ES2152913T3 - Medio para el analisis cualitativo y cuantitativo de las poblaciones microbianas potencialmente presentes en una muestra. - Google Patents
Medio para el analisis cualitativo y cuantitativo de las poblaciones microbianas potencialmente presentes en una muestra.Info
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Abstract
Método de análisis cualitativo y cuantitativo de la o las poblaciones microbianas potencialmente presentes en una muestra, caracterizado porque cosiste en: - poner en contacto los microorganismos potencialmente presentes en dicha muestra con como mínimo una sonda de oligonucleótido dirigida a ARN, en lo sucesivo denominada sonda específica, capaz de dirigirse a una población microbiológica deseada, bajo condiciones favorables para hibridación in situ en células completas, - extraer las sondas hibridadas por separación de su diana y elución fuera de dichas células, - detectar las sondas extraídas y medir la cantidad de las mismas o sus cantidades respectivas.
Description
Medio para el análisis cualitativo y cuantitativo
de las poblaciones microbianas potencialmente presentes en una
muestra.
Esta invención puede describirse generalmente
como un medio de análisis cualitativo y cuantitativo de las
poblaciones microbianas potencialmente presentes en una muestra.
Más específicamente, se refiere a un medio de análisis cualitativo
y cuantitativo que utiliza sondas de oligonucleótidos dirigidas a
ARN.
El análisis de las poblaciones microbianas
potencialmente presentes es necesario para muchos tipos de muestras
sólidas y fluidas. Algunos ejemplos notables son las muestras
obtenidas a partir de un entorno natural o biológico tal como el
agua natural o las fuentes termales; las muestras tomadas de seres
humanos o animales tales como sangre, orina, flora intestinal y
vaginal; y muestras de entornos urbanos, agrícolas e industriales
tales como productos alimenticios, agua industrial, efluentes
industriales, aguas residuales municipales, lodo industrial, medios
de fermentación, aerosoles, filtros o aire procedente de sistemas de
aire acondicionado.
Se han desarrollado diversas técnicas de
laboratorio para el análisis cualitativo y cuantitativo de las
poblaciones microbianas potencialmente presentes en una muestra
dada.
Una técnica conocida supone un recuento de los
microorganismos que se desarrollan tras cultivar la muestra (o un
extracto de la misma) en diversos medios selectivos de nutrientes
en las condiciones habituales. Esta técnica es sencilla pero
implica riesgos significativos de errores y artefactos (baja
especificidad de los criterios morfológicos, incapacidad para
detectar microorganismos viables pero no cultivables, incapacidad
para detectar microorganismos de crecimiento lento, necesidad de
mantener la viabilidad de las bacterias entre la recogida y la
enumeración). Además, esta técnica requiere generalmente más de 24
horas para producir resultados.
Una segunda técnica, que implica la medida de la
actividad de una o más enzimas, permite una rápida cuantificación de
las poblaciones de microorganismos vivos (microorganismos
cultivables y/o microorganismos en una forma viable pero no
cultivable). Esta técnica puede utilizarse, en particular, para
monitorizar un conjunto de poblaciones, pero no consigue niveles
muy elevados de especificidad o sensibilidad.
Una tercera técnica que utiliza sondas
inmunológicas, a menudo requiere una etapa de crecimiento y, por
tanto, necesita de más de 24 horas para producir resultados.
Además, frecuentemente carece tanto de sensibilidad como de
especificidad (puede producirse un error en la identificación debido
a reacciones cruzadas).
Las técnicas más recientes se basan en el uso de
sondas específicas de ADN, que se marcan generalmente para permitir
su detección tras la hibridación con sus dianas. Se han
desarrollado dos categorías principales de sondas de
oligonucleótidos: las que se dirigen a ADN y las que se dirigen a
ARN (ARN ribosómico o ARN mensajero).
Las sondas dirigidas a ADN, aunque potencialmente
son muy específicas, tienen el inconveniente de su baja sensibilidad
debido a las pocas copias de los genes del ADN diana en cada célula
microbiana. Aunque el uso de PCR (reacción en cadena de la
polimerasa) para amplificar las secuencias de ADN diana antes de su
detección puede compensar la falta de sensibilidad de las sondas de
ADN, tiene varios inconvenientes en sí mismo: por ejemplo, la
presencia de inhibidores puede conducir a reacciones de falso
negativo, mientras que la contaminación remanente o similar puede
conducir a reacciones de falso positivo. Por el contrario, el uso
de sondas dirigidas a ARN evita tales inconvenientes. En particular,
debido al gran número de copias de ARNr que se producen de
manera natural en un microorganismo (las células en crecimiento
activo pueden contener 10^{4} ribosomas, cada uno una diana
potencial de una sonda), el uso de sondas dirigidas a ARNr
no requiere la etapa de amplificación, superando así las
limitaciones y artefactos asociados con la misma. La ventaja de
dirigirse a ARNr es que aproximadamente el 85 - 90 por
ciento del ARN total en una célula normal es ARNr.
