ES2211871T3 - Procedimiento para la deteccion de un parto prematuro. - Google Patents
Procedimiento para la deteccion de un parto prematuro.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN METODO PARA DETECTAR EL INMINENTE COMIENZO DE PARTO DE UN PACIENTE, QUE COMPRENDE ANALIZAR UN FLUIDO CORPORAL DEL PACIENTE DE LA CONCENTRACION DE ESTRIOL; CORRELACIONAR LA CONCENTRACION CON UN VALOR ESTANDAR; Y RELACIONAR UNA ALTA CONCENTRACION DE ESTRIOL EN RELACION A UN VALOR ESTANDAR COMO INDICACION DEL COMIENZO POTENCIAL DEL PARTO PREMATURO. EL ESTANDAR SE ELIGE NORMALMENTE DEL GRUPO CONSISTENTE EN (1) UN INTERVALO PREDETERMINADO DE CONCENTRACIONES DE ESTRIOL DEL FLUIDO CORPORAL EN MUJERES EMBARAZADAS EN UN MOMENTO PRESELECCIONADO RELATIVO AL PERIODO COMPLETO NORMAL DEL PARTO, O (2) UNA CONCENTRACION DE ESTRIOL PREVIAMENTE MEDIDA DEL MISMO FLUIDO CORPORAL DE LA MUJER EMBARAZADA. EL USO DE ESTE METODO NO REQUIERE LA DETERMINACION DE UNA RELACION DE CONCENTRACION DE ESTRIOL/PROGESTERONA EN EL FLUIDO CORPORAL QUE SE EXAMINA.
Description
Procedimiento para la detección de un parto
prematuro.
Esta invención hace referencia a los
procedimientos para la detección del término del embarazo por parto
prematuro y se dirige en particular a los ensayos que predicen el
inicio del parto mediante la detección de niveles hormonales.
Los estrógenos, que son esteroides de 18 carbonos
con un anillo aromático A, un grupo hidroxilo fenólico en la
posición 3 del anillo A y un grupo de oxígeno funcional (bien
carboxilo o carbonilo) en la posición 17 del anillo D, producen una
gran variedad de efectos sobre los órganos diana específicos y sobre
el cuerpo en general, actuando en solitario o junto con otras
hormonas. Muchos estudios sobre estrógenos se han centrado en el
estradiol (a veces referido como E2, que hace referencia a la
presencia de dos grupos hidroxilos), el cual había sido considerado
el principal estrógeno activo. Sin embargo, el estradiol no es un
indicador útil de la presentación del parto en mujeres embarazadas,
tal como se describió en Block y col., Am. J. Obstet. Gynecol.
150:716-22 (1984), quienes indican de forma rotunda
que el parto prematuro no puede predecirse mediante cuantificaciones
seriadas de la concentración de estradiol (o progesterona) en
plasma.
Inicialmente, se consideró el estriol (E3) como
un producto de degradación oxidativa del metabolismo del estradiol,
aunque estudios actuales indican la existencia de efectos biológicos
asociados con el estriol que no están asociados con el estradiol.
Por ejemplo, hoy en día se sabe que la producción de estradiol en
mujeres embarazadas está asociada con la placenta (al menos en
parte). Sin embargo, la presencia de estriol foráneo como resultado
del metabolismo del estradiol ha impedido la utilización de
estrioles como medida de la actividad hormonal. Por otra parte, el
aumento de solubilidad en los fluidos corporales del estriol
respecto al estradiol y su aspecto resultante en la forma no
conjugada en diversos fluidos corporales hace que el estriol sea una
diana deseable para el análisis, una vez que se haya alcanzado un
conocimiento profundo del mismo y se pueda lograr su asociación con
la actividad biológica.
La relación del estriol en la saliva respecto al
estriol en el suero durante el embarazo normal fue estudiada por
Fischer-Rasmussen y col., Acta Obst Gynecol. Scand.,
60:417-420 (1981). En otro estudio, las
concentraciones salivales de estriol y progesterona se cuantificaron
para determinar si se producía un descenso en el nivel de
progesterona, o un aumento en la proporción de
estrógeno:progesterona en las mujeres antes de la presentación de la
primera etapa del parto. Ver Lewis y col., J. Endocr.,
115:177-181 (1987). Este estudio concluyó que no se
produjo ningún descenso en la concentración hormonal antes de la
presentación de la primera etapa del parto y tampoco cambió la
proporción del estradiol respecto a la progesterona durante las dos
últimas semanas del embarazo, lo que no proporcionó ninguna
evidencia que apoyara las reivindicaciones de otros autores sobre
que el parto en las mujeres está precedido por un descenso
significativo en la concentración de progesterona. Evans y col.,
Clinical Chemistry, 30:120-121, describen las
concentraciones de estriol salival durante los embarazos normales y
en una comparación con el estriol plasmático. La cuantificación del
estriol plasmático durante el embarazo se describe como de amplia
utilización en el control del bienestar del feto, y el estudio se
dirige a la determinación de si las concentraciones de estriol
salival y plasmático podrían utilizarse para reemplazar las
cuantificaciones de estriol en la orina obtenidas anteriormente con
dicho fin. Sin embargo, no hay argumentos que relacionen las
concentraciones de estriol con las situaciones clínicas distintas a
las referentes al bienestar del feto. Dame y col., British Medical
Journal, 294:270-272 (1987), proponen que un
incremento en la proporción de estriol salival respecto a la
progesterona puede ser un predictor posible para el parto prematuro.
