EP3724347A1 - Method and device for the qualitative and quantitative detection of biofilm-building bacteria contained in an aquatic system - Google Patents

Method and device for the qualitative and quantitative detection of biofilm-building bacteria contained in an aquatic system

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Publication number
EP3724347A1
EP3724347A1 EP18803565.3A EP18803565A EP3724347A1 EP 3724347 A1 EP3724347 A1 EP 3724347A1 EP 18803565 A EP18803565 A EP 18803565A EP 3724347 A1 EP3724347 A1 EP 3724347A1
Authority
EP
European Patent Office
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bacteria
aquatic system
microtiter plate
biofilm
contained
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18803565.3A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Anna Salek
Robert Priller
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Domatec GmbH
Original Assignee
Domatec GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Domatec GmbH filed Critical Domatec GmbH
Publication of EP3724347A1 publication Critical patent/EP3724347A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/21—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/245—Escherichia (G)
    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/265—Enterobacter (G)

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for the qualitative and quantitative detection of contained in an aquatic system, biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus.
  • Biofilms represent microbial cell communities that are expressed in aquatic, i. aqueous systems, preferably at surfaces or interfaces of
  • the mucus layer forms a kind of matrix, in which the microbial cells, so especially bacteria of the genus Legionella spp. are embedded, including the species Legionella pneumophila, and thus are surrounded by an environment that allows the bacteria a long lifetime.
  • Legionella spp. can be found in both fresh and salt water and can be found in a temperature range between 25 ° C and 50 ° C
  • Hot water production and distribution plants swimming pools, air washers in air conditioners, cooling towers, dead pipes, water tanks and the like. In particular, they can occur in hot water pipes or cold water pipes with external heat, which are not used for a long time.
  • Cogeneration plant belonging cooling towers could be attributed.
  • Each of the above methods of analysis provides on-site sampling and detection in a laboratory equipped for testing for Legionella.
  • the document WO 2011/157584 A1 discloses a portable device and a method for the qualitative and quantitative determination of Legionella in water.
  • the known device operates in several stages, in which contained in a defined amount of sample microorganisms separated by filtration and the Legionella from the separated microorganisms selectively means
  • the immunomagnetic methods are separated to be subsequently labeled by means of suitable fluorescent markers.
  • the labeled Legionella are excited by a suitable excitation source for fluorescence, which can then be registered by means of a detector and evaluated qualitatively and / or quantitatively by a computer system.
  • the device is suitable for temporary or permanent integration in water-bearing systems, such as. Drinking water network, cooling towers, air conditioners, etc.
  • TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride
  • the invention is based on the object of a method and a device for the qualitative and quantitative detection of in an aquatic system
  • biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus such that a safe and rapid analysis and determination at least for the detection of Legionella pneumophila within one to two days
  • the device according to the invention should also be possible on site, ie in the form of a portable field device.
  • the solution of the problem underlying the invention is specified in claim 1.
  • the subject of claim 16 is a device in the form of a microtiter plate for carrying out the method according to the invention according to claim 1.
  • Preferred uses are subject matter of claims 21 to 25. Den
  • biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus on a biochemical reaction of the bacteria with at least one substance that initiates a bacteria-specific metabolic reaction by which a colorimetric reagent is chemically influenced, measured its spectrometric or more accurate, spectrophotometric properties and the Evidence of the biofilm-forming bacteria contained in the aquatic system.
  • the method according to the invention uses the measurement of catabolism-based vitality or activity of specific biofilm-producing bacteria.
  • the metabolic reactions necessary for the preservation of the living cells are considered, in which metabolic products are degraded from complex to simple molecules for the detoxification of the cell organism and for the production of energy.
  • the detection of bacteria of the bacterial genera Legionella, Pseudomonas, Escherichia and Enterobacter is the detection of bacteria of the bacterial genera Legionella, Pseudomonas, Escherichia and Enterobacter.
  • the choice of a bacteria-specific metabolic reaction initiating substance is a highly selective detection of bacteria of a particular
  • Legionella pneumophila are preferably amino acids for the purpose of catabolization or metabolism by these bacteria, since amino acids, especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila.
  • amino acids especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen
  • Colorimetric reagent for example tetrazolium salt, preferably in the form of (2,3,5-triphenyl-2Fl-terazolium chloride, TTC) or in the form of (2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- ( 2,4-disulfophenyl) -2FI-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator).