La hibridación de las sondas dirigidas a ARN
puede lograrse o bien tras lisis celular, extracción y purificación
de los ácidos nucleicos totales de la muestra, o bien in
situ en las células completas, generalmente tras fijación
(permeabilización) de la membrana (o pared) de los microorganismos
potencialmente presentes en la muestra.
Sin embargo, la lisis celular y las subsiguientes
extracción y purificación de los ácidos nucleicos, particularmente
del ARN total, son manipulaciones delicadas y que llevan mucho
tiempo, que requieren aparatos costosos, personal cualificado y
estrictas condiciones experimentales, particularmente la prevención
de la contaminación por nucleasas durante el procedimiento. Esta
técnica implica además el uso de un soporte sólido, tal como una
membrana de nylon, sobre el que se inmovilizan los ácidos nucleicos
purificados de tal manera que pueda distinguirse entre ellos (por
ejemplo, dot-blot (transferencia puntual),
slot-blot (transferencia en ranura)). También
implica más generalmente el uso de marcadores radiactivos de sonda,
cuyo manejo requiere un cuidado especial. Por tanto, la técnica de
lisis celular para la hibridación de ARN es inadecuada para
utilizarla en el análisis de rutina en la industria o en
laboratorios biológicos.
La hibridación in situ en células
completas supera la necesidad de una extracción preliminar de los
ácidos nucleicos diana mediante lisis celular con todas sus
desventajas asociadas. El proceso FISH (Fluorescent In Situ
Hybridization, hibridación in situ fluorescente), que emplea
sondas de ARNr marcadas con fluorescencia, es una técnica
in situ existente. Este tipo de técnica, que implica
generalmente microscopía de fluorescencia, proporciona un análisis
cualitativo rápido y sensible con muchos tipos de muestra.
Actualmente, las sondas dirigidas a ARNr así hibridadas in
situ con sus dianas dentro de células completas, pueden
cuantificarse directamente en la muestra (citometría de flujo,
microscopía), aunque el método no es completamente satisfactorio:
la cuantificación directamente en la muestra es técnicamente
costosa, lleva mucho tiempo, requiere personal cualificado y no
permite una cuantificación exacta de las sondas hibridadas cuando la
muestra es compleja y no uniforme (por ejemplo, flóculos o
agregados formados por bacterias filamentosas en lodos de
tratamiento de aguas residuales; muestras que contienen de manera
natural microorganismos fluorescentes). Como resultado, la técnica
de hibridación in situ en células completas que utiliza
sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia ha quedado,
hasta la fecha, como una técnica esencialmente cualitativa que no
proporciona resultados cuantitativos fiables.
Para cumplir con la necesidad de una realización
en la industria en muestras que pueden ser complejas y/o no
uniformes, esta invención proporciona un medio para analizar, tanto
cualitativa como cuantitativamente, las poblaciones microbianas
potencialmente presentes en una muestra biológica, superando dicho
medio las desventajas de las técnicas de la técnica anterior.
Por tanto, el objeto de esta invención es un
método de análisis cualitativo y cuantitativo de la(s)
población / poblaciones potencialmente presente(s) en una
muestra caracterizado porque comprende:
- poner en contacto los microorganismos
potencialmente presentes en dicha muestra con al menos una sonda de
oligonucleótidos dirigida a ARN, denominada más adelante en este
documento como sonda específica, capaz de dirigirse a una población
microbiológica deseada, en condiciones favorables, para la
hibridación in situ en las células completas.
- extraer, mediante la separación de su diana y
elución fuera de dichas células, aquellas sondas que se han
hibridado,
- detectar las sondas extraídas y medir la
cantidad de las mismas o sus cantidades respectivas.
La presente invención permite, por tanto,
ventajosamente la extracción de dichas sondas sin la destrucción de
dichas células.
