ES2200023T3 - Procedimiento cromatografico. - Google Patents
Procedimiento cromatografico.Info
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Abstract
UN PROCEDIMIENTO PARA LA RECUPERACION DE UN ACIDO GRASO INSATURADO CON AL MENOS DIECISEIS ATOMOS DE CARBONO EN LA MOLECULA O DE UN DERIVADO DE TAL ACIDO GRASO A PARTIR DE UNA MEZCLA DE ACIDOS GRASOS Y/O DERIVADOS DE ACIDOS GRASOS POR CROMATOGRAFIA DE COLUMNA CON DIOXIDO DE CARBONO SUPERCRITICO O LIQUIDO COMO FASE MOVIL, QUE CONSISTE EN QUE SE UTILIZA COMO FASE ESTACIONARIA OXIDO DE ALUMINIO PRETRATADO OPCIONALMENTE CON ALCALI. EL PRETRATAMIENTO DEL OXIDO DE ALUMINIO SE REALIZA CONVENIENTEMENTE POR CONTACTO DEL OXIDO DE ALUMINIO EN FORMA DE PARTICULAS CON UNA DISOLUCION ACUOSA DE UN HIDROXIDO DE METAL ALCALINO O ALCALINOTERREO A UN PH DE APROX. 10 A APROX. 12 DURANTE VARIAS HORAS; LA DISOLUCION ACUOSA, SE SE DESEA PUEDE TENER UN DISOLVENTE ORGANICO HIDROSOLUBLE O QUE SE PUEDA MEZCLAR CON AGUA. LOS ACIDOS GRASOS INSATURADOS OBTENIDOS DE ESTA MANERA SE UTILIZAN COMO PRINCIPIOS ACTIVOS VALIOSOS EN LOS CAMPOS DE LA ALIMENTACION Y DE LA MEDICINA.
Description
Procedimiento cromatográfico.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de ácidos grasos insaturados,
eventualmente derivatizados, por cromatografía de columna partiendo
de mezclas de estos con otros componentes, p.ej. con ácidos grasos
saturados, eventualmente derivatizados.
Desde mucho tiempo atrás existe un interés
alimentario y médico-científico por los ácidos
grasos insaturados, en especial poliinsaturados (término inglés:
polyunsaturated fatty acids, abreviado con las siglas "PUFA").
Como es sabido, ciertos ácidos grasos, en especial los PUFA, son
compuestos previos de síntesis de prostanoides, p.ej.
prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos, que desempeñan un
papel biológico importante entre otros en la agregación de
trombocitos, en inflamaciones y en alergias. En especial los dos
ácidos "\omega-3"-PUFA (en los que el primer
doble enlace se halla en el tercer átomo de carbono antes del grupo
metilo terminal del ácido), el ácido eicosapentaenoico ("EPA")
y el ácido docosahexaenoico ("DHA"), son útiles como
principios activos para el tratamiento y la prevención de las
llamadas enfermedades de la "civilización", en especial de las
enfermedades cardiocirculatorias, p.ej. el infarto cardíaco y el
nivel elevado de colesterol. Es también conocido que el ácido
\omega-3- y también el
\omega-6-PUFA (con el primer doble
enlace situado en el sexto átomo de carbono) desempeñan un papel
fundamental en el desarrollo de la retina, del cerebro y del
desarrollo general de los mamíferos. En efecto, los ácidos
\omega-3- y
\omega-6-PUFA se han detectado en
la leche materna; se considera probado que los bebés alimentados
con leche materna se desarrollan con una rapidez mucho mayor que
los niños de igual edad que no se hayan alimentado con leche
materna. Actualmente se están realizando estudios en profundidad
sobre los ácidos eicosapentaenoico y docosahexaenoico y sus efectos
positivos en el tratamiento de la arterioesclerosis, en la
disminución del nivel de colesterol y de la grasa en la sangre así
como en la prevención de agregaciones de trombocitos, de
inflamaciones crónicas, por ejemplo la artritis reumatoide y de
neurodermatitis y de alergias.