Sin embargo, la interacción del complejo de estas dos hormonas
impide la utilización de esta cuantificación en un ensayo
sencillo.
Según ello, es un objetivo de la presente
invención desarrollar un conocimiento profundo sobre la relación de
las concentraciones de estriol en diversos fluidos corporales
respecto a funciones biológicas subyacentes y utilizar los ensayos
diagnósticos del estriol para evaluar el estado biológico actual y/o
potencial de la paciente, de quien se ha obtenido la muestra de
estriol.
Furuhashi y col., (Chem. Abs. 102:106522m, 1985)
determinaron los niveles séricos de hormonas en la presentación de
parto espontáneo y en embarazos tardíos normales. Los autores
sugirieron que podía utilizarse la determinación de lactógeno
placentario humano y de estriol sin conjugar para predecir el
parto.
Dame y col., (British Med. J., 294,
270-272, 1987) sugirieron que la proporción de
estriol respecto a progesterona en saliva podía ser útil para la
predicción del parto prematuro.
Lachelin y col., (Brit. J. Obs. and Gyn., 91,
1203-1209, (1984) describen un estudio de niveles de
estriol durante el embarazo normal. La presente invención
proporciona un procedimiento de cribaje de la presentación potencial
de un parto prematuro en una mujer embarazada, en donde el
procedimiento comprende:
(a) analizar una muestra de fluido corporal de
dicha mujer embarazada para determinar la concentración de estriol
sin conjugar en el fluido corporal;
(b) correlacionar dicha concentración determinada
en la etapa (a) con
- (1)
- una concentración de estriol sin conjugar estándar y predeterminada para dicho fluido corporal en mujeres embarazadas normales, o
- (2)
- una concentración de estriol sin conjugar cuantificada previamente en dicho fluido corporal de dicha mujer embarazada para determinar una tasa de incremento en la concentración de estriol sin conjugar en el fluido corporal de dicha mujer embarazada; y
(c) relacionar una mayor concentración de estriol
sin conjugar en el fluido corporal de dicha mujer embarazada en
relación con la mencionada concentración de estriol sin conjugar
estándar y predeterminada, o relacionar una tasa elevada de
incremento en la concentración de estriol sin conjugar en el fluido
corporal de dicha mujer embarazada, con una tasa de incremento en el
estriol sin conjugar de una mujer embarazada normal, como indicación
de la posible presentación de un parto prematuro en la mencionada
mujer embarazada, en donde dicha dosis relativa no tiene en
consideración la concentración de progesterona en dicho fluido
corporal.
Puede llevarse a cabo antes de los 30 semanas de
gestación.
Puede llevarse a cabo a las 20-36
semanas de gestación.
La utilización de este procedimiento no requiere
la determinación de una proporción de concentraciones de
estriol/progesterona en el fluido corporal a analizar, lo que en un
principio se pensó era necesario para la utilización de
concentraciones de estriol con el fin de evaluar las condiciones
biológicas
La presente invención proporciona un
procedimiento para la detección de la presentación de parto
prematuro en una mujer embarazada mediante una cuantificación
sencilla en el fluido corporal de la concentración de estriol. Este
procedimiento es más sencillo que las técnicas anteriores y
proporciona un ensayo que puede llevarse a cabo por la paciente en
casa, obviando la necesidad de proporcionar muestras a un
laboratorio profesional en una localización alejada para la
paciente, con la consecuente demora. Por ejemplo, el ensayo puede
llevarse a cabo en una muestra de saliva utilizando un equipo de
diagnóstico sencillo con un marcaje enzimático. En la actualidad,
están disponibles ensayos similares para otras sustancias, así como
un ensayo de laboratorio para el estriol que utiliza el marcaje
radioactivo está disponible comercialmente.
En esta invención, no hay limitaciones sobre el
tipo de ensayo utilizado para cuantificar el estriol. Se puede
utilizar cualquiera de los ensayos actuales para el estriol, además
de ensayos que puedan desarrollarse en un futuro. Ejemplos de
ensayos de estriol se describen más adelante.
