ES2197331T3

ES2197331T3 - Medio de contraste estabilizado termicamente.

Info

Publication number: ES2197331T3
Application number: ES97903507T
Authority: ES
Inventors: Marit Swaerd-Nordmo; Per Helge Gulliksen; Jorunn Undheim Braenden; Anne Kjersti Fahlvik
Original assignee: Amersham Health AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1996-02-19
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2017-02-19
Also published as: CN1092988C; EP0885016B1; JP4250747B2; EP0885016A1; DE69720979D1; AU722735B2; EA000900B1; JP2000506122A; CA2246778A1; CZ262698A3; ATE237362T1; NO313815B1; HUP9900812A2; AU1805197A; CN1213971A; EE9800248A; KR100501863B1; IL125800A0; EA199800739A1; PL328309A1

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA VESICULA SECADA POR CONGELACION QUE CONTIENE UN AGENTE DE CONTRASTE PARA ULTRASONIDOS QUE CONTIENE UN ESTABILIZADOR PARA EL SECADO POR CONGELACION Y TERMICAMENTE ESTABLE A TEMPERATURAS SUPERIORES A 20 (GRADOS) C.

Description

Medio de contraste estabilizado térmicamente.

Esta invención se refiere a vesículas estabilizadas térmicamente liofilizadas que contienen agentes de contraste de ultrasonidos y un procedimiento para su preparación.

Las vesículas (el término se usa en este documento para referirse estructuras unilamelares y multilamelares, por ejemplo estructuras tales como liposomas, micelas, microburbujas y micro-globos) se usan frecuentemente como medios para liberar agentes terapéuticamente o diagnósticamente activos. En el campo de los medios de contraste de imágenes ultrasónicas, las vesículas que contienen materiales (en este documento se citan como materiales vesiculares) que son gaseosos a la temperatura corporal pueden usarse como agentes de contraste ecogénicos, particularmente para la administración en la vasculatura.

Los medios de contraste vesiculares se administrarán generalmente en forma de dispersión acuosa que contiene una baja concentración de vesículas con respecto al medio de soporte acuoso. Por consiguiente, el almacenamiento y transporte de tales agentes de contraste vesicular se hace significantemente más eficaz si las vesículas pueden almacenarse en forma seca.

La liofilización de composiciones vesiculares en posible y, para esto, se incluyen generalmente excipientes de formulación en la composición para ayudar en la técnica de secado. Tales excipientes tienen una de dos funciones. Se añaden agentes de carga para aumentar el contenido total de sólidos para conseguir un producto mecánicamente más fuerte. Se añaden estabilizadores, también llamados crioprotectores o lioprotectores, para ayudar a la formación del estado cristalino producido durante la deshidratación y para dar fuerza física al producto seco. Los Ejemplos de estabilizadores usados de esta forma incluyen manitos y glucosa.

Los agentes de contraste de ultrasonidos de vesículas liofilizadas, aunque que proporcionan ventajas para el transporte y almacenamiento debido a la reducción en volumen con respecto a las dispersiones acuosas listas para usar, también causan problemas ya que el producto liofilizado no es estable térmicamente en el intervalo de temperaturas ambientales encontradas normalmente durante el transporte y el almacenamiento, y como resultado deben mantenerse, antes de la producción secundaria, en un medio en el cual la temperatura se mantenga por debajo de la temperatura ambiente (por ejemplo de 5 a 10ºC).

Sorprendentemente, se ha descubierto que mediante la elección adecuada del estabilizador usado para la liofilización es posible producir agentes de contraste de ultrasonidos de vesículas liofilizadas que son estables térmicamente a la temperatura ambiente y superiores, y de hecho, a todas las temperaturas encontradas normalmente durante el transporte y almacenamiento.

El producto estable térmicamente liofilizado puede almacenarse y transportarse sin necesidad de control de la temperatura ambiental y en particular puede suministrarse a hospitales y médicos para la formulación in situ en una dispersión administrable sin requerir que tales usuarios tengan instalaciones de almacenamiento especiales.

Visto de esta manera un aspecto de esta invención proporciona un agente de contraste de ultrasonidos liofilizado que contiene vesículas y que contiene un estabilizador de liofilización o mezcla de estabilizadores, en donde (i) la relación de peso de dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores con las vesículas en dicho agente es al menos 10:1, (ii) dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores tiene un valor Tg superior a 20ºC (Preferiblemente por lo menos 22ºC, especialmente preferiblemente al menos 25ºC, más preferiblemente por lo menos 30ºC, y especialmente preferiblemente al menos 40ºC, por ejemplo, hasta los 65ºC o más) y un valor Tg' de -37ºC o superior (más preferiblemente más de -36ºC, especialmente preferiblemente más de -35ºC, por ejemplo de -10 a -37ºC), (iii) y dicho agente es estable térmicamente a temperaturas superiores a 20ºC (preferiblemente al menos 22ºC, especialmente preferiblemente al menos 25ºC, más preferiblemente al menos 30ºC y especialmente preferiblemente al menos 30ºC, por ejemplo, hasta los 65ºC o más).