Las grasas y aceites naturales, en especial los
aceites de pescado, de animales marinos y de aceites vegetales, son
importantes fuentes de los ácidos \omega-3- y
\omega-6-PUFA, que existen en la
naturaleza sobre todo en forma de sus glicéridos y fosfolípidos,
acompañados de numerosos productos secundarios e impurezas
molestos. Los ácidos \omega-3-PUFA
recién mencionados, el ácido eicosapentaenoico y el ácido
docosahexaenoico, se hallan sobre todo en los aceites de pescado,
mientras que los ácidos
\omega-6-PUFA, el ácido
araquidónico y el ácido linoleico, se hallan sobre todo en grasas
animales y en aceites vegetales, p.ej. aceite de maíz. En vista de
las ventajas recién mencionadas de la ingestión o administración
de ácidos PUFA y del hecho de que el contenido total de los ácidos
PUFA de cadena larga deseados en grasas y aceites alimentarios se
sitúa en el intervalo de 10 al 21% (p.ej. el contenido de ácidos
\omega-3- y
\omega-6-PUFA en aceite de pescado
se sitúa entre el 12 y el 18%), para llegar a la dosis diaria
recomendada de ácidos
\omega-3-PUFA tendrían que
ingerirse grandes cantidades de pescado como alimento. Sin embargo,
esto no es viable por las razones más diversas. Por ello, aparte de
los aceites de pescado que disponibles desde hace varias décadas
en el mercado en su concentración natural, algunos fabricantes han
optado por comercializar cápsulas que contienen concentraciones
mayores de ácidos PUFA en una forma lo más pura posible, en forma
de ésteres o en forma de triglicéridos resustituidos. Sigue
habiendo demanda por disponer de los ácidos PUFA individuales en
una forma lo más pura posible.
Por hidrólisis alcalina de las mezclas que
contienen los ácidos PUFA, p.ej. de aceites de pescado, de animales
marinos o de aceites vegetales, tal cual o de sus formas refinadas,
y posterior transesterificación con alcoholes, en especial con
etanol, se obtienen entre otros los correspondientes ésteres de
alquilo. Como es sabido, la separación técnica ulterior de la
mezcla de ésteres de alquilo puede realizarse entre otros por
extracción en contracorriente con un gas supercrítico, en especial
con dióxido de carbono, con lo cual es posible la separación
prácticamente por el número de átomos de carbono. De este modo se
obtienen fracciones con grados de pureza relativamente altos en
ácidos PUFA del mismo número de átomos de carbono o de un número
muy próximo de átomos de carbono, p.ej. una mezcla con una pureza
del 60% en ácido eicosapentaenoico (C_{20}) y ácido
docosahexaenoico (C_{22}). Sin embargo, por experiencia se sabe
que por este método no es viable la separación específica por grado
de saturación (número de dobles enlaces). Para poder estudiar los
efectos fisiológicos de los distintos ácidos PUFA es necesario
obtener fracciones de una pureza notablemente mayor. Debido a las
deficiencias de los métodos separativos actuales no se ha podido
esclarecer todavía si los distintos ácidos
\omega-3-PUFA, el ácido
eicosapentaenoico y el ácido docosahexaenoico, actúan por separado
o interaccionan entre sí, lo dicho se puede aplicar también al
ácido docosapentaenoico que, de forma inevitable, se administra
siempre junto con el ácido docosahexaenoico.
Con la separación de los ácidos PUFA, en especial
de los ácidos PUFA interesantes desde el punto de vista alimentario
y médico-científico, que poseen por lo menos
dieciséis átomos de carbono en su molécula, ya sea por el número de
átomos de carbono, ya sea por el número de dobles enlaces, se
dispondría de los distintos ácidos PUFA, que constituirían no solo
un complemento para la nutrición diaria, sino también un
complemento medicamentoso específico.
En el ámbito de la cromatografía preparativa de
líquidos supercríticos (término inglés: supercritical fluid
chromatography, abreviado con las siglas "SFC") se dispone ya
de algunas publicaciones, que se basan en su mayor parte en los
trabajos de los grupos dirigidos por M. Perrut [ver por ejemplo
LC-GC (Magazine of Liquid and Gas Chromatography) 6,
10 (1988), 914]. Según estas publicaciones pueden separarse por
cromatografía SFC preparativa en columnas empaquetadas el ácido
docosapentaenoico y el ácido docosahexaenoico, obtenidos a partir
de aceite de pescado y convertidos en los correspondientes ésteres
etílicos. Empleando una columna con relleno de sílice se han podido
lograr purezas de ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico
del 96% y del 85%, respectivamente. No se facilitan datos sobre la
separación del ácido docosapentaenoico, lo cual junto con la pureza
relativamente baja conseguida en ácido docosahexaneoico, cifrada
en un 85%, permite suponer que no se ha conseguido separar el ácido
docosapentaenoico por este método.
