ES2210258T5 - Procedimiento de tratamiento de la ateroesclerosis o reestenosis usando un agente estabilizante de microtubulos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION ES UN METODO PARA PREVENIR O REDUCIR LA ATEROSCLEROSIS O RESTENOSIS, Y UNA PREPARACION FARMACEUTICA UTILIZADA EN EL MISMO. EN PARTICULAR, ES UN METODO PARA PREVENIR O REDUCIR LA ATEROSCLEROSIS O RESTENOSIS DESPUES DE UN DAÑO ARTERIAL POR UN TRATAMIENTO CON UNA DOSIS BAJA DE UN AGENTE ESTABILIZANTE MICROTUBULO COMO UN TAXOL O UN DERIVADO DEL MISMO SOLUBLE EN AGUA. LA DOSIS PEQUEÑA UTILIZADA EN LA PRESENTE INVENCION EVITA EL BLOQUEO ARTERIAL MIENTRAS MINIMIZA CUALQUIER EFECTO SECUNDARIO NEGATIVO ASOCIADO CON EL MEDICAMENTO.

Description

Procedimiento de tratamiento de la ateroesclerosis o reestenosis usando un agente estabilizante de microtúbulos.

La presente invención se refiere al uso de un sistema de administración de fármaco que comprende un medio para administrar de manera local paclitaxel, un derivado de paclitaxel u óxido de deuterio diferente de la inyección o infusión intravenosa para la fabricación de una composición farmacéutica para la reducción o prevención del desarrollo de aterosclerosis, en la que los medios para la administración local de paclitaxel, un derivado de paclitaxel u óxido de deuterio soluble en agua, comprenden stents de polímeros eluyentes de fármacos biodegradables.

Además, la presente invención se refiere al uso de óxido de deuterio en la fabricación de una composición farmacéutica para la prevención de reestenosis o aterosclerosis en un paciente.

Además una realización de la presente invención es el uso de un derivado de paclitaxel soluble en agua en la fabricación de una composición farmacéutica para la prevención o reducción de aterosclerosis en un paciente En el que dicho derivado de paclitaxel se selecciona entre el grupo constituido por 2'-succinil-paclitaxel; 2'-succinil-paclitaxel trietanolamina; 2'-glutarilpaclitaxel; sal trietanolamina de 2'-glutarilpaclitaxel; 2'-O-éster con N-dimetilaminoetilo) glutamina; y sal clorhidrato de 2'-O-éster- con N-(dimetilaminoetilo) glutamina.

Más concretamente, la invención se refiere al uso descrito más arriba para el tratamiento de estos pacientes con una solución de paclitaxel a dosis baja para evitar o reducir el desarrollo de la aterosclerosis.

La vasculopatía es la principal causa de muerte e incapacidad en el mundo desarrollado, que afecta particularmente a los ancianos. Sólo en Estados Unidos, a pesar de las alentadoras disminuciones recientes, la cardiopatía vascular sigue siendo responsable de casi un millón de muertes cada año y de más de la mitad de todas las muertes; cada año se hospitalizan casi 5 millones de personas aquejadas de cardiopatía vascular. El coste de esta enfermedad, en cuanto a personas que la padecen y recursos materiales, es casi incalculable.

La aterosclerosis es la forma más común de vasculopatía y conduce a una administración insuficiente de sangre a los órganos corporales críticos, dando como resultado infarto de miocardio, apoplejía e insuficiencia renal. Además, la aterosclerosis causa complicaciones importantes en quienes sufren hipertensión y diabetes y, también, en los fumadores de tabaco. La aterosclerosis es una forma de lesión vascular crónica en la cual algunas de las células normales del músculo liso vascular ("VSMC") de la pared arterial, que normalmente controlan el tono vascular regulando el flujo sanguíneo, cambian su naturaleza y desarrollan un comportamiento de "tipo canceroso". Estas células VSMC se vuelven anormalmente proliferativas, segregando sustancias (factores de crecimiento, enzimas degradantes de tejidos y otras proteínas) que les permiten invadir las paredes interiores del vaso y propagarse dentro de las mismas, bloqueando el flujo sanguíneo y haciendo que vasos anormalmente susceptibles se bloqueen completamente por la coagulación local de la sangre, produciendo muerte del tejido abastecido por esa arteria.

Como resultado, existe la necesidad de un tratamiento quimioterapéutico satisfactorio que reduzca o evite el bloqueo arterial. La forma más eficaz de evitar esta enfermedad es hacerlo en el nivel celular, en lugar de mediante revascularización quirúrgica que puede acarrear un riesgo importante de complicaciones o la muerte, consume tiempo y dinero y es inconveniente para el paciente.

Los microtúbulos, organelas celulares presentes en todas las células eucarióticas, son necesarios para las actividades celulares normales. Son un componente esencial del huso acromático necesario para la división celular, y también para el mantenimiento de la forma celular y otras actividades celulares como la movilidad, el anclaje, el transporte entre organelas celulares, los procesos de secreción extracelular (Dustin, P. (1980) Sci. Am., 243: 66-76), además de la modulación de las interacciones entre los factores de crecimiento y los receptores de la superficie celular y la transducción de señales intracelulares. Además, los microtúbulos desempeñan un papel regulador crítico en la replicación celular ya que el oncogen c-mos y la quinasa CDC-2, que regulan la entrada en la mitosis, se unen a la tubulina y la fosforilan (Verde, F. et al. (1990) Nature, 343: 233-238), y el producto del gen supresor de tumor, p53, y el antígeno T de SV-40 se unen a la tubulina en un complejo ternario (Maxwell, S.A. et al. (1991) Cell Growth Differen., 2: 115-127). Los microtúbulos no son estáticos sino que están en equilibrio dinámico con sus subunidades de proteína soluble, los heterodímeros de tubulina \alpha y \beta. En condiciones fisiológicas la unión requiere guanosina trifosfato (GTP), y ciertas proteínas asociadas a los microtúbulos y organizadoras de los mismos y como cofactores; por otra parte, un nivel de calcio alto y temperaturas frías causan despolimerización.

