ES2199804T3 - Modulacion de la permeabilidad vascular por medio de activadores del receptor tie2. - Google Patents

Abstract

Uso de un activador del receptor TIE2 en la fabricación de un medicamento para emplear en un método para disminuir o inhibir la pérdida de plasma en un mamífero.

Description

Modulación de la permeabilidad vascular por medio de activadores del receptor TIE2.

Campo de la invención

La invención se refiere en general a factores angiogénicos y más particularmente a la familia de angiopoyetina de factores de crecimiento y a métodos para disminuir o inhibir la permeabilidad vascular y/o pérdida de plasma.

Antecedentes de la invención

La pérdida de plasma, un componente clave de la inflamación, ocurre en un subconjunto distinto de los microvasos. En particular, en la mayoría de los órganos la pérdida de plasma ocurre específicamente en las venulas. A diferencia de las arteriolas y capilares, las vénulas se resquebrajan en respuesta a numerosos mediadores inflamatorios incluido histamina, bradiquinina, y serotonina. Una característica de la inflamación es la pérdida de plasma que resulta de fisuras intercelulares que se forman en el endotelio de las vénulas. La mayoría de los modelos experimentales de la inflamación indican que estas fisuras intercelulares ocurren entre las células endoteliales de vénulas postcapilares y colectoras (Baluk, P., et al., Am. J. Pathol. 1998 152:1463-76). Se ha mostrado que ciertas lectinas pueden emplearse para revelar características de sitios focales de pérdida de plasma, fisuras endoteliales, y extensiones digitiformes en los bordes de células endoteliales en vénulas inflamadas (Thurston, G., et al., Am. J. Physiol, 1996, 271: H2547- 62). En particular, se han empleado lectinas de plantas para visualizar cambios morfológicos en bordes de células endoteliales en vénulas inflamadas de, por ejemplo, la tráquea de rata. Lectinas, tales como concanavalina A y ricina, que se unen focalmente a vénulas inflamadas revelan regiones de la pared del vaso subendotelial expuestas a fisuras que corresponden a sitios de pérdida de plasma (Thurston, G., et al., Am. J. Physiol, 1996, 271: H2547-62).

Las propiedades de los microvasos son dinámicas. Enfermedades inflamatorias crónicas, por ejemplo, están asociadas con remodelado microvascular, incluido angiogénesis y agrandamiento del microvaso. Los microvasos también se remodelan al adquirir propiedades fenotípicas anormales. En un modelo murino de inflamación de vías respiratorias crónica, encontramos que los capilares de vías respiratorias adquieren propiedades de vénulas, incluido diámetro de vaso ampliado, inmunoreactividad incrementada para factor de von Willebrand, e inmunoreactividad incrementada para selectina-P. Además, estos vasos remodelados tienen pérdidas en respuesta a mediadores inflamatorios, aunque vasos en la misma posición en las vías respiratorias de un ratón normal no las tengan.

Ciertas sustancias han mostrado disminuir o inhibir permeabilidad vascular y/o pérdida de plasma. Por ejemplo, las mistixinas son polipéptidos sintéticos que han sido descritos por inhibir pérdida de plasma sin bloquear la formación de fisuras endoteliales (Baluk, P., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1998, 284: 693-9). También, el agonista del receptor beta 2-adrenérgico formoterol reduce la pérdida microvascular al inhibir la formación de fisuras endoteliales (Baluk, P. and McDonald, D. M., Am. J. Physiol., 1994, 266: L461-8).

¿Qué factores determinan si un vaso adquirirá características fenotípicas de vénulas? Una pista aparente vino de estudios de angiopoyetina-1 (Ang1), un ligando para el receptor específico de célula endotelial TIE2. En ratón que sobreexpresa transgenéticamente Ang1 en la piel bajo el promotor queratina-14 (ratón K14-Ang1), los microvasos en la posición de capilares tienen un diámetro de vaso ampliado, inmunoreactividad para selectina-P, e inmunoreactividad para factor von Willebrand. De este modo, estos vasos tienen características fenotípicas de vénulas.

