ES2211603T3 - Dispositivo de ensayos analiticos con substrato dotado de canales pasantes y metodos mejorados y aparato para su utilizacion. - Google Patents

Abstract

Método para el análisis de una o varias muestras de fluido para detectar la presencia, cantidad o identidad de uno o varios analitos opcionalmente presentes en dichas muestras, cuyo método comprende las siguientes etapas: (a) disponer un dispositivo que comprende uno o varios pocillos redondos con un diámetro fijo, exponiendo dichos pocillos un substrato de un grosor específico, y estando dotada el área del substrato expuesto en el pocillo, como mínimo, de una substancia de unión específica para, como mínimo, uno de dichos analitos, (b) añadir una cantidad de fluido de muestra a uno o varios de los pocillos del dispositivo, (c) generar un flujo alternativo a través del substrato de los pocillos aplicando una diferencia de presión alternativa sobre el substrato en los pocillos, de manera que el volumen de líquido del fluido de muestra es forzado a pasar a través del substrato desde el lado superior del mismo al lado inferior de substrato y nuevamente a la inversa como mínimo una vez, en condiciones que son favorables para la reacción entre cualquier analito presente en la muestra y una substancia o substancias de unión, (d) proceder a la lectura de cualquier señal generada en cualquiera de los pocillos, y (e) determinar a partir de dichas señales la presencia, cantidad y/o identidad de dicho analito o analitos caracterizado porque se utiliza un substrato que tiene canales pasantes orientados y porque se aplica una diferencia de presión alternativa inferior a la presión capilar de los canales del substrato.

Description

Dispositivo de ensayos analíticos con substrato dotado de canales pasantes y métodos mejorados y aparato para su utilización.

La presente invención se refiere a un dispositivo para llevar a cabo un ensayo, el cual comprende un substrato que tiene unos canales pasantes orientados, cuyos canales se abren en una superficie para aplicación de muestra, estando dotados los canales por lo menos en un área de la superficie para la aplicación de muestras con la primera substancia de unión capaz de efectuar la unión a un analito.

Un dispositivo de este tipo se da a conocer en la Patente WO95/11755 para aplicaciones de "secuenciado por hibridación". El dispositivo comprende un substrato dotado de canales, estando orientados éstos perpendicularmente de manera sustancial a la superficie del substrato. Se dan a conocer tres tipos de substratos. El primer tipo está formado por una serie de fibras de vidrio huecas. Se fabrica por apilamiento de fibras de vidrio que tienen un núcleo atacable, dotando al apilamiento de extremos planos, puliendo dichos extremos, y efectuando el ataque de los núcleos habitualmente con ácido. El segundo tipo de substrato es producido por ataque electroquímico de una oblea de silicio cristalino. En primer lugar, la posición de los canales así como sus dimensiones se definen utilizando métodos fotolitográficos estándar. A continuación, los canales orientados son formados electroquímicamente. El tercer tipo de substrato es producido por ataque de guiado nuclear de un substrato inorgánico. Este método comprende las etapas de exponer el substrato a partículas pesadas, dotadas de energía y efectuando ataque en húmedo, dando como resultado un substrato con canales dispuestos al azar sobre la superficie del substrato. Con densidades de poros más elevadas y mayor porosidad, existen mayores probabilidades de fusión de canales, que muestran reducida resistencia al flujo con respecto a los otros canales no fusionados.

Los tres tipos de substratos son muy caros a causa de los procedimientos de fabricación que requieren una importante proporción de mano de obra y/o por utilizar materiales iniciales de elevado precio y por una operativa que tiene muchos desperdicios, tal como aserrado y pulido, y/o equipos de elevado precio. Además, los substratos se caracterizan por una porosidad relativamente baja de 30% o menos. De manera ventajosa, se ha dicho que se pueden conseguir porosidades más elevadas de hasta 80%, pero solamente para densidades de canales relativamente bajas, con la desventaja de que la superficie efectiva de los canales de un área particular del substrato es más baja en comparación con un substrato que tiene una porosidad comparable pero con densidades de canales más elevadas (y como consecuencia canales más estrechos). Los substratos basados en silicio que se dan a conocer en el documento WO95/11755 no son transparentes a la luz. Por lo tanto, estos substratos deterioran la utilización ventajosa de sistemas marcadores ópticos para la detección de analitos unidos en el substrato. Los sistemas marcadores ópticos conocidos se basan, por ejemplo, en reacciones de color inducidas enzimáticamente, en bio- o quimio-luminiscencia, o en fotoluminiscencia. En este último caso, la luz de excitación y la luz emitida tienen que atravesar el material del substrato.

Otro dispositivo que comprende un substrato con canales pasantes orientados se describe en la solicitud de Patente pendiente con la actual número EP98/04938, cuyo contenido se incorpora a la actual a título de referencia. En la Patente EP98/04938 se da a conocer un dispositivo en el que el substrato poroso es una membrana de óxido metálico elaborada electroquímicamente.