Por la publicación de patente europea (EP) 558
974 se conoce un procedimiento cromatográfico de columna SFC para
obtener ácidos grasos insaturados o derivados de los mismos
partiendo de mezclas de origen vegetal o animal que los contengan.
En este procedimiento se emplea como fase móvil el dióxido de
carbono supercrítico o líquido y, como fase estacionaria, una fase
rellena que se define a continuación. La fase estacionaria es por lo
general una estructura o armazón básico formado por gel de sílice o
por óxido de aluminio, que está provisto necesariamente de una fase
de revestimiento, dotada de pares de electrones libres y/o de
enlaces múltiples, existentes por ejemplo en un compuesto que
contenga un grupo amino (p.ej. de un aminopropilo) o un grupo nitro
o un grupo fenilo o un grupo ciano (p.ej. de un cianopropilo). En
modo alguno se desprende del documento EP 558 974 que se logre una
separación efectiva de los distintos ácidos PUFA por cromatografía
de columna SFC con dióxido de carbono como fase móvil, pero
empleando un armazón básico sin revestir, en especial un armazón de
óxido de aluminio.
El objetivo de la presente invención consiste en
desarrollar un nuevo procedimiento de obtención por cromatografía
de columna de ácidos grasos insaturados valiosos, como tales o en
forma de derivados, en especial en forma de ésteres de alquilo
inferior de estos ácidos grasos, partiendo de una mezcla de ácidos
grasos y/o de ésteres de ácidos grasos, a saber, un procedimiento
que no permita soslayar en su mayor parte los inconvenientes del
estado de la técnica. El procedimiento de la invención consiste en
un procedimiento de obtención de ácidos grasos insaturados
provistos por lo menos de dieciséis átomos de carbono en su
molécula o de derivados de tales ácidos grasos partiendo de una
mezcla de ácidos grasos y/o de derivados de ácidos grasos que se
basa en la cromatografía de columna con dióxido de carbono
supercrítico o líquido como fase móvil, que está caracterizado
porque como fase estacionaria se emplea óxido de aluminio tratado
previamente con álcali.
El procedimiento de la invención se lleva a la
práctica en principio de modo que la mezcla de ácidos grasos y/o de
derivados de ácidos grasos, que eventualmente ya está bajo
presión, se pone en contacto con la fase móvil del dióxido de
carbono supercrítico o líquido, todo lo cual, eventualmente junto
con una segunda fase móvil, se introduce en la columna
cromatográfica empaquetada con la fase estacionaria mencionada
anteriormente y se hace pasar a través de ella (eluir), realizando
la elución en las condiciones elegidas de temperatura y presión, con
lo cual gracias al intenso intercambio entre la fase estacionaria
y los distintos componentes de la mezcla se logra una separación
temporal de estos componentes, se recogen los componentes
(materiales eluidos) disueltos en dióxido de carbono que salen de
la columna de forma sucesiva después de haberlos detectado
(determinado) de forma secuencial en recipiente colectores
determinados por el agente de detección y se elimina el dióxido de
carbono del material recogido en cada recipiente por descompresión
(volatilización), de modo que finalmente los distintos componentes
o "fracciones" separados (entre otros los ácidos grasos
insaturados o los derivados de ácidos grasos deseados) se hallan
exentos de dióxido de carbono en los distintos recipientes
colectores. Si se desea, después de haber pasado por la columna y
de haber salido de la misma, se puede someter el líquido eluido a
uno o a diversos procesos cromatográficos similares, con el fin de
conseguir una mayor división de los componentes. Lo dicho puede
aplicarse a una cualquiera de las fracciones obtenidas, en el
supuesto de que su pureza no se ajuste al grado pretendido.
Si después de ejecutado el procedimiento de la
invención a partir de la mezcla empleada se obtiene un derivado
existente inicialmente en la de mezcla, p.ej. un éster de alquilo
inferior o un triglicérido de origen natural, de un ácido graso
insaturado provisto por lo menos de dieciséis átomos de carbono,
pero lo que se desea realmente es el ácido graso propiamente dicho,
entonces este podrá obtenerse por métodos convencionales a partir
del derivado, p.ej. por saponificación del éster de alquilo
inferior o del triglicérido. Incluso después de un tratamiento
químico de este tipo, suponiendo que el ácido graso insaturado
obtenido tenga una pureza insuficiente, se podrá someter el
producto en cuestión al procedimiento de la invención hasta lograr
que el producto eluido resultante tenga la pureza deseada.
