ES2092560T5 - Proteinas inmunologicamente activas de borrelia burgdorferi, estuches de ensayo relacionados y vacuna. - Google Patents
Proteinas inmunologicamente activas de borrelia burgdorferi, estuches de ensayo relacionados y vacuna.Info
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Abstract
PROTEINAS ACTIVAS INMUNOLOGICAS DE BORRELIA BURGDORFERI, KITS DE PRUEBA RELACIONADOS Y VACUNAS. DIVERSAS PROTEINAS INMUNOLOGICAMENTE ACTIVAS DE BORRELIA BURGDORFERI SE PRODUJERON EN MICROORGANISMOS POR TRATAMIENTO TECNOLOGICO DE GENES. PARA ELLO, SE SELECCIONARON LAS SECUENCIAS DE DNA ESPECIFICAS DE UN BANCO DE GENES DE B. BURGDORFERI CON METODOS DE BUSQUEDA APROPIADOS Y SE REPRESENTARON DIRECTAMENTE MEDIANTE LA AMPLIFICACION DEL DNA CON PRUEBAS DE HIDRURACION SELECCIONADAS Y BAJO EL CONTROL DE PROMOTORES INDUCIBLES COMO POR EJEMPLO EL PROMOTOR LAC. MEDIANTE LA DESCRIPCION DE PROCEDIMIENTOS DE LIMPIEZA EFICIENTES PARA LOS ANTIGENOS EXPRIMIDOS, SE PUDIERON DISPONER LAS PROTEINAS EN LA FORMA APROPIADA. CON ESTAS PROTEINAS SE PUEDEN CONFECCIONAR KITS DE PRUEBA ESPECIFICOS Y DIAGNOSTICOS SENSITIVOS. MEDIANTE LA COMBINACION SELECTIVA DE LAS PROTEINAS ACTIVAS INMUNOLOGICAMENTE ES POSIBLE UN DIAGNOSTICO PRECISO. ADEMAS, SE GENERARON ANTICUERPOS MONOCLONALES, QUE ENCUENTRAN APLICACION COMO REACTANTES PARA LA PRUEBA DE EXCITACION DIRECTAMENTE DE PRUEBAS DE EXAMEN Y DESPUES DEL CULTIVO. LAS SECUENCIAS DE DNA ESPECIFICAS DE LA BORRELIA BURGDORFERI SE PUEDEN APLICAR EN PRUEBAS DE PACIENTES PARA LA DEMOSTRACION DIRECTA DEL EXCITANTE (P.EJ. MEDIANTE REACCION PCR).
Description
Proteínas inmunológicamente activas de
Borrelia burgdorferi, estuches de ensayo relacionados y
vacuna.
La borreliosis de Lyme es la enfermedad
infecciosa más frecuente en el hombre, transmitida por garrapatas,
en la República Federal Alemana. En contraposición a la
meningoencefalitis de comienzos de veranos (FSME), que es
transmitida asimismo por garrapatas, la borreliosis de Lyme no se
limita a unas pocas zonas endémicas, sino que se presenta en todas
las regiones de la República Federal Alemana. La epidemia del vector
principal en Europa, Ixodes ricinus, con el agente patógeno
de la borreliosis de Lyme, la espiroqueta Borrelia
burgdorferi, se encuentra en la región sur de Alemania en
aproximadamente el 20% de los adultos, aproximadamente el 10% de las
ninfas y en aproximadamente el 1% de las larvas. El vector principal
en los Estados Unidos, Ixodes dammini, puede estar afectado
por borrelias en hasta un 100% en zonas altamente
endémicas.
B. burgdorferi pertenece a la familia de
las espiroquetas. Las espiroquetas son bacterias helicoidales de una
longitud de 8-30 \mum. Consisten en una envuelta
exterior, los endoflagelos en el periplasma y el cilindro
protoplasmático. El cilindro protoplasmático es un complejo a base
de citoplasma, membrana celular interna y péptidoglicano. A los
representantes patógenos humanos de las espiroquetas pertenecen,
junto a B. burgdorferi, las borrelias de fiebre
recurrente (por ejemplo B. recurrentis), el agente patógeno
de la sífilis (Treponema (T.) pallidum) y las
leptospiras. En virtud de la estrecha relación inmunológica de los
agentes patógenos, son un problema, con los ensayos hasta ahora
disponibles, las reacciones cruzadas en la detección serológica de
anticuerpos en el caso de sífilis y borreliosis de
Lyme.
Lyme.
Una infección con B. burgdorferi conduce a
un cuadro clínico complejo que, de manera similar al caso de la
sífilis, se puede dividir en tres estadíos diferentes. Las
manifestaciones más importantes son:
Fase temprana: | estadío I | erisipeloide |
meningorradiculitis linfocitaria Bannwarth (MRL) | ||
linfocitoma por borrelias | ||
Fase tardía: | estadío III | artritis de Lyme |
acrodermatitis crónica atrofiante (ACA) | ||
encefalomielitis crónica por borrelias |
Manifestaciones clínicas más raras son: carditis,
miositis, iritis y panoftalmitis. Es posible la transmisión
diaplacentaria del agente patógeno, pero hasta ahora sólo están
documentados unos pocos casos de una borreliosis de Lyme conatal.
Los diferentes estadíos pueden manifestarse individualmente o
combinados. La infección con B. burgdorferi puede discurrir
también subclínicamente. Estudios epidemiológicos en 375 casos
clínicamente detectados mostraron algunas particularidades en la
distribución por edades y sexo en las distintas manifestaciones
clínicas. Así, pacientes con erisipeloide se encontraron de la forma
más frecuente en el grupo de edad de los 30 a los 60 años.
Manifestaciones neurológicas mostraron dos picos de edad: el
primero, en niños y jóvenes de hasta 20 años, y el segundo en
personas de 40 a 70 años. La artritis de Lyme se observó de la forma
más frecuente en personas de 30 a 60 años. Pacientes con ACA no eran
en ningún caso menores de 30 años. La ACA afecta claramente de forma
más frecuente a mujeres que a hombres. La investigación serológica
mostró en el ensayo de inmunofluorescencia en pacientes con
erisipeloide predominantemente síntomas de IgM positivos y en el
caso de manifestaciones neurológicas, predominantemente síntomas de
IgG positivos. En las manifestaciones tardías de ACA y artritis de
Lyme, los títulos de IgG estaban regularmente incrementados y los
anticuerpos de IgM sólo se podían detectar ya en casos
especiales.
Para el diagnóstico, se encuentra a disposición
tanto la detección del agente patógeno como también la detección del
anticuerpo. La detección del agente patógeno a partir de material
del paciente (biopsias de piel, líquido cefalorraquídeo, líquido
extraído por punción) es particularmente aconsejable en el estadío
temprano (erisipeloide), en el que una detección del anticuerpo es a
menudo negativa. No obstante, para el cultivo de B.
burgdorferi es necesario un medio nutricio complejo
(Preac-Mursic, V.; Wilske, B.; Schierz, G. (1986):
European Borreliae Burgdorferi isolated from humans and ticks
-culture conditions and antibiotic susceptibility. Zbl. Bakt. Hyg. A
163, 112-118) y, por lo tanto, el cultivo está
reservado a laboratorios especiales. Para el aislamiento del agente
patógeno, se requiere, además, un tiempo de hasta 5 semanas. El
aislamiento de B. burgdorferi se consigue a partir de
muestras de piel en el 50-70% de los casos con
manifestaciones de la piel y en el 3-5% de los casos
con neuroborreliosis (Preac-Mursic, V.; resultados
no publicados).
La detección del anticuerpo (IgM, IgG) se lleva a
cabo en el suero y, en manifestaciones neurológicas, también a
partir del líquido cefalorraquídeo. El síntoma serológico depende de
la fase de la enfermedad, la duración de los síntomas y una eventual
terapia con antibióticos ya realizada. Así, la detección del
anticuerpo con los ensayos hasta ahora disponibles en el caso de
erisipeloide sólo tenía éxito en el 20-50% de los
casos, en manifestaciones neurológicas en el 50-90%
y en ACA y artritis en el 90-100%.
La terapia de la borreliosis de Lyme se lleva a
cabo predominantemente con penicilina G, tetraciclinas, eritromicina
o cefalosporinas. La borreliosis de Lyme cura ciertamente a menudo
de manera espontánea en las fases tempranas, pero tampoco entonces
se han de excluir manifestaciones tardías. Por lo tanto, es
inevitable una terapia en el estadío temprano. Además, una curación
clínica después de terapia con antibióticos en manifestaciones
tardías sólo se puede conseguir en una parte de los casos (por
ejemplo, sólo aproximadamente 50% en el caso de artritis de
Lyme).
Por lo tanto, la borreliosis de Lyme debería
diagnosticarse lo más temprano posible. Dado que (como ya se ha
explicado) el aislamiento del agente patógeno es costoso, laborioso
y, además, no siempre efectivo, deberían desarrollarse mejores
ensayos serodiagnósticos. Los procedimientos hasta ahora utilizados
(ensayo de inmunofluorescencia (IFT), ensayo de hemaglutinación
indirecto (IHA), análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISA)
fracasan a menudo en los estadíos tempranos. Como antígenos se
emplean para estos ensayos células completas de B.
burgdorferi o ultrasonicados de células completas. El empleo de
diferentes cepas de B. burgdorferi como antígeno conduce en
el ELISA con ultrasonicados a diferentes resultados de ensayo. Las
células se fijan sobre portaobjetos o el antígeno del ultrasonicado
se fija sobre placas de microtitulación, se incuban con suero o
líquido cefalorraquídeo y los anticuerpos específicos de
borrelia se detectan con un segundo anticuerpo, marcado por
fluorescencia o con peroxidasa, de la correspondiente clase de
inmunoglobulinas. La reacción se evalúa entonces en el microscopio
de fluorescencia (IFT) o según una reacción de color en el fotómetro
(ELISA).