El ensayo puede llevarse a cabo en cualquier
muestra de fluido corporal, como la sangre (o una fracción
sanguínea, especialmente el suero o el plasma), la orina, las
secreciones cervicales o vaginales, o la saliva. El estriol es
suficientemente soluble en agua, de modo que se distribuye en los
fluidos por todo del cuerpo. Es preferible la saliva por su
simplicidad de muestreo y porque, al contrario que en la orina, la
detección no se complica por la presencia de conjugados de
estrógeno.
Una "muestra" es el material que se analiza
y generalmente tiene un origen biológico directo, aunque el
pre-tratamiento puede haber eliminado algunos de los
compuestos biológicos normales asociados con el analito (como los
glóbulos rojos separados del plasma en una muestra de sangre
completa). Los ensayos se dirigen a la detección de estriol libre,
ya que el estriol conjugado tiene una actividad biológica reducida.
En la saliva, aproximadamente el 92% del estriol se halla en la
forma libre, mientras que la mayoría de estriol en la orina está
presente como un conjugado. Como será evidente para los
familiarizados con el metabolismo esteroideo, un conjugado de
estriol es un compuesto formado por la formación de una unión
covalente de un compuesto no-esteroideo con el
estriol. La unión se produce generalmente a través de un grupo
hidroxilo del sistema de anillos esteroidales. El componente no
esteroideo puede ser inorgánico (p.ej., un grupo sulfato) u orgánico
(p.ej., un grupo glucurónico).
En aspectos más generales de la invención, no
existen limitaciones sobre la recogida y la manipulación de muestras
siempre que se mantenga una coherencia. Con algunos fluidos
corporales como la saliva y el plasma, existe poca variación diurna
en los niveles de estriol. Para otros fluidos, en especial la orina,
ocurren variaciones, y es preferible eliminar dichas variaciones en
la mayor parte posible, por ejemplo tomando las muestras en el mismo
momento del día. Sin embargo, otras técnicas pueden utilizarse para
asegurar la consistencia de la cuantificación de analitos en los
fluidos clínicos. Por ejemplo, la creatinina puede cuantificarse
junto con el estriol en la orina. La creatinina se produce a una
velocidad constante en los riñones y las cuantificaciones de la
concentración de creatinina permiten la corrección de muchos errores
en las muestras de orina, tal como se conoce en la materia.
Si se desea (aunque no es necesario en las
aplicaciones más generales de la presente invención) y dependiendo
de la fuente del fluido que se analiza, el estriol libre puede
separarse de los conjugados de estriol. Las técnicas para dichas
separaciones son conocidas en la materia. Ver, por ejemplo, Evan,
N.A. Med. Lab. Tech. 33:86 (1979), que describe dichas separaciones
además de dos radioinmunoensayos de utilidad para cuantificar el
estriol del plasma. Sin embargo, estas separaciones son en general
difíciles y por lo tanto son preferibles los ensayos que no
requieren separación, bien debido a la utilización de anticuerpos
específicos u otros compuestos de unión que diferencian entre el
estriol libre y el conjugado, o porque la muestra se obtiene de una
fuente que contiene principalmente estriol libre, como la
saliva.
La concentración de estriol en el fluido
analizado se correlaciona con un valor estándar para determinar
cuándo es inminente el parto. El estándar es: (1) un intervalo
predeterminado de concentraciones de estriol para el mismo fluido
corporal en mujeres embarazadas normales en la población general, en
el tiempo correspondiente de embarazo o en un tiempo específico
relativo al término normal del embarazo; o (2) una concentración de
estriol cuantificada con anterioridad del mismo fluido corporal de
la misma mujer embarazada. Una concentración superior cuantificada
de estriol relativa al valor estándar es una indicación de la
posible presentación de un parto prematuro. El procedimiento de la
invención no requiere la cuantificación de ninguna sustancia, como
puede ser la concentración de progesterona en el fluido corporal, ni
requiere la cuantificación de la producción de estriol total en un
intervalo de tiempo. Sin embargo, las cuantificaciones de estriol
total en un tiempo determinado, como 24 horas, pueden utilizarse con
la orina si se desea.
Tal como se utiliza en la presente invención, el
término "inminente" hace referencia a que el parto prematuro es
probable, no siendo posible determinar con precisión cuando ocurrirá
en ausencia de intervención. El alumbramiento ocurre generalmente en
las 6 semanas correspondientes con un primer nivel anormalmente
elevado de estriol, produciéndose el parto en la mayoría de
pacientes a las 2-3 semanas si no son tratados. En
algunos casos, el parto puede retrasarse durante algunas semanas
más. Sin embargo, un incremento estadísticamente significativo en la
concentración de estriol de un fluido corporal proporciona un aviso
físico temprano de parto, incluso en ausencia de síntomas clínicos,
de modo que los síntomas clínicos pueden controlarse estrechamente
y/o puede modificarse el comportamiento de la paciente (p.ej.,
evitando períodos prolongados sin cuidados médicos y en los casos de
mayor peligro, hospitalizando la paciente).