Las membranas de óxido metálico con canales pasantes orientados se pueden fabricar de manera económica por ataque electroquímico de una chapa metálica. Los metales que entran en consideración son, entre otros, tántalo, titanio y aluminio, así como aleaciones de dos o más metales y metales con dopaje y aleaciones. Las membranas de óxido metálico son transparentes, especialmente en húmedo, lo que permite ensayos utilizando diferentes técnicas ópticas. Estas membranas tienen canales orientados con diámetro bien controlado y características superficiales químicas ventajosas. Cuando se utilizan en un ensayo los canales de, por lo menos, un área de la superficie de la membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente, están dotados de una primera substancia de unión capaz de unirse a un analito. De acuerdo con una realización preferente, la membrana de óxido metálico está formada por óxido de aluminio.

Por lo tanto, las membranas de óxido de aluminio pueden adaptarse a elevadas densidades de áreas comprendiendo primeras substancias de unión. Las membranas de óxido de aluminio con canales pasantes orientados se dan a conocer en el trabajo de Rigby, W.R. y otros (Trans. Inst. Metal Finish., 68(3), p.95, 1990). Estas membranas fueron utilizadas para purificar virus, y para almacenar enzimas a efectos de detección, y, tal como se da a conocer en la Patente EP98/04938, se observó que eran muy apropiadas como substratos en dispositivos de flujo pasante, por ejemplo, para ensayos basados en sondas.

Los reactivos utilizados en estos ensayos son inmovilizados en los canales de los substrato y el fluido de muestra será forzado a pasar por los canales en contacto con los reactivos.

La Patente WO 87/07954 da a conocer un ejemplo de un método, según el preámbulo de la reivindicación 1, y de un aparato, según el preámbulo de la reivindicación 15.

En la Patente WO87/07954 se describe una modificación de un llamado dispositivo de vacío de colector: La permeabilidad de la base de los pocillos, por ejemplo, en una placa de microtitulación de 96 pocillos se utiliza para mejorar la mezcla de fluido en los pocillos, al aplicar de manera repetida una diferencia de presión sobre la base porosa del pocillo, forzando de esta manera el fluido a que atraviese la base y, después de ello, pase hacia adentro del pocillo. Se ha demostrado que este procedimiento tiene como resultado una mejor mezcla de los ingredientes (por ejemplo, gránulos, microesferas u otros elementos de la pequeña muestra de fluido en los pocillos) y, por lo tanto, es una alternativa para los métodos de mezcla mecánica tales como burbujeo, agitación por torbellino o agitación del fluido de la muestra por una placa de turbulencia.

Por ejemplo, tal como se describe en la Patente WO87/07954, se formaron fibras de vidrio unidas a antígenos constituyendo un filtro y se utilizaron como base de los pocillos de una placa de colector. Se lleva a cabo un inmunoensayo enzimático de manera que un precipitado púrpura, altamente visible, es formado con dimensiones suficientemente grandes para su retención por el filtro.

El objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer métodos mejorados de contacto de un flujo a través de un dispositivo que comprende un substrato con canales pasantes orientados con el fluido de muestra. Por lo tanto, la presente invención da a conocer nuevas formas no evidentes de llevar a cabo el ensayo utilizando flujo a través de dispositivos con canales pasantes orientados en los que se han inmovilizado reactivos. Se hace utilización de las fuerzas capilares de los canales en el substrato. Basándose en las dimensiones del substrato y el dispositivo en el que se utiliza, se da a conocer un método óptimo de contacto del fluido de muestra con los reactivos en los canales.

Con la presente invención se ha descubierto que, basándose en los parámetros físicos del substrato, el dispositivo y el volumen de la muestra, se puede conseguir un método muy eficaz y sensible para analizar fluidos de muestra. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para analizar una o varias muestras de fluidos para determinar la presencia, cantidad o identidad de uno o varios analitos opcionalmente presentes en dichas muestras, cuyo método comprende las siguientes etapas:

(a)

disponer un dispositivo que comprende uno o varios pocillos redondos con un diámetro fijo, cuyos pocillos exponen un substrato con un grosor específico, cuyo substrato tiene canales pasantes orientados, y el área del substrato expuesto en el pocillo está dotada, como mínimo, de una substancia de unión específica como mínimo para uno de dichos analitos,

(b)

añadir una cantidad de fluido de muestra a uno o varios de los pocillos del dispositivo, calculándose la cantidad de fluido de muestra añadido en base a las dimensiones de los pocillos y el substrato,

(c)

generar un flujo alternativo a través del substrato en los pocillos, de manera que el volumen de líquido del fluido de muestra es obligado a atravesar los canales del substrato desde la cara superior del mismo hacia la cara inferior del substrato, y nuevamente como mínimo una vez, en condiciones que son favorables a una reacción entre un analito presente en la muestra y la substancia o substancias de unión,

(d)

leer cualquier señal generada en cualquiera de los pocillos y

(e)

determinar a partir de dicha señal o señales la presencia, cantidad y/o identidad de dicho analito o analitos.

En caso necesario (por ejemplo, en caso de un ensayo en el que se requiere una etapa de separación sin unión), el substrato puede ser lavado antes de la lectura de la señal.

