ES2200023T3

ES2200023T3 - Procedimiento cromatografico.

Info

Publication number: ES2200023T3
Application number: ES96112637T
Authority: ES
Inventors: Gerd Brunner; Frank Reichmann
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1995-08-17
Filing date: 1996-08-05
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2016-08-05
Also published as: EP0760393A3; JP3739494B2; CN1137745C; DK0760393T3; ATE242303T1; EP0760393A2; US5777141A; JPH09104894A; DE59610489D1; CN1154868A; EP0760393B1

Abstract

UN PROCEDIMIENTO PARA LA RECUPERACION DE UN ACIDO GRASO INSATURADO CON AL MENOS DIECISEIS ATOMOS DE CARBONO EN LA MOLECULA O DE UN DERIVADO DE TAL ACIDO GRASO A PARTIR DE UNA MEZCLA DE ACIDOS GRASOS Y/O DERIVADOS DE ACIDOS GRASOS POR CROMATOGRAFIA DE COLUMNA CON DIOXIDO DE CARBONO SUPERCRITICO O LIQUIDO COMO FASE MOVIL, QUE CONSISTE EN QUE SE UTILIZA COMO FASE ESTACIONARIA OXIDO DE ALUMINIO PRETRATADO OPCIONALMENTE CON ALCALI. EL PRETRATAMIENTO DEL OXIDO DE ALUMINIO SE REALIZA CONVENIENTEMENTE POR CONTACTO DEL OXIDO DE ALUMINIO EN FORMA DE PARTICULAS CON UNA DISOLUCION ACUOSA DE UN HIDROXIDO DE METAL ALCALINO O ALCALINOTERREO A UN PH DE APROX. 10 A APROX. 12 DURANTE VARIAS HORAS; LA DISOLUCION ACUOSA, SE SE DESEA PUEDE TENER UN DISOLVENTE ORGANICO HIDROSOLUBLE O QUE SE PUEDA MEZCLAR CON AGUA. LOS ACIDOS GRASOS INSATURADOS OBTENIDOS DE ESTA MANERA SE UTILIZAN COMO PRINCIPIOS ACTIVOS VALIOSOS EN LOS CAMPOS DE LA ALIMENTACION Y DE LA MEDICINA.

Description

Procedimiento cromatográfico.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de ácidos grasos insaturados, eventualmente derivatizados, por cromatografía de columna partiendo de mezclas de estos con otros componentes, p.ej. con ácidos grasos saturados, eventualmente derivatizados.

Desde mucho tiempo atrás existe un interés alimentario y médico-científico por los ácidos grasos insaturados, en especial poliinsaturados (término inglés: polyunsaturated fatty acids, abreviado con las siglas "PUFA"). Como es sabido, ciertos ácidos grasos, en especial los PUFA, son compuestos previos de síntesis de prostanoides, p.ej. prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos, que desempeñan un papel biológico importante entre otros en la agregación de trombocitos, en inflamaciones y en alergias. En especial los dos ácidos "\omega-3"-PUFA (en los que el primer doble enlace se halla en el tercer átomo de carbono antes del grupo metilo terminal del ácido), el ácido eicosapentaenoico ("EPA") y el ácido docosahexaenoico ("DHA"), son útiles como principios activos para el tratamiento y la prevención de las llamadas enfermedades de la "civilización", en especial de las enfermedades cardiocirculatorias, p.ej. el infarto cardíaco y el nivel elevado de colesterol. Es también conocido que el ácido \omega-3- y también el \omega-6-PUFA (con el primer doble enlace situado en el sexto átomo de carbono) desempeñan un papel fundamental en el desarrollo de la retina, del cerebro y del desarrollo general de los mamíferos. En efecto, los ácidos \omega-3- y \omega-6-PUFA se han detectado en la leche materna; se considera probado que los bebés alimentados con leche materna se desarrollan con una rapidez mucho mayor que los niños de igual edad que no se hayan alimentado con leche materna. Actualmente se están realizando estudios en profundidad sobre los ácidos eicosapentaenoico y docosahexaenoico y sus efectos positivos en el tratamiento de la arterioesclerosis, en la disminución del nivel de colesterol y de la grasa en la sangre así como en la prevención de agregaciones de trombocitos, de inflamaciones crónicas, por ejemplo la artritis reumatoide y de neurodermatitis y de alergias.

