ES2201055T3 - Vacunas de adenovirus recombinante. - Google Patents
Vacunas de adenovirus recombinante.Info
- Publication number
- ES2201055T3 ES2201055T3 ES93305833T ES93305833T ES2201055T3 ES 2201055 T3 ES2201055 T3 ES 2201055T3 ES 93305833 T ES93305833 T ES 93305833T ES 93305833 T ES93305833 T ES 93305833T ES 2201055 T3 ES2201055 T3 ES 2201055T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- env
- recombinant
- gag
- tplhrev
- hiv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 229940021704 adenovirus vaccine Drugs 0.000 title description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 65
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 10
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 3
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 3
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 claims 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 19
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 abstract description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 49
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 16
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 16
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 16
- 230000004044 response Effects 0.000 description 16
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 14
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 13
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 11
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 5
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000701096 Human adenovirus 7 Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241001135572 Human adenovirus E4 Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 2
- 241001200329 Chanda Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 241000422980 Marietta Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000003263 anti-adenoviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 2
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 2
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 2
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002555 auscultation Methods 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000035584 blastogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000007791 dehumidification Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N glutaric acid Chemical compound OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000033065 inborn errors of immunity Diseases 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
SE MUESTRA LA PRODUCCION DE ANTICUERPOS O DE INMUNIDAD MEDIATIZADA DE CELULAS A UN ORGANISMO INFECCIOSOS EN UN MAMIFERO DE SANGRE CALIENTE. LA PRODUCCION COMPRENDE LA ADMINISTRACION A DICHO MAMIFERO DE SANGRE CALIENTE INTRANASAL, INTRAMUSCULAR O SUBCUTANEAMENTE, LOS ADENOVIRUS RECOMBINANTES VIVOS EN EL QUE LA PROTEINA ESTRUCTURAL DE VIRION ESTA SIN CAMBIAR DESDE QUE EN EL ADENOVIRUS NATIVO SE PRODUCE EL ADENOVIRUS RECOMBINANTE A PARTIR DE ESTE, Y QUE CONTIENE EL GEN QUE CODIFICA EL ANTIGENO QUE CORRESPONDE A DICHOS ANTICUERPOS O QUE COMPRENDE DICHA INMUNIDAD MEDIATIZADA DE CELULAS. LAS VACUNAS QUE CONTIENEN LOS ADENOVIRUS RECOMBINANTES TAMBIEN SON DESCRITAS. ALGUNOS DE LOS ADENOVIRUS RECOMBINANTES TAMBIEN SON NUEVOS PER SE.
Description
Vacunas de adenovirus recombinante.
Un objetivo principal de la investigación
biomédica es proporcionar protección contra las enfermedades
víricas mediante la inmunización. Una estrategia ha sido la
utilización vacunas con gérmenes muertos. Sin embargo, son
necesarias grandes cantidades de material para que la vacuna con
gérmenes muertos retenga una masa antigénica suficiente. Además,
las vacunas con gérmenes muertos se contaminan frecuentemente con
productos indeseables durante su preparación. Las vacunas
heterólogas con gérmenes vivos, que utilizan adenovirus modificado
apropiadamente, que es en sí mismo una vacuna, parecen excelentes
inmunógenos [Chanock R., JAMA, 195, 151 (1967)]. La presente
invención se refiere a vacunas que utilizan adenovirus como
vector.
La adenovacuna comercializada en la actualidad
comprende adenovirus vivos, infecciosos, en una forma farmacéutica
con recubrimiento entérico. Tras la administración al paciente que
se va a vacunar, el virus se transporta a través de las vías
respiratorias superiores (donde se cree que se produce la infección
que provoca la enfermedad) y se libera en el intestino. En el
intestino, el virus se reproduce en la pared intestinal, donde,
aunque no es capaz de causar enfermedad adenovírica, provoca, no
obstante, la formación de anticuerpos contra el adenovirus,
confiriendo de este modo inmunidad contra la enfermedad
adenovírica. En la presente invención se utiliza un adenovirus vivo,
infeccioso, que ha sido modificado para contener genes que
codifican antígenos producidos por otros patógenos. Tras su
liberación, el virus se reproducirá y expresará separadamente tanto
el antígeno adenovírico como el antígeno del patógeno, provocando
de este modo la formación de anticuerpos o de inmunidad celular
tanto contra el adenovirus como contra el otro patógeno. Por
"virus vivo" se entiende, en contraposición a virus
"muerto", un virus que es, bien por sí mismo o junto con
material genético adicional, capaz de producir progenie idéntica.
Por "infeccioso" se entiende la capacidad de introducir el
genoma vírico en las células.
Roy propuso, en la publicación de patente europea
80.806 (1983), un método para producir inmunidad contra las
enfermedades microbianas mediante la administración de un microbio
que contiene un gen foráneo que expresará un antígeno de un segundo
microbio contra el que se confiere inmunidad. Se afirma que las
preparaciones orales preferidas tienen recubrimiento entérico.
Dulbecco propuso vacunas con adenovirus recombinantes en las que la
proteína de la superficie del adenovirus está modificada para que
contenga en su estructura un segmento de una proteína foránea que
producirá una respuesta biológica deseada tras su administración a
animales. [Publicación internacional PCT WO 83/02393 (1983)]. Davis
describe vacunas orales procedentes de adenovirus recombinantes.
[Patente británica GB 2166349 B].
El virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1
(VIH-1) se ha asociado etiológicamente al síndrome
de la inmunodeficiencia humana (SIDA) y a trastornos relacionados.
[Barre-Sinoussi, F., Science 220: 868 (1983); Gallo,
R., Science 224: 500 (1984); Popovic, M., Science 224: 497 (1984);
Sarngadharan, M., Science 224: 506 (1984)]. El SIDA es ahora una
epidemia mundial para la que, actualmente, no hay ninguna vacuna o
curación. La mayoría de los esfuerzos para el desarrollo de vacunas
se han centrado en la glicoproteína de la cubierta (env) como
antígeno que puede proporcionar inmunidad protectora. Los
antisueros preparados contra la gp 120 purificada pueden
neutralizar el VIH-1 in vitro. [Crowl, R.,
Cell 41: 979 (1985); Putney, S., Science 234: 1392 (1986); Ho, D.,
J. Virol. 61: 2024 (1987); Nara, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:
3797 (1987)]. El antígeno de la cubierta del VIH-1
ha sido producido en diferentes sistemas de expresión, entre ellos
Escherichia coli [Crowl, R., Cell 41: 979 (1985); Chang, T.,
Bio/Technology 3: 905 (1985); Dawson, G., J. Infect. Dis. 157: 149
(1988)] así como células de mamífero [Chakrabarti, S., Nature 320:
535 (1986); Dewar, R., J. Virol. 63: 129 (1989); Rekosh, D., Proc.
Natl. Acad. Sci.USA 85: 334 (1988); Whealy, M., J. Virol. 62: 4185
(1988)] de levadura [Barr, P., Vaccine 5: 90 (1987)] y de insectos
[Hu, S., Nature 328: 721 (1978); Rusche, J., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84: 6294 (1987)].
Se evaluaron el virus de la vacuna recombinante,
vivo, que expresaba la glicoproteína env completa del
VIH-1 [Hu, S., J. Virol. 61: 3617 (1987)] o la
glicoproteína env gp 120 recombinante purificada [Berman, P., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85: 5200 (1988)] en chimpancés, como
candidatos para vacunas. La inmunización activa con estas vacunas
provocó buenas respuestas de inmunidad celular así como actividad de
linfocitos T citotóxicos contra el antígeno env [Zarling, J., J.
