EP3999524A1 - Method for self-assembly of a protein on a substrate in a three-dimensional honeycomb structure - Google Patents

Method for self-assembly of a protein on a substrate in a three-dimensional honeycomb structure

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Publication number
EP3999524A1
EP3999524A1 EP20740366.8A EP20740366A EP3999524A1 EP 3999524 A1 EP3999524 A1 EP 3999524A1 EP 20740366 A EP20740366 A EP 20740366A EP 3999524 A1 EP3999524 A1 EP 3999524A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
substrate
assembly
primary
self
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20740366.8A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Pierre-Henri ELCHINGER
Renaud Dumas
Elise JACQUIER
Pierre-Henri JOUNEAU
François PARCY
Raluca Tiron
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Grenoble Alpes
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Universite Grenoble Alpes
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Universite Grenoble Alpes, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/306—Extraction; Separation; Purification by precipitation by crystallization
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures

Definitions

  • the present invention relates to the general field of protein crystallization.
  • the invention relates to a method of self-assembling proteins on a substrate in a three-dimensional honeycomb structure.
  • the invention is particularly advantageous since it makes it possible to obtain a nanostructured, stable material, the patterns of which exhibit very great regularity.
  • the invention also relates to the assembly, formed from the substrate and the protein structure, thus obtained.
  • Such an assembly forms a grafting platform for a wide variety of molecules.
  • the invention also relates to a use of such an assembly.
  • the invention finds applications in many industrial fields, and in particular in the field of photolithography, catalysis, optics, or else for the manufacture of membranes.
  • the invention also relates to a method for manufacturing nanopillars from such an assembly.
  • top-down the top-down approach
  • bottom-up the bottom-up approach
  • top-down type approach consists in locally modifying the surface of a substrate so as to create binding sites that can interact with proteins. The self-assembly of proteins is then conditioned by their attachment to these binding sites.
  • Such an approach requires structuring the substrate at the nanometric or micrometric scale, which requires additional steps and makes the process longer and more expensive.
  • the different architectures obtained are 2D architectures, formed of single or double layers. However, these protein architectures do not exhibit great stability.
  • An aim of the present invention is therefore to provide a method making it possible to manufacture a self-assembly of proteins which is stable over time and / or resistant to solvents.
  • the present invention provides a method of self-assembly of a protein according to a three-dimensional honeycomb structure comprising the following successive steps:
  • a solution comprising a solvent and a protein, the protein comprising an amino acid sequence corresponding to an oligomerization domain of a LEAFY protein, for example to the oligomerization domain of Ginkgo biloba, in fusion with a tag,
  • the invention differs fundamentally from the prior art by the use of a label allowing growth perpendicular to the surface of the substrate (ie growth in height and not along the substrate) and therefore to obtain three-dimensional architecture.
  • the primary helices form, within the protein structure, regularly spaced alveoli, which may advantageously be functionalized.
  • Such an architecture has very good stability.
  • Such a process is relatively simple to implement since the protein structure spontaneously self-assembles during the evaporation of the solvent.
  • the method comprises an additional step during which is added to the honeycomb structure, already formed, another protein corresponding to the oligomerization domain of the unlabeled LEAFY protein, whereby the height of the label is increased. honeycomb structure perpendicular to the substrate.
  • the substrate is made of a material chosen from a metal, a metalloid or a carbonaceous material.
  • the choice of substrate material and in particular its hydrophilic / hydrophobic properties plays on the substrate / label affinity. This goes influence the surface of the self-assembled structure as well as the rate of coverage of the substrate by this structure.
  • the invention also relates to an assembly obtained by such a method, the assembly comprising a substrate covered by a self-assembly of protein according to a three-dimensional honeycomb structure,
  • the protein comprising an amino acid sequence corresponding to an oligomerization domain of a LEAFY protein, for example to the oligomerization domain of Ginkgo biloba, in fusion with a tag,
  • the oligomerization domain being crystallized in the form of a primary helix, each primary helix interacting with six other primary helices, the structure being fixed perpendicularly to the substrate by the label.
  • the pitch between each primary helix is less than lOnm.
  • pitch is meant the distance between the center of the lumen of two adjacent primary helices.
  • the internal diameter of a primary propeller ranges from 4nm to 6nm, for example 5nm.
  • the self-assembly covers an area of at least
  • the substrate is porous.
  • This embodiment is particularly advantageous, in particular for manufacturing membranes whose pore size is defined by the cells of the honeycomb structure.
  • the protein is functionalized with a metal (metal nanoparticles), a metal salt, an inorganic complex or an organic molecule.
  • a metal metal nanoparticles
  • a metal salt metal salt
  • an inorganic complex or an organic molecule.
  • This embodiment is particularly advantageous for manufacturing metallic nanopillars, nanocatalysts or nanophosphors.
  • the organic molecule can be, for example, a chromophore or a fluorophore.
  • the organic molecule is a peptide which can interact with metals (such as gold for example) and / or which can reduce metal salts to manufacture metal nanopillars.
  • the protein is functionalized with quantum dots (also called quantum dots or QD for “Quantum Dots”).
  • the honeycomb structure is metallized, for example with gold.
  • This embodiment is particularly advantageous for forming metal rings of regularly spaced nanometric dimensions, for optical applications.
  • the C -terminal sequence of the protein is modified by a peptide sequence which can interact with metals (such as gold for example) and / or which can reduce metal salts, for example, to manufacture metallic nanopillars.
  • metals such as gold for example
  • the structure can be deposited on many flat or curved substrates
  • the invention also relates to a use of an assembly as defined above, to develop applications in nanotechnologies, for example as a photolithography mask, as an amplifier of a signal from an optical sensor, as a membrane, or as a catalyst.
  • the invention also relates to a method of manufacturing nano metal pillars comprising the following successive steps: - Provide an assembly comprising a substrate covered by a self-assembly of protein according to a three-dimensional honeycomb structure, the protein comprising an amino acid sequence corresponding to an oligomerization domain of a LEAFY protein, for example to the domain oligomerization of Ginkgo biloba, in fusion with a tag, and specific amino acids, capable of being functionalized by a metal or a metal salt, lining the alveoli of the honeycomb, the oligomerization domain being crystallized in the form a primary helix, each primary helix interacting with six other primary helices, the structure being fixed perpendicularly to the substrate by the label,
  • FIG. 1A represents, schematically, according to different views, the structure of two monomers of the oligomerization domain of an interacting LEAFY protein (PDB code 4UDE), according to a particular embodiment of the invention; for greater readability, the histidine tag and the disordered C-terminal part of the monomers are not shown.
  • PDB code 4UDE interacting LEAFY protein
  • FIG. 1B schematically represents, according to different views, the structure of the helix formed by the head-tail oligomerization of the monomers of oligomerization domain of a LEAFY protein, according to a particular embodiment of the invention.
  • FIG. 1C diagrammatically represents, according to different views, the details of the interaction of two primary helices formed by oligomerization of the oligomerization domain of a LEAFY protein, according to a particular embodiment of the invention; for greater readability, only the monomers of a helix are differentiated.
  • FIG. 1D schematically represents a primary helix interacting with 6 other primary helices to form a honeycomb-like protein structure, according to a particular embodiment of the invention.
  • FIG. 2 is an image obtained by electron microscopy (STEM), of a self-assembly of the oligomerization domain of a LEAFY protein lacking a histidine tag according to a honeycomb structure, parallel to the surface of a carbon substrate; the inset schematically represents the orientation of a primary helix in the structure.
  • STEM electron microscopy
  • Figure 3A and 3B are images obtained by electron microscopy
  • FIGS. 4A and 4B are images obtained by electron microscopy (STEM) of a protein self-assembly on a carbon substrate, at different scales, according to a particular embodiment of the invention.
  • STEM electron microscopy
  • FIGS. 2, 3A, 3B, 4A and 4B were obtained by carrying out a black labeling, with uranyl acetate, of the amino acids which line the lumen of the wells of the primary helices.
  • the self-assembly process is described for a protein.
  • the invention is transposable to peptides, polypeptides and more generally to amino acid sequences homologous to the amino acid sequence of the oligomerization domain of the LEAFY protein.
  • the self-assembly process to obtain a three-dimensional honeycomb protein structure comprises the following successive steps:
  • the protein of interest used to form the three-dimensional honeycomb protein structure on the substrate has a primary amino acid sequence comprising:
  • oligomerization domain is intended to mean an amino acid sequence allowing proteins to assemble one after the other, in small chains.
  • the oligomerization domain is that of the LEAFY protein.
  • the LEAFY transcription factor also noted LFY
  • the oligomerization of the LEAFY protein is a head-tail oligomerization ( Figures IA, IB, IC).
  • Such oligomerization allows, unlike head-head interactions, to self-assemble monomers in the form of a primary helix.
  • the primary helix of the protein oligomerization domain forms a substantially helical coil, the internal diameter of which forms an alveolus (also called a well or lumen).
  • the walls of the cell are lined with the C-terminus of each monomer.
  • the groove of a primary helix interacts in parallel with the groove of 6 other primary helices to generate a honeycomb organization ( Figures 1D).
  • a primary helix is nested with six other primary helices, according to a honeycomb structure (or hexagonal structure).
  • the bonds between the primary helices are hydrogen and ionic bonds.
  • the oligomerization domain can be that of Arabidopsis. thaliana (AtLFY), Ginkgo biloba (GbLFY), Ceratopteris richardii (CrLFY) or Physcomitrella patens (PpLFY).
  • the oligomerization domain of the LEAFY protein of Ginkgo biloba is (here and subsequently all the amino acid sequences are noted from the N-terminal to the C-terminal):
  • the orientation of the self-assembly is determined by the addition of a label.
  • the tag is a short sequence of amino acids (typically having 6 to 30 amino acids).
  • FIGS. 3A and 3B represent a self-assembly obtained with a label (histidine label): the growth is perpendicular to the surface of the substrate.
  • the protein tag allows the protein structure to be attached to the surface of the substrate.
  • Labels composed of positively charged amino acids (for example from 6 to 30 and preferably from 6 to 10 residues among lysine (K) or arginine (R)) making it possible to bind to a negatively charged surface; for example, such labels could be used with silicon oxide surfaces,
  • labels composed of negatively charged amino acids (for example from 6 to 30 and preferably from 6 to 10 residues among glutamate (E) or aspartate (D)) making it possible to bind to a positively charged surface; for example, such labels can be used with surfaces treated with amylamine,
  • hydrophobic amino acids for example from 6 to 30 and preferably from 6 to 10 residues among leucine (L), valine (V), isoleucine (I), methionine (M), phenylalanine (F), tryptophan (W), proline (P)) making it possible to bind to a hydrophobic surface; for example, such labels could be used with surfaces treated with silanes,
  • - labels composed of polar amino acids (for example from 6 to 30 and preferably from 6 to 10 residues among serine (S), threonine (T), tyrosine (Y)) making it possible to attach to a surface polar; for example, such labels could be used with silicon, aluminum or titanium oxide surfaces,
  • labels composed of amino acids making it possible to bind to metals (for example from 6 to 30 and preferably from 6 to 10 residues among cysteine (C), histidine (H), glutamate (E), aspartate (D)) allowing it to be attached to metal surfaces; for example, such labels can be used with surfaces made of palladium, platinum, molybdenum, cobalt or gold,
  • -tags composed of specific amino acids allowing a high affinity receptor / ligand type interaction on functionalized surfaces such as, for example, a Strep tag (WSHPQFEK; SEQ ID NO: 2 in the attached sequence listing) on a surface functionalized with streptavidin.
  • WSHPQFEK Strep tag
  • the label begins with an initiator methionine (M).
  • the label can end with a sequence composed, for example, of 2 to 20 residues serving as a spacer (“linker”), for example GA.
  • linker for example GA.
  • the tag is a histidine tag (also called polyhistidine tag or histidine tag).
  • the histidine tag contains at least six histidine amino acids. It can have more than six histidine amino acids. It can also include other amino acids.
  • one of the following sequences can be chosen:
  • histidine tag Any other label, in particular of equivalent size, clinging in a non-specific or specific manner to a substrate, and allowing growth of the protein structure perpendicular to the substrate can be used.
  • the amino acid sequence also includes a part intended to line the alveoli of the honeycomb.
  • this part corresponds to the sequence: KKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ. (SEQ ID NO: 12 in the attached sequence listing)
  • This part is completely modular. It can be deleted. It can also be modified by deletion, substitution, or insertion. The modifications on this part do not affect the self-assembly capacity of the protein.
  • it is modified by substitution or insertion so as to introduce one or more specific amino acids capable of being functionalized by a metal ion, a metal or an organic molecule.
  • a cysteine also called cysteine residue (C)
  • C cysteine residue
  • sequence of the part lining the alveoli modified by substitution can be for example: CKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ (SEQ ID NO: 13 in the attached sequence listing).
  • the following table lists various amino acid sequences of the protein which can be used: a primary sequence and sequences of mutants.
  • the mutant sequences are obtained by modifying the tag and / or the C-terminal sequence lining the alveoli of the primary sequence. These mutants have been tested and self-assemble in honeycombs perpendicular to the surface.
  • the C-terminal can be shortened or replaced by combinations of amino acids (Cysteine, Histidine, Lysine; Glutamate, Glycine) capable of interacting with molecules and preceded by a more or less short spacer.
