ES2200892T3

ES2200892T3 - Conjugados de exendina-4 y su uso medico.

Info

Publication number: ES2200892T3
Application number: ES00945656T
Authority: ES
Inventors: Bjarne Due Larsen; Jens Damsgaard Mikkelsen; Soren Neve
Original assignee: Zealand Pharma AS
Current assignee: Zealand Pharma AS
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2000-07-12
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2020-07-12
Also published as: IL147293A0; EP1329458B1; WO2001004156A1; JP2011102305A; JP2007001987A; AU5966000A; CN1376166A; IL185763A; EP1329458A3; ATE551362T1; IL147293A; CA2378431A1; FR13C0021I2; ES2384963T9; PT1329458E; PT2112161E; IL206445A; SI1329458T1; LU92175I2; CA2680437A1

Abstract

Un péptido conjugado de una variante de exendina¿4(1¿39) que comprende una deleción de entre 1 y 5 residuos de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 34¿38 de exendina¿4, en el que la variante de exendina¿4 está acoplada a través de su extremo C¿terminal a una secuencia de aminoácidos Z, donde Z comprende de 1 hasta 7 residuos de aminoácido Lys.

Description

Conjugados de exendina-4 y su uso médico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos conjugados de exendina-4, y especialmente a conjugados que reducen los niveles de glucosa en sangre. Los conjugados se pueden usar en el tratamiento de enfermedades que se benefician de la regulación de niveles excesivos de glucosa en sangre y/o la regulación del vaciado gástrico, tales como la diabetes y los trastornos alimenticios.

Antecedentes de la invención

Varias hormonas que reducen los niveles de glucosa en sangre se liberan de la mucosa gastrointestinal en respuesta a la presencia y absorción de nutrientes en el intestino. Éstas incluyen gastrina, secretina, polipéptido insulinotrópico dependiente de la glucosa (GIP) y péptido 1 similar al glucagón (GLP-1). La sustancia más potente conocida es el GLP-1 (\diameterrskov, 1992, Diabetología 35:701-711). El péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) es un producto del proglucagón, un péptido de 180 aminoácidos (Drucker, 1998, Diabetes 47:159-169). La secuencia total del proglucagón contiene la secuencia de 29 aminoácidos del glucagón, la secuencia de 36 ó 37 aminoácidos del GLP-1 y la secuencia de 34 aminoácidos del péptido 2 similar al glucagón (GLP-2), un péptido intestinotrófico. El GLP-1 tiene varias funciones. Es una hormona fisiológica que aumenta el efecto sobre la secreción de insulina en humanos normales y es por lo tanto una hormona incretina. Además, el GLP-1 también reduce las concentraciones de glucagón, ralentiza el vaciado gástrico, estimula la biosíntesis de (pro)insulina, y aumenta la sensibilidad de la insulina (Nauck, 1997, Horm. Metab. Resp. 47:1253-1258). El péptido también aumenta la capacidad de las células \beta para percibir y responder a glucosa en sujetos con tolerancia a la glucosa disminuida. (Byrne, 1998, Eur. J. Clin. Invest. 28:72-78). El efecto insulinotrópico del GLP-1 en humanos incrementa la velocidad de desaparición de la glucosa en parte debido al aumento de los niveles de insulina y en parte debido al aumento de la sensibilidad de la insulina (D'Alessio, 1994, Eur. J. Clin. Invest. 28:72-78). Esto ha situado al GLP-1 como un agente prometedor para el tratamiento de la diabetes tipo II. Se ha encontrado que los fragmentos activos del GLP-1 son el GLP-1(7-36) y el GLP-1(7-37). Sin embargo, un problema farmacológico importante con el GLP-1 natural es su corta semivida. En humanos y ratas, el GLP-1 se degrada rápidamente por la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) en GLP-1(9-36)amida, que actúa como un antagonista del receptor de GLP-1 endógeno (Deacon, 1998, Diabetologia 41:271-278). Se han propuesto varias estrategias que evitan este problema, algunas usan inhibidores de DPP-IV y otras, análogos de GLP-1(7-36)amida resistentes a DPP-IV (Deacon, 1998, Diabetologia 41:271-278; Deacon et al., 1998, Diabetes 47:764-769; Ritzel, 1998, J. Endocrinol. 159:93-102; Número de patente de EE.UU. 5.545.618; Pederson, 1998, Diabetes 47:1253-1258).

Las exendinas, otro grupo de péptidos que reducen los niveles de glucosa en sangre, tienen cierta similitud de secuencia (53%) con GLP-1[7-36]NH_{2} (Goke et al. 1993, J.Biol. Chem. 268:19650-55). Las exendinas se encuentran en el veneno de Helodermatidae o en los lagartos de cuentas (Raufman, 1996, Reg. Peptides 61:1-18). La exendina-3 está presente en el veneno de Heloderma horridum, el lagarto de cuentas mexicano y la exendina-4 está presente en el veneno de Heloderma suspectrum, el monstruo de Gila. La exendina-4 difiere de la exendina-3 en sólo las posiciones dos y tres. Se ha clonado y secuenciado el ADNc que codifica la proteína precursora de exendina-4, un péptido de 47 aminoácidos fusionado al extremo amino terminal de exendina-4 (Pohl et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:9778-9784 y el documento WO98/35033). Tanto la exendina-3 como la exendina-4, estimulan un aumento en la producción de AMPc celular en células acinares pancreáticas de conejillo de Indias por interacción con receptores de exendina (Raufman, 1996, Reg. Peptides 61:1-18). La exendina-3 causa un incremento bifásico en la producción de AMPc celular, pero un incremento monofásico en la liberación de amilasa en células acinares pancreáticas. En cambio, la exendina-4 causa un incremento monofásico en la producción de AMPc y no altera la liberación de amilasa.

La exendina-4 es un fuerte agonista del receptor de GLP-1 en células de insulinomas de rata aisladas (Goke et al. 1993, J. Biol. Chem. 268:19650-55). Esto es previsible porque el dominio (His Ala) del GLP-1 reconocido por el DPP-IV no está presente en la exendina-4 (Goke et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:19650-55). La unión del [^{125}I]GLP-I al núcleo del tracto solitario se inhibió en dependencia de la concentración mediante GLP-1 no marcado y [Tyr39]exendina-4 con valores de Ki de 3,5 y 9,4 nM, respectivamente, y se encuentran valores similares en líneas celulares (Goke et al., 1995, Eur. J. Neurosci. 7:2294-2300 y Goke et al. 1993, J. Biol. Chem. 268:19650-55). Además, la exendina-4 suministrada sistemáticamente reduce los niveles de glucosa en sangre en un 40% en ratones diabéticos db/db (WO99/07404). Recientemente, Grieg et al. (1999, Diabetologia 42:45-50) han mostrado un efecto de larga duración en la reducción de los niveles de glucosa en sangre con una eyección diaria intraperitoneal de exendina-4 a ratones diabéticos ob/ob. El número de patente de EE.UU. 5.424.286 describe que una porción considerable de la secuencia N-terminal es esencial para preservar la actividad insulinotrópica (exendina-4(1-31) y

\hbox{Y ^{31} -exendina-4(1-31))}

mientras que una exendina con el extremo N-terminal truncado (exendina-4(9-39)) tiene propiedades inhibitorias.

Se ha propuesto el uso de exendina-3, exendina-4 y agonistas de exendina para el tratamiento de diabetes mellitus, por reducción de la motilidad gástrica y retraso del vaciado gástrico, y para la prevención de la hiperglucemia (Número de patente de EE.UU. 5.424.286, WO98/05351) así como para la reducción de la ingestión de alimentos (WO98/30231). Se han propuesto formas de obtener compuestos nuevos modificando las secuencias de exendina natural. Una forma es incorporar sustituyentes lipófilos a la molécula, por ejemplo, como se describe en el documento WO 99/43708 que describe derivados de exendina con sólo un sustituyente incorporado al residuo de aminoácido

\hbox{C-terminal.}

Una aproximación importante ha sido diseñar análogos de exendina caracterizados por sustituciones de aminoácidos y/o por el truncamiento del extremo C-terminal de la secuencia de exendina-4 natural. Esta aproximación se representa a través de los compuestos de los documentos WO99/07404, WO99/25727 y WO99/25728.

El documento WO99/07404 describe los agonistas de exendina que tienen una fórmula general I que define una secuencia peptídica de 39 residuos de aminoácidos con Gly Thr en las posiciones 4-5, Ser Lys Gln en las posiciones 11-13, Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu en las posiciones 15-21, Leu Lys Asn Gly Gly en las posiciones 26-30, Ser Ser Gly Ala en las posiciones 32-35, y en la que las posiciones restantes pueden estar ocupadas por residuos de aminoácidos de exendina silvestre o pueden estar ocupadas por sustituciones de aminoácidos específicos. La fórmula I no incluye a ningún agonista de exendina o análogos que tengan deleciones de aminoácidos específicos y/o que sean conjugados como se describe en la presente memoria, tales como los compuestos nuevos desPro^{36}-exendina-4(1-39), exendina-4(1-39)-k_{6} o desPro^{36}-exendina-4(1-39)-K_{6}.

El documento WO 99/25727 describe los agonistas de exendina que tienen una fórmula general I que define una secuencia peptídica de 28 hasta 38 residuos de aminoácidos con Gly en la posición 4 y Ala en la posición 18, y en la que las posiciones restantes pueden estar ocupadas por residuos de aminoácidos de exendina silvestre o pueden estar ocupadas por sustituciones de aminoácidos específicos. La fórmula I no comprende una secuencia peptídica que tenga Ser como aminoácido C-terminal y agonistas de exendina o análogos que tengan deleciones de aminoácidos específicos y/o que sean conjugados como se describe en la presente memoria, tales como los nuevos compuestos desPro^{36}-exendina-4(1-39), exendina-4(1-39)-k_{6} o desPro^{36}-exendina-4(1-39)-K_{6}. Además, la fórmula II del documento WO99/25727 define una secuencia peptídica similar a la fórmula I, pero incluye derivados de exendina que tienen un sustituyente de C(1-10)alcanoil o cicloalquilalcanoil sobre la lisina en la posición 27 ó 28.

Al tratar niveles inadecuados de glucosa en sangre posprandial los compuestos se administran frecuentemente, por ejemplo una, dos o tres veces por día.

El documento WO 99/25728 describe los agonistas de exendina que tienen una fórmula general I que define una secuencia peptídica de 28 hasta 39 residuos de aminoácidos con una Ala fija en la posición 18, y en la que las posiciones restantes pueden estar ocupadas por residuos de aminoácidos de exendina silvestre o pueden estar ocupadas por sustituciones de aminoácidos específicos. Dichos agonistas de exendina corresponden todos a un análogo de exendina truncado que tiene sustituciones en grado variable de aminoácidos. Las secuencias peptídicas de 34 hasta 38 residuos de aminoácidos no tienen Ser C-terminal. Una secuencia peptídica de 39 residuos de aminoácidos puede tener Ser o Tyr en el extremo C-terminal, pero ningún otro residuo. La fórmula I no comprende los agonistas de exendina o análogos que tienen deleciones de aminoácidos específicos y/o que son conjugados de acuerdo con la invención descrita en la presente memoria. Además, la fórmula II define una secuencia petídica similar a la fórmula I, pero incluye derivados de exendina que tienen un sustituyente de C(1-10)alcanoil o cicloalquilalcanoil en la lisina en la posición 27 ó 28.

El documento WO 99/46283 (publicado el 16.09.99) describe los péptidos conjugados que comprenden un pétido X activo farmacológicamente y una secuencia peptídica estabilizante Z de 4-20 residuos de aminoácidos unida covalentemente a X, donde dichos conjugados se caracterizan por tener una semivida aumentada comparada con la semivida de X. X puede ser exendina-4 o exendina-3.

Objetivo de la invención

Existe una necesidad de compuestos que reduzcan los niveles de glucosa en sangre en mamíferos, y que sean estables y efectivos. Por lo tanto, es un objetivo de la invención proporcionar compuestos nuevos que reduzcan los niveles de glucosa en sangre en mamíferos. Idealmente, éstos deberían ser efectivos cuando se administren oralmente. Otro objetivo de la invención es proporcionar agonistas peptídicos nuevos de la actividad de exendina-4. Un propósito adicional de la invención es proporcionar agonistas peptídicos de la actividad de exendina-4 que tengan una semivida aumentada y/o una eliminación disminuida.

Compendio de la invención

La invención se dirige a un péptido conjugado como se expone en las reivindicaciones 1 a 8 y a los usos médicos de estos conjugados y a las composiciones farmacéuticas que los comprenden.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el efecto del compuesto 1 (Nº ID SEC (Número de Identificación de Secuencia): 101) (des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-NH_{2}) sobre los niveles de glucosa de ratones, véase Ejemplo 15.

La Figura 2 muestra el efecto del compuesto 2 (Nº ID SEC: 93) (des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2}) sobre los niveles de glucosa de ratones, véase Ejemplo 15.

La Figura 3 es un gráfico de los valores de ABC (área bajo la curva) (media \pm error estándar de la media (EEM)) para los compuestos 2, 14-16, 18 y 19 en un ensayo oral de tolerancia a la glucosa (EOTG), véase Ejemplo 17.

La Figura 4 muestra un ADNc sintético construido para la expresión heteróloga del compuesto 2 en levadura. Se diseñó la nueva construcción pYES0010, véase Ejemplo 12.

La Figura 5 es un gráfico de dosis-respuesta en un ensayo de tolerancia a la glucosa (ETG) en ratones db/db basado en valores relativos de ABC_{0-240 min} (media \pm EEM) para el compuesto 2 y el compuesto (i), véase Ejemplo 18.