Con el método según la presente invención, la mezcla del fluido de muestra es favorecida durante la realización del ensayo, así como un contacto óptimo entre el fluido de la muestra y el interior de cada uno de los canales pasantes en los que están inmovilizadas las substancias de unión.

Los substratos del dispositivo tienen canales pasantes orientados que han sido dotados de una o varias substancias de unión, específicas para uno o varios analitos presentes en la muestra. Cuando se aplica una gota de líquido de muestra a la superficie superior del substrato, ésta pasa por los canales del substrato, entrando en contacto de esta manera con las substancias de unión de dichos canales.

Los canales del substrato son capilares y tienen una presión capilar muy elevada. Siempre que un volumen sobrante sobre la superficie de la membrana ha sido succionado a través de los capilares, esta presión capilar impedirá que los mismos canales se vacíen. Esto significa que finalmente se detendrá el flujo, y que la gotita formada en la otra cara de la membrana no se verá influenciada por la diferencia de presión superpuesta. Con la presente invención, se ha observado que este efecto se puede aprovechar para mejorar el contacto entre el líquido de muestra y el substrato con las substancias de unión inmovilizadas sobre el mismo.

Una de las ideas subyacentes, en la presente invención, consiste en controlar las dimensiones del volumen de muestra, o ajustarlas al parámetro del diseño del dispositivo (o al revés) y tener las ventajas de los efectos descritos anteriormente para mejorar la sensibilidad y rendimiento de los ensayos bioquímicos llevados a cabo con dichas substancias sobre las que se han inmovilizado las substancias de unión.

En cada ensayo bioquímico hay ciertos parámetros que se tienen que tomar en consideración cuando se determina el volumen de muestra utilizado. Desde luego, el volumen de muestra, positivo para un cierto analito, debe comprender analito suficiente para generar una señal detectable en un ensayo. Cuando la concentración esperada de cierto analito es muy baja, se necesitan cantidades más grandes del líquido de muestra, si no se toman otras medidas (por ejemplo, concentración de la muestra de líquido, amplificación de la señal o bien, por ejemplo, cuando se detecta ácido nucleico, incrementando exponencialmente la cantidad de "secuencia objetivo" en la muestra mediante una técnica de amplificación de ácido nucleico).

Por otra parte, los volúmenes de muestra no deben ser tampoco demasiado pequeños. Si la substancia de unión es inmovilizada sobre una superficie, entonces el volumen de la muestra debe ser suficientemente grande para tener capacidad de humectar toda la superficie o, como mínimo, para asegurar un buen contacto entre la superficie y el volumen. Por lo tanto, para la mayor parte de ensayos bioquímicos hay unos volúmenes de muestra más o menos estándar.

Con el método de la invención, se puede utilizar un dispositivo que comprende uno o varios pocillos redondos con un diámetro fijo. En cada pocillo, se expone el substrato que tiene canales bastante orientados, y el área del substrato expuesta en el pocillo es dotada, como mínimo, de una substancia de unión específica, como mínimo, para uno de dichos analitos.

Muchos de los pocillos redondos pueden quedar dispuestos en una placa, por ejemplo, poniendo el substrato entre la tapa superior y una tapa inferior, de manera que los pocillos son formados por orificios realizados en el mismo lugar tanto en la tapa superior como en la tapa inferior (ver figura 1). El volumen de líquido, que es colocado en cada pocillo para llevar a cabo el ensayo, se puede optimizar basándose en las características del fluido de muestra y la membrana.

Con el método de la invención, el volumen de la muestra se puede ajustar, basándose en los parámetros de diseño del dispositivo y el substrato, en particular: el volumen de la muestra no debe superar un cierto valor máximo. Los volúmenes de la muestra, aplicados a cierto pocillo del dispositivo, que superan el valor máximo se desprenderán del substrato debido al peso del fluido.

No obstante, un volumen de fluido de muestra con un peso por debajo del valor máximo permanecerá fijado a la superficie inferior del substrato debido a la tensión superficial del fluido.

Cuando se utilizan muestras con un volumen por debajo de este valor máximo, ello posibilita una utilización mucho más eficaz del substrato. Un volumen que permanece acoplado a la superficie inferior puede establecer contacto con la superficie interior de los canales del substrato nuevamente, generando un flujo inverso a través del substrato, hasta que el volumen completo del fluido de muestra vuelve a su posición original, es decir: sobre la superficie superior del substrato donde ha sido aplicado.

El procedimiento se puede repetir y se puede generar un flujo alternativo a través del substrato tan frecuentemente como sea necesario, asegurando un contacto óptimo entre el fluido de muestra y la superficie interior del substrato en la que se ha situado la mayor parte de las substancias de unión.