  • TTC formazan test detection
  • the colorimetric reagent which in the initial state is a colorless compound, is reduced by chemical reaction with the living and thus metabolically active bacteria to a soluble - formazan product - the amount of which is directly proportional to the number of living cells or bacteria within the aquatic system is.
  • the method of optical Spectrophotometry which measures the optical absorbance of the aquatic system stained by the color change of the colorimetric reagent.
  • an absolute extinction value and / or a temporally variable extinction function can be determined in order, for example, to determine the time
  • Color development Information on the density and / or catabolic activity of bacteria within the aquatic system is provided.
  • biofilm-producing bacteria in particular Legionella pneumophila amino acids, preferably L-serine and L-threonine or their degradation product catabolize a-ketobutyric acid preferably in a microaerophilic atmosphere
  • biochemical reaction of the biofilm-forming bacteria contained within the aquatic system with the determined selected substance and the colorimetric added Reagent preferably under conditions of microaerophilic incubation at a temperature in the range between 25 ° C and 45 ° C, preferably between 30 ° C and 40 ° C, in particular carried out at 37 ° C.
  • bacteria-specific substance of about 20 to 50 hours, preferably after just 24 hours, are obtained.
  • the method according to the solution is especially suitable for further detection of bacteria of the following bacterial genera: Pseudomonas, Escherichia, Enterobacter.
  • the bacterium Pseudomonas aeruginosa is suitable as a substance for Initiation of the bacteria-specific metabolic reaction L-arginine, L-asparagine, itaconic acid or putrescine.
  • the bacterium Enterobacter aerogenes is suitable as substance for the initiation of the bacteria-specific metabolic reaction D-glucosaminic acid, D-cellobiose, ß-methyl-D-glucoside or D-mannitol.
  • bacteria-specific metabolic reaction initiating substance L-phenylalanine, ⁇ -D-glucose or glucose-1-phosphate is suitable as the bacteria-specific metabolic reaction initiating substance L-phenylalanine, ⁇ -D-glucose or glucose-1-phosphate.
  • At least a portion, preferably all of the aforementioned substances, which are catabolized by said biofilm-producing bacteria are used for the purpose of as comprehensive as possible detection of the biofilm-producing bacteria contained in an aquatic system. Flierzu the respective substances are stored separately in mutually isolated wells of a microtiter plate together with an above-described colorimetric reagent, in each of which a sample of the biofilm-forming bacteria-containing aquatic system is introduced.
  • the use of a microtiter plate allows a simple and above all uniform handling and implementation of the biochemical reaction within the individual cavities under uniform reaction conditions.
  • the use of a light-transparent microtiter plate known per se makes it possible to carry out a spectrophotometric measurement of all samples within the individual, mutually insulated cavities after a certain reaction time.
  • a further preferred embodiment of the microtiter plate designed above for the purpose of detecting Legionella pneumophila provides for a further detection of the bacterium Pseudomonas aeruginosa in at least two further cavities in each case one substance which in each case differs and are selected from the group of the following substances: Arginine, L-asparagine, itaconic acid, putrescine.
  • another embodiment provides for the additional detection of the bacterium Enterobacter aerogenes, in which at least two further cavities each contain a substance which is different from one another and those from the group of the following substances D-glucosaminic acid, D-cellobiose, ⁇ -methyl-D-glucoside, D-mannitol.
  • a last preferred embodiment provides alternatively or in combination with the above-described preferred embodiments for further detection of the bacterium Escherichia coli in at least two other cavities respectively different substances, which are selected from the group of the following substances: L-phenylalanine, aD-glucose, Glucose-1-phosphate
  • Tetrazolium salt preferably in the form of (2,3,5-triphenyl-2Fl-terazolium chloride, TTC) or (2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) - 2FI-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator).
  • a preferred use of the microtiter plate designed in accordance with the invention is for the qualitative and quantitative determination of Legionella pneumophila contained in aquatic systems, preferably of at least one further biofilm-producing bacterium of the following group: Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli.
  • microtiter plate and the associated method according to the invention for the qualitative and quantitative detection of biofilm-forming bacteria is primarily for the study of water in water distribution systems, i. including from the source to the end user, both for human and animal care and in industrial installations such as
  • cooling towers for example cooling towers etc.
  • the use of the microplate according to the invention is of great use, in particular for the investigation of the following aquatic systems: body fluids, especially urine, cerebrospinal fluid, bile, saliva, gastric juice, breast milk, vaginal secretions, tear fluid, nasal secretions, ejaculate.