  • the spacer may be composed of the amino acids Glycine and Serine.
  • the spacer can be GGSGGS (SEQ ID NO: 14 in the attached sequence listing), GGS and G.
  • the protein of interest can be synthesized by synthetic biology.
  • the protein of interest is produced by a bacterium.
  • the protein of interest can be expressed in a commercial strain, advantageously by a strain of E. coli bacteria.
  • the protein of interest is then purified from the soluble extract of the bacteria that produced it.
  • the purification consists, for example, in collecting the bacteria by centrifugation, in breaking their membrane by sonication and then in separating the soluble proteins containing the protein of interest by centrifugation.
  • the protein of interest is then purified one or more times. It may be a purification by affinity on a resin containing nickel (for example of the Nickel-Sepharose type) and / or on permeation gel (for example of the Nickel-Sepharose type). Superdex 200, marketed by GE Healfcare). Only the proteins provided with the histidine tag are retained on the resin containing nickel.
  • the protein is soluble in an aqueous buffer, preferably Tris- HCl (pH between 7.0 and 9.0 at a concentration between 10 and 100 mM) containing a thiol reducer (DTT (Dithiothreitol) or TCEP ( Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) at a concentration of 1 mM), to form a protein solution.
  • Tris- HCl pH between 7.0 and 9.0 at a concentration between 10 and 100 mM
  • DTT Dithiothreitol
  • TCEP Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride
  • the protein solution is advantageously mixed with a crystallization solution (composed of a buffer and a salt). It may be a 50/50 volume mixture.
  • the crystallization solution includes, for example, Tris-HCl (the buffer) and ammonium sulfate (the salt). More generally, it is also possible to use a buffer called Good's buffer (such as, for example, ADA, HEPES, CAPS) at concentrations of between 25 and 200 mM and a pH of between 6.5 and 8.5. It is also possible to use other salts such as, for example, lithium sulfate.
  • the concentration of the protein in the solution used during step a) can range from 0.5 mg / mL to 5 mg / mL.
  • a volume Vi of the solution containing the protein of interest is brought into contact with the substrate.
  • the substrate can be of different types. For example, it can be metallic, in a metalloid element or even in a carbonaceous material. By way of illustration, it can be silicon or carbon. For example, it is possible to choose a wafer of silicon or a silicon or carbon microscopy grid.
  • the substrate can be transparent. By transparent is meant that the substrate has a transmittance greater than 50% in the visible range, i.e. from 350nm to 750nm, and preferably greater than 70% in the visible range.
  • the substrate is hydrophilic to promote its covering with the solution containing the protein of interest and / or the interactions with the histidine tag.
  • the surface of the substrate to be functionalized can be greater than 50 ⁇ m 2 , or even greater than 1 mm 2 . It may for example be about 7 mm 2 .
  • a drop of solution containing the protein of interest, or a larger volume of this solution, can be deposited on the surface to be treated or the surface to be treated can be deposited on the solution containing the protein of interest.
  • the protein solution can advantageously cover the substrate locally.
  • a step can be carried out prior to step b) during which a layer called a protective layer is formed locally on the substrate, for example during a photolithography step through a mask.
  • the substrate then comprises parts covered by the protective layer and parts not covered by the protective layer. This makes it possible to delimit the areas of the substrate to be functionalized with the protein structure.
  • the protein solution is in contact with the surface of the substrate at the level of the parts not covered by the protective layer.
  • the walls of the protective layer act as a guide during the growth of the protein structure.
  • step c the protein is crystallized to form the protein structure.
  • Crystallization involves changing the protein from a soluble state to a solid, ordered state.
  • the solution containing the protein is gradually evaporated in order to increase the protein concentration until it crystallizes.
  • the self-assembly of the protein on the surface of the substrate is advantageously carried out in a closed chamber, for example in a crystallization chamber.
  • the enclosure advantageously contains a crystallization tank of volume V2 containing the crystallization buffer solution.
  • a volume V2 greater than the volume Vi.
  • the volume V2 ranges, for example, from 500pL to 5mL.
  • step c) advantageously lasts from 4 h to 48 h. This duration depends on the surface of the substrate to be functionalized as well as on the volume of solution. Self-assembly is visible from 4 hours and reaches an optimal after 24 hours.
  • an assembly comprising a substrate covered by the crystallized protein and self-assembled according to a three-dimensional honeycomb structure perpendicular to the surface of the substrate. It has a controlled height corresponding to the stacking of the various monomers.
  • the height of the protein structure is on average 18nm with the protein containing the histidine tag but possibly higher using a second growth step in the presence of the protein without the histidine tag.
  • the internal diameter of the cells of the honeycomb ranges, for example, from 4nm to 6nm.
  • the pitch between the primary helices is less than 10 nm. It ranges, for example, from 8 nm to 10 nm.
  • the protein architecture obtained with the oligomerization domain of the LEAFY protein of Ginkgo biloba has the following characteristics ( Figures 3A and 3B):
  • the height of the three-dimensional structure is approximately 31 nm, corresponding to the stack of 40 monomers
  • the pitch between the center of the lumens of two adjacent primary helices is 9.5 nm
  • the width of the groove within the same primary helix ranges from 4 to 5nm
  • the internal diameter of the primary propeller is 5 nm.
  • AFM atomic force microscopy
  • STEM transmission electron microscopy
  • the parameters of the self-assembled protein structure such as the diameter of the wells and the height of the wells can be easily changed.
  • the diameter of the wells can be reduced.
  • the variation in the number of acids Amines lining the inside of the wells also makes it possible to modulate the number of molecules grafted into the alveoli of the protein structure.
  • the height of the self-assembled structure can be increased by the addition of the oligomerization domain, devoid of the histidine tag, in other words by the addition on the self-assembly of monomers of the oligomerization domain so as to grow the primary helices of the protein structure.
  • This modification makes it possible, for example, to increase the number of grafted molecules (inorganic, organic or mixed), to have a nano-lithography mask having a greater thickness or even to increase the height of the pillars which can grow in height. within this self-assembly.
  • the area of the self-assembled structure as well as the coverage rate of a substrate can be increased, for example, by varying the affinity of the substrate for the histidine tag.
  • PDB Protein Data Bank
  • the self-assembled three-dimensional honeycomb structure thus obtained is a biomaterial which can be used for many applications.
  • the structure can be used as a membrane, when the self-assembled structure is formed on a porous surface, the permeability threshold is determined by the internal diameter of the primary helices.
  • the self-assembled structure can be covered, totally or partially with a metallic layer, for example of gold. It can be metallized by physical vapor deposition, by chemical vapor deposition, by chemical deposition or by electrochemical deposition.
  • a metallic layer for example of gold. It can be metallized by physical vapor deposition, by chemical vapor deposition, by chemical deposition or by electrochemical deposition.
  • Such a structure can be used to influence the behavior of a light wave on the surface of a substrate.
  • This is particularly useful for amplifying the signal from an optical sensor, such as, for example, a sensor chosen from sensors based on surface plasmon resonance (SPR), surface enhanced Raman scattering (SERS) sensors, or else for surface enhanced infrared spectroscopy (SEIRAS). It is, for example, possible to form regularly spaced gold rings by covering the upper part of the structure with gold.
  • SPR surface plasmon resonance
  • SERS surface enhanced Raman scattering
  • SEIRAS surface enhanced infrared spectroscopy
  • the self-assembled structure can be used as a photolithography mask: the self-assembly generating wells of regular diameter and spacing (for example with a diameter of 5 nm and spaced 9 nm apart ), it can be used as a photolithography mask to etch a support through the alveoli of the honeycomb.
  • the etching could be, for example, of the chemical type (HF) on a silicon support or by ultra-violet (UV) on a photosensitive surface.
  • the self-assembly can serve as a platform / support for grafting inorganic molecules (metal ions, inorganic complexes, Q.D or metal particles for example) and organic (fluorophores or peptides for example).
  • a protein will be chosen having a sequence comprising one or more amino acids which can be functionalized by metal salts which can be reduced to metal nanoparticles, by inorganic complexes having a certain catalytic activity, by organic molecules or even by QDs. or nanoparticles.
  • the C-terminal part of the protein can be replaced by an amino acid sequence which makes it possible both to attract the metal salts and to reduce them in situ without the need to add a reducing agent.
  • - amines with lysine as typical amino acid by way of example, mention may be made of primary amines such as that of lysine in order to carry out acylation reactions and thus to graft all the compounds comprising an acid chloride because the nitrogen of the primary amine is nucleophilic and can react with electrophilic sites,
  • thiols for the grafting of compounds comprising maleimides and / or for the creation of dissulfide bridges with compounds also possessing thiols and / or for reactions of oxidation, alkylations and metallation,
  • This grafting platform can be used in the photovoltaic field or for the detection of molecules. It is possible to consider the detection of single molecules. It is possible to graft molecules playing, for example, the role of catalysts. The immobilization of the catalysts increases their stability. It is thus possible to manufacture bio-hybrid materials, for example, for photo-catalysis.
  • This confinement is also particularly advantageous, for example for artificial photosynthesis or for carrying out oxidation-reduction reactions.
  • the specific grafting of metals (or of metal ions which are subsequently reduced) inside the wells can be used for the design of metal nanopillars in the cells of the protein structure (wells). , for example for nanoelectronics. Their lengths and diameters depends on the protein architecture.
  • the nanopillars are oriented perpendicular to the surface of the substrate and are regularly spaced. It is possible, for example, to make gold nanopillars, via a thiol function, binding to the cysteines of the amino acid sequence of the protein. To fix metal salts, one will choose, for example, histidines.
  • a metal for example in the form of a metallic nanoparticle, the metal binding to the amino acid reactive with respect to metals, and playing the role of a metal germ for the growth of the nanopillar,
  • GGSTGTSVLIATPGV SEQ ID NO: 32 in the attached sequence listing
  • GGSWAGAKRLVLRRE SEQ. ID NO: 33 in the attached sequence listing
  • a step can subsequently be carried out during which the protein structure is removed in order to keep only the nanopillars on the surface of the substrate.
  • This step can be accomplished, depending on the nature of the substrate, by plasma, or even by thermal annealing at a temperature above the decomposition temperature of the protein (typically at a temperature above 100 ° C.).
  • the self-assembled protein architecture is obtained by carrying out the following successive steps:
  • a permeation gel for example of the Superdex 200 type, sold by GE healfcare
  • a permeation gel for example of the Superdex 200 type, sold by GE healfcare
  • a 20 mM Tris-HCl buffer pH between 7 and 9.0
  • concentrate the pure protein between 0.5 and 5 mg / ml; the protein can be frozen in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C before use.
  • a volume of x ⁇ l of the protein solution of interest (with x ranging for example from 5 to 50 ⁇ l) is mixed with the same volume of a crystallization solution so as to form a drop of protein which is then contact with a surface to be treated.
  • the crystallization solution can include Tris-HCl with a pH of 7 to 9 and ammonium sulfate at a concentration of 40 to 350 mM.
  • the surface to be treated can be made hydrophilic, for example by a plasma treatment (“glow-discharge”).
  • a crystallization tank having a volume, ranging for example from 500pL to 5mL) is filled with the crystallization solution. Then the crystallization chamber is sealed to initiate the diffusion of vapor from the drop towards the reservoir. After a time ranging from 4 h to 48 h at room temperature, the treated surface is removed from the crystallization chamber.
  • the material obtained can then be visualized by transmission electron microscopy (STEM, TEM) when the support is transparent to electrons.
  • STEM transmission electron microscopy
  • the support is deposited on an aqueous solution containing a dye (for example 2% uranyl acetate) for 2 min.
  • Uranyl acetate will more specifically mark the lumen of honeycombs by interaction of the metal with negative amino acids (Glutamate and Aspartate) which line the lumen of the wells.
  • FIGS. 4A and 4B are photographs obtained under an electron microscope (STEM) of a self-assembled structure of proteins on a 7mm 2 carbon substrate.
  • the honeycomb structure perpendicular to the surface of the substrate is clearly visible.
  • the recovery rate is 40%.

Abstract

Method for self-assembly of a protein in a three-dimensional honeycomb structure, comprising the following consecutive steps: - providing a solution comprising a solvent and a protein, the protein comprising a sequence of amino acids corresponding to an oligomerisation domain of a LEAFY protein, for example to the oligomerisation domain of Ginkgo biloba, in fusion with a tag, - placing the solution in contact with a substrate, - evaporating the solvent in order to crystallise the protein, the oligomerisation domain crystallising in the form of a primary helix, each primary helix interacting with six other primary helixes, whereby a three-dimensional honeycomb protein structure is obtained perpendicular to the substrate, the protein structure being attached to the substrate by the tag.

Description

PROCEDE D'AUTO-ASSEMBLAGE D'UNE PROTEINE SUR UN SUBSTRAT SELON UNE STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE EN NID D'ABEILLE PROCESS FOR SELF-ASSEMBLING A PROTEIN ON A SUBSTRATE ACCORDING TO A THREE-DIMENSIONAL HONEYCOMB STRUCTURE
DESCRIPTION DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE TECHNICAL AREA
La présente invention se rapporte au domaine général de la cristallisation de protéines. The present invention relates to the general field of protein crystallization.
L'invention concerne un procédé d'auto-assemblage de protéines sur un substrat selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille. The invention relates to a method of self-assembling proteins on a substrate in a three-dimensional honeycomb structure.