El primer estándar general propuesto
anteriormente, concretamente un intervalo predeterminado de
concentraciones para el mismo fluido corporal en mujeres embarazadas
normales, se obtiene de forma característica utilizando la misma
técnica de ensayo que se utilizará en la aplicación del
procedimiento a un individuo a analizar, con el fin de asegurar la
mayor correlación. Para producir un intervalo estadísticamente
significativo de valores normales para el valor para el que se
realizará una comparación, se realizan las suficientes
cuantificaciones en una población normal de mujeres embarazadas.
Dichas cuantificaciones se realizan en general a intervalos de
tiempo preseleccionados durante el embarazo normal. Aunque, a menudo
se utiliza para la comparación el período de tiempo inmediato
anterior al parto normal (38 a 40 semanas), es posible utilizar
otros períodos de tiempo. Por ejemplo, los niveles de estriol
durante una semana dada de un embarazo individual (es decir, el de
la paciente en particular) pueden compararse con el intervalo normal
de concentraciones para el mismo periodo de tiempo (p.ej., la 20ª
semana). En general, la concentración mínima indicativa de la
posible presentación del parto se considera de por lo menos 1
desviación estándar, preferentemente de por lo menos 2, más
preferentemente de por lo menos 3 y aún más preferentemente de por
lo menos 4 desviaciones estándares por encima de la concentración
media de estriol, determinada para cualquier fluido corporal en la
comparación seleccionada, y justo antes de la presentación del parto
en mujeres embarazadas normales.
Se sobreentenderá por aquellos familiarizados con
la estadística que el valor de las desviaciones estándares utilizado
como una indicación de las complicaciones del embarazo se
seleccionará teniendo en cuenta un fin diagnóstico adecuado. Por
ejemplo, un intervalo de una desviación estándar por encima y por
debajo de la media abarcará aproximadamente el 68% de las muestras
normales; es decir, el 32% de las muestras normales se espera que se
hallen fuera de los límites inferiores y superiores fijados para una
desviación estándar de la media (en consecuencia, se esperaría que
el 16% estuviera por encima del límite de selección). Así, 1
desviación estándar por encima de la media normal no se utiliza para
el análisis definitivo, ya que incluiría demasiados falsos
positivos. Sin embargo, una desviación estándar de valor 1 es
adecuada para un ensayo que se desee utilizar en la posterior
evaluación de candidatos posibles que pueden predisponer al parto
prematuro; o dicho límite puede seleccionarse para pacientes que se
sabe presentan valores de estriol normales o bajos y relativamente
poca variación entre las muestras. Una desviación estándar de valor
1 también puede seleccionarse para una paciente conocida por tener
problemas de partos prematuros, con el fin de determinar cuándo
vigilar la paciente de forma más estrecha en condiciones controladas
(como por ejemplo tener una paciente admitido en un hospital para su
control continuo). Dos desviaciones estándares de la media
abarcarían aproximadamente el 95% de las muestras normales; 3
desviaciones estándares, aproximadamente el 99%; 4 desviaciones
estándares, más del 99%. Generalmente, estos niveles son más
adecuados para pacientes cuyos niveles de estriol se sabe que son
normales o ligeramente por encima de la normalidad o varían de una
muestra a otra, así como para ensayos con un coeficiente elevado de
varianza. En una realización preferida, los niveles de estriol que
se mantienen por encima de un umbral elevado preseleccionado (p.ej.,
durante por lo menos 12 horas, preferentemente al menos 24 horas y
más preferentemente durante al menos 72 horas) son preferibles como
indicación de la presentación probable del parto.
No es necesario expresar el límite inferior de la
indicación del parto (límite superior del intervalo normal) en las
desviaciones estándares. Se puede emplear cualquier otro sistema que
pueda ser utilizado para proporcionar una indicación
estadísticamente significativa de la presentación probable del
parto. Por ejemplo, el límite se puede fijar a una concentración que
sea por lo menos tan alta como la concentración de percentil 95 para
pacientes normales e igual fluido corporal en un embarazo normal. En
muchos casos, es preferible seleccionar un nivel normal entre el
período de 38-42 semanas para embarazos normales,
preferentemente las 40 semanas, y controlar la concentración que se
inicia a, o antes de las 30 semanas.
