diagrama esquemático que
muestra una pantalla CRT para introducir datos de marcador, como un
ejemplo de pantalla visualizada en el CRT proporcionado en un
sistema para separar y para ensayar lipoproteína de acuerdo con la
presente invención;
La figura 8 es un diagrama de flujo para explicar
un primer procedimiento para separar y ensayar lipoproteína de
acuerdo con la presente invención.
La figura 9 es un diagrama de flujo para explicar
un segundo procedimiento para separar y ensayar lipoproteína de
acuerdo con la presente invención;
La figura 10 es un diagrama esquemático que
muestra una pantalla CRT que visualiza de manera gráfica y numérica
a través del ordenador, visualizando los resultados obtenidos por un
densitómetro proporcionado en un sistema para separar y ensayar
lipoproteína de acuerdo con la presente invención;
La figura 11 es un diagrama esquemático que
muestra una pantalla CRT que visualiza de manera gráfica y numérica
a través del ordenador, visualizando los resultados obtenidos por un
densitómetro proporcionado en un sistema para separar y ensayar
lipoproteína de acuerdo con la presente invención; y
La figura 12 es un diagrama esquemático que
muestra una pantalla CRT que visualiza de manera gráfica y numérica
a través de un ordenador, visualizando los resultados obtenidos por
un densitómetro proporcionado en un sistema para separar y ensayar
lipoproteína de acuerdo con la presente invención.
El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteína de acuerdo con la presente invención usa una
electroforesis para determinar un grado de modificación de
lipoproteína, por ejemplo, el grado de modificación del LDL
modificado de acuerdo con un cambio en el punto isoeléctrico causado
por las anomalías cualitativas y cuantitativas de la apoproteína
contenida en la lipoproteína por medio de un simple
procedimiento.
Aquí, el LDL será descrito principalmente como un
ejemplo que lleva colesterol sintetizado en el hígado a otros
tejidos.
El LDL es un factor peligroso de las enfermedades
de arteriosclerosis (infarto de miocardio, estenocardia, infarto
cerebral y similares), y es importante para el tratamiento de las
enfermedades de arteriosclerosis para investigar las anomalías
cuantitativas y cualitativas del LDL. Como ya se ha descrito, la
apoproteína LDL está compuesta solamente de B-100,
cuando se modifica el componente de lípido que constituye el LDL, la
cantidad de carga negativa de apoproteína B-100
cambia. Por lo tanto, cuando una muestra que contiene LDL que tenga
lípido modificado es sometida a electroforesis en el punto
isoeléctrico, el LDL modificado muestra diferente movilidad de la de
el LDL de una muestra estándar (se supone que es sin contener lípido
modificado). Los inventores han llevado a cabo el procedimiento para
separar y ensayar lipoproteína usando electroforesis como se
describe más adelante con vistas a una diferencia entre LDL normal y
LDL modificado.
El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteína de acuerdo con la presente invención utiliza un
procedimiento electroforético usando una lámina basada en agarosa o
en acetato de celulosa como un ingrediente principal. Aquí, se
describe un procedimiento electroforético usando agarosa como una
lámina. La agarosa se usa como una lámina en electroforesis de ácido
nucleico y proteínas porque las moléculas de los mismos están unidas
mediante hidrógeno unas con otras para formar una estructura de red,
la preparación de una solución es fácil, es no tóxica y la operación
de extracción tras la electroforesis es sencilla.
En la presente invención, se estudia la
concentración de agarosa para habilitar la separación de
lipoproteína, y se determina que la agarosa se disuelve y se usa en
un margen de concentración de 0,5% (P/P) a 1,2% (P/P) en una
solución de tampón tal como tris-barbital, barbital
sodio tristin o similares.
Cuando se usa una película delgada de agarosa de
120 mm de longitud, 130 mm de anchura y 500 micrómetros de grosor de
la película, la tensión aplicada en la electroforesis se fija en 300
a 500 V, de 30 a 70 mA. Sin embargo, se requiere que la temperatura
de la lámina de agarosa permanezca constante en el intervalo
generalmente de 10ºC a 25ºC durante la electroforesis. La
distribución de temperatura sobre la lámina se encuentra
preferiblemente dentro de \pm 1º , más preferiblemente dentro de
\pm 0,5ºC, porque la movilidad cambia con la temperatura.
La lámina que comprende agarosa usada en la
presente invención contiene la cantidad predeterminada de 0,01% a
0,5%, de manera más preferible 0,04% a 0,2% de albúmina de suero
bovino (BSA). Esto es porque si el ácido graso libre en el suero
sobrepasa una cantidad predeterminada, afecta a la velocidad de
separación de HDL, VLDL, LDL y demás, sin embargo, conteniendo BSA
en la lámina, se evita que la velocidad de separación sea
cambiada.
Además, como tipos de aparatos electroforéticos,
se conoce un tipo horizontal y un tipo vertical, y se puede usar
cualquiera de estos tipos. Sin embargo, en la presente realización
se describe un uso de un tipo horizontal de aparato electroforético.
En la presente invención, se usa REP de HELENA LABORATORIES
CORPORATION (EE.UU.) como un aparato electroforético, sin embargo,
la presente invención no está limitada a este tipo.
El principio del procedimiento para separar y
ensayar lipoproteína de acuerdo con la presente invención será
descrito con referencia a la figura 1. En la figura, el número de
referencia 100 indica un patrón electroforético (de aquí en adelante
se hará referencia al mismo simplemente como el patrón) formado
sobre una lámina de agarosa (también denominada película delgada de
agarosa), 101 es un agujero de muestra formado sobre la lámina
(también denominado un punto de aplicación) y 102 y 103 son agujeros
utilizados cuando se posiciona la lámina sobre un densitómetro (que
será descrito más adelante). En la figura 1, se obtienen cinco
patrones electroforéticos aplicando cinco tipos diferentes de
muestras dentro de cinco agujeros de muestra 101 y sometiéndolos a
electroforesis. Primero, se describirá un ejemplo de separación y de
ensayo de un lípido en la primera y segunda muestras.
El primer ejemplo, (al que se hará referencia de
aquí en adelante como la muestra estándar (1)) es un suero estándar.
Esto es, ha sido muestreado de gente joven y sana que no tiene
enfermedades que afecten a la lipoproteína del suero tales como
enfermedades cardiovasculares, en las que se asume que no se nota de
manera sustancial modificación de LDL. En la figura 1, se muestran
las fracciones de LDL (lipoproteína de baja densidad), VLDL
(lipoproteína de muy baja densidad) y HDL (lipoproteína de alta
densidad) obtenidas mediante electroforesis de la muestra estándar
(1). La distancia desde el punto de aplicación 101 a la posición
central de la fracción LDL está representada por "a".
La segunda muestra (a la que se hace referencia
de aquí en adelante como el espécimen (2) es suero con una alta
probabilidad de que contenga LDL modificado, muestreado de un
paciente que tiene o que se sospecha que tiene una enfermedad que
afecta a la lipoproteína del suero, tal como las enfermedades
cardiovasculares. El espécimen (2) tiene potencial para la
modificación del LDL. Cuando el espécimen (2) es sometido a
electroforesis, las fracciones de LDL, VLDL y HDL se obtienen como
con la primera muestra. Sin embargo, la movilidad de cada fracción
es diferente de la muestra estándar (1). Aquí, la distancia desde el
punto de aplicación 101 del espécimen (2) hasta la posición central
de una fracción 104 correspondiente a LDL (de aquí en adelante
simplemente referida como fracción LDL) está representada como
"b".