Desde otro aspecto adicional, la invención proporciona un proceso para la preparación de un agente de contraste de ultrasonidos que contiene vesículas liofilizado y estable térmicamente que es estable térmicamente a temperaturas superiores a 20ºC (preferiblemente al menos 22ºC, especialmente preferiblemente al menos 25ºC, más preferiblemente al menos 30ºC, y especialmente preferiblemente al menos 30ºC, por ejemplo hasta los 65ºC o más), comprendiendo dicho proceso liofilizar una dispersión acuosa que comprende un agente de contraste de ultrasonidos vesicular y un estabilizador de liofilización o mezcla de estabilizadores, caracterizado porque dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores está presente en dicha dispersión en una relación de peso con respecto a las vesículas de la misma de al menos 10:1, y porque dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores tiene un valor Tg superior a 20ºC (Preferiblemente por lo menos 22ºC, especialmente preferiblemente al menos 25ºC, más preferiblemente por lo menos 30ºC, y especialmente preferiblemente al menos 40ºC, por ejemplo, hasta los 65ºC o más) y un valor Tg' de -37ºC o superior (preferiblemente más de -36ºC, especialmente preferiblemente más de -35ºC, por ejemplo de -10 a -37ºC).

Desde otro aspecto más, la invención proporciona el uso de un estabilizador de liofilización o mezcla de estabilizadores que tienen un valor Tg superior a 20ºC (preferiblemente por lo menos 22ºC, especialmente preferiblemente al menos 25ºC, más preferiblemente por lo menos 30ºC, y especialmente preferiblemente al menos 40ºC, por ejemplo, hasta los 65ºC o más) y un valor Tg' de -37ºC o más (preferiblemente más de -36ºC, especialmente preferiblemente más de -35ºC, por ejemplo de -10 a -37ºC) en la fabricación de un agente de contraste de ultrasonidos que contiene vesículas que es estable térmicamente a temperaturas superiores a 20ºC (preferiblemente al menos 22ºC, especialmente preferiblemente al menos 25ºC, más preferiblemente al menos 30ºC, y especialmente preferiblemente al menos 30ºC, por ejemplo hasta los 65ºC o más), y que contiene dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores en una relación de peso con respecto a las vesículas del mismo de al menos 10:1.

Visto desde otro aspecto adicional la invención proporciona un proceso para el almacenamiento o transporte de un agente de contraste de ultrasonidos que contiene vesículas liofilizado como se ha descrito anteriormente, en donde dicho almacenamiento o transporte tiene lugar sin refrigeración.

Visto desde todavía otro aspecto adicional la invención proporciona un proceso para la preparación de un agente de contraste de ultrasonidos que contiene vesículas que comprende dispersar un agente de contraste de ultrasonidos que contiene vesículas liofilizado como se ha descrito anteriormente en un medio de dispersión acuoso tolerable fisiológicamente.

Para cualquier material, Tg es la temperatura de transición vítrea del material seco mientras que Tg' es la temperatura de transición vítrea de la solución acuosa pura concentrada al máximo.

Además de la estabilidad térmica mejorada, los agentes de contraste vesicular liofilizados de acuerdo con la invención también mejoran sorprendentemente la capacidad de las vesículas para retener los gases hidrocarburos halogenados y los precursores gaseosos usados comúnmente en los agentes de contraste de ultrasonidos.

En la invención, el agente de contraste de ultrasonidos puede ser cualquier agente vesicular ecogénico tolerable fisiológicamente. Sin embargo, preferiblemente, las vesículas contendrán un gas o precursor gaseoso (por ejemplo, un compuesto o mezcla de compuestos que está en forma sustancialmente gaseosa (incluyendo vapor) a temperaturas corporales humanas normales (37ºC). Puede emplearse cualquier gas biocompatible, precursor gaseoso, o mezcla. De esta forma, el gas puede, por ejemplo, comprender aire; nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono, hidrógeno, óxido nitroso, un gas inerte tal como helio, argón, xenón, o criptón; un fluoruro de azufre tal como hexafluoruro de azufre, decafluoruro de diazufre o pentafluoruro de trifluometilazufre; hexafluoruro de selenio; un silano opcionalmente halogenado tal como tetrametilsilano; un hidrocarburo de bajo peso molecular (por ejemplo que contenga hasta 7 átomos de carbono), por ejemplo un alcano tal como metano, etano, un propano, un butano, o un pentano, un cicloalcano tal como ciclobutano o ciclopentano, un alqueno tal como propeno, o un buteno, o un alquino tal como acetileno; un éter; una cetona; un éster; un hidrocarburo halogenado de bajo peso molecular (por ejemplo que contenga hasta 7 átomos de carbono); o una mezcla de cualquiera de los anteriores. Al menos algunos de los átomos halógenos en los gases halogenados son ventajosamente átomos de flúor. De esta forma, gases de hidrocarburos halogenados biocompatibles pueden, por ejemplo, seleccionarse entre bromoclorodifluorometano, clorodifluorometano, diclorodifluorometano, bromotrifluorometano, clorotrifluorometano, cloropentafluoretano, diclorotetrafluoroetano y perfluorocarburos, por ejemplo perfluoroalcanos tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropanos, perfluorobutanos (por ejemplo perfluoro-n-butano, opcionalmente en mezcla con otros isómeros tales como perfluoro-iso-butano), perfluoropentanos, perfluorohexanos y perfluoroheptanos; perfluoroalquenos tales como perfluoropropeno, perfluorobutenos (por ejemplo perfluorobut-2-eno) y perfluorobutadieno; perfluoroalquinos tales como perfluorobut-2-ino; y perfluorocicloalcanos tales como perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, perfluorodimetilciclobutanos, perfluorotrimetilciclobutanos, perfluorociclopentano, perfluorometilciclopentano, perfluorodimetilciclopentanos, perfluorociclohexanos, perfluorometilciclohexano y perfluorocicloheptano. Otros gases halogenados incluyen fluorados, por ejemplo, cetonas perfluoradas tales como perfluoroacetona y éter fluorados, por ejemplo, tales como perfluorodietil éter.