Immunol. 139: 988 (1987)]. Todos los animales experimentales
presentaron seroconversión, a juzgar por los análisis de ELISA y de
inmunotransferencia. Sin embargo, los chimpancés inmunizados no
desarrollaron títulos, o bien desarrollaron títulos muy bajos, de
anticuerpos neutralizantes contra el VIH-1. La
prueba de provocación con virus vivos no consiguió proteger a los
chimpancés contra estas vacunas. Se encontraron anticuerpos
neutralizantes de tipo específico contra el VIH-1 en
los chimpancés, en la etapa temprana de la infección, dirigidos
contra un dominio variable (V3) de la mitad
C-terminal de gp 120 [Goudsmit, J., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 4478 (1988)]. También se ha comprobado que la gp
120 recombinante sintetizada en células de insectos provoca
respuestas de inmunidad humoral en cabras (Rusche J., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84: 6294 (1987)]. Zagury [Nature 332: 728 (1988)] ha
demostrado reacciones inmunitarias anamnésicas tanto humorales como
celulares en seres humanos, utilizando un virus de la vacuna
recombinante que expresaba gp 160. [Chakrabarti, S., Nature 320: 535
(1986); Hahn, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4813 (1985)].
También se comprobaron tanto la inmunidad celular específica de
grupo como la citotoxicidad celular contra células T4 infectadas.
Estos resultados indican que puede alcanzarse la inmunidad contra el
VIH-1 en seres humanos utilizando una vacuna basada
en la env recombinante. Recientemente, Desrosiers ha demostrado que
la vacunación con el virus de la inmunodeficiencia de los simios
(SIV) entero inactivado puede proteger a macacos de la prueba de
provocación con SIV vivos. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6353
(1989)]. Estos datos ofrecen esperanzas de que sea posible la
protección, con vacunas, contra la infección por el virus del SIDA
humano, VIH-1.
Chanda describe elevados niveles de expresión de
las glucoproteínas de la cubierta del VIH-1 en
presencia del gen rev, utilizando formas recombinantes del
adenovirus de tipo 7, independiente de colaboradores. [Virology 175:
535 (1990)]. Vernon describe la caracterización ultraestructural de
la subunidad gag del VIH-1 en un sistema de vector
de adenovirus recombinante. [J. Gen. Virology 72: 1243 (1991)].
Vernon describe asimismo la preparación de los adenovirus
recombinantes del VIH-1,
Ad7-rev-gag y
Ad4-rev-gag.
La presente invención proporciona la utilización
de un adenovirus recombinante vivo para preparar un medicamento
para su utilización en el tratamiento para producir anticuerpos o
inmunidad celular contra el virus de la inmunodeficiencia humana de
tipo 1, en el que la proteína estructural del virión permanece
invariable respecto a la del adenovirus nativo a partir del cual se
ha producido el adenovirus recombinante, y que contiene el gen que
codifica el antígeno correspondiente a dichos anticuerpos o que
induce dicha inmunidad celular, en el que el adenovirus
recombinante se selecciona a parir de uno o más del grupo formado
por:
Ad7-tplenv-tplHrev,
Ad7-tplgag-tplHrev,
Ad7-rev-gag,
Ad4-tplenv-tplHrev, Ad4-
tplgag-tplHrev,
Ad4-rev-gag,
Ad5-tplenv-tplHrev, y
Ad5-tplgag-tplHrev,
estando destinado el medicamento para su
administración intranasal a un mamífero del orden de los Primates,
incluido el
hombre.
En una realización adicional de la invención, el
medicamento comprende además una o más de una proteína subunitaria
del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1.
Preferiblemente, la proteína subunitaria es env o gag.
Aunque la descripción se refiere específicamente
a adenovirus que tienen una deleción en la región temprana 3 (E3),
también pueden utilizarse como vectores adenovirus que están
atenuados, contienen una lesión sensible a la temperatura o una
deleción E1.
En una realización preferida, el método de
tratamiento incluye administrar el adenovirus recombinante tanto de
modo profiláctico a un mamífero susceptible al
VIH-1 como en forma de inmunoterapia tras la
detección del VIH en dicho mamífero. Se utilizaron pautas de
administración con los siguientes adenovirus recombinantes para
producir las respuestas contra el VIH.
| Nombre del virus | Nombre descriptivo | Nombre de la ATCC |
| Ad7-env | Ad7-tplenv-tplHrev | VR-2299 |
| Ad7-gag | Ad7-tplgag-tplHrev | VR-2393 |
| Ad7-gag-1 | Ad7-rev-gag | VR-2392 |
| Ad4-env | Ad4-tplenv-tplHrev | VR-2293 |
| Ad4-gag | Ad4-tplgag-tplHrev | VR-2391 |
| Ad4-gag-1 | Ad4-rev-gag | VR-2390 |
| Ad5-env | Ad5-tplenv-tplHrev | VR-2297 |
| Ad5-gag | Ad5-tplgag-tplHrev | VR-2298 |
En relación con la tabla anterior, Ad4, Ad5 y Ad7
se refieren a adenovirus humanos de tipo 4, 5 y 7, respectivamente,
en los que la región E3 se ha eliminado por deleción. Env se
refiere al gen de la glicoproteína de la cubierta del VIH (gp 160).
Gag se refiere al gen gag/pro del VIH. Rev se refiere al gen
regulador del VIH. Hrev se refiere una versión modificada del gen
rev, en la que se cambiaron las secuencias nucleotídicas sin
cambiar la secuencia aminoácida, empleando codones de uso frecuente
en seres humanos. Tpl se refiere a la secuencia del líder
tripartito corriente arriba del adenovirus, con una secuencia
intercalada entre el primer y el segundo líder, que se han colocado
delante de los genes recombinantes.
En realizaciones adicionales de la presente
invención se proporcionan virus
X-tplY-tplHrev recombinantes vivos,
en los que X es Ad4, Ad5 o Ad7, e Y es env o gag.
Como se describe en detalle más adelante, la
administración intranasal de virus Ad-VIH
recombinantes a chimpancés sin experiencia previa del virus dio
lugar a la sensibilización y al refuerzo de las respuestas
inmunitarias tanto humorales como celulares dirigidas contra los
antígenos recombinantes del VIH. Se comprobó que los adenovirus
recombinantes administrados a chimpancés producían anticuerpos
contra las proteínas env y gag del VIH. Se observaron anticuerpos
de IgG específicos contra el VIH en las secreciones nasales,
salivales y vaginales tras la administración de los adenovirus
recombinantes y se observaron anticuerpos de IgA específicos contra
el VIH en las secreciones nasales y salivales. El primer grupo de
virus recombinantes (Ad7) parecía liberarse durante un período de
tiempo más prolongado y provocó la mejor respuesta con anticuerpos
anti-Ad. Los resultados también demostraron que la
administración de vacunas Ad-VIH por la vía
intranasal era superior a la administración de virus recombinantes
con recubrimiento entérico por la vía oral.
Las respuestas inmunitarias óptimas dirigidas
contra los antígenos del VIH requerían infección primaria con
inmunización de refuerzo con un Ad-VIH recombinante
heterotípico para provocar un alto nivel de anticuerpos de unión
contra el VIH. La administración intranasal de los virus
Ad-VIH sensibilizó eficazmente a los chimpancés para
responder con altas concentraciones de anticuerpos neutralizantes
contra el VIH-1 tras la posterior inmunización de
refuerzo con la proteína subunitaria del VIH-1.
Los siguientes Ejemplos muestran la construcción
de adenovirus recombinantes representativos de la presente
invención. Los virus recombinantes se propagaron en células A549 y
después se titularon en células A549.
La construcción de adenovirus recombinantes que
contenían el gen de la proteína de la cubierta del VIH ha sido
descrita [Chanda, P., Virology 175: 535 (1990)]; se utilizó un
procedimiento similar para incorporar gag y pro [véase Vernon, S.,
J. Gen. Virology 72: 1243 (1991)]. Brevemente, se construyó un
fragmento de ADN que contenía las regiones codificantes completas
de gag y pro (335 a 2165 pb) de la cepa LAV del
VIH-1 [Wain-Hobson, S., Cell 40: 9,
(1985)] con un sitio Sa/I único delante del codón AUG del gen gag y
un sitio XbaI en la posición 2165 pb, para la inserción del elemento
vírico de respuesta rev (rre; 7178 a 7698 pb). Un fragmento SaI de
2,37 kb que contenía las tres secuencias del VIH-1,
se insertó en un sitio SaI en una casete de expresión que contenía
el principal promotor tardío (MLP) del adenovirus de tipo 7 (Ad7),
el líder tripartito (TPL) con una secuencia intercalada entre los
líderes primero y segundo y el sitio de poliadenilación
(poli-A) de hexon, como se describe en Chanda
[Virology 175: 535 (1990)]. La casete se insertó 159 pb desde el
extremo derecho de un genoma Ad7 [Sussenbach, The Adenoviruses,
Ginsberg, ed., Plenum Press, pp. 34-124 (1984)] que
contenía el gen rev del VIH-1 [Feinberg, M., Cell
46: 807 (1986); Sodroski, J., Nature 321: 412 (1986)] en una región
E3 [79,5 a 88,4 unidades cartográficas (m.u.)] eliminada por
deleción [Chanda, P., Virology 175: 535 (1990)].