L'invention est particulièrement intéressante puisqu'elle permet d'obtenir un matériau nanostructuré, stable, dont les motifs présentent une très grande régularité. The invention is particularly advantageous since it makes it possible to obtain a nanostructured, stable material, the patterns of which exhibit very great regularity.
L'invention concerne également l'ensemble, formé du substrat et de la structure protéique, ainsi obtenu. Un tel ensemble forme une plate-forme de greffage pour une grande variété de molécules. The invention also relates to the assembly, formed from the substrate and the protein structure, thus obtained. Such an assembly forms a grafting platform for a wide variety of molecules.
L'invention concerne également une utilisation d'un tel ensemble. L'invention trouve des applications dans de nombreux domaines industriels, et notamment dans le domaine de la photolithographie, de la catalyse, de l'optique, ou encore pour la fabrication de membrane. The invention also relates to a use of such an assembly. The invention finds applications in many industrial fields, and in particular in the field of photolithography, catalysis, optics, or else for the manufacture of membranes.
L'invention concerne également un procédé pour fabriquer des nanopiliers à partir d'un tel ensemble. The invention also relates to a method for manufacturing nanopillars from such an assembly.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE STATE OF THE PRIOR ART
Actuellement, pour générer l'auto-assemblage de protéines sur une surface, deux approches sont utilisées : l'approche de haut en bas (dite « top-down ») et l'approche de bas en haut (dite « bottom-up »). Currently, to generate the self-assembly of proteins on a surface, two approaches are used: the top-down approach (called "top-down") and the bottom-up approach (called "bottom-up" ).
L'approche de type « top-down » consiste à modifier localement la surface d'un substrat de manière à créer des sites de liaisons pouvant interagir avec des protéines. L'auto-assemblage des protéines est alors conditionné par leur attachement sur ces sites de liaison. Cependant, une telle approche nécessite de structurer le substrat à l'échelle nanométrique ou micrométrique, ce qui nécessite des étapes additionnelles et rend le procédé plus long et plus coûteux. The “top-down” type approach consists in locally modifying the surface of a substrate so as to create binding sites that can interact with proteins. The self-assembly of proteins is then conditioned by their attachment to these binding sites. However, such an approach requires structuring the substrate at the nanometric or micrometric scale, which requires additional steps and makes the process longer and more expensive.
L'approche de « type bottom-up » repose sur les propriétés intrinsèques des protéines à pouvoir interagir entre elles. Plusieurs types de procédés « bottom-up » ont été rapportés. On peut, notamment, citer : The “bottom-up” approach is based on the intrinsic properties of proteins to be able to interact with each other. Several types of “bottom-up” processes have been reported. We can, in particular, quote:
- les techniques d'émulsion inverse, basées sur l'évaporation d'une microémulsion de protéine sur une surface (« inverse émulsion breath-figure »), - reverse emulsion techniques, based on the evaporation of a protein microemulsion on a surface (“reverse breath-figure emulsion”),
- les techniques de Langmuir-Blodgett, reposant sur la fabrication d'un film protéique monocouche induit par pression à la surface d'un liquide, puis au dépôt de ce film sur une surface solide, et - Langmuir-Blodgett techniques, based on the production of a single-layer protein film induced by pressure on the surface of a liquid, then on the deposition of this film on a solid surface, and
- les procédés de recristallisation 2D de protéines « S-layer ». - 2D recrystallization processes of "S-layer" proteins.
Par exemple, dans l'article de Gonen et al. (« Design of ordered two- dimensional arrays mediated by noncovalent protein-protein interfaces », Science (2015), 348, 6241, 1365-1368), la conception d'interfaces protéiques, assistée par ordinateur, a permis de définir différentes architectures de réseaux 2D. Des cristaux protéiques allant jusqu'à lpm de long et 8nm d'épaisseur sont obtenus. For example, in the article by Gonen et al. (“Design of ordered two-dimensional arrays mediated by noncovalent protein-protein interfaces”, Science (2015), 348, 6241, 1365-1368), the design of protein interfaces, aided by computer, has made it possible to define different architectures of 2D networks. Protein crystals of up to lpm long and 8nm thick are obtained.
Dans l'article de Sayou et al. (« A SAM oligomérization domain shapes the genomic binding landscape of the LEAFY transcription factor », Nature Communications (2016), 7, 11222), la structure cristalline du domaine d'oligomérisation de Ginkgo biloba a été étudiée en solution. Les auteurs ont montré que l'oligomérisation tête queue des monomères conduit à la formation d'une hélice. In the article by Sayou et al. (“A SAM oligomerization domain shapes the genomic binding landscape of the LEAFY transcription factor”, Nature Communications (2016), 7, 11222), the crystal structure of the oligomerization domain of Ginkgo biloba was studied in solution. The authors have shown that head-to-tail oligomerization of monomers leads to the formation of a helix.
Les différentes architectures obtenues sont des architectures 2D, formées de couches simples ou doubles. Cependant, ces architectures protéiques ne présentent pas une grande stabilité. The different architectures obtained are 2D architectures, formed of single or double layers. However, these protein architectures do not exhibit great stability.
EXPOSÉ DE L'INVENTION DISCLOSURE OF THE INVENTION
Un but de la présente invention est donc de proposer un procédé permettant de fabriquer un auto-assemblage de protéines stable dans le temps et/ou résistant aux solvants. Pour cela, la présente invention propose un procédé d'auto-assemblage d'une protéine selon une structure tridimensionnelle en nids d'abeille comprenant les étapes successives suivantes : An aim of the present invention is therefore to provide a method making it possible to manufacture a self-assembly of proteins which is stable over time and / or resistant to solvents. For this, the present invention provides a method of self-assembly of a protein according to a three-dimensional honeycomb structure comprising the following successive steps:
- fournir une solution comprenant un solvant et une protéine, la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, par exemple au domaine d'oligomérisation de Ginkgo biloba, en fusion avec une étiquette, - providing a solution comprising a solvent and a protein, the protein comprising an amino acid sequence corresponding to an oligomerization domain of a LEAFY protein, for example to the oligomerization domain of Ginkgo biloba, in fusion with a tag,
- mettre la solution en contact avec un substrat, - bring the solution into contact with a substrate,
- faire évaporer le solvant pour cristalliser la protéine, par exemple par diffusion de vapeur, le domaine d'oligomérisation cristallisant sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, moyennant quoi on obtient une structure protéique tridimensionnelle en nid d'abeille, perpendiculaire au substrat, la structure protéique étant fixée au substrat par l'étiquette. - evaporate the solvent to crystallize the protein, for example by vapor diffusion, the oligomerization domain crystallizing in the form of a primary helix, each primary helix interacting with six other primary helices, whereby a three-dimensional protein structure is obtained honeycomb, perpendicular to the substrate, the protein structure being fixed to the substrate by the label.
L'invention se distingue fondamentalement de l'art antérieur par l'utilisation d'une étiquette permettant une croissance perpendiculairement à la surface du substrat (i.e. une croissance en hauteur et non pas le long du substrat) et donc à l'obtention d'une architecture tridimensionnelle. Les hélices primaires forment, au sein de la structure protéique, des alvéoles régulièrement espacées, pouvant être, avantageusement, fonctionnalisées. Une telle architecture présente une très bonne stabilité. Un tel procédé est relativement simple à mettre en œuvre puisque la structure protéique s'auto-assemble spontanément lors de l'évaporation du solvant. The invention differs fundamentally from the prior art by the use of a label allowing growth perpendicular to the surface of the substrate (ie growth in height and not along the substrate) and therefore to obtain three-dimensional architecture. The primary helices form, within the protein structure, regularly spaced alveoli, which may advantageously be functionalized. Such an architecture has very good stability. Such a process is relatively simple to implement since the protein structure spontaneously self-assembles during the evaporation of the solvent.
Avantageusement, le procédé comporte une étape additionnelle au cours de laquelle on ajoute sur la structure en nid d'abeille, déjà formée, une autre protéine correspondant au domaine d'oligomérisation de la protéine LEAFY sans étiquette, moyennant quoi on augmente la hauteur de la structure en nid d'abeille perpendiculairement au substrat. Advantageously, the method comprises an additional step during which is added to the honeycomb structure, already formed, another protein corresponding to the oligomerization domain of the unlabeled LEAFY protein, whereby the height of the label is increased. honeycomb structure perpendicular to the substrate.
Avantageusement, le substrat est en un matériau choisi parmi un métal, un métalloïde ou un matériau carboné. Le choix du matériau du substrat et notamment ses propriétés hydrophiles/hydrophobes joue sur l'affinité substrat/étiquette. Ceci va influencer la surface de la structure auto-assemblée ainsi que le taux de recouvrement du substrat par cette structure. Advantageously, the substrate is made of a material chosen from a metal, a metalloid or a carbonaceous material. The choice of substrate material and in particular its hydrophilic / hydrophobic properties plays on the substrate / label affinity. This goes influence the surface of the self-assembled structure as well as the rate of coverage of the substrate by this structure.
L'invention concerne également un ensemble obtenu par un tel procédé, l'ensemble comprenant un substrat recouvert par un auto-assemblage de protéine selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille, The invention also relates to an assembly obtained by such a method, the assembly comprising a substrate covered by a self-assembly of protein according to a three-dimensional honeycomb structure,
la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, par exemple au domaine d'oligomérisation de Ginkgo biloba, en fusion avec une étiquette, the protein comprising an amino acid sequence corresponding to an oligomerization domain of a LEAFY protein, for example to the oligomerization domain of Ginkgo biloba, in fusion with a tag,
le domaine d'oligomérisation étant cristallisé sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, la structure étant fixée perpendiculairement au substrat par l'étiquette. the oligomerization domain being crystallized in the form of a primary helix, each primary helix interacting with six other primary helices, the structure being fixed perpendicularly to the substrate by the label.
Avantageusement, le pas entre chaque hélice primaire est inférieur à lOnm. Par pas, on entend la distance entre le centre de la lumière de deux hélices primaires adjacentes. Advantageously, the pitch between each primary helix is less than lOnm. By pitch is meant the distance between the center of the lumen of two adjacent primary helices.
Avantageusement, le diamètre intérieur d'une hélice primaire va de 4nm à 6nm, par exemple 5nm. Advantageously, the internal diameter of a primary propeller ranges from 4nm to 6nm, for example 5nm.
Avantageusement, l'auto-assemblage couvre une surface d'au moins Advantageously, the self-assembly covers an area of at least
50pm2. 50pm 2 .
Avantageusement, le substrat est poreux. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux, notamment pour fabriquer des membranes dont la taille des pores est définie par les alvéoles de la structure en nid d'abeille. Advantageously, the substrate is porous. This embodiment is particularly advantageous, in particular for manufacturing membranes whose pore size is defined by the cells of the honeycomb structure.
Selon une première variante avantageuse, la protéine est fonctionnalisée avec un métal (nanoparticules métalliques), un sel métallique, un complexe inorganique ou une molécule organique. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux pour fabriquer des nanopiliers métalliques, des nanocatalyseurs ou des nanophosphores. According to a first advantageous variant, the protein is functionalized with a metal (metal nanoparticles), a metal salt, an inorganic complex or an organic molecule. This embodiment is particularly advantageous for manufacturing metallic nanopillars, nanocatalysts or nanophosphors.
La molécule organique peut être, par exemple, un chromophore ou un fluorophore. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la molécule organique est un peptide pouvant interagir avec des métaux (comme de l'or par exemple) et/ou pouvant réduire des sels métalliques pour fabriquer des nanopiliers métalliques. Selon une autre variante avantageuse, la protéine est fonctionnalisée avec des boîtes quantiques (aussi appelés points quantiques ou Q.D pour « Quantum Dots »). The organic molecule can be, for example, a chromophore or a fluorophore. According to a particularly advantageous embodiment, the organic molecule is a peptide which can interact with metals (such as gold for example) and / or which can reduce metal salts to manufacture metal nanopillars. According to another advantageous variant, the protein is functionalized with quantum dots (also called quantum dots or QD for “Quantum Dots”).
Selon une autre variante avantageuse, la structure en nids d'abeille est métallisée, par exemple avec de l'or. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux pour former des anneaux métalliques de dimensions nanométriques régulièrement espacés, pour des applications optiques. According to another advantageous variant, the honeycomb structure is metallized, for example with gold. This embodiment is particularly advantageous for forming metal rings of regularly spaced nanometric dimensions, for optical applications.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la séquence C -terminale de la protéine est modifiée par une séquence peptidique pouvant interagir avec des métaux (comme de l'or par exemple) et/ou pouvant réduire des sels métalliques, par exemple, pour fabriquer des nanopiliers métalliques. According to a particularly advantageous embodiment, the C -terminal sequence of the protein is modified by a peptide sequence which can interact with metals (such as gold for example) and / or which can reduce metal salts, for example, to manufacture metallic nanopillars.