Un problema de la especificidad de los ensayos
son amplias reacciones cruzadas del agente patógeno B.
burgdorferi con otros agentes patógenos bacterianos, en
particular con T. pallidum, el agente patógeno de la sífilis.
Dado que los antígenos de ensayo consisten, por lo general, en
lisados del agente patógeno completo, también se determinan
anticuerpos contra el denominado "antígeno común" (Hansen, K.;
Hindersson, P.; Pedersen, N.S. (1988): Measurement of antibodies to
the Borrelia burgdorferi flagellum improves sorodiagnosis in
Lyme disease. J. Clin. Microbiol., 26, 338-346).
"Antígenos comunes" son proteínas muy difundidas y fuertemente
conservadas en su secuencia, es decir los "antígenos comunes"
de borrelias, treponemas, pero también numerosas otras
bacterias poseen epítopos comunes. Junto a ello, pueden manifestarse
reacciones falsas positivas en el IFT con IgM o en el ELISA con IgM
en el caso de sueros con actividad de factor del reuma. Con el fin
de hacer más específicos los ensayos, se lleva a cabo por lo tanto
en la detección de anticuerpos de IgG e IgM una
pre-absorción de los sueros con un ultrasonicado de
treponema y, adicionalmente, en el caso de la detección de
anticuerpos de IgM, además una absorción con absorbente del factor
del reuma.
Gassmann et al. (Nucleic Acids Research,
Vol. 17 (1989), pág. 3590) describen la secuencia de ADN de una
flagelina principal de la cepa B31 de Borrelia
burgdorferi.
Wallich et al. (Nucleic Acids Research,
Vol. 17 (1989), pág. 8864) describen la clonación y secuenciación de
un gen que codifica la proteína A de la superficie exterior (OspA)
de la cepa ZS7 de Borrelia burgdorferi.
Wilske et al. (Annals New York Acad.
Science, 1988, Vol. 539, págs. 126-143) describen la
variabilidad antigenética de diferentes cepas de Borrelia
burgdorferi. Las investigaciones se llevaron a cabo
esencialmente con borrelias completas o con lisados de
células completas. La producción de proteínas individuales con ayuda
de métodos de tecnología genética no se describe en esta cita
bibliográfica.
Luft et al. (Infection and Immunity
(noviembre 1989), págs. 3637-3645) describen la
caracterización bioquímica e inmunológica de proteínas de superficie
de Borrelia burgdorferi, utilizándose en particular la cepa
B31. La secuencia aminoterminal de la proteína de 22 kDa, indicada
en esta cita bibliográfica, se diferencia por completo de la
correspondiente secuencia de la proteína conforme a la
invención.
Es por lo tanto misión de la presente invención
poner a disposición proteínas inmunológicamente activas de
Borrelia burgdorferi que encuentran aplicación en un estuche
de ensayo que no presenta los inconvenientes antes mencionados.
Además, este estuche de ensayo ha de posibilitar la detección rápida
y fiable de anticuerpos dirigidos contra Borrelia
burgdorferi.
Además de ello, se han de poner a disposición
proteínas inmunológicamente activas que sean adecuadas como vacunas
contra infecciones provocadas por cepas de borrelias.
En la investigación de sueros de pacientes de
diferentes estadíos patológicos de la borreliosis de Lyme en la
transferencia de Western, así como en la investigación de pacientes
que no padecen borreliosis de Lyme (en particular pacientes de
sífilis) en cuanto a la reactividad cruzada con B.
burgdorferi se encontraron proteínas inmunológicamente activas
(antígenos de B. burgdorferi) que, por una parte, provocan
una buena respuesta del anticuerpo después de la infección y, por
otra, muestran una escasa reactividad cruzada con sueros no B.
burgdorferi-positivos (Ejemplo 1). Se demostró que una
determinada cepa de B. burgdorferi, con la denominación
interna de laboratorio PKo que fue depositada en la Colección
Alemana para Microorganismos (DSM) bajo el número 5662, posee, entre
otros, una proteína inmunodominante en el intervalo de pesos
moleculares de alrededor de 22 kD (proteína pC). La determinación
del peso molecular de las proteínas conformes a la invención se
realizó según métodos en sí conocidos, en particular mediante
electroforesis en gel con SDS. Se encontró que esta proteína es
inmunodominante para la respuesta de IgM. Esta proteína no está
expresada de la misma manera en todas las cepas de B.
burgdorferi. Conforme a la invención, esta proteína
inmunológicamente activa (proteína pC) se preparó por tecnología
genética (Ejemplo 3).
También otras proteínas inmunológicamente activas
(antígenos), que son adecuadas de manera particular para el empleo
en estuches de ensayo, se prepararon en células de Escherichia
coli generalmente accesibles y adquiribles en el comercio, tales
como por ejemplo las cepas JM 105 (Pharmacia) o DH 5
(Gibco-BRL). Para ello, se aislaron los fragmentos
de ADN de B. burgdorferi que codifican estas proteínas y, a
continuación, se introdujeron en vectores de expresión eficaces
(Ejemplos 2 y 3).
La identificación y el aislamiento de los
correspondientes fragmentos de ADN se efectuó según métodos
diferentes. Así, se preparó una proteína inmunológicamente activa,
no conforme a la invención, con un peso molecular de aproximadamente
41 kD, que en lo que sigue se denomina también como proteína p41,
mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y cebadores
específicos, cuyas secuencias se prepararon por vía sintética
(Ejemplo 2).
Además, se preparó un banco de genes del genoma
de B. burgdorferi que se investigó mediante anticuerpos
monoclonales en cuanto a la expresión directa de proteínas
inmunológicamente activas.
De manera correspondiente, también se clonaron y
secuenciaron proteínas con pesos moleculares de aproximadamente 100
kD y 31 kD.
Otro método consistía en purificar determinadas
elegidas proteínas inmunológicamente activas (antígenos) a partir de
lisados de B. burgdorferi y determinar secuencias de
aminoácidos de estos antígenos. A continuación, se sintetizaron
oligodesoxinucleótidos correspondientes a la secuencia de
aminoácidos y, mediante hibridación, se identificaron los clones del
banco de genes que presentaban las secuencias de ADN que codifican
las proteínas inmunológicamente activas. Los dos métodos mencionados
en último lugar se explican con mayor detalle en el Ejemplo 3.
Después de la caracterización, secuenciación y
reclonación de los genes en correspondientes vectores de expresión,
se expresaron los antígenos en células de E. coli y a
continuación se purificaron. Un procedimiento de purificación
preferido se describe en el Ejemplo 4.
Las proteínas inmunológicamente activas de
Borrelia burgdorferi, preparadas conforme a la invención,
pueden utilizarse en estuches de ensayo que ponen a disposición una
detección sorprendentemente sensible de anticuerpos contra B.
burgdorferi en diferentes líquidos de investigación. Una ventaja
de las proteínas inmunológicamente activas, preparadas conforme a la
invención, consistía en que las preparaciones sólo se componían de
la proteína deseada y, posiblemente, de proteínas que han de
atribuirse a manifestaciones de degradación y/o a una traducción
completa. Estas preparaciones no contienen proteínas de B.
burgdorferi de este tipo que no corresponden a la proteína
producida por vía recombinante, ya que se prepararon por tecnología
genética.
Las proteínas conformes a la invención se
caracterizan porque presenta o presentan
a) la secuencia de aminoácidos
o una secuencia parcial de la misma de al menos
10 aminoácidos,
o
b) la secuencia de aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
o una secuencia parcial de la misma de al menos
10 aminoácidos,
o
c) se compone de la secuencia de aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
o de la secuencia parcial de esta proteína con
una deleción de 20-25 aminoácidos en el
N-terminal de la proteína,
o
d) la secuencia de aminoácidos
o una secuencia parcial de la misma de al menos
10
aminoácidos.
Bajo la expresión "estuches de ensayo" se
entiende un conjunto de reactivos de ensayo que posibilita la
detección de determinados anticuerpos. Los principios en los que se
fundamentan los estuches de ensayo se describieron en
"Immunoassays for the 80s" (1981) de A. Voller et al.,
aparecido en MTP Press Ltd, Falcon House, Lancaster, Inglaterra. Los
reactivos de ensayo presentan como componente más importante el o
los antígenos y eventualmente anticuerpos específicos,
preferiblemente monoclonales.
Los estuches de ensayo conformes a la invención
para la detección de anticuerpos contra Borrelia burgdorferi
se caracterizan porque contienen al menos una proteína
inmunológicamente activa conforme a la invención, antes definida,
que se encuentra a disposición sin impurificaciones por otras
proteínas de la cepa de Borrelia burgdorferi. Esta proteína
inmunológicamente activa actúa como antígeno y reacciona con los
anticuerpos presentes en el líquido de investigación.
Preferiblemente, los estuches de ensayo conformes a la invención
presentan dos a cuatro proteínas inmunológicamente activas que se
encuentran a disposición sin impurificación por otras proteínas de
B. burgdorferi. Además, el estuche de ensayo contiene un
componente indicador que posibilita la presencia de complejos a base
de antígenos y anticuerpos.
Los estuches de ensayo conformes a la invención
pueden basarse en diferentes principios, en sí conocidos.
Básicamente, el antígeno puede portar una marcación, pudiendo
consistir la marcación en un isótopo radiactivo o en una enzima que
cataliza una reacción de color. Asimismo, el antígeno puede estar
fijado a una base sólida (placas de microtitulación o esferitas), y
el componente indicador puede consistir en un anticuerpo dirigido
contra un anticuerpo, que porta una marcación, pudiendo consistir la
marcación en un isótopo radiactivo o una enzima que cataliza una
reacción de color.