Preferentemente, el volumen del fluido de muestra es controlado de manera que no se caerá del substrato por la acción de su peso. Esto impone ciertas restricciones en el máximo volumen de muestra que se puede manipular por un dispositivo con unas dimensiones determinadas. Por lo tanto, si un cierto volumen de muestra es absolutamente necesario para poder realizar un ensayo, entonces las dimensiones del substrato y el dispositivo se ajustarán de acuerdo con ello (para evitar la utilización de un volumen de muestra que se pueda desprender del dispositivo debido a su peso). Si el volumen de la muestra no es crítico, se puede utilizar un dispositivo con dimensiones fijas, y el volumen de la muestra se puede ajustar a las dimensiones del dispositivo. En cualquier caso, las dimensiones del dispositivo y del substrato deben "ajustarse" al volumen de la muestra y otras características del fluido de la misma. El volumen máximo que permanecerá acoplado a la superficie cuando ha pasado a través de los canales capilares se puede calcular.

Las dimensiones importantes, en este caso, son las características del fluido (\gamma: tensión superficial, \rho: más específica, g: aceleración de la gravedad), las dimensiones del pocillo y las dimensiones del substrato. La relación entre el volumen máximo que quedará acoplado a la superficie inferior del substrato (V_{max2}) y estas dimensiones está controlada por la siguiente ecuación:

V_{max2}=\pi \cdot R_{pocillo}\cdot \left(\frac{2\cdot \gamma }{\rho \cdot g}+R_{pocillo}\cdot d\right)

en la que:

R_{well}=

diámetro de un pocillo

d=grosor

del substrato

\vartheta=ángulo

de contacto entre el fluido de la muestra y la superficie del substrato

\gamma=tensión

superficial del líquido de la muestra

\rho=masa

específica del líquido de la muestra

g=9,8

m/s^{2}

Por lo tanto, para impedir que el volumen de la muestra de líquido se desprenda del substrato, dicho volumen de la muestra no debe superar preferentemente V_{max2}.

Una gota de fluido de muestra sobre la superficie de la membrana adoptará automáticamente forma esférica. El ángulo de contacto entre la superficie y el líquido es característico del material y será siempre menor de 90 grados. La gota esférica que se ha formado penetrará inmediatamente en los canales capilares de substrato con una velocidad que está determinada por las dimensiones de los canales capilares y el ángulo de contacto con el substrato.

El método de la invención tiene también como resultado una mezcla mejor del volumen de muestra. Se ha demostrado que una mezcla eficaz es el resultado de la forma de la gotita y de un flujo homogéneo a través del substrato.

En una realización preferente de la invención, el volumen de la muestra y los parámetros del dispositivo se ajustan para aprovechar este efecto y para hacer máxima la mezcla del fluido. Por lo tanto, cualquier analito presente en la muestra recibirá contacto finalmente de las substancias de unión inmovilizadas en el substrato.

El efecto de mezcla de la diferencia de presión sobre el volumen de la muestra está relacionado con la forma de la superficie del líquido en un pocillo del dispositivo.

Se utilizan volúmenes de muestras preferentes que formen una gota con una superficie esférica sobre el pocillo.

Para asegurar el efecto de mezcla mejorado se debe escoger un volumen eficaz de la muestra.

Cuando el volumen de la muestra es demasiado elevado, el pocillo rebosará y la forma de la gota del volumen de muestra se alterará o la muestra pasará a otros pocillos, en cualquier caso no se puede asegurar que el mismo fluido de la muestra es el que se bombea por los canales del substrato en un pocillo específico. El volumen de la muestra viene también influenciado por las otras dimensiones del pocillo. Un pocillo del dispositivo tendrá una cierta profundidad y un cierto radio. Por lo tanto, en el caso en que se desee mantener un determinado volumen de muestra restringido a un pocillo determinado, las dimensiones del pocillo tienen que ser tomadas en consideración cuando se calcula el volumen de la muestra. Asimismo, si se requiere un cierto volumen de muestra para un ensayo específico, se tendrán que ajustar las dimensiones del pocillo de acuerdo con el volumen de la muestra necesario.

El ángulo de contacto entre la muestra y el material del dispositivo y la geometría del pocillo determinarán el volumen de muestra más grande que se puede utilizar antes de que tenga lugar el rebose. La relación entre este volumen de muestra máximo (V_{max}) y los otros parámetros está determinada por la siguiente ecuación:

V_{max}=\pi \cdot R_{pocillo}{}^{2}\cdot \left(d+\frac{R_{pocillo}}{3\cdot sin^{3}\vartheta } (1-cos\vartheta )^{2} (2+cos\vartheta )\right)

en la que:

R_{pocillo}

= radio del pocillo

d

= grosor del substrato

\vartheta

= ángulo de contacto entre el fluido de la muestra y la superficie del substrato.

En una realización preferente de la invención se utilizó el volumen de muestra que cumple todas las exigencias indicadas anteriormente. Por lo tanto, no supera V_{max2} para asegurar que la gota del fluido de muestra no se caerá del dispositivo en la superficie inferior. El fluido de muestra tampoco debe superar V_{max} para asegurar que los pocillos del dispositivo no rebosan cuando se aplica la muestra. Por lo tanto, el volumen de la muestra preferentemente no debe superar el valor inferior de V_{max2} y V_{max}.