La inflamación crónica está asociada con la formación de vasos sanguíneos y ampliación y cambios en el fenotipo del vaso. En ratón con inflamación de vías respiratorias, las diferencias dependientes de la raza han mostrado dar como resultado al mismo estímulo bien proliferación de vasos sanguíneos o ampliación, dependiendo de la respuesta del huésped (Thurston, G., et al., Am. J. Pathol., 1998, 153: 1099- 112). El análisis de embriones de ratones deficientes en el receptor TIE2 ilustran su importancia en angiogénesis, particularmente para la formación de la red vascular en células endoteliales. Sato, T. N., et al., Nature 376:70-74 (1995). En el sistema vascular maduro, los TIEs pueden actuar en la supervivencia de la célula endotelial, mantenimiento y respuesta a influencias patogénicas.

Se ha sugerido que los receptores TIE juegan papeles en la determinación de células endoteliales, proliferación, diferenciación y migración celular y modelado en elementos vasculares. La expresión predominante de los receptores TIE en endotelios vasculares sugiere que los TIEs juegan un papel en el desarrollo y mantenimiento del sistema vascular. Los receptores TIE se expresan también en células madre hematopoyéticas primitivas, células B y un subconjunto de células megacariocíticas, sugiriendo de este modo el papel de ligandos que se unen a estos receptores en hematopoyesis temprana, en la diferenciación y/o proliferación de células B, y en la etapa de diferenciación megacariocítica. Iwama, et al., Biochem. Biophys. Research Communications 195:301-309 (1993); Hashiyama, et al. Blood 87:93-101 (1996); Batard, et al. Blood 87:2212-2220 (1996).

Un factor angiogénico, que originalmente se llamó ligando-1 TIE2 (TL1) pero que también se denomina como angiopoyetina-1 (Ang1), se ha identificado que da la señal al receptor TIE2 y es esencial para un desarrollo vascular normal en el ratón. Por detección de homología, se identificó un Ang1 de la misma familia y se llamó ligando-2 TIE2 (TL2) o angiopoyetina-2 (Ang-2). Ang-2 es un antagonista que se encuentra naturalmente para Ang1 y el receptor TIE2. Para una descripción de la clonación y secuenciación de TL1 (Ang1) y TL2 (Ang-2) así como para sus métodos de preparación y sus usos, se hace referencia en este texto a la Publicación Internacional PCT Nº. WO 96/11269 publicada el 18 de Abril y la Publicación Internacional PCT Nº. WO 96/31598 publicada el 10 de Octubre de 1996 ambas en nombre de Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; and S. Davis, et al., Cell 87: 1161-1169 (1996) cada una de las que se incorpora en este texto como referencia. Ang1* es una forma mutante de Ang1 que comprende el dominio N- terminal de Ang-2 fusionado al dominio hélice enrollada y el dominio fibrinógeno de Ang1 que tiene una mutación de Cys a Ser en el aminoácido 245 (véase la Publicación Internacional PCT Nº. WO 98/05779 publicada el 12 de Febrero de 1998 en nombre de Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ang1* ha mostrado ser un agonista potente para el receptor TIE2.