Une telle structure présente de nombreux avantages : Such a structure has many advantages:
- la régularité des motifs de la structure déposée est très grande, voire supérieure aux technologies existantes (copolymères à blocs notamment), - the regularity of the patterns of the deposited structure is very high, even superior to existing technologies (block copolymers in particular),
- il est possible de fonctionnaliser l'intérieur des puits avec des molécules organiques et/ ou inorganiques, - it is possible to functionalize the inside of the wells with organic and / or inorganic molecules,
- la structure peut être déposée sur de nombreux substrats plans ou courbes, - the structure can be deposited on many flat or curved substrates,
- il est possible de contrôler le diamètre des alvéoles de la structure en nid d'abeille ainsi que le pas entre les alvéoles, en utilisant différentes architectures protéiques, - it is possible to control the diameter of the alveoli of the honeycomb structure as well as the pitch between the alveoli, using different protein architectures,
- la structure protéique fixée au substrat est très stable, - the protein structure attached to the substrate is very stable,
- il n'y a pas besoin de structurer préalablement le substrat pour fixer la structure protéique. - there is no need to structure the substrate beforehand to fix the protein structure.
L'invention concerne également une utilisation d'un ensemble tel que défini précédemment, pour développer des applications en nanotechnologies, par exemple comme masque de photolithographie, comme amplificateur d'un signal d'un capteur optique, comme membrane, ou comme catalyseur. The invention also relates to a use of an assembly as defined above, to develop applications in nanotechnologies, for example as a photolithography mask, as an amplifier of a signal from an optical sensor, as a membrane, or as a catalyst.
L'invention concerne également un procédé de fabrication de nano piliers métalliques comprenant les étapes successives suivantes : - fournir un ensemble comprenant un substrat recouvert par un auto assemblage de protéine selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille, la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, par exemple au domaine d'oligomérisation de Ginkgo biloba, en fusion avec une étiquette, et des acides aminés spécifiques, apte à être fonctionnalisés par un métal ou un sel métallique, tapissant les alvéoles du nid d'abeille, le domaine d'oligomérisation étant cristallisé sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, la structure étant fixée perpendiculairement au substrat par l'étiquette, The invention also relates to a method of manufacturing nano metal pillars comprising the following successive steps: - Provide an assembly comprising a substrate covered by a self-assembly of protein according to a three-dimensional honeycomb structure, the protein comprising an amino acid sequence corresponding to an oligomerization domain of a LEAFY protein, for example to the domain oligomerization of Ginkgo biloba, in fusion with a tag, and specific amino acids, capable of being functionalized by a metal or a metal salt, lining the alveoli of the honeycomb, the oligomerization domain being crystallized in the form a primary helix, each primary helix interacting with six other primary helices, the structure being fixed perpendicularly to the substrate by the label,
- greffer, sur les acides aminés spécifiques, un métal (par exemple sous la forme de nanoparticules métalliques), un complexe inorganique ou un sel métallique et le réduire, pour former des nano-piliers métalliques dans les alvéoles du nid d'abeille. - grafting, onto specific amino acids, a metal (for example in the form of metallic nanoparticles), an inorganic complex or a metallic salt and reducing it, to form metallic nanopillars in the cells of the honeycomb.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront du complément de description qui suit. Other characteristics and advantages of the invention will emerge from the additional description which follows.
Il va de soi que ce complément de description n'est donné qu'à titre d'illustration de l'objet de l'invention et ne doit en aucun cas être interprété comme une limitation de cet objet. It goes without saying that this additional description is given only by way of illustration of the subject of the invention and should in no case be interpreted as a limitation of this subject.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description d'exemples de réalisation donnés à titre purement indicatif et nullement limitatif en faisant référence aux dessins annexés sur lesquels : The present invention will be better understood on reading the description of exemplary embodiments given purely as an indication and in no way limiting, with reference to the appended drawings in which:
La figure IA représente, schématiquement, selon différentes vues, la structure de deux monomères du domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY en interaction (code PDB 4UDE), selon un mode de réalisation particulier de l'invention ; pour plus de lisibilité l'étiquette histidine et la partie C-terminale désordonnée des monomères ne sont pas représentées. FIG. 1A represents, schematically, according to different views, the structure of two monomers of the oligomerization domain of an interacting LEAFY protein (PDB code 4UDE), according to a particular embodiment of the invention; for greater readability, the histidine tag and the disordered C-terminal part of the monomers are not shown.
La figure IB représente de manière schématique, selon différentes vues, la structure de l'hélice formée par l'oligomérisation tête queue des monomères du domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, selon un mode de réalisation particulier de l'invention. FIG. 1B schematically represents, according to different views, the structure of the helix formed by the head-tail oligomerization of the monomers of oligomerization domain of a LEAFY protein, according to a particular embodiment of the invention.
La figure IC représente de manière schématique, selon différentes vues, les détails de l'interaction de deux hélices primaires formées par oligomérisation du domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, selon un mode de réalisation particulier de l'invention ; pour plus de lisibilité, seuls les monomères d'une hélice sont différenciés. FIG. 1C diagrammatically represents, according to different views, the details of the interaction of two primary helices formed by oligomerization of the oligomerization domain of a LEAFY protein, according to a particular embodiment of the invention; for greater readability, only the monomers of a helix are differentiated.
La figure 1D représente de manière schématique une hélice primaire interagissant avec 6 autres hélices primaires pour former une structure protéique en nid d'abeille, selon un mode de réalisation particulier de l'invention. FIG. 1D schematically represents a primary helix interacting with 6 other primary helices to form a honeycomb-like protein structure, according to a particular embodiment of the invention.
La figure 2 est un cliché obtenu par microscopie électronique (STEM), d'un auto-assemblage du domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY dépourvue d'étiquette histidine selon une structure en nid d'abeille, parallèlement à la surface d'un substrat en carbone ; l'encart représente schématiquement l'orientation d'une hélice primaire dans la structure. FIG. 2 is an image obtained by electron microscopy (STEM), of a self-assembly of the oligomerization domain of a LEAFY protein lacking a histidine tag according to a honeycomb structure, parallel to the surface of a carbon substrate; the inset schematically represents the orientation of a primary helix in the structure.
La figure 3A et 3B sont des clichés obtenus par microscopie électronique Figure 3A and 3B are images obtained by electron microscopy
(STEM), d'un auto-assemblage d'une protéine comprenant un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY munie d'une étiquette histidine, selon une structure en nid d'abeille, perpendiculaire à la surface d'un substrat en carbone, selon un mode de réalisation particulier de l'invention et selon différentes échelles ; l'encart de la figure 3B représente schématiquement l'orientation d'une hélice primaire dans la structure. (STEM), of a self-assembly of a protein comprising an oligomerization domain of a LEAFY protein provided with a histidine tag, according to a honeycomb structure, perpendicular to the surface of a substrate in carbon, according to a particular embodiment of the invention and according to different scales; the inset of Figure 3B schematically shows the orientation of a primary helix in the structure.
Les figures 4A et 4B sont des clichés obtenus par microscopie électronique (STEM) d'un auto-assemblage de protéine sur un substrat de carbone, à différentes échelles, selon un mode de réalisation particulier de l'invention. FIGS. 4A and 4B are images obtained by electron microscopy (STEM) of a protein self-assembly on a carbon substrate, at different scales, according to a particular embodiment of the invention.
Les figures 2, 3A, 3B, 4A et 4B ont été obtenues en réalisant un marquage en noir, à l'acétate d'uranyle, des acides aminés qui tapissent la lumière des puits des hélices primaires. FIGS. 2, 3A, 3B, 4A and 4B were obtained by carrying out a black labeling, with uranyl acetate, of the amino acids which line the lumen of the wells of the primary helices.
Les différentes parties représentées sur les figures ne le sont pas nécessairement selon une échelle uniforme, pour rendre les figures plus lisibles. Les différentes possibilités (variantes et modes de réalisation) doivent être comprises comme n'étant pas exclusives les unes des autres et peuvent se combiner entre elles. The different parts shown in the figures are not necessarily on a uniform scale, to make the figures more readable. The different possibilities (variants and embodiments) must be understood as not being mutually exclusive and can be combined with one another.
En outre, dans la description ci-après, des termes qui dépendent de l'orientation, tels que « dessus », « sur », «dessous », « sous », etc. d'une structure s'appliquent en considérant que la structure est orientée de la façon illustrée sur les figures. In addition, in the following description, terms which depend on the orientation, such as "above", "on", "below", "under", etc. of a structure apply considering that the structure is oriented as shown in the figures.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS DETAILED PRESENTATION OF PARTICULAR EMBODIMENTS
Ici et par la suite, le procédé d'auto-assemblage est décrit pour une protéine. Cependant, l'invention est transposable aux peptides, polypeptides et d'une manière plus générale aux séquences d'acides aminés homologues à la séquence en acide aminés du domaine d'oligomérisation de la protéine LEAFY. Here and below, the self-assembly process is described for a protein. However, the invention is transposable to peptides, polypeptides and more generally to amino acid sequences homologous to the amino acid sequence of the oligomerization domain of the LEAFY protein.
Le procédé d'auto-assemblage pour obtenir une structure protéique tridimensionnelle en nid d'abeille comprend les étapes successives suivantes : The self-assembly process to obtain a three-dimensional honeycomb protein structure comprises the following successive steps:
a) fournir une solution contenant une protéine d'intérêt, b) mettre la solution en contact avec la surface d'un substrat, c) faire cristalliser la protéine, moyennant quoi on obtient un auto assemblage tridimensionnel de la protéine selon une structure en nids d'abeille, perpendiculairement à la surface du substrat. a) providing a solution containing a protein of interest, b) contacting the solution with the surface of a substrate, c) crystallizing the protein, whereby a three-dimensional self-assembly of the protein in a nested structure is obtained bee, perpendicular to the surface of the substrate.
Lors de l'étape a), la protéine d'intérêt utilisée pour former la structure protéique tridimensionnelle en nid d'abeille sur le substrat présente une séquence primaire en acides aminés comprenant : During step a), the protein of interest used to form the three-dimensional honeycomb protein structure on the substrate has a primary amino acid sequence comprising:
- une étiquette, - a label,
- un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, - an oligomerization domain of a LEAFY protein,
- une partie destinée à tapisser les alvéoles du nid d'abeille. - a part intended to line the cells of the honeycomb.
Par domaine d'oligomérisation, on entend une séquence d'acides aminés permettant aux protéines de s'assembler les unes à la suite des autres, en petites chaînes. Le domaine d'oligomérisation est celui de la protéine LEAFY. Le facteur de transcription LEAFY (aussi noté LFY) est impliqué dans des processus développementaux chez les plantes, en particulier la formation des fleurs. L'oligomérisation de la protéine LEAFY est une oligomérisation tête-queue (figures IA, IB, IC). Une telle oligomérisation permet, contrairement à des interactions tête-tête, d'auto- assembler des monomères sous la forme d'une hélice primaire. L'hélice primaire du domaine d'oligomérisation de la protéine forme un enroulement sensiblement hélicoïdal dont le diamètre interne forme une alvéole (aussi appelé puits ou lumière). Les pa rois de l'alvéole sont tapissées par l'extrémité C-terminale de chaque monomère. Le sillon d'une hélice primaire interagit parallèlement avec le sillon de 6 autres hélices primaires pour générer une organisation en nids d'abeille (figures 1D). Autrement dit, une hélice primaire est imbriquée avec six autres hélices primaire, selon une structure en nid d'abeille (ou structure hexagonale). Les liaisons entre les hélices primaires sont des liaisons hydrogène et ionique. The term “oligomerization domain” is intended to mean an amino acid sequence allowing proteins to assemble one after the other, in small chains. The oligomerization domain is that of the LEAFY protein. The LEAFY transcription factor (also noted LFY) is involved in developmental processes in plants, in particular the formation of flowers. The oligomerization of the LEAFY protein is a head-tail oligomerization (Figures IA, IB, IC). Such oligomerization allows, unlike head-head interactions, to self-assemble monomers in the form of a primary helix. The primary helix of the protein oligomerization domain forms a substantially helical coil, the internal diameter of which forms an alveolus (also called a well or lumen). The walls of the cell are lined with the C-terminus of each monomer. The groove of a primary helix interacts in parallel with the groove of 6 other primary helices to generate a honeycomb organization (Figures 1D). In other words, a primary helix is nested with six other primary helices, according to a honeycomb structure (or hexagonal structure). The bonds between the primary helices are hydrogen and ionic bonds.
A titre illustratif et non limitatif, le domaine d'oligomérisation peut être celui de Arabidopsis. thaliana (AtLFY), de Ginkgo biloba (GbLFY), de Ceratopteris richardii (CrLFY) ou de Physcomitrella patens (PpLFY). By way of illustration and without limitation, the oligomerization domain can be that of Arabidopsis. thaliana (AtLFY), Ginkgo biloba (GbLFY), Ceratopteris richardii (CrLFY) or Physcomitrella patens (PpLFY).
Par exemple, le domaine d'oligomérisation de la protéine LEAFY du Ginkgo biloba est (ici et par la suite toutes les séquences d'acides aminés sont notées du N-terminal vers le C -terminal): For example, the oligomerization domain of the LEAFY protein of Ginkgo biloba is (here and subsequently all the amino acid sequences are noted from the N-terminal to the C-terminal):
MARKELSSLEELFRHYGVRYMTLTKMVEMGFTVNTLVNMTEQELDDVI RTLVDI YRVDLLVGEKYGIKSAVRAEKRRLDELERKKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ. (SEQ. ID NO: 1 dans le listage de séquences en annexe). MARKELSSLEELFRHYGVRYMTLTKMVEMGFTVNTLVNMTEQELDDVI RTLVDI YRVDLLVGEKYGIKSAVRAEKRRLDELERKKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ. (SEQ. ID NO: 1 in the attached sequence listing).