De forma particularmente preferida, las vesículas contendrán un perfluoroalcano, especialmente un perfluorobutano, perfluoropentano, o perfluorohexano, en particular n-perfluorobutano.

En las vesículas, la membrana puede formarse con cualquier material que forme una membrana tolerable fisiológicamente, en particular fosfolípidos, y puede estar reticulada o no reticulada. Las membranas formadas de mezclas de fosfolípidos cargados y no cargados son especialmente preferidas y es particularmente preferido que las vesículas lleven una carga superficial neta, preferiblemente una carga negativa. Tales vesículas fosfolípidas tienen tiempos de residencia en la sangre particularmente favorables.

Las vesículas pueden suministrarse además con un agente de prolongación de residencia en sangre, por ejemplo conjugando un agente a la membrana o a un grupo lipófilo que se colocará dentro de la membrana. Tales agentes de prolongación de residencia en sangre, por ejemplo óxidos de polialquileno tales como polietilen glicol, pueden actuar como inhibidores de opsonización retrasando la captación de las vesículas en la vasculatura por el sistema retículo endotelial.

Es deseable que al menos un 75%, preferiblemente sustancialmente todo el material fosfolipídico en el agente de contraste de la invención conste de moléculas que llevan individualmente una carga total neta en condiciones de preparación y/o uso, que puede ser positiva, o preferiblemente negativa. Los fosfolípidos cargados positivamente representativos incluyen ésteres de ácidos fosfatídicos tales como ácido dipalmitoilfosfatídico o ácido diestearoilofosfatídico y aminoalcoholes tales como hidroxietilenodiamina. Los ejemplos de fosfolípidos cargados negativamente incluyen fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos y cardiolipinas naturales (por ejemplo soja o derivado de yema de huevo), semisintéticos (por ejemplo parcialmente o totalmente hidrogenados) y sintéticos. Los grupos acilo grasos de tales fosfolípidos contendrán típicamente aproximadamente de 14 a 22 átomos de carbono, por ejemplo como en los grupos palmitoílo y estearoílo. Las formas lyso de tales fosfolípidos cargados son también útiles de acuerdo con la invención, el término ``lyso'' se refiere a fosfolípidos que contienen sólo un grupo acilo graso, enlazado mediante un enlace éster al átomo de carbono de la posición 1 del resto glicerilo. Tales formas lyso de fosfolípidos cargados pueden usarse ventajosamente en mezcla con fosfolípidos cargados que contienen dos grupos acilo grasos.

Las fosfatidilserinas representan fosfolípidos particularmente preferidos para usar el agentes de contraste de acuerdo con la invención y constituyen preferiblemente una parte sustancial, por ejemplo al menos un 80% del contenido en fosfolípidos inicial del mismo, por ejemplo del 85 - 92%, aunque esto puede reducirse posteriormente, por ejemplo a aprox. un 70% en procesamientos posteriores tales como esterilización por calor. Aunque no deseamos vernos limitados por consideraciones teóricas, es posible que el puente iónico entre los grupos carboxilo y amino de restos serina adyacentes contribuya a la estabilidad de tales sistemas. Las fosfatidilserinas preferidas incluyen fosfatidilserina natural saturadas (por ejemplo hidrogenadas o sintéticas) y dialacanoilfosfatidilserinas sintéticas o semisintéticas tales como distearoilfosfatidilserina, dipalmitoilfosfatidilserina y diaraquidoilfosfatidilserina.

Una ventaja importante de usar tales agentes de contraste basados en fosfatidilserina es que el cuerpo reconoce glóbulos rojos viejos y plaquetas por las altas concentraciones de fosfatidilserina en su superficie y así puede eliminar agentes de contraste del flujo sanguíneo de una forma similar a la eliminación de glóbulos rojos viejos. Además, ya que la superficie de tales agentes de contraste puede registrarse por el cuerpo como endógena, puede evitarse la inducción de efectos secundarios sistémicos adversos tales como efectos hemodinámicos y otras reacciones anafilácticas que pueden acompañar a la administración de algunas preparaciones liposómicas. (véase por ejemplo el documento WO-A-95/12386).

Pueden prepararse agentes de contraste de ultrasonidos liposómicos adecuados para el uso de acuerdo con la invención como se describe en la bibliografía, véanse por ejemplo los documentos WO-A-92/22247, WO-A-94/28780, WO-a-93/05819, WO-A-95/16467, PCT/GB96/01361 y Unger et al. Invest. Radiol. 29 (Suppl. 2): S123-S136 (1994).