Incluidas las angiopoyetinas descritas antes, los demandantes han identificado una familia de varios factores angiogénicos relacionados. Estos se han designado ligando-1 TIE2 (TL1) también denominado como angiopoyetina-1 (Ang1); ligando-2 TIE2 (TL2) o angiopoyetina-2 (Ang2); ligando-3 Tie (TL3) o angiopoyetina-3 (Ang3) y ligando-4 Tie (TL4) o angiopoyetina-4 (Ang4). Para descripciones de las propiedades estructurales y funcionales de estos cuatro factores, se hace referencia en este texto a las siguientes publicaciones: Patente de EE.UU. Nº 5.643.755, publicada el 7/1/97 por Davis, et al.; Patente de EE.UU. Nº 5.521.073 publicada el 5/28/96 por Davis, et al.; Patente de EE.UU. Nº 5.650.490, publicada el 7/22/97 por Davis, et al.; Patente de EE.UU. Nº 5.879.672, publicada el 9 de Marzo, 1999; Patente de EE.UU. Nº 5.814.464, publicada el 29 de Septiembre, 1998; Patente de EE.UU. Nº.5.851.797, publicada el 22 de Diciembre, 1998; Solicitud de patente internacional PCT Nº. PCT/US95/12935, presentada el 6 de Oct., 1995, publicada el 18 de Abril, 1996, con Nº de Publicación WO 96/11269; y Solicitud de patente internacional PCT Nº. PCT/US96/04806, presentada el 5 de Abril, 1996, publicada el 10 de octubre, 1996, con Nº de Publicación WO 96/31598, ambas solicitudes de patente PCT en nombre de Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Las angiopoyetinas pueden dividirse estructuralmente en tres dominios: una región N-terminal que carece de homología con cualquier estructura conocida; un segmento hélice enroscada rico en hélice alfa similar a restos encontrados en muchas proteínas que parecen promover multimerización; y un "dominio similar a fibrinógeno" así denominado porque está relacionado vagamente por homología a un dominio encontrado primero en fibrinógeno pero ahora detectado en muchas otras proteínas (Davis, S. et al., (1996) Cell 87: 1161-1169). El dominio similar a fibrinógeno representa la región más conservada de las angiopoyetinas, estudios recientes indican que comprende la porción de unión al receptor de las angiopoyetinas. Además, toda la información que determina ya sea si una angiopoyetina es un agonista o un antagonista de los receptores TIE parece residir en el dominio similar a fibrinógeno. Por ejemplo, cuando se hacen moléculas quiméricas en que los dominios similares a fibrinógeno de Ang1 y Ang-2 se intercambian, habilidades agonísticas o antagonísticas siguen la huella de los dominios similares a fibrinógeno. Las regiones hélice enroscada y N-terminal parecen servir principalmente para multimerizar los dominios similares a fibrinógeno, que aparentemente deben agruparse para ser activos. De hecho, las regiones hélice enroscada y N-terminal pueden sustituirse por restos alternativos que permiten agrupamiento o multimerización. De este modo, las actividades de Ang1 y Ang-2 pueden simularse precisamente por sustitutos en los que los dominios similares a fibrinógeno (FD) de estos factores se fusionan a la región constante de un anticuerpo, resultando en fusiones FD-Fc, que pueden agruparse luego empleando anticuerpos secundarios dirigidos contra las Fc. Para una descripción general de la producción y uso de fusiones FD-Fc, véase la Publicación Internacional Número WO 97/48804 publicada el 24 de Diciembre de 1997. Empleando estas técnicas, un experto en la técnica sería capaz de hacer similarmente fusiones FD-Fc empleando el dominio similar a fibrinógeno de cualquier miembro de la familia de angiopoyetina. Una ventaja práctica de tales sustitutos es que angiopoyetinas nativas pueden ser difíciles de producir recombinantemente, mientras los sustitutos pueden ser más fáciles de producir.

Como se describe en C. Suri, et al., Cell, 1996, 87: 1171-1180, la ausencia de Ang1 causa severas anormalidades vasculares en el desarrollo del embrión de ratón. Ang1 y Ang-2 se han descrito como reguladores de angiogénesis positivos (agonistas) o negativos (antagonistas) que se encuentran naturalmente. La regulación positiva o negativa de TIE2 es probable que de diferentes resultados dependiendo de la combinación de señales angiogénicas que actúan simultáneamente.

Las angiopoyetinas y miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (denominado abreviadamente VEGF por sus iniciales en inglés) son los únicos factores de crecimiento de los que se piensa sean ampliamente específicos para células endoteliales vasculares. Estudios de inactivación de genes concretos en ratón han mostrado que VEGF es necesario para las etapas tempranas del desarrollo vascular y que se requiere Ang1 para etapas tardías de remodelado vascular. Se ha descrito que la sobreexpresión transgénica de Ang1 en la piel de ratón produce vasos más grandes, más numerosos y más altamente ramificados, sin embargo las características de los vasos resultantes son ampliamente desconocidas. (Suri, C., et al., Science, 1998, 282:468-471). La presente invención es el resultado de los esfuerzos de los demandantes por examinar estos vasos en gran detalle al, entre otros estudios, ensayar la pérdida de permeabilidad/plasma de los vasos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona el uso de un activador del receptor TIE-2 (agonista) en la fabricación de un medicamento para emplear en un método para disminuir o inhibir la pérdida de plasma (incluida permeabilidad vascular) en un mamífero.