En la fracción LDL 104 del espécimen (2) se
considera que cuando el LDL es modificado, se incrementa la carga
negativa de apoproteína B-100 que forma el LDL
modificado, en comparación con el LDL normal de la muestra estándar
(1). Por lo tanto, como la velocidad de modificación del LDL
modificado es más rápida que la velocidad de modificación del LDL
normal, da como resultado que la distancia "b" es mayor que la
distancia "a". Por ejemplo, por lo tanto el grado de
modificación del LDL contenido en el espécimen (2) o el grado de
modificación del componente predeterminado contenido en el LDL se
puede estimar obteniendo la movilidad relativa "z = (b/a)" de
la distancia "b" a la distancia "a" y haciendo entonces
una comparación entre la distancia "a" y la distancia "b".
A propósito, el término "componente predeterminado" denota un
lípido específico tal como el colesterol o una proteína tal como la
apoproteína contenida en la lipoproteína. Además, el término
"grado de modificación de componente predeterminado" denota una
relación, frecuencia, símbolo de clasificación, porcentaje o similar
del grado de modificación del componente predeterminado tal como LDL
o lípido, además de una movilidad relativa de por sí.
Se describirá un ejemplo de representación del
grado de modificación. Si el LDL contenido en el espécimen no es
modificado, la distancia "a" es igual a la distancia "b",
y de esta forma, la movilidad relativa "z" toma un valor de
"1 (uno)". De esta forma la relación de modificación "M"
del espécimen puede ser obtenida restando "1 (uno)" de la
movilidad relativa "z". Esto es, el grado de modificación del
espécimen puede ser representado como la relación de modificación
"M" sustituyendo la movilidad relativa "z" dentro de una
ecuación de:
(1)M = b / a - 1 = (b - a) /
a
De acuerdo con la ecuación (1), la movilidad
relativa "z" toma un valor "1 (uno)" si el espécimen no es
modificado y por tanto la relación de modificación "M" del
espécimen toma un valor de "0 (cero)". Si la relación de
modificación "M" toma un valor mayor de cero (es decir, M >
0), se determina que el LDL es un LDL modificado. Si la relación de
modificación "M" toma un valor más pequeño que cero (es decir,
M < 0), juzgamos que el LDL es un LDL modificado con una
anormalidad de su componente. Si la relación de modificación
"M" toma un valor negativo, en general, se sospecha que hay una
enfermedad del tracto hepático o biliar y similares.
La frecuencia de modificación "M'" de la
lipoproteína se puede representar como un número entero por medio de
la siguiente ecuación (2) en la que la constante "k" (k > 0)
puede ser de manera apropiada y selectivamente cualquier valor.
(2)M' = k (b / a - 1) = k (b
- a) /
a
La frecuencia de modificación "M'" puede ser
representada también como un símbolo de clasificación tal como
"grande", "media" o "pequeña". Para otra
representación, la frecuencia de modificación de LDL puede ser
representada también como una relación de la distancia "a"
desde un punto de aplicación de la muestra estándar cuando la
frecuencia de modificación "M'" esté representada como un
porcentaje de "a / a + b".
Además, cuando los datos sobre la movilidad
relativa y sobre el grado de modificación de la muestra que contiene
LDL modificado correspondiente a las respectivas enfermedades y la
muestra estándar (1) son acumulados por diferentes enfermedades del
tracto hepático y biliar en memoria de un ordenador que será
descrito más adelante, se puede determinar una enfermedad
correspondiente al espécimen (2) por medio de la introducción de la
distancia "b" del espécimen (2) y de la distancia "a" de
la muestra estándar (1), y la comparación de esas distancias con los
datos introducidos.
A continuación, en lugar de la muestra estándar
(1), se describe un caso en el que se usa una tercera muestra (a la
que se hace referencia de aquí en adelante como control (3)) como
una muestra de indicador. El control (3) comprende suero humano, por
ejemplo, preparado como se muestra más adelante. Esto es, se recogen
sueros frescos de valores totales de colesterol y de triglicéridos
dentro del intervalo normal, a los que se añade una mezcla de 100 mg
de EDTA\cdot2Na\cdot2H_{2}O y 25 gr de sacarosa como
estabilizador en una cantidad de 2,5 gr por cada 10 cc de suero. A
continuación, la mezcla se divide en pequeños elementos y se
liofilizan o se congelan a -20ºC para su conservación. Las
liofilizadas y el control almacenado (3) se disuelven con igual
volumen de agua destilada o agua purificada antes de su uso. El
control congelado (3) es descongelado a temperatura ambiente antes
de usar.
Cuando el control así preparado (3) es sometido a
electroforesis, se obtiene un diagrama como el que se muestra en la
figura 1. Entonces, si la muestra estándar (1) no se encuentra
disponible, determinando previamente la movilidad relativa de la
distancia de migración de la fracción 105 correspondiente al LDL del
control (3) (a la que se hará referencia de aquí en adelante
simplemente como la fracción de marcador) y la distancia de
migración de la fracción LDL de la muestra (1), se puede determinar
también por medio de conversión el grado de modificación.
Por ejemplo, donde se asuma que la distancia
desde el punto de aplicación a la posición central de la fracción
LDL es "a" en la muestra estándar (1), se asuma como "b"
en el espécimen (2), y la distancia desde el punto de aplicación a
la posición central de la fracción de marcador como "c" en el
control (3), una movilidad relativa "z_{1}" del control (3) a
la muestra estándar (1) es representada por medio de "z_{1} = c
/ a" (esto es, "a = c / z_{1}"). Por otra parte, una
movilidad relativa "z_{2}" del espécimen (2) respecto de la
muestra estándar (1) está representado por "z_{2} = b / a".
Por lo tanto, "z_{1} = b\cdotz_{1} / c", si la distancia
"a" de la muestra estándar no se puede medir, cuando la
movilidad relativa "z_{1}" respecto al control (3) es
conocida previamente, la movilidad relativa "z_{1}" puede
determinarse midiendo la distancia "c" del control (3) y la
distancia "b" del espécimen (2). Además, la movilidad relativa
obtenida "z_{1}" puede ser procesada de manera adicional como
se ha mostrado antes para determinar el grado de modificación.
A continuación, se describe un caso en el que se
usa una enzima de deshidrogenación de alcohol comprendiendo un
marcador como una muestra de indicador en lugar de usar la muestra
estándar (1) o el control (3). En la figura 1, una cuarta muestra (a
la que se hará referencia de aquí en adelante como muestra (4)) es
una muestra preparada añadiendo al espécimen un marcador que
comprende una enzima de origen equino de deshidrogenación del
alcohol. Además, una quinta muestra (a la que se hará referencia de
aquí en adelante como la muestra (5)) es una muestra preparada
añadiendo al espécimen un marcador que comprende una enzima de
origen bacteriano de deshidrogenación del alcohol.
Para los respectivos marcadores (a los que
también se hace referencia como las muestras de indicador)
comprendiendo enzimas de origen equino o bacteriano de
deshidrogenación del alcohol, la enzima de deshidrogenación del
alcohol es preparada dentro de una dispersión de sulfato de amonio y
es preparada de forma que cuando se añade 1 \mul de enzima de
deshidrogenación del alcohol a 50 \mul de muestra, una cantidad de
desarrollo de color está en torno a 80 mg/dl en la concentración de
colesterol, y se ajusta la relación de mezcla de cada enzima y el
sulfato de
amonio.
amonio.