Como se ha descrito anteriormente, el estabilizador usado de acuerdo con la invención es un estabilizador liofilizado tolerable fisiológicamente (o mezcla) que tiene una temperatura de transición vítrea (Tg) por encima de 20ºC, por ejemplo en el intervalo de 25 a 80ºC, y que tiene un valor Tg' de -37ºC o superior. Ejemplo de estabilizadores adecuados incluyen sacarosa, maltosa, H_{2}O, trehalosa, rafinosa y estaquiosa. Un ejemplo particularmente adecuado es la sacarosa, opcionalmente en mezcla con cantidades menores (por ejemplo hasta un 20% en peso, preferiblemente hasta un 10% en peso) de otros estabilizadores.

Como se ha descrito anteriormente, el estabilizador estará presente en la composición en una relación de peso de al menos 10:1, preferiblemente al menos 20:1, óptimamente tan alta como 200:1, por ejemplo hasta 5000:1 o incluso mayor. En consecuencia, la contribución a la temperatura de transición vítrea (Tg) del producto seco, es relativamente independiente del componente vesicular y los estabilizadores candidatos pueden controlarse fácilmente por técnicas habituales para determinar si, en combinación con los otros excipientes presentes en el medio de soporte acuoso secan para formar un producto con una temperatura de transición vítrea (Tg) superior a 20ºC.

Convenientemente, el estabilizador estará presente de un 1 a un 50% en peso, preferiblemente de un 5 a un 30%, más especialmente aproximadamente de un 10 a un 20% en peso, en la composición que experimenta la liofilización. Si se desea, la concentración de estabilizador puede ser superior a concentraciones isotónicas, ya que en la reconstitución después de la liofilización, el producto puede diluirse. El componente vesícular estará presente preferiblemente de un 0,01 a un 5% en peso, preferiblemente de un 0,1 a un 3% en peso, de forma especialmente preferida de aproximadamente un 0,5 a un 1,5% en peso (considerando como su peso sólo el peso del material que forma la membrana). La cantidad de estabilizador con respecto al fluido de reconstitución usado para transformar el producto liofilizado en una dispersión administrable se seleccionará dependiendo de la región corporal u órgano del que se desea la imagen y en el modo de administración elegido. A modo de ejemplo puede ser al menos dos veces superior que en la composición que se liofilizó.

Para aplicaciones de ultrasonidos tales como ecocardiografía, para permitir paso libre a través del sistema pulmonar y para conseguir resonancias con las frecuencias de imágenes preferidas de aproximadamente 0,1 - 15 MHz, puede ser conveniente emplear vesículas con un tamaño medio de 1 - 10 \mum, por ejemplo 1-7 \mum. Las vesículas pueden producirse con una distribución de tamaño muy estrecha dentro del intervalo preferido para ecocardiografía, por lo cual se mejora en gran medida su ecogeneicidad así como su seguridad in vivo, y generar los agentes de contraste particularmente ventajosos en aplicaciones tales como mediciones de la presión sanguínea, del flujo sanguíneo, y tomografía de ultrasonidos. De esta forma, por ejemplo, los productos en los cuales más del 90% (por ejemplo al menos 95%, preferiblemente al menos 98%) de las vesículas tienen diámetros en el intervalo 1-7 \mum y menos del 5% (por ejemplo, no más del 3%, preferiblemente no más del 2%) de las vesículas tienen diámetros superiores a 7\mum pueden prepararse fácilmente.

En aplicaciones de ultrasonidos el medio de contraste puede, por ejemplo, administrarse en dosis tales que la cantidad de material que forma membrana (por ejemplo fosfolípido) inyectado está en el intervalo de 0,1-10 \mug/kg de peso corporal, más preferiblemente 1-5 \mug/kg. Se apreciará que el uso de niveles tan bajos de material que forma membrana es sustancialmente ventajoso en la minimización de posibles efectos secundarios tóxicos.

La concentración total de material que forma la membrana en composiciones listas para usar usando el producto seco de la invención estará deseablemente en el intervalo del 0,01 al 5% en peso, preferiblemente del 0,05 al 2,0% y particularmente aproximadamente el 0,5% en peso.

La composición sometida a liofilización contendrá ventajosamente al menos un agente de carga, por ejemplo un poliol (por ejemplo un poliol C_{3}) tal como glicerol o propilenglicol) o un polisacárido tal como dextrano, o un poliglicol tal como polietilenglicol o mezclas de los mismos. Típicamente el agente de carga puede usarse en concentraciones similares o ligeramente menores que las del estabilizador, por ejemplo del 3 al 10% en peso, preferiblemente aproximadamente del 5% en peso. Los agentes de carga deberían poder cristalizar durante el proceso de liofilización ya que sólo en este estado tienen un efecto neutro en la estabilidad del producto. De esta forma, se distinguen de los estabilizadores que estarían en un estado amorfo durante la liofilización.

Si se desea, pueden estar presentes otros excipientes en la composición que se está secando o pueden añadirse en la formulación para la administración. Tales excipientes pueden incluir por ejemplo reguladores de pH, ajustadores de osmolalidad, mejoradores de la viscosidad, emulsionantes, etc. y pueden usarse en las cantidades convencionales.

