ES2212121T3 - Mutantes de factor-2 de crecimiento queranocitico (kgf-2 o factor -12 de crecimiento fibroblastico, fgf-12). - Google Patents

Mutantes de factor-2 de crecimiento queranocitico (kgf-2 o factor -12 de crecimiento fibroblastico, fgf-12).

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ES2212121T3 ES97937200T ES97937200T ES2212121T3 ES 2212121 T3 ES2212121 T3 ES 2212121T3 ES 97937200 T ES97937200 T ES 97937200T ES 97937200 T ES97937200 T ES 97937200T ES 2212121 T3 ES2212121 T3 ES 2212121T3
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Mark A. Rampy
Donna Mendrick
Jun Zhang
Jian Ni
Paul A. Moore
Timothy A. Coleman
Reiner L. Gentz
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS POLINUCLEOTIDOS RECIENTEMENTE IDENTIFICADOS, POLIPEPTIDOS CODIFICADOS POR ESTOS POLINUCLEOTIDOS, EL USO DE ESTOS POLINUCLEOTIDOS Y POLIPEPTIDOS, ASI COMO LA PRODUCCION DE ESTOS POLINUCLEOTIDOS Y POLIPEPTIDOS. DE UN MODO MAS PARTICULAR, EL POLIPEPTIDO DE ESTA INVENCION ES UN FACTOR DE CRECIMIENTO DE LOS QUERATINOCITOS, QUE SE LLAMA A VECES A CONTINUACION "KGF - 2", CONOCIDO HASTA AHORA COMO FACTOR DE CRECIMIENTO DE LOS FIBROBLASTOS 12 O "FGF - 12". ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA INHIBICION DE LA ACCION DE DICHOS POLIPEPTIDOS. ESTA INVENCION SE REFIERE ADEMAS AL USO TERAPEUTICO DEL KGF - 2 PARA FAVORECER O ACELERAR LA CURACION DE LAS HERIDAS. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A NUEVAS FORMAS MUTANTES DEL KGF - 2 QUE MUESTRAN UNA ACTIVIDAD REFORZADA, ESTABILIDAD INCREMENTADA, UN MAYOR RENDIMIENTO O UNA MEJOR SOLUBILIDAD.

Description

Mutantes de factor-2 de crecimiento queranocítico (KGF-2 o factor-12 de crecimiento fibroblástico, FGF-12).
Campo de la invención
La presente invención se refiere a polinucleótidos recientemente identificados, polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos, al uso de dichos polinucleótidos y polipéptidos, así como a la producción de dichos polinucleótidos y polipéptidos. Más particularmente, los polipéptidos de la presente invención son mutantes del Factor de Crecimiento Queratinocítico, designado en ocasiones, de aquí en adelante, "KGF-2", también conocido anteriormente como Factor de Crecimiento Fibroblástico 12 (FGF-12). La invención se refiere también a la inhibición de la acción de dichos polipéptidos. Adicionalmente, esta invención se refiere al uso terapéutico de los mutantes de KGF-2 para estimular o acelerar la cicatrización de heridas. Esta invención se refiere a nuevas formas mutantes de KGF-2 que muestran una actividad potenciada, una estabilidad incrementada, mayor rendimiento o mejor solubilidad. Además, la presente invención se refiere a un método para purificar los mutantes de KGF-2.
Antecedentes de la invención
La familia del factor de crecimiento fibroblástico se ha revelado como una gran familia de factores de crecimiento que intervienen en el crecimiento y regeneración de tejidos blandos. En la actualidad, incluye varios miembros que comparten un grado variable de homología en cuanto a las proteínas y que, con una excepción, parecen tener un amplio espectro mitogénico similar, es decir, estimulan la proliferación de diversas células de origen mesodérmico y neurodérmico y/o estimulan la angiogénesis.
El patrón de expresión de los diferentes miembros de la familia es muy diferente, y va desde expresiones extremadamente restringidas de algunas etapas de desarrollo, a una expresión prácticamente ubicua en una variedad de tejidos y órganos. Todos los miembros parecen unir proteoglicanos de heparina y sulfato de heparina y glicosaminoglicanos, concentrándose fuertemente en la matriz extracelular. KGF se identificó originalmente como un miembro de la familia de FGF por homología de secuencia o purificación y clonación de factores. El factor de crecimiento queratinocítico (KGF) se aisló como mitógeno para una línea de queratinocitos de ratón cultivados (Rubin, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:802-806 (1989)). A diferencia de otros miembros de la familia de FGF, posee escasa actividad sobre células derivadas del mesénquima, pero estimula el crecimiento de células epiteliales. El gen del factor de crecimiento queratinocítico codifica un polipéptido de 194 aminoácidos (Finch, P.W. et al., Science 245:752-755 (1989)). Los 64 aminoácidos N-terminales son únicos, pero el resto de la proteína tiene una homología de aproximadamente 30% con bFGF. KGF es el miembro más divergente de la familia de FGF. La molécula tiene una secuencia de señal hidrófoba y se segrega de manera eficaz. Las modificaciones post-traducción incluyen una escisión de la señal de secuencia y una glicosilación unida a N en un sitio, dando como resultado una proteína de 28 kDa. El factor de crecimiento queratinocítico se produce a partir de fibroblastos derivados de la piel y del pulmón fetal (Rubin et al., (1989)). Se ha encontrado que el mRNA del factor de crecimiento queratinocítico se expresa en el riñón, colon e ilion adultos, pero no así en el cerebro ni en el pulmón (Finch, P.W. et al. Science 245:752-755 (1989)). KGF muestra las regiones conservadas dentro de la familia de proteínas FGF. KGF se fija al receptor FGF-2 con una alta afinidad.
La cicatrización alterada es una fuente importante de morbididad y puede tener como consecuencias complicaciones tales como dehiscencia, degradación anastomótica y heridas que no cicatrizan. En el individuo normal, la cicatrización de heridas se logra sin complicaciones. Por el contrario, la cicatrización alterada se asocia con diversas patologías tales como diabetes, infección, inmunosupresión, obesidad y malnutrición (Cruse, P.J. y Foord, R., Arch. Surg. 107:206 (1973); Schrock, T.R. et al., Ann. Surg. 177:513 (1973); Poole, G.U., Jr., Surgery 97:631 (1985); Irvin, G.L. et al., Am. Surg. 51:418 (1985)).
La reparación de heridas es el resultado de complejas interacciones y procesos biológicos. Se han descrito tres fases en la cicatrización normal de heridas: fase inflamatoria aguda, síntesis de matriz extracelular y de colágeno, y remodelamiento (Peacock, E.E., Jr., Wound Repair, 2º edición, WB Saunders, Filadelfia (1984)). El proceso implica la interacción de queratinocitos, fibroblastos y células inflamatorias en el sitio de la lesión.
La regeneración tisular parece estar controlada por factores peptídicos específicos que regulan la migración y proliferación de las células que intervienen en el proceso de reparación (Barrett, T.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6772-6774 (1985); Collins, T. et al., Nature 316:784-750 (1985)). De esta forma, los factores de crecimiento pueden constituir prometedores agentes terapéuticos en el tratamiento de heridas, quemaduras y otros trastornos de la piel (Rifkin, D.B. y Moscatelli, J. Cell. Biol. 109:1-6 (1989); Sporn, M.B. et al., J. Cell. Biol. 105:1039-1045 (1987); Pierce, G.F. et al., J. Cell. Biochem. 45:319-326 (1991)). La secuencia del proceso de cicatrización se inicia durante una fase inflamatoria aguda, con el depósito de tejido provisional. A esto le sigue la re-epitelización, síntesis y depósito de colágeno, proliferación de fibroblastos y neo-vascularización, todo lo cual define, por último, la fase de remodelamiento (Clark, R.A.F., J. Am. Acad. Dermatol. 13:701 (1985)). Estos acontecimientos están influidos por factores de crecimiento y citoquinas segregadas por células inflamatorias o por las células localizadas en los bordes de la herida (Assoian, R.K. et al., Nature (Lond.) 309:804 (1984); Nemeth, G.G. et al., "Growth Factors and Their Role in Wound and Fracture Healing", Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing in Biological and Clinical Implications, Nueva York (1988), págs. 1-17.
Se han identificado numerosos factores de crecimiento peptídicos que parecen participar en la cicatrización de heridas, incluido el factor de crecimiento queratinocítico (KGF) (Antioniades, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:565 (1991)), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Antioniades, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:565 (1991); Staiano-Coico, L. et al., Jour, Exp. Med. 178:865-878 (1993)), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) (Golden, M.A. et al., J. Clin. Invest. 87:406 (1991)), factor de crecimiento fibroblástico ácido (aFGF) (Mellin, T.N. et al., J. Invest. Dermatol. 104:850-855 (1995)), factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Whitby, D.J. y Ferguson, W.J., Dev. Biol.. 147:207 (1991)), factor de crecimiento transformante-\alpha (TGF-\alpha) (Gartner, M.H. et al., Surg. Forum 42:643 1991); Todd, R. et al., Am. J. Pathol. 138:1307 (1991)), factor de crecimiento transformante-\beta
(TGF-\beta) (Wong, D.T.W. et al., Am. J. Pathol. 142:622 (1987)), factor de diferenciación neu (rNDF) (Danilenko, D.M. et al., J. Clin. Invest. 95:842-851 (1995)), factor de crecimiento semejante a la insulina I (IGF-I), y factor de crecimiento similar a la insulina II (IGF-II) (Cromack, D.T. et al., J. Surg. Res. 42:622 (1987)).
Se ha informado de que rKGF-1 en la piel estimula los queratinocitos epidérmicos, los queratinocitos en el interior de los folículos del pelo y glándulas sebáceas (Pierce, G.F. et al., J. Exp. Med. 179:831-840 (1994)).
Resumen de la invención
Se presentan en este documento moléculas de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica el factor de crecimiento queratinocítico (KGF-2) que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Fig. 1 [SEC ID NO:2], o la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA depositado en un huésped bacteriano como Número de Depósito de ATCC 75977 el 16 de diciembre de 1994. La secuencia de nucleótidos determinada por la secuenciación del clon de KGF-2 depositado, que se muestra en la Figura 1 [SEC ID NO:1] contiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de 208 residuos de aminoácidos, incluido un codón de iniciación en las posiciones 1-3, con una secuencia líder predicha de aproximadamente 35 ó 36 residuos de aminoácidos, y un peso molecular deducido de aproximadamente 23,4 kDa. La secuencia de aminoácidos del KGF-2 maduro se muestra en la Figura 1, residuos de aminoácidos aproximadamente 36 ó 37 a 208 [SEC ID NO:2].
El polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos se ha identificado, de forma putativa, como miembro de la familia FGF y, de manera más particular, el polipéptido de ha identificado, de forma putativa, como KGF-2 como consecuencia de la homología de la secuencia de aminoácidos con otros miembros de la familia FGF.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan nuevos polipéptidos KGF-2 mutantes, que son biológicamente activos y útiles en diagnóstico o terapia.
Los polipéptidos de la presente invención son de origen humano.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos que codifican mutantes de KGF-2 humanos, incluidos mRNA, DNA, cDNA y DNA genómico, que son biológicamente activos y útiles en diagnóstico o terapia.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para producir dicho polipéptido por técnicas de recombinación, a través del empleo de vectores recombinantes, tales como plasmidios de clonación y expresión, útiles como reactivos en la producción recombinante de proteínas KGF-2 mutantes, así como células hospedadoras procariotas y/o eucariotas recombinantes que comprenden secuencias de ácidos nucleicos de KGF-2 humano
mutante.
De acuerdo con todavía un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar dicho polipéptido, o polinucleótido que codifica dicho polipéptido, con fines terapéuticos, por ejemplo, para estimular la proliferación de células epiteliales y queratinocitos basales con el objetivo de la cicatrización de heridas, y para estimular la producción de folículos pilosos y la cicatrización de heridas dérmicas. KGF-2 puede ser de utilidad clínica en la estimulación de la cicatrización de heridas, incluidas las heridas quirúrgicas, heridas de escisión, heridas profundas que implican lesión de la dermis y epidermis, heridas del tejido ocular, heridas del tejido dental, heridas de la cavidad bucal, úlceras diabéticas, úlceras cutáneas, úlceras por decúbito, úlceras arteriales, úlceras por estasis venosa, quemaduras resultantes de la exposición al calor o a productos químicos, y otras situaciones de cicatrización anormal de las heridas, tales como uremia, malnutrición, déficits vitamínicos, y complicaciones asociadas con el tratamiento sistémico con esteroides, radioterapia y medicamentos antineoplásicos y antimetabolitos. KGF-2 se puede utilizar para estimular el restablecimiento dérmico posterior a la pérdida de dermis.
KGF-2 se puede utilizar para incrementar la adherencia de injertos de piel a un lecho de herida y para estimular la re-epitelización a partir del lecho de la herida. Los siguientes son injertos en los que se podría utilizar KGF-2 para aumentar la adherencia al lecho de la herida: autoinjertos, piel artificial, aloinjertos, injerto auto-dérmico, injertos auto-epidérmicos, injertos avasculares, injertos de Blair-Brown, injertos de tejido óseo, injertos brefoplásticos, injerto de cutis, injerto retardado, injerto dérmico, injerto epidérmico, injerto de facias, injerto de grosor total, injerto heterólogo, xeno-injerto, injerto homólogo, injerto hiperplásico, injerto laminar, injerto de malla, injerto de mucosa, injerto de Ollier-Thiersch injerto omenpal, injerto de parche, injerto pediculado, injerto penetrante, injerto de piel dividida, injerto dividido grueso. KGF-2 se puede utilizar para estimular la resistencia de la piel y para mejorar el aspecto de la piel envejecida.
Se cree que KGF-2 producirá también cambios en la proliferación de hepatocitos, y proliferación de células epiteliales en pulmón, mama, páncreas, estómago, intestino delgado e intestino grueso. KGF-2 puede estimular la proliferación de células epiteliales tales como sebocitos, folículos pilosos, hepatocitos, neumocitos de tipo II, células cáliz productoras de mucina, y otras células epiteliales y sus progenitoras, contenidas en la piel, pulmón, hígado y tracto gastrointestinal. KGF-2 puede estimular la proliferación de células endoteliales, queratinocitos y queratinocitos basales.
KGF-2 se puede utilizar también para reducir los efectos secundarios de la toxicidad intestinal resultante de los tratamientos con radiación, quimioterapia, o de las infecciones víricas. KGF-2 puede tener un efecto citoprotector sobre la mucosa del intestino delgado. Asimismo, KGF-2 puede estimular la cicatrización de las mucositis (úlceras bucales) resultantes de la quimioterapia y de infecciones víricas.
Adicionalmente, KGF-2 se puede utilizar en la regeneración integral de la piel en defectos de espesor cutáneo totales o parciales, incluidas las quemaduras (es decir, repoblación de folículos pilosos, glándulas sudoríparas, y glándulas sebáceas), tratamiento de otras lesiones de la piel tales como psoriasis. KGF-2 se puede utilizar para tratar la epidermolisis bullosa, un defecto de adherencia de la epidermis a la dermis subyacente que tiene como consecuencia frecuentes ampollas abiertas y dolorosas, al acelerar la re-epitelización de estas lesiones. Igualmente, KGF-2 se puede usar para tratar úlceras gástricas y duodenales y ayudar a curar más rápidamente, por formación de cicatrices del revestimiento de la mucosa y regeneración de la mucosa glandular y del revestimiento de la mucosa duodenal. Enfermedades intestinales inflamatorias, tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, son enfermedades que tienen como consecuencia de la destrucción de la superficie mucosa del intestino delgado y grueso, respectivamente. De este modo, KGF-2 podría utilizarse para estimular la regeneración de la superficie mucosa para ayudar a una cicatrización más rápida e impedir la progresión de la enfermedad intestinal inflamatoria. Se espera que el tratamiento con KGF-2 tenga un efecto significativo sobre la producción de moco a todo lo largo del tracto gastrointestinal, pudiendo utilizarlo para proteger la mucosa intestinal de sustancias nocivas que se ingieran o después de la cirugía. KGF-2 se puede utilizar para tratar enfermedades asociadas con la sub-expresión de KGF-2.
Adicionalmente, KGF-2 se puede utilizar para prevenir y curar lesiones pulmonares debidas a diversos estados patológico. Un factor de crecimiento tal como KGF-2 podría estimular la proliferación y la diferenciación y estimular la reparación de alvéolos y del epitelio bronquiolar para prevenir lesiones pulmonares agudas o crónicas. Por ejemplo, el enfisema, que tiene como consecuencia la progresiva pérdida de alvéolos y lesiones de inhalación, es decir, resultantes de la inhalación de humo y quemaduras, que causan necrosis del epitelio bronquiolar y de los alvéolos, se podría tratar eficazmente con KGF-2. Asimismo, KGF-2 se podría utilizar para estimular la proliferación y diferenciación de neumocitos de tipo II, lo que puede ayudar a tratar o prevenir enfermedades tales como las enfermedades de membranas hialinas, el síndrome de distrés respiratorio infantil y la displasia broncopulmonar en bebés prematuros.
KGF-2 podría estimular la proliferación y diferenciación de hepatocitos y se podría utilizar, por lo tanto, para aliviar o tratar enfermedades y patologías del hígado tales como la insuficiencia hepática fulminante causada por cirrosis, lesiones del hígado causadas por hepatitis virales y sustancias tóxicas (es decir, acetominofeno, tetracloruro de carbono y otras toxinas hepáticas conocidas en la técnica).
Además, KGF-2 se podría utilizar para tratar o prevenir la instauración de diabetes mellitus. En pacientes con diabetes de Tipos I y II recién diagnosticadas, en las que están todavía conservadas algunas funciones de las células de los islotes, KGF-2 se podría utilizar para mantener la función de los islotes con el fin de aliviar, retrasar o prevenir la manifestación permanente de la enfermedad. Igualmente, KGF-2 se podría usar como elemento auxiliar en el trasplante de células de islote para mejorar o estimular la función de dichas células de islote.
Se describen, adicionalmente, en este documento péptidos miméticos de KGF-2 que se pueden utilizar como péptidos terapéuticos. Péptidos miméticos de KGF-2 son péptidos cortos que imitan la actividad biológica de la proteína KGF-2 al unirse y activar los receptores afines a KGF-2.
Además, se pueden usar antagonistas de estos polipéptidos para inhibir la acción de dichos polipéptidos, por ejemplo, para reducir la formación de cicatrices durante el proceso de cicatrización de heridas y para prevenir y/o tratar la proliferación de tumores, la retinopatía diabética, la artritis reumatoide, la osteoartritis y el crecimiento tumoral. Los antagonistas de KGF-2 se pueden usar también para tratar enfermedades asociadas con la sobreexpresión de KGF-2.
Se pueden emplear ensayos diagnósticos para detectar enfermedades o la susceptibilidad a enfermedades relacionadas con mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos de KGF-2, o con la sobreexpresión de los polipéptidos codificados por esas secuencias.
Dichos polipéptidos, o polinucleótidos que codifican esos polipéptidos se pueden usar in vitro con fines relacionados con la investigación científica, síntesis de DNA y fabricación de vectores de DNA.
De esta forma, un aspecto de la invención proporciona un polipéptido mutante de KGF-2 seleccionado del grupo formado por:
(a)
Un mutante de deleción N-terminal de KGF-2, en el cual dicho mutante consiste en la secuencia de aminoácidos Ala(63)-Ser(208) de SEC ID NO: 2, o de la secuencia de aminoácidos Ala(63)-Ser(208) de la proteína codificada por el cDNA contenido en el plasmidio ATCC 75977, y en el cual dicho mutante incluye una metionina N-terminal;
(b)
Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en 90%, 95%, 97% ó 99% a la secuencia de aminoácidos de dicho mutante de KGF-2 de (a);
(c)
un polipéptido de (a), en el que dicho polipéptido tiene al menos una sustitución de aminoácido seleccionado del grupo formado por Arg(194)Glu, Arg(194)Gln, Lys(191)Glu, Lys(191)Gln, Arg(188)Glu y Lys(183)Glu.
El mutante de la invención puede ser un polinucleótido que se hibride bajo condiciones estrictas de hibridación con un polinucleótido de (a) anterior. Este polinucleótido que se hibrida no lo hace bajo condiciones estrictas de hibridación en un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos formada por sólo residuos A o de sólo residuos T.
El polinucleótido puede codificar la secuencia de aminoácidos de una porción portadora de un epitopo de un KGF-2 que tenga una secuencia de aminoácidos en (a), (b) o (c) anterior.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se describen nuevas variantes de mutantes de KGF-2. Éstos se pueden producir por deleción o sustitución de uno o más aminoácidos de mutantes de KGF-2. Las mutaciones naturales se denominan variaciones alélicas.
Las variaciones alélicas pueden ser silentes (sin cambios en el polipéptido codificado), o pueden tener una secuencia de aminoácidos alterada. Con el fin de intentar mejorar o alterar las características de KGF-2 nativo, se puede emplear ingeniería proteica. Se puede utilizar la tecnología de DNA recombinante, conocida en la técnica, para crear nuevos polipéptidos. Muteínas y mutaciones de deleción pueden mostrar, por ejemplo, una actividad potenciada o una estabilidad incrementada. Además, se podrían purificar con un rendimiento mayor, mostrando una mejor solubilidad al menos bajo determinadas condiciones de purificación y almacenamiento.
Estos y otros aspectos de la presente invención deben resultar evidentes para los expertos en la técnica a partir de las presentes enseñanzas.
Breve descripción de las figuras
Los siguientes dibujos ilustran realizaciones de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención según queda definida en las reivindicaciones.
Las Figuras 1A-1C ilustran el cDNA y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducida del polipéptido de la presente invención. Los 35 ó 36 residuos iniciales de aminoácidos representan la secuencia líder putativa (subrayada). Se utilizan las abreviaturas estándares de una sola letra para los aminoácidos. Las inexactitudes de secuencia son un problema frecuente cuando se intentan determinar secuencias de polinucleótidos. La secuenciación se llevó a cabo utilizando un Secuenciador de DNA Automático 373 (Applied Biosystems, Inc.). La exactitud de la secuenciación se prevé superior a 97%. [SEC ID NO:1].
Las Figuras 2A-2D son una ilustración de una comparación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la presente invención y otros factores de crecimiento fibroblásticos. [SEC ID NOS: 13-22].
Las Figuras 3A-3D muestran el mRNA de longitud total y la secuencia de aminoácidos para el gen de KGF-2. [SEC ID NOS: 23 y 24].
Las Figuras 4A-4E muestran un análisis de la secuencia de aminoácidos de KGF-2. Se muestran las regiones alfa, beta, giro y espiral; hidrofilia e hidrofobia; regiones anfipáticas; regiones flexibles; índice antigénico y probabilidad de superficie. En el gráfico de "Índice Antigénico - Jameson-Wolf", los residuos de aminoácidos 41-109 en la Figura 1 corresponden a las regiones altamente antigénicas mostradas de la proteína KGF-2. Las regiones hidrófobas (trazado de Hopp-Woods) se encuentran por debajo de la línea mediana (valores negativos), mientras que las regiones hidrófilas (trazado de Kyte-Doolittle) están por encima de la línea mediana (valores positivos, por ejemplo los residuos de aminoácidos 41-109). El trazado es sobre todo el ORF de 208 aminoácidos.
La Figura 5 muestra la evaluación de KGF-2 sobre el cierre de heridas en ratones diabéticos. Las heridas se midieron inmediatamente después de su provocación, y a diario, durante 5 días consecutivos, y el día 8. El cierre porcentual de la herida se calculó usando la siguiente fórmula: [Área del día 1]-[Área del día 8]/[Área del día 1]. El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test t no apareado (media +/- EEM, n=5).
La Figura 6 muestra la evaluación de KGF-2 sobre el cierre de heridas en ratones no diabéticos. Las heridas se midieron inmediatamente después de su provocación, y a diario, durante 5 días consecutivos, y el día 8. El cierre porcentual de la herida se calculó usando la siguiente fórmula: [Área del día 1]-[Área del día 8]/[Área del día 1]. El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test t no apareado (media +/- EEM, n=5).
La Figura 7 muestra la evolución en el tiempo del cierre de heridas en ratones diabéticos. Las áreas de las heridas se midieron inmediatamente después de su provocación, y a diario, durante 5 días, y el día 8. Los valores se presentan como área total (mm^{2}). El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test t no apareado (media +/- EEM,
n=5).
La Figura 8 muestra la evolución en el tiempo del cierre de heridas en ratones no diabéticos. Las áreas de las heridas se midieron inmediatamente después de su provocación, y a diario, durante 5 días, y el día 8. Los valores se presentan como área total (mm^{2}). El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test t no apareado (media +/- EEM, n=5).
La Figura 9 muestra una evaluación histopatológica de KGF-2 en ratones diabéticos. Las puntuaciones las ofreció un observador ciego. El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test t no apareado (media +/- EEM, n=5).
La Figura 10 muestra una evaluación histopatológica de KGF-2 en ratones no diabéticos. Las puntuaciones las ofreció un observador ciego. El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test t no apareado (media +/- EEM, n=5).
La Figura 11 muestra el efecto del crecimiento de queratinocitos en ratones diabéticos. Las puntuaciones las ofreció un observador ciego. El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test t no apareado (media +/- EEM, n=5).
La Figura 12 muestra el efecto del crecimiento de queratinocitos en ratones no diabéticos. Las puntuaciones las ofreció un observador ciego. El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test t no apareado (media +/- EEM, n=5).
La Figura 13 muestra el efecto de la proliferación de piel en ratones diabéticos. Las puntuaciones las ofreció un observador ciego. El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test t no apareado (media +/- EEM, n=5).
La Figura 14 muestra el efecto de la proliferación de piel en ratones no diabéticos. Las puntuaciones las ofreció un observador ciego. El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test t no apareado (media +/- EEM, n=5).
La Figura 15 muestra la secuencia de DNA y la proteína expresada a partir de la construcción pQE60-Cys37. La proteína KGF-2 expresada contiene la secuencia desde Cisteína en posición 37 a Serina en posición 208 con una marca 6X(His) unida al extremo N de la proteína.
La Figura 16 muestra el efecto de metilprednisolona sobre la cicatrización de heridas en ratas. Se inyectaron en ratas machos SD adultas (n=5), el día en que se provocó la herida, 5 mg de metilprednisolona. Se practicaron en los animales heridas dérmicas en sacabocados (8 mm) y se les trató a diario con solución tampón o solución de KGF-2 en 50 \mul de solución tampón durante 5 días consecutivos. Las heridas se midieron a diario en los días 1-5 y el día 8 con un calibre calibrado de Jameson. Los valores representan las mediciones realizadas el día 8 (media +/- EEM).
La Figura 17 muestra el efecto de KGF-2 sobre el cierre de heridas. Se realizaron en ratas SD machos adultas (n=5) heridas dérmicas en sacabocados (8 mm) y se administraron 5 mg de metilprednisolona el día en que se provocó la herida. Los animales se trataron a diario con una solución tampón o KGF-2 en 50 \mul de solución tampón durante 5 días consecutivos, a partir del día en que se provocó la herida. Las mediciones se realizaron a diario durante 5 días consecutivos y en el día 8. El cierre de la herida se calculó mediante la fórmula siguiente: [Área del día 8] - [Área del día 1]/[Área del día 1]. El área del día 1 se estableció en 64 mm^{2}, la superficie creada por el sacabocados dérmico. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado. (Media +/- EEM).
La Figura 18 muestra la evolución en el tiempo de la cicatrización de heridas en el modelo de cicatrización de heridas alterado por glucocorticoides. Se practicaron en ratas SD machos adultas (n=5) heridas dérmicas en sacabocados (8 mm) el día 1 y se les trató a diario, durante 5 días consecutivos, con una solución tampón o una solución de KGF-2 en 50 \mul. Los animales recibieron 5 mg de metilprednisolona el día de la herida. Las heridas se midieron durante cinco días consecutivos, contando a partir del día de la herida, y el día 8, con un calibre calibrado de Jameson. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado. (Media +/- EEM).
La Figura 19 (A) muestra el efecto de KGF-2 sobre el área de la herida en el modelo de rata de cicatrización de heridas sin metilprednisolona en el día 5 después de la herida. Se practicaron en ratas SD machos (n=5) heridas dérmicas en sacabocados (8 mm) el día 1 y se les trató con una solución tampón o KGF-2 en 50 \mul de solución el día de la herida y. seguidamente, durante 5 días consecutivos. Las heridas se midieron a diario usando un calibre calibrado de Jameson. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado. (Media +/- EEM). (B) Evaluación de PDGF-BB y KGF-2 en ratas SD machos (n=6). En todas las ratas se practicaron heridas dorsales de 8 mm y metilprednisolona (MP) (17 mg/kg) para alterar la cicatrización de las heridas. Las heridas se trataron a diario con tampón o diversas concentraciones de PDGF-BB y KGF-2. Las heridas se midieron los días 2, 4, 6, 8 y 10 usando un calibre calibrado de Jameson. El análisis estadístico se llevó a cabo usando un test t no apareado. (Media +/- EEM) * Comparado con tampón; ** PDGF-BB 1 \mug frente a KGF-2/E3 1 \mug.
La Figura 20 muestra el efecto de KGF-2 sobre la distancia de heridas en el modelo de cicatrización de heridas alterado por glucocorticoides. Se practicaron en ratas SD machos adultas (n=5) heridas dérmicas en sacabocados (8 mm) y se administraron 17 mg/kg de metilprednisolona el día de la herida. Los animales se trataron a diario con una solución tampón o KGF-2 en 50 \mul de solución tampón durante 5 días consecutivos y el día 8. La distancia de la herida se midió bajo microscopia óptica con un micrómetro calibrado. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado. (Media +/- EEM).
La Figura 21 (A) muestra la estimulación de la proliferación normal de queratinocitos epidérmicos primarios con KGF-2. (B) muestra la estimulación de la proliferación normal de queratinocitos epidérmicos primarios con KGF-2 \Delta33. (C) muestra la estimulación de la proliferación normal de queratinocitos epidérmicos primarios con KGF-2 \Delta28. Se incubaron queratinocitos epidérmicos primarios normales humanos con diversas concentraciones de KGF-2, KGF-2 \Delta33 o KGF-2 \Delta28 durante tres días. Para los tres experimentos se añadió entonces Azul de alamar durante 16 h y se midió la intensidad del color rojo convertido de Azul de alamar por las células, por la diferencia entre D.O. 570 nm y D.O. 600 nm. Para cada una de las proteínas de KGF-2 se incluyeron un control positivo con medio completo de crecimiento de queratinocitos (KGM), y un control negativo con medio basal de queratinocitos (KBM) en la misma placa de ensayo.
La Figura 22 (A) muestra la estimulación de la incorporación de timidina por KGF-2 y FGF7 en células Baf3 transfectadas con FGFR1b y FGFR2. Se examinaron los efectos de KGF-2 (panel derecho) y FGF7 (panel izquierdo) sobre la proliferación de células Baf3 transfectadas con FGFR1iiib (círculos abiertos) o FDFR2iiib/KGFR (círculos cerrados). El eje Y representa la cantidad de incorporación de [3H]-timidina (cpm) en el DNA de células Baf3. El eje X representa la concentración final de KGF-2 o FGF7 añadido al medio de cultivo tisular. (B) muestra la estimulación de la incorporación de timidina por KGF-2 \Delta33 en células Baf3 transfectadas con FGFR2iiib. (C) muestra la estimulación de la incorporación de timidina por KGF-2 (barra blanca), KGF-2 \Delta33 (barra negra) y KGF-2 \Delta28 (barra gris) en células Baf3 transfectadas con FGFR2iiib.
La Figura 23 muestra el DNA y la secuencia de proteínas para el KGF-2 de longitud total optimizado por E. coli.
Las Figuras 24A y B muestran las secuencias de DNA y de proteínas del KGF-2 maduro optimizado por E. coli.
La Figura 25 muestra la secuencia de DNA y la de proteína codificada para la construcción de deleción de KGF-2 que comprende los aminoácidos 36 a 208 de KGF-2.
La Figura 26 muestra la secuencia de DNA y de proteína codificada para la construcción de deleción de KGF-2 que comprende los aminoácidos 63 a 208 de KGF-2.
La Figura 27 muestra la secuencia de DNA y de proteína codificada para la construcción de deleción de KGF-2 que comprende los aminoácidos 77 a 208 de KGF-2.
La Figura 28 muestra la secuencia de DNA y de proteína codificada para la construcción de deleción de KGF-2 que comprende los aminoácidos 93 a 208 de KGF-2.
La Figura 29 muestra la secuencia de DNA y de proteína codificada para la construcción de deleción de KGF-2 que comprende los aminoácidos 104 a 208 de KGF-2.
La Figura 30 muestra la secuencia de DNA y de proteína codificada para la construcción de deleción de KGF-2 que comprende los aminoácidos 123 a 208 de KGF-2.
La Figura 31 muestra la secuencia de DNA y de proteína codificada para la construcción de deleción de KGF-2 que comprende los aminoácidos 138 a 208 de KGF-2.
La Figura 32 muestra la secuencia de DNA y de proteína codificada para la construcción de deleción de KGF-2 que comprende los aminoácidos 36 a 153 de KGF-2.
La Figura 33 muestra la secuencia de DNA y de proteína codificada para la construcción de deleción de KGF-2 que comprende los aminoácidos 63 a 153 de KGF-2.
La Figura 34 muestra la secuencia de DNA para la construcción mutante Cisteína-37 a Serina de KGF-2.
La Figura 35 muestra la secuencia de DNA para la construcción mutante Cisteína-37/Cisteína-106 a Serina de KGF-2.
La Figura 36 muestra la evaluación de los efectos de KGF-2 \Delta33 sobre la cicatrización de heridas en ratas SD machos (n=5). Se practicó en los animales una herida dorsal de 6 mm y se les trató con diversas concentraciones de tampón, o KGF-2 \Delta33, durante 4 días consecutivos. Las heridas se midieron a diario usando un calibre calibrado de Jameson. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado. (Media +/- EE) *Comparado con tampón.
La Figura 37 muestra el efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la cicatrización de heridas en ratas normales. En ratas SD, machos, 250-300 g (n=5) se realizaron heridas dorsales de 6 mm de espesor total. Las heridas se midieron con un calibre y se trataron con diversas concentraciones de KGF-2 \Delta33 y tampón durante cuatro días, comenzando el día de la cirugía. El día final, se cosecharon las heridas. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado. * Valor comparado con Control Sin Tratamiento. \dagger El Valor se compara con el Control de Tampón.
La Figura 38 muestra el efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la resistencia a la rotura en las heridas de incisión. Se practicaron en ratas SD machos, adultas (n=10) heridas de incisión de 2,5 cm y grosor total el día 1 y recibieron tratamiento en el interior de la incisión después de la herida con una aplicación de tampón o KGF-2 (Delta 33) (1, 4 y 10 \mug). Los animales se sacrificaron el día 5 y se escindieron muestras de 0,5 cm de las heridas para histología de rutina y análisis de la resistencia a la rotura. Los ensayos biomecánicos se llevaron a cabo usando un tensiómetro Instron para la piel, con una fuerza aplicada a través de la herida. La resistencia a la rotura se definió como la máxima fuerza soportada por cada herida antes de la rotura. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado. (Media +/- EE).
La Figura 39 muestra el efecto de KGF-2 (Delta 33) sobre el grosor de la epidermis en heridas de incisión. Se practicaron en ratas SD machos, adultas (n=10) heridas de incisión de 2,5 cm y grosor total el día 1 y recibieron tratamiento dentro de la incisión después de la herida con una aplicación de tampón o KGF-2 (Delta 33) (1, 4 y 10 \mug). Los animales fueron sacrificados el día 5 y se escindieron muestras de 0,5 cm de la herida para histología de rutina y análisis de la resistencia a la rotura. El espesor de la epidermis se determinó tomando la media de 6 mediciones realizadas alrededor del sitio de la herida. Un observador ciego tomó las mediciones en secciones teñidas con Mason Trichrome bajo microscopia óptica usando un micrómetro con lente calibrada. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado. (Media +/- EE).
La Figura 40 muestra el efecto de KGF-2 (Delta 33) sobre el grosor epidérmico tras una única inyección intradérmica. Ratas SD machos, adultas (n=18) recibieron 6 inyecciones intradérmicas de tampón o KGF-2 en una concentración de 1 y 4 \mug en 50 \mul el día 0. Los animales fueron sacrificados 24 y 48 horas después de la inyección. El grosor de la epidermis se midió desde la capa granular hasta el fondo de la capa basal. Se realizaron aproximadamente 20 mediciones a lo largo del sitio de la inyección y se cuantificó el espesor medio. Las mediciones se determinaron usando un micrómetro calibrado sobre secciones teñidas con Mason Trichrome bajo microscopia óptica. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado. (Media +/- EE).