Siguiendo el procedimiento para la construcción
del adenovirus recombinante Ad7- gag-1 en el Ejemplo
1, se insertaron una casete de expresión similar que contenía
secuencias Ad4 análogas y las tres regiones codificantes del VIH en
un sitio 139 pb desde el extremo derecho de un genoma Ad4 que
contenía el gen rev del VIH-1 en una deleción E3
entre 76 y 86 m.u.
El
Ad5-tplenv-tplHrev contiene la
secuencia codificante completa de la gp160 del
VIH-1 (cepa LAV) y una versión modificada del gen
rev, llamada Hrev. Tanto el gen env como el rev están precedidos
por una copia sintética del líder tripartito del Ad5
(Ad5-tpl). El Ad5-tpl se sintetizó
químicamente y se clonó en el vector pTZ. Después, la secuencia de
ADN de la gp160 se insertó detrás del Ad5-tpl, para
crear el clon Ad5-tplenv/PTZ18R. El Hrev (\sim360
pb) también se sintetizó químicamente, cambiando las secuencias
nucleotídicas sin cambiar la secuencia de aminoácidos con ayuda de
la utilización de diferentes codones. Esto se realizó para evitar
la recombinación homóloga, ya que existen algunas secuencias
idénticas entre env y rev. De modo análogo al de la construcción
Ad5-tplenv, se insertó también el gen Hrev detrás
del tpl en el vector pTZ18R, para crear el plásmido
Ad5-tplHrev. La secuencia completa que contenía
Ad5-tplHrev se cortó y se insertó detrás de
Ad5-tplenv, para crear el plásmido
Ad5-tplenv-tplHrev. Este plásmido se
insertó a continuación en la región E3 eliminada por deleción de la
cepa Marietta del Ad5 (deleción 78,8-85,7_m.u.) en
la posición 78,8 m.u. Este plásmido se linealizó con la enzima BglI
y después se mezcló con el fragmento SnaB1 0-87
m.u. procedente del virus Ad5 de tipo salvaje purificado. Después de
transfectar las células A549 con las mezclas de ADN, se escogieron
placas del virus recombinante, se purificaron tres veces en placas
y se confirmaron sus estructuras genómicas por análisis de los
sitios de endonucleasas de restricción en ADN extraído de células
infectadas por el método de Hirt. [J. Mol Bio. 26: 365 (1967)].
\newpage
El
Ad5-tplgag-tplHrev contiene las
regiones gag y pro completas, así como el gen rev modificado, Hrev.
Una copia del líder tripartito sintético del Ad5 se colocó delante
de los genes gag y Hrev. Un fragmento de ADN que contenía las
regiones gag y pro completas (335 a 2165 pb de la cepa LAV del
VIH-1) se construyó con un sitio SalI único delante
del codón AUG del gen gag y un sitio Xba en la posición 2165 pb,
para la inserción del elemento de respuesta rev vírico (rre;
7178-7698 pb). Se construyeron dos plásmidos
independientes Ad5-tplgag así como
Ad5-tplHrev, de modo similar al descrito para
Ad5-tplenv-tplHrev. Después, el
fragmento Ad5-tplHrev se insertó detrás de
Ad5-tplgag, para crear el plásmido
Ad5-tplgag-tplHrev. Después se
insertó el fragmento
Ad5-tplgag-tplHrev en el sitio XbaI
único en la posición 78,8 del mapa de la cepa Marietta del Ad5 con
una deleción E3 (deleción E3 78,8-85,7 m.u.).
Después, el plásmido final que contenía la secuencia Ad5 se
linealizó y se mezcló con el fragmento vírico SnaB1
0-87 m.u. para la transfección. Se escogieron
placas recombinantes, se purificaron tres veces en placas y se
analizaron por análisis de Hirt del ADN extraído de las células
infectadas.
Los adenovirus recombinantes se cultivaron en
células A549 y se recogieron después de 3 ciclos de
congelación-descongelación. Los lisados clarificados
de células infectadas se liofilizaron y se envasaron 60 a 100 mg en
cápsulas de gelatina nº 2 utilizando un émbolo de una jeringa de 1
ml en condiciones de deshumidificación. Las cápsulas se recubrieron
con ftalato acetato de celulosa al 10% en acetona/etanol al 100%
(1:1) mojando manualmente cada extremo 6 veces y secando al aire
entre cada ocasión. En estas condiciones se formó un recubrimiento
de 69 a 77 mg de ftalato acetato de celulosa. Se analizaron
muestras de cápsulas para comprobar su resistencia al líquido
gástrico simulado (pepsina al 0,32%, NaCl al 0,2% pH 1,2) a 37ºC,
utilizando un aparato de análisis de desintegración VanKel durante
1 h. Las cápsulas se inspeccionaron para determinar agujeros o
fisuras y se transfirieron a un tubo de 15 ml que contenía 10 ml de
líquido intestinal simulado (pancreatina al 1,0%, fosfato de
potasio monobásico 0,05 M pH 7,5) y se sometieron a rotación a
37ºC. Todas las cápsulas analizadas fueron resistentes al líquido
gástrico simulado durante 1 h a 37ºC con agitación y comenzaron a
disolverse en el plazo de 15 min en líquido intestinal simulado. La
cantidad de virus se valoró en monocapas de células A549 confluentes
mediante un ensayo de placas, y la estabilidad del ADN vírico se
confirmó por análisis de Hirt.
La inmunogenicidad de los adenovirus
recombinantes para el VIH se evaluó en chimpancés utilizando tres
pautas de tratamiento. La primera pauta de tratamiento consistía en
administrar los adenovirus recombinantes por vía oral, por medio de
una cápsula con recubrimiento entérico (Ejemplo 5) a las 0, 7 y 26
semanas, seguido por una dosis de refuerzo con las proteínas
subunitarias env + gag utilizando Alum como adyuvante. La segunda
pauta de tratamiento consistía en tratar además a los chimpancés que
habían sido sometidos a la pauta 1 a las 46 y 58 semanas con una
dosis de refuerzo adicional de adenovirus recombinantes
administrados por vía intranasal. La tercera pauta de tratamiento
consistía en administrar adenovirus recombinantes por vía intranasal
a chimpancés sin experiencia previa de tratamiento a las 0, 24 y 52
semanas, seguido por una dosis de refuerzo con la subunidad env a
la semana 72.
La siguiente tabla presenta un resumen de las
pautas de tratamiento 1 y 2.
