ES2207861T3 - Esqueleto de polimero biodegradable. - Google Patents

Abstract

Un esqueleto de polímero macroporoso, que comprende columnas de polímero que definen macroporos que están interconectados por vías de paso macroporosas, que incluyen vías de paso microporosas que se extienden a través de dichas columnas de polímero de forma que los macroporos en cualquier lado de una columna de polímero específica estén en comunicación a través de dicha columna de polímero específica, teniendo dichos macroporos un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 0, 5 a aproximadamente 3, 5 mm, conectando dichas vías de paso macroporosas macroporos que tienen un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 200 m a aproximadamente 2 mm, y donde dichas vías de paso microporosas tienen un diámetro medio menor que aproximadamente 200 m, y teniendo dicho esqueleto de polímero macroporoso una porosidad de al menos un 50%.

Description

Esqueleto de polímero biodegradable.

La presente invención se refiere al uso de un esqueleto de polímero biodegradable para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Más particularmente, la presente invención se refiere a un nuevo esqueleto de polímero macroporoso que tiene un alto nivel de interconectividad entre los macroporos.

Antecedentes de la invención

Los tratamientos de lesiones de hueso, malformaciones genéticas y enfermedades a menudo requieren implantación de injertos. Es bien conocido que los autoinjertos y aloinjertos son los implantes más seguros; sin embargo, debido al suministro limitado, a los riesgos de transmisión de enfermedades y al rechazo con los que se enfrentan estos injertos, también se han usado ampliamente biomateriales sintéticos como implantes. Con algunos de estos biomateriales se observaron complicaciones in vivo, tales como desequilibrios mecánicos (enmascaramiento de esfuerzos) y aparición de residuos de desgaste que conducen a una atrofia de huesos, osteoporosis u osteolisis alrededor de los implantes (Woo et al., 1976, Terjesen et al., 1988).

Una nueva estrategia, definida como ingeniería de tejidos (TE) ha suscitado recientemente mucho interés. La ingeniería de tejidos implica el desarrollo de una nueva generación de biomateriales capaces de realizar interacciones específicas con tejidos biológicos para producir equivalentes de tejidos funcionales. El concepto subyacente es que pueden aislarse células de un paciente, expandirse en un cultivo celular y sembrarse en un esqueleto preparado a partir de un biomaterial específico para formar un compuesto de esqueleto/material biológico denominado "construcción de TE". La construcción después puede injertarse en el mismo paciente para funcionar como un tejido de reemplazo. Algunos de estos sistemas son útiles para el reemplazo de tejidos de órganos en los que hay una disponibilidad limitada de órganos de donante o donde, en algunos casos (por ejemplo, en pacientes jóvenes) se dispone de elementos substitutivos naturales inadecuados. El propio esqueleto puede actuar como un vehículo de suministro de restos biológicamente activos a partir de factores de crecimiento, genes y fármacos. Esta estrategia revolucionaria para la cirugía tiene amplias aplicaciones con efectos beneficiosos tanto para el bienestar del paciente como para el avance de los sistemas sanitarios.

La aplicación de la ingeniería de tejidos al desarrollo de tejidos óseos implica la recolección de células madre osteogénicas, su siembra y el desarrollo de las mismas para producir un nuevo tejido in vitro. El tejido recién obtenido después puede usarse como un autoinjerto. Se han usado poliésteres biodegradables - en particular poli(lactida-co-glicolida) como esqueletos para la ingeniería de tejidos de varias poblaciones celulares diferentes, por ejemplo: condrocitos (como se describe por Freed et al., en J. of Biomed. Mater. Res. 27:11-13, 1993), hepatocitos (como se describe por Mooney et al., en Journal of Biomedical Mat. Res. 29, 959-965, 1995), y más recientemente, células derivadas de médula ósea (como se describe por Ishaug et al., en J. Biomed. Mat. Res. 36: 17-28, 1997 y Holy et al., en Cells and Materials, 7, 223-234, 1997). Específicamente, se prepararon estructuras porosas de estos poliésteres y se sembraron con células; sin embargo, cuando se cultivaron células derivadas de médula ósea en estas estructuras porosas, sólo se produjo crecimiento óseo dentro del borde externo del esqueleto polimérico 3-D (Ishaug et al., supra; Holy et al., supra). De esta manera, los esqueletos de polímeros preparados en estos casos fueron inadecuados para permitir el desarrollo celular necesario para hacer que el tejido fuera adecuado para la implantación o para el uso como un autoinjerto.

El documento EP 0747068A1 se refiere a un método para producir materiales de implante absorbibles con tamaños de poros que están en el intervalo de 0,1 mm a 3,0 mm. El método implica el uso de gotitas de agua o gotitas de aceite congeladas que se mezclan con una dispersión de fibras de colágeno enfriadas previamente. Tras la liofilización de la dispersión se producen esponjas que tienen el tamaño de poros deseado.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.338.772 expedida a Bauer et al. describe un material de implante que es un compuesto de partículas cerámicas de fosfato cálcico y un polímero bioadsorbible. En este método de preparación, se mezcla fosfato cálcico en polvo con un polímero y la mezcla se somete a energía de microondas que funde el polímero y lo convierte en un líquido que rodea a las partículas.

Sumario de la invención

Ahora se ha descubierto que los esqueletos de polímeros caracterizados por macroporos en el intervalo de tamaños milimétrico con interconexiones como las vistas en el hueso trabecular, son particularmente útiles para la ingeniería de tejidos, ya que permiten el desarrollo celular que es crucial para el desarrollo del tejido tridimensional. Tales esqueletos de polímeros pueden prepararse usando un proceso que combina las técnicas de inversión de fase y lavado de partículas.

Por consiguiente, se proporciona un esqueleto de polímero que comprende macroporos, con un tamaño que varía entre 0,5 mm y 3,5 mm, y que tiene una porosidad de interconexión similar a la encontrada en el hueso trabecular humano.

Más particularmente, se proporciona un esqueleto de polímero macroporoso con una morfología trabecular que tiene una porosidad de al menos un 50%, incluyendo dicho esqueleto de polímero macroporoso macroporos que tienen un diámetro medio que está en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5 mm, teniendo los macroporos paredes de poros definidas por columnas de polímero, e incluyendo vías de paso macroporosas que interconectan los macroporos.

La presente invención proporciona un esqueleto de polímero macroporoso, que comprende: columnas de polímero que definen macroporos que están interconectados por vías de paso macroporosas, que incluyen vías de paso microporosas que se extienden a través de dichas columnas de polímero de forma que dichas columnas de polímero sean microporosas, de manera que los macroporos de cualquier lado de una columna de polímero específica están en comunicación a través de dicha columna de polímero específica, teniendo dichos macroporos un diámetro medio que está en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5 mm, conectando dichas vías de paso macroporosas macroporos que tienen un diámetro medio que está en el intervalo de aproximadamente 200 \mum a aproximadamente 2 mm, y teniendo dichas vías de paso microporosas un diámetro medio que es menor que aproximadamente 200 \mum, y teniendo dicho esqueleto de polímero macroporoso una porosidad de al menos un 50%.

La presente invención también proporciona un proceso para sintetizar un esqueleto de polímero macroporoso que comprende las etapas de:

mezclar un polímero liquido con partículas para formar un mezcla del polímero líquido y las partículas;

estabilizar la mezcla;

sumergir la mezcla en un fluido que no sea disolvente del polímero líquido para que dicho polímero líquido precipite, produciendo una mezcla solidificada; y

sumergir la mezcla solidificada en un disolvente que disuelva las partículas durante un período de tiempo suficiente para disolver las partículas con el fin de obtener dicho esqueleto de polímero macroporoso.

La presente invención también proporciona un esqueleto de polímero macroporoso con columnas de polímero microporoso que definen macroporos interconectados por vías de paso macroporosas, que se forma mezclando un polímero líquido con partículas para formar un mezcla del polímero líquido y las partículas, sumergiendo la mezcla en un fluido no disolvente para el polímero líquido con el fin de que el polímero líquido precipite y produzca una mezcla solidificada, y sumergiendo la mezcla solidificada en un disolvente que disuelve las partículas durante un tiempo suficiente para disolver las partículas y obtener dicho esqueleto de polímero macroporoso con columnas de polímero microporoso que definen dichos macroporos interconectados por dichas vías de paso macroporosas, donde dichos macroporos tienen un diámetro medio que está en el intervalo de 0,5 a 3,5 mm, donde dichas vías de paso macroporosas que interconectan dichos macroporos tienen un diámetro medio que está en el intervalo de 200 \mum a 2 mm, donde dichas columnas de polímero microporoso incluyen vías de paso microporosas que se extienden a través de las columnas que tienen un diámetro medio mayor que 50 \mum y menor que 200 \mum, y donde dicho esqueleto de polímero macroporoso tiene una porosidad de al menos un 50%.