La Figura 6 muestra los efectos de una dosis máxima del compuesto 2, es decir, 100 nmol/kg i.p., en el ensayo oral de tolerancia a la glucosa (EOTG) cuando se administró hasta 24 horas antes del EOTG.

Descripción detallada de la invención

Los compuestos de la presente invención incluyen hasta ahora variantes desconocidas de deleción de una exendina madre. En contraste con las variantes de sustitución y/o de truncamiento conocidas de exendina-4(1-39), se cree que los nuevos compuestos exhiben una estructura alfa-hélice estabilizada con propiedades de estabilidad superiores y con propiedades de unión no reducidas o aumentadas. Más aún, la conjugación de las variantes nuevas, con secuencias peptídicas cortas específicas (Z) proporciona estabilidad a estos compuestos sin comprometer las propiedades farmacológicas. Estas conjugaciones confieren in vivo estabilidad e hidrofobicidad a la molécula peptídica. La secuencia Z está compuesta por residuos de aminoácidos, y sola no tiene características estructurales en términos de conformación en \alpha-hélice. Sin embargo, a partir de estudios que usan tanto el dicroísmo circular como la espectroscopia por resonancia magnética nuclear (RMN), la adición de Z modifica dramáticamente las características estructurales de algunos péptidos como se evidencia por el aumento en la cantidad de conformación en \alpha-hélice en el péptido. Unido a los resultados farmacológicos, los análisis estructurales sugieren que Z está modificando la conformación del péptido lo que conduce a una mayor estabilidad enzimática, pero sin perder su potencia. También las propiedades físicas y químicas de los péptidos se pueden alterar considerablemente por la modificación de Z con el consiguiente impacto sobre la estrategia de formulación farmacológica.

Variantes de exendina

La variante de exendina de la presente invención es una variante de un péptido de exendina madre que comprende entre una y cinco deleciones en las posiciones 34-38. Preferentemente la variante comprende entre 1 y 4 deleciones en las posiciones 34-38, más preferentemente entre 1 y 3 deleciones en las posiciones 36-38. Preferentemente la exendina madre es la exendina-4, y una variante preferida incluida como péptido X en los péptidos conjugados de la presente memoria tiene una secuencia de aminoácidos en la que 1, 2 ó 3 de los residuos de Pro en las posiciones 36, 37 y 38 se han suprimidos de la secuencia de aminoácidos de exendina-4 y preferentemente de la secuencia de aminoácidos de exendina-4(1-39).

Se cree que el acoplamiento de la secuencia Z al péptido X de la presente memoria aumenta la estabilidad de estos compuestos. La prolina es un aminoácido rígido que puede interferir con el efecto de Z para estabilizar la estructura del péptido X. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, se prefiere la deleción de uno, dos o todos los aminoácidos de prolina en las posiciones 36, 37 y 38 de la cadena carbonada de exendina en los péptidos conjugados que comprenden una variante de un exendina madre, siempre que la eficacia de dichos conjugados, medida, por ejemplo, en un ensayo oral de tolerancia a la glucosa (EOTG) en ratones db/db diabéticos, no esté afectada negativamente.

En otra realización, la variante comprende un residuo adicional en la posición 40, un residuo de lisina que comprende un sustituyente lipófilo unido al grupo amino epsilon de la lisina mediante una enlace amida. Los sustituyentes lipófilos pueden ser el grupo acilo de un ácido graso de cadena lineal o ramificada o de un ácido dicarboxílico-\alpha,\omega alcano de cadena lineal o ramificada. El grupo acilo puede tener la formula CH_{3}(CH_{2})_{n}CO-, en la que n es un entero de 4-38 y preferentemente de 4-24. En una realización específica, el grupo acilo se selecciona del grupo consistente en CH_{3}(CH_{2})_{6}CO-, CH_{3}(CH_{2})_{8}CO-, CH_{3}(CH_{2})_{10}CO-, CH_{3}(CH_{2})_{12}CO-, CH_{3}(CH_{2})_{14}CO-, CH_{3}(CH_{2})_{16}CO-,

\hbox{CH _{3} (CH _{2} ) _{18} CO-,}

CH_{3}(CH_{2})_{20}CO-, y CH_{3}(CH_{2})_{22}CO-. El grupo acilo puede tener la fórmula HOOC(CH_{2})_{m}CO-, en la que n es un entero de 4-38 y preferentemente de 4-24. En una realización específica, el grupo acilo se selecciona del grupo consistente en HOOC(CH_{2})_{14}CO-, HOOC(CH_{2})_{16}CO-, HOOC(CH_{2})_{18}CO-, HOOC(CH_{2})_{20}CO- y HOOC(CH_{2})_{22}CO-. En una realización más específica, el sustituyente lipófilo se selecciona del grupo consistente en tetradecanoilo, \omega-carboxinonadecanoilo, 7-deoxicoloilo, coloilo, palmitoilo y litocolilo. En una realización más específica, el sustituyente lipófilo es palmitoilo.

Alternativamente, el sustituyente lipófilo puede tener un grupo NH. Realizaciones específicas incluyen, pero no se limitan a las fórmulas CH_{3}(CH_{2})_{a}((CH_{2})_{b}COOH)CHNHCO(CH_{2})_{2}CO-, en las que a y b son enteros y a+b es un entero de 8 hasta 33, preferentemente de 12 hasta 28;

CH_{3}(CH_{2})_{c}CONHCH(COOH)(CH_{2})_{2}CO-, en la que c es un entero de 10 hasta 24; CH_{3}(CH_{2})_{d} CONHCH(CH_{2})_{2}(COOH)CO-, en la que d es un entero de 8 hasta 24; COOH(CH_{2})_{e}CO-, en la que e es un entero de 8 hasta 24;

\newpage

-NHCH(COOH)(CH_{2})_{4}NHCO(CH_{2})_{f}CH_{3}, en la que f es un entero de 8 hasta 18;

- NHCH(COOH)(CH_{2})_{4}NHCOCH(CH_{2})_{2}(COOH)NHCO(CH_{2})_{g}CH_{3 }, en la que g es un entero de 10 hasta 16; y

- NHCH(COOH)(CH_{2})_{4}NHCO(CH_{2})_{2}CH(COOH)NHCO(CH_{2})_{h}CH_{3 }, en la que h es un entero de 0 o de 1 hasta 22 y preferentemente de 10 hasta 16.

Las variantes de exendina que tienen un residuo de lisina en la posición 40, el cual lleva opcionalmente un sustituyente lipófilo, comprenden además entre uno y cinco deleciones, preferentemente entre uno y tres deleciones, en las posiciones 34 a 39, preferentemente en las posiciones 34-38, tales como [des Ser^{39}, Lys^{40}(palmitoil)]exendina-4(1-39), [des Pro^{36}, Lys^{40}(palmitoil)]exendina-4(1-39) y [des Pro^{36}, Lys^{40}(palmitoil)]exendina-4(1-40).

La variante puede estar en una realización más específica seleccionada del grupo consistente en:

Compuesto 1: des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 101),

des Pro^{36}-exendina-4(1-40)-NH_{2},

Compuesto 14: des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}-exendina-4(1-39)-NH_{2},

des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}-exendina-4(1-40)-NH_{2},

des Pro^{36},Pro^{37}-exendina-4(1-39)-NH_{2},

des Ala^{35}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 105),

des Gly^{34}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 106),

des Ser^{39}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 107),

des Gly^{34}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 108),

des Ala^{35}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 109),

des Pro^{36}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 110), y su ácido libre y una de sus sales aceptable farmacéuticamente.

Péptidos conjugados

La secuencia peptídica Z puede estar unida al extremo C-terminal de la secuencia peptídica de exendina, preferentemente mediante un enlace peptídico.

Z es una secuencia peptídica que comprende entre 1 y 7 residuos de Lys y tiene preferentemente entre 4-20 residuos de aminoácidos, por ejemplo, en el intervalo de 4-15, más preferentemente en el intervalo de 4-10, en particular en el intervalo de 4-7 residuos de aminoácidos, por ejemplo, de 4, 5, 6, 7, 8 ó 10 residuos de aminoácidos, donde se prefieren 6 residuos de aminoácidos. Aparte de uno o más residuos de Lys, los otros residuos de aminoácidos en la secuencia peptídica Z se seleccionan independientemente del grupo consistente en Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met, Orn, ácido diaminobutanoico y ácido diaminopropanoico. Preferentemente, los residuos de aminoácidos se seleccionan de Glu, Lys, y Met, especialmente Lys, o los residuos de aminoácidos se seleccionan del grupo consistente en Asn, Glu y Lys. Los aminoácidos mencionados más arriba pueden tener configuración D o L, pero preferentemente los aminoácidos mencionados más arriba tienen una configuración L.

Así, ejemplos ilustrativos de la secuencia peptídica Z son:

Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 1), Xaa-Lys-Lys-Lys, Lys-Xaa-Lys-Lys, Lys-Lys-Xaa-Lys, Lys-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Lys-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 3), Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 4), Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 5), Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 6), Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 7), Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa, Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 9), Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 10), Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 11), Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 12), Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 13), Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 14), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa (Nº ID SEC: 15), Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 16), Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 17), Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 18), Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 19), Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa (Nº ID SEC: 20), Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 21), Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 22), Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 23), Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa (Nº ID SEC: 24), Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 25), Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 26), Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa (Nº ID SEC: 27), Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 28), Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa (Nº ID SEC: 29), Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 30), Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 31), Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 32), Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 33), Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 34), Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 35), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 36), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa (Nº ID SEC: 37), Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 38), Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 39), Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 40), Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 41), Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 42), Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 43), Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 44), Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 45), Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 46), Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 47), Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 48), Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 49), Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 50), Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 51), Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 52), Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 53), Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 54), Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 55), Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 56), Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 57), Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 58), Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 59), Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 60), Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 61), Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa (Nº ID SEC: 62), Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa (Nº ID SEC: 63), Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa (Nº ID SEC: 64), Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 65), Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa (Nº ID SEC: 66), Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa (Nº ID SEC: 67), Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa (Nº ID SEC: 68), Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 69), Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa (Nº ID SEC: 70), Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 71), Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa (Nº ID SEC: 72), Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa (Nº ID SEC: 73), Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 74), Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 75), Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa (Nº ID SEC: 76), Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 77), Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 78), Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 79), Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys (Nº ID SEC: 80), Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys (Nº ID SEC: 81), Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys (Nº ID SEC: 82), Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, en las que cada Xaa se selecciona independietemente del grupo consistente en Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His, Met, Orn, y aminoácidos de la formula I según se define en la presente memoria, por ejemplo, Dbu o Dpr.

Como se indica más arriba los residuos de aminoácidos de Z pueden, por supuesto, ser todos diferentes o todos idénticos. Sin embargo, en realizaciones interesantes de la presente invención, los residuos de aminoácidos de Z se seleccionan de dos o tres aminoácidos diferentes, o son aminoácidos idénticos. Ejemplos de secuencias peptídicas adecuadas, en las que los residuos de aminoácidos de Z son idénticos son por ejemplo, (Lys)_{n}, en la que n es un entero en el intervalo de 4 hasta 7, por ejemplo, Lys_{4} (Nº ID SEC: 1), Lys_{5} (Nº ID SEC: 2), Lys_{6} (Nº ID SEC: 8), Lys_{7} (Nº ID SEC: 30). Se prefiere (Lys)_{6} unido mediante enlace peptídico al extremo C-terminal de X.

Ejemplos de secuencias peptídicas adecuadas, en las que los residuos de aminoácidos de Z se seleccionan de aproximadamente dos aminoácidos diferentes son por ejemplo, (Lys-Xaa)_{m} o (Xaa-Lys)_{m}, en las que m es un entero en el intervalo de aproximadamente 2 hasta 7, preferentemente en el intervalo de 2 hasta 5, tal como en el intervalo de 2 hasta 4, por ejemplo, 3, y Xaa se selecciona independientemente del grupo consistente en Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His, Orn, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,3 diaminopropanoico y Met. Más preferentemente tales secuencias peptídicas son por ejemplo, (Lys-Xaa)_{3} o (Xaa-Lys)_{3}, en las que Xaa es como se define más arriba, tales como (Lys-Glu)_{3} (Nº ID SEC: 83) o (Glu-Lys)_{3} (Nº ID SEC: 84). Otros ejemplos de secuencias peptídicas adecuadas, en las que los residuos de aminoácidos de Z se seleccionan de aproximadamente dos residuos de aminoácidos son por ejemplo, Lys_{p}-Xaa_{q} o Xaa_{p}-Lys_{q}, en las que p y q son enteros en el intervalo de 1 hasta 14, con la condición de que p+q esté en el intervalo de 4 hasta 15, preferentemente en el intervalo de 4 hasta 10, tal como en el intervalo de 4 hasta 8, por ejemplo, en el intervalo de 4 hasta 6, por ejemplo, 4, 5 ó 6, y Xaa se selecciona independientemente del grupo consistente en Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His and Met. Más preferentemente tales secuencias peptídicas son, por ejemplo, Lys_{3}-Xaa_{3} o Xaa_{3}-Lys_{3}, en las que Xaa son como se definen más arriba, tales como Lys_{3}-Glu_{3} (Nº ID SEC: 85) o Glu_{3}-Lys_{3} (Nº ID SEC: 86). Las secuencias Z más preferidas consisten en una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionados de Asn y Gln junto con 4-7 residuos de aminoácidos seleccionados de Glu y Asp, tales como Asn-(Glu)_{5}, Asn-(Glu)_{6}, Gln-(Glu)_{5}, Asn-(Asp)_{5}, y Gln-(Asp)_{5}, que es la parte N-terminal del péptido conjugado de la invención.