La Figura 41 muestra el efecto de KGF-2 (Delta 33) sobre la puntuación BrdU. Ratas SD machos, adultas (n=18) recibieron 6 inyecciones intradérmicas de placebo o KGF-2 en una concentración de 1 y 4 \mug en 50 \mul el día 0. Los animales fueron sacrificados 24 y 48 horas después de la inyección. Dos horas antes del sacrificio, se inyectó a los animales 5-2'-bromo-desoxirudina (100 mg/kg ip). La puntuación la llevó a cabo un observador ciego bajo microscopia óptica, empleando el siguiente sistema de puntuación: 0-3 ninguna a mínimas células marcadas con BrdU; 4-6, marca moderada; 7-10 células intensamente marcadas. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado. (Media +/- EE).
La Figura 42 muestra el efecto antiinflamatorio de KGF-2 sobre el edema de la pata inducido por PAF.
La Figura 43 muestra el efecto antiinflamatorio de KGF-2 \Delta33 sobre el edema de la pata inducido por PAF en ratas Lewis.
La Figura 44 muestra el efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la supervivencia de ratones Balb/c irradiados de cuerpo entero. Ratones Balb/c machos (n=5), de 22,1 g, se irradiaron con 519 RADS. Los animales fueron tratados con tampón o KGF-2 (1 y 5 mg/kg, s.c.) 2 días antes de la irradiación y diariamente después, durante 7 días.
La Figura 45 muestra el efecto de KGF-2 \Delta33 sobre el peso corporal de ratones irradiados. Ratones Balb/c machos (n=5), de 22,1 g de peso, recibieron inyecciones de tampón o KGF-2 \Delta33 (1,5 mg/kg) durante 2 días antes de la irradiación con 519 Rad/min. Los animales se pesaron a diario y se les inyectó durante 7 días después de la
irradiación.
La Figura 46 muestra el efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la tasa de supervivencia de ratones Balb/c irradiados de cuerpo entero. Ratones Balb/c machos (n=7), de 22,1 g, fueron irradiados con 519 RADS. Los animales fueron tratados con tampón o KGF-2 (1 y 5 mg/kg, s.q.) 2 días antes de la irradiación y a diario, después, durante 7 días.
La Figura 47 muestra el efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la cicatrización de heridas en un modelo de rata alterado por glucocorticoides.
La Figura 48 muestra el efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la proliferación celular determinada usando la marca de BrdU.
La Figura 49 muestra el efecto de KGF-2 \Delta33 sobre el contenido en colágeno localizado en sitios quirúrgicos anastomosados en cólones de rata.
Descripción detallada
En relación con la presente invención, se describe un ácido nucleico aislado (polinucleótido) que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEC ID NO:2), o el polipéptido codificado por el cDNA del clon depositado como Nº de Depósito ATCC 75977 el 16 de diciembre de 1994 en la American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852.
Moléculas de ácidos nucleicos
A menos que se indique lo contrario, en este documento todas las secuencias de nucleótidos determinadas por la secuenciación de una molécula de DNA se determinaron usando un secuenciador automático de DNA (tal como el modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.) y todas las secuencias de aminoácidos de polipéptidos codificadas por moléculas de DNA determinadas en este documento se predijeron por traducción de una secuencia de DNA determinada de la forma anteriormente mencionada. Por lo tanto, tal como se sabe en la técnica para cualquier secuencia de DNA determinada por este método automático, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en este documento puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas de forma automática son, de manera típica, al menos idénticas en aproximadamente 90%, más típicamente al menos aproximadamente 95% a al menos aproximadamente 99,9% idénticas con la secuencia real de nucleótidos de la molécula de DNA secuenciada. La secuencia real se puede determinar de manera más precisa por otros métodos, incluida la secuenciación manual de DNA, bien conocidos en la técnica. También se conoce en la técnica que una única inserción o deleción en una secuencia determinada de nucleótidos, comparada con la secuencia real, provocará una desviación del marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos, de forma que la secuencia predicha de aminoácidos codificada por una secuencia determinada de nucleótidos será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula secuenciada de DNA, a partir del punto en que se ha practicado dicha inserción o deleción.
A menos que se indique lo contrario, cada "secuencia de nucleótidos" expuesta en este documento se presenta como una secuencia de desoxirribonucleótidos (abreviados A, G, C y T). Sin embargo, por "secuencia de nucleótidos" de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido se entiende, para una molécula o polinucleótido de DNA, una secuencia de desoxirribonucleótidos, y para una molécula o polinucleótido de RNA, la correspondiente secuencia de ribonucleótidos (A, G, C y U), en la que cada desoxirribonucleótido timidina (T) en la secuencia especificada de desoxirribonucleótidos está sustituida por el ribonucleótido uridina (U). Por ejemplo, la referencia a una molécula de RNA que tenga la secuencia de SEC ID NO:1 expuesta usando abreviaturas de desoxirribonucleótidos, se pretende que indique una molécula de RNA que tenga una secuencia en la que cada desoxirribonucleótido A, G o C de SEC ID NO:1 haya sido sustituido por el correspondiente ribonucleótido A, G o C, y cada desoxirribonucleótido T haya sido sustituido por un ribonucleótido U.
Por molécula(s) "aislada(s)" de ácidos nucleicos se entiende una molécula de ácido nucleico, DNA o RNA, que ha sido retirada de su entorno nativo. Por ejemplo, las moléculas de DNA recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas a los efectos de la presente invención. Ejemplos adicionales de moléculas de DNA aisladas incluyen moléculas de DNA mantenidas en células hospedadoras heterólogas o moléculas purificadas (parcial o sustancialmente) en solución. Moléculas aisladas de RNA incluyen trascriptos de RNA in vivo o in vitro de las moléculas de DNA de la presente invención. Moléculas de ácidos nucleicos aisladas, según la presente invención, incluyen, además, dichas moléculas producidas de forma sintética. Moléculas aisladas de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen moléculas de DNA que comprenden una secuencia sustancialmente diferente de las anteriormente descritas, pero que, debido a la degeneración del código genético, siguen codificando KGF-2 mutante.
Evidentemente, el código genético es bien conocido en la técnica. Por lo tanto, sería rutinario para un experto en la técnica generar las variantes degeneradas descritas anteriormente.
El polinucleótido que codifica un polipéptido KGF-2 se puede obtener a partir de la próstata humana y del pulmón fetal. Se aisló inicialmente un fragmento del cDNA que codifica el polipéptido de una biblioteca derivada de una próstata humana normal. El marco de lectura abierta que codifica la proteína de longitud total se aisló subsiguientemente a partir de una biblioteca de cDNA de pulmón fetal humano cebado aleatoriamente. Está estructuralmente relacionado con la familia FGF. Contiene un marco de lectura abierta que codifica una proteína de 208 residuos de aminoácidos, de los cuales aproximadamente los primeros 35 ó 36 aminoácidos constituyen la secuencia líder putativa, de modo que la proteína madura comprende 173 ó 172 aminoácidos. La proteína exhibe el máximo grado de homología con el factor de crecimiento queratinocítico con 45% de identidad y 82% de similitud sobre un tramo de 206 aminoácidos. Es importante, también que las secuencias conservadas a través de la familia FGF estén también conservadas en la proteína de la presente invención.
Adicionalmente, los resultados de PCR anidada de cDNA de KGF-2 procedente de bibliotecas demostraron que había formas potenciales y alternativas empalmadas de KGF-2. De manera específica, usando cebadores que flanqueaban el extremo N del marco de lectura abierta de KGF-2, se obtuvieron productos de PCR de 0,2 kb y 0,4 kb a partir de diversas bibliotecas de cDNA. Un tamaño de 0,2 kb fue el producto esperado de KGF-2, en tanto que el tamaño de 0,4 kb puede ser el resultado de una forma empalmada de manera alternativa de KGF-2. El producto de 0,4 kb se observó en bibliotecas de cáncer de estómago, testículos adultos, duodeno y páncreas.
El polinucleótido de la presente invención puede estar en forma de RNA o en forma de DNA, DNA que incluye cDNA, DNA genómico y DNA sintético. El DNA puede ser de cadena sobre o sencilla y, en este último caso, puede ser la cadena de codificación o de no codificación (anti-sentido). La secuencia de codificación que codifica la parte correspondiente del polipéptido maduro puede ser idéntica a la correspondiente secuencia de codificación que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:1), o a la del clon depositado, o puede ser una secuencia de codificación diferente, secuencia de codificación que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica la misma parte correspondiente del polipéptido maduro que el DNA de la Figura 1 (SEC ID NO:1) o del cDNA depositado.
El polinucleótido que codifica polipéptidos de KGF-2 mutante puede incluir: sólo la secuencia de codificación para los polipéptidos mutantes; la secuencia de cosificación para los polipéptidos mutantes y una secuencia de codificación adicional, tal como una secuencia líder o una secuencia de pro-proteína; la secuencia de codificación para los polipéptidos mutantes (y una secuencia de codificación adicional opcional) y una secuencia de no codificación, tal como un intrón o una secuencia de no codificación 5' y/o 3' de la secuencia de codificación para los polipéptidos mutantes. Además, se ha obtenido un mRNA de longitud total, que contiene regiones 5' y 3' no traducidas del gen
(Figura 3).
Como podrá apreciar un experto en la técnica, debido a las posibilidades de errores de secuenciación anteriormente descritos, así como a la variabilidad de los sitios de escisión para líderes en diferentes proteínas conocidas, el polipéptido KGF-2 real, codificado por el cDNA depositado, comprende aproximadamente 208 aminoácidos, pero puede encontrarse en cualquier punto del intervalo entre 200 y 220 aminoácidos; y la secuencia líder real de esta proteína es de aproximadamente 35 ó 36 aminoácidos, pero puede encontrarse en cualquier punto del intervalo desde aproximadamente 30 a aproximadamente 40 aminoácidos.
De este modo, la expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" incluye un polinucleótido que comprende sólo una secuencia de codificación para el polipéptido, así como un polipéptido que incluye secuencias adicionales de codificación y/o no codificación.
La presente solicitud describe, además, variantes de los polinucleótidos anteriormente descritos, que codifican variantes de polipéptidos de KGF-2 mutante que tienen partes correspondientes de la secuencia deducida de aminoácidos de la Figura 1 (SEC ID NO:2), o el polipéptido codificado por el cDNA del clon depositado. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica de origen natural del polinucleótido, o una variante del polinucleótido de origen no natural.
Así, la presente solicitud describe polinucleótidos que codifican partes correspondientes del polipéptido maduro predicho, tal como se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:2), o el mismo polipéptido maduro predicho, codificado por el cDNA del clon depositado, así como variantes de esos polinucleótidos.
Estas variantes de nucleótidos incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción.
La presente solicitud describe también polinucleótidos que codifican péptidos miméticos de KGF-2, que se pueden utilizar como péptidos terapéuticos. Péptidos miméticos de KGF-2 son péptidos cortos que imitan la actividad biológica de la proteína KGF-2 al unirse y activar los receptores afines de KGF-2. Los receptores de KGF-2 incluyen, pero no están limitados a, FGFR2iiib y FGFR1iiib. Estos péptidos miméticos se obtienen mediante métodos tales como, sin estar limitados a, presentación de fagos o química de combinación. Por ejemplo, el método descrito por Wrighton et al, Science 273:458-463 (1996) para generar péptidos miméticos de KGF-2.
Como se ha indicado anteriormente, el polinucleótido puede tener una secuencia de codificación que sea una variante alélica de origen natural de la secuencia de codificación que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:1), o de la secuencia de codificación del clon depositado. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótido que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos y que no altera de manera sustancial la función del polipéptido codificado.
La presente invención incluye también polinucleótidos en los que la secuencia de codificación para los polipéptidos mutantes puede estar fusionada en el mismo marco de lectura con una secuencia de polinucleótido que ayuda en la expresión y secreción de un polipéptido a partir de una célula hospedadora, por ejemplo, una secuencia líder que actúa como secuencia de secreción para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una pre-proteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula hospedadora para dar lugar a la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos pueden codificar también para una pro-proteína, que es la proteína madura más residuos de aminoácidos 5' adicionales. Una proteína madura que tenga una pro-secuencia es una pro-proteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez escindida la pro-secuencia, sigue existiendo una proteína madura activa.
De esta forma, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína madura, o una proteína que tanga una pro-secuencia, o una proteína que tenga tanto una pro-secuencia como una pre-secuencia (secuencia líder).
Los polinucleótidos de la presente invención pueden tener, también, la secuencia de codificación fundida en el marco con una secuencia de marca que permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una marca de hexahistidina suministrada por un vector pQE-9 para permitir la purificación del polipéptido maduro fusionado con la marcadora en el caso de un huésped bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una marca de hemaglutinina (HA) en el caso de utilizar un huésped mamífero, por ejemplo, células COS-7. La marca HA corresponde a un epitopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson, I. et al., Cell 37:767 (1984)).
El término "gen" significa el segmento de DNA que interviene en la producción de una cadena de polipéptido; incluye regiones anteriores y posteriores a las regiones de codificación (líder y remolque), así como secuencias interventoras (intrones) entre segmentos individuales de codificación (exones).
Se pueden utilizar fragmentos del gen de longitud total de la presente invención como sonda de hibridación para una biblioteca de cDNA para aislar el cDNA de longitud total y aislar otros cDNA que tienen una elevada similitud de secuencia con el gen o actividad biológica similar. Sondas de este tipo tienen, preferentemente, al menos 30 bases y pueden contener, por ejemplo, 50 o más bases. La sonda se puede utilizar para identificar un clon de cDNA correspondiente a un transcripto de longitud total y un clon o clones genómicos que contengan el gen completo, incluidas las regiones de regulación y promoción, exones e intrones. Un ejemplo de un análisis comprende aislar la región codificadora del gen usando la secuencia de DNA conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Se utilizan oligonucleótidos marcados, que tienen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención, para analizar una biblioteca de cDNA humano, DNA genómico o cDNA para determinar los miembros de la biblioteca con los que la sonda se hibrida.
La presente solicitud describe la forma de aislar o proporcionar moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos 90% y, más preferentemente, en al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a (a) una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido KGF-2 de longitud total, que tiene la secuencia de aminoácidos completa descrita en la Figura 1 (SEC ID NO:2), incluida la secuencia líder predicha; (b) una secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido KGF-2 maduro (polipéptido de longitud total con la líder eliminada), que tiene la secuencia de aminoácidos en posiciones de aproximadamente 36 ó 37 a 208 descrita en la Figura 1 (SEC ID NO:2); (c) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido KGF-2 de longitud total, que tiene la secuencia de aminoácidos completa, incluida la líder codificada por el clon cDNA contenido en el Depósito de ATCC Nº 75977; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido KGF-2 maduro, que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon cDNA contenido en el Depósito de ATCC Nº 75977; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los análogos de KGF-2 o mutantes de deleción descritos más adelante; o (f) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencia de nucleótidos de (a), (b), (c), (d) o (e).
Por un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos idéntica al menos, por ejemplo, en 95% a una secuencia de nucleótidos de referencia que codifique un polipéptido KGF-2 se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia del polinucleótido puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido KGF-2. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos 95% a una secuencia de nucleótidos de referencia, se puede eliminar o sustituir por otros nucleótidos hasta 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia, o un número de nucleótidos de hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia, o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, entremezcladas ya sea individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia, o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
En términos prácticos, se puede determinar si cualquier molécula de ácido nucleico particular es al menos idéntica en 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que se muestra en la Figura 1 o a la secuencia de nucleótidos del clon de cDNA depositado, de manera convencional utilizando programas informáticos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unís, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711. Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para hallar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineación para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, idéntica en 95% a una secuencia de referencia según la presente invención, los parámetros se establecen, lógicamente, de modo que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud total de la secuencia de nucleótidos de referencia, y que se permitan separaciones de homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.
Por consiguiente, la presente solicitud describe moléculas de ácido nucleico idénticas en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la Figura 1 [SEC ID NO:1] o a la secuencia de ácido nucleico del cDNA depositado, independientemente de que codifiquen un polipéptido con actividad de KGF-2. Esto se debe a que, incluso cuando una molécula de ácido nucleico particular no codifica un polipéptido que tenga actividad KGF-2, un experto en la técnica sabrá cómo utilizar la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, como sonda de hibridación o como cebador en una reacción de cadena de polimerasa (PCR). Los usos de estas moléculas de ácido nucleico que no codifican un polipéptido con actividad KGF-2 incluyen, entre otros, (1) aislar el gen KGF-2 o variantes alélicas del mismo en una biblioteca de cDNA; (2) hibridación in situ (por ejemplo, "FISH") a prolongaciones cromosómicas en metafase para proporcionar una localización cromosómica precisa del gen KGF-2, según se describe en Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988); y análisis de transferencia Northern para detectar expresión de mRNA de KGF-2 en tejidos específicos.
La presente solicitud describe, en especial, moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias idénticas en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a las secuencias de ácido nucleico que se muestran en la Figura 1 [SEC ID NO:1], o a la secuencia de ácido nucleico del cDNA depositado que codifica, de hecho, un polipéptido con actividad de la proteína KGF-2. Por "polipéptido que tiene actividad KGF-2" se entienden polipéptidos que exhiben una actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la proteína KGF-2 de tipo salvaje de la invención, o una actividad que está potenciada por encima de la de la proteína KGF-2 de tipo salvaje (ya sea la proteína de longitud total o, preferentemente, la proteína madura), según se mide en un ensayo biológico particular.
Se describen ensayos de actividad KGF-2, por ejemplo, en los Ejemplos 10 y 11 más adelante. Estos ensayos se pueden usar para medir actividad KGF-2 de proteína nativa o recombinante, parcialmente purificada o purificada.
KGF-2 estimula la proliferación de queratinocitos epidérmicos, pero no de células mesenquimales tales como fibroblastos. De esta forma, "un polipéptido que tenga actividad de proteína KGF-2" incluye polipéptidos que exhiben la actividad KGF-2, en el ensayo de proliferación de queratinocitos que se presenta en el Ejemplo 10, y que se fijará a las isoformas del receptor de FGF 1-iiib y 2-iiib (Ejemplo 11). Aunque el grado de actividad no necesita ser idéntico al de la proteína KGF-2, preferentemente "un polipéptido que tenga actividad de proteína KGF-2" exhibirá una actividad sustancialmente similar en comparación con la proteína KGF-2 (es decir, el polipéptido candidato exhibirá mayor actividad o no más de aproximadamente diez veces menos y, preferentemente, no más de aproximadamente dos veces menos actividad en relación con la proteína KGF-2 de referencia).
Evidentemente, debido a la degeneración del código genético, cualquier experto en la técnica reconocerá de inmediato que un elevado número de moléculas de ácido nucleico que sean idénticas en al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a la secuencia de ácido nucleico del cDNA depositado, o a la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la Figura 1 [SEC ID NO:1], codificará un polipéptido "que tenga actividad de proteína KGF-2". De hecho, dado que las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican, todas ellas, el mismo polipéptido, esto resultará evidente para el experto en la técnica incluso sin realizar el ensayo comparativo anteriormente descrito. Se reconocerá, adicionalmente, en la técnica que para aquellas moléculas de ácido nucleico que no sean variantes degeneradas, un número razonable de ellas codificará también un polipéptido con actividad de proteína KGF-2. Ello se debe a que el experto en la técnica es plenamente consciente de las sustituciones de aminoácidos que tienen probabilidades, o ninguna, de afectar de forma significativa a la función proteica (por ejemplo, sustituyendo un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático).
Por ejemplo, en Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message en Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990), se ofrecen directrices relativas a cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silentes, en las que los autores indican que existen dos métodos principales para estudiar la tolerancia al cambio de una secuencia de aminoácidos. El primer método se basa en el proceso de la evolución, en el que las mutaciones son aceptadas o rechazadas por selección natural. El segundo enfoque utiliza ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y selecciona o analiza para identificar las secuencias que conservan la funcionalidad. Como declaran los autores, estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Los autores indican, adicionalmente, qué cambios de aminoácidos es probable que estén permitidos en una posición determinada de la proteína. Por ejemplo, la mayor parte de los residuos de aminoácidos enterrados requieren cadenas laterales no polares, en tanto que, por lo general, se conservan escasas características de las cadenas laterales de superficie. Se describen otras sustituciones fenotípicamente silentes en Bowie, J.U., véase antes, y en las referencias citadas en ese documento.
También se describen polinucleótidos que se hibridan con las secuencias anteriormente descritas si existe una identidad de al menos 70%, preferentemente de al menos 90%, y más preferentemente, de al menos 95% y, de forma todavía más preferente, de 96%, 97%, 98%, 99% entre las secuencias.
Adicionalmente, se describen polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones estrictas con los polinucleótidos anteriormente descritos. Como se usa en este documento, la expresión "condiciones estrictas" significa que la hibridación se producirá sólo si existe una identidad de al menos 95%, y preferentemente, de al menos 97% entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridan con los polinucleótidos anteriormente descritos codifican, preferentemente, polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por los cDNA de la Figura 1 [SEC ID NO:1] o los cDNA depositados.
Un ejemplo de "condiciones estrictas de hibridación" incluye la incubación durante la noche a 42ºC en una solución que comprende; formamida al 50%, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y cizallado, seguido de lavado de los filtros en 0,1xSSC a aproximadamente 65ºC.
De forma alternativa, el polinucleótido puede tener al menos 20 bases, preferentemente, 30 bases y, más preferentemente, al menos 50 bases que se hibriden con un polinucleótido de la presente invención y que tenga una identidad con la misma, como se ha descrito anteriormente, y que puede retener o no actividad. Por ejemplo, estos polinucleótidos se pueden emplear como sondas para el polinucleótido de SEC ID NO:1, por ejemplo, para recuperar el polinucleótido o como sonda diagnóstica o como cebador de PCR.
Por supuesto, los polinucleótidos que se hibridan a una porción mayor del polinucleótido de referencia (por ejemplo, el clon de cDNA depositado), por ejemplo una porción de 50-750 nt de longitud, o incluso a la longitud total del polinucleótido de referencia, también resultan útiles como sondas según la presente invención, al igual que los polinucleótidos correspondientes a la mayor parte, sino a la totalidad, de la secuencia de nucleótidos del cDNA depositado, o la secuencia de nucleótidos que se muestra en la Figura 1 [SEC ID NO:1]. Por una porción de un polinucleótido de "al menos 20 nt de longitud", por ejemplo, se entienden 20 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia (por ejemplo, el cDNA depositado o la secuencia de nucleótidos que se muestra en la Figura 1 [SEC ID NO:1]). Como se ha indicado, estas porciones son útiles en diagnóstico, ya sea como una sonda según las técnicas de hibridación de DNA convencionales, o como cebadores para amplificación de una secuencia diana por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, recopilada por Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T: (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, cuya descripción total se incorpora al presente documento como referencia.
Dado que un clon de cDNA de KGF-2 está depositado y su secuencia de nucleótidos determinada se ofrece en la Figura 1 [SEC ID NO:1], la generación de polinucleótidos que se hibriden con una porción de la molécula de cDNA de KGF-2 sería una tarea rutinaria para un experto en la técnica. Por ejemplo, se podría utilizar fácilmente la escisión o cizallamiento de endonucleasas de restricción por sonicación del clon de cDNA de KGF-2 para generar porciones de DNA de diversos tamaños, que son polinucleótidos que se hibridan con una porción de la molécula de cDNA de KGF-2. De manera alternativa, los polinucleótidos hibridantes de la presente invención se podrían generar de forma sintética según técnicas conocidas. Lógicamente, un polinucleótido que se hibride sólo a una secuencia poli(A) (tal como el tracto poli(A) 3' terminal del cDNA de KGF-2 que se muestra en la Figura 1 [SEC ID NO:1]), o a un tramo complementario de residuos T 8o U), no se incluiría en un polinucleótido de la invención usado para hibridar a una porción de un ácido nucleico de la invención, puesto que dicho polinucleótido hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contuviera un tramo poli(A) o su complemento (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de cDNA de doble cadena).
Se describen moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican polipéptidos que comprenden los siguientes residuos de aminoácidos de la Figura 1 (SEC ID NO:2), que los presentes inventores han determinado como regiones antígenas de la proteína KGF-2: 1. Gly41-Asn71: GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN [SEC ID NO:25]; 2. Lys91-Ser109: KIEKNGKVSGTKKENCPYS [SEC ID NO:26]; 3. Asn135-Tyr164: NKKGKLYGSKEFNNDCKL
KERIIENGYNTY [SEC ID NO: 27; Y 4. Asn181-Ala199; NGKGAPRRGQKTRRKNTSA [SEC ID NO:28].
Asimismo, hay dos áreas antígenas adicionales, más cortas, predichas, Gln74-Arg78 y Gln170-Gln175. Se describen más adelante y en detalle métodos para generar estas porciones portadoras de epitopo de KGF-2.
El o los depósitos a los que se hace referencia en este documento se mantendrán bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a efectos de Procedimientos de Patentes. Estos depósitos se ofrecen exclusivamente como un factor de comodidad a los expertos en la técnica y no constituyen admisión de que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C \NAK 112. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por los mismos, se incorporan a este documento como referencia y actúan como control en caso de conflictos con cualquier descripción de secuencia en este documento. Puede ser necesaria una autorización para fabricar, usar o vender los materiales depositados y el presente documento no concede autorización alguna.
Polipéptidos y Fragmentos de KGF-2
La presente invención se refiere a un polipéptido mutante de KGF-2 seleccionado del grupo formado por:
(a)
Un mutante de deleción N-terminal de KGF-2, en el cual dicho mutante consiste en la secuencia de aminoácidos Ala(63)-Ser(208) de SEC ID NO: 2, o de la secuencia de aminoácidos Ala(63)-Ser(208) de la proteína codificada por el cDNA contenido en el plasmidio ATCC 75977, y en el cual dicho mutante incluye una metionina N-terminal;
(b)
Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en 90%, 95%, 97% o 99% a la secuencia de aminoácidos de dicho mutante de KGF-2 de (a);
(c)
un polipéptido de (a), en el que dicho polipéptido tiene al menos una sustitución de aminoácido seleccionado del grupo formado por Arg(194)Glu, Arg(194)Gln, Lys(191)Glu, Lys(191)Gln, Arg(188)Glu y Lys(183)Glu.
Como podrá apreciar un experto en la técnica, debido a las posibilidades de errores de secuenciación anteriormente discutidas, así como a la variabilidad de sitios de escisión para líderes en diferentes proteína conocidas, el polipéptido KGF-2 real codificado por el cDNA depositado comprende aproximadamente 208 aminoácidos, pero puede encontrarse en cualquier punto del intervalo entre 200 y 220 aminoácidos; y la secuencia líder real de esta proteína tiene aproximadamente 35 ó 36 aminoácidos, pero puede encontrarse en cualquier punto del intervalo entre aproximadamente 30 y aproximadamente 40 aminoácidos.
Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo", cuando se refieren al polipéptido de la Figura 1 (SEC ID NO:2) o al codificado por el cDNA depositado, significan un polipéptido que conserva esencialmente la misma función o actividad biológica de dicho polipéptido. De este modo, un análogo incluye una pro-proteína que se puede activar por escisión de la porción de pro-proteína para producir el polipéptido maduro activo.
El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, preferentemente un polipéptido recombinante.
El fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEC ID NO:2), o del codificado por el cDNA depositado, puede ser (i) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácidos conservado o no conservado (preferentemente, un residuo de aminoácidos conservado) y dicho residuo de aminoácidos sustituido puede estar o no codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos incluya un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro esté fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales estén fusionados con el polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretaria, o una secuencia que se emplee para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de pro-proteína. Estos fragmentos, derivados y análogos se consideran dentro del alcance de los expertos en la técnica gracias a las enseñanzas del presente documento.
Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (tal como sucede con frecuencia) y cada término se puede utilizar de forma intercambiable según lo requiera el contexto para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos unidos por enlaces de peptidilo. La palabra "polipéptido" se usa en este documento para cadenas que contienen más de diez residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos en este documento se escriben de izquierda a derecha y en la dirección del extremo amino al extremo carboxi.
Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos del polipéptido KGF-2 se pueden variar sin efectos importantes sobre la estructura o función de la proteína. Si se contemplan estas diferencias en las secuencias, es preciso recordar que habrá zonas críticas en la proteína que determinen actividad. En general, resulta posible sustituir residuos que forman la estructura terciaria, siempre que se utilicen residuos que realicen una función similar. En otros casos, el tipo de residuo puede carecer por completo de importancia si la alteración se produce en una región no crítica de la proteína.
Por lo tanto, la invención incluye, adicionalmente, variaciones de polipéptidos KGF-2 mutantes que exhiben una actividad sustancial de polipéptido KGF-2, o que incluyen regiones de la proteína KGF-2 tales como las porciones de proteínas que se discuten más adelante. Estos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones de tipo (por ejemplo, sustituir un residuo hidrófilo por otro, o un residuo no fuertemente hidrófilo por uno fuertemente hidrófilo, como norma). Pequeños cambios o estas sustituciones "neutras" de aminoácidos tendrán, por lo general, escaso efecto sobre la actividad.
Consideradas típicamente como sustituciones conservadoras son las sustituciones, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; intercambio de los residuos hidroxilo Ser y Thr, intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, sustituciones entre los residuos amino Asn y Gln, intercambio de los residuos básicos Lys y Arg, y sustituciones entre los residuos aromáticos Phe, Tyr.
Como se ha indicado detalladamente antes, se pueden encontrar directrices adicionales relativas a qué cambios de aminoácidos son probablemente silentes fenotípicamente (es decir, no es probable que tengan un efecto deletéreo importante sobre una función) en Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990).
La presente solicitud describe péptidos miméticos de KGF-2 mutante que se pueden usar como péptidos terapéuticos. Péptidos miméticos de KGF-2 mutante son péptidos cortos que imitan la actividad biológica del KGF-2 mutante al unirse y activar los receptores afines de KGF-2. Los péptidos miméticos de KGF-2 mutante pueden también unirse e inhibir los receptores afines de KGF-2. Receptores de KGF-2 incluyen, pero no están limitados a, FGFR2iiib y FGFR1iiib. Estos péptidos miméticos se obtienen por métodos tales como, pero no limitados a, presentación de fagos o química de combinación. Por ejemplo, se puede utilizar el método descrito por Wrighton et al, Science 273:458-463 (1996) para generar péptidos miméticos de KGF-2 mutante.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan, preferentemente, en forma aislada y, preferentemente, están purificados a homogeneidad.
Los polipéptidos de la presente invención se encuentran, preferentemente, en forma aislada. Por "polipéptido aislado" se entiende un polipéptido retirado de su entorno nativo. De esta forma, un polipéptido producido y/o contenido en una célula hospedadora recombinante se considera aislado a los efectos de la presente invención. También se entienden polipéptidos que han sido purificados, parcial o sustancialmente, a partir de una célula hospedadora recombinante o de una fuente nativa.
Como se ha descrito anteriormente, la presente invención se refiere también a polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90%, 95%, 97% o 99% a la secuencia de aminoácidos de un mutante por deleción N-terminal de KGF-2, consistiendo dicho mutante en la secuencia de aminoácidos Ala(63) - Ser(208) de la SEC ID NO:2, o de la secuencia de aminoácidos Ala(63) - Ser(208) de la proteína codificada por el cDNA contenido en el plasmidio ATCC 75977.
Como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando las secuencias de aminoácidos y sus sustitutos aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.
Por "% de similitud" para dos polipéptidos se entiende una puntuación de similitud producida por la comparación de las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos utilizando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unís, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) y los establecimientos por defecto para determinar similitud. Bestfit emplea el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias.
Por un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos "idéntica" en al menos 95% a una secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido KGF-2 se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la referencia de aminoácidos del polipéptido KGF-2. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 95% a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5% de los residuos aminoácidos en la secuencia de referencia se pueden eliminar o sustituir con otros aminoácidos, o un número de hasta 5% de los residuos totales de aminoácidos en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxi-terminal de la secuencia de aminoácidos de referencia, o en cualquier punto entre estas dos posiciones terminales, pueden estar entremezcladas individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia, o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
En términos prácticos, se puede determinar si cualquier polipéptido particular es al menos idéntico en 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que se muestra en la Figura 1 o a la secuencia de aminoácidos codificado por el clon de cDNA depositado, de manera convencional utilizando programas informáticos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unís, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, idéntica en 95% a una secuencia de referencia según la presente invención, los parámetros se establecen, lógicamente, de modo que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia, y que se permitan separaciones de homología de hasta 5% del número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia.
Como se describirá más detalladamente más adelante, los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar para generar anticuerpos policlonales y monoclonales, que son de utilidad en ensayos diagnósticos para detectar la expresión de proteína KGF-2, según se describe más adelante, o como agonistas y antagonistas capaces de potenciar o inhibir la función de la proteína KGF-2. Adicionalmente, estos polipéptidos se pueden usar en el sistema doble híbrido de levadura para "capturar" las proteínas que se fijan a la proteína KGF-2, que son también agonistas o antagonistas candidatos según la presente invención. El sistema doble híbrido de levadura se describe en Fields y Song, Nature 340:245-246 (1989).
Como podrá apreciar un experto en la técnica, polipéptidos mutantes de KGF-2 de la presente invención se pueden combinar con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), dando lugar a polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran, in vivo, una semivida aumentada. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas formadas por los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de mamíferos (documento EPA 394.827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). Asimismo, las proteínas de fusión que tienen una estructura dímera unida por disulfuros, debido a la parte IgG, pueden ser más eficaces en fijarse y neutralizar otras moléculas que la proteína KGF-2 monómera o fragmento de proteína (Fountoulakis et al., J. Biochem 270:3958-3964 (1995)).
También se describen nuevas variantes de KGF-2 mutante. Éstas se pueden producir por deleción o sustitución de uno o más aminoácidos de KGF-2 mutante. Las mutaciones naturales de llaman variaciones alélicas. Las variaciones alélicas pueden ser silentes (sin cambios en el polipéptido codificado), o pueden tener una secuencia alterada de aminoácidos.
Con el fin de intentar mejorar o alterar las características de KGF-2 mutante, se puede emplear ingeniería proteica. Se puede utilizar tecnología de DNA recombinante, conocida para los expertos en la técnica, para crear nuevos polipéptidos. Muteínas y deleciones pueden mostrar, por ejemplo, actividad potenciada o estabilidad incrementada. Además, se les ha podido purificar con un mayor rendimiento y muestra una mejor solubilidad al menos bajo determinadas condiciones de purificación y almacenamiento. Más adelante se citan ejemplos de mutaciones que se pueden construir.
Deleciones amino-terminales y carboxi-terminales
Diversos miembros de la familia FGF han sido modificados utilizando tecnología de DNA recombinante. Moléculas de carga positiva han sido sustituidas o eliminadas tanto en aFGF como en bFGF, que son importantes para la fijación de heparina. Las moléculas modificadas dieron como resultado una actividad reducida de fijación de heparina. En consecuencia, se sabe que se reduciría la cantidad de molécula modificada secuestrada por la heparina en un paciente, aumentando la potencia dado que más FGF alcanzaría el receptor apropiado (documento EP 0 298 723).
El KGF-2 nativo es relativamente inestable en estado acuoso y está sometido a degradación química y física, lo que determina una pérdida de actividad biológica durante el procesamiento y almacenamiento. El KGF-2 nativo es también propenso a la agregación en solución acuosa, a temperaturas elevadas y se inactiva bajo condiciones ácidas.
Con el fin de mejorar o alterar una o más características del KGF-2 nativo, se puede emplear ingeniería de proteína. Ron et al., J. Biol. Chem., 268(4):2984-2988 (1993) informaron sobre proteínas KGF modificadas que tenían actividad de fijación de heparina incluso en ausencia de los residuos de aminoácidos terminales 3, 8 ó 27. La deleción de 3 y 8 aminoácidos tuvo actividad completa. Se han descrito más deleciones de KGF en el documento PCT/IB95/00971. La deleción de aminoácidos carboxi-terminales puede potenciar la actividad de proteínas. Un ejemplo es el interferón gamma, que muestra una actividad hasta diez veces mayor mediante la deleción de diez residuos aminoácidos del extremo carboxi de la proteína (Döbeli et al., J. of Biotechnology 7:199-216 (1988)). Así, un aspecto de la invención es proporcionar análogos de polipéptidos de KGF-2 y secuencias de nucleótidos que codifican dichos análogos, que exhiben una estabilidad potenciada (por ejemplo, cuando se les expone a pH, condiciones térmicas u otras condiciones de almacenamiento típicos) en relación con el polipéptido KGF-2.