Por tanto, es de esperar que la interferencia con este equilibrio normal entre el microtúbulo y sus subunidades interrumpa la división y la movilidad, además de otras actividades dependientes de los microtúbulos. Esta estrategia se ha usado con un éxito importante en el tratamiento de ciertos tumores malignos. En realidad, los agentes antimicrotúbulo como la colquicina y los alcaloides de la vinca están entre los fármacos anticáncer más importantes. Estos agentes antimicrotúbulo, que promueven la desagregación de los microtúbulos, desempeñan papeles importantes en la quimioterapia de los neoplasmas más curables, incluyendo la leucemia linfocítica aguda, los linfomas hodgkinianos y ahodgkinianos, y los tumores de células reproductoras, y también en el tratamiento paliativo de muchos otros cánceres.

El agente antimicrotúbulo más novedoso y promisorio en investigación es el paclitaxel. El paclitaxel es un agente antimicrotúbulo aislado de la corteza del tallo de Taxus brevifolia, el tejo occidental (Pacífico). A diferencia de otros antimicrotúbulos como los alcaloides de la colquicina y la vinca que promueven la desagregación de los microtúbulos, el paclitaxel actúa promoviendo la formación de microtúbulos inusualmente estables, inhibiendo la reorganización dinámica normal de la red de microtúbulos necesaria para la mitosis y la proliferación celular (Schiff, P.B., et al. (1979) Nature 277: 665; Schiff, P.B., et al. (1981) Biochemistry 20: 3247). En presencia de paclitaxel, la concentración de tubulina requerida para la polimerización es significativamente menor; la agregación de los microtúbulos se produce sin GTP y a temperaturas bajas, y los microtúbulos formados son más resistentes a la despolimerización por dilución, calcio, frío y fármacos inhibitorios. El paclitaxel se une reversiblemente a la tubulina polimerizada, y otros fármacos de unión de la tubulina se unen a esta aún en presencia de paclitaxel.

El paclitaxel tiene uno de los espectros de actividad antineoplásica más amplios, renovando un intenso interés por las estrategias quimioterapéuticas dirigidas contra los microtúbulos (Rowinsky, E.K., et al. 1990) Jrnl. of Nat'l. Cancer Inst., 82:1247-1259). En estudios recientes, el paclitaxel ha mostrado una actividad importante en el cáncer de ovario avanzado y resistente al tratamiento (Binzig, A.I., et al. (1992) J. Clin. Oncol., 10: 1748), el melanoma maligno (Einzig, A.I. (1991) Invest. New Drugs, 9: 59-64), y en los cánceres de mama (Holmes, F.A., et al. (1991) JNCI, 83:1797-1805), cabeza y cuello y pulmón.

El paclitaxel ha sido estudiado por sus efectos contra el crecimiento tumoral en varios estudios clínicos usando varias pautas de administración. Se han observado reacciones alérgicas graves tras la administración de paclitaxel. Sin embargo, se ha demostrado que la incidencia y la gravedad de las reacciones alérgicas es afectada por la dosis y la velocidad de la infusión de este fármaco (Weiss, R.B., et al. (1990) J. Clin. Oncol. 8: 1263).

Las arritmias de paclitaxel están asociadas a arritmias cardiacas, y al igual que las reacciones alérgicas, su incidencia es afectada por la dosis y la velocidad de administración del fármaco. La bradicardia sinusal se presenta en el 40% de los pacientes y la arritmia Mobitz II en el 5% de los pacientes, comenzado 4-6 horas después del inicio de la infusión de paclitaxel, y continuando durante 4-8 horas después de terminada esta. En la mayoría de los pacientes, el ritmo anormal es transitorio, asintomático y hemodinámicamente estable, y no requiere medicamentos cardíacos o estimulación eléctrica. Además, se ha observado que la incidencia de eventos cardiacos graves es baja en los pacientes que reciben paclitaxel solo. Por consiguiente, se han usado tiempos de infusión de hasta 24 horas en el tratamiento con paclitaxel para disminuir la incidencia de la toxicidad y las reacciones alérgicas a los fármacos.

Durante la angioplastia, el inflado del catéter balón intrarterial produce la desendotelización, ruptura de la lámina elástica interna y lesión de las células del músculo liso de la capa media. Finalmente se produce la desdiferenciación de las células del músculo liso de la capa media vascular desde un fenotipo contráctil a un fenotipo secretor. Esto implica, principalmente, la secreción de metaloproteinasas por parte de las células del músculo liso vascular que degradan la membrana basal circundante, la proliferación y la migración quimiotáxica dentro de la íntima, y la secreción de una gran matriz extracelular, que forma la lesión fibroproliferativa de la neoíntima. Gran parte de la desdiferenciación fenotípica de las células del músculo liso vascular tras la lesión arterial es similar a la de las células neoplásicas (es decir, proliferación anormal, secreción de moléculas reguladoras del crecimiento y proteasa, migración e invasión basal).