En el marco de la presente invención se prefiere
como estuche de ensayo el denominado ELISA (análisis con enzima
unida a inmunosorbente). Una forma de realización del mismo se
describe con mayor detalle en el Ejemplo 5. Los resultados de este
ejemplo demuestran que, sorprendentemente, mediante el empleo de
sólo una proteína inmunológicamente activa conforme a la invención
se podía conseguir una especificidad muy elevada del estuche de
ensayo. Además de ello, los estuches de ensayo conformes a la
invención posibilitan, de manera sorprendente, una diferenciación
correlacionada con el estadío de la enfermedad. El empleo combinado
de varios antígenos en un estuche de ensayo posibilita la detección
de anticuerpos contra Borrelia burgdorferi también en
aquellos casos en los que todavía no se han manifestado clínicamente
los síntomas de la enfermedad. Asimismo, pueden diagnosticarse
infecciones con B. burgdorferi en las que el paciente
atraviesa sólo una infección subclínica. La manifestación que puede
obtenerse mediante los estuches de ensayo conformes a la invención
es particularmente importante en los casos en los que se pudo
comprobar una picadura de garrapata, pero no está claro si está
presente una infección con una cepa de borrelias.
En el marco de la presente invención se prefiere
el empleo combinado de varias proteínas inmunológicamente activas.
Es muy particularmente preferida una combinación de las proteínas pC
y p100. Mediante el empleo de los estuches de ensayo ELISA
preferidos conformes a la invención puede efectuarse también una
diferenciación en relación con la naturaleza de los anticuerpos. Por
ejemplo, si se han de detectar anticuerpos de IgM, se puede emplear
el denominado análisis de captura \mu, en el que anticuerpos
dirigidos contra anticuerpos de IgM se fijan a la fase sólida.
Después de incubación de las placas de ensayo con el líquido a
investigar se fijan a la fase sólida los anticuerpos de IgM
presentes en el líquido de investigación. Después de la saturación
de uniones no específicas, puede entonces agregarse a la presente
invención una proteína inmunológicamente activa. Este antígeno se
detecta entonces mediante una molécula indicadora. En este caso, el
antígeno puede estar biotinilidado, añadiéndose a continuación
avidina que presenta peroxidasa fijada covalentemente. La peroxidasa
cataliza entonces una reacción que conduce a la formación de
color.
Otra posibilidad consiste en añadir al complejo
soporte/ anticuerpo anti-IgM, anticuerpo a detectar/
antígeno conforme a la invención anticuerpos monoclonales que son
específicos para el antígeno y que están biotinilados. La
biotinilación se describe por ejemplo en Monoklonale Antikörper
(1985) editorial Springer, J. H. Peters et al. La detección
del complejo se efectúa allí por adición de avidina a la que está
acoplada una enzima que cataliza una reacción de color.
Otra forma de realización de la presente
invención consiste en que la detección de IgM se lleva a cabo
mediante el ELISA indirecto. En este caso, los antígenos conformes a
la invención se fijan sobre placas de microtitulación, se incuban
con el líquido a investigar y, después del lavado, se efectúa la
detección de los complejos inmunes mediante conjugado
anti-\mu.
También se pueden preparar anticuerpos
monoclonales que están dirigidos contra las proteínas
inmunológicamente activas de Borrelia burgdorferi. La
producción de anticuerpos monoclonales de este tipo se explica más
detalladamente en el Ejemplo 6. Se pueden emplear anticuerpos
monoclonales de este tipo en calidad de reactivos para la detección
directa del agente patógeno. Sin embargo, también se pueden acoplar
anticuerpos monoclonales a la fase sólida de una placa de
microtitulación. Después de la adición de las proteínas
inmunológicamente activas (antígenos), éstas se fijan a la placa de
microtitulación mediante fijación
anticuerpo-antígeno. A continuación, se añade el
líquido de investigación (del que se puede tratar por ejemplo de
suero o líquido de cefalorraquídeo). Los anticuerpos presentes en el
líquido cefalorraquídeo se fijan entonces al antígeno y se pueden
detectar con ayuda de un componente indicador.
Además de ello, los anticuerpos monoclonales se
pueden utilizar muy bien para la purificación de las proteínas
inmunológicamente activas (antígenos). Es ventajoso en este caso que
la purificación sea particularmente moderada. Para ello, los
anticuerpos monoclonales se fijan a una matriz sólida.
Preferiblemente, esta matriz sólida se encuentra en forma de una
columna. A continuación, los antígenos parcialmente prepurificados
se reúnen, en condiciones fisiológicas, con los anticuerpos
acoplados a una matriz sólida. Después del lavado del complejo
matriz-anticuerpo-antígeno se pueden
eluir los antígenos. Habitualmente, se utilizan para ello elevadas
concentraciones de sales o tampones con un valor del pH que
posibilite la elución.
También se pueden poner a disposición secuencias
de ADN que corresponden, en su totalidad o en parte, a la secuencia
de aminoácidos de las proteínas inmunológicamente activas. Estas
secuencias de ADN pueden utilizarse preferiblemente para la
detección mediante hibridación de cepas de borrelias en el
material de investigación. Para ello, se prepara un oligonucleótido
que corresponde en parte a la secuencia de ADN. Este oligonucleótido
se marca radiactivamente. Por otra parte, el ADN del material de
investigación se fija a un filtro adecuado, preferiblemente
nitrocelulosa, y a continuación se hibrida con el oligonucleótido
radiactivamente marcado. Asimismo, las secuencias de ADN conformes a
la invención pueden utilizarse para la hibridación in situ
para la detección directa de B. burgdorferi en el tejido
infectado. En lugar de los oligonucleótidos químicamente
sintetizados, también se pueden multiplicar en bacterias
correspondientes fragmentos de ADN y, a continuación, separarse de
los vectores por corte con ayuda de endonucleasas de restricción.
Después del aislamiento de estos fragmentos de ADN, éstos se pueden
marcar radiactivamente y utilizar para la hibridación tal como se ha
descrito antes.
Otro aspecto de la presente invención consiste en
poder utilizar las proteínas inmunológicamente activas (antígenos)
conformes a la invención de Borrelia burgdorferi como
vacunas. Para ello, los antígenos conformes a la invención se
preparan en forma pura. A continuación, se aplican a la persona a
vacunar individualmente o en combinación con o sin un agente que
estimula la respuesta inmune. Con ello, se excita la formación de
anticuerpos que son específicos contra cepas de Borrelia
burgdorferi.
Las proteínas conformes a la invención pueden
encontrar aplicación en diferentes sectores. Así, los estuches de
ensayo conformes a la invención pueden utilizarse también para la
detección de infecciones por B. burgdorferi en animales, y
las proteínas pueden también utilizarse para la vacunación de
animales, en particular de animales valiosos.
En la medida en que la presente invención
concierne a proteínas de Borrelia burgdorferi, también se
puede tratar de fragmentos de proteínas que presentan únicamente una
secuencia parcial de la secuencia completa del aminoácido.
Secuencias parciales de este tipo presentan al menos 10 aminoácidos
y, preferiblemente, al menos 15 aminoácidos.
Sin embargo, habitualmente, los fragmentos de
proteínas son mayores.
En el marco de la presente invención se prefieren
particularmente las proteínas conformes a la invención con un peso
molecular de aproximadamente 22 kD o 100 kD. Estas proteínas pueden
proceder también de otras cepas de Borrelia burgdorferi,
siempre que correspondan a la definición antes mencionada.
Con ayuda de las siguientes tablas, figuras y
ejemplos se explican más detalladamente las formas de realización
preferidas de la presente invención.
La proteína p41 mencionada en los Ejemplos no es
objeto de la invención.
Se buscaron anticuerpos de suero específicos y
que aparecen frecuentemente, que están dirigidos contra determinados
antígenos individuales de B. burgdorferi, que muestran una
reactividad cruzada lo más escasa posible con proteínas de agentes
patógenos relacionados y que, adicionalmente, también permiten una
correlación con los distintos estadíos de la enfermedad de
borreliosis de Lyme.
La búsqueda de antígenos reconocidos
frecuentemente se efectuó mediante la transferencia de Western. Para
ello, un extracto de bacterias de B. burgdorferi (cepa PKo)
(Preac-Mursic, V.: Wilske, B.; Schierz, G. (1986):
European Borreliae burgdorferi isolated from humans and ticks
-culture conditions and antibiotic susceptibility. Zbl. Bakt. Hyg. A
163, 112-118) se separó, después de sedimentación,
resuspensión en PBS/NaCl y tratamiento con ultrasonidos,
electroforéticamente en un gel de poliacrilamida con SDS (Laemmli,
U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of
the head of bacteriophage T4. Nature 227,
680-685).
Los geles consistían en un gel recolector con
bolsas para las muestras y en un gel separador. La composición de
los geles separadores era la siguiente: acrilamida al 15%
(Bio-Rad), dialiltartardiamida al 0,026% (DATD,
Bio-Rad) por porcentaje de acrilamida, SDS al 0,15%,
Tris-HCl 375 mM pH 8,5, peroxodisulfato de amonio
0,14 mM (AMPER, Bio-Rad) y
N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina al 0,035% (TEMED,
Bio-Rad). En este caso, AMPER y TEMED servían como
iniciadores de radicales para la polimerización. 2-4
h después de la polimerización, el gel recolector (acrilamida al
3,1%, dialiltartardiamida al 0,08%, SDS al 0,1%,
Tris-HCl 125 mm pH 7,0, AMPER 3 mM y TEMED al 0,05)
se vertió sobre el gel separador y se proveyó de un peine de teflón.
Las cámaras del ánodo y cátodo se rellenaron con solución tampón
idéntica: base Tris 25 mM, glicina 192 mM y SDS al 0,1%, pH 8,5.