Ejemplos de secuencias peptídicas adecuadas, en las que los residuos de aminoácidos de Z se seleccionan de tres aminoácidos diferentes son, por ejemplo, Xaa^{1}-(Lys)_{x}-(Xaa^{2})_{y}, Xaa^{1}-(Xaa^{2})_{x}-(Lys)_{y}, (Lys)_{x}-(Xaa^{2})_{y}-Xaa^{1}, (Xaa^{1})_{x}-(Lys)_{y}-Xaa^{2}, (Lys)_{x}-Xaa^{1}-(Xaa^{2})_{y}, (Xaa^{1})_{x}-Xaa^{2}-(Lys)_{y}, Xaa^{1}-Lys-Xaa^{2}-Lys, Xaa^{1}-Lys-Xaa^{2}-Lys-Xaa^{2}, Xaa^{1}-Lys-Xaa^{2}-Lys-Xaa^{2}-Lys, Xaa^{1}-Xaa^{2}-Lys-Xaa^{2}, Xaa^{1}-Xaa^{2}-Lys-Xaa^{2}-Lys, Xaa^{1}-Xaa^{1}-Lys-Xaa^{2}-Lys-Xaa^{2}, Lys-Xaa^{2}-Lys-Xaa^{1}, Lys-Xaa^{2}-Lys-Xaa^{2}-Xaa^{1}, Lys-Xaa^{2}-Lys-Xaa^{2}-Lys-Xaa^{1}, Xaa^{2}-Lys-Xaa^{2}-Xaa^{1}, Xaa^{2}-Lys-Xaa^{2}-Lys-Xaa^{1}, Xaa^{2}-Lys-Xaa^{1}-Lys-Xaa^{2}-Xaa^{1}, etc., en las que x e y son enteros en el intervalo de aproximadamente 1 hasta 5 con la condición de que x+y sea como máximo 6, y Xaa^{1} y Xaa^{2} se seleccionan independientemente aproximadamente del grupo consistente en Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His, Met, Orn, ácido 2,3-diaminopropanoico, ácido 2,4-diaminobutanoico y aminoácidos de la fórmula I según se define en la presente memoria.

Una realización más preferida de la invención se dirige hacia un péptido conjugado nuevo que comprende un péptido X que es un agonista de la actividad de exendina-4 seleccionado del grupo consistente en

des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 101),

des Pro^{36}-exendina-4(1-40)-NH_{2},

des Pro^{36}-des Pro^{37}-exendina-4(1-39)-NH_{2},

des Pro^{36}-des Pro^{37}-des Pro^{38}-exendina-4(1-39)-NH_{2},

des Pro^{36}-des Pro^{37}-des Pro^{38}-exendina-4(1-40)-NH_{2},

des Ala^{35}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 105),

des Gly^{34}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 106),

des Gly^{34}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 108),

des Ala^{35}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 109),

des Pro^{36}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 110),

Se debería entender que los péptidos conjugados de la invención también podrían estar en la amida preferida (NH_{2}) o en forma de ácido libre (OH) o en forma de una de sus sales. Ejemplos de péptidos conjugados de la invención son

des Ser^{39}-exendina-4(1-39)-(Lys)_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 91),

exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 92),

des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 93),

des Ala^{35}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 94),

des Gly^{34}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 95),

des Ser^{39}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-Lys_{7}-NH_{2} (Nº ID SEC: 96),

des Gly^{34}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-Lys_{7}-NH_{2} (Nº ID SEC: 97),

des Ala^{35}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-Lys_{7}-NH_{2} (Nº ID SEC: 98),

des Pro^{36}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-Lys_{7}-NH_{2} (Nº ID SEC: 99),

(Lys^{40}(palmitoil)exendina-4(1-39)-Lys_{7}-NH_{2} (Nº ID SEC: 100),

des Pro^{36},Pro^{37}-exendina-4(1-39)-(Lys)_{6}-NH_{2},

Asn(Glu)_{5}-des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2},

des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2},

y su ácido libre y una de sus sales aceptable farmacéuticamente.

Entre los conjugados preferidos están

des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 93),

des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2},

y sus sales según se definen en la presente memoria.

En una realización más específica, los conjugados se seleccionan del grupo consistente en des Ser^{39}-exendina-4(1-39)-(Lys)_{6}-NH_{2}, exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2}, des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2}, des Ala^{35}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2}, des Gly^{34}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2}, des Ser^{39}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-Lys_{7}-NH_{2}, des Gly^{34}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-Lys_{7}-NH_{2}, des Ala^{35}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-Lys_{7}-NH_{2}, des Pro^{36}-(Lys^{40}(palmitoil))exendina-4(1-39)-Lys_{7}-NH_{2}, y (Lys^{40}(palmitoil)exendina-4(1-39)-Lys_{7}-NH_{2}.

La especificación de los péptidos conjugados de la presente invención permite que los péptidos conjugados de exendina que reducen la glucosa en sangre y a sus análogos activos sean administrados oralmente. En la presente memoria los fragmentos peptídicos terminales Z preferidos se seleccionan para introducir una estructura alfa-helicoidal al péptido X sin afectar significativamente la actividad deseada de X. Dicha estructura helicoidal estabiliza la cadena peptídica, por ejemplo, contra la degradación, como se evidencia por el aumento de 2 hasta 3 veces de la semivida del péptido conjugado comparado con el del péptido no conjugado, véase la tabla 5 más abajo. La secuencia peptídica Z es la parte del péptido conjugado responsable de introducir una cierta estructura en la molécula de modo que la dosis efectiva mínima se reduce al menos 5 veces. Preferentemente, la dosis efectiva mínima se reduce al menos 10 veces, más preferentemente 25 veces, aún más preferentemente 40 veces, y más preferentemente 50 veces. Por lo tanto, la presente invención también se refiere al uso de una secuencia peptídica (Z) como se define más arriba para la preparación de dicho péptido conjugado como se define más arriba.

Así, la invención también se refiere a un péptido conjugado nuevo que comprende un péptido X, como se define en la presente memoria, y en la que X reduce el nivel de glucosa en sangre de un mamífero donde la relación entre la dosis oral efectiva mínima de dicho péptido conjugado y la dosis oral efectiva mínima del péptido X es al menos 1:5.

Específicamente, la invención proporciona el uso médico de los conjugados de exendina-4, específicamente en el tratamiento de la diabetes tipo 1 o tipo 2, obesidad, trastornos alimenticios, hiperglucemia, trastornos metabólicos, enfermedad gástrica y síndrome de resistencia a la insulina.

La presente invención también se refiere a los métodos de preparación de dicho péptido conjugado, mediante tecnología de ADN recombinante que comprende las etapas de (a) introducir en la célula huésped una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho conjugado y (b) cultivar dicha célula huésped y (c) aislar dicho conjugado del cultivo o (a) cultivar una célula huésped recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho conjugado bajo condiciones que permitan la producción de dicho conjugado y (b) aislar dicho conjugado del cultivo.

El método también se refiere a los métodos para la preparación de dicho péptido conjugado en los que el péptido X se obtiene mediante métodos de ADN recombinante aislando dicho péptido. A continuación, X se conjuga a Z que se incorpora a un soporte sólido o se ha preparado mediante métodos sintéticos de fase sólida. Además, la invención se refiere a la preparación del péptido conjugado de la presente invención mediante métodos sintéticos de péptidos. Además, la invención se refiere a la preparación del péptido conjugado de la presente invención mediante métodos sintéticos de péptidos.

Los conjugados de la invención que comprenden una secuencia N-terminal de 33 hasta 39, preferentemente de 36 hasta 38, residuos de aminoácidos que tienen una homología substancial con la secuencia N-terminal de exendina-4 natural, que se cree es esencial para la unión al receptor (actividad insulinotrópica), y una secuencia C-terminal de Z poseen como ventaja adicional una estabilidad mejorada comparada con la de las exendinas naturales y las formas de exendina con el extremo C-terminal truncado.

Composiciones

La invención también se refiere a una composición que comprende el péptido conjugado de exendina-4 de la presente invención en combinación con un vehículo aceptable fisiológicamente. Tales composiciones pueden estar en una forma adaptada para la administración por vía oral, parenteral (incluyendo subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.), epidural, directa al cerebro e intraperitoneal (i.p.)), rectal, intratraqueal, intranasal, dérmica, vaginal, bucal, ocular, o pulmonar, preferentemente en una forma adaptada a la administración subcutánea o por vía oral, y tales composiciones se pueden preparar de un modo bien conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, como en líneas generales se describe en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 y en ediciones más recientes y en las monografías de la serie "Drugs and the Pharmaceutical Sciences" de Marcel Dekker. Las composiciones pueden aparecer en formas convencionales, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, aerosoles, formas de aplicación tópica, formas líquidas o semilíquidas, tales como disoluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, micelas o liposomas. Para la administración s.c. se prefieren composiciones líquidas adecuadas. En una realización preferida, las composiciones de la presente invención se administran subcutáneamente. En una realización preferida alternativa, las composiciones de la presente invención se administran oralmente, y en tales casos una forma de administración preferida es en comprimido o en cápsula.

El vehículo farmacéutico o diluyente empleado puede ser un vehículo sólido o líquido convencional. Ejemplos de vehículos sólidos son lactosa, sulfato de calcio, sacarosa, ciclodextrina, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico o éteres de alquilo inferiores de celulosa. Ejemplos de vehículos líquidos son jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, fosfolípidos, esteroles, ácidos grasos, aminas de ácidos grasos, polioxietileno, disoluciones tampón isotónicas y agua. Igualmente, el vehículo o diluyente puede incluir cualquier material de liberación sostenida conocido en la técnica, tales como gliceril monoestearato o gliceril diestearato, sólos o mezclado con una cera. Si se usa un vehículo sólido para la administración por vía oral, la preparación se puede distribuir en forma de comprimido, colocada en una cápsula de gelatina dura en polvo o en forma de pelet o puede estar en forma de una tableta o de una gragea. La cantidad de vehículo sólido variará ampliamente, pero normalmente será de aproximadamente 25 mg hasta aproximadamente 1 g.

Un comprimido típico que se puede preparar por técnicas de fabricación de comprimidos convencionales puede contener:

\Box: Núcleo: 100 mg de compuesto activo (como el compuesto libre de la invención o su sal); 1,5 mg de dióxido de silicio coloidal (Aerosil); 70 mg de celulosa, microcristalina (Avicel); 7,5 mg de goma de celulosa modificada (Ac-Di-Sol); estearato de magnesio.

\Box: Recubrimiento: aproximadamente 9 mg de HPMC;

: *aproximadamente 0,9 mg de Mywacett 9-40T;

: *monoglicérido acilado usado como plastificante para el recubrimiento de la película.

Si se usa un vehículo líquido, la preparación puede estar en la forma de jarabe, emulsión, cápsula de gelatina blanda o líquido inyectable estéril tales como una suspensión o disolución líquida acuosa y no acuosa.

Para la administración nasal, la preparación puede contener un compuesto de la presente invención, preferentemente un conjugado, disuelto o suspendido en un vehículo líquido, en particular, un vehículo acuoso, para aplicación en aerosol. El vehículo puede contener aditivos tales como agentes solubilizadores, por ejemplo, propilenglicol, tensioactivos, tales como sales de ácidos biliares o éteres de alcoholes superiores de polioxietileno, potenciadores de la absorción tales como lecitina (fosfatidilcolina) o ciclodextrina, o conservantes tales como parabinas.

La composición también puede estar en una forma adecuada para inyección local o sistémica o infusión y, como tal, se puede formular con agua estéril o con una disolución salina isotónica o con una disolución de glucosa. Las composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales que son bien conocidas en la técnica. Las disoluciones acuosas que resultan se pueden empaquetar para usar o filtrar bajo condiciones asépticas y liofilizar, combinándose la preparación liofilizada con la disolución acuosa estéril antes de su administración. Preferentemente, la formulación que ha de usarse para la dosificación intravenosa, subcutánea y por vía oral será una disolución del compuesto activo en tampón. La preparación se puede producir inmediatamente antes de su uso a partir del principio activo y de la disolución tampón estéril. Un método preferido de esterilización puede ser mediante filtración estéril de una disolución preparada inmediatamente antes de su uso. La composición puede contener sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente como se requiere para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes tampones, agentes de ajuste de tonicidad y similares, por ejemplo acetado sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, etc.

Los compuestos de la invención poseen propiedades farmacológicas valiosas, por ejemplo, estabilidad respecto a las enzimas proteolíticas. Estudios de estabilidad in vitro con los péptidos actuales y los péptidos conjugados en presencia de enzimas proteolíticas seleccionadas muestran un aumento en la semivida de los péptidos nuevos comparado con los péptidos de técnicas anteriores. Así, los compuestos de la invención exhiben una duración de su acción in vivo considerablemente prolongada comparada con la de GLP-1 y otros agonistas de GLP-1. Además, los compuestos de la invención estimulan la formación de AMPc. Este efecto se puede demostrar en un ensayo de AMPc, por ejemplo, según se describe en el documento WO 98/08871.

Los compuestos peptídicos de la presente invención son agonistas de la actividad de exendina-4 y mejoran la tolerancia de la glucosa en sangre en mamíferos diabéticos cuando se determina por conocidos ensayos en la técnica para un péptido particular. Ejemplos de tal ensayo se describen en la presente memoria. Así, la invención también se refiere a las variantes de exendina y péptidos conjugados como se definen más arriba para usar en terapia, y el uso de los péptidos conjugados como se define más arriba para la fabricación de una composición farmacéutica para usar en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de diabetes tipo 1 o tipo 2, obesidad, trastornos alimenticios y síndrome de resistencia a la insulina.