Un proceso para desarrollar un tejido, con distribución penetrante, en un esqueleto de polímero macroporoso tridimensional con una morfología trabecular, hasta una profundidad de al menos 2,5 veces el tamaño medio de los macroporos del esqueleto, que comprende las etapas de:

proporcionar un esqueleto de polímero macroporoso que comprende columnas de polímero que definen macroporos que están interconectados por vías de paso macroporosas, que incluye vías de paso microporosas que se extienden a través de dichas columnas de polímero de forma que dichas columnas de polímero sean microporosas, para que los macroporos de cualquier lado de una columna de polímero específica estén en comunicación a través de dicha columna de polímero específica, teniendo dichos macroporos un diámetro medio que está en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5 mm, conectando dichas vías de paso macroporosas macroporos que tienen un diámetro medio que está en el intervalo de aproximadamente 200 \mum a aproximadamente 2 mm, y teniendo dichas vías de paso microporosas un diámetro medio menor que aproximadamente 200 \mum, teniendo dicho esqueleto de polímero macroporoso una porosidad de al menos un 50%;

sembrar el esqueleto de polímero con células de tejidos; y

cultivar dichas células de tejidos.

Breve descripción de los dibujos

A continuación se describen con más detalle realizaciones de la presente invención haciendo referencia a los dibujos adjuntos y a las micrografías digitalizadas por ordenador, donde:

la figura 1 es una representación esquemática de una porción de un sistema de poros de un polímero que ilustra los diferentes componentes definidos más adelante;

la figura 2 es una micrografía óptica de las trabéculas del hueso en el cuello del fémur que muestra las áreas isotrópica y anisotrópica (micrografía óptica modificada de Tobin WJ., en J. Bone Jt Surg 37A(1) 57-72, 1955);

la figura 3A es una micrografía óptica de un polímero de acuerdo con la presente invención (amplitud de campo = 1,8 cm);

la figura 3B es una micrografía óptica de una sección de 20 \mum del esqueleto de polímero de la figura 3A (amplitud de campo = 3,5 mm);

la figura 3C es una micrografía electrónica de barrido de las paredes de los poros del esqueleto de polímero de la fig. 3A;

la figura 4A es un diagrama que ilustra la curva de esfuerzo/resistencia de los esqueletos de polímeros cuando se someten a un ensayo de compresión a una velocidad de deformación del 1% por segundo;

la figura 4B es un diagrama que ilustra el efecto de la concentración de polímeros sobre las propiedades mecánicas de esqueletos de polímeros.

El coeficiente de elasticidad de la primera región elástica se denomina Y_{1} y el coeficiente de elasticidad de la segunda región elástica se denomina Y2;

la figura 5 es una micrografía electrónica de barrido de la estructura de la pared de los poros de un esqueleto preparado con una concentración de 0,05 g/ml de PLGA 75:25 en DMSO;

la figura 6 es una micrografía electrónica de barrido de la estructura de la pared de los poros de un esqueleto preparado con una concentración de 0,2 g/ml de PLGA 75:25 en DMSO;

la figura 7A es una micrografía electrónica de barrido de esqueletos de PLGA 75/25 obtenidos usando partículas menores que 0,35 mm;

la figura 7B es una micrografía electrónica de barrido de esqueletos de PLGA 75/25 obtenidos usando partículas que varían de 0,54 a 0,8 mm;

la figura 7C es una micrografía electrónica de barrido de esqueletos de PLGA 75/25 obtenidos usando partículas que varían de 0,8 a 2,0 mm;

la figura 8 es una micrografía electrónica de barrido de una membrana de PLGA 75/25 preparada en ausencia de partículas;

la figura 9A es una micrografía electrónica de barrido de una espuma de PLGA 75/25 obtenida a una Tmezcla = 11ºC y Tno disolvente = 0ºC;

la figura 9B es una micrografía electrónica de barrido de una espuma de PLGA 75/25 obtenida a una Tmezcla = -20ºC y Tno disolvente = 0ºC;

la figura 9C es una micrografía electrónica de barrido de una espuma de PLGA 75/25 obtenida a Tmezcla = -20ºC y Tno disolvente = 40ºC;

la figura 10 es una micrografía electrónica de barrido de una lámina de CaP que recubre un esqueleto de PLGA 75/25;

la figura 11 es una micrografía confocal de un esqueleto Dex+ cultivado durante 42 días (amplitud de campo = 1,8 mm);

la figura 12 es una micrografía óptica iluminada con luz UV de un esqueleto Dex+ teñido con tetraciclina (amplitud de campo = 2,0 cm);

la figura 13 es una micrografía óptica de un esqueleto inmunomarcado con osteocalcina (amplitud de campo = 1,1 cm);

la figura 14 es una micrografía óptica de una sección de esqueleto cultivado con Dex+ y teñido con hematoxilina y eosina (amplitud de campo = 0,8 cm);

la figura 15 es una micrografía óptica de una sección de esqueleto cultivado con Dex- y teñido con hematoxilina y eosina (amplitud de campo = 0,6 cm);

la figura 16A es una micrografía electrónica de barrido de un esqueleto membranoso de PLGA 75/25 de la técnica anterior creado con partículas menores que 0,35 mm;

la figura 16B es una micrografía electrónica de barrido de un esqueleto membranoso de PLGA 75/25 de la técnica anterior creado con partículas que varían en tamaño de 0,54 a 0,8 mm;

la figura 16C es una micrografía electrónica de barrido de un esqueleto membranoso de PLGA 75/25 de la técnica anterior creado con partículas que varían en tamaño de 0,8 a 2,0 mm;

la figura 16D es una micrografía electrónica de barrido de esqueleto intermedio de PLGA 75/25 creado con partículas menores que 0,35 mm;

la figura 16E es una micrografía electrónica de barrido de esqueleto intermedio de PLGA 75/25 creado con partículas que varían en tamaño de 0,54 a 0,8 mm;

la figura 16F es una micrografía electrónica de barrido de esqueleto intermedio de PLGA 75/25 creado con partículas que varían en tamaño de 0,8 a 2,0 mm;

la figura 16G es un micrografía electrónica de barrido de un esqueleto semejante a un hueso de PLGA 75/25 creado con partículas menores que 0,35 mm;

la figura 16H es un micrografía electrónica de barrido de un esqueleto semejante a un hueso de PLGA 75/25 creado con partículas que varían en tamaño de 0,54 a 0,8 mm; y

la figura 16I es un micrografía electrónica de barrido de un esqueleto semejante a un hueso de PLGA 75/25 creado con partículas que varían en tamaño de 0,8 a 2,0 mm.

Descripción detallada de la invención

La figura 1 es una representación esquemática de una porción de un esqueleto de polímero que muestra dos macroporos interconectados entre sí por una interconexión macroporosa. Los dos macroporos también están conectados a los macroporos circundantes por vías de paso microporosas (también denominadas microporos). A continuación se describen estos y otros diversos términos usados en la descripción del esqueleto de polímero producido de acuerdo con la presente invención. Esqueleto: dispositivo diseñado como un soporte de células para aplicaciones de ingeniería de tejidos o aplicaciones relacionadas. Este dispositivo preferiblemente tiene una morfología porosa para colonizarse por las células. En nuestro caso específico, el esqueleto tiene una morfología de poros abiertos.

Macroporos: huecos dentro del esqueleto de polímero, delineados por paredes de polímero. Los macroporos típicamente tienen un diámetro comprendido entre 0,5 y 3,5 mm.

Paredes de poros: columnas de polímero que delinean los macroporos. Cuando las columnas de polímero forman haces anisotrópicos, en los que las interconexiones de microporos separan las columnas entre sí en el mismo haz, la estructura de la pared del poro se define como "lamelar". Cuando las columnas son isotrópicas, no forman haces y están separadas ampliamente entre sí por interconexiones principalmente macroporosas, y la pared de los poros de define como "de tipo columna". Tanto las estructuras lamelares como las estructuras de tipo columna de las paredes de los poros presentan nanoporos cuando se seccionan.

Interconexiones microporosas (también denominadas microporos o vías de paso microporosas): huecos encontrados en las paredes de los poros lamelares. Las columnas o lamelas de polímero se separan entre sí por estructuras de poro alargadas paralelas denominadas microporos. El tamaño de estos poros es menor que 200 \mum. Los microporos contribuyen a la interconectividad total de los esqueletos.

Interconexiones macroporosas: vías de paso entre series lamelares de paredes de poros, o entre columnas de polímero. Contribuyen principalmente a la interconectividad de los macroporos, y varían en tamaño entre 200 \mum y 2 mm.

Nanoporos: huecos encontrados en la masa del polímero. Las secciones transversales de la masa del material polimérico, tanto si la pared de los poros presenta estructuras de columna como si presenta estructuras lamelares, muestran concavidades redondeadas que pueden o pueden no perforar el material polimérico entero. Estos nanoporos pueden producirse por el no disolvente atrapado dentro de la masa del polímero, o por degradación autocatalítica de la masa del polímero. Los nanoporos están distribuidos en las paredes del esqueleto. Sólo contribuyen a la interconectividad total de los macroporos cuando atraviesan toda la masa del material.