Tal como se utiliza en el presente documento, la
expresión "población microbiológica" (o "dominio
microbiológico") significa el conjunto de microorganismos que
una sonda dada es capaz de reconocer mediante el reconocimiento de
una secuencia diana de ARN presente en cada elemento de dicho
conjunto. El enfoque se basa en sondas de hibridación de
oligonucleótidos complementarias a secuencias de ARN que son
diagnósticas para grupos filogenéticos seleccionados que
corresponden, en grados variables, a una región diana típica de un
tipo de microorganismo o un grupo completo de microorganismos.
Cualquier sonda que permita dicha etapa de puesta en contacto es
apropiada para la puesta en práctica del método según la invención.
La elección de la(s) sonda(s) específica(s) se
relaciona directamente con el análisis deseado para dicha muestra.
Las sondas pueden estar compuestas, por ejemplo, por secuencias de
oligonucleótidos que pueden distinguir entre los reinos primarios
(eucariotas, eubacterias y arqueobacterias) y entre microorganismos
estrechamente relacionados (el grupo de la
\beta-proteobacteria oxidante de amoniaco, el
género Nitrobacter o Acinetobacter o la especie
Fibrobacter intestinalis, la especie Escherichia
Coli). Las sondas con mejor resolución filogenética pueden
obtenerse utilizando las colecciones ya existentes de secuencias de
ARN. Muchos ejemplos de tales sondas dirigidas a ARN se describen
en la técnica anterior tales como en patentes o solicitudes de
patente, publicaciones científicas, por ejemplo, Los Reyes et
al. Appli. Environ. Microbiol. Vol. 63 nº 3 págs. 1107 - 1117;
Mobarry et al. 1996, Appli. Environ. Microbiol. Vol. 62 nº 6
págs. 2156 - 2162; Wagner et al. 1994, Appli. Environ.
Microbiol. Vol. 60 nº 3 págs. 792 - 800; Kane et al. Appli.
Environ. Microbiol. Vol. 59 nº 3 págs. 682 - 686. Otros ejemplos de
tales sondas también pueden diseñarse por la persona experta en la
técnica. Las sondas ventajosas son aquéllas con ARN ribosómico
diana (ARNr). Ejemplos de tales sondas ventajosas incluyen Nb1000
(secuencia SEQ ID Nº 1) y Nso 1225 (secuencia SEQ ID Nº 2).
El método de la invención da resultados
cuantitativos particularmente exactos cuando el número de células en
dicha muestra es igual o superior a aproximadamente 10^{3} o
10^{4} células por ml. Si se desea, la concentración de
microorganismos de una muestra líquida puede aumentarse mediante
filtración o cualquier otra técnica antes de la puesta en práctica
del método de la invención.
En una disposición preferida de la invención,
dichos microorganismos potencialmente presentes en la muestra
también se ponen en contacto con al menos una sonda, denominada más
adelante en el presente documento como "sonda universal", que
sirve para normalizar los resultados obtenidos con las sondas que
se dirigen a grupos filogenéticos específicos de microorganismos
("sondas específicas"). Entonces, puede expresarse la cantidad
de una sonda específica en dicha muestra como una proporción de la
cantidad de dicha sonda universal. Por tanto, tal sonda universal
puede permitir la expresión de, por ejemplo, el ARNr diana
específico como un porcentaje del ARNr total. Ejemplos de
tales "sondas universales" incluyen sondas específicas para
cualquier microorganismo, o sondas específicas para bacterias o para
eucariotas. Tales "sondas universales" son bien conocidas en
la técnica y puede utilizarse cualquiera de ellas siempre que
permita dicha etapa de puesta en contacto, y permita la
normalización de la "sonda específica" deseada. Tal "sonda
universal" se utiliza en el método según la invención de manera
similar a una "sonda específica" y, en consecuencia, es
ventajosamente una sonda dirigida a ARNr.
Puede ser ventajoso extraer los microorganismos
potencialmente presentes en dicha muestra de la misma, en
particular mediante centrifugación, antes de proceder con cualquier
etapa del método de la invención. Un motivo para proceder de esta
manera es eliminar el ruido de fondo que una muestra de composición
compleja puede generar. Otro motivo puede ser poner en disolución
los microorganismos potencialmente presentes en una muestra sólida,
gaseosa o viscosa.