  • Bacteria all of which can be assigned to the so-called gram-negative bacterial group, become the ones to be detected and contained in the aquatic system
  • hydromechanical modification in which the cell membrane permeability of the bacteria is specifically conditioned.
  • the chemically and / or hydromechanically initiated modification leads to a change in the cell surface properties and an associated increase in the permeability of the bacterial membrane.
  • Gram-negative bacteria in the respective outer membrane have non-specific transmembrane proteins, so-called porins, which serve for the exchange of substances through the membrane. It shows, for example, that the addition of the surface-active chemical substance Polysorbate 80 to the bacteria to be detected, a significant increase in the permeability of the outer cell membrane of the bacteria can be achieved.
  • the membrane modification made at least the exchange of electrons or protons by the outer membrane with the aquatic environment is supported, whereby the bacteria-specific metabolic reaction which can be initiated by the at least one substance has a significantly higher efficiency and an associated temporal acceleration of the entire detection method can be carried out.
  • the increase in the material permeability of the outer cell membrane caused by the membrane modification also leads to an increase in the detection capability or an improvement in the sensory sensitivity of the detection method according to the invention.
  • low concentrations of bacteria can be detected in a sample and this within a very short detection periods of well below 24 h.
  • the bioenergetic activity ie the temporal catabolic behavior of Legionella pneumophila
  • the bioenergetic activity has already been determined by measuring the rates of electron flow into and through the electron transport chains on different metabolic substrates, for example of L-serine, L-threonine, a Ketobutyric acid and pyruvic acid methyl ester.
  • L-serine L-threonine
  • a Ketobutyric acid pyruvic acid methyl ester.
  • the electrons always migrate from the beginning to the distal part of the electron transport chain, where a redox dye as the terminal Electron or proton acceptor acts, which converts the dye according to reduction, and the color change can be detected in the manner described spectrophotometrically.
  • polysorbate 80 as one of
  • Biosurfactants are also suitable for conditioning the cell membrane permeability of the bacteria. First of all rhamnolipid or surfactin.
  • Fig. 1 is a schematic representation of the distribution of different substances within cavities of a microtiter plate.
  • Figure 1 shows a tabular arrangement consisting of four columns (1, 2, 3, 4) and eight rows (AH), in the 32 fields distinguishable from each other by a individual column and row membership are addressable.
  • the tabular arrangement illustrates very schematically a microtiter plate whose cavities are represented by the 32 fields.
  • Selected fields or cavities of a microtiter plate represented by the tabular arrangement contain in each case the substances which can be taken from FIG. 1 and each of which is able to initiate a bacteria-specific metabolic reaction.
  • the name of the bacterium is given in bold type
  • Substance in the aquatic system reduced by way of a metabolic reaction.
  • Representative in this context is the cavity located in column A column 2 mentioned, in which for the detection of the bacterium Enterobacter aerogenes the substance ß-methyl-D-glucoside is included.
  • water is stored as a neutral buffer medium in one cavity, preferably in the well A / 1, on the basis of a photometric measurement
  • a colorimetric reagent in the form of a redox indicator in the form of a redox indicator, preferably tetrazolium salt, is present in each well, for example in the form of (2,3,5-triphenyl-2Fl-terazolium chloride, TTC) or (2 - (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2-FI-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator).
  • Substances distributed in different cavities are not to be understood as limiting, of course, alternative spatial distributions of the substances in the wells of a microtiter plate are largely possible.
  • the fields / cavities filled with substances in FIG. 1, for example A / 3, B / 1, B / 2, B / 3, can also C / 1, etc., with further or already distributed in the microtiter plate substances are filled.

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Abstract

The invention relates to a method and a device for qualitatively and quantitatively detecting biofilm building bacteria of at least one type of bacteria contained in an aquatic system, by means of biochemical reaction of the bacteria with at least one substance, which initiates a bacteria-specific metabolic reaction, and a colorimetric reagent which can be influenced by the metabolic reaction and the spectrophotometric properties of which are measured and are based on the detection.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien  Method and device for the qualitative and quantitative detection of biofilm-forming bacteria contained in an aquatic system
Technisches Gebiet Technical area
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung. The invention relates to a method and a device for the qualitative and quantitative detection of contained in an aquatic system, biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus.