A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, la pérdida de permeabilidad/plasma puede producirse por un agente inflamatorio o por una lesión. En una realización de la invención, el mamífero es un ser humano. Por permeabilidad vascular, lo que se entiende es un proceso que lleva a una pérdida o extravasation de plasma incluida, pero no limitada a, permeabilidad endotelial incrementada. Véanse por ejemplo, McDonald, D. M., et al., Microcirculation 6: 7-22 (1999); Feng, D., et al., Microcirculation 6: 23-44 (1999); y Michael, C.C., and Neal, C. R., Microcirculation 6: 45-54 (1999).

La invención además proporciona para un uso en el que el activador del receptor TIE2 es Ang1, o un polipéptido que comprende un fragmento o uno de sus derivados capaz de activar el receptor TIE2.

La invención también proporciona para un uso en el que el activador del receptor TIE2 es un anticuerpo activante, o un polipéptido que comprende un fragmento o uno de sus derivados capaz de activar el receptor TIE2.

La invención además proporciona para un uso en el que el activador del receptor TIE2 es una pequeña molécula capaz de activar el receptor TIE2.

La invención también proporciona el uso de un anticuerpo que neutraliza anti-Ang-2 en la fabricación de un medicamento para emplear en un método para disminuir o inhibir la pérdida de plasma (incluida permeabilidad vascular) en un mamífero. En una realización de esta invención, el mamífero es un ser humano. La invención también proporciona para un uso en el que el anticuerpo que neutraliza anti-Ang-2 es un anticuerpo monoclonal, incluido un anticuerpo monoclonal totalmente humano. La invención además proporciona para un uso en el que el anticuerpo que neutraliza el anti-Ang-2 es un antisuero policlonal.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 - Vasos que muestran tinción de ricina en ratón que sobre-expresa Ang1 son resistentes a pérdida vascular inducida por aceite de mostaza. La microvascularidad de ratón que sobre-expresa Ang1 en la piel (K14-Ang1-panel inferior) y ratón FVB/N control de tipo salvaje (control-panel superior) fue estresado por perfusión de lectina (ricina) después de tratamiento con agente inflamatorio aceite de mostaza, luego examinado muestras completas de piel de oreja.

Figura 2 - Pérdida en de vasos de oreja de ratón de tipo salvaje y K14-Ang1. Se aplicó aceite de mostaza (5%) sobre la superficie de la piel de oreja, oreja control no recibió tratamiento. Se inyectó serotonina (10 \mum/ml) por vía dérmica, oreja control recibió inyección de vehículo. La pérdida se midió a 30 min. después de estímulo, n = 4 hasta 6 orejas por grupo, valores son media \pm SE. *Significantemente diferente de valor tipo salvaje correspondiente, P< 0,05, ensayo Bonferroni/Dunn.

Figura 3 - Cantidad de extravasation de azul de Evans en orejas de ratón de tipo salvaje, K14-Ang1, K14-VEGF, y K14-Ang1/VEGF 30 minutos después de aplicación tópica de aceite de mostaza. El asterisco marca significativamente mayor pérdida en orejas no tratadas de ratón K14-VEGF que en orejas no tratadas de ratón de tipo salvaje, K14-Ang1, o K14-Ang1/VEGF. La cruz marca significativamente mayor pérdida en orejas tratadas de ratón tipo salvaje que en orejas tratadas de ratón K14-Ang1, o K14-Ang1/VEGF. # marca significativamente mayor pérdida en orejas tratadas de ratón K14-VEGF que en orejas tratadas de ratón K14-Ang1, o K14-Ang1/VEGF.

Figura 4 - Cantidad de extravasation de azul de Evans en orejas de ratón de tipo salvaje inyectadas por vía intravenosa con adenovirus que expresa Ang1* o adenovirus que expresa proteína fluorescente verde seis días antes, y luego tratada durante 30 minutos por aplicación tópica de aceite de mostaza.

Figura 5 - Cuantificación de niveles de tejido de colorante azul de Evans en orejas de ratón pretratado sistémicamente con cualquier Ad-Ang1 o Ad-GFP, y 5-7 días más tarde enfrentado a inyecciones por vía intradérmica de proteína VEGF o suero salino (solución estéril de 0,9% de NaCl); orejas tratadas con aceite de mostaza sirven como un control adicional. También se muestra el bloqueo del efecto VEGF empleando co-inyección de un antagonista VEGF específico, es decir, un exceso 10 veces molar de una proteína de fusión VEGFR1-Fc soluble.

*, Significativamente mayor pérdida que en ratón control y tratado con Ad-Ang1.

Descripción detallada de la invención

Como se describe en mayor detalle posteriormente, los demandantes han encontrado que el activador del receptor TIE-2 puede emplearse para disminuir o inhibir la permeabilidad vascular y/o pérdida de plasma en mamíferos. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, la pérdida de permeabilidad vascular/plasma puede producirse por un agente inflamatorio o por lesión. En una realización de la invención, el mamífero es un ser humano.

El activador del receptor TIE-2 puede ser Ang1, o un polipéptido que comprende un fragmento o uno de sus derivados capaz de activar el receptor TIE2.

El activador del receptor TIE-2 puede ser alternativamente un anticuerpo activante, o un polipéptido que comprende un fragmento o uno de sus derivados capaz de activar el receptor TIE2.

El activador del receptor TIE-2 puede ser, en otra alternativa, una pequeña molécula capaz de activar el receptor TIE2.

También se puede emplear un anticuerpo que neutraliza anti-Ang-2 para disminuir o inhibir la permeabilidad vascular y/o pérdida de plasma en un mamífero.

En una realización de esta invención, el mamífero es un ser humano. La invención también proporciona para un uso en el que el anticuerpo que neutraliza anti-Ang-2 es un anticuerpo monoclonal, incluido un anticuerpo monoclonal totalmente humano. La invención además proporciona para un uso en el que el anticuerpo que neutraliza anti-Ang-2 es un antisuero policlonal.

A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, la invención puede ser útil en tratar condiciones clínicas que se caracterizan por pérdida de plasma/permeabilidad vascular, edema o inflamación tal como edema cerebral asociado con lesión, derrame cerebral o tumor; edema asociado con desórdenes inflamatorios tales como psoriasis o artritis, incluida artritis reumatoide; asma; edema generalizado asociado a quemaduras; ascitis y efusión pleural asociada a tumores, inflamación o trauma; inflamación crónica de las vías respiratorias, síndrome de pérdida capilar; septicemia; enfermedad de riñón asociada con pérdida incrementada de proteína; y desórdenes oculares tales como degeneración macular relacionada con la edad y retinopatía diabética.

Las composiciones de la invención pueden administrarse sistémicamente o localmente. Puede emplearse cualquier modo apropiado de aplicación conocido en la técnica, incluido, pero no limitado, por vía intravenosa, intratecal, intra- arterial, intranasal, oral, subcutánea, intraperitoneal, o inyección local o implante quirúrgico. También se proporcionan formulaciones de liberación contínua.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede emplear cualquier técnica que se proporciona para la producción de moléculas anticuerpo por líneas celulares estables en cultivo. Por ejemplo, la técnica hibridoma originalmente desarrollada por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica trioma, la técnica hybridoma célula B humana (Kozbor et al., 1983, Inmunology Today 4:72), y la técnica hybridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., en "Monoclonal antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc. pp 77-96) y similares están dentro del alcance de la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpos monoclonales humano-ratón (u otras especies) quiméricos. Pueden hacerse anticuerpos monoclonales humanos mediante cualquier técnica conocida en la técnica (p.ej. Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Inmunology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). Sepueden preparar moléculas anticuerpo quiméricas que contienen un dominio de unión a antígeno de ratón con regiones constantes humanas (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, Takeda et al., 1985, Nature 314:452). También se proporcionan anticuerpos monoclonales totalmente humanos y se pueden preparar como se describe en, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº. 5.939.598, publicada el 17 de Agosto, 1999 y asignada a Abgenix, Inc.

Se pueden emplear varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales. Para la producción de anticuerpos que inactivan Ang-2, se pueden inmunizar varios animales huésped, incluido pero no limitado a conejos, ratón y ratas por inyección con Ang-2, o un fragmento o uno de sus derivados. Para la producción de anticuerpos que activan TIE2, incluido pero no limitado a conejos, se pueden inmunizar ratón y ratas por inyección con dominio extracelular de receptor TIE2, o un fragmento o uno de sus derivados. Se pueden emplear varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies huésped, e incluido pero no limitado al adyuvante de Freund (completo o incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, polipéptidos, emulsiones aceitosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol, y potencialmente adyuvantes humanos tales como BCG (Bacille Calmette-Guerin) y Corynobacterium parvum.

Un clon molecular de un anticuerpo a un epitopo seleccionado puede prepararse por técnicas conocidas. Se puede emplear metodilogía de DNA recombinante (véase p.ej. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) para construir secuencias de ácidos nucleicos que codifican una molécula de anticuerpo monoclonal, o una sus regiones de unión a antígeno.

La presente invención proporciona moléculas anticuerpo así como fragmentos de tales moléculas anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo que contiene el iodotipo de la molécula puede generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero están limitados a: el fragmento F(ab')_{2} que puede producirse por digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden generarse al reducir los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2}, y los fragmentos Fab que pueden generarse al tratar la molécula de anticuerpo con papaina y un agente reductor. Las moléculas de anticuerpo pueden purificarse por técnicas conocidas, p.ej. cromatografía de inmunoabsorción o inmunoafinidad, métodos cromatográficos tales como HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia), o una de sus combinaciones.

En realizaciones alternativas de la invención, se puede preparar por ingeniería genética una cadena simple Fv. Una cadena simple Fv (scFv) es un Fab truncado que solo tiene la región V de una cadena pesada unida por una secuencia de péptido sintético a una región V de una cadena simple. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N^{os} 5.565.332; 5.733.743; 5.837.242; 5.858.657; y 5.871.907 asignadas a Cambridge Antibody Technology Limited.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplos Ejemplo 1

Se mostró previamente que la sobre-expresión transgénica de Ang1 en la piel de ratón (K14-Ang1) según describe Suri, C., et al., 1998, Science 282: 468-471 produce vasos más anchos, más numerosos, y más altamente ramificados. La microvascularidad de ratón que sobre-expresa Ang1 en la piel (K14-Ang1) y ratón FVB/n control de tipo salvaje fue luego teñida por perfusión de lectina, como se describe en general en Thurston, G. et al., 1998, Am. J. Pathol. 153(4): 1099-112, luego se examinó en muestras completas de piel de oreja como se muestra la

\hbox{Figura 1.}

La pérdida de plasma de los vasos de la oreja medida en algún ratón después de la aplicación tópica de los agentes inflamatorios aceite de mostaza o serotonina (Véase Inoue, H., et al., 1997, Eur. J. Pharmacol. 333:231-40) con el marcador azul de Evans (Véase Baluk, P., et al., 1997, Am. J. Physiol. 272:L155-170). La pérdida de plasma se midió empleando el colorante marcador azul de Evans. Se inyectó azul de Evans (EM Sciences, Cherry Hill, NJ) 30 mg/kg en un volumen de 100 \mul en una vena femoral de ratón anestesiado, y 1 min. más tarde se administró aceite de mostaza o serotonina a una oreja. Se diluyó el aceite de mostaza (Sigma, St. Louis, MO) al 5% en aceite mineral y se aplicó con una Q-tip sobre las superficies dorsales y ventrales de la piel de una oreja, y no se hizo nada a la otra oreja (control de la línea base). La serotonina (Sigma) se preparó a 0,22 mg/ml en suero salino estéril más ácido acético 0,005N (vehículo). Se inyectaron aproximadamente 10 \mul por vía intradérmica en la piel de la oreja dorsal, y se inyectó un volumen similar de vehículo sobre la otra oreja (control). Treinta minutos después del estímulo, la vascularidad se fijó por perfusión (1% de para formaldehido en tampón citrato 50mM, pH 3,5) durante 2 min. Se retiraron las orejas, se llevaron a sequedad, y pesaron. Se extrajo el azul de Evans de las orejas con formaldehido y se midió con un espectrofotómetro a 610 nm.

Se encontró que los vasos en la posición de capilares en la piel de ratón K14-Ang1 eran anormalmente grandes y tenían propiedades fenotípicas de vénulas, incluido inmunoreactividad fuerte para selectina-P y factor von Willebrand. Por comparación, en ratón de tipo salvaje, la inmunoreactividad de estas proteínas estaba ampliamente restringida a vénulas. La microvascularidad de la piel de oreja no estaba resquebrajada en cualquier grupo de ratón bajo las condiciones de la línea base (6,7 \pm 1,7 mg de azul de Evans por mg de peso de tejido mojado en ratón K14-Ang1 comparado con 6,4 \pm 1,6 ng/mg en ratón de tipo salvaje), pero estaba significativamente menos resquebrajado en ratón K14-Ang1 comparado con el control después de tratamiento con aceite de mostaza (5,9 \pm 1,8 ng/mg en K14-Ang1 vs 18,1 \pm 3,9 ng/mg en ratón de tipo salvaje) -véase Figura 2, panel superior. Los vasos en ratón K14-Ang1 fueron también resistentes a pérdida después de tratamiento con serotonina -véase Figura 2, panel inferior. Aunque la sobre-expresión de Ang1 inducía algunas de las características fenotípicas de vénulas, los vasos de la piel en ratón K14-Ang1 eran más resistentes a pérdida inducida por estímulo inflamatorio.

En resumen, se encontró que el mediador inflamatorio aceite de mostaza inducía pérdida de plasma en la piel de oreja de ratón de tipo salvaje. Sin embargo, contrario a nuestras expectaciones, se encontró que el aceite de mostaza no inducía pérdida de plasma significante en ratón transgénico K14-Ang1 (Figura 2).

Además, se encontró que otro mediador inflamatorio, serotonina, también falló para inducir pérdida significante en ratón K14-Ang1 (Figura 2).

Ejemplo 2

En otro grupo de experimentos, se encontró que los vasos de la piel en ratón que sobre-expresa VEGF tenía incrementada la pérdida en la línea base. Los vasos en estos ratones mostraron más incrementos en pérdida después de la estimulación con aceite de mostaza. Sin embargo, inesperadamente, la alta pérdida en la línea base en ratón transgénico K14-VEGF se redujo a valores normales en ratón doblemente transgénico K14-VEGF/Ang1. En adición, el aceite de mostaza no indujo pérdida significante en ratón doblemente transgénico K14-VEGF/Ang1 (Figura 3). Estos experimentos establecen que la sobre-expresión transgénica de Ang1 da como resultado vasos que son resistentes a la pérdida inducida por mediadores inflamatorios (aceite de mostaza, serotonina) y por sobre-expresión transgénica de VEGF.

Para determinar si una administración importante de Ang1 puede también reducir pérdida asociada a la inflamación, se empleó una codificación de adenovirus para angiopoyetina-1* (adeno-Ang1*) para producir niveles sistémicos altos en ratón de algún modo normal. Ang1* ha mostrado ser un potente agonista para el receptor TIE2. La pérdida de plasma se ensayó en piel de oreja de ratón dando este virus por inyección iv. El ratón control recibió inyección iv de codificación de adenovirus para una proteína no activa (proteína fluorescente verde- GFP). Después de seis días de la administración de adenovirus, la cantidad de pérdida de plasma inducida por aceite de mostaza fue significativamente menos en ratón que recibió adeno-Ang1* que en los que recibieron adeno-GFP (Figura 4). Este experimento establece que la administración de Ang1 a ratón de tipo salvaje puede dar como resultado vasos que son resistentes a pérdida inducida por inflamación.