Debido a los muchos y diferentes objetivos
posibles, el médico puede seleccionar mejor el nivel actual de
estriol, como indicador de la presentación probable del parto
prematuro, obteniendo varias muestras de la paciente durante la
primera parte del embarazo y teniendo en cuenta el tiempo en el que
se realiza la cuantificación. Por ejemplo, en un embarazo normal en
la semana 30, el cambio esperado en la concentración de estriol
antes de la presentación del parto es menor que 2 desviaciones
estándares de la concentración media de estriol a las 30 semanas.
Así, mientras que los ensayos durante la primera parte del embarazo
(antes de las 30 semanas) pueden utilizar 3 ó 4 desviaciones
estándares como indicación de la presentación del parto, 2, 1,5 e
incluso 1 desviación estándar sería más adecuado en la última parte
de un embarazo (p.ej., después de las 30 semanas) dependiendo de la
condición de la paciente, de otras indicaciones clínicas de la madre
conocidas por el médico y de la salud del feto. Desde luego, son los
estadíos iniciales de un embarazo que requieren la mayor atención
para evitar el parto prematuro, debido a la ausencia de desarrollo
fetal en estos estadíos y al elevado riesgo de muerte infantil
post-parto. En consecuencia, se considera que el
parto prematuro es cualquier parto que suceda antes del término
normal de 40 semanas de embarazo, preferentemente antes de iniciarse
la 38ª semana desde la concepción. El procedimiento de la invención
se utiliza preferentemente en embarazos durante las semanas 20 a 36,
en donde la prolongación del embarazo incluso durante un breve
período de tiempo es lo más eficaz para reducir los efectos de un
parto prematuro.
De modo similar, y con las mismas constricciones
argumentadas anteriormente, se puede utilizar como indicación de un
embarazo normal una concentración de ensayo de al menos 1 desviación
estándar, preferentemente de al menos 2, más preferentemente de al
menos 3 y aún más preferentemente de al menos 4 desviaciones
estándares por encima de la concentración media normal para la mima
etapa del embarazo. Y por ello, se puede utilizar como indicación de
la posible presentación del parto, aunque la probabilidad es
inferior si el nivel cuantificado no alcanza los niveles
considerados normales para las semanas 38-42.
Los valores estándares variarán con el fluido
corporal específico cuya concentración se cuantifica y con el
ensayo específico a utilizar (aunque en menor magnitud). Los niveles
indicativos mínimos y característicos de la presentación del parto
en un ensayo que cuantifica el estriol sin conjugar son los
siguientes, para los fluidos corporales indicados (todas las
concentraciones son mM): saliva, al menos 3, preferentemente al
menos 5, más preferentemente al menos 7; suero, 30, preferentemente
al menos 35, más preferentemente al menos 45.
Como una alternativa a la comparación de
concentraciones de estriol con las presentes en una población
normal, se puede utilizar una concentración de estriol cuantificada
con anterioridad del mismo fluido corporal y misma mujer embarazada
como un estándar de comparación. En este caso, lo que se determina
es generalmente la tasa de incremento de la concentración de estriol
en el fluido a analizar. Se considera que un ensayo es positivo (es
decir, que indica la presentación inminente de parto) cuando la
concentración cuantificada de estriol excede la cuantificada
anteriormente en el mismo fluido corporal de la misma mujer
embarazada en un 50%, preferentemente en un 75% y más
preferentemente en un 100%. De nuevo la selección de una tasa
determinada de incremento para marcar como límite inferior para la
presentación del parto, es mejor seleccionada por el médico según su
criterio. Por ejemplo, un ensayo de cribaje que pretenda reunir las
pacientes con problemas potenciales en el hospital para su
observación y estudio, podría seleccionar el incremento del 50% como
límite con el fin de evitar resultados falsos negativos, mientras
que la no hospitalización y por lo tanto la aceptación de posibles
problemas conllevaría la inclusión de un número relativamente grande
de falsos positivos. Incrementos con porcentajes superiores, como la
indicación positiva mínima, son más aceptables para los análisis en
casa y similares, de igual forma que la descrita anteriormente para
desviaciones estándares de la media en la población normal. Los
incrementos en la concentración de estriol que satisfacen los
estándares de este párrafo y adicionalmente alcanzan los niveles
antes indicados para ser indicadores de la presentación del parto en
poblaciones normales de pacientes, parecen ser indicadores
especiales de la presentación inminente del parto.
Se sobreentenderá por los expertos en análisis
clínicos que los ensayos para un analito dado, incluyendo este
ensayo para el estriol, no se espera que se obtengan ni interpreten
por el médico sin información adicional. Adicionalmente, los
resultados de cualquier ensayo son mejor considerados como
indicadores de la probabilidad de presentación de una condición
clínica en lugar de una prueba absoluta. La misma situación existe
para la presente invención. Sin embargo, una indicación de
probabilidad incrementada de presentación del parto es una
información de utilidad clínica y puede utilizarse por un médico
experto, junto con la información adicional para cuidar las
pacientes de forma más acertada que en el caso de no disponer de
información.