Interconexiones: las vías de paso de fluido que conectan los macroporos entre sí. Las interconexiones comprenden las interconexiones (vías de paso) macroporosas, las interconexiones (vías de paso) microporosas y los nanoporos que perforan la masa entera del material definido anteriormente.

La presente invención proporciona un esqueleto de polímero macroporoso que comprende macroporos e interconexiones. Los macroporos tienen un diámetro en el intervalo de 0,5-3,5 mm, e interconexiones como las vistas en el hueso trabecular. La morfología de los esqueletos de polímero (también denominados estructuras de espuma) descritos en este documento se basa en la del hueso trabecular.

Se ha demostrado que el hueso trabecular es metabólicamente el sitio más activo del hueso (como se describe por Rodan GA, en Bone 13, S3-S6 1992). La geometría de poros abiertos específica del hueso trabecular afecta favorablemente a la formación y reabsorción del hueso y, por lo tanto, tiene un interés considerable en el contexto de la ingeniería de tejido óseo: de hecho, el diseño de un esqueleto ideal para la ingeniería del tejido óseo también debe permitir una rápida formación y reabsorción del hueso. Por lo tanto, la morfología de las trabéculas del hueso ha servido como modelo para crear las nuevas estructuras de esqueleto de polímero descritas en este documento.

La arquitectura de las trabéculas del hueso depende del sitio anatómico en el que se encuentre el hueso y, en una menor medida, de la edad del paciente.

Martin RB (en CRC Critical Reviews in Biomedical Engineering, 10(3), 179-222, 1984) describió las trabéculas del hueso como "un sistema complejo de paredes y columnas interrumpidas", los huecos encontrados entre las trabéculas se denominan "espacios de médula". Las direcciones de las trabéculas son irregulares; sin embargo, algunas veces es visible una organización global de la geometría de las trabéculas y sigue las fuerzas que actúan sobre el hueso. Las áreas en las que las trabéculas siguen una dirección dada son anisotrópicas, mientras que las áreas en las que las trabéculas se disponen aleatoriamente son isotrópicas (véase la figura 2).

Whitehouse y Dyson (supra), así como Martin (supra), describieron la porosidad del hueso trabecular en el fémur en gran detalle. La tabla 1.1 indica diferentes porosidades y anchuras trabeculares determinadas por Whitehouse y Dyson para todas las áreas del fémur.

TABLA 1.1

Porosidad del hueso trabecular del fémur y anchura de las trabéculas
Área	Porosidad (% de huecos/hueso)	Anchura de las trabéculas (mm)
Media	71,5 \pm 5,0	0,23 \pm 0,060
Lateral	79,0 \pm 5,0	0,23 \pm 0,053
Arcos intertrocantéricos	88,2 \pm 3,2	0,14 \pm 0,029
Interior de arcos intertrocantéricos	84,5 \pm 1,8	0,14 \pm 0,024
Trocánter mayor	90,5 \pm 1,0	0,31 \pm 0,026

La estructura del hueso trabecular se ha investigado con respecto a la anchura de las trabéculas, la porosidad, la anisotropía y modelos generales tales como conectividad y el volumen estrellado. Las micrografías óptica y electrónica de barrido publicadas sobre el hueso trabecular indican que los espacios de médula delineados por trabéculas (es decir, los poros) varían en tamaño de uno a varios milímetros y están interconectados con agujeros que varían de aproximadamente 0,3 a un milímetro.

Cuando el uso de las trabéculas producidas a partir del polímero que constituye la presente invención es para aplicaciones fisiológicas, el esqueleto de polímero preferiblemente se prepara a partir de cualquier polímero biocompatible. El término "biocompatible", como se usa en este documento, pretende incluir polímeros que no son tóxicos para las células y que permiten que las células los colonicen. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen poli(lactida), poli(lactida-co-glicolida) (PLGA) de diversas relaciones, poliestireno, poli(glicolida), poli(acriltato)s, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de hidroxietilo), poli(alcohol vinílico), poli(carbonato), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(anhídrido), poli(etileno), poli(propileno), poli(hidroxibutirato), poli(hidroxivalerato), poli(uretano)s, poli(éter uretano), poli(éster uretano), poli(arilato), poli(imida), poli(anhídrido-co-imida), poli(aminoácidos) y poli(fosfazeno). Los poliésteres alifáticos biodegradables tales como el ácido poliláctico y polímeros derivados del mismo, representan una clase particularmente útil de polímeros en aplicaciones de los presente esqueletos en relación con el trasplante de células debido al hecho de que ya se han aprobado para uso clínico en seres humanos. A este respecto, un polímero preferido para uso como esqueleto es PLGA, particularmente mezclas que comprenden más de un 50% de poli(DL-lactida), tales como PLGA 85:15 y PLGA 75:25.

Las aplicaciones adecuadas para los presentes esqueletos variarán con la composición y estructura del polímero. Por ejemplo, los esqueletos de polímeros biodegradables son adecuados para uso en aplicaciones in vitro y/o en el trasplante de células in vivo. Las matrices después pueden servir como soportes o esqueletos para permitir que se produzca el crecimiento celular in vitro antes de la implantación in vivo. Los esqueletos también pueden usarse directamente in vivo, sin sembrarse previamente con células. En ambas aplicaciones (con o sin siembra previa de células), las matrices de polímero biodegradable de acuerdo con la presente invención son particularmente útiles para el crecimiento de tejidos tridimensionales y pueden usarse en el crecimiento de tejidos conectivos, tales como hueso, cartílago, tejido paradontal, así como tejidos dentales y otros órganos, tales como tejido hepático o de mama.

Una característica significativa del presente esqueleto de polímero es la presencia de macroporos de los que al menos un 50% tienen un diámetro dentro del intervalo de 0,5 a 3,5 mm, un intervalo representativo del encontrado en el hueso trabecular humano. Preferiblemente, los macroporos tienen un diámetro de al menos 1,0 mm, y aún más preferiblemente, los macroporos tienen un diámetro comprendido entre aproximadamente 1,0 mm y 3,5 mm.

Además de su estructura macroporosa, el esqueleto también se caracteriza por un alto nivel de interconectividad que aumenta tanto la penetración del esqueleto por las células como el flujo de nutrientes a las células. Las interconexiones macroporosas de al menos 0,35 mm proporcionan un medio de "celdas abiertas" en el esqueleto de polímero, que es importante para promover el crecimiento del tejido a través del esqueleto, es decir, el crecimiento de tejido tridimensional.

Los macroporos están delineados por paredes de polímero poroso que pueden o pueden no presentar una estructura lamelar. El espesor total de las paredes de los poros no es mayor que aproximadamente 0,4 mm, y preferiblemente no es mayor que aproximadamente 0,3 mm. El grado de interconectividad en las paredes de los poros depende, entre otros factores, de las temperaturas de procesamiento.

Un resultado sorprendente e inesperado es que cada macroporo está en comunicación fluida con un número significativo de macroporos vecinos a través de las interconexiones tanto macroporosas como microporosas.

En el presente documento se describen esqueletos con diferentes estructuras de paredes de poros obtenidos a diferentes temperaturas de procesamiento usando este nuevo proceso de inversión de fase con lavado de partículas.

La porosidad del esqueleto de polímero está al menos a un nivel del 50% para todos los esqueletos obtenidos, como se estima usando un software de análisis de imágenes Northern Eclipse, y preferiblemente a un nivel mayor que el 50%. El nivel de porosidad del presente esqueleto de polímero también contribuye a la naturaleza de "celdas abiertas" del mismo, produciendo un solapamiento significativo entre los macroporos (que producen las vías de paso macroporosas) que define la naturaleza de alta interconexión del presente esqueleto y aumenta adicionalmente su utilidad como esqueleto para el crecimiento celular. A este respecto, el nivel de porosidad preferiblemente es mayor que aproximadamente un 75%, mientras que el nivel más preferido de porosidad es mayor que aproximadamente un 85%.

Las características del presente esqueleto hacen que sea particularmente adecuado para uso en ingeniería de tejidos y, más notablemente, en el trasplante de células, porque proporciona un esqueleto biocompatible que las células pueden colonizar de una manera tridimensional a través de la red macroporosa interconectada del esqueleto. Esto es significativo cuando se considera el trasplante de cualquier célula que produzca tejidos, especialmente los que requieren neoangiogénesis tales como el tejido óseo. Además, cuando se usa para el trasplante de células, el esqueleto es biodegradable, y su degradación puede controlarse de tal forma que el crecimiento de las células pueda ser simultáneo con la degradación del esqueleto.

Los especialistas en la técnica entenderán que el presente esqueleto de polímero puede modificarse para mejorar adicionalmente sus propiedades para uso como esqueleto para el crecimiento celular. Las modificaciones que afectan típicamente a las estructuras usadas como soporte para el crecimiento celular también serían adecuadas para modificar el presente esqueleto de polímero. Tales modificaciones funcionan potenciando la respuesta biológica e incluyen, por ejemplo, modificaciones de la superficie con colágeno, fosfato cálcico, proteoglicanos, proteínas, péptidos, carbohidratos y polisacáridos, o por tratamiento ácido/base. Además, el esqueleto de polímero puede servir como depósito para la liberación de moléculas activas, tales como proteínas, factores de crecimiento, etc., que aumentan la función celular.