Pautas de tratamiento 1 y
2
| Inmunización | Tiempo | Chimpancés 1 y 2 | Chimpancé 3 |
| Pauta 1 | |||
| Primaria* | 0 semanas | 1,5 x 10^{7} ufp de Ad7-env | 1,5 x 10^{7} ufp de Ad7-env |
| 2,0 x 109 ufp de Ad7-gag-1 | |||
| 1^{er} Refuerzo* | 7 semanas | 1,1 x 10^{10} ufp de Ad4-env | 1,1 x 10^{10} ufp de Ad4-env |
| 1,0 x 10^{10} ufp de Ad4-gag-1 | |||
| 2^{o} Refuerzo* | 26 semanas | 7,9 x 10^{10} ufp de Ad5-env | 7,9 x 10^{10} ufp de Ad5-env |
| 3^{er} Refuerzo^{+} | 34 semanas | 200 \mug de env en Alum al 0,2% | 200 \mug de env en Alum al 0,2% |
| 500 \mug de env en Alum al 0,2% |
(Continuación)
| Inmunización | Tiempo | Chimpancés 1 y 2 | Chimpancé 3 |
| Pauta 2 | |||
| 1^{er} Refuerzo | 46 semanas | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad7-env | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad7-env |
| intranasal | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad7-gag | ||
| 1^{er} Refuerzo | 58 semanas | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad4-env | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad4-env |
| intranasal | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad4-gag | ||
| * Cada dosis se administró en cápsulas de gelatina con recubrimiento entérico, en 3 dias consecutivos. | |||
| ^{+} Administrada por vía intramuscular. |
La siguiente tabla presenta un resumen de la
pauta de tratamiento 3.
Pauta de tratamiento
3
| Inmunización | Tiempo | Chimpancés 4 y 5 | Chimpancé 6 |
| Primaria* | 0 semanas | 1,0 x 10^{7} ufp de Ad7-env | 1,5 x 10^{7} ufp de Ad7-env |
| 1,0 x 10^{7} ufp de Ad7-gag | |||
| 1^{er} Refuerzo* | 24 semanas | 1,0 x 10^{7} ufp de Ad4-env | 1,5 x 10^{7} ufp de Ad4-env |
| 1,0 x 10^{7} ufp de Ad4-gag | |||
| 2^{o} Refuerzo* | 52 semanas | 1,0 x 10^{7} ufp de Ad5-env | 1,5 x 10^{7} ufp de Ad5-env |
| 1,0 x 10^{7} ufp de Ad5-gag | |||
| 3^{er} Refuerzo^{+} | 75 semanas | 0,5 mg de env | |
| * Administrada por vía intranasal | |||
| ^{+} Administrada por vía intramuscular. |
Pauta de tratamiento
1
Tres chimpancés (2 machos y 1 hembra) que habían
dado resultados negativos en los análisis de la presencia de
anticuerpos neutralizantes contra los adenovirus humanos de tipo 4
y 7 se evaluaron utilizando la pauta de tratamiento 1. Se
administraron cápsulas con recubrimiento entérico que contenían
adenovirus recombinantes, utilizando una sonda gástrica, con
anestesia, en tres días consecutivos. Dos chimpancés (1 y 2)
recibieron ambos virus recombinantes env y gag, mientras que el
tercer chimpancé (3) recibió sólo virus recombinantes env.
Las preparaciones de subunidades procedentes de
adenovirus, que contenían los productos del gen env o gag, se
purificaron a partir de cultivos de células A549 infectadas [véase
Vernon, S., J. Gen. Virology 72: 1243 (1991) y Natuk, R., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 7777 (1992)]. Los antígenos recombinantes
se formularon con adyuvante Alum y se administraron por vía
intramuscular 200 \mug/dosis de partículas de env y 500
\mug/dosis de partículas de gag.
Se recogieron muestras de sangre entera, suero y
heces a diferentes tiempos durante el transcurso del experimento.
Se preparó la sangre entera para obtener poblaciones de leucocitos
para FACS, CTL del VIH (utilizando virus de la vacuna recombinantes
que expresaban VIH-env, VIH-gag, o
los productos del gen lac) y para ensayos linfoproliferativos con
gp160, gp120 y p24 purificadas del VIH recombinante. Las muestras de
suero y de heces se almacenaron a -70ºC hasta su utilización.
\newpage
Se descongelaron muestras de heces de chimpancés
y se prepararon suspensiones al 10% (V/V) en DMEM que contenía
antibióticos. Se utilizaron suspensiones de heces clarificadas para
infectar monocapas de células A549 confluentes en placas de cultivo
de tejidos de 60 mm. Tras un período de adsorción de 1 h, se eliminó
por lavado el material no unido y se aplicó una capa de medio con
agar al 0,5% sobre las monocapas. Se dejó desarrollar las placas
durante 7-10 días y las placas se visualizaron por
tinción con rojo neutro, se contaron y se retiró suavemente la capa
de agar, teniendo cuidado de no perturbar la monocapa de células.
La hoja de células se transfirió a filtros de nitrocelulosa
(Millipore Tipo HA, 0,45 \mum), previamente empapados en SSC 20X,
que se colocaron sobre la hoja de células y se dejaron en contacto
con la monocapa de células durante 2 a 4 minutos. Los filtros se
retiraron, se secaron con aire y se calentaron durante 2 h en una
estufa de vacío a 80ºC. Los filtros de nitrocelulosa se lavaron dos
veces con SSc 3X/SDS al 0,1% a temperatura ambiente y se
prehibridaron e hibridaron siguiendo procedimientos estándar
[Poncet, D., J. Virol. Methods 26: 27 (1989)]. Se añadieron sondas
de oligonucleótidos marcados con ^{32}P al tampón de hibridación
(1 x 10^{6} CPM) y se incubaron toda la noche a 42ºC. Se
prepararon sondas de ADN para detectar secuencias específicas de
fibra de Ad4, fibra de Ad5, fibra de Ad7, VIH-env o
VIH-gag. [Wain-Hobson, Cell 40: 9
(1985)]. Los filtros se lavaron, se autorradiografiaron y se
contaron las señales de hibridación.
Se prepararon diluciones dobles sucesivas
(empezando con 1:4) de suero de perro termoinactivado (56ºC durante
30 min) en placas de microvaloración de 96 pocillos (0,05
ml/pocillo) y se mezclaron con 0,05 ml de medio que contenía
30-100 TCID_{50} del virus durante 1 h a 37ºC. A
cada pocillo se añadieron 0,05 ml de medio que contenía 2 x
10^{4} células A549 y las placas se incubaron a 37ºC con CO_{2}
al 5% durante 7-10 días. Todas las muestras se
realizaron por duplicado. Se incluyeron testigos de virus y células
no infectadas en cada ensayo para determinar el punto final en los
sueros analizados. Los títulos se expresaron como los recíprocos de
la dilución mínima a la que se observaba el 50% del efecto
citopático.
La detección anticuerpos anti-VIH
y las respuestas de los chimpancés con anticuerpos contra antígenos
del VIH-1 se midieron analizando varias diluciones
con kits comerciales de ELISA y de inmunotransferencia, siguiendo
las instrucciones del fabricante (DuPont, Wilmington, DE).
Se recogieron heces de cada chimpancé antes y
después de la inoculación con virus y se almacenaron a -70ºC. Se
prepararon suspensiones de cada muestra al diez por ciento y se
utilizaron para infectar monocapas de células A549 confluentes. Tras
7-10 días, se identificaron placas víricas por
tinción con rojo neutro y las monocapas de células se transfirieron
a membranas de nitrocelulosa. Se hibridaron muestras
representativas con varias sondas de oligonucleótidos marcados para
detectar secuencias específicas de genes de Ad4, Ad5, Ad7,
VIH-env o VIH-gag. La identificación
de virus Ad-VIH recombinantes específicos pudo
determinarse por esta técnica de hibridación de placas. Ninguno de
los virus recombinantes se liberó en las heces durante más de 7
días tras la inoculación. Los títulos máximos estuvieron siempre
asociados a las muestras de los días 1-3 y
representaban probablemente los virus del inóculo que no se habían
absorbido. Estudios previos con chimpancés utilizando virus
Ad-HBsAg recombinantes habían sugerido que los virus
Ad-HBsAg recombinantes podían detectarse durante
30-40 días tras la inoculación. En el caso de la
vía de administración por cápsula con recubrimiento entérico parece
ser que estos virus recombinantes no se replicaron bien in
vivo.
La seroconversión al serotipo de vectores de
adenovirus utilizado se determinó por procedimientos de análisis de
neutralización. Se midieron títulos séricos de anticuerpos
anti-adenovirus muy bajos a modestos para los 3
serotipos utilizados en cada uno de los chimpancés.