Además, por ejemplo, cuando se investiga un grado
de modificación del colesterol contenido en la lipoproteína para
desarrollar color del marcador (por ejemplo, TITAN GEL S CHOLESTEROL
comercializado por HELENA LABORATORIES CO., LTD. (Japón))
comprendiendo enzima de deshidrogenación del alcohol, se añade 1
\mul de etanol como una lámina de la encima de deshidrogenación
del alcohol a 1 ml de reactivo de medida del colesterol. Como
resultado, por el etanol y el NAD en el reactivo de medida del
colesterol y la enzima de deshidrogenación del alcohol del reactivo,
el NAD es convertido a NADH^{+}H, adicionalmente por la diaforasa
y sal de tetrazolio de la enzima de deshidrogenaición del alcohol,
formando formazán, el mismo como en el reagente de medida del
colesterol, cuando reacciona con el colesterol, lo que desarrolla un
color. Aquí, el anterior NADH^{+}H puede ser detectado por medio
de medida fluorescente usando un reactivo de medida fluorescente tal
como el REP Flur Colesterol Profile-Kit
comercializado por HELENA LABORATORIES CORPORATION (EE.UU.).
Cuando el marcador así preparado que comprende
enzima de origen equino o bacteriano de deshidrogenación del alcohol
se mezcla con el espécimen y se somete a electroforesis, se obtiene
un patrón electroforético como el que se muestra en la figura 1.
Cuando se usa una muestra (4) que comprende el marcador y el
espécimen, el marcador es separado del espécimen y se obtiene una
fracción de marcador 106 que es situada en el lado opuesto de la
fracción LDL 104 contenida en el espécimen al punto de aplicación.
Esta fracción 106 es considerada como la fracción correspondiente a
la fracción de LDL de la muestra estándar ya descrita (1). Además,
cuando se usa la muestra (5), la fracción de marcador 107 generada
entre la fracción VLDL y la fracción HDL es considerada como la
fracción correspondiente a LDL de la muestra estándar (1). En cada
caso, determinando con anterioridad la movilidad relativa de la
distancia "a" de la muestra estándar (1) con respecto a la
distancia "c" del punto de aplicación de la muestra (4) ó (5)
al marcador, se puede investigar el grado de modificación de LDL
modificado en el espécimen usando el mismo procedimiento que en el
caso en el que se usa el control (3). En el caso de usar la muestra
(4), existe una ventaja que se puede realizar la determinación
cuantitativa de otras fracciones fácilmente sin añadir la fracción
de marcador. El caso de usar la muestra (5) tiene la ventaja de que
no es necesario realizar un control de temperatura de manera tan
estricta durante la electroforesis.
Además, se puede añadir y usar un marcador que
comprenda una enzima de origen equino o bacteriano de
deshidrogenación del alcohol al control (3).
Lo anterior es lo esencial del procedimiento para
separar y ensayar lipoproteína de acuerdo con la presente invención.
Sin embargo, el grado de modificación en la presente invención puede
ser no solo comparación de la muestra estándar o la muestra de
indicador y el espécimen sino también una comparación entre muestras
de la misma especie. Por ejemplo, cuando se examina la modificación
de una muestra de la misma especie in vitro respecto a una
muestra original, la muestra original como una muestra estándar se
usa y se introduce un entero positivo 1 sobre el elemento de la
movilidad relativa.
La separación y el ensayo anteriormente descritos
de lipoproteína es un procedimiento por medio de electroforesis
usando una lámina de agarosa y puede ser usado en un sistema
construido como se muestra a continuación.
La figura 2 es un diagrama que muestra un ejemplo
de construcción del sistema para separar y ensayar lipoproteína de
acuerdo con la presente invención. El sistema para separar y ensayar
lipoproteína comprende un aparato electroforético automático 201
para realizar la separación de lipoproteína, un densitómetro 206
para leer el patrón electroforético obtenido por medio del aparato
electroforético automático 201, y un cuerpo principal de ordenador
204 para controlar el funcionamiento del aparato electroforético
automático 201 y el densitómetro 206 y procesar los datos
provenientes del densitómetro 206 de acuerdo con el procedimiento
para separar y ensayar lipoproteína de la presente invención y sacar
o almacenar los resultados de procesamiento a la pantalla del
ordenador, en un medio de almacenamiento, impresora o similar.
El aparato electroforético automático 201 tiene
la misma configuración que la normalmente usada por un aparato
electroforético que tenga una sola mesa 214, un aplicador 212, un
estante de botellas de reactivo 218 y una cámara electroforética
216.
El densitómetro 206 es un dispositivo para medir
la densidad de cada componente fraccionado por medio de la
electroforesis utilizando la absorción y la reflexión de la luz, el
cual es conectado al cuerpo principal del ordenador 204 y el
funcionamiento del mismo es controlado por medio del ordenador.
El ordenador comprende el cuerpo principal de
ordenador 204, los dispositivos de entrada (teclado 203, ratón 208),
un dispositivo de pantalla (CRT) 202, y un dispositivo de salida
(impresora) 205.
El número de referencia 207 en la figura indica
una fuente de alimentación para alimentar el aparato electroforético
201.
A continuación, se describirá el funcionamiento
del conjunto anteriormente construido para separar y ensayar
lipoproteína.
Primeramente, se realiza el fraccionamiento de la
lipoproteína usando el aparato electroforético automático 201 y la
preparación del patrón electroforético. Como el funcionamiento
normal de un proceso electroforético es bien conocido por una
persona experta, excepto para puntos específicos de la presente
invención, la descripción será simplificada.
El desarrollo de la muestra se puede realizar,
como se muestra en la figura 1, por medio de una combinación de la
muestra estándar (1) con el espécimen (2), o una combinación de
espécimen (2) con el control (3). En el caso de la muestra (4) o la
muestra (5) que contengan el marcador, el desarrollo de cada muestra
se puede realizar en combinación con el espécimen (2) o solamente
mediante la mezcla con el espécimen (2).
A continuación, se describe un ejemplo de
separación y de ensayo de lipoproteína usando el sistema para
separar y ensayar lipoproteína mostrado en la figura 2.
Primero, una película delgada de agarosa usada
para la lámina del aparato electroforético se prepara por medio de
la solidificación de una cantidad predeterminada de solución de
agarosa. En este momento, para formar la película delgada de agarosa
con la forma deseada, se usan una película delgada de plástico
provista de agujeros de punta de fijación 102 y 103 (véase la figura
1) y un molde de metal provisto de puntas que se corresponden con
estos agujeros y facilitar el posicionamiento. En el presente
aparato electroforético, está formado de forma que la lámina de
agarosa pueda mantener una solución electroforética de tampón. Para
este propósito, el molde de metal es grueso en la parte del
electrodo para sostener la solución de tampón, y tiene una forma tal
que se forma un agujero de muestra 101 en la parte de aplicación de
la muestra. Los agujeros de punta de fijación 102 y 103 de la
película delgada de plástico están alineados con el anterior molde
de metal, presionados con una lámina plana desde el lado superior,
entonces la solución de agarosa es vertida dentro del molde de
metal, y solidificada para preparar la película delgada de agarosa.
La película delgada de agarosa se puede preparar y almacenar
previamente, o se puede usar un producto comercial tal como REP LIPO
30 PLATE comercializado por HELENA LABORATORIES CO., LTD.
(Japón).