El presente esqueleto de polímero puede obtenerse usando un proceso que combina la metodología de lavado de partículas con la metodología de inversión de fase. En una etapa inicial, el esqueleto de polímero seleccionado se prepara como un polímero líquido. Como se usa en este documento, la expresión polímero líquido pretende hacer referencia a un polímero en forma líquida, solo o mezclado con otro líquido. Esto puede conseguirse mezclando el polímero en un disolvente para formar una solución de polímero. Para este fin puede usarse cualquier disolvente generalmente útil para preparar una solución de polímero, incluyendo dimetilsulfóxido (DMSO), cloruro de metileno, acetato de etilo, cloroformo, acetona, benceno, 2-butanona, tetracloruro de carbono, cloroformo, n-heptano, n-hexano y n-pentano. Como apreciará un especialista en la técnica, preferiblemente se usan disolventes no citotóxicos tales como DMSO para preparar la solución de forma que no afecte adversamente al crecimiento celular. La concentración del polímero en la solución de polímero variará con las características del polímero usado para obtener el esqueleto. Como alternativa, el polímero puede transformarse en un polímero líquido por calentamiento hasta su punto de fusión.

El polímero líquido después se mezcla con partículas de un tamaño apropiado en relación con la fase de lavado de partículas del proceso. Son adecuadas las partículas que tienen un diámetro correspondiente al diámetro deseado de los macroporos del esqueleto de polímero, específicamente partículas que tienen un diámetro en el intervalo de 0,5-3,5 mm. Más preferiblemente, las partículas tienen un diámetro mayor que 1,0 mm y aun más preferiblemente las partículas tienen un diámetro comprendido entre 1,0 y 2,0 mm. Los ejemplos de partículas adecuadas para mezcla con el polímero incluyen polisacáridos (tales como glucosa), sales orgánicas e inorgánicas, proteínas y lípidos de un tamaño apropiado, que puedan disolverse en un disolvente distinto del disolvente para el polímero (es decir, un no disolvente de polímero). De nuevo, la cantidad de partículas mezcladas con la solución de polímero variará con las características del polímero usado para fabricar el presente esqueleto.

Una vez que las partículas se han mezclado minuciosamente con el polímero líquido para formar una mezcla de polímero particulada, el polímero se somete a una etapa de inversión de fase en la que se convierte de un líquido a un sólido. Esta etapa se consigue sumergiendo la mezcla de polímero particulada en un no disolvente para el polímero, un disolvente en el que no sea soluble el polímero. Tales no disolventes de polímero incluyen, por ejemplo, agua, alcohol, 1-4 dioxano y anilina.

Para obtener un esqueleto de polímero sólido en una forma particular, la mezcla de polímero puede ponerse en un molde durante la etapa de inversión de fase. Preferiblemente, el polímero líquido puede estabilizarse alrededor de las partículas, por ejemplo, por congelación de la suspensión de polímero-partículas. Por lo tanto, no se usa ningún molde y el proceso de inversión de fase se realiza simultáneamente desde todas las superficies externas. Cuando el disolvente del polímero es DMSO, por ejemplo, la mezcla de polímero se enfría a una temperatura menor o igual a 12ºC, que es la temperatura de congelación del DMSO. También pueden usarse temperaturas inferiores, tales como temperaturas menores que 0ºC. Una consecuencia del uso de bajas temperaturas (por ejemplo, -20ºC o -80ºC) durante esta etapa del proceso es la formación posterior de un esqueleto de polímero con una morfología diferente (véase el ejemplo 4), tal como una estructura de revestimiento más espesa, que puede retirarse antes del uso como esqueleto para el crecimiento tridimensional de células como se describe en el ejemplo 1. Además de la refrigeración, pueden usarse otros métodos para estabilizar la mezcla de polímero-partículas, por ejemplo, gelificación (aumento de la viscosidad).

Después de la conversión de la mezcla de polímero desde la fase líquida a la fase sólida, el polímero se somete a un lavado de partículas. En esta etapa del proceso, el polímero se sumerge en un disolvente de las partículas, es decir, un disolvente que actúa disolviendo las partículas dispersadas a lo largo de todo el polímero pero no disuelve el propio polímero. Por supuesto, los disolventes de partículas apropiados dependerán de la naturaleza de las partículas y del polímero. Los ejemplos de disolventes de partículas apropiados incluyen agua, alcohol, 1-4 dioxano y anilina. La temperatura del disolvente de partículas puede variarse con un efecto mínimo sobre el esqueleto de polímero resultante. Sin embargo, la temperatura generalmente estará comprendida entre el punto de congelación del disolvente de partículas y la temperatura de transición vítrea del polímero, de forma que el esqueleto de polímero no se funda o se vuelva viscoso bajo el efecto de la temperatura del no disolvente. En un ejemplo, al disolvente de partículas se le aplica una temperatura comprendida entre aproximadamente 0ºC y 45ºC cuando el disolvente de partículas es agua y el polímero es PLGA 75:25.

El polímero se sumerge en el disolvente de partículas durante un período de tiempo apropiado para permitir la disolución completa de las partículas dispersadas a lo largo de todo el esqueleto de polímero. Generalmente, se requiere un período de al menos 24 horas para obtener la disolución completa de las partículas en el esqueleto de polímero, aunque se prefiere un período de al menos 48 horas. Para facilitar una disolución eficaz de las partículas, es deseable sumergir el polímero en disolvente limpio a intervalos frecuentes durante el período de disolución, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente 8-9 horas o mediante el uso de un baño de disolvente circulante.

Los procesos de inversión de fase y de lavado de partículas pueden realizarse en una etapa con un disolvente que sea simultáneamente un no disolvente del polímero y un disolvente de las partículas. En un ejemplo, se usó agua destilada dos veces (ddH_{2}O).

El esqueleto de polímero se retira del disolvente de partículas después de un período de disolución de partículas apropiado y puede secarse al vacío antes del uso o desinfectarse en alcohol (tal como etanol al 70%), aclararse y acondicionarse en medio de cultivo para un uso posterior. Si el esqueleto de polímero no se requiere para un uso inmediato, deseablemente se almacena en un desecador para impedir la retención de humedad y la posible degradación del polímero.

El presente proceso ventajosamente produce un esqueleto de polímero que tiene características únicas y, en particular, produce un esqueleto de polímero que tiene una red macroporosa interconectada. Otra ventaja significativa del presente proceso de dos etapas es que proporciona medios amplificados para controlar la morfología del esqueleto de polímero resultante. En otras palabras, el proceso proporciona dos niveles, lavado de partículas e inversión de fase, en los que se puede ejercer un efecto sobre la morfología del esqueleto de polímero. Por ejemplo, el tamaño y la distribución de los macroporos pueden alterarse tanto durante la fase de lavado de partículas como durante la fase de inversión de fase del proceso, y se rigen por el tamaño y la distribución de las partículas y, en una menor medida, por las temperaturas de procesamiento del esqueleto. Además, puede influirse sobre la formación y el tamaño de las interconexiones variando la velocidad de la inversión de fase. La velocidad de inversión de fase puede alterarse alterando varias variables que incluyen la temperatura, el tipo de no disolvente de polímero y la concentración del polímero. De esta manera puede controlarse la morfología final del esqueleto. Preferiblemente, la morfología resultante se parece a la del hueso trabecular humano.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para cultivar células para el crecimiento tridimensional usando el esqueleto de polímero descrito en este documento. La nueva estructura macroporosa interconectada del presente esqueleto de polímero es especialmente adecuada para la obtención de tejidos por ingeniería, y notablemente la obtención de tejido óseo por ingeniería, una alternativa interesante a las terapias de reparación de hueso disponibles actualmente. A este respeto, se realiza una siembra de células derivadas de médula ósea en el esqueleto de polímero usando métodos convencionales, que son bien conocidos para los especialistas en la técnica (como se describe en Maniatopoulos et al., en Cell Tissue Res 254, 317-330, 1988). Las células se siembran en el esqueleto de polímero y se cultivan en condiciones de crecimiento adecuadas. Los cultivos se nutren con medios apropiados para establecer su crecimiento.

Como se ha indicado anteriormente, a lo largo del presente esqueleto de polímero pueden desarrollarse células de diversos tipos. Sin embargo, el esqueleto de polímero de la presente invención es particularmente adecuado para el crecimiento de células osteogénicas, especialmente células que elaboran la matriz ósea. Para la obtención de tejidos por ingeniería, las células pueden tener cualquier origen. Las células ventajosamente son de origen humano. El presente método de crecimiento de células en un esqueleto de polímero tridimensional de acuerdo con la invención permite que las células osteogénicas sembradas, por ejemplo, penetren en el esqueleto de polímero para elaborar una matriz ósea, durante la fase in vitro, con una distribución penetrante en la estructura del esqueleto de polímero y particularmente a una profundidad de al menos 2,5 veces la profundidad del tamaño medio de los macroporos. La penetración de células osteogénicas y, como resultado, la elaboración de matriz ósea puede aumentarse por medios mecánicos, ultrasónicos, campo eléctrico o electrónicos.