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En realizaciones específicas, las variantes de exendina y los péptidos conjugados de la invención se pueden usar para estimular la liberación de la insulina, reducir el nivel de la glucosa en sangre, reducir la motilidad gástrica, retrasar el vaciado gástrico, inhibir la ingesta de alimentos, por ejemplo, por supresión del apetito, o reducir el nivel de lípido en plasma en vertebrado o en mamífero. Generalmente, los compuestos nuevos de la invención también se pueden usar en el tratamiento de diabetes mellitus asociada con el riesgo de hiperglucemia, es decir, cuando la sensibilidad a la insulina se ha reducido por estrés, infecciones del miocardio, ataques e infecciones, o en casos de resistencia a la insulina durante el embarazo. Los compuestos nuevos también se pueden usar en el tratamiento de otros tipos de diabetes, tales como los casos donde la diabetes puede ser secundaria a otras enfermedades endocrinas tales como acromegalia, síndrome de Cushing, feocromocitoma, glucagonoma, somatostatinoma, aldosteronismo primario, o secundaria a la administración de ciertas hormonas que causan hiperglucemia, o secundaria a ciertos fármacos (fármacos antihipertensivos, diuréticos de tiazide, preparaciones que contienen estrógeno, fármacos psicoáctivos, agentes simpatomiméticos. Además, en líneas generales, los compuestos nuevos de la invención se pueden usar en el tratamiento de enfermedades y condiciones asociadas con el riesgo de hipoglucemia, es decir, cuando se disminuye la producción de glucosa endógena, tras la ingestión de alcohol, o en casos donde se disminuye la sensibilidad a la insulina en pacientes con hipopituitarismo o insuficiencia adrenocortical primaria, o cuando se disminuye la eliminación de la insulina como en la insuficiencia renal progresiva.

Otros usos terapéuticos específicos se describen en los documentos WO 99/40788 (referente a los efectos inótropo y diurético de exendina y GLP-1), WO 98/39022 (referente a un método de sedación de un sujeto mamífero, que tiene incrementada la activación del sistema nervioso central o periférico, que comprende la administración de exendina o GLP-1 o un agonista de exendina o GLP-1 al sujeto para producir un efecto sedativo o ansiolítico sobre el sujeto), WO 93/18786 (referente al tratamiento de la diabetes usando GLP-1(7-37) o GLP-1(7-36)amida en un régimen que comprende adicionalmente el tratamiento con un agente hipoglucémico oral, tal como sulfonilurea, que produce un fuerte efecto sinergético), WO 98/19698 (referente al uso de análogos de GLP-1 para la regulación de la obesidad), WO 98/08531 (referente al uso de GLP-1 o análogos en un método para reducir la mortalidad y la morbilidad después de un infarto de miocardio), WO 98/08873 (referente al uso de GLP-1 o análogos en un método para atenuar los cambios catabólicos post-quirúrgico y las respuestas hormonales a estrés). Además, los compuestos de la invención son adecuados en una terapia combinada con otros agentes antidiabéticos, tales como insulina, metformina, sulfonilureas y tiazolidindionas, o en terapia combinada con otros agentes antiobesidad, tales como leptina, dexfenfluramina, amfetamina, etc.

Definiciones

Un "péptido" según se usa en la presente memoria es cualquier compuesto producido por la formación de un enlace amida entre un grupo carboxilo de un aminoácido y un grupo amino de otro. Los enlaces amida en péptidos se pueden llamar enlaces peptídicos. La palabra péptido normalmente se aplica a compuestos cuyos enlaces amida se forman entre el C-1 de un aminoácido y el N-2 de otro (a veces llamados enlaces eupeptídicos), pero incluyen compuestos con residuos unidos por otros enlaces amida (a veces llamados enlaces isopeptídicos). Los péptidos con menos de aproximadamente 10-20 residuos también se pueden llamar oligopéptidos, aquellos con más, polipéptidos. Los polipéptidos de secuencia específica de más de aproximadamente 50 residuos se conocen normalmente como proteínas. Una "secuencia polipeptídica natural" como se usa en la presente memoria se refiere a una secuencia polipeptídica consistente en residuos de L-aminoácidos naturales y que se puede expresar en una célula huésped recombinante. Los compuestos X de la presente memoria son todos secuencias peptídicas de 40 residuos de aminoácidos o menos.

"Agonista" se refiere a una sustancia endógena o a un fármaco que puede interactuar con un receptor e iniciar una respuesta fisiológica o farmacológica característica de tal receptor (contracción, relajación, secreción, activación enzimática, etc.).

"Antagonista" se refiere a un fármaco o a un compuesto que se opone a los efectos fisiológicos de otro. A nivel del receptor, es una entidad química que se opone a las respuesta asociadas al receptor normalmente inducidas por otro agente bioactivo.

"Agonista parcial" se refiere a un agonista que no puede inducir activación máxima de una población de receptores, con independencia de la cantidad de fármaco aplicada. Un "agonista parcial" se puede calificar de "agonista con eficacia intrínsica intermedia" en un tejido dado. Más aún, un agonista parcial puede oponerse el efecto de un agonista total que actúa sobre el mismo receptor.

"Receptor" se refieren a una molécula o a una estructura polimérica dentro de una célula o en su membrana que específicamente reconoce y se une a un compuesto que actúa como un mensajero molecular (neurotransmisor, hormona, linfoquina, lectina, fármaco, etc.).

"Exendina-4" como se usa en la presente memoria se refiere a la exendina-4(1-39), la secuencia de aminoácidos que se describe en el número de patente de EE.UU. 5.424.286., Nº ID SEC: 2, y a la exendina-4(1-40) como se describe por Chen y Drucker en The Journal of Biological Chemistry, Vol.272, No. 7, pp.4108-15 que difiere solamente en que tiene glicina en la posición 40 como residuo de aminonoácido C-terminal. La homología de la exendina madre se determina como el grado de identidad entre dos secuencias de proteínas que indica una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología se puede determinar adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP, proporcionado en el paquete de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, Agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU. 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), J. Mol. Biol. 48:443-453). Se pueden utilizar las siguientes opciones para la comparación de la secuencia polipeptídica: penalización de apertura de GAP (huecos) de 3,0 y penalización de extensión de GAP de 0,1.

"Sales" incluye sales aceptables farmacéuticamente, tales como sales de adición ácida y sales básicas. Ejemplos de sales de adición ácida son las sales de hidrocloruro, sales sódicas, sales de hidrobromuro, etc. Ejemplos de sales básicas son las sales donde el catión se selecciona de los metales alcalinos, tales como el sodio y el potasio, metales alcalinotérreos, tales como el calcio, e iones amonio ^{+}N(R^{3})_{3}(R^{4}), donde R^{3} y R^{4} designan independientemente C_{1-6}-alquilo sustituido opcionalmente, C_{2-6}-alquenilo sustituido opcionalmente, aril sustituido opcionalmente, o heteroarilo sustituido opcionalmente. Otros ejemplos de sales aceptables farmacéuticamente son, por ejemplo, aquellas descritas en "Remington's Pharmaceutical Science" 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 y en ediciones más recientes, y en Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.

Preparación de variantes y conjugados

Las variantes de exendina y los péptidos conjugados de la invención se pueden preparar por métodos conocidos per se en la técnica. Así, las variantes y las secuencias peptídicas X y Z se pueden preparar por técnicas estándares de preparación de péptidos tales como síntesis en disolución o síntesis en fase sólida del tipo Merrifield. Se cree que las estrategias de Boc (terc-butiloxicarbonilo) y de Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) son aplicables.

En una estrategia de síntesis posible, los péptidos conjugados de la invención se pueden preparar mediante síntesis en fase sólida, primero construyendo la secuencia peptídica Z usando protección estándar bien conocida, procedimientos de acoplamiento y desprotección, después acoplando secuencialmente la exendina a Z de un modo similar a la construcción de Z, y finalmente, desanclando el péptido conjugado completo del transportador. Esta estrategia produce un péptido conjugado, en el que la secuencia peptídica Z se une covalentemente al péptido X en la función carbonilo del extremo C-terminal de X. Sin embargo, si el deseado péptido conjugado es un péptido conjugado en el que dos secuencias Z estabilizantes están covalente e independientemente unidas tanto al extremo C-terminal como al extremo N-terminal del péptido X, la estrategia de más arriba también es aplicable pero, como se entenderá por el experto en la técnica, antes de desanclar del soporte sólido el péptido conjugado unido por el extremo C-terminal, es necesario acoplar secuencialmente la segunda secuencia peptídica Z al extremo N-terminal de X de un modo similar al procedimiento descrito más arriba. Esta estrategia también se puede usar para incorporar Z a la función carbonilo en la cadena lateral de Glu o Asp. Una posible estrategia para la preparación de péptidos conjugados, en los que la secuencia peptídica Z se une covalentemente al átomo de nitrógeno N-terminal o se une covalentemente al átomo de nitrógeno en la cadena lateral de Lys, Arg o His de X es análoga con el método descrito arriba, es decir, dichos péptidos conjugados se pueden preparar mediante síntesis en fase sólida primero construyendo la secuencia peptídica X usando protección estándar bien conocida, procedimientos de acoplamiento y desprotección, después acoplando secuencialmente la secuencia peptídica Z en X de un modo similar a la construcción de X, y finalmente, desanclando el péptido conjugado completo del transportador. Otra posible estrategia es preparar una o las dos secuencias X y Z (o sus partes) separadamente mediante síntesis en disolución, síntesis en fase sólida, técnicas recombinante, o síntesis enzimática, seguido por acomplamiento de las dos secuencias mediante procedimientos bien conocidos de condensación de segmentos, bien en disolución, bien usando técnicas en fase sólida o su combinación. En una realización, X se puede preparar por métodos de ADN recombinante y Z se puede preparar por síntesis en fase sólida. La conjugación de X y Z se puede llevar a cabo usando ligamiento químico. Esta técnica permite el ensamblaje de segmentos peptídicos totalmente desprotegidos de un modo muy específico (Liu et al., 1996, J. Am. Chem. Soc. 118:307-312 y Dawson et al., 1996, 226:776). La conjugación también se puede realizar por formación de enlace peptídico catalizado por proteasa, lo cual ofrece una técnica muy específica para combinar segmentos peptídicos totalmente desprotegidos a través de un enlace peptídico (W. Kullmann, 1987, Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, Florida, pp. 41-59).

La derivación de la cadena lateral de Lys, Arg, His, Trp, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp y Glu con la secuencia peptídica, Z, se puede llevar a cabo mediante síntesis peptídica convergente tradicional que usa esquemas de protección ortogonal adecuados como se conocen en la técnica, o usando el método general, igualmente bien conocido, de fase sólida con protección ortogonal adecuada de la cadena separable.

Además, se prevé que una combinación de las estrategias mencionadas más arriba puede ser especialmente aplicable cuando una secuencia peptídica modificada, por ejemplo, de un péptido X que comprende enlaces isostéricos tales como enlaces peptídicos reducidos, tiene que acoplarse a una secuencia peptídica Z. En este caso, puedo ser ventajoso preparar el fragmento inmovilizado de Z por acoplamientos sucesivos de aminoácidos, y después acoplar una secuencia peptídica completa X (preparada en disolución o usando técnicas de fase sólida completa o parcialmente o mediante técnicas recombinante) al fragmento.

Ejemplos de materiales de soporte sólido (MSS) adecuados son, por ejemplo, resinas funcionalizadas tales como poliestireno, poliacrilamida, polidimetilacrilamida, polietilenglicol, celulosa, polietileno, polietilenglicol insertado sobre poliestireno, latex, dynabeads, etc. Se debería comprender que puede ser necesario o deseable que el aminoácido C-terminal de la secuencia peptídica Z o el aminoácido C-terminal del péptido X se incorpora al material de soporte sólido mediante un enlazador común tales como 2,4-dimetoxi-4'-hidroxi-benzofenona, ácido 4-(4-hidroxi-metil-3-metoxifenoxi)-butírico, ácido 4-hidroxi-metilbenzoico, ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético, ácido 3-4(hidroximetilfenoxi) propiónico, y ácido p-[(R,S)-a[1-(9H-fluoren-9-il)metoxiformamido]-2,4-dimetoxibenzil]-fenoxi-acético.

Las variantes y los péptidos conjugados de la invención se pueden desanclar del material de soporte sólido mediante un ácido tal como ácido trifluoroacético, ácido trifluorometanosulfónico, bromuro de hidrógeno, cloruro de hidrógeno, fluoruro hidrógeno, etc., opcionalmente en combinación con uno o más "atrapadores" adecuados para el propósito, por ejemplo, etaneditiol, triisopropilsilano, fenol, tioanisol, etc., o el péptido conjugado de la invención se puede desanclar del soporte sólido mediante una base tal como amoníaco, hidracina, un alcóxido, tal como etóxido sódico, un hidróxido, tal como hidróxido sódico, etc.

Así, los péptidos conjugados de la presente invención se pueden preparar mediante un método para la preparación de un péptido conjugado de fórmula I (X-Z), que comprende las etapas de:

a) acoplar un aminoácido o dipéptido que tiene grupos protectores adecuados, que incluyen un grupo N-\alpha-protector, en la forma activada a una secuencia peptídica inmovilizada H-Z-MSS, de ese modo formar un fragmento peptídico N-\alpha-protegido inmovilizado,

b) separar dicho grupo N-\alpha-protector, de ese modo formar un fragmento peptídico protegido inmovilizado que tiene un extremo N-terminal desprotegido,

c) acoplar un aminoácido adicional o dipéptido que tiene grupos protectores adecuados que incluyen un grupo N-\alpha-protector en la forma activada del carboxilo al extremo N-terminal del fragmento peptídico inmovilizado, y repetir el procedimiento de las etapas de separación/acoplamiento en las etapas b) y c) hasta que se obtenga la secuencia peptídica X deseada, y después

d) desanclar el péptido conjugado del material de soporte sólido.