En calidad de mezcla de ácidos grasos y/o de
derivados de ácidos grasos es idónea cualquier mezcla que contenga
por lo menos un ácido graso insaturado, cuya molécula tenga por lo
menos de dieciséis átomos de carbono, o un derivado del mismo. Se
pueden emplear por ejemplo aceites o grasas de origen vegetal o
animal (incluidos los de animales marinos) que contengan entre
otros los ácidos grasos deseados en forma de triglicéridos, amidas,
fosfolípidos, lactonas y sales y otros ácidos grasos diversos y
derivados, por ejemplo triglicéridos, etc. de los mismos,
esteroles, p.ej. colesterol, vitaminas, p.ej. tocoferoles, y
materiales que normalmente se consideran impurezas, p.ej.
policlorobifenilo (PCB), hidrocarburos poliaromáticos (PAH),
pesticidas, dioxinas, metales pesados, productos de oxidación y de
descomposición de ácidos grasos saturados o de sus derivados,
disolventes o reactivos residuales de las operaciones de
concentración o de purificación practicadas hasta el momento, etc.
En el procedimiento de la invención se utiliza la materia prima
(aceite o grasa) eventualmente refinada y tratada químicamente con
anterioridad, esterificada o transesterificada. El aceite o la
grasa en cuestión, eventualmente refinados con anterioridad, se
someten a una hidrólisis ácida o básica, con la que los
triglicéridos que contienen se convierten en los correspondientes
ácidos, que se esterifican seguidamente con un alquilalcohol
C_{1}-C_{6}, con preferencia con etanol, después
de lo cual los triglicéridos de los ácidos grasos insaturados y
saturados se han transesterificado en los correspondientes ésteres
de alquilo inferior. La hidrólisis y la esterificación pueden
efectuarse por métodos convencionales. Las materias primas
preferidas, que eventualmente pueden haberse refinado y/o tratado
químicamente con anterioridad, son los aceites de pescado, p.ej.
aceite de sardinas y aceite de atún, ya que estos son fuente
valiosas de los ácidos más codiciados, el ácido eicosapentaenoico y
el ácido docosahexaenoico, así como las grasas animales y los
aceites vegetales, p.ej. el aceite de maíz, ya que estos son
fuentes valiosas de los también codiciados ácidos araquidónico y
ácido linoleico, en especial los aceites de pescado.
La mezcla de ácidos grasos y/o ésteres de ácidos
grasos se introduce normalmente sin diluir en la columna
cromatográfica junto con el dióxido de carbono supercrítico o
líquido, dicha columna tiene un relleno de la fase estacionaria
empleada con arreglo a la invención, también es posible diluir
previamente dicha mezcla en un disolvente idóneo, p.ej. en un
alcano inferior, con preferencia en n-hexano. Sin
embargo, la mezcla se utiliza con preferencia sin diluir.
El dióxido de carbono supercrítico que se emplea
en el procedimiento de la invención es, como es sabido, una forma
del dióxido de carbono que se mantiene por lo menos a una
temperatura de 31ºC y por lo menos a una presión de 73 bar, por lo
cual dicha forma no es totalmente líquida ni totalmente gaseosa,
sino un híbrido de las dos formas físicas. El dióxido de carbono
líquido que puede emplearse como alternativa en el procedimiento de
la invención presenta una temperatura inferior a 31ºC y una presión
superior a 73 bar. Las ventajas de emplear el dióxido de carbono
consisten en su ausencia de toxicidad, su no inflamabilidad y su
facilidad de eliminación por descompresión de los líquidos eluidos
recogidos en los recipientes colectores, sin que quede de él ningún
residuo potencialmente nocivo en los ácidos grasos insaturados
separados o en el derivado de los mismos. Además, el dióxido de
carbono puede adquirirse con gran pureza y costes reducidos sin
problema alguno y puede emplearse como parte de la fase móvil, si
se desea, junto con un co-disolvente orgánico
("modifier"), p. ej. con el n-hexano ya
mencionado anteriormente, o incluso con un alcanol inferior, por
ejemplo el metanol o el etanol, y una cetona alifática inferior,
por ejemplo la acetona. La temperatura crítica del dióxido de
carbono no es mucho mayor que la temperatura ambiente y los ácidos
grasos insaturados o los derivados de ácidos grasos que se
pretenden obtener según la invención son sensibles a la temperatura
(termolábiles), por estos motivos el dióxido de carbono es
perfectamente indicado para el uso de fase móvil en el
procedimiento de la invención.