Stand der Technik State of the art
Biofilme stellen mikrobielle Zellgemeinschaften dar, die sich in aquatischen, d.h. wässrigen Systemen, vorzugsweise an Oberflächen bzw. Grenzflächen von Biofilms represent microbial cell communities that are expressed in aquatic, i. aqueous systems, preferably at surfaces or interfaces of
Substraten in Form einer durch die mikrobiellen Zellen selbst hergestellten Substrates in the form of a produced by the microbial cells themselves
Schleimschicht aus extrazellulären, polymeren Substanzen (EPS) ausbilden. Die Schleimschicht bildet dabei eine Art Matrix, in der die mikrobiellen Zellen, so insbesondere Bakterien der Gattung Legionella spp. inklusive der Art Legionella pneumophila eingebettet sind und auf diese Weis von einem Milieu umgeben sind, das den Bakterien eine lange Lebenszeit ermöglicht. Form mucus layer of extracellular, polymeric substances (EPS). The mucus layer forms a kind of matrix, in which the microbial cells, so especially bacteria of the genus Legionella spp. are embedded, including the species Legionella pneumophila, and thus are surrounded by an environment that allows the bacteria a long lifetime.
Legionella spp. können sowohl in Süßwasser, als auch in Salzwasser Vorkommen und finden in einem Temperaturbereich zwischen 25°C und 50°C optimale Legionella spp. can be found in both fresh and salt water and can be found in a temperature range between 25 ° C and 50 ° C
Lebensbedingungen. So kommen sie häufig in Einrichtungen wie Living conditions. So they often come in facilities like
Warmwassererzeugungs- und -Verteilungsanlagen, Schwimmbädern, Luftwäschern in Klimaanlagen, Kühltürmen, Totleitungen, Wassertanks und der gleichen vor. Insbesondere können sie in Warmwasserleitungen oder Kaltwasserleitungen mit Wärmeeinwirkung von außen, welche über längere Zeit nicht genutzt werden, auftreten. Hot water production and distribution plants, swimming pools, air washers in air conditioners, cooling towers, dead pipes, water tanks and the like. In particular, they can occur in hot water pipes or cold water pipes with external heat, which are not used for a long time.
Gerade in den letzten Jahren wurden viele Berichte über mögliche Infektionsquellen für den Menschen mit Legionella pneumophila Bakterien veröffentlicht. Dabei stellen vor allem kontaminierte Wasserverteilsysteme in Gebäuden sowie industrielle Anlagen, insbesondere Kühlturme, eine besondere Bedrohung für den Menschen dar. So ereignete sich Anfang Januar 2010 eine Legionellen-Epidemie in Especially in recent years, many reports have been published about possible sources of infection for humans with Legionella pneumophila bacteria. In particular, contaminated water distribution systems in buildings and industrial plants, especially cooling towers, present a particular threat to humans. At the beginning of January 2010, a legionella epidemic took place in
Deutschland mit 5 Toten und 64 Infizierten, deren Ursache auf die zu einem Germany with 5 dead and 64 infected, whose cause on the one to
Blockheizkraftwerk gehörigen Kühltürme zurückgeführt werden konnte. Cogeneration plant belonging cooling towers could be attributed.
Gemäß den Vorgaben des DVGW (Deutscher Verein des Gas- und Wasserfaches e. V.) Arbeitsblatt W 551 gilt Trinkwasser bei einem Gehalt von 100 KbE According to the specifications of DVGW (German Association of the Gas and Water Industry eV) Worksheet W 551, drinking water is considered to be 100 KbE
(koloniebildende Einheiten pro 100 ml) als kontaminiert mit einem geringen (Colony forming units per 100 ml) as contaminated with a low
Infektionsrisiko. Handlungsbedarf ist geboten ab einem Wert von größer 10.000 KbE/100 ml, welche Sofortmaßnahmen wie z. B. eine Desinfektion des Risk of infection. Action is required from a value of more than 10,000 cfu / 100 ml, which immediate measures such. B. a disinfection of
Leitungsnetzes und die Verhängung eines vorläufigen Nutzungsverbots notwendig macht. Network and the imposition of a temporary ban on use.