El producto seco estará generalmente en forma de polvo y es fácilmente reconstituible en agua, una solución acuosa tal como una solución salina (que puede equilibrarse ventajosamente para que el producto final para la inyección no sea hipotónico), o una solución de una o más sustancias ajustadoras de la tonicidad tal como sales (por ejemplo de cationes de plasma con contraiones tolerables fisiológicamente) o azúcares, alcoholes de azúcar, glicoles, y otros materiales de polioles no iónicos (por ejemplo glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, glicerol, polietilenglicoles, propilenglicoles, y similares). La reconstitución requerirá normalmente agitación mínima tal como puede, por ejemplo, proporcionarse mediante una leve agitación manual. El tamaño de las vesículas generadas de esta forma es reproducible consistentemente y en la práctica es independiente de la cantidad de energía de agitación aplicada, determinándose por el tamaño de las vesículas formadas en la dispersión de vesículas inicial, manteniéndose sorprendentemente este parámetro de tamaño de forma sustancial en el producto liofilizado y reconstituido. De esta manera, como el tamaño de las vesículas en la dispersión inicial puede controlarse fácilmente por parámetros del proceso tales como el procedimiento, velocidad y duración de la agitación, el tamaño final de vesícula puede controlarse fácilmente.

Deseablemente, el volumen y concentraciones del líquido de reconstitución puede equilibrarse para hacer que las formulaciones listas para usar resultantes sean sustancialmente isotónicas. De aquí que el volumen y la concentración del fluido reconstituyente elegido dependerá del tipo y cantidad de estabilizador (y otros agentes de carga) presentes en el producto liofilizado.

Los productos liofilizados de acuerdo con la invención han demostrado ser estables en el almacenamiento durante varios meses a condiciones ambientales. Las dispersiones de vesículas generadas al reconstituir en agua (u otros líquidos reconstituyentes como se ha mencionado anteriormente) pueden permanecer estables durante periodos de tiempo considerable, por ejemplo al menos 12 horas, permitiendo una flexibilidad considerable cuando el producto seco se reconstituye antes de la inyección.

Si el líquido de reconstitución contiene como ajustador de tonicidad el mismo compuesto que se usa como estabilizador en la liofilización, la cantidad de estabilizador presente en la composición para la liofilización solo tiene que ser suficiente para producir la estabilización óptima durante la liofilización. De esta forma, puede conseguirse isotonicidad en el producto final seleccionando una cantidad y concentración adecuadas del líquido de reconstitución. Por tanto se permite una flexibilidad considerable en la concentración y tipo de compuesto(s) que se usan como estabilizador(es) durante la etapa de liofilización, y en la concentración y tipo de compuesto(s) en el líquido de reconstitución, mientras que se sigue consiguiendo un producto reconstituido estable.

La liofilización de acuerdo con la invención puede efectuarse de una forma convencional aunque el uso de estabilizadores de acuerdo con la invención puede tener la ventaja añadida de que, dado que las composiciones antes del secado tienen generalmente temperaturas vítreas (Tg') más altas que las composiciones equivalentes que contienen crioprotectores, tales como glucosa o manitol, pueden usarse ciclos de liofilización más cortos.

La invención se ha descrito anteriormente con referencia a agentes de contraste de ultrasonidos vesiculares. Sin embargo, también es aplicable a agentes de contraste vesiculares para otras modalidades de obtención de imágenes con fines de diagnóstico (por ejemplo MRI, rayos X, SPECT, PET, obtención de imágenes magnetográficas, etc).

A continuación se describirá adicionalmente la invención con referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Preparación de producto liofilizado

Se añadieron 500,4 mg de fosfatidilserina de huevo hidrogenada a 100 ml de agua que contenían un 5,4% (p/p) de una mezcla de propilenglicol y glicerol (3:10 p/p). La mezcla se agitó y se calentó a 80ºC durante cinco minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente, se agitó otra vez y se dejó reposar durante una noche antes del uso.

Se transfirieron 50 ml de la solución resultante a un matraz de fondo redondo con una boca cónica. El matraz se equipó con un a cubierta de vidrio que tenía una entrada y salida con control de temperatura conectada a un baño de agua mantenida a 25ºC. Se introdujo un eje de mezcla de reostato de arranque del rotor en la solución y para impedir el escape de gas, se sello el espacio entre la pared de la boca y el eje de mezcla con un tapón de metal diseñado específicamente con una conexión de entrada/salida de gas para ajustar el contenido de gas y controlar la presión. La salida de gas se conectó a una bomba de vacío y la solución se desgasificó durante un minuto. Después, se aplicó una atmósfera de gas perfluoro n-butano a través de la entrada de gas.

La solución se homogeneizó a 23.000 rpm durante 10 minutos, manteniendo la varilla del eje de mezcla de reostato de arranque del rotor de tal forma que las aberturas estaban ligeramente por encima de la superficie del líquido. Se obtuvo una dispersión cremosa de color blanco, que se transfirió a un contenedor cerrable herméticamente y se aclaró con perfluoro n-butano. Después, la dispersión se transfirió a un embudo de decantación y se centrifugó a 12.000 rpm durante 30 minutos, dando una capa cremosa de burbujas en la parte superior y un infranadante turbio. Se retiró el infranadante y se reemplazó con agua. Se repitió la centrifugación dos veces, pero ahora a 12.000 rpm durante 15 minutos. Después de la última centrifugación, el sobrenadante se reemplazó con 10% (p/p) de sacarosa. Se dividieron porciones de 2 ml de la dispersión resultante entre viales de fondo liso de 10 ml diseñados especialmente para liofilización, y los viales se enfriaron a -47ºC y se liofilizaron durante aproximadamente 48 horas, dando una sustancia sólida blanca esponjosa. Los viales se transfirieron a una cámara de vacío, y se retiró el aire con una bomba de vacío y se reemplazó con gas perfluoro n-butano. Antes de usar, se añadió agua y los viales se agitaron a mano levemente durante varios segundos, produciendo dispersiones de microburbujas adecuadas como agentes de contraste de ultrasonidos.