Las grasas y aceites naturales, en especial los aceites de pescado, de animales marinos y de aceites vegetales, son importantes fuentes de los ácidos \omega-3- y \omega-6-PUFA, que existen en la naturaleza sobre todo en forma de sus glicéridos y fosfolípidos, acompañados de numerosos productos secundarios e impurezas molestos. Los ácidos \omega-3-PUFA recién mencionados, el ácido eicosapentaenoico y el ácido docosahexaenoico, se hallan sobre todo en los aceites de pescado, mientras que los ácidos \omega-6-PUFA, el ácido araquidónico y el ácido linoleico, se hallan sobre todo en grasas animales y en aceites vegetales, p.ej. aceite de maíz. En vista de las ventajas recién mencionadas de la ingestión o administración de ácidos PUFA y del hecho de que el contenido total de los ácidos PUFA de cadena larga deseados en grasas y aceites alimentarios se sitúa en el intervalo de 10 al 21% (p.ej. el contenido de ácidos \omega-3- y \omega-6-PUFA en aceite de pescado se sitúa entre el 12 y el 18%), para llegar a la dosis diaria recomendada de ácidos \omega-3-PUFA tendrían que ingerirse grandes cantidades de pescado como alimento. Sin embargo, esto no es viable por las razones más diversas. Por ello, aparte de los aceites de pescado que disponibles desde hace varias décadas en el mercado en su concentración natural, algunos fabricantes han optado por comercializar cápsulas que contienen concentraciones mayores de ácidos PUFA en una forma lo más pura posible, en forma de ésteres o en forma de triglicéridos resustituidos. Sigue habiendo demanda por disponer de los ácidos PUFA individuales en una forma lo más pura posible.

Por hidrólisis alcalina de las mezclas que contienen los ácidos PUFA, p.ej. de aceites de pescado, de animales marinos o de aceites vegetales, tal cual o de sus formas refinadas, y posterior transesterificación con alcoholes, en especial con etanol, se obtienen entre otros los correspondientes ésteres de alquilo. Como es sabido, la separación técnica ulterior de la mezcla de ésteres de alquilo puede realizarse entre otros por extracción en contracorriente con un gas supercrítico, en especial con dióxido de carbono, con lo cual es posible la separación prácticamente por el número de átomos de carbono. De este modo se obtienen fracciones con grados de pureza relativamente altos en ácidos PUFA del mismo número de átomos de carbono o de un número muy próximo de átomos de carbono, p.ej. una mezcla con una pureza del 60% en ácido eicosapentaenoico (C_{20}) y ácido docosahexaenoico (C_{22}). Sin embargo, por experiencia se sabe que por este método no es viable la separación específica por grado de saturación (número de dobles enlaces). Para poder estudiar los efectos fisiológicos de los distintos ácidos PUFA es necesario obtener fracciones de una pureza notablemente mayor. Debido a las deficiencias de los métodos separativos actuales no se ha podido esclarecer todavía si los distintos ácidos \omega-3-PUFA, el ácido eicosapentaenoico y el ácido docosahexaenoico, actúan por separado o interaccionan entre sí, lo dicho se puede aplicar también al ácido docosapentaenoico que, de forma inevitable, se administra siempre junto con el ácido docosahexaenoico.

Con la separación de los ácidos PUFA, en especial de los ácidos PUFA interesantes desde el punto de vista alimentario y médico-científico, que poseen por lo menos dieciséis átomos de carbono en su molécula, ya sea por el número de átomos de carbono, ya sea por el número de dobles enlaces, se dispondría de los distintos ácidos PUFA, que constituirían no solo un complemento para la nutrición diaria, sino también un complemento medicamentoso específico.

En el ámbito de la cromatografía preparativa de líquidos supercríticos (término inglés: supercritical fluid chromatography, abreviado con las siglas "SFC") se dispone ya de algunas publicaciones, que se basan en su mayor parte en los trabajos de los grupos dirigidos por M. Perrut [ver por ejemplo LC-GC (Magazine of Liquid and Gas Chromatography) 6, 10 (1988), 914]. Según estas publicaciones pueden separarse por cromatografía SFC preparativa en columnas empaquetadas el ácido docosapentaenoico y el ácido docosahexaenoico, obtenidos a partir de aceite de pescado y convertidos en los correspondientes ésteres etílicos. Empleando una columna con relleno de sílice se han podido lograr purezas de ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico del 96% y del 85%, respectivamente. No se facilitan datos sobre la separación del ácido docosapentaenoico, lo cual junto con la pureza relativamente baja conseguida en ácido docosahexaneoico, cifrada en un 85%, permite suponer que no se ha conseguido separar el ácido docosapentaenoico por este método.