El óxido de aluminio empleado como fase
estacionaria en el procedimiento de la invención (y característico
de esta invención) se presenta de modo conveniente en forma de
partículas empaquetadas de la forma más homogénea posible, de
partículas no uniformes o, con preferencia, de partículas
esféricas, cuyo tamaño se sitúa entre 5 y 25 \mum. Tal óxido de
aluminio esférico es un producto comercial muy asequible. Como
ejemplos de óxidos de aluminio comerciales cabe mencionar el
Aluspher(r) Al y el Spherisorb Alumina; el primero presenta
una superficie específica S_{BET} de 170 m^{2}/g, un volumen de
poros Vp de 0,5 ml/g, un diámetro de poro D de 100 \ring{A} y un
tamaño de partícula dp_{50} de 5 \mum; mientras que el segundo
posee una superficie específica S_{BET} de 93 m^{2}/g, un D de
130 \ring{A} y un dp_{50} igualmente de
\hbox{5 \mu m}. Diversos fabricantes comercializan materiales triturados, p.ej. la empresa ICN Biomedicabs Inc. Estos óxidos de aluminio presentan distribuciones de tamaño de grano de 3 a 6 \mum, de 7 a 12 \mum, de 10 a 18 \mum o de 18 a 32 \mum. La superficie específica de estos materiales S_{BET} se sitúa en 200 m^{2}/g; el volumen de poros y el diámetro de poro se sitúan en valores similares a los de los materiales esféricos.
Antes del uso, el óxido de aluminio se somete a
un tratamiento alcalino. Este tratamiento previo consiste en
principio en el contacto del óxido de aluminio en forma de
partículas con una solución acuosa de un hidróxido alcalino o
alcalinotérreo, por ejemplo el hidróxido sódico, potásico o
cálcico, en un intervalo de pH de 10 a 13, durante varias horas, de
modo conveniente entre 8 y 20 horas. La concentración de la
solución acuosa de hidróxido alcalino o alcalinotérreo se sitúa de
modo conveniente entre 0,01 M y 0,1 M. Si se desea, la solución
acuosa de hidróxido alcalino o alcalinotérreo puede completarse con
un disolvente orgánico miscible con agua o soluble en agua, con el
fin de ajustar la viscosidad de la solución a un valor viable desde
el punto de vista del trabajo industrial. Esto se consigue por
ejemplo con un disolvente orgánico polar, el acetonitrilo o la
acetona. Ha dado excelentes resultados una mezcla 10:90 (v/v) de
acetonitrilo y una solución acuosa 0,1 M de hidróxido sódico, cuyo
pH es de 13.
Por razones de índole práctica, el tratamiento
previo alcalino del óxido de aluminio se realiza de modo
conveniente por paso de un caudal continuo de la solución alcalina
a través del óxido de aluminio ya empaquetado dentro de la columna
cromatográfica, durante varias horas, con preferencia entre 12 y 16
horas, después se realiza un enjuague del óxido de aluminio así
tratado con agua destilada, hasta que el agua de enjuague que sale
de la columna sea neutra. Para eliminar el agua residual del óxido
de aluminio pretratado se recomienda calentar la columna entre 50 y
90ºC durante un período de 4 a 10 horas y después enjuagar el óxido
de aluminio pretratado con un alcano inferior, con preferencia con
n-heptano, durante varias horas, con preferencia de
8 a 20 horas. A continuación, el óxido de aluminio así tratado
puede utilizarse ya como fase estacionaria del procedimiento de la
invención. El uso del óxido de aluminio pretratado con álcali
constituye un aspecto preferido del procedimiento de la
invención.
Para mantener el dióxido de carbono, que se
emplea como fase móvil en el procedimiento de la invención, en el
intervalo supercrítico o líquido, deberán mantenerse determinadas
condiciones de presión y de temperatura, a saber, no solo durante
la introducción del dióxido de carbono en la columna cromatográfica
empaquetada con la fase estacionaria, sino también durante la
siguiente operación de elución. El procedimiento se lleva a cabo de
modo conveniente en un intervalo de temperaturas comprendido entre
30 y 100ºC y con una presión de 140 a 320 bar, pero, en caso de
emplear un óxido de aluminio tratado previamente con álcali en
lugar del óxido de aluminio sin tratar, la presión idónea será
inferior, manteniendo iguales las condiciones restantes del
proceso. El intervalo de temperaturas se sitúa con preferencia
entre 45 y 75ºC y la presión correspondiente se sitúa entre 220 bar
y 260 bar. La densidad del dióxido de carbono puede ajustarse con
la presión y la temperatura, y en el intervalo de temperaturas y
presiones que se ha citado en último lugar se produce una densidad
óptima del dióxido de carbono, que se sitúa entre 720 kg/m^{3} y
\hbox{850 kg/m ^{3} }.