A continuación, se muestran polipéptidos KGF-2 de la invención (la numeración se inicia con el primer aminoácido en la proteína (Met)):
Ser(46)
\;
- 
\;
Ser(208)
Pro(47)
\;
- 
\;
Ser(208)
Glu(48)
\;
- 
\;
Ser(208)
Ala(49)
\;
- 
\;
Ser(208)
Thr(50)
\;
- 
\;
Ser(208)
Asn(51)
\;
- 
\;
Ser(208)
Ser(52)
\;
- 
\;
Ser(208)
Ser(53)
\;
- 
\;
Ser(208)
Ser(54)
\;
- 
\;
Ser(208)
Ser(55)
\;
- 
\;
Ser(208)
Ser(56)
\;
- 
\;
Ser(208)
Phe(57)
\;
- 
\;
Ser(208)
Ser(59)
\;
- 
\;
Ser(208)
Ser(62)
\;
- 
\;
Ser(208)
Ala(63)
\;
- 
\;
Ser(208)
Gly(64)
\;
- 
\;
Ser(208)
Arg(65)
\;
- 
\;
Ser(208)
Val(67)
\;
- 
\;
Ser(208)
Ser(69)
\;
- 
\;
Ser(208)
Val(77)
\;
- 
\;
Ser(208)
La invención incluye las deleciones N-terminal Ala(63) - Ser(208) (KGF-2\Delta28) y Ser(69) - Ser(208) (KGF-2\Delta33). Otros mutantes preferidos por deleción N-terminal y C-terminal se describen en los Ejemplos 13 y 16 (c) de la especificación, e incluyen:
Pro(47)
\;
- 
\;
Ser(208) y Val(77)
\;
- 
\;
Ser(208)
También incluye la presente invención mutantes por deleción que tienen aminoácidos eliminados tanto del extremo N como del C.
Estas combinaciones se pueden realizar usando técnicas de recombinación conocidas por el experto en la técnica.
En la presente solicitud se describen mutantes por deleción N-terminal. Estos mutantes incluyen los que comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:2), excepto una deleción de al menos los primeros 38 residuos aminoácidos N-terminales (es decir, una deleción de al menos Met(1) - Gln(38)), pero no más que los primeros 147 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). De forma alternativa, la deleción incluirá al menos del primeros 38 residuos aminoácidos N-terminales (es decir, una deleción de al menos Met(1) - Gln(38)), pero no más que los primeros 137 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). De manera alternativa, la deleción incluirá al menos los primeros 46 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 137 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). Alternativamente, la deleción incluirá al menos los primeros 62 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 137 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). De forma alternativa, la deleción incluirá al menos los primeros 68 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 137 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). Alternativamente, la deleción incluirá al menos los primeros 76 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 137 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 2 (SEC ID NO:2). De manera alternativa, la deleción incluirá al menos los primeros 92 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 137 residuos aminoácidos de la Figura 1 (SEC ID NO:2). De manera alternativa, la deleción incluirá al menos los primeros 103 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 137 residuos aminoácidos de la Figura 1 (SEC ID NO:2). De forma alternativa, la deleción incluirá al menos los primeros 122 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 137 residuos aminoácidos de la Figura 1 (SEC ID NO:2).
Además de los intervalos de mutantes por deleción N-terminal anteriormente descritos, la presente solicitud describe también todas las combinaciones de los intervalos anteriormente descritos, por ejemplo, deleciones de al menos los primeros 62 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 68 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los primeros 62 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 76 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los primeros 62 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 92 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los primeros 62 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 103 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los primeros 68 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 76 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los primeros 68 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 92 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los primeros 68 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 103 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los primeros 46 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 62 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los primeros 46 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 68 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los primeros 46 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 76 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); etc., etc., etc.
En la presente solicitud se describen también mutantes por deleción C-terminal.
Preferentemente, el residuo aminoácido N-terminal de dichos mutantes por deleción C-terminal es el residuo aminoácido 1 (Met), 36 (Thr), o 37 (Cys) de la Figura 1 (SEC ID NO:2). Estos mutantes incluyen aquellos que comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:2), excepto una deleción de al menos el último residuo aminoácido C-terminal (Ser(208)), pero no más que los últimos 55 residuos aminoácidos C-terminales (es decir, una deleción de los residuos aminoácidos Glu(154) - Ser(208)) de la Figura 1 (SEC ID NO:2). Alternativamente, la deleción incluirá al menos el último residuo aminoácido C-terminal, pero no más que los últimos 65 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). De modo alternativo, la deleción incluirá al menos los últimos 10 residuos aminoácidos C-terminales, pero no más que los últimos 55 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). De forma alternativa, la deleción incluirá al menos los últimos 20 residuos aminoácidos C-terminales, pero no más que los últimos 55 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). De manera alternativa, la deleción incluirá al menos los últimos 30 residuos aminoácidos C-terminales, pero no más que los últimos 55 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). Alternativamente, la deleción incluirá al menos los últimos 40 residuos aminoácidos C-terminales, pero no más que los últimos 55 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). De modo alternativo, la deleción incluirá al menos los últimos 50 residuos aminoácidos C-terminales, pero no más que los últimos 55 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2).
Además de los intervalos de mutantes por deleción C-terminal anteriormente descritos, la presente solicitud describe también todas las combinaciones de los intervalos anteriormente descritos, por ejemplo, deleciones de la menos el último residuo aminoácido C-terminal, pero no más que los 10 últimos residuos aminoácidos de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos el último residuo C-terminal, pero no más que los 20 últimos residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos el último residuo aminoácido C-terminal, pero no más que los últimos 30 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos el último residuo aminoácido C-terminal, pero no más que los últimos 40 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los 10 últimos residuos aminoácidos C-terminales, pero no más que los últimos 20 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los 10 últimos residuos aminoácidos C-terminales, pero no más que los últimos 30 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los 10 últimos residuos aminoácidos C-terminales, pero no más que los últimos 40 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); deleciones de al menos los 20 últimos residuos aminoácidos C-terminales, pero no más que los últimos 30 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2); etc., etc., etc.
También se describen en la presente solicitud mutantes de deleción en los que se eliminan aminoácidos tanto de los residuos N-terminales como C-terminales. Estos mutantes incluyen todas las combinaciones de los mutantes por deleción N-terminal y de los mutantes por deleción C-terminal anteriormente descritos. Estos mutantes incluyen los que comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:2), excepto una deleción de al menos los primeros 46 residuos aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 137 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2), y una deleción de al menos el último residuo aminoácido C-terminal, pero no más que los últimos 55 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2). De forma alternativa, una deleción puede incluir al menos los primeros 62, 68, 76, 92, 103, o 122 aminoácidos N-terminales, pero no más que los primeros 137 residuos aminoácidos N-terminales de la Figura 1 (SEC ID NO:2), y una deleción de al menos los últimos 10, 20, 30, 40 ó 50 residuos aminoácidos C-terminales, pero no más que los últimos 55 residuos aminoácidos C-terminales de la Figura 1.
Se describen, adicionalmente, todas las combinaciones de los intervalos anteriormente descritos.
Sustitución de aminoácidos
Un aspecto adicional de la presente invención incluye también la sustitución de aminoácidos. El KGF-2 nativo maduro contiene 44 residuos cargados, 32 de los cuales tienen una carga positiva. Dependiendo de la localización de dichos residuos en la estructura tridimensional de la proteína, la sustitución de uno o más de estos residuos agrupados con aminoácidos portadores de una carga negativa o una carga neutra puede alterar las interacciones electrostáticas de residuos adyacentes y puede ser de utilidad para lograr una estabilidad aumentada y una agregación reducida de la proteína. La agregación de proteínas no sólo puede dar lugar a una pérdida de actividad, sino que también puede ser problemática cuando se preparen formulaciones farmacéuticas, porque pueden ser inmunogénicas (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967), Robbins et al., Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)). Cualquier modificación debe dar consideración a minimizar la repulsión de cargas en la estructura terciaria de la molécula de proteína. Así, resultan especialmente interesantes las sustituciones de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados, con carga neutra o negativa. Esto último da como consecuencia proteínas con una reducida carga positiva para mejorar las características de KGF-2. Estas mejoras incluyen una mayor estabilidad y reducida agregación del análogo, en comparación con la proteína KGF-2
nativa.
La sustitución de aminoácidos puede cambiar también la selectividad de unión a los receptores superficiales de la célula. Ostade et al, Nature 361:266-268 (1993) describen ciertas mutaciones de TNF alfa resultantes en una fijación selectiva de TNF alfa a sólo uno de los dos receptores de TNF conocidos.
Las moléculas de KGF-2 pueden incluir una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, ya sea por mutación natural o por manipulación humana.
Ejemplos de algunas mutaciones preferidas son: Ala(49)Gln, Asn(51)Ala, Ser(54)Val, Ala(63)Pro, Gly(64)Glu, Val(67)Thr, Trp(79)Val, Arg(80)Lys, Lys(87)Arg, Tyr(88)Trp, Phe(89)Tyr, Lys(91)Arg, Ser(99)Lys, Lys(102)Gln, Lys(103)Glu, Glu(104)Met, Asn(105)Lys, Pro(107)Asn, Ser(109)Asn, Leu(111)Met, Thr(114)Arg, Glu(117)Ala, Val(120)Ile, Val(123)Ile, Ala(125)Gly, Ile(126)Val, Asn(127)Glu, Asn(127)Gln, Tyr(130)Phe, Met(134)Thr, Lys(136)Glu, Lys(137)Glu, Gly(142)Ala, Ser(143)Lys, Phe(146)Ser, Asn(148)Glu, Lys(151)Asn, Leu(152)Phe, Glu(154)Gly, Glu(154)Asp, Arg(155)Leu, Glu(157)Leu, Gly(160)His, Phe(167)Ala, Asn(168)Lys, Gln(170)Thr, Arg(174)Gly, Tyr(177)Phe, Gly(182)Gln, Ala(185)Val, Ala(185)Leu, Ala(185)Ile, Arg(187)Gln(190)Lys, Lys(195)Glu, Thr(197)Lys, Ser(198)Thr, Arg(194)Glu, Arg(194)Gln, Lys(191)Glu, Lys(191)Gln, Arg(188)Glu, Arg(188)Gln, Lys(183)Glu.
Por la designación, por ejemplo, de Ala(49)Gln se entiende que la Ala en posición 49 de la Figura 1 (SEC ID NO:2) se reemplaza por Gln.
Preferentemente, los cambios de naturaleza menor, de modo que las sustituciones de aminoácidos conservadores no afecten de manera significativa al plegado o actividad de la proteína. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadores conocidas por los expertos en la técnica se exponen a continuación:
Aromáticos: fenilalanina
triptófano
tirosina
Hidrófobos: leucina
isoleucina
valina
Polares: glutamina
asparagina
Básicos: arginina
lisina
histidina
Ácidos: ácido aspártico
ácido glutámico
Pequeños: alanina
serina
treonina
metionina
glicina
Lógicamente, el número de sustituciones de aminoácidos que realizará un experto en la técnica depende de muchos factores, incluidos los anteriormente descritos. En términos generales, el número de sustituciones para cualquier polipéptido KGF-2 determinado no será mayor que 50, 40, 30, 20, 10, 5 ó 3, dependiendo del objetivo. Por ejemplo, una serie de sustituciones que se puede realizar en el extremo C de KGF-2 para mejorar la estabilidad se han descrito anteriormente y en el Ejemplo 22.
Aminoácidos en KGF-2 que son esenciales para la función se pueden identificar por métodos bien conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de escaneo de alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Este último procedimiento introduce mutaciones únicas de alanina en cada residuo de la molécula. Se analiza, entonces, la actividad biológica de las moléculas mutantes resultantes, tales como fijación a receptores o la actividad proliferativa in vitro e in vivo (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 10 y 11). Asimismo, se pueden determinar sitios que resultan críticos para la unión de ligando-receptor, por análisis estructural tales como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcado por foto-afinidad. (Véanse, por ejemplo: Smith et al., J. Mol. Biol.. 224:899-904 (1992); y de Vos et al. Science, 255:306-312 (1992)).
Se puede efectuar una sustitución de serina por cisteína en las posiciones de aminoácidos 106 y 150. Un número no uniforme de cisteínas significa que al menos un residuo de cisteína está disponible para entrecruzamientos o enlaces intermoleculares, que pueden determinar que la proteína adopte una estructura terciaria indeseable. Nuevas proteínas KGF-2 que tienen una o más cisteínas sustituidas por serina o, por ejemplo, alanina, se purifican por lo general con un rendimiento mayor de proteína soluble, correctamente plegada. Aunque no se ha comprobado, se cree que el residuo de cisteína en la posición 106 es importante para la función. Este residuo de cisteína está altamente conservado entre todos los restantes miembros de la familia FGF.
Un aspecto adicional de la presente invención son las fusiones de KGF-2 con otras proteínas o fragmentos de las mismas, tales como fusiones o híbridos con otras proteínas FGF, por ejemplo KGF (FGF-7), bFGF, aFGF, FGF-5, FGF-6, etc. Se ha informado de un híbrido de este tipo para KGF (FGF-7). En la solicitud publicada de PCT nº 90/08771, se ha producido una proteína quimérica compuesta por los primeros 40 residuos aminoácidos de KGF y la porción C-terminal de aFGF. Se ha informado que esta quimera es diana para queratinocitos tales como KGF, pero que carece de susceptibilidad a la heparina, una característica de aFGF, pero no de KGF. Las fusiones con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG) muestran, a menudo, un tiempo de semivida aumentado in vivo. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas compuestas por los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano con diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de mamíferos (Solicitud de Patente Europea, Publicación Nº 394 827, Traunecker et al., Nature 331, 84-86 (1988). Las proteínas de fusión que tienen una estructura enlazada por disulfuros pueden ser también más eficaces en la unión de moléculas monómeras solas (Fountoulakis et al., J. of Biochemistry, 270:3958-3964 (1995)).
Partes antigénicas/hidrófilas de KGF-2
Como se ha demostrado en las Figuras 4A-4E, existen 4 regiones importantes, altamente hidrófilas, en la proteína KGF-2. Residuos aminoácidos Gly41 - Asn71, Lys91 - Ser109, Asn135 - Tyr164 y Asn181 - Ala199 [SEC ID NOS:25-28]. Hay otras dos áreas antigénicas más cortas, predichas, adicionales, Gln74 - Arg78 y Gln170 - Gln175. Se sabe que las partes hidrófilas se encuentran principalmente en el exterior (superficie) de las proteínas y, por lo tanto, están disponibles para los anticuerpos que reconocen estas regiones. Asimismo, existen dos regiones que están probablemente implicadas en la fijación de KGF-2 a su(s) receptor(es). Péptidos sintéticos derivados de estas áreas pueden interferir con la unión de KGF-2 a su(s) receptor(es) y, por lo tanto, bloquear la función de la proteína. Péptidos sintéticos de las partes hidrófilas de la proteína pueden tener también una acción agonista, es decir, imitar la función de KGF-2.
Modificaciones químicas
Es posible modificar adicionalmente polipéptidos de KGF mutante para contener restos químicos adicionales que no forman parte normalmente de la proteína. Estos restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la semivida biológica o la absorción de la proteína. Asimismo, los restos pueden reducir o eliminar cualquier efecto secundario indeseable de las proteínas y similares. Se puede encontrar un análisis de estos restos en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18ª edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). polietilenglicol (PEG) es uno de estos restos químicos que se ha utilizado para la preparación de proteínas terapéuticas. La unión de PEG a proteínas ha demostrado conferir protección contra la proteólisis, Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71:137-139 (1991). Existen varios métodos disponibles para la unión de ciertos restos de PEG. Para su análisis, véase: Abuchowski et al., in Encimes as Drugs. (Holcerberg y Roberts, compiladores), pág-367-383 (1981). Muchas patentes publicadas describen derivados de PEG y procesos para su preparación, por ejemplo, Ono et al, Patente de EE.UU. Nº 5.342.940; Nitecki et al., Patente de EE.UU. Nº 5.089.261; Delgado et al., Patente de EE.UU. Nº 5.349.052. Por lo general, las moléculas de PEG están conectadas con la proteína a través de un grupo reactivo que se encuentra en la proteína. Entre otros, los grupos amino, por ejemplo en lisinas o el extremo amino de la proteína resultan adecuados para esta unión.
Vectores y células hospedadoras
La presente invención se refiere también a vectores, que incluyen las moléculas de DNA aisladas de la presente invención, células hospedadoras modificadas por ingeniería genética con los vectores recombinantes, y la producción de polipéptidos mutantes de KGF-2, o fragmentos de los mismos, por técnicas recombinantes.
Se pueden emplear fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención para producir el correspondiente polipéptido de longitud total por síntesis peptídica; por consiguiente, los fragmentos se pueden utilizar como intermedios para producir polipéptidos de longitud total. Se pueden usar fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención para sintetizar polinucleótidos de longitud total de la presente invención. La presente invención se refiere también a vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, células hospedadoras modificadas por ingeniería genética con vectores de la invención, y la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.
Las células hospedadoras se modifican por ingeniería genética (transducción, transformación o transfección) con los vectores de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plasmidio, una partícula viral, un fago, etc. Las células hospedadoras modificadas por ingeniería se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales, modificados de la forma adecuada, para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes KGF-2. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con las células hospedadoras seleccionadas para expresión, y resultarán evidentes para el experto en la técnica.
Los polinucleótidos de la presente invención se pueden emplear para producir polipéptidos por técnicas recombinantes. De esta forma, por ejemplo, el polinucleótido puede estar incluido en cualquiera de diversos vectores de expresión para expresar un polipéptido. Estos vectores incluyen secuencias de DNA cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plasmidios bacterianos; DNA de fago; baculovirus; plasmidios de levaduras; vectores derivados de combinaciones de DNA de plasmidios y fagos, DNA vírico tal como vaccinia, adenovirus, virus del epitelioma contagioso, y pseudo-rabia. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector siempre que sea replicable y viable en el huésped.
La secuencia adecuada de DNA se puede insertar en el vector por diversos procedimientos. En general, la secuencia de DNA se inserta en sitio(s) adecuados de endonucleasa de restricción por procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que estos y otros procedimientos se encuentran al alcance de los expertos en la técnica.
La secuencia de DNA en el vector de expresión está enlazada operativamente con secuencias de control de expresión adecuadas (promotor) para dirigir la síntesis de cDNA. Como ejemplos representativos de tales promotores, se pueden mencionar: promotor LTR o SV40, lac o trp de E. coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores de los que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión contiene también un sitio de fijación de ribosomas para iniciar la traducción y un terminador de trascripción. El vector puede incluir también secuencias apropiadas para amplificar la expresión.
Además, los vectores de expresión contienen, preferentemente, uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas, tales como dihidrofolato-reductasa o resistencia a la neomicina para cultivo de células eucariotas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.
El vector que contiene la secuencia de DNA adecuada, como se ha descrito anteriormente, así como un promotor o secuencia de control adecuada, se pueden emplear para transformar un huésped adecuado para permitir que el huésped exprese la proteína.
Como ejemplos representativos de huéspedes adecuados, se pueden mencionar: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como levaduras; células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células vegetales, etc. Se estima que la selección de un huésped adecuado se encuentra al alcance de los expertos en la técnica gracias a las presentes enseñanzas.
Más particularmente, la presente invención incluye también construcciones recombinantes, que comprenden una o más de las secuencias, tal como se ha descrito ampliamente antes. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plasmidio o vector vírico, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en orientación hacia delante o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende, adicionalmente, secuencias de regulación que incluyen, por ejemplo, un promotor, enlazado de forma operativa con la secuencia. Los expertos en la técnica conocen un elevado número de vectores y promotores adecuados, que están disponibles en el comercio. Se ofrecen los siguientes vectores a modo de ejemplo; bacteriano; pQE70, pQE-9 (Qiagen), pBS, pDIO, fagoscripto, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eucariotas: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). No obstante se puede utilizar cualquier otro plasmidio o vector, siempre que sea replicable y viable en el huésped.
Se pueden seleccionar regiones promotoras a partir de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol-transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Promotores bacterianos especialmente mencionados incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, P_{R} lambda, P_{L} y trp. Promotores eucariotas incluyen CMV inmediato temprano, timidina-quinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La selección de los vectores y promotores adecuados se encuentra dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a células hospedadoras que contienen las construcciones anteriormente descritas. La célula hospedadora puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedadora se puede efectuar por transfección de fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o por electroporación (Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).
Las construcciones en las células hospedadoras se pueden utilizar de forma convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. De forma alternativa, los polipéptidos de la invención se puede producir de forma sintética por medios de sintetizadores convencionales de péptidos.
Las proteínas maduras se pueden expresar en células de mamíferos, células de levadura, bacterias u otras células, bajo el control de promotores apropiados. Asimismo, se pueden emplear sistemas de traducción acelulares para producir estas proteínas usando RNA derivados de las construcciones de DNA de la presente invención. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), describen vectores de clonación y expresión adecuados para ser utilizados con huéspedes procariotas y eucariotas, descripción que se incorpora a este documento como referencia.
La trascripción del DNA que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores, se incrementa mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Potenciadores son elementos de acción cis de DNA, de habitualmente alrededor de 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su trascripción. Los ejemplos de los mismos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación, 100 pb a 270, un potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.
Para la secreción de la proteína traducida hacia la luz del retículo endoplasmático, en el espacio periplasmático o en el entorno extracelular, se pueden incorporar señales adecuadas de secreción en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas para el polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
El polipéptido se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, se puede añadir al extremo N del polipéptido una región de aminoácidos adicionales, en especial aminoácidos cargados, para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación, o durante la subsiguiente manipulación y almacenamiento. Igualmente, se pueden añadir restos peptídicos al polipéptido para facilitar la purificación. Estas regiones se pueden separar antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos peptídicos a polipéptidos para generar secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y facilitar la purificación, entre otros, son técnicas familiares y rutinarias en la técnica. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que resulta útil para solubilizar receptores. Por ejemplo, el documento EP-A-O 464 533 (equivalente canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de región constante de moléculas de inmunoglobulina, junto con otra proteína humana o una parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc en la proteína de fusión es absolutamente ventajosa para utilizar en terapia y diagnóstico, dando como resultado, por tanto, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (documento EP-A 0232 262). Por otra parte, para determinadas utilizaciones, sería deseable poder eliminar la parte Fc después de que la proteína de fusión se haya expresado, detectado y purificado de la forma ventajosa descrita. Este es el caso cuando la porción Fc demuestra ser un impedimento para su uso en terapia y diagnóstico, por ejemplo cuando la proteína de fusión se debe utilizar como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de medicamentos, por ejemplo, proteínas humanas, tales como shIL-5, se han fusionado con porciones Fc con el fin de obtener ensayos de análisis de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. Véase D. Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, Vol. 8 52-58 (1995) y K. Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, Nº 16, págs, 9459-9471 (1995).
Por lo general, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables, que permiten la transformación de la célula hospedadora, por ejemplo el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la trascripción de una secuencia estructural corriente abajo. Estos promotores se pueden derivar de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato-quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida, o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga está ensamblada en fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de traducción y, preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de proteína traducida al espacio periplasmático o al medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que imparte características deseadas, por ejemplo estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.
Vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de DNA estructural que codifica una proteína deseada, junto con las señales de inicio y terminación de la traducción, en fase de lectura operable, con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para garantizar la conservación del vector y, si se desea, para amplificar dentro del huésped. Huéspedes procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aun cuando se pueden emplear otras si así se decide.
Como ejemplo representativo, pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen bacteriano de replicación, derivado de plasmidios disponibles en el comercio que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Estos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEMI (Promega Biotec, Madisom Wi, EE.UU.). Estas secciones "fundamentales" pBR322 se combinan con un promotor adecuado y la secuencia estructural que se va a expresar.
Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y del crecimiento de la cepa hospedadora a una densidad celular apropiada, se induce el promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un período adicional.
Las células se cosechan, típicamente, por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto bruto resultante se conserva para posterior purificación.
Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas se pueden romper por cualquier método conveniente, incluidos los ciclos de congelación-descongelación, sonicación, disrupción mecánica, o uso de agentes lisadores, siendo estos métodos bien conocidos para los expertos en la técnica.
Asimismo, se pueden utilizar diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar la proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de simio, descritas por Gluzman, Cell 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados, así como cualquier sitio de fijación de ribosomas necesario, sitio de poliadenilación, sitios de unión de donante y aceptor, secuencias de terminación trascripcional, y secuencias no trascritas de flanqueo 5'. Se pueden utilizar secuencias de DNA derivadas de la unión SV40, y sitios de poliadenilación para proporcionar los elementos genéticos no trascritos requeridos.
El polipéptido KGF-2 se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes, por métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción por ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. En caso necesario, se pueden utilizar etapas de replegado de proteínas para completar la configuración de la proteína madura. Por último, se puede usar cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para etapas de purificación finales.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto de purificación natural, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o producido por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariota o eucariota (por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, insectos o mamíferos en cultivo). Dependiendo del huésped utilizado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o no glicosilados. Los polipéptidos de la invención pueden incluir también un residuo aminoácido inicial de metionina.
Aplicaciones diagnósticas y terapéuticas de KGF-2
Como se usa en la sección siguiente, "KGF-2" hace referencia a las formas de KGF-2 de longitud total y maduras descritas en este documento, y a análogos, derivados y mutantes de KGF-2 descritos en este documento. Esta invención se refiere también al uso del gen KGF-2 como parte de un ensayo diagnóstico para detectar enfermedades o susceptibilidad a enfermedades relacionadas con la presencia de mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos de KGF-2.
Los individuos portadores de mutaciones del gen de KGF-2 se pueden detectar a nivel del DNA por una variedad de técnicas. Ácidos nucleicos para el diagnóstico se pueden obtener de las células de un paciente, tales como de sangre, orina, saliva, biopsia de tejidos y material de autopsia. El DNA genómico se puede utilizar directamente para la detección, o se puede amplificar de manera enzimática mediante el uso de PCR (Saiki et al., Nature 324:163-166 (1986)), antes del análisis. También se puede utilizar RNA o cDNA para el mismo propósito. Por ejemplo, se pueden utilizar cebadores de PCR complementarios para los ácidos nucleicos que codifican KGF-2, para identificar y analizar mutaciones de KGF-2. Por ejemplo, se pueden detectar deleciones e inserciones por un cambio del tamaño del producto amplificado, en comparación con el genotipo normal. Mutaciones puntuales se pueden identificar hibridando DNA amplificado a RNA marcado radiactivamente de KGF-2 o, de forma alternativa, secuencias de DNA antisentido, marcadas radiactivamente, de KGF-2. Se pueden distinguir secuencias perfectamente coincidentes de dúplex no coincidentes por digestión con RNasa A o por diferencias en las temperaturas de fusión.
Los ensayos genéticos, basados en las diferencias de secuencias de DNA, se pueden alcanzar por detección de alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de DNA en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Es posible visualizar pequeñas deleciones e inserciones de secuencia por electroforesis sobre gel de alta resolución. Los fragmentos de DNA de diferentes secuencias se pueden distinguir sobre geles en gradiente de formamida desnaturalizante en los que las movilidades de diferentes fragmentos de DNA se retrasan en el gel en diferentes posiciones, de acuerdo con sus temperaturas de fusión específica o parcial (véase, por ejemplo, Myers et al., Science, 230:1242 (1985)).
También se pueden revelar cambios de secuencias en localizaciones específicas por ensayos de protección de nucleasa, tales como RNasa y protección SI, o por el método de escisión química (por ejemplo, Cotton et al, PNAS, USA, 85:4397-4401 (1985)).
De este modo, se puede lograr la detección de una secuencia de DNA específica por métodos tales como hibridación, protección con RNasa, escisión química, secuenciación de DNA directa, o por el uso de enzimas de restricción (por ejemplo, Polimorfismos de Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP)) y transferencia de Southern de DNA genómico.
Además de la electroforesis sobre gel y la secuenciación de DNA, más convencionales, las mutaciones se pueden detectar también por análisis in situ.
La presente invención describe, igualmente, un ensayo diagnóstico para detectar niveles alterados de proteína KGF-2 en diversos tejidos, puesto que una sobreexpresión de las proteínas, comparada con muestras de tejido de control normal, puede detectar la presencia de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, por ejemplo, un tumor. Los ensayos utilizados para detectar niveles de proteína KGF-2 en una muestra procedente de un huésped son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de western, ensayos ELISA y ensayo en "emparedado". Un ensayo ELISA (Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), Capítulo 6, (1991)) comprende, inicialmente, preparar un anticuerpo específico contra el antígeno KGF-2, preferentemente un anticuerpo monoclonal. Al anticuerpo informador se une un reactivo detectable, tal como radiactividad, fluorescencia o, en este ejemplo, una enzima peroxidasa de rábano picante. Se extrae una muestra del huésped y se incuba en un soporte sólido, por ejemplo una placa de poliestireno, que une las proteínas en la muestra. A continuación se cubre cualquier sitio libre de unión de proteínas mediante la incubación con una proteína no específica, tal como albúmina de suero bovino. Seguidamente, se fijan anticuerpos monoclonales a cualquier proteína KGF-2 unida a la placa de poliestireno. Se retira por lavado con tampón el anticuerpo monoclonal no unido. El anticuerpo informador enlazado con la peroxidasa de rábano picante se coloca entonces en la placa, dando como resultado la unión del anticuerpo informador a cualquier anticuerpo monoclonal fijado a KGF-2. Se retira, entonces, por lavado el anticuerpo informador no unido. Se añaden, a continuación, sustratos de peroxidasa a la placa y la cantidad de color desarrollada en un período determinado de tiempo es la medición de la cantidad de proteína KGF-2 presente en un volumen determinado de muestra del paciente, comparado frente a una curva estándar.
Se puede emplear un ensayo de competición cuando los anticuerpos específicos para KGF-2 se unen a un soporte sólido, y se hacen pasar KGF-2 marcado y una muestra procedente del huésped a través del soporte sólido, pudiéndose correlacionar la cantidad de marca detectada, por ejemplo por cromatografía de escintilación líquida, con una cantidad de KGF-2 en la muestra.
Un ensayo en "emparedado" es similar al ensayo ELISA. En este ensayo de "emparedado", se hace pasar KGF-2 a través de un soporte sólido y se une al anticuerpo unido al soporte sólido. A continuación, se une un segundo anticuerpo a KGF-2. Seguidamente, se hace pasar un tercer anticuerpo, que está marcado y es específico para el segundo anticuerpo, a través del soporte sólido y se fija al segundo anticuerpo, pudiéndose cuantificar entonces una cantidad.
Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de los mismos, o las células que los expresan, se pueden utilizar como inmunógeno para producir anticuerpos contra el mismo. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, policlonales o monoclonales. La presente invención incluye también anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla, y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. Se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de estos anticuerpos y fragmentos.
Se pueden obtener anticuerpos generados contra los polipéptidos correspondientes a una secuencia de la presente invención, por inyección directa de los polipéptidos en un animal, o mediante la administración de los polipéptidos a un animal, preferentemente no humano. El anticuerpo así obtenido se fijará entonces a los propios polipéptidos. De esta forma, incluso una secuencia que codifique sólo un fragmento de los polipéptidos se puede utilizar para generar anticuerpos que se fijan a la totalidad de los polipéptidos nativos. Estos anticuerpos se pueden usar, entonces, para aislar el polipéptido del tejido que lo expresa.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales se puede utilizar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, Nature, 256:495-497 (1975), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)), y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96 (1985)).
Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de EE.UU. Nº 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla contra los productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención. Asimismo, se pueden usar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados contra los productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención.
Los polipéptidos de la presente invención se pueden usar para la preparación de una composición farmacéutica para la estimulación del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, o angiogénesis. De manera particular, los polipéptidos de la presente invención pueden estimular el crecimiento y proliferación celular de queratinocitos. En consecuencia, la presente invención proporciona un proceso para utilizar ese polipéptido, o un polinucleótido que codifica dicho polipéptido, para la preparación de una composición farmacéutica con fines terapéuticos, por ejemplo, para estimular la proliferación de células epiteliales y los queratinocitos basales para la cicatrización de heridas, y para estimular la producción de folículos pilosos y curar las heridas dérmicas.
Como se ha señalado anteriormente, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar para la preparación de una composición farmacéutica para cicatrizar heridas dérmicas por la estimulación de la proliferación de células epidérmicas.
Estas heridas pueden ser de naturaleza superficial, o pueden ser profundas y afectar a la dermis y epidermis de la piel. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para la producción de una composición farmacéutica diseñada para ser administrada con el objetivo de estimular la cicatrización de heridas.
El individuo al que se administra KGF-2 puede cicatrizar las heridas a una velocidad normal, o puede tener una cicatrización alterada. Cuando se administra a un individuo que no presenta alteración de la cicatrización, KGF-2 se administra para acelerar el proceso normal de curación. Cuando se administra a un individuo con cicatrización alterada, KGF-2 se administra para facilitar la cicatrización de heridas que, de lo contrario, curarían lentamente o no cicatrizarían en absoluto. como se señala más adelante, una serie de afecciones y patologías pueden tener como consecuencia una alteración de la cicatrización. Estas afecciones y patologías incluyen diabetes (por ejemplo, diabetes mellitus Tipo II), tratamientos con esteroides y otros agentes farmacológicos, y bloqueo o lesión isquémica. Los esteroides que han demostrado alterar la cicatrización de heridas incluyen cortisona, hidrocortisona, dexametasona y metilprednisolona.
Compuestos no esteroides, por ejemplo, acetato de octreotida, han demostrado alterar también la cicatrización. Waddell, B. et al., Am. Surg. 63:446- 449 (1997). Se estima que la presente invención estimula la cicatrización de heridas en individuos sometidos a tratamiento con estos agentes no esteroides.
Se ha demostrado que una serie de factores de crecimiento estimulan la cicatrización en individuos con alteración de esta función. Véase, por ejemplo, Steed, D. et al., J. Am. Coll. Surg. 183:61-64 (1996); Richard, J. et al., Diabetes Care 18:64-69 (1995); Steed, D., J. Vasc. Surg. 21:71-78 (1995); Kelley, S. et al., Proc. Soc. Exp. Biol.. 194:320-326 (1990). Estos factores de crecimiento incluyen factor liberador de hormona del crecimiento, factor de crecimiento derivado de plaquetas, y factor de crecimiento fibroblástico básico. Por lo tanto, la presente invención incluye también la administración de KGF-2 junto con uno o más factores de crecimiento adicionales, u otros agentes que estimulan la cicatrización.
La presente invención proporciona, igualmente, el uso de polipéptidos de la presente invención, para la producción de una composición farmacéutica para estimular la cicatrización de heridas anastomóticas o de otro tipo, causadas por procedimientos quirúrgicos en individuos que tienen una cicatrización normal y con una cicatrización alterada. La composición farmacéutica se puede diseñar para la administración de una cantidad eficaz de KGF-2 a un individuo antes, después y/o durante anastomosis u otro procedimiento quirúrgico. La anastomosis es la conexión de dos estructuras tubulares, tal como ocurre, por ejemplo, cuando se elimina una sección media de intestino y las porciones remanentes se unen para reconstituir el tracto intestinal. A diferencia de la cicatrización cutánea, el proceso de curación de las heridas anastomóticas no se visualiza en directo. Además, la cicatrización de heridas, al menos en el tracto gastrointestinal, se produce rápidamente en ausencia de complicaciones; no obstante, las complicaciones requieren a menudo correcciones por cirugía adicional. Thornton, F. y Barbul, A., Surg. Clin. North Am. 77:549-573 (1997).
Como se muestra en los Ejemplos 21 y 28, el tratamiento con KGF-2 provoca una reducción significativa de la filtración peritoneal y de la constricción anastomótica tras la anastomosis del colon. Se cree que KGF-2 produce estos resultados al acelerar el proceso de cicatrización, reduciendo de esta forma la probabilidad de que surjan complicaciones después de procedimientos de este tipo.
Por lo tanto, la presente invención proporciona también el uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para acelerar la cicatrización tras anastomosis u otros procedimientos quirúrgicos en un individuo con cicatrización a velocidad normal o cicatrización alterada.
Los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar también para preparar una composición farmacéutica para la estimulación de la diferenciación de células, por ejemplo, células musculares, células que conforman tejido nervioso, células de la próstata y células del pulmón.
KGF-2 puede resultar clínicamente útil para estimular la cicatrización de heridas, incluidas las heridas quirúrgicas, heridas por escisión, heridas profundas que implican daños de la dermis y epidermis, heridas de los tejidos oculares, heridas de los tejidos dentales, heridas de la cavidad bucal, úlceras diabéticas, úlceras dérmicas, úlceras por decúbito, úlceras arteriales, úlceras por estasis venoso y quemaduras resultantes de la exposición al calor o a productos químicos, en individuos normales y los que están sometidos a condiciones que inducen una cicatrización anormal de las heridas, tales como uremia, malnutrición, déficits de vitaminas, obesidad, infección, inmunosupresión y complicaciones asociadas con el tratamiento sistémico con esteroides, radioterapia y con fármacos antineoplásicos y antimetabolitos. KGF-2 es útil también para estimular la cicatrización de heridas asociadas con isquemia y lesiones isquémicas, por ejemplo, úlceras venosas crónicas de las piernas causadas por un trastorno y/o insuficiencia del sistema de retorno de la circulación venosa.