En los siguientes ejemplos específicos se describen realizaciones de la presente invención que son ilustrativas y no deben considerarse limitantes.

Ejemplo 1 Preparación de un esqueleto de polímero de PLGA 75:25

Se preparó un esqueleto de polímero de PLGA 75:25 de acuerdo con la presente invención usando PLGA 75:25 (obtenido en Birmingham Polymer Inc.) con una viscosidad intrínseca de 0,87 dUg. Un ml de PLGA 75:25 a 0,1 g/ml en DMSO se mezcló con 2 g de cristales de glucosa (variando el tamaño de las partículas de 0,8 mm a 2 mm) en un molde aluminio. La mezcla de PLGA 75:25-DMSO se enfrió a -20ºC. Esta temperatura de la mezcla de PLGA 75:25-DMSO se denomina T_{mezcla}. Los bloques de PLGA 75:25 congelados después se sumergieron en una suspensión de hielo-agua de ddH_{2}O a 0ºC, que es un no disolvente para el polímero. Esta temperatura del agua se denomina T_{no \ disolvente}. Los bloques permanecieron en ddH_{2}O durante 48 horas, tiempo durante el cual el ddH_{2}O se cambió aproximadamente cada 8 horas. Los esqueletos obtenidos después se retiraron del agua, se secaron al vacío durante 72 horas a 0,01 mm Hg y se almacenaron a 4ºC en un desecador al vacío hasta el uso. Después, los esqueletos obtenidos usando las condiciones mencionadas anteriormente se analizaron con detalle.

La estructura macroporosa de secciones de esqueleto de polímero de 2 mm de espesor se observó a pocos aumentos (16X) usando microscopio de disección como se muestra en la figura 3A. A lo largo del esqueleto de polímero se observó una distribución uniforme de los macroporos interconectados que variaban en tamaño de aproximadamente 0,8-1,5 mm. Los macroporos presentaron morfologías elípticas y paredes espesas (de aproximadamente 300 \mum de espesor) que contenían microporos.

El esqueleto de polímero después se incluyó en un medio de impregnación Tissue-Tek (Miles Nº 4583) y se seccionó en un criostato a -20ºC. Se recogió una serie de secciones de 20 \mum de espesor (50 secciones) en portaobjetos de vidrio (VWR Canlab). Las secciones se fotografiaron a pocos aumentos (16X) usando un microscopio de disección y se exploraron. La figura 3B es una sección de esqueleto explorada que identifica los componentes porosos del esqueleto, los macroporos, las interconexiones (vías de paso) macroporosas y las interconexiones (vías de paso) microporosas. Se observó una película fina de polímero (es decir, una capa de revestimiento) sobre la superficie externa del esqueleto de polímero. Las imágenes se convirtieron en ficheros .TIFF y se analizaron en un ordenador PC usando el software de análisis de imágenes Northern Eclipse. Se usó el menú "una sola medición" para medir los tamaños de las paredes de los poros (área, perímetro, diámetro, etc.) para cada sección explorada. La rutina "medición de los datos" calculó el área y el número de columnas de pared de poros por portaobjetos explorado.

Estas mediciones se convirtieron desde unidades píxel en milímetros calibrando el sistema, usando los aumentos mencionados anteriormente de las imágenes exploradas para determinar la relación pixel/mm. El tamaño de los macroporos se determinó trazando manualmente una línea con una herramienta de software en la imagen digitalizada de la sección de esqueleto de polímero desde una pared de poro a la pared de poro adyacente. Las características del esqueleto de polímero resultante determinadas usando el software de análisis de imágenes Northern Eclipse fueron las siguientes:

Tamaño de macroporos	1,79 \pm /-0,42 mm
Interconexiones macroporosas	0,37 \pm /-0,15 mm
Espesor de la pared del poro	0,29 \pm /-0,13 mm
Microporos	0,10 \pm /-0,05 mm
Porosidad	86,7 \pm /2,43%

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La porosidad de las matrices poliméricas también se estimó por porosimetría de mercurio (Quantachrome Autoscan 60). Se usó un penetrómetro sólido con un volumen del tronco de celdas de 5 cm^{3} para muestras en el intervalo de 0,015 a 0,020 g. Los valores del volumen de huecos se calcularon a partir del volumen de intrusión de mercurio. A partir del volumen de intrusión de mercurio se calculó una porosidad del 89,6%. La porosidad estimada usando el software de análisis de imágenes Northern Eclipse (\sim 87%) es substancialmente equivalente a la de \sim 90% medida por la porosimetría de mercurio, ya que el método de porosimetría de mercurio no es preciso cuando se analizan esqueletos de polímero con diámetros de poros mayores de \sim 75 \mum.

El esqueleto de polímero también se preparó para el análisis usando microscopía electrónica de barrido (SEM). El esqueleto se seccionó transversalmente a un espesor de aproximadamente 2 mm y se recubrió por bombardeo iónico con oro en una atmósfera de argón (Polaron Instrument Inc. Doylestown, PA). Se tomaron micrografías electrónicas de barrido en un SEM Hitachi 2500 a un voltaje de aceleración de 15 kV. Usando las micrografías SEM se confirmó que el diámetro de los macroporos era de aproximadamente 1 a 1,5 mm, aunque no siempre se observó una separación clara entre los macroporos, ilustrando la estructura con interconexiones muy abiertas de estos esqueletos de polímero.

La naturaleza microporosa de las paredes de los poros, observada con el microscopio óptico, se confirmó por SEM, como se muestra en la figura 3C.

El esqueleto de polímero se ensayó mecánicamente como se indica a continuación. Se preparó un esqueleto de polímero en forma de un cilindro con un diámetro y una altura de 1,5 cm y se ensayó usando un aparato de ensayo Instron Mechanical. Los experimentos mecánicos se realizaron en una máquina de ensayo servohidráulica uniaxial (configuración de carga Instron Modelo 1331 con controlador de la Serie 2150). Para todos los ensayos de compresión se usó una celda de carga de 1 kg (Sensotec. Modelo 31/4680). La deflexión del actuador se midió por un transformador diferencial variable linealmente DC (LVDT, intertechnology Modelo SE 374). La señales de la celda de carga y el LVDT se representaron usando el ensayo en un osciloscopio de almacenamiento digital (Gould, Modelo 1425). Las señales también se introdujeron en un convertidor analógico-digital (A/D) de 16 canales, de 12 bit, en un ordenador Apple IIe acelerado. La velocidad de adquisición de datos para estos experimentos fue de 430 pares de puntos de datos por segundo. La compresión del esqueleto de polímero se produjo a una velocidad de 0,1 mm/s. Como se muestra en la figura 4A, un gráfico de la resistencia a la compresión frente al porcentaje de deformación del esqueleto de polímero mostró dos coeficientes. El coeficiente de elasticidad para la primera región elástica (denominado Y_{1}) fue de 0,76 \pm 0,12 MPa, y para segunda región elástica (denominado Y_{2}) fue de 0,18 \pm 0,016 MPa.

Ejemplo 2 Efecto de la concentración de polímero sobre la estructura de esqueleto de polímero

El efecto de la concentración de PLGA 75:25 en DMSO sobre la estructura del esqueleto de polímero resultante se determinó usando el protocolo indicado con detalle en el ejemplo 1. Se usaron tres concentraciones diferentes de PLGA 75:25 en DMSO (0,05 g/ml, 0,1 g/ml y 0,2 g/ml) para obtener matrices poliméricas, mientras que todas las demás condiciones se mantuvieron constantes como se ha descrito en el ejemplo 1.

Cada uno de los esqueletos de polímero preparados se cortó por la mitad usando una cuchilla de afeitar. Se descubrió una estructura de revestimiento sobre cada uno, independientemente de la concentración de partida de PLGA 75:25 en DMSO. Se evaluaron las propiedades mecánicas de tres esqueletos de polímero diferentes y se ilustran en la figura 4B. Se observó una reducción significativa en el coeficiente de elasticidad en el esqueleto de polímero preparado usando el PLGA en DMSO de 0,05 mg/ml, mientras que el esqueleto más rígido se obtuvo con una concentración de PLGA 75:25 de 2 mg/ml.

Estos esqueletos también se observaron con microscopía óptica y SEM. No pudieron detectarse diferencias en la estructura entre los tres esqueletos de polímero con un microscopio óptico. Sin embargo, cuando se observaron con SEM, los esqueletos creados con 0,05 g/ml de PLGA en DMSO mostraron más cantidad de estructura de pared lamelar con más interconexiones microporosas (véase la figura 5) que los creados con 0,2 g/ml de PLGA en DMSO, donde se vieron menos interconexiones porosas microporosas (véase la figura 6).