Por la publicación de patente europea (EP) 558 974 se conoce un procedimiento cromatográfico de columna SFC para obtener ácidos grasos insaturados o derivados de los mismos partiendo de mezclas de origen vegetal o animal que los contengan. En este procedimiento se emplea como fase móvil el dióxido de carbono supercrítico o líquido y, como fase estacionaria, una fase rellena que se define a continuación. La fase estacionaria es por lo general una estructura o armazón básico formado por gel de sílice o por óxido de aluminio, que está provisto necesariamente de una fase de revestimiento, dotada de pares de electrones libres y/o de enlaces múltiples, existentes por ejemplo en un compuesto que contenga un grupo amino (p.ej. de un aminopropilo) o un grupo nitro o un grupo fenilo o un grupo ciano (p.ej. de un cianopropilo). En modo alguno se desprende del documento EP 558 974 que se logre una separación efectiva de los distintos ácidos PUFA por cromatografía de columna SFC con dióxido de carbono como fase móvil, pero empleando un armazón básico sin revestir, en especial un armazón de óxido de aluminio.

El objetivo de la presente invención consiste en desarrollar un nuevo procedimiento de obtención por cromatografía de columna de ácidos grasos insaturados valiosos, como tales o en forma de derivados, en especial en forma de ésteres de alquilo inferior de estos ácidos grasos, partiendo de una mezcla de ácidos grasos y/o de ésteres de ácidos grasos, a saber, un procedimiento que no permita soslayar en su mayor parte los inconvenientes del estado de la técnica. El procedimiento de la invención consiste en un procedimiento de obtención de ácidos grasos insaturados provistos por lo menos de dieciséis átomos de carbono en su molécula o de derivados de tales ácidos grasos partiendo de una mezcla de ácidos grasos y/o de derivados de ácidos grasos que se basa en la cromatografía de columna con dióxido de carbono supercrítico o líquido como fase móvil, que está caracterizado porque como fase estacionaria se emplea óxido de aluminio tratado previamente con álcali.

El procedimiento de la invención se lleva a la práctica en principio de modo que la mezcla de ácidos grasos y/o de derivados de ácidos grasos, que eventualmente ya está bajo presión, se pone en contacto con la fase móvil del dióxido de carbono supercrítico o líquido, todo lo cual, eventualmente junto con una segunda fase móvil, se introduce en la columna cromatográfica empaquetada con la fase estacionaria mencionada anteriormente y se hace pasar a través de ella (eluir), realizando la elución en las condiciones elegidas de temperatura y presión, con lo cual gracias al intenso intercambio entre la fase estacionaria y los distintos componentes de la mezcla se logra una separación temporal de estos componentes, se recogen los componentes (materiales eluidos) disueltos en dióxido de carbono que salen de la columna de forma sucesiva después de haberlos detectado (determinado) de forma secuencial en recipiente colectores determinados por el agente de detección y se elimina el dióxido de carbono del material recogido en cada recipiente por descompresión (volatilización), de modo que finalmente los distintos componentes o "fracciones" separados (entre otros los ácidos grasos insaturados o los derivados de ácidos grasos deseados) se hallan exentos de dióxido de carbono en los distintos recipientes colectores. Si se desea, después de haber pasado por la columna y de haber salido de la misma, se puede someter el líquido eluido a uno o a diversos procesos cromatográficos similares, con el fin de conseguir una mayor división de los componentes. Lo dicho puede aplicarse a una cualquiera de las fracciones obtenidas, en el supuesto de que su pureza no se ajuste al grado pretendido.

Si después de ejecutado el procedimiento de la invención a partir de la mezcla empleada se obtiene un derivado existente inicialmente en la de mezcla, p.ej. un éster de alquilo inferior o un triglicérido de origen natural, de un ácido graso insaturado provisto por lo menos de dieciséis átomos de carbono, pero lo que se desea realmente es el ácido graso propiamente dicho, entonces este podrá obtenerse por métodos convencionales a partir del derivado, p.ej. por saponificación del éster de alquilo inferior o del triglicérido. Incluso después de un tratamiento químico de este tipo, suponiendo que el ácido graso insaturado obtenido tenga una pureza insuficiente, se podrá someter el producto en cuestión al procedimiento de la invención hasta lograr que el producto eluido resultante tenga la pureza deseada.