Von Yanez, M.A., et. al. wird in "Quantitative detection of Legionella pneumophila in water samples by immunomagnetic purification and real-time PCR amplification of the dotA gene", Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 71 , Nr. 7, 07, S. 3434- 3436, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Legionella pneumophila in Wasserproben mittels immunomagnetischer Reinigung und echt-zeit PCR- Amplifikation von dotA Genen beschrieben. By Yanez, MA, et. al. is described in "Quantitative detection of Legionella pneumophila in water samples by immunological purification and real-time PCR amplification of the dotA gene", Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 71, No. 7, 07, p. 3436, a method for the quantitative determination of Legionella pneumophila in water samples by immunomagnetic purification and real-time PCR amplification of dotA genes described.
Von Füchslin et. al. wird in "Rapid and quantitative detection of Legionalla Von Füchslin et. al. is published in "Rapid and quantitative detection of Legionalla
pneumophila applying immunomagnetic Separation and flow cytometry", Cytometry Part A, 77A, 03/2010, S.264-274, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Legionella pneumophilia in Wasserproben mittels einer Kombination aus pneumophila applying immunomagnetic separation and flow cytometry, "Cytometry Part A, 77A, 03/2010, p.264-274, a method for the quantitative determination of Legionella pneumophilia in water samples using a combination of
immunomagnetischer Separation und Durchflusscytometrie beschrieben. immunomagnetic separation and flow cytometry.
Die vorstehenden Analysemethoden sehen jeweils eine Probennahme vor Ort und den Nachweis in einem für die Untersuchung auf Legionellen ausgerüsteten Labor vor. Each of the above methods of analysis provides on-site sampling and detection in a laboratory equipped for testing for Legionella.
Die Druckschrift WO 2011/157584 A1 offenbart eine portable Vorrichtung sowie ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Legionellen in Wasser. Die bekannte Vorrichtung arbeitet in mehreren Stufen, in welchen in einer definierten Probemenge enthaltene Mikroorganismen mittels Filtration abgetrennt und die Legionellen aus den abgetrennten Mikroorganismen selektiv mittels The document WO 2011/157584 A1 discloses a portable device and a method for the qualitative and quantitative determination of Legionella in water. The known device operates in several stages, in which contained in a defined amount of sample microorganisms separated by filtration and the Legionella from the separated microorganisms selectively means
immunomagnetischer Methoden separiert werden, um anschließend mittels geeigneter Fluoreszenzmarker markiert zu werden. Die markierten Legionellen werden durch eine geeignete Anregungsquelle zur Fluoreszenz angeregt, welche anschließend mittels eines Detektors registriert und über ein Rechnersystem qualitativ und/oder quantitativ ausgewertet werden kann. Insbesondere eignet sich die Vorrichtung zur temporären oder permanenten Integration in wasserführenden Systemen, wie bspw. Trinkwasserleitungsnetz, Kühltürme, Klimaanlagen etc. immunomagnetic methods are separated to be subsequently labeled by means of suitable fluorescent markers. The labeled Legionella are excited by a suitable excitation source for fluorescence, which can then be registered by means of a detector and evaluated qualitatively and / or quantitatively by a computer system. In particular, the device is suitable for temporary or permanent integration in water-bearing systems, such as. Drinking water network, cooling towers, air conditioners, etc.
Während die Identifizierung von Legionellen in Trinkwassersystemen bereits weit fortgeschritten ist, stellt diese in Verdunstungskühlsystemen, aufgrund einer erhöhten Biofilm-bauenden Begleitflora, wie bspw. Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes oder Escherichia coli und der damit einhergehenden Biofilmbildung, eine besondere Schwierigkeit dar. Der Artikel von Rahman, M. et al The catabolism of arginine by Pseudomonas aeruginosa, J. Gen. Microbiol. (1980), 116, S. 371 -380, diskutiert den Metabolismus von aus einem Pseudomonas aeruginosa-Stamm isolierten Mutanten, die nicht in der Lage sind L-Arginin oder L-Ornithin als Kohlenstoffquelle für das Wachstum zu verwenden. While the identification of Legionella in drinking water systems is already well advanced, it represents a particular difficulty in evaporative cooling systems, due to an increased biofilm-building accompanying flora, such as Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes or Escherichia coli and the associated biofilm formation. The article by Rahman, M. et al The catabolism of arginine by Pseudomonas aeruginosa, J. Gen. Microbiol. (1980), 116, pp. 371-380, discusses the metabolism of mutants isolated from a Pseudomonas aeruginosa strain that are unable to use L-arginine or L-ornithine as a carbon source for growth.