Un ensayo preferido para utilizar con la presente
invención se describe en la patente internacional WO 93 204 48. Este
ensayo utiliza un componente marcado con una enzima (aquí una
molécula de estriol o un derivado) en un ensayo de unión competitiva
para el estriol. El ensayo es un inmunoensayo enzimático
no-instrumentalizado que proporciona resultados
analíticos de presente/no presente o "umbral" (+/-) en un valor
de corte preseleccionado y por ello se adapta bien a la utilización
con la presente invención.
En un ensayo típico que utiliza esta técnica, el
componente de unión competitivo, marcado enzimáticamente, comprende
el estriol (o la porción de lo mismo utilizada para generar el
anticuerpo que se emplea en el ensayo) unido al inmunógeno que se
utiliza para producir el anticuerpo del ensayo. Un marcaje
enzimático se une a esta porción, preferentemente por una molécula
engarce de gran volumen como el complejo
avidina-biotina. La utilización de dicho compuesto
de unión competitiva permite que los anticuerpos se utilicen sin
necesidad de manipular su afinidad de unión con el competidor,
proporcionando todavía la curva de unión competitiva pronunciada
requerida para un análisis +/-.
En un ensayo típico, el anticuerpo se une a una
superficie sólida, como el pocillo de una placa de microtitulación,
un tubo de ensayo o una tira de reactivo porosa (como celulosa o
fibra de vidrio). La superficie sólida recubierta con el anticuerpo
se contacta entonces simultáneamente con una muestra y con un
compuesto de unión competitiva. Si se proporcionan menos sitios de
unión al anticuerpo que los presentes en el combinado total de
analito y compuesto de unión competitiva, sólo una fracción de las
moléculas en solución se unirá a la superficie sólida. Si no hay
moléculas de analito presentes, todos los sitios de unión serán
ocupados por los compuestos de unión competitiva, consiguiéndose que
una cantidad máxima de enzima se una a la superficie sólida. Cuando
se contacta un sustrato para la enzima con la superficie sólida,
después de retirar la muestra mediante lavados, la reacción de la
enzima con el sustrato proporciona una señal detectable
(generalmente, la formación de color), que indica al usuario la
ausencia de analito en la muestra (un resultado negativo). Si el
analito está presente en la muestra, el analito compite por los
sitios de unión de modo que se puede unir menos competidor marcado
enzimáticamente. Utilizando una composición de unión voluminosa, que
se une menos rápidamente al anticuerpo que el analito y
seleccionando adecuadamente el número de sitios de unión en relación
con la cantidad de muestra añadida (lo que es una técnica estándar
para un experto en la materia), el analito presente a una
concentración por encima de un nivel mínimo preseleccionado excluirá
la unión de la composición de unión competitiva y en consecuencia la
unión de la enzima con el sustrato sólido. Un ejemplo de dicho
proceso de selección para proporcionar niveles de umbral distintos,
se describe en la solicitud de patente citada para el estradiol. El
mismo proceso de selección puede utilizarse con el estriol para
llevar a cabo un ensayo de la invención. Así, si en la muestra hay
suficiente analito, después de la reacción no habrá enzima para
producir un cambio de color y la mezcla de reacción permanecerá de
igual color (es decir una reacción positiva según el esquema de
reacción).
Pueden utilizarse otros esquemas de reacción en
donde la formación de color es indicativa de la presencia del
analito. El ejemplo anterior es simplemente uno de los muchos tipos
de ensayos de unión competitiva con los que el estriol puede
cuantificarse.
La producción de anticuerpos para utilizar en un
ensayo de estradiol es convencional y no se describe aquí en
detalle. Las técnicas para la producción de anticuerpos son bien
conocidas en la literatura y se ejemplifican en la publicación: A
Laboratory Manual (1988) eds. Harlow y Lane, Cold Spring Harbor
Laboratories Press, y la patente americana U.S. 4.381.292, 4.451.570
y 4.618.577. Para un ejemplo de producción de anticuerpos
específicos para el estradiol, ver Lasley y col., Fertility and
Sterility (1985) 43:861-867 y Munro y col.,
Abstract, Society for Gynecologic Investigation, San Diego, March
1989. Las mismas técnicas pueden utilizarse para producir
anticuerpos contra el estriol. Para aquellos que pueden no estar
familiarizados con el proceso, se incluye una breve descripción de
las técnicas generales para la producción de anticuerpos específicos
para este-
roides.
roides.