En calidad de mezcla de ácidos grasos y/o de derivados de ácidos grasos es idónea cualquier mezcla que contenga por lo menos un ácido graso insaturado, cuya molécula tenga por lo menos de dieciséis átomos de carbono, o un derivado del mismo. Se pueden emplear por ejemplo aceites o grasas de origen vegetal o animal (incluidos los de animales marinos) que contengan entre otros los ácidos grasos deseados en forma de triglicéridos, amidas, fosfolípidos, lactonas y sales y otros ácidos grasos diversos y derivados, por ejemplo triglicéridos, etc. de los mismos, esteroles, p.ej. colesterol, vitaminas, p.ej. tocoferoles, y materiales que normalmente se consideran impurezas, p.ej. policlorobifenilo (PCB), hidrocarburos poliaromáticos (PAH), pesticidas, dioxinas, metales pesados, productos de oxidación y de descomposición de ácidos grasos saturados o de sus derivados, disolventes o reactivos residuales de las operaciones de concentración o de purificación practicadas hasta el momento, etc. En el procedimiento de la invención se utiliza la materia prima (aceite o grasa) eventualmente refinada y tratada químicamente con anterioridad, esterificada o transesterificada. El aceite o la grasa en cuestión, eventualmente refinados con anterioridad, se someten a una hidrólisis ácida o básica, con la que los triglicéridos que contienen se convierten en los correspondientes ácidos, que se esterifican seguidamente con un alquilalcohol C_{1}-C_{6}, con preferencia con etanol, después de lo cual los triglicéridos de los ácidos grasos insaturados y saturados se han transesterificado en los correspondientes ésteres de alquilo inferior. La hidrólisis y la esterificación pueden efectuarse por métodos convencionales. Las materias primas preferidas, que eventualmente pueden haberse refinado y/o tratado químicamente con anterioridad, son los aceites de pescado, p.ej. aceite de sardinas y aceite de atún, ya que estos son fuente valiosas de los ácidos más codiciados, el ácido eicosapentaenoico y el ácido docosahexaenoico, así como las grasas animales y los aceites vegetales, p.ej. el aceite de maíz, ya que estos son fuentes valiosas de los también codiciados ácidos araquidónico y ácido linoleico, en especial los aceites de pescado.

La mezcla de ácidos grasos y/o ésteres de ácidos grasos se introduce normalmente sin diluir en la columna cromatográfica junto con el dióxido de carbono supercrítico o líquido, dicha columna tiene un relleno de la fase estacionaria empleada con arreglo a la invención, también es posible diluir previamente dicha mezcla en un disolvente idóneo, p.ej. en un alcano inferior, con preferencia en n-hexano. Sin embargo, la mezcla se utiliza con preferencia sin diluir.

El dióxido de carbono supercrítico que se emplea en el procedimiento de la invención es, como es sabido, una forma del dióxido de carbono que se mantiene por lo menos a una temperatura de 31ºC y por lo menos a una presión de 73 bar, por lo cual dicha forma no es totalmente líquida ni totalmente gaseosa, sino un híbrido de las dos formas físicas. El dióxido de carbono líquido que puede emplearse como alternativa en el procedimiento de la invención presenta una temperatura inferior a 31ºC y una presión superior a 73 bar. Las ventajas de emplear el dióxido de carbono consisten en su ausencia de toxicidad, su no inflamabilidad y su facilidad de eliminación por descompresión de los líquidos eluidos recogidos en los recipientes colectores, sin que quede de él ningún residuo potencialmente nocivo en los ácidos grasos insaturados separados o en el derivado de los mismos. Además, el dióxido de carbono puede adquirirse con gran pureza y costes reducidos sin problema alguno y puede emplearse como parte de la fase móvil, si se desea, junto con un co-disolvente orgánico ("modifier"), p. ej. con el n-hexano ya mencionado anteriormente, o incluso con un alcanol inferior, por ejemplo el metanol o el etanol, y una cetona alifática inferior, por ejemplo la acetona. La temperatura crítica del dióxido de carbono no es mucho mayor que la temperatura ambiente y los ácidos grasos insaturados o los derivados de ácidos grasos que se pretenden obtener según la invención son sensibles a la temperatura (termolábiles), por estos motivos el dióxido de carbono es perfectamente indicado para el uso de fase móvil en el procedimiento de la invención.