\newpage
En calidad de fase estacionaria, el óxido de
aluminio realiza en la ejecución del procedimiento de la invención
la separación cromatográfica de los ácidos grasos o derivados de
ácidos grasos insaturados en distintos grados y de los ácidos
grasos o derivados de ácidos grasos saturados, en el supuesto de
que existan, a saber por un lado en función de la longitud de
cadena (número de átomos de C) y por otro lado en función del grado
de saturación (número de dobles enlaces: cuanto mayor es este
número, tanto menor es el grado de saturación). A partir de un
cierto número de dobles enlaces parece que predomina la
selectividad referida al grado de saturación. Si los ácidos grasos
o derivados de ácidos grasos que se pretende separar disponen
solamente de un doble enlace, por ejemplo el ácido erúcico (22
átomos de C, 1 doble enlace: "22:1"), entonces la selectividad
referida a la longitud de cadena pasa claramente a un segundo
término y los ácidos grasos o derivados se eluyen antes que los
ácidos grasos o derivados de cadena más corta pero más insaturados,
por ejemplo el ácido graso eicosapentaenoico 20:5. Por el
contrario, cuando se eluyen los ácidos grasos 20:5, 22:5 y 22:6
(ácidos eicosapentaenoico, docosapentaenoico y docosahexaenoico),
los ácidos de cadena más larga quedan retenidos más fuertemente
(por más tiempo) sobre la fase estacionaria que los ácidos del
mismo número de dobles enlaces pero de cadena más corta, de modo
que el ácido graso 20:5 se eluye en primer lugar, seguido por el
ácido graso 22:5 y en último lugar se eluye el ácido graso 22:6.
Precisamente en la última región (número de átomos de C entre 20 y
22 y/o número de dobles enlaces 5 ó 6), los ácidos grasos
insaturados son de gran interés para la industria alimentaria y
para la medicina, en las que es muy importante efectuar
separaciones cromatográficas netas sin excesiva presencia de colas
(tailing).
Tanto las condiciones de temperatura y presión,
en las que se ejecuta el procedimiento de la invención, como la
elección como fase estacionaria entre óxido de aluminio sin tratar
y óxido de aluminio tratado previamente con álcali tienen una gran
influencia sobre el resultado de la separación. En general, un
aumento de la temperatura o una disminución de la presión conllevan
que los líquidos eluidos de los distintos ácidos grasos se
distancien temporalmente entre sí, mientras que un aumento de la
presión o una disminución de la temperatura se traducen en que los
líquidos eluidos salen de la columna en momentos temporales más
próximos, de modo que la variación discrecional de estos parámetros
puede determinar el curso temporal del procedimiento de la
invención. Con el tratamiento alcalino previo del óxido de aluminio
pueden bloquearse los centros activos (principalmente ácidos de
Lewis y bases) de la superficie, de modo que se debilita la
polaridad del óxido de aluminio. Después de este tratamiento no se
altera el orden de salida de los líquido eluidos, pero se reducen
los tiempos de salida de colas (tailing) de los ácidos grasos
polares poliinsaturados y se reducen claramente los tiempos de
elución. Por ejemplo, ejecutando el procedimiento de la invención a
65ºC y 280 bar sobre óxido de aluminio sin tratar, el ácido graso
22:6 que se eluye en último lugar no sale hasta después de una
media hora con una notable dilatación del tiempo de salida de colas
(tailing), en cambio si se efectúa la elución en las mismas
condiciones de presión y temperatura pero con el óxido de aluminio
tratado con álcali, entonces el tiempo se reduce casi a un tercio y
la dispersión de las colas se reduce en gran manera. Por este
motivo, en el procedimiento de la invención se utiliza el óxido de
aluminio tratado previamente con álcali.
La detección de los componentes disueltos
(líquidos eluidos) en dióxido de carbono, que salen sucesivamente
de la columna cromatográfica, se efectúa con preferencia en un
detector UV, después del cual está montado un detector de
ionización de llama (FID). El detector UV permite evaluar los
componentes por su número de dobles enlaces y por ello contribuye a
la elucidación parcial de la estructura de los distintos
componentes. El empleo del detector FID permite la clasificación
electrónica de los distintos líquidos eluidos y su trasvase a los
recipientes colectores correctos. Esta tecnología es conocida de
por sí, así como el método para eliminar el dióxido de carbono (por
descompresión) del material recogido en cuestión.