Caracterización

Se midió la distribución de tamaño y la concentración del volumen de las microburbujas usando un aparato Coulter Counter Mark II equipado con una apertura de 50 \mum con un intervalo de medida de 1-30 \mum. Se diluyeron muestras de 20 \mul en 200 ml de solución salina saturada con aire a temperatura ambiente, y se dejó equilibrar durante 3 minutos antes de la medida.

La caracterización de ultrasonidos se realizó en un escenario experimental ligeramente modificado de Jong, N. and Hoff, Ultrasonics, 31: 175-181 (1993). Esta instrumentación mide la eficacia de atenuación de ultrasonidos en el intervalo de frecuencia de 2-8 MHz de una suspensión diluida de un agente de contraste. Durante la medida de atenuación se realizó una prueba de estabilidad de presión exponiendo la muestra a una sobrepresión de 120 mmHg durante 90 segundos. Se disolvió típicamente 2-3 \mul de muestra en 55 ml de Isoton II y la suspensión de muestra diluida se agitó durante 3 minutos antes del análisis. Se usó la atenuación a 3,5 MHz como parámetro de respuesta principal, junto con el valor de atenuación de recuperación a 3,5 MHz después liberar la sobrepresión.

TABLA 1

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|}\hline\multicolumn{6}{|l|}{Características
 in vitro  de dispersiones de burbujas
producidas}\\\multicolumn{6}{|l|}{de acuerdo con el Ejemplo 1.
Concentraciones ponderadas con respecto}\\\multicolumn{6}{|l|}{al
número y al volumen y diámetros medios con respecto
al}\\\multicolumn{6}{|l|}{volumen. Propiedades acústicas medidas de
acuerdo con la}\\\multicolumn{6}{|l|}{descripción anterior.}\\\hline
 Número  \+ Vol. Conc.  \+ Diam.  \+ Atenuación  \+ Supervivencia 
\+ Frec. A \\  conc.  \+ [%]  \+ medio Vol.  \+ a 3,5 MHz  \+
después de  \+ atenuación \\  [10 ^{6} /ml]  \+  \+ [ \mu m]  \+
[dB/cm]  \+ sobrepresión  \+ max. \\   \+  \+  \+  \+ [%]  \+ [MHz]
\\\hline  10.518  \+ 6,51  \+ 3,16  \+ 150,4  \+ 96  \+ 4,3
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 2

Se reemplazaron los contenidos de gas de cinco muestras preparadas de acuerdo con el Ejemplo 1 con aire, perfluorobutano, hexafluoruro de azufre, pentafluoruro de trifluorometilazufre y tetrametilsilano respectivamente, de acuerdo con el siguiente procedimiento:

Se colocaron dos muestras que contenían producto liofilizado en un desecados con una toma de gas y una salida de gas. El desecador se conectó a un controlador de vacío/destilador Büchi 168 que permitía la evacuación controlada de las muestras y la entrada de un gas seleccionado. Las muestras se evacuaron a aproximadamente 10 mbar durante 5 minutos, tras lo cual la presión se incrementó a atmosférica por entrada del gas seleccionado, seguido del cierre cuidadoso de los viales. Se repitió el procedimiento usando pares adicionales de muestras para cada uno de los gases seleccionados.

Se añadió 2 ml de agua destilada a cada vial y los viales se agitaron a mano levemente antes de usar. Las dispersiones de microburbujas se caracterizaron con respecto a las medidas de distribución de tamaño como se describió en el Ejemplo 1. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline\multicolumn{5}{|l|}{Características
 in vitro  de dispersiones de
burbujas}\\\multicolumn{5}{|l|}{fosfatidilserina  -  estabilizadas
producidas de acuerdo con el Ejemplo}\\\multicolumn{5}{|l|}{2.
Concentraciones ponderadas con respecto al número y al volumen
y}\\\multicolumn{5}{|l|}{diámetros medios con respecto al
volumen.}\\\hline  Gas  \+ Número  \+ Núm. medio  \+ Vol. conc.  \+
Vol. medio \\   \+ conc.  \+ diámetro  \+ [%]  \+ diámetro \\   \+
[10 ^{6} /ml]  \+ [ \mu m]  \+  \+ [ \mu m] \\  \+ \+ \+ \+ \\\hline
 Perfluorobutano  \+ 9.756  \+ 1,8  \+ 4,9  \+ 5,8 \\\hline 
Pentafluoruro de  \+ 10.243  \+ 1,9  \+ 5,9  \+ 3,5 \\ 
trifluorometilazufre \+ \+ \+ \+ \\\hline  Hexafluoruro de  \+ 9.927
 \+ 1,9  \+ 5,7  \+ 3,2 \\  azufre \+ \+ \+ \+ \\\hline 
Tetrametilsilano  \+ 9.947  \+ 1,9  \+ 6,1  \+ 3,7 \\\hline  Aire 
\+ 9.909  \+ 1,9  \+ 6,4  \+ 4,0
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Como se verá en los resultados anteriores no hay cambio significativo en la distribución de tamaño en el intercambio gaseoso, demostrando que el tamaño de burbuja preformada se conserva sustancialmente durante la liofilización y reconstitución.