Además, un método para la preparación de un péptido conjugado de fórmula III (Z-X-Z), comprende las etapas de:

a) acoplar un aminoácido o dipéptido que tiene grupos protectores adecuados, que incluyen un grupo N-\alpha-protector, en la forma activada del carboxilo a una secuencia peptídica inmovilizada H-Z-MSS, de ese modo formar un fragmento peptídico N-\alpha-protegido inmovilizado,

b) separar dicho grupo N-\alpha-protector, de ese modo formar un fragmento peptídico inmovilizado que tiene un extremo N-terminal desprotegido,

c) acoplar un aminoácido adicional o dipéptido que tiene grupos protectores adecuados, que incluyen un grupo N-\alpha-protector, en la forma activada del carboxilo al extremo N-terminal del fragmento peptídico inmovilizado, y repetir el procedimiento de las etapas de separación/acoplamiento en las etapas b) y c) hasta que se obtenga la secuencia peptídica X deseada, y después

d) acoplar un aminoácido adicional o dipéptido que tiene grupos protectores adecuados, que incluyen un grupo N-\alpha-protector, en la forma activada del carboxilo al extremo N-terminal del fragmento peptídico inmovilizado, y repetir el procedimiento de las etapas de separación/acoplamiento en los pasos b) y d) hasta que se obtenga la secuencia peptídica Z deseada, y después

e) desanclar el péptido conjugado del material de soporte sólido.

Las etapas de acoplamiento, separación y desanclaje se realizan mediante métodos conocidos por el experto en la técnica que toma en consideración la estrategia de protección y el material de fase sólida seleccionado. Sin embargo, en general se cree que las estrategias de protección de Boc (terc-butiloxicarbonilo) y de Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) son aplicables y que los enlaces peptídicos se pueden formar usando varios procedimientos de activación conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, haciendo reaccionar un derivado activado de extremo C-terminal (haluro de ácido, anhídrido de ácido, éster activado, por ejemplo, HObt-éster, etc.) del aminoácido apropiado o el péptido con el grupo amino del aminoácido o péptido pertinente como es conocido por un experto en química de péptidos. Además, puede ser necesario o deseable incluir grupos protectores de cadena lateral al usar residuos de aminoácidos portadores de grupos funcionales que son reactivos bajo condiciones predominantes. El esquema de protección necesario se conocerá por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, M. Bodanszky y A. Bodanszky, "The Practice of Peptide Synthesis", 2.Ed, Springer-Verlag, 1994, J. Jones, "The Chemical Synthesis of Peptides", Clarendon Press, 1991, y Dryland et al., 1986, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1:125-137).

Los péptidos y péptidos conjugados de la invención también se pueden preparar mediante tecnología de ADN recombinante usando métodos generales y principios conocidos por el experto en la técnica. Una secuencia de ácido nucleico que codifica los péptidos y péptidos conjugados se puede preparar sintéticamente por métodos estándares establecidos, por ejemplo, el método de la fosfoamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, pp. 801-805. Según el método de la fosfoamidita, se sintetizan los oligonucleótidos, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se hibridan, se ligan y se clonan en vectores adecuados. Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido X se conocen en la técnica e incluyen el aislamiento del ADN genómico, la preparación del ADNc, o una de sus combinaciones. La clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención a partir del ADN genómico se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (conocida abreviadamente como PCR por sus iniciales en inglés Polymerase Chain Reaction) o la selección con anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Se pueden usar otros procedimientos de amplificación de ácidos nucléicos tales como la reacción en cadena de la ligasa (conocida abreviadamente como LCR por sus iniciales en inglés Ligase Chain Reaction LCR), la transcripción activada ligada (conocida abreviadamente como LAT por sus iniciales en inglés Ligated Activated Transcription) y la amplificación de ácidos nucleicos dependiente de la secuencia (conocida abreviadamente como NASBA por sus iniciales en inglés Nucleic Acid Sequence-Based Amplification). A continuación, se puede ligar a una secuencia de ácido nucleico que codifica Z.

Posteriormente, la secuencia de ácido nucleico que codifica a los péptidos y péptidos conjugados se inserta en un vector de expresión recombinante que puede ser cualquier vector que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante. A menudo, la selección del vector dependerá de la célula huésped en la que se tiene que introducir. Así, el vector puede ser un vector replicante autónomo, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosomal, cuya replicación es independiente de la replicación cromosomal, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el que se ha integrado.

En el vector, la secuencia de ácido nucleico que codifica los péptidos y péptidos conjugados de la presente invención deberían estar conectados de modo operativo a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula huésped elegida y se pueda derivar de los genes que codifican las proteínas homólogas o heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico que codifica dichos péptidos y péptidos conjugados en células de mamíferos son el promotor SV 40 (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1, 1981, pp. 854-864), el promotor MT-1 (gen metalotioneina) (Palmiter et al., Science 222, 1983, pp. 809-814) o el promotor tardío principal de adenovirus 2, un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV) (Boshart et al., 1981, Cell 41:521-530) y un promotor del virus del papiloma bovino (BPV). Un promotor adecuado para usar en células de insectos es el promotor polihedrina (Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, 1992, pp. 7-11).

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico que codifica los péptidos y los péptidos conjugados, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, el gen agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, el gen levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, el gen alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, el gen alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, el gen penicilinasa (penP) de Bacillus licheniformis, los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, y el gen beta-lactamasa de procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 75:3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the Nacional Academy of Sciences U.S.A. 80:21-25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico que codifica los péptidos y los péptidos conjugados en una célula huésped fúngica filamentosa son los promotores obtenidos de los genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la aspártico proteinasa de Rhizomucor miehei, la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, la alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, la glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, la acetamidasa de Aspergillus nidulans, la proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum (según se describe en el número de patente de EE.UU. 4.288.627, que se incorpora en la presente memoria como referencia), y sus híbridos. Los promotores preferidos particularmente para usar en células huéspedes fúngicas filamentosas son la TAKA amilasa, la NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes que codifican la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), y los promotores glaA. En un huésped de levadura, los promotores útiles se obtienen del gen enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, del gen galactoquinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, de los genes alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, y del gen 3-phosphoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para las células huéspedes de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast, 8:423-488.

La secuencia de ácido nucleico que codifica dichos péptidos y péptidos conjugados también pueden estar conectados de modo operativo a un terminador adecuado, tal como el terminador de la hormona de crecimiento humano (Palmiter et al., op. cit.). Los terminadores preferidos para las células huéspedes fúngicas filamentosas se obtienen de los genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la glucoamilasa de Aspergillus Níger, la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, la alfa-glucosidasa de Aspergillus Níger, y la proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum. Los terminadores preferidos para las células huéspedes de levaduras se obtienen de los genes que codifican la enolasa de Saccharomices cerevisiae, el citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, o la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para las células huéspedes de levaduras se describen en Romanos et al., 1992, supra.

El vector además puede comprender elementos tales como las señales de poliadenilación (por ejemplo, de SV 40 o la región Elb de adenovirus 5), secuencias activadoras de la transcripción (por ejemplo, el activador SV 40) y las secuencias activadoras de la traducción (por ejemplo, los que codifican a VA RNAs de adenovirus). Además, las secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes fúngicas filamentosas se obtienen de los genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la glucoamilasa de Aspergillus Níger, la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, y la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger. Las secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura se describen en Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15:5983-5990.

El vector de expresión recombinante además puede comprender una secuencia de ADN que le permite al vector replicarse en la célula huésped en cuestión. Ejemplo de tal secuencia (cuando la célula huésped es una célula de mamífero) es la SV 40 o el origen de replicación del polioma. Ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, pACYC184, pUB110, pE194, pTA1060, y pAM\beta1. Ejemplos de origen de replicación para usar en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, la combinación de CEN6 y ARS4, y la combinación de CEN3 y ARS1. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación para hacer su función sensible a la temperatura en la célula huésped (véase, por ejemplo, Ehrlich, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:1433).

El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, tal como el gen que codifica para dihidrofolato reductasa (DHFR) o uno que confiere resistencia a un fármaco, por ejemplo, neomicina, geneticina, ampicilina, o higromicina. Marcadores adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Un marcador seleccionable para usar en una célula huésped fúngica filamentosa se puede seleccionar del grupo que incluye, pero no se limita a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa) bar (fosfinotricina acetil-transferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), y marcadores resistentes a glufosinato, así como equivalentes de otras especies. Para usar en una célula de Aspergillus se prefieren los marcadores amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el marcador bar de Streptomyces hygroscopicus. Además, la selección se puede llevar a cabo por cotransfomación, por ejemplo, según se describe en el documento WO 91/17243, donde el marcador seleccionable está en un vector diferente.

Los procedimientos usados para ligar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para los péptidos y los péptidos conjugados, los promotores y los terminadores, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al, op. cit.).

La célula huésped en la que el vector de expresión se introduce puede ser cualquier célula que sea capaz de producir los péptidos y los péptidos conjugados y puede ser una célula eucariota, tales como las células de invertebrados (insecto) o las células de vertebrados, por ejemplo, oocitos de Xenopus laevis o células de mamíferos, en particular células de insectos y mamíferos. Ejemplos de líneas celulares adecuadas de mamíferos son las líneas celulares COS (por ejemplo, ATCC CRL 1650), BHK (por ejemplo, ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) o CHO (por ejemplo, ATCC CCL 61).

Los métodos para transfectar células de mamíferos y expresar secuencias de ADN introducidas en las células se describen en, por ejemplo, Kaufman y Sharp, 1982, J. Mol. Biol. 159:601-621; Southern y Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341; Loyter et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:422-426; Wigler et al., 1978, Cell 14:725; Corsaro y Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7:603, Graham y van der Eb, 1973, Virology 52:456; Fraley et al., 1980, JBC 225:10431; Capecchi, 1980, Cell 22:479; Wiberg et al., 1983, NAR 11:7287; y Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-845. La célula huésped también puede ser un patógeno unicelular, por ejemplo, un procariota, o un patógeno no-unicelular, por ejemplo, un eucariota. Las células unicelulares útiles son células bacterianas tales como una bacteria gram positiva que incluye, pero no se limita a, una célula de Bacillus, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, por ejemplo, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o una bacteria gram negativa tales como E. coli y Pseudomonas sp. En una realización preferida, la célula huésped bacteriana es una Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o célula de Bacillus subtilis. La transformación de una célula huésped bacteriana se puede efectuar, por ejemplo, mediante transformación por protoplasto (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115), utilizando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829, o Dubnar y Davidoff Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221), por electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751), o por conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278). La célula huésped puede ser una célula fúngica. La célula huésped fúngica también puede ser una célula de levadura. El término "levadura" como se usa en la presente memoria incluye levaduras ascoesporogenas (Endomicetales), levaduras basidioesporogenas, y levadura que pertenecen a los hongos imperfectos (Blastomicetos).

El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para crecer células de mamíferos, tales como un medio que contenga suero o un medio libre de suero que contenga suplementos apropiados, o un medio adecuado para crecer células de insecto, levadura o fúngicas. Los medios adecuados están disponibles en distribuidores comerciales o se pueden preparar según las fórmulas publicadas (por ejemplo, en los catálogos de la Americam Type Culture Collection).

Así, la invención también se refiere a un método para producir las variantes de exendina y péptidos conjugados de la invención que tienen una secuencia polipeptídica natural, que comprende

a): introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia polipeptídica que comprende la secuencia peptídica de la variante de exendina o el péptido conjugado de la invención y un marcador seleccionable contenido en una construcción de ácido nucleico o un vector en la célula huésped para obtener una célula huésped recombinante;

b): seleccionar dicha célula huésped recombinante;

c): cultivar dichas células huéspedes recombinantes bajo condiciones que permitan la producción de dicha secuencia polipeptídica;

d): aislar dicha secuencia polipeptídica del cultivo; y

e): desanclar, opcionalmente, dicha secuencia polipeptídica usando una proteasa apropiada para obtener dicho péptido conjugado.

Las variantes y péptidos conjugados de la invención que tienen una secuencia polipeptídica natural producidas de este modo por las células, posteriormente se pueden recuperar del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales que incluyen separar las células huéspedes del medio por centrifugación o filtración, precipitar los componentes proteicos del sobrenadante o filtrar mediante una sal, por ejemplo, sulfato de amonio, purificar por varios procedimientos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares. El(los) sustituyente(s) lipófilo(s) se pueden incorporar al péptido de la presente invención usando procedimientos conocidos en la técnica. En una realización, el sustituyente polipeptídico se puede introducir incorporando un aminoácido con el sustituyente lipófilo ya incorporado en el método de síntesis estándar (véase, por ejemplo, síntesis del compuesto 7 en la sección de Ejemplos). Alternativamente, los sustituyentes se pueden incorporar después de que el péptido haya sido sintetizado y aislado como, por ejemplo, se describe en el documento WO98/08871.

La invención además se ilustra mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos Síntesis peptídica, procedimientos generales \bullet Aparato y estrategia sintética

Los péptidos se sintetizan en modo de lote en un recipiente de polietileno provisto con un filtro de polipropileno para filtración usando 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) como el grupo protector N-\alpha-amino y los grupos protectores comunes adecuados para las funcionalidades de la cadena lateral (Dryland et al., 1986, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1:125-137).