Der Artikel von Sabaeifard P., Abdi-Ali A., Soudi MR. und Dinarvand R., Optimization of tetrazolium salt assay for Pseudomonas aeruginosa biofilm using microtiter plate method, J. Microbiol. Methods, 2014 Okt.,105, S.134-140, beschäftigt sich mit Pseudomonas aeruginosa, das eines der wichtigsten pathogenen Bakterien im Zusammenhang mit Biofilm-Infektionen ist. Aufgrund der Biofilm-Mehrfachresistenz sind Verfahren zur Biofilmbildungszählung von Interesse für die Beurteilung einer effizienten Medikamentenregimenentwicklung für die Biofilminhibierung oder - ausrottung. Bei der Bestimmung von der Biofilmbildung werden vitale oder nicht- vitale Farbstoffe eingesetzt. Gegenstand der vorliegenden Studie ist die Entwicklung eines Tests unter Verwendung eines Mitglieds der Tetrazoliumsalzfamilie, 2,3,5- Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), zum Nachweis der Pseudomonas aeruginosa- Biofilmbildung. The article by Sabaeifard P., Abdi-Ali A., Soudi MR. and Dinarvand R., Optimization of tetrazolium salt assay for Pseudomonas aeruginosa biofilm using microtiter plate method, J. Microbiol. Methods, 2014 Oct., 105, p.134-140, deals with Pseudomonas aeruginosa, which is one of the major pathogenic bacteria associated with biofilm infections. Because of biofilm multiple resistance, biofilm mapping methods are of interest in assessing efficient drug regimen development for biofilm inhibition or eradication. In determining biofilm formation, vital or non-vital dyes are used. The subject of this study is the development of a test using a member of the tetrazolium salt family, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC), to detect Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.
Darstellung der Erfindung Presentation of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System  The invention is based on the object of a method and a device for the qualitative and quantitative detection of in an aquatic system
enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung derart anzugeben, so dass eine sichere und schnelle Analyse und Bestimmung wenigstens zum Nachweis von Legionella pneumophila innerhalb ein bis zwei Tagen, containing biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus such that a safe and rapid analysis and determination at least for the detection of Legionella pneumophila within one to two days,
vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden und weniger, möglich sein soll. preferably within 24 hours and less, should be possible.
Insbesondere gilt es eine Bestimmung von Legionella pneumophila sowie weitere Bakterien unterschiedlicher Bakteriengattung innerhalb einer multizellulären  In particular, it is a determination of Legionella pneumophila and other bacteria of different bacterial genus within a multicellular
Gemeinschaft aus biofilmbauenden Bakterien innerhalb eines aquatischen Systems fehlerfrei zu detektieren, um möglichst gezielte Maßnahmen verzögerungsfrei zur Verhinderung bzw. Minimierung einer Biofilmbildung, wie beispielsweise der Einsatz von bakterienspezifischen Reinigungsmethoden, vornehmen zu können. Der Einsatz der lösungsgemäßen Vorrichtung soll auch vor Ort, d.h. in Form eines portablen Feldgerätes möglich sein. Community of biofilm-producing bacteria within an aquatic system to detect error-free, in order to make targeted measures possible delay to prevent or minimize biofilm formation, such as the use of bacteria-specific cleaning methods to make. The use the device according to the invention should also be possible on site, ie in the form of a portable field device.
Die Lösung der der Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe ist im Anspruch 1 angegeben. Gegenstand des Anspruches 16 ist eine Vorrichtung in Form einer Mikrotiterplatte zur Durchführung des lösungsgemäßen Verfahrens nach Anspruch 1. Bevorzugte Verwendungen sind Gegenstand der Ansprüche 21 bis 25. Den The solution of the problem underlying the invention is specified in claim 1. The subject of claim 16 is a device in the form of a microtiter plate for carrying out the method according to the invention according to claim 1. Preferred uses are subject matter of claims 21 to 25. Den
Erfindungsgedanken in vorteilhafter weise ausbildende Merkmale sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der weiteren Beschreibung unter Bezugnahme auf die illustrierten Ausführungsbeispiele zu entnehmen. Invention features advantageously forming features are the subject of the dependent claims and the further description with reference to the illustrated embodiments can be seen.