Por bolsa se aplicaron en cada caso 20 \mul de
muestra de tampón de lisis (sacarosa al 3%, SDS al 2%,
\beta-mercaptoetanol al 5%,
Tris-HCl 20 mM, pH 7,0, azul de bromofenol;
calentado durante 5 min. a 100ºC). La electroforesis se llevó a cabo
a la temperatura ambiente durante una noche con una intensidad
constante de corriente de 6 mA para geles con un tamaño de 20 x 15
cm. A continuación, los geles se transfirieron sobre nitrocelulosa
(NC).
Para la transferencia de proteínas, el gel se
encontraba con la nitrocelulosa contigua entre papel de filtro
Whatman 3 MM, conductor, material esponjado de 1 cm de espesor y dos
placas de carbón que conducían la corriente a través de electrodos
de platino. El papel de filtro, el material esponjado y la
nitrocelulosa se impregnaron bien con tampón de borrón (glicina 192
mM, base Tris 25 mM, metanol al 20%, pH 8,5). La transferencia tuvo
lugar a 2 mA/cm^{2} durante 2 h. Los lugares de fijación libres
sobre la nitrocelulosa se saturaron durante 1 h a 37ºC con tampón
Cohen (1 mg/ml de Ficoll 400, 1 mg/ml de polivinilpirrolidona, 16
mg/ml de albúmina de suero bovino, NP 40 al 0,1%, gelatina Bacto al
0,05% en tampón borato de sodio pH 8,2); (Cohen G. H., Dietzschold,
B., Ponce de Leon, M., Long, D., Golub, E., Varrichio, A., Pereira,
L y Eisenberg, R.J.: Localisation and synthesis of an antigenic
determinant of Herpes simplex virus glycoprotein D that stimulates
the production of neutralizing antibodies. J. Virol. 49 (1984)
4183-4187). El borrón se incubó bajo sacudimiento
durante una noche a temperatura ambiente con los sueros de los
pacientes (dilución 1:100 en NaCl 154 mM y Tris-HCl
10 mM pH 7,5).
Después de la incubación del suero, el borrón se
lavó durante cuatro veces en cada caso durante 15 min. con TTBS
(Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, Tween 20 al
0,01%). A continuación, el borrón se incubó durante 2 h a la
temperatura ambiente con inmunoglobulina anti-humana
acoplada con peroxidasa (DAKO, Hamburgo, dilución 1:1000 en NaCl 154
mM y Tris-HCl 10 mM, pH 7,5). Después de un lavado
múltiple con TTBS, el borrón se tiñó con 0,5 mg/ml de
diaminobencidina y peróxido de hidrógeno al 0,01% en
Tris-HCl 50 mM pH 7,5. A continuación, la tinción se
detuvo con ácido sulfúrico 1 N, el borrón se lavó con agua hasta
quedar exento de ácido y se secó entre papel de filtro.
En las figuras 1, 2a y b se muestra una elección
del modelo de reacción de diferentes sueros con las tiras de
transferencia de Western.
Como inmunodominantes se manifestaron en este
caso las siguientes proteínas: p17 (17 kDa), pC (22 kDa), p41 (41
kDa) y p100 (100 kDa con variaciones del tamaño en diferentes
materiales aislados de B. burgdorferi). A excepción de p41,
las funciones biológicas de estos antígenos son desconocidas; p41
representa la proteína flagelina (Barbour, A.G.S., Hayes, S.F.,
Heiland, R.A., Schrumpf, M.E. y Tessier, S.L.: A Borrelia
genus-specific monoclonal antibody binds to a flagellar epitope.
Infect. Immun. 52 (1986) 549-554).
En virtud de estos análisis, que se llevaron a
cabo con un gran número de sueros de pacientes procedentes de los
distintos estadíos de la enfermedad, resultaron puntos de partida
que con un único antígeno no siempre se determinan todos los
infectados por B. burgdorferi. Se demostró que, ante todo en
el caso de sueros con anticuerpos de IgM (infección reciente) se
reconoce de manera particularmente frecuente, junto a la flagelina
(p41), además, una proteína (pC) en el intervalo de 22 kD. La
simultánea manifestación de los dos anticuerpos no era sin embargo
obligatoria. Se podían encontrar tanto sueros que sólo poseían
anticuerpos contra p41 o sólo anticuerpos contra la proteína
pC (figuras 1 y 2a, transferencias de Western). En la
neuroborreliosis es de gran importancia la detección de los
anticuerpos formados intratecalmente en el líquido cefalorraquídeo.
Las transferencias de Western con IgG en el caso de 12 pares de
líquido cefalorraquídeo/suero de pacientes una
meningorradiculitis linfocitaria Bannwarth demostraron en
todos los casos una respuesta inmune intratecal local contra p41. En
la fase tardía se encontraron, junto a anticuerpos de IgG contra la
flagelina, sobre todo anticuerpos contra proteínas en el intervalo
de 100 kD (p100) y en el intervalo de 17 kD (p17), que en los
estadíos tempranos no se podían o sólo se podían raramente detectar.
Por consiguiente, reactividades de anticuerpos contra las proteínas
p17 y p100 son buenos marcadores para alcanzar el estadío III
(figura 2b, transferencia de Western).
Con ayuda de estos cuatro antígenos puede
alcanzarse una mejor estandarización de los ensayos.
Las proteínas p41, pC y p17 muestran, además,
sólo una escasa reactividad cruzada por otras cepas de bacterias, y
la proteína p100 se manifestó como una proteína específica del
género con epítopos específicos de B. burgdorferi. En la
Tabla 2 (reactividad de sueros inmunes contra diferentes agentes
patógenos bacterianos con proteínas de B. burgdorferi) se
recoge de manera sintetizada la reactividad cruzada de sueros contra
diferentes agentes patógenos relacionados con antígenos de B.
burgdorferi según el análisis de la transferencia de Western. En
el caso de ensayos para purificar las cuatro proteínas (p41, pC,
p17, p100) de extractos de B. burgdorferi, se demostró que se
requieren grandes cantidades de material de partida. Una particular
dificultad la ofrecía la purificación de p100, que está
subrepresentada en el extracto total. Dado que el cultivo es
complejo y caro, se hubieron de buscar posibilidades de tecnología
genética para la preparación de estos antígenos. El análisis de
sueros de pacientes mediante la transferencia de Western ha
demostrado que con una combinación de p41, pC, p17 así como p100
como antígeno, producidas por tecnología genética, se puede realizar
una determinación casi completa de todos los sueros positivos y,
además, se da una correlación con la fase de la enfermedad.
La zona codificante de p41 se obtuvo mediante
amplificación del ADN por una "reacción en cadena de
polimerasa" (PCR) a partir de una preparación de ADN total de
B. burgdorferi (DSM-Nº 5662 P/Ko2/85). La
secuencia, así obtenida, se puso a continuación bajo el control de
promotores inducibles y, después de la transfección, se expresó en
E. coli (Maniatis, T.; Fritsch, E.F.; Sambrook, J. (1982)
Molecular cloning. Cold Spring Harbor).
Para ello, las células de B. burgdorferi
se cultivaron durante 2 semanas a 37ºC en 2 1 de medio de
Barbour-Stoenner-Kelly-(BSK)
modificado (Preac-Mursic, V.; Wilske, B.; Schierz,
G. (1986): European Borreliae burgdorferi isolated from
humans and ticks -culture conditions and antibiotic susceptibility.
Zbl. Bakt. Hyg. A 163, 112-118), se sedimentaron a
6000 rpm, se lavaron en tampón TEN (Tris-HCl 10 mM
pH 7,6; EDTA 1 mM; NaCl 10 mM) y se resuspendieron en 20 ml de
tampón de lisozima (sacarosa al 20%, Tris-HCl 50 mM
pH 7,6, EDTA 50 mM, 5 mg/ml de lisozima). Después de la incubación
durante 30 min. a 37ºC, los protoplastos resultantes por la acción
de la lisozima sobre la pared celular se lisaron mediante la adición
de 1 ml de SDS (dodecilsulfato de sodio) al 25%. Después de otros 10
min., se añadieron 4 ml de una solución de NaCl 5 M. La proteína se
desnaturalizó mediante la adición de un mismo volumen de fenol
saturado con TE (TE: Tris/HCl 10 mM pH 7,8, EDTA 1 mM). Mediante
centrifugación a 4ºC y 6500 rpm durante 5 min. se efectuó la
separación de las fases. La fase acuosa superior con contenido en
ADN se transfirió cuidadosamente a un tubito reciente con una pipeta
con una boca ancha (para evitar fuerzas de cizallamiento) y a
continuación se extrajo otra vez con el mismo volumen de
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (1:1:0,04). Después de la
separación, la fase acuosa superior se transfirió de nuevo
cuidadosamente a un nuevo tubito y el ADN se precipitó con el doble
volumen de etanol. Después de aproximadamente 5 min., el ADN
precipitado en forma de una estructura larga y a modo de hilo se
retira mediante enrollamiento en una varilla de vidrio y se
transfiere a una solución en etanol al 70% para el lavado. El ADN
unido por adhesión a la varilla de vidrio se almacenó a continuación
durante 2 h a la temperatura ambiente, con el fin de provocar una
separación por evaporación del etanol y después se transfirió a 4 ml
de tampón TEN.
En cada caso 1 \mul del ADN total de B.
burgdorferi, así obtenido, se amplificó en cinco tandas PCR de
100 \mul.