Asimismo, se puede usar KGF-2 para estimular el restablecimiento dérmico subsiguiente a la pérdida de dermis. Además, KGF-2 se puede usar para incrementar la fuerza de tensión de la epidermis y el espesor de la epidermis.
KGF-2 se puede usar para aumentar la adherencia de injertos de piel al lecho de una herida y para estimular la re-epitelización desde el lecho de la herida. Los siguientes son tipos de injertos en los que KGF-2 se podría utilizar para incrementar la adherencia al lecho de la herida: autoinjertos, piel artificial, aloinjertos, injerto auto-dérmico, injertos auto-epidérmicos, injertos avasculares, injertos de Blair-Brown, injertos de tejido óseo, injertos brefoplásticos, injerto de cutis, injerto retardado, injerto dérmico, injerto epidérmico, injerto de facias, injerto de grosor total, injerto heterólogo, xeno-injerto, injerto homólogo, injerto hiperplásico, injerto laminar, injerto de malla, injerto de mucosa, injerto de Ollier-Thiersch injerto omenpal, injerto de parche, injerto pediculado, injerto penetrante, injerto de piel dividida, injerto dividido grueso. KGF-2 se puede utilizar para estimular la resistencia de la piel y para mejorar el aspecto de la piel envejecida.
Se cree que KGF-2 producirá también cambios en la proliferación de hepatocitos, y proliferación de células epiteliales en pulmón, mama, páncreas, estómago, intestino delgado e intestino grueso. KGF-2 puede estimular la proliferación de células epiteliales tales como sebocitos, folículos pilosos, hepatocitos, neumocitos de tipo II, células cáliz productoras de mucina, y otras células epiteliales y sus progenitoras, contenidas en la piel, pulmón, hígado y tracto gastrointestinal. Por consiguiente, KGF-2 podría estimular la proliferación y diferenciación de hepatocitos y, de esta forma, se podría utilizar para aliviar o tratar enfermedades y patologías del hígado tales como insuficiencia hepática fulminante causada por cirrosis, lesiones hepáticas causadas por hepatitis virales y sustancias tóxicas (es decir, acetaminofeno, tetracloruro de carbono y otras toxinas hepáticas conocidas en la técnica). KGF-2 se puede utilizar también para estimular o promover la regeneración del hígado.
Igualmente, se puede usar KGF-2 para reducir los efectos secundarios de toxicidad intestinal resultante del tratamiento de infecciones víricas, radioterapia, quimioterapia u otros tratamientos. KGF-2 podría tener un efecto citoprotector sobre la mucosa del intestino delgado. KGF-2 se puede utilizar también de forma preventiva o terapéutica para prevenir o atenuar la mucositis y para estimular la cicatrización de la mucositis (por ejemplo, úlceras bucales, esofágicas, intestinales, del colon, recto y ano), consecuencia de la quimioterapia, otros agentes e infecciones víricas. Por lo tanto, la presente invención proporciona también el uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades o situaciones patológicas de la mucosa, incluida la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn, y otras enfermedades en las que la mucosa resulta dañada. La presente invención proporciona, igualmente, un método para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar la mucositis bucal (incluyendo la deglución dolorosa asociada con lesiones de la mucosa en la faringe o hipofaringe), esofágica, gástrica, intestinal, del colon y del recto, independientemente del agente l modalidad que cause la lesión.
KGF-2 puede estimular la proliferación de células endoteliales, queratinocitos, y queratinocitos basales. De este modo, la presente invención proporciona también un método in vitro para estimular la proliferación de estos tipos de células, que implica poner en contacto las células con una cantidad eficaz de los polipéptidos mutantes de KGF-2 de la presente invención. Adicionalmente, la presente invención se refiere al uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la proliferación de células endoteliales, queratinocitos, y queratinocitos basales. La presente invención proporciona, además, el uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la cicatrización urotelial, que comprende administrar una cantidad eficaz de KGF-2 a un individuo. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para la preparación de una composición farmacéutica para acelerar la cicatrización o tratamiento de una serie de patologías que afectan a las células uroteliales (es decir, células que recubren el tracto urinario). Las capas de tejido que comprende dichas células pueden estar dañadas por numerosos mecanismos, incluida la cateterización, cirugía o infecciones bacterianas (por ejemplo, infección por un agente responsable de una enfermedad de transmisión sexual, tal como gonorrea).
La presente invención comprende también el uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la cicatrización de tejidos en el tracto genital femenino. Las lesiones del tejido del tracto genital femenino pueden estar causadas por una amplia variedad de afecciones, incluidas las infecciones por Candida, tricomoniasis, Gardnerella, gonorrea, clamidia, infecciones por micoplasma y otras enfermedades de transmisión sexual.
Como se muestra en los Ejemplos 10, 18 y 19, KGF-2 estimula la proliferación de queratinocitos epidérmicos e incrementa el grosor de la epidermis. Por lo tanto, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar para la preparación de composiciones farmacéuticas para utilizar en la regeneración completa de la piel; en defectos cutáneos de espesor total o parcial, incluidas quemaduras (es decir, repoblación de folículos pilosos, glándulas sudoríparas, y glándulas sebáceas); y para usar en el tratamiento de otros trastornos de la piel, como psoriasis.
KGF-2 se puede usar para tratar la epidermolisis bullosa, un trastorno de adherencia de la epidermis a la dermis subyacente, que da lugar a frecuentes ampollas abiertas y dolorosas, mediante la aceleración de la re-epitelización de estas lesiones. Igualmente, KGF-2 se puede utilizar para tratar úlceras gástricas y duodenales y ayudar a cicatrizar el revestimiento de mucosa y regenerar el revestimiento de la mucosa glandular y duodenal más rápidamente. Las enfermedades inflamatorias del intestino, tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, son enfermedades que tienen como consecuencia la destrucción de la superficie mucosa del intestino delgado o grueso, respectivamente. Por lo tanto, KGF-2 se podría utilizar para estimular la recuperación de la superficie mucosa, con el fin de contribuir a una más rápida cicatrización y prevenir o atenuar la progresión de las enfermedades intestinales inflamatorias. Se espera que el tratamiento con KGF-2 tenga un efecto significativo sobre la producción de moco en todo el tracto gastrointestinal, que se podría utilizar para proteger la mucosa intestinal frente a sustancias nocivas que se ingieran o tras la cirugía. Como se ha señalado anteriormente, KGF-2 se puede usar también para estimular la cicatrización de anastomosis intestinales o del colon. KGF-2 se puede usar, adicionalmente, para tratar enfermedades asociadas con la sub- expresión de KGF-2.
Adicionalmente, KGF-2 se puede utilizar para prevenir y curar lesiones pulmonares causadas por diversos estados patológicos. Como factor de crecimiento, KGF-2 podría estimular la proliferación y diferenciación y estimular la reparación de alvéolos y del epitelio bronquiolar para prevenir, atenuar o tratar lesiones pulmonares agudas o crónicas. Por ejemplo, el enfisema, que tiene como resultado la progresiva pérdida de alvéolos, y lesiones por inhalación, es decir, resultantes de la inhalación de humo y quemaduras, que provocan necrosis del epitelio bronquiolar y de los alvéolos, se podrían tratar eficazmente usando KGF-2. Asimismo, KGF-2 se podría utilizar para estimular la proliferación y diferenciación de neumocitos tipo II, que pueden ayudar a tratar o prevenir enfermedades tales como las de la membrana hialina, el síndrome de distrés respiratorio infantil y la displasia broncopulmonar en bebés prematuros.
Las tres causas de la insuficiencia renal aguda son pre-renal (por ejemplo, insuficiencia cardiaca), intrínseca (por ejemplo, nefrotoxicidad inducida por agentes quimioterapéuticos) y post-renal (por ejemplo, obstrucción de las vías renales), que da lugar a lisis de la células túbulo-renales, obstrucción de la luz tubular y reflujo del filtrado a los glomérulos (analizado por Thadhani et al., N. Engl. J. Med. 334:1448-1460 (1996)). Factores de crecimiento tales como factor de crecimiento similar a la insulina I, proteína osteogénica-1, factor de crecimiento hepatocitario, y factor de crecimiento epidérmico han demostrado potencial para mejorar la enfermedad renal en modelos animales. Taub et al., Cytokine 5:175-179 (1993); Vukicevic et al., J. Am. Soc. Nephrol. 7:1867 (1996). KGF-2 podría estimular la proliferación y diferenciación de células renales y se le podría utilizar, por lo tanto, para aliviar o tratar enfermedades y patologías renales tales como la insuficiencia renal aguda y crónica y la enfermedad renal de estadio final.
KGF-2 podría estimular la proliferación y diferenciación del tejido mamario y, por lo tanto, se le podría utilizar para estimular la cicatrización de lesiones del tejido mamario causadas por cirugía, traumatismos o cáncer.
Además, KGF-2 se podría utilizar para tratar o prevenir el establecimiento de diabetes mellitus. En pacientes con diabetes Tipos I y II recientemente diagnosticadas, cuando aún se conserva una cierta función de las células del islote, KGF-2 se podría usar para conservar la función de los islotes para aliviar, retrasar o prevenir la manifestación permanente de la enfermedad. Asimismo, KGF-2 se podría utilizar como coadyuvante en el trasplante de células de islote para mejorar o estimular la función de las células de islote.
Adicionalmente, las propiedades antiinflamatorias de KGF-2 podrían ser beneficiosas para tratar patologías agudas o crónicas en las que la inflamación es un elemento patogénico clave de las enfermedades, incluidas, pero sin estar limitadas a, psoriasis, eccema, dermatitis y/o artritis. De este modo, la presente invención proporciona el uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o atenuar la inflamación, y enfermedades que cursan con inflamación, en un individuo.
KGF-2 se puede usar para estimular la cicatrización y aliviar las lesiones del tejido cerebral debidas a traumatismo, cirugía o productos químicos.
Además, dado que KGF-2 incrementa el espesor de la epidermis, la proteína se podría utilizar para mejorar la piel envejecida, reducir arrugas de la piel, y reducir las cicatrices tras la cirugía. Las cicatrices de tejidos heridos implican a menudo una hiperproliferación de fibroblastos dérmicos. Como se indica en el Ejemplo 10, KGF-2 no estimula la proliferación de fibroblastos. Por lo tanto, KGF-2 parece ser un mitógeno específico para queratinocitos epidérmicos e induce una cicatrización de heridas con mínimas cicatrices. Por lo tanto, la presente invención proporciona el uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la cicatrización de heridas con cicatrices mínimas. KGF-2 se puede administrar antes, durante y/o después del proceso que produce la herida (por ejemplo, cirugía estética, traumatismo de tejidos accidental o deliberado, causado por un objeto afilado).
Como se ha señalado anteriormente, KGF-2 estimula también la proliferación de queratinocitos y folículos pilosos y se le puede utilizar, por tanto, para estimular el crecimiento del cabello en el cuero cabelludo alopécico y en pacientes de trasplante de cabello. De este modo, la presente invención proporciona, adicionalmente, el uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para estimular el crecimiento del cabello o para estimular la producción de folículos pilosos.
La presente invención proporciona, igualmente, el uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para proteger a un individuo contra los efectos de la radiación ionizante, quimioterapia, o tratamiento con agentes anti-víricos. La presente invención proporciona, además, el uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para tratar las lesiones de tejidos resultantes de la exposición a la radiación ionizante, agentes quimioterapéuticos o agentes anti-víricos. Un individuo puede verse sometido a una radiación ionizante por una serie de motivos, incluidos los fines terapéuticos (por ejemplo, para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos), como consecuencia de una liberación accidental de un isótopo radiactivo al ambiente, o durante procedimientos de diagnóstico médico no invasivos (por ejemplo, rayos X). Adicionalmente, un número importante de personas está expuesto a radón radiactivo en sus puestos de trabajo o en sus hogares. La exposición ambiental a largo plazo y continua se ha utilizado para calcular las estimaciones de esperanza de vida perdida. Jonson, W. y Kearfott, K., Health Phys. 73:312-319 (1997). Como se muestra en el Ejemplo 23, las proteínas de la presente invención potencian la supervivencia de animales expuestos a radiación. Por lo tanto, KGF-2 se puede utilizar para incrementar los índices de supervivencia de individuos que presentan lesiones inducidas por la radiación, para proteger a los individuos contra dosis sub-letales de radiación, y para aumentar la relación terapéutica de irradiación en el tratamiento de afecciones tales como los trastornos hiperproliferativos.
KGF-2 se puede utilizar también para proteger a los individuos contra dosificaciones de radiación, fármacos quimioterapéuticos o agentes anti-víricos que normalmente no serían toleradas. Cuando se usa de esta forma, o de otra manera descrita en este documento, KGF-2 se puede administrar antes, después y/o durante la terapia/exposición a radiación, la quimioterapia o el tratamiento con agentes anti-víricos. Dosificaciones elevadas de radiación y agentes quimioterapéuticos pueden resultar especialmente útiles cuando se tratan individuos con un estadio avanzado de afecciones tales como los trastornos hiperproliferativos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de los polipéptidos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar patologías tales como lesiones bucales y gastrointestinales inducidas por radiación, mucositis, fibrosis intestinal, proctitis, fibrosis pulmonar inducida por radiación, neumonitis inducida por radiación, retracción pleural inducida por radiación, síndrome hemopoyético inducido por radiación y mielotoxicidad inducida por radiación.
KGF-2 se puede usar solo o junto con uno o más agentes adicionales que confieren protección contra la radiación u otros agentes. Se ha demostrado que una serie de citoquinas (por ejemplo, IL-1, TNF, IL-6, IL-12) proporcionan dicho efecto protector. Véase, por ejemplo, Neta, R. et al., J. Exp. Med. 173:1177 (1991). Además, se ha demostrado que IL-11 protege las células de la mucosa del intestino delgado tras la combinación de irradiación y quimioterapia, Du, X.X. et al., Blood 83:33 (1994), y la lesión torácica inducida por la radiación. Redlich, C.A. et al., J. Immun. 157:1705-1710 (1996). Asimismo, se ha demostrado que numerosos factores de crecimiento ofrecen protección contra la exposición a la radiación, por ejemplo factor de crecimiento fibroblástico y factor de crecimiento de transformación beta-3. Ding, I. et al., Acta Oncol. 36:337-340 (1997); Potten, C. et al., Br. J. Cancer 75:1454-1459 (1997).
Como se utiliza en este documento, por "individuo" se entiende un animal, preferentemente un mamífero (tal como monos, vacas, caballos, cerdos, jabalís, ovejas, roedores, cabras, perros, gatos, pollos, simios, conejos, hurones, ballenas y delfines) y, más preferentemente, un ser humano.
La secuencia de señal de los aminoácidos que codifican KGF-2 1 a 35 ó 36 se puede utilizar para identificar proteínas segregadas en general por hibridación y/o algoritmos de investigación informática.
La secuencia de nucleótidos de KGF-2 se podría emplear para aislar secuencias 5' de hibridación. Entonces, se podrían utilizar plasmidios que comprendan el gen KGF-2, bajo el control de sus secuencias promotora/potenciadora nativas, en estudios in vitro dirigidos a la identificación de transactivadores celulares y víricos endógenos de la expresión del gen de KGF-2.
La proteína KGF-2 se puede utilizar también como control positivo en experimentos diseñados para identificar miméticos peptídicos que actúan sobre el receptor de KGF-2.
La presente solicitud describe un proceso para utilizar estos polipéptidos, o polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, con objetivos in vitro relacionados con la investigación científica, síntesis de DNA, fabricación de vectores de DNA, y con el propósito de proporcionar medios diagnósticos y terapéuticos para el tratamiento de enfermedades humanas.
Se pueden utilizar fragmentos del gen de KGF-2 de longitud total como sonda de hibridación para una biblioteca de cDNA, con el fin de aislar los genes de KGF-2 de longitud total y aislar otros genes que tienen una elevada similitud de secuencia con estos genes, o actividad biológica similar. Las sondas de este tipo tienen, por lo general, al menos 20 bases. Sin embargo, y preferentemente, las sondas tienen al menos 30 bases y, por lo general, no superan las 50 bases, aun cuando pueden tener un número mayor de bases. La sonda se puede usar también para identificar un clon de cDNA correspondiente a un trascripto de longitud total y un clon o clones genómicos que contienen el gen KGF-2 completo, incluidas las regiones reguladora y promotora, exones e intrones. Un ejemplo de un análisis comprende aislar la región codificadora del gen KGF-2 utilizando la secuencia de DNA conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Se utilizan oligonucleótidos marcados, que tienen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención, para analizar una biblioteca de cDNA humano, DNA genómico o cDNA para determinar con qué miembros de la biblioteca se hibrida la sonda.
La presente solicitud describe también un método para la identificación de los receptores para el péptido KGF-2. El gen que codifica el receptor se puede identificar por numerosos métodos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, separación de ligandos y clasificación de FACS (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Capítulo 5 (1991)). Preferentemente, se utiliza la clonación de expresión en la que se prepara RNA poliadenilado a partir de una célula que responde a los polipéptidos, y una biblioteca de cDNA creada a partir de este RNA se divide en grupos y se utiliza para transfectar células COS u otras células que no responden a los polipéptidos. Las células transfectadas, cultivadas sobre portas de vidrio, se exponen a los polipéptidos marcados. Los polipéptidos se pueden marcar por diversos medios, incluida la yodinación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteín-quinasa específica de ese sitio. Tras la fijación e incubación, los portas se someten a análisis auto-radiográfico. Se identifican los grupos positivos y se preparan subgrupos que se re-transfectan usando un proceso repetitivo de formación de subgrupos y re-análisis, dando finalmente un clon único que codifica el receptor putativo.
Como método alternativo para la identificación de receptores, los polipéptidos marcados se pueden enlazar, por foto-afinidad, con preparaciones de membranas o extractos celulares que expresan la molécula receptora. El material entrecruzado se resuelve por análisis PAGE y se exponen a una película de rayos X. El complejo marcado que contiene los receptores de los polipéptidos se puede escindir, resolver en fragmentos peptídicos y someter a micro-secuenciación proteica. La secuencia de aminoácidos obtenida de la micro-secuenciación se utilizaría para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos degenerados para analizar una biblioteca de cDNA para identificar los genes que codifican los receptores putativos.
La presente solicitud describe, adicionalmente, un método para analizar compuestos, con el fin de identificar los que actúan como agonistas de la acción de KGF-2 o bloquean la función de KGF-2. Un ejemplo de dicho ensayo comprende combinar una célula de queratinocito de mamífero, el compuesto a analizar y ^{3}[H]-timidina bajo condiciones de cultivo celular en las que el queratinocito proliferaría normalmente. Se puede efectuar un ensayo de control, con ausencia del compuesto a analizar, comparando la cantidad de proliferación del queratinocito en presencia del compuesto, para determinar si el compuesto estimula la proliferación de queratinocitos.
En el análisis de antagonistas, se puede llevar a cabo el mismo ensayo, en presencia de KGF-2, midiendo la capacidad del compuesto para impedir la proliferación de queratinocitos y determinando la capacidad de antagonismo. La cantidad de proliferación celular de queratinocitos se mide por cromatografía líquida de escintilación, que mide la incorporación de ^{3}[H]-timidina.
En otro método, se incuba una preparación de células o membranas de mamíferos que expresan el receptor KGF-2, con KGF-2 marcado en presencia del compuesto. Se puede medir, entonces, la capacidad del compuesto para potenciar o bloquear esta interacción. De forma alternativa, se mide la respuesta de un segundo sistema de mensajeros, conocido, tras la interacción de KGF-2 y receptor, comparándola en presencia o ausencia del compuesto. Estos sistemas de mensajeros secundarios incluyen, pero no están limitados a, cAMP guanilato-ciclasa, canales iónicos o hidrólisis de fosfoinositida.
Ejemplos de antagonistas potenciales de KGF-2 incluyen un anticuerpo o, en algunos casos, un oligonucleótido que se fija al polipéptido. DE forma alternativa, un antagonista potencial de KGF-2 puede ser una forma mutante de KGF-2 que se fija a los receptores de KGF-2, si bien no se genera una respuesta de segundo mensajero y, por lo tanto, la acción de KGF-2 se bloquea eficazmente.
Otro antagonista potencial de KGF-2 es una construcción antisentido preparada utilizando tecnología antisentido. Se puede usar tecnología antisentido para controla la expresión de genes a través de la formación de una triple hélice o DNA o RNA antisentido, estando ambos métodos basados en la fijación de un polinucleótido a DNA o RNA. Por ejemplo, se utiliza la porción codificadora 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica los polipéptidos maduros de la presente invención, para diseñar un oligonucleótido de RNA antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de DNA para que sea complementario a una región del gen que interviene en la trascripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucl. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991), impidiendo de esta forma la trascripción y la producción de KGF-2. El oligonuceótido de RNA antisentido se híbrida con el cDNA in vivo y bloquea la traducción de la molécula de cDNA en el polipéptido KGF-2 (Antisentido - Okano, J., Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)). Los oligonucleótidos anteriormente descritos se puede suministrar también a células, de forma que el RNA o DNA antisentido se exprese in vivo para inhibir la producción de KGF-2.
Antagonistas potenciales de KGF-2 incluyen pequeñas moléculas que se unen y ocupan el sitio de fijación del receptor de KGF-2, haciendo de esta forma que el receptor sea inaccesible a KGF-2, impidiendo así la actividad biológica normal. Ejemplos de pequeñas moléculas incluyen, pero no están limitadas a, pequeños péptidos o moléculas semejantes a péptidos.
Los antagonistas de KGF-2 se pueden emplear para prevenir la inducción de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, o angiogénesis, en tumores. La angiogénesis estimulada por KGF-2 también contribuye a varias patologías que se pueden tratar mediante los antagonistas de la presente invención, incluida la retinopatía diabética, e inhibición de crecimiento de tejidos patológicos, como en la artritis reumatoide.
También se pueden utilizar antagonistas de KGF-2 para tratar la glomerulonefritis, que se caracteriza por la marcada proliferación de células epiteliales glomerulares, que forman una masa celular que rellena el espacio de Bowman.
Los antagonistas se pueden emplear también para inhibir la sobreproducción de tejido cicatricial observada en la formación de queloides tras la cirugía, la fibrosis tras el infarto de miocardio, o lesiones fibróticas asociadas con la fibrosis y re-estenosis pulmonar. Asimismo, se pueden utilizar antagonistas de KGF-2 para tratar otras enfermedades proliferativas que son estimuladas por KGF-2, incluido cáncer y sarcoma de Kaposi.
Igualmente, se pueden emplear antagonistas de KGF-2 en el tratamiento de la queratitis, consistente en una infiltración crónica de las capas profundas de la córnea con inflamación uveal, caracterizada por la proliferación de células epiteliales.
Los antagonistas se pueden emplear en una composición con un vehículo farmacéuticamente tolerable, por ejemplo, como se describe más adelante.
Los polipéptidos, agonistas y antagonistas descritos en este documento se pueden utilizar en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado para formar una composición farmacéutica. Estas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido, agonista o antagonista, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente tolerable. Estos vehículos incluyen, pero no están limitados a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerina, etanol, y sus combinaciones. La formulación debe estar adaptada al modo de administración.
La invención proporciona también un envase farmacéutico que comprende uno o más viales rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociado a estos viales puede estar un prospecto en la forma establecida por la agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, prospecto en el que se refleja la aprobación de la agencia para la fabricación, uso o venta para administración humana. Adicionalmente, los polipéptidos, agonistas y antagonistas de la presente invención se pueden emplear junto con otros compuestos terapéuticos.
Los polipéptidos de la presente invención se pueden administrar en composiciones farmacéuticas, en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente tolerables. Se entenderá que, cuando se administre a un paciente humano, el empleo diario total de las composiciones farmacéuticas de la presente invención será decidido por el médico encargado del tratamiento, y conforme con el juicio médico correcto. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente dependerá de una serie de factores, incluido el tipo y grado de respuesta que se desee alcanzar; la composición específica, en caso de utilizar otro agente; edad, peso corporal, estado general de salud, sexo y dieta del paciente; hora de administración, vía de administración, y velocidad de excreción de la composición; duración del tratamiento; medicamentos (tal como fármacos quimioterapéuticos) usados en combinación o de forma simultánea con la composición específica; y factores similares bien conocidos en medicina. Se pueden encontrar formulaciones adecuadas, conocidas en la técnica, en Remington's Pharmaceutical Sciences (última edición), Mack Publishing Company, Easton, PA.
Las composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención, y que se utilizará de forma terapéutica, se formularán y dosificarán de manera consistente con la correcta práctica médica, tomando en consideración el estado clínico del paciente individual (en especial, los efectos secundarios del tratamiento con KGF-2 solo), el sitio de administración de la composición de KGF-2, el método de administración, la posología de administración, y otros factores conocidos en la práctica médica. A los efectos del presente documento, la "cantidad eficaz" de KGF-2 (incluida la cantidad eficaz de KGF-2) queda determinada, por tanto, por estas consideraciones.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de manera conveniente por vías oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que resulta eficaz para tratar y/o prevenir la indicación específica. En la mayoría de los casos, la dosificación es de 1 \mug/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal al día, teniendo en consideración las vías de administración, síntomas, etc. En el caso específico de la administración tópica, las dosificaciones se administran preferentemente desde aproximadamente 0,01 \mug a 9 mg por cm^{2}.
Como propuesta general, la cantidad farmacéuticamente eficaz total del KGF-2 administrado por vía parenteral, como dosis más preferente, estará en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/kg/día a 100 mg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque, como se ha señalado antes, esto queda sujeto a la discreción terapéutica. Si se administra de forma continua, KGF-2 se administra típicamente a un ritmo de dosis de aproximadamente 1 \mug/kg/hora a aproximadamente 50 \mug/kg/hora, ya sea por 1-4 inyecciones diarias o por infusiones subcutáneas continuas, utilizando, por ejemplo, una mini-bomba. Asimismo, se puede emplear una solución de bolsa o botella intravenosa.
Parece óptimo un ciclo de tratamiento de KGF-2, capaz de afectar al sistema fibrinolítico, si se prolonga durante más tiempo que un número mínimo de días, 7 días en el caso del ratón. La duración del tratamiento necesaria para registrar cambios, así como el intervalo tras el tratamiento para que se produzcan respuestas, parece variar, en función del efecto deseado.
KGF-2 se administra también de manera adecuada por sistemas de liberación sostenida. Ejemplos apropiados de composiciones de liberación sostenida incluyen matrices polímeras semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen polilactidas (Pat. de EE.UU. Nº 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (U. Sidman et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli(metacrilato de 2.hidroxietilo) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), y R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), acetato de etilen-vinilo (R. Langer et al., ídem) o ácido poli-D-(-)3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Composiciones de KGF-2 de liberación sostenida incluyen también KGF-2 incluido en liposomas. Los liposomas que contienen KGF-2 se preparan mediante métodos en sí conocidos: Documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980); documentos EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Pat. de EE.UU. N^{os} 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324. Normalmente, los liposomas son de tipo laminar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms), en los que el contenido en lípidos es mayor que aproximadamente 30 por ciento en moles de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima con KGF-2.
Para la administración parenteral, en una realización, KGF-2 se formula por lo general mezclándolo al grado deseado de pureza, en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, o emulsión), con un vehículo farmacéuticamente tolerable, es decir, que no resulte tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, y que sea compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación no contiene, preferentemente, agentes oxidantes ni otros compuestos de los que se sabe que resultan perjudiciales para los polipéptidos.
En general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto el KGF-2, de forma uniforme e íntima, con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos. Entonces, si es necesario, el producto se conforma en la formulación deseada. Preferentemente, el vehículo es un vehículo parenteral, más preferentemente una solución que es isotónica con la sangre del receptor. Ejemplos de estos vehículos incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, y solución de dextrosa. También son útiles en este documento los vehículos no acuosos, tales como aceites fijos y oleato etílico, así como los liposomas. Formulaciones adecuadas, conocidas en la técnica, se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences (última edición), Mack Publishing Company, Easton, PA.
El vehículo contiene, de forma adecuada, cantidades mínimas de aditivos, tales como sustancias que potencian la isotonía y la estabilidad química. Estos materiales son atóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos y sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos que aproximadamente diez residuos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, incluida la celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes sacáricos tales como manitol o sorbitol; iones conjugados tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros o PEG.
De manera típica, KGF-2 se formula en estos vehículos a una concentración de aproximadamente 0,01 \mug/ml a 100 mg/ml, preferentemente 0,01 \mug/ml a 10 mg/ml, a un pH de aproximadamente 3 a 8. Se entiende que el uso de algunos de los excipientes, vehículos o estabilizantes anteriormente mencionados dará como resultado la formación de sales de KGF-2.
El KGF-2 a utilizar para administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se logra fácilmente por filtración sobre membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros). Las composiciones terapéuticas de KGF-2 se envasan, por lo general, en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa, provisto de una tampón perforable mediante la aguja de una jeringuilla hipodérmica.
Normalmente, KGF-2 se almacenará en recipientes mono- o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, en forma de solución acuosa o como una formulación liofilizada para reconstituir. Como ejemplo de una formulación liofilizada, se llenan viales de 10 ml con 5 ml de solución acuosa al 1% (p/v) de KGF-2, filtrada a esterilidad, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo el KGF-2 liofilizado usando Agua para inyección bacteriostática.
La dosificación se puede disponer en un paciente de manera específica para proporcionar una concentración predeterminada de una actividad de KGF-2 en sangre, según se determine, por ejemplo, por una técnica de RIA. De esta forma, la dosificación para el paciente se puede ajustar para alcanzar niveles mínimos regulares en sangre, medidos por RIA, del orden de 50 a 1000 ng/ml, preferentemente 150 a 500 ng/ml.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intradérmica, intravaginal, intraperitoneal, tópica (en forma de polvos, ungüentos, geles, cremas, gotas o parche transdérmico), bucal, o en forma de spray oral o nasal. Por "vehículo farmacéuticamente tolerable" se entiende una carga, diluyente, material de encapsulación o coadyuvante de formulación de cualquier tipo, atóxico, sólido, semisólido o líquido. El término "parenteral", como se usa en este documento, se refiere a modos de administración que incluyen inyecciones e infusiones intravenosas, intramusculares, intraperitoneales, intraesternales, subcutáneas e intracelulares. Los polipéptidos, agonistas y antagonistas de KGF-2 que son polipéptidos se pueden emplear también por expresión de estos polipéptidos in vivo, en lo que se denomina a menudo "terapia génica".
De esta forma, por ejemplo, es posible modificar por ingeniería las células de un paciente con un polinucleótido (DNA o RNA) que codifique un polipéptido ex vivo, administrando seguidamente las células modificadas por ingeniería a un paciente que se deba tratar con el polipéptido. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden modificar por procedimientos de ingeniería conocidos en la técnica, mediante el uso de una partícula retroviral que contiene RNA que codifica un polipéptido de la presente invención.
De igual forma, las células se pueden modificar in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo, por ejemplo, mediante procedimientos conocidos en la técnica. Como se conoce en la técnica, se puede administrar una célula productora, para producir una partícula retroviral que contiene RNA que codifica el polipéptido de la presente invención, a un paciente para modificar las células in vivo y para la expresión del polipéptido in vivo. Estos y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención por dicho método deben resultar evidentes para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para células modificadas puede ser distinto de un retrovirus, por ejemplo, un adenovirus que se puede utilizar para modificar células in vivo tras la combinación con un vehículo adecuado de suministro. Ejemplos de otros vehículos de suministro incluyen un sistema de vector basado en HSV, vectores víricos adeno-asociados, y vehículos inertes, por ejemplo, partículas de ferrita recubiertas de dextrano.
Retrovirus a partir de los cuales se pueden derivar los vectores de plasmidios retrovirales anteriormente mencionados incluyen, pero no están limitados a, virus de la Leucemia del Ratón de Moloney, virus de la necrosis esplénica, retrovirus tales como Virus del Sarcoma de Rous, virus del Sarcoma de Harvey, virus de la leucemia de aves, virus de la leucemia del gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus del Sarcoma Mieloproliferativo, y virus del tumor de mama. En una realización, el vector de plasmidio retroviral se deriva del virus de la Leucemia de Ratón de Moloney.
El vector incluye uno o más promotores. Promotores adecuados que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a, el LTR retroviral; promotor SV40; y el promotor del citomegalovirus (CMV) humano descrito en Miller et al., Biotechniques Vol. 7, Nº 9:980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucariotas que incluyen, pero no están limitados a, promotores de histona, pol III y \beta-actina). Otros promotores víricos que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a, promotores de adenovirus, promotores de timidín-quinasa (TK), y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas del presente documento.
La secuencia de ácido nucleicos que codifica el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Promotores adecuados que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a, promotores de adenovirus, tales como el promotor adenovírico principal tardío; o promotores heterólogos, tales como promotor de citomegalovirus (CMV); promotor del virus sincitial respiratorio (RSV); promotores inducibles, tales como el promotor MMT y el promotor de metalotioneína; promotores del golpe de calor; promotor de albúmina; promotor Apoya, promotores de globina humana; promotores de timidín-quinasa vírica, tales como el promotor de la timidóin-quinasa de Herpes Simples; LTR retrovirales (incluidas las LTR retrovirales modificadas anteriormente descritas); promotor de \beta-actina; y promotores de la hormona del crecimiento humano. El promotor puede ser también el promotor nativo que controla el gen que codifica el polipéptido.
El vector de plasmidio retroviral se emplea para transducir líneas celulares de empaquetado para formar líneas celulares productoras. Ejemplos de líneas celulares de empaquetado que se pueden transfectar incluyen, pero no están limitadas a, las líneas celulares PE501, PA317, \Psi-2, \Psi-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, \PsiCRE, \PsiCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, y DAN, según aparecen descritas en Miller, Human Gene Therapy I:5-14 (1990), que se incorpora a este documento en su totalidad como referencia. El vector puede transducir las células de empaquetado a través de cualquier medio conocido en la técnica. Estos medios incluyen, pero no están limitados a, electroporación, uso de liposomas, y precipitación con CaPO_{4}. En una alternativa, el vector de plasmidio retroviral puede estar encapsulado en un liposoma, o acoplado con un lípido, administrándolo seguidamente a un huésped.
La línea celular productora genera partículas de vector retroviral infecciosas, que incluyen la o las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. Entonces, estas partículas de vector retroviral se pueden emplear para transducir células eucariotas, tanto in vitro como in vivo. Las células eucariotas transducidas expresarán la o las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. Células eucariotas que se pueden transducir incluyen, pero no están limitadas a, células madre embrionarias, células de carcinoma embrionario, así como células madre hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales y células epiteliales bronquiales.
Ensayos cromosómicos
Las secuencias descritas en la presente invención son valiosas también para la identificación de cromosomas. La secuencia tiene un objetivo específico y se puede hibridar con una localización particular en un cromosoma humano individual. Adicionalmente, existe en la actualidad la necesidad de identificar sitios particulares en los cromosomas. Actualmente se dispone de pocos reactivos marcadores de cromosomas basados en datos de secuencias reales (polimorfismos repetidos) para marcar localizaciones cromosómicas. El mapeo de DNA a cromosomas de acuerdo con la presente invención es una importante primera etapa en correlacionar estas secuencias con genes asociados a enfermedades.
En pocas palabras, es posible mapear secuencias a cromosomas preparando cebadores de PCR (preferentemente, 15-25 pb) a partir del cDNA. Se utiliza el análisis computadorizado de la región 3' no traducida para seleccionar rápidamente cebadores que no abarquen más que un exón en el DNA genómico, complicando, de esta forma, el proceso de amplificación. Estos cebadores se usan, entonces, para el análisis por PCR de híbridos de células somáticas que comprenden cromosomas humanos individuales. Solamente los híbridos que contienen el gen humano correspondiente al cebador proporcionarán un fragmento amplificado.
El mapeo por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un DNA particular a un cromosoma determinado. Usando la presente invención con los mismos cebadores de oligonucleótidos, se puede lograr la sub-localización con paneles de fragmentos procedentes de cromosomas específicos o grupos de grandes clones genómicos de forma análoga. Se pueden utilizar, de igual modo, otras estrategias de mapeo para mapear a sus cromosomas, incluida la hibridación in situ, el pre-análisis con cromosomas marcados clasificados por flujo y la preselección por hibridación para construir bibliotecas de cDNA específico de cromosomas.
La hibridación por fluorescencia in situ (FISH) de un clon de cDNA a un fragmento cromosómico en metafase se puede usar para proporcionar una localización precisa del cromosoma en una sola etapa. Esta técnica se puede usar con cDNA del orden de 50 a 60 bases. Para el análisis de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988).
Cuando se ha mapeado una secuencia hasta una localización cromosómica precisa, se puede correlacionar la posición física de la secuencia en el cromosoma con datos de mapas genéticos. Estos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible on line a través de la Biblioteca Médica Welch de la Universidad Johns Hopkins). La relación entre genes y enfermedades que se ha mapeado a la misma región del cromosoma se identifica, entonces, por análisis de enlaces (co-herencia de genes físicamente adyacentes).