\bullet Disolventes

El disolvente DMF (N,N-dimetilformamida, Riedel de-Häen, Alemania) se purifica haciéndolo pasar a través de una columna rellena con una resina fuerte intercambiadora de cationes (ácido fuerte Lewatit S 100 MB/H, Bayer AG Leverkusen, Alemania) y se analizan, antes de usar, las aminas libres mediante adición de 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (Dhbt-OH) que da lugar a un color amarillo (Dhbt-O-anion) si las aminas libres están presente. El disolvente DCM (diclorometano, grado analítico, Riedel de-Häen, Alemania) se usa directamente sin purificación. El THF (tetrahidrofurano, grado analítico, Riedel de-Häen, Alemania) se usa directamente sin purificación adicional.

\bullet Aminoácidos

Los aminoácidos protegidos por Fmoc se adquieren de MilliGen (Reino Unido) y de PerSeptive Biosystems GmbH Hamburgo, Alemania en formas con la cadena lateral adecuadamente protegidas. El FmocLys(palmitoil)-OH se adquiere de Bachem (Suiza).

\bullet Enlazador

El ácido (4-hidroximetilfenoxi) acético (HMPA), Novabiochem, Suiza se acopla a la resina como un éster de 1-hidroxibenzotriazol (HObt) bien preformado, bien generado in situ mediante DIC.

\bullet Reactivos de acoplamientos

El reactivo de acoplamiento diisopropilcarbodiimida (DIC) se adquiere de (Riedel de Häen, Alemania) y se destila antes de usar, la diciclohexilcarbodiimida (DCC) se adquiere de Merck-Schuchardt, München, Alemania, y se purifica por destilación.

\bullet Soportes sólidos

Los péptidos sintetizados según la estrategia de Fmoc se sintetizan sobre los siguientes tipos de soportes sólidos utilizan 0,05 M o concentraciones superiores de aminoácido activado protegido por Fmoc en DMF. Resinas de TentaGel S 0,22-0,31 mmol/g (TentaGel S-Ram, TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc; Rapp Polymere, Alemania).

\bullet Catalizadores y otros reactivos

La diisopropiletilamina (DIEA) se adquiere de Aldrich, Alemania, y la etilendiamina de Fluka, la piperidina y la piridina de Riedel-de Häen, Frankfurt, Alemania. 4-(N,N-di-metilamin)piridina (DMAP) se adquiere de Fluka, Suiza y se usa como un catalizador en reacciones de acoplamiento que involucran anhídridos simétricos. El etaneditiol se adquiere de Riedel-de Häen, Frankfurt, Alemania. El 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (Dhbt-OH) y el 1-hidroxibenzotriazol (HObt) se obtienen de Fluka, Suiza.

\bullet Procedimientos de acoplamiento

El primer aminoácido se acopla como un anhídrido simétrico en DMF generado del aminoácido N-\alpha-protegido apropiado mediante DIC o DCC. Los siguientes aminoácidos se acoplan como ésteres de HObt preformados preparados a partir de aminoácidos N-\alpha-protegidos y HObt mediante DIC en DMF. Las acilaciones se comprueban mediante el ensayo de la ninhidrina realizado a 80ºC para evitar la desprotección del Fmoc durante el ensayo (Larsen, B. D. y Holm, A., 1994, Int. J. Peptide Protein Res. 43:1-9).

\bullet Acoplamiento como éster de HObt

Método a. 3 eq. de aminoácido N-\alpha-amino protegido se disuelven en DMF junto con 3 eq. de HObt y 3 eq. de DIC. La disolución se deja a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se añade a la resina, que se habrá lavado con una disolución de Dhbt-OH al 0,2% en DMF antes de la adición del aminoácido preactivado.

Método b. 3 eq. de aminoácido N-\alpha-amino protegido se disuelven en DMF junto con 3 eq. de HObt. 3 eq. de DIC se añaden justo antes de usar. La disolución final se añade a la resina.

\bullet Anhídrido simétrico preformado

6 eq. de aminoácido N-\alpha-amino protegido se disuelven en DCM y se enfrían a 0ºC. Se añade DCC o DIC (3 eq.) y la reacción se mantiene durante 10 minutos. El disolvente se separa in vacuo y el se disuelve residuo en DMF. En caso de usar DCC la disolución de DMF se filtra e inmediatamente se añade a la resina seguida de 0,1 eq. de DMAP.

\bullet Desprotección del grupo Fmoc N-\alpha-amino protector

La desprotección del grupo Fmoc se realiza mediante tratamiento con piperidina al 20% en DMF (1x5 y 1x10 min), seguida de lavado con DMF hasta que no se pueda detectar el color amarillo (Dhbt-O-) después de la adición de Dhbt-OH al DMF drenado.

\bullet Desanclaje del péptido de la resina con ácido

Método a. Los péptidos se desanclan de las resinas mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA, Riedel-de Häden, Frankfurt, Alemania)-agua al 95% v/v o con TFA al 95% y etanoditiol al 5% v/v a temperatura ambiente durante 2 horas. Las resinas filtradas se lavan con TFA-agua al 95% y los filtros y lavados se diluyen añadiendo ácido acético al 10%. La mezcla que resulta se extrae 3 veces con éter y finalmente se liofiliza. El crudo del producto liofilizado se analiza por cromatografía líquida de alta resolución (conocida abreviadamente como HPLC por sus iniciales en inglés High Performance Liquid Chromatography) y se identifica por espectroscopia de masa (EM).

\bullet Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-RAM

Se coloca la resina TentaGel S-RAM (100-1.000 mg, 0,22-0,31 mmol/g) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración. La resina se hincha en DMF (5-10 mL), y el grupo Fmoc se separa según el procedimiento descrito más arriba. Los siguientes aminoácidos según la secuencia se acoplan como ésteres de HObt protegidos por Fmoc (3 eq.) generados in situ mediante DIC como se describe más arriba. Los acoplamientos se mantienen durante 3 h, a menos que se especifique de otro modo. La resina se drena y lava con DMF (4x5-10 mL, 2 min cada vez) para separar el reactivo en exceso. Todas las acilaciones se comprueban mediante el ensayo de la ninhidrina realizado a 80ºC. Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5-10 mL, 5 min cada vez), DCM (3x5-10 mL, 1 min cada vez) y finalmente con dietiléter (3x5-10 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo.

\bullet Condiciones de HPLC

El análisis isocrático por HPLC se realiza en un sistema Shimadzu que consiste en una bomba LC-6A, un detector de MERCK HITACHI L-4000 UV operado a 215 nm y una válvula de inyección de Rheodyne 7125 con un lazo de

\hbox{20  \mu l.}

La columna usada para el análisis isocrático es una Spherisorb ODS-2 (100x3 mm; partículas de 5 \mum) (Microlab, Aarhus, Dinamarca). El análisis por HPLC utilizando gradientes se realiza en una bomba MERCK-HITACHI L-6200 Intelligent, en un detector de MERCK HITACHI L-4000 UV a 215 nm y en una válvula de inyección de Rheodyne 7125 con un lazo de 20 \mul, o en un instrumento Waters 600 E provisto de un detector de redes de fotodiodo Waters 996. La columnas usadas son una Rescorce™ RPC 1 mL (Waters) o una LiChroCART 125-4, LiChrospher 100 RP-18 (5 \mum)(Merck).

El tampón A es TFA 0,1% vol. en agua y el tampón B es acetonitrilo 90% vol., agua 9,9% vol. y TFA 0,1% vol. Los tampones se bombean a través de las columnas a un flujo de 1,3-1,5 mL/min utilizando cualquiera de los siguientes gradientes para el análisis peptídico 1) gradiente lineal de B al 0% - 100% (30 min) o 2) B al 0% (2 min), gradiente lineal de B al 0% 50% (23 min), B al 50% 100% (5 min).

Para HPLC preparativa, la purificación se realiza en un instrumento Waters 600 E provisto de un detector de redes de fotodiodo Waters 996. La columna utilizada es Waters Delta-Pak C-18 15 \mum, 100 \ring{A}, 25x100 mm. El gradiente "2)" se usa con un flujo de 9 mL/min.

\bullet Espectroscopia de masa

El espectro de masa se obtiene en un instrumento Finnigan Mat LCQ provisto de una sonda de electroespray (ESI) (ES-EM) y en un TofSpec E, Fisons Instruments (MALDI-TOF) que usan ácido \beta-ciano-p-hidroxicinámico como matriz. Alternativamente, el espectro se puede obtener por un instrumento Micromass LCT.

Síntesis peptídica de los péptidos de la técnica anterior (i) Síntesis peptídica del compuesto (i)

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH_{2}

(exendina-4(1-39)-NH_{2}) (Nº ID SEC: 102) en TentaGel S-RAM.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM seca (0,25 mmol/g, 1.000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc se separa según el procedimiento descrito más arriba, y el péptido de acuerdo con la secuencia se ensambla como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en resinas TentaGel S-RAM". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del péptido se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 90%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 17%.

(ii) Síntesis peptídica del compuesto (ii)

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-NH_{2}

(des Ser^{39} exendina-4(1-39)-NH_{2}) en TentaGel S-RAM.

Se coloca la Resina de TentaGel S-RAM seca (0,25 mmol/g, 1.000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc se separa según el procedimiento descrito más arriba, y el péptido de acuerdo con la secuencia se ensambla como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en resinas de TentaGel S-RAM". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del péptido se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 97%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 22%.

1. Síntesis peptídica del compuesto 1

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-NH_{2}

(des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-NH_{2}) (Nº ID SEC: 101) en TentaGel S-RAM.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM seca (0,25 mmol/g, 1.500 mg) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc se separa según el procedimiento descrito más arriba, y el péptido de acuerdo con la secuencia se ensambla como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en resinas de TentaGel S-RAM". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del péptido se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 95%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 18,3%.

2. Síntesis peptídica del compuesto 2

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser- (Lys)_{6}-NH_{2}

(des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2}) (Nº ID SEC: 93) en TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc seca (0,22 mmol/g, 1.500 mg) en un recipiente de polietileno provisto con un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc de la primera lisina se separa según se describe más arriba y la síntesis continúa hasta finalizar la secuencia peptídica como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del producto liofilizado se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 95%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 22,1%.

3. Síntesis peptídica del compuesto 3

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser- (Lys)_{6}-NH_{2}

(exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2}) (Nº ID SEC: 92) en TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc seca (0,22 mmol/g, 1.000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc de la primera lisina se separa según se describe más arriba y la síntesis continúa hasta finalizar la secuencia peptídica como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del producto liofilizado se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 90%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 20,5%.

4. Síntesis peptídica del compuesto 8

H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-NH_{2}

(H-(Lys)_{6}-des Pro^{36}exendina-4(1-39)-NH_{2}) en TentaGel S-RAM-Fmoc.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM-Fmoc seca (0,23 mmol/g, 1.000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc en la resina se separa según se describe más arriba y la síntesis continúa hasta finalizar la secuencia peptídica como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-Ram-Fmoc". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del producto liofilizado se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 95%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 26%.

5. Síntesis peptídica del compuesto 9

H-Lys_{6}-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)_{6}-NH_{2}

(H-Lys_{6}-des Pro^{36}exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2}) en TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc seca (0,22 mmol/g, 1.000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc en la primera lisina se separa según se describe más arriba y la síntesis continúa hasta finalizar la secuencia peptídica como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del producto liofilizado se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 90%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 32%.

6. Síntesis peptídica del compuesto 14

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH_{2}

(H-des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}exendina-4(1-39)-NH_{2}) en TentaGel S-RAM-Fmoc.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM-Fmoc seca (0,23 mmol/g, 1.000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc en la resina se separa según se describe más arriba y la síntesis continúa hasta finalizar la secuencia peptídica como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-Ram-Fmoc". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del producto liofilizado se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 95%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 11%.

7. Síntesis peptídica del compuesto 15

H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH_{2}

(H-(Lys)_{6}-des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}exendina-4(1-39)-NH_{2}) en TentaGel S-RAM-Fmoc.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM-Fmoc seca (0,23 mmol/g, 1.000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc en la resina se separa según se describe más arriba y la síntesis continúa hasta finalizar la secuencia peptídica como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-Ram-Fmoc". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del producto liofilizado se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 94%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 17%.

8. Síntesis peptídica del compuesto 16

H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH_{2}

(H-Asn-(Glu)_{5}-des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}exendina-4(1-39)-NH_{2}) en TentaGel S-RAM-Fmoc.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM-Fmoc seca (0,23 mmol/g, 1000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc en la resina se separa según se describe más arriba y la síntesis continúa hasta finalizar la secuencia peptídica como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-Ram-Fmoc". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del producto liofilizado se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 90%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 9%.

9. Síntesis peptídica del compuesto 17

Compuesto 3, H-(Lys)_{6}-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)_{6}-NH_{2}

(H-(Lys)_{6}-des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}exendina-4(1-39)- (Lys)_{6}-NH_{2}) en TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc seca (0,22 mmol/g, 1.000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc en la primera lisina se separa según se describe más arriba y la síntesis continúa hasta finalizar la secuencia peptídica como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del producto liofilizado se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 90%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 10%.

10. Síntesis peptídica del compuesto 18

H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)_{6}-NH_{2}

(H-Asn-(Glu)_{5}-des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}exendina-4(1-39)- (Lys)_{6}-NH_{2}) en TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.

Se coloca la Resina de TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc seca (0,22 mmol/g, 1.000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc en la primera lisina se separa según se describe más arriba y la síntesis continúa hasta finalizar la secuencia peptídica como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidil resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del producto liofilizado se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 92%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 14%.

11. Síntesis peptídica del compuesto 19

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)_{6}-NH_{2}

(des Pro^{36},Pro^{37},Pro^{38}exendina-4(1-39)-(Lys)_{6}-NH_{2}) en TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.