Ejemplo 3 Efecto de la partículas sobre la estructura de esqueleto de polímero

El efecto sobre la estructura de esqueleto de polímero de la variación de la cantidad y del tamaño de las partículas de glucosa mezcladas con el polímero de PLGA se determinó como se indica a continuación. Se mezclaron cantidades diferentes de partículas de glucosa (0,5 g, 1 g y 2 g) con 1 ml de solución de polímero, manteniendo constantes todas las demás condiciones como se han descrito en el ejemplo 1. El efecto del tamaño de las partículas sobre la morfología del esqueleto final también se evaluó usando las siguientes partículas tamizadas: (tamices de ensayo convencionales, VWR, West Chester, PA): 1) cristales de NaCl (< 0,35 mm), 2) cristales de sacarosa (0,54 mm < tamaño del cristal < 0,8 mm) y 3) cristales de glucosa (0,8 mm < tamaño del cristal < 2 mm). Los esqueletos de polímero resultantes se observaron con microscopía óptica. Cuando se mezcló la solución de polímero con las partículas, se observó que para pequeñas cantidades de partículas (es decir, 0,5 g/ml), la solución de polímero no se sumergía completamente en el lecho particulado. Esta capa de solución de polímero, después de la inversión de fase, produjo una estructura membranosa, similar a la observada cuando no se usan partículas. Las densidades mayores de partículas (es decir, 2,0 g/ml) se infiltraron completamente en la solución de polímero, de forma que el esqueleto resultante contenía una distribución de macroporos sin esta estructura membranosa.

El tamaño de los macroporos era directamente proporcional al tamaño de las partículas usadas, por ejemplo, el tamaño de los macroporos era \sim 0,33 mm cuando se usaban partículas < 0,35 mm (véase la figura 7A) y \sim 0,75 mm cuando se usaban partículas que variaban de 0,54 a 0,8 mm (véase la figura 7B). Finalmente, cuando se usaron partículas mayores de 0,8 mm, los macroporos observados fueron \sim 1,4 mm (véase la figura 7C). Cuando no se mezclaron partículas con la solución de polímero-DMSO, la estructura de polímero resultante era un cilindro hueco compuesto de un revestimiento fino que contenía microporos, como se ilustra en la figura 8. Este revestimiento se parecía mucho a la estructura de membrana resultante de un proceso de inversión de fase normal.

Ejemplo 4 Efecto de las temperaturas de procesamiento sobre la estructura del esqueleto de polímero

Se estudiaron los efectos de tres T_{mezcla} diferentes (11ºC, -20ºC y -80ºC) a una T_{no \ disolvente} constante (0ºC). Se obtuvieron dos estructuras de esqueleto principales diferentes: 1) con T_{mezcla} = 11ºC y 2) con T_{mezcla} = -20ºC y T_{mezcla} = -80ºC. Los esqueletos obtenidos con una T_{mezcla} = 11ºC y T_{no \ disolvente} = 0ºC carecían de revestimiento y mostraron una estructura muy abierta. Como se muestra en la figura 9A, los tamaños de los macroporos parecían ampliados, y como se estimó por SEM eran de \sim 2,72 mm. Las paredes de los poros tenían menos microporos pero más interconexiones macroporosas, proporcionando una estructura generalmente más abierta a los esqueletos. Los esqueletos obtenidos para la T_{mezcla} = -20ºC y -80ºC tenían una estructura de revestimiento. Para T_{mezcla} = -20ºC, los macroporos parecían más pequeños que en los esqueletos obtenidos a mayores T_{mezcla}, y sus tamaños estimados por SEM fueron de \sim 1,80 mm. Las paredes de los poros eran lamelares, con menos interconexiones macroporosas pero más interconexiones microporosas (véase la figura 9B). Se observó que el tamaño de los macroporos se reducía al reducir la T_{mezcla}. Las diferencias en los tamaños de los macroporos fueron particularmente importantes entre esqueletos creados a T_{mezcla} = 11ºC y T_{mezcla} = -20ºC, mientras que se encontraron diferencias minoritarias en el tamaño de los macroporos entre los esqueletos creados a T_{mezcla} = -20ºC y T_{mezcla} = -80ºC. Aunque los tamaños de los macroporos se reducen con la T_{mezcla }, la estructura de la pared de los poros también cambió como se ha descrito anteriormente. Las diferencias en la T_{mezcla} pueden haber afectado a la velocidad de precipitación del polímero y, por lo tanto, a la complejidad de la estructura de la pared de los poros.

También se estudiaron diferentes T_{no \ disolvente} (40ºC, 20ºC y 0ºC), con una T_{mezcla} constante de -20ºC. En este caso, la diferencia principal entre todos los esqueletos fue su espesor de la pared de los poros. Las T_{no \ disolvente} inferiores produjeron paredes de poros más espesas y más complejas, mientras que las T_{no \ disolvente} superiores crearon paredes de poros finas y compactas, comparables a las columnas de polímero que delinean cada macroporo. Las figuras 9B y 9C muestran las diferentes morfologías de las estructuras de esqueleto a T_{no \ disolvente} = 0ºC y 40ºC respectivamente. La mayoría de las diferencias estructurales se observaron entre los esqueletos creados a T_{no \ disolvente} = 0ºC y T_{no \ disolvente} = 20ºC. Se observaron menos diferencias entre los esqueletos obtenidos a T_{no \ disolvente} = 20ºC o 40ºC. Aunque las T_{no \ disolvente} inferiores (0ºC) proporcionaron paredes de poros lamelares (véase la figura 9B), las T_{no \ disolvente} superiores (40ºC) proporcionaron morfología de paredes de poros similares a columnas (véase la figura 9C).

El espesor de las paredes de los poros de los polímeros creados a diferentes T_{no \ disolvente} se estimó por SEM. A T_{no \ disolvente} = 0ºC, se estimó un espesor de las paredes de los poros de 0,29 mm, mientras que a T_{no \ disolvente} = 20ºC, el tamaño de las paredes de los poros fue \sim 0,10 mm; y no pudo medirse ninguna diferencia significativa entre T_{no \ disolvente} = 20ºC y 40ºC. Todos los esqueletos creados con las diversas temperaturas mencionadas anteriormente se seccionaron, y se midió el tamaño de los poros y el espesor de las paredes de los poros. Su porosidad también se estimó usando el software de análisis de imágenes Northern Eclipse. Se obtuvieron los siguientes resultados:

1

Ejemplo 5 Modificación de la superficie del esqueleto de polímero

Los esqueletos obtenidos como se ha descrito en el ejemplo 1 se modificaron adicionalmente en la superficie por tratamiento con ácido/base; deposición de colágeno; y deposición de fosfato cálcico. Los procedimientos y los resultados fueron los siguientes:

El tratamiento ácido/base se desarrolló para potenciar la carga superficial y cambiar la topografía de la superficie. Los esqueletos se mantuvieron en varias concentraciones de ácido acético (0,1 M, 1 M, 5 M), durante 24 horas. Los esqueletos también se mantuvieron en varias concentraciones de NaOH durante 24 horas para observar la hidrólisis de las cadenas de polímero de la superficie. En la SEM, los esqueletos tratados con ácido acético 5 M o NaOH 0,1 M durante 24 horas mostraron cambios en la topografía de la superficie con la aparición de nanoporos.

Se diseñó un experimento de deposición de colágeno para mejorar la adhesión de las células sobre las superficies de polímero. Los esqueletos se mantuvieron en colágeno al 0,1% durante 1 hora, 5 horas, 8 horas y 24 horas.

Se realizó un experimento de deposición de fosfato cálcico para mejorar la adhesión celular sobre la superficie de los esqueletos. Éstos se mantuvieron durante 1 semana en medio completamente suplementado (como se describe en el ejemplo 6) a 37ºC. Los cristales de fosfato cálcico sobre la superficie de los esqueletos se visualizaron por tinción de Von Kossa.

Se realizaron experimentos adicionales de deposición de CaP en los que los esqueletos se sumergieron en Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM durante 2 horas a temperatura ambiente, y se equilibraron adicionalmente en una solución de Ca^{2+} saturada durante una noche. Los esqueletos después se observaron con SEM y se observaron cristales con morfologías de láminas sobre la estructura del esqueleto (véase la figura 10).

Ejemplo 6 Cultivo de células derivadas de médula ósea en esqueletos de polímero

Se prepararon esqueletos de polímero de PLGA 75:25 como se ha descrito previamente: se dispersaron cristales de glucosa a 2 g/ml en una solución de PLGA 75:25 a 0,1 g/ml en dimetilsulfóxido (DMSO, BDH, Toronto, ON). La suspensión de polímeros se congeló a 11ºC. El polímero después se precipitó y los cristales de glucosa se extrajeron del polímero precipitado en ddH_{2}O a 40ºC. Los esqueletos se secaron hasta una masa constante (10 \mum, Hg, 72 horas), se desinfectaron en EtOH al 70% durante 0,5 horas, se aclararon tres veces con \alpha-MEM y se equilibraron en \alpha-MEM estéril a 37ºC durante 6 días.