A continuación, es necesario determinar las diferencias en el cDNA o secuencia genómica entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados, pero no en los individuos normales, es probable, entonces, que la mutación sea el agente causante de la enfermedad.
Con la resolución actual del mapeo físico y las técnicas de mapeo genético, un cDNA localizado de manera precisa en una región cromosómica asociada con la enfermedad, podría ser uno entre 50 y 500 genes causantes potenciales. (Se supone para esto una resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb).
La presente invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, se debe entender que la presente invención no está limitada por estos ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique lo contrario, están en peso.
Con el fin de facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos, se describirán algunos métodos y/o expresiones que aparecen con frecuencia.
Los "plasmidios" se designan por un p minúscula, precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o cifras. Los plasmidios de partida en este documento están disponibles en el comercio, disponibles públicamente de forma ilimitada, o se pueden construir a partir de plasmidios disponibles, según procedimientos publicados. Además, plasmidios equivalentes a los descritos se conocen en la técnica y resultarán evidentes para el experto en la técnica.
La "digestión" de DNA hace referencia a la escisión catalítica del DNA con una enzima de restricción que actúa sólo en determinadas secuencias en el DNA. Las diversas enzimas de restricción utilizadas en este documento están disponibles en el comercio y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se han aplicado de la forma conocida por el experto en la técnica. A efectos analíticos, se utiliza típicamente 1 \mug de plasmidio o fragmento de DNA con aproximadamente 2 unidades de enzima, en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Con el fin de aislar fragmentos de DNA para la construcción de plasmidios, se digieren típicamente 5 a 50 \mug de DNA con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. El fabricante especifica las cantidades adecuadas de tampones y sustratos para enzimas de restricción particulares. Normalmente, se utilizan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Tras la digestión, la reacción se somete a electroforesis directamente en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.
La separación por tamaño de los fragmentos escindidos se lleva a cabo usando gel de poliacrilamida al 8%, descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980).
"Oligonucleótidos" se refieren a polidesoxinucleótidos de cadena sencilla o dos cadenas complementarias de polidesoxinucleótidos, que pueden estar sintetizados químicamente. Estos oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5' y, por lo tanto, no se unirán con otros oligonucleótidos sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de quinasa. Un oligonucleótido sintético se unirá a un fragmento que no ha sido sometido a desfosforilación.
"Unión" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiésteres entre dos fragmentos de ácido nucleico de cadena doble (Maniatis, T. et al., Id., pág. 146). A menos que se señale lo contrario, la unión se puede lograr usando tampones y condiciones conocidos con 10 unidades de DNA-ligasa T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de DNA que se deben unir.
Una células ha sido "transformada" por DNA exógeno cuando dicho DNA exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. El DNA exógeno puede o no estar integrado (unido covalentemente) en el DNA inter-cromosómico que constituye el genoma de la célula. En el caso de procariotas y levaduras, por ejemplo, el DNA exógeno puede conservarse sobre un elemento episomal, tal como un plasmidio. Con respecto a células eucariotas, una célula establemente transformada o transfectada es aquella en la que el DNA exógeno se ha integrado en el cromosoma, de forma que es heredado por las células hijas por replicación cromosómica. Esta situación se demuestra por la capacidad de las células eucariotas para establecer líneas celulares o clones, compuestos por una población de células hijas que contienen el DNA exógeno. Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973) ofrecen un ejemplo de transformación.
"Transducción" o "transducido" hace referencia a un proceso mediante el cual las células captan DNA ajeno y lo integran en su cromosoma. La transducción se puede conseguir, por ejemplo, por transfección, que se refiere a diversas técnicas por las que las células incorporan DNA, o infección, por la que se utilizan virus para transferir DNA a las células.
Ejemplo 1 Expresión bacteriana y purificación de KGF-2
La secuencia de DNA que codifica KGF-2, ATCC nº 75977, se amplifica inicialmente usando cebadores oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias de los extremos 5' y 3' del cDNA de KGF-2 procesado (incluida la secuencia de péptidos de señal). El cebador oligonucleótido 5' tiene la secuencia 5'CCCCACATGTGGAAATG
GATACTGACACATTGTGCC 3' (SEC ID NO:3), contiene un sitio de enzima de restricción Afl III, que incluye y va seguida por 30 nucleótidos de la secuencia de codificación de KGF-2 del presunto codón de iniciación. La secuencia 3' 5'CCCAAGCTTCCAACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAC 3' (SEC ID NO:4) contiene secuencias complementarias al sitio Hind III y va seguida de 26 nucleótidos de KGF-2. Los sitios de enzima de restricción son compatibles con los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-60 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). pQE-60 codifica la resistencia a antibióticos (AAMp'), un origen bacteriano de replicación (ori), un operador promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de fijación de ribosomas (RBS), una marca 6-His y sitios de enzima de restricción. Seguidamente, pQE-60 se digiere con NcoI y Hindi. Las secuencias amplificadas están ligadas en pQE-60 y se insertan en el marco. Se usa, entonces, la mezcla de unión para transformar la cepa M15/rep4 de E. coli (Qiagen, Inc.) por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989).M15/rer4 contiene múltiples copias del plasmidio pREP4, que expresa el represor lacI y confiere también resistencia a la kanamicina (Kan'). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer sobre placas LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aísla el DNA del plasmidio y se confirma por análisis de restricción. Los clones que contienen las construcciones deseadas se cultivan durante una noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 \mug/ml) como Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un gran cultivo en una relación de 1:100 a 1:250. Las células se cultivan hasta una densidad óptica de 600 (D.O.^{600}) de entre 0,4 y 0,6. A continuación, se añade IPTG ("isopropil-B-D-tiogalacto-piranósido") a una concentración final de 1 mM. IPTG induce por inactivación el represor lacI, despejando el P/O que conduce a la expresión génica aumentada. Las células se cultivan durante 3 a 4 horas adicionales. Seguidamente, las células se cosechan por centrifugación. El conglomerado celular se solubiliza mediante el agente caotrópico Guanidina HCl6 Molar. Tras la clarificación, se purifica KGF-2 solubilizado de esta solución por cromatografía sobre una columna de afinidad de heparina bajo condiciones que permiten una estrecha fijación de las proteínas (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). Se eluye KGF-2 (puro al 75%) de la columna mediante un tampón salino alto.
Ejemplo 2 Expresión bacteriana y purificación de una versión truncada de KGF-2
La secuencia de DNA que codifica KGF-2, ATCC nº 75977, se amplifica inicialmente usando cebadores oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' de la versión truncada del polipéptido KGF-2. La versión truncada comprende el polipéptido menos la secuencia de señal de 36 aminoácidos, agregándose un residuo de metionina y alanina inmediatamente antes del residuo de cisteína que comprende el aminoácido 37 de la proteína de longitud total. El cebador oligonucleótido 5' tiene la secuencia 5' CATGCCATGGCGTGCCAAGCCCTTGGTCAGGACATG 3' (SEC ID NO: 5) contiene un sitio de enzima de restricción NcoI que incluye y va seguido por 24 nucleótidos de la secuencia de codificación de KGF-2. La secuencia 3' 5' CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTC TATGAG 3' (SEC ID NO:6) contiene secuencias complementarias al sitio Hind III y va seguida por 26 nucleótidos del gen de KGF-2. Los sitios de enzima de restricción son compatibles con los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión bacteriana pQE-60 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). pQE-60 codifica la resistencia a antibióticos (Amp'), un origen bacteriano de replicación (ori), un operador de promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de fijación de ribosomas (RBS), una marca 6-His y sitios de enzima de restricción. A continuación, pQE-60 se digiere con NcoI y Hindi. Las secuencias amplificadas se ligan en pQE-60 y se insertan en el marco. La mezcla de unión se usa, entonces, para transformar la cepa M15/rep4 de E. coli (Qiagen, Inc.) por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989). M15/rep4 contiene múltiples copias del plasmidio pREP4, que expresa el represor lacI y confiere también resistencia a la kanamicina (Kan'). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer sobre placas LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilina/ kanamicina. Se aísla el DNA del plasmidio y se confirma por análisis de restricción. Los clones que contienen las construcciones deseadas se cultivan durante una noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 \mug/ml) como Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un gran cultivo en una relación de 1:100 a 1:250. Las células se cultivan hasta una densidad óptica de 600 (D.O.^{600}) de entre 0,4 y 0,6. A continuación, se añade IPTG ("isopropil-\beta-D-tiogalacto-piranósido") a una concentración final de 1 mM. IPTG induce por inactivación el represor lacI, despejando el P/O que conduce a la expresión génica aumentada. Las células se cultivan durante 3 a 4 horas adicionales. Seguidamente, las células se cosechan por centrifugación. El conglomerado celular se solubiliza mediante el agente caotrópico Guanidina HCl6 Molar. Tras la clarificación, se purifica KGF-2 solubilizado de esta solución por cromatografía sobre una columna de afinidad de heparina bajo condiciones que permiten una estrecha fijación de las proteínas (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). Se eluye la proteína KGF-2 de la columna mediante un tampón salino alto.
Ejemplo 3 Clonación y expresión de KGF-2 usando el sistema de expresión de baculovirus
La secuencia de DNA que codifica la proteína KGF-2 de longitud total, ATCC nº 75977, se amplifica usando cebadores oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen:
El cebador 5' tiene la secuencia 5' GCGGGATCCGCCATCATCATGTGGAAATGGATACTCAC 3' (SEC ID NO: 7) y contiene un sitio de enzima de restricción (en negritas)seguido por 6 nucleótidos que se asemejan a una señal eficaz para la iniciación de la traducción en células eucariotas (Kozak, M., J. Mol. Biol.. 196:947-950 (1987)), e, inmediatamente detrás, los primeros 17 nucleótidos del gen KGF-2 (el codón de iniciación para traducción "ATG" está subrayado).
El cebador 3' tiene la secuencia 5' GCGCGGTACCACAAACGTTGCCTTCCT 3' (SEC ID NO:8) y contiene el sitio de escisión para la endonucleasa de restricción Asp718 y 19 nucleótidos complementarios a la secuencia 3' no traducida del gen KGF-2. Las secuencias amplificadas se aíslan de un gel de agarosa al 1% usando un kit disponible en el comercio de Qiagen, Inc., Chatsworth, CA. El fragmento, entonces, se digiere con las endonucleasas BamHI y Asp718 y luego se purifica nuevamente sobre un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se designa F2.
Se utiliza el vector pA2 (modificación del vector pVL941, discutido más adelante) para la expresión de la proteína KGF-2, usando el sistema de expresión de baculovirus (véase Summers, M.D. y Smith, G.E., A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nº 1555 (1987)). Este vector de expresión contiene el potente promotor de polihedrina del virus de la polihidrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV), seguido por los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BamHI y Asp718. El sitio de poliadenilación del virus del simio (SV) 40 se utiliza para una eficaz poliadenilación. Para una sencilla selección de virus recombinantes, se inserta el gen de beta-galactosidasa de E. coli en la misma orientación que el promotor de polihedrina, seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Las secuencias de polihedrina están flanqueadas a ambos lados por secuencias víricas para la recombinación homóloga, mediada por la célula, del DNA vírico de tipo salvaje, co-transfectado. Se podrían utilizar otros muchos vectores de baculovirus en lugar de pRG1, tales como pAc373, pVL941 y pAcIM1 (Luckow, V.A. y Summers, M.D., Virology, 170:31-39).
El plasmidio se digiere con las enzimas de restricción BamHI y Asp718. Se aísla, entonces, el DNA de un gel de agarosa al 1% usando el kit disponible en el comercio (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). Este DNA de vector se designa V2.
El fragmento F2 y el plasmidio V2 se ligan con DNA-ligasa T4. Se transforman, entonces, células de E. coli HB101 y se identificaron las bacterias que contenían el plasmidio (pBacKGF-2) con el gen KGF-2 usando PCR con ambos oligonucleótidos de clonación. La secuencia del fragmento clonado se confirma por secuenciación de DNA.
Se co-transfectan 5 \mug del plasmidio pBacKKGF-2 con 1,0 \mug de un baculovirus linealizado, disponible en el comercio ("BaculoGold® baculovirus DNA", Pharmigen, San Diego, CA), usando el método de lipofección (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)).
En el pocillo estéril de una placa de microtitulación que contiene 50 \mul de medio de Grace exento de suero (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) se mezcla 1 \mug de DNA vírico de BaculoGold® y 5 \mug del plasmidio pBacKGF-2. Seguidamente, se añaden 10 \mul de Lipofectin más 90 \mul de medio de Grace, se mezcla y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de transfección se agrega gota a gota a las células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711), sembradas en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se balancea para mezclar la solución recién añadida. A continuación, la placa se incuba durante 5 horas a 27ºC. Después de 5 horas, se retira la solución de transfección de la placa y se añade 1 ml de medio de insecto de Grace suplementado con suero bovino fetal al 10%. La placa se devuelve a la incubadora y el cultivo se continúa a 27ºC durante cuatro días.
Después de cuatro días, se recoge el sobrenadante y se realiza un ensayo de placa similar al descrito por Summers y Smith (véase antes). Como modificación, se utiliza un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies, Inc., Gaithersburg), que permite un fácil aislamiento de placas teñidas de azul. (Se puede encontrar una descripción detallada de un "ensayo de placa" también en la guía del usuario para el cultivo de células de insectos y baculovirología, distribuida por Life Technologies, Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).
Cuatro días después de la dilución seriada, se añaden los virus a las células y se tocan las placas teñidas de azul con la punta de una pipeta de Eppendorf. El agar que contiene los virus recombinantes se resuspende, entonces, en un tubo de Eppendorf que contiene 200 \mul de medio de Grace. Se retira el agar mediante una breve centrifugación y el sobrenadante, que contiene el baculovirus recombinante, se utiliza para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días más tarde, se cosechan los sobrenadantes de estas placas de cultivo y se almacenan a 4ºC.
Células Sf9 se cultivan en medio de Grace suplementado con SBF al 10%, inactivado por calor. Las células se infectan con el baculovirus recombinante V-KGF-2 con una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Seis horas más tarde, se retira el medio y se sustituye con medio SF900 II menos metionina y cisteína (Life Technologies, Inc., Gaithersburg). 42 horas después, se añaden 5 \muCi de ^{35}S metionina y 5 \muCi de ^{35}S cisteína (Amersham). Las células se siguen incubando durante 16 horas antes de cosecharlas por centrifugación y se visualizan las proteínas marcadas por SDS-PAGE y auto-radiografía.
Ejemplo 4
La mayoría de los vectores utilizados para la expresión transitoria de la secuencia del gen de la proteína KGF-2 en células de mamíferos deben portar el origen SV40 de replicación. Ello permite la replicación del vector a un elevado número de copias en células (por ejemplo, células COS) que expresan el antígeno T requerido para la iniciación de la síntesis de DNA vírico. Para este propósito se puede utilizar cualquier otra línea celular de mamíferos.
Un vector de expresión en mamíferos típico contiene el elemento promotor, que media la iniciación de trascripción de mRNA, la secuencia de codificación de la proteína, y las señales necesarias para la terminación de la trascripción y la poliadenilación del trascripto. Elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias de Kozak y secuencias de intervención, flanqueadas por sitios de donante y aceptor para la división de RNA. Se puede lograr una trascripción altamente eficaz con los promotores temprano y tardío de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, se pueden utilizar también señales celulares (por ejemplo, promotor de actina humana). Vectores de expresión adecuados para utilizar en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Células hospedadoras de mamíferos que se podría utilizar incluyen HeLa humana, 283, H9 y células Jurkart, células NIH3T3 y C127 de ratón, células Cos7 y CV1, del mono verde africano, células Qci-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario del hámster chino.
De forma alternativa, el gen se puede expresar en líneas celulares estables, que contienen el gen integrado en un cromosoma. La co-transfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina, permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas.
El gen transfectado se puede amplificar también para expresar grandes cantidades de la proteína codificada. La DHFR (dihidrofolato-reductasa) es un marcador útil para desarrollar líneas celulares portadoras de varios centenares o, incluso, varios millares de copias del gen de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamin-sintasa (GS) (Murphy et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/technology 10:169-175 (1992)). Mediante el empleo de estos marcadores, las células de mamífero se cultivan en medio selectivo y se seleccionan las células con la mayor resistencia. Estas líneas celulares contienen el o los genes amplificados, integrados en un cromosoma. A menudo, se utilizan células del ovario de hámster chino (CHO) para la producción de proteínas.
Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el potente promotor (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cell Biology, 438-447 (Marzo, 1985)), más un fragmento del potenciador CMV (Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)). Múltiples sitios de clonación, por ejemplo, con los sitios de escisión de enzimas de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen, adicionalmente, el intrón 3', la señal de poliadenilación y de terminación del gen de la pre-proinsulina.
Expresión de KGF-2 recombinante en células COS
La expresión del plasmidio, KGF-2 HA, se derivó de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) origen SV40 de replicación, 2) gen de resistencia a la ampicilina, 3) origen de replicación de E. coli, 4) promotor CMV, seguido por una región de poli-enlace, un intrón SV40 y un sitio de poliadenilación. La marca HA corresponde a un epitopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza, como se ha descrito anteriormente (Wilson, I. et al., Cell 37:767, (1984)). La infusión de marca HA a la proteína diana permite una fácil detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epitopo HA. Un fragmento de DNA que codifica la totalidad de la marca HA del precursor KGF-2, fusionado en marco con la marca HA, por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante está dirigida bajo el promotor CMV.
La estrategia de constricción del plasmidio se describe de la forma siguiente:
La secuencia de DNA que codifica KGF-2, ATCC nº 75977, se construye por PCR usando dos cebadores: el cebador 5' 5' TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC 3' (SEC ID NO: 9) contiene un sitio BamHI seguido por 22 nucleótidos de la secuencia que codifica KGF-2 que se inicia en el codón de iniciación; la secuencia 3' 5' TAAGCACTCGAGTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG 3' (SEC ID NO: 10) contiene secuencias complementarias para un sitio XhoI, marca HA y los últimos 26 nucleótidos de la secuencia de codificación de KGF-2 (sin incluir el codón de detención). Por consiguiente, el producto de PCR contiene un sitio BamHI, la secuencia de codificación de KGF-2 seguida por un sitio XhoI, una marca HA fusionada en el marco, y un codón de detención de terminación de traducción próximo a la marca HA. El fragmento de DNA amplificado por PCR y el vector, pcDNA-3'HA, se digieren con las enzimas de restricción BamHI y XhoI y se ligan, dando como resultado pcDNA-3'HA-KGF-2. La mezcla de unión se transforma en E. coli cepa XLI Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), el cultivo transformado se deposita sobre placas con medio de ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes. Se aisló DNA de plasmidio a partir de los transformantes y se examinó por PCR y análisis de restricción, en busca del fragmento correcto. Para la expresión de KGF-2 recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el método DEAE-DEXTRANO (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989)). La expresión de la proteína KGF-2 HA se detectó por marcaje radiactivo y el método de inmunoprecipitación (Harlow, E. Y Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Se recogieron, entonces, los medios de cultivo y las células se lisaron con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5) (Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 15%.
B: Expresión y purificación de la proteína KGF-2 humana usando el sistema de expresión CHO
Se utiliza el vector pC1 para la expresión de la proteína KGF-2. El plasmidio pC1 es un derivado del plasmidio pSV2-dhfr [Nº de acceso ATCC 37146]. Ambos plasmidios contienen el gen DHFR de ratón bajo control del promotor temprano de SV40. Se pueden seleccionar células del ovario del hámster chino y otras células que carecen de actividad dihidrofolato, que están transfectadas con estos plasmidios, cultivando las células en un medio selectivo (MEM alfa menos, Life Technologies), suplementado con el agente quimioterapéutico metotrexate. La amplificación de los genes DHFR en células resistentes a metotrexate (MTX) ha sido bien documentada (véase, por ejemplo, Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R. y Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370; Hamlin, J.L. y Ma, C., 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143; Page, M.J. y Sydenham, M.A., 1991, Biotechnology Vol. 9:64-68). Las células cultivadas en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al medicamento mediante la sobreproducción de la enzima diana, DHFR, como consecuencia de la amplificación de gen DHFR. Si se une un segundo gen al gen DHFR, normalmente resulta co-amplificado y muestra sobreexpresión. En el estado de la técnica se desarrollan líneas celulares portadoras de más de 1.000 copias de los genes. A continuación, cuando se retira metotrexate, las líneas celulares contienen el gen amplificado integrado en el o los cromosomas.
El plasmidio pC1 contiene para la expresión del gen de interés un potente promotor de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, Marzo 1985:438-4470), más un fragmento aislado del potenciador del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985). Corriente abajo del promotor se encuentran las siguientes sitios de escisión únicos de enzimas de restricción que permiten la integración de los genes: BamHI, PvuII y NruI. Detrás de estos sitios de clonación, el plasmidio contiene codones de detención de traducción en los tres marcos de lectura, seguido por el intrón 3' y el sitio de poliadenilación del gen de la pre-proinsulina de rata. También se pueden utilizar otros promotores altamente eficaces para la expresión, por ejemplo, el promotor de \beta-actina humana, los promotores temprano o tardío de SV40, o las repeticiones terminales largas de otros retrovirus, por ejemplo HIV y HTLVI. Para la poliadenilación del mRNA se pueden usar también otras señales, por ejemplo, de los genes de la hormona de crecimiento humano o de globina.
Asimismo, se pueden seleccionar líneas celulares estables, portadoras de un gen de interés, integrado en los cromosomas, tras la co-transfección con un marcador seleccionable tal como gpt, G418 o higromicina. Resulta ventajoso utilizar más de un marcador seleccionable al comienzo, por ejemplo G418 más metotrexate.
El plasmidio pC1 se digiere con la enzima de restricción BamHI y, a continuación, se desfosforila usando fosfatasa de intestino bovino, mediante procedimientos conocidos en la técnica. Luego, se aísla de vector de un gel de agarosa al 1%.
La secuencia de DNA que codifica KGF-2, ATCC Nº 75977, se amplifica usando cebadores oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen.
El cebador 5' tiene la secuencia 5' TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC 3' (SEC ID NO: 9), que contiene el sitio de enzima de restricción BamHI subrayado, seguido por 21 bases de la secuencia de KGF-2 de la Figura 1 (SEC ID NO:1). Insertado en un vector de expresión, como se describe más adelante, el extremo 5' del fragmento amplificado que codifica KGF-2 humano proporciona un péptido señal eficaz. Una señal eficaz para iniciar la traducción en células eucariotas, como describe Kozak, M.J., Mol. Biol., 196:947-950 (1987) se encuentra adecuadamente localizada en la porción del vector de la construcción.
El cebador 3' tiene la secuencia 5' TAAGCAGGATCCTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG 3' (SEC ID NO: 10), que contiene la restricción BamHI seguida por nucleótidos complementarios a los últimos 26 nucleótidos de la secuencia de codificación de KGF-2 establecida en la Figura 1 (SEC ID NO:1), sin incluir el codón de detención.
Los fragmentos amplificados se aíslan de un gel de agarosa al 1%, según se ha descrito anteriormente, y se digieren, a continuación, con la endonucleasa BamHI y se purifica, entonces, sobre el gel de agarosa al 1%.
El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan entonces con DNA-ligasa T4. Seguidamente, se transforman células de E. coli HB101 y se identifican las bacterias que contuvieron el plasmidio pC1. La secuencia y orientación del gen insertado se confirma por secuenciación de DNA.
Transfección de células CHO-DHFR
Se utilizan para la transfección células de ovario del hámster chino exentas de una enzima DHFR activa. Se co-transfectan 5 \mug del plasmidio de expresión C1 con 0,5 \mug del plasmidio pSVneo, utilizando el método de lipofección (Felgner et al, véase más arriba). El plasmidio pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5, que codifica una enzima que confiere resistencia frente a un grupo de antibióticos, incluido G418. Las células se siembran en MEM menos alfa suplementado con 1 mg/ml de G418. Después de 2 días, las células se tripsinizan y se siembran en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania) y se cultivan durante 10-14 días. Después de este período, se tripsinizan clones sencillos y se siembran, luego, en placas Petri de 6 pocillos, utilizando diferentes concentraciones de metotrexate (25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM). Los clones que crecen a las máximas concentraciones de metotrexate se transfieren, entonces, a nuevas placas de 6 pocillos que contienen concentraciones todavía mayores de metotrexate (500 nM, 1 \muM, 2 \muM, 5 \muM). Se repite el mismo procedimiento hasta que los clones crecen a una concentración de 100 \muM.
La expresión del producto génico deseado se analiza por análisis de transferencia de Western y SDS-PAGE.
Ejemplo 5 Trascripción y traducción de KGF-2 recombinante in vitro
Se deriva un producto de PCR del cDNA clonado en el vector pA2 utilizado para la expresión en células de insecto de KGF-2. Los cebadores utilizados para esta PCR fueron: 5' ATTAACCCTCAACTAAAGGGAGGCCATGTG
GAAATGGATACTGACA CATTGTGCC 3' (SEC ID NO:11) y 5' CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTAT
GAG 3' (SEC ID NO:12).
El primer cebador contiene la secuencia de un promotor T3 5' al codón de iniciación ATG. El segundo cebador es complementario con el extremo 3' del marco de lectura abierta de KGF-2, y codifica el complemento inverso de un codón de detención.
El producto de PCR resultante se purifica usando un kit disponible en el comercio de Qiagen. Se utilizan 0,5 \mug de este DNA como modelo para una reacción in vitro de trascripción-traducción. La reacción se lleva a cabo con un kit disponible en el comercio de Promega bajo la marca TNT. El ensayo se realiza según se describe en las instrucciones del kit, usando como sustrato metionina marcada radiactivamente, con la excepción de que se emplea sólo la mitad de los volúmenes indicados de reactivos, y que la reacción se deja progresar a 33ºC durante 1,5 horas.
5 \mul de la reacción se separan por electroforesis sobre un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 10 a 15%. El gel se fija durante 30 minutos en una mezcla de agua:metano:ácido acético 6:3:1, respectivamente. A continuación, el gel se seca con calor y al vacío y se expone, seguidamente, a una película de rayos X durante 16 horas. La película se revela, mostrando la presencia de una banda de proteína radiactiva correspondiente en tamaño al KGF-2 conceptualmente traducido, lo que sugiere fuertemente que el cDNA clonado para KGF-2 contiene un marco de lectura abierta que codifica una proteína del tamaño esperado.
Ejemplo 6 Expresión a través de terapia génica
Se obtienen fibroblastos de un sujeto por biopsia de la piel. El tejido resultante se coloca en medio de cultivo para tejidos y se separa en pequeños trozos. Se sitúan fragmentos pequeños del tejido sobre una superficie húmeda de un matraz de cultivo de tejidos, colocando aproximadamente diez trozos en cada matraz. El matraz se invierte, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz se vuelve a invertir y los trozos de tejido permanecen unidos al fondo del matraz, y se añade medio fresco (por ejemplo, medio F12 de Ham, con SBF al 10%, penicilina y estreptomicina). Esto se incuba a 37ºC durante aproximadamente una semana. En ese momento, se añade medio fresco y, subsiguientemente, se cambia cada varios días. Después de dos semanas adicionales de cultivo, surge una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsiniza y se lleva a matraces mayores.
Se digiere pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-225 (1988)), flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma de Moloney de ratón, con EcoRI y HindIII y, subsiguientemente, se le trata con fosfatasa intestinal de ternero. El vector lineal se fracciona sobre gel de agarosa y se purifica, utilizando perlas de vidrio.
El cDNA que codifica un polipéptido de la presente invención se amplifica usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias terminales 5' y 3', respectivamente. El cebador 5' contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' incluye, adicionalmente, un sitio HindIII. Se juntan cantidades iguales de la base lineal del virus del sarcoma de ratón de Moloney y del fragmento EcoRI y HindIII amplificado, en presencia de DNA-ligasa T4. La mezcla resultante se utiliza para transformar bacterias HB101 que, seguidamente, se siembran en placas que contienen kanamicina con el fin de confirmar que el vector tenía el gen de interés adecuadamente insertado.
Las células de empaquetamiento anfotróficas pA317 o GP+aml2 se cultivan en cultivo tisular hasta densidad confluente en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) con suero de ternero (CS) al 10%, penicilina y estreptomicina. A continuación, se añade al medio el vector MSV que contiene el gen y se transducen las células de empaquetamiento con el vector. Las células de empaquetamiento producen ahora partículas víricas infecciosas que contienen el gen (las células de empaquetamiento pasan a denominarse células productoras).
Se añade medio fresco a las células productoras transducidas y, subsiguientemente, se cosecha el medio a partir de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio gastado, que contiene las partículas víricas infecciosas, se filtra a través de un filtro millipore para separar las células productoras desprendidas y se utiliza, entonces, este medio para infectar células fibroblásticas. Se retira el medio de una placa sub-confluente de fibroblastos y se sustituye rápidamente con el medio de las células productoras. Este medio se separa y se sustituye con medio fresco. Si el título de virus es alto, entonces prácticamente todos los fibroblastos estarán infectados y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, es necesario entonces utilizar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his.
Los fibroblastos modificados por ingeniería se inyectan ahora en el huésped, ya sea solos o después de haberlos cultiva hasta confluencia sobre perlas microportadoras cytodex 3. Ahora, los fibroblastos producen el producto proteico.
Ejemplo 7 Cicatrización de heridas estimulada por KGF-2 en el modelo de ratón diabético
Para demostrar que el factor de crecimiento queratinocítico-2 (KGF-2) es capaz de acelerar el proceso de curación, se utilizó el modelo de cicatrización de heridas en el ratón genéticamente diabético. El modelo de cicatrización de heridas de espesor total en el ratón db+/db+ es un modelo bien caracterizado, clínicamente relevante y reproducible de cicatrización alterada de heridas. La cicatrización de la herida en diabéticos depende de la formación de tejido de granulación y re-epitelización, en lugar de contracción (Gartner, M.H. et al., J. Surg. Res. 52:389 (1992); Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)).
Los animales diabéticos tienen muchas de las características típicas observadas en la diabetes mellitus de Tipo II. Los ratones homocigóticos (db+/db+) son obesos en comparación con sus equivalentes heterocigóticos (db+/+m) de camada. Los ratones diabéticos (db+/db+) mutantes tienen una sola mutación recesiva autosómica en el cromosoma 4 (db+) (Coleman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:283-293 (1982)). Los animales muestran polifagia, polidipsia y poliuria. Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) tienen glucosa elevada en sangre, niveles incrementados o normales de insulina, e inmunidad mediada celularmente suprimida (Mandel et al., J. Immunol. 120:1375 (1978); Debray-Sachs, M. et al., Clin. Exp. Immunol. 51(1):1-7 (1983); Leiter et al., Am. J. of Pathol. 114:46-55 (1985)). En estos animales se han descrito neuropatía periférica, complicaciones miocárdicas, y lesiones microvasculares, engrosamiento de la membrana basal y anomalías de la filtración glomerular (Norido, F. et al., Exp. Neurol. 83(2):221-232 (1984); Robertson et al., Diabetes 29(1):60-67 (1980); Giacomelli et al., Lab. Invest. 40(4):460-473 (1979); Coleman, D.L., Diabetes 31 (Suppl):1-6 (1982)). Estos ratones diabéticos homocigóticos desarrollan una hiperglucemia resistente a insulina análoga a la diabetes de Tipo II humana (Mandel et al., J. Immunol. 120:1375-1377 (1978)).
Las características observadas en estos animales indican que la cicatrización en este modelo puede ser similar a la observada en la diabetes humana (Greenhalgh et al., Am. J. of Pathol. 136:1235-1246 (1990)). Los resultados de este estudio demostraron que KGF-2 posee un potente efecto estimulante sobre la cicatrización de heridas de espesor total en fratrias heterocigóticas diabéticas y no diabéticas. En los animales tratados con KGF-2 se observaron marcados efectos sobre la re-epitelización y un incremento de las fibrillas de colágeno, y de tejido de granulación dentro de la dermis. La aplicación exógena de factores de crecimiento puede acelerar la formación de tejido de granulación al llevar células inflamatorias hacia la herida.
Animales
En este estudio, se utilizaron ratones hembras genéticamente diabéticas C57BL/KsJ (db+/db+) y sus equivalentes heterocigóticos de camada, no diabéticos (db+/+m) (Jackson Laboratories). Los animales se adquirieron con 6 semanas de edad y tenían 8 semanas de edad al iniciar el estudio. Los animales se enjaularon por separado y recibieron alimentos y agua a voluntad. Todas las manipulaciones se llevaron a cabo usando técnicas asépticas. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las normas y directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Human Genome Sciences, Inc. y las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
KGF-2
El KGF-2 recombinante humano utilizado en los estudios de cicatrización de heridas se sobre-expresó y purifico de pQE60-Cys37, un sistema de vector de expresión de E. coli (pQE-9, Qiagen). La proteína expresada a partir de esta construcción es el KGF-2 de Cisteína en posición 37 a Serina en posición 208 con una marca 6X(His) unida al extremo N de la proteína (SEC ID NOS:29-30) (Figura 15). Se utilizaron para el experimento fracciones que contenían más de 95% de materiales recombinantes puros. El factor de crecimiento queratinocítico-2 se formuló en un vehículo que contenía Tris 100 mM, NaCl 8,0 y 600 mM. Las concentraciones finales fueron 80 \mug/ml y 8 \mug/ml de la solución madre. Se efectuaron diluciones de la solución madre usando el mismo vehículo.
Heridas quirúrgicas
El protocolo de las heridas se efectuó de acuerdo con métodos anteriormente comunicados (Tsuboi, R. y Rifkin, D.B., J. Exp. Med. 172:245-251 (1990)). En resumen, el día en que se realizaron las heridas, los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de Avertin (0,01 mg/ml), 2,2,2-tribromoetanol y 2-metil-2- butanol disuelto en agua desionizada. Se afeitó la región dorsal del animal y la piel se lavó con una solución al 70% de etanol y yodo. El área quirúrgica se secó con gasas estériles antes de practicar la herida. Seguidamente, se produjo una herida de espesor total de 8 mm usando un sacabocados de tejido de Keyes. Inmediatamente después, se estiró suavemente la piel adyacente para eliminar la expansión de la herida. Las heridas se dejaron descubiertas durante todo el experimento. El tratamiento se aplicó de forma tópica durante 5 días consecutivos, comenzando el día de la herida. Antes del tratamiento, las heridas se limpiaron suavemente con solución salina y esponjas de gasa estériles.
Las heridas se examinaron visualmente y se fotografiaron a una distancia establecida el día de la cirugía y, de ahí en adelante, a intervalos de dos días. El cierre de la herida se determinó por mediciones diarias en los días 1-5 y el día 8. Las heridas se midieron horizontal y verticalmente usando un calibre calibrado de Jameson. Las heridas se consideraron curadas si ya no se visualizaba tejido de granulación y la lesión estaba cubierta por un epitelio continuo.
KGF-2 se administró usando dos dosis diferentes de KGF-2, una a 4 \mug por herida y día durante 8 días, y la segunda a 40 \mug por herida y día durante 8 días, en 50 \mul de vehículo. Los grupos de control de vehículo recibieron 50 \mul de solución de vehículo.
Los animales fueron sacrificados por eutanasia el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mg/kg). Se tomaron muestras de las heridas y de la piel adyacente para histología e inmunohistoquímica. Las muestras de tejido se colocaron en formalina tamponada neutra al 10% en cartuchos de tejido entre esponjas de biopsia para posterior procesamiento.
Diseño experimental
Se evaluaron tres grupos de 10 animales cada uno (5 diabéticos y 5 controles no diabéticos): 1) control de placebo con vehículo, 2) KGF-2 4 \mug/día, y 3) KGF-2 40 \mug/día. El estudio se diseñó de la forma siguiente:
1
Medición del área de la herida y cierre
El cierre de las heridas se analizó midiendo el área de los ejes vertical y horizontal y obteniendo la superficie total de la herida. Seguidamente, se calculó la contracción estableciendo las diferencias entre el área inicial de la herida (día 0) y la del post-tratamiento (día 8). El área de la herida el día 1 fue de 64 mm^{2}, es decir, el tamaño correspondiente al sacabocados dérmico. Los cálculos se realizaron usando la fórmula siguiente:
[área abierta el día 8] - [área abierta el día 1] / [área abierta el día 1]
Histología
Las muestras se fijaron en formalina tamponada al 10% y los bloques incluidos en parafina se cortaron perpendicularmente a la superficie de la herida (5 \mum) y se cortaron usando un micrótomo de Reichert-Jung. Se realizó una tinción convencional de hematoxilina-eosina (H&E) en secciones cruzadas de las heridas biseccionadas. Se utilizó el examen histológico de las heridas para evaluar si el proceso de cicatrización y el aspecto morfológico de la piel reparada estaban alterados por el tratamiento con KGF-2. Esta evaluación incluyó la verificación de la presencia de acumulaciones de células, células inflamatorias, capilares, fibroblastos, re-epitelización y madurez epidérmica (Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)) (Tabla 1). Un observador ciego utilizó un micrómetro de lente calibrada.
