ES2199913T3 - Productos intermedios de productos finales de glusilacion avanzada e inhibicion post-amadori. - Google Patents
Productos intermedios de productos finales de glusilacion avanzada e inhibicion post-amadori.Info
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Abstract
El uso de piridoxamina para preparar un medicamento para tratar o prevenir una patología relacionada con un producto de glucosilación avanzada en un mamífero.
Description
Productos intermedios de productos finales de
glucosilación avanzada e inhibición
post-amadori.
La glucosilación no enzimática por la glucosa y
otros azúcares reductores es una importante modificación de las
proteínas posterior a su traducción que ha sido crecientemente
implicada en diversas patologías. La glucosilación no enzimática
irreversible y la reticulación a través de un lento proceso inducido
por la glucosa pueden mediar en muchas de las complicaciones
asociadas con la diabetes. La hiperglucemia crónica asociada con la
diabetes puede causar daños hísticos crónicos que pueden llevar a
complicaciones tales como retinopatía, nefropatía y enfermedad
ateroesclerótica (Cohen and Ziyadeh, 1996, J. Amer. Soc.
Nephrol. 7: 183-190). Se ha demostrado que el
daño hístico crónico resultante asociado con la diabetes mellitus a
largo plazo surge en parte por la formación in situ de un
completo inmunitario debido a la acumulación de inmunoglobulinas
y/o antígenos ligados a las proteínas estructurales de larga vida
que han sufrido la formación de un producto de glucosilación
avanzada (AGE), por medio de la glucosilación no enzimática
(Brownlee et al., 1983, J. Exp. Med. 158:
1739-1744). Se cree que la principal proteína
objetivo es el colágeno asociado con la matriz extracelular. La
glucosilación no enzimática de las proteínas, lípidos, y ácidos
nucleicos puede desempeñar un importante papel en los procesos
naturales de envejecimiento. Recientemente se ha asociado la
glucosilación de las proteínas con los depósitos
\beta-amieloides y la formación de ovillos
neurofibrilares en la enfermedad de Alzheimer, y posiblemente otras
enfermedades neurodegenerativas que implican amiloidosis (Colaco
and Harrington, 1994, NeuroReport 5:
859-861). Se ha demostrado también que las
proteínas glucosiladas son tóxicas, antigénicas y capaces de
desencadenar respuestas de lesiones celulares después de la
absorción por específicos receptores celulares (véase por ejemplo,
Vlassara, Bucala & Striker, 1994, Lab. Invest. 70:
138-151; Vlassara et al., 1994, PNAS
(USA) 91: 11704-11708; Daniels &
Hauser, 1992, Diabetes 41: 1415-1421;
Brownlee, 1994, Diabetes 43: 836-841;
Cohen et al., 1994, Kidney Int. 45:
1673-1679; Brett et al., 1993, Am. J.
Path. 143: 1699-1712; y Yan et
al., 1994, PNAS (USA) 91:
7787-7791).
La aparición de pigmentos pardos durante la
cocción de los alimentos es un fenómeno reconocido universalmente,
cuya química fue descrita por primera vez por Maillard en 1912, y
que ha llevado posteriormente a investigar en el concepto de
envejecimiento de las proteínas. Es sabido que los alimentos
almacenados y tratados con calor sufren un pardeamiento no
enzimático que se caracteriza por la reticulación de las proteínas,
lo que disminuye su biodisponibilidad. Se encontró que esta reacción
de Maillard tenía lugar también in vivo, cuando se encontró
que una glucosa se había unido, por medio de un reordenamiento de
Amadori, al amino terminal de la cadena \alpha de la
hemoglobina.
La presente descripción muestra el mecanismo
desconocido previamente y no previsto, de la formación de los
productos de glucosilación avanzada post-Amadori
(productos de Maillard; los AGE) y métodos para identificar y
caracterizar a los inhibidores eficaces de la formación de los AGE
post-Amadori. La presente descripción demuestra el
aislamiento y caracterización cinética excepcionales de un
intermedio de proteína reactiva competente para formar un AGE
post-Amadori, y por primera vez presenta métodos que
permiten la aclaración específica y el estudio cinético cuantitativo
rápido de las "últimas" etapas de la reacción de glucosilación
de la proteína.
En contraste con tal formación "última" de
los AGE, las etapas "iniciales" de la reacción de
glucosilación han sido relativamente bien caracterizadas e
identificadas para varias proteínas (Harding, 1985, Adv. Protein
Chem. 37: 248-334; Monnier & Baynes
eds., 1989, The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and
Nutrition (Alan R. Liss, New York); Finot et al., 1990,
eds. The Maillard Reaction in Food Processing, Human Nutrition
and Physiology (Birkhauser Verlag, Basel)). Es sabido que las
reacciones de glucosilación se inician por reacciones reversibles de
adición de una base de Schiff (aldimina o cetimina) con los grupos
\varepsilon-amino de la cadena lateral y los
grupos \alpha-amino terminales de la lisina,
seguidas por reordenamientos de Amadori esencialmente irreversibles
para obtener productos de cetoamina, por ejemplo
1-amino-1-desoxi-cetosas
a partir de la reacción de aldosas (Baynes et al., 1989, en
The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition, ed.
Monnier and Baynes, (Alan R. Liss, New York, pp
43-67). Típicamente, los azúcares reaccionan
inicialmente en sus formas aldehído o ceto de cadena abierta (no
las estructuras predominantes de piranosa y furanosa) con los
grupos \varepsilon-amino de la cadena lateral y
los grupos \alpha-amino terminales de la lisina a
través de la condensación reversible con una base de Schiff (Esquema
I). Los productos aldimina o cetimina resultantes sufren entonces
reordenamientos de Amadori para dar productos de cetoamina de
Amadori, esto es,
1-amino-1-desoxi-cetosas
a partir de la reacción de aldosas (Means & Chang, 1982,
Diabetes 31, Suppl. 3: 1-4; Harding,
1985, Adv. Protein Chem. 37: 248-334).
Estos productos de Amadori sufren entonces, durante un periodo de
semanas y meses, reacciones lentas e irreversibles de
"pardeamiento" de Maillard, formando productos fluorescentes y
otros productos por medio de reacciones de reordenamiento,
deshidratación, fragmentación oxidativa, y reticulación. Estas
reacciones post-Amadori, (reacciones lentas de
"pardeamiento" de Maillard), llevan a productos de
glucosilación avanzada (los AGE) pobremente caracterizados.
Al igual que con los intermedios de Amadori y
otros intermedios de glucosilación, la propia glucosa libre puede
sufrir reacciones oxidativas que llevan a la producción de
peróxidos y fragmentos altamente reactivos como los dicarbonilos del
glioxal y del glicoaldehído. Por tanto la aclaración del mecanismo
de formación de una variedad de AGE ha sido sumamente compleja ya
que la mayor parte de los estudios in vitro han sido
realizados en concentraciones de azúcar sumamente altas.
En contraste con la formación relativamente bien
caracterizada de estos productos "iniciales", ha existido una
clara falta de entendimiento de los mecanismos de formación de los
"últimos" productos de Maillard producidos en las reacciones
post-Amadori, a causa de su heterogeneidad, largos
tiempos de reacción, y complejidad. La falta de información
detallada sobre la química de la "última" reacción de Maillard
ha estimulado la investigación para identificar los cromóforos de
los AGE fluorescentes derivados de la reacción de la glucosa con
los grupos amino de los polipéptidos. Se ha identificado uno de
tales cromóforos,
2-(2-furoil)-4(5)-(2-furanil)-1H-imidazol
(FFI) después del pardeamiento no enzimático de la seroalbúmina
bovina y de la polilisina con la glucosa, y se plantea que es
representativo del cromóforo presente en los polipéptidos intactos.
(Pongor et al., 1984, PNAS (USA) 81:
2684-2688). Los últimos estudios han establecido
que el FFI es un artefacto formado durante la hidrólisis ácida para
el análisis.
Una serie de patentes de Estados Unidos han sido
expedidas en el área de la inhibición de la glucosilación de las
proteínas y de la reticulación de las aminas de las proteínas con
azúcar basándose en la hipótesis de que el mecanismo de tal
glucosilación y reticulación ocurre por medio de la glucosilación y
subsiguiente reticulación de las aminas de las proteínas con azúcar
por medio de una única reacción básica y repetitiva. Estas patentes
incluyen las patentes de Estados Unidos 4.665.192; 5.017.696;
4.758.853; 4.908.446; 4.983.604; 5.140.048; 5.130.337; 5.262. 152;
5.130.324; 5.272.165; 5.221.683; 5.258.381; 5.106.877; 5.128.360;
5.100.919; 5.254.593; 5.137. 916; 5.272.176; 5.175.192; 5.218.001;
5.238.963; 5.358.960; 5.318.982; y 5.334.617.
El objetivo principal de estas patentes de
Estados Unidos es un método para la inhibición de la formación de
los AGE enfocado sobre el resto carbonilo del producto de Amadori
de la glucosilación inicial, y en particular la inhibición más
eficaz demostrada presenta el uso de aminoguanidina administrada de
forma exógena. La eficacia de la aminoguanidina como inhibidor de la
formación del AGE está siendo probada en la actualidad en ensayos
clínicos.
La inhibición de la formación de los AGE tiene
utilidad en las áreas de, por ejemplo, deterioro de alimentos,
envejecimiento de proteínas animales, y en la higiene personal tal
como para combatir el oscurecimiento de los dientes. Algunos
notables productos de glucosilación avanzada, aunque
cuantitativamente menores, son pentosidina y
N^{\varepsilon}-carboximetillisina (Sell and
Monnier, 1989, J. Biol. Chem. 264:
21597-21602; Ahmed et al., 1986, J. Biol.
Chem. 261: 4889-4894.
El producto intermedio de Amadori y la
subsiguiente formación del AGE post-Amadori, como
se expone en la presente invención, no es totalmente inhibido por
reacción con la aminoguanidina. Por tanto, la formación de los AGE
post-Amadori como se expone en la presente
descripción tiene lugar por medio de una importante y excepcional
ruta de reacción que no ha sido mostrada previamente, o incluso que
no ha sido posible demostrar previamente de forma aislada. Es un
objetivo muy deseable disponer de un método eficiente y eficaz para
identificar y caracterizar los inhibidores eficaces de los AGE
post-Amadori de esta "última" reacción. Al
proporcionar métodos de cribado y sistemas de modelos eficientes,
se puede emplear la química combinatoria para seleccionar los
compuestos candidatos de forma efectiva, y con ello reducir
grandemente el tiempo, coste, y esfuerzo en la eventual validación
de los compuestos inhibidores. Sería muy útil disponer de métodos
in vivo para modelar y estudiar los efectos de la formación
de los AGE post-Amadori, lo que permitiría después
la caracterización eficiente de los inhibidores eficaces.
Los compuestos inhibidores que son biodegradables
y/o que se metabolizan de forma natural son más deseables para uso
como productos terapéuticos que los compuestos muy reactivos que
pueden tener efectos secundarios tóxicos, tal como la
aminoguanidina.
Los documentos Biosis Pre 19958285221 (1995) y
Biosis Prev 199497461151 (1994) describen ambos el uso de fosfato de
piridoxal (vitamina B6) como un inhibidor potencial de la forma de
productos de glucosilación avanzada (AGEs). Sin embargo, el
documento Prev 199497461151 indica que la disminución de la
glucosilación en presencia de fosfato de piridoxal apoya la noción
de que podría ser útil en la prevención de complicaciones
diabéticas, pero la reacción del fosfato de piridoxal por sí mismo
con proteínas es menos alentador. El documento Prev 199598285221 se
concentra en los efectos de la aminoguanidina como inhibidor de
productos de glucosilación.
La presente invención proporciona el uso de la
piridoxamina para preparar un medicamento para tratar o prevenir
una patología relacionada con un producto de glucosilación avanzada
en un mamífero.
Preferiblemente, la patología relacionada con el
producto de glucosilación avanzada se selecciona del grupo que
consiste en retinopatía, nefropatía, enfermedad neurodegenerativa,
y envejecimiento de proteínas.
La Figura 1 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE en seroalbúmina bovina (BSA). Figura 1A,
piridoxamina (PM); Figura 1B, fosfato de piridoxal (PLP); Figura
1C, piridoxal (PL); Figura 1D, piridoxina (PN).
La Figura 2 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{1} y de
la aminoguanidina (AG) sobre la formación de AGE en seroalbúmina
bovina. Figura 2A, pirofosfato de tiamina (TPP); Figura 2B,
monofosfato de tiamina (TP); Figura 2C, tiamina (T); Figura 2D,
aminoguanidina (AG).
La Figura 3 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE en metahemoglobina humana (Hb). Figura 3A,
piridoxamina (PM); Figura 3B, fosfato de piridoxal (PLP); Figura
3C, piridoxal (PL); Figura 3D, piridoxina (PN).
La Figura 4 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{1} y de
la aminoguanidina (AG) sobre la formación de AGE en metahemoglobina
humana (Hb). Figura 4A, pirofosfato de tiamina (TPP); Figura 4B,
monofosfato de tiamina (TP); Figura 4C, tiamina (T); Figura 4D,
aminoguanidina (AG).
La Figura 5 es una comparación en gráfico de
barras de la inhibición de la glucosilación de la ribonucleasa A por
pirofosfato de tiamina (TPP), piridoxamina (PM) y aminoguanidina
(AG).
La Figura 6A es un gráfico de la cinética de
glucosilación de la RNasa A (10 mg/ml) por la ribosa como se
comprueba por ELISA. La Figura 6B es un gráfico que muestra la
dependencia del número inverso de las semividas de la concentración
de ribosa a pH 7,5.
La Figura 7 presenta dos gráficos que muestran
una comparación de la glucosilación ininterrumpida e interrumpida de
la RNasa A por glucosa (7B), y ribosa (7A), como se detecta por
ELISA.
La Figura 8 presenta dos gráficos que muestran la
cinética del aumento de la fluorescencia de pentosidina (unidades
arbitrarias) durante la glucosilación ininterrumpida e interrumpida
de la RNasa A por ribosa. Figura 8A, glucosilación ininterrumpida
en presencia de ribosa 0,05 M. Figura 8B, glucosilación interrumpida
después de 8 y 24 horas de incubación.
La Figura 9 es un gráfico que muestra la cinética
de la formación del intermedio reactivo.