L'orientation de l'auto-assemblage est déterminée par l'addition d'une étiquette. D'une manière générale, l'étiquette est une séquence courte d'acides aminés (typiquement ayant de 6 à 30 acides aminés). The orientation of the self-assembly is determined by the addition of a label. Generally speaking, the tag is a short sequence of amino acids (typically having 6 to 30 amino acids).
En absence de cette étiquette, l'auto-assemblage croit parallèlement à la surface, c'est-à-dire dans le plan de la surface du substrat en contact avec la solution de protéine d'intérêt lors de l'étape b) (figure 2). En présence de cette étiquette, l'assemblage croit perpendiculairement à la surface du substrat, c'est-à-dire perpendiculairement au plan de la surface du substrat en contact avec la solution de protéine d'intérêt lors de l'étape b). Les figures 3A et 3B représentent un auto assemblage obtenu avec une étiquette (étiquette histidine) : la croissance est perpendiculaire à la surface du substrat. L'étiquette de la protéine permet de fixer la structure protéique à la surface du substrat. In the absence of this label, self-assembly grows parallel to the surface, i.e. in the plane of the surface of the substrate in contact with the solution of protein of interest during step b) ( figure 2). In the presence of this label, the assembly grows perpendicular to the surface of the substrate, that is to say perpendicular to the plane of the surface of the substrate in contact with the solution of protein of interest during step b). FIGS. 3A and 3B represent a self-assembly obtained with a label (histidine label): the growth is perpendicular to the surface of the substrate. The protein tag allows the protein structure to be attached to the surface of the substrate.
Plusieurs types d'étiquettes pourront être utilisés comme par exemple : Several types of labels can be used, for example:
- des étiquettes composées d'acides aminés chargés positivement (par exemple de 6 à 30 et de préférence de 6 à 10 résidus parmi la lysine (K) ou l'arginine (R)) permettant de se fixer sur une surface chargée négativement ; par exemple on pourra utiliser de telles étiquettes avec des surfaces d'oxyde de silicium, - Labels composed of positively charged amino acids (for example from 6 to 30 and preferably from 6 to 10 residues among lysine (K) or arginine (R)) making it possible to bind to a negatively charged surface; for example, such labels could be used with silicon oxide surfaces,
-des étiquettes composées d'acides aminés chargés négativement (par exemple de 6 à 30 et de préférence de 6 à 10 résidus parmi le glutamate (E) ou l'aspartate (D)) permettant de se fixer sur une surface chargée positivement ; par exemple on pourra utiliser de telles étiquettes avec des surfaces traitées avec de l'amylamine, labels composed of negatively charged amino acids (for example from 6 to 30 and preferably from 6 to 10 residues among glutamate (E) or aspartate (D)) making it possible to bind to a positively charged surface; for example, such labels can be used with surfaces treated with amylamine,
-des étiquettes composées d'acides aminés hydrophobes (par exemple de 6 à 30 et de préférence de 6 à 10 résidus parmi la leucine (L), la valine (V), l'isoleucine (I), la méthionine (M), la phénylalanine (F), le tryptophane (W), la proline (P)) permettant de se fixer sur une surface hydrophobe ; par exemple on pourra utiliser de telles étiquettes avec des surfaces traitées avec des silanes, - labels composed of hydrophobic amino acids (for example from 6 to 30 and preferably from 6 to 10 residues among leucine (L), valine (V), isoleucine (I), methionine (M), phenylalanine (F), tryptophan (W), proline (P)) making it possible to bind to a hydrophobic surface; for example, such labels could be used with surfaces treated with silanes,
-des étiquettes composées d'acides aminés polaires (par exemple de 6 à 30 et de préférence de 6 à 10 résidus parmi la sérine (S), la thréonine (T), la tyrosine (Y)) permettant de se fixer sur une surface polaire ; par exemple on pourra utiliser de telles étiquettes avec des surfaces d'oxyde de silicium, d'aluminium ou de titane, - labels composed of polar amino acids (for example from 6 to 30 and preferably from 6 to 10 residues among serine (S), threonine (T), tyrosine (Y)) making it possible to attach to a surface polar; for example, such labels could be used with silicon, aluminum or titanium oxide surfaces,
-des étiquettes composées d'acides aminés permettant de se lier à des métaux (par exemple de 6 à 30 et de préférence de 6 à 10 résidus parmi la cystéine (C), l'histidine (H), le glutamate (E), l'aspartate (D)) permettant de se fixer sur des surfaces métalliques ; par exemple on pourra utiliser de telles étiquettes avec des surfaces en palladium, platine, molybdène, cobalt ou en or, - labels composed of amino acids making it possible to bind to metals (for example from 6 to 30 and preferably from 6 to 10 residues among cysteine (C), histidine (H), glutamate (E), aspartate (D)) allowing it to be attached to metal surfaces; for example, such labels can be used with surfaces made of palladium, platinum, molybdenum, cobalt or gold,
-des étiquettes composées d'acides aminés spécifiques permettant une interaction de forte affinité de type récepteur/ligand sur des surfaces fonctionnalisées comme par exemple une étiquette Strep (WSHPQFEK ; SEQ ID NO: 2 dans le listage des séquences en annexe) sur une surface fonctionnalisée avec de la streptavidine. -tags composed of specific amino acids allowing a high affinity receptor / ligand type interaction on functionalized surfaces such as, for example, a Strep tag (WSHPQFEK; SEQ ID NO: 2 in the attached sequence listing) on a surface functionalized with streptavidin.
L'étiquette commence par une Méthionine initiatrice (M). The label begins with an initiator methionine (M).
L'étiquette peut se terminer par une séquence composée, par exemple, de 2 à 20 résidus servant office d'espaceur (« linker »), par exemple GA. The label can end with a sequence composed, for example, of 2 to 20 residues serving as a spacer (“linker”), for example GA.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'étiquette est une étiquette histidine (aussi appelée étiquette polyhistidine ou tag histidine). L'étiquette histidine comprend au moins six acides aminés histidine. Elle peut comporter plus de six acides aminés histidine. Elle peut également comprendre d'autres acides aminés. A titre illustratif et non limitatif, on peut choisir l'une des séquences suivantes : According to a particularly advantageous embodiment, the tag is a histidine tag (also called polyhistidine tag or histidine tag). The histidine tag contains at least six histidine amino acids. It can have more than six histidine amino acids. It can also include other amino acids. By way of illustration and without limitation, one of the following sequences can be chosen:
- MKHHHHHHPMSDYDIPTTENLYFQGA (SEQ ID NO: 3 dans le listage de séquences en annexe), - MKHHHHHHPMSDYDIPTTENLYFQGA (SEQ ID NO: 3 in the attached sequence listing),
- MKHHHHHHPMSDYDIPTTEGA (SEQ ID NO: 4 dans le listage de séquences en annexe) - MKHHHHHHPMSDYDIPTTEGA (SEQ ID NO: 4 in the attached sequence listing)
- MKHHHHHHPMSDYDGA (SEQ ID NO: 5 dans le listage de séquences en annexe) - MKHHHHHHPMSDYDGA (SEQ ID NO: 5 in the attached sequence listing)
- MKHHHHHHPGA (SEQ ID NO: 6 dans le listage de séquences en annexe) - MKHHHHHHPGA (SEQ ID NO: 6 in the attached sequence listing)
- MHHHHHHGA (SEQ ID NO: 7 dans le listage de séquences en annexe) Toutes ces séquences ont été testées et permettent un ancrage de la structure en nid d'abeille perpendiculairement à la surface du substrat. - MHHHHHHGA (SEQ ID NO: 7 in the attached sequence listing) All these sequences have been tested and allow anchoring of the honeycomb structure perpendicular to the surface of the substrate.
D'autres constructions comportant une étiquette poly-Lysine, poly- Glutamate, poly-Glutamate/Lysine et poly-Proline ont aussi été obtenues : Other constructions comprising a poly-Lysine, poly-Glutamate, poly-Glutamate / Lysine and poly-Proline label have also been obtained:
- Séquence poly-Lysine : MKKKKKKGA (SEQ. ID NO: 8 dans le listage des séquences en annexe), - Poly-Lysine sequence: MKKKKKKGA (SEQ. ID NO: 8 in the sequence listing in the appendix),
- Séquence poly-Glutamate : MEEEEEEGA (SEQ ID NO: 9 dans le listage des séquences en annexe), - Poly-Glutamate sequence: MEEEEEEGA (SEQ ID NO: 9 in the attached sequence listing),
- Séquence poly-Glutamate/Lysine : MEEEKKKGA (SEQ ID NO: 10 dans le listage des séquences en annexe), - Séquence poly-Proline : MPPPPPPGA (SEQ. ID NO: 11 dans le listage des séquences en annexe). - Poly-Glutamate / Lysine sequence: MEEEKKKGA (SEQ ID NO: 10 in the listing of sequences in the appendix), - Poly-Proline sequence: MPPPPPPGA (SEQ. ID NO: 11 in the sequence listing in the appendix).
Par la suite, on décrira une étiquette histidine. Toute autre étiquette, notamment de taille équivalente, s'accrochant de manière aspécifique ou spécifique à un substrat, et permettant une croissance de la structure protéique perpendiculaire au substrat peut être utilisée. Hereinafter, a histidine tag will be described. Any other label, in particular of equivalent size, clinging in a non-specific or specific manner to a substrate, and allowing growth of the protein structure perpendicular to the substrate can be used.
La séquence d'acides aminés comprend également une partie destinée à tapisser les alvéoles du nid d'abeille. Par exemple, cette partie correspond à la séquence : KKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ. (SEQ ID NO: 12 dans le listage de séquences en annexe) The amino acid sequence also includes a part intended to line the alveoli of the honeycomb. For example, this part corresponds to the sequence: KKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ. (SEQ ID NO: 12 in the attached sequence listing)
Cette partie est complètement modulable. Elle peut être supprimée. Elle peut également être modifiée par délétion, substitution, ou insertion. Les modifications sur cette partie n'affectent pas la capacité d'auto-assemblage de la protéine. Avantageusement, elle est modifiée par substitution ou insertion de manière à introduire un ou plusieurs acides aminés spécifiques apte à être fonctionnalisés par un ion métallique, un métal ou une molécule organique. Par exemple, on choisira comme acide aminé spécifique une cystéine (aussi appelé résidu de cystéine (C)) permettant de greffer spécifiquement des molécules portant un groupement maléimide, iodoacétamide ou encore des sels métalliques. This part is completely modular. It can be deleted. It can also be modified by deletion, substitution, or insertion. The modifications on this part do not affect the self-assembly capacity of the protein. Advantageously, it is modified by substitution or insertion so as to introduce one or more specific amino acids capable of being functionalized by a metal ion, a metal or an organic molecule. For example, a cysteine (also called cysteine residue (C)) will be chosen as specific amino acid, making it possible to specifically graft molecules bearing a maleimide or iodoacetamide group or even metal salts.
La séquence de la partie tapissant les alvéoles modifiées par substitution peut être par exemple : CKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ (SEQ ID NO: 13 dans le listage de séquences en annexe). The sequence of the part lining the alveoli modified by substitution can be for example: CKLDLFVDVDGKRKADENALDTLSQ (SEQ ID NO: 13 in the attached sequence listing).
A titre illustratif et non limitatif, le tableau suivant répertorie différentes séquences d'acides aminés de la protéine pouvant être utilisées : une séquence primaire et des séquences de mutants. Les séquences de mutants sont obtenues par modification de l'étiquette et/ou de la séquence C-terminale tapissant les alvéoles de la séquence primaire. Ces mutants ont été testés et s'auto-assemblent en nids d'abeille perpendiculairement à la surface. Dans les exemples donnés, le C-terminal peut être raccourci ou remplacé par des combinaisons d'acides aminés (Cystéine, Histidine, Lysine; Glutamate, Glycine) capables d'interagir avec des molécules et précédés d'un espaceur plus ou moins court. L'espaceur peut être composé d'acides aminés Glycine et Sérine. Par exemple, l'espaceur peut être GGSGGS (SEQ ID NO: 14 dans le listage des séquences en annexe), GGS et G.By way of illustration and without limitation, the following table lists various amino acid sequences of the protein which can be used: a primary sequence and sequences of mutants. The mutant sequences are obtained by modifying the tag and / or the C-terminal sequence lining the alveoli of the primary sequence. These mutants have been tested and self-assemble in honeycombs perpendicular to the surface. In the examples given, the C-terminal can be shortened or replaced by combinations of amino acids (Cysteine, Histidine, Lysine; Glutamate, Glycine) capable of interacting with molecules and preceded by a more or less short spacer. The spacer may be composed of the amino acids Glycine and Serine. By example, the spacer can be GGSGGS (SEQ ID NO: 14 in the attached sequence listing), GGS and G.
Selon une première alternative, la protéine d'intérêt peut être synthétisée par biologie de synthèse. According to a first alternative, the protein of interest can be synthesized by synthetic biology.