Según una realización de la invención, dicha
etapa de puesta en contacto se realiza tras hacer que las células
se sometan a una etapa de fijación (o etapa de permeabilización)
esencial para mantener su integridad morfológica, y que hace que
los microorganismos potencialmente presentes en dicha muestra sean
permeables a sondas de oligonucleótidos cortas (de aproximadamente
15 - 25 nucleótidos). Esta etapa de fijación permite que las sondas
penetren en el interior de las células microbianas sin afectar a la
integridad de las mismas, alcanzando así su diana o dianas in
situ. Cuando sea pertinente, dicha muestra se homogeneizará
antes de dicha etapa de fijación con el fin de que al menos dicha
sonda tenga acceso a todas las poblaciones microbianas
potencialmente presentes en la muestra.
Dicha fijación se consigue ventajosamente
incubando dichas células en una disolución de paraformaldehído que
está a menos del 10%, preferiblemente al 4% aproximadamente, durante
de 3 a 12 horas a 4ºC. Este procedimiento de fijación se adapta más
particularmente a bacterias gram-negativas. Para
ciertas bacterias gram-negativas, dicha etapa de
fijación se puede conseguir incubando dichas células en una
disolución de etanol al 100%.
Tras la fijación, pueden recuperarse dichas
células, por ejemplo mediante centrifugación, y almacenarse hasta su
uso a -20ºC en una disolución tamponada a un pH de aproximadamente
7 (tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato), por ejemplo)
que contiene aproximadamente un 50% de etanol.
En una disposición preferida de esta realización
de la invención, dicha fijación va seguida por una etapa de
deshidratación (o etapa de secado) antes de dicha fase de puesta en
contacto. Por tanto, dicha etapa de deshidratación puede llevarse a
cabo poniendo en contacto dicha muestra con al menos una disolución
de etanol, preferiblemente con una serie de disoluciones de etanol
de concentración creciente, por ejemplo, poniendo la muestra en una
disolución de etanol al 70%, al 80% y después al 95%.
Ventajosamente, dicha fase de puesta en contacto
se realiza poniendo en contacto la muestra al menos dicha sonda, en
presencia de una disolución denominada más adelante en el presente
documento "disolución de hibridación", que comprende un agente
desnaturalizante tal como dodecilsulfato sódico (SDS) en una
concentración en un intervalo del 0,001 - 0,1%, preferiblemente del
orden del 0,01%; Tris-HCl, pH de aproximadamente 8
en una concentración en un intervalo de 0,001 - 0,1 M,
preferiblemente del orden de 0,02 M; y una sal tal como cloruro
sódico en una concentración en un intervalo de 0,1 - 1,5 M,
preferiblemente del orden de 0,9 M. Tal puesta en contacto se
realiza ventajosamente durante un tiempo de incubación comprendido
entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 2 horas, y a una
temperatura de hibridación que es preferiblemente la temperatura
óptima. Para cada sonda de oligonucleótidos, las condiciones de
hibridación (temperatura; concentración de sales y agentes
desnaturalizantes) pueden optimizarse, de hecho, de modo que se
mejore la especificidad de la sonda de oligonucleótidos por las
correspondientes secuencias de ARN que se encuentran en las células
diana. Cuando se utiliza simultáneamente una pluralidad de sondas
de oligonucleótidos, estas condiciones de hibridación pueden
elegirse de modo que se tengan en cuenta las condiciones óptimas
peculiares para cada sonda.
Es muy ventajoso para la extracción de al menos
dicha sonda que se realice tras la eliminación del exceso y del
material de sonda noo unida o de sonda asociada n específicamente
puesta en contacto, particularmente mediante lavado con una
disolución denominada más adelante en el presente documento como
"disolución de lavado". Tal "disolución de lavado"
comprende ventajosamente un agente desnaturalizante tal como
dodecilsulfato sódico (SDS) en una concentración en un intervalo
del 0,001 - 0,1%, preferiblemente del orden del 0,02%;
Tris-HCl, pH de aproximadamente 8 en una
concentración en un intervalo de 0,001 - 0,1 M, preferiblemente del
orden de 0,02 M, y una sal tal como cloruro sódico en una
concentración en un intervalo de 0,01 - 0,9 M, preferiblemente del
orden de 0,1 M. La formulación de la "disolución de lavado"
(por ejemplo, naturaleza y/o concentración de la sal y el agente
desnaturalizante) se ajusta de modo que se consiga la rigurosidad
adecuada; es decir, la rigurosidad necesaria para la eliminación de
la sonda no asociada específicamente. Gracias a tal etapa de
lavado, la etapa de extracción se realizará sólo en aquellas sondas
que se han hibridado eficazmente a la(s) diana(s)
deseada(s).