El volumen de la muestra puede atravesar el substrato bajo la influencia de un diferencial de presión. El flujo a través del substrato es homogéneo. A causa de la elevada presión capilar de los canales (capilares) en el substrato, el flujo cesará automáticamente cuando ya no quede ninguna muestra en la superficie superior del substrato.

La presión capilar del substrato en un pocillo será habitualmente mucho más elevada que el diferencial de presión que es aplicado para generar el flujo. Por lo tanto, es virtualmente imposible "empujar el fluido del substrato" aplicando un diferencial de presión demasiado elevado. El flujo a través del substrato debe ser optimizado de acuerdo con el ensayo que se lleva a cabo. Desde luego el flujo debe ser tal que permita la unión de un analito a la substancia de unión.

El lavado de la membrana puede ser llevado a cabo, por ejemplo, aplicando gotitas múltiples de un líquido de lavado sobre la parte superior del substrato en un pocillo sometido a una presión constante sobre el substrato. A causa del flujo homogéneo, todas las partes del substrato se lavarán con igual eficacia.

Cuando el volumen acumulado de las gotitas supera V_{max2} el fluido de lavado se caerá. Para retirar gotitas fijadas al final de la etapa de lavado, por ejemplo, se puede utilizar una contraplaca hidrofílica conformada de forma especial.

Además la presente invención proporciona dispositivos con substratos que tienen canales pasantes orientados, cuyo diseño y dimensiones han sido optimizados para la utilización con el método de la invención, así como un aparato en el que se puede llevar a cabo de forma automatizada el método según la invención.

Un dispositivo que puede ser utilizado con el método de la invención comprende preferentemente uno o varios pocillos redondos con un diámetro fijo, exponiendo un substrato con un grosor específico, teniendo dicho substrato canales pasantes orientados, estando dotados los canales de una primera substancia de unión por lo menos en una área del substrato de manera que dicho substrato es colocado entre una capa superior y una capa inferior y los pocillos son formados por orificios realizados en la misma situación tanto en la capa superior como en la capa inferior (figura 1).

Al construir el dispositivo de este modo, es posible diseñar y fabricar dispositivos ajustados a la utilización de un determinado volumen de muestra. El substrato quedará expuesto en los pocillos que han sido definidos por los orificios realizados en la capa superior y en la capa inferior. La profundidad de cada pocillo se puede escoger ajustando el grosor de la placa de capa. Un volumen de muestra puede ser colocado en los pocillos definidos por los orificios redondos realizados en la placa de capa superior y el ángulo de contacto válido para el material de la placa y el fluido de la muestra. Cuando se aplica una diferencia de presión al dispositivo, el volumen de la muestra será obligado a pasar a través del substrato en los pocillos y aparecerá como gotita pendiente de un substrato en la abertura redonda realizada en la placa de cubrición inferior.

El material del que se pueden fabricar las placas puede ser cualquier material conocido en esta técnica, por ejemplo, el material de las placas de microtitulación. El material de las placas no debe dificultar la detección de cualquier señal procedente del substrato.

Los resultados del ensayo se pueden leer al observar la superficie del substrato. Esto se puede realizar por cualquier forma conocida en esta técnica.

El dispositivo de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado para detectar muchos analitos al mismo tiempo. Por ejemplo, comprobando diferentes analitos en diferentes pocillos del dispositivo. El dispositivo puede ser utilizado asimismo para rastrear múltiples muestras, por ejemplo llevando a cabo el mismo ensayo para una diferente muestra de cada pocillo.

Preferentemente la substancia de unión acoplada al substrato se escoge entre el grupo que consiste en sondas de ácido nucleico, anticuerpos, antígenos, receptores, haptenos y un ligando para un receptor.

Los ensayos en los que se puede utilizar el dispositivo según la presente invención puede incluir el secuenciado por hibridación, inmunoensayos, ensayos receptor/ligando y similares.

Cuando se usa el dispositivo como herramienta para obtener información de secuencia de ADN, se consigue un largo conjunto de áreas cada una de las cuales comprende como primera substancia de unión una sonda oligonucleótido de diferente secuencia base-par. El substrato de cada pocillo del dispositivo puede quedar dotado de un conjunto de puntos ("spotted array"), comprendiendo cada punto una substancia de unión diferente. Dado que un dispositivo puede tener muchos pocillos, se podrían colocar muchos conjuntos en un dispositivo o bien un conjunto podría ser dividido en diferentes pocillos.

Si una muestra que contiene fragmentos de ADN o ARN con una secuencia (parcialmente) desconocida se lleva a establecer contacto con el substrato, puede tener lugar un modelo de hibridación específico del cual se puede derivar la información de secuencia del ADN/ARN. Estos métodos de "secuenciado por hibridación" son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Fodor, S.P.A. y otros (1992), Science 251, 767-773 y Southern, E.M. y otros (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1368-1373).