Se inyecta un animal con una composición que
contenga estriol unido covalentemente con un inmunógeno,
generalmente una proteína, se prepara tal como se describió
anteriormente. Inyecciones múltiples o la utilización de un
adyuvante asegurarán una estimulación máxima del sistema inmune y la
producción de anticuerpos. Si se desea producir anticuerpos
policlonales, se pueden preparar simplemente recolectando la sangre
del animal inmunizado y separando los anticuerpos de otros
componentes de la célula mediante técnicas estándares. Para obtener
anticuerpos monoclonales, se extrae el bazo o los linfocitos del
animal inmunizado y éstos se inmortalizan o utilizan para preparar
hibridomas mediante procedimientos de fusión celular, conocidos por
los expertos en la materia. Los anticuerpos secretados por las
células inmortalizadas se criban para determinar los clones que
secretan anticuerpos con la deseada especificidad. Para anticuerpos
anti-estriol monoclonales, los anticuerpos deben
unirse al estriol. Las células productoras de anticuerpos con la
deseada especificidad se seleccionan, se clonan y crecen para
producir los anticuerpos monoclonales deseados.
El anticuerpo puede unirse a una superficie
sólida para utilizar en un ensayo de la invención, empleando
técnicas conocidas para la unión de material proteico a materiales
de soporte sólidos. El soporte sólido puede incluir superficies de
plástico de tubos de ensayo o placas de microtitulación, bolas
poliméricas, varillas impregnables o materiales de filtro. Los
procedimientos de unión incluyen la adsorción inespecífica de la
proteína sobre el soporte y la unión covalente de la proteína,
generalmente a través de un grupo amino libre con un grupo químico
reactivo sobre el soporte sólido, como un grupo carboxilo,
hidroxilo, o aldehído activado.
Mediante la detección de la probable presentación
de un parto prematuro, tal como se describe aquí, un médico será
capaz de utilizar las técnicas existentes para retrasar el parto y
evitar el alumbramiento prematuro y en el consecuente riesgo elevado
de muerte infantil.
El siguiente ejemplo se ofrece como vía de
ilustración y no como limitación.
Las cuantificaciones de estriol salival se
llevaron a cabo en una serie de pacientes que inicialmente eran
asintomáticas pero presentaban un riesgo elevado de parto prematuro
debido a anteriores nacimientos prematuros, o anomalías uterinas. La
cuantificación de estriol se realizó mediante cromatografía de
celite. En este estudio, se consideró como valor umbral para la
indicación de presentación probable de parto prematuro el estriol
salival 5 nM. La edad gestacional se determinó por la fecha del
último período menstrual.
En algunas pacientes, el embarazo continuó hasta
el término. En estos casos, los niveles de estriol en saliva antes
de las 32 semanas permanecieron por debajo de 5 nM. En otros casos,
las pacientes mostraron un incremento por encima del umbral
indicado, pero no se han incluido aquí porque también presentaron
síntomas clínicos y se trataron con agentes tocolíticos para
retrasar el parto.
Una paciente no se trató con tocolíticos y
experimentó un parto prematuro a las 36 semanas y 5 días. Esta
paciente era maníaco-depresiva y estaba tomando el
fármaco anti-psicotrópico Haldol. La saliva de esta
paciente se analizó por primera vez a las 25 semanas y 5 días,
hallándose una concentración de estriol de 2,3 nM (en el intervalo
normal). La paciente no presentó síntomas clínicos (contracciones
uterinas, cambio de cérvix, o ruptura espontánea de membranas) en el
examen inicial. Aproximadamente una semana más tarde (26 semanas y 4
días), el nivel de estriol salival aumentó a 7,7 nM, de nuevo sin
síntomas clínicos. El estriol salival permaneció alto (6,4 nM) a las
27 semanas y 4 días, pero descendió a 3,1 nM a las 28 semanas y 6
días. El estriol salival subió de nuevo a 5 nM (5,2 nM) a las 30
semanas y 4 días. La paciente presentó síntomas clínicos
(contracciones uterinas irregulares sin cambio cervical o ruptura de
membranas) por primera vez a las 31 semanas y 5 días,
hospitalizándose a continuación por una severa depresión bipolar. La
concentración de estriol en dichas circunstancias había disminuido
ligeramente a 4,3 nM. Después de las 31 semanas y 5 días no se
dispuso de ninguna muestra de estriol salival. La paciente presentó
un parto prematuro a las 36 semanas y 5 días. Durante la
intervención, período en el que no se cuantificó el estriol salival,
la paciente presentó síntomas normales de parto inminente (p.ej.,
dilatación de cérvix 1,0 cm a las 34 semanas y 5 días y 2,0 cm el
día del parto).