Como cebador específico para la amplificación
catalizada por polimerasa se eligieron secuencias que contenían la
información para la iniciación de la traducción, así como el extremo
3' de p41 (flagelina). Para ello, se utilizaron las secuencias de
ADN mostradas en la figura 3. Los dos oligodesoxinucleótidos se
sintetizaron en un sintetizador de ADN Milligen/Biosearch 8700 en
columnas de 1 \mumol, después de la disociación con amoníaco, se
purificaron toscamente mediante precipitación con etanol y se
recogieron en cada caso en 400 \mul de H_{2}O. Por cada tanda de
PCR se emplearon en cada caso 1 \mul de esta solución de
oligodesoxinucleótidos; los tampones, nucleótidos y la
Taq-polimerasa procedían de un estuche de ensayo
adquirible en el comercio (Cetus/Perkin-Elmer,
Überlingen) y se utilizaron también según las prescripciones del
ensayo. Las condiciones de temperatura para los distintos ciclos
eran:
2 min. de desnaturalización a | 94ºC |
2 min. de reasociación a | 45ºC |
4 min. de síntesis de ADN a | 73ºC |
se llevaron a cabo 50
ciclos.
A continuación, las tandas procedentes de las
PCR's se reunieron y el ADN se precipitó mediante la adición de NaCl
con una concentración final de 0,2 M, con 2,5 veces la cantidad en
etanol a -20ºC durante 5 h. Después de la sedimentación y el lavado
en etanol al 70%, el ADN se disolvió en 200 \mul de H_{2}O y,
después de la adición de correspondientes tampones, se separó con
las enzimas de restricción Bam HI y Pst I (Boehringer Mannheim)
según los datos del fabricante.
Después de la separación electroforética en un
gel de agarosa al 1,5%, se aisló el fragmento de ADN amplificado
(aprox. 1000 pb) y se insertó en un vector pUC8 cortado con BamHI y
PstI (Pharmacia) (Vieira, J.; Messing, J. (1982): The pUC plasmids,
and M13mp7-derived system for insertion mutagenesis
and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19,
259-268), empleándose 0,25 \mug del vector, 0,5
\mug del fragmento p41 y 2 unidades de
T4-ADN-ligasa con tampón según las
indicaciones del fabricante (Boehringer Mannhein).
Después de la transformación de los fragmentos
ligados de ADN en la cepa de E. coli JM 109 (Pharmacia)
(Yanisch-Perron, C.; Vieira, J.; Messing, J. (1985):
Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide
sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33,
103-119) y la extensión sobre placas de agar con
ampicilina (50 \mug/ml) y X-Gal (30 \mug/ml) se
cultivaron colonias blancas en 5 ml de medio
L-Broth, y los plásmidos aislados se investigaron
mediante disociación con enzimas de restricción en cuanto a sus
inserciones.
El fragmento de ADN que codifica la flagelina de
B. burgdorferi está asentado, por consiguiente, detrás del
promotor lacUV5 inducible del vector en el mismo marco de lectura
que el segmento transcrito que codifica lacZ\alpha, iniciado por
este promotor. Con ello, resulta una flagelina que en su
N-terminal contiene algunos aminoácidos
codificadores de pUC8. Esta zona se recoge seguidamente:
De los clones E. coli positivos (por
ejemplo pUC8 1y13), que contenían el vector con la inserción de ADN
con la longitud esperada (1000 pb) se dispusieron de nuevo cultivos
líquidos, y la transcripción del promotor lac del plásmido se indujo
mediante inducción durante 3 horas con IPTG 1 mM a 37ºC y
sacudimiento. 1,5 ml de estos cultivos se sedimentaron entonces
durante breve tiempo, las bacterias se lisaron con una "mezcla
hirviendo" (sacarosa al 3%, SDS al 2%,
\beta-mercaptoetanol al 5%,
Tris-HCl 20 mM pH 7,0, azul de bromofenol al 2%) a
100ºC durante 10 min., y las proteínas se separaron mediante PAGE
con SDS al 17,5%. Mediante la tinción de las proteínas por azul
brillante Coomasie, se demostró en las células con la inserción del
plásmido una nueva banda adicional en aproximadamente 41 kD que
corresponde al tamaño esperado de la flagelina. Una reacción
específica de este antígeno recombinante con un suero de un paciente
de borreliosis de Lyme así como con un anticuerpo monoclonal contra
la flagelina p41 de B. burgdorferi se detecta en la
inmunotransferencia mostrada en la figura 4.
Al igual que pUC8, también cualquier otro
plásmido inducible que inicia una transcripción en el mismo marco de
lectura, es adecuado para la producción de p41. Mediante la
separación de la zona codificadora de p41 en la iniciación de la
traducción con BspHI (TC ATG A) y PstI (en el extremo 3') e
introducción del fragmento en el lugar NcoI (CC ATG G) y el lugar
PstI de un denominado vector ATG, también es posible la expresión de
una p41 auténtica que no tiene fusionados ningún tipo de aminoácidos
extraños. Para los procedimientos mostrados a continuación, se
utilizó el clon pUC81y17.
Para la puesta a disposición de secuencias de ADN
específicas de B. burgdorferi se dispuso en E. coli un
banco de genes cromosomal. Con ayuda de métodos adecuados, tales
como inmunoevaluación o hibridación con oligonucleótidos elegidos,
se pudieron identificar en este banco de genes clones de E.
coli que contenían correspondientes secuencias de ADN
específicas de B. burgdorferi. Después del análisis con
enzimas de restricción, se preparó un mapa de enzimas de
restricción. Este mapa se pudo utilizar con el fin de transformar
deliberadamente las secuencias de ADN buscadas en vectores de
expresión o de llevar a cabo su secuenciación. En este caso, se
procedió en particular como sigue: para el aislamiento de ADN (ADN
cromosómico, tal como ADN del plásmido) de B. burgdorferi
(DSM-Nº 5662), las células se cultivaron tal como se
describe en el Ejemplo 2. Después de la centrifugación a 12000 rpm
durante 20 minutos, las células se lavaron y se resuspendieron en
tampón SET (sacarosa al 20%, Tris-HCl 50 mM pH 7,6;
EDTA 50 mM). Mediante la adición de 15 mg/5 ml de lisozima durante
20 minutos, la pared de la célula se separó parcialmente. A
continuación, las células protoplastadas se lisaron mediante la
adición de SDS (sal sódica de N-dodecilsulfato) con
una concentración final de 1%. Después de 20 minutos a 37ºC, se
añadió proteinasa K (concentración final 1 mg/ml) por dos veces
durante 1 hora, y la solución con contenido en ADN se ajustó a NaCl
100 mM con tampón TEN (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 1
mM, NaCl 300 mM). Se realizaron una extracción con fenol y otras dos
extracciones con fenol/cloroformo/alcohol
iso-amílico (fenol:cloroformo en la relación 1:1;
cloroformo:alcohol iso-amílico en la relación 24:1).
El material sobrenadante, así extraído, se reunió con 2,5 volúmenes
de etanol al 95% y el ADN se precipitó a -20ºC. Mediante el
enrollamiento en una varilla de vidrio, se pudo obtener el ADN en
forma de hilo precipitado y se pudo lavar en etanol al 70%. Después
de un breve secado en el desecador, el ADN se recogió en tampón TE
(Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 1 mM) que contenía
RNAsa (20 \mug/ml). El ADN, así preparado, se utilizó para las
etapas ulteriores.
El ADN de B. burgdorferi se incubó con la
enzima de restricción Sau 3A (Boehringer Mannheim) según las
prescripciones del fabricante. Mediante la elección de diluciones
adecuadas con enzima o de un tiempo de acción de la enzima sobre el
ADN, se alcanzó una separación parcial del mismo. El ADN separado
parcialmente, así obtenido, se ligó con ADN de vector (pUC18 u otro
ADN de vector adecuado) restringido con BamHI y desfosforilado
mediante tratamiento con fosfatasa alcalina. Para ello, se empleó
T4-ADN-ligasa (Boehringer Manheim)
según las prescripciones del fabricante. Por cada tanda de
transformación se emplearon 0,2-0,5 \mug/\mul de
ADN total. E. coli JM 109 (u otras cepas de E. coli
adecuadas) se transformaron con el ADN ligado según el protocolo de
Hanahan (Hanahan, D. (1985): Techniques of Transformation of
Escherichia coli, págs. 109-135. En: D.M.
Glover (ed.) DNA cloning, Vol. 1., A practical approach. IRL Press,
Oxford) o según Maniatis et al., (Maniatis, T. (1982):
Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York). Los clones de E.
coli recombinantes se seleccionaron y cultivaron en medio LB (10
g de triptona, Difco, 5 g de extracto de levadura, Difco, 5 g de
NaCl, Merck), que contenía 100 \mug/ml de ampicilina (u otro
antibiótico adecuado). El modelo de colonia se transfirió de manera
idéntica sobre placas LB y se prepararon réplicas de colonias sobre
nitrocelulosa. Las células de estas réplicas de colonias se lisaron
de manera diferente sobre el filtro, en función del procedimiento de
evaluación empleado. En el caso de utilizar sueros monoclonales o
policlonales (inmunoevaluación) para la detección de productos
génicos específicos de B. burgdorferi, que son inducidos
mediante el ADN incorporado por recombinación, las células se
lisaron durante 15 min. a través de vapor de cloroformo saturado.
Después de la saturación del filtro así tratado con una solución de
leche desnatada durante 2 horas, los filtros se incubaron durante
una noche con los distintos sueros, se lavaron varias veces con
tampón TTBS (véase antes) y se incubaron durante 2 horas con el
segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa (Dako, Hamburgo). El
lavado renovado con tampón TTBS servía para la reducción de
anticuerpos conjugados con peroxidasa fijados de manera no
específica. Mediante reacción enzimática de los sustratos
diaminobencidina (Sigma Chemie, Munich) y H_{2}O_{2} en un
pigmento pardo insoluble se pudieron reconocer clones de E.
coli positivos, es decir, productores de antígenos de B.
burgdorferi. Los clones de E. coli positivos, así
reconocidos, se inocularon de la placa de partida y se analizaron.