Selon une seconde alternative préférée, la protéine d'intérêt est produite par une bactérie. Pour cela, la protéine d'intérêt peut être exprimée dans une souche commerciale, avantageusement par une souche de bactéries E. coli. La protéine d'intérêt est ensuite purifiée à pa rtir de l'extrait soluble des bactéries l'ayant produite. La purification consiste, par exemple, à recueillir les bactéries par centrifugation, à casser leur membrane par sonication puis à séparer les protéines solubles contenant la protéine d'intérêt par centrifugation. La protéine d'intérêt est ensuite purifiée une ou plusieurs fois. I l peut s'agir d'une purification par affinité sur une résine contenant du Nickel (par exemple de type Nickel-Sépharose) et/ou sur gel de perméation (par exemple de type Superdex 200, commercialisé par GE Healfcare). Seules les protéines munies de l'étiquette histidine sont retenues sur la résine contenant du nickel. According to a second preferred alternative, the protein of interest is produced by a bacterium. For this, the protein of interest can be expressed in a commercial strain, advantageously by a strain of E. coli bacteria. The protein of interest is then purified from the soluble extract of the bacteria that produced it. The purification consists, for example, in collecting the bacteria by centrifugation, in breaking their membrane by sonication and then in separating the soluble proteins containing the protein of interest by centrifugation. The protein of interest is then purified one or more times. It may be a purification by affinity on a resin containing nickel (for example of the Nickel-Sepharose type) and / or on permeation gel (for example of the Nickel-Sepharose type). Superdex 200, marketed by GE Healfcare). Only the proteins provided with the histidine tag are retained on the resin containing nickel.
La protéine est soluble dans un tampon aqueux, de préférence du Tris- HCI (pH entre 7,0 et 9,0 à une concentration entre 10 et 100 mM) contenant un réducteur de fonction thiol (du DTT (Dithiothréitol) ou du TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) à une concentration de 1 mM), pour former une solution protéique. The protein is soluble in an aqueous buffer, preferably Tris- HCl (pH between 7.0 and 9.0 at a concentration between 10 and 100 mM) containing a thiol reducer (DTT (Dithiothreitol) or TCEP ( Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) at a concentration of 1 mM), to form a protein solution.
La solution protéique est avantageusement mélangée avec une solution de cristallisation (composée d'un tampon et d'un sel). Il peut s'agir d'un mélange volumique 50/50. La solution de cristallisation comprend, par exemple, du Tris-HCI (le tampon) et du sulfate d'ammonium (le sel). D'une façon plus générale, on pourra également utiliser un tampon dit tampon de Good (comme par exemple l'ADA, l'HEPES, le CAPS) à des concentrations comprises entre 25 et 200 mM et un pH compris entre 6,5 et 8,5. On pourra aussi utiliser d'autres sels comme par exemple le sulfate de lithium. The protein solution is advantageously mixed with a crystallization solution (composed of a buffer and a salt). It may be a 50/50 volume mixture. The crystallization solution includes, for example, Tris-HCl (the buffer) and ammonium sulfate (the salt). More generally, it is also possible to use a buffer called Good's buffer (such as, for example, ADA, HEPES, CAPS) at concentrations of between 25 and 200 mM and a pH of between 6.5 and 8.5. It is also possible to use other salts such as, for example, lithium sulfate.
La concentration de la protéine dans la solution utilisée lors de l'étape a) peut aller de 0,5 mg/mL à 5 mg/mL. The concentration of the protein in the solution used during step a) can range from 0.5 mg / mL to 5 mg / mL.
Lors de l'étape b), un volume Vi de la solution contenant la protéine d'intérêt est mis en contact avec le substrat. Le substrat peut être de différentes natures. Par exemple, il peut être métallique, en un élément métalloïde ou encore en un matériau carboné. A titre illustratif, il peut s'agir de silicium ou de carbone. Par exemple, on pourra choisir une tranche (« wafer ») de silicium ou une grille de microscopie en silicium ou en carbone. Le substrat peut être transparent. Par transparent, on entend que le substrat a une transmittance supérieure à 50% dans le domaine visible, i.e. de 350nm à 750nm, et de préférence supérieure à 70% dans le domaine visible. During step b), a volume Vi of the solution containing the protein of interest is brought into contact with the substrate. The substrate can be of different types. For example, it can be metallic, in a metalloid element or even in a carbonaceous material. By way of illustration, it can be silicon or carbon. For example, it is possible to choose a wafer of silicon or a silicon or carbon microscopy grid. The substrate can be transparent. By transparent is meant that the substrate has a transmittance greater than 50% in the visible range, i.e. from 350nm to 750nm, and preferably greater than 70% in the visible range.
Avantageusement, le substrat est hydrophile pour favoriser son recouvrement par la solution contenant la protéine d'intérêt et/ou les interactions avec l'étiquette histidine. Advantageously, the substrate is hydrophilic to promote its covering with the solution containing the protein of interest and / or the interactions with the histidine tag.
La surface du substrat à fonctionnaliser peut être supérieure à 50pm2, voire supérieure à 1mm2. Elle peut être par exemple d'environ 7 mm2. Une goutte de solution contenant la protéine d'intérêt, ou un volume plus important de cette solution, peut être déposée sur la surface à traiter ou la surface à traiter peut être déposée sur la solution contenant la protéine d'intérêt. The surface of the substrate to be functionalized can be greater than 50 μm 2 , or even greater than 1 mm 2 . It may for example be about 7 mm 2 . A drop of solution containing the protein of interest, or a larger volume of this solution, can be deposited on the surface to be treated or the surface to be treated can be deposited on the solution containing the protein of interest.
Lors de l'étape b), la solution de protéine peut recouvrir, avantageusement, localement le substrat. Selon une variante de réalisation particulièrement avantageuse, on peut réaliser préalablement à l'étape b), une étape au cours de laquelle une couche dite couche de protection est formée localement sur le substrat, par exemple lors d'une étape de photolithographie à travers un masque. Le substrat comprend alors des parties recouvertes par la couche de protection et des parties non recouvertes par la couche de protection. Ceci permet de délimiter les zones du substrat à fonctionnaliser avec la structure de protéine. La solution de protéine est en contact avec la surface du substrat au niveau des parties non recouvertes par la couche de protection. Les parois de la couche de protection jouent le rôle de guide lors de la croissance de la structure protéique. During step b), the protein solution can advantageously cover the substrate locally. According to a particularly advantageous variant embodiment, a step can be carried out prior to step b) during which a layer called a protective layer is formed locally on the substrate, for example during a photolithography step through a mask. The substrate then comprises parts covered by the protective layer and parts not covered by the protective layer. This makes it possible to delimit the areas of the substrate to be functionalized with the protein structure. The protein solution is in contact with the surface of the substrate at the level of the parts not covered by the protective layer. The walls of the protective layer act as a guide during the growth of the protein structure.
Lors de l'étape c), la protéine est cristallisée pour former la structure protéique. La cristallisation consiste à faire passer la protéine d'un état soluble à un état solide et ordonné. On fait progressivement évaporer la solution contenant la protéine afin d'augmenter la concentration en protéine jusqu'à sa cristallisation. During step c), the protein is crystallized to form the protein structure. Crystallization involves changing the protein from a soluble state to a solid, ordered state. The solution containing the protein is gradually evaporated in order to increase the protein concentration until it crystallizes.
L'auto-assemblage de la protéine sur la surface du substrat est, avantageusement, réalisé dans une enceinte fermée, par exemple dans une chambre de cristallisation. The self-assembly of the protein on the surface of the substrate is advantageously carried out in a closed chamber, for example in a crystallization chamber.
L'enceinte contient, avantageusement, un réservoir de cristallisation de volume V2 contenant la solution tampon de cristallisation. On choisira un volume V2 supérieur au volume Vi. Le volume V2 va, par exemple, de 500pL à 5mL. Une fois l'enceinte rendue étanche, la diffusion de vapeur de la goutte contenant la solution protéique vers le réservoir est initiée et aboutit à une évaporation lente du solvant de la solution protéique permettant l'auto-assemblage de la protéine sur la surface. The enclosure advantageously contains a crystallization tank of volume V2 containing the crystallization buffer solution. We will choose a volume V2 greater than the volume Vi. The volume V2 ranges, for example, from 500pL to 5mL. Once the enclosure has been sealed, the vapor diffusion of the drop containing the protein solution towards the reservoir is initiated and results in a slow evaporation of the solvent from the protein solution allowing the self-assembly of the protein on the surface.
La cristallisation est, avantageusement, réalisée à température ambiante (i.e. de 20 à 25°C) et à pression ambiante (de l'ordre de lbar). La durée de l'étape c) dure, avantageusement, de 4h à 48 h. Cette durée dépend de la surface du substrat à fonctionnaliser ainsi que du volume de solution. L'auto-assemblage est visible à partir de 4 heures et atteint un optimal après 24 heures. The crystallization is advantageously carried out at ambient temperature (ie from 20 to 25 ° C.) and at ambient pressure (of the order of 1 bar). The duration of step c) advantageously lasts from 4 h to 48 h. This duration depends on the surface of the substrate to be functionalized as well as on the volume of solution. Self-assembly is visible from 4 hours and reaches an optimal after 24 hours.
A l'issue du procédé, on obtient un ensemble comprenant un substrat recouvert par la protéine cristallisée et auto-assemblée selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille perpendiculaire à la surface du substrat. Elle présente une hauteur maîtrisée correspondant à l'empilement des différents monomères. La hauteur de la structure protéique est en moyenne de 18nm avec la protéine contenant l'étiquette histidine mais peut-être plus élevée en utilisant une deuxième étape de croissance en présence de la protéine sans étiquette histidine. Le diamètre interne des alvéoles du nid d'abeille va, par exemple, de 4nm à 6nm. Le pas entre les hélices primaires est inférieur à 10 nm. Il va, par exemple, de 8 nm à 10 nm. At the end of the process, an assembly is obtained comprising a substrate covered by the crystallized protein and self-assembled according to a three-dimensional honeycomb structure perpendicular to the surface of the substrate. It has a controlled height corresponding to the stacking of the various monomers. The height of the protein structure is on average 18nm with the protein containing the histidine tag but possibly higher using a second growth step in the presence of the protein without the histidine tag. The internal diameter of the cells of the honeycomb ranges, for example, from 4nm to 6nm. The pitch between the primary helices is less than 10 nm. It ranges, for example, from 8 nm to 10 nm.
A titre illustratif, l'architecture protéique obtenue avec le domaine d'oligomérisation de la protéine LEAFY du Ginkgo biloba présente les caractéristiques suivantes (figures 3A et 3B): By way of illustration, the protein architecture obtained with the oligomerization domain of the LEAFY protein of Ginkgo biloba has the following characteristics (Figures 3A and 3B):
- un tour d'hélice primaire correspond à 12 monomères, - one turn of the primary propeller corresponds to 12 monomers,
- la hauteur de la structure tridimensionnelle est d'environ 31 nm, correspondant à l'empilement de 40 monomères, - the height of the three-dimensional structure is approximately 31 nm, corresponding to the stack of 40 monomers,
- le pas entre le centre des lumières de deux hélices primaires adjacentes est de 9,5 nm, - the pitch between the center of the lumens of two adjacent primary helices is 9.5 nm,
- la largeur du sillon au sein d'une même hélice primaire va de 4 à 5nm, - the width of the groove within the same primary helix ranges from 4 to 5nm,
- le diamètre interne de l'hélice primaire est de 5 nm. - the internal diameter of the primary propeller is 5 nm.
Ces caractéristiques peuvent être mesurées par microscopie à force atomique (AFM) ou par microscopie électronique (STEM) à transmission, e.g. STEM, TEM après une étape de coloration standard des structures protéiques utilisant l'acétate d'uranyle. These characteristics can be measured by atomic force microscopy (AFM) or by transmission electron microscopy (STEM), e.g. STEM, TEM after a standard staining step of protein structures using uranyl acetate.
Les paramètres de la structure auto-assemblée de protéines, tel que le diamètre des puits et la hauteur des puits peuvent être facilement modifiés. The parameters of the self-assembled protein structure, such as the diameter of the wells and the height of the wells can be easily changed.
Par exemple, en augmentant le nombre d'acides aminés tapissant la paroi des puits, le diamètre des puits peut être réduit. La variation du nombre d'acides aminés tapissant l'intérieur des puits permet également de moduler le nombre de molécules greffées dans les alvéoles de la structure protéique. For example, by increasing the number of amino acids lining the wall of wells, the diameter of the wells can be reduced. The variation in the number of acids Amines lining the inside of the wells also makes it possible to modulate the number of molecules grafted into the alveoli of the protein structure.
La hauteur de la structure auto-assemblée peut être augmentée par addition du domaine d'oligomérisation, dépourvu de l'étiquette histidine, autrement dit par l'addition sur l'auto-assemblage de monomères du domaine d'oligomérisation de manière à faire croître les hélices primaires de la structure protéique. Cette modification permet, par exemple, d'augmenter le nombre de molécules greffées (inorganiques, organiques ou mixtes), d'avoir un masque de nano-lithographie ayant une plus forte épaisseur ou bien encore d'augmenter la hauteur des piliers pouvant croître au sein de cet auto-assemblage. The height of the self-assembled structure can be increased by the addition of the oligomerization domain, devoid of the histidine tag, in other words by the addition on the self-assembly of monomers of the oligomerization domain so as to grow the primary helices of the protein structure. This modification makes it possible, for example, to increase the number of grafted molecules (inorganic, organic or mixed), to have a nano-lithography mask having a greater thickness or even to increase the height of the pillars which can grow in height. within this self-assembly.