El óxido de aluminio empleado como fase estacionaria en el procedimiento de la invención (y característico de esta invención) se presenta de modo conveniente en forma de partículas empaquetadas de la forma más homogénea posible, de partículas no uniformes o, con preferencia, de partículas esféricas, cuyo tamaño se sitúa entre 5 y 25 \mum. Tal óxido de aluminio esférico es un producto comercial muy asequible. Como ejemplos de óxidos de aluminio comerciales cabe mencionar el Aluspher(r) Al y el Spherisorb Alumina; el primero presenta una superficie específica S_{BET} de 170 m^{2}/g, un volumen de poros Vp de 0,5 ml/g, un diámetro de poro D de 100 \ring{A} y un tamaño de partícula dp_{50} de 5 \mum; mientras que el segundo posee una superficie específica S_{BET} de 93 m^{2}/g, un D de 130 \ring{A} y un dp_{50} igualmente de

\hbox{5
 \mu m}

. Diversos fabricantes comercializan materiales triturados, p.ej. la empresa ICN Biomedicabs Inc. Estos óxidos de aluminio presentan distribuciones de tamaño de grano de 3 a 6 \mum, de 7 a 12 \mum, de 10 a 18 \mum o de 18 a 32 \mum. La superficie específica de estos materiales S_{BET} se sitúa en 200 m^{2}/g; el volumen de poros y el diámetro de poro se sitúan en valores similares a los de los materiales esféricos.

Antes del uso, el óxido de aluminio se somete a un tratamiento alcalino. Este tratamiento previo consiste en principio en el contacto del óxido de aluminio en forma de partículas con una solución acuosa de un hidróxido alcalino o alcalinotérreo, por ejemplo el hidróxido sódico, potásico o cálcico, en un intervalo de pH de 10 a 13, durante varias horas, de modo conveniente entre 8 y 20 horas. La concentración de la solución acuosa de hidróxido alcalino o alcalinotérreo se sitúa de modo conveniente entre 0,01 M y 0,1 M. Si se desea, la solución acuosa de hidróxido alcalino o alcalinotérreo puede completarse con un disolvente orgánico miscible con agua o soluble en agua, con el fin de ajustar la viscosidad de la solución a un valor viable desde el punto de vista del trabajo industrial. Esto se consigue por ejemplo con un disolvente orgánico polar, el acetonitrilo o la acetona. Ha dado excelentes resultados una mezcla 10:90 (v/v) de acetonitrilo y una solución acuosa 0,1 M de hidróxido sódico, cuyo pH es de 13.

Por razones de índole práctica, el tratamiento previo alcalino del óxido de aluminio se realiza de modo conveniente por paso de un caudal continuo de la solución alcalina a través del óxido de aluminio ya empaquetado dentro de la columna cromatográfica, durante varias horas, con preferencia entre 12 y 16 horas, después se realiza un enjuague del óxido de aluminio así tratado con agua destilada, hasta que el agua de enjuague que sale de la columna sea neutra. Para eliminar el agua residual del óxido de aluminio pretratado se recomienda calentar la columna entre 50 y 90ºC durante un período de 4 a 10 horas y después enjuagar el óxido de aluminio pretratado con un alcano inferior, con preferencia con n-heptano, durante varias horas, con preferencia de 8 a 20 horas. A continuación, el óxido de aluminio así tratado puede utilizarse ya como fase estacionaria del procedimiento de la invención. El uso del óxido de aluminio pretratado con álcali constituye un aspecto preferido del procedimiento de la invención.

Para mantener el dióxido de carbono, que se emplea como fase móvil en el procedimiento de la invención, en el intervalo supercrítico o líquido, deberán mantenerse determinadas condiciones de presión y de temperatura, a saber, no solo durante la introducción del dióxido de carbono en la columna cromatográfica empaquetada con la fase estacionaria, sino también durante la siguiente operación de elución. El procedimiento se lleva a cabo de modo conveniente en un intervalo de temperaturas comprendido entre 30 y 100ºC y con una presión de 140 a 320 bar, pero, en caso de emplear un óxido de aluminio tratado previamente con álcali en lugar del óxido de aluminio sin tratar, la presión idónea será inferior, manteniendo iguales las condiciones restantes del proceso. El intervalo de temperaturas se sitúa con preferencia entre 45 y 75ºC y la presión correspondiente se sitúa entre 220 bar y 260 bar. La densidad del dióxido de carbono puede ajustarse con la presión y la temperatura, y en el intervalo de temperaturas y presiones que se ha citado en último lugar se produce una densidad óptima del dióxido de carbono, que se sitúa entre 720 kg/m^{3} y

\hbox{850 kg/m ^{3} }

.