Im Unterschied zu bekannten Nachweisverfahren zur Detektion biofilmbauender Bakterien, die das Wachstumsverhalten (Anabolismus) von Bakterien untersuchen und infolgedessen viel Zeit in Anspruch nehmen, um eine zuverlässige Aussage über das Vorhandensein entsprechender Bakterien treffen zu können, basiert das lösungsgemäße Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung auf einer biochemischen Reaktion der Bakterien mit wenigstens einer Substanz, die eine bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion initiiert, durch die eine farbmetrische Reagenz chemisch beeinflussbar ist, dessen spektrometrische bzw. genauer, spektrophotometrische Eigenschaften gemessen und dem Nachweis der in dem aquatischen System enthaltenen biofilmbauenden Bakterien zugrunde gelegt wird. In contrast to known detection methods for detecting biofilm-forming bacteria, which investigate the growth behavior (anabolism) of bacteria and consequently take a long time to make a reliable statement about the presence of corresponding bacteria, the method according to the solution for the qualitative and quantitative detection of contained in an aquatic system, biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus on a biochemical reaction of the bacteria with at least one substance that initiates a bacteria-specific metabolic reaction by which a colorimetric reagent is chemically influenced, measured its spectrometric or more accurate, spectrophotometric properties and the Evidence of the biofilm-forming bacteria contained in the aquatic system.
Das lösungsgemäße Verfahren nutzt die Messung der auf Katabolismus beruhenden Vitalität bzw. Aktivität, spezifischer biofilmbauender Bakterien. Hierbei werden die zum Erhalt der lebenden Zellen erforderlichen Stoffwechselreaktionen in Betracht gezogen, bei denen Stoffwechselprodukte von komplexen zu einfachen Molekülen zur Entgiftung des Zellorganismus und zur Energiegewinnung abgebaut werden. Von besonderen Interesse hierbei ist der Nachweis von Bakterien der Bakteriengattungen Legionella, Pseudomonas, Escherichia und Enterobacter. Durch die Wahl der eine Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion initiierenden Substanz ist ein hochselektiver Nachweis von Bakterien einer bestimmten The method according to the invention uses the measurement of catabolism-based vitality or activity of specific biofilm-producing bacteria. Hereby, the metabolic reactions necessary for the preservation of the living cells are considered, in which metabolic products are degraded from complex to simple molecules for the detoxification of the cell organism and for the production of energy. Of particular interest here is the detection of bacteria of the bacterial genera Legionella, Pseudomonas, Escherichia and Enterobacter. The choice of a bacteria-specific metabolic reaction initiating substance is a highly selective detection of bacteria of a particular
Bakteriengattung innerhalb eines aquatischen Systems möglich. Bacterial genus within an aquatic system possible.
Für den Nachweis von Bakterien der Baktieriengattung Legionella, insbesondere der Bakteriumsart Legionella pneumophila, eignen sich vorzugsweise Aminosäuren zum Zwecke der Katabolisierung bzw. Verstoffwechselung durch diese Bakterien, da Aminosäuren, allen voran L-Serin, L-Threonin eine bevorzugte Kohlenstoff- und Stickstoffquelle für Legionella pneumophila darstellen. Neben den vorstehenden Aminosäuren eignen sich auch a-Ketobuttersäure, als Abbauprodukt der For the detection of bacteria of the Bactieriengattung Legionella, in particular the bacterium Legionella pneumophila, are preferably amino acids for the purpose of catabolization or metabolism by these bacteria, since amino acids, especially L-serine, L-threonine a preferred source of carbon and nitrogen for Legionella represent pneumophila. In addition to the above amino acids are also a-ketobutyric acid, as a degradation product of
Aminosäuren Threonin -, sowie Brenztraubensäure - zum Zwecke der Amino acids threonine -, as well as pyruvic acid - for the purpose of
Katabolisierung durch das Bakterium Legionella pneumophila. Catabolism by the bacterium Legionella pneumophila.
Zur Bestimmung der Anzahl der innerhalb des aquatischen Systems enthaltenen Bakterien Legionella pneumophila, deren Stoffwechsel durch wenigstens eine der vorstehenden Substanzen gezielt angeregt bzw. aktiviert wird, dient ein To determine the number of bacteria contained within the aquatic system Legionella pneumophila whose metabolism is specifically stimulated or activated by at least one of the above substances, serves a
farbmetrisches Reagenz, beispielsweise Tetrazolium Salz, vorzugsweise in Form von (2,3,5-Tripheny-2FI-Terazoliumchlorid, TTC) oder in Form von (2-(4-lodophenyl)-3-(4- Nitrophenyl)-5-(2,4-Disulfophenyl)-2FI-Tetrazolium, WST-1 ) mit mPMS (1 -Methoxy-5- Methyl-Phenazinium Methyl Sulfat, wie Elektron Mediator). Colorimetric reagent, for example tetrazolium salt, preferably in the form of (2,3,5-triphenyl-2Fl-terazolium chloride, TTC) or in the form of (2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- ( 2,4-disulfophenyl) -2FI-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator).