La surface de la structure auto-assemblée ainsi que le taux de recouvrement d'un substrat peuvent être augmentés, par exemple, en faisant varier l'affinité du substrat pour l'étiquette histidine. The area of the self-assembled structure as well as the coverage rate of a substrate can be increased, for example, by varying the affinity of the substrate for the histidine tag.
Il est également possible de modifier la forme, le diamètre des puits ainsi que leur espacement, en choisissant des architectures protéiques différentes. L'identification de ces architectures protéiques ou domaines protéique capables de faire des interactions tête-queue peut être réalisée dans la « Protein Data Bank » (PDB) recueillant l'ensemble des structures protéiques connues. It is also possible to modify the shape, the diameter of the wells as well as their spacing, by choosing different protein architectures. The identification of these protein architectures or protein domains capable of carrying out head-tail interactions can be carried out in the “Protein Data Bank” (PDB) which collects all of the known protein structures.
La structure tridimensionnelle en nid d'abeille auto-assemblée ainsi obtenue est un biomatériau qui peut être utilisé pour de nombreuses applications. The self-assembled three-dimensional honeycomb structure thus obtained is a biomaterial which can be used for many applications.
Selon un mode de réalisation particulier, la structure peut être utilisée comme membrane, lorsque la structure auto-assemblée est formée sur une surface poreuse, le seuil de perméabilité est déterminé par le diamètre interne des hélices primaires. According to a particular embodiment, the structure can be used as a membrane, when the self-assembled structure is formed on a porous surface, the permeability threshold is determined by the internal diameter of the primary helices.
Selon un autre mode de réalisation, la structure auto-assemblée peut être recouverte, totalement, ou partiellement par une couche métallique, par exemple en or. Elle peut être métallisée par dépôt physique par phase vapeur, par dépôt chimique par phase vapeur, par dépôt chimique ou par dépôt électrochimique. Une telle structure peut servir à influer le comportement d'une onde lumineuse à la surface d'un substrat. Ceci est particulièrement intéressant pour amplifier le signal d'un capteur optique, comme par exemple un capteur choisi parmi les capteurs basés sur la résonance plasmonique de surface (SPR), les capteurs de diffusion Raman exaltée de surface (SERS), ou encore pour la spectroscopie infrarouge exaltée de surface (SEIRAS). Il est, par exemple, possible de former des anneaux d'or régulièrement espacés en recouvrant la partie supérieure de la structure par de l'or. According to another embodiment, the self-assembled structure can be covered, totally or partially with a metallic layer, for example of gold. It can be metallized by physical vapor deposition, by chemical vapor deposition, by chemical deposition or by electrochemical deposition. Such a structure can be used to influence the behavior of a light wave on the surface of a substrate. This is particularly useful for amplifying the signal from an optical sensor, such as, for example, a sensor chosen from sensors based on surface plasmon resonance (SPR), surface enhanced Raman scattering (SERS) sensors, or else for surface enhanced infrared spectroscopy (SEIRAS). It is, for example, possible to form regularly spaced gold rings by covering the upper part of the structure with gold.
Selon un autre mode de réalisation, la structure auto-assemblée peut être utilisée comme masque de photolithographie : l'auto-assemblage générant des puits de diamètre et d'espacements réguliers (par exemple d'un diamètre de 5 nm et espacés de 9 nm), il peut être utilisé comme un masque de photolithographie pour graver un support au travers des alvéoles du nid d'abeille. La gravure pourra être, par exemple, de type chimique (HF) sur support silicium ou par ultra-violet (UV) sur surface photosensible. According to another embodiment, the self-assembled structure can be used as a photolithography mask: the self-assembly generating wells of regular diameter and spacing (for example with a diameter of 5 nm and spaced 9 nm apart ), it can be used as a photolithography mask to etch a support through the alveoli of the honeycomb. The etching could be, for example, of the chemical type (HF) on a silicon support or by ultra-violet (UV) on a photosensitive surface.
Selon un autre mode de réalisation, l'auto-assemblage peut servir de plateforme/support de greffage de molécules inorganiques (ions métalliques, complexes inorganiques, Q.D ou particules métalliques par exemple) et organiques (fluorophores ou peptides par exemple). Pour cela, on choisira une protéine ayant une séquence comprenant un ou plusieurs acides aminés pouvant être fonctionnalisés par des sels métalliques pouvant être réduits en nanoparticules métalliques, par des complexes inorganiques présentant une certaine activité catalytique, par des molécules organiques ou bien encore par des Q.D ou des nanoparticules. Alternativement, on peut remplacer la partie C-terminale de la protéine par une séquence en acide aminés qui permet à la fois d'attirer les sels métalliques et de les réduire in situ sans nécessité d'ajouter un réducteur. According to another embodiment, the self-assembly can serve as a platform / support for grafting inorganic molecules (metal ions, inorganic complexes, Q.D or metal particles for example) and organic (fluorophores or peptides for example). For this, a protein will be chosen having a sequence comprising one or more amino acids which can be functionalized by metal salts which can be reduced to metal nanoparticles, by inorganic complexes having a certain catalytic activity, by organic molecules or even by QDs. or nanoparticles. Alternatively, the C-terminal part of the protein can be replaced by an amino acid sequence which makes it possible both to attract the metal salts and to reduce them in situ without the need to add a reducing agent.
A titre illustratif, sur la seule base d'un auto-assemblage de 31 nm de hauteur (soit un empilement de 40 monomères par puits) et d'environ 12 000 puits par pm2, on estime la fixation d'environ 480 000 molécules/ pm2 (soit 48 000 milliard/ cm2). Un tel auto-assemblage présente une surface élevée et donc permet de fixer une forte quantité de molécules. La position et la spécificité de greffage peut être contrôlée par la composition en acides aminés tapissant la lumière des puits et la réactivité des composés à greffer. A titre d'exemple, les fonctionnalisations peuvent être réalisées sur des acides aminés, présents naturellement ou modifiés, de l'extrémité C-terminale de la protéine qui se retrouvent dans la lumière des nids d'abeille. La chimie du greffage de molécules est celle développée pour les acides aminés. By way of illustration, on the sole basis of a self-assembly of 31 nm in height (i.e. a stack of 40 monomers per well) and of approximately 12,000 wells per μm 2 , the binding of approximately 480,000 molecules is estimated. / pm 2 (or 48,000 billion / cm 2 ). Such a self-assembly has a high surface area and therefore allows a large amount of molecules to be fixed. The position and specificity of grafting can be controlled by the amino acid composition lining the lumen of the wells and the reactivity of the compounds to be grafted. By way of example, the functionalizations can be carried out on amino acids, naturally present or modified, of the C-terminal end of the protein which are found in the lumen of honeycombs. The chemistry of the grafting of molecules is that developed for amino acids.
On peut citer, à titre d'exemple, les techniques de greffages impliquant : Mention may be made, by way of example, of grafting techniques involving:
- des amines avec comme acide aminé typique la lysine ; à titre d'exemple, on peut citer les amines primaires comme celle de la lysine pour réaliser des réactions d'acylation et ainsi de greffer tous les composés comportant un chlorure d'acide car l'azote de l'amine primaire est nucléophile et peut réagir avec des sites électrophiles, - amines with lysine as typical amino acid; by way of example, mention may be made of primary amines such as that of lysine in order to carry out acylation reactions and thus to graft all the compounds comprising an acid chloride because the nitrogen of the primary amine is nucleophilic and can react with electrophilic sites,
- des acides carboxyliques avec comme acides aminés typiques les acides aspartiques et glutamiques ; à titre d'exemple, on peut choisir des réactions d'estérification avec des composés possédant des fonctions alcools, - carboxylic acids with typical amino acids aspartic and glutamic acids; by way of example, it is possible to choose esterification reactions with compounds having alcohol functions,
- des thiols avec comme acide aminé typique la cystéine ; à titre d'exemple, on peut citer les thiols pour le greffage de composés comportant des maléimides et/ou pour la création de ponts dissulfures avec des composés possédant également des thiols et/ou pour des réactions d'oxydation, d'alkylations et de métallation, - thiols with cysteine as typical amino acid; by way of example, mention may be made of thiols for the grafting of compounds comprising maleimides and / or for the creation of dissulfide bridges with compounds also possessing thiols and / or for reactions of oxidation, alkylations and metallation,
- des histidines pour le greffage de métaux. - histidines for metal grafting.
Cette plate-forme de greffage peut être utilisée dans le domaine photovoltaïque ou pour la détection de molécules. Il est possible d'envisager la détection de molécules uniques. Il est possible de greffer des molécules jouant, par exemple, le rôle de catalyseurs. L'immobilisation des catalyseurs augmente leur stabilité. Il est ainsi possible de fabriquer des matériaux bio-hybrides, par exemple, pour la photo-catalyse. This grafting platform can be used in the photovoltaic field or for the detection of molecules. It is possible to consider the detection of single molecules. It is possible to graft molecules playing, for example, the role of catalysts. The immobilization of the catalysts increases their stability. It is thus possible to manufacture bio-hybrid materials, for example, for photo-catalysis.
Ce confinement est également particulièrement intéressant par exemple pour la photosynthèse artificielle ou pour réaliser des réactions d'oxydo- réduction. This confinement is also particularly advantageous, for example for artificial photosynthesis or for carrying out oxidation-reduction reactions.
D'une manière particulièrement avantageuse, le greffage spécifique des métaux (ou d'ions métalliques qui sont par la suite réduits) à l'intérieur des puits pourra être utilisé pour la conception de nanopiliers métalliques dans les alvéoles de la structure protéique (puits), par exemple pour la nanoélectronique. Leurs longueurs et leurs diamètres dépend de l'architecture protéique. Les nanopiliers sont orientés perpendiculairement à la surface du substrat et sont régulièrement espacés. On pourra réaliser, par exemple, des nanopiliers en or, via une fonction thiol, se fixant aux cystéines de la séquence d'acides aminés de la protéine. Pour fixer des sels métalliques, on choisira, par exemple, des histidines. In a particularly advantageous manner, the specific grafting of metals (or of metal ions which are subsequently reduced) inside the wells can be used for the design of metal nanopillars in the cells of the protein structure (wells). , for example for nanoelectronics. Their lengths and diameters depends on the protein architecture. The nanopillars are oriented perpendicular to the surface of the substrate and are regularly spaced. It is possible, for example, to make gold nanopillars, via a thiol function, binding to the cysteines of the amino acid sequence of the protein. To fix metal salts, one will choose, for example, histidines.
Le procédé de fabrication des nano-piliers comprend, avantageusement, les étapes successives suivantes : The method of manufacturing the nanopillars advantageously comprises the following successive steps:
- fonctionnaliser la partie de la séquence d'acides aminés de la protéine destinée à tapisser les puits du nid d'abeille, en introduisant un acide aminé réactif vis-à- vis des métaux, par exemple un acide aminé cystéine, - functionalize the part of the amino acid sequence of the protein intended to line the wells of the honeycomb, by introducing an amino acid which is reactive with respect to metals, for example a cysteine amino acid,
-cristalliser la structure protéique tridimensionnelle sur un substrat, -crystallize the three-dimensional protein structure on a substrate,
- ajouter un métal, par exemple sous la forme de nanoparticule métallique, le métal se liant à l'acide aminé réactif vis-à-vis des métaux, et jouant le rôle de germe métallique pour la croissance du nano-pilier, - add a metal, for example in the form of a metallic nanoparticle, the metal binding to the amino acid reactive with respect to metals, and playing the role of a metal germ for the growth of the nanopillar,
- faire croître le nano-pilier métallique, dans le puits, par agglomération de métaux autour du germe métallique. - grow the metallic nanopillar, in the well, by agglomeration of metals around the metallic germ.
Une manière alternative de faire croître des nano-piliers dans la lumière des nids d'abeille est de remplacer la partie C-terminale de la protéine par une séquence en acide aminés qui permet à la fois d'attirer les sels métalliques et de les réduire in situ sans nécessité d'ajouter un réducteur. Par exemple, on peut utiliser l'une des séquences d'acides aminés répertoriées dans le tableau suivant : An alternative way to grow nano-pillars in the lumen of honeycombs is to replace the C-terminal part of the protein with an amino acid sequence that both attracts and reduces metal salts. in situ without the need to add a reducing agent. For example, one can use one of the amino acid sequences listed in the following table:
Ces protéines s'auto-assemblent en nids d'abeille de manière perpendiculaire à la surface. Les peptides GGSTGTSVLIATPGV (SEQ ID NO : 32 dans le listage des séquences en annexe) et GGSWAGAKRLVLRRE (SEQ. ID NO: 33 dans le listage des séquences en annexe), couplés à la protéine, permettent à la fois d'attirer les sels métalliques et de les réduire. These proteins self-assemble in honeycombs perpendicular to the surface. The peptides GGSTGTSVLIATPGV (SEQ ID NO: 32 in the attached sequence listing) and GGSWAGAKRLVLRRE (SEQ. ID NO: 33 in the attached sequence listing), coupled to the protein, both make it possible to attract metal salts and reduce them.
Selon ce mode de réalisation, on pourra réaliser, ultérieurement, une étape au cours de laquelle on retire la structure de protéines pour ne conserver que les nanopiliers à la surface du substrat. Cette étape peut être accomplie, en fonction de la nature du substrat, par plasma, ou encore par recuit thermique à une température supérieure à la température de décomposition de la protéine (typiquement à une température supérieure à 100°C). According to this embodiment, a step can subsequently be carried out during which the protein structure is removed in order to keep only the nanopillars on the surface of the substrate. This step can be accomplished, depending on the nature of the substrate, by plasma, or even by thermal annealing at a temperature above the decomposition temperature of the protein (typically at a temperature above 100 ° C.).