Según una realización preferida de la invención,
dicha extracción se realiza poniendo los microorganismos
potencialmente presentes en condiciones para desnaturalizar, lo que
permite la desnaturalización de cada sonda específicamente asociada
con su secuencia diana, particularmente en presencia de un agente
desnaturalizante de sonda - diana, tal como uno que separará el
dúplex ADN/ADN o ADN/ARN y, en particular, el dúplex sonda - diana
en consideración, y a una temperatura superior a la temperatura de
fusión de la sonda en consideración, particularmente a una
temperatura de aproximadamente 100ºC. Según una realización
particularmente preferida de la invención, dicho agente
desnaturalizante es formamida. A continuación, se realiza dicha
extracción incubando dichos microorganismos en formamida a 100ºC
durante 10 minutos, utilizando una incubadora de temperatura
controlada. Después, puede recuperarse el sobrenadante para la
cuantificación, por ejemplo mediante centrifugación. Para mejorar
la detección, dichas sondas extraídas pueden concentrarse,
particularmente utilizando un Speed-Vac®
(concentrador automático) antes de la medida de la cantidad
correspondiente de cada sonda.
La detección de una sonda hibridada con la diana
y la medida de su cantidad da, por tanto, un análisis cualitativo y
cuantitativo del conjunto de microorganismos diana presentes en la
muestra. Es ventajoso realizar dicha detección y medida de la
cantidad de las sondas extraídas mediante la detección y medida de
la cantidad de un marcador asociado con o incorporado a cada una de
las sondas puestas en contacto, tal como un marcador radiactivo
(^{32}P, ^{35}S, ^{125}I), quimioluminiscente o fluorescente.
Luego se miden las cantidades respectivas de las sondas mediante la
cuantificación del marcador correspondiente. Es particularmente
ventajoso utilizar un marcador fluorescente, particularmente
fluoresceína, que puede cuantificarse fácilmente utilizando un
espectrofotómetro de fluorescencia.
Puede situarse diferentes sondas, por ejemplo
sonda(s) específica(s) y/o sonda(s)
universal(es), en muestras separadas o en la misma muestra.
En este último caso, es posible distinguir cada sonda utilizada de
las demás durante la etapa de detección, por ejemplo facilitando a
cada una su propio marcador específico (por ejemplo, diferentes
fluorocromos).
El método de la invención puede aplicarse a una
variedad de muestras. Muestras para las que es de particular interés
un análisis utilizando el método de la invención incluyen las
tomadas de fluidos tales como el agua natural, agua industrial,
efluentes industriales, aguas residuales municipales, lodo
industrial, fango termal, gel o líquido alimenticio, medio de
fermentación, aire, gas, aerosol; muestras de un conducto de
ventilación de un edificio, conducto de aire acondicionado;
muestras de un sólido comestible, tierra; muestras de un equipo
médico; muestras humanas o animales tales como sangre, orina, flora
intestinal o vaginal.
El método de la invención no utiliza ni cultivos
microbiológicos, ni microscopía, ni una etapa de amplificación
in vitro (como PCR) y no necesita ninguna etapa de lisis
celular. Es reproducible, sencillo, rápido (menos de 3 horas), de
bajo coste y no requiere personal especialmente cualificado. El
método de la invención ofrece la ventaja adicional de ser fácil de
automatizar.
El método de la invención proporciona
particularmente una medida cualitativa y cuantitativa del estado
microbiológico o sanitario de dicha muestra y, en consecuencia, del
producto del que se toma dicha muestra. Por tanto, el método de la
invención puede combinarse ventajosamente con una función de alarma
relacionada con la monitorización sanitaria, de la seguridad y/o
calidad del producto del que se toma la muestra, particularmente
como parte de una línea de producción industrial.
Cuando se supera el valor umbral o punto fijado,
el método de la invención permite que se active la correspondiente
alarma sanitaria, de seguridad y/o calidad. También permite el
control automático o por retroalimentación de un proceso de
enriquecimiento o eliminación microbiológico.
La invención también se refiere a la aplicación
de dicho método al diagnóstico in vitro de enfermedades
infecciosas.