La seroconversión a los productos de los genes
del VIH recombinante se determinó o bien por técnicas de ELISA o de
inmunotransferencia. No se detectó respuesta de ELISA en ninguno de
los chimpancés antes de la segunda inoculación de refuerzo con el
virus Ad5-env recombinante. Dos semanas después de
la inoculación con Ad5-env pudieron medirse
respuestas anti-env en 2 de los 3 animales. La
inyección intramuscular de preparaciones de gag y/o env tuvo un
ligero efecto de refuerzo en 1 de los 3 animales. El análisis de
inmunotransferencia resultó mucho más sensible que el de ELISA y
presentaba la ventaja adicional de identificar qué productos de los
genes env y/o gag estaban siendo reconocidos como inmunógenos. Se
midieron títulos séricos de anticuerpos bajos, tanto tras la dosis
primaria con virus Ad7 recombinante como con la primera dosis de
refuerzo con virus Ad4 recombinantes. Se observó un aumento
significativo en los títulos séricos de anticuerpos contra los
productos del gen env tras la segunda inmunización de refuerzo con
el virus Ad5-env recombinante. Se observaron
aumentos significativos en los 2 animales que recibieron los
productos del gen gag tras la inyección con preparaciones de
subunidades. A pesar de los relativamente buenos títulos de
anticuerpos contra los antígenos del VIH observados en la
inmunotransferencia, sólo 1 de los 3 animales respondió con
anticuerpos séricos neutralizantes. Esta respuesta fue muy baja en
el chimpancé 2 (título de 10 a 20).
\newpage
Estos resultados se resumen en la siguiente
tabla.
Resultados obtenidos utilizando la pauta de
tratamiento
1
| Titulos máximos | ||||||
| Liberación | de anti-VIH en | |||||
| del virus | Titulo máximo | inmunotrans- | Titulo máximo | |||
| Chimpancé | Virus | recombinante | de anti-Adeno | ferencia | de anti-VIH | |
| n^{o} | recombinante | Heces (días) | neutralizantes | env | gag | neutralizantes |
| 1 | Ad7-env, Ad7-gag-1 | 2,2 | 128 | - | 20 | <10 |
| Ad4-env, Ad4-gag-1 | 2,2 | 8 | - | 20 | <10 | |
| Ad5-env | 7+ | 128 | 100 | - | <10 | |
| subunidad: env + gag | 100 | 1000 | <10 | |||
| 2 | Ad7-env, Ad7-gag-1 | 3,2 | 64 | - | 20 | <10 |
| Ad4-env, Ad4-gag-1 | 1,7 | 128 | 20 | 100 | <10 | |
| Ad5-env | 7+ | 64 | 10000 | - | 20 | |
| subunidad: env + gag | 1000 | 10000 | 10 | |||
| 3 | Ad7-env | 2 | 6 | 20 | N/A* | <10 |
| Ad4-env | 1 | 128 | 20 | N/A | <10 | |
| Ad5-env | 7+ | 512 | 1000 | N/A | <10 | |
| subunidad: env | 100 | N/A | <10 | |||
| *N/A= No aplicable |
La inmunidad celular se midió en una población de
células mononucleares de sangre periférica de chimpancés. Se midió
la actividad CTL específica para el VIH determinando la lisis de
células diana singénicas infectadas con formas recombinantes del
virus de la vacuna que expresaban o bien los productos del gen
VIH-env, o los productos del gen
VIH-gag, o el producto del gen lac (testigo de
citotoxicidad no específica). Un indicio de la actividad CTL
específica para el VIH se midió de esta manera.
Se realizaron ensayos linfoproliferativos para
determinar si las preparaciones de env (gp160, gp120) o gag (p24)
recombinantes purificadas eran capaces de estimular la
blastogénesis. No se midió ninguna proliferación tras la inoculación
primaria y sólo 1 de los 3 animales mostró una respuesta
linfoproliferativa tras la administración de la primera dosis de
refuerzo con virus Ad4 recombinantes. Los 3 animales respondieron
con respuestas proliferativas tras la segunda dosis de refuerzo
(Ad5-env) y la tercera dosis de refuerzo
(preparaciones con subunidades).
Pauta de tratamiento
2
Tres chimpancés (2 machos y 1 hembra) que habían
sido previamente inoculados con virus Ad-VIH
recombinantes en cápsulas con recubrimiento entérico y que habían
recibido dosis de refuerzo con subunidades gag y/o env procedentes
de adenovirus (pauta de tratamiento 1) se infectaron por vía
intranasal con virus Ad7-VIH (semana 46), y 12
semanas después (semana 58) con virus Ad4-VIH. Los
adenovirus recombinantes se administraron en medio de cultivo de
tejidos diluido con solución salina tamponada con fosfato, gota a
gota, en las fosas nasales de los chimpancés, con anestesia. Dos
chimpancés (números 1 y 2) recibieron ambos virus recombinantes env
y gag, mientras que el tercer chimpancé (número 3) recibió sólo
virus recombinantes env.
Se recogieron muestras de sangre entera, suero y
heces a diferentes tiempos durante el transcurso del experimento y
se prepararon como se describe en la Pauta 1. La detección de
adenovirus en las muestras de heces o en exudados nasales, los
procedimientos de análisis de neutralización de adenovirus y la
detección de anticuerpos contra el VIH se realizaron según los
procedimientos descritos en la Pauta 1.
La primera dosis intranasal de refuerzo con virus
Ad7 recombinantes se administró en una dosis de 1x10^{8} ufp/
chimpancé. En el momento de la administración del virus, los
chimpancés 3, 1 y 2 tenían títulos séricos de anticuerpos
neutralizantes anti-Ad7 de < 4, 8 y 64,
respectivamente, derivados de inmunizaciones orales previas. Se
examinaron exudados nasales y muestras de heces para determinar la
presencia de virus recombinantes liberados, por medio de una
técnica de hibridación en placas. Se detectó el virus
Ad7-env recombinante en los exudados nasales hasta
un máximo de 7 días tras la inoculación en dos de los animales. Se
comprobó que los virus Ad7-env y
Ad7-gag recombinantes estaban presentes en muestras
de heces de 5 a 12 días tras la inoculación. Hubo correlación entre
el título sérico de Ad7 y la capacidad de detectar virus
recombinantes en los exudados nasales y en las muestras de heces.
Dos animales presentaron una respuesta marginal con anticuerpos
anti-VIH, que se vio considerablemente aumentada por
las dosis intranasales de refuerzo. El tercer animal experimentó
una menor respuesta. Entonces pudieron detectarse en los tres
animales anticuerpos neutralizantes, de bajo título, dirigidos
contra el VIH. Se detectaron anticuerpos secretores en exudados
nasales que contenían anticuerpos de unión anti-gag
y/o env. No se observaron signos o síntomas de enfermedad
respiratoria en estos animales como resultado de la administración
intranasal de los virus Ad7 recombinantes.
Tres meses después, se inmunizaron los chimpancés
con virus Ad4 recombinantes a una dosis única de 1x10^{8}
ufp/chimpancé/virus. Estos animales tuvieron títulos séricos de
anticuerpos neutralizantes anti-Ad4 entre 128 y 256,
debido a la inmunización oral previa en el momento de la prueba de
provocación intranasal. A los 3 días después de la infección, 2 de
los animales (2 y 3) tuvieron un ligero catarro. El tercer animal
(número 1) murió el día 5 de una neumonía bacteriana (se aisló
Streptococcus pneumoniae). Los otros dos animales
presentaron ruidos respiratorios ásperos durante la auscultación y
se aisló S. pneumoniae a partir de ambos chimpancés. Se iniciaron
tratamientos con antibióticos y ambos chimpancés se
recuperaron.