La Figura 10 presenta gráficos de la inhibición
post-Amadori de la formación de AGE por la ribosa.
La Figura 10A representa datos en los que se diluyeron alícuotas en
soluciones tampón que contienen el inhibidor al tiempo 0. La Figura
10B representa datos en los que las muestras se interrumpieron a
las 24 h, y después se diluyeron en tampones que contienen el
inhibidor.
La Figura 11 es un gráfico que muestra la
dependencia del pH de la velocidad inicial de formación de un AGE
antigénico después de la interrupción de la glucosilación.
La Figura 12 presenta dos gráficos que muestran
el efecto del salto de pH sobre la formación de los AGE detectada
por ELISA después de la glucosilación interrumpida. Las muestras
interrumpidas dejadas 12 días a 37ºC en un tampón de pH 5,0
produjeron cantidades sustanciales de AGE (33%; Figura 12B) cuando
se cambió el pH a 7,5, en comparación con la muestra control normal
no expuesta a pH bajo (Figura 12A).
La Figura 13 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de vitamina B_{6} sobre la
formación de AGE durante la glucosilación ininterrumpida de
ribonucleasa A (RNasa A) por la ribosa. Figura 13A, piridoxamina
(PM); Figura 13B,
piridoxal-5'-fosfato (PLP); Figura
3C, piridoxal (PL); Figura 3D, piridoxina (PN).
La Figura 14 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{1} y de
la aminoguanidina (AG) sobre la formación de AGE durante la
glucosilación ininterrumpida de ribonucleasa A (RNasa A) por la
ribosa. Figura 14A, pirofosfato de tiamina (TPP); Figura 14B,
monofosfato de tiamina (TP); Figura 14C, tiamina (T); Figura 14D,
aminoguanidina (AG).
La Figura 15 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE durante la glucosilación ininterrumpida de
seroalbúmina bovina (BSA) por la ribosa. Figura 15A, piridoxamina
(PM); Figura 15B,
piridoxal-5'-fosfato (PLP); Figura
15C, piridoxal (PL); Figura 15D, piridoxina (PN).
La Figura 16 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{1} y de
la aminoguanidina (AG) sobre la formación de AGE durante la
glucosilación ininterrumpida de seroalbúmina bovina (BSA) por la
ribosa. Figura 16A, pirofosfato de tiamina (TPP); Figura 16B,
monofosfato de tiamina (TP); Figura 16C, tiamina (T); Figura 16D,
aminoguanidina (AG).
La Figura 17 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE durante la glucosilación ininterrumpida de
metahemoglobina humana (Hb) por la ribosa. Figura 17A, piridoxamina
(PM); Figura 17B,
piridoxal-5'-fosfato (PLP); Figura
17C, piridoxal (PL); Figura 17D, piridoxina (PN).
La Figura 18 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE post-Amadori después de
glucosilación interrumpida por ribosa. Figura 18A, BSA y
piridoxamina (PM); Figura 18B, BSA y
piridoxal-5'-fosfato (PLP); Figura
18C, BSA y piridoxal (PL); Figura 18D, RNasa y piridoxamina
(PM).
La Figura 19 presenta gráficos que muestran el
efecto del pirofosfato de tiamina sobre la formación de AGE
post-Amadori después de glucosilación interrumpida
por ribosa. Figura 19A, RNasa; Figura 19B, BSA.
La Figura 20 presenta gráficos que muestran el
efecto de la aminoguanidina sobre la formación de AGE
post-Amadori después de glucosilación interrumpida
por ribosa. Figura 20A, RNasa; Figura 20B, BSA.
La Figura 21 es un gráfico que representa el
efecto de la N^{\alpha}-acetil-L-
lisina sobre la formación de AGE post-Amadori
después de glucosilación interrumpida por ribosa.
La Figura 22 presenta gráficos de barras que
muestran una comparación de la inhibición
post-Amadori de la formación de AGE por pirofosfato
de tiamina (TPP), piridoxamina (PM) y aminoguanidina (AG) después de
glucosilación interrumpida de RNasa (Figura 22A) y BSA (Figura 22B)
por la ribosa.
La Figura 23 es un gráfico de barras que muestra
los efectos del tratamiento con ribosa sola in vivo sobre la
tensión sanguínea de ratas en un manguito de la cola. El
tratamiento se hizo con ribosa (R) 0,05 M, 0,30 M, y 1 M inyectada
durante 1, 2 o 8 días (D).
La Figura 24 es un gráfico de barras que muestra
los efectos del tratamiento con ribosa sola in vivo sobre el
aclaramiento de creatinina en la rata (aclaramiento por 100 g de
peso corporal). El tratamiento se hizo con ribosa (R) 0,05 M, 0,30
M, y 1 M inyectada durante 1, 2 ó 8 días (D).
La Figura 25 es un gráfico de barras que muestra
los efectos del tratamiento con ribosa sola in vivo sobre la
albuminuria (velocidad de efusión de la albúmina) en la rata. El
tratamiento se hizo con ribosa (R) 0,30 M, y 1 M inyectada durante
1, 2 o 8 días (D).
La Figura 26 es un gráfico de barras que muestra
los efectos del tratamiento con un inhibidor in vivo con o
sin ribosa, sobre la tensión sanguínea de ratas en un manguito de
la cola. Los grupos de tratamiento fueron: 25 mg de aminoguanidina
(AG) por 100 g de peso corporal; 25 o 250 mg de piridoxamina (P)
por 100 g de peso corporal; 250 mg de pirofosfato de tiamina (T)
por 100 g de peso corporal, o con ribosa (R) 1 M.
La Figura 27 es un gráfico de barras que muestra
los efectos del tratamiento con un inhibidor in vivo con o
sin ribosa, sobre el aclaramiento de creatinina en la rata
(aclaramiento por 100 g de peso corporal). Los grupos de tratamiento
fueron: 25 mg de aminoguanidina (AG) por 100 g de peso corporal; 25
o 250 mg de piridoxamina (P) por 100 g de peso corporal; 250 mg de
pirofosfato de tiamina (T) por 100 g de peso corporal, o con ribosa
(R) 1 M.
La Figura 28 es un gráfico de barras que muestra
los efectos del tratamiento con un inhibidor in vivo sin
ribosa, y de ribosa sola sobre la albuminuria (velocidad de efusión
de la albúmina) en la rata. Los grupos de tratamiento fueron: 25 mg
de aminoguanidina (AG) por 100 g de peso corporal; 250 mg de
piridoxamina (P) por 100 g de peso corporal; 250 mg de pirofosfato
de tiamina (T) por 100 g de peso corporal, o tratamiento con ribosa
(R) 1 M durante 8 días. El grupo testigo no recibió ningún
tratamiento.
La Figura 29 es un gráfico de barras que muestra
los efectos del tratamiento con un inhibidor in vivo con
ribosa 1 M, sobre la albuminuria (velocidad de efusión de la
albúmina) en la rata. Los grupos de tratamiento fueron: 25 mg de
aminoguanidina (AG) por 100 g de peso corporal; 25 y 250 mg de
piridoxamina (P) por 100 g de peso corporal; 250 mg de pirofosfato
de tiamina (T) por 100 g de peso corporal, o tratamiento con ribosa
(R) 1 M sola durante 8 días. El grupo testigo no recibió ningún
tratamiento.
La Figura 30A representa el Esquema 1 que muestra
un diagrama de formación de los AGE a partir de las proteínas. La
Figura 30B representa el Esquema 2, una estructura química de
aminoguanidina. La Figura 30C representa el Esquema 3, estructuras
químicas de tiamina,
tiamina-5'-fosfato, y pirofosfato de
tiamina. La Figura 30D representa el Esquema 4, estructuras
químicas de piridoxina, piridoxamina,
piridoxal-5'-fosfato, y piridoxal.
La Figura 30E representa el Esquema 5, representación cinética de
la formación de AGE. La Figura 30F representa el Esquema 6,
representación cinética de la formación del AGE y de la formación
de un intermedio.
La Figura 31 muestra un espectro de resonancia
^{13}C NMR, a 125 MHz del intermedio de Amadori de la ribonucleasa
preparado por una reacción de 24 horas con 99% de
[2-C13]ribosa.
Las figuras que no muestran efectos ligados a la
piridoxamina se muestran con propósito comparativo.
Se han usado ratas Lewis diabéticas inducidas con
aloxano como un modelo para el envejecimiento de las proteínas para
demostrar la eficacia in vivo de los inhibidores de la
formación de los AGE. La correlación que se demuestra está entre la
inhibición de la patología relacionada con la diabetes avanzada y la
inhibición efectiva de la formación de los AGE (Brownlee, Cerami,
and Vlassara, 1988, New Eng. J. Med. 318 (20):
1315-1321). Se han utilizado también, la inducción
de la diabetes por la estreptozotocina en ratas Lewis, conejos
blancos de Nueva Zelanda con diabetes inducida y ratas BB/Worcester
genéticamente diabéticas, como se ha descrito en, por ejemplo, la
patente de Estados Unidos 5.334.617 (incorporada como referencia).
Un problema principal con estos sistemas modelos es el largo
periodo de tiempo requerido para demostrar las lesiones
relacionadas con los AGE, y por tanto para ensayar los compuestos en
cuanto a la inhibición de los AGE. Por ejemplo, se necesitaron 16
semanas de tratamiento para los estudios en ratas descritos en la
patente de Estados Unidos 5.334.617, y 12 semanas para los estudios
en conejos. Por tanto sería muy deseable y útil disponer de un
sistema modelo en el que la patología diabética relacionada con los
AGE, se manifieste en un periodo de tiempo más corto, que permita
una determinación más eficiente y más rápida de las lesiones
relacionadas con los AGE y de la eficacia de los inhibidores de la
formación de los AGE post-Amadori.
Una herramienta importante para estudiar la
formación de los AGE es el uso de anticuerpos policlonales y
monoclonales que son específicos para los AGE producidos por la
reacción de varios azúcares con una variedad de proteínas elegidas.
Los anticuerpos se seleccionan en cuanto a la especificidad
resultante frente a los AGE que es independiente de la naturaleza
del componente proteínico del AGE (Nakayama et al., 1989,
Biochem. Biophys. Res. Comm. 162:
740-745; Nakayama et al., 1991, J.
Immunol. Methods 140: 119-125; Horiuchi
et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:
7329-7332; Araki et al., 1992, J. Biol.
Chem. 267: 10211-10214; Makita et
al., 1992, J. Biol. Chem. 267:
5133-5138. Tales anticuerpos han sido usados para
verificar la formación de los AGE in vivo o in
vitro.
El primer miembro del complejo vitamínico B a ser
identificado, la tiamina, carece prácticamente de acciones
farmacodinámicas cuando se administra en las dosis terapéuticas
usuales; y no se conoce que incluso dosis grandes tengan algún
efecto. El pirofosfato de tiamina es la forma fisiológicamente
activa de la tiamina, y funciona principalmente en el metabolismo
de los carbohidratos como una coenzima en la descarboxilación de los
\alpha-ceto-ácidos. Los comprimidos de
hidrocloruro de tiamina están disponibles en cantidades que varían
de 5 a 500 mg cada uno. Están disponibles soluciones inyectables de
hidrocloruro de tiamina que contienen de 100 a 200 mg/ml.
Para tratar la deficiencia de tiamina, comúnmente
se usan dosis intravenosas tan altas como 100 mg/l de fluido
parenteral, siendo la dosis típica administrada, de 50 a 100 mg. La
absorción gastrointestinal de la tiamina se cree que está limitada
de 8 a 15 mg por día, pero puede ser aumentada por la
administración oral en dosis divididas con alimentos.
La administración repetida de glucosa puede
precipitar la deficiencia de tiamina en pacientes desnutridos, y
esto ha sido observado durante la corrección de la
hiperglucemia.
Sorprendentemente, en la presente invención se ha
encontrado, como se muestra por el ensayo in vitro, que la
administración de pirofosfato de tiamina a niveles superiores a los
que se encuentran normalmente en el cuerpo humano o se administran
para terapia dietética, es un inhibidor eficaz de la formación de
los AGE antigénicos post- Amadori y que esta inhibición es más
completa que la que es posible por la administración de
aminoguanidina.
La vitamina B_{6} está típicamente disponible
en la forma de hidrocloruro de piridoxina en preparaciones que se
dispensan sin receta, disponibles de muchas fuentes. Por ejemplo,
los comprimidos Beelith de Beach Pharmaceuticals contienen 25 mg de
hidrocloruro de piridoxina que son equivalentes a 20 mg de B_{6},
otras preparaciones incluyen la Marlyn Formula 50 de Marlyn Health
Care que contiene 1 mg de piridoxina HCl y la Marlyn Formula 50
Mega Forte que contiene 6 mg de piridoxina HCl, los comprimidos
Stuart Prenatal® de Wyeth-Ayerst que contienen 2,6
mg de piridoxina HCl, los comprimidos Stuart Formula® de
J&J-Merck Corp. que contienen 2 mg de piridoxina
HCl, y las multivitaminas masticables Sunkist Children's Chewable
Multivitamins de CIBA Consumer que contienen 1,05 mg de piridoxina
HCl, 150% de la ingesta diaria recomendada (RDA) en Estados Unidos
para niños de 2 a 4 años de edad, y 53% de la RDA en Estados Unidos
para niños mayores de 4 años de edad y para adultos. (Physician's
Desk Reference for nonprescription drugs, 14th edition (Medical
Economics Data Production Co., Montvale, N.J., 1993)).
Hay tres formas relacionadas de piridoxina, que
se diferencian en la naturaleza de la sustitución sobre el átomo de
carbono de la posición 4 del núcleo de la piridina: la piridoxina
es un alcohol primario, el piridoxal es el correspondiente aldehído,
y la piridoxamina contiene un grupo aminometilo en esta posición.
Cada una de estas tres formas puede ser utilizada por los mamíferos
después de la conversión por el hígado a
piridoxal-5'-fosfato, la forma
activa de la vitamina. Se ha creído durante mucho tiempo que estas
tres formas son equivalentes en propiedades biológicas y han sido
tratadas en la técnica como formas equivalentes de vitamina B_{6}.
El Council on Pharmacy and Chemistry ha asignado el nombre de
piridoxina a la vitamina.