En el caso de emplear oligonucleótidos específicos para la
hibridación y, por consiguiente, para la detección de secuencias
específicas de antígenos de B. burgdorferi (evaluación
mediante hibridación), las células se lisaron alcalinamente sobre el
filtro de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell) (por humectación
de los filtros durante 5 minutos con NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M).
Después de la neutralización (por humectación de los filtros durante
5 minutos en NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M pH 8,0), los
filtros se humectaron con el ADN desnaturalizado con 2x SSPE (20x
SSPE: NaCl 3,6 M, NaH_{2}PO_{4} 200 mM, pH 7,4, EDTA 20 mM, pH
7,4) y se secaron. Mediante cocción de los filtros durante 2 horas a
80ºC, se fijó el ADN. Los filtros, así tratados, se emplearon
entonces para la hibridación. La hibridación se efectuó con empleo
de métodos de detección radiactivos (^{32}P) o no radiactivos (por
ejemplo digoxigenina, Boehringer Mannheim). En este caso, se
procedió según métodos de marcación (marcación con ^{32}P con
^{32}P-gamma-ATP y reacción de
quinasa, o marcación con digoxigenina con
Dig-11-UTP y reacción de transferasa
terminal) conocidos (Maniatis, T. (1982): Molecular cloning: a
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor) o aconsejados por el fabricante (Boehringer Mannheim). De
los clones de E. coli positivos se constituyó un análisis con
enzimas de restricción, y con esta información se llevó a cabo una
expresión de las secuencias de ADN codificadoras de los antígenos en
vectores adecuados o su secuenciación.
En calidad de sondas de hibridación se emplearon
al comienzo oligodesoxinucleótidos sintéticos, cuyas secuencias se
eligieron con ayuda de secuencias de aminoácidos de p100 y pC. En
este caso, se procedió de la forma siguiente:
A partir de lisados de B. burgdorferi se
purificaron parcialmente las dos proteínas por extracción con
n-octil-\beta-D-tioglucopiranósido
y se separaron ulteriormente mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida con SDS. A continuación, los antígenos se
transfirieron a una matriz de fibra de vidrio mediante la
transferencia de Western y se cortaron los trozos correspondientes
con las proteínas de B. burgdorferi. Después, p100 se
incorporó por secuenciación en el N-terminal y se
determinaron los primeros 22 aminoácidos del
amino-terminal (este método de la
"microsecuenciación" se describe en: Eckerskorn, C., Mewes, W.,
Goretzki, H. y Lottspeich, F.: A new siliconized fiber as support
for protein-chemical analysis of electroblotted
proteins. Eur. J. Biochem. 176 (1988) 509-519). En
el caso de pC no era posible una incorporación por secuenciación
directa, ya que el N-terminal no es directamente
accesible a una secuenciación, es decir en este caso se encuentran
presentes eventualmente una miristilación o modificaciones
similares. Por ello, esta proteína se separó trípticamente, los
fragmentos se separaron mediante HPLC y después se incorporaron por
secuenciación dos de ellos. A partir de las secuencias de
aminoácidos, así obtenidas, se dedujeron entonces las secuencias de
oligodesoxinucleótidos que se recogen seguidamente. Ya que la
mayoría de las veces existen varias posibilidades de codones para un
aminoácido, tuvieron que tenerse en cuenta en los correspondientes
lugares del oligonucleótido también las variaciones de bases e
incorporarse en relaciones equimolares durante la síntesis.
Secuencia de aminoácidos de
p100-p1-p100:
Glu Leu Asp Lys Glu Lys Leu Lys Asp Phe Val Asn
Leu Asp Leu Glu Phe Val Asn Thr
La secuencia del oligodesoxinucleótido de p100,
las bases indicadas entre paréntesis y separadas por ";" se
incorporaron durante la síntesis (en un sintetizador de ADN
Milligen/Biosearch 8700) en relaciones equimolares:
La secuencia de oligodesoxinucleótidos se utilizó
como sonda y se hibridó con los clones que contenían el ADN de B.
burgdorferi. Después de la subclonación se obtuvo un clon que
contiene el gen para p100. Se determinó la siguiente secuencia de
ADN codificante de p100 (extremo 5') de la cepa PKo a una longitud
de 346 pares de bases:
Después de la clonación completa, se determinó la
siguiente secuencia de aminoácidos:
\hskip1.7cmSecuencia de aminoácidos de la proteína p100
De manera análoga se sintetizaron, a través de
las secuencias de aminoácidos de pC:
las correspondientes secuencias de
oligodesoxinucleótidos: Secuencia de oligodesoxinucleótidos de
pC-p1:
Secuencia de oligodesoxinucleótidos de
pC-p2:
Después de hallar clones adecuados mediante
hibridación y subclonación del gen deseado, se pudo determinar la
siguiente secuencia de ADN codificante de pC de la cepa PKo a una
longitud de 639 pares de bases:
La proteína pC presenta, a una longitud de 212
aminoácidos las siguientes secuencias:
\hskip0.3cmSecuencia de aminoácidos de la proteína pC -22 kD-
De manera correspondiente también se determinó
una parte de la secuencia de ADN codificante de OspA (extremo 5') de
la cepa PKo a una longitud de 680 pares de bases:
Después de la secuenciación completa, se pudo
determinar la siguiente secuencia de aminoácidos para la proteína de
31 kD:
\hskip1.5cmSecuencia de aminoácidos de OspA (cepa PKo)
Un cultivo de una noche de 50 ml del clon pUC81y2
descrito en el Ejemplo 2 se añadió a 1,5 ml de medio de
L-Broth de reciente aportación y se incubó a 37ºC y
con intenso sacudimiento. Al alcanzar una densidad óptica de 0,7, el
cultivo se indujo con IPTG en una concentración final de 1 mM y se
incubó durante otras 3 h. Las bacterias se sedimentaron (6000 rpm,
10 min.), se resuspendieron en 300 ml de Tris-HCl 20
mM pH 8,0, EDTA 50 mM, 0,5 mg/ml de lisozima y se añadieron durante
45 min. a un baño de agua a 37ºC. Después de la adición de NaCl en
una concentración final de 150 mM y
Triton-X-100 en una concentración
final de 1%, se incubó ulteriormente durante 45 min. a 37ºC, y la
suspensión se trató a continuación con ultrasonidos por tres veces
en cada caso durante 5 min. Los componentes insolubles se
sedimentaron a 9000 rpm en el espacio de 30 min., se resuspendieron
en Tris-HCl 20 mM pH 8,0, ditiotreitol 10 mM y
octil-glucopiranósido al 1%
(Sigma-Chemie, Munich) y se agitó durante 1 h a la
temperatura ambiente. Después de la subsiguiente sedimentación de
los componentes insolubles a 17000 rpm en el espacio de 30 min., el
material sobrenadante se decantó cuidadosamente.
A continuación, el sedimento se resuspendió
mediante agitación durante 2 h en 150 ml de Tris-HCl
20 mM pH 8,0, urea 8 M y \beta-mercaptoetanol al
1%. También aquí, los componentes insolubles se separaron de nuevo
por centrifugación a 17000 rpm en el espacio de 30 min., y el
material sobrenadante se bombeó sobre una columna de
DEAE-Sephacel (Pharmacia, Freiburg) con un volumen
de gel de 550 ml (3 cm de diámetro, 80 cm de altura). La elución del
antígeno de p41 se efectuó en un gradiente de NaCl de
0-800 mM en un volumen total de 600 ml. La p41
recombinante se eluye a una concentración de NaCl de aproximadamente
0,25 M. Las correspondientes fracciones se reunieron y se
purificaron ulteriormente mediante una HPLC con una columna Mono Q
(intercambiador de aniones) (figura 4). En la figura 5 se muestra un
perfil de elución con la p41 purificada en un gradiente de NaCl de
0-800 mM. Las fracciones
p41-positivas de este caso (según el análisis de la
transferencia de Western) se dializaron contra
Tris-HCL 20 mM pH 8,0, MgCl_{2} 10 mM y
\beta-mercaptoetanol al 0,1% y a continuación se
utilizaron los ensayos mostrados en el Ejemplo 5. A partir de una
purificación de p41 partiendo de 11 cultivos de bacterias puede
esperarse típicamente un rendimiento de 5 a 10 mg.
Después de la secuenciación, se pudo determinar
la siguiente secuencia de aminoácidos:
\hskip1.4cmSecuencia de aminoácidos de la proteína p41
Un clon que contiene el gen para el antígeno pC
(pDS1PC5) se inocula en 100 ml de L-Broth (con 50
\mug de ampicilina/ml), se deja crecer durante una noche y después
se trasladan 900 ml de L-Broth/ampicilina -extracto
de levadura doblemente concentrado/2 ml de glicerol-, se induce
después de aproximadamente 1 h con IPTG 2 mM y se sacude
ulteriormente durante 2-3 h.
Después de separar por centrifugación a 8000 rpm
durante 10 min., el sedimento se resuspende en 20 ml de tampón de
lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, DTE 0,1
mM, PMSF 0,1 mM; 0,4 mg/ml de lisozima). Después de agitar durante
30 min. a temperatura ambiente se efectúa la adición de
Triton-X-100 (concentración final
0,1-0,2%). Adicionalmente, se añaden 10 \mul de
benzonasa (Merck). Se agita durante otros 30 min. a temperatura
ambiente. La solución ahora transparente se ajusta con NaCl sólido a
NaCl 1 M y se agita durante otros 30 min.-60 min. (a 4ºC).