Durante el examen retrospectivo de esta situación
se realizaron varias observaciones. En el momento de la
administración intranasal, el chimpancé número 1 ya tenía fiebre y
un hemograma anómalo. Hubo un número desproporcionado de células
polimorfonucleares presentes y un nivel del 5% de células en cayado
(células polimorfonucleares inmaduras); en conjunto, esta
información indica que tuvo lugar una infección bacteriana
significativa antes de la inoculación con el virus. Las muestras de
autopsia del pulmón, hígado, bazo y suero fueron todas negativas en
lo referente a la presencia de adenovirus infecciosos, según reveló
el cultivo de tejidos utilizando 3 pasadas en ciego en monocapas de
células A549 susceptibles. Se obtuvieron resultados similares por
técnicas de hibridación en placas. Las muestras del pulmón y del
hígado incluidas en parafina resultaron negativas en lo referente a
la presencia de antígenos de adenovirus, utilizando un kit comercial
de inmunofluorescencia para antígenos de adenovirus. Se observaron
cuerpos de inclusión en secciones de pulmón teñidas con H&E.
Hubo un desacuerdo entre los expertos acerca de si estas
inclusiones fueron causadas, o no, por adenovirus. Varias semanas
después, otro chimpancé tuvo un desenlace similar en el mismo
centro de primates y murió. Aunque es probable que la
administración de adenovirus recombinantes haya tenido sólo un papel
mínimo, si alguno, en provocar la muerte del chimpancé número 1, se
consideró prudente administrar antibióticos de forma profiláctica
antes y después de cualquier otra administración intranasal de
adenovirus recombinantes a los chimpancés.
La siguiente tabla muestra los resultados
obtenidos utilizando la pauta de tratamiento 1 y los virus Ad7
recombinantes en la Pauta 2.
Resultados obtenidos utilizando las pautas de
tratamiento 1 y
2
| Títulos máximos | ||||||
| Liberación | de anti-VIH en | |||||
| del virus | Título máximo | inmunotrans- | Titulo máximo | |||
| Chimpancé | Virus | recombinante | de anti-Adeno | ferencia | de anti-VIH | |
| n^{o} | recombinante | Heces (días) | neutralizantes | env | gag | neutralizantes |
| 1 | Pauta 1 | |||||
| \hskip0.3cm Ad7-env, Ad7-gag-1 | 2,2 | 128 | - | 20 | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad4-env, Ad4-gag-1 | 2,2 | 8 | - | 20 | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad5-env | 7+ | 128 | 100 | - | <10 | |
| \hskip0.3cm subunidad: env + gag | 100 | 1000 | <10 | |||
| Pauta 2 | ||||||
| \hskip0.3cm Ad7-env, Ad7-gag | 12 | 512 | 10000 | 10000 | 10 | |
| 2 | Pauta 1 | |||||
| \hskip0.3cm Ad7-env, Ad7-gag-1 | 3,2 | 64 | - | 20 | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad4-env, Ad4-gag-1 | 1,7 | 128 | 20 | 100 | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad5-env | 7+ | 64 | 10000 | - | 20 | |
| \hskip0.3cm subunidad: env + gag | 1000 | 10000 | 10 | |||
| Pauta 2 | ||||||
| \hskip0.3cm Ad7-env, Ad7-gag | 9 | 8192 | 1000 | 10000 | 20 |
(Continuación)
| Títulos máximos | ||||||
| Liberación | de anti-VIH en | |||||
| del virus | Título máximo | inmunotrans- | Titulo máximo | |||
| Chimpancé | Virus | recombinante | de anti-Adeno | ferencia | de anti-VIH | |
| n^{o} | recombinante | Heces (días) | neutralizantes | env | gag | neutralizantes |
| 3 | Pauta 1 | |||||
| \hskip0.3cm Ad7-env | 2 | 6 | 20 | N/A* | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad4-env | 1 | 128 | 20 | N/A | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad5-env | 7+ | 512 | 1000 | N/A | <10 | |
| \hskip0.3cm subunidad: env | 100 | N/A | <10 | |||
| Pauta 2 | ||||||
| \hskip0.3cm Ad7-env | 7 | 256 | 10000 | N/A | 10 | |
| *N/A= No aplicable |
Pauta de tratamiento
3
Tres chimpancés (2 machos y 1 hembra) que
resultaron negativos en el escrutinio referente a la presencia de
anticuerpos neutralizantes contra los adenovirus humanos de tipo 4,
5 y 7 se evaluaron utilizando la pauta de tratamiento 3. Dos
chimpancés (números 4 y 5) recibieron ambos virus recombinantes env
y gag, mientras que el tercer chimpancé (número 6) recibió sólo
virus recombinantes env. Se administraron antibióticos a los
chimpancés de forma profiláctica y no se observaron trastornos
respiratorios.
Se recogieron muestras de sangre entera, suero y
heces a diferentes tiempos durante el transcurso del experimento y
se prepararon como se describe en la Pauta 1. La detección de
adenovirus en muestras de heces o exudados nasales, los ensayos de
neutralización adenovirus y de detección de anticuerpos contra el
VIH se realizaron según los procedimientos descritos en la Pauta
1.
Los virus recombinantes se liberaron en las heces
durante 22 a 34 días después de la infección. No se detectaron virus
recombinantes en las secreciones nasales examinadas 2 semanas
después de la infección. La seroconversión al serotipo de vectores
de adenovirus utilizado se determinó por ensayos de neutralización.
Se midieron excelentes títulos séricos de anticuerpos
anti-adenovirus en los 3 chimpancés, dirigidos
contra los serotipos Ad7 utilizados en cada uno de los chimpancés.
La seroconversión a los productos genéticos del VIH recombinante se
determinó por inmunotransferencia. Cuatro semanas después de la
inmunización primaria con los virus Ad7 recombinantes, pudieron
medirse respuestas anti-env y
anti-gag en 2 de los 3 chimpancés. A las 20 semanas
después de la infección, los 3 animales presentaron niveles
medibles de anticuerpos contra antígenos del VIH. No se encontraron
anticuerpos secretores en los exudados nasales examinados durante
las 4 primeras semanas después de la inmunización primaria. Ninguno
de los 3 chimpancés desarrolló respuestas detectables con
anticuerpos neutralizantes anti-VIH.
Los virus Ad4 recombinantes se liberaron en las
heces durante 14-28 días después de la infección. El
examen de los exudados nasales demostró que los virus Ad4
recombinantes podían detectarse en los 3 chimpancés durante por lo
menos 7 días después de la infección. Se desarrollaron respuestas
significativas anti-Ad4 contra el serotipo Ad4 tras
la administración intranasal. La magnitud fue ligeramente inferior a
la medida contra los virus Ad7 recombinantes. Se midieron
excelentes respuestas a la dosis de refuerzo contra los antígenos
gag y/o env en los tres animales. Se midieron respuestas con un
bajo título (1:2) de anticuerpos anti-gag y/o
anti-env en los exudados nasales de los chimpancés
4 y 5. Tampoco se midieron anticuerpos neutralizantes
anti-VIH en ninguno de los animales.
Los virus Ad5 recombinantes se liberaron en las
heces durante 8 días después de la infección. No se detectaron virus
recombinantes en los exudados nasales a las 0, 1 ó 2 semanas
después de la infección. Se midieron anticuerpos secretores IgG e
IgA en los exudados nasales de los 3 animales. Se detectaron
anticuerpos secretores en la saliva de los 3 animales y en los
exudados vaginales del único chimpancé hembra. Se detectaron
anticuerpos neutralizantes anti-VIH específicos de
tipo en los tres chimpancés.
Tablas resumen: La siguiente tabla muestra
los resultados obtenidos utilizando la pauta de tratamiento 3.