El más activo antimetabolito de la piridoxina es
la 4-desoxipiridoxina, en la cual la actividad de
antimetabolito ha sido atribuida a la formación in vivo de
4-desoxipiridoxin-5-fosfato,
un inhibidor competitivo de varias enzimas dependientes del
piridoxal-fosfato. Las acciones farmacológicas de la
piridoxina son limitadas, ya que no presenta acciones
farmacodinámicas notables después de su administración ya sea oral o
ya sea intravenosa, y tiene una baja toxicidad aguda, siendo soluble
en agua. Se ha supuesto que la neurotoxicidad puede desarrollarse
después de la ingestión prolongada de cantidades tan pequeñas como
200 mg de piridoxina al día. Fisiológicamente, como una coenzima,
el fosfato de piridoxina está implicado en varias transformaciones
metabólicas de los aminoácidos incluyendo la descarboxilación,
transaminación y racemización, así como en las etapas enzimáticas
del metabolismo de los aminoácidos que contienen azufre y de los
hidroxi-aminoácidos. En el caso de la
transaminación, el piridoxal-fosfato es aminado
hasta fosfato de piridoxamina por el aminoácido donador, y el
fosfato de piridoxamina ligado es desaminado entonces hasta
piridoxal-fosfato por el
\alpha-ceto-ácido aceptor. Por tanto, se sabe que
el complejo vitamínico B es un suplemento necesario de la dieta
implicado en una descomposición específica de los aminoácidos. Para
una revisión general del complejo vitamínico B véase The
Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th edition, ed. Gilman,
Rall, Nies, and Taylor (Pergamon Press, New York, 1990, pp.
1293-4; pp 1523-1540).
De forma sorprendente, en la presente invención
se ha descubierto que las dosis eficaces de la forma
piridoxal-amina metabólicamente transitoria de la
vitamina B_{6} (piridoxamina), a niveles superiores a los que se
encuentran normalmente en el cuerpo humano, son un inhibidor eficaz
de la formación de los AGE antigénicos
post-Amadori, y que esta inhibición puede ser más
completa que la que se obtiene por la administración de
aminoguanidina.
El estudio típico de la reacción de una proteína
con glucosa para formar los AGE ha sido realizado por el método
ELISA usando anticuerpos dirigidos frente a los AGE antigénicos, y
la detección de la producción de un AGE fluorescente estable a los
ácidos, la pentosidina, por medio de HPLC después de la hidrólisis
ácida. La glucosilación de las proteínas elegidas (esto es, BSA o
RNasa A) con glucosa y ribosa se comparó haciendo seguimiento con
ELISA de la reactividad de los anticuerpos policlonales de conejo
anti-glucosa-AGE-RNasa
y
anti-glucosa-AGE-BSA.
Se generó el antígeno haciendo reaccionar glucosa 1 M con RNasa
durante 60 días y con BSA durante 90 días. Se seleccionaron los
anticuerpos (R618 y R479) que mostraron reactividad solamente con
los AGE y no con la proteína, excepto para el inmunógeno
portador.
Algunos vitámeros B_{6}, especialmente
piridoxal-fosfato (PLP), han sido propuestos
previamente para actuar como "inhibidores competitivos" de la
glucosación inicial, ya que como aldehídos pueden formar por sí
mismos aductos de bases de Schiff con los grupos amino de las
proteínas (Khatami et al., 1988, Life Sciences
43: 1725-1731) y de este modo pueden limitar
la cantidad de aminas disponibles para la unión de la glucosa. Sin
embargo, la eficacia para limitar la unión inicial del azúcar no es
un predictor de la inhibición de la conversión en AGE de ninguno de
los productos de Amadori formados. La presente invención describe
inhibidores de las reacciones "últimas" de glucosilación como
se indica por sus efectos sobre la formación in vitro de AGE
antigénicos (Booth et al., 1996, Biochem. Biophys. Res.
Com. 220: 113-119).
La ribonucleasa A (RNasa) pancreática bovina era
cromatográficamente pura, de un grado libre de agregados,
procedente de Worthington Biochemicals. La seroalbúmina bovina
(BSA; fracción V, libre de ácidos grasos), metahemoglobina humana
(Hb), D-glucosa, piridoxina, piridoxal,
piridoxal-5'-fosfato, piridoxamina,
tiamina, monofosfato de tiamina, pirofosfato de tiamina, y la IgG
de cabra anti-conejo conjugada con fosfatasa
alcalina, se obtuvieron todos de Sigma Chemicals. El hidrocloruro de
aminoguanidina se compró a Aldrich Chemicals.
Se incubaron seroalbúmina bovina, ribonucleasa A
y hemoglobina humana, con glucosa a 37ºC en solución tampón de
fosfato de sodio 0,4 M de pH 7,5 que contiene 0,02% de aziduro de
sodio. La proteína, la glucosa (a concentración 1,0 M), y los
inhibidores prospectivos (a concentraciones 0,5, 3, 15 y 50 mM) se
introdujeron en la mezcla de incubación simultáneamente. Las
soluciones se mantuvieron en la oscuridad en tubos tapados. Se
tomaron alícuotas e inmediatamente se congelaron hasta ser
analizadas por ELISA a la conclusión de la reacción. Las
incubaciones se realizaron durante 3 semanas (Hb) o 6 semanas
(RNasa, BSA).
La preparación del inmunógeno siguió protocolos
anteriores (Nakayama et al., 1989, Biochem. Biophys. Res.
Comm. 162: 740-745; Horiuchi et
al., 1991, J. Biol. Chem. 266:
7329-7332; Makita et al., 1992, J. Biol.
Chem. 267: 5133-5138). Brevemente, se
preparó el inmunógeno por glucosilación de BSA (anticuerpos R479) o
RNasa (anticuerpos R618) en 1,6 g de proteína en 15 ml durante
60-90 días usando glucosa 1,5 M en solución tampón
de fosfato de sodio 0,4 M de pH 7,5 que contiene 0,05% de aziduro de
sodio a pH 7,4 y 37ºC. Se inmunizaron conejos machos blancos de
Nueva Zelanda de 8-12 semanas, por administración
subcutánea de 1 ml de solución que contiene 1 mg/ml de proteína
glucosilada en coadyuvante de Freund. La inyección primaria usó el
coadyuvante completo y se prepararon tres inyecciones de refuerzo a
intervalos de tres semanas con el coadyuvante de Freund incompleto.
Se sangraron los conejos tres semanas después de la última
inyección de refuerzo. Se recogió el suero por centrifugación de la
sangre entera coagulada. Los anticuerpos son específicos de los
AGE, no siendo reactivos con otras proteínas nativas (excepto para
el portador) ni con los intermedios de Amadori. Los anticuerpos
policlonales anti-AGE han demostrado ser un
instrumento analítico sensible y valioso para el estudio de la
formación "última" de AGE in vitro e in vivo. La
naturaleza del epítopo o hapteno antigénico dominante de los AGE
sigue siendo dudosa, aunque recientemente se ha sugerido que el
producto de la glucoxidación de las proteínas, la
carboximetil-lisina (CmL), puede ser un antígeno
dominante de algunos anticuerpos Reddy et al., 1995,
Biochem. 34: 10872-10878). Estudios
anteriores no han podido revelar la reactividad de ELISA con el
modelo de compuestos de CmL (Makita et al., 1992, J.
Biol. Chem. 267: 5133-5138).
Se usó el método general de Engvall (1981,
Methods Enzymol. 70: 419-439) para
realizar el ensayo ELISA. Típicamente, las muestras de proteína
glucosilada se diluyeron hasta aproximadamente 1,5 \mug/ml en
solución tampón de carbonato de sodio 0,1 M de pH 9,5 a 9,7. Se
recubrió la proteína durante la noche a temperatura ambiente sobre
placas de poliestireno de 96 pocillos pipeteando 200 \mul de la
solución de proteína en cada pocillo (0,3 \mug/pocillo). Después
del recubrimiento, se lavó la proteína de los pocillos con una
solución salina que contiene 0,05% de Tween-20. Se
bloquearon entonces los pocillos con 200 \mul de caseína al 1% en
solución tampón de carbonato durante 2 h a 37ºC, seguido por
lavado. Los anticuerpos de conejo anti-AGE se
diluyeron a un título de aproximadamente 1:350 en la solución tampón
de incubación, y se incubaron durante 1 h a 37ºC seguido por
lavado. Para minimizar las lecturas de fondo, los anticuerpos R479
usados para detectar la RNasa glucosilada se produjeron frente a
BSA glucosilada, y los anticuerpos R618 usados para detectar la BSA
glucosilada y Hb glucosilada se produjeron frente a RNasa
glucosilada. Se añadió entonces, como el anticuerpo secundario, un
anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina para la IgG de conejo,
con un título de 1:2000 o 1:2500 (dependiendo del lote) y se incubó
durante 1 h a 37ºC, seguido por lavado. Se añadió entonces la
solución del sustrato p-nitrofenilfosfato (200
\mul/pocillo) a las placas, haciéndose seguimiento de la
absorbancia del p-nitrofenolato liberado a 410 nm con un
lector de microplacas Dynatech MR 400.
Se incluyeron rutinariamente testigos que
contienen proteína sin modificar, y se restaron sus lecturas,
siendo las correcciones usualmente insignificantes. La validez del
uso del método ELISA para el estudio cuantitativo de la
cinética de la formación de los AGE depende de la linealidad del
ensayo (Kemeny & Challacombe, 1988, ELISA and Other Solid
Phase Immunoassays, John Wiley & Sons, Chichester, U.K.). Se
realizaron experimentos de control, por ejemplo, que demuestran que
el intervalo lineal para la RNasa está por debajo de una
concentración de recubrimiento de aproximadamente
0,2-0,3 mg/pocillo.
La Figura 1 A-D presenta gráficos
que muestran el efecto de los derivados de la vitamina B_{6}
sobre la formación de los AGE post-Amadori en
seroalbúmina bovina glucosilada con glucosa. Se incubó BSA (10
mg/ml) con glucosa 1,0 M en presencia y ausencia de los diferentes
derivados indicados, en una solución tampón de fosfato de sodio 0,4
M de pH 7,5 a 37ºC durante 6 semanas. Se ensayaron alícuotas por
ELISA usando anticuerpos R618 anti-AGE. Las
concentraciones de los inhibidores fueron 3, 15 y 50 mM.
Inhibidores usados en las figuras: (1A), piridoxamina (PM); (1B),
fosfato de piridoxal (PLP); (1C), piridoxal (PL); (1D), piridoxina
(PN).
La Figura 1 (curvas control) demuestra que la
reacción de BSA con glucosa 0,1 M es lenta e incompleta después de
40 días, incluso en la concentración alta de azúcar usada para
acelerar la reacción. La inclusión simultánea de diferentes
concentraciones de diferentes vitámeros B_{6} afecta marcadamente
a la formación de AGE antigénicos post-Amadori.
(Figura 1A-D) La piridoxamina y el
piridoxal-fosfato redujeron fuertemente la
formación de AGE antigénicos post-Amadori, incluso a
las más bajas concentraciones ensayadas, mientras que el piridoxal
fue eficaz a concentraciones por encima de 15 mM. La piridoxina fue
ligeramente eficaz a las más altas concentraciones ensayadas.
La Figura 2 A-D presenta gráficos
que muestran el efecto de los derivados de vitamina B_{1} y
aminoguanidina (AG) sobre la formación de los AGE post- Amadori en
seroalbúmina bovina. Se incubó BSA (10 mg/ml) con glucosa 1,0 M en
presencia y ausencia de los diferentes derivados indicados, en una
solución tampón de fosfato de sodio 0,4 M de pH 7,5 a 37ºC durante
6 semanas. Se ensayaron alícuotas por ELISA usando anticuerpos R618
anti-AGE. Las concentraciones de los inhibidores
fueron 3, 15 y 50 mM. Inhibidores usados en las figuras: (2A),
pirofosfato de tiamina (TPP); (2B), monofosfato de tiamina (TP);
(2C), tiamina (T); (2D), aminoguanidina (AG).
De los diferentes vitámeros B_{1} ensayados de
forma similar (Figuras 2A-D), el pirofosfato de
tiamina fue eficaz en todas las concentraciones ensayadas (Figura
2C), mientras que la tiamina y el monofosfato de tiamina no fueron
inhibidores. De forma más significativa es interesante observar la
reducción de los niveles finales de los AGE formados observada con
pirofosfato de tiamina, piridoxal-fosfato y
piridoxamina. La aminoguanidina (Figura 2D) produjo algo de
inhibición en la formación de AGE post-Amadori en
BSA, pero menos que los compuestos anteriores. Se llevaron a cabo
estudios similares con metahemoglobina humana y ribonucleasa A
bovina.
La Figura 3 A-D presenta gráficos
que muestran el efecto de los derivados de la vitamina B_{6}
sobre la formación de los AGE post-Amadori en
metahemoglobina humana. Se incubó Hb (1 mg/ml) con glucosa 1,0 M en
presencia y ausencia de los diferentes derivados indicados, en una
solución tampón de fosfato de sodio 0,4 M de pH 7,5 a 37ºC durante
3 semanas. Se ensayaron alícuotas por ELISA usando anticuerpos R618
anti-AGE. Las concentraciones de los inhibidores
fueron 0,5, 3, 15 y 50 mM. Inhibidores usados en las figuras: (3A),
piridoxamina (PM); (3B), fosfato de piridoxal (PLP); (3C),
piridoxal (PL); (3D), piridoxina (PN).
Hay informes previos sobre que la Hb de un
paciente diabético contiene un componente que se liga a los
anticuerpos anti-AGE, y se ha sugerido que esta Hb
glucosilada (denominada Hb-AGE, no debe ser
confundida con HbAlc) podría ser útil para medir la exposición a la
glucosa a largo plazo. La incubación in vitro de la Hb con
glucosa produce los AGE antigénicos a una velocidad claramente más
rápida que la observada con BSA. Sin embargo, los diferentes
vitámeros B_{6} (Figura 3A-D) y B_{1} (Figura
4A-D) presentaron las mismas tendencias de
inhibición en la Hb, siendo la piridoxamina y el pirofosfato de
tiamina los inhibidores más eficaces en cada una de sus respectivas
familias. Significativamente, en la Hb, la aminoguanidina inhibió
solamente la velocidad de formación de los AGE
post-Amadori, y no los niveles finales de los AGE
post-Amadori formados (Figura 4D).