\newpage

En calidad de fase estacionaria, el óxido de aluminio realiza en la ejecución del procedimiento de la invención la separación cromatográfica de los ácidos grasos o derivados de ácidos grasos insaturados en distintos grados y de los ácidos grasos o derivados de ácidos grasos saturados, en el supuesto de que existan, a saber por un lado en función de la longitud de cadena (número de átomos de C) y por otro lado en función del grado de saturación (número de dobles enlaces: cuanto mayor es este número, tanto menor es el grado de saturación). A partir de un cierto número de dobles enlaces parece que predomina la selectividad referida al grado de saturación. Si los ácidos grasos o derivados de ácidos grasos que se pretende separar disponen solamente de un doble enlace, por ejemplo el ácido erúcico (22 átomos de C, 1 doble enlace: "22:1"), entonces la selectividad referida a la longitud de cadena pasa claramente a un segundo término y los ácidos grasos o derivados se eluyen antes que los ácidos grasos o derivados de cadena más corta pero más insaturados, por ejemplo el ácido graso eicosapentaenoico 20:5. Por el contrario, cuando se eluyen los ácidos grasos 20:5, 22:5 y 22:6 (ácidos eicosapentaenoico, docosapentaenoico y docosahexaenoico), los ácidos de cadena más larga quedan retenidos más fuertemente (por más tiempo) sobre la fase estacionaria que los ácidos del mismo número de dobles enlaces pero de cadena más corta, de modo que el ácido graso 20:5 se eluye en primer lugar, seguido por el ácido graso 22:5 y en último lugar se eluye el ácido graso 22:6. Precisamente en la última región (número de átomos de C entre 20 y 22 y/o número de dobles enlaces 5 ó 6), los ácidos grasos insaturados son de gran interés para la industria alimentaria y para la medicina, en las que es muy importante efectuar separaciones cromatográficas netas sin excesiva presencia de colas (tailing).

Tanto las condiciones de temperatura y presión, en las que se ejecuta el procedimiento de la invención, como la elección como fase estacionaria entre óxido de aluminio sin tratar y óxido de aluminio tratado previamente con álcali tienen una gran influencia sobre el resultado de la separación. En general, un aumento de la temperatura o una disminución de la presión conllevan que los líquidos eluidos de los distintos ácidos grasos se distancien temporalmente entre sí, mientras que un aumento de la presión o una disminución de la temperatura se traducen en que los líquidos eluidos salen de la columna en momentos temporales más próximos, de modo que la variación discrecional de estos parámetros puede determinar el curso temporal del procedimiento de la invención. Con el tratamiento alcalino previo del óxido de aluminio pueden bloquearse los centros activos (principalmente ácidos de Lewis y bases) de la superficie, de modo que se debilita la polaridad del óxido de aluminio. Después de este tratamiento no se altera el orden de salida de los líquido eluidos, pero se reducen los tiempos de salida de colas (tailing) de los ácidos grasos polares poliinsaturados y se reducen claramente los tiempos de elución. Por ejemplo, ejecutando el procedimiento de la invención a 65ºC y 280 bar sobre óxido de aluminio sin tratar, el ácido graso 22:6 que se eluye en último lugar no sale hasta después de una media hora con una notable dilatación del tiempo de salida de colas (tailing), en cambio si se efectúa la elución en las mismas condiciones de presión y temperatura pero con el óxido de aluminio tratado con álcali, entonces el tiempo se reduce casi a un tercio y la dispersión de las colas se reduce en gran manera. Por este motivo, en el procedimiento de la invención se utiliza el óxido de aluminio tratado previamente con álcali.

La detección de los componentes disueltos (líquidos eluidos) en dióxido de carbono, que salen sucesivamente de la columna cromatográfica, se efectúa con preferencia en un detector UV, después del cual está montado un detector de ionización de llama (FID). El detector UV permite evaluar los componentes por su número de dobles enlaces y por ello contribuye a la elucidación parcial de la estructura de los distintos componentes. El empleo del detector FID permite la clasificación electrónica de los distintos líquidos eluidos y su trasvase a los recipientes colectores correctos. Esta tecnología es conocida de por sí, así como el método para eliminar el dióxido de carbono (por descompresión) del material recogido en cuestión.