La técnica no ha sugerido el uso de paclitaxel para prevenir o reducir la ateroesclerosis. Por tanto, el paso de la presente invención es evitar o reducir el desarrollo de aterosclerosis usando paclitaxel o un derivado del paclitaxel soluble en agua. Este mecanismo para evitar la aterosclerosis mediante la estabilización de los microtúbulos es apoyado por resultados análogos obtenidos en experimentos sobre proliferación celular y migración usando paclitaxel y ^{2}H_{2}O (óxido de deuterio), que ejercen efectos comparables sobre los microtúbulos a través de diferentes mecanismos subyacentes.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar una preparación farmacéutica para prevenir o evitar la aterosclerosis en que dicha preparación farmacéutica contenga una dosis baja de paclitaxel o de un derivado de paclitaxel soluble en agua.

Toda la bibliografía citada se incorpora aquí por referencia.

También son de especial interés las siguientes citas bibliográficas: El efecto inhibitorio de DMSO en la proliferación de células cultivadas de músculo liso arterial se comenta en Exp. and Molecular Pathology (1988), vol. 48, p. 48 - 58. Se investiga la relación entre este fenómeno y los microtúbulos citoplásmicos. Los mecanismos fisiopatológicos de la reestenosis posterior a la angioplastia coronaria se investigan en J. of Int. Med. (1993), vol. 233, p. 215 - 226. En Atherosclerosis (1982), vol. 44, p. 385 - 390 se investiga el uso de antitubulinas para el tratamiento de la aterosclerosis. En Circulation (1989), vol. 80/s-II, p. 66, se describen las investigaciones in vivo en conejos ateroscleróticos, y se investigó el beneficio del tratamiento con colquicina después de una angioplastia ilíaca. Las actividades normolipémicas de los derivados de acrilofenona, que también tienen propiedades antimicrotubulares, se describen en Meth. and Find. Clin. Pharmacol. (1985), vol. 7, no. 4, p. 183 - 187. En la patente de EE.UU. nº 5.223.269 (Liepins) se describen compuestos que contienen deuterio que se utilizan para el tratamiento de la hipertensión. En la patente de EE.UU. nº 5.157.049 (Haugwitz et al.) se describen derivados del paclitaxel solubles en agua que son útiles para el tratamiento del cáncer.

De acuerdo con los objetivos de la presente invención se proporciona un uso como el descrito más arriba para evitar o reducir la aterosclerosis, que comprende el tratamiento con un stent de polímero que elude fármaco biodegradable para la administración local de una cantidad terapéuticamente eficaz de paclitaxel, un derivado del paclitaxel u óxido de deuterio. Una cantidad terapéuticamente eficaz del agente es una cantidad suficiente como para evitar o reducir el desarrollo de la aterosclerosis. La invención además se refiere al uso de óxido de deuterio en la fabricación de una composición farmacéutica para la prevención de reestenosis o aterosclerosis en pacientes. También se refiere al uso de derivados de paclitaxel solubles en agua caracterizado en las reivindicaciones en la fabricación de una composición farmacéutica para la prevención de aterosclerosis n pacientes.

Este uso proporciona una forma eficaz de evitar o reducir el desarrollo de aterosclerosis en los pacientes susceptibles a esa enfermedad. Además, debido a que la dosis del agente quimioterapéutico es baja la posibilidad de un paciente de desarrollar reacciones adversas es potencialmente baja.

La Figura 1 representa la disminución inducida por el paclitaxel de la capacidad de VSMC de invadir filtros revestidos con proteínas de la membrana basal, y la inhibición por el paclitaxel de la incorporación de [^{3}H]-timidina a las células del músculo liso vascular cultivadas.

La Figura 2 muestra la inhibición por el paclitaxel de la acumulación de neoíntima en las células del músculo liso vascular después de la lesión por el catéter balón de la arteria carótida de la rata.

La Figura 3 representa la inhibición de la quimioinvasión de VSMC dependiente de la dosis producida por el óxido de deuterio, y la inhibición de la incorporación de bromodeoxiuridina (BrDU) a las células del músculo liso vascular producida por el óxido de deuterio.

La Figura 4 muestra que las concentraciones de paclitaxel causan la unión de los microtúbulos dependiente de la dosis en células del músculo liso vascular cultivadas sobre plástico.

La Figura 5 muestra la unión de los microtúbulos inducida por el óxido de deuterio en VSMC cultivadas.

El uso en la práctica de una realización en la presente invención puede realizarse mediante varias vías alternativas de administración del fármaco, como la inyección subcutánea o intraperitoneal, la infusión intravenosa continua, la ingestión oral o la administración local (directa), o una combinación de dos o más vías. Cuando se formula una solución para inyección o infusión continua, primero debe prepararse la solución de paclitaxel. El paclitaxel se administra mediante CTEP, DCT, NCI (IND nº 22850) como solución concentrada, 6 mg/ml, en viales de 5 ml (30 mg/vial) en un vehículo de aceite de castor polioxietilado (Cremophor EL®) al 50% y alcohol deshidratado, USP (50%). Los viales intactos se deben almacenar con refrigeración y diluirse antes de usar. Cuando se diluyen en inyección de dextrosa al 5% o cloruro de sodio al 0,9%, las concentraciones de paclitaxel de 0,3-1,2 mg/ml son física y químicamente estables durante al menos 12 horas a temperatura ambiente. (Datos de investigación del NCI; datos farmacéuticos (1990)). También se ha demostrado que las concentraciones de paclitaxel de 0,6 mg/ml diluidos en D5W o NS y 1,2 mg/ml diluidos en NS preparado en recipientes de poliolefina son estables al menos durante 25 horas a temperatura ambiente (20-23ºC). (Waugh, et al. (1990) Am. J. Hosp. Pharm. 48, 1520). Aunque estas concentraciones han exhibido estabilidad para los periodos antes mencionados, no significa que limiten la práctica de la presente invención donde puede utilizarse cualquier concentración de paclitaxel.