A continuación, en la cámara electroforética 216
de la figura 2, dos agujeros de puntas de fijación 102 y 103 (véase
la figura 1) de la película delgada de agarosa usados en el ensayo
son insertados con las puntas de prueba (no mostradas) de la cámara
electroforética 216 hasta un contacto próximo con el fondo de la
cámara electroforética 216. Una varilla de desarrollo de reactivo
que tiene cuerpos magnéticos en ambos extremos y una varilla de
electrodo son atraídas al electrodo como un imán para hacer contacto
con la película delgada de agarosa (lámina electroforética), y la
puerta de la cámara electroforética se cierra. Se prepara una
botella de reactivo de colesterol sobre el estante de botellas de
reactivo 218, y se lleva sobre la mesa de muestra 214.
Tras completar la preparación de la
electroforesis como se ha descrito antes, se comienza la
electroforesis para preparar un patrón electroforético. Primero, se
introduce una instrucción de inicio de la electroforesis desde el
teclado 203. Esto envía la instrucción de comienzo de la
electroforesis desde el ordenador hasta el aparato
electroforético.
A continuación, se describirá el procedimiento de
preparación del patrón electroforético con referencia a la figura
3.
Cuando el aparato electroforético 201 recibió la
instrucción de inicio de la electroforesis desde el cuerpo principal
del ordenador 204, la muestra sobre la tabla de muestras 214 es
inyectada en un surco de muestra 101 (S301).
A continuación, se aplica a la película delgada
de agarosa una tensión eléctrica para iniciar la electroforesis
(S302).
Después de que haya pasado un tiempo
predeterminado y se haya completado la electroforesis, se desarrolla
el reactivo de desarrollo de color tal como el reactivo de medida de
colesterol (S303).
La película delgada de agarosa está impregnada y
se le ha hecho reaccionar con el reactivo de desarrollo de color
para teñir la película delgada de agarosa durante un tiempo
predeterminado y una temperatura predeterminada (por ejemplo, 30ºC)
(S304).
Como un reactivo de desarrollo del color para
detectar el componente de colesterol, se puede usar un reactivo de
medida del colesterol tal como TITAN GEL S CHOLESTEROL
comercializado por HELENA LABORATORIES CO., LTD. (Japón). A
continuación, la película delgada de agarosa teñida es fijada con
ácido acético al 5% (S305) y secada (S306).
Como resultado de dicho trabajo, por ejemplo, se
obtiene un patrón electroforético como el que se muestra en la
figura 1 (en lo que sigue se hará referencia al mismo como el patrón
electroforético).
Tras haber obtenido el patrón electroforético
usando el procedimiento descrito anteriormente, se lee la
concentración y la posición de cada fracción constitutiva del patrón
electroforético desarrollado sobre la película delgada de agarosa
por medio del densitómetro 206.
La película delgada de agarosa descrita con el
patrón electroforético se fija en posición sobre el densitómetro 206
(figura 2). Esto es, las puntas de una alimentación de patrón
electroforético 522 (figura 5) se posicionan con los agujeros de
puntas de fijación de película delgada de agarosa 102 y 103 (figura
1). La configuración de la condición de exploración del patrón
electroforético se puede llevar a cabo sobre la pantalla visualizada
en el CRT202 conectada al cuerpo principal del ordenador 204. En la
figura 4 se muestra un ejemplo de dicha pantalla.
Una programación (aplicación predeterminada)
almacenada en el cuerpo principal del ordenador 204 es leída para
visualizar una pantalla de configuración de la condición de
exploración (esto es, la pantalla de configuración de parámetro de
exploración 401) como se muestra en la figura 4 en el CRT 202. En la
pantalla de configuración de parámetro de exploración 401, el nombre
del elemento que vaya a ser examinado es seleccionado del nombre del
elemento 402, y entonces se ordena al explorador 402 que inicie la
medida. En la pantalla mostrada, se selecciona "Colesterol" en
el nombre del elemento 402. La configuración de la configuración
adicional de exploración detallada se realiza sobre la parte de
configuración de parámetros 404 en la parte inferior de la pantalla,
y la entrada de cada parámetro (condición) se realiza utilizando el
ratón 208 y el teclado 203.
De manera alternativa, se puede usar una
configuración por defecto fijada anteriormente. Cuando no sea
necesario cambiar la configuración por defecto, la entrada de la
secuencia de exploración (Secuencia de exploración) 405 (figura 4)
es suficiente. En este caso, se pulsa el botón de exploración 403
por medio del ratón 208 o se pulsa una tecla predeterminada de atajo
en el teclado 203.
Cuando se haya iniciado la exploración del patrón
electroforético por parte del densitómetro 206, los datos de
velocidad del patrón electroforético transportados en el
densitómetro y los datos de cambio en la cantidad de luz transmitida
a través del patrón electroforético detectado por el densitómetro
206 son introducidos al cuerpo principal del ordenador 204. En base
a estos datos, la posición y la concentración relativas de cada
fracción constituyente del patrón electroforético son calculadas por
el cuerpo principal del ordenador 204. Estos procesos serán
descritos en detalle con referencia a la figura 5.
La figura 5 es un diagrama de bloques para
explicar la configuración del densitómetro y del ordenador. A
continuación, por simplicidad de explicación, se explicará un caso
en el que una combinación del espécimen (2) y del control (3) es
sometida a la electroforesis.
Primero, con la preparación de la medida
completada como se ha dicho anteriormente, se pulsa el botón de
exploración 403 para iniciar la medida. La luz de medida del haz
(flecha B en la figura) transmitida desde un sistema óptico 524
(figura 5) pasa a través de un corte (no mostrado) y a través de un
patrón electroforético 100. Pasando la luz de medida del haz B a
través del patrón electroforético 100, parte de la luz es absorbida
por el patrón electroforético 100 para convertir un cambio en la luz
de medida del haz B, y la cantidad de cambio es cogida como una
fuerza electromotriz por medio de un dispositivo receptor de luz
526. La cantidad de cambio recogida por el dispositivo de recepción
de luz 526 es amplificada logarítmicamente por medio de un
amplificador logarítmico 528, convertida a un valor digital por
medio de un conversor A/D 530, y almacenada en un medio de registro
(por ejemplo, un disco duro) incorporado en el cuerpo principal del
ordenador 204. Ordenando una salida del resultado del examen, se
puede visualizar un gráfico 532 que traza un valor integrado sobre
el eje de las ordenadas frente a la dirección de exploración sobre
el eje de las abcisas sobre el CRT 202, o se puede sacar por
impresora 205. Además, el cuerpo principal del ordenador 204, en
base al valor integrado de la forma de onda, convierte cada fracción
en porcentaje, y la concentración de cada fracción puede
determinarse a partir de la concentración total ya determinada. Como
las puntas de la alimentación del patrón electroforético 522 y los
agujeros de las puntas de fijación del patrón electroforético 102 y
103 (figura 1) están en línea unas con los otros, y el punto de
aplicación de muestra se determina por medio de los agujeros de las
puntas de fijación 102 y 103, el punto de aplicación de muestra
siempre se fija en la misma
posición.
posición.
Cada fracción de lipoproteína que contiene
colesterol, teñida con un reactivo de medida del colesterol, muestra
un espectro de absorción de luz específico dependiendo del reactivo
de desarrollo del color. Por ejemplo, cuando se detecta colesterol
usando un reactivo de medida de colesterol tal como TITAN GEL S
CHOLESTEROL comercializado por HELENA LABORATORIES CO., LTD.