Se sembraron células derivadas de médula ósea primarias de primer paso en esqueletos de 0,25 cm^{3} usando los protocolos y medios descritos con detalle en otras partes (como se describe por Maniatopoulos et al, supra y Davies et al., en Cells and Materials, 1:3-15, 1991). En resumen, se recogieron células derivadas de médula ósea de los dos fémures de ratas Wistar macho adultas jóvenes (de aproximadamente 150 g) y se introdujeron en un medio completamente suplementado (FSM): \alpha-MEM suplementado con un 15% de suero bovino fetal, ácido ascórbico a 50 mg/ml,
\beta-glicerofosfato 10 mM y antibióticos (penicilina G a 0,1 mg/ml, gentamicina a 0,05 mg/ml y fungizona a 0,3 mg/ml); se añadió dexametasona (Dex) 10^{-8} M al FSM sólo de los cultivos Dex+.

Las células se mantuvieron en cultivo durante 6 días y se volvió a añadir FSM en los días 2 y 5. En el día 6, las células Dex- se tripsinizaron con tripsina al 0,01% en PBS, mientras que los cultivos Dex+, en los que eran visibles signos de calcificación, se tripsinizaron con tripsina al 0,01% y ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) 10 \muM en PBS. Se sembraron células Dex+ y Dex- en esqueletos prehumedecidos separados a una concentración de 7,5x10^{5} células/esqueleto. Los cultivos se mantuvieron durante 42 días a 37ºC con un 5% de CO_{2} y se volvieron a nutrir cada 2-3 días con FSM. Se añadió Dex al FSM de cultivos de células Dex+ a una concentración de 10^{-8} M para cada realimentación.

Se disolvió polvo de tetraciclina\cdotHCl (Sigma, St. Louis, MO) en \alpha-MEM para preparar una solución madre de 90 mg/ml. Se preparó un nuevo medio suplementado completamente que contenía tetraciclina (TFSM) de \alpha-MEM que contenía un 15% de suero bovino fetal, ácido ascórbico a 50 mg/ml, \alpha-glicerofosfato 10 mM y tetraciclina a 9 mg/ml. El TFSM se usó durante la última realimentación en el día 40. En el día 42, los cultivos se lavaron en \alpha-MEM (10 veces, -3 min cada uno) y se fijaron en agente de fijación de Karnovsky (paraformaldehído al 2,0%, glutaraldehído al 2,5% y tampón cacodilato sódico 0,1 M, pH 7,2-7,4) durante una noche. Algunos cultivos se mantuvieron para las observaciones por SEM y se deshidrataron en una serie de soluciones de alcohol graduadas (70%, 100%) y se liofilizaron a 0,01 mm Hg durante 2 días. Todos los demás cultivos se mantuvieron en tampón cacodilato 0,1 M para las observaciones histológicas o confocales.

Las observaciones confocales se realizaron como se indica a continuación: se pusieron muestras en cámaras hechas de encargo en tampón cacodilato 0,1 M (obtenido en BDH). Las cámaras se sellaron con un cubreobjetos de vidrio. Se detectaron señales fluorescentes por seccionamiento óptico en un microscopio láser confocal Bio-Rad MRC-600, usando el filtro BHS. Los esqueletos sembrados con células Dex(+) mostraron un marcador fluorescente hasta una profundidad de aproximadamente 1 mm como se ve en la figura 11. No pudo observarse fluorescencia a más profundidad dentro de los esqueletos debido a que la profundidad del campo del microscopio confocal no era suficiente. Por lo tanto, los esqueletos se seccionaron a un espesor de aproximadamente 2 mm y se analizaron por microscopía confocal por ambos lados. Se observó fluorescencia a lo largo de todo el esqueleto. También se vio el marcador fluorescente usando secciones de esqueletos sembrados con células Dex(+) (véase la figura 12). Las secciones transversales de esqueletos de polímero sembrados con células Dex(-) y Dex(+) se observaron con luz UV. Sólo se observó una señal fluorescente brillante a lo largo de todo el esqueleto en las secciones Dex(+). Específicamente, la matriz ósea elaborada, observada por la señal fluorescente, se visualizó a lo largo de toda la profundidad de un esqueleto de polímero de 0,5 cm que se empleó en el cultivo. El factor limitante en este ensayo fue la profundidad del esqueleto de polímero; por lo que aumentando la profundidad del esqueleto de polímero aumentaría la profundidad a la que penetran las células y de esta manera podría conseguirse la formación de la matriz ósea en este esqueleto de polímero.

También se inmunomarcaron esqueletos para detectar la osteocalcina. La expresión de osteocalcina tanto en cultivos Dex+ como en cultivos Dex- se evaluó por métodos inmunohistoquímicos usando anti-osteocalcina de rata (Biomedical Technologies Inc., Stoughton MA) a una dilución final de 1:6000. El ensayo se terminó por marcaje con un segundo antisuero de burro anti-IgG de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante, a una concentración de 1:250. Para revelar la tinción se usó un kit de substrato de 3,3-diaminobencidina (DAB) para peroxidasa (Vector Laboratories, Burlingame CA) suplementado con cloruro de níquel. La figura 13 muestra un esqueleto marcado con osteocalcina sembrado con células Dex+ y mantenido en cultivo durante 6 semanas. Se obtuvieron secciones histológicas de los esqueletos como se indica a continuación: se incluyeron muestras en Tissue Tek y se seccionaron verticalmente a un espesor de 6 mm. También se observó el crecimiento celular dentro de los esqueletos en las secciones histológicas. A pocos aumentos, pudo visualizarse la sección entera del esqueleto por LM. Tanto en los cultivos Dex+ como en los cultivos Dex-, se encontró una cobertura de células a lo largo de toda la estructura del esqueleto. Se observó tinción con hematoxilina y eosina a lo largo de todos los macroporos, en las superficies externas así como en la mitad de los esqueletos. Las figuras 14 y 15 muestran una imagen de pocos aumentos de espumas cultivadas Dex+ y Dex-. La cantidad de matriz elaborada en cultivos Dex- fue, con mucho, más abundante que la de los cultivos Dex+, como se observa a más aumentos. En los cultivos Dex+, sólo se encontraron unas pocas capas de células que revestían las paredes de los poros y producían una matriz en yuxtaposición a las paredes de los poros, mientras que en los cultivos Dex-, los volúmenes de macroporos enteros se rellenaron con matriz.

Ejemplo 7 Siembra de células de médula humana en el esqueleto de polímero

Se prepararon matrices de PLGA 75:25 como se describe en el ejemplo 1. Estos esqueletos se desinfectaron en etanol al 70% durante 30 minutos antes de sembrarse con células estromáticas de médula ósea humana, procedentes de donantes jóvenes, usando protocolos y medios que contenían dexametasona (dex) como se describe en detalle por Parker et al. (J. of Bone Min. Res., 12(1), S300: F298, 1997).

Ejemplo 8 Efecto del tamaño de los macroporos y la interconectividad sobre la invasión celular

Se crearon tres morfologías de esqueleto diferentes: 1) esqueletos obtenidos sólo por lavado de partículas, denominados esqueletos membranosos que forman parte de la técnica anterior y que se muestran en las figuras 16A, 16B y 16C descritas brevemente más adelante, 2) esqueletos obtenidos por inversión de fase con lavado de partículas usando bajas temperaturas de procesamiento, como se describe en el ejemplo 1, denominados esqueletos intermedios y 3) esqueletos obtenidos por inversión de fase con lavado de partículas usando mayores temperaturas de procesamiento, como se describe en el ejemplo 4, denominados esqueletos semejantes al hueso. A partir de cada una de estas tres vías de procesamiento básicas, se crearon tres estructuras de esqueleto con diferentes tamaños de macroporos, de forma que se obtuvo un total de nueve estructuras de esqueleto diferentes. Estas nueve estructuras se ilustran en las figuras 16A a 16I.

Se crearon esqueletos membranosos usando sólo una técnica de lavado de partículas (como se describe por Mikos et al, en Biomaterials 14, 323-330, 1993), véase la técnica anterior mostrada en las figuras 16A, 16B y 16C. En resumen, se vertió una solución de PLGA a 75/25 (Birmingham Polymers) en cloroformo sobre partículas tamizadas, 1) NaCl (tamaño<0,35 mm), 2) cristales de sacarosa (con un tamaño que variaba de 0,54 a 0,8 mm) o 3) cristales de glucosa (con un tamaño que variaba de 0,8 a 2 mm). Las estructuras de polímero se dejaron a temperatura ambiente para permitir la evaporación del cloroformo, después de lo cual las partículas se disolvieron en ddH_{2}O.