Todas las soluciones de paclitaxel muestran una nebulosidad directamente proporcional a las concentraciones de fármaco y el tiempo transcurrido después de la preparación. Después de la preparación de soluciones para infusión de paclitaxel se ha observado la formación de un pequeño número de fibras en la solución (dentro de los límites aceptables por la Prueba para el material formado de partículas de la Farmacopea de Estados Unidos (USP) para LVP). La formación de partículas no indica una pérdida de potencia del fármaco; sin embargo, no deben usarse las soluciones que muestren una formación excesiva de partículas. Por tanto, cuando se las administra por infusión continua, puede ser necesaria la filtración en la vía y se puede realizar incorporando un filtro hidrófilo, microporoso, con un tamaño de poro inferior a los 0,22 micrómetros (IVEX-HP In Line Filter Set-SL, 38,1 cm, modelo Abbott nº 4525 o equivalente) en el trayecto del líquido distal con respecto a una bomba de infusión.

El paclitaxel debe prepararse en recipientes para solución no plastificados (por ejemplo, vidrio, poliolefina o polipropileno) debido a la disolución del plastificante dietilhexilftalato (DEHP) de las bolsas y las vías intravenosas de cloruro de polivinilo (PVC). El paclitaxel no debe administrarse a través de equipos de PVC intravenoso o de inyección. Por tanto, deben usarse equipos de poliolefina o vías de poliolefina como los equipos intravenosos de nitroglicerina (o equivalentes) para conectar la botella o bolsa (que contiene la solución de paclitaxel para una infusión continua) a la bomba intravenosa, un filtro de 0,22 micrómetros se sujeta al equipo intravenoso y luego puede sujetarse directamente al dispositivo de acceso central del paciente. Si es necesario puede usarse un equipo de extensión de vía de polivinilo (Polyfin^{TM} Extension Set, MiniMed Techologies, Modelo nº 126) para proporcionar distancia adicional entre la bomba intravenosa y el dispositivo de acceso central del paciente.

Una pauta de administración para seres humanos puede consistir (aunque no se limita a la misma) en un pretratamiento intravenoso continuo de 24 horas con 0,5-2 mg/kg (20-80 mg/m^{2}) como máximo antes del procedimiento vascular, alrededor de 0,25-2 mg/kg (10-80 mg/m^{2}) de infusión intravenosa continua en 24 horas posprocedimiento, luego alrededor de 0,25-2 mg/kg (10-80 mg/m^{2}) de infusión intravenosa continua durante 24 horas cada 21 días durante 1 a 6 ciclos. Esta dosificación es significativamente menor que la usada para tratar cánceres humanos (aproximadamente 4-6 mg/kg).

Una categoría de uso de paclitaxel abarcaría la prevención primaria o la atenuación del desarrollo de arteriopatía (aterosclerosis). Algunas de estas aplicaciones (entre las que se incluyen, por ejemplo, la prevención de la aterosclerosis del alotrasplante cardiaco, la insuficiencia multiorgánica que se produce como resultado de las complicaciones vasculares de la diabetes mellitus o la aterosclerosis acelerada resistente al tratamiento farmacológico en pacientes que son malos candidatos quirúrgicos) pueden requerir ciclos posteriores de tratamiento que consistan en infusiones intravenosas continuas a dosis baja (1-5 mg/m^{2}/día) durante 5-7 días. Cada uno de los tratamientos de paclitaxel requerirá, por lo general, un pretratamiento con 20 mg de dexametasona por vía oral 14 a 7 horas antes del paclitaxel, 50 mg de difenhidramina intravenosa y 300 mg de cimetidina intravenosa 30 minutos antes del paclitaxel para reducir a mínimo los episodios de reacción alérgica. Otras aplicaciones que pueden no estar asociadas a un procedimiento quirúrgico incluyen el tratamiento de la displasia fibromuscular vascular, poliarteritis nudosa y arteritis de Takayasu. En cada una de las aplicaciones antes mencionadas también puede ser favorable la aplicación selectiva, localizada de preparaciones de liberación sostenida de paclitaxel, derivados de paclitaxel u óxido de deuterio que permitan la administración local de fármaco a dosis altas con poca toxicidad sistémica.

Además, en la presente invención pueden usarse también los derivados solubles en agua de paclitaxel. Como se describe en la Pat. de EE.UU. nº 5.157.049 de Haugwitz et al. (incorporada aquí como cita bibliográfica) entre estos derivados solubles en agua se incluyen 2'-succinil-paclitaxel; 2'-succinil-paclitaxel trietanolamina; 2'-glutarilpaclitaxel; sal trietanolamina de 2'-glutarilpaclitaxel; 2'-O-éster con N-dimetilaminoetil) glutamina; sal clorhidrato de 2'-O-éster- con N-(dimetilaminoetilo) glutamina, aunque no se limitan a estos. Estos derivados de paclitaxel solubles en agua pueden administrarse con una pauta análoga a la dada más arriba para paclitaxel con las modificaciones adecuadas pendientes de la aclaración de las farmacocinéticas de estos agentes.

Una composición farmacéutica que comprenda una cantidad eficaz de un derivado de paclitaxel soluble en agua como ingrediente activo se prepara fácilmente mediante los procedimientos bien conocidos en la técnica, con excipientes estériles atóxicos farmacéuticamente aceptables, si es necesario. Esas preparaciones pueden administrarse por vía oral o de forma inyectable, o directamente sobre una zona afectada, a un paciente en riesgo de desarrollar la enfermedad.

Los ejemplos siguientes ilustran la eficacia del paclitaxel, los derivados del paclitaxel y el óxido de deuterio en la inhibición de la proliferación y migración de células del músculo liso vascular.