Resultados obtenidos utilizando la pauta de
tratamiento
3
| Titulos máximos | ||||||
| Liberación | de anti-VIH en | |||||
| del virus | Titulo máximo | inmunotrans- | Titulo máximo | |||
| Chimpancé | Virus | recombinante | de anti-Adeno | ferencia | de anti-VIH | |
| n^{o} | recombinante | Heces (dias) | neutralizantes | env | gag | neutralizantes |
| 4 | Ad7-env, Ad7-gag | 22,22 | 1024 | 100 | 1000 | <10 |
| Ad4-env, Ad4-gag | 14,14 | 128 | 10000 | 10000 | <10 | |
| Ad5-env, Ad5-gag | 8,8 | 32 | 10000 | 10000 | 20 | |
| subunidad: env | N/A* | N/A | >10000 | 10000 | 640 | |
| 5 | Ad7-env, Ad7-gag | 34,27 | 1024 | 100 | 10000 | <10 |
| Ad4-env, Ad4-gag | 14,14 | 512 | 10000 | 10000 | <10 | |
| Ad5-env, Ad5-gag | 8,8 | 32 | 10000 | 10000 | 20 | |
| subunidad: env | N/A | N/A | 1000 | 10000 | 320 | |
| 6 | Ad7-env | 34 | 1024 | 100 | N/A | <10 |
| Ad4-env | 28 | 512 | 10000 | N/A | <10 | |
| Ad5-env | 8 | 32 | 10000 | N/A | 40 | |
| subunidad: env | N/A | N/A | >10000 | N/A | 320 | |
| *N/A= No aplicable |
La siguiente tabla resume las respuestas
anti-VIH detectadas en secreciones de chimpancés
tras la inmunización intranasal de refuerzo con los virus
Ad5-VIH recombinantes.
Respuestas con anticuerpos
anti-VIH detectadas en
secreciones
| Secreción analizada | ||||||||
| Semanas | ||||||||
| Chimpancé | Antígeno | tras el | Nasal | Saliva | Vaginal | |||
| número | reconocido | refuerzo** | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG |
| 4 | env | 0 | -* | 360 | - | - | - | - |
| 1 | 180 | 360 | - | - | - | 90 | ||
| 2 | 180 | 2880 | 20 | 20 | - | 90 | ||
| 4 | 720 | 1440 | - | 20 | - | 360 | ||
| gag | 0 | - | 180 | - | - | - | - | |
| 1 | 360 | 360 | - | 20 | - | 90 | ||
| 2 | 720 | 2880 | - | 20 | - | 90 | ||
| 4 | 720 | 720 | - | 20 | - | 90 | ||
| 5 | env | 0 | - | - | - | - | N/A^{+} | N/A |
| 1 | - | 90 | - | - | N/A | N/A | ||
| 2 | - | 2880 | - | - | N/A | N/A | ||
| 4 | - | 360 | - | - | N/A | N/A |
(Continuación)
| Secreción analizada | ||||||||
| Semanas | ||||||||
| Chimpancé | Antígeno | tras el | Nasal | Saliva | Vaginal | |||
| número | reconocido | refuerzo** | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG |
| gag | 0 | - | - | - | - | N/A | N/A | |
| 1 | - | 90 | - | - | N/A | N/A | ||
| 2 | 90 | 1440 | - | - | N/A | N/A | ||
| 4 | - | 360 | - | - | N/A | N/A | ||
| 6 | env | 0 | - | - | - | - | N/A | N/A |
| 1 | - | - | - | - | N/A | N/A | ||
| 2 | - | 1440 | 20 | 20 | N/A | N/A | ||
| 4 | - | 360 | - | - | N/A | N/A | ||
| * - equivale a menos de 90 para los exudados nasales y vaginales, y menos de 20 para las muestras | ||||||||
| salivales. | ||||||||
| ^{+} N/A = no aplicable |
El adenovirus recombinante vivo que se va a
utilizar según la invención para la producción de vacunas puede
construirse insertando en un adenovirus un gen que codifica un
antígeno que corresponde a un anticuerpo contra un organismo
infeccioso en animales de sangre caliente o que induce la inmunidad
celular contra un organismo infeccioso en animales de sangre
caliente. La inserción puede realizarse según se describe en P.K.
Chanda et al., Virology, 175, 535-547
(1990); véase en particular la página 539.
El adenovirus recombinante vivo que se va a
utilizar según la invención puede purificarse en placas. Pueden
aumentarse las cantidades del virus para la producción de vacunas
por replicación en un hospedador adecuado. La replicación puede
realizarse en cultivo celular. Las células del cultivo celular son
preferiblemente células BK (de riñón bovino) o células de carcinoma
humano, particularmente células de carcinoma cervical humano, por
ejemplo, la línea celular HeLa, o células de carcinoma de pulmón
humano, por ejemplo, la línea celular A549. El virus puede
almacenase a -70ºC en un medio tal como DMEM con suero de ternero
fetal al 5%.
Para la administración intranasal, la vacuna
puede comprender el virus con un estabilizante, por ejemplo, SPGA
(sacarosa, fosfato, glutarato y albúmina) y, cuando convenga, uno o
más azúcares.
La invención se utiliza preferiblemente para el
tratamiento de mamíferos del orden de los Primates (incluido el
hombre).
Claims (12)
1. Utilización de un adenovirus recombinante para
preparar un medicamento para su utilización en el tratamiento para
producir anticuerpos o inmunidad celular contra el virus de la
inmunodeficiencia humana de tipo 1, en el que la proteína
estructural del virión permanece invariable respecto a la del
adenovirus nativo a partir del cual se ha producido el adenovirus
recombinante, y que contiene el gen que codifica el antígeno
correspondiente a dichos anticuerpos o que induce dicha inmunidad
celular, en el que el adenovirus recombinante se selecciona a partir
de uno o más del grupo formado por:
Ad7-tplenv-tplHrev,
Ad7-tplgag-tplHrev,
Ad7-rev-gag,
Ad4-tplenv-tplHrev,
Ad4-tplgag-tplHrev,
Ad4-rev-gag,
Ad5-tplenv-tplHrev y
Ad5-tplgag-tplHrev, estando
destinado el medicamento para su administración intranasal a un
mamífero del orden de los Primates, incluido el hombre.
2. Utilización según la reivindicación 1, que
comprende además la utilización de una o más de una proteína
subunitaria del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 para
preparar un medicamento para su administración en dicho método para
producir anticuerpos o inmunidad celular.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que la subunidad es env o gag.
4. Utilización según las reivindicaciones 2 ó 3,
en la que se administran una o más dosis del adenovirus
recombinante vivo, con la administración subsiguiente de una o más
dosis de una proteína que es una subunidad del virus de la
inmunodeficiencia humana de tipo 1.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en la que la proteína que es una subunidad
del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 es env.
6. Adenovirus recombinante vivo que es
X-tplY-tplHrev; en el que X es Ad4,
Ad5 o Ad7, e Y es env o gag.
7. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad4-tplenv-tplHrev.
8. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad5-tplenv-tplHrev.
9. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad7-tplenv-tplHrev.
10. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad4-tplgag-tplHrev.
11. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad5-tplgag-tplHrev.
12. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad7-tplgag-tplHrev.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US92649192A | 1992-08-07 | 1992-08-07 | |
| US926491 | 1992-08-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2201055T3 true ES2201055T3 (es) | 2004-03-16 |
Family
ID=25453282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES93305833T Expired - Lifetime ES2201055T3 (es) | 1992-08-07 | 1993-07-23 | Vacunas de adenovirus recombinante. |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0586076B1 (es) |
| JP (1) | JP4093597B2 (es) |
| KR (1) | KR100347219B1 (es) |
| AT (1) | ATE243755T1 (es) |
| AU (2) | AU680826B2 (es) |
| BR (1) | BR9303226A (es) |
| CA (1) | CA2101463C (es) |
| DE (1) | DE69333057T2 (es) |
| DK (1) | DK0586076T3 (es) |
| ES (1) | ES2201055T3 (es) |
| FI (1) | FI114318B (es) |
| HK (1) | HK1009978A1 (es) |
| HU (2) | HU214364B (es) |
| IL (1) | IL106508A (es) |
| MX (1) | MX9304765A (es) |
| NZ (1) | NZ248328A (es) |
| PT (1) | PT586076E (es) |
| ZA (1) | ZA935355B (es) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG43029A1 (en) * | 1993-08-11 | 1997-10-17 | American Home Prod | Recombinant adenovirus vaccines |
| IL113817A (en) * | 1994-06-30 | 2001-03-19 | Merck & Co Inc | Polynucleotide for vaccination against the umbilical cord virus |
| FR2727867B1 (fr) * | 1994-12-13 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux |
| EP0800403A2 (en) * | 1994-12-30 | 1997-10-15 | Chiron Corporation | Non-traumatic administration of gene delivery vehicles |
| KR100464395B1 (ko) * | 1997-10-13 | 2005-02-28 | 삼성전자주식회사 | 반도체소자의비아홀형성방법 |
| CA2378539A1 (en) | 1999-07-06 | 2001-01-11 | Merck & Co., Inc. | Adenovirus carrying gag gene hiv vaccine |
| US6733993B2 (en) | 2000-09-15 | 2004-05-11 | Merck & Co., Inc. | Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications |
| US8926987B2 (en) | 2004-11-18 | 2015-01-06 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Replication-competent adenoviral vectors |
| US9132031B2 (en) | 2006-09-26 | 2015-09-15 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Cooling device having a plurality of controllable cooling elements to provide a predetermined cooling profile |
| US20080287839A1 (en) | 2007-05-18 | 2008-11-20 | Juniper Medical, Inc. | Method of enhanced removal of heat from subcutaneous lipid-rich cells and treatment apparatus having an actuator |
| US8523927B2 (en) | 2007-07-13 | 2013-09-03 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | System for treating lipid-rich regions |
| EP3488833A1 (en) | 2007-08-21 | 2019-05-29 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Monitoring the cooling of subcutaneous lipid-rich cells, such as the cooling of adipose tissue |
| US8603073B2 (en) | 2008-12-17 | 2013-12-10 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Systems and methods with interrupt/resume capabilities for treating subcutaneous lipid-rich cells |
| BRPI1014623B1 (pt) | 2009-04-30 | 2020-01-07 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Sistema para tratamento de celulas subcutâneas ricas em lipídeos em uma área alvo |
| US9314368B2 (en) | 2010-01-25 | 2016-04-19 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Home-use applicators for non-invasively removing heat from subcutaneous lipid-rich cells via phase change coolants, and associates devices, systems and methods |
| US8676338B2 (en) | 2010-07-20 | 2014-03-18 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Combined modality treatment systems, methods and apparatus for body contouring applications |
| US10722395B2 (en) | 2011-01-25 | 2020-07-28 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Devices, application systems and methods with localized heat flux zones for removing heat from subcutaneous lipid-rich cells |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925784A (en) * | 1986-04-04 | 1990-05-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein |
| US5585264A (en) * | 1988-07-15 | 1996-12-17 | University Of Saskatchewan | Nucleotide sequences encoding recombinant bovine herpesvirus type-1 GI, GIII and GIV polypeptides |
| GB8919102D0 (en) * | 1989-08-22 | 1989-10-04 | Oxford Virology Ltd | A recombinant adenovirus dna sequence,a recombinant adenovirus expressing the dna sequence and a rhabdovirus vaccine including the recombinant adenovirus |
| WO1992011028A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-07-09 | Epitope, Inc. | Hiv reverse transcriptase vaccine |
| GB9114437D0 (en) * | 1991-07-03 | 1991-08-21 | Health Lab Service Board | Recombinant adenoviruses and the use thereof for detecting the presence in eukaryotic cells of the expression products of specific genes |
-
1993
- 1993-07-23 PT PT93305833T patent/PT586076E/pt unknown
- 1993-07-23 EP EP93305833A patent/EP0586076B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-23 ZA ZA935355A patent/ZA935355B/xx unknown
- 1993-07-23 DK DK93305833T patent/DK0586076T3/da active
- 1993-07-23 ES ES93305833T patent/ES2201055T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-23 DE DE69333057T patent/DE69333057T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-23 AT AT93305833T patent/ATE243755T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-28 IL IL106508A patent/IL106508A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-07-28 CA CA002101463A patent/CA2101463C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-30 BR BR9303226A patent/BR9303226A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-08-04 NZ NZ248328A patent/NZ248328A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-08-04 JP JP19341093A patent/JP4093597B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-08-05 MX MX9304765A patent/MX9304765A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-08-06 KR KR1019930015236A patent/KR100347219B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-08-06 AU AU44465/93A patent/AU680826B2/en not_active Ceased
- 1993-08-06 FI FI933495A patent/FI114318B/fi active IP Right Grant
- 1993-08-06 HU HU9302285A patent/HU214364B/hu not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-30 HU HU95P/P00643P patent/HU211691A9/hu unknown
-
1997
- 1997-08-18 AU AU34227/97A patent/AU715190B2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-09-19 HK HK98110746A patent/HK1009978A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX9304765A (es) | 1995-01-31 |
| FI933495A0 (fi) | 1993-08-06 |
| AU680826B2 (en) | 1997-08-14 |
| AU4446593A (en) | 1994-02-10 |
| IL106508A (en) | 1998-02-22 |
| EP0586076B1 (en) | 2003-06-25 |
| PT586076E (pt) | 2003-11-28 |
| HK1009978A1 (en) | 1999-06-11 |
| DE69333057T2 (de) | 2004-07-08 |
| AU3422797A (en) | 1997-11-20 |
| EP0586076A3 (en) | 1994-04-20 |
| ZA935355B (en) | 1995-01-23 |
| ATE243755T1 (de) | 2003-07-15 |
| FI114318B (fi) | 2004-09-30 |
| KR100347219B1 (ko) | 2003-02-25 |
| JPH06165689A (ja) | 1994-06-14 |
| IL106508A0 (en) | 1993-11-15 |
| DK0586076T3 (da) | 2003-10-20 |
| NZ248328A (en) | 1997-05-26 |
| AU715190B2 (en) | 2000-01-20 |
| HU211691A9 (en) | 1995-12-28 |
| HUT67302A (en) | 1995-03-28 |
| JP4093597B2 (ja) | 2008-06-04 |
| KR940003566A (ko) | 1994-03-12 |
| EP0586076A2 (en) | 1994-03-09 |
| CA2101463C (en) | 2007-03-13 |
| CA2101463A1 (en) | 1994-02-08 |
| HU9302285D0 (en) | 1993-11-29 |
| BR9303226A (pt) | 1994-03-08 |
| DE69333057D1 (de) | 2003-07-31 |
| HU214364B (hu) | 1998-03-30 |
| FI933495A (fi) | 1994-02-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2201055T3 (es) | Vacunas de adenovirus recombinante. | |
| US11207400B2 (en) | Compositions and methods for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection | |
| US6511845B1 (en) | Methods for producing an immune response against HIV-1 | |
| NATUK et al. | Immunogenicity of recombinant human adenovirus-human immunodeficiency virus vaccines in chimpanzees | |
| PL188641B1 (pl) | Szczepionka polienv przeciwko HIV, sposób wytwarzania szczepionki polienv,zastosowanie szczepionki polienv,zastosowanie przynajmniej jednego rekombinowanego białka env HIV lub przynajmniej jednego wektora DNA, który koduje ekspresję rekombinowanego białka env HIV, plazmid bifunkcjonalny. | |
| JP2018524977A (ja) | アデノウイルスポリヌクレオチド及びポリペプチド | |
| JP2017507672A (ja) | 複製型組み換えアデノウイルスベクター、組成物およびこれらの使用方法 | |
| US11859199B2 (en) | Adenoviral vectors with two expression cassettes encoding RSV antigenic proteins or fragments thereof | |
| US20240093161A1 (en) | Simian adenoviral vectors with two expression cassettes | |
| EP0638316B1 (en) | Recombinant adenovirus vaccines | |
| CA2519207A1 (en) | Adenovirus serotype 34 vectors, nucleic acids and virus produced thereby | |
| Xiang et al. | Induction of mucosal immunity with a replication-defective adenoviral recombinant | |
| AU766264B2 (en) | Viral chimeras comprised of caev and hiv-1 genetic elements | |
| WO2023128799A1 (ru) | ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ SARS-CoV-2 И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) | |
| AU5190900A (en) | Recombinant adenovirus vaccines | |
| Yilma et al. | Genetically engineered vaccines | |
| NZ767061A (en) | Methods and compositions for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection | |
| NZ767061B2 (en) | Methods and compositions for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection | |
| NZ730841B2 (en) | Methods and compositions for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection |