ES2199172T3 - Compensacion de color para ganancias electronicas y de temperatura. - Google Patents
Compensacion de color para ganancias electronicas y de temperatura.Info
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Abstract
Método para la determinación de la presencia de, por lo menos, dos analitos en una muestra, que comprende: proporcionar por lo menos dos entidades detectoras, comprendiendo cada una de ellas un marcaje fluorescente distinto del marcaje fluorescente de cualquiera de las otras entidades detectoras, y siendo capaz cada una de dichas entidades de unirse específicamente con sus respectivos analitos, contactar la muestra con las entidades detectoras para permitir la unión específica de los analitos y de las entidades detectoras, excitar cada una de dichas entidades marcadas con luz de una longitud de onda apropiada para inducir fluorescencia, determinar los valores de fluorescencia de las entidades marcadas en por lo menos dos canales espectrales distintos a través de un intervalo térmico, y compensar dichos valores para el solapamiento espectral, en el que la etapa de compensación incluye la corrección de la dependencia de la temperatura de los valores de la fluorescencia.
Description
Compensación de color para ganancias electrónicas
y de temperatura.
La presente invención se refiere a un método para
el análisis simultáneo, por lo menos, de dos analitos, utilizando
como mínimo dos entidades detectoras fluorescentes. Más
particularmente, la presente invención se refiere a la utilización
de sondas de hibridación marcadas fluorescentemente para identificar
los genotipos en más de un locus de un ácido nucleico corrigiendo el
solapamiento espectral dependiente de la temperatura de las sondas
fluorescentes.
El continuo descubrimiento de nuevos genes
proporciona recursos de material genético para estudiar la
asociación entre genotipo y enfermedad. Véase Kononen, J., y otros,
(1998) Nat. Med. 4, páginas 844-847. La mayoría de
las enfermedades genéticas se deben a alteraciones únicas de las
bases que pueden encontrarse en múltiples lugares en el interior de
uno o varios genes. Véase Cooper, D.N., y Krawczak, M. (1990) Hum.
Genet. 85, páginas 55-74; Neufeld, E.J. (1998)
Hematol. Oncol. Clin. North Am. 12, páginas
1193-1209. Por esta razón, las técnicas para el
análisis de los ácidos nucleicos requieren a menudo el análisis de
múltiples loci y variantes secuenciales. Por conveniencia, es
preferible llevar a cabo este análisis en una reacción única.
Distintos colorantes fluorescentes coloreados se
utilizan frecuentemente para aumentar la cantidad de información
obtenida a partir de una muestra de ácido nucleico. Mansfield, E.S.,
y otros (1997) J.Chromatogr. A. 781, páginas
295-305; Samiotaki, M., y otros (1997) Anal.
Biochem. 253, páginas 156-161. Estos colorantes
pueden unirse a iniciadores o sondas, y los productos pueden ser
analizados durante la amplificación PCR o mediante métodos de
detección posteriores a la amplificación. Pritham, G.H., y Wittwer,
C.T. (1998), J. Clin. Lig. Assay, 21, páginas 1-9.
Aunque el análisis después de la amplificación aumenta el tiempo del
ensayo, dicho análisis proporciona un segundo nivel de investigación
que multiplica la potencia del ensayo. Por ejemplo, la detección
fluorescente multicolor en combinación con la clasificación por el
tamaño del producto ha tenido éxito para tipificar (o "tipar")
la identidad utilizando repeticiones cortas en tándem, el tipado
genotípico de cambios únicos de las bases mediante
minisecuenciación, el tipado genotípico mediante cebado competitivo.
Mansfield, E.S., y otros (1997) J. Chromatogr. 781, páginas
295-305; Pritham, G.H., y Wittwer, C.T. (1998) J.
Clin. Lig. Assay, 21, páginas 1-9; Pastinen, T y
otros, (1996) Clin. Chem. 42, páginas 1391-1397.
Las sondas de hibridación proporcionan un sistema
elegante para la amplificación PCR homogénea y el tipado genotípico.
Véase Lay, M.J., y Wittwer, C.T. (1997) Clin. Chem. 43, páginas
2262-2267; Bernard, P.S., y otros (1998) Anal.
Biochem. 255, páginas 101-107; Bernard, P. S., y
otros (1998) Am. J. Pathol. 153, páginas 1055-1061.
En un sistema de este tipo, se utilizan dos sondas oligonucleótidas
que hibridizan a regiones adyacentes de una secuencia de ADN, en el
que cada sonda oligonucleótida se marca con un miembro respectivo de
un par de transferencia energética fluorescente. En este sistema, un
colorante fluorescente donante es excitado y transfiere energía a un
colorante fluorescente aceptante si ambos colorantes están muy
próximos, como lo estarían cuando se hibridizarán a regiones
adyacentes de la secuencia del ADN. El análisis después de la
amplificación de la curva de fusión permite identificar por lo menos
a dos alelos utilizando estas sondas de hibridación de par único.
Esto se debe a que variaciones en las secuencias de ADN crean
desemparejamientos con la sonda, dando lugar a cambios de T_{m}
característicos que se miden controlando los cambios en la
transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia durante
el calentamiento lento.
Se puede hacer que las sondas que tienen
distintas T_{m} con diversos alelos puedan transmitir varias
señales simultáneamente para aumentar la potencia de esta técnica
(Bernard, P.S. y otros, (1998) Am. J. Pathol 153, páginas
1055-1061); sin embargo, esta transmisión múltiple
simultánea de varias señales está limitada en última instancia por
el número de T_{m} que pueden diferenciarse con respecto al
conjunto de temperaturas de fusión de las sondas. La presente
invención se refiere a la ampliación de la potencia de la
transmisión múltiple simultánea de varias señales de las sondas de
hibridación, utilizando el color, así como las T_{m} para la
tipificación genotípica de distintos alelos al mismo tiempo. Se
utilizan múltiples sondas con distintos colorantes aceptantes. A
causa de que el colorante aceptante emite a distintas longitudes de
onda, tales análisis multicolor pueden utilizarse para ampliar el
número de alelos que pueden estudiarse al mismo tiempo.
Aunque el análisis multicolor puede utilizarse
para ampliar la cantidad de información obtenida en una curva de
fusión única, el análisis multicolor requiere la utilización de
técnicas de compensación de interferencias para corregir el
solapamiento de la fluorescencia entre los canales. Estos métodos se
desarrollaron originariamente para el control fluorescente
multiparamétrico de células, utilizando la citometría de flujo.
Bagwell, C.B. y Adams, E.G. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. páginas 677,
167-184. Aunque estas técnicas han probado su
utilidad, en la citometría de flujo la temperatura permanece
constante, y estos métodos no corrigen por cambios en los efectos de
entrecruzamiento dependientes de la temperatura. Con el análisis de
la curva de fusión, la temperatura oscila entre 40 y 95ºC, y pueden
surgir errores significativos si los efectos de entrecruzamiento
dependientes de la temperatura no son corregidos. Con objeto de
adaptar el análisis multicolor para su utilización con las sondas de
hibridación, son necesarias concesiones algorítmicas para distintos
ajustes de ganancia y para los efectos térmicos sobre el
solapamiento de la fluorescencia entre los canales.
La Solicitud de Patente Internacional No. WO
97/46714 da a conocer métodos para controlar la hibridización
durante una reacción polimerásica. Los métodos implican el rápido
ciclado térmico y la utilización de colorantes de ADN bicatenario o
de sondas de hibridación específicas. Particularmente, se utiliza un
par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y la
cuantificación/determinación de la pureza del ADN amplificado es
conseguido mediante el análisis de las curvas Tm.
El presente planteamiento consiste en llevar a
cabo un procesamiento de calibración durante una subida de
temperatura para definir la dependencia térmica de cada fluoróforo.
Esta dependencia térmica se aproxima entonces con polinomios de
tercer grado. Entonces, se utiliza la temperatura de adquisición
para el valor de fluorescencia durante los procesamientos
consecutivos del ensayo, para interpolar los coeficientes de
calibración de la fluorescencia a esa temperatura. Sin esta
corrección, los valores de fluorescencia serían incorrectos debido
al solapamiento espectral térmico-dependiente.
Además, también se desea la corrección para la
ganancia del amplificador, ya que los procesamientos experimentales
pueden conseguirse con varias ganancias. A causa de que no es
práctico realizar los procesamientos de calibración para todas las
combinaciones de ganancias, el archivo de compensación deberá
trabajar con los procesamientos experimentales obtenidos con
cualquier ajuste de ganancia. La corrección para la ganancia puede
alcanzarse multiplicando las curvas de calibración fluorescente por
la proporción de ganancia del procesamiento con respecto a la
ganancia de calibración para cada canal.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención
se refiere a un método para la determinación de la presencia de, por
lo menos, dos analitos, utilizando como mínimo dos entidades
detectoras fluorescentes específicas para sus analitos respectivos.
Las entidades fluorescentes son excitadas con luz que presenta la
longitud de onda apropiada; la fluorescencia se determina en por lo
menos, dos canales espectrales; y los valores de fluorescencia son
corregidos con respecto al solapamiento espectral y a la dependencia
de la temperatura de los valores fluorescentes.
En una forma preferente de realización de la
presente invención, los analitos son loci de ácidos nucleicos, y las
entidades fluorescentes son específicas para sus loci respectivos.
Las entidades fluorescentes son excitadas con luz que presenta una
longitud de onda apropiada; la fluorescencia se mide a través de una
gama de temperaturas; y los valores de señal se compensan con
respecto a la dependencia térmica. En una forma de realización
preferente, las entidades fluorescentes se fijan a oligonucleótidos
que tienen secuencias complementarias a sus loci respectivos; los
oligonucleótidos se hibridizan a los loci; y la etapa de medición
incluye el control de la fluorescencia durante el calentamiento para
fundir los oligonucleótidos de sus loci respectivos.
El gen de la apolipoproteína ("Apo E") sirve
como un sistema modelo para la presente invención. Alteraciones de
bases únicas en el interior de los codones 112 y 158 del gen Apo E
explican los tres alelos comunes (\in2, \in3 y \in4) y los
seis fenotipos de Apo E. Mahley, R.W. (1988) Science 240, páginas
622-630. Se sintetizaron dianas oligonucleótidas
para proporcionar el tipado genotípico de la sonda de hibridación
adyacente de los alelos Apo E. Utilizando matrices artificiales, los
efectos de la concentración de dianas, de la competencia de las
cadenas complementarias, de la concentración de sondas, de la
concentración de Mg^{++}, y de las condiciones de hibridación
previas al análisis de la curva de fusión, podrían ser estudiados
sistemáticamente independientemente de la técnica de amplificación.
De este modo, una forma de realización adicional de la presente
invención incluye la optimización de la concentración de las dianas
y de las condiciones de hibridación, y la reducción de la
competencia de las cadenas complementarias para proporcionar
mediciones fluorescentes compensadas óptimas.
Características adicionales de la presente
invención quedarán evidentes a los técnicos en la materia a partir
de la consideración de la siguiente descripción detallada de
realizaciones preferentes que ejemplifican la mejor forma de llevar
a cabo la invención, tal como ésta se percibe actualmente.
La figura 1 es una representación esquemática del
análisis de la curva de fusión fluorescente para el tipado
genotípico;
la figura 1A muestra el equilibrio entre la
hibridación y la fusión en las T_{m} de dúplex emparejados y no
emparejados;
la figura 1B es un gráfico del tiempo con
respecto a la temperatura durante la fase de fusión de la
reacción;
la figura 1C es un gráfico de la fluorescencia
con respecto a la temperatura para la sonda LC Red 640; y
la figura 1D es un gráfico de la derivada
negativa de la fluorescencia de la figura 1C con respecto al
tiempo.
La figura 2 muestra el efecto de distintos
protocolos de hibridación sobre la simetría del pico de las curvas
derivadas de la fusión para un heterocigoto de muestra en el codon
158 del gen Apo E;
la figura 2A ilustra un protocolo de enfriamiento
rápido (20º C/s) hacia una temperatura 8º por debajo de la T_{m}
de un dúplex desemparejado;
la figura 2B ilustra el protocolo de enfriamiento
rápido interrumpido durante 20 segundos que se mantiene a
temperaturas 8ºC inferiores a la T_{m} para el dúplex emparejado y
por lo tanto desemparejado;
la figura 2C ilustra una velocidad de transición
térmica más lenta (1º C/s) hacia una temperatura 8ºC inferior a la
T_{m} de un dúplex desemparejado;
las figuras 2D-F son gráficos de
las curvas de fusión derivadas negativas (-dF/dT) (0,1º C/s) para
los protocolos de hibridación de las figuras 2A-C,
respectivamente.
La figura 3 ilustra la optimización de las
concentraciones de los oligonucleótidos diana y de Mg^{++} para el
tipado genotípicode los codones 112 y 158 del gen Apo E utilizando
el protocolo de hibridación de la figura 2C;
la figura 3A es un gráfico -dF/dT que mide LC Red
705 (codon 112) en 1 mM de MgCl_{2};
la figura 3B muestra LC Red 705 (codon 112) en 3
mM MgCl_{2};
la figura 3C muestra LC Red 640 (codon 158) en 1
mM MgCl_{2}; y
la figura 3D muestra LC Red 640 (codon 158) en 3
mM MgCl_{2}. Las concentraciones de las dianas fueron de 0,05
\mugM (---) o 0,2 \muM (- -), las de las
sondas de fluoresceína fueron de 0,1 \muM, y las de las sondas
aceptoras fueron de 0,2 \muM, y las cadenas de competencia no
estaban presentes.
La figura 4 ilustra la competencia durante el
tipado genotípico de las sondas Apo E en presencia de las cadenas
complementarias, utilizando el protocolo de hibridación de la figura
2C y graficada como la derivada de la fluorescencia (-dF/dT) con
respecto a la temperatura;
la figura 4A muestra los picos de fusión
heterocigótica para los alelos \in3/\in4 (codon 112) y
la figura 4B muestra los picos de fusión
heterocigótica para los alelos \in2/\in3 (codon 158), en
presencia (---) o ausencia (- -) de cadenas de competencia.
Cada reacción incluyó 0,1 \muM de sonda marcada con fluoresceína,
0,2 \muM de sonda aceptora, 0,05 \muM de la sonda heterocigótica
con o sin 0,05 \muM de competidor, y 1 mM MgCl_{2} (codon 112) o
3 mM MgCl_{2} (codon 158).
La figura 5 muestra la calibración y la
aplicación de la compensación de color para el solapamiento
espectral con compensación de un caso extremo del vertido de LC Red
640 sobre el canal LC Red 705; las ganancias del instrumento fueron
de 1, 30, y 50 para la fluoresceína, y los canales LC Red 640 y LC
Red 705, respectivamente; la concentración de las sondas marcadas
fue de 0,1 \muM de fluoresceína (-o-), 2 \muM de LC Red 640
(-X-), y 2 \muM de LC Red 705 (---) en 50 mM de Tris, pH 8,5
(25ºC), 1 mM de MgCl_{2} y 250 \muM/ml de albúmina sérica
bovina, e incluyéndose una muestra que contenía tampón sin sondas
(-\Delta-) como un blanco;
la figura 5A muestra los datos de calibración del
color original;
la figura 5B muestra los datos de calibración
después de la compensación del color; y
la figura 5C muestra la corrección de la
temperatura a 50ºC después de la compensación del color; los
algoritmos de compensación y de corrección se aplicaron entonces al
canal LC Red 705 en un ensayo de color multipléxico, y en las
figuras 5D-F se muestran las curvas de fluorescencia
con respecto a temperatura; los genotipos que se muestran son
homocigóticos \in4/homocigóticos \in3 (....), homocigóticos
\in3/homocigóticos \in3 (- - -), y homocigóticos
\in3/heterocigóticos \in2/\in3 (---).
La figura 6 muestra el tipado genotípico
multipléxico de color de los codones 112 y 158 sin cadena
competidora, utilizando el protocolo de hibridación de la figura 2C;
las curvas de fusión derivadas (-dF/dT con respecto a la
temperatura) compensadas (figura 6B) y no compensadas (figura 6A) se
muestran para el canal LC Red 705 utilizado para el análisis del
codon 112;
la figura 6A muestra la purga a partir de LC Red
640;
la figura 6B muestra sólo los genotipos en el
codon 112; los genotipos que se muestran son homocigóticos
\in4/homocigóticos \in3 (....), homocigóticos
\in3/homocigóticos \in3 (---), y homocigóticos
\in3/heterocigóticos \in2/\in3
\hbox{(- - -).}
la figura 7 muestra el efecto de una temperatura
de hibridación más baja sobre el área de los picos para los
desemparejamientos \in3 en el tipado genotípico de la muestra
heterocigótica \in2/\in3;
la figura 7A muestra el tipado genotípico después
de enfriar en 1ºC/s a 42ºC, la temperatura utilizada para la
transmisión múltiple simultánea de varias señales en la figura 6;
y
la figura 7B muestra el tipado genotípico después
de enfriar en 1ºC/s a 48ºC la temperatura utilizada para la
optimización del tipado genotípico en el codon 158.
En la descripción y reivindicaciones de la
invención, se utilizará la siguiente terminología según las
definiciones que se exponen a continuación.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"ácido nucleico", "ADN", y términos similares incluyen
también análogos de ácidos nucleicos, es decir, análogos que tienen
estructuras distintas a las de tipo fosfodiéster. Por ejemplo, los
denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que se conocen en la
técnica y poseen enlaces peptídicos en vez de enlaces fosfodiéster
en su estructura, se consideran incluidos dentro del alcance de la
presente invención.
Tal como se utilizan en la presente memoria,
"par de transferencia de energía de resonancia de
fluorescencia" o "par FRET" se refiere a un par de
fluoróforos que incluyen un fluoróforo donante y un fluoróforo
aceptor, en el que el fluoróforo donante es capaz de transferir
energía de resonancia al fluoróforo aceptor. En otras palabras, el
espectro de emisión del fluoróforo donante se solapa con el espectro
de absorción del fluoróforo aceptor. En los pares preferentes de
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, el espectro
de absorción del fluoróforo donante no se solapa sustancialmente con
el espectro de absorción del fluoróforo aceptor.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"una sonda oligonucleótida donantea" se refiere a un
oligonucleótido que se marca con un fluoróforo donante de un par de
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"una sonda oligonucleótida aceptora" se refiere a un
oligonucleótido que se marca con un fluoróforo aceptor de un par de
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "un
par oligonucleótido FRET" se refiere al par de la sonda
oligonucleótida donantea y de la sonda oligonucleótida receptora que
conforman una relación de transferencia de energía de resonancia de
fluorescencia cuando la sonda oligonucleótida donantea y la sonda
oligonucleótida aceptora se hibridizan ambas a sus secuencias ácido
nucleicas diana complementarias.
La presente invención se refiere a un método para
la utilización de, por lo menos, dos entidades detectoras
fluorescentes para la determinación de la presencia de, como mínimo,
dos analitos. Aunque esta técnica puede utilizarse ampliamente, una
forma de realización preferente de la presente invención es un
método para el rastreo de loci múltiples de secuencias ácido
nucleico con respecto a la presencia de mutaciones o polimorfismos.
Más particularmente, la presente invención permite un método rápido
que puede llevarse a cabo enteramente en el interior de un
recipiente reactivo único, para la detección de mutaciones y
polimorfismos en loci múltiples de una muestra de ADN genómico
preparada a partir de un organismo individual. Aunque el método
puede utilizarse en cualquier muestra apropiada de ácido nucleico,
el método puede llevarse a cabo sobre productos de amplificación PCR
y puede realizarse dentro del mismo vaso reactivo único que el
utilizado para la amplificación PCR. El método preferente de la
presente invención comprende las etapas de combinación de una
muestra biológica que incluye las secuencias de ácido nucleico con
dos o más pares oligonucleótidos FRET, la iluminación de la muestra
biológica con la longitud de onda apropiada, el control de la
fluorescencia como función de la temperatura durante el
calentamiento, y la compensación de los valores de
fluorescencia.
Las sondas fluorescentes para utilización en la
detección y control del ADN incluyen colorantes específicos para el
ADN bicatenario y sondas específico-secuenciales. La
figura 1 muestra un esquema de hibridación basado en la
transferencia de energía de resonancia entre fluoróforos situados en
dos sondas adyacentes. Tal como se define más adelante en la Tabla
1, este método es específico secuencial y permite el análisis con
curvas de fusión. Cuando las dos sondas marcadas se hibridizan con
la misma cadena matriz, los dos componentes del par FRET se
comprometen en una vecindad cercana y la transferencia energética
puede ocurrir (figura 1A). A causa de un desemparejamiento entre uno
de los alelos y una de las sondas oligonucleótidas, se producirá la
fusión a una temperatura inferior para aquel alelo, separando de
este modo los elementos del par FRET. El alelo que contiene el
desemparejamiento mostrará una T_{m} más baja característica que
el alelo que se empareje con la sonda (figuras
1B-D).
Las sondas de hibridación específicas para los
distintos alelos y marcadas con diferentes colores aceptores pueden
utilizarse simultáneamente para obtener curvas multipléxicas de
fusión fluorescente para el tipado genotípico. Dos pares
oligonucleótidos FRET separados, siendo específico cada uno para un
locus e incluyendo cada uno un colorante aceptor distinto, pueden
utilizarse al mismo tiempo. Pares aceptables de fluoróforos, para
utilización como pares de transferencia energética de resonancia
fluorescente, son bien conocidos por los expertos en la materia e
incluyen, pero no están limitados a fluoresceína/rodamina,
ficoeritrina/Cy7, fluoresceína/Cy5, fluoresceína/Cy5,5,
fluoresceína/LC Red 640, y fluoresceína/LC Red 705.
La muestra nucleótida a analizar puede consistir
en productos de amplificación PCR proporcionados utilizando las
técnicas de ciclación rápida descritas en la patente US No
5.455.175. La ciclación a temperatura rápida, comparada con la
ciclación térmica convencional, muestra que 30 ciclos de
amplificación pueden completarse en 15 minutos y que los productos
PCR resultantes contienen muchos menos productos secundarios. De
este modo, con una ciclación rápida, los tiempos requeridos para la
amplificación se reducen aproximadamente 10 veces, mejorando la
especificidad.
El control en tiempo real de las curvas de fusión
durante el calentamiento lento puede realizarse utilizando
colorantes fluorescentes y sondas marcadas fluorescentes. La
utilización del control fluorescente en tiempo real de las
reacciones de los ácidos nucleicos se ha descrito en la patente US
No 5.455.175 publicada el 3 de octubre de 1995, y en las Solicitudes
de Patente US Números de Serie 08/869.275 y 08/869.276, cada una
presentada el 4 de junio de 1997.
El análisis de las curvas de fusión fluorescente
constituye un método efectivo y rápido para el tipado genotípico.
Véase, por ejemplo, Lay, M.J., y Wittwer, C.T. (1997) Clin. Chem.
43, páginas 2262-2267; Bernard, P. S., y otros
(1998) Anal. Biochem. 255, páginas 101-107; Bernard,
P. S., y otros (1998) Am. J. Pathol. 153, páginas
1055-1061; Lyon, E. y otros (1988) Mol. Diag. 3,
páginas 203-210. La PCR de ciclo rápido y el tipado
genotípico de base única puede realizarse en un único tubo de ensayo
y sin la intervención de etapas en un tiempo de 40 minutos. Los
algoritmos y métodos de la presente invención demuestran que la
transmisión múltiple simultánea de varias señales coloreadas en
solución es posible con cicladores térmicos capaces de fluorescencia
tal como el LightCycler™. Véase Wetmur J.G.(1995) en "Molecular
Biology and Biotechnology" (Meyers, R.A. ed.) páginas
605-608, VCH Publishers, Inc., Nueva York, NY. La
tecnología multipléxica podría aplicarse también a métodos de
cuantificación, tales como los que utilizan controles internos para
PCR competitiva. Sidhu, M.K. y otros (1998) en "Gene
Quantification" (Ferre, F.,Ed., páginas 265-276,
Birkhauser, Boston, MA.
El gen Apo E sirve como un sistema modelo para la
presente invención. Alteraciones de base única en el interior de los
codones 112 y 158 del gen Apo E explican los tres alelos comunes
(\in2, \in3 y \in4) y los seis fenotipos de Apo E. Mahley,
R.W. (1988) "Science" 240, 622-630. Se
sintetizaron dianas oligonucleótidas para proporcionar el tipado
genotípico de la sonda de hibridación adyacente de los alelos de Apo
E. Los pares FRET utilizados son fluoresceína/LC Red 640, y
fluoresceína/LC Red 705. Las secuencias se muestran a continuación
en la Tabla I. Además de la compensación para la dependencia térmica
de los colorantes fluorescentes, los efectos de la concentración de
dianas, de la competencia de las cadenas complementarias, de la
concentración de sondas, de la concentración de Mg^{++}, y de las
condiciones de hibridación previas al análisis de la curva de fusión
son estudiados y optimizados.
Diana \in3 | GGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCG |
GCCGCCTGGTGCAGT^{a}[SEQ ID NO:1] | |
Diana \in4 | GGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGCGC |
GGCCGCCTGGTGCAGT^{a}[SEQ ID NO:2] | |
Sondas fluo- | CCAGGCGGCCGCACACG-fluoresceína[SEQ ID NO:3] |
rescentes | LCT705-CCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCG[SEQ ID NO:4] |
Secuencias para el tipado genotípico del codon 158 | |
Diana \in2 | GCGGCTCCTGCCCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGG |
CAGTGTACCA^{a}[SEQ ID NO:5] | |
Diana \in3 | GCGGCTCCTGCCCGATGCCGATGACCTGCAGAAGCGCCTGG |
CAGTGTACCA^{a}[SEQ ID NO:6] | |
Sondas | ACACTGCCAGGCACTTC-fluoresceína[SEQ ID NO:7] |
fluorescentes | LCR640-GCCAGGTCATCGGCATCGGGGCAGGAGCC[SEQ ID NO:8] |
^{a} El área subrayada indica la región diana de la sonda de fluoresceína; la superficie en negrita indica la localización | |
del desemparejamiento. |
La tasa sonda oligonucleótida/hibridación de la
diana puede determinarse mediante una etapa única de nucleación. Sin
embargo, (el cociente) sonda/hibridación de la diana está
influenciado por la concentración salina, temperatura, y estructura
secundaria. Wetmur, J. G. (1995) en "Molecular Biology and
Biotechnology" (Meyers, R.A., Ed.), páginas
605-608, VCH Publishers, Inc., Nueva York, NY. Se
cree que estas mismas condiciones influencian la calidad del tipado
genotípico durante la fusión sonda/diana. Por ejemplo, áreas
equivalentes de los picos de fusión fluorescente de una muestra
heterocigótica requerirían tener casi las mismas concentraciones de
sondas hibridizadas a cada diana antes de la fusión. De este modo,
para el tipado genotípico, las temperaturas de hibridación son
seleccionadas para optimizar las tasas sonda/hibridación de la
diana. Empíricamente, las máximas tasas sonda/hibridación de la
diana tuvieron lugar a 5-10ºC por debajo de la
T_{m} del duplex. Actualmente, como temperatura de la diana se
utiliza una temperatura de aproximadamente 8ºC por debajo de la
T_{m} del dúplex.
Utilizando temperaturas de hibridación
específicas de la diana para cada sitio, una tasa de transición
gradual antes de la fusión proporcionó el mejor tipado genotípico
(figura 2C). Además, las concentraciones de MgCl_{2} y de la diana
afectan la calidad del tipado genotípico en cada sitio. Una
concentración alta de MgCl_{2} produce una escasa diferenciación
de los picos para el tipado genotípico heterocigótico en el codon
112, pero un tipado genotípico óptimo en el codon 158 en presencia
de una concentración baja de la diana. El tipado genotípico en el
codon 158 depende de una concentración escasa de la diana para que
el dúplex desemparejado quede mejor representado. Una explicación
posible para esto es que la proporción más alta sonda/diana puede
asegurar mejor la saturación de ambas cadenas de la diana antes de
la fusión.
El hallazgo de que los sitios optimizan a
distintas concentraciones de la matriz sugiere que el ciclo en el
cual la amplificación se detiene y la investigación del principio de
la secuencia son importantes. El análisis de la curva de fusión
empieza habitualmente después de que la fase de meseta de la
amplificación se alcance. Véase Bernard, P.S., y otros (1998) Anal.
Biochem. 255, páginas 101-107; Bernard, P.S., y
otros (1998) Am. J. Pathol. 153, páginas 1055-1061.
Sin embargo, este punto puede representar un retraso excesivo para
el tipado genotípico en los sitios tales como el codon 158. Como
alternativa, el análisis de la curva de fusión puede programarse
para que se inicie en cualquier ciclo con objeto de proporcionar un
tipado genotípico óptimo.
Para la transmisión múltiple simultánea de varias
señales de las sondas de hibridación mediante el color, se escogió
una concentración salina y una concentración de la diana única. Se
escogió una concentración salina baja debido al codon 112 y debido
al codon 158, una concentración matricial baja. La concentración más
baja de MgCl_{2} disminuyó el área del pico desemparejado en el
codon 158. Sin embargo, este efecto se corrigió parcialmente
haciendo descender la temperatura de hibridación para que la
transmisión múltiple simultánea de varias señales tuviera lugar en
una cuantía superior a 8ºC por debajo de la T_{m}, la temperatura
inicialmente seleccionada. La temperatura de hibridación más baja
utilizada para la transmisión múltiple simultánea de varias señales
no fue necesaria para el análisis en un único sitio en el codon 158,
ya que podrían producirse picos heterocigóticos equivalentes con una
concentración más alta de MgCl_{2}. En general, puede ser
necesario utilizar temperaturas de hibridación inferiores a 8ºC por
debajo de T_{m} para aumentar la hibridación sonda/diana bajo
concentraciones bajas de MgCl_{2}.
La fase de meseta de la amplificación se debe en
gran parte a las cadenas de producto complementarias que se acumulan
compitiendo por los sitios de hibridación de los iniciadores.
Wittwer, C.T. y otros (1997) "BioTechniques" 22, páginas
130-138. Esto estaría de acuerdo con la competición
con respecto a la diana que se observa entre la cadena
complementaria y las sondas de hibridación, durante el tipado
genotípico. Aunque esta competición no evita el análisis de la curva
de fusión de las mutaciones de la progenie germinal, puede limitar
la sensibilidad de la detección de las mutaciones somáticas dentro
del producto antecedente de tipo salvaje. Se han desarrollado varias
técnicas para evitar la competición a partir de la cadena no diana
durante el análisis. Por ejemplo, las sondas ácido nucleicas
peptídicas (PNA) compiten efectivamente contra la cadena
complementaria formando un dúplex extraordinariamente estable con la
diana. Egholm, M., y otros (1993) "Nature" 365, páginas
566-658. Otra alternativa es unir la sonda a un
soporte sólido y eliminar entonces la cadena competidora. Pastinen,
T., y otros (1996) Clin. Chem. 42, páginas
1391-1397. La tipificación genotípica mediante
amplificación PCR asimétrica previa a la curva de fusión reduciría
la competición, manteniendo al mismo tiempo un ensayo homogéneo.
Además, otras técnicas producen directamente un producto
monocatenario, tal como la amplificación basada en la secuencia de
ácido nucleico (NASBA) o la amplificación mediante círculo rodante.
Reitsma, P. H., y otros (1996) Blood Coagul. Fibrinolysis 7, páginas
659-663; Lizardi, P. M., y otros (1998) Nat.
Technol. 19, páginas 225-232.
Algoritmos de compensación de color de la técnica
anterior, desarrollados para la citometría de flujo, no compensan
con respecto a cambios en las ganancias de señal o en los efectos de
entrecruzamiento dependiente de la temperatura. El cambio en los
coeficientes de entrecruzamiento con la temperatura no constituye
una ventaja cuando la temperatura permanece constante. Sin embargo,
con el análisis de la curva de fusión, la temperatura varía de 40 a
95ºC y surgen errores significativos si los datos de calibración
utilizados para derivar los coeficientes de entrecruzamiento se
obtienen a una temperatura diferente que los datos a ser evaluados.
El planteamiento de la presente invención es conseguir un
procesamiento de calibración con respecto a una subida lenta de la
temperatura y el cálculo de coeficientes de entrecruzamiento
específicos de la temperatura para cada temperatura, interpolando un
polinomio de tercer grado. Esto es, se calcula una matriz de
entrecruzamiento térmico específica para la temperatura de cada
punto de datos que va a ser evaluado. De modo similar, la corrección
de la ganancia es posible calculando una nueva matriz a partir de
los valores de fluorescencia que se multiplican por la proporción de
la ganancia del punto de datos con respecto al procesamiento de
calibración. Mientras las ganancias de la señal electrónica estén
aseguradas, la nueva matriz del coeficiente de entrecruzamiento casa
con los datos experimentales.
La compensación de color para el solapamiento
espectral de los colorantes fluorescentes se ha modificado a partir
de las técnicas de citometría de flujo. Véase Bagwell, C.B. y Adams,
E.G. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. páginas 677,
167-184. El software del análisis de costumbre se
elaboró en LabView (National Instruments, Austin, TX). En resumen,
se obtuvo en primer lugar un procesamiento de calibración de cada
oligonucleótido fluorescente puro y control de autofluorescencia con
valores de fluorescencia conseguidos en cada canal. A partir de
estos valores se calculan constantes de entrecruzamiento de señales
y se utilizan para convertir la fluorescencia observada (o) a la
fluorescencia de la señal actual (s) mediante álgebra matricial.
Varias modificaciones para los algoritmos de
compensación de color desarrolladas para la citometría de flujo
fueron necesarias para utilización en los datos de tipado
genotípico. Siguiendo la notación dada en Bagwell, C.B., y Adams,
E.G. (1993) Ann. N.Y. Acad. Sci. 677, páginas
167-184, que se incorporan en la presente invención
como referencia, y eliminando la consecución de sucesos múltiples
(relacionada con la citometría de flujo pero no con la fluorescencia
de la solución), las constantes de entrecruzamiento son:
en
donde:
k(i,j) | = | señal de entrecruzamiento del colorante i en el canal j |
o(i,j) | = | señal observada del colorante i en el canal j |
a(j) | = | autofluorescencia en el canal j |
n | = | índice del canal |
N | = | canal máximo |
Experimentos preliminares han mostrado que la
fluorescencia de algunos de los colorantes, y las constantes de
entrecruzamiento de algunas combinaciones de colorante/canal,
dependen de la temperatura sobre el intervalo deseado del análisis
(40-95ºC). Por lo tanto, los procesamientos de
calibración se obtuvieron consiguiendo valores de fluorescencia
continuamente durante una subida de temperatura de 0,2ºC/s entre 40
y 95ºC. Las curvas de temperatura con respecto a la fluorescencia
fueron casi lineales, pero se aproximaron mejor mediante polinomios
de tercer grado. Los coeficientes polinómicos de tercer grado para
las curvas de temperatura con respecto a la fluorescencia de cada
una de las combinaciones colorante/canal y los controles de
autofluorescencia de cada canal se almacenaron para la interpolación
de la temperatura.
Para compensar los datos de la fluorescencia del
color, la temperatura de cada adquisición se utilizó para interpolar
la fluorescencia térmico-específica a partir de las
curvas de calibración. Estos valores se ajustaron entonces para
cualquier cambio en la ganancia electrónica entre la calibración y
el procesamiento de los datos de la manera siguiente:
o(i,j) | = | [w(i,j)T^{3} + x(i,j)T^{2} + y(i,j)T + z(i,j)] [G_{D}(j)/G_{C} (j)] |
a(j) | = | [m(j)T^{3} + n(j)T^{2} + p(j)T + q(j)][G_{D} (j)/G_{C} (j)] |
en
donde:
- w(i,j), x(i,j), y(i,j) y z(i,j) son coeficientes polinómicos de tercer grado para las curvas de temperatura con respecto a fluorescencia del colorante i en el canal j, y m(j), n(j), p(j) y q(j) son coeficientes polinómicos de tercer grado para la curva de temperatura con respecto a la de fluorescencia autofluorescencia en el canal j
T | = | temperatura de adquisición |
G_{D}(j) | = | ganancia del canal (j) durante el procesamiento de d datos |
G_{C}(j) | = | ganancia del canal j durante el procesamiento de calibración |
La fluorescencia de la señal real de cada
colorante se calcula mediante la ecuación matricial:
en
donde:
S | = | fluorescencia de la señal real de cada colorante |
K | = | constante de entrecruzamiento de cada colorante en cada canal |
O | = | fluorescencia observada en cada canal |
A | = | autofluorescencia observada en cada canal |
Si se desea la corrección de la temperatura, así
como la compensación del color, los datos de calibración compensan
el color mediante el método anterior y las curvas de temperatura con
respecto a la fluorescencia de la señal real se adecuan a los
polinomios de tercer grado y los coeficientes se conservan para la
interpolación térmica. El procesamiento de los datos compensa el
color, y la fluorescencia de cada colorante durante cada adquisición
corrige la temperatura de la forma siguiente:
en
donde:
s_{TC} | = | fluorescencia de la señal corregida para la temperatura |
s | = | fluorescencia de la señal |
s_{C}(T_{s}) | = | fluorescencia de la señal interpolada a partir del procesamiento de calibración a una |
temperatura estándar (seleccionada por el usuario) | ||
s_{C}(T_{D}) | = | fluorescencia de la señal interpolada a partir del procesamiento de calibración a la |
temperatura de adquisición de los datos |
Un ejemplo de los resultados de la compensación
de color y de la corrección de la temperatura se muestra en la
figura 5.
La secuencia del gen de la apolipoproteína E
humana (número de registro K00396 de GenBank) se utilizó para
diseñar cadenas diana no marcadas, cadenas (complementarias)
competitivas no marcadas, y sondas marcadas fluorescentemente. Las
secuencias se muestran anteriormente en la Tabla 1. Todos los
oligonucleótidos se sintetizaron mediante la química de la
fosforamidita estándar (Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus,
Piscataway, NJ). Las sondas aceptoras LC Red 640 (LightCycler Red
640) y LC Red 705 (LightCycler Red 705) marcadas en el extremo 5' se
sintetizaron utilizando un modificador C6dT amino (Glen Research,
Sterling, VA) y fosforamidita LC Red 705 (Roche Molecular
Biochemicals), respectivamente. El éster LC Red
640N-hidroxisuccinimídico (Roche Molecular
Biochemicals) se conjugó manualmente a una concentración equimolar
de oligonucleótido en tampón borato 0,1 M, pH 9,0. La incubación se
llevó a cabo durante dos horas en la oscuridad. Ambas sondas
aceptoras se sintetizaron con un reactivo de fosforilación químico
(Glen Research) en el extremo 3'. Las sondas marcadas con
3'-fluoresceína se sintetizaron sobre casetes de
vidrio poroso controlados por fluoresceína (BioGenex, San Ramón,
CA).
Se conservó un grupo 5'-tritilo
durante la síntesis sobre la diana oligonucleótida y las cadenas
competidoras, la sonda LC Red 640 pre-conjugada y
las sondas marcadas con fluoresceína. Las secuencias de longitud
completa para todos los oligonucleótidos y las sondas se purificaron
mediante cromatografía líquida de alta presión C18 de fase inversa
(HPLC) utilizando una columna Waters Symmetry 4,6 x 150 mm de 3,5
\mu (Waters, Milford, MA). La fase móvil consistía en 0,1
mol/acetato de trietilamonio, pH 7,0, y un gradiente de acetonitrilo
(1 ml/minuto) de 10 a 30% (sonda de fluoresceína) o de 10 a 80%
(oligonucleótidos no marcados y sonda LC Red 705). El eluado se
controló con absorbancia tándem y detectores de fluorescencia
(Waters 486 y 474, Milford, MA). Para las sondas, se recuperaron
fracciones con A_{260} coincidentes y picos de fluorescencia. La
destritilación final se llevó a cabo en una columna Polypack (Glen
Research, Sterling, VA) y los productos se eluyeron con acetonitrilo
al 50%.
Los oligonucleótidos y sondas se secaron al
vacío, se volvieron a suspender en 1 mM de Tris-HCl,
0,1 mM de EDTA, pH 8,0 y entonces, fueron cuantificados. Se
utilizaron oligonucleótidos no marcados con valores
A_{260}/A_{280} entre 1,6 y 1,8. La proporción de la
concentración de fluoróforo a oligonucleótido se calculó para cada
sonda. Las sondas con proporciones fuera del intervalo 0,9 - 1,1 se
purificaron posteriormente sobre un gel de poliacrilamida al 15%
desnaturalizado que contenía 7M de urea, seguido por HPLC para
eliminar la urea.
Se utilizó una sonda de 17 unidades isoméricas
marcada con 3'-fluoresceína en cada codon para el
tipado genotípico. Aunque estas sondas eran distintas
secuencialmente, ambas formaban un desemparejamiento A:C flanqueado
por pares C:G cuando se hibridizaron a la diana no complementaria
(Tabla 1). El desemparejamiento en ambos dúplex se situó en un lugar
situado 5 pares de bases a partir del extremo 3' de la sonda.
El tipado genotípico en cada sitio se optimizó
para concentraciones de reactivo y condiciones de hibridación
previas al análisis de la curva de fusión (véanse Ejemplos 2 y 3 a
continuación). Las concentraciones de MgCl_{2}, cadena diana,
cadena competitiva, y sonda de fluoresceína variaron. Las
concentraciones de MgCl_{2} variaron entre 1 y 5 mM. Las
concentraciones de oligonucleótidos diana variaron entre 0,05 y 0,2
\muM, y los oligonucleótidos competitivos se encontraban en una
concentración equimolar con respecto a la cadena diana. Las sondas
marcadas con fluoresceína variaron entre 0,1 y 0,2 \muM. Cada 10
\muL de reactivos contenía también 50 mM Tris, pH 8,5 (25ºC), 250
\mug/ml albúmina sérica bovina y 0,2 \muM de la sonda aceptora
(LC Red 640 o LC Red 705). La figura 2 muestra las distintas
condiciones térmicas utilizadas para la hibridación de las sondas
antes del tipado genotípico. Las muestras heterocigóticas se
utilizaron para determinar las condiciones ópticas para el tipado
genotípico, evaluadas como curvas de Gauss de forma similar y áreas
de pico equivalentes.
Para el tipado genotípico de la transmisión
múltiple simultánea de varias señales se necesitaron reactivos
habituales y un protocolo de temperatura única. Los reactivos
utilizados fueron 1 mM de MgCl_{2}, 0,05 \muM de
oligonucleótidos diana para cada sitio, 0,2 \muM de la sonda
aceptora para cada sitio, 0,1 \muM de la sonda marcada con
fluoresceína que comprende el codon 112 y 0,2 \muM de la sonda
marcada con fluoresceína que comprende el codon 158. El protocolo
térmico para el tipado genotípico de la transmisión múltiple
simultánea de varias señales se proporciona en la figura 2C.
Las muestras se cargaron en cubetas capilares
compuestas por plástico/vidrio, se taparon, se centrifugaron
brevemente y se cargaron en el dispositivo rotatorio de 32 muestras
de un ciclador térmico con una capacidad de control de la
fluorescencia de 3 colores (LightCycler™, Roche Molecular
Biochemicals). Se incluyeron doce muestras en cada procesamiento
analítico de la curva de fusión. Durante la fase de calentamiento
lento (0,1ºC/s) del protocolo de tipado genotípico, se controló
continuamente la fluorescencia con adquisiciones de 100 ms. Los
valores de fluorescencia de la fluoresceína, LC Red 640 y LC Red 705
se adquirieron en una coincidencia temporal exacta, utilizando una
disposición lineal de los filtros de paso de banda dicroico. Véase
Wittwer, C.T., y otros (1997) BioTechniques 22, páginas
176-181. Los datos se mostraron como gráficas
fluorescencia (F) con respecto a temperatura (T) y como derivada de
la fluorescencia (-dF/dT) con respecto a la temperatura, tal como se
muestra en las figuras 1C y 1D.
La calidad del análisis de la curva de fusión
depende no sólo del protocolo de fusión, sino también de las
condiciones de hibridación antes de la obtención de la curva de
difusión. La figura 2 muestra que los protocolos de hibridación con
una temperatura que cambia lenta y gradualmente dan lugar a picos de
fusión heterocigótica más simétricos que la hibridación que utiliza
una única transición térmica rápida. Este resultado se observó
incluso aunque los tiempos totales de hibridación fueran
aproximadamente los mismos (compárense las figuras 2A, B, y C)
sugiriendo que el enfriamiento lineal a través de las T_{m} de
cada dúplex favorece la formación idéntica de cada dúplex.
La Tabla 2 muestra una comparación de los cambios
de T_{m} creados por el mismo desemparejamiento en dos sitios,
utilizando distintas concentraciones de MgCl_{2}. Los
desemparejamientos desestabilizan los dúplex sonda/diana en cada
sitio en aproximadamente la misma magnitud. Además, la
\DeltaT_{m} entre los dúplex emparejados y desemparejados
aumentó con una concentración más alta de MgCl_{2}, mientras que
el aumento de la concentración de la sonda de fluoresceína
incrementó las T_{m} de ambos dúplex sin afectar a
\DeltaT_{m} (datos que no se muestran).
[MgCl_{2}] | codon | sonda: diana | T_{m} del dúplex | \DeltaT_{m} |
1 mM | 112 | A:T | 70,0 | |
5,9 | ||||
A:C | 64,1 | |||
158 | A:T | 62,4 | ||
6,6 | ||||
A:C | 55,8 | |||
3 mM | 112 | A:T | 71,2 | |
6,5 | ||||
A:C | 64,7 | |||
158 | A:T | 64,2 | ||
7,0 | ||||
A:C | 57,2 |
La resolución clara de un heterocigoto en el
codon 112 (incluido en un 82% de la sonda GC) dependió de una
concentración baja de MgCl_{2} (figura 3A con respecto a 3B). En
contraste, el tipado genotípico del heterocigoto en el codon 158
(incluido en un 59% de la sonda GC) fue más simétrico con una
concentración más alta de MgCl_{2} y una concentración baja de la
diana (figura 3C con respecto a 3D).
El tipado genotípico a partir de un producto
bicatenario (es decir, concentraciones iguales de diana y cadena
complementaria) se muestra en la figura 4. En presencia del
competidor (cadena complementaria), el tipado genotípico optimizó a
los mismos parámetros mostrados en la figura 3, pero con una
reducción en la señal de fluorescencia de aproximadamente el 60% en
cada sitio.
La figura 5 muestra el efecto de la compensación
del color y de la corrección de la temperatura aplicados a un
procesamiento de calibración y a la transmisión múltiple simultánea
de varias señales del color del locus Apo E. La dependencia térmica
de LC Red 705 es sustancial, mientras que la fluorescencia de LC Red
640 es casi constante con la temperatura (figura 5A). Tal como se
esperaba, sólo la muestra de calibración LC Red 705 muestra
fluorescencia después de la compensación del color (figura 5B) y la
dependencia de la temperatura se elimina después de la corrección de
la temperatura (figura 5C). Las huellas de la fluorescencia original
con respecto a la temperatura para el canal LC Red 705 (codon 112)
son complejas y no interpretables, debido al solapamiento de la
fluorescencia de LC Red 640 (figura 5D). Sin embargo, las
transiciones únicas de temperatura se distinguen después de la
compensación del color (figura 5E). Después de la corrección de
temperatura (figura 5F), la pendiente de línea de base fuera de la
región de transición de la fusión aumenta.
La transmisión múltiple simultánea de varias
señales por el color y la T_{m} proporciona la identificación
simultánea de variantes en los codones 112 y 158 en un tubo de
ensayo único a los diez minutos. La figura 6 muestra los picos de
fusión fluorescente no compensados (A) y compensados (B) para el
tipado genotípico del codon 112. Sin compensación, existe un vertido
sustancial desde el colorante aceptor LC Red 640 al canal para el
control del colorante aceptor LC Red 705 (figura 6A). Esto da lugar
a productos evidentes con T_{m} de 55ºC y 62ºC. Sin embargo, estos
picos adicionales desaparecen después de la compensación, revelando
los genotipos homocigóticos verdaderos en el codon 112. La totalidad
de los genotipos para las 6 isoformas de la proteína Apo E que se
encuentran naturalmente podrían distinguirse utilizando este método.
Además, los otros 3 posibles genotipos que no se encuentran
normalmente en las poblaciones humanas se construyeron utilizando
matrices sintetizadas y se analizaron correctamente (datos que no se
muestran).
El tipado genotípico de la transmisión múltiple
simultánea de varias señales se mostró óptimo utilizando
concentraciones bajas tanto de la diana como de MgCl_{2}.
Utilizando la concentración más baja de MgCl_{2} para el tipado
genotípico del codon 158, disminuyó el área del pico del dúplex
desemparejado. Sin embargo, la asimetría resultante en los picos
heterocigóticos podría compensarse parcialmente disminuyendo la
temperatura de la diana de hibridación (desde 48ºC a 42ºC) antes de
la fusión (figura 7).
\vskip0.333000\baselineskip
<110> Fundación para la Investigación de la
Universidad de Utah
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Compensación de color para ganancias
térmicas y electrónicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<130> 7475-66797
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<140>
\vskip0.333000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<150> 09/374,422
\vskip0.333000\baselineskip
<151>
1999-08-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
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<211> 56
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<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
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\dddseqskipggcgcaggcc cggctgggcg cggacatgga ggacgtgtgc ggccgcctgg tgcagt
\hfill56
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<210> 2
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<211> 56
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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\dddseqskipggcgcaggcc cggctgggcg cggacatgga ggacgtgcgc ggccgcctgg tgcagt
\hfill56
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<210> 3
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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\dddseqskipccaggcggcc gcacacg
\hfill17
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<210> 4
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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\dddseqskipcctccatgtc cgcgcccagc cgggcctgcg
\hfill30
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<210> 5
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<211> 51
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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\dddseqskipgcggctcctg cccgatgccg atgacctgca gaagtgcctg gcagtgtacc a
\hfill51
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<211> 51
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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\dddseqskipgcggctcctg cccgatgccg atgacctgca gaagcgcctg gcagtgtacc a
\hfill51
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<210> 7
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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\dddseqskipacactgccag gcacttc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 29
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgccaggtcat cggcatcggg gcaggagcc
\hfill29
Claims (17)
1. Método para la determinación de la presencia
de, por lo menos, dos analitos en una muestra, que comprende:
proporcionar por lo menos dos entidades
detectoras, comprendiendo cada una de ellas un marcaje fluorescente
distinto del marcaje fluorescente de cualquiera de las otras
entidades detectoras, y siendo capaz cada una de dichas entidades de
unirse específicamente con sus respectivos analitos,
contactar la muestra con las entidades detectoras
para permitir la unión específica de los analitos y de las entidades
detectoras,
excitar cada una de dichas entidades marcadas con
luz de una longitud de onda apropiada para inducir
fluorescencia,
determinar los valores de fluorescencia de las
entidades marcadas en por lo menos dos canales espectrales distintos
a través de un intervalo térmico, y
compensar dichos valores para el solapamiento
espectral, en el que la etapa de compensación incluye la corrección
de la dependencia de la temperatura de los valores de la
fluorescencia.
2. Método, según la reivindicación 1, en el que
la corrección con respecto a la dependencia térmica se lleva a cabo
calculando un coeficiente de solapamiento específico de la
temperatura.
3. Método, según la reivindicación 1, en el que
los analitos son productos de amplificación de ácidos nucleicos.
4. Método, según la reivindicación 3, que
comprende además la etapa de determinar el tipado genotípico de cada
uno de los productos de amplificación de ácido nucleico.
5. Método, según la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de compensación de dichos valores con
respecto a la ganancia del amplificador.
6. Método, según la reivindicación 1, en el
que:
la muestra es una muestra de ácido nucleico,
los analitos comprenden un primer locus y un
segundo locus del ácido nucleico y las entidades detectoras
comprenden,
una primera entidad detectora que comprende un
primer marcador fluorescente que es específico para el primer locus,
y
una segunda entidad detectora que comprende un
segundo marcador fluorescente que es específico para el segundo
locus, y
en el que la etapa de determinación incluye la
medición de una primera señal fluorescente de la primera entidad
detectora en un primer canal espectral y una segunda señal
fluorescente de la segunda entidad detectora en un segundo canal
espectral.
7. Método, según la reivindicación 6, en el que
la etapa de compensación se lleva a cabo calculando un coeficiente
dependiente de la temperatura.
8. Método, según la reivindicación 7, que
comprende además la etapa de compensación con respecto a la ganancia
del amplificador.
9. Método, según la reivindicación 6, en el que
la primera entidad detectora comprende además una secuencia de ácido
nucleico complementaria de, por lo menos, una parte del primer
locus, y la segunda entidad detectora comprende además una secuencia
de ácido nucleico complementaria de, por lo menos, una parte del
segundo locus.
10. Método, según la reivindicación 9, en el que
la etapa de contacto incluye la hibridación de la primera y segunda
entidades detectoras a sus loci respectivos, y la etapa de
determinación incluye el control de señales fluorescentes en los
canales espectrales durante el calentamiento para fundir las
entidades detectoras de sus loci respectivos.
11. Método, según la reivindicación 10, en el que
la etapa de contacto se realiza disminuyendo la temperatura
1ºC/s.
12. Método, según la reivindicación 6, en el que
el primer locus posee un primer alelo, el primer marcaje
fluorescente comprende un primer colorante donante, un primer
colorante aceptor, y un primer par de oligonucleótidos, unido cada
uno de ellos a uno de los colorantes, y siendo cada uno de ellos
complementario a regiones vecinas del primer alelo del primer
locus.
13. Método, según la reivindicación 12, en el que
el segundo locus posee un primer alelo, el segundo marcaje
fluorescente comprende un segundo colorante donante, un segundo
colorante aceptor, y un segundo par de oligonucleótidos, unido cada
uno de ellos a uno de los colorantes, y siendo cada uno de ellos
complementario a regiones vecinas del primer alelo del segundo
locus.
14. Método, según la reivindicación 13, en el que
el primer colorante donante es fluoresceína y el primer colorante
aceptor es LC Red 705.
15. Método, según la reivindicación 14, en el que
el segundo colorante donante es fluoresceína y el segundo colorante
aceptor es LC Red 640.
16. Método, según la reivindicación 12, en el que
el primer locus posee múltiples alelos y la concentración de
Mg^{++} es optimizada para producir picos de fusión simétricos
para los alelos, cuando los valores compensados de las señales se
grafican como -dF/dT con respecto a temperatura.
17. Método, según la reivindicación 12, en el que
el primer locus posee múltiples alelos, y la concentración del ácido
nucleico que comprende el primer locus es optimizada para producir
picos de fusión simétricos para los alelos, cuando los valores
compensados de las señales se grafican como -dF/dT con respecto a
temperatura.
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