Se coloca la resina de TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc seca (0,22 mmol/g, 1.000 mg) en un recipiente de polietileno provisto de un filtro de polipropileno para filtración y se hincha durante dos horas en DMF (5 mL). El grupo Fmoc en la primera lisina se separa según se describe más arriba y la síntesis continúa hasta finalizar la secuencia peptídica como se describe en "Síntesis peptídica en modo de lote en TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc". Una vez que ha finalizado la síntesis, se lava la peptidel resina con DMF (3x5 mL, 1 min cada vez), DCM (3x5 mL, 1 min cada vez), dietiléter (3x5 mL, 1 min cada vez) y se seca in vacuo. El péptido se desancla de la resina según el método a descrito más arriba y se liofiliza con ácido acético. El crudo del producto liofilizado se purifica mediante HPLC preparativa usando el procedimiento descrito más arriba. El producto purificado resulta ser homogéneo y la pureza resulta ser superior al 97%. La identidad del péptido se confirma mediante ES-EM. Rendimiento 19%.

12. Preparación recombinante del compuesto 2 Construcción del vector de expresión pYES0010

Se construyó en levadura un ADNc sintético por expresión heteróloga. Se tradujo a la inversa la secuencia de proteína que codifica al Compuesto 2 utilizando una tabla de uso de codones de Saccharomyces cerevisiae (Base de datos del Genoma de Saccharomyces). Para permitir la traducción del ADNc sintético se añadió un codón de inicio ATG adicional al extremo 5' y se añadió un codón de paro TAA al extremo 3'. La construcción se insertó en HindIII y en el sitio EcoRI del vector lanzadera pYES2 que comprende un gen resistente a la ampicilina, y la nueva construcción se denominó pYES0010, véase Fig. 6. A continuación, se transformó E. coli con pYES0010 y se sometió a presión de selección por ampicilina. Se seleccionaron y secuenciaron los clones positivos.

Transformación en levadura

Para transformar en la levadura haploide INVSc1:MATa his3delta1 leu2 trp1-289 ura3-52 con pYES0010 se creció la levadura en medio YPD (extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, glucosa al 2%, sulfato de adenina al 0,004%) a 30ºC hasta saturación. Se cosechó 1 mL de cultivo para las transformaciones. Se añadieron 2 \muL de ADN portador de 10 mg/mL y 1 \mug de pYES0010 y se mezclaron. Se añadió 0,5 mL de (PEG 4000 al 45%, Li OAc 1M, EDTA 0,5M y Tris-HCl 1M) (pH 7,5) y se mezclaron. Finalmente, se añadieron 20 \muL de DTT 1M y se incubó la mezcla durante 16 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, se expusieron las células a un choque de calor a 42ºC durante 10 minutos y se prepararon placas selectivas (base nitrogenada de levadura al 6,7%, glucosa al 2%, adenina 20 \mug/mL, arginina 20 \mug/mL, isoleucina 29 \mug/mL, histidina 20 \mug/mL, leucina 60 \mug/mL, lisina 20 \mug/mL, triptófano 20 \mug/mL, metionina 20 \mug/mL, fenilalanina 50 \mug/mL, valina 150 \mug/mL, Tirosina 30 \mug/mL y agar al 2,5%. Se incubaron las placas a 30ºC durante 3 a 5 días hasta que aparecieron los transformantes.

Expresión y purificación del compuesto 2

Se cultivaron los transformantes en medios selectivos (base nitrogenada de levadura al 6,7%, glucosa al 2%, adenina 20 \mug/mL, arginina 20 \mug/mL, isoleucina 29 \mug/mL, histidina 20 \mug/mL, leucina 60 \mug/mL, lisina 20 \mug/mL, Triptófano 20 \mug/mL, metionina 20 \mug/mL, fenilalanina 50 \mug/mL, valina 150 \mug/mL, Tirosina 30 \mug/mL) durante 1,5 días. Se cosecharon y resuspendieron las células en medio de inducción de galactosa (base nitrogenada de levadura al 6,7%, galactosa al 4%, adenina 20 \mug/mL, arginina 20 \mug/mL, isoleucina 29 \mug/mL, histidina 20 \mug/mL, leucina 60 \mug/mL, lisina 20 \mug/mL, Triptófano 20 \mug/mL, metionina 20 \mug/mL, fenilalanina 50 \mug/mL, valina 150 \mug/mL, Tirosina 30 \mug/mL) durante 1 día. Se cosecharon y homogenizaron las células en Tris-HCl 10 mM pH 7,5 que contenía inhibidores de la proteasa (Roche). Se aclaró el lisado mediante centrifugación a 20.000 X g durante 30 min. Se cargó el sobrenadante en una columna de Superdex 12 HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con Tris-HCl 10 mM pH 7,5. La columna se eluyó en tampón de bicarbonato amónico 50 mM de pH 8,0. Se agruparon las muestras que contenían Compuesto 2 recombinante. Se separó la metionina N-terminal mediante metionina aminopeptidasa y además se purificaron las muestras en una Columna de HPLC.

Condiciones HPLC para la purificación del compuesto 2

Columna de HPLC: Kromasil RP C8; K 100-10-C8 nr. CER 2230. compuesto

Temperatura: 22ºC

Flujo: 35 mL/min

Disolventes para HPLC:

A: ácido trifluoracético al 0,10% en agua

B: ácido trifluoracético al 0,10% en acetonitrilo:agua a 90:10.

Se eluyó el compuesto 2 de la columna de HPLC con ácido trifluoroacético al 0,10% en Acetonitrilo al 20% hasta 80% durante 40 min.

13. Formulaciones de inyección del péptido

Las formulaciones de dosis fijada de péptido para inyecciones intravenosas se preparan disolviendo el péptido en una disolución salina, estéril e isotónica, y almacenando la disolución que resulta en ampollas de vidrio rellenas con gas inerte bajo condiciones estériles. Cada dosis del péptido se almacena seca en ampollas o viales tapados rellenos con gas inerte. Las formulaciones de multidosis de péptido para inyección intravenosa se preparan disolviendo el péptido en una disolución salina, estéril e isotónica, y almacenando la disolución que resulta en viales tapados, añadiendo conservante (por ejemplo, parahidroxibenzoato al 0,1%, alcohol bencílico al 1% o clorocresol al 0,1%) si es necesario.

Ejemplo de formulación multidosis de péptido

Compuesto 2 12,25 mg

Dihidrogenofosfatosódico 1,380 g

Parahidroxibensoato 0,1 g

Agua para inyectables 100 mL

14. Efecto de la administración de dosis única por vía oral y parenteral de los compuestos sobre los niveles de glucosa en sangre en ratones ob/ob diabéticos

Los compuestos de la invención poseen propiedades que reducen la glucosa en sangre. Este efecto de los compuestos se examinó evaluando sus efectos sobre los niveles de glucosa en sangre (GS) en los ratones mutantes ob/ob después de la administración por vías intraperitoneal (i.p.) y oral (p.o.).

Parte experimental

Se alojaron cuarenta ratones ob/ob diabéticos hembras (3 ratones/jaulas) (Ume\ring{a} strain, Bomholtgaard), que son obesos debido a una leptina mutante dominante (Tomita, T., Doull, V., Pollock, H.G., y Krizsan, D. 1992. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas 7: 367-75) bajo condiciones ambientales controladas siguiendo un ciclo luz:oscuridad de 12:12 h y se alimentaron con dieta estándar Altromin nº 1324 con libre acceso al grifo de agua. A su llegada, los animales tenían 8 semanas de edad. Se les permitió a los ratones 2 semanas de aclimatación antes que se iniciaran los experimentos. En el momento del experimento los ratones tenían 13 semanas de edad con un peso corporal de 41,8 \pm 3,2 g (media \pm desviación estándar (DS); n=42). La manipulación de los ratones Se realizó uno y tres días antes del experimento para reducir las excursiones de GS inducidas por estrés. El día del experimento, se tomó sangre de la punta del rabo 2-3 horas después de encender la luz. Se vertió una única gota de sangre (<5 \muL) sobre una tira de glucosa para el análisis y se midió mediante un equipo Elite Autoanalyzer, Bayer, Dinamarca. Se analizó la concentración total de glucosa en sangre (GS) por el método de glucosa oxidasa inmovilizada. Los niveles de glucosa en sangre variaron entre normoglucemia y hiperglucemia severa (intervalo: 3,6-15,6 mM; media \pm DS: 9,4 \pm 3,3 mM; n=42). Se excluyeron del estudio a seis animales con GS < 5,8 mM (total n=36). Los restantes animales fueron estratificados basándose en sus niveles de GS para asegurar que la media de GS fuera similar entre los grupos. Una hora después de tomar la muestra control inicial de sangre, se administraron los fármacos y se midió la GS a t=60 min, t=120 min, t=240 min, t=480 min.

Péptidos y otros materiales

Se disolvió el compuesto en NaCl isotónico estéril poco antes de dosificar y se suministró en un volumen de 0,2 mL. Se usaron las mimas disoluciones tanto para administración p.o como para i.p. Para cada animal se rellenó una hoja de datos logarítmicos en el momento de cada toma de muestra de sangre.

15. Estudios in vivo con

Compuesto 1 (des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 101)),

Compuesto 2 (des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 93)),

Se administraron diversas concentraciones de cada péptido oral e intraperitonealmente a ratones ob/ob para determinar si estos compuestos afectan a los niveles de glucosa en sangre. Las condiciones experimentales usadas fueron las mismas que las descritas en el Ejemplo 14.

Péptidos y otros materiales

El des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Compuesto 1, Nº ID SEC: 101) y el mismo péptido, pero con una secuencia adicional, Lys_{6}, incorporada al extremo C-terminal y el des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Compuesto 2, Nº ID SEC: 93), el Gly^{8}-GLP1-(7-36)(Humano)-NH_{2} (Compuesto (ii), Nº ID SEC: 87) y el mismo péptido, pero con una secuencia adicional, Lys_{6}, incorporada al extremo C-terminal se sintetizan usando los métodos descritos más arriba. Las disoluciones se preparan en la mañana de la dosificación, inmediatamente antes de administrarlos a los animales. Las mismas disoluciones se usan tanto para la administración por vía oral como para la interperitoneal. Todos los péptidos se disuelven en NaCl isotónico estéril y se suministran en un volumen de 0,2 mL. Todos los experimentos se llevan a cabo en los mismos ratones para comparar la dosis activa de los péptidos que se muestran en la Tabla 1. La toma de muestra de sangre se realiza según se describe más arriba y a los animales se les administra las dosis mostradas en la Tabla 2. Como control negativo, se administra la disolución salina oralmente. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 1

Número	Compuesto
Compuesto 1	des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 101)
Compuesto 2	des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 93)

TABLA 2

Compuesto	Grupo 1	Grupo 2	Grupo 3	Grupo 4	Grupo 5	Grupo 6
	dosis por	dosis por	dosis por	dosis por	dosis por	dosis i.p.
	vía oral	vía oral	vía oral	vía oral	vía oral	\mug/ratón
	\mug/ratón	\mug/ratón	\mug/ratón	\mug/ratón	\mug/ratón
					disolución
					salina
					isotónica
Compuesto 1	400	40	4	0,4	200 \muL	40
Compuesto 2	1.000	100	10	1	200 \muL	100

\newpage

Se resumieron los datos de grupo como la media \pm EEM de los resultados individuales en cada grupo de tratamiento. Para analizar los efectos de los compuestos, se calculó la diferencia absoluta y relativa (% de t=0) con respecto a la línea base para cada punto de tiempo.

TABLA 3

	0	1 hora	2 horas	4 horas
Compuesto 1-disolución salina	100	103	107	92
Compuesto 1-400 \mug p.o.	100	93	88	93
Compuesto 1-40 \mug p.o.	100	89	89	91
Compuesto 1-4 \mug p.o.	100	105	88	91
Compuesto 1-0,4 \mug p.o.	100	106	103	100
Compuesto 1-40 \mug i.p.	100	68	69	74
Compuesto 2-disolución salina	100	100	112	114
Compuesto 2-1.000 \mug p.o.	100	67	69	64
Compuesto 2 100 \mug p.o.	100	78	71	72
Compuesto 2 10 \mug p.o.	100	86	72	72
Compuesto 2 1 \mug p.o.	100	112	101	96
Compuesto 2 100 \mug i.p.	100	75	67	63

Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3 y en las Figuras 1-2.

Estos resultados muestran que todos los compuestos ensayados tienen un efecto sobre la reducción de los niveles de glucosa en sangre. El efecto es más marcado cuando se suministra el Compuesto 1 intraperitonealmente, mientras que el efecto de 1.000 \mug p.o. de Compuesto 2 es comparable al efecto de 100 \mug i.p. de Compuesto 2. Cuando se suministran intraperitonealmente, la potencia del Compuesto 1 (des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-NH_{2}, Nº ID SEC: 101) y del Compuesto 2 (des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2}, Nº ID SEC: 93) es muy similar a la de la propia exendina-4(1-39)-NH_{2} (Compuesto (i)) (no se dan los datos) administrada del mismo modo.

Cuando el Compuesto 1, des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 101), se administra por vía oral no se produce efecto en la reducción de los niveles de glucosa en sangre hasta una dosis de 400 \mug/ratón, mientras que para el mismo compuesto con la adición del fragmento Lys_{6} se observa actividad a una dosis de 10 \mug/ratón. Esto indica que la dosis oral mínima efectiva del compuesto des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 93) es al menos 40 veces inferior que para el compuesto des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-NH_{2} (Nº ID SEC: 101).