(Japón), el componente de colesterol en la lipoproteína reacciona
con un componente en el reactivo de medida de colesterol para formar
formazán. Por lo tanto, el patrón electroforético puede ser
explorado a una longitud de onda de 570 nm correspondiente al
espectro de absorción del formazán. El gráfico obtenido sobre la
fracción de lipoproteína (colesterol) es almacenado en un medio de
registro tal como un disco duro. En las figuras 10 a la 12 se
muestran ejemplos de gráfico sobre la fracción de lipoproteína
almacenados de esta forma en un medio de registro (serán descritos
más adelante).
El cuerpo principal del ordenador 204 se
sincroniza con la alimentación de patrón electroforético 522 para
obtener información posicional de la alimentación del patrón
electroforético. El teclado 203 se usa cuando se introduce una
instrucción o se introducen datos al cuerpo principal del ordenador
204. La impresora 205 se usa para preparar un informe de resultado
del examen. Un conversor de E/S 534 se usa para la comunicación tal
como el intercambio de datos con los terminales de un ordenador
externo.
Las figuras 6 y 7 son pantallas que se visualizan
en el CRT 202 conectado con el ordenador para realizar la entrada o
el registro de la posición de aplicación, los valores de control
(datos) y similares.
La posición de aplicación 604 (figura 6) es
seleccionada con el ratón (figura 2) para fijar el punto de
aplicación de la muestra sobre la lámina para la electroforesis. Por
ejemplo, cuando se realiza una medida de fraccionamiento del
colesterol como una fracción de lipoproteína, el "colesterol"
es instruido sobre el nombre del elemento 601. A continuación, los
datos son introducidos para el inicio de la exploración (comienzo)
602 y el final de la exploración (fin) 603. Cuando se hace coincidir
la luz del haz del corte del sistema óptico con el punto de
aplicación 101 (figura 1) del patrón electroforético, y la posición
de aplicación 604 es seleccionada con el ratón 208 (figura 2), los
datos de la posición de aplicación, por ejemplo, el número
"1590" son visualizados en la posición de aplicación 607
(figura 6). Sin embargo, el número visualizado en la posición de
aplicación 607 (aquí, "1590") debe ser un número que caiga
entre el número "2003" visualizado en el inicio de la
exploración 602 y el número "1535" visualizado al final de la
exploración 603.
Cuando se usa la misma posición de configuración
para el mismo elemento, se selecciona con el botón del ratón 208 una
copia gradual 606 (figura 2) para instruir todos los números de
etapa, y se selecciona el registro 608 (figura 6) para el registro
de instrucción. Como, por medio de dicha operación, los datos son
registrados en el medio de registro del ordenador, posteriormente
cuando se realiza la medida de fraccionamiento del
"colesterol", no es necesaria la entrada repetida. Cuando se
selecciona un botón de confirmación 605 con el ratón 208, la luz de
haz del corte se mueve a la posición del punto de aplicación para
confirmar si la posición de aplicación es o no es cogida de manera
exacta.
Cuando se selecciona un registro de control 609
(figura 6) con el ratón 208 (figura 2), se abre un menú de entrada
de valor de control de la figura 7.
A continuación, los datos (aquí, "1,125") de
movilidad relativa 701 (figura 7) y de la distancia LDL 702 (aquí,
"64") son introducidos en la pantalla mostrada en la figura 7.
Aquí, la movilidad relativa 701 es la relación del valor c de
control (3) respecto del valor a de la muestra estándar (1). Además,
la distancia LDL 702 muestra una distancia "c" desde el punto
de aplicación del control (3) a la posición central de la fracción
de LDL. La distancia LDL 702 se usa también para el propósito de
corregir las diferencias delicadas entre varias películas delgadas
utilizables como láminas para la electroforesis. Después de que se
hayan introducido los valores respectivos, cuando se selecciona
registro 703 con el ratón 208 (figura 2), los datos son registrados
en el cuerpo principal del ordenador 204, y se obtiene la frecuencia
de modificación.
A continuación, se describen en detalle los
procedimientos para determinar la frecuencia de modificación del
LDL.
Se describirá un primer procedimiento con
referencia al diagrama de flujo mostrado en la figura 8. Por
ejemplo, la distancia de migración "a" desde el punto de
aplicación de la muestra estándar (1) a la posición central de la
fracción de LDL se asume como a = 55 puntos (S801), y la distancia
de migración "b" desde el punto de aplicación del espécimen (2)
a la posición central de la fracción LDL como b = 70 puntos (S802).
En este caso, la movilidad relativa z es z = b / a = 1,273 (S803).
El término "punto" usado en este documento, por ejemplo, si el
intervalo de medida (intervalo de exploración) se especifica como
256 puntos, quiere decir que el intervalo de medida está dividido
por 256.
Como la movilidad relativa de un espécimen (2)
del LDL no modificado es "1", la relación de modificación es
"1,273 - 1 = 0,273". Este valor "0,273" se puede dividir
por un valor predeterminado para determinar una frecuencia de
modificación (S804). Sin embargo, es necesario determinar cuántas
etapas en las que se divide la relación de modificación "0,273"
son las apropiadas para representar la frecuencia de modificación, y
el intervalo por división se incorpora en el programa como un valor
predeterminado. Por ejemplo, cuando el intervalo por división es de
"0,1", la relación de modificación de "0,273" es
representada como la frecuencia de modificación "2,73"
(S805).
Además, mediante el uso de un símbolo de
clasificación apropiado tal como grande, medio y pequeño, y
determinando el intervalo de valores correspondientes a estos
símbolos, el valor previamente obtenido (aquí, "0,273") se
puede visualizar por medio del símbolo grande, medio o pequeño
correspondiente al valor. Aún más, el valor obtenido también puede
ser visualizado en porcentaje.
A continuación, se describirá un segundo
procedimiento con referencia al diagrama de flujo mostrado en la
figura 9. Por ejemplo, en el caso en el que la distancia "b"
desde la posición de aplicación del espécimen (2) a la posición
central de la fracción LDL sea b = 70 puntos (S901), la distancia
"c" desde la posición de aplicación del control (3) a la
posición central de la fracción LDL sea de "c" = 60 puntos
(S902), y la movilidad relativa del control (3) sea "c / a" =
1,125 (S903), se determina la frecuencia de modificación del LDL
contenido en el espécimen. La distancia "a" desde la posición
de aplicación de la muestra estándar (1) a la posición central de la
fracción LDL es "a" = "c / 1,125" = 53 puntos, la
movilidad relativa "z" del espécimen (2) y de la muestra
estándar (1) es "z" = "b / a" = 70 / 53 = 1,32. Por lo
tanto, como la movilidad relativa del espécimen (2) que no contiene
LDL modificado es "1", la relación de modificación es "1,32 -
1 = 0,32" (S904). Tras esto, la relación de modificación del
espécimen (2) es convertida a la frecuencia de modificación usando
el mismo procedimiento que en el primer procedimiento
(correspondiente a S905 en la figura). Cuando el intervalo por
división sea "0,08", la frecuencia de modificación es
representada como "4" (S906).
La descripción anterior es sólo a modo de
ejemplo, y es posible cualquier visualización especificando las
condiciones apropiadas.
Las figuras 10 a la 12 son diagramas que muestran
una pantalla CRT que muestra los gráficos mostrando el resultado del
ensayo por el ordenador de la información obtenida por el
densitómetro (la concentración de colesterol y la distribución
posicional). En el gráfico de la figura, el eje de las abcisas
representa la posición de desarrollo de fracción y el eje de las
ordenadas representa una densidad óptica o una absorbencia. Además,
en la parte adyacente al gráfico de la pantalla, se visualizan las
relaciones y concentraciones de HDL, VLDL y LDL y similares
detectadas por colesterol, y en la parte inferior de la misma se
muestra la relación de HDL y LDL.