El procedimiento de la invención es indicado con preferencia especial para obtener el ácido graso eicosapentaenoico 20:5 y el ácido graso docosahexaenoico 22:6, ya sea de forma directa, ya sea a través de un derivado de los mismos, con preferencia del éster etílico.

La invención se ilustra con los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Ejecución del procedimiento

Para estudiar la obtención cromatográfica de los componentes, en especial de los ésteres de etilo de ácidos grasos insaturado, partiendo de un aceite de pescado esterificado con etanol se emplea un equipo de la empresa Carlo Erba Instruments (ver figura 1). El equipo se alimenta en continuo de fase móvil a partir de una bombona de dióxido de carbono (CO_{2}). En función de las temperaturas de presión y temperatura elegidas, la fase móvil podrá utilizarse en estado supercrítico (en el caso del CO_{2} a 31ºC y 73 bar) o en estado subcrítico.

Para ello, el CO_{2} de la bombona se alimenta a la cámara de la bomba y en esta cámara se condensa con un termostato a -6ºC. El émbolo se acciona con un motor paso a paso (= de avance gradual) y de este modo comprime la fase móvil hasta la presión deseada. La presión de la bomba inyectora y la temperatura del horno de la columna pueden ajustarse mediante un ordenador. La fase móvil fluye con la presión elegida a través del equipo y pasa en primer lugar al sistema de inyección. En él tiene lugar la entrega o incorporación de la muestra mediante una válvula de dos vías a la fase móvil que fluye de paso. El tiempo de entrega o incorporación puede elegirse de forma discrecional entre 0 y 999 msegundos. El volumen cedido de muestra se sitúa en un valor constante de 0,5 \mul. A continuación, la muestra entra junto con la fase móvil en la columna. En la columna tiene lugar la separación de la mezcla en virtud de las interacciones de distinta intensidad entre la fase estacionaria y los distintos componentes de la solución de muestra. Los distintos componentes de la mezcla salen de la columna de forma sucesiva (en el caso ideal). La columna se halla dentro de un horno, por ello es posible además influir en el comportamiento de elución a través de la temperatura. La detección (determinación) de las sustancias separadas en la columna (entre otros los ésteres de etilo de los ácidos grasos insaturados) se efectúa de modo secuencial mediante un detector UV y después mediante un detector de ionización de llama (FID).

Figura 1 Ejecución experimental Equipo SFC-3000 de la empresa Carlo Erba Instruments

1

\newpage

Las siguientes figuras 2 y 3 presentan los cromatogramas obtenidos.

Figura 2

2

\hskip2cm

280 bar/65ºC

\hskip2cm

muestra: cabezal 3

Columna antes y después de la modificación alcalina

fase estacionaria: óxido de aluminio (Spherisorb Alumina)

velocidad de avance del papel del registro: 0,25 cm/min

atenuación: 64

\newpage

concentración: 40 mg/ml de n-hexano

detección: FID

Figura 3

3

columna modificada: Al_{2}O_{3} (separación de fases), 5 \mum

dimensiones: 250 x 1 mm

condiciones: 240 bar/80ºC

muestra: cabezal 3

detección: FID

La fase estacionaria, la velocidad de avance del papel del registro, la atenuación y la concentración: igual que en la figura 2.

Ejemplo 2 Tratamiento alcalino de la fase estacionaria de óxido de aluminio

Una columna cromatográfica con relleno de óxido de aluminio se trata durante varias horas (de 12 a 24 horas) con una mezcla de una solución acuosa 0,1 M de hidróxido sódico y acetonitrilo (90:10% v/v). El pH de la solución es de 13. Se lava la columna con agua hasta dejarla en pH neutro, después se calienta entre 50 y 90ºC durante un período de 4 a 10 horas y después se enjuaga con n-heptano durante un tiempo de 12 a 18 horas.