Ejemplo 1

Se comprobó la capacidad in vitro de las células del músculo liso vascular cultivadas, pretratadas con diferentes concentraciones de paclitaxel, de invadir filtros revestidos con proteínas de membrana basal reconstituidas para evaluar en qué medida la unión de los microtúbulos inducida por el paclitaxel entorpece los procesos celulares necesarios para la formación de neoíntima in vivo.

Se aislaron células del músculo liso vascular (VSMC) por digestión enzimática con colagenasa/elastasa de las capas medias de la aorta de rata obtenidas de ratas Wistar de 6 meses. Se mantuvieron las células en cultivo con suero fetal bovino al 10%, con DMEM con alto contenido de glucosa y suplemento aminoácido. Los cultivos celulares se mantuvieron a 37ºC en CO_{2} al 5%.

Después de un pretratamiento de paclitaxel de 18 horas en cultivo, las células se fijaron en formalina al 3,7%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 1%, y la tubulina polimerizada se marcó con un anticuerpo frente a 6-tubulina (anticuerpo monoclonal SMI 62 frente a 6-tubulina polimerizada, Paragon Biotec, Inc., Baltimore, Maryland, EE.UU.). El marcado secundario se logró con 1 nm de anticuerpo de conejo antirratón conjugado con de oro, mejorado con plata (Goldmark Biologicals, Phillipsburg, New Jersey, EE.UU.). En la Figura 4 se muestran microfotografías ópticas representativas de VSMC de (A) control, y tratadas con (B) 0,1 nM de paclitaxel, (C) 1 nM de paclitaxel y (D) 10 mM de paclitaxel.

Se realizaron determinaciones de quimioinvasión (cámara Boyden) usando una cámara Boyden modificada (Albini, et al. (1987) Cancer Res., 47: 3239-3245), que comprende una cámara superior separada de una cámara inferior por un filtro poroso PVPF. Los filtros PVPF (diámetro de poro de 8 \mum, Nucleopore Filters, Pleasonton, California, EE.UU.) se recubrieron y consecutivamente se secaron con aire, con soluciones que contenían 100 \mug/ml de colágeno tipo I, 5 \mug/ml de fibronectina y 5 \mug de membrana basal reconstituida (producida a partir de tumor Englebreth-Holm-Swarm (Kleinman, et al. (1986) Biochemistry, 25: 312-318), que produjo una matriz de recubrimiento continuo de 10 \mum de espesor. Se montaron las cámaras Boyden agregando 10 ng/ml de PDGF BB en DMEM a la cámara baja (factor quimiotáctico). Se suspendieron células (aproximadamente 200.000) en DMEM con 0,1% BSA y se agregaron luego a la cámara superior. Algunas de las células usadas en estos estudios se pretrataron 18 horas con paclitaxel (concentración 30 pM a 100 nM) en cultivo. En los grupos tratados con paclitaxel, se agregó el paclitaxel a las cámaras superior y inferior a la misma concentración usada para el pretratamiento. Las cámaras se incubaron luego durante 4 horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Al final del periodo de incubación, se fijaron las células y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las células de la superficie superior (no invasoras) se eliminaron mecánicamente, y las células de la parte inferior del filtro (invasoras) se contaron con un aumento de 400 x (se contaron en cuatro campos al azar por filtro y todos los experimentos se hicieron por triplicado y cada determinación triplicada se repitió al menos tres veces en ocasiones diferentes usando preparaciones diferentes de células del músculo liso vascular). Se determinó la quimiotaxia de forma análoga en las cámaras Boyden descritas más arriba, excepto que se omitió la membrana basal reconstituida. Los expertos en la técnica aceptan que en esta determinación de quimioinvasión muestra una correlación alta entre la invasividad in vitro y el comportamiento celular que se produce in vivo (Iwamoto, Y., et al. (1992) Avances in Experimental Medicine & Biology, 324: 141-9).

Usando el PDGF-BB como factor quimiotáctico, el paclitaxel inhibió la invasión de células del músculo liso vascular con la mitad de la concentración inhibitoria máxima de 0,5 nM. El paclitaxel causó una inhibición esencialmente total a 100 nM y aún era significativamente resolutiva la inhibición a 30 pM (la menor dosis usada) (Figura 1). Se realizó de forma análoga una determinación de quimiotaxia (filtro recubierto sólo por fibronectina y colágeno I, sin proteínas de la membrana basal que ocluyeran los poros del filtro) con PDGF-BB como factor quimiotáctico produciendo un resultado similar. Estos resultados demuestran que, al menos a niveles nanomolares de fármaco, el paclitaxel inhibe la invasión de VSMC principalmente a través de la inhibición del movimiento y/o cambios de forma, más que inhibiendo la secreción celular de colagenasas y metaloproteinasas, que se sabe que son necesarias para que las VSMC penetren las proteínas de la membrana basal en esta determinación.

Se realizó la cimografía de la gelatinasa en los sobrenadantes extraídos después de 4 horas de terminadas las determinaciones de las cámaras Boyden descritas mas arriba. Las proteinasas degradantes de gelatina segregadas en los medios por las VSMC se analizaron por electroforesis en gel no reductor de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico en un gel de poliacrilamida al 10% con 0,1% (p/v) de gelatina. Después de la electroforesis, se renaturalizaron las gelatinasas incubando el gel durante 30 minutos a 23ºC en Triton X-100 al 2,5% (v/v) seguido de 18 horas de incubación a 37ºC en NaCl 0,2 M, 5 nm CaCl_{2} 0,02% Brij 35 (p/v), 50 mM Tris-HCl (pH 7,6). Los geles se tiñeron durante 90 minutos con Coomassie Brilliant Blue G-250 al 0,5% y se destiñeron con ácido acético al 10%, metanol al 40%. La actividad gelatinolítica estuvo indicada por una banda clara contra el fondo de gelatina teñida de azul.