El dispositivo de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado también para rastrear un elemento biológico, tal como sangre, en cuanto a un gran número de analitos. El conjunto puede comprender áreas dotadas de sondas de oligonucleótidos específicas, por ejemplo, E. coli, S. aureus, S. pneumoniae etc. Una muestra biológica puede ser preparada tal como se describe en la Patente EP 0.389.063. Si esta muestra se lleva a establecer contacto con el substrato, se puede leer el modelo de hibridación resultante, por ejemplo utilizando una cámara CCD en combinación con un marcador óptico apropiado.

Aparte del rastreo de bacterias, el dispositivo es adecuado para la detección de virus, así como para clasificación de diferentes subtipos, por ejemplo, virus HIV y HCV, etc. La clasificación de virus puede ser esencial para determinar potencial resistencia a los medicamentos. En general requiere capacidad de detectar mutaciones de punto único en el ARN del virus.

El dispositivo es también adecuado para llevar a cabo inmunoensayos sandwich. En este caso es preferible que se utilice un segundo anticuerpo para su unión al analito unido, siendo reconocido dicho segundo anticuerpo para cada uno de los analitos por un tercer anticuerpo etiquetado. Esto se puede conseguir si el segundo y tercer anticuerpos se derivan de diferentes especies y el tercer anticuerpo es cultivado contra anticuerpos de otras especies. Por lo tanto, se evita etiquetar el segundo anticuerpo para cada analito específico.

El dispositivo es asimismo adecuado para llevar a cabo "exploraciones rápidas" ("pepscans") tal como se da a conocer en Geysen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984). En este caso las primeras substancias de unión que son fijadas a las diferentes áreas del substrato constituyen diferentes secuencias de aminoácidos. Si el substrato se lleva a establecer contacto con un líquido que contiene un analito específico, puede tener lugar un modelo de reacción que representa la afinidad específica del analito para las diferentes secuencias de aminoácido.

Es preferible que la substancia de unión se una de forma covalente al substrato.

Esto minimiza las pérdidas de la substancia de unión desde el substrato. La unión covalente de un compuesto orgánico con un óxido metálico es bien conocida en esta técnica, por ejemplo utilizando el método descrito por Chu. C.W., y otros (J. Adhesion Sci. Technol., 7, páginas 417-433, 1993) y Fadda, M.B. y otros (Biotechnology and Applied Biochemistry, 16, pp.221-227, 1992).

El substrato es preferentemente una membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente, preferentemente compuesto por óxido de aluminio. Estas membranas se describen en la solicitud pendiente con la actual EP98/04938.

La presente invención se refiere además a un aparato para llevar a cabo el método de la invención.

Un aparato según la invención comprende:

-

medios para la adición de una cantidad controlada de un fluido como mínimo a uno de los pocillos del dispositivo,

-

medios para aplicar y/o mantener durante un tiempo suficiente una diferencia de presión controlada sobre el substrato en cada uno de los pocillos.

Preferentemente el aparato comprendería también medios para controlar la temperatura alrededor del dispositivo. Por lo tanto el dispositivo puede quedar dotado de un incubador en el que queda colocado el dispositivo para asegurar una temperatura constante en cada pocillo. De este modo, un aparato según la invención permitiría la adición controlada de fluido de muestras a los pocillos. Como medio para aplicar el fluido de muestra a los pocillos el aparato puede comprender un pipeteador que se puede desplazar sobre el substrato para añadir fluido a los diferentes pocillos correspondientes. El aparato puede comprender un pipeteador desplazable y se puede dirigir a diferentes pocillos o uno distinto para cada pocillo en particular. Los medios para aplicar el fluido se pueden conectar a recipientes para el fluido muestra y recipientes para fluido de lavado o similares. El aparato se debe construir de manera tal que la cantidad de fluido añadido a cada pocillo se puede controlar y se puede ajustar. Preferentemente el aparato comprende los controladores programables necesarios para poder alimentar el aparato con los parámetros relevantes en base a los cuales el controlador programable puede calcular el volumen de muestra adecuado.

El aparato comprende también medios para aplicar un diferencial de presión sobre el dispositivo.

La diferencia de presión puede también ser regulada por una unidad programable.

De este modo, el conjunto del aparato puede ser automatizado llevando a cabo el ensayo con la diferencia de presión y cantidades de fluido de muestra adecuadas, una vez está dotado de las instrucciones necesarias tales como detalles con respecto a la muestra y al substrato.

Para poder aplicar una diferencia de presión en el dispositivo, éste puede quedar situado como capa sobre un contenedor. Los medios para aplicar una diferencia de presión funcionarán en este caso cambiando la presión en el contenedor.

De manera conveniente el contenedor está conectado a una salida de fluido que se puede abrir y cerrar y a través de la cual se puede retirar cualquier líquido del contenedor.

El aparato está dotado preferentemente de un dispositivo de lectura capaz de leer una señal desde la superficie (superior) del substrato en cada uno de los pocillos.