Además de las aplicaciones de los tipos "medida
de un estado o condición" y "alarma", esta invención se
refiere en particular a la aplicación de dicho método para el
control automático o por retroalimentación de procesos
microbiológicos tales como la fermentación metánica de abono
líquido, tratamiento de efluentes orgánicos, procesos de
tratamiento de aguas residuales tales como el tratamiento con lodos
activados; o al control automático o por retroalimentación de un
proceso dirigido a eliminar o evitar el crecimiento de
microorganismos.
Por tanto, el método de la invención puede
aplicarse ventajosamente a la detección de la formación de espuma
durante la puesta en práctica de procesos con lodos activados y/o
al control por retroalimentación de un proceso dirigido a eliminar
o evitar el desarrollo de tales espumas.
Otras características y ventajas de la invención
se harán evidentes además en las siguientes realizaciones a modo de
ejemplo, que se facilitan con fines ilustrativos y no
limitantes.
Se mezclan muestras de efluente procedente de
reactores de lodos activados para el tratamiento de aguas residuales
y luego se lavan tres veces utilizando una disolución de tampón
fosfato (PBS, solución salina tamponada con fosfato) a pH 7.
Entonces, se incorpora la muestra a tres volúmenes de una disolución
de paraformaldehído al 4% y se incuba durante de 3 a 12 horas a
4ºC. Tras centrifugación, se retira el sobrenadante y la muestra se
mezcla de nuevo con una solución salina tamponada con fosfato (PBS)
a pH 7. Se añade un volumen igual de etanol y puede almacenarse la
muestra a -20ºC hasta su uso.
La muestra fijada se centrifuga tras añadir 1 ml
de etanol al 70% sobre el residuo y resuspender las células. La
mezcla se centrifuga durante 5 minutos, luego se retira el
sobrenadante. Se repite el procedimiento con etanol al 80% y luego
de nuevo utilizando etanol al 95%.
Se prepara un baño de agua a la temperatura de
hibridación requerida por la sonda que se esté utilizando (la
temperatura depende de la longitud y la secuencia de la sonda). En
el ejemplo notificado en el presente documento, se utilizaron las
siguientes sondas:
Sonda Nb 1000 específica para el género
Nitrobacter, con la secuencia SEQ ID nº 1: 5'
TGCGACCGGTCATGG 3'
Sonda Nso 1225, específica para la
\beta-proteobacteria oxidante de amoniaco, con
una secuencia SEQ ID nº 2: 5' CGCCATTGTATTACGTGTGA 3'
Sonda S Univ-1390, una sonda
universal para cualquier microorganismo, con una secuencia SEQ ID nº
3: 5' GACGGGCGGTGTGTACAA 3', y
Sonda S Bac338, específica para bacterias, con la
secuencia SEQ ID nº 4: 5' GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3'.
Estas sondas se sintetizaron, se purificaron
mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), luego se
marcaron con fluoresceína en el extremo 5'. Están disponibles de
Operon Technologies de Alameda, California (EE.UU.) o, en Francia,
de la empresa Genset con sede en París (entre otros).
Las células obtenidas a partir de la etapa de
deshidratación se resuspendieron en 400 \mul de una disolución de
hibridación que comprendía (para 10 ml): 1,8 ml de NaOH 5 M; 200
\mul de Tris-HCl 1 M; 5 \mul de SDS
(dodecilsulfato sódico); 8 ml de agua destilada excipiente, para
diez ml. Tras marcarse cada sonda con un fluorocromo, se añade la
cantidad necesaria de cada sonda (en el presente documento, 1,5
nanomoles). Se incuban las células en la disolución de hibridación
en contacto con las sondas durante de 10 minutos a 2 horas a la
temperatura de hibridación. Las muestras de hibridación se
centrifugan y se retiran los sobrenadantes.
Tras la hibridación, las células se lavaron dos
veces, durante 15 minutos cada vez a la temperatura de hibridación,
en una disolución de lavado tamponada que comprendía, para 50 ml, 1
ml de NaOH 5 M; 9 ml de Tris-HCl 1 M; 50 \mul de
SDS al 20%. La formulación de la "disolución de lavado" (por
ejemplo, sal y desnaturalizante) se ajusta de acuerdo con la
necesidad de conseguir la rigurosidad apropiada, es decir la
eliminación de la sonda no asociada específicamente.