Inmunohistoquímica Re-epitelización
Se tiñeron secciones de tejido de forma inmunohistoquímica con un anticuerpo policlonal de queratina anti-humano de conejo, usando un sistema de detección ABC Elite. Se utilizó piel humana como control de tejido positivo, en tanto que se usó IgG no inmune como control negativo. El crecimiento de queratinocitos se determinó evaluando el grado de re-epitelización de la herida, usando un micrómetro con lente calibrada.
Marcador de proliferación celular
El antígeno nuclear/ciclina de las células en proliferación (PCNA) en muestras de piel se demostró usando un anticuerpo anti-PCNA (1:50) con un sistema de detección ABC Elite. El cáncer de colon humano sirvió como control de tejido positivo y se utilizó tejido de cerebro humano como control de tejido negativo. Cada muestra incluyó una sección, con omisión del anticuerpo primario y sustitución con IgG de ratón no inmune. La clasificación de estas secciones se basó en el grado de proliferación en una escala de 0-8, reflejando la parte inferior de la escala una ligera proliferación, hasta una intensa proliferación en el lado superior.
Análisis estadístico
Los datos experimentales se analizaron usando un test t no apareado. Se consideró significativo un valor de p < 0,05. Los datos se expresaron como la media \pm EEM.
Resultados Efecto de KGF-2 sobre el cierre de heridas
Los ratones diabéticos mostraron una cicatrización alterada en comparación con los ratones heterocigóticos normales. La dosis de 4 \mug de KGF-2 por sitio pareció producir una respuesta máxima en animales diabéticos y no diabéticos (Figuras 5,6). Estos resultados fueron estadísticamente significativos (p=0,002 y p<0,0001) en comparación con los grupos de control de tampón. El tratamiento con KGF-2 dio como resultado un cierre final promedio de 60,6% en el grupo que recibió 4 \mug/día, y 34,5% en el grupo de 40 \mug/día. Las heridas en el grupo de control de tampón tuvieron sólo un cierre de 3,8% el día 8. Las mediciones repetidas de las heridas en los días 2-5 después de la intervención y el día 8, realizadas en los ratones db+/db+ tratados con KGF-2 pusieron de manifiesto una mejoría significativa del área total de la herida (mm^{2}) el día 3 después de la intervención, comparados con el grupo de control de tampón. Esta mejoría continuó y, al final del experimento, se observaron resultados estadísticamente significativos (Figura 7). Los animales de los grupos bd+/+m que recibieron KGF-2 mostraron una reducción mayor del área de la herida en comparación con los grupos de control de tampón en las mediciones repetidas (Figura 8). Estos resultados confirmaron el índice mayor de cierre de las heridas en los animales tratados con KGF-2.
Efecto de KGF-2 sobre la puntuación histológica
La evaluación histopatológica de KGF-2 en el modelo diabético (db+/db+)el día 8 demostró una mejoría estadísticamente significativa (p<0,0001) de la puntuación de las heridas, comparada con el control de tampón. Los efectos farmacológicos observados con las dosis de 4 \mug y 40 \mug de KGF-2 no fueron significativamente diferentes entre ellos. El grupo de control de tampón mostró una mínima acumulación de células, sin tejido de granulación ni extensión de epitelio, en tanto que las dosis de 4 \mug y 40 \mug de KGF-2 (p<0,0001 y p=0,06, respectivamente) mostraron un recubrimiento con epitelio de la herida, neovascularización, formación de tejido de granulación y depósitos de fibroblastos y colágeno (Figura 9).
La evaluación histopatológica de las heridas cutáneas se llevó a cabo sobre muestras teñidas con hematoxilina-eosina. Los criterios de puntuación incluyeron una escala de 1-12, en la que la puntuación 1 representa una acumulación mínima de células, con escasa o mula granulación, y la puntuación 12 representa la presencia abundante de fibroblastos, depósito de colágeno y nuevo epitelio de recubrimiento de la herida (Tabla 1).
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La evaluación de los equivalentes no diabéticos de la camada, después de las dos dosis de KGF-2, no mostró actividad significativa en comparación con el grupo de control de tampón en ninguna de las mediciones evaluadas (Figura 10). El grupo de control de tampón mostró tejido de granulación inmaduro, células inflamatorias y capilares. La puntuación media fue superior a la del grupo diabético, lo que indica cicatrización alterada en los ratones diabéticos (db+/db+).
Efecto de KGF-2 sobre la re-epitelización
Se utilizó la inmunotinción de citoqueratina para determinar el grado de re-epitelización. Las puntuaciones se asignaron en base al grado de cierre sobre una escala de 0 (ausencia de cierre) a 8 (cierre completo). En los grupos que recibieron 4 \mug/día, hubo una mejoría estadísticamente significativa de la puntuación de re-epitelización, en comparación con el grupo de control de tampón, p<0,001 (Figura 11). En este grupo, se observaron queratinocitos localizados en la epidermis recién formada que recubre la herida. Asimismo, las dos dosis de KGF-2 exhibieron figuras mitóticas en diversas etapas. La evaluación de los grupos no diabéticos con las dos dosis de KGF-2 mostró también una clasificación mejorada de la re-epitelización (p=0,006 y 0,01, respectivamente) (Figura 12).
Efecto de KGF-2 sobre la proliferación celular
La inmunotinción con antígeno nuclear de células en proliferación demostró una proliferación significativa en los dos grupos tratados con 4 \mug y 40 \mug (Figura 13). El grupo no diabético evidenció resultados similares, puesto que los dos grupos que recibieron las citadas dosis de KGF-2 mostraron una puntuación significativamente mejorada, en comparación con el grupo de control de tampón (Figura 14). Se observó proliferación de la epidermis especialmente en la capa basal de la misma. Adicionalmente, se observaron células marcadas con PCNA de alta densidad en la dermis, especialmente en los folículos pilosos.
Conclusión
Los resultados demuestran que KGF-2 estimula específicamente el crecimiento de queratinocitos epidérmicos primarios. Además, estos experimentos demuestran que la aplicación tópica de KGF-2 recombinante humano acelera de forma pronunciada la velocidad de cicatrización de heridas dérmicas de espesor total en ratones diabéticos. La evaluación histológica pone de manifiesto que KGF-2 induce proliferación de queratinocitos, con engrosamiento epidérmico. Esta proliferación está localizada en la capa basal de la epidermis, como lo demuestra el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA). En la dermis, el depósito de colágeno, la proliferación de fibroblastos y la neovascularización restablecieron la arquitectura normal de la piel.
La alta densidad de células marcadas con PCNA en animales tratados con KGF-2, en contraste con el grupo de tampón, que tuvo menos células marcadas con PCNA, indica la estimulación de queratinocitos en el nivel dérmico-epidérmico, fibroblastos y folículos pilosos. En este experimento se observó de manera consistente una potenciación del proceso de cicatrización mediante KGF-2. Este efecto fue estadísticamente significativo en los parámetros evaluados (re-epitelización y cierre de heridas porcentuales). Es importante señalar que se observaron queratinocitos marcados con PCNA principalmente en la capa basal inferior de la epidermis. La dermis mostró tejido normalizado, con fibroblastos, colágeno y tejido de granulación.
La actividad observada en los animales no diabéticos indica que KGF-2 tuvo una respuesta farmacológica significativa sobre el porcentaje de cierres de heridas en el día 8, así como durante el trascurso del experimento, basado en mediciones diarias. Aunque la evaluación histopatológica no fue significativamente diferente, en comparación con el grupo de tampón, el crecimiento de queratinocitos y las puntuaciones de PCNA demostraron efectos relevantes.
En resumen, estos resultados pusieron de manifiesto que KGF-2 muestra una actividad significativa en los modelos de heridas por escisión, tanto alterados como normales, usando el modelo de ratón db+/db+, por lo que puede ser útil en el tratamiento de heridas, incluidas las heridas quirúrgicas, úlceras diabéticas, úlceras por estasis venoso, quemaduras y otras patologías de la piel.
Experimento 8
Cicatrización de heridas mediada por KGF-2 en el modelo de rata alterada por esteroides
La inhibición de la cicatrización de heridas por medio de esteroides está bien documentada en diversos sistemas in vitro e in vivo (Wahl, S.M., Glucocorticoids and Wound Healing. In Anti-inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280-302 (1989); Wahl, S.M. et al., J. Immunol. 115:476-481 (1975); Werb, Z. et al., J. Exp. Med. 147:1684-1694 (1978)). Los glucocorticoides retrasan la cicatrización al inhibir la angiogénesis, disminuir la permeabilidad vascular (Ebert, R.H. et al., An. Intern. Med. 37:701-705 (1952), la proliferación de fibroblastos, y la síntesis de colágeno (Beck, L.S. et al., Growth Factors. 5:295-304 (1991); Haynes, B.F. et al., J. Clin. Invest. 61:703-797 (1978)) y producir una reducción transitoria de los monocitos circulantes (Haynes, B.F. et al., J. Clin. Invest. 61:703-797 (1978); Wahl, S.M., Glucocorticoids and wound healing. In Anti-inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, Nueva York, págs. 280-302 (1989)).La administración sistémica de esteroides en la cicatrización alterada es un fenómeno bien establecido en ratas (Beck, L.S. et al., Growth Factors, 5:295-304 (1991); Haynes, B.F. et al., J. Clin. Invest. 61:703-797 (1978); Wahl, S.M., Glucocorticoids and wound healing. In Anti-inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, Nueva York, págs. 280-302 (1989); Pierce, G.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2229-2233 (1989)).
Para demostrar que KGF-2 es capaz de acelerar el proceso de cicatrización, se evaluaron los efectos de múltiples aplicaciones tópicas de KGF-2 en heridas por escisión de espesor total en ratas, en las que la cicatrización se había alterado mediante la administración sistémica de metilprednisolona. Estudios in vitro han demostrado que KGF-2 estimula específicamente el crecimiento de queratinocitos epidérmicos primarios humanos. El presente ejemplo demuestra que KGF-2 recombinante humano, aplicado tópicamente, acelera la velocidad de cicatrización de heridas por escisión de espesor total en la rata, midiendo la separación de la herida con un calibre calibrado de Jameson y por histomorfometría e inmunohistoquímica. La evaluación histológica demuestra que KGF-2 acelera la re-epitelización y, en consecuencia, la reparación de heridas.
Animales
Se utilizaron en este ejemplo ratas Sprague-Dawley machos, adultas jóvenes, con un peso de 250-300 g (Charles River Laboratories). Los animales se adquirieron a las 8 semanas de edad y tenían 9 semanas de edad al iniciar el estudio. La respuesta de cicatrización de las ratas se alteró mediante la administración sistémica de metilprednisolona (17 mg/kg/rata, por vía intramuscular) en el momento que se practicaron las heridas. Los animales se alojaron por separado y recibieron alimento y agua a voluntad. Todas las manipulaciones se realizaron usando técnicas asépticas. Este estudio se realizó de acuerdo con las normas y directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Human Genome Sciences, Inc. y las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
KGF-2
Se sobre-expresó y purificó KGF-2 humano recombinante a partir de pQE-60-Cys37, un sistema de vector de expresión en E. coli (pQE-9, Qiagen). La proteína expresada de esta construcción es KGF-2 de cisteína en posición 37 a Serina en posición 208, con una marca 6X(His) unida al extremo N de la proteína (Figura 15) (SEC ID NOS:29-30). Se utilizaron para el experimento fracciones que contenían más de 95% de materiales puros recombinantes. KGF-2 se formuló en un vehículo que contenía 1X PBS. Las concentraciones finales fueron 20 \mug/ml y 80 \mug/ml de la solución madre. Se efectuaron diluciones de la solución madre usando el mismo vehículo.
Se sobre-expresó y purificó KGF-2 \Delta28 a partir del sistema de vector de expresión de E. coli. Se utilizaron para el experimento fracciones que contenían más de 95% de materiales recombinantes puros. KGF-2 se formuló en un vehículo que contenía 1X PBS. Las concentraciones finales fueron 20 \mug/ml y 80 \mug/ml de la solución madre. Se efectuaron diluciones de la solución madre usando el mismo vehículo.
Heridas quirúrgicas
El protocolo de las heridas se efectuó de acuerdo con el anterior Ejemplo 7. El día en que se realizaron las heridas, los animales se anestesiaron con una inyección intramuscular de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg). Se afeitó la región dorsal del animal y la piel se lavó con una solución al 70% de etanol y yodo. El área quirúrgica se secó con gasas estériles antes de practicar la herida. Seguidamente, se produjo una herida de espesor total de 8 mm usando un sacabocados de tejido de Keyes. Las heridas se dejaron descubiertas durante todo el experimento. La aplicación de los materiales de ensayo se realizó por vía tópica, una vez al día durante 7 días consecutivos, iniciándola el día de la herida y posteriormente a la administración de metilprednisolona. Antes del tratamiento, las heridas se limpiaron suavemente con solución salina y esponjas de gasa estériles.
Las heridas se examinaron visualmente y se fotografiaron a una distancia establecida el día de la cirugía y al final de tratamiento. El cierre de la herida se determinó por mediciones diarias en los días 1-5 y el día 8. Las heridas se midieron horizontal y verticalmente usando un calibre calibrado de Jameson. Las heridas se consideraron curadas si ya no se visualizaba tejido de granulación y la lesión estaba cubierta por un epitelio continuo.
Se llevó a cabo un estudio de respuesta a la dosis, usando dos dosis diferentes de KGF-2, una de 1 \mug por herida y día y, la segunda, de 4 \mug por herida y día, durante 5 días en 50 \mul de vehículo. Los grupos de control de vehículo recibieron 50 \mul de 1X PBS.
Los animales fueron sacrificados por eutanasia el día 8, mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mg/kg). Se colocaron muestras de tejido en formalina tamponada neutra al 10% en cartuchos de tejido, entre esponjas de biopsia para su posterior procesamiento.
Diseño experimental
Se evaluaron cuatro grupos de 10 animales cada uno (5 con metilprednisolona y 5 sin glucocorticoide): 1) Grupo no tratado; 2) Grupo de control de placebo de vehículo; 3) KGF-2 1 \mug/día; y 4) KGF-2 4 \mug/día. El presente estudio se diseñó de la forma siguiente:
\newpage
n Grupo Tratamiento
\bullet Tratado con glucocorticoide
N=5 No tratado
N=5 Vehículo 50 \mul
N=5 KGF-2 (1 \mug) 50 \mul
N=5 KGF-2 (4 \mug) 50 \mul
\bullet Sin glucocorticoide
N=5 No tratado
N=5 Vehículo 50 \mul
N=5 KGF-2 (1 \mug) 50 \mul
N=5 KGF-2 (4 \mug) 50 \mul
Medición del área de la herida y cierre
El cierre de las heridas se analizó midiendo el área de los ejes vertical y horizontal y obteniendo la superficie total de la herida. Seguidamente, se calculó el cierre estableciendo las diferencias entre el área inicial de la herida (día 0) y la del post-tratamiento (día 8). El área de la herida el día 1 fue de 64 mm^{2}, es decir, el tamaño correspondiente al sacabocados dérmico. Los cálculos se realizaron usando la fórmula siguiente:
[área abierta el día 8] - [área abierta el día 1] / [área abierta el día 1]
Histología
Las muestras se fijaron en formalina tamponada al 10% y los bloques incluidos en parafina se cortaron perpendicularmente a la superficie de la herida (5 \mum) y se cortaron usando un micrótomo de Olympus. Se realizó una tinción convencional de hematoxilina-eosina (H&E) en secciones cruzadas de las heridas biseccionadas. El examen histológico de las heridas permitió evaluar si el proceso de cicatrización y el aspecto morfológico de la piel reparada estaban mejorados por el tratamiento con KGF-2. Un observador ciego utilizó un micrómetro de lente calibrada para determinar la distancia de la separación de la herida.
Análisis estadístico
Los datos experimentales se analizaron usando un test t no apareado. Se consideró significativo un valor de p<0,05. Los datos se expresaron como media \pm EEM.
Resultados
La comparación del cierre de la herida en los grupos de control no tratados con y sin metilprednisolona demuestra que las ratas tratadas con metilprednisolona tienen una alteración significativa de la cicatrización a los 8 días después de la realización de las heridas, en comparación con ratas normales. El área total de la herida medió 58,4 mm^{2} en el grupo que recibió metilprednisolona y 22,4 mm^{2} en el grupo que no recibió el glucocorticoide (Figura 16).
Efecto de KGF-2 sobre el cierre de la herida
La administración sistémica de metilprednisolona a ratas en el momento de la herida retrasó el cierre de las mismas (p=0,002) de ratas normales. Las mediciones del cierre de la herida en los grupos alterados con metilprednisolona al final del experimento, el día 8, demostraron que el cierre de las heridas con KGF-2 era significativamente mayor desde el punto de vista estadístico (1 \mug, p=0,002 y 4 \mug, p=0,005), en comparación con el grupo no tratado (Figura 16). El cierre porcentual de heridas fue 60,2% en el grupo que recibió 1 \mug de KGF-2 (p=0,002) y 73% en el grupo tratado con 4 \mug de KGF-2 (p=0,0008). Por el contrario, el cierre de las heridas en el grupo no tratado fue 12,5% y, en el grupo de placebo de vehículo, fue 28,6% (Figura 17).
El análisis longitudinal del cierre de heridas en los grupos que recibieron glucocorticoide desde el día 1 a 8 muestra una reducción significativa del tamaño de la herida, desde el día 3 a 8 después de la intervención, con las dos dosis de KGF- 2 en los grupos tratados (Figura 18).
Los resultados demuestran que el grupo tratado con 4 \mug de KGF-2 manifestó un cierre de la herida acelerado de forma estadísticamente significativa (p=0,05), en comparación con el grupo no tratado (Figura 19A). Aun cuando resulta difícil evaluar la capacidad de una proteína u otros compuestos para acelerar la cicatrización en animales normales (debido a su rápida recuperación), se demostró, sin embargo, que KGF-2 acelera la cicatrización de heridas en este modelo.
Evaluación histopatológica de las heridas tratadas con KGF-2
La histomorfometría de la separación de la herida indicó una reducción de la distancia de la herida en el grupo tratado con KGF-2. La separación de la herida observada en el grupo no tratado fue de 5.336 \mu, mientras que en el grupo tratado con 1 \mug de KGF-2 se produjo una reducción de este parámetro a 2.972 \mu; el grupo tratado con 4 \mug de KGF-2 (p=0,04) mostró una reducción de la separación de la herida a 3.086 \mu (Figura 20).
Efectos de KGF-2 \Delta28 en la cicatrización de heridas
También se evaluaron KGF-2 \Delta28 y PDGF-BB sobre la cicatrización de heridas en el modelo de rata alterado por metilprednisolona. El experimento se llevó a cabo de la misma forma que para la proteína KGF-2 anteriormente descrito, excepto que la proteína KGF-2 \Delta28 no está marcada con His y la cicatrización se midió en los días 2, 4, 6, 8 y 10. El vehículo tampón para las proteínas fue NaOAc 40 mM y NaCl 150 mM, pH 6,5, para todas, salvo la preparación "E2" de KGF-2 de longitud total. El vehículo tampón para la preparación "E2" de KGF-2 fue NaOAc 20 mM y NaCl 400 mM, pH 6,4.
Los resultados que se muestran en la Figura 19B demuestran que KGF-2 \Delta28 aceleró de forma estadísticamente significativa el cierre de las heridas, en comparación con el grupo no tratado, y que invirtió los efectos de metilprednisolona sobre la cicatrización de heridas.
Conclusiones
El presente ejemplo demuestra que KGF-2 invirtió los efectos de metilprednisolona sobre la cicatrización de heridas. La aplicación exógena de factores de crecimiento puede acelerar la formación de tejido de granulación, aportando células inflamatorias hacia la herida. Se observó una actividad similar también en animales que no recibieron metilprednisolona, lo que indica que KGF-2 generó una respuesta farmacológica significativa en el porcentaje de cierre de heridas en el día 5, basándose en mediciones diarias. El modelo de cicatrización alterada por glucocorticoides en ratas demostró ser un modelo adecuado y reproducible para medir la eficacia de KGF-2 y otros compuestos en la zona de cicatrización de la herida.
En resumen, los resultados demuestran que KGF-2 exhibe actividad significativa en los modelos de cicatrización de heridas por escisión tanto alterado por glucocorticoide como normal. Por consiguiente, KGF-2 puede resultar clínicamente útil en la estimulación de la cicatrización de heridas, incluidas heridas quirúrgicas, úlceras diabéticas, úlceras por estasis venosa, quemaduras, y otras situaciones de cicatrización anormal tales como uremia, malnutrición, déficits vitamínicos y tratamiento sistémico con esteroides y medicamentos antineoplásicos.
Ejemplo 9 Distribución tisular de la expresión de mRNA de KGF-2
Se efectúa un análisis de transferencia de Northern para examinar los niveles de expresión del gen que codifica la proteína KGF-2 en tejidos humanos, utilizando métodos descritos por, entre otros, Sambrook, et al., anteriormente citado. Se obtuvo por PCR una sonda correspondiente a la totalidad del marco abierto de lectura de KGF-2 de la presente invención (SEC ID NO:1), marcándolo con ^{32}P empleando el sistema de marcado de DNA rediprime® (Amersham Life Sciences), según las instrucciones del fabricante. Después del marcado, la sonda se purificó usando una columna CHROMA SPIN-100® (Clontech Laboratories, Inc.), de acuerdo con el protocolo del fabricante, número PT1200-1. La sonda marcada y purificada se usó entonces para examinar en diversos tejidos humanos la expresión del gen que codifica KGF-2.
Se obtuvieron de Clontech transferencias de Northern de múltiples tejidos (MTN) que contenían RNA poli-A de diversos tejidos humanos (H) o tejidos de inmunosistemas humanos (IM), y se les examinó con sonda marcada usando la Solución de Hibridación ExpressHyb® (Clontech) según el protocolo del fabricante número PT1190-1. Tras la hibridación y el lavado, se montan las transferencias y se exponen a película a -70ºC durante una noche, revelando las películas según procedimientos estándares.
En la mayoría de los tejidos humanos se observó una especie principal de mRNA de aproximadamente 4,2 kb. El mRNA de KGF-2 fue relativamente abundante en corazones, páncreas, placentas y ovarios. Asimismo, se observó una especie menor de mRNA, de aproximadamente 5,2 kb, en varias regiones. La identidad de esta especie de mRNA de 5,2 kb no estaba clara. Es posible que el trascripto de 5,2 kb codifique una forma separada alternativamente de KGF-2 o un tercer miembro de la familia de KGF. El cDNA de KGF-2 tuvo 4,1 kb, consistente con el tamaño del mRNA de 4,2 kb.
Ejemplo 10 Ensayos de proliferación de queratinocitos
Los queratinocitos dérmicos son células en la epidermis de la piel. El crecimiento y difusión de queratinocitos en la piel es un proceso importante en la cicatrización de heridas. Por lo tanto, un ensayo de proliferación de queratinocitos es un valioso indicador de las actividades de proteínas en la estimulación del crecimiento de queratinocitos y, por lo tanto, en la cicatrización.
Sin embargo, los queratinocitos son difícilmente cultivables in vitro. Existen pocas líneas celulares de queratinocitos. Estas líneas celulares tienen diversos defectos celulares y genéticos. Con el fin de evitar complicaciones de este ensayo por defectos celulares tales como pérdida de receptores de factores de crecimiento clave, o dependencia de factores de crecimiento clave para el crecimiento, se seleccionan para el presente ensayo queratinocitos dérmicos primarios. Estos queratinocitos primarios se obtuvieron de Clonetics, Inc. (San Diego, CA).
Ensayo de proliferación de queratinocitos con alamarBlue
alamarBlue es una tinción azul viable que es metabolizado por las mitocondrias cuando se añade a un medio de cultivo. La tinción se torna roja, entonces, en los sobrenadantes de cultivos de tejidos. Las cantidades de tinción roja se pueden cuantificar directamente mediante diferencias de lectura en densidades ópticas entre 570 nm y 600 nm. Esta lectura refleja las actividades celulares y el número de células.
Se adquieren queratinocitos dérmicos primarios normales (CC-0255, NHEK-Neo pooled) de Clonetics, Inc. Estas células se encuentran en el pasaje 2. Los queratinocitos se cultivan en medio completo para crecimiento de queratinocitos (CC-3001, KGM; Clonetics, Inc.) hasta que alcancen una confluencia de 80%. Las células se tripsinizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante. En pocas palabras, las células se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hank. Se añadieron 2-3 ml de tripsina a las células durante aproximadamente 3-5 min a temperatura ambiente. Se añadió solución de neutralización de tripsina y se recogieron las células. Las células se centrifugan a 600 xg durante 5 min a temperatura ambiente y se siembran en nuevos matraces en un volumen de 3.000 células por centímetro cuadrado, utilizando medio precalentado.
Para el ensayo de proliferación, se deben sembrar 1.000-2.000 queratinocitos por pocillo de las placas de 96 pocillos de fondo plano de Corning en medio completo, excepto las filas más exteriores. Rellenar los pocillos exterior4es con 200 \mul de agua estéril. Este procedimiento ayuda a minimizar las fluctuaciones de temperatura y humedad de los pocillos. Cultivar las células durante una noche a 37ºC con CO_{2} al 5%. Lavar las células dos veces con medio basal de queratinocitos (CC-3101, KBM, Clonetics, Inc.) y añadir 100 \mul de KBM en cada pocillo. Incubar durante 24 horas. Diluir los factores de crecimiento en KBM en diluciones seriadas y añadir 100 \mul a cada pocillo. Utilizar KGM como control positivo y KBM como control negativo. Se usan seis pocillos para cada punto de concentración. Incubar durante dos a tres días. Al final de la incubación, lavar las células una vez con KBM y añadir 100 \mul de KBM con alamarBlue al 10% en volumen premezclado en el medio. Incubar durante 6 a 16 horas hasta que el color del medio empiece a tornarse rojo en el control positivo de KGM. Medir la D.O. 570 nm menos D.O. 600 nm colocando las placas directamente en el lector de placas.
Resultados Estimulación de la proliferación de queratinocitos por KGF-2
Para demostrar que KGF-2 (es decir, que se inicia en el aminoácido Cys37, según se ha descrito en los Ejemplos 7 y 8 anteriores) y los mutantes por deleción N-terminal KGF-2 \Delta33 y KGF-2 \Delta28, fueron activos en la estimulación del crecimiento de queratinocitos epidérmicos, se incubaron queratinocitos epidérmicos humanos primarios normales con proteína KGF-2 expresada en E. coli y purificada (número de lote E3) (SEC ID NO:2), KGF-2 \Delta33 (número de lote E1) y KGF-2 \Delta28 (número de lote E2). La proteína KGF-2 estimuló el crecimiento de queratinocitos epidérmicos con una CE50 de aproximadamente 5 ng/ml, equivalente a la de FGF7/KGF-1 (Figura 21A). Por el contrario, otros FGF tales como FGF-1 y FGF-2 no estimularon el crecimiento de queratinocitos primarios. La CE50 para KGF-2 \Delta33 fue 0,2 ng/ml y la de KGF-2 \Delta28, 2 ng/ml (véanse las Figuras 21B y C). Por lo tanto, KGF-2 pareció ser tan potente como FGF7/KGF-1 en la estimulación de la proliferación de queratinocitos epidérmicos primarios. No obstante, KGF-2 \Delta33 es más potente en la estimulación de la proliferación de queratinocitos que el KGF-2 "Cys(37)" descrito en los Ejemplos 7 y 8 anteriores, y que el KGF-2 \Delta28.
La formación de cicatrices de tejidos implica la hiperproliferación de fibroblastos dérmicos. Para determinar si los efectos estimulantes de KGF-2 fueron específicos para queratinocitos, pero no para fibroblastos, se ensayaron fibroblastos de ratón Balb.c.3T3 y fibroblastos pulmonares humanos. Ninguno de los tipos de fibroblastos respondió a KGF-2 en los ensayos de proliferación. Por lo tanto, KGF-2 parece ser un mitógeno específico para los queratinocitos epidérmicos, pero no para células mesenquimales tales como fibroblastos. Esto indica que la probabilidad de que KGF-2 provoque cicatrices de los tejidos lesionados fue baja.
Ejemplo 11 A. Efectos mitógenos de KGF-2 sobre células transfectadas con receptores específicos de FGF
Para determinar qué isoforma(s) de los receptores de FGF media(n) los efectos proliferativos de KGF-2, se analizaron los efectos de KGF-2 sobre células que expresan isoformas específicas de receptores de FGF, de acuerdo con el método descrito por Santos-Ocampo et al., J. Biol.. Chem. 271:1726-1731 (1996). Se sabía que FGF7/KGF induce mitogénesis de las células epiteliales al unirse a y activar de manera específica la forma FGFR2iiib (Miki et al., Science 251:72-75 (1991)). Por lo tanto, los efectos proliferativos de KGF-2 en ensayos de mitogénesis se analizaron usando células que expresan una de las siguientes isoformas del receptor de FGF: FGFR1iiib, FGFR2iiib, FGFR3iiib, y FGFR4.
Ensayo de mitogénesis de células que expresan receptores de FGF
Se llevó a cabo la incorporación de timidina de células BaF3 que expresan receptores específicos de FGF según lo descrito por Santos-Ocampo et al., J. Biol.. Chem. 271:1726-1731 (1996). En pocas palabras, células BaF3 que expresan receptores específicos de FGF se lavaron y resuspendieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco, suero de ternero neonato al 10%, L-glutamina. Se sembraron aproximadamente 22.500 células por pocillo en una placa de ensayo de 96 pocillos, en medio que contenía 2 \mug/ml de heparina. Se añadieron los reactivos del ensayo a cada pocillo, hasta un volumen total de 200 \mul por pocillo. Las células se incubaron durante 2 días a 37ºC. A continuación, se agregó a cada pocillo 1 \muCi de ^{3}H-timidina en un volumen de 50 \mul. Las células se cosecharon después de 4-5 horas por filtración a través de papel de fibra de vidrio. La ^{3}H-timidina incorporada se determinó con un contador de escintilación de placa Wellac beta.
Resultados
Los resultados revelaron que la proteína KGF-2 (Thr(36) - Ser(208) de la Figura 1 (SEC ID NO:2), con una Met N-terminal añadida) estimuló fuertemente la proliferación de células BaF3 que expresan el receptor de KGF, isoforma FGFR2iiib, según indica la incorporación de ^{3}H-timidina (Figura 22A). Es interesante destacar que se observó un ligero efecto estimulante de KGF-2 sobre la proliferación de células BaF3 que expresan la isoforma FGFR1iiib. KGF-2 careció de efecto sobre las células que expresan la forma FGFR3iiib o FGFR4 del receptor.
FGF7/KGF estimuló la proliferación de células que expresan el receptor de KGF, FGFR2iiib, pero no la isoforma FGFR1iiib. La diferencia entre KGF-2 y FGF7/KGF fue intrigante. En los experimentos de control, aFGF estimuló sus receptores, FGFR1iiib e iiic, y bFGF estimuló su receptor FGFR2iiic. Por consiguiente, estos resultados sugirieron que KGF-2 se une a la isoforma FGFR2iiib y estimula la mitogénesis. Al contrario que FGF7/KGF, KGF-2 también se une a la isoforma FGFR1iiib y estimula la mitogénesis.
B. Efectos mitógenos de KGF-2 \Delta33 sobre células transfectadas con receptores específicos de FGF
Como se ha demostrado anteriormente, tanto los FGF como KGF-1 ó 2 se unen y activan el receptor FGF 2iiib (FGFR2iiib). Los efectos proliferativos de KGF-2 \Delta33 en ensayos de mitogénesis se analizaron usando células que expresan una de las siguientes isoformas de receptor de FGF: FGFR2iiib o FGFR2iiic (las células transfectadas con el receptor 2iiic se incluyen como control negativo).
Los experimentos se llevaron a cabo como anteriormente, en la parte A de este ejemplo. En resumen, se cultivaron células BaF3 en RPMI que contenía suero de ternero al 10% (BCS - no suero fetal), 10% de medio acondicionado de cultivos de células WEH13 (cultivadas en RPMI que contenía BCS al 5%), \beta-mercaptoetanol 50 nM, L-Glu (2% de una solución madre de 100X) y pen/estrep (1% de una solución madre 100X).
Para el ensayo, las células BaF3 se enjuagaron dos veces en medio RPMI que contenía BCS al 10% y 1 \mug/ml de heparina. Las células BaF3 (22.000/pocillo) se sembraron en una placa de 96 pocillos en 150 \mul de medio RPMI que contenía BCS al 10% y 1 \mug/ml de heparina. Se añadieron las proteínas FGF ácido, FGF básico, KGF-1 (HG15400) o KGF-2 (HG03400, 03401, 03410 ó 03411) a concentraciones desde aproximadamente 0 a 10 nM. Las células se incubaron en un volumen final de 200 \mul durante 48 horas a 37ºC. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Se añadió timidina tritiada (0,5 \muCi) a cada pocillo durante 4 horas a 37ºC y, a continuación, las células se cosecharon por filtración a través de un filtro de fibra de vidrio. La cantidad total de radiactividad incorporada se determinó, entonces, por recuento de escintilación líquida. Se utilizaron los siguientes controles positivos: FGF básico y FGF ácido para células FGFR2iiic; FGF ácido y KGF-1 para células FGFR2iiib. Se usaron los siguientes controles negativos; medio basal (medio RPMI que contiene BCS al 10% y 1 \mug/ml de heparina).
Resultados
Los resultados pusieron de manifiesto que las proteínas KGF-2 (Thr(36) - Ser(208) con Met N-terminal añadida), KGF-2 \Delta33 y KGF-2 \Delta28 estimulan fuertemente la proliferación de células BaF3 que expresan el receptor de KGF, la isoforma FGFR2iiib, como lo indica la incorporación de ^{3}H-timidina (Figuras 22A-C). Las proteínas KGF-2 no ejercieron ningún efecto sobre las células que expresan las formas FGFR2iiic del receptor. Estos resultados indicaron que las proteínas KGF-2 se unen a la isoforma FGFR2iiib y estimulan la mitogénesis. Además, parece ser que KGF-2 \Delta33 fue capaz de estimular la proliferación de las células BaF3 mejor que KGF-2 (Thr(36) - Ser(208)).
Ejemplo 12 A. Construcción de KGF-2 de longitud total optimizado en E. coli
Con el objetivo de incrementar los niveles de expresión de KGF-2 de longitud total en un sistema de expresión de E. coli, se optimizaron los codones de la porción amino-terminal del gen a los codones E. coli frecuentemente utilizados. Para la síntesis de la región optimizada de KGF-2, se sintetizó una serie de seis oligonucleótidos: números 1-6 (las secuencias se exponen más adelante). Estos oligonucleótidos solapados se utilizaron en una reacción de PCR durante siete ciclos bajo las condiciones siguientes:
Desnaturalización 95 grados 20 segundos
Templado 58 grados 20 segundos
Extensión 72 grados 60 segundos
Se estableció una segunda reacción de PCR usando 1 \mul de la primera reacción de PCR con el cebador sintético 6 de KGF-2 como cebador 3' y 5' BamHI sintético de KGF-2 como cebador 5', usando las mismas condiciones que las descritas anteriormente para 25 ciclos. El producto preparado por esta reacción final se restringió con AvaII y BamHI. La construcción de KGF-2 del Ejemplo 1 se restringió con AvaII y HindIII y se aisló el fragmento. Estos dos fragmentos se clonaron en pQE-9 restringido con BamHI y HindIII en una unión de tres fragmentos.
Cebadores usados para construir KGF-2 1/208 sintético optimizado:
107
El clon resultante se muestra en la Figura 23 (SEC ID NOS:38 y 39).
B. Construcción de KGF-2 maduro optimizado por E. coli
Al objeto de incrementar adicionalmente los niveles de expresión de la forma madura de KGF-2 en un sistema de expresión de E. coli, se optimizaron los codones de la porción amino-terminal del gen a codones de E. coli altamente utilizados. Para corresponder con la forma madura de KGF-1, se construyó una forma truncada de KGF-2, empezando en treonina 36. Como modelo se utilizó KGF-2 sintético de E. coli del Ejemplo 12 A en una reacción de PCR, usando 5' KGF-2 BspHI como cebador 5' (la secuencia se ofrece más adelante) y 3' KGF-2 HindIII como cebador 3' (la secuencia se ofrece más adelante). La amplificación se llevó a cabo usando condiciones estándares, como se han indicado anteriormente en el Ejemplo 12 A para 25 ciclos. El producto resultante se restringió con BspHI y HindII y se clonó en el vector de expresión de E. coli pQE60, digerido con NcoI y HindIII.