El dispositivo de lectura puede leer una señal cuando se ha llevado a cabo el ensayo completo, pero también se puede utilizar para registrar el crecimiento de la señal mientras se lleva a cabo el ensayo. En este caso la reacción entre el analito y la substancia de unión se puede controlar de manera continuada durante la alteración del flujo a través del substrato leyendo la señal procedente de la superficie superior de la membrana siempre que el fluido haya pasado a través del substrato y retenga una gota por debajo del mismo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: En esta figura se ha mostrado la forma en la que el fluido forma una gota en forma de bola en la parte superior de la membrana, hasta que se aplica una presión negativa. La gotita es succionada a través del dispositivo. Como resultado de la forma de la gotita y el flujo homogéneo a través de la membrana, el fluido se mezcla de manera efectiva.

Figura 2: En esta figura se ha mostrado la forma en la que la inversión de la presión invertirá el proceso. Finalmente la gotita se encuentra encima de la membrana nuevamente.

Figura 3: En esta figura se han indicado los parámetros relevantes del dispositivo que determinan la mayor dimensión de la gotita antes de que tenga lugar su expansión.

Figura 4: En esta figura se han indicado los parámetros relevantes que determinan el mayor tamaño de la gotita antes de que la gotita se desprenda del dispositivo a causa de su peso.

Claims (26)

1. Método para el análisis de una o varias muestras de fluido para detectar la presencia, cantidad o identidad de uno o varios analitos opcionalmente presentes en dichas muestras, cuyo método comprende las siguientes etapas:

(a)

disponer un dispositivo que comprende uno o varios pocillos redondos con un diámetro fijo, exponiendo dichos pocillos un substrato de un grosor específico, y estando dotada el área del substrato expuesto en el pocillo, como mínimo, de una substancia de unión específica para, como mínimo, uno de dichos analitos,

(b)

añadir una cantidad de fluido de muestra a uno o varios de los pocillos del dispositivo,

(c)

generar un flujo alternativo a través del substrato de los pocillos aplicando una diferencia de presión alternativa sobre el substrato en los pocillos, de manera que el volumen de líquido del fluido de muestra es forzado a pasar a través del substrato desde el lado superior del mismo al lado inferior de substrato y nuevamente a la inversa como mínimo una vez, en condiciones que son favorables para la reacción entre cualquier analito presente en la muestra y una substancia o substancias de unión,

(d)

proceder a la lectura de cualquier señal generada en cualquiera de los pocillos, y

(e)

determinar a partir de dichas señales la presencia, cantidad y/o identidad de dicho analito o analitos

caracterizado porque se utiliza un substrato que tiene canales pasantes orientados y porque se aplica una diferencia de presión alternativa inferior a la presión capilar de los canales del substrato.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el substrato es lavado antes de la lectura de la señal.

3. Método, según la reivindicación 1, en el que la cantidad de fluido de muestra añadido se calcula en base a las dimensiones y/o características materiales de los pocillos, el substrato y el fluido de muestra.

4. Método, según la reivindicación 3, en el que la cantidad de fluido de muestra añadido a cada pocillo no supera V_{max2}, y V_{max2} se calcula de acuerdo con las siguientes ecuaciones:

V_{max2}=\pi \cdot R_{pocillo}\cdot \left(\frac{2\cdot \gamma }{\rho \cdot g}+R_{pocillo}\cdot d\right)

en la que:

R_{pocillo}=

diámetro de un pocillo

d=

profundidad del pocillo

\vartheta

= ángulo de contacto entre el fluido de muestra y la superficie del substrato

\gamma

= tensión superficial del líquido de muestra

\rho

= masa específica del líquido de muestra

g=

9,8 m/s^{2}

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cantidad de fluido de muestra añadido a cada pocillo no supera V_{max}, y V_{max} se calcula de acuerdo con las siguientes ecuaciones:

V_{max}=\pi \cdot R_{pocillo}{}^{2}\cdot \left(d+\frac{R_{pocillo}}{3\cdot sin^{3}\vartheta }(1-cos\vartheta )^{2}(2+cos\vartheta )\right)

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el volumen de muestra no supera el menor valor de V_{max} y V_{max2}.

7. Método, según la reivindicación 1, en el que en la etapa c el flujo, a través de la membrana, es generado aplicando una diferencia de presión alternativa controlada sobre el substrato en los pocillos.

8. Método, según la reivindicación 7, en el que se crea un flujo descendente a través de los canales del substrato aplicando una presión inferior por debajo del dispositivo, y dicha presión inferior se mantiene hasta que todo el fluido de muestra ha pasado a través de los canales del substrato y ha formado una gota que queda suspendida por debajo del substrato en el pocillo, a continuación se crea un flujo ascendente a través de los canales del substrato al elevar la presión hasta una sobrepresión suficiente y dicha sobrepresión se mantiene hasta que todo el fluido ha pasado a través de los canales nuevamente en dirección hacia arriba y ha formado una gota en la superficie superior del substrato, y repitiendo estas fases tantas veces como sea necesario para asegurar un contacto óptimo entre el analito o analitos y la substancia o substancias de unión.

9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la reacción entre el analito y la substancia de unión se controla de manera continuada durante la alteración del flujo a través del substrato por lectura de la señal desde la superficie superior de la membrana.

10. Método, según la reivindicación 9, en el que la señal es leída siempre que el fluido ha pasado a través del substrato y queda suspendido como gota por debajo del substrato.