Estas determinaciones de la gelatinasa por cimografía de los experimentos de invasión en cámaras Boyden confirman que el nivel de secreción de colagenasa de las VSMC no varió significativamente a lo largo del intervalo de paclitaxel de 30 pM a 100 mM, en comparación con el control (Figura 2, recuadro insertado).

Ejemplo 2

Para confirmar el hecho de que la estabilización de los microtúbulos y la hiperpolimerización es el factor crítico y suficiente implicado en la inhibición de la invasividad de las VSMC por el paclitaxel, se realizó la determinación de quimioinvasión (cámara Boyden) con óxido de deuterio (^{2}H_{2}O, agua pesada). El óxido de deuterio aumenta la polimerización de microtúbulos/tubulina mediante un mecanismo distinto que el paclitaxel. Una combinación de los efectos de isótopo y de solvente del óxido de deuterio aumenta reversiblemente la polimerización de los microtúbulos reduciendo la concentración crítica para la polimerización de los heterodímeros de \alpha\beta-tubulina mediante el aumento de las interacciones hidrófobas de la tubulina (Itoh, T.J. et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta., 800: 21-27), y convirtiendo una población de tubulina no polimerizable en la forma polimerizable (Takahashi, T.C., et al. (1984) Cell Struct. Funct., 9: 45-52).

Se aislaron VSMC por digestión enzimática colagenasa/elastasa de las capas medias de la aorta de rata obtenida de ratas Wistar de 6 meses. Las células se mantuvieron en cultivo con suero fetal bobino al 10%, DMEM de alto contenido en glucosa y suplemento aminoácido. Los cultivos celulares se mantuvieron a 37ºC en CO_{2} al 5%.

En células tratadas con óxido de deuterio, se sustituyó el agua (H_{2}O) por ^{2}H_{2}O (v/v) en la preparación del medio de cultivo concentrado de DMEM. Después de 18 horas de pretratamiento con óxido de deuterio en cultivo, se fijaron las células en formalina al 3,7%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 1% y la tubulina polimerizada se marcó con anticuerpo anti-\beta-tubulina de ratón (anticuerpo monoclonal SMI 62 contra \beta-tubulina polimerizada, Paragon Biotec, Inc., Baltimore, Maryland, Estados Unidos). Se logró el marcado secundario con 1 nm de anticuerpo de conejo antirratón conjugado con oro mejorado con plata (Goldmark Biologicals, Phillipsburg, New Jersey, Estados Unidos). En las Figuras 5A-5B se muestran fotomicrografías ópticas de VSMC de control (5A) y tratadas con óxido de deuterio al 75% (5B).

Las determinaciones de quimioinvasión se realizaron usando una cámara Boyden modificada, que consistió en una cámara superior separada de la cámara inferior por un filtro poroso PVPF. Se recubrieron filtros PVPF (diámetro de poro de 8 \mum, Nucleopore Filters, Pleasonton, California, Estados Unidos) y se secaron con aire consecutivamente con soluciones que contenían 100 \mug/ml de colágeno tipo I, 5 \mug/ml de fibronectina y 5 \mug de membrana basal reconstituida (producida a partir del tumor Englebreth-Holm-Swarm), que produjo un revestimiento continuo de matriz de 10 \mum de espesor. Las cámaras Boyden se ensamblaron con 10 ng/ml de PDGF-BB en DMEM en la cámara inferior (factor quimiotáctico), luego se agregaron a la cámara superior células (aproximadamente 200.000) suspendidas en DMEM con BSA al 0,1%. Algunas de las células usadas en estas determinaciones se pretrataron 18 horas con óxido de deuterio (sustitución del H_{2}O en un 25%, 50% o 75% v/v) en cultivo. En los grupos tratados con óxido de deuterio el DMEM sustituido con ^{2}H_{2}O (v/v) se agregó a las cámaras superior e inferior a la misma concentración que la usada en el pretratamiento. Luego se incubaron las cámaras durante 4 horas a 37ºC en una atmósfera húmeda con CO_{2} al 5%. Al finalizar el experimento, se eliminaron los filtros, y las células se fijaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Después de eliminar mecánicamente las células de la superficie superior del filtro (no invasoras), se contaron las células del lado inferior (invasoras) con un aumento de 400 X (se contaron cuatro campos al azar por filtro y se hicieron todos los experimentos por triplicado).

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VSMC cultivadas pretratadas durante 18 horas con óxido de deuterio al 25%, 50% ó 75% causaron una hiperpolimerización de los microtúbulos dependiente de la dosis similar a la observada con paclitaxel. Este tratamiento inhibió de la misma forma la invasión de la cámara de Boyden por las células del músculo liso vascular mediada por PDGF, logrando la mitad de la inhibición máxima con ^{2}H_{2}O al 25% y una inhibición casi total con ^{2}H_{2}O al 75% (Figura 3).

Ejemplo 3

Además de participar en la repoblación y la migración de células, las diversas moléculas reguladoras del crecimiento elaboradas tras la lesión arterial, como PDGP y bFGF, participan también en la mitogénesis y en la proliferación celular. Para medir el efecto del paclitaxel sobre la síntesis de ADN de las VSMC, se midió la incorporación de [^{3}H]-timidina. Las VSMC se cultivaron en placas a razón de 4,5 x 10^{4} en placas de 24 pocillos. Después de 5 horas de incubación en FCS+DMEM al 10% se agregaron 0,5 mCi de [^{3}H]-timidina y se continuó la incubación durante 16 horas más. Se lavaron las células dos veces con solución salina tampón fosfato, se extrajeron con TCA al 10% durante 2 horas sobre hielo, luego se centrifugaron a 2.000 g durante 10 minutos. Se decantaron los sobrenadantes y se solubilizaron los sedimentos en 0,5 ml de NaOH 1 N. Después de neutralizar con 0,5 ml de HCl 1 N, se determinó la absorción de [^{3}H]-timidina con un contador de centelleo líquido Beckman. Las VSMC se trataron con varias concentraciones de paclitaxel durante 18 horas antes del agregado de timidina y durante la incorporación de timidina. Cada una de las condiciones de estos experimentos se realizó por triplicado.