Es evidente a partir de estos datos que un
incremento en la concentración de estriol salival precedió a los
signos clínicos de un parto inminente en varias semanas (semana 26 y
4 días para el estriol elevado, respecto a 31 semanas y 5 días para
los síntomas clínicos). En consecuencia, un incremento
estadísticamente significativo en la concentración de estriol de un
fluido corporal proporciona un aviso temprano para el médico de la
presentación probable de un parto prematuro, incluso en ausencia de
síntomas clínicos.
Claims (10)
1. Procedimiento para el cribaje en las semanas
20 a 36 de gestación de la posible presentación de un parto
prematuro en una mujer embarazada, comprendiendo dicho
procedimiento:
(a) analizar una muestra de fluido corporal de
dicha mujer embarazada para determinar la concentración de estriol
sin conjugar en el fluido corporal;
(b) correlacionar dicha concentración determinada
en la etapa (a) con:
- (1)
- una concentración estándar predeterminada de estriol sin conjugar para dicho fluido corporal en mujeres embarazadas normales, o
- (2)
- una concentración de estriol sin conjugar cuantificada previamente en dicho fluido corporal de dicha mujer embarazada, para determinar una tasa de incremento en la concentración de estriol sin conjugar en el fluido corporal de dicha mujer embarazada; y
(c) relacionar una concentración superior de
estriol sin conjugar en el fluido corporal de dicha mujer embarazada
con una concentración de estriol sin conjugar estándar
predeterminada, o relacionar una tasa elevada de incremento de
concentración de estriol sin conjugar en el fluido corporal de dicha
mujer embarazada con una tasa de incremento en el estriol sin
conjugar para una mujer embarazada normal como indicación de una
presentación posible de parto prematuro en dicha mujer embarazada,
en donde dicha relación no considera la concentración de
progesterona en dicho fluido corporal.
2. Procedimiento de cribaje antes de las 30
semanas de gestación para la presentación posible de parto prematuro
en una mujer embarazada, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) analizar una muestra de fluido corporal
procedente de dicha mujer embarazada para determinar la
concentración de estriol sin conjugar en el fluido corporal;
(b) correlacionar dicha concentración determinada
en la etapa (a) con:
- (1)
- una concentración de estriol sin conjugar estándar y predeterminada para dicho fluido corporal en mujeres embarazadas, o
- (2)
- una concentración de estriol sin conjugar cuantificada previamente en dicho fluido corporal de dicha mujer embarazada para determinar una tasa de incremento en la concentración de estriol sin conjugar en el fluido corporal de dicha mujer embarazada; y
(c) relacionar una concentración superior de
estriol sin conjugar en el fluido corporal de dicha mujer embarazada
respecto a la concentración mencionada de estriol sin conjugar
estándar, o relacionar una tasa elevada de incremento en la
concentración de estriol sin conjugar en el fluido corporal de dicha
mujer embarazada con una tasa de incremento de estriol sin conjugar
para mujeres embarazadas como indicación de la posible presentación
de parto prematuro en dicha mujer embarazada, en donde dicha
relación no considera la concentración de progesterona en el
mencionado fluido corporal.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en donde dicho fluido corporal es la saliva, el plasma, el
suero, la orina, la secreción cervical o vaginal, o el sudor.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
3, en donde dicho fluido corporal es la saliva y dicha concentración
predeterminada de estriol sin conjugar es por lo menos de 5 nM.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
4, en donde dicho fluido corporal es la saliva y dicha concentración
predeterminada de estriol sin conjugar es por lo menos de 7 nM.
6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en donde dicha concentración determinada en la etapa (a) se
determina dentro de una semana de la concentración cuantificada
previamente de estriol sin conjugar en dicho fluido corporal de
dicha mujer embarazada y en donde una tasa elevada de incremento en
una concentración de estriol sin conjugar en el fluido corporal de
dicha mujer embarazada está indicada cuando dicha concentración
determinada en la etapa (a) excede la concentración de estriol sin
conjugar cuantificada anteriormente en el fluido corporal de dicha
mujer embarazada en por lo menos el 50%.
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en donde dicha concentración determinada en la etapa (a) se
determina a las 30 semanas de gestación o antes y dicha
concentración predeterminada de estriol sin conjugar estándar es por
lo menos tan alta como la concentración de percentil 95 de estriol
sin conjugar para dicho fluido corporal para una embarazada normal a
las 40 semanas de gestación.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en donde dicho análisis comprende un inmunoensayo enzimático
no instrumentalizado para el estriol sin conjugar.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
8, en donde dicho ensayo produce un cambio de color a una
concentración mínima considerada indicativa de parto inminente.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en donde dicha concentración superior de
estriol sin conjugar se mantiene por lo menos durante 12 horas.
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