Estos resultados muestran que la incorporación de la secuencia Z no tiene efecto significativo sobre la potencia de los diversos péptidos cuando se administran interperitonealmente mientras que cuando se administran por vía oral aumenta significativamente la potencia del compuesto.

16. Farmacocinética in vivo del compuesto 1 y del compuesto 2 tras administración i.v. a conejos y cerdos

Para establecer si la estabilidad in vitro se mantiene in vivo, se determinaron los parámetros farmacocinéticos de los compuestos 1 y 2 en conejos y en cerdos, utilizando condiciones similares.

Productos químicos y reactivos

El plasma blanco de conejo en heparina sódica (5.000 unidades/mL) se obtuvo de Harlan Sera Lab Ltd. (Loughborough, Reino Unido). Las columnas de extracción de fase sólida OASIS™ HLB, de 1 cc y 30 mg de sorbente, se obtuvieron de Waters (Milford, MA, EE.UU.) y las columnas SPE ISOLUTE C18 (EC), de 1 cc, se obtuvieron de IST (Mid Glamorgan, Reino Unido). El análisis por CL(cromatografía líquida)/EM se realizó en un instrumento HP 1100 que consiste en un desgasificador en línea, una bomba de gradiente binario, un muestreador automático, y un horno de columna, Hewlett Packard (Wilmintong, DE, EE.UU.) en combinación con un espectrómetro de masa Quattro Ultima de Micromass (Altrincham, Reino Unido), tanto la CL como la EM se controlaron por el programa MassLynx 3.3. Las separaciones por CL anteriores a la detección por EM se realizaron en una columna de Vydac 218MS52 (2,1x250 mm) (Hesperia, CA, EE.UU.).

Fármacos y niveles de dosis

Se disolvieron los péptidos en disolución salina isotónica apirógena y los péptidos se administraron i.v. tanto a conejos como a ratas usando una dosis de 1.000 nmol/kg.

Conejos

Se usaron para el experimento cincuenta conejos de la raza Nueva Zelanda Blanco que pesaban 2,5 a 3,0 kg. El día del experimento, se anestesiaron los conejos con Hypnorm® i.m. seguido de Dormicum® i.v.

Los catéteres se insertaron en la vena femoral y en la arteria para la administración i.v. de fármacos y la toma de muestra de sangre arterial. Los conejos permanecieron inconscientes durante todo el experimento.

Tratamiento de la muestra

Se recogieron las muestras de sangre a t=1,3,5,10,15,20,30,40,60,90,120,150,180, y 240 min. Se recogió la sangre en tubos enfriados con hielo que contenían EDTA e inmediatamente se centrifugó a 4ºC durante 5 min (20.000 x g). Se transfirió el plasma (250 \muL) a viales PLC de 0,75 mL enfriados con hielo que contenían 250 \muL de la disolución de extracción (MeCN: Carbonato Amónico 0,18 M pH 9,5, 10:90 v/v). Se almacenaron las muestras de plasma a -20ºC hasta la extracción en fase sólida (EFS) y el análisis por CL/EM.

Extracción en fase sólida

Se cargan las muestras de plasma (400 \mul) que contienen el fármaco en las columnas de extracción en fase sólida OASIS™ HLB (Compuesto 4) o ISOLUTE™ (Compuesto (iii)) precondicionadas con 950 \muL de MeCN seguido de 950 \muL de agua. Se lavaron las columnas con 250 \muL de TFA al 2% en agua seguido por un volumen igual de TFA al 2% en MeCN:agua (20:78 v/v). Se eluyeron los analitos con 500 \muL de TFA al 2% en MeCN:agua (60:38 v/v) y se analizaron por CL/EM.

CL/EM

Se mantuvieron las muestras a 18ºC en una bandeja muestreadora automático antes de la inyección de 20 a 50 \muL en la columna de CL (Vydac 218MS52 (2,1 x 250 mm)). Se realizaron las separaciones a 30ºC usando un flujo de 250 \muL/min y un gradiente según la tabla de abajo. Tanto el compuesto ensayado como el fármaco de referencia se detectaron por registro de ion único (conocida abreviadamente como SIR por sus iniciales en inglés Single Ion Recording) utilizando las especies iónicas de m/z=676,7 y de m/z= 1.095,2 y 821,8, respectivamente. Todas las condiciones instrumentales se controlaron a través del programa MassLynz versión 3.3.

Las muestras de plasma se analizaron según se describe en materiales y métodos y la concentración en plasma (C_{pl}) se representó frente al tiempo en un diagrama semilogarítmico. La concentración en plasma se siguió durante tres horas en conejos. Las curvas de C_{pl} frente al tiempo de los conejos individuales se ajustaron a un modelo abierto de dos compartimentos (no se muestra la figura) usando mínimos cuadrado ponderado con l/y^{2} con el programa WinNonlin 3.1 (Pharsight Corp. (Mountain View, CA)). Las constantes farmacocinéticas obtenidas del análisis de datos se recogen en la Tabla 4.

TABLA 4 Cinética in vivo en conejos y cerdos**

Parámetro	Comp. 1 (n=5) Media	Comp. 2 (n=5) Media	Comp. 2** (n=2) Media
T_{1/2}, \alpha min	4,4	11	16
T_{1/2}, \beta min	23	69	252

Tabla 4: Se obtuvieron las constantes farmacocinéticas de los conejos cuando se ajustaron matemáticamente las curvas de C_{pl} frente al tiempo. Se administraron i.v. los compuestos a una concentración de 1.000 nmol/kg. Los valores T_{1/2} se dan en minutos (min) para las fases \alpha y \beta.

Estadística: la prueba t pareada, supuestas unas muestras con varianzas desiguales, mostró un p<0,001 para todos los parámetros medidos. En conclusión el valor T_{1/2} para el Compuesto 2 es aproximadamente tres veces el valor calculado para el Compuesto 1 que representa al equivalente no conjugado.

17. Ensayo de tolerancia a la glucosa de los compuestos 2, 14-16, 18 y 19 comparados con el compuesto (i)

Se usaron ratones db/db diabéticos machos (M&B, Bomholdtgaard, Ll., Skensved, Dinamarca). Este modelo de ratón, bien descrito, ha heredado las disfunciones del metabolismo de la glucosa debido a una mutación en el receptor de leptina. Como en pacientes humanos con diabetes mellitus no insulinodependiente descontrolada (DMNID), los ratones homocigóticos db/db experimentan polidipsia, poliuria y glucosuria y ganan peso durante sus primeros tres meses de vida a pesar de su estado hiperglucémico. Sin embargo, en este modelo se asocia la hiperglucemia con la atrofia progresiva de los islotes pancreáticos, con una posible cetosis y con la muerte a los 6-8 meses de edad. De este modo, se debería prestar atención a la progresión y situación del estado de la enfermedad. Por lo tanto, preferentemente, sólo se deberían usar ratones db/db de menos de 16 semanas de edad para los ensayos de fármacos de análogos de GLP-1.

Todos los animales se aclimatan durante al menos una semana y se manipulan diariamente durante dos días antes del primer ensayo oral de tolerancia a la glucosa(EOTG). Además, para reducir las excursiones de la glucosa inducidas por estrés, los animales se deberían someter por los menos a un EOTG sin compuesto antes del experimento según se describe más arriba. Debido a la gran dispersión de la tolerancia a la glucosa entre los ratones diabéticos, los animales son estratificados mediante un EOTG antes de ser empleados por primera vez.

Péptidos

Los péptidos se disuelven en tampón fosfato salino 0,1 M (TFS) con albúmina bovina al 0,1% donde se ajusta el pH a 7,4 añadiendo NaOH 5 M. Todas las disoluciones se preparan frescas en la mañana inmediatamente antes del experimento. A los animales tratados con vehículo se les suministra TFS con solo albúmina al 0,1%.

Ensayo de tolerancia a la glucosa y dosificación

Antes del ensayo oral de tolerancia a la glucosa, los animales se mantienen en ayuna durante 17 horas (desde las 4 p.m. hasta las 9 a.m. de la siguiente mañana). A partir de las 9.00 a.m., se toma sangre de la punta del rabo (t=-15 min) y se mide la glucosa en sangre. La concentración total de glucosa en sangre (mM) se analiza por el método de glucosa oxidasa inmovilizada usando una gota de sangre (< 5 \muL, Elite Autoanalyser, Bayer, Dinamarca) siguiendo el manual del fabricante. Se excluyen los animales con diabetes severa (> 10 mM). Inmediatamente después de la muestra de sangre inicial, los animales reciben una inyección intraperitoneal (i.p.) de vehículo o una dosis de compuesto antidiabético. El volumen de inyección es 200 \muL/50 g de peso corporal en todos los grupos. Cincuenta minutos después de la administración i.p. de la sustancia se suministra una dosis oral de 1 g/kg de glucosa (Sigma, St. Louis) disuelta en agua (200 \muL/50 g de peso corporal), y se devuelven los animales a sus jaulas (t=0). Los niveles de glucosa en sangre se miden a t=30 min, t=60 min, t=120 min y t=240 min. Los animales se mantienen en ayuna durante el periodo de observación. Para cada animal se rellenó una hoja de datos logarítmicos en el momento de cada toma de muestra de sangre.

Cálculos y estadística

Para analizar los efectos de los compuestos, se calcula la diferencia absoluta y relativa con respecto a la línea base (t=0) para cada punto de tiempo. Se determina el área bajo la curva del experimento completo (ABC 0-240 min) usando el método de los trapecios. El día de la estratificación, se distribuyen los ratones para asegurar que las tolerancias a la glucosa sean similares en todos los grupos. Sin embargo, para corregir la progresión de la diabetes con el tiempo, se ensaya un grupo de control tratado con vehículo cada día de experimento y se expresa la respuesta a los fármacos relativa a la respuesta observada en animales de control temporal tratados con vehículos.

Se representan las curvas de dosis-respuesta para cada sustancia, véase Fig.3, y se analiza el efecto del fármaco relativo a la respuesta obtenida durante el tratamiento con vehículo usando un análisis de ANCOVA (análisis de covarianza). El tratamiento (fármaco o vehículo) se considera la variable independiente, el ABC 0-240 min expresado como el porcentaje de la respuesta en ratones de control temporal tratados con vehículo es la variable dependiente y la dosis del fármaco se define como la covariante. Se realiza el análisis post-hoc usando la prueba de mínimos significativos de Fisher. Las diferencias se consideran significativas al nivel de 0,05. Se realizaron los análisis estadísticos usando Statistica versión 5.5 para Windows NT, StatSoft, Tulsa, Oklahoma, EE.UU. Las curvas de dosis-respuesta representadas en la Fig. 3 muestran claramente que todos los compuestos ensayados presentan un efecto de reducción de la glucosa comparable al del fármaco de referencia.

18. Efectos del compuesto 2 y del compuesto (i) sobre EOTG en ratones db/db

La Figura 5 es un gráfico de ABC para el Compuesto 2 y el Compuesto (i) en un EOTG realizado usando las mismas condiciones experimentales que las descritas en el Ejemplo 17. La figura muestra que el efecto de reducción de la glucosa en sangre del Compuesto 2 es la misma que el efecto del compuesto (i) de la técnica anterior.

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19. Efectos a largo plazo del Compuesto 2, 100 nmol/kg i.p., en el ensayo oral de tolerancia a la glucosa (EOTG) cuando se administra hasta 24 horas antes del EOTG

Este experimento usa la dosis máxima de 100 nmol/kg i.p. en ratones db/db y por lo demás, se usan las mismas condiciones experimentales que las descritas en el Ejemplo 17. En la Fig. 6 se muestran los resultados y la conclusión del experimento es que la duración de la acción del Compuesto 2 en ratones db/db es de hasta 18 horas.

La invención descrita y reivindicada en la presente memoria no tiene por qué estar limitada en alcance por las realizaciones específicas descritas en la presente memoria, puesto que se pretende que estas realizaciones sirvan como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se pretende que cualquier realización equivalente esté dentro del alcance de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente memoria resultarán obvias para los expertos en la técnica de la descripción anterior. También se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntadas.

Claims

1. Un péptido conjugado de una variante de exendina-4(1-39) que comprende una deleción de entre 1 y 5 residuos de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 34-38 de exendina-4, en el que la variante de exendina-4 está acoplada a través de su extremo C-terminal a una secuencia de aminoácidos Z, donde Z comprende de 1 hasta 7 residuos de aminoácido Lys.

2. El péptido conjugado de la reivindicación 1, en el que la variante comprende una deleción de entre 1 y 3 residuos de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 36-38 de exendina 4.

3. El péptido conjugado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la variante comprende una deleción de 1, 2, ó 3 residuos de Pro en las posiciones que corresponden a las posiciones 36-38 de exendina-4.

4. El péptido conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Z es Lys_{6}.

5. El péptido conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la variante de exendina-4 es des Pro^{36}extendina-4(1-39).

6. El péptido conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido conjugado está en forma de ácido libre o una sal aceptable farmacéuticamente.

7. El péptido conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual es: des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 93), des Pro^{36}Pro^{37}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} o des Pro^{36}Pro^{37}Pro^{38}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} o un ácido libre o una de sus sales aceptable farmacéuticamente.

8. El péptido conjugado de la reivindicación 7, el cual es des Pro^{36}-exendina-4(1-39)-Lys_{6}-NH_{2} (Nº ID SEC: 93) o un ácido libre o una de sus sales aceptable farmacéuticamente.

9. Una composición farmacéutica que comprende el péptido conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

10. Un péptido conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para usar en un método de tratamiento médico.

11. Uso del péptido conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de una composición farmacéutica.

12. Uso del péptido conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes de tipo 1 o

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