El paclitaxel inhibió la incorporación de [^{3}H]-timidina, un índice de división celular, a las VSMC cultivadas, de forma dependiente de la dosis, con la mitad de la concentración inhibitoria máxima de 5 mM. El paclitaxel causó una inhibición esencialmente total a 100 nM y se detectó una inhibición significativa a 1 nM (Figura 1). El hecho de que este perfil de inhibición difiera en cierto modo del de la invasión y quimiotaxia, demostrando una sensibilidad menor en una unidad logarítmica de concentración pero con una dependencia con pendiente mayor, posiblemente surja debido a los papeles considerablemente diferentes desempeñados por los microtúbulos entre estos procesos. El paclitaxel también inhibió la expresión del mRNA del c-fos estimulada por PDGF-BB en este modelo cultivado de VSMC, de forma dependiente de la dosis, con la mitad de la concentración inhibitoria máxima de 1 nM, con una inhibición esencialmente total por encima de los 20 nM. Así la inhibición de una inducción génica temprana inmediata es otro mecanismo importante mediante el cual el paclitaxel bloquea la estimulación del factor de crecimiento en las VSMC y, al menos en parte, puede ser la causa subyacente de los resultados de la incorporación de timidina.

Así el paclitaxel inhibe significativamente la invasión y proliferación de células del músculo liso vascular in vitro mediante la interferencia con la función de los microtúbulos, interrumpiendo el movimiento y la capacidad de alterar la forma, además de la expresión génica temprana y la proliferación celular estimulada por el factor de crecimiento a concentraciones cien a mil veces menores a las usadas para tratar el cáncer humano.

Ejemplo 4

Se midió la incorporación de un análogo de la timidina, la bromodeoxiuridina (BrDU), para determinar el efecto del óxido de deuterio sobre la síntesis de ADN de las VSMC. Se cultivaron VSMC en placas a razón de 4,5 x 10^{4} en placas de 24 pocillos. Después de 20 horas de incubación FCS+DMEM al 10% a varias concentraciones de ^{2}H_{2}O, se agregaron 10 \muM de BrDU y se continuó la incubación durante otras 4 horas. Se lavaron dos veces las células con solución salina tampón fosfato (PBS) y se fijaron con metanol al 100% (-20ºC) durante 10 minutos. Se incubaron las células durante 2 horas con HCl 1 N para desnaturalizar el ADN y luego se lavaron 4 veces en PBS. Se incubó anticuerpo BrDU monoclonal de ratón (Boehringer Mannheim) en BSA-PBS al 2% con células durante 1 hora. Después del lavado con PBS, se agregó anticuerpo de cabra antirratón conjugado con fosfatasa alcalina. Los núcleos celulares que contenían timidina sustituida por BrDU se tiñeron de rojo con un sustrato de fosfatasa alcalina, mientras el resto de los núcleos se tiñeron de azul. La fracción de núcleos BrDU-positivos se comparó con el control (definido como el 100%) y la de los grupos pretratados con óxido de deuterio.

Los resultados indicaron que el óxido de deuterio inhibió de forma similar al paclitaxel la proliferación y la síntesis de ADN de las VSMC cultivadas, de forma dependiente de la dosis, consistente con el equilibrio crítico de la dinámica microtúbulo-tubulina en la proliferación de células del músculo liso vascular.

Mientras que el paclitaxel y el óxido de deuterio tienen potencialmente múltiples efectos intracelulares, la coincidencia de sus efectos paralelos sobre los microtúbulos (a pesar de los diferentes mecanismos de acción) y sobre la funcionalidad de las VSMC a múltiples niveles, indica que el mecanismo común de estabilización de los microtúbulos es responsable de los cambios funcionales observados. Así, teniendo en cuenta los resultados de los experimentos con paclitaxel y con óxido de deuterio, es evidente que los microtúbulos están involucrados en el control de los mecanismos intracelulares más críticos y sensibles necesarios para que las VSMC sufran las múltiples transformaciones implicadas en el desarrollo de la aterosclerosis después de la lesión arterial, haciendo que los microtúbulos sean objetivos particularmente estratégicos para influir el resultado.

Ejemplo 5

Siguiendo el protocolo aprobado por el National Institute on Aging Animal Care and use Committee, se anestesiaron ratas Wistar de 6 meses de la colonia GRC con 20 mg de pentobarbital/kg de peso corporal, 2 mg de ketamina/kg de peso corporal y 4 mg de xilacina/kg de peso corporal por vía intraperitoneal. La arteria carótida externa izquierda se canuló con un catéter de embolectomía Fogarty de 2 French, se infló con solución salina y se pasó tres veces hacia arriba y hacia abajo de la arteria carótida primitiva para producir lesión distensora, con desendotelización. Se trataron los animales con 2 mg de solución de paclitaxel/kg de peso corporal o los animales de control con vehículo solo (13,4 ml/kg de peso corporal por día de 1:2:2:165 DMSO:Cremophor EL:Etanol deshidratado:solución salina tamponada fosfato) por inyección intraperitoneal comenzando 2 horas después de la lesión. La solución de paclitaxel o el vehículo solo se administró una vez al día como una inyección intraperitoneal, durante los 4 días siguientes. Después de 11 días 8 animales tratados con paclitaxel y 10 tratados con vehículo) se anestesiaron como se describió más arriba, y se aisló la arteria carótida y se fijó en formalina tamponada al 10% y se embebió en parafina. Secciones transversales de las carótidas se montaron sobre portaobjetos para microscopio y se tiñeron con colorante hematoxilina y eosina. La imagen de la arteria carótida se proyectó sobre una tabla de traducción a la forma digital, y se midieron las áreas de las secciones transversales de la íntima y la media. Los resultados se muestran en la Figura 2.