Con la RNasa, la velocidad de formación de los
AGE antigénicos post-Amadori por la glucosa fue
intermedia entre la de Hb y BSA, pero la extensión de la inhibición
dentro de cada serie de vitámeros se mantuvo. Una vez más la
piridoxamina y el pirofosfato de tiamina fueron más eficaces que la
aminoguanidina (Figura 5).
La Figura 4 A-D presenta gráficos
que muestran el efecto de los derivados de vitamina B_{1} y
aminoguanidina (AG) sobre la formación de los AGE
post-Amadori en metahemoglobina humana. Se incubó Hb
(1 mg/ml) con glucosa 1,0 M en presencia y ausencia de los
diferentes derivados indicados, en una solución tampón de fosfato
de sodio 0,4 M de pH 7,5 a 37ºC durante 3 semanas. Se ensayaron
alícuotas por ELISA usando anticuerpos R618
anti-AGE. Las concentraciones de los inhibidores
fueron 0,5, 3, 15 y 50 mM. Inhibidores usados en las figuras: (4A),
pirofosfato de tiamina (TPP); (4B), monofosfato de tiamina (TP);
(4C), tiamina (T); (4D), aminoguanidina (AG).
La Figura 5 es un gráfico de barras que muestra
una comparación de la inhibición de la glucosilación de la
ribonucleasa A por pirofosfato de tiamina (TPP), piridoxamina (PM)
y aminoguanidina (AG). Se incubó RNasa (1 mg/ml) con glucosa 1,0 M
en presencia y ausencia de los diferentes derivados indicados, en
una solución tampón de fosfato de sodio 0,4 M de pH 7,5 a 37ºC
durante 6 semanas. Se ensayaron alícuotas por ELISA usando
anticuerpos R479 anti-AGE. El porcentaje de
inhibición indicado se calculó a partir de las lecturas de ELISA en
ausencia y presencia de los inhibidores en el punto de tiempo de 6
semanas. Las concentraciones de los inhibidores fueron 0,5, 3, 15 y
50 mM.
Estos resultados demuestran que ciertos derivados
de las vitaminas B_{1} y B_{6} son capaces de inhibir la
formación "última" de los AGE post-Amadori.
Algunos de estos vitámeros inhibieron satisfactoriamente los
niveles finales de los AGE post-Amadori producidos,
en contraste con la aminoguanidina, lo que parece indicar que tienen
mayores interacciones con los precursores de Amadori o
post-Amadori de los AGE antigénicos. Los intermedios
de Amadori o post-Amadori representan una coyuntura
crucial en la que la ruta "clásica" de la glucosilación no
enzimática empieza a ser esencialmente irreversible (Esquema I). En
los primeros estudios de inhibición la "glucosilación" era
medida usualmente o como la base de Schiff formada (después de
reducción con cianoborohidruro marcado) o como el producto de
Amadori formado (después de precipitación ácida usando azúcar
marcado). Tales ensayos no proporcionan información sobre la
inhibición de las etapas de conversión post-Amadori
hasta los "últimos" productos AGE
post-Amadori, puesto que tales etapas no llevan a
ningún cambio en la cantidad del azúcar marcado que está unido a las
proteínas. Otros ensayos de "glucosilación" se han basado en
el aumento inducido por el azúcar de la fluorescencia no específica
de la proteína, pero ésta puede ser inducida también por los
fragmentos oxidativos de dicarbonilo del azúcar libre, tal como
glicoaldehído o glioxal (Hunt et al., 1988, Biochem.
256: 205-212), independientemente de la
formación del producto de Amadori.
En el caso de piridoxal (PL) o
piridoxal-fosfato (PLP), los datos confirman el
simple mecanismo de inhibición que implica la condensación
competitiva de la base de Schiff de estos aldehídos con los grupos
amino de las proteínas en los sitios de la glucosilación. Debido a
la formación de un hemiacetal interno en el piridoxal pero no en el
piridoxal-fosfato, se espera una inhibición más
fuerte de la formación de los AGE post-Amadori por
el PLP por este mecanismo competitivo. Esto se observa ciertamente
en los datos (Figura 1B, 1C, Figura 3B, 3C). La inhibición por la
piridoxamina es necesariamente diferente, ya que la piridoxamina
carece de un grupo aldehído. Sin embargo, la piridoxamina es una
amina candidato potencialmente capaz de formar una unión de base de
Schiff con los carbonilos de los azúcares de cadena abierta, con
fragmentos dicarbonilo, con productos de Amadori o con intermedios
post-Amadori. El mecanismo de inhibición de los
compuestos B_{1} no es obvio. Todas las formas contienen una
funcionalidad amino, de modo que la marcada eficiencia de la forma
pirofosfato solamente, da a entender un requerimiento importante de
una fuerte carga negativa.
Una observación importante inesperada es que la
extensión de la inhibición por aminoguanidina, y algunos de los
otros compuestos, es considerablemente menor en las últimas etapas
de la reacción que durante la primera fase inicial. Esto indica un
mecanismo de acción diferente al de la piridoxamina y pirofosfato de
tiamina, lo que permite suponer que el potencial terapéutico de
estos compuestos mejorará por la co-administración
con aminoguanidina.
Aunque se usan altas concentraciones de glucosa
para producir la glucosilación no enzimática de las proteínas, se
ha encontrado paradójicamente, que la ribosa a altas
concentraciones es inhibidora de la formación de los AGE
post-Amadori en ribonucleasa por actuar en las
"últimas" etapas post-Amadori de la reacción de
glucosilación. Este inesperado efecto inhibidor da a entender que
los intermedios reactivos "iniciales", presumiblemente
productos de Amadori, se pueden acumular con poca formación de los
"últimos" productos AGE post-Amadori (los AGE;
productos Maillard). La investigación de este fenómeno ha
demostrado: (1) capacidad para definir las condiciones para el
aislamiento cinético del intermedio o intermedios glucosilados de
Amadori (o post-Amadori); (2) capacidad para
estudiar la cinética rápida de la formación de tal intermedio; (3)
capacidad para estudiar la cinética sorprendentemente rápida de la
conversión de tales intermedios a productos AGE en ausencia de
azúcar libre o ligado de forma reversible; (4) capacidad para usar
estos intermedios para estudiar y caracterizar la inhibición de las
etapas post-Amadori de la formación de los AGE
proporcionando de este modo un nuevo sistema para investigar el
mecanismo de reacción y la eficacia de agentes potenciales que
podrían bloquear la formación de los AGE; y (5) con este
conocimiento es posible también de forma adicional usar la ^{13}C
NMR para estudiar los intermedios reactivos y verificar su
conversión a los diferentes AGE candidatos (Khalifah et al.,
1996, Biochemistry 35(15):
4645-4654
Como en el Ejemplo 1 anterior.
Como en el Ejemplo 1 anterior.
Como en el Ejemplo 1 anterior.
Los análisis de aminoácidos se realizaron en la
Biotechnology Support Facility del Kansas University Medical
Center. Los análisis se realizaron después de la hidrólisis de la
proteína glucosilada (reducida con cianoborohidruro de sodio) con
HCl 6 N a 110ºC durante 18-24 h. Se usó
isotiocianato de fenilo para derivatización, y los derivados PTH se
analizaron por HPLC en fase inversa en un analizador de aminoácidos
Applied Biosystems (derivatizador 420A, sistema de separación 130A,
sistema de análisis de datos 920A).
La producción de pentosidina en RNasa se
cuantificó por HPLC (Sell & Monnier, 1989, J. Biol.
Chem. 264: 21597-21602; Odetti et
al., 1992, Diabetes 41: 153-159).
Las muestras de proteína modificada por la ribosa se hidrolizaron en
HCl 6 N durante 18 h a 100ºC y después se secaron en un Speed Vac.
Se redisolvieron después las muestras, y se tomaron alícuotas en
ácido trifluoroacético al 0,1% y se analizaron por HPLC en un
sistema Shimadsu usando una columna Vydac C-18
equilibrada con TFA al 0,1%. Se realizó la cromatografía en
gradiente de 0-6% de acetonitrilo (0,1% en TFA) en
30 minutos a un caudal de aproximadamente 1 ml/min. Se detectó la
pentosidina por fluorescencia, excitación a 335 nm/emisión a 385
nm, y su tiempo de elución se determinó cromatografiando un estándar
sintetizado. Debido a los niveles sumamente pequeños de pentosidina
esperados (Grandhee & Monnier, 1991, J. Biol. Chem. 266:
11649-11653; Dyer et al., 1991, J. Biol.
Chem. 266: 11654-11660), no se hizo
ningún intento de cuantificar las concentraciones absolutas. Se
determinaron solamente las concentraciones relativas a partir de
las áreas de los picos.
La modificación con ribosa o glucosa se hizo
generalmente a 37ºC en solución tampón de fosfato 0,4 M de pH 7,5
que contiene 0,02% de aziduro de sodio. La concentración alta del
tampón se usó siempre con modificaciones con ribosa 0,5 M. Las
soluciones se mantuvieron en tubos cerrados que se abrieron
solamente para sacar alícuotas que fueron congeladas inmediatamente
para realizar más tarde los diferentes análisis. Los experimentos
de "glucosilación interrumpida" se realizaron incubando en
primer lugar la proteína con la ribosa a 37ºC durante 8 ó 24 h,
seguido por diálisis inmediata y extensiva frente a cambios
frecuentes de tampón frío a 4ºC. Después se reincubaron las
muestras calentando rápidamente a 37ºC en ausencia de ribosa
externa. Se tomaron alícuotas y se congelaron a diferentes
intervalos para posterior análisis. Debido al bajo peso molecular
de la RNasa, las concentraciones de proteína se midieron de nuevo
después de la diálisis incluso cuando se usó un tubo de diálisis
con corte a bajo peso molecular. Se ideó también un procedimiento
alternativo (véase más adelante) en el cual se consiguió la
interrupción por una dilución simple de 100 veces a partir de las
mezclas de reacción que contienen ribosa 0,5 M. Las concentraciones
de proteína se estimaron a partir de los espectros UV. La diferencia
en la extinción molar entre el pico (278 nm) y el valle (250 nm) se
usó para las determinaciones de la concentración de RNasa, para
compensar el aumento general de la absorbancia UV que acompaña a la
glucosilación. Se llevaron a cabo estudios espectrales de
diferencias en UV dependientes del tiempo, para caracterizar las
contribuciones de la glucosilación al espectro UV.
Los datos cinéticos se ajustaron rutinariamente a
funciones monoexponenciales o biexponenciales usando los métodos no
lineales de los mínimos cuadrados. Los mecanismos cinéticos de los
esquemas 5-6 han sido examinados por simulaciones
numéricas de las ecuaciones diferenciales de la reacción. Tanto las
simulaciones como los ajustes de los datos cinéticos observados se
realizaron con el programa de software SCIENTIST 2.0 (Micromath,
Inc.). La determinación de las semividas aparentes (Figura 6B)
desde los datos cinéticos ajustados a funciones biexponenciales
(Figura 6A) se realizó con la función ``solve'' del software
MathCAD 4.0 (MathSoft, Inc.).
La reacción de la RNasa A con ribosa y glucosa se
ha seguido en primer lugar con ensayos ELISA, usando anticuerpos de
conejo R479 específicos de los AGE desarrollados frente a BSA
modificada por glucosa. En menor grado, la producción de
pentosidina, el único AGE fluorescente conocido estable a los
ácidos, se cuantificó por HPLC después de hidrólisis ácida. Los
estudios preliminares usando ribosa 0,05 M a 37ºC demostraron que
la velocidad de formación del AGE antigénico parece que aumenta
moderadamente (unas 2-3 veces medida por la semivida
aparente) cuando el pH aumenta de 5,0 a 7,5, con un corto periodo de
inducción aparente en el comienzo de la cinética en todos los
casos. La glucosilación de la RNasa con ribosa 0,05 M a pH 7,5
(semivida, aproximadamente 6,5 días) parece que es casi un orden de
magnitud más rápida que la glucosilación con glucosa 1,0 M (semivida
superior a 30 días; véase la Figura 7B, línea sólida). Esta última
cinética también presenta un corto periodo de inducción pero un
nivel incompleto incluso después de 60 días, haciendo difícil
estimar una verdadera semivida.
Cuando la dependencia de la cinética frente a la
concentración de ribosa se examinó a pH 7,5, se obtuvo el resultado
más inesperado. La velocidad de reacción aumentó inicialmente al
aumentar la concentración de ribosa, pero a concentraciones
superiores a 0,15 M la velocidad de reacción se niveló y después se
redujo significativamente (Figura 6A). Una representación de la
dependencia del número inverso de la semivida frente a la
concentración de ribosa (Figura 6B) muestra que las concentraciones
altas de ribosa son paradójicamente inhibidoras de la formación de
los AGE antigénicos post-Amadori. Se encontró que
este inusual pero invariable efecto era independiente de los
cambios de concentración del tampón (2 veces) o de la RNasa (10
veces), y no cambiaba por la purificación de afinidad del anticuerpo
R479 en una columna de RNasa con AGE inmovilizado. Tampoco es
debido a los efectos de la ribosa sobre el propio ensayo ELISA. El
efecto inhibidor medido de la ribosa sobre la formación de los AGE
post-Amadori no es probablemente debido a la
interferencia de la ribosa con el reconocimiento por parte del
anticuerpo de los sitios antigénicos del AGE sobre la proteína en
el ensayo ELISA. Antes del primer contacto con el anticuerpo
anti-AGE primario sobre las placas ELISA, la
proteína glucosilada ha sido diluida más de 1000 veces, lavada
extensamente con Tween-20 después de la adsorción, y
bloqueada con un recubrimiento de caseína al 1% seguido por lavado
adicional con Tween-20.
En vista del corto periodo de inducción
observado, se ha hecho un intento para determinar si hubo alguna
acumulación durante la reacción, de un precursor inicial tal como
un intermedio de Amadori, capaz de producir los AGE antigénicos
post-Amadori detectables por ELISA. La RNasa se
glucosiló a pH 7,5 a 37ºC con una alta concentración de ribosa 0,5
M, y la reacción se interrumpió después de 24 h por enfriamiento
inmediato a 4ºC y diálisis frente a varios cambios de tampón frío a
lo largo de un periodo de 24 h para separar la ribosa libre y la
ligada de forma reversible (base de Schiff). Dicha muestra libre de
ribosa se calentó entonces rápidamente a 37ºC sin volver a
añadir ribosa, y después se tomó muestra para ver la formación
de AGE post-Amadori a lo largo de varios días. La
producción del antígeno AGE de esta "glucosilación
interrumpida" a las 24 h se muestra por la línea de trazos y
triángulos vacíos en la Figura 7A, no está incluido el tiempo
empleado en la diálisis en frío. Un control no interrumpido (línea
sólida y círculos rellenos) se muestra también para comparación.