Ejemplo 3 Ejecución del procedimiento (variante de ejecución)

Para poner en funcionamiento columnas de diámetro interior considerable y, por tanto, de una mayor productividad por unidad de tiempo se emplea un equipo de la empresa New Ways of Analytics (ver figura 4). El equipo se abastece en continuo con fase móvil mediante una tubería de alimentación de CO_{2}. Según las condiciones de presión y de temperatura que se elijan, la fase móvil estará en estado supercrítico (en el caso del CO_{2} a 31ºC y 73 bar) o incluso en estado subcrítico. Para ello se condensa con un termostato a -6ºC el CO_{2} que procede de la bombona de CO_{2} y se introduce en el termostato del módulo de presión PM-101. Una bomba neumática de émbolo comprime la fase móvil hasta una presión de 300 a 400 bar. En el siguiente módulo de reducción de presión PR-102 se reduce la fase móvil comprimida hasta la presión deseada y se amortiguan además las oscilaciones de presión que resultan del funcionamiento del módulo de presión PM-101. La fase móvil fluye hacia el equipo con la presión elegida en el módulo de reducción de presión PR-102 y pasa en primer lugar por la válvula de inyección. En ella tiene lugar la entrega o incorporación de la muestra a través de una válvula de seis vías (Rheodyne 7125) a la fase móvil que fluye de paso. El volumen cedido de muestra puede variarse entre 5 \mul y varios mililitros mediante la elección de la correspondiente corredera de muestras. A continuación la muestra entra en la columna junto con la fase móvil. En la columna tiene lugar la separación de la mezcla en virtud de las interacciones de distinta intensidad entre la fase estacionaria y los distintos componentes de la solución de muestra. Los distintos componentes de la mezcla salen de la columna de forma sucesiva en el caso ideal. La columna se halla dentro de un horno, por ello es posible además influir en el comportamiento de elución a través de la temperatura. Las sustancias separadas en la columna se controlan con el detector UV y este transmite sus resultados a un programa informático de la cromatografía. Este programa informático ordena la abertura de válvulas que permiten la salida de los componentes separados. Finalmente, la fase supercrítica se descomprime en la unidad de descompresión PE-103.

(Figura pasa a página siguiente)

Figura 4 Equipo de la empresa New Ways of Analytics (NWA)

4

\newpage

La siguiente figura 5 presenta el cromatograma UV obtenido en un óxido de aluminio triturado con un equipo NWA.

Figura 5

5

columna: ICN 18-32 B \mum

dimensiones: 250 x 4 mm

condiciones: 235 bar/50ºC

volumen inyectado: 5 \mul

dilución en hexano: 1:1

detección: UV

muestra: cabezal 3

Claims

1. Procedimiento para la obtención de ácidos grasos insaturados cuya molécula está provista por lo menos de dieciséis átomos de carbono o de sus ésteres de alquilo C_{1}-C_{6} partiendo de una mezcla de ácidos grasos y/o de derivados de ácidos grasos por cromatografía de columna empleando como fase móvil el dióxido de carbono supercrítico o líquido, caracterizado porque se separan los ácidos grasos en forma de sus ésteres de alquilo C_{1}-C_{6} a través de una fase estacionaria de óxido de aluminio tratado previamente con álcali y, si se desea, se saponifican los ésteres recogidos para obtener los ácidos libres.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el óxido de aluminio tratado previamente con álcali se utiliza en forma de partículas esféricas, empaquetadas del modo lo más homogéneo posible, cuyo tamaño de partícula se sitúa entre 5 y 25 \mum.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el tratamiento previo de la fase estacionaria se realiza por contacto del óxido de aluminio dividido en forma de partículas con una solución acuosa de un hidróxido alcalino o alcalinotérreo, en un intervalo de pH comprendido entre 10 y 13 y durante un período de 8 a 20 horas.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque para ajustar la viscosidad de la solución acuosa a un valor viable desde el punto de vista industrial se completa la solución con un disolvente orgánico miscible con agua o soluble en agua, en especial con acetonitrilo o con acetona.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque para el tratamiento previo del óxido de aluminio se emplea una mezcla 10:90 (v/v) de acetonitrilo y una solución acuosa 0,1 M de hidróxido sódico.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 5, caracterizado porque como mezcla de ácidos grasos y/o de derivados de ácidos grasos se emplea un aceite de pescado eventualmente refinado y/o tratado químicamente con anterioridad.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque como mezcla de ácidos grasos y/o de derivados de ácidos grasos se emplea un aceite de pescado esterificado previamente con un alcanol C_{1}-C_{6}, en especial un aceite de pescado esterificado con etanol.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo en un intervalo de temperaturas comprendido entre 30 y 100ºC y con una presión de 140 bar a 320 bar.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el intervalo de temperaturas se sitúa entre 45 y 75ºC y el intervalo de presiones entre 220 bar y 260 bar.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 9, caracterizado porque se emplea para obtener ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico o ácido docosahexaenoico a través de sus ésteres de etilo.