El análisis cuantitativo de los segmentos lesionados de la carótida mostraron que el tratamiento con paclitaxel redujo el área de la neoíntima en un 70% en comparación con los animales tratados con vehículo (Tabla I) (*P < 0,001; \daggerP = NS; \ddaggerP < 0,001). Varios de los animales tratados con paclitaxel mostraron una neoíntima virtualmente indiscernible (en presencia de endotelio despojado, que proporciona lesión), mientras que todos los animales tratados con vehículo demostraron al menos un engrosamiento pequeño de la neoíntima.

Aunque la dosis sistémica de paclitaxel in vivo usada en estos experimentos (2 mg/kg) es significativamente menor que la usada normalmente para tratar cánceres humanos (aproximadamente 3-6 mg/kg); no obstante, es posible una dosificación sistémica drásticamente menor manteniendo e incluso mejorando la eficacia combinando un régimen de pretratamiento con la duración óptima de del tratamiento. Además, el objetivo del tratamiento es mantener las VSMC "activadas" bajo control o, preferiblemente, evitar la activación en primer lugar hasta que se ha resuelto el estímulo para el crecimiento y la migración (más que causar citotoxicidad que produzca muerte celular); por tanto, el objetivo del tratamiento a corto plazo con toxicidad limitada puede ser posible en los seres humanos. Finalmente, los sistemas de administración de liberación sostenida local pueden ofrecer una mejor solución para evitar la aterosclerosis, ya que permiten concentraciones locales altas de fármaco administrado y eliminan esencialmente los problemas de toxicidad sistémica. Entre los sistemas de administración de fármacos que pueden ser valiosos se incluyen los stents metálicos recubiertos de polímero impregnado en fármaco, los stents de polímero biodegradable eluyente de fármaco y las células endoteliales genéticamente sensibilizadas para recubrir stents metálicos o para administrarse directamente como una cubierta celular endotelial local. (Muller, D.W.M. et al. (1991) JACC 17: 126b-131b). Estos sistemas permiten el uso seguro de un agente quimioterapéutico sin efectos secundarios sistémicos. Como alternativa, el tratamiento puede implicar un periodo de pretratamiento (es decir, antes de la cirugía vascular) vía infusión intravenosa continua durante un periodo, seguida de un tratamiento diferente durante (local, administración directa) o después (oral, inyección) de la cirugía.

Los ejemplos anteriores enseñan los posibles usos benéficos del paclitaxel, los derivados del paclitaxel y el óxido de deuterio para evitar el bloqueo arterial y, de esta forma, reducir la posibilidad o evitar los infartos de miocardio, las apoplejías, la insuficiencia hepática y la diálisis renal, la ceguera, la amputación de extremidades, pérdida nerviosa, necesidad de cirugía vascular correctora/angioplastia o transplante de órganos, y la incapacidad prematura y permanente que requieren hospitalización crónica. Se ha descrito en detalle la invención, pero se comprenderá que la invención puede tener otras realizaciones diferentes.

TABLA 1

1

Claims (7)

1. Uso de un sistema de administración de fármaco que comprende un medio para la administración local de paclitaxel, un derivado del paclitaxel u óxido de deuterio soluble en agua diferente de la inyección intravenosa o la infusión para la preparación de una composición farmacéutica para reducir o prevenir el desarrollo de aterosclerosis, en el que los medios para la administración local de paclitaxel, un derivado del paclitaxel, derivado del paclitaxel soluble en agua u óxido de deuterio, comprende stents poliméricos eluyentes de fármacos biodegradables.

2. Uso de óxido de deuterio en al fabricación de una composición farmacéutica para la prevención de reestenosis o aterosclerosis en un paciente.

3. Uso de un derivado de paclitaxel soluble en agua en la fabricación de una composición farmacéutica para la prevención o reducción de aterosclerosis en un paciente, en el que dicho derivado de paclitaxel soluble en agua selecciona un grupo constituido por 2'-succinil-paclitaxel; 2'-succinil-paclitaxel trietanolamina; 2'-glutarilpaclitaxel; sal trietanolamina de 2'-glutarilpaclitaxel; 2'-O-éster con N-dimetilaminoetil) glutamina; y sal clorhidrato de 2'-O-éster- con N-(dimetilaminoetilo) glutamina.

4. El uso de la reivindicación 2 ó 3 en que dicho tratamiento comprende la administración sistémica de dicha preparación farmacéutica.

5. El uso de la reivindicación 2 ó 3 en que dicho tratamiento comprende la administración local de dicha preparación farmacéutica.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que la administración local comprende un sistema de administración con liberación sostenida.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en que el derivado de paclitaxel soluble en agua se selecciona entre 2'-succinil-paclitaxel; 2'-succinil-paclitaxel trietanolamina; 2'-glutarilpaclitaxel; y sal trietanolamina de 2'-glutarilpaclitaxel; 2'-O-éster con N-dimetilaminoetil) glutamina; sal clorhidrato de 2'-O-éster- con N-(dimetilaminoetilo) glutamina.