Después de la centrifugación a 4ºC, 30 min., a
15000 rpm, la proteína pC se encuentra cuantitativamente en el
material sobrenadante. El sedimento se desecha. El material
sobrenadante se dializa contra Tris-HCl 10 mM pH
8,0, efectuándose varias veces un cambio del tampón. Después de la
centrifugación y/o filtración, se aplica sobre
DEAE-Sepharose (Pharmacia), equilibrándose la
columna con Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. En la elución
con NaCl 0 M, la proteína pC se encuentra en el 2º pico del
recorrido. Las primeras fracciones se pueden desechar y el resto se
recoge y recromatografía. La columna de separación se regenera con
NaCl 1 M y se equilibra en Tris-HCl 10 mM pH 8,0. El
antígeno, así obtenido, puede utilizarse entonces en un estuche de
ensayo adecuado, por ejemplo un ELISA.
Un clon que contiene el gen para el antígeno OspA
(pDS10spA) se inocula en 100 ml de L-Broth (con 50
\mug de ampicilina/ml) y se cultiva durante una noche. El caldo
del cultivo se transfiere a 900 ml de
L-Broth/ampicilina -extracto de levadura doblemente
concentrado/2 ml de glicerol-, después de aproximadamente 1 h se
induce con IPTG 2 mM y se continúa sacudiendo durante
2-3 h.
Las células se separan por centrifugación a 6000
rpm, 5 min., y el sedimento se resuspende en 20 ml de tampón de
lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, DTE 0,1
mM, PMSF 0,1 mM; 0,4 mg/ml de lisozima). Después de agitar durante
30 min. a la temperatura ambiente, se efectúa la adición de
Triton-X 100 (concentración final
0,5-1%). Adicionalmente, se añaden 10 \mul de
benzonasa (MERCK). Después de ello, se agita durante otros 30 min. a
la temperatura ambiente.
La solución ahora transparente se ajusta con NaCl
sólido a NaCl 1 M y se continúa agitando (a 4ºC). Después de la
centrifugación a 4ºC durante 30 min. y a 15000 rpm, el OspA se
encuentra casi cuantitativamente en el sedimento. El material
sobrenadante se desecha, y el sedimento se resuspende en urea 2 M
(con Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, DTE 0,1 mM).
OspA se encuentra ahora en el material sobrenadante.
El material sobrenadante se dializa en la
manguera de diálisis contra tampón MES 5 mM (ácido
2-[N-morfolino] etanosulfónico), pH 6,0, siendo
absolutamente necesario cambiar varias veces el tampón. Después de
la centrifugación y filtración, la proteína se aplica sobre una
columna de flujo rápido de S-Sepharose (Pharmacia).
Primero se lava con NaCl 0 M y luego se eluye con un gradiente de
NaCl 0 a 1 M. El antígeno de OspA eluye en forma de un pico nítido
en aproximadamente NaCl 0,4 M. Después de la diásilis contra
Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, el antígeno OspA puede
utilizarse entonces en un estuche de ensayo adecuado, por ejemplo un
ELISA.
Condicionado por la elevada pureza de los
antígenos recombinantes producidos, son posibles ensayos específicos
para B. burgdorferi que se pueden leer en la máquina y se
pueden realizar sin una gran complejidad técnica y de personal.
Las placas de microtitulación se recubrieron en
cada caso con 50 \mul de la p41 purificada (concentración
0,5-5 \mug/ml) por pocillo. Las placas se
incubaron según métodos estándares a 4ºC durante una noche, se
lavaron y los lugares de unión todavía libres se saturaron con
solución de albúmina de suero bovino al 2%. A continuación, se
añadieron a ello por pipeteado en cada caso 50 \mul de suero
(dilución 1:200), se incubaron durante 2 h a 37ºC, las partes no
unidas se separaron por lavado y los complejos inmunes unidos se
detectaron en cada caso con 50 \mul de IgG
anti-humana marcada con peroxidasa (solución
1:1000). Después de varios lavados, los pocillos se cargaron en cada
caso con 100 \mul de ortofenilendiamina (concentración, 0,1% en
tampón fosfato 0,1 M, pH 6,0 con H_{2}O_{2} al 0,03%) como
reactivo de color, y la tinción llevada a cabo en la oscuridad se
detuvo después de 10 min. con 100 \mul de ácido sulfúrico 1 N. La
placa de microtitulación se evaluó en un fotómetro a 486 nm (figura
6).
En el ejemplo aquí mostrado, se ensayaron 7
sueros anti-B. burgdorferi positivos y 8 negativos. De los
sueros Lyme-positivos, asegurados clínicamente,
tres, que no mostraban ninguna reacción con p41 sobre tiras de la
transferencia de Western con B. burgdorferi como antígeno, es
decir representaban sueros del estadío temprano de la infección.
Estos reaccionaron en el ELISA con el antígeno recombinante,
asimismo sólo hasta un valor límite. Por el contrario, los sueros
p41-positivos normales reaccionaron muy bien,
mientras que los sueros Lyme-negativos permanecieron
en el intervalo inferior a una DO = 0,3.
Ratones Balb/c hembras se inmunizaron
intraperitonealmente con B. burgdorferi
(DSM-Nº 5662). La 1ª inmunización se efectuó con
coadyuvante completo de Freund, a la que siguieron
2-5 inmunizaciones adicionales con coadyuvante
incompleto de Freund a intervalos de 2 semanas. 2 semanas después,
el antígeno se aplicó sin coadyuvante y 3 días después se sacrificó
a los ratones y se les retiró el bazo.
Los linfocitos del bazo se mezclaron con células
de mieloma de ratón (Ag8-653) en la relación 1:1, se
sedimentaron y se reunieron con solución de fusión (2,5 g de
polietilenglicol (PEG), 2,5 ml de medio RPMI, 250 \mul de DMSO):
adición durante 1 min. de la solución de fusión, incubación durante
90 s a 37ºC. Las células se sedimentaron de nuevo, se retiró el PEG
y se añadió medio de cultivo (medio HAT). Por último, la suspensión
de células se sembró en placas de microtitulación que contenían
macrófagos como células cebadoras, y se cultivaron. Los materiales
sobrenadantes del hibridoma se ensayaron sin dilución en la
inmunofluorescencia indirecta (IFT) (Wilske, B.; Schierz, G.;
Preac-Mursic, V.; Weber, K; Pfister, H.-W.;
Einhäupl, K. (1984): Serological diagnosis of Erythema migrans
disease and related disorders. Infection, 12,
331-337).
Los materiales sobrenadantes de células
IFT-positivos se analizaron mediante la
transferencia de Western. Hibridomas reactivos en la transferencia
de Western se subclonaron 4 veces mediante "dilución
limitante", y se identificaron en relación con su clase de
inmunoglobulina y subclase de IgG.
De este modo, se obtuvieron los siguientes
anticuerpos monoclonales (MAB):
- 1.
- MAB contra p41:
- (a)
- L41 1C11
- Este anticuerpo era reactivo con todas las 30 cepas de B. burgdorferi sometidas a ensayo y con borrelias de fiebre recurrente (a excepción de B. hermsii), pero no con treponemas.
- (b)
- L41 1D3
- Este anticuerpo era reactivo con la mayoría (21 de 24) de las cepas de B. burgdorferi, pero no con las borrelias de fiebre recurrente y treponemas.
- 2.
- MAB contra p100 (L100 1D4):
- Este anticuerpo era reactivo con todas las 30 cepas de B. burgdorferi sometidas a ensayo, pero no con borrelias de fiebre recurrente o treponemas.
- 3.
- MAB contra pC (L22 1F8):
- Este MAB era reactivo con proteínas pC de cepas de la piel y del líquido cefalorraquídeo, y por el contrario eran negativas las proteínas pC de algunas pero no de todos los géneros de garrapatas.
- 4.
- MAB contra OspA:
- OspA es una proteína principal (intervalo de 30 kD) de la membrana externa de la mayoría de las cepas de B. burgdorferi. Las proteínas OspA de cepas europeas de B. burgdorferi son antigenéticamente heterogéneas y se diferencian antigenéticamente de las cepas americanas. Las pocas cepas OspA-negativas tienen proteínas pC.
- (a)
- L32 2E7
- En total, de 32 cepas, 29 eran reactivas. Las cepas negativas no presentaban ninguna proteína OspA. Las 3 cepas negativas eran reactivas con el MAB L22 específico de pC.
- (b)
- L32 1G3:
- Este MAB sólo era reactivo en 3 de 25 cepas sometidas a ensayo.
La combinación de MAB L32 2E7 y MAB L22 1F8, así
como la reacción con MAB L100 1D4 permite la identificación de
borrelias de B. burgdorferi y treponemas. Una
identificación y diferenciación seguras de B. burgdorferi no
era posible con los anticuerpos monoclonales disponibles hasta
ahora.
Conforme a los métodos descritos en los ejemplos
precedentes, se determinó la secuencia de aminoácidos de una
proteína con un peso molecular de aproximadamente 22 kD. Esta
proteína se clonó en otra cepa de borrelia y a continuación
se secuenció. Esta cepa se depositó en la ATCC bajo el número 35210
y es generalmente accesible. En este caso, se determinó la siguiente
secuencia de aminoácidos:
\hskip1cmSecuencia de aminoácidos de proteína pC
Se sometieron a ensayo 74 sueros de pacientes con
erisipeloide en cuanto a anticuerpos de IgM e IgG. Adicionalmente,
se examinó un grupo testigo negativo de 100 donantes de sangre. En
los ensayos se emplearon en una ocasión, conforme a métodos de
realización de ensayo ELISA en sí conocidos, preparados de
ultrasonidos de Borrelia burgdorferi. Por otra parte, se
emplearon por separado y en común proteínas recombinantes preparadas
conforme a la invención. Las siguientes Tablas muestran claramente
que mediante el procedimiento conforme a la invención se puede
conseguir una sensibilidad considerablemente más elevada en
comparación con el empleo de material tratado con ultrasonidos.