Los esqueletos intermedios y semejantes al hueso se produjeron como se describe en los ejemplos 1 y 4 extrayendo las mismas partículas diferentes que se han descrito anteriormente del polímero precipitado. Los esqueletos intermedios se crearon a una temperatura de solución del polímero de -20ºC y un no disolvente a temperatura ambiente mientras que los esqueletos semejantes a hueso se produjeron con una temperatura de solución de polímero a 11ºC y un no disolvente a temperatura ambiente. Los esqueletos obtenidos se desinfectaron en etanol al 70% durante 30 minutos antes de sembrarse con células.

La colonización celular de los esqueletos se confirmó por microscopía confocal, y la diferenciación celular a lo largo de toda la estructura del esqueleto se confirmó usando el ensayo de marcaje con osteocalcina descrito en el ejemplo 6. Se observaron los siguientes resultados:

TABLA 2 Tamaños del esqueleto y modelos de colonización celular

2

La colonización celular de los esqueletos, como se indica en la tabla 2, requería un tamaño mínimo de interconexiones de 0,35 mm y un tamaño de macroporos de 0,7 mm.

En este ejemplo, los esqueletos membranosos con un tamaño de macroporos de 1,1 mm no se colonizaron por las células, mientras que los esqueletos semejantes al hueso con tamaños de macroporos de 0,7 mm se colonizaron completamente por las células. En conclusión, este ejemplo demuestra que los esqueletos obtenidos por una técnica de inversión de fase con lavado de partículas permitieron la colonización por células a lo largo de toda la morfología del esqueleto, mientras que el esqueleto publicado previamente sólo se colonizó por las células dentro de su capa de poros superficial.

La descripción anterior de las realizaciones preferidas de la invención se ha presentado para ilustrar los principios de la invención y no para limitar la invención a la realización particular ilustrada. Se pretende que el alcance de la invención se defina por todas las realizaciones incluidas dentro de las siguientes reivindicaciones.

Claims (31)

1. Un esqueleto de polímero macroporoso, que comprende

columnas de polímero que definen macroporos que están interconectados por vías de paso macroporosas, que incluyen vías de paso microporosas que se extienden a través de dichas columnas de polímero de forma que los macroporos en cualquier lado de una columna de polímero específica estén en comunicación a través de dicha columna de polímero específica, teniendo dichos macroporos un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5 mm, conectando dichas vías de paso macroporosas macroporos que tienen un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 200 \mum a aproximadamente 2 mm, y donde dichas vías de paso microporosas tienen un diámetro medio menor que aproximadamente 200 \mum, y teniendo dicho esqueleto de polímero macroporoso una porosidad de al menos un 50%.

2. Un esqueleto de polímero como se define en la reivindicación 1, donde dichas columnas de polímero que separan los macroporos tienen un espesor menor que 0,4 mm.

3. Un esqueleto de polímero como se define en las reivindicaciones 1 ó 2, que es biocompatible.

4. Un esqueleto de polímero como se define en las reivindicaciones 1, 2 ó 3, que es biodegradable.

5. Un esqueleto de polímero como se define en la reivindicación 3, donde dicho polímero es poli(lactida-co-glicolida).

6. Un esqueleto de polímero como se define en la reivindicación 5, donde el polímero comprende poli(lactida-co-glicolida) en una relación de un 75% de lactida y un 25% de glicolida.

7. Un esqueleto de polímero como se define en las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, que tiene una porosidad de al menos un 85%.

8. Un esqueleto de polímero como se define en las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, donde dichas columnas de polímero que separan los macroporos tienen un espesor menor que 0,4 mm, y donde dicho polímero es biocompatible y biodegradable, y tiene una porosidad de al menos un 85%.

9. Un proceso para sintetizar un esqueleto de polímero macroporoso, que comprende las etapas de:

mezclar el polímero líquido con partículas para formar una mezcla del polímero líquido y partículas;

estabilizar la mezcla;

sumergir la mezcla en un no disolvente para el polímero líquido con el fin de precipitar dicho polímero líquido produciendo una mezcla solidificada; y

sumergir la mezcla solidificada en un disolvente que disuelva las partículas durante un período de tiempo suficiente para disolver las partículas con el fin de obtener dicho esqueleto de polímero macroporoso.

10. Un proceso como se define en la reivindicación 9, donde dicho polímero líquido se forma disolviendo un polímero en un disolvente polimérico.

11. Un proceso como se define en la reivindicación 10, donde dicho disolvente de polímero es dimetilsulfóxido.

12. Un proceso como se define en las reivindicaciones 9, 10 u 11, donde las partículas tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5 mm.

13. Un proceso como se define en la reivindicación 12, donde dichas partículas tienen un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 2,0 mm.

14. Un proceso como se define en las reivindicaciones 9, 10, 11, 12 ó 13, donde dichas partículas se seleccionan entre el grupo compuesto por polisacáridos, sales orgánicas, sales inorgánicas, proteínas, lípidos y combinaciones de los mismos.

15. Un proceso como se define en la reivindicación 14, donde dicho polisacárido es glucosa.

16. Un proceso como se define en la reivindicación 13, donde dichas partículas son partículas de azúcar.

17. Un proceso como se define en las reivindicaciones 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16, que comprende además la etapa de modificar la superficie del esqueleto de polímero.

18. Un proceso como se define en la reivindicación 17, donde la superficie del esqueleto de polímero se modifica usando un tratamiento seleccionado entre el grupo compuesto por tratamiento con ácido, tratamiento con base, deposición de colágeno y deposición de fosfato cálcico.

19. Un proceso como se define en la reivindicación 9, donde dicho polímero líquido se forma por calentamiento de un polímero hasta su punto de fusión para licuar dicho polímero.

20. El proceso de la reivindicaciones 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18, donde dicho no disolvente para el polímero se selecciona entre el grupo compuesto por agua, alcohol, 1-4 dioxano y anilina.

21. El proceso de la reivindicación 9, donde dicho polímero líquido procede de poli(lactida-co-glicolida).

22. Un esqueleto de polímero macroporoso con columnas de polímero microporosas que definen macroporos interconectados por vías de paso macroporosas, formado mezclando un polímero líquido con partículas para formar una mezcla del polímero líquido y las partículas, sumergiendo la mezcla en un no disolvente para el polímero líquido para precipitar el polímero líquido y producir una mezcla solidificada, y sumergiendo la mezcla solidificada en un disolvente que disuelva las partículas durante un período de tiempo suficiente para disolver las partículas y obtener dicho esqueleto de polímero macroporoso con columnas de polímero microporosas que definen dichos macroporos interconectados por dichas vías de paso macroporosas, donde dichos macroporos tienen un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5 mm, donde dichas vías de paso macroporosas que interconectan dichos macroporos tienen un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 200 \mum a aproximadamente 2 mm, donde dichas columnas de polímero microporosas incluyen vías de paso microporosas que se extienden a través de las columnas que tienen un diámetro medio mayor que aproximadamente 50 \mum y menor que aproximadamente 200 \mum, y donde dicho esqueleto de polímero macroporoso tiene una porosidad de al menos un 50%.

23. Un proceso para desarrollar tejido, con distribución penetrante, en un esqueleto de polímero macroporoso tridimensional con una morfología trabecular hasta una profundidad de al menos 2,5 veces el tamaño medio de los macroporos en el esqueleto, que comprende las etapas de:

proporcionar un esqueleto de polímero macroporoso que comprende

columnas de polímero que definen macroporos que están interconectados por vías de paso macroporosas, que incluyen vías de paso microporosas que se extienden a través de dichas columnas de polímero de forma que los macroporos en cualquier lado de una columna de polímero específica estén en comunicación a través de dicha columna de polímero específica, teniendo dichos macroporos un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5 mm, conectando dichas vías de paso macroporosas macroporos que tienen un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 200 \mum a aproximadamente 2 mm, y donde dichas vías de paso microporosas tienen un diámetro medio menor que aproximadamente 200 \mum, y teniendo dicho esqueleto de polímero macroporoso una porosidad de al menos un 50%;

sembrar el esqueleto de polímero con células de tejidos;

cultivar dichas células de tejidos.

24. El proceso de acuerdo con la reivindicación 23, donde dicho esqueleto de polímero macroporoso es biocompatible y tiene una porosidad de al menos un 85%.

25. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 23 ó 24 que comprende además la etapa de modificar la superficie del esqueleto de polímero antes de sembrar el esqueleto de polímero.

26. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 25, donde la superficie del esqueleto de polímero se modifica usando un tratamiento seleccionado entre el grupo compuesto por tratamiento con ácido, tratamiento con base, deposición de colágeno y deposición de fosfato cálcico.

27. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 23, 24, 25 ó 26, donde dichas células de tejido son células osteogénicas.

28. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 27, donde dichas células de tejido elaboran una matriz ósea.

29. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 28, donde dichas células de tejido son de origen humano.

30. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 29, donde dichas células de tejido se seleccionan entre el grupo compuesto por células de tejido paradontal, células de tejido de cartílago, células de tejido dental, células de tejido hepático y células de tejido de mama.

\newpage

31. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30, donde dichas células se mantienen para aplicaciones in vitro e in vivo.