Resultados in vivo

Se evaluó in vivo un lote preparado con cada uno de los cinco gases para las propiedades de mejora Doppler a 10 MHz. Las dispersiones se inyectaron en conejos chinchilla por una vena de la oreja y se midieron usando una técnica Doppler en la que se coloca una sonda directamente en una arteria carótida. Se grabaron las intensidades y duración de las señales y se calcula la integral de la curva Doppler. Los resultados obtenidos (véase Tabla 3 a continuación) muestran que las microburbujas que contienen perfluorobutano dan la mejora más fuerte en la intensidad Doppler. Las microburbujas que contienen hexafluoruro de azufre, pentafluoruro de triflurometilazufre o tetrametilsilano son sólo ligeramente menos eficaces como mejoradores Doppler que aquellas que contienen perfluorobutano, dando integrales en el intervalo del 60 al 80% de la figura para perfluorobutano.

TABLA 3

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline\multicolumn{2}{|l|}{Resultados
para inyecciones i.v. del Ejemplo 2 en conejos. Los
valores}\\\multicolumn{2}{|l|}{se ajustan para el cambio en el
inicio. La unidad Doppler se define como}\\\multicolumn{2}{|l|}{el
incremento en la señal Doppler con respecto a la de la
sangre.}\\\hline  Gas  \+ Mejora Integrada Arterial Doppler \\   \+
(NDU.s) \\\hline  Perfluorobutano*  \+ 10.361 \\\hline 
Pentafluoruro de trifluorometilazufre  \+ 8.006 \\\hline 
Tetrametilsilano  \+ 6.370 \\\hline  Hexafluoruro de azufre  \+
6.297 \\\hline  Aire  \+ 1.024
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

*media de dos inyecciones.

Ejemplo 3

Se preparó un vial que contenía materia liofilizado bajo una atmósfera de perfluorobutano como se describe en el Ejemplo 1. Se añadió agua al vial justo antes de usar para dar una suspensión de microburbujas.

Se expusieron 200 ml de líquido Isoton II al aire durante varios días a temperatura ambiente para dar una solución completamente saturada de aire. Se desgasificaron otros 200 ml del fluido en un matraz de vacío a 60ºC durante una hora y se enfrió a temperatura ambiente mientras se mantenía el vacío. Se permitió la entrada de aire en el matraz inmediatamente antes de usar.

Se añadieron porciones de 10 \mul de la suspensión de microburbujas a cada uno de los fluidos y las mezclas resultantes se incubaron durante 5 minutos antes de la caracterización de tamaño (Coulter Multisizer Mark II).

En el ambiente desgasificado, cuando no se esperaba difusión de gases del fluido en las microburbujas, el diámetro medio de microburbuja era 1,77 \mum y 0,25% de las microburbujas eran mayores de 5 \mum. En el líquido saturado de aire los valores correspondientes fueron 2,43 \mum y 0,67%; Repetidas mediciones hechas después de 5 minutos indicaron que el tamaño de microburbuja había alcanzado un valor estable.

Estos descubrimientos muestran que el tamaño medio de las microburbujas aumenta sólo en 37% cuando se exponen a un fluido saturado de aire análogo a la sangre arterial, con muy pocas microburbujas alcanzando un tamaño que pueda causar bloqueo de vasos sanguíneos capilares. Esto puede contrastarse con que el tamaño de microburbujas que contienen aire/perfluorohexano se dobla en un entorno similar. (i.e., una dispersión altamente diluida de microburbujas en agua que contiene aire disuelto) descrito en el Ejemplo II de WO-A-95/03835.

Ejemplo 4 Comparación

Se repitió el Ejemplo 1 reemplazando el sobrenadante antes de la liofilización con (a) 65 mg/ml de sacarosa, más 65 mg/ml de manitol, (b) 100 mg/ml de manitol más 50 mg/ml de glucosa, (c) 20 mg/ml de sacarosa, 76 mg/ml de manitol y 38 mg/ml de glucosa, y (d) 90 mg/ml de sacarosa.

Se determinaron los valores Tg y Tg' de las composiciones húmeda y seca y se muestran a continuación en la Tabla 4.

TABLA 4

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|l|}\hline
 Formulación  \+ Tg'  \+ Tg \\\hline  (a)  \+ -38ºC  \+ 19ºC
\\\hline  (b)  \+ -43ºC  \+ 14ºC \\\hline  (c)  \+ -42ºC  \+ 12ºC
\\\hline  (d)  \+ -32ºC  \+ 66ºC
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Las formulaciones (a) a (c) necesitan ciclos de liofilización más largos que la formulación (d) y a diferencia de (d) deben almacenarse por debajo de temperatura ambiente para mantener su integridad.