Exemples illustratifs et non limitatifs d'un mode de réalisation : Illustrative and nonlimiting examples of one embodiment:
Dans cet exemple, l'architecture auto-assemblée de protéines est obtenue en réalisant les étapes successives suivantes : In this example, the self-assembled protein architecture is obtained by carrying out the following successive steps:
1) choisir et synthétiser une séquence capable d'oligomériser avec des interactions tête-queue pour pouvoir assurer une croissance en 3D de l'auto-assemblage ; les interactions tête-queue conduisant à la formation d'une hélice primaire possédant un sillon d'une largeur suffisante pour permettre l'imbrication des hélices entre elles (comme montré dans la figure IC), 1) choose and synthesize a sequence capable of oligomerizing with head-tail interactions to be able to ensure a 3D growth of the self-assembly; head-tail interactions leading to the formation of a primary helix possessing a groove of sufficient width to allow the interlocking of the propellers (as shown in figure IC),
2) rajouter à cette séquence en N-terminal une étiquette histidine de manière à positionner l'auto-assemblage avec une croissance perpendiculaire à la surface. 2) add a histidine tag to this N-terminal sequence so as to position the self-assembly with growth perpendicular to the surface.
3) utiliser cette construction ou des séquences dites mutants de manière à fonctionnaliser spécifiquement la lumière des nids d'abeille. 3) use this construction or so-called mutant sequences so as to specifically functionalize the lumen of honeycombs.
4) produire la protéine d'intérêt dans des bactéries. 4) produce the protein of interest in bacteria.
5) purifier la protéine d'intérêt à partir de l'extrait soluble des bactéries l'ayant produite, en réalisant les étapes suivantes : 5) purify the protein of interest from the soluble extract of the bacteria that produced it, by carrying out the following steps:
- recueillir les bactéries par centrifugation, casser leur membrane par sonication puis séparer l'ensemble des protéines solubles des bactéries (contenant la protéine d'intérêt) des autres éléments contenus dans les bactéries par centrifugation, - collect the bacteria by centrifugation, break their membrane by sonication and then separate all the soluble bacteria proteins (containing the protein of interest) from the other elements contained in the bacteria by centrifugation,
- purifier l'ensemble : - purify the whole:
* dans le cas des constructions possédant une étiquette histidine, purifier l'ensemble par affinité sur une résine contenant du nickel (par exemple du type Nickel-Sépharose), de manière à sélectivement retenir la protéine d'intérêt, * in the case of constructions having a histidine tag, purify the whole by affinity on a resin containing nickel (for example of the Nickel-Sepharose type), so as to selectively retain the protein of interest,
* dans le cas des constructions possédant une étiquette chargée positivement, chargée négativement ou hydrophobe (dans une zone de pH comprise entre 6 et 9), purifier respectivement l'ensemble par des techniques de chromatographie par échange d'anions (par exemple sur résine de type Q.-Sépharose), échange de cations (par exemple sur résine de type S-Sépharose) ou d'interaction hydrophobe (par exemple sur résine de type Phényl-Sepharose), * in the case of constructions having a positively charged, negatively charged or hydrophobic label (in a pH zone between 6 and 9), respectively purify the whole by techniques of chromatography by anion exchange (for example on resin of Q.-Sepharose type), cation exchange (for example on resin of S-Sepharose type) or of hydrophobic interaction (for example on resin of Phenyl-Sepharose type),
* dans le cas d'interactions fortes de type récepteur/ligand, purifier l'ensemble par des techniques de chromatographie d'affinité (par exemple sur une résine contenant de la streptavidine ou de la Strep-Tactin (commercialisée par IBA Lifesciences) pour une construction contenant une étiquette Strep), * in the case of strong receptor / ligand-type interactions, purify the whole by affinity chromatography techniques (for example on a resin containing streptavidin or Strep-Tactin (marketed by IBA Lifesciences) for a construct containing a Strep tag),
- éventuellement réaliser une seconde purification sur un gel de perméation (par exemple de type Superdex 200, commercialisé chez GE healfcare) dans un tampon Tris-HCI (pH entre 7 et 9.0) 20 mM, - concentrer la protéine pure entre 0,5 et 5 mg/ml ; la protéine peut être congelée à l'azote liquide puis conservée à -80°C avant utilisation. - optionally carry out a second purification on a permeation gel (for example of the Superdex 200 type, sold by GE healfcare) in a 20 mM Tris-HCl buffer (pH between 7 and 9.0), - concentrate the pure protein between 0.5 and 5 mg / ml; the protein can be frozen in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C before use.
6) un volume de x pL de la solution de protéine d'intérêt (avec x allant par exemple de 5 à 50 pl) est mélangée avec le même volume d'une solution de cristallisation de manière à former une goutte de protéine qui est ensuite mise en contact avec une surface à traiter. La solution de cristallisation peut comprendre du Tris-HCI avec un pH de 7 à 9 et du sulfate d'ammonium à une concentration allant de 40 à 350 mM. La surface à traiter peut être rendue hydrophile par exemple par un traitement au plasma (« glow-discharge »). Un réservoir de cristallisation ayant un volume, allant par exemple de 500pL à 5mL) est rempli par la solution de cristallisation. Puis la chambre de cristallisation est rendue étanche pour initier la diffusion de vapeur de la goutte vers le réservoir. Après un temps allant de 4h à 48 h à température ambiante, la surface traitée est retirée de la chambre de cristallisation. 6) a volume of x µl of the protein solution of interest (with x ranging for example from 5 to 50 µl) is mixed with the same volume of a crystallization solution so as to form a drop of protein which is then contact with a surface to be treated. The crystallization solution can include Tris-HCl with a pH of 7 to 9 and ammonium sulfate at a concentration of 40 to 350 mM. The surface to be treated can be made hydrophilic, for example by a plasma treatment (“glow-discharge”). A crystallization tank having a volume, ranging for example from 500pL to 5mL) is filled with the crystallization solution. Then the crystallization chamber is sealed to initiate the diffusion of vapor from the drop towards the reservoir. After a time ranging from 4 h to 48 h at room temperature, the treated surface is removed from the crystallization chamber.
A l'issue du procédé, le matériau obtenu peut ensuite être visualisé en microscopie électronique par transmission (STEM, TEM) lorsque le support est transparent aux électrons. Pour cela, le support est déposé sur une solution aqueuse contenant un colorant (par exemple de l'acétate d'uranyle à 2%) pendant 2min. L'acétate d'uranyle va marquer plus spécifiquement la lumière des nids d'abeille par interaction du métal avec les acides aminés négatifs (Glutamate et Aspartate) qui tapissent la lumière des puits. At the end of the process, the material obtained can then be visualized by transmission electron microscopy (STEM, TEM) when the support is transparent to electrons. For this, the support is deposited on an aqueous solution containing a dye (for example 2% uranyl acetate) for 2 min. Uranyl acetate will more specifically mark the lumen of honeycombs by interaction of the metal with negative amino acids (Glutamate and Aspartate) which line the lumen of the wells.
Les figures 4A et 4B sont des clichés obtenus au microscope électronique (STEM) d'une structure auto-assemblée de protéines sur un substrat en carbone de 7mm2. La structure en nid d'abeille perpendiculaire à la surface du substrat est bien visible. Le taux de recouvrement est de 40%. FIGS. 4A and 4B are photographs obtained under an electron microscope (STEM) of a self-assembled structure of proteins on a 7mm 2 carbon substrate. The honeycomb structure perpendicular to the surface of the substrate is clearly visible. The recovery rate is 40%.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'auto-assemblage d'une protéine selon une structure tridimensionnelle en nids d'abeille comprenant les étapes successives suivantes : 1. A method of self-assembly of a protein according to a three-dimensional honeycomb structure comprising the following successive steps:
- fournir une solution comprenant un solvant et une protéine, la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY en fusion avec une étiquette, - providing a solution comprising a solvent and a protein, the protein comprising an amino acid sequence corresponding to an oligomerization domain of a LEAFY protein in fusion with a tag,
- mettre la solution en contact avec un substrat, - bring the solution into contact with a substrate,
- faire évaporer le solvant pour cristalliser la protéine, le domaine d'oligomérisation cristallisant sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, moyennant quoi on obtient une structure protéique tridimensionnelle en nid d'abeille, perpendiculaire au substrat, la structure protéique étant fixée au substrat par l'étiquette. - evaporate the solvent to crystallize the protein, the oligomerization domain crystallizing in the form of a primary helix, each primary helix interacting with six other primary helices, whereby we obtain a three-dimensional protein structure in a honeycomb, perpendicular to the substrate, the protein structure being attached to the substrate by the label.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé comporte une étape additionnelle au cours de laquelle on ajoute sur la structure en nid d'abeille une autre protéine correspondant au domaine d'oligomérisation de la protéine LEAFY, sans étiquette, moyennant quoi on augmente la hauteur de la structure en nid d'abeille perpendiculairement au substrat. 2. Method according to claim 1, characterized in that the method comprises an additional step during which is added to the honeycomb structure another protein corresponding to the oligomerization domain of the LEAFY protein, without tag, by means of which increases the height of the honeycomb structure perpendicular to the substrate.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le substrat est en un matériau choisi parmi un métal, un métalloïde ou un matériau carboné. 3. Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that the substrate is made of a material chosen from a metal, a metalloid or a carbonaceous material.
4. Ensemble comprenant un substrat recouvert par un auto-assemblage de protéine selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille, 4. Assembly comprising a substrate covered by a self-assembly of protein according to a three-dimensional honeycomb structure,
la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, en fusion avec une étiquette, the protein comprising an amino acid sequence corresponding to an oligomerization domain of a LEAFY protein, in fusion with a tag,
le domaine d'oligomérisation étant cristallisé sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, la structure étant fixée perpendiculairement au substrat par l'étiquette. the oligomerization domain being crystallized in the form of a primary helix, each primary helix interacting with six other primary helices, the structure being fixed perpendicularly to the substrate by the label.
5. Ensemble selon la revendication 4, caractérisé en ce que le pas entre chaque hélice primaire est inférieur à lOnm et/ou en ce que le diamètre intérieur d'une hélice primaire va de 4nm à 6nm. 5. Assembly according to claim 4, characterized in that the pitch between each primary helix is less than lOnm and / or in that the internal diameter of a primary helix ranges from 4nm to 6nm.
6. Ensemble selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que l'auto-assemblage couvre une surface d'au moins 50pm2. 6. Assembly according to one of claims 4 and 5, characterized in that the self-assembly covers an area of at least 50 μm 2 .
7. Ensemble selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le substrat est poreux. 7. Assembly according to any one of claims 4 to 6, characterized in that the substrate is porous.
8. Ensemble selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que la protéine est métallisée ou fonctionnalisée avec un métal, un sel métallique, un complexe inorganique ou une molécule organique. 8. Assembly according to any one of claims 4 to 7, characterized in that the protein is metallized or functionalized with a metal, a metal salt, an inorganic complex or an organic molecule.
9. Utilisation d'un ensemble tel que défini dans l'une des revendications 4 à 8, comme masque de photolithographie, comme amplificateur d'un signal d'un capteur optique, comme membrane, ou comme catalyseur. 9. Use of an assembly as defined in one of claims 4 to 8, as a photolithography mask, as an amplifier of a signal from an optical sensor, as a membrane, or as a catalyst.
10. Procédé de fabrication de nano-piliers comprenant les étapes successives suivantes : 10. A method of manufacturing nano-pillars comprising the following successive steps:
- fournir un ensemble comprenant un substrat recouvert par un auto assemblage de protéine selon une structure tridimensionnelle en nid d'abeille, - providing an assembly comprising a substrate covered by a self-assembly of protein according to a three-dimensional honeycomb structure,
la protéine comprenant une séquence d'acides aminés correspondant à un domaine d'oligomérisation d'une protéine LEAFY, par exemple au domaine d'oligomérisation de Ginkgo biloba, en fusion avec une étiquette, et des acides aminés spécifiques, apte à être fonctionnalisés par un métal ou un sel métallique, tapissant les alvéoles du nid d'abeille, le domaine d'oligomérisation étant cristallisé sous la forme d'une hélice primaire, chaque hélice primaire interagissant avec six autres hélices primaires, la structure étant fixée perpendiculairement au substrat par l'étiquette, - greffer un métal, un complexe inorganique ou un sel métallique sur les acides aminés spécifiques, et réduire le sel métallique, pour former des nano-piliers métalliques dans les alvéoles du nid d'abeille. the protein comprising an amino acid sequence corresponding to an oligomerization domain of a LEAFY protein, for example to the oligomerization domain of Ginkgo biloba, in fusion with a tag, and specific amino acids, capable of being functionalized by a metal or a metallic salt, lining the alveoli of the honeycomb, the oligomerization domain being crystallized in the form of a primary helix, each primary helix interacting with six other primary helices, the structure being fixed perpendicular to the substrate by the label, - grafting a metal, an inorganic complex or a metal salt on specific amino acids, and reducing the metal salt, to form metal nanopillars in the cells of the honeycomb.
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