Las notables diferencias en la cinética de formación de los AGE
antigénicos post-Amadori son evidentes en las dos
muestras. La cinética de la producción de antígeno AGE de la muestra
interrumpida libre de ribosa muestra ahora (1) una cinética
monoexponencial sin periodo de inducción, (2) un gran aumento de la
velocidad de formación del AGE antigénico, con semividas dignas de
mención, del orden de 10 h, y (3) una producción de niveles de
antígenos comparables a los vistos en incubaciones largas en
presencia continuada de ribosa (véase la Figura 6A). De forma
igualmente importante, los datos demuestran también que se formó
antígeno AGE insignificante durante el periodo de diálisis en frío,
como se muestra por las pequeñas diferencias entre los puntos de
triángulos vacíos y círculos llenos en el día 1 de tiempo en la
Figura 7A. Se formó muy poco AGE, si se formó algo, por el propio
procedimiento de "interrupción". Estas observaciones demuestran
que se había generado un intermedio o precursor del AGE antigénico
aislable totalmente competente durante las 24 h de contacto con la
ribosa antes de la separación del azúcar libre y del ligado de forma
reversible.
Las muestras interrumpidas después de sólo 8 h
produjeron una cantidad final de antígeno AGE que fue
aproximadamente 72% de la muestra interrumpida a las 24 h. Las
muestras de RNasa glucosilada solamente con ribosa 0,05 M e
interrumpida a las 8 h por diálisis en frío y reincubación a 37ºC
revelaron menos de 5% de producción de antígeno reactivo a ELISA
después de 9 días. La interrupción a las 24 h produjo, sin embargo,
un rápido aumento del antígeno frente a ELISA (similar a la Figura
7A) hasta un nivel de aproximadamente 50% del producido en la
presencia ininterrumpida de ribosa 0,05 M.
Los mismos efectos generales de la interrupción
se observaron también con otras proteínas (BSA y hemoglobina). Con
la excepción de un valor absoluto algo diferente de las constantes
de velocidad, y de la cantidad de los AGE antigénicos formados
durante la incubación de 24 h con ribosa 0,5 M, se observó el mismo
notable incremento en la velocidad de formación del antígeno AGE
después de la separación de la ribosa 0,5 M.
La glucosilación es mucho más lenta con glucosa
que con ribosa (nótese la diferencia en las escalas de tiempo entre
la Figura 7A y la Figura 7B). Sin embargo, al contrario que en el
caso de la ribosa, la interrupción después de 3 días de
glucosilación por glucosa 1,0 M produjo una formación insignificante
del precursor de los antígenos AGE reactivo frente a ELISA (Figura
7B, curva de trazos).
Las muestras sometidas al análisis por ELISA se
ensayaron también en cuanto a la producción de pentosidina, un AGE
estable a los ácidos. El contenido de pentosidina se midió para las
mismas muestras de RNasa analizadas por ELISA en cuanto a su
reactividad frente a los anticuerpos. La glucosilación por ribosa en
solución tampón de fosfato 0,4 M a pH 7,5 produjo pentosidina en
RNasa A que se cuantificó por fluorescencia después de hidrólisis
ácida. La Figura 8A muestra que en condiciones no interrumpidas, la
ribosa 0,05 M produce un aumento progresivo de la pentosidina. Sin
embargo, cuando la glucosilación se realiza en condiciones
"interrumpidas" usando ribosa 0,5 M, se observa un notable
aumento de la velocidad de formación de pentosidina inmediatamente
después de la separación del exceso de ribosa (Figura 8B), que es
similar a la cinética de aparición de los AGE antigénicos (Figura
7A), aunque ligeramente más rápido. Se produjo también una gran
cantidad de pentosidina con la interrupción a las 24 h en
comparación con la de 8 h. Se pueden observar también diferencias
reproducibles entre la cinética de formación de pentosidina y de los
AGE antigénicos. Se forma una cantidad importante de pentosidina
durante las 24 h de incubación y también durante la diálisis en
frío, que dan como resultado un salto en la línea vertical de
trazos de la Figura 8B. Estas observaciones demuestran así que
durante la glucosilación con ribosa se acumula un precursor de la
pentosidina que puede producir rápidamente pentosidina después de la
separación de la ribosa (véase Odetti et al., 1992,
Diabetes 41: 153-159).
Los experimentos de "glucosilación
interrumpida" descritos antes demuestran que, durante la
glucosilación con ribosa, se puede acumular un precursor o
precursores tanto de los AGE antigénicos
post-Amadori como de la pentosidina. Se puede seguir
y cuantificar independientemente la cinética de formación de este
intermedio por una variación de los experimentos descritos antes.
La cantidad de intermedio generada en la RNsa a diferentes tiempos
de contacto con la ribosa se puede ensayar por la máxima extensión
a la cual puede producir el AGE antigénico después de la
interrupción. A tiempos variables después de iniciar la
glucosilación, se separan la ribosa libre y la ligada de forma
reversible por diálisis en frío o por dilución rápida (véase más
adelante). Se deja entonces tiempo suficiente (5 días, que
representan varias semividas de acuerdo con la Figura 7A) después
de calentar a 37ºC para el máximo desarrollo de los AGE antigénicos
post-Amadori. Las lecturas del método ELISA 5 días
después de cada punto de interrupción, que representan el máximo
desarrollo de los AGE, deberían entonces ser proporcionales a la
concentración del intermedio presente en el tiempo de la
interrupción.
La Figura 9 muestra un experimento tal en el que
la cinética de formación del intermedio se mide para la RNsa en
presencia de ribosa 0,5 M (símbolos y curva rellenos). Para
comparación, se muestra también la cantidad de AGE presente antes
de la separación de la ribosa en cada punto de interrupción
(símbolos vacíos y líneas de trazos). Como era de esperar (véase la
Figura 7A), se forma poco AGE antes de la separación (o dilución) de
la ribosa, de modo que las lecturas del ensayo ELISA después de los
periodos de incubación secundaria de 5 días, son principalmente una
medida del AGE formado después de la separación de la ribosa. Los
resultados de la Figura 9 muestran que la velocidad de formación del
intermedio en ribosa 0,5 M es exponencial y muy rápida, con una
semivida de aproximadamente 3,3 h. Esta es aproximadamente 3 veces
más rápida que la velocidad observada de conversión del intermedio
en los AGE antigénicos después de la interrupción (símbolos vacíos
y curva de trazos de la Figura 7A).
En estos experimentos la separación de la ribosa
en cada tiempo de interrupción se consiguió por dilución de 100
veces, y no por diálisis. La dilución simple redujo la
concentración de la ribosa de 0,05 M a 0,005 M. Se determinó de
forma independiente (Figura 6A) que se produce poca cantidad de AGE
en esta escala de tiempo con la ribosa 5 mM residual. Este método
de dilución fue decidido principalmente por la necesidad de una
exactitud cuantitativa punto a punto. Tal exactitud no habría sido
alcanzada por el procedimiento de diálisis que se podría haber
realizado independientemente para cada muestra en cada punto de
interrupción. Los resultados demuestran que la dilución fue
equivalente a la diálisis.
Un experimento de control separado (véase la
Figura 10, más adelante) demostró que la dilución instántanea de
100 veces dio resultados casi idénticos a los del procedimiento de
diálisis. Estos experimentos de control demostraron que el
equilibrio reversible de la unión ribosa-proteína
(base de Schiff) es bastante rápido en esta escala de tiempo. Esto
se corresponde con los datos de Bunn and Higgins (1981,
Science 213: 222-224) que indicaron
que la semivida de formación de la base de Schiff con ribosa 0,5 M
debería ser del orden de unos minutos. El método de dilución rápida
de 100 veces para reducir la ribosa es un método válido en el que
la exactitud cuantitativa es esencial y no puede ser alcanzada por
la diálisis múltiple en muchas muestras.
El aumento de la velocidad de formación de AGE
después de la interrupción y dilución con azúcar da a entender,
aunque no prueba, que las altas concentraciones de ribosa inhiben
la reacción en el primer intermedio "estable" o después de él,
presumiblemente el derivado de Amadori (dentro de un recuadro en el
Esquema I). Se realizó entonces un ensayo de éste, por medio de
estudiar el efecto de añadir directamente ribosa, en la reacción
post-Amadori. Se incubó en primer lugar RNasa
durante 24 h en ribosa 0,5 M para preparar el intermedio. Se
siguieron entonces dos protocolos para medir la posible inhibición
de la formación post-Amadori de los AGE antigénicos
por diferentes concentraciones de ribosa. En el primer experimento,
la muestra tratada con ribosa 24 h, se diluyó simplemente 100 veces
en soluciones que contienen concentraciones finales variables de
ribosa que van desde 0,005 M a 0,505 M (Figura 10A). Se ve
claramente que la velocidad y grado de formación del AGE disminuyen
al aumentar las concentraciones de ribosa. De modo significativo,
hasta la concentración más alta de ribosa 0,5 M, la cinética aparece
como exponencial y no muestra el periodo de inducción que tiene
lugar con la glucosilación ininterrumpida (figuras 6A y 7A) en las
concentraciones altas de ribosa.
Se realizó también un segundo experimento (Figura
10B) en el cual la muestra interrumpida a las 24 h se dializó
extensamente en frío para liberar la ribosa libre y la ligada de
forma reversible así como todos los productos inhibidores que se
puedan haber formado durante la incubación de 24 h con ribosa.
Después de esto, se diluyeron alícuotas 100 veces en concentraciones
variables de la ribosa recientemente preparada, y se hizo
seguimiento como antes de la formación de los productos AGE
antigénicos. Los resultados fueron casi idénticos al experimento de
la Figura 10A en el que se omitió la etapa de diálisis. En ambos
casos, la velocidad y el grado de formación del AGE disminuyeron al
aumentar las concentraciones de ribosa, y la cinética aparece como
exponencial sin ningún periodo de inducción.
Se investigó también la cuestión de si la glucosa
u otros azúcares pueden inhibir también la formación de los AGE
desde el intermedio reactivo obtenido por la glucosilación
interrumpida en ribosa 0,5 M. Se ensayaron los efectos de la
glucosa a concentraciones de 1,0-2,0 M (no se
muestran los datos). Claramente, la glucosa no fue tan inhibidora
como la ribosa. Cuando la muestra interrumpida por ribosa a las 24
h se diluyó 100 veces en estas soluciones de glucosa, la cantidad
del AGE antigénico formado disminuyó en aproximadamente 30%, pero
hubo una disminución muy pequeña en la constante de velocidad
aparente. Una vez más, la cinética apareció como exponencial.
El método de glucosilación interrumpida se usó
para investigar la dependencia del pH de la cinética
post-Amadori de la formación de los AGE a partir del
intermedio reactivo. En estos experimentos, se hizo reaccionar en
primer lugar RNasa A durante 24 h con ribosa 0,5 M a pH 7,5 para
generar el intermedio reactivo. La cinética de la descomposición
del intermedio hasta los AGE se midió entonces por ELISA. La Figura
11 muestra que se alcanzó un intervalo de pH sumamente ancho de
5,0-9,5 cuando se midió la cinética por las
velocidades iniciales. Se observó una dependencia notable en forma
de campana, que demuestra que la cinética de formación de los AGE
antigénicos disminuye tanto en los intervalos de pH ácido como
alcalino, con un óptimo cerca de pH 8.
Se realizó también un único experimento de
"salto de pH" en la muestra de pH 5,0 estudiada antes que
tenía la más lenta velocidad de formación de AGE antigénico. Después
de 12 días a 37ºC en tampón de pH 5,0, se ajustó rápidamente el pH a
7,5 y se verificó la formación del AGE antigénico por el método
ELISA. Dentro del error experimental, la muestra presentó idéntica
cinética (la misma constante de velocidad de primer orden) de
formación de AGE que las muestras de glucosilación interrumpida que
se habían estudiado directamente a pH 7,5 (Figura 12). En este
experimento, las cantidades relativas del AGE antigénico no se
pudieron comparar directamente sobre la misma placa de ELISA, pero
la muestra con salto de pH pareció tener formados niveles
sustanciales aunque algo disminuidos de los AGE antigénicos. Estos
resultados demuestran que se puede preparar el intermedio libre de
AGE y conservarlo a pH 5 para estudios posteriores de conversión a
los AGE.
La eficacia de la aminoguanidina se ensayó por
este método de glucosilación interrumpida, esto es, ensayando su
efecto sobre la formación post-Amadori de los AGE
antigénicos después de separar el exceso de ribosa y de la ribosa
ligada de forma reversible. La Figura 20A demuestra que la
aminoguanidina tiene efectos modestos sobre el bloqueo de la
formación de AGE antigénicos en RNasa en estas condiciones, con
poca inhibición por debajo de 50 mM. Se consigue una inhibición de
aproximadamente 50% solamente a 100-250 mM o por
encima. Nótese de nuevo que en estos experimentos, la proteína fue
expuesta a la aminoguanidina solamente después de la interrupción y
separación de la ribosa libre y de la ligada de forma reversible. Se
obtuvieron también resultados comparables con la glucosilación
interrumpida de BSA (Figura 20B).
Se realizó el análisis de aminoácidos sobre RNasa
después de 24 h de contacto con ribosa 0,5 M (sin dializar),
después de una diálisis extensiva de las muestras glucosiladas 24
h, y después de 5 días de incubación de esta última muestra a 37ºC.
Estas determinaciones se hicieron después de la reducción con
cianoborohidruro de sodio, que reduce la base de Schiff presente en
las lisinas o grupos amino terminales. Las tres muestras,
normalizadas a alanina (12 residuos), mostraron el mismo contenido
de lisina residual (4,0 \pm 0,5 además del original 10 en RNasa).
Esto indica que después de 24 h de contacto con ribosa 0,5 M, la
mayor parte de los aductos de base de Schiff formados habían sido
convertidos en productos de Amadori o subsiguientes. No se perdieron
residuos de arginina ni histidina por la modificación.