Detección de anticuerpos de
IgM
ELISA/antígeno | Erisipeloide (n=74) |
Material tratado con ultrasonidos | 20 27,0% |
p41 (recomb.) | 22 29,7% |
OspA (recomb.) | 7 9,4% |
pC (recomb.) | 26 35,1% |
p41 y/o pC | 34 45,9% |
p41 y/o PC y/u OspA | 34 45,9% |
Detección de anticuerpos de
IgG
ELISA/antígeno | Erisipeloide (n=74) |
Material tratado con ultrasonidos | 17 22,9% |
p41 (recomb.) | 23 31,1% |
OspA (recomb.) | 6 8,1% |
pC (recomb.) | 27 36,5% |
p41 y/o pC | 34 45,9% |
p41 y/o PC y/u OspA | 35 47,3% |
Detección de anticuerpos IgG y/o
IgM
ELISA/antígeno | Erisipeloide (n=74) |
Material tratado con ultrasonidos | 30 40% |
p41 (recomb.) | 39 53% |
OspA (recomb.) | 11 15% |
pC (recomb.) | 41 55% |
p41 y/o pC | 53 72% |
p41 y/o PC y/u OspA | 53 72% |
Figuras 1 a y
b
Se sometieron a ensayo sueros de los estadíos II
y III (neuroborreliosis, estadío II (IgM e IgG); acrodermatitis
(IgG) y artritis (IgG), estadio III). La respuesta inmune temprana
es independiente de la cepa de ensayo contra un estrecho espectro de
proteínas de borrelias (pC y p41). La respuesta inmune tardía
está dirigida contra un amplio panel de proteínas de
borrelias. Proteínas inmunodominantes son (independientemente
de la cepa de ensayo) p100 (con peso molecular variable) y p41.
La proteína pC puede ser la proteína
inmunodominante de la respuesta inmune temprana. Posteriormente,
pueden aparecer anticuerpos contra p41 y sólo estar débilmente
acusados. En el caso de una duración mayor de la enfermedad, también
pueden manifestarse anticuerpos de IgM contra p17.
Los anticuerpos de IgG reconocen un amplio
espectro de proteínas de borrelias. En el caso de emplear la
cepa PKo, se manifiestan como proteínas inmunodominantes p17 y p100.
p17 es fuertemente expresada por la cepa PKo (en contraposición con
otras cepas; véase la figura 1). La flagelina p41 no fue reconocida
en 2 de estos Ejemplos (sueros 1 y 2).
A; segmento del ADN de B. burgdorferi con
la región codificadora de p41 (segmento negro).
B; aumento del extremo 5' o 3' del gen de p41 con
el de las respectivas secuencias de ADN. Se indica adicionalmente el
comienzo de la traducción (ATG), así como el codón de terminación en
el extremo 3' (TAA). Las secuencias de cebador utilizadas para la
PCR están indicadas adicionalmente por debajo (cebador 1) o por
encima (cebador 2) de la doble cadena de ADN codificadora de p41.
Una hibridación del cebador sólo puede efectuarse con los
respectivos extremos 3'. Los extremos 5' contienen partes no
hibridantes, que representan lugares de corte para enzimas de
restricción: GGATCC-BamHI;
TCATGA-BspHI, en el extremo 5';
GACGTC-PstI en el extremo 3'.
Parte izquierda: gel de poliacrilamida con SDS
teñido con azul Coomasie. Las distintas pistas estaban cargadas como
sigue: 1, lisado de E. coli, testigo negativo; 2, lisado de
E. coli con pUC81y17 después de inducción con IPTG, la p41
producida por vía recombinante se puede reconocer como banda
adicional en el intervalo de aproximadamente 45 kDa; 3, material
sobrenadante del lisado de 2 después de lisar las células tal como
se describe en el Ejemplo 4; 4, fracción de sedimento de las células
lisadas con la p41 recombinante; 5, material sobrenadante de
octil-glucopiranósido; 6, como 5, pero fracción de
sedimento; 7 - 10, fracciones después de la elución de p41 de una
columna Mono Q a través de una gradiente de sales; las pistas 9 y 10
contienen p41 recombinante, condicionado por manifestaciones de
degradación, así como por una traducción incompleta, se manifiestan,
junto al producto completo, además pequeños fragmentos que se pueden
encontrar también sin embargo en material de p41 auténtico de B.
burgdorferi.
Parte derecha: transferencia de Western
inmunocoloreada de un gel de SDS con muestras del gel teñido con
Coomasie. La tinción inmunológica se llevó a cabo con un anticuerpo
monoclonal descrito en el Ejemplo 6. Designación de las pistas o de
las muestras, tal como gel teñido con Coomasie; pista 0, pista
vacía.
A continuación de la purificación del
intercambiador de aniones (Mono Q de Pharmacia) de p41, el antígeno
se volvió a dializar contra urea 4 M sin sal y, de nuevo, se añadió
a la columna Mono Q con el fin de verificar la pureza. El perfil de
elución ya sólo muestra un pico de adsorción de proteínas. El pico
menor directamente delante de la porción principal corresponde al
fragmento p41 visible en la figura 4, pista 8, con un tamaño de
aproximadamente 30 kD (ensayado mediante transferencia de
Western).
El antígeno recombinante purificado a través de
un intercambiador de aniones (Mono Q) (véase la figura 5) se empleó
en una concentración de 0,5 \mug/ml. Se sometieron a ensayo 7
sueros de pacientes con una borreliosis de Lyme definida
clínicamente y 8 sueros de personas sanas. 4 sueros de los pacientes
con borreliosis de Lyme eran fuertemente reactivos en la
transferencia de Western con la p41 recombinante (= positivos), 3
sueros eran débilmente reactivos (= valor límite) y los sueros de
las personas sanas no reaccionaron (= negativos). El ELISA de IgG
mostró un resultado equiparable. Eje Y: densidad óptica a una
longitud de onda de 486 nm; vl = valor límite.
Seis anticuerpos monoclonales contra B.
burgdorferi se sometieron a ensayo con 30 cepas diferentes de
B. burgdorferi, 4 cepas de borrelias de fiebre
recurrente y 2 treponemas distintos. En la figura se representan a
título de ejemplo tres materiales aislados diferentes de B.
burgdorferi (1 = B31, cepa americana; 2 = PKo, cepa alemana de
la piel; 3 = PBi, cepa alemana del líquido cefalorraquídeo), una
borrelia de fiebre recurrente (4 = B. hermsii) y una
cepa de treponema (5 = T. phagedenis). Se emplearon los
anticuerpos monoclonales preparados conforme al Ejemplo 6.
Claims (12)
1. Procedimiento para la preparación de una
proteína inmunológicamente activa de Borrelia burgdorferi que
se presenta en una forma libre de otras proteínas procedentes de
Borrelia burgdorferi, y que
a) presenta la secuencia de aminoácidos
o una secuencia parcial de la misma de al menos
10 aminoácidos,
o
b) presenta la secuencia de aminoácidos
o una secuencia parcial de la misma de al menos
10 aminoácidos,
o
c) se compone de la secuencia de aminoácidos
o de la secuencia parcial de esta proteína con
una deleción de 20-25 aminoácidos en el
N-terminal de la proteína,
o
d) presenta la secuencia de aminoácidos
o una secuencia parcial de la misma de al menos
10 aminoácidos, caracterizado porque se prepara por
tecnología
genética.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la proteína inmunológicamente activa se
puede preparar empleando ADN aislado de Borrelia
burgdorferi.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la proteína inmunológicamente activa se
puede preparar empleando ADN aislado de Borrelia burgdorferi
(DSM-Nº 5662).
4. Estuche de ensayo para la detección de
anticuerpos contra cepas de borrelias, caracterizado
porque contiene al menos una proteína inmunológicamente activa que
se puede preparar según una de las reivindicaciones 1 a 3 y que
puede reaccionar con los anticuerpos presentes en el líquido de
investigación, y porque presenta al menos un componente indicador
que posibilita la detección de complejos a base de proteína
inmunológicamente activa y anticuer-
pos.
pos.
5. Estuche de ensayo según la reivindicación 4,
caracterizado porque contiene 2 a 4 proteínas
inmunológicamente activas que se pueden preparar según las
reivindicaciones 1 a 3.
6. Estuche de ensayo según una de las
reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque el componente
indicador es un anticuerpo dirigido contra el anticuerpo a detectar,
que presenta una marcación.
7. Estuche de ensayo según la reivindicación 6,
caracterizado porque la marcación consiste en un isótopo
radiactivo.
8. Estuche de ensayo según una de las
reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque la marcación
consiste en una enzima que puede catalizar una reacción de
color.
9. Estuche de ensayo según una de las
reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque la proteína
inmunológicamente activa o un anticuerpo monoclonal dirigido contra
ella está biotinilado, y el componente indicador es avidina o
estreptoavidina con una enzima unida a ella de forma covalente, en
particular peroxidasa.
10. Estuche de ensayo según una de las
reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque es un estuche de
ensayo ELISA.
11. Estuche de ensayo según la reivindicación 10,
caracterizado porque está acoplada a placas de
microtitulación al menos una proteína inmunológicamente activa según
una de las reivindicaciones 1 a 3, y el componente indicador se
compone de inmunoglobulina anti-humana, en
particular anticuerpos de IgG y/o IgM, a los que está acoplada una
enzima que cataliza una reacción de color.
12. Procedimiento para la preparación de vacunas
para la protección contra infecciones, de bacterias
borrelias, preferiblemente cepas de Borrelia
burgdorferi, caracterizado porque se utilizan proteínas
inmunológicamente activas que se pueden preparar según una de las
reivindicaciones 1 a 3.
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