Se añadieron 300 \mul de formamida calentada
hasta 100ºC a las muestras obtenidas a partir de la etapa de lavado,
y el residuo se resuspende suavemente. Cada tubo se pone a 100ºC
durante 10 minutos, preferiblemente utilizando una incubadora de
temperatura controlada. Se centrifuga durante 10 minutos. Se
recupera el sobrenadante y se almacena en un lugar oscuro hasta que
pueda analizarse mediante espectroscopía de fluorescencia. La
fluorescencia se cuantifica utilizando un espectrofluorómetro. Las
cantidades medidas de las sondas Nb1000 y Nso 1225 corresponden a
las cantidades relativas de bacteria Nitrobacter y
\beta-proteobacteria oxidante de amoniaco
contenidas en la muestra. Estas cantidades se comparan con las
medidas para la sonda universal S Univ-1390 y la
sonda para bacterias S Bac 338.
Esto da una razón en porcentaje (la proporción
relativa) de los microorganismos contenidos en la muestra, que son
respectivamente Nitrobacter y
\beta-proteobacteria oxidante de amoniaco.
Se entiende que esta invención no se limita a las
realizaciones descritas e ilustradas en el presente documento, sino
que cubre todas las variantes de la misma.
(1) Información general:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Solicitante:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Nombre: Suez Lyonnaise des Eaux
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Dirección: 72 avenue de la Liberté
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Ciudad: Nanterre Cédex
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- País: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Código postal: 92753
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Título de la invención: medio para el análisis cualitativo y cuantitativo de las poblaciones microbianas potencialmente presentes en una muestra
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Número de secuencias: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- Forma legible por un ordenador:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- tipo de medio de almacenamiento: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- ordenador: PC (ordenador personal) compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- sistema operativo: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- software: PatentIn Release nº 1,0, versión nº 1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Información para la SEQ ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Longitud: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Tipo: nucleotídica
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Número de cadenas: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Configuración: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Hipotético: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- Antisentido: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- Fuente inmediata:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Clon: Nb1000
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEQ ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCGACCGGT CATGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(3) Información para la SEQ ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Longitud: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Tipo: nucleotídica
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Número de cadenas: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Configuración: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Hipotético: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- Antisentido: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- Fuente inmediata:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Clon: Nb 1225
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEQ ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm5' CGCCATTGTA TTACGTGTGA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
(4) Información para la SEQ ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Longitud: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Tipo: nucleotídica
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Número de cadenas: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Configuración: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Hipotético: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- Antisentido: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- Fuente inmediata:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Clon: S Univ-1390
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEQ ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm5' GACGGGCGGTGTGTACAA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
(5) Información para la SEQ ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Longitud: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Tipo: nucleotídica
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Número de cadenas: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Configuración: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- hipotético: sí
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- Antisentido: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- Fuente inmediata:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Clon: S Bac338
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: SEQ ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm5' GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3'
Claims (23)
1. Método de análisis cualitativo y cuantitativo
de la(s) población / poblaciones microbiana(s)
potencialmente presente(s) en una muestra,
caracterizado porque comprende:
- poner en contacto los microorganismos
potencialmente presentes en dicha muestra con al menos una sonda de
oligonucleótidos dirigida a ARN, denominada más adelante en este
documento como sonda específica, capaz de dirigirse a una población
microbiológica deseada, en condiciones favorables, a la hibridación
in situ en células completas,
- extraer, mediante la separación de su diana y
elución fuera de dichas células, aquellas sondas que se han
hibridado,
- detectar las sondas extraídas y medir la
cantidad de las mismas o sus cantidades respectivas.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado además porque al menos dicha sonda específica
se elige entre el grupo que consiste en Nb 1000 (SEQ ID Nº 1) y Nso
1225 (SEQ ID Nº 2).
3. Método según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado además porque dichos microorganismos
potencialmente presentes en dicha muestra se ponen en contacto con
otra sonda, denominada más adelante en el presente documento sonda
universal, que sirve para normalizar los resultados obtenidos con
las sondas que se dirigen a grupos filogenéticos específicos de
microorganismos.
4. Método según la reivindicación 3,
caracterizado además porque dicha sonda universal se elige
entre el grupo que consiste en S Univ-1390 (SEQ ID
Nº 3) y S Bac 338 (SEQ ID Nº 4).
5. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque
dicha(s) sonda(s) específica(s) y/o
universal(es) es una (son) sonda(s) dirigida(s)
a ARNr.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque
dichos microorganismos potencialmente presentes en dicha muestra se
extraen de dicha muestra, particularmente mediante
centrifugación.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque
dicha puesta en contacto se realiza tras la fijación de dichas
células.