\newpage
El uso de ribosa que reacciona rápidamente y el
descubrimiento de su inhibición reversible de las etapas
post-Amadori han permitido el análisis y
determinación de la cinética de las diferentes etapas de
glucosilación de proteínas en RNasa. La mayor parte de los estudios
cinéticos previos de la "glucosilación" de proteínas han sido
realmente restringidos a las etapas "iniciales" de formación de
la base de Schiff y subsiguiente reordenamiento de Amadori. Se han
realizado algunos estudios cinéticos empezando con fructosilaminas
sintetizadas, esto es, pequeños modelos de compuestos de Amadori de
glucosa (Smith and Thornalley, 1992, Eur. J. Biochem.
210: 729-739, y las referencias citadas
allí), pero tales estudios, con pocas excepciones, no han sido
posibles previamente con proteínas. Una notable excepción es la
demostración de Monnier (Odetti et al., 1992, citado antes)
de que la BSA parcialmente glucosilada con ribosa puede producir
rápidamente pentosidina después de la separación de la ribosa. La
mayor reactividad de la ribosa ha demostrado también una ventaja
clara para definir cuantitativamente el tiempo de formación de los
AGE. Se observa que la glucosa y la ribosa son capaces ambas de
producir productos AGE similares, tales como pentosidina (Grandhee
& Monnier, 1991, citado antes; Dyer et al., 1991, citado
antes) y se ha realizado algún trabajo con el compuesto modelo para
^{13}C NMR con ADP-ribosa
(Cervantes-Laurean et al., 1993,
Biochemistry 32: 1528-1534). El
presente trabajo demuestra que los AGE antigénicos productos de la
ribosa reaccionan completamente de forma cruzada con los
anticuerpos anti-AGE dirigidos frente a las
proteínas modificadas con glucosa, lo que da a entender que la
ribosa y la glucosa producen similares AGE antigénicos. Las
principales diferencias cinéticas observadas entre estos dos
azúcares son debidas probablemente a diferencias relativas en las
constantes de velocidad de las etapas que llevan a la formación de
los AGE post-Amadori, en lugar de diferencias en el
mecanismo.
Los resultados presentados revelan una inhibición
marcada y paradójica de la formación global de los AGE por altas
concentraciones de ribosa (Figura 6) que no ha sido prevista en
estudios anteriores. Esta inhibición es rápidamente reversible
hasta el punto de que se separa por diálisis de la proteína
modificada inicialmente (Figura 7A) o por dilución simple de 100
veces (como se usa en la Figura 11). Los experimentos de la Figura
10 demuestran que no es debida a la acumulación de intermedios
inhibidores dializables durante la glucosilación inicial, ya que la
diálisis de la proteína modificada a las 24 h seguida por la
adición de diferentes concentraciones de ribosa fresca induce la
misma inhibición. Los datos de la Figura 10A,B demuestran que la
inhibición tiene lugar por la interacción reversible y rápida de la
ribosa con el intermedio de proteína que contiene los productos de
Amadori reactivos. Es improbable que la inhibición se aplique a las
etapas iniciales de formación del producto de Amadori debido a la
rápida velocidad de formación del supuesto intermedio de Amadori
que se determinó en el experimento de la Figura 9. La
identificación del intermedio reactivo como un producto de Amadori
está bien confirmada por el análisis de aminoácidos realizado
(después de reducción con cianoborohidruro de sodio) antes y
después de la diálisis en el punto de interrupción de 24 h. El
contenido de lisina residual no cambiada indica que todas las bases
de Schiff separables han sido convertidas ya de forma irreversible
(probablemente por reordenamiento de Amadori) a las 24 h.
La supresión de ribosa secundaria de las
"últimas" etapas de glucosilación pero no de las
"iniciales" aumenta significativamente la acumulación de un
intermedio de Amadori reactivo totalmente competente que contiene
poco AGE. Su aislamiento por el procedimiento de la interrupción es
de importancia para los estudios cinéticos y estructurales, ya que
permite que se realicen estudios en ausencia de azúcar libre o de
azúcar ligado a una base de Schiff y sus reacciones y complicaciones
asociadas. Por ejemplo, se han medido las velocidades de conversión
post-Amadori hasta los AGE antigénicos y productos
AGE de pentosidina (Figura 7A, símbolos vacíos, y Figura 8B), y han
demostrado ser mucho más rápidas (t ½ \sim 10 h) que las
reflejadas en la cinética global en condiciones de ininterrupción
(Figura 6A y Figura 8A). La rápida formación de pentosidina que fue
medida parece de acuerdo con un experimento anterior interrumpido
con ribosa sobre BSA realizado por Odetti et al., (1992,
citado antes). Puesto que la ribosa y derivados tales como
ADP-ribosa son metabolitos normales, las
velocidades muy altas de formación de los AGE observadas aquí dan a
entender que se deben considerar más seriamente como fuentes de
glucosilación potencial en diferentes compartimentos celulares
(Cervantes-Laurean et al., 1993, citado
antes), incluso aunque sus concentraciones estén muy por debajo de
las de la glucosa menos reactiva.
Otra nueva aplicación del aislamiento del
intermedio está en el estudio de la dependencia del pH de esta
compleja reacción. El perfil inusual de pH en forma de campana
observado en la formación post-Amadori de los AGE
(Figura 11) está en sorprendente contraste con la dependencia
moderada del pH de la reacción global. La cinética de esta última
refleja un efecto compuesto del pH en todas las etapas de la
reacción, incluyendo la formación de bases de Schiff y productos de
Amadori, cada uno de los cuales puede tener una dependencia
excepcional del pH. Esta complejidad está especialmente bien
ilustrada por los estudios de glucosilación de la hemoglobina
(Lowery et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:
11611-11618). El perfil de pH en forma de campana
da a entender, aunque no prueba, la implicación de dos grupos
ionizantes. Si fuera cierto, los datos pueden implicar la
participación de un segundo grupo amino, tal como el procedente de
una lisina vecina, en la formación de los AGE antigénicos
dominantes. El perfil de pH observado y las observaciones sobre el
salto de pH descritas, dan a entender que una ruta útil para aislar
y mantener el intermedio reactivo podría ser la rápida bajada del
pH hasta cerca de 5,0 después de interrupción a las 24 h.
Los estudios cinéticos proporcionan nuevos
conocimientos sobre los mecanismos de acción de la aminoguanidina
(guanilhidrazina), un inhibidor de los AGE propuesto por Cerami y
colaboradores para combinarse con los intermedios de Amadori
(Brownlee et al., 1986, citado antes). Este agente farmacológico
propuesto está ahora en ensayos clínicos de Fase III para posibles
efectos terapéuticos en el tratamiento de la diabetes (Vlassara
et al., 1994, citado antes). Sin embargo, su mecanismo de
inhibición de los AGE es probable que sea bastante complejo, puesto
que es multifuncional. Como una hidrazina nucleófila, se puede
añadir de forma reversible a los carbonilos activos, incluyendo los
aldehído-carbonilos de cadena abierta glucosa y
ribosa (Khatami et al., 1988, Life Sci. 43:
1725-1731; Hirsch et al., 1995, Carbohyd.
Res. 267: 17-25), así como los
ceto-carbonilos de los compuestos de Amadori. Es
también un compuesto de guanidinio que puede captar los intermedios
de la glucosilación de dicarbonilo altamente reactivos tales como
glioxal y glucosonas (Chen & Cerami, 1993, J. Carbohyd.
Chem. 12: 731-742; Hirsch et al.,
Carbohyd. Res. 232: 125-130; Ou &
Wolff, 1993, Biochem. Pharmacol. 46:
1139-1144). El método de glucosilación interrumpida
permitió el examen de la eficacia de la aminoguanidina solamente en
las etapas post-Amadori de la formación de los AGE.
Igualmente importante, el mismo método permitió los estudios en
ausencia de azúcar libre o de fragmentos reactivos con dicarbonilo
procedentes de azúcar libre (Wolff & Dean, 1987, Biochem.
J. 245: 243-250;
Wells-Knecht et al., 1995,
Biochemistry 34: 3702-3709) que puede
combinarse con la aminoguanidina. Los resultados de la Figura 20
demuestran que la aminoguanidina tiene, como mucho, sólo un efecto
modesto sobre las reacciones de formación de los AGE
post-Amadori, alcanzando 50% de inhibición a
concentraciones por encima de 100-250 mM. La
eficacia de la aminoguanidina resulta por tanto predominantemente o
bien de inhibir las etapas iniciales de la glucosilación (formación
de bases de Schiff) o bien de captar los dicarbonilos altamente
reactivos generados durante la glucosilación. En contra de las
reivindicaciones originales, no parece que inhiba la formación de
los AGE por formar un complejo con el intermedio de Amadori.
El uso de la glucosilación interrumpida no está
limitado para los estudios cinéticos. La glucosilación interrumpida
puede simplificar los estudios estructurales de las proteínas
glucosiladas e identificar los AGE desconocidos usando técnicas
tales como ^{13}C NMR que ha sido usada para detectar aductos de
Amadori de la RNasa (Neglia et al., 1983, J. Biol.
Chem. 258: 14279-14283; 1985, J. Biol.
Chem. 260: 5406-5410). El uso combinado
de los métodos estructurales y cinéticos debe ser también de
especial interés. Por ejemplo, aunque sigue sin aclarar la
identidad de los AGE antigénicos dominantes que reaccionan con los
anticuerpos policlonales, los AGE candidatos, tales como el
recientemente propuesto (carboximetil)lisina (Reddy et
al., 1995, Biochemistry 34:
10872-10878; véase Makita et al., 1992, J.
Biol. Chem. 267: 5133-5138), deben
presentar la misma cinética de formación a partir del intermedio
reactivo que la observada en esta invención. La disponibilidad del
método de cinética interrumpida ayudará también a determinar la
importancia de la ruta Amadori para la formación de este AGE.
Similarmente, el hacer seguimiento de la reacción de glucosilación
interrumpida por técnicas tales como ^{13}C NMR debe identificar
las resonancias de otros AGE antigénicos candidatos como los que
presentan cinéticas similares de apariencia. La Tabla I lista los
picos de ^{13}C NMR de los intermedios de Amadori de RNasa
preparados por reacción con ribosa enriquecida en
C-2. El pico desplazado hacia abajo próximo a 205
ppm es probablemente debido al carbonilo del producto de Amadori. En
todos los casos, la capacidad para eliminar el exceso de azúcares
libres y ligados a bases de Schiff a través de la glucosilación
interrumpida simplificará considerablemente el aislamiento,
identificación y caracterización estructurales.
La Tabla I lista los picos que fueron asignados a
los intermedios post- Amadori debido a su intensidad invariable o
decreciente con el tiempo. Las posiciones de los picos se indican
en ppm de desplazamiento desde tetrametilsilano (TMS).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\hskip1cm 216,5 \+ \hskip1cm ppm
\+ \hskip1cm 108,5 \+ \hskip1cm ppm\cr
\hskip1cm 211,7 \+ \hskip1cm
\+ \hskip1cm 105,9\+\cr \hskip1cm 208
\+ \hskip1cm \+ \hskip1cm 103,9\+\cr
\hskip1cm \+ \hskip1cm \+ \hskip1cm
103\+\cr \hskip1cm 172 \+ \hskip1cm
\+ \hskip1cm 95,8\+\cr \hskip1cm 165\+\+\+\cr
\hskip1cm 163,9 \+ \hskip1cm
\+ \hskip1cm 73,65\+\cr \hskip1cm 162,1
\+ \hskip1cm \+ \hskip1cm 70,2\+\cr
\hskip1cm \+ \hskip1cm \+ \hskip1cm
69,7\+\cr}
Se hizo reaccionar la ribonucleasa A durante 24 h
con solución 0,5 M de ribosa del 99% enriquecida en
C-2, y a continuación se separó el exceso de ribosa
y la ribosa ligada a la base de Schiff por diálisis extensiva en
frío. La muestra se volvió a calentar entonces a 37ºC
inmediatamente antes de hacer un barrido de 2 h por NMR. Las señales
de la RNasa que había reaccionado con la ribosa de afluencia natural
en idénticas condiciones se restaron entonces del espectro de NMR.
De este modo, todos los picos mostrados son debidos al
C-13 enriquecido que se origina en la posición
C-2. Algunos de los picos surgen de los productos de
degradación del intermedio, y estos se pueden identificar por el
aumento en la intensidad del pico a lo largo del tiempo. La Figura
31 muestra el espectro NMR obtenido.
El método de glucosilación interrumpida para la
siguiente cinética post-Amadori de formación de los
AGE, permite el estudio cuantitativo rápido de la "últimas"
etapas de la reacción de glucosilación. De forma importante, este
método permite estudios de inhibición que están libres de rutas de
formación de los AGE que surgen de los productos glucoxidativos del
azúcar libre o base de Schiff (ruta de Namiki) como se ilustra en
el Esquema I. Por tanto el método de glucosilación interrumpida
permite la identificación y caracterización rápidas y excepcionales
de los inhibidores de las "últimas" etapas de glucosilación
que llevan a la formación de los AGE antigénicos.
Entre los derivados de las vitaminas B_{1} y
B_{6} examinados, la piridoxamina y el pirofosfato de tiamina son
inhibidores excepcionales de la ruta post-Amadori de
formación de los AGE. De forma importante, se ha encontrado que la
eficacia de inhibición de la glucosilación global de la proteína,
en presencia de altas concentraciones de azúcar, no es predictiva
de la capacidad para inhibir las etapas post-Amadori
de formación de los AGE cuando se separa el azúcar libre. Por
tanto, aunque la piridoxamina, pirofosfato de tiamina y
aminoguanidina son inhibidores potentes de la formación de los AGE
en la glucosilación global de la proteína por la glucosa, la
aminoguanidina difiere de las otras dos en que no es un inhibidor
eficaz de la formación de los AGE post-Amadori. La
aminoguanidina reduce marcadamente la velocidad inicial de formación
de AGE por la ribosa en condiciones ininterrumpidas, pero no tiene
ningún efecto sobre los niveles finales de los AGE antigénicos
producidos. El examen de diferentes proteínas (RNasa, BSA y
hemoglobina), confirmó que los resultados de inhibición generalmente
no son específicos de la proteína usada, incluso aunque haya
variaciones individuales en las velocidades de formación e
inhibición de los AGE.