Primeramente, se describirá la figura 10. Esta
figura muestra un caso en el que el LDL modificado no está contenido
en el espécimen (2) (correspondiente a la muestra estándar (1)). En
el gráfico 1004 de la figura, la línea recta 1001 muestra la
posición del punto de aplicación, la línea recta 1002 muestra la
posición central (en el pico de la curva) de la fracción de LDL de
la muestra estándar (1) de no modificación, y la posición central
(en el pico de la curva) de la fracción de LDL del espécimen (2). La
frecuencia de modificación se visualiza en 1003, sin embargo, debido
a que en la figura 10, la posición de la muestra estándar (1) y la
posición central del LDL del espécimen (2) están solapadas, la
frecuencia de modificación muestra un cero.
A continuación, la figura 11 muestra un caso en
el que el LDL modificado está contenido en el espécimen. En el
gráfico 1105 de la figura, la línea recta 1101 muestra la posición
del punto de aplicación, la línea recta 1102 muestra la posición
central (en el pico de la curva) de la fracción LDL de la muestra
estándar (1), la línea recta 1103 muestra la posición central (en el
pico de la curva) de la fracción de LDL del espécimen (2). Como la
frecuencia de modificación 1104 es visualizada como "+86", se
entiende que el LDL es modificado.
Además, la figura 12 muestra un caso en el que el
LDL está contenido en el espécimen (2), y la frecuencia de
modificación es un valor negativo. En el gráfico 1205 de la figura,
la línea recta 1201 muestra la posición del punto de aplicación, la
línea recta 1202 muestra la posición central (en el pico de la
curva) de la fracción de LDL de la muestra estándar (1), y la línea
recta 1203 muestra la posición central (en el pico de la curva) de
la fracción de LDL del espécimen (2). Como la posición central de la
fracción de LDL estándar está en el lado izquierdo de la posición
central de la fracción de LDL del espécimen (2), y la distancia
desde el punto de aplicación a la posición central es larga, la
modificación 1204 es un valor negativo como "-42". Un valor
negativo de la frecuencia de modificación muestra que la velocidad
electroforética del LDL del espécimen (2) es más lenta que la
velocidad electroforética de LDL de la muestra estándar (1), lo que
es útil para la detección de LDL anormal que aparece en enfermedades
del tracto hepático o biliar.
Cuando la modificación de frecuencia es
determinada automáticamente usando el resultado de separación y
ensayo de lipoproteína por medio de electroforesis como se ha
descrito anteriormente, es fácil establecer planes para diagnosticar
y prescribir tratamiento o tratamiento de medicamento de acuerdo con
los resultados de diagnóstico.
Los gráficos visualizados en las pantallas
anteriores pueden sacarse por impresora 205 (figura 5) por medio de
la instrucción del operador.
En la descripción anterior, el examen de la
lipoproteína del suero ha sido descrito con vistas sobre la posición
y la concentración del colesterol contenido en la lipoproteína. Sin
embargo, no hace falta decir que la presente invención no está
limitada al colesterol, sino que se puede aplicar a otros
componentes de lípidos o componentes de proteínas.
Además, en la presente especificación, se
describen casos de muestras de suero sobre la lámina por proceso
electroforético de agarosa. Sin embargo, el procedimiento para
separar y ensayar lipoproteína de acuerdo con la presente invención
se puede aplicar a muestras separadas por electroforesis usando
varias películas delgadas que se pueden usar como láminas tales como
acetato de celulosa, agar, y similares. Adicionalmente, el
procedimiento para separar y para ensayar lipoproteína de acuerdo
con la presente invención se puede aplicar no sólo a la
electroforesis usando varias películas delgadas sino que también se
puede aplicar a un caso de usar electroforesis capilar. En el caso
de usar un dispositivo de electroforesis capilar, es posible
realizar el procedimiento para separar y ensayar lipoproteínas de
acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente tras las
etapas de someter a una muestra estándar o una muestras de marcador
a la electroforesis capilar antes o después de la electroforesis de
un espécimen y obtener después un grado de movilidad relativa de la
lipoproteína deseada desde una distancia entre el punto de
aplicación de cada muestra y el punto central de la fracción de LDL
o el tiempo que transcurre antes de que la separación se complete.
En el presente procedimiento, además, un marcador puede ser una
sustancia estándar que generalmente se usará en la electroforesis
capilar. De esta forma, es posible realizar el procedimiento para
separar y ensayar lipoproteínas de acuerdo con los procedimientos
descritos anteriormente sometiendo a una mezcla de dicho marcador y
un espécimen a la electroforesis capilar.
Aún más, como se ha descrito anteriormente, como,
en la presente invención, a partir del resultado de la
electroforesis de lipoproteínas, se puede determinar el lípido
modificado relativo a la arteriosclerosis, esto es, el grado de
modificación y la frecuencia de modificación del LDL modificado, se
puede realizar fácilmente y de manera efectiva la anomalía
cualitativa de lípidos. De acuerdo con la presente invención, es
posible proporcionar el procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas, el conjunto para realizar dicho procedimiento y el
sistema que incluye dicho conjunto, lo que permite los resultados
más cuantitativos y reproducibles con un uso mejorado en gran manera
del mismo para probar muchos especímenes de manera efectiva en
exámenes clínicos y similares. De acuerdo con la presente invención,
además, los resultados del procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas se pueden usar en el seguimiento de la eficacia de
medicamentos (por ejemplo, la eficacia de un agente antioxidante)
para observar un efecto curativo del medicamento sobre la
enfermedad. Por lo tanto, comienza a ser posible contribuir al
recorte de gastos en sanidad además de una simplificación en hacer
políticas de tratamiento (por ejemplo, prescripción de agente
terapéutico) para tomar.
La presente invención se ha descrito con detalle
con respecto a varias realizaciones, y ahora será aparente a partir
de lo anterior, para los expertos en la técnica, que se pueden hacer
cambios y modificaciones sin salirse de la invención en sus aspectos
más amplios, y se pretende por lo tanto, que las reivindicaciones
adjuntas cubran los cambios y modificaciones comprendidos dentro del
espíritu verdadero de la invención.
Claims (28)
1. Un conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas y determinar el grado de modificación de un componente
predeterminado en un espécimen usando un patrón electroforético de
una muestra estándar que contiene una lipoproteína que tiene el
componente predeterminado y el patrón electroforético del espécimen
que contiene una lipoproteína que tiene componente de una misma
clase que el componente predeterminado, caracterizado
porque
comprende:
comprende:
un medio de preparación (201) de un patrón
electroforético para realizar la electroforesis de la muestra
estándar y el espécimen para fraccionar la lipoproteína de cada
muestra, tiñendo después el respectivo componente predeterminado
usando un reactivo para detectar el respectivo componente
predeterminado tiñendo el respectivo componente predeterminado en la
respectiva lipoproteína para preparar el respectivo patrón
electroforético con el respectivo componente predeterminado
visualizado;
un medio de preparación (206) de un diagrama de
forma de onda para explorar ópticamente el respectivo patrón
electroforético con el respectivo componente predeterminado
visualizado y convirtiendo el respectivo patrón electroforético en
una forma de onda de densidad óptica para preparar el respectivo
diagrama de forma de onda del respectivo componente predeterminado;
y
un medio para juzgar el grado de modificación del
componente predeterminado (204) en el espécimen procesando
matemáticamente los respectivos patrones electroforéticos;
caracterizado porque el medio para juzgar el grado de
modificación del componente predeterminado (204) comprende:
un primer medio para determinar una distancia
"a" desde un punto de aplicación de la muestra estándar hasta
una posición central de una fracción correspondiente al componente
predeterminado en la muestra estándar a partir del patrón
electroforético del componente predeterminado de la muestra
estándar;
un segundo medio para determinar una distancia
"b" desde un punto de aplicación del espécimen hasta una
posición central de una fracción correspondiente al componente
predeterminado en el espécimen a partir del patrón electroforético
del componente predeterminado del espécimen; y
un tercer medio para comparar la distancia
"a" con la distancia "b" para determinar una movilidad
relativa "z (= b / a)" del espécimen respecto de la
muestra estándar, caracterizado porque
el grado de modificación del componente
predeterminado en el espécimen está siendo juzgado en base a la
movilidad relativa "z".