El procedimiento de la invención es indicado con
preferencia especial para obtener el ácido graso eicosapentaenoico
20:5 y el ácido graso docosahexaenoico 22:6, ya sea de forma
directa, ya sea a través de un derivado de los mismos, con
preferencia del éster etílico.
La invención se ilustra con los ejemplos
siguientes.
Para estudiar la obtención cromatográfica de los
componentes, en especial de los ésteres de etilo de ácidos grasos
insaturado, partiendo de un aceite de pescado esterificado con
etanol se emplea un equipo de la empresa Carlo Erba Instruments
(ver figura 1). El equipo se alimenta en continuo de fase móvil a
partir de una bombona de dióxido de carbono (CO_{2}). En función
de las temperaturas de presión y temperatura elegidas, la fase
móvil podrá utilizarse en estado supercrítico (en el caso del
CO_{2} a 31ºC y 73 bar) o en estado subcrítico.
Para ello, el CO_{2} de la bombona se alimenta
a la cámara de la bomba y en esta cámara se condensa con un
termostato a -6ºC. El émbolo se acciona con un motor paso a paso (=
de avance gradual) y de este modo comprime la fase móvil hasta la
presión deseada. La presión de la bomba inyectora y la temperatura
del horno de la columna pueden ajustarse mediante un ordenador. La
fase móvil fluye con la presión elegida a través del equipo y pasa
en primer lugar al sistema de inyección. En él tiene lugar la
entrega o incorporación de la muestra mediante una válvula de dos
vías a la fase móvil que fluye de paso. El tiempo de entrega o
incorporación puede elegirse de forma discrecional entre 0 y 999
msegundos. El volumen cedido de muestra se sitúa en un valor
constante de 0,5 \mul. A continuación, la muestra entra junto con
la fase móvil en la columna. En la columna tiene lugar la
separación de la mezcla en virtud de las interacciones de distinta
intensidad entre la fase estacionaria y los distintos componentes
de la solución de muestra. Los distintos componentes de la mezcla
salen de la columna de forma sucesiva (en el caso ideal). La
columna se halla dentro de un horno, por ello es posible además
influir en el comportamiento de elución a través de la temperatura.
La detección (determinación) de las sustancias separadas en la
columna (entre otros los ésteres de etilo de los ácidos grasos
insaturados) se efectúa de modo secuencial mediante un detector UV
y después mediante un detector de ionización de llama (FID).
\newpage
Las siguientes figuras 2 y 3 presentan los
cromatogramas obtenidos.
\hskip2cm280 bar/65ºC
\hskip2cmmuestra: cabezal 3
Columna antes y después de la modificación
alcalina
fase estacionaria: óxido de aluminio (Spherisorb
Alumina)
velocidad de avance del papel del registro: 0,25
cm/min
atenuación: 64
\newpage
concentración: 40 mg/ml de
n-hexano
detección: FID
columna modificada: Al_{2}O_{3} (separación
de fases), 5
\mum
dimensiones: 250 x 1 mm
condiciones: 240 bar/80ºC
muestra: cabezal 3
detección: FID
La fase estacionaria, la velocidad de avance del
papel del registro, la atenuación y la concentración: igual que en
la figura 2.
Una columna cromatográfica con relleno de óxido
de aluminio se trata durante varias horas (de 12 a 24 horas) con
una mezcla de una solución acuosa 0,1 M de hidróxido sódico y
acetonitrilo (90:10% v/v). El pH de la solución es de 13. Se lava
la columna con agua hasta dejarla en pH neutro, después se calienta
entre 50 y 90ºC durante un período de 4 a 10 horas y después se
enjuaga con n-heptano durante un tiempo de 12 a 18
horas.