Como en el Ejemplo 1 anterior.
Como en el Ejemplo 1 anterior.
Como en el Ejemplo 1 anterior.
Se incubaron seroalbúmina bovina, ribonucleasa A,
y hemoglobina humana con ribosa a 37ºC en solución tampón de fosfato
de sodio 0,4 M de pH 7,5 que contiene 0,02% de aziduro de sodio. La
proteína (10 mg/ml o 1 mg/ml), la ribosa 0,05 M, y los inhibidores
prospectivos (a concentraciones 0,5, 3, 15 y 50 mM) se introdujeron
simultáneamente en la mezcla de incubación. Se mantuvieron las
soluciones en la oscuridad en tubos tapados. Se tomaron alícuotas y
se congelaron inmediatamente hasta que se analizaron por ELISA al
terminar la reacción. Las incubaciones duraron 3 semanas (Hb) o 6
semanas (RNasa, BSA). Se hizo seguimiento de las reacciones de
glucosilación en cuanto a pH constante a lo largo de la duración de
los experimentos.
Se realizó en primer lugar la glucosilación
incubando la proteína (10 mg/ml) con ribosa 0,5 M a 37ºC en
solución tampón de fosfato de sodio 0,4 M de pH 7,5 que contiene
0,02% de aziduro de sodio, durante 24 h en ausencia de inhibidores.
Se interrumpió entonces la glucosilación para separar el exceso de
azúcar y el azúcar ligado de forma reversible (base de Schiff), por
diálisis extensiva frente a cambios frecuentes de tampón frío a
4ºC. Las muestras intermedias glucosiladas que contienen la máxima
cantidad de producto de Amadori y poco AGE (dependiendo de la
proteína) se calentaron entonces rápidamente a 37ºC sin volver a
añadir ribosa. Esto inició la conversión de los intermedios de
Amadori a productos AGE en ausencia o presencia de diferentes
concentraciones (típicamente, 3, 15 y 50 mM) de inhibidores
prospectivos. Se tomaron alícuotas a diferentes intervalos y se
congelaron para posterior análisis. Las soluciones se mantuvieron
en tubos cerrados que se abrieron solamente para separar alícuotas
programadas que fueron inmediatamente congeladas para realizar
después los diferentes análisis.
Los datos cinéticos (curvas de progresión en el
tiempo) se ajustaron rutinariamente a funciones mono- o
bi-exponenciales usando métodos no lineales de los
mínimos cuadrados utilizando los programas SCIENTIST 2.0 (MicroMath,
Inc.) o ORIGIN (Microcal, Inc.) que permiten funciones definidas
por el usuario y control de los parámetros a ser repetidos. Las
desviaciones estándar de los parámetros de las funciones ajustadas
(valores de la ordenada iniciales y finales y constantes de
velocidad) se presentaron de nuevo como medidas de la precisión de
los ajustes. Las semividas aparentes para los ajustes
bi-exponenciales de la cinética se determinaron con
la función "solve" del programa MathCad (MathSoft, Inc.).
Los efectos inhibidores de los derivados de las
vitaminas B_{1} y B_{6} sobre la cinética de formación de los
AGE antigénicos se evaluaron por anticuerpos policlonales
específicos para los AGE. Los estudios de la inhibición inicial se
realizaron sobre la glucosilación de ribonucleasa A (RNasa) bovina
en presencia continua de ribosa 0,05 M, que es la concentración de
ribosa a la que la velocidad de formación del AGE es casi máxima.
La Figura 13 (curvas de control, rectángulos rellenos) demuestra que
la formación de los AGE antigénicos sobre la RNasa cuando se incuba
con ribosa 0,05 M es relativamente rápida, con una semivida de
aproximadamente 6 días en estas condiciones. El
piridoxal-5'-fosfato (Figura 13B) y
el piridoxal (Figura 13C) inhibieron significativamente la
velocidad de formación del AGE sobre la RNasa a concentraciones de
50 mM y 15 mM. De forma sorprendente, la piridoxina, la forma
alcohol de la vitamina B_{6}, también inhibió moderadamente la
formación de AGE sobre la RNasa (Figura 13D). De los derivados de
B_{6} examinados, la piridoxamina a 50 mM fue el mejor inhibidor
de los niveles "finales" del AGE formado sobre la RNasa durante
el periodo de 6 semanas en que se hizo seguimiento (Figura
13A).
Todos los vitámeros B_{1} inhibieron la
formación de los AGE antigénicos sobre la RNasa a altas
concentraciones, pero la inhibición pareció más compleja que para
los derivados de la vitamina B_{6} (Figura 13A-C).
En el caso de pirofosfato de tiamina como inhibidor (Figura 14A),
tanto la velocidad de formación de los AGE como los niveles finales
de AGE producidos en la meseta aparecieron disminuidos. En el caso
de fosfato de tiamina como inhibidor (Figura 14B), y tiamina
(Figura 14C), parecieron tener poco efecto sobre la velocidad de
formación de los AGE, aunque una disminución sustancial en el nivel
final del AGE formado en presencia de la concentración más alta del
inhibidor. En general, el pirofosfato de tiamina demostró mayor
inhibición que los otros dos compuestos, en las concentraciones más
bajas examinadas.
La inhibición de la formación de AGE por
aminoguanidina (Figura 14D) fue claramente diferente de la observada
en los experimentos con B_{1} y B_{6}. El aumento de la
concentración de aminoguanidina disminuyó la velocidad de formación
de AGE sobre la RNasa, pero no redujo el nivel final del AGE
formado. El nivel final del AGE formado después de 6 semanas fue
casi idéntico al del control para todas las concentraciones de
aminoguanidina ensayadas.
Se realizaron estudios comparativos con BSA y
metahemoglobina humana (Hb) para determinar si la inhibición
observada era o no específica de la proteína. Los diferentes
derivados de vitamina B_{6} (Figura 15A-D) y de
vitamina B_{1} (Figura 16A-C) presentaron
tendencias de inhibición similares cuando se incubaron con BSA que
cuando lo hicieron con RNasa, siendo la piridoxamina y el
pirofosfato de tiamina los inhibidores más eficaces de cada
familia. La piridoxina falló en inhibir la formación de los AGE
sobre la BSA (Figura 15D). El piridoxal-fosfato y el
piridoxal (Figura 15B-C) inhibieron principalmente
la velocidad de formación del AGE pero no los niveles finales de
los AGE formados. La piridoxamina (Figura 15A) presentó algo de
inhibición a las concentraciones más bajas, y a la concentración
más alta ensayada pareció que inhibía los niveles finales de los
AGE formados de forma más eficaz que cualquiera de los otros
derivados de B_{6}. En el caso de los derivados de B_{1}, la
extensión global de la inhibición de la formación de AGE con BSA
(Figura 16A-C), fue menor que la observada con RNasa
(Figura 14A-C). Las concentraciones más altas de
tiamina y pirofosfato de tiamina inhibieron los niveles finales de
los AGE formados, sin afectar grandemente a la velocidad de
formación de los AGE (Figura 16C). La aminoguanidina presentó de
nuevo los mismos efectos de inhibición con BSA que los vistos con
RNasa (Figura 16D), pareciendo que reduce la velocidad de formación
del AGE, sin afectar grandemente a los niveles finales del AGE
formado.
Se examinó también la cinética de formación de
AGE usando Hb en presencia de los derivados de las vitaminas
B_{6} y B_{1}, y aminoguanidina. Las velocidades absolutas
aparentes de formación de AGE fueron significativamente más altas
con Hb que con RNasa o BSA. Sin embargo, los inhibidores ensayados
mostraron un comportamiento esencialmente similar. Los efectos de
los derivados de la vitamina B_{6} se muestran en la Figura 17.
La piridoxamina mostró la mayor inhibición a concentraciones de 3 mM
o superiores (Figura 17A), y fue la más eficaz en comparación con
el piridoxal-fosfato (Figura 17B), piridoxal (Figura
17C) y piridoxina (Figura 17D). En el caso de los derivados de la
vitamina B_{1} (no se muestran datos), los efectos inhibidores
fueron más similares para las tendencias de inhibición en BSA que
en RNasa. La inhibición fue solamente moderada en las
concentraciones más altas ensayadas (50 mM), siendo casi de
30-50% para los tres derivados de la vitamina
B_{1}. La manifestación principal de inhibición fue la reducción
de los niveles finales de los AGE formados.
\newpage
Usando el modelo de glucosilación interrumpida
para ensayar la inhibición de la "última" formación de los AGE
post-Amadori, se examinó la cinética incubando
intermedios de Amadori aislados ya sea de RNasa o ya sea de BSA a
37ºC en ausencia de ribosa libre o ligada de forma reversible. El
azúcar ribosa que se usó inicialmente para preparar los intermedios
se separó por diálisis en frío después de un periodo inicial de la
reacción de glucosilación de 24 h. Una vez que se permite reanudar
la formación de AGE, la formación de AGE es bastante rápida
(semividas de aproximadamente 10 h) en ausencia de cualquier
inhibidor. La Figura 18 muestra los efectos de la piridoxamina
(Figura 18A), piridoxal-fosfato (Figura 18B) y
piridoxal (Figura 18C) sobre la cinética
post-Amadori de BSA. La piridoxina no produjo
ninguna inhibición (no se muestran datos). Se realizaron
experimentos similares sobre RNasa. La piridoxamina produjo una
inhibición casi completa de la formación de AGE con RNasa a
concentraciones 15 mM y 50 mM (Figura 18D). El piridoxal no presentó
ninguna inhibición significativa a concentración 15 mM (la más alta
ensayada), pero el piridoxal- fosfato presentó una inhibición
significativa a concentración 15 mM. Es sabido que el
piridoxal-fosfato es capaz de marcar por afinidad el
sitio activo de la RNasa (Raetz and Auld, 1972, Biochemistry
11: 2229-2236).
Con la BSA, al contrario que con la RNasa, se
formó una cantidad importante de AGE antigénico durante la
incubación inicial de 24 h con RNasa (25-30%), como
se puede ver por las lecturas más altas en ELISA después de la
separación de la ribosa en el tiempo cero, en las figuras
18A-C. Tanto para la BSA como para la RNasa, la
inhibición, cuando se observa, parece manifestarse como una
disminución de los niveles finales del AGE formado antes que como
una disminución de la velocidad de formación del AGE.
El pirofosfato de tiamina inhibió la formación de
los AGE más efectivamente que los otros derivados de la vitamina
B_{1} tanto con RNasa como con BSA (Figura 19). La tiamina no
mostró ningún efecto, mientras que el fosfato de tiamina mostró
algún efecto intermedio. Igual que en los ensayos con B_{6}, la
inhibición post-Amadori se manifestó más claramente
como una disminución de los niveles finales del AGE formado.
La Figura 20 muestra los resultados de los
ensayos de aminoguanidina en cuanto a la inhibición de la cinética
de formación post-Amadori de los AGE tanto con BSA
como con RNasa. A una concentración 50 mM, la inhibición fue de
aproximadamente 20% en el caso de BSA (Figura 20B) y menos de 15%
con RNasa (Figura 20A). La posibilidad de inhibición por las
funcionalidades que contienen un simple amino se ensayó también
usando
N^{\alpha}-acetil-L-lisina
(Figura 21), que contiene solamente un grupo
N^{\varepsilon}-amino libre. La
N^{\alpha}-acetil-L-lisina
en concentraciones hasta 50 mM, no presentó ninguna inhibición
significativa de la formación de AGE.
Numerosos estudios han demostrado que la
aminoguanidina es un inhibidor claramente potente de muchas
manifestaciones de la glucosilación no enzimática (Brownlee et
al., 1986; Brownlee, 1992, 1994, 1995). Los efectos inhibidores
de la aminoguanidina sobre diferentes fenómenos que son inducidos
por los azúcares reductores se consideran generalmente como una
prueba de la implicación de la glucosilación en muchos de tales
fenómenos. La aminoguanidina ha entrado recientemente en una segunda
ronda de ensayos clínicos de Fase III (como pimagedina) para
mejorar las complicaciones de la diabetes que se piensa que son
causadas por la glucosilación de las proteínas del tejido
conjuntivo debido a altos niveles de azúcar.
Los datos del estudio cinético de la formación
ininterrumpida "lenta" de los AGE con RNasa inducida por la
glucosa (Ejemplo 1) confirmaron que la aminoguanidina es un
inhibidor eficaz, y además identificaron una serie de derivados de
las vitaminas B_{1} y B_{6} como inhibidores igualmente
eficaces o ligeramente más eficaces. Sin embargo, la inhibición por
aminoguanidina, de forma inesperada pareció que disminuía
efectivamente en las últimas etapas de la reacción de formación de
AGE. Debido a la lentitud de la glucosilación de la proteína con la
glucosa, esta observación sorprendente podría no estar
completamente examinada. Además, se ha sugerido que puede haber
dudas acerca de la estabilidad a largo plazo de la aminoguanidina
(Ou and Wolff, 1993, citado antes).
El análisis que usa la glucosilación por ribosa
mucho más rápida permitió que fuera completamente observado y
cuantificado el tiempo completo de formación de los AGE durante la
glucosilación ininterrumpida de la proteína. El uso de la
glucosilación interrumpida permitió excepcionalmente el posterior
aislamiento y examen solamente de la formación de los AGE
antigénicos post-Amadori en ausencia de ribosa libre
y ribosa ligada de forma reversible (base de Schiff). La
comparación de los datos de estos dos métodos con la anterior
cinética de la glucosilación con glucosa ha proporcionado nuevos
conocimientos de los mecanismos y eficacia de diferentes
inhibidores. La Figura 22 muestra gráficos de barras que
representan datos comparativos resumidos del porcentaje de
inhibición a puntos de tiempo definidos usando diferentes
concentraciones de inhibidor. La Figura 22A representa los datos de
la inhibición de la formación de los AGE por ribosa después de la
glucosilación interrumpida de BSA. La Figura 22B representa los
datos de la inhibición de la formación de los AGE por ribosa,
después de la glucosilación interrumpida de RNasa.