2. El conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en la reivindicación 1,
caracterizado porque el grado de modificación del componente
predeterminado es obtenido como la relación de modificación "M"
sustituyendo la movilidad relativa "z(= b / a)" en la
ecuación:
(1)M = b / a - 1 = (b - a) /
a
3. El conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en la reivindicación 1,
caracterizado porque el grado de modificación del componente
predeterminado es obtenido como una frecuencia de modificación
"M'" sustituyendo la movilidad relativa "z (= b / a)" en
la ecuación:
(2)M' = k (b / a - 1) = k (b
- a) /
a
que se caracteriza porque "k" es una
constante (k >
0).
4. El conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el componente
predeterminado es una lipoproteína de baja densidad.
5. El conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la
electroforesis es llevada a cabo por medio de un aparato
electroforético usando una lámina caracterizada porque
comprende gel de agarosa como ingrediente principal.
6. Un conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas para determinar un grado de modificación de un
componente predeterminado en un espécimen usando un patrón
electroforético de una muestra estándar que contiene una
lipoproteína que tiene el componente predeterminado, un patrón
electroforético del espécimen que contiene una lipoproteína que
tiene un componente de la misma clase que el componente
predeterminado, y un patrón electroforético de una muestra de
indicador conteniendo un componente de marcador capaz de ser un
indicador del componente predeterminado, caracterizado porque
comprende:
un medio de preparación (201) de patrón
electroforético para realizar la electroforesis de la muestra
estándar y el espécimen y la muestra de indicador para fraccionar
cada muestra, tiñendo entonces los respectivos componentes usando
reactivos para detectar el componente predeterminado en las
respectivas fracciones de la muestra estándar y el espécimen, y el
componente de marcador en fracción de la muestra de indicador por
medio de teñido, preparando de ese modo los patrones
electroforéticos respectivos con los respectivos componentes
visualizados;
un medio de preparación (206) de diagrama de
forma de onda para explorar ópticamente los respectivos patrones
electroforéticos visualizados y convertir el patrón electroforético
respectivo en una forma de onda de densidad óptica para preparar el
diagrama de forma de onda respectivo del respectivo componente
predeterminado y el componente de marcador; y
un medio para juzgar el grado de modificación del
componente predeterminado (204) en el espécimen procesando
matemáticamente los respectivos patrones electroforéticos;
caracterizado porque
el medio para juzgar el grado de modificación del
componente predeterminado (204) tiene un primer medio de medida y un
segundo medio de medida para juzgar el grado de modificación del
componente predeterminado en el espécimen en base a una movilidad
relativa de la muestra de indicador determinado por los dos medios
de medida, caracterizado porque
el primer medio de medida está
caracterizado porque comprende:
un primer medio para determinar una distancia
"a" desde un punto de aplicación de la muestra estándar hasta
una posición central de una fracción correspondiente al componente
predeterminado en la muestra estándar, a partir del diagrama de
forma de onda de la muestra estándar,
un segundo medio para determinar una distancia
"c" desde un punto de aplicación de la muestra de indicador
hasta una posición central de una fracción correspondiente al
componente marcador en la muestra de indicador, y
un tercer medio para comparar la distancia
"a" con la distancia "c" y determinar una movilidad
relativa "z_{1} (= c / a)" de la muestra de indicador
respecto de la muestra estándar,
el segundo medio de medida está
caracterizado porque comprende:
un cuarto medio para determinar a partir del
diagrama de la forma de onda del espécimen una distancia "b"
desde un punto de aplicación del espécimen hasta la posición central
de una fracción correspondiente al componente predeterminado en el
espécimen, a partir del diagrama de forma de onda de la muestra de
indicador una distancia "c" desde un punto de aplicación de la
muestra de indicador hasta una posición central de una fracción
correspondiente al componente marcador en la muestra de indicador,
y
un quinto medio para determinar una movilidad
relativa "z_{2} (= b / a = b\cdotz_{1} / c)" del
espécimen a partir de la movilidad relativa "z_{1}"
determinada por el primer medio de medida y la distancia "b" y
la distancia "c" determinadas por el segundo medio de
medida.
7. El conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en la reivindicación 6,
caracterizado porque el grado de modificación del componente
predeterminado se obtiene como la relación de modificación "M"
sustituyendo la movilidad relativa "z_{2} (= b / a =
b\cdotz_{1} / c)" en la ecuación:
(3)M = b\cdot z_{1} / c -
1
8. El conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en la reivindicación 6,
caracterizado porque el grado de modificación del componente
predeterminado se obtiene como una frecuencia de modificación
"M'" sustituyendo la movilidad relativa "z_{2} (= b / a =
b\cdotz_{1} / c)" en una ecuación:
(4)M' = k (b\cdotz_{1} /
c –
1)
que se caracteriza porque "k" es una
constante (k >
0)).
9. El conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la muestra de
indicador contiene una enzima de deshidrogenación del alcohol capaz
de ser un marcador.
10. El conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en la reivindicación 9,
caracterizado porque en el segundo medio de medida, el cuarto
medio es un medio para determinar de manera simultánea la distancia
"b" y la distancia "c" sometiendo una mezcla de la muestra
de indicador y el espécimen a electroforesis.
11. El conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque el primer
componente predeterminado es una lipoproteína de baja densidad.
12. El conjunto para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 11, caracterizado porque la
electroforesis es llevada a cabo por medio de un aparato
electroforético usando una lámina caracterizada por
comprender gel de agarosa como ingrediente principal.