Ejemplo 3

Como se ha definido supra, la sobre-expresión transgénica de VEGF lleva a la formación de vasos anormalmente resquebrajados, pero el resquebrejamiento podría normalizarse por sobre-expresión transgénica simultánea de Ang1. Para determinar si la pre-administración de Ad-Ang1 podría bloquear la pérdida inducida por VEGF en los atributos de adulto, se inyectó proteína VEGF por vía intradérmica en las orejas de ratón a los que se había inyectado previamente por vía intravenosa con colorante azul de Evans. La extravasation del colorante resultó, y esta extravasation pudo bloquearse por co-administración de un inhibidor de VEGF (Fig. 5). La pre-administración de Ad- Ang1 pero no Ad-VEGF también bloqueó la pérdida inducida por VEGF (Fig. 5), demostrando que la liberación a corto plazo de Ang1 podía dar vasos adultos resistentes a pérdida vascular inducida por cualquier agente inflamatorio o VEGF.

Los ensayos con azul de Evans se llevaron a cabo como se ha descrito recientemente (Thurston, G. et al., Science 286, 2511-2514 (1999); Suri, C., et al., Science 282, 468-471 (1998); Thurston, G., Baluk, P., Hirata, A. & McDonald, D. M., Am. J. Physiol. 271, H2547-2562 (1996)). En adición, el ensayo de Miles modificado en ratón adulto se llevó a cabo por inyección de azul de Evans, seguida un minuto más tarde de inyección por vía intradérmica de VEGF (400 nanogramos en 8 microlitros) en la parte dorsal de la región media de la oreja; se recogieron las orejas treinta minutos después de inyección y se procedió como en otros ensayos de azul de Evans. Para ensayar los efectos de Ang1 en los ensayos de Miles modificados y controles descritos en Fig. 5, se inyectó el ratón con 109 PFU de Ad-Ang1 o Ad-GFP 1 a 5 días antes del ensayo.

Los estudios anteriores demuestran que la administración importante de Ang1 protege la vascularidad adulta contra pérdida inducida por una variedad de retos, como fue el caso con Ang1 transgénicamente sobre-expresado durante el desarrollo de los vasos.

Hace mucho que se ha apreciado que VEGF puede rápidamente incrementar la permeabilidad vascular en el adulto, y que la pérdida de plasma inducida por VEGF puede contribuir a una variedad de procesos de enfermedad. Nuestros datos demuestran, por el primer momento, que este efecto potencialmente adverso de VEGF puede bloquearse por administración importante de Ang1.

La presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones específicas descritas en este texto. De hecho, varias modificaciones de la invención en adición a las descritas en este texto se harán aparentes a los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y de las figuras que acompañan.

Claims (10)

1. Uso de un activador del receptor TIE2 en la fabricación de un medicamento para emplear en un método para disminuir o inhibir la pérdida de plasma en un mamífero.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el mamífero es un ser humano.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el activador del receptor TIE2 es Ang1, o un polipéptido que comprende un fragmento o uno de sus derivados capaz de activar el receptor TIE2.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el activador del receptor TIE2 es un anticuerpo activante, o un polipéptido que comprende un fragmento o uno de sus derivados capaz de activar el receptor TIE2.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el activador del receptor TIE2 es una molécula pequeña capaz de activar el receptor TIE2.

6. Uso de un anticuerpo que neutraliza anti- Ang-2 en la fabricación de un medicamento para emplear en un método para disminuir o inhibir la pérdida de plasma en un mamífero.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el mamífero es un ser humano.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7ª, en el que el anticuerpo que neutraliza anti-Ang-2 es un anticuerpo monoclonal.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal totalmente humano.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el que el anticuerpo que neutraliza anti-Ang-2 es un antisuero policlonal.