Los resultados globales demuestran sin ambigüedad
que la aminoguanidina hace más lenta la velocidad de formación del
AGE antigénico post-Amadori en presencia de azúcar
pero tiene poco efecto sobre la cantidad final del AGE
post-Amadori formado. Por tanto, las observaciones
limitadas solamente a las etapas "iniciales" de formación de
AGE que indican su eficacia como inhibidor pueden de hecho ser
malinterpretadas como la verdadera eficacia de inhibición de la
formación de AGE post-Amadori. Por tanto, la
capacidad de observar el curso completo de la reacción que usa
glucosa y glucosilación interrumpida, da una imagen más completa de
la eficacia de la inhibición de la formación de AGE
post-Amadori.
La hiperglucemia puede ser rápidamente inducida
(dentro de uno o dos días) en las ratas por la administración de
estreptozocina (conocida también como estreptozotocina, STZ) o
aloxano. Éstas se han convertido en un modelo común de la diabetes
mellitus. Sin embargo, estas ratas manifiestan nefropatía solamente
después de muchos meses de hiperglucemia, y usualmente justo antes
de la muerte por enfermedad renal terminal (ESRD). Se cree que esta
patología es causada por la modificación química irreversible por la
glucosa de las proteínas de larga duración tales como el colágeno
de la membrana basal. Las ratas diabéticas por STZ presentan
albuminuria muy tardía después de la inducción de la hiperglucemia,
en aproximadamente 40 semanas y usualmente sólo justo antes de la
muerte.
A causa de los efectos dramáticos rápidos de la
ribosa demostrados in vitro en los ejemplos anteriores, se
decidió examinar los efectos de la administración de ribosa a las
ratas, y la posible inducción de los AGE por la glucosilación rápida
con ribosa. De este estudio, se ha desarrollado un modelo de rata
para patología acelerada inducida por ribosa.
Protocolo de Fase
I
Se administró a cada uno de dos grupos de seis
ratas, en un día, cualquiera de las dos opciones siguientes:
a. ribosa 300 mM (dos infusiones
intraperitoneales separadas por 6-8 horas,
representando cada una el 5% del peso corporal en ml); o
b. ribosa 50 mM (una infusión).
Se mantuvieron entonces las ratas durante 4 días
sin ninguna administración adicional de ribosa, a cuyo tiempo se
sacrificaron y se determinaron las siguientes medidas fisiológicas:
(i) peso corporal inicial y final; (ii) peso de los riñones en la
etapa final; (iii) tensión sanguínea inicial y final en el manguito
de la cola; (iv) aclaramiento de creatinina por 100 g de peso
corporal.
No se midieron las velocidades de filtración de
la albúmina, puesto que inicialmente no se esperaban cambios
rápidos. La pasada experiencia con ratas diabéticas por STZ
demuestra que la albuminuria se desarrolla muy tarde (alrededor de
40 semanas) después de la inducción de la hiperglucemia y justo
antes de que los animales mueran.
a. El peso corporal final y el peso final de un
único riñón fue el mismo para los grupos de tratamiento con ribosa
alta y baja.
b. La tensión sanguínea en el manguito de la cola
aumentó desde 66 \pm 4 hasta 83 \pm 3 para las ratas tratadas
con ribosa baja (1 x 50 mM), y desde 66 \pm 4 hasta 106 \pm 5
para las ratas tratadas con ribosa alta (2 x 300 mM). Estos
resultados se muestran en el gráfico de barras de la Figura 23.
c. El aclaramiento de creatinina, como cc por 100
g de peso corporal, disminuyó (intervalo normal esperado,
aproximadamente 1,0-1,2) en una forma dosis-
dependiente hasta 0,87 \pm 0,15 para el grupo con ribosa baja, y
disminuyó aún 30% más hasta 0,62 \pm 0,13 para el grupo con
ribosa alta. Estos resultados se muestran en el gráfico de barras
de la Figura 24.
El tratamiento de un sólo día con ribosa causó
una hipertensión dosis- dependiente y una disminución
dosis-dependiente de la función de aclaramiento
glomerular que se manifestaron 4 días más tarde. Estos son cambios
metabólicos importantes de la diabetes observados sólo mucho más
tarde en las ratas diabéticas por STZ. Se puede suponer que estos
fenómenos son debidos a la modificación química irreversible por la
ribosa (glucosilación) de la proteína in vivo.
\newpage
Protocolo de Fase
II
Se administró intraperitonealmente a grupos de
ratas (3-6), "dosis bajas de ribosa" 0,3 M
(LR) o "dosis altas de ribosa" 1,0 M (HR) por dos inyecciones
diarias durante cualquiera de los tiempos siguientes: (i) 1 día,
(ii) un "corto plazo" (S) de 4 días, o (iii) un "largo
plazo" (L) de 8 días. Adicionalmente, estas concentraciones de
ribosa se incluyeron en el agua de beber.
a. La tensión sanguínea en el manguito de la cola
aumentó en todos los grupos de ratas tratadas con ribosa,
confirmando los resultados de la Fase I (Figura 23).
b. El aclaramiento de creatinina disminuyó en
todos los grupos en una forma dosis-dependiente y
tiempo-dependiente (Figura 24).
c. La velocidad de efusión de la albúmina (AER)
aumentó notablemente en una forma
ribosa-dependiente en las exposiciones de 1 día y de
4 días. Sin embargo, presentó alguna recuperación a los 8 días en
comparación con los 4 días en el grupo de dosis alta pero no en el
grupo de dosis baja. Estos resultados se muestran en el gráfico de
barras de la Figura 25.
d. El aclaramiento de creatinina por 100 g de
peso corporal disminuyó para ambos grupos, el de ribosa baja y el
de ribosa alta en aproximadamente la misma extensión de una manera
tiempo-dependiente (Figura 24).
La exposición a la ribosa durante tan poco tiempo
como 4 días lleva a la hipertensión y a la disfunción renal, como se
manifiesta tanto por la disminución del aclaramiento de creatinina
como por el aumento de la filtración de albúmina. Estos cambios son
típicos de la diabetes y se observan mucho más tarde en las ratas
diabéticas por STZ.
Protocolo de Fase
III
Se distribuyeron al azar sesenta ratas en 9
grupos diferentes, que incluyen los expuestos a ribosa 1 M durante
8 días en presencia y ausencia de aminoguanidina, piridoxamina, y
pirofosfato de tiamina, como sigue:
Grupos
testigo
- (i) sin tratamiento;
- (ii) dosis alta de piridoxamina ("compuesto P") (250 mg/kg de peso corporal);
- (iii) dosis alta de pirofosfato de tiamina ("compuesto T" o "TPP") (250 mg/kg de peso corporal); y
- (iv) dosis baja de aminoguanidina ("AG") (25 mg/kg de peso corporal).
Grupos de
ensayo
- (i) solamente ribosa 1 M en solución salina (2 x 9 cc diariamente intraperitonealmente durante 8 días);
- (ii) ribosa más dosis baja ("LP") de piridoxamina (25 mg/kg de peso corporal inyectados como 0,5 ml con 9 cc de ribosa);
- (iii) ribosa más dosis alta ("HP") de piridoxamina (250 mg/kg de peso corporal inyectados como 0,5 ml con 9 cc de ribosa);
- (iv) ribosa más dosis alta ("HT") de pirofosfato de tiamina (250 mg/kg de peso corporal inyectados como 0,5 ml con 9 cc de ribosa);
- (v) ribosa más dosis baja de aminoguanidina (25 mg/kg de peso corporal inyectados como 0,5 ml con 9 cc de ribosa).
Al contrario que en la Fase II, no se administró
ribosa en el agua de beber. Los compuestos de intervención fueron
pre-administrados un día antes de introducirlos con
la ribosa.
a. La tensión sanguínea aumentó muy ligeramente
con los tres compuestos solos (grupo testigo); la tensión sanguínea
(BP) elevada por la ribosa no mejoró por la coadministración de los
compuestos. Estos resultados se muestran en el gráfico de barras de
la Figura 26.
b. El aclaramiento de creatinina de los testigos
permaneció sin cambios, excepto para el TPP que lo hizo
disminuir.
c. El aclaramiento de creatinina se normalizó
cuando la ribosa fue coadministrada con la dosis baja (25 mg/kg)
bien de aminoguanidina o bien de piridoxamina. Estos resultados se
muestran en el gráfico de barras de la Figura 27.
d. Las altas concentraciones (250 mg/kg) de
piridoxamina y TPP mostraron solamente una protección parcial frente
a la disminución del aclaramiento de creatinina inducida por la
ribosa (Figura 27).
e. La velocidad de efusión de la albúmina (AER)
aumentó por la ribosa, así como por las dosis altas de piridoxamina
y TPP, y por la dosis baja de aminoguanidina en ausencia de ribosa.
Estos resultados se muestran en el gráfico de barras de la Figura
28.
f. La velocidad de efusión de la albúmina se
restableció hasta valores normales por la coadministración de dosis
bajas tanto de aminoguanidina como de piridoxamina. Estos
resultados se muestran en el gráfico de barras de la Figura 29.
Cuando se miden por los dos signos de la función
renal, la piridoxamina y aminoguanidina, ambas a 25 mg/kg, fueron
claramente eficaces, y en igual grado, para prevenir la disminución
del aclaramiento de creatinina inducida por la ribosa y el aumento
moderado de la albuminuria inducido por la ribosa.
(i) El pirofosfato de tiamina no fue ensayado a
25 mg/kg; (ii) el pirofosfato de tiamina y la piridoxamina a 250
mg/kg fueron parcialmente eficaces para prevenir las disminuciones
del aclaramiento de creatinina pero posiblemente no para prevenir
la proteinuria moderada; (iii) en estas concentraciones muy altas y
en ausencia de ribosa, el pirofosfato de tiamina solo produjo una
disminución del aclaramiento de creatinina y ambos produjeron
aumentos moderados de la albuminuria.
La hiperglucemia persistente en la diabetes
mellitus lleva a una nefropatía diabética en aproximadamente un
tercio de los pacientes humanos. Clínicamente, la nefropatía
diabética está definida por la presencia de:
1. una disminución de la función renal
(aclaramiento glomerular deteriorado)
2. un aumento de las proteínas urinarias
(filtración deteriorada)
3. la presencia simultánea de hipertensión.
La función renal depende del flujo sanguíneo (no
medido) y del aclaramiento glomerular, que se puede medir o por
aclaramiento de inulina (no medido) o por aclaramiento de
creatinina. La permeabilidad glomerular se mide por la velocidad de
filtración de la albúmina, pero este parámetro es bastante variable.
Es también una función de distribución logarítmica: un aumento de
cien veces en la excreción de albúmina representa solamente una
disminución de dos veces en la capacidad de filtración.
Por los criterios anteriores, parece que la
ribosa induce muy rápidamente las manifestaciones de nefropatía
diabética, que se refleja en hipertensión, aclaramiento de
creatinina y albuminuria, incluso aunque la última no sea grande. En
la rata diabética por STZ establecida, la hiperglucemia se
establece rápidamente en 1-2 días, pero las
manifestaciones clínicas de la nefropatía diabética aparecen muy
tarde, quizá tanto como 40 semanas para la albuminuria. En general,
la albuminuria es muy variable de día a día y de animal a animal,
aunque al contrario que los humanos, la mayoría de las ratas con
STZ desarrollan nefropatía con el tiempo.
Usando los animales tratados con ribosa, la
piridoxamina a 25 mg/kg de peso corporal parece que evita de forma
eficaz dos de las tres manifestaciones usualmente atribuidas a la
diabetes, principalmente el deterioro del aclaramiento de
creatinina y de la filtración de albúmina. La piridoxamina hace esto
de una forma tan eficaz como la aminoguanidina. La eficacia del
pirofosfato de tiamina no se puso de manifiesto, pero debe
enfatizarse que esto puede ser debido a su uso en concentraciones
elevadas de 250 mg/kg de peso corporal. La piridoxamina podría
haber aparecido como mucho menos eficaz si sólo se consideran los
resultados a 250 mg/kg de peso corporal.
Globalmente, parece que las ratas toleran bien
los compuestos. Los pesos de los riñones no fueron dignos de
mención y las ratas desarrollaron poca hipertensión. Los efectos
fisiológicos de los compuestos se ensayaron sólo a 250 mg/kg. El
pirofosfato de tiamina pero no la piridoxamina, parece que disminuye
el aclaramiento de creatinina a esta concentración. Ambos parece
que aumentan ligeramente la albuminuria, pero estas medidas fueron
quizás las menos fiables.
Un humano adulto típico que tiene una altura
media, pesa entre 66-77 kg. Típicamente, los
pacientes diabéticos pueden tender a un sobrepeso y pueden estar
por encima de 112 kg. Las cantidades dietéticas recomendadas para un
varón adulto entre 66-77 kg, como se han revisado
en 1989, indican 1,5 mg al día de tiamina, y 2,0 mg al día de
Vitamina B_{6} (Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16th
edition (Merck & Co., Rahway, N. J., 1992) pp
938-939).
Basándose en el método del modelo de rata, un
intervalo de dosis para la administración de piridoxamina o
pirofosfato de tiamina que se prevé que es eficaz para inhibir la
formación de los AGE post-Amadori y por tanto para
inhibir las patologías relacionadas, podría estar en el intervalo
de 1 mg/100 g de peso corporal a 200 mg/100 g de peso corporal. El
intervalo apropiado cuando se coadministra con aminoguanidina será
similar. Calculado para un adulto medio de 75 kg, el intervalo (a 10
mg/1 kg de peso corporal) puede ser aproximadamente desde 750 mg
hasta más de 150 g (a 2 g/1 kg de peso corporal). Esto variará
naturalmente según el particular paciente.
Los experimentos no relacionados directamente con
el efecto de la piridoxamina se han introducido con propósitos
comparativos.
Claims (6)
1. El uso de piridoxamina para preparar un
medicamento para tratar o prevenir una patología relacionada con un
producto de glucosilación avanzada en un mamífero.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que la
patología relacionada con un producto de glucosilación avanzada se
selecciona del grupo que consiste en retinopatía, nefropatía,
enfermedad neurodegenerativa y envejecimiento de proteínas.
3. El uso de la reivindicación 2, en el que la
patología relacionada con un producto de glucosilación avanzada es
retinopatía.
4. El uso de la reivindicación 2, en el que la
patología relacionada con un producto de glucosilación avanzada es
nefropatía.
5. El uso de la reivindicación 2, en el que la
patología relacionada con un producto de glucosilación avanzada es
una enfermedad neurodegenerativa.
6. El uso de la reivindicación 2, en el que la
patología relacionada con un producto de glucosilación avanzada es
envejecimiento de proteínas.
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