Zudem eignet sich der als TTC- oder Formazan-Test bekannte Nachweis für die Bestimmung der Vitalität von Zellen bzw. Bakterien, insbesondere von Legionella pneumophila, besonders gut zur messtechnischen Erfassung der im aquatischen System enthaltenen biofilmbauenden Bakterien. Das farbmetrische Reagenz, das im Ausgangzustand eine farblose Verbindung darstellt, wird durch chemische Reaktion mit den lebenden und somit metabolisch aktiven Bakterien zu einem löslichen - Formazan-Produkt- reduziert, dessen Menge direkt proportional zur Anzahl der lebenden Zellen bzw. Bakterien innerhalb des aquatischen Systems ist. In addition, the well-known as TTC or formazan test detection for the determination of the vitality of cells or bacteria, in particular of Legionella pneumophila, particularly suitable for metrological detection of biofilm-forming bacteria contained in the aquatic system. The colorimetric reagent, which in the initial state is a colorless compound, is reduced by chemical reaction with the living and thus metabolically active bacteria to a soluble - formazan product - the amount of which is directly proportional to the number of living cells or bacteria within the aquatic system is.
Zur messtechnischen Erfassung der spektrophotometrischen Eigenschaften des farbmetrischen Reagenz im aquatischen System dient das Verfahren der optischen Spektrophotometrie, mit dem die optische Extinktion des durch den Farbumschlag des farbmetrischen Reagenz eingefärbten aquatischen Systems gemessen wird. Hierbei kann je nach Analyseart ein absoluter Extinktionswert und/oder eine zeitliche veränderliche Extinktionsfunktion ermittelt werden, um bspw. die zeitliche For metrological detection of the spectrophotometric properties of the colorimetric reagent in the aquatic system, the method of optical Spectrophotometry, which measures the optical absorbance of the aquatic system stained by the color change of the colorimetric reagent. In this case, depending on the type of analysis, an absolute extinction value and / or a temporally variable extinction function can be determined in order, for example, to determine the time
Veränderung der Aktivität der die Substanz metabolisierenden Bakterien im aquatischen System erfassen zu können. So liefert die Geschwindigkeit der To be able to detect changes in the activity of the substance metabolizing bacteria in the aquatic system. So delivers the speed of
Farbentwicklung Informationen über die Dichte und/oder die katabolische Aktivität der Bakterien innerhalb des aquatischen Systems. Color development Information on the density and / or catabolic activity of bacteria within the aquatic system.
Da biofilmbauende Bakterien, insbesondere Legionella pneumophila Aminosäuren, vorzugsweise L-Serin und L-Threonin oder deren Abbauprodukt a-Ketobuttersäure bevorzugt in mikroaerophiler Atmosphäre katabolieren, wird die biochemische Reaktion der innerhalb des aquatischen Systems enthaltenen biofilmbauenden Bakterien mit der bestimmt ausgewählten Substanz sowie dem beigegeben farbmetrischen Reagenz vorzugsweise unter Bedingungen einer mikroaerophilen Bebrütung bei einer Temperatur im Bereich zwischen 25°C und 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 40°C, insbesondere bei 37°C durchgeführt. Since biofilm-producing bacteria, in particular Legionella pneumophila amino acids, preferably L-serine and L-threonine or their degradation product catabolize a-ketobutyric acid preferably in a microaerophilic atmosphere, the biochemical reaction of the biofilm-forming bacteria contained within the aquatic system with the determined selected substance and the colorimetric added Reagent preferably under conditions of microaerophilic incubation at a temperature in the range between 25 ° C and 45 ° C, preferably between 30 ° C and 40 ° C, in particular carried out at 37 ° C.
Belastbare Messresultate über die Menge, d.h. Anzahl, sowie auch Aktivität der innerhalb des aquatischen Systems vorhandenen biofilmbauenden Bakterien können bereits nach einer Reaktionszeit zwischen den Bakterien und der jeweils Resilient measurement results on the quantity