Cebador 5' KGF-2 BspHI: TTTCATGACTTGTCAAGCTCTGGGTCAAGATATGGTTC (SEC ID NO:40)
Cebador 3' KGF-2 HindIII: GCCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCC (SEC ID NO:41)
El clon resultante se muestra en la Figura 24A (SEC ID NOS:42 y 43).
C. Construcción de un KGF-2 maduro optimizado por E. coli alternativo
Con el fin de incrementar aún más los niveles de expresión de la forma madura de KGF-2 en un sistema de expresión de E. coli, los codones de 53 aminoácidos en la porción amino-terminal del gen optimizado con E. coli se cambiaron a codones de E. coli alternativos, altamente utilizados. Para la síntesis de la región optimizada de KGF-2, se sintetizó una serie de seis oligonucleótidos: números 18062, 18061, 18058, 18064, 18059 y 18063 (Las secuencias se muestran más adelante). Estos oligonucleótidos solapados se utilizaron en una reacción de PCR durante siete ciclos bajo las condiciones siguientes:
Desnaturalización 95 grados 20 segundos
Templado 58 grados 20 segundos
Extensión 72 grados 60 segundos
Después de los siete ciclos de síntesis, se añadieron un cebador 5' para esta región, 18169, y un cebador 3' para esta región completa, 18060, a una reacción de PCR que contenía 1 microlitro de la reacción inicial de los seis oligonucleótidos. Este producto se amplificó durante 30 ciclos usando las condiciones siguientes:
Desnaturalización 95 grados 20 segundos
Templado 55 grados 20 segundos
Extensión 72 grados 60 segundos
Se estableció una segunda reacción de PCR para amplificar la región 3' del gen usando los cebadores 18066 y 18065 bajo las mismas condiciones que se han descrito anteriormente para 25 ciclos. Los productos resultantes se separaron sobre un gel de agarosa. Secciones de gel que contenían el producto se diluyeron en Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5. Se utilizó 1 microlitro de cada una de las secciones de gel diluidas en una reacción de PCR adicional, usando el cebador 18169 como cebador 5', y el cebador 18065 como cebador 3'. El producto se amplificó durante 25 ciclos usando las mismas condiciones citadas. El producto generado por esta reacción final se restringió con EcoRI y HindIII, y se clonó en pQE60, que también se cortó con EcoRI y HindIII (ahora, pQE6).
Secuencias de los cebadores sintéticos 5':
3
4
La secuencia del gen sintético de KGF-2 y sus aminoácidos correspondientes se muestran en la Figura 24B (SEC ID NOS: 54 y 55).
Ejemplo 13 Construcción de mutantes por deleción de KGF-2
Se construyeron mutantes por deleción a partir de los extremos 5' y 3' del gen de KGF-2, usando la construcción optimizada de KGF-2 del Ejemplo 12A como modelo. Las deleciones se seleccionaron en base a las regiones del gen que pudieran afectar negativamente a la expresión en E. coli. Para la deleción 5', se utilizaron los cebadores enumerados más adelante como cebador 5'. Estos cebadores contienen el sitio de restricción indicado y un ATG para codificar la metionina de inicio. Se utilizó el cebador KGF-2 (FGF-12) 208 aminoácidos 3' HindIII para el cebador 3'. Se realizó una amplificación por PCR durante 25 ciclos empleando condiciones estándares, según se expone en el Ejemplo 12. Los productos para el mutante por deleción de KGF-2 36aa/208aa fueron BspHI restringido para el sitio 5' y HindIII para el sitio 3', y se clonó en pQE60, digerido con BspHI y HindIII. Todos los demás productos se restringieron con NcoI para la enzima de restricción 5' y HindIII para el sitio 3', y se clonaron en pQE60, digerido con NcoI y HindIII. Para KGF-2 (FGF-12) se usó 3' HindIII 36aa/153aa y 128aa como cebador 3' con FGF-12 36aa/208aa como cebador 5'. Para FGF-12 62aa/153aa, se usó HindIII 128aa como cebador 3' con FGF-12 62aa/208aa como cebador 5'. La nomenclatura de los clones resultantes indica el primer y último aminoácidos del polipéptido resultante de la deleción. Por ejemplo, KGF-2 36aa/153aa indica que el primer aminoácido del mutante de deleción es el aminoácido 36 y que el último aminoácido es el aminoácido 153 de KGF-2. Además, como se indica en las Figuras 25-33, a cada mutante se agrega una Met N-terminal.
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(Secuencias pasa a página siguiente)
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Secuencias de los cebadores de deleción:
5
Las secuencias correspondientes a las mutaciones por deleción resultantes se exponen en las Figuras 25-33 [SEC ID NOS:65-82]
Ejemplo 14 Construcción de mutantes de cisteína de KGF-2
Se utilizó la construcción de los cebadores de mutación C-37 5457 5' BspHI y 5258 173aa 3' HindIII para amplificar el modelo de KGF-2 (FGF-12) del Ejemplo 12 A. El cebador 5457 5' BspHi cambia la cisteína 37 por una serina. La amplificación se realizó usando las condiciones estándares anteriormente presentadas en el Ejemplo 12A para 25 ciclos. El producto resultante se restringió con BspHI y HindIII y se clonó en el vector de expresión de E. coli pQE60, se digirió con BspHI y HindIII. (Figura 34) [SEC ID NO:38].
Para la mutación de cisteína 106 en serina, se establecieron dos reacciones de PCR para la mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótidos de esta cisteína. En una reacción, se utilizó 5453 BspHi como cebador 5' y se usó 5455 como cebador 3' en la reacción. En una segunda reacción, se utilizó 5456 como cebador 5' y se usó 5258 HindIII como cebador 3'. Las reacciones se amplificaron durante 25 ciclos bajo condiciones estándares, según se presenta en el Ejemplo 12. Se utilizó 1 microlitro de cada una de estas reacciones de PCR como modelo en una reacción subsiguiente, en la que se utilizó como cebador 5' 5453 BspHI y, como cebador 3', 5258 HindIII. La amplificación durante 25 ciclos se llevó a cabo usando condiciones estándares, según se presenta en el Ejemplo 12. El producto resultante se restringió con BspHI y HindIII y se clonó en el vector de expresión de E. coli pQE60, que se restringió con NcoI y HindIII.
Fueron necesarias dos reacciones de PCR para preparar el mutante C-37/C-106. Se utilizaron los cebadores 5457 BspHI y 5455 para crear la región 5' del mutante, que contenía cisteína para sustitución por serina, y se usó el cebador 5456 y 5258 HindIII para crear la región 3' del mutante que contenía cisteína 106 para sustitución por serina. En la segunda reacción, se usó el cebador 5457 BspHI como cebador 5' y se usó el cebador 5258 HindIII como cebador 3' para crear el mutante C-37/C-106 usando 1 \mul de cada una de las reacciones iniciales juntos como modelo. Este producto de PCR se restringió con BspHI y HindIII, y se clonó en pQE60 que había sido restringido con NcoI y HindIII. El clon resultante se muestra en la Figura 35 (SEC ID NO:84).
Secuencias de los cebadores de mutante de cisteína:
7
Ejemplo 15 Producción y purificación de KGF-2 (FGF-12)
La secuencia de DNA que codifica la proteína madura optimizada, descrita en el Ejemplo 12B (es decir, aminoácidos T36 a S208 de KGF-2) se clonó en el plasmidio pQE-9 (Qiagen). Se cultivó E. coli (M15/rep4; Qiagen) hasta fase estacionaria durante una noche a 37ºC en LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml de kanamicina. Este cultivo se utilizó para inocular medio LB fresco que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml de kanamicina, a una dilución de 1:50. Las células se cultivaron a 37ºC hasta una D.O._{595} de 0,7, inducidas por la adición de isopropil-1-tio-\beta-D-galactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM. Después de 3-4 horas, las células se cosecharon por centrifugación y se resuspendieron en un tampón que contenía NaPO_{4} 60 mM y NaCl 360 mM en una relación de 5 volúmenes de tampón:1 volumen de pasta celular. Tras la disrupción en un Mautin Gaulin, se extracto se ajustó a pH 8,0 mediante la adición de NaOH y se clarificó por centrifugación.
El extracto soluble clarificado se aplicó a una columna Poros HS-50 (2,0X10,0 cm; PerSeptive Biosystems, Inc.) y las proteínas fijadas se eluyeron por etapas con NaPO_{4} 50 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 0,5 M, 1,0 M y 1,5 M. El KGF-2 eluyó en la fracción de sal 1,5 M que, seguidamente, se diluyó cinco veces con NaPO_{4} 50 mM, pH 6,5, hasta una concentración salina final de 300 mM. Esta fracción que contenía KGF-2 se hizo pasar entonces, de forma secuencial, a través de una columna Poros HQ-20 (2,0X7,0 cm; PerSeptive Biosystems, Inc.) y, luego, se fijó a una columna Poros CM-20 (2,0X9,0 cm, PerSeptive Biosystems, Inc.). Las fracciones que contenían KGF-2 (FGF-12) que eluyeron con NaCl a aproximadamente 500 a 750 mM se reunieron, diluyeron y re-aplicaron a una columna CM-20 para concentrar. Por último, la proteína se separó sobre una columna de filtración sobre gel (S-75; Pharmacia) en NaOAc 40 mM, pH 6,5; NaCl 150 mM (Lote E-5). De manera alternativa, la columna de filtración sobre gel se hizo funcionar con solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS, Lote E-4). Las fracciones que contenían KGF-2 se reunieron y se determinó la concentración en proteína por Ensayo Proteico Bio-Rad. Se consideró que las proteínas eran puras en >90% por SDS-PAGE. Por último, los niveles de endotoxinas, determinados por Limulus Amebocyte Lysate Assay (Cape Cod Associates) demostraron ser \leq 1 UE/mg. Las proteínas preparadas de esta forma pudieron fijar heparina, que es una marca característica de los miembros de la familia FGF.
Ejemplo 16 A. Construcción de mutante por deleción N-terminal KGF-2 \Delta33
Para incrementar el nivel de expresión de KGF-2 en E. coli, y potenciar las propiedades de solubilidad y estabilidad de KGF-2 expresado en E. coli, se generó una variante por deleción KGF-2 \Delta33 (KGF-2 aa 69-208), que elimina los primeros 68 aminoácidos del KGF-2 pre-procesado. El motivo para crear esta variante de deleción se basó en las siguientes observaciones. En primer lugar, KGF-2 maduro (KGF-2 aa 36-208) contiene un número impar (tres) de residuos de cisteína, que pueden conducir a la agregación debido a la formación intramolecular de puentes disulfuro. La variante de deleción KGF-2 \Delta33 contiene solamente dos residuos de cisteína, lo que reduce el potencial de formación intramolecular de puentes disulfuro y subsiguiente agregación. Un descenso de la agregación debería dar lugar a un incremento del rendimiento de proteína KGF-2 activa. En segundo lugar, la variante de deleción de KGF-2 elimina un tramo de poli-serina, que no está presente en KGF-1 y no parece ser importante para la actividad, pero que sí puede impedir la expresión de la proteína en E. coli. De esta forma, la eliminación del tramo de poli-serina puede aumentar los niveles de expresión de la proteína KGF-2 activa. En tercer lugar, la expresión de KGF-2 \Delta33 en E. coli da lugar a una escisión natural de KGF-2 entre los residuos 68 y 69. Por lo tanto, se prevé que KGF-2 \Delta33 sea procesado eficazmente y sea estable en E. coli.
Construcción de KGF-2 \Delta33 en pQE6
Para permitir la amplificación dirigida por la Reacción en cadena de la polimerasa y la sub-clonación de KGF-2 \Delta33 en el vector de expresión de proteínas de E. coli, pQE6, se sintetizaron dos cebadores oligonucleótidos (5952 y 19138) complementarios a la región deseada de KGF-2, con la siguiente secuencia de bases.
Cebador 5952: 5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'
Cebador 19193: 5' GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT 3'
En el caso del cebador N-terminal (5952), se incorporó un sitio de restricción AfIIII, mientras que en el caso del cebador C-terminal (19138), se incorporó un sitio de restricción HindIII. El cebador 5952 contiene también una secuencia ATG adyacente y en marco con la región de codificación de KGF-2, para permitir la traducción del fragmento clonado en E. coli, en tanto que el cebador 19138 contiene dos codones de detención (utilizados preferentemente en E. coli), adyacentes y en marco con la región de codificación de KGF-2, que garantiza la correcta terminación de traducción en E. coli.
La Reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo usando condiciones estándares, bien conocidas para los expertos en la técnica, y la secuencia de nucleótidos para el KGF-2 maduro (aa36-208) (construida en el Ejemplo 12C) como modelo. El amplicón resultante se digirió con restricción con AfIIII y HindIII y se sub-clonó en el vector de expresión de proteínas pQE6 digerido con NcoI/HindIII.
Construcción de KGF-2 \Delta33 en pHE1
Para permitir la amplificación dirigida por Reacción en cadena de la polimerasa y la sub-clonación de KGF-2 \Delta33 en el vector de expresión de E. coli, pHE1, se sintetizaron dos cebadores oligonucleótidos (6153 y 6150) correspondientes a la región deseada de KGF-2, con la siguiente secuencia de bases.
Cebador 6153: 5' CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG 3'
Cebador 6150: 5' CCGGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGG 3'
En el caso de cebador N-terminal (6153) se incorporó un sitio de restricción NdeI, mientras que en el caso del cebador C-terminal (6150), se incorporó un sitio de restricción Asp718. El cebador 6153 contiene también una secuencia ATG adyacente y en marco con la región de codificación de KGF-2 para permitir la traducción del fragmento clonado en E. coli, en tanto que el cebador 6150 contiene dos codones de detención (utilizados preferentemente en E. coli) adyacentes y en marco con la región de codificación de KGF-2, que garantiza una correcta terminación de traducción en E. coli.
La Reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo usando condiciones estándares bien conocidas para los expertos en la técnica y la secuencia de nucleótidos para el KGF-2 maduro (aa36-208) (construido en el Ejemplo 12C) como modelo. El amplicón resultante se digirió con restricción con NdeI y Asp718 y se sub-clonó en el vector de expresión de proteínas pHE1 digerido con NdeI/Asp718.
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Secuencia de nucleótidos de KGF-2 \Delta33:
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Secuencia de aminoácidos de KGF-2 \Delta33:
9
B. Construcción de un KGF-2 \Delta33 optimizado
Al objeto de aumentar los niveles de expresión de KGF-2 \Delta33 en E. coli, se optimizaron los codones del gen completo para hacerlos comparables a los más altamente utilizados en E. coli. Dado que el modelo utilizado para generar el KGF-2 \Delta33 tenía sus codones optimizados dentro de la región N-terminal, fue preciso optimizar los aminoácidos C-terminales (84-208).
En primer lugar, se optimizaron los codones de los aminoácidos 172-208 para generar KGF-2 \Delta33 (S172-208). Esto se consiguió mediante una estrategia de PCR solapada. Se combinaron y templaron los oligonucleótidos PM07 y PM08 (correspondientes a los aminoácidos 172-208), calentándolos juntos a 70ºC y dejándolos enfriar a 37ºC. Los oligonucleótidos templados se utilizaron entonces como modelo para una reacción de PCR estándar, dirigida por los cebadores PM09 y PM10. En una reacción de PCR separada, bajo condiciones estándares bien conocidas para los expertos en la técnica y utilizando KGF-2 \Delta33 como modelo, se usaron los oligonucleótidos PM05 (que se solapa con el sitio Pst1 dentro de la región de codificación de KGF-2) y PM11 para amplificar la región de KGF-2 correspondiente a los aminoácidos 84.172. En una tercera reacción de PCR, se combinaron el producto de la primera reacción de PCR (correspondiente a los aminoácidos con codones optimizados 172-208) y el producto de la segunda reacción de PCR (correspondiente a los aminoácidos con codones optimizados 84-172) y se usaron como modelo para una reacción de PCR estándar, dirigida por los oligonucleótidos PM05 y PM10. El amplicón resultante se digirió con PstI/HindIII y se sub-clonó en pQE6-KGF-2 \Delta33 digerido con PstI/HindIII, sustituyendo eficazmente la región no optimizada en codones, y creando pQE6-KGF-2 \Delta33 (sl 172-208).
Para completar la optimización de codones de KGF-2, se generó un codón de gen sintético, optimizado para la región de KGF-2 correspondiente a los aminoácidos 84-172, utilizando oligonucleótidos solapados. En primer lugar, se combinaron cuatro oligonucleótidos (PM31, PM32, PM33 y PM34) y se realizaron siete ciclos de la siguiente PCR: 94ºC, 30 seg; 46,5ºC, 30 seg; y 72ºC, 30 seg.
Se llevó a cabo, entonces, una segunda reacción de PCR, dirigida por cebadores PM35 y PM36, según procedimientos estándares, utilizando 1 \mul de la primera reacción de PCR como modelo. El fragmento génico resultante, con codones optimizados, se digirió entonces con Pst1/Sali y se sub-clonó en pQE6-KGF-2 \Delta33 (s 172-208) digerido con Pst1/Sal1, para crear un gen codificador de KGF-2 completamente optimizado, pQE6-KGF-2 \Delta33s.
Para crear un vector de expresión de proteínas de E. coli alternativo, se amplificó por PCR KGF-2 \Delta33 utilizando los cebadores PM102 y PM130 sobre pQE6-KGF-2 \Delta33s. El amplicón resultante se digirió con NdeI y EcoRV y se sub-clonó en el vector de expresión pHE1, que había digerido con NdeI y Asp718 (extremo romo) para crear pHE1\Delta33s.
Secuencias de oligonucleótidos usadas en la construcción de KGF-2 \Delta33s con codones optimizados:
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Secuencia de nucleótidos de KGF-2 \Delta33 (s172-208):
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Secuencia de aminoácidos de KHG-2 \Delta33 (s172-208):
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C. Construcción del mutante por deleción N-terminal KGF-2 \Delta4
Para aumentar el nivel de expresión de KGF-2 en E. coli y potenciar las propiedades de estabilidad y solubilidad del KGF-2 expresado en E. coli, se construyó una variante de deleción KGF-2 \Delta4 (aminoácidos 39-208), que elimina los primeros 38 aminoácidos del KGF-2 pre-procesado, incluida la cisteína en posición 37. Puesto que la molécula de deleción resultante de KGF-2 contiene un número par de cisteínas, se deberían reducir los problemas debidos a la agregación causada por la formación intramolecular de puentes de disulfuro, dando como resultado un nivel potenciado de expresión de la proteína activa.
Para permitir la amplificación dirigida por Reacción en cadena de la polimerasa y la sub-clonación de KGF-2 \Delta4 en el vector de expresión de E. coli, pQE6, se sintetizaron dos cebadores oligonucleótidos (PM61 y 19138), con la siguiente secuencia de bases:
PM61: CGCGGCCATGGCTCTGGGTCAGGACATG
19138: GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT
En el caso del cebador N-terminal (PM61), se incorporó un sitio de restricción NcoI, mientras que en el cebador C-terminal (19138) se incorporó un sitio de restricción HindIII. PM61 contiene también una secuencia ATG adyacente y en marco con la región de codificación de KGF-2, para permitir la traducción del fragmento clonado en E. coli, en tanto que 19138 contiene un codón de detención (utilizado preferentemente en E. coli), adyacente a y en marco con la región de codificación de KGF-2 que garantiza una correcta terminación de traducción en E. coli.
La Reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo usando condiciones estándares bien conocidas para los expertos en la técnica y el KGF-2 de longitud total (aa36-208) como modelo (construido en el Ejemplo 12C). El amplicón resultante se digirió con restricción con NcoI y HindIII y se sub-clonó en el vector de expresión de proteína pQE6 digerido con NcoI/HindIII.
Secuencia de nucleótidos de KGF-2 \Delta4:
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Secuencia de aminoácidos de KGF-2 \Delta4:
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Ejemplo 17 Cicatrización estimulada por KGF-2 \Delta33 en la rata normal
Para demostrar que KGF.2 \Delta33 es capaz de acelerar el proceso de cicatrización, se examinó la cicatrización de heridas usando el modelo siguiente.
Se produce en ratas Sprague-Dawley (n=5) una herida por escisión dorsal de 6 mm con un sacabocados de piel de Keyes. Las heridas se dejan descubiertas y se tratan de forma tópica con diversas concentraciones de KGF-2 \Delta33 (en NaOAc 40 mM y NaCl 150 mM, tampón a pH 6,5) y tampón (NaOAc 40 mM y NaCl 150 mM, pH 6,5), durante 4 días, a partir del día en que se provocó la herida. Las heridas se miden diariamente, usando un calibre calibrado de Jameson. El tamaño de la herida se expresa en milímetros cuadrados. El último día, las heridas se midieron y cosecharon para posteriores análisis. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado (media \pm EE). Los parámetros de evaluación incluyen cierre porcentual de las heridas, puntuación histológica (1-3, acumulación celular mínima, ausencia de granulación; 4-6, granulación inmadura, células inflamatorias, capilares; 7-9, tejido de granulación, células, fibroblastos, nuevo epitelio; 10-12, dermis madura con fibroblastos, colágeno, epitelio), re-epitelización e inmunohistoquímica.
A los tres días después de la herida, el tratamiento con KGF-2 \Delta33 mostró una reducción del tamaño de la herida (30,4 mm^{2} con 4 \mug, p=0,006, 33,6 mm^{2} con 1 \mug, p=0,0007), en comparación con el control de tampón de 38,9 mm^{2}. A los cuatro días después de la herida, el tratamiento con KGF-2 \Delta33 evidenció una reducción del tamaño de la herida (27,2 mm^{2} con 0,1 \mug, p=0,02, 27,9 mm^{2} con 0,4 \mug, p=0,04), comparado con el control de tampón de 33,8 mm^{2}. AL quinto día después de la herida, el tratamiento con KGF-2 \Delta33 puso de manifiesto una reducción del tamaño de la herida (18,1 mm^{2}) con 4 \mug, p=0,02, en comparación con el control de tampón de 25,1 mm^{2}. Véase la Figura 36.
Tras la cosecha de la herida del día 56, se evaluaron parámetros adicionales. KGF-2 \Delta33 mostró un incremento en el porcentaje de cierre de la herida con 4 \mug (71,2%, p=0,02), en comparación con el control de tampón, 60,2%. La administración de KGF-2 \Delta33 da también como resultado una mejoría de la puntuación histológica con 1 y 4 \mug (8,4 con 1 \mug, p=0,005, 8,5 con 4 \mug, p=0,04) en relación con el control de tampón de 6,4. También mejoró la re-epitelización con 1 y 4 \mug de KGF-2 \Delta33 (1389 \mum con 1 \mug, p=0,007, 1220 \mum con 4 \mug, p=0,02), en relación con el control de tampón, de 923 \mum. Véase la Figura 37.
Este estudio demuestra que el tratamiento diario con KGF-2 \Delta33 acelera la velocidad de cicatrización en animales normales, como lo demuestra la disminución del área bruta de la herida. Además, la evaluación histológica de las muestras de la herida y la evaluación de la re-epitelización pone de manifiesto también que KGF-2 \Delta33 mejora la velocidad de cicatrización en este modelo de rata normal.
Ejemplo 18 Efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la resistencia a la tensión y espesor de la epidermis en la rata normal
Para demostrar que KGF-2 \Delta33 es capaz de incrementar la resistencia a la tensión y el espesor de la epidermis en las heridas, se llevó a cabo el siguiente experimento.
Se produce una herida de incisión, de espesor total y 2,5 cm, en la línea media del dorso de ratas Sprague-Dawley machos (n=8 ó 9). La incisión cutánea se cierra usando 3 grapas metálicas para la piel, equidistantes. Se aplicó de forma tópica tampón (NaAOc 40 mM y NaCl 150 mM, pH 6,5) o KGF-2 \Delta33 (en tampón de NaOAc 40 mM y NaCl 150 mM, pH 6,5) en el momento de producir la herida. El día 5 se cortan cuatro tiras de la herida, con un ancho de 0,5 cm. Las muestras se utilizan para el estudio de la resistencia a la rotura, empleando un tensiómetro cutáneo Instron®, para la determinación de hidroxiprolina y evaluación histopatológica. La resistencia a la rotura se definió como la máxima fuerza soportada por cada herida antes de la rotura. El análisis estadístico se realizó usando un test t no apareado (media \pm EE).
En el modelo de incisión en la piel de rata, KGF-2 \Delta33 aplicado tópicamente exhibió un incremento estadísticamente significativo de la resistencia a la rotura, resistencia a la tensión y espesor de la epidermis, como resultado de una única aplicación dentro de la incisión subsiguiente a la creación de la herida. En un estudio, la resistencia a la rotura de las heridas tratadas con KGF-2 con 1, 4 y 10 \mug fue significativamente superior comparada con los controles que recibieron tampón (107,3 g con 1 \mug, p=0,0006, 126,4 g con 4 \mug, p<0,0001, 123,8 g con 10 \mug, p<0,0001). Véase la Figura 38.
El espesor de la epidermis se evaluó a microscopia óptica sobre secciones Masson Trichrome. Las heridas tratadas con KGF-2 \Delta33 mostraron un engrosamiento epidérmico aumentado (60,5 \mu con 1 \mug, 66,51 \mu con 4 \mug, p=0,01, 59,6 \mu con 10 \mug), frente a los controles de tampón, con 54,8 \mu. Véase la Figura 39.
Estos estudios demuestran que una única aplicación dentro de la incisión de KGF-2 aumenta y acelera el proceso de cicatrización, que se distingue por un incremento de la resistencia a la rotura y del espesor epidérmico de las heridas de incisión.
Ejemplo 19 Efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la piel de ratas normales
Con el fin de determinar el efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la piel de la rata normal tras la inyección intradérmica, se realizó el siguiente experimento.
Ratas SD machos adultas (n=3) recibieron, el día 0, seis inyecciones intradérmicas de placebo o KGF-2 \Delta33 (en tampón de NaOAc 40 mM y NaCl 150 mM, pH 6,5), en una concentración de 1 y 4 \mug en 50 \mul. Se inyectó en los animales 5-2'-bromo-desoxirudina (BrdU) (100 mg/kg, i.p.) dos horas antes del sacrificio a las 24 y 48 horas. Se midió el espesor de la epidermis desde la capa granular hasta el fondo de la capa basal. Se realizaron, aproximadamente, 20 mediciones a lo largo del sitio de la inyección, cuantificando el espesor medio. Las mediciones se determinaron empleando un micrómetro calibrado sobre secciones teñidas con Masson Trichrome bajo microscopia óptica. La puntuación de BrdU se llevó a cabo por dos observadores ciegos, bajo microscopia óptica, usando el siguiente sistema de puntuación: 0-3, nulas a mínimas células marcadas con BrdU; 4-6, marcado moderado; 7-10, células intensamente marcadas. Los animales fueron sacrificados 24 y 48 horas después de la inyección. El análisis estadístico se efectuó usando un test t no apareado (media \pm EE).
La piel tratada con KGF-2 \Delta33 mostró un engrosamiento incrementado de la epidermis a las 24 horas (32,2 \mu con 1 \mug, p<0,001, 35,4 \mu con 4 \mug, p<0,0001) en comparación con el control de tampón, de 27,1 \mu. A las 48 horas, la piel tratada con KGF-2 \Delta33 mostró un engrosamiento incrementado de la epidermis (34 \mu con 1 \mug, p=0,0003, 42,4 \mu con 4 \mug, p<0,0001), comparado con el control de tampón de 27,8 \mu. Véase la Figura 40. La piel tratada con KGF-2 \Delta33 mostró también un inmunomarcado aumentado de BrdU a las 48 horas (4,73 con 1 \mug, p=0,07, 6,85 con 4 \mug, p<0,0001), en comparación con el control de tampón de 3,33. Véase la Figura 41.
Estos estudios demuestran que una inyección intradérmica de KGF-2 aumenta y acelera el engrosamiento de la epidermis. Por lo tanto, KGF-2 podría utilizarse para prevenir o aliviar las arrugas, mejorar la piel envejecida y reducir las cicatrices o mejorar la cicatrización en cirugía estética. Además, KGF-2 se puede usar de forma profiláctica para prevenir o reducir la mucositis oral (úlceras bucales), y la inflamación intestinal en respuesta a la quimioterapia u otros agentes.
Ejemplo 20 Efecto antiinflamatorio de KGF-2 sobre el edema de la pata inducido por PAF
Para demostrar un efecto antiinflamatorio de KGF-2, se llevó a cabo el siguiente experimento, usando el modelo de inflamación por edema de la pata, inducido por PAF.
Grupos de cuatro ratas Lewis (190-210 g) recibieron inyecciones subcutáneas en la almohadilla de la pata posterior derecha de 120 \mul de una solución que contenía 2,5 nmol de PAF, junto con los siguientes reactivos: 125 \mug de Ckb-10(B5), 24 \mug de LPS, 73 \mug de KGF-2 (Thr(36) - Ser(208) de la Figura 1 (SEC ID NO:2) con una Met N-terminal), o ninguna proteína. La pata posterior izquierda recibió la misma cantidad de tampón, para usarla como control paralelo. El volumen de la pata se cuantificó inmediatamente antes ó 30 y 90 minutos después de la inyección de PAF, usando un sistema de pletismógrafo. Se calcularon las variaciones porcentuales (%) del volumen de la pata.
Reactivos de ensayo en los experimentos nº 1 y nº 2 
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Como se muestra en la Figura 42, las patas posteriores derechas inyectadas con PAF solo exhibieron un incremento significativo de volumen (75 ó 100% para el experimento nº 1 ó 2, respectivamente), 0,5 horas después de la inyección, tal como se esperaba; en tanto, las patas posteriores izquierda, que recibieron tampón, o las patas posteriores derechas que recibieron LPS o SEB solo mostraron escasos signos de edema (datos no mostrados). Sin embargo, al administrar KGF-2 junto con PAF por vía local, se produjo una reducción sustancial (25 ó 50% para el experimento nº 1 ó 2, respectivamente) del volumen de la pata, en comparación con las patas inyectadas con PAF solo. La reducción del edema de la pata no se observó en los animales que recibieron PAF junto con Ckb-10 (una proteína diferente), LPS o SEB (dos mediadores de la inflamación). Estos resultados permiten suponer que el efecto antiinflamatorio de KGF-2 es específico y no se debe a alguna naturaleza no específica de la proteína.
Efecto de KGF-2 \Delta33 sobre el edema de la pata, inducido por PFA, en la rata
Después de los experimentos anteriormente descritos con KGF-2 \Delta33 para confirmar sus actividades biológicas in vitro en la estimulación de la proliferación de queratinocitos y su efecto in vivo sobre la cicatrización de heridas, KGF-2 \Delta33 se evaluó, adicionalmente, en el modelo del edema de la pata de la rata, inducido por PAF. Grupos de cuatro ratas Lewis (190-210 g) recibieron una inyección subcutánea en la almohadilla de la pata posterior derecha 120 \mul de solución que contenía 2,5 nmol de PAF, junto con 210 \mug de KGF-2 \Delta33 o albúmina. La para posterior izquierda recibió la misma cantidad de tampón, albúmina o KGF-2 \Delta33 solo, para actuar como control paralelo. El volumen de la pata se cuantificó a diversos intervalos tras la inyección de PAF, usando un sistema de pletismografía. Se calculó la variación porcentual (%) del volumen de la pata.
Como se muestra en la Figura 43, las patas posteriores derechas inyectadas con PAF exhibieron un incremento significativo (75%) de volumen, 0,5 horas después de la inyección, como era de esperar; en tanto, las patas posteriores izquierdas, que recibieron tampón, albúmina o KGF-2 \Delta33 solo mostraron escasos signos de edema. No obstante, al administrar KGF-2 \Delta33 junto con PAF por vía local, hubo una reducción sustancial (promedio, 20%) del volumen de la pata, en comparación con las patas inyectadas con PAF y albúmina, a lo largo de todo el experimento, que finalizó en 4 horas. Estos resultados confirman la propiedad antiinflamatoria de KGF-2 \Delta33.
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Reactivos de ensayo 
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Por lo tanto, KGF-2 resulta útil en el tratamiento de trastornos agudos o crónicos en los que la inflamación representa una patogénesis clave de la enfermedad, incluida, pero no limitada a, psoriasis, eccema, dermatitis y/o artritis.
Ejemplo 21 Efecto de KGF-2 \Delta33 en el modelo de anastomosis bilateral de colon en la rata
El presente ejemplo demuestra que KGF-2 \Delta33 aumentará la velocidad de reparación intestinal en un modelo de anastomosis intestinal o de colon en ratas Wistar o Sprague Dawley.
El uso de ratas en la anastomosis experimental es un modelo bien caracterizado, relevante y reproducible de la cicatrización de heridas quirúrgicas. Este modelo se puede extender también a estudiar los efectos de los tratamientos crónicos con esteroides, o de los efectos de distintos regímenes quimioterapéuticos sobre la calidad y velocidad de cicatrización de las heridas quirúrgicas en el colon e intestino delgado (Mastboom, W.J.B. et al., Br. J. Surg. 78:54-56 (1991), Salm, R. et al., J. Surg. Oncol. 47:5-11 (1991); Weiber, S. et al., Eur. Surg. Res. 26:173-178 (1994)). La cicatrización de anastomosis es similar a la de cualquier otro lugar del cuerpo. Las fases precoces de la cicatrización se distinguen por una inflamación aguda, seguida de proliferación de fibroblastos y síntesis de colágeno. El colágeno se va remodelando gradualmente y la herida desarrolla más resistencia a medida que se sintetiza nuevo colágeno (Koruda, M.J. y Rolandelli, R.H., J. Surg. Res., 48:504-515 (1990). La mayoría de las complicaciones postoperatorias, tales como filtración de la anastomosis, se produce durante los primeros días tras la cirugía, un período durante el cual la resistencia del colon depende principalmente de la capacidad de la herida para mantener las suturas. Se ha informado de que la capacidad de mantenimiento de las suturas del tracto GI disminuye en hasta 80% durante los primeros días del postoperatorio (Hogstrom, H. y Haglund, U., Acta Chir, Scand. 151:533-535 (1985), Jonson, K. et al., Am. J. Surg. 145:800-803 (1983)).
Se anestesiaron ratas SD machos adultas (n=5) con una combinación de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) por vía intramuscular. Se abrió la cavidad abdominal con una incisión de 4 cm de longitud en la línea media. Se seccionó un segmento de 1 cm de ancho del colon izquierdo, 3 cm proximal a la reflexión peritoneal, conservando los vasos marginales. Se practicó una anastomosis de capa única, de un extremo a otro, con 8-10 suturas invertidas e interrumpidas de Vicryl 5-0 para restaurar la continuidad intestinal. Seguidamente, la anastomosis se trató de forma tópica, a través de una jeringuilla, con tampón o KGF-2 \Delta33, a concentraciones de 1 y 4 \mug. La herida de incisión se cerró con una sutura continua de seda 3-0 para la capa muscular, y con grapas quirúrgicas para la piel. A continuación, los tratamientos se administraron diariamente y consistieron en tampón o KGF-2 \Delta33, a dosis de 1 y 5 mg/kg, s.c. Se determinaron los pesos el día de la intervención y diariamente de ahí en adelante. Los animales fueron sacrificados por eutanasia 24 horas después del último tratamiento (día 5). Los animales fueron anestesiados y recibieron enemas de bario, realizando radiografías a una distancia establecida. El análisis radiológico, tras la administración intracolónica, realizado por 2 observadores ciegos, reveló que los grupos tratados con KGF-2 \Delta33 mostraron 1) un índice reducido de filtración de bario en el sitio quirúrgico, 2) menor grado de constricción en el sitio de la cirugía, y 3) un incremento de la presencia de granulados fecales distales al sitio quirúrgico.
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Anastomosis del colon Análisis radiológico 
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Ejemplo 22 Construcción de mutaciones carboxi-terminales de KGF-2
El extremo carboxilo de KGF-2 está altamente cargado. La densidad de estos residuos cargados puede afectar a la estabilidad y, en consecuencia, a la solubilidad de la proteína. Para producir muteínas capaces de estabilizar la proteína en solución, se creó una serie de mutaciones en esta región del gen.
Para crear mutantes puntuales 194 R/E, 194 R/Q, 191 K/E, 191 K/Q, 188 R/E, 188 R/Q, se utilizó el cebador 5952 KGF\Delta33 5' Afl III 5' con los cebadores 3' indicados, que contienen las mutaciones puntuales apropiadas para KGF-2, en reacciones de PCR bajo condiciones estándares bien conocidas para los expertos en la técnica, con KGF-2 \Delta33 como modelo. Los productos resultantes se restringieron con AflIII y HindIII y se clonaron en el vector de expresión de E. coli, pQE60, restringido con NcoI y HindIII.