Ejemplo 5 Retención de gas

Se expuso material producido análogamente al Ejemplo 1 pero usando (a) 10% (p/p) sacarosa, (b) 5% (p/p) PEG 3000, (c) 2% (p/p) manitol y 1% (p/p) glucosa, y (d) 5% (p/p) trehalosa para reemplazar el sobrenadante antes de la liofilización a un aclarado extensivo con N_{2}, exposición a ciclos repetidos de vacío, y trituración para comprobar la capacidad del producto para retener perfluorobutano. Se determinó el contenido en perfluorobutano después de tratamiento en condiciones extremas. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 5.

TABLA 5

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|l|}\hline
 Crioprotector  \+ mg PFB/g  producto \\\hline  Sacarosa  \+ 0,69
 \pm  0,10 \\\hline  PEG 3000  \+ = 0,05 \\\hline  Manitol + glucosa
 \+ 0,29  \pm  0,10 \\\hline  Trehalosa  \+ 1,24  \pm  0,38
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

En los ejemplos anteriores, pueden usarse porcentajes más altos de estabilizador (por ejemplo el 20% en lugar del 10%) y líquidos de reconstitución distintos de agua, por ejemplo pueden usarse las soluciones salina o de poliol a las que se ha hecho referencia anteriormente. De forma similar, las porciones que son liofilizadas pueden ser mayores (por ejemplo 4 ml en lugar de 2 ml), los viales de liofilización pueden ser mayores (por ejemplo 20 ml) y la liofilización puede ser más larga (por ejemplo 60 horas).

Claims

1. Un agente de contraste de ultrasonidos que contiene vesículas liofilizadas que contiene un estabilizador o mezcla de estabilizadores liofilizados, donde (i) la relación en peso de dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores con respecto a las vesículas en dicho agente es al menos de 10:1, (ii) dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores tiene un valor de Tg mayor de 20ºC y un valor de Tg' de -37ºC o inferior, y (iii) dicho agente es térmicamente estable a temperaturas superiores a 20ºC.

2. Un agente de contraste de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores se selecciona entre uno o más de los siguientes: sacarosa, maltosa. H_{2}O, trehalosa, rafinosa y estaquiosa.

3. Un agente de contraste de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, donde dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores comprende sacarosa.

4. Un agente de contraste de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la relación en peso de dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores con respecto a las vesículas es de al menos 20:1.

5. Un agente de contraste de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las vesículas contienen un gas o precursor de gas de hidrocarburo halogenado o un gas de fluoruro de azufre.

6. Un agente de contraste de acuerdo con la reivindicación 5, donde dicho gas o precursor de gas de hidrocarburo halogenado es un perfluoroalcano.

7. Un agente de contraste de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho perfluoroalcano es perfluorobutano o perfluoropentano.

8. Un agente de constaste de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho gas de fluoruro de azufre es un hexafluoruro de azufre, decasulfuro de diazufre o pentafluoruro de trifluorometilazufre.

9. Un agente de contraste de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las vesículas tienen membranas que comprenden un fosfolípido.

10. Un proceso para la preparación de un agente de contraste de ultrasonidos que contiene vesículas liofilizadas que es térmicamente estable a temperaturas superiores a 20ºC, comprendiendo dicho proceso liofilizar una dispersión acuosa que comprende un agente de contraste de ultrasonidos vesicular y un estabilizador o mezcla de estabilizadores liofilizados, caracterizado porque dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores está presente en dicha dispersión en una relación en peso con respecto a las vesículas de al menos 10:1, y porque dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores tiene un valor de Tg superior a 20ºC y un valor de Tg' de -37º o inferior.

11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicha dispersión acuosa contiene de un 1 a un 50% en peso de dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores.

12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, donde dicho agente de contraste vesicular contiene un gas o precursor de gas de hidrocarburo halogenado o un gas de fluoruro de azufre.

13. El proceso de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicho gas o precursor de gas de hidrocarburo halogenado es perfluorobutano o perfluoropentano.

14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicho gas de fluoruro de azufre es hexafluoruro de azufre, decafluoruro de diazufre o pentafluoruro de trifluorometiulazufre.

15. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, donde dicha dispersión acuosa contiene además un agente de carga.

16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicho agente de carga es un poliol C_{3}.

17. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 15 o con la reivindicación 16, donde dicha dispersión acuosa contiene del 3 al 10% en peso de dicho agente de carga.

18. Un proceso para el almacenamiento o transporte de un agente de contraste de ultrasonidos que contiene vesículas liofilizadas como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho almacenamiento o transporte tiene lugar sin el uso de refrigeración.

19. Un proceso para la preparación de un agente de contraste de ultrasonidos que contiene vesículas inyectable que comprende dispersar un agente de contraste de ultrasonidos que contiene vesículas liofilizadas como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un medio de soporte acuoso inyectable tolerable desde el punto de vista fisiológico.

20. Uso de un estabiliador o mezcla de estabilizadores liofilizados que tienen un valor de Tg superior a 20ºC y un valor de Tg' de -37º o inferior, en la fabricación de un agente de contraste que contiene vesículas que térmicamente estable a temperaturas superiores a 20ºC y que contiene dicho estabilizador o mezcla de estabilizadores en una relación en peso con respecto a las vesículas de al menos 10:1.