13. Un procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas para determinar un grado de modificación de un
componente predeterminado en un espécimen usando un patrón
electroforético de una muestra estándar que contiene una
lipoproteína que tiene el componente predeterminado y un patrón
electroforético del espécimen que contiene una lipoproteína que
tiene componente de la misma clase que el componente predeterminado,
caracterizado porque comprende:
una etapa de preparación del patrón
electroforético para realizar la electroforesis de la muestra
estándar y el espécimen para fraccionar la lipoproteína de cada
muestra, tiñendo entonces el respectivo componente predeterminado
usando un reactivo para detectar el respectivo componente
predeterminado tiñendo el respectivo componente predeterminado en la
respectiva lipoproteína para preparar el respectivo patrón
electroforético con el respectivo componente predeterminado
visualizado;
una etapa de preparación de un diagrama de forma
de onda para explorar ópticamente el respectivo patrón
electroforético con el respectivo componente predeterminado
visualizado y convirtiendo el respectivo patrón electroforético en
una forma de onda de densidad óptica para preparar el respectivo
diagrama de forma de onda del respectivo componente predeterminado;
y
una etapa para juzgar el grado de modificación
del componente predeterminado en el espécimen procesando
matemáticamente los respectivos patrones electroforéticos;
caracterizado porque la etapa de juzgar el
grado de modificación del componente predeterminado se
caracteriza porque comprende:
una primera etapa de determinación de una
distancia "a" desde un punto de aplicación de la muestra
estándar a una posición central de una fracción correspondiente al
componente predeterminado en la muestra estándar a partir del patrón
electroforético del componente predeterminado de la muestra
estándar;
una segunda etapa para determinar una distancia
"b" desde un punto de aplicación del espécimen hasta una
posición central de una fracción correspondiente al componente
predeterminado en el espécimen a partir del patrón electroforético
del componente predeterminado del espécimen; y
una tercera etapa para comparar la distancia
"a" con la distancia "b" para determinar una movilidad
relativa "z (= b / a)" del espécimen respecto a la muestra
estándar, caracterizado porque
el grado de modificación del componente
predeterminado en el espécimen está siendo juzgado en base a la
movilidad relativa "z".
14. El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en la reivindicación 13,
caracterizado porque el grado de modificación del componente
predeterminado se obtiene como la relación de modificación "M"
sustituyendo la movilidad relativa "z (= b / a)" en la
ecuación:
(1)M = b / a - 1 = (b - a) /
a
15. El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en la reivindicación 13,
caracterizado porque el grado de modificación del componente
predeterminado se obtiene como una frecuencia de modificación
"M'" sustituyendo la movilidad relativa "z (= b / a)" en
una ecuación:
(2)M' = k (b / a - 1) = k (b
- a) /
a
que se caracteriza porque "k" es una
constante (k >
0)).
16. El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque el componente
predeterminado es una lipoproteína de baja densidad.
17. El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque la
electroforesis es llevada a cabo por medio de un aparato
electroforético que usa una lámina caracterizada porque
comprende gel de agarosa como ingrediente principal.
18. Un medio de registro que almacena una
programación para realizar el procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17.
19. Un sistema para separar y ensayar
lipoproteínas, caracterizado porque comprende: un ordenador
para ejecutar la programación almacenada en el medio de registro
como se reivindica en la reivindicación 18, y un conjunto para
separar y ensayar lipoproteínas de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, de acuerdo con una instrucción basada en la
programación del ordenador.
20. Un procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas para determinar un grado de modificación de un
componente predeterminado en un espécimen usando un patrón
electroforético de una muestra estándar que contiene una
lipoproteína que tiene el componente predeterminado, un patrón
electroforético del espécimen que contiene una lipoproteína que
tiene el componente de la misma clase que el componente
predeterminado, y un patrón electroforético de una muestra de
indicador que contiene un componente marcador capaz de ser un
indicador del componente predeterminado, caracterizado porque
comprende:
una etapa de preparación del patrón
electroforético para realizar la electroforesis de la muestra
estándar y el espécimen y la muestra de indicador para fraccionar
cada muestra, tiñendo entonces los componentes respectivos usando
reactivos para detectar el componente predeterminado en las
fracciones respectivas de la muestra estándar y el espécimen, y el
componente de marcador en la fracción de la muestra de indicador por
medio del teñido preparando de ese modo los patrones de
electroforesis respectivos con los respectivos componentes
visualizados;
una etapa de preparación del diagrama de la forma
de onda para explorar ópticamente los patrones electroforéticos
respectivos visualizados y convertir el respectivo patrón
electroforético en una forma de onda de densidad óptica para
preparar el respectivo diagrama de forma de onda del respectivo
componente predeterminado y el componente de marcador; y
una etapa para juzgar el grado de modificación
del componente predeterminado en el espécimen procesando
matemáticamente los respectivos patrones electroforéticos; en la
que
la etapa para juzgar el grado de modificación del
componente respectivo tiene una primera etapa de medida y una
segunda etapa de medida, para juzgar el grado de modificación del
componente predeterminado en el espécimen en base a la movilidad
relativa de la muestra de indicador determinada por los dos etapas
de medida, en las que
la primera etapa de medida comprende:
una primera etapa para determinar una distancia
"a" desde un punto de aplicación de la muestra estándar hasta
una posición central de una fracción correspondiente al componente
predeterminado en la muestra estándar, a partir del diagrama de
forma de onda de la muestra estándar,
una segunda etapa para determinar una distancia
"c" desde un punto de aplicación de la muestra de indicador
hasta una posición central de una fracción correspondiente al
componente marcador en la muestra de indicador, a partir del
diagrama de forma de onda de la muestra de indicador, y
una tercera etapa para comparar la distancia
"a" con la distancia "c" y determinar una movilidad
relativa "z_{1} (= c / a)" de la muestra de indicador
respecto de la muestra estándar,
comprendiendo la segunda etapa de medida:
una cuarta etapa para determinar a partir del
diagrama de forma de onda del espécimen, una distancia "b"
desde un punto de aplicación del espécimen hasta una posición
central de una fracción correspondiente a un componente
predeterminado en el espécimen,
una quinta etapa para determinar a partir del
diagrama de forma de onda de la muestra de indicador una distancia
"c" desde un punto de aplicación de la muestra de indicador
hasta una posición central de una fracción correspondiente al
componente marcador en la muestra de indicador, y
una sexta etapa para determinar una movilidad
relativa "z_{2} (= b / a = b\cdotz_{1} / c)" del
espécimen a partir de la movilidad relativa "z_{1}"
determinada por la primera etapa de medida y la distancia "b" y
la distancia "c" determinadas por la segunda etapa de
medida.
21. El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en la reivindicación 20,
caracterizado porque el grado de modificación del componente
predeterminado se obtiene como la relación de modificación "M"
sustituyendo la movilidad relativa "z_{2} (= b / a =
b\cdotz_{1} / c)" en una ecuación:
(3)M = b\cdotz_{1} / c –
1
22. El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en la reivindicación 20,
caracterizado porque el grado de modificación del componente
predeterminado es obtenido como una frecuencia de modificación
"M'" sustituyendo la movilidad relativa "z_{2} (= b / a =
b\cdotz_{1} / c)" en una ecuación:
(4)M' = k (b\cdotz_{1} /
c –
1)
que se caracteriza porque "k" es una
constante (k >
0).
23. El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque la muestra de
indicador contiene una enzima de deshidrogenación del alcohol capaz
de ser un marcador.
24. El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en la reivindicación 23,
caracterizado porque la segunda etapa de medida, la cuarta
etapa y la quinta etapa son ejecutadas de manera simultánea
sometiendo una mezcla de la muestra de indicador y el espécimen a
electroforesis.
25. El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 24, caracterizado porque el primer
componente predeterminado es una lipoproteína de baja densidad.
26. El procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 25, caracterizado porque la
electroforesis es llevada a cabo por medio de un aparato
electroforético usando una lámina caracterizada porque
comprende gel de agarosa como ingrediente principal.
27. Un medio de registro que almacena una
programación para ejecutar el procedimiento para separar y ensayar
lipoproteínas como se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 26.
28. Un sistema para separar y ensayar
lipoproteínas, caracterizado porque comprende: un ordenador
para ejecutar una programación almacenada en el medio de registro
como se reivindica en la reivindicación 27, y un conjunto para
separar y ensayar lipoproteínas de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, que opera de acuerdo con una instrucción
basada en la programación del ordenador.
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