Construcción de KGF-2 \Delta33, 194 R/E:
Se utilizaron los siguientes cebadores:
5952 KGF \Delta 33 5' Afl III:
5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'
KGF-2 3'HindIII 194aa R a E:
5' CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTTTCTCGTGTT
TTCTGTCC 3'
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Secuencia de nucleótidos de KGF-2 \Delta33, 194 R/E:
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20 
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Secuencia de aminoácidos de KGF-2 \Delta33, 194 R/E:
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21 
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Construcción de KGF-2 \Delta33, 194 R/Q:
Se usaron los siguientes cebadores:
5952 KGF \Delta33 5' Afl III:
5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'
KGF-2 3' HindIII 194aa R a Q:
5' CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCTGTCGTGTT
TTCTGTCC 3'
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Secuencia de nucleótidos de KGF-2 \Delta33, 194 R/Q:
22
Secuencia de aminoácidos de KGF-2 \Delta33, 194 R/Q:
23
Construcción de KGF-2 \Delta33, 191 K/E:
Se utilizaron los siguientes cebadores:
5952 KGF \Delta33 5' Afl III:
5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'
KGF-2-3' HindIII 191aa K a E:
5' CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGT
TTCCTGTCCTCTCTCCTTGG 3'
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Secuencia de nucleótidos de KGF-2 \Delta33, 191 K/E:
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24 
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Secuencia de aminoácidos de KGF-2 \Delta33, 191 K/E:
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25 
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Construcción de KGF-2 \Delta33, 191 K/E:
Se usaron los siguientes cebadores:
5952 KGF \Delta33 5' Afl III:
5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'
KGF-2 3' hINDiii 191AA k A q
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26 
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Secuencia de nucleótidos de KGF-2 \Delta33, 191 K/Q:
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27 
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Secuencia de aminoácidos de KGF-2 \Delta33, 191 K/Q:
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28 
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Construcción de KGF-2 \Delta33, 188 R/E:
Se usaron los siguientes cebadores:
5952 \Delta33 5' Afl III:
5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'
KGF-2 3' HindIII 188aa R a E:
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29 
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Secuencia de nucleótidos de KGF-2 \Delta33, 188 R/E:
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30 
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Secuencia de aminoácidos de KGF-2- \Delta33, 188 R/E:
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31 
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Construcción de KGF-2 \Delta33, 188 R/Q:
Se usaron los siguientes cebadores:
5952 KGF \Delta33 5' Afl III:
5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'
KGF-2-3' HindIII 188aa R a Q:
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32 
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Secuencia de nucleótidos de KGF-2 \Delta33, 188 R/Q:
33
Secuencia de aminoácidos de KGF-2 \Delta33, 188 R/Q:
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34 
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Construcción de KGF-2 \Delta33, 183 K/E
Para la mutación 183 K/E, se establecieron dos reacciones de PCR para la mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótidos de esta lisina. En una reacción, se usó 5952 KGF \Delta33 5' AflIII como cebador 5', y se utilizó KGF-2 183aa K a E antisentido como cebador 3' en esta reacción. En una segunda reacción, se usó KGF-2 5' 183aa K a E sentido como cebador 5', y se utilizó KGF-2 3' HindIII TAA detención como cebador 3'. Se empleó KGF-2 \Delta33 como modelo para estas reacciones. Las reacciones se amplificaron bajo condiciones estándares, bien conocidas para los expertos en la técnica. Se utilizó 1 microlitro de cada una de estas reacciones de PCR como modelo en una reacción subsiguiente, usando como cebador 5' 5453 BspHI, y como cebador 3', 5258 HindIII. La amplificación se llevó a cabo usando condiciones estándares bien conocidas para los expertos en la técnica. El producto resultante se restringió con Afl III y HindIII y se clonó en el vector de expresión de E. coli, pQE60, que se restringió con NcoI y HindIII.
Se utilizaron los siguientes cebadores:
5952 KGF \Delta33 5' Afl III:
5' GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3'
KGF-2 5' a83aa K a E sentido:
5' TTGAATGGAGAAGGAGCTCCA 3'
KGF-2 183aa K a E antisentido:
5' TGGAGCTCCTTCTCCATTCAA 3'
KGF-2- 3' HindIII TAA detención:
5' CTGCCCAAGCTTTTATGAGTACCACCATTGG 3'
Secuencia de nucleótidos de KGF-2 \Delta33, 183 K/E:
35
36 
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Secuencia de aminoácidos de KGF-2 \Delta33, 183 K/E:
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Ejemplo 23 Efecto de KGF-2 sobre la supervivencia tras la irradiación de cuerpo entero en ratones Balb/c
Con frecuencia, se utilizan radiaciones ionizantes para tratar muchos tumores, incluidos los cánceres de pulmón y mama, linfomas y tumores pélvicos (Ward, W.F. et al., CRC Handbook of Animal Models of Pulmonary Disease, CRC Press, págs. 165-195 (1989)). Sin embargo, las lesiones inducidas por la radiación (pulmón, intestino, etc.) limitan la intensidad y el éxito de la radioterapia (Morgan, G.W. et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol.. Phys. 31:361 (1995)). La mucosa gastrointestinal tiene un rápido ciclo celular y es particularmente sensible a los agentes citotóxicos (Potten, C.S. et al., en: Cytotoxic Insult to Tissue, Churchill Livingstone, págs. 105-152 (1983)). Algunas de las manifestaciones de las lesiones inducidas por la radiación intestinal incluyen proctitis aguda, fibrosis intestinal, formación de estenosis o fístulas (Anseline, D.F. et al., Ann. Surg. 194:716-724 (1981)). Un tratamiento capaz de proteger las estructuras normales contra la radiación, sin alterar la radiosensibilidad del tumor, sería beneficioso en el tratamiento de estos trastornos. Independientemente de la región irradiada, la dosis de radiación está limitada por la radiosensibilidad del tejido normal. Las complicaciones tras la irradiación total o parcial del cuerpo incluyen neumonitis, fibrosis, lesiones gastrointestinales y alteraciones de la médula ósea.
Varias citoquinas, incluidas IL-1, TNF, IL-6, IL-12, han demostrado efectos radioprotectores tras la irradiación del cuerpo entero (TBI) (Neta, R. et al., J. Exp. Med. 173:1177 (1991)). Se ha demostrado que IL-11 protege a las células mucosas del intestino delgado tras radio-y quimioterapia combinada (Du, X.X. et al., Blood 83:33 (1994)) y la lesión torácica inducida por la radiación (Redlich, C.A. et al., The Journal of Immunology 157:1705-1710 (1996)).
Animales
Todos los experimentos se realizaron usando ratones Balb/c. Los animales se adquirieron a las 6 semanas de edad y tuvieron 7 semanas de edad al inicio del estudio. Todas las manipulaciones se efectuaron usando técnicas asépticas. El presente estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Human Genome Sciences, Inc, que revisó y aprobó el protocolo experimental.
KGF-2
La proteína consiste en una proteína humana de 141 aminoácidos, denominada KGF-2 \Delta33. Esta proteína es una isoforma truncada de KGF-2, que está exenta de los primeros 33 residuos amino-terminales de la proteína madura. El gen que codifica esta proteína se ha clonado en un vector de expresión de E. coli. Se utilizaron en el experimento fracciones que contenían más de 95% de materiales puros recombinantes. KGF-2 se formuló en un vehículo que contenía acetato de Na 40 mM + NaCl 150 mM, pH 6,5. Se realizaron diluciones de la solución madre, empleando el mismo vehículo.
Irradiación de cuerpo entero y diseño experimental
Los ratones fueron irradiados con 519 RADS (5,19 Gy), usando un Irradiador de Cesio Mark I Shepherd. KGF-2 \Delta33 se administró diariamente por vía subcutánea, empezando 2 días antes de la irradiación y continuando durante 7 días después de la misma. Se registraron los pesos diarios de todos los ratones. Se distribuyeron aleatoriamente grupos de ratones para recibir uno de los tres tratamientos: irradiación de cuerpo entero (TBI) más tampón, TBI más KGF-2 \Delta33 (1 mg/kg, s.c.), TBI más KGF-2 \Delta33 (5 mg/kg, s.c.). Se realizaron dos experimentos independientes.
Resultados
Se llevaron a cabo dos estudios usando animales irradiados. En el primer estudio, los animales fueron irradiados con 519 RADS (5,19 Gy). Los animales se trataron con tampón o KGF-2 \Delta33 a 1 y 5 mg/kg, s.c. desde dos días antes de la irradiación y, a continuación, diariamente durante 7 días. El día 25 después de la irradiación de cuerpo entero, sobrevivió en el grupo de tampón 1/5 animales. Por el contrario, los grupos tratados con KGF-2 tuvieron una supervivencia de 5/5 animales con 1 mg/kg y 4/5 con 5 mg/kg (Figura 44).
Además, los animales tratados con KGF-2 mostraron una ganancia ponderal de 0,9% y 5,3% el día 20 post-TBI. En contraste, el grupo tratado con tampón tuvo una pérdida de peso de 4,2% el día 20. Los animales de control, normales, no irradiados y comparables en edad, mostraron una ganancia de peso de 6,7% en el mismo período de tiempo (Figura 45).
Los animales del segundo estudio fueron irradiados también con 519 RADS (5,19 Gy). Estos animales se trataron con tampón o KGF-2 \Delta33, a dosis de 1 y 5 mg/kg, s.c., desde dos días antes de la irradiación y, a continuación, diariamente durante 7 días. El día 15 después de la irradiación de cuerpo entero, habían muerto todos los animales del grupo de tampón. La dosis de 1 mg/kg de KGF-2 tuvo un índice de supervivencia de 30% y la de 5 mg/kg, de 60%. El día 25 después de la TBI, el grupo de 1 mg/kg mostró una supervivencia de 20% y el de 5 mg/kg de 50%
(Figura 46).
Conclusiones
En resumen, estos resultados demuestran que KGF-2 tiene un efecto protector tras la TBI. La capacidad de KGF-2 para aumentar el índice de supervivencia en animales sometidos a TBI sugiere que podría ser útil también en las lesiones inducidas por la radiación y para aumentar la relación terapéutica de irradiación en el tratamiento de tumores.
Ejemplo 24 Evaluación de KGF-2 en el modelo TPA de inflamación cutánea en el ratón
Para demostrar que KGF-2 es capaz de atenuar la progresión de la dermatitis de contacto, se utiliza un modelo de inflamación cutánea en el ratón, inducida por acetato de tetradecanoilforbol (TPA). El uso del ratón Balb/c hembra y Swiss Webster macho en la inflamación cutánea experimental es un modelo bien caracterizado, relevante y reproducible de dermatitis de contacto. Estas razas de ratones han demostrado desarrollar una respuesta inflamatoria de larga duración, tras la aplicación tópica de TPA, que se compone de hemodinámica local, permeabilidad vascular y migración local de leucocitos, siendo estos cambios patológicos similares a los de la dermatitis humana (Rao et al., 1993, Inflammation 17(6):723, Rao et al, 1994, J. Kipid Mediators Cell Signalling, 10:213).
Grupos de ratones reciben vehículo o KGF-2 por vía intraperitoneal, subcutánea o intravenosa, 60 min después de la aplicación tópica de TPA (4 \mug/oreja), aplicado como solución en acetona (200 \mug/ml), 10 \mul en el interior y 10 \mul en el exterior de la oreja. El grupo de control recibe 20 \mul de acetona como aplicación tópica. Cuatro horas después de la aplicación de TPA, se mide el incremento del grosor de la oreja y ésta se corta para histología. Para determinar la permeabilidad vascular en respuesta a TPA, los ratones reciben una inyección intravenosa, a través de las venas caudales, de azul de Evans (300 mg/kg) a intervalos seleccionados tras la aplicación tópica de TPA y los ratones son sacrificados 15 min más tarde. Se cortan y retiran las orejas, se extraen luego en dimetilformamida y se centrifugan. Las lecturas de absorbancia se miden por espectrofotometría a 590 nm.
Ejemplo 25 Efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la cicatrización de heridas
Se examinaron los efectos biológicos de KGF-2 \Delta33 sobre la piel, basándose en los datos iniciales in vitro que demuestran la capacidad de KGF-2 para estimular los queratinocitos epidérmicos primarios humanos, así como las células BaF3 pro-B de ratón, transfectadas con la isoforma 2iiib de FGFR. Se realizaron experimentos iniciales para determinar los efectos biológicos de KGF-2 \Delta33 tras la administración intradérmica. Después de los estudios intradérmicos, se analizó KGF-2 \Delta33 en una variedad de modelos de cicatrización de heridas (incluidas las heridas por biopsia en sacabocados de espesor completo y las heridas por incisión) para determinar su potencial como agente cicatrizante.
Efecto de KGF-2 \Delta33 en un modelo de cicatrización alterada por glucocorticoides en la rata
La cicatrización alterada es un importante problema clínico asociado con una serie de situaciones patológicas tales como la diabetes, siendo, además, una complicación de la administración sistémica de esteroides o antimetabolitos. Se sabe que el tratamiento con glucocorticoides sistémicos altera la cicatrización de heridas en el ser humano y en modelos animales de reparación de tejidos. Tras la administración de glucocorticoides se ha observado una reducción de los niveles de monocitos circulantes y una inhibición de la síntesis de procolágeno. Por consiguiente, la fase inflamatoria de la cicatrización y la síntesis de matriz son factores importantes que intervienen en el complejo proceso de la reparación de tejidos. En el presente estudio, se evaluaron los efectos de múltiples aplicaciones tópicas de KGF-2 sobre heridas cutáneas por escisión, de espesor completo, en ratas en las que la cicatrización se ha alterado por la administración sistémica de metilprednisolona.
Ratas Sprague Dawley (n=5/grupo de tratamiento) recibieron heridas dorsales de 8 mm y metilprednisolona (17 mg/kg, i.m.) para alterar la cicatrización. Las heridas se trataron de forma tópica a diario con tampón o KGF-2 a dosis de 0,1, 0,5 y 1,5 \mug en un volumen de 50 \mul. Las heridas se midieron los días 2, 4, 6 y 8 usando un calibre calibrado de Jameson. El día 6 (datos no mostrados) y el día 8 (Figura 47), los grupos tratados con KGF-2 mostraron una reducción estadísticamente significativa del cierre de las heridas, en comparación con el control de tampón.
Efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la cicatrización en el modelo del ratón diabético
En ratones hembras homocigóticas, genéticamente diabéticas (db+/db+), de 6 semanas de edad (n=6), de 30-35 g de peso, se practicó una herida dorsal de espesor total con un sacabocados de biopsia de 6 mm. Las heridas se dejaron descubiertas y se trataron diariamente con placebo o KGF-2 a dosis de 0,1, 0,5 y 1,5 \mug. El cierre de las heridas se determinó usando un calibre de Jameson. Los animales fueron sacrificados por eutanasia el día 10 y se analizaron las heridas para histología.
KGF-2 mostró una mejoría significativa del cierre porcentual de las heridas con 0,1 \mug (p=0,02), en comparación con placebo o con el grupo no tratado. La administración de KGF-2 dio también como resultado una mejoría de la puntuación histológica con 0,1 \mug (p=0,03), en comparación con placebo o con el grupo no tratado (p=0,01) y con 1,5 \mug (p=0,05), comparado con el grupo no tratado.
Conclusiones
Basándose en los resultados anteriores, KGF-2 muestra una actividad significativa en situaciones alteradas, tales como la administración de glucocorticoides y diabetes. Por lo tanto, KGF-2 puede resultar clínicamente útil en la estimulación de la cicatrización de heridas tras cirugía, úlceras crónicas en pacientes con diabetes o mala circulación (por ejemplo, insuficiencia venosa y úlceras venosas), quemaduras y otros trastornos de la cicatrización, tales como uremia, malnutrición, déficit de vitaminas y tratamiento sistémico con esteroides y medicamentos antineoplásicos.
Ejemplo 26 Efectos de KGF-2 \Delta33 sobre la mucosa bucal
Los agentes citotóxicos utilizados en clínica tienen el desagradable efecto de inhibir la proliferación del epitelio normal en algunas localizaciones, tal como la mucosa bucal, dando lugar a trastornos amenazantes para la vida de la barrera mucosa. Los presentes inventores han llevado a cabo estudios para examinar la eficacia de KGF-2 en esta área clínica. Los datos confirman un efecto terapéutico de KGF-2 en modelos de mucositis.
Efectos de KGF-2 \Delta33 sobre la mucosa bucal del hámster
Se intentó dilucidar si KGF-2 era capaz de inducir la proliferación del epitelio mucoso bucal normal. El efecto de KGF-2 sobre la mucosa bucal se evaluó en hámster Golden Syrian machos. Se trató diariamente la bolsa de la mejilla del hámster con tampón o KGF-2 \Delta33 (a dosis de 0,1, 1 y 10 \mug/carrillo), que se aplicaron tópicamente a los carrillos del hámster anestesiado en un volumen de 100 \mul por carrillo. El compuesto estuvo en contacto con el carrillo durante un mínimo de 60 segundos y fue posteriormente deglutido. Después de 7 días de tratamiento, se inyectó en los animales BrdU y se les sacrificó de la forma anteriormente descrita. Las células proliferantes se marcaron con anticuerpo anti-BrdU. La Figura 48 muestra que hubo un incremento significativo del marcado de BrdU (proliferación celular) cuando los animales fueron tratados con 1 \mug y 10 \mug de KGF-2 \Delta33 (en comparación con el tratamiento de tampón).
El tratamiento tópico con KGF-2 indujo la proliferación de células epiteliales mucosas normales. En base a estos resultados, KGF-2 se puede utilizar clínicamente en la prevención de la mucositis bucal causada por cualquier agente quimioterapéutico (u otros regímenes con medicamentos tóxicos), radioterapia, o cualquier régimen combinado de quimio y radioterapia. Además, KGF-2 puede resultar útil como agente terapéutico al reducir la intensidad de las lesiones de la mucosa bucal debidas a agentes tóxicos (quimioterapia) o radioterapia.
Ejemplo 27 Efecto de KGF-2 \Delta33 sobre la cicatrización isquémica en ratas
El objetivo de los experimentos que se exponen en este ejemplo fue determinar la eficacia de KGF-2 en la cicatrización de heridas usando un modelo de cicatrización isquémica.
El aporte de sangre a la piel local se interrumpió parcialmente mediante la elevación de un colgajo miocutáneo aleatorio de espesor completo con un solo pedículo (3x4 cm). Se practicó una herida de espesor total en la piel local, compuesta por el colgajo miocutáneo. Se utilizaron 60 ratas Sprague Dawley adultas, que se distribuyeron aleatoriamente a los grupos de tratamiento con KGF-2 \Delta33 y placebo para este estudio (5 animales/grupo/intervalo). Las heridas se estudiaron, respectivamente, en los días 1, 3, 5, 7, 10 y 15 después de la herida.
La resistencia a la rotura de la herida no mostró diferencias significativas entre los grupos tratados con KGF-2 y tampón en los momentos iniciales, hasta los días 10 y 15 después de la herida.
Los resultados indicaron que KGF-2 mejoró de forma significativa la resistencia a la rotura de la herida en la reparación isquémica 10 días después de la herida. Estos resultados señalan también que la isquemia retrasa el proceso de cicatrización en ambos grupos, comparados con los datos anteriormente obtenidos en estudios de cicatrización normal.
Este modelo de colgajo miocutáneo proporciona datos e información en situación de isquemia, resultante del retorno venoso. Estos resultados sugieren que KGF-2 podría utilizarse en el tratamiento de úlceras venosas crónicas de las piernas, causadas por un trastorno del retorno y/o insuficiencia venosa.
Ejemplo 28 Evaluación de KGF-2 en la cicatrización de la anastomosis del colon en ratas
Los resultados del presente experimento demuestran que KGF-2 \Delta33 incrementa la velocidad de reparación intestinal en un modelo de anastomosis intestinal o de colon en ratas Wistar o Sprague Dawley. Adicionalmente, este modelo se puede usar para demostrar que KGF-2 y sus isoformas aumentan la capacidad de la pared gastrointestinal o del colon para fijar suturas.
El uso de la rata en la anastomosis experimental es un modelo bien caracterizado, relevante y reproducible de cicatrización de heridas quirúrgicas. Este modelo se puede extender, asimismo, para estudiar los efectos del tratamiento crónico con esteroides o los efectos de diversos regímenes quimioterapéuticos sobre la calidad y velocidad de cicatrización de heridas quirúrgicas en el colon e intestino delgado (Mastboom, W.J.B. et al., Br. J. Surg, 78:54-56 (1991); Salm, R. et al., J. Surg. Oncol. 47:5-11 (1991); Weiber, S. et al., Eur. Surg. Res. 26:173-178 (1994)). La cicatrización de las anastomosis es similar a la de cualquier otra parte del cuerpo. Las fases precoces se caracterizan por una inflamación aguda, seguida de proliferación de fibroblastos y síntesis de colágeno. El colágeno se remodela gradualmente y la herida desarrolla resistencia a medida que se sintetiza nuevo colágeno (Koruda, M.J. y Rolandelli, R.H., J. Surg. Res. 48:504-515 (1990)). La mayoría de las complicaciones postoperatorias, tales como filtración de la anastomosis, se produce durante los primeros días siguientes a la cirugía, un período durante el cual la resistencia del colon está asegurada principalmente por la capacidad de los márgenes de la herida para mantener las suturas. Se ha comunicado que la capacidad de mantenimiento de las suturas del tracto GI se reduce hasta en 80% durante los primeros días del postoperatorio (Hogstrom, H. y Haglund, U., Acta Chir. Scand. 151:533-535 (1985); Jonsson, K. et al., Am. J. Surg. 145:800-803 (1983)).
Las ratas se anestesiaron con una combinación de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) por vía intramuscular. Los animales se mantuvieron sobre una almohadilla calefactora durante la desinfección de la piel, cirugía y post-cirugía. Se abrió la cavidad abdominal con una incisión en la línea media de 4 cm de longitud. Se cortó una sección de 1 cm de ancho del colon izquierdo, 3 cm proximal a la reflexión peritoneal, conservando los vasos sanguíneos marginales. Se practicó una anastomosis de capa única de un extremo a otro con 8-10 suturas invertidas interrumpidas con propileno 8-0, que se utilizaron para restaurar la continuidad intestinal. La incisión se cerró con una sutura continua de seda 3-0 para la capa muscular y grapas quirúrgicas para la piel. Se llevaron a cabo evaluaciones clínicas diarias en cada animal, consistentes en la determinación del peso corporal individual, temperatura corporal y patrones de consumo de alimentos.
Se administraron diariamente tratamientos con KGF-2 \Delta33 y placebo, por vía s.c., tópica, i.p., i.m., intragástrica o intracolónica, inmediatamente después de la intervención y se continuaron hasta el día del sacrificio, es decir, el día 7. Hubo un grupo de control no tratado, un grupo de placebo y grupos de KGF-2 \Delta33. Dos horas antes de la eutanasia, se administró a los animales una inyección i.p. de 100 mg/kg de BrdU. Los animales fueron sometidos a eutanasia 24 horas después del último tratamiento (día 5). Se efectuó una incisión de línea media en la pared abdominal anterior y se extrajo un segmento de colon de 1 cm de longitud, incluida la anastomosis. Se tomó un tercer segmento del sitio quirúrgico para el análisis de colágeno total.
En una serie de dos experimentos, ratas SD machos adultas (n=5) fueron anestesiadas y se practicó una anastomosis de capa única y de extremo a extremo del colon distal con 8-10 suturas invertidas interrumpidas de prolene 6-0. El sitio de la anastomosis se trató entonces por vía tópica, a través de una jeringuilla, con tampón o KGF-2 \Delta33, a una concentración de 1 y 4 \mug. A continuación, los animales se trataron diariamente con tampón o KGF-2 \Delta33 a concentraciones de 1 mg/kg o 5 mg/kg i.p. Los animales fueron sacrificados por eutanasia el día 5, se escindió el colon y se congeló de inmediato en nitrógeno líquido, se liofilizó y se sometió a determinaciones de colágeno. La concentración de colágeno se expresa como \mug de colágeno / mg de tejido seco. El análisis estadístico se efectuó usando un test t no apareado (media \pm EE). El día 5, las ratas se anestesiaron y se les administraron enemas de bario para análisis radiográfico. La evaluación radiológica del enema de bario de la anastomosis del colon, de un extremo a otro, procedente de los dos experimentos, mostró una reducción consistente de la filtración peritoneal en los animales tratados con KGF-2 a dosis de 1 y 5 mg/kg. Estos datos se muestran en la tabla siguiente. Además, se examinó la resistencia a la rotura del sitio quirúrgico, usando un tensiómetro. No se observaron diferencias significativas entre los grupos de KGF-2 \Delta33 y de tampón. Como se muestra en la Figura 49, se evidenciaron incrementos significativos de contenido en colágeno en el sitio quirúrgico tanto con 1 mg/kg de KGF-2 \Delta33 (p=0,02) como con 5 mg/kg (p=0,004) en relación con los controles que recibieron tampón.
TABLA
Anastomosis del colon Análisis radiológico
38
*Puntuación de constricción anastomótica: 0 = ausencia de constricción; 1-5 constricción mínima a intensa
Ratas SD machos adultas (n=5) se anestesiaron con una combinación de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) por vía intramuscular. Se abrió la cavidad abdominal con una incisión de 4 cm de longitud en la línea media. Se seccionó un segmento de 1 cm de ancho del colon izquierdo, 3 cm proximal a la reflexión peritoneal, conservando los vasos marginales. Se practicó una anastomosis de capa única, de un extremo a otro, con 8-10 suturas invertidas e interrumpidas de prolene 6-0 para restaurar la continuidad intestinal. Seguidamente, la anastomosis se trató de forma tópica, a través de una jeringuilla, con tampón o KGF-2, a concentraciones de 1 y 4 \mug. La herida de incisión se cerró con una sutura continua de seda 3-0 para la capa muscular, y con grapas quirúrgicas para la piel. A continuación, los tratamientos se administraron diariamente y consistieron en tampón o KGF-2 \Delta33, a dosis de 1 y 5 mg/kg, s.c. Se determinaron los pesos el día de la intervención y diariamente de ahí en adelante. Los animales fueron sacrificados por eutanasia 24 horas después del último tratamiento (día 5). Los animales fueron anestesiados y recibieron enemas de bario, realizando radiografías a una distancia establecida. La anastomosis se cortó seguidamente para análisis histopatológicos y biomecánicos.
Ejemplo 29 Evaluación de KGF-2 en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino
KGF-2 es una proteína que induce proliferación de queratinocitos in vitro y que es activa en diversos modelos de cicatrización in vivo. El propósito de este estudio fue determinar si KGF-2 era eficaz en un modelo de colitis del ratón inducida por la exposición ad libitum a sulfato sódico de dextrano en el agua de bebida.
En un modelo de enfermedad intestinal inflamatoria, inducida con una solución al 4% de sulfato sódico (DSS, PM 36.000-44.000, American International Chemistry, Natick, MA), administrada ad libitum durante una semana, se utilizaron ratones Swiss Webster hembras, de seis a ocho semanas de edad (20-25 g, Charles River, Raleigh, NC). KGF-2 se administró diariamente por vía parenteral (n=10). Se utilizaron tres parámetros para determinar la eficacia: 1) puntuación clínica, basada en la evaluación de las heces; 2) puntuación histológica, basada en la evaluación del colon; y 3) variación de peso. La puntuación clínica estuvo compuesta por dos partes, con una puntuación máxima de 4. La consistencia de las heces se clasificó como: 0 = firme; 1 = suelta; 2 = diarrea. También se evaluó la sangre en heces sobre una escala de 0 a 2, en la que 0 = ausencia de sangre; 1 = sangre oculta; y 2 = hemorragia rectal abundante. Una puntuación media de grupo superior a 3 indicó probable letalidad y una enfermedad que había progresado más allá de su etapa tratable. Las puntuaciones clínicas se tomaron los días 0, 4, 5, 6 y 7. Para efectuar la puntuación histológica, se evaluaron placas del colon ascendente, transversal y descendente de forma ciega, basadas en la puntuación de inflamación (0-3) y la puntuación críptica (0-4). El peso corporal se midió a diario. Los datos se expresan como media + EEM. Se usó un test t de Student no apareado para determinar diferencias significativas en comparación con el control de la enfermedad (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001).
Cuando los ratones tratados con DSS recibieron una inyección intraperitoneal (i.p.) diaria de KGF-2 \Delta33 a una dosis de 1, 5 ó 10 mg/kg durante 7 días, KGF-2 redujo de forma significativa la puntuación clínica: 28, 38 y 50%, respectivamente. La evaluación histológica fue paralela a la inhibición dependiente de la dosis de la puntuación clínica, reduciendo las dosis de 1, 5 y 10 mg/kg la puntuación histológica en un significativo 26, 48 y 51%, respectivamente. KGF-2 redujo también de manera significativa la pérdida de peso asociada a la colitis inducida por DSS.
En un segundo estudio, se efectuó una comparación de la eficacia relativa de KGF-2 \Delta33 (10 mg/kg) administrado por vía i.p, o subcutánea (s.c.) a diario. Al final del experimento, el día 7, los animales que recibieron la inyección i.p. de KGF-2 mostraron una reducción significativa de 34% de la puntuación clínica, en tanto que KGF-2 inyectado por vía s.c. provocó una reducción significativa de 46%. La dosis s.c. redujo también significativamente la pérdida de peso con respecto a los controles de DSS. En base a la medición de la puntuación clínica y del peso corporal, la administración s.c. de KGF-2 es al menos tan eficaz como la administración i.p.
Es evidente que la invención se puede llevar a la práctica de forma diferente de la particularmente descrita en la anterior descripción y ejemplos.
Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las anteriores enseñanzas y, por lo tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención se puede llevar a la práctica de forma distinta de la particularmente descrita.

Claims (52)

1. Un polipéptido mutante KGF-2 seleccionado del grupo formado por:
(a)
un mutante por deleción N-terminal de KGF-2, en el que dicho mutante está compuesto por la secuencia de aminoácidos Ala(63) - Ser(208) de la Figura 1, o por la secuencia de aminoácidos Ala(63) - Ser(208) de la proteína codificada por el cDNA contenido en el plasmidio ATCC 75977, y en el que dicho mutante incluye una metionina N-terminal;
(b)
un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90%, 95%, 97% o 99% a la secuencia de aminoácidos de dicho mutante de KGF-2 de (a);
(c)
un polipéptido de (a), en el que dicho polipéptido tiene al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo formado por Arg(194)Glu, Arg(194)Gln, Lys(191)Glu, Lys(191)Gln, Arg(188)Glu y Lys(183)Glu.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, que no está glicosilado.
3. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 ó 2.
4. La proteína de fusión de la reivindicación 3, en la que el polipéptido de la reivindicación 1 ó 2 está fusionado con una secuencia marcadora.
5. La proteína de fusión de la reivindicación 4, en la que dicha secuencia marcadora se selecciona de una marca de hexahistidina o una marca de hemaglutinina.
6. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. El polinucleótido de la reivindicación 6, que está optimizado para expresión en E. coli.
8. Un método para preparar un vector recombinante que comprende insertar el polinucleótido de la reivindicación 6 ó 7 en un vector.
9. Un vector que contiene el polinucleótido de la reivindicación 6 ó 7, o producido por el método de la reivindicación 8.
10. El vector de la reivindicación 9, en el que el polinucleótido está unido de forma operativa con secuencias de control de expresión, lo que permite la expresión en células hospedadoras procariotas o eucariotas.
11. Un método para preparar una célula hospedadora recombinante, que comprende introducir el vector de la reivindicación 9 ó 10 en una célula hospedadora.
12. Una célula hospedadora que
(a)
expresa el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
(b)
está modificada por ingeniería con el polinucleótido de la reivindicación 6 ó 7;
(c)
está modificada por ingeniería con el vector de la reivindicación 9 ó 10, o
(d)
se produce por el método de la reivindicación 11.
13. La célula hospedadora de la reivindicación 12, que es una célula bacteriana, de levadura, vegetal, de insecto o de mamífero.
14. La célula hospedadora de la reivindicación 13, que es una célula de E. coli, SF9, COS o CHO.
15. Un proceso para producir un polipéptido de KGF-2 mutante, que comprende cultivar la célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 y recuperar el polipéptido codificado por dicho polinucleótido del cultivo.
16. Un polipéptido que se puede obtener por el proceso de la reivindicación 15.
17. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, el polinucleótido de la reivindicación 6 ó 7, o el vector de la reivindicación 9 ó 10, junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente tolerable.
18. Un método in vitro para estimular el crecimiento o la proliferación de células epiteliales, que comprende poner en contacto dichas células con una cantidad eficaz del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16.
19. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para estimular el crecimiento o la proliferación de células epiteliales en un individuo.
20. Uso de la reivindicación 18 ó 19, en el que dichas células epiteliales son queratinocitos o queratinocitos basales.
21. Uso de la reivindicación 18 ó 19, en el que dichas células epiteliales proceden del pulmón, mama, páncreas, estómago, intestino delgado o intestino grueso.
22. Uso de la reivindicación 18 ó 19, en el que dichas células epiteliales son sebocitos, folículos pilosos, hepatocitos, neumocitos de tipo II o células cáliz productoras de mucina, u otras células epiteliales y sus progenitoras contenidas en la piel, pulmón, hígado y tracto gastrointestinal.
23. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o mejorar la aparición de arrugas o la piel envejecida, mejorar la resistencia de la piel, estimular el engrosamiento de la epidermis o reducir las cicatrices.
24. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para mejorar la cicatrización tras la cirugía estética.
25. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la cicatrización de heridas en un individuo.
26. Uso de la reivindicación 25, en el que dicha herida se selecciona de heridas quirúrgicas, heridas por escisión, heridas profundas que implican lesión de la dermis y epidermis, heridas de los tejidos oculares, heridas de los tejidos dentales, heridas de la cavidad bucal, úlceras y quemaduras.
27. Uso de la reivindicación 26, en el que dicha úlcera es una úlcera diabética, una úlcera dérmica, una úlcera por decúbito, una úlcera arterial o una úlcera por estasis venosa.
28. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar heridas causadas por un procedimiento quirúrgico del colon o gastrointestinal (GI) en un individuo.
29. Uso de la reivindicación 28, en el que dicho procedimiento es una anastomosis.
30. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, en el que dicho individuo tiene una alteración de la cicatrización de heridas.
31. Uso de la reivindicación 30, en el que dicha alteración está causada por diabetes, bloqueo o lesión isquémica, compuestos no esteroides, uremia, malnutrición, déficits de vitaminas, obesidad, infección, inmunosupresión, radioterapia, o quimioterapia, o es una complicación asociada con el tratamiento sistémico con esteroides.
32. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir la mucositis.
33. Uso de la reivindicación 32, en el que dicha mucositis se selecciona de la mucositis bucal, esofágica, gástrica, intestinal, del colon, rectal o anal.
34. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar enfermedades inflamatorias del intestino.
35. Uso de la reivindicación 34, en el que dicha enfermedad es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
36. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para reducir la inflamación.
37. Uso de la reivindicación 36, en el que dicha inflamación está asociada con una enfermedad o trastorno seleccionado de psoriasis o artritis.
38. Uso de la reivindicación 36, en el que dicha inflamación está asociada con una enfermedad o trastorno seleccionado de eccema o dermatitis.
39. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la cicatrización urotelial, o para estimular el crecimiento o reparación de tejidos en el tracto genital femenino.
40. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para estimular el crecimiento del cabello.
41. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar tejidos expuestos a radiación, o proteger tejidos que vayan a ser expuestos a radiación.
42. Uso de la reivindicación 41, en el que dicha composición farmacéutica está diseñada para ser administrada para permitir un incremento de la dosificación de la radiación usada para tratar un tumor en dicho individuo.
43. Uso de la reivindicación 42, en el que dicha composición farmacéutica está diseñada para ser administrada en el tratamiento de un trastorno inducido por la radiación seleccionado de lesiones bucales, lesiones gastrointestinales, mucositis, fibrosis intestinal, proctitis, fibrosis pulmonar, neumonitis, retracción pleural, síndrome hemopoyético, o mielotoxicidad.
44. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar enfermedades pulmonares.
45. Uso de la reivindicación 44, en el que dicha enfermedad pulmonar es una lesión pulmonar aguda o crónica.
46. Uso de la reivindicación 44, en el que dicha enfermedad pulmonar es enfisema, lesiones por inhalación, enfermedad de la membrana hialina, síndrome de distrés respiratorio infantil, o displasia broncopulmonar.
47. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para la preparación de una composición para enfermedades del hígado.
48. Uso de la reivindicación 47, en el que dicha enfermedad del hígado es una insuficiencia hepática fulminante causada por cirrosis.
49. Uso de la reivindicación 47, en el que dicha enfermedad del hígado es una lesión hepática causada por hepatitis vírica o sustancias tóxicas.
50. Uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 16, para preparar una composición farmacéutica para la diabetes.
51. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 50, en el que dicha composición farmacéutica es para administración terapéutica.
52. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 50, en el que dicha composición farmacéutica es para administración profiláctica.
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