11. Dispositivo para llevar a cabo un ensayo utilizando un método, según el preámbulo de la reivindicación 1, cuyo dispositivo comprende uno o más pocillos redondos con un diámetro fijo, exponiendo un substrato de un grosor específico dotado de una primera substancia de unión, como mínimo en un área del substrato, de manera que el substrato es situado entre una tapa superior y una tapa inferior y los pocillos son formados por orificios realizados en lugares correspondientes en la tapa superior y en la tapa inferior, caracterizado porque dicho substrato tiene canales pasantes orientados, estando dotados los canales de una primera substancia de unión como mínimo en un área del substrato, y porque el dispositivo es adecuado para aplicar una diferencia de presión alternativa inferior a la presión capilar de los canales en el substrato.

12. Dispositivo, según la reivindicación 11, en el que el substrato es una membrana de óxido metálico fabricada por métodos electroquímicos.

13. Dispositivo, según la reivindicación 12, en el que la membrana de óxido metálico está compuesta por óxido de aluminio.

14. Dispositivo, según la reivindicación 11, en el que el substrato de cada pocillo está dotado de un conjunto de puntos ("spotted array"), comprendiendo cada uno de los puntos una substancia de unión distinta.

15. Dispositivo, según la reivindicación 14, en el que las substancias de unión diferentes son oligonucleótidos.

16. Aparato para la realización automatizada de uno o varios ensayos utilizando un dispositivo para realizar un ensayo que comprende uno o varios pocillos redondos con un diámetro fijo, exponiendo una substancia de un grosor específico, quedando dispuesta una primera substancia de unión como mínimo en un área del substrato, de manera que el substrato es colocado entre una tapa superior y una tapa inferior y los pocillos quedan constituidos por orificios realizados en lugares correspondientes tanto en la tapa superior como en la tapa inferior, comprendiendo dicho aparato:

- medios para la adición de una cantidad controlada de un fluido como mínimo a uno de los pocillos del dispositivo, y

- medios para aplicar una diferencia de presión alternativa controlada sobre el substrato en cada uno de los pocillos,

caracterizado porque el aparato está adaptado para llevar a cabo un ensayo utilizando un dispositivo en el que los pocillos exponen un substrato que tiene canales pasantes orientados, dotado de una primera substancia de unión por lo menos en un área del substrato, y porque el aparato comprende medios para aplicar una diferencia de presión alternativa controlada que es inferior que la presión capilar de los canales del substrato.

17. Aparato, según la reivindicación 16, en el que los medios para la adición de un fluido están conectados a un recipiente para un fluido de muestra y/o un recipiente para un fluido de lavado de los pocillos.

18. Aparato, según la reivindicación 16, que comprende además medios para controlar la temperatura alrededor de un dispositivo.

19. Aparato, según la reivindicación 16, en el que el dispositivo está situado como tapa en la pared de un contenedor y los medios para aplicar un diferencial de presión funcionan cambiando la presión en el contenedor.

20. Aparato, según la reivindicación 16, en el que el contenedor está conectado a una salida de fluido que se puede abrir y cerrar, y a través de la cual se puede eliminar cualquier cantidad de líquido del contenedor.

21. Aparato, según la reivindicación 16, que comprende un dispositivo de lectura capaz de leer una señal de la superficie superior del substrato de cada uno de los pocillos.

22. Aparato, según la reivindicación 16, que está dotado de un controlador programable para los medios para adición de fluido y medios para aplicar una diferencia de presión.

23. Aparato, según la reivindicación 22, en el que los medios para la adición de fluido están conectados a una unidad de control programada para controlar el volumen añadido del líquido de muestra que se añade a cada uno de los pocillos basándose en ciertas características del fluido y del substrato y dimensiones del pocillo.

24. Aparato, según la reivindicación 23, en el que dicho volumen añadido es igual a V_{max} o V_{max2}, cualquiera de ellos que sea el más reducido y V_{max} y V_{max2} se calculan de acuerdo con las siguientes ecuaciones:

V_{max}=\pi \cdot R_{pocillo}{}^{2}\cdot \left(d+\frac{R_{pocillo}}{3\cdot sin^{3}\vartheta }(1-cos\vartheta )^{2}(2+cos\vartheta )\right)

V_{max2}=\pi \cdot R_{pocillo}\cdot \left(\frac{2\cdot \gamma }{\rho \cdot g}+R_{pocillo}\cdot d\right)

en las que:

R_{pocillo}=

diámetro de un pocillo

d=

grosor del substrato

\vartheta

= ángulo de contacto entre el fluido de muestra y la superficie del substrato

\gamma

= tensión superficial del líquido de muestra

\rho

= masa específica del líquido de muestra

g=

9,8 m/s2

25. Utilización de un dispositivo, según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en un método para el análisis de una o varias muestras de fluido para determinar la presencia, cantidad o identidad de uno o varios analitos.

26. Utilización de un aparato, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, en un método de análisis de una o varias muestras de fluido para determinar la presencia, cantidad o identidad de uno o varios analitos.