8. Método según la reivindicación 7,
caracterizado además porque dicha fijación de las células se
consigue mediante la incubación de dichas células en una disolución
de paraformaldehído a menos del 10% y, preferiblemente, al 4%
aproximadamente, durante de 3 a 12 horas a 4ºC.
9. Método según la reivindicación 7 u 8,
caracterizado además porque dicha fijación va seguida por
una etapa de deshidratación, antes de dicha etapa de puesta en
contacto.
10. Método según la reivindicación 9,
caracterizado además porque dicha etapa de deshidratación se
realiza poniendo en contacto dicha muestra con al menos una
disolución de etanol y, preferiblemente, con una serie de
disoluciones de etanol de concentraciones crecientes.
11. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque
dicha puesta en contacto se realiza poniendo en contacto dicha
muestra con al menos una sonda en presencia de una disolución,
denominada más adelante en el presente documento disolución de
hibridación, que comprende particularmente un agente
desnaturalizante tal como dodecilsulfato sódico (SDS) en una
concentración en un intervalo del 0,001 - 0,1%, preferiblemente del
orden del 0,01%, Tris-HCl, pH de aproximadamente 8 a
una concentración en un intervalo de 0,001 - 0,1 M, preferiblemente
del orden de 0,02 M; y una sal tal como cloruro sódico en una
concentración en un intervalo de 0,1 - 1,5 M, preferiblemente del
orden de 0,9 M.
12. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque
dicha puesta en contacto se realiza durante un tiempo de incubación
de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 2 horas, y a la
temperatura de hibridación óptima.
13. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque
dicha extracción de al menos dicha sonda se realiza tras la
eliminación del exceso y del material de sonda no unida o de sonda
asociada no específicamente puesto en contacto, particularmente
lavando con una disolución, denominada más adelante en el presente
documento disolución de lavado, que comprende particularmente un
agente desnaturalizante tal como dodecilsulfato sódico (SDS) y una
sal tal como cloruro sódico en concentraciones apropiadas para
conseguir la rigurosidad necesaria para la eliminación de la sonda
asociada no específicamente.
14. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque
dicha extracción se realiza poniendo dichos microorganismos
potencialmente presentes en condiciones que permitan la
desnaturalización de cada sonda asociada específicamente con su
secuencia diana, particularmente en presencia de un agente capaz de
desnaturalizar el dúplex sonda - diana y a una temperatura superior
a la temperatura de fusión de la sonda en consideración,
particularmente a una temperatura de aproximadamente 100ºC.
15. Método según la reivindicación 14,
caracterizado además porque el agente desnaturalizante es
formamida.
16. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque
dichas sondas extraídas se concentran, particularmente utilizando
un Speed-Vac®, antes de la medida de la cantidad de
las mismas o de sus cantidades respectivas.
17. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque
dicha detección y medida de la cantidad de las sondas extraídas se
realiza mediante la detección y medida de la cantidad de un
marcador asociado o incorporado en cada una de las sondas puestas en
contacto, tal como un marcador radiactivo, quimioluminiscente o
fluorescente, particularmente tal como la fluoresceína.
18. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la
muestra se toma de fluidos tales como el agua natural, agua
industrial, efluente industrial, aguas residuales municipales, lodo
industrial, fango termal, gel o líquido alimenticio, medios de
fermentación, aire, gas, aerosol, o es una muestra tomada de un
conducto de ventilación de un edificio, un conducto de aire
acondicionado, una muestra de un sólido alimenticio, una muestra de
tierra, una muestra de un equipo médico, o es una muestra humana o
animal, tal como sangre, orina, flora intestinal o vaginal.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque se
utiliza en combinación con un proceso para activar una alarma
relacionada con la monitorización sanitaria, de la seguridad y/o de
la calidad del producto del que se ha obtenido la muestra.
20. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque se
utiliza en el diagnóstico in vitro de una enfermedad
infecciosa.
21. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque se
utiliza en el control automático o por retroalimentación de un
proceso microbiológico tal como la fermentación metánica de abono
líquido, el tratamiento de efluentes orgánicos, los procesos de
tratamiento de aguas residuales tales como el tratamiento mediante
lodos activados.
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque se
utiliza en el control automático o por retroalimentación de un
proceso relacionado con la eliminación o prevención del desarrollo
de microorganismos.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se aplica
en la detección de la formación de espuma durante la puesta en
práctica de procesos con lodos activados y/o para el control por
retroalimentación de un método relacionado con la eliminación o
prevención de dichas espumas.
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Publications (2)
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