Para poner en funcionamiento columnas de diámetro
interior considerable y, por tanto, de una mayor productividad por
unidad de tiempo se emplea un equipo de la empresa New Ways of
Analytics (ver figura 4). El equipo se abastece en continuo con
fase móvil mediante una tubería de alimentación de CO_{2}. Según
las condiciones de presión y de temperatura que se elijan, la fase
móvil estará en estado supercrítico (en el caso del CO_{2} a 31ºC
y 73 bar) o incluso en estado subcrítico. Para ello se condensa con
un termostato a -6ºC el CO_{2} que procede de la bombona de
CO_{2} y se introduce en el termostato del módulo de presión
PM-101. Una bomba neumática de émbolo comprime la
fase móvil hasta una presión de 300 a 400 bar. En el siguiente
módulo de reducción de presión PR-102 se reduce la
fase móvil comprimida hasta la presión deseada y se amortiguan
además las oscilaciones de presión que resultan del funcionamiento
del módulo de presión PM-101. La fase móvil fluye
hacia el equipo con la presión elegida en el módulo de reducción de
presión PR-102 y pasa en primer lugar por la
válvula de inyección. En ella tiene lugar la entrega o
incorporación de la muestra a través de una válvula de seis vías
(Rheodyne 7125) a la fase móvil que fluye de paso. El volumen
cedido de muestra puede variarse entre 5 \mul y varios mililitros
mediante la elección de la correspondiente corredera de muestras. A
continuación la muestra entra en la columna junto con la fase
móvil. En la columna tiene lugar la separación de la mezcla en
virtud de las interacciones de distinta intensidad entre la fase
estacionaria y los distintos componentes de la solución de muestra.
Los distintos componentes de la mezcla salen de la columna de forma
sucesiva en el caso ideal. La columna se halla dentro de un horno,
por ello es posible además influir en el comportamiento de elución
a través de la temperatura. Las sustancias separadas en la columna
se controlan con el detector UV y este transmite sus resultados a
un programa informático de la cromatografía. Este programa
informático ordena la abertura de válvulas que permiten la salida
de los componentes separados. Finalmente, la fase supercrítica se
descomprime en la unidad de descompresión
PE-103.
(Figura pasa a página
siguiente)
\newpage
La siguiente figura 5 presenta el cromatograma UV
obtenido en un óxido de aluminio triturado con un equipo NWA.
columna: ICN 18-32 B
\mum
dimensiones: 250 x 4 mm
condiciones: 235 bar/50ºC
volumen inyectado: 5 \mul
dilución en hexano: 1:1
detección: UV
muestra: cabezal 3
Claims (10)
1. Procedimiento para la obtención de ácidos
grasos insaturados cuya molécula está provista por lo menos de
dieciséis átomos de carbono o de sus ésteres de alquilo
C_{1}-C_{6} partiendo de una mezcla de ácidos
grasos y/o de derivados de ácidos grasos por cromatografía de
columna empleando como fase móvil el dióxido de carbono
supercrítico o líquido, caracterizado porque se separan los
ácidos grasos en forma de sus ésteres de alquilo
C_{1}-C_{6} a través de una fase estacionaria de
óxido de aluminio tratado previamente con álcali y, si se desea,
se saponifican los ésteres recogidos para obtener los ácidos
libres.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el óxido de aluminio tratado
previamente con álcali se utiliza en forma de partículas esféricas,
empaquetadas del modo lo más homogéneo posible, cuyo tamaño de
partícula se sitúa entre 5 y 25 \mum.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el tratamiento previo de la fase
estacionaria se realiza por contacto del óxido de aluminio dividido
en forma de partículas con una solución acuosa de un hidróxido
alcalino o alcalinotérreo, en un intervalo de pH comprendido entre
10 y 13 y durante un período de 8 a 20 horas.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque para ajustar la viscosidad de la
solución acuosa a un valor viable desde el punto de vista
industrial se completa la solución con un disolvente orgánico
miscible con agua o soluble en agua, en especial con acetonitrilo o
con acetona.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque para el tratamiento previo del óxido de
aluminio se emplea una mezcla 10:90 (v/v) de acetonitrilo y una
solución acuosa 0,1 M de hidróxido sódico.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 5, caracterizado porque como mezcla
de ácidos grasos y/o de derivados de ácidos grasos se emplea un
aceite de pescado eventualmente refinado y/o tratado químicamente
con anterioridad.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque como mezcla de ácidos grasos y/o de
derivados de ácidos grasos se emplea un aceite de pescado
esterificado previamente con un alcanol
C_{1}-C_{6}, en especial un aceite de pescado
esterificado con etanol.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque el
procedimiento se lleva a cabo en un intervalo de temperaturas
comprendido entre 30 y 100ºC y con una presión de 140 bar a 320
bar.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque el intervalo de temperaturas se sitúa
entre 45 y 75ºC y el intervalo de presiones entre 220 bar y 260
bar.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 9, caracterizado porque se emplea
para obtener ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico o
ácido docosahexaenoico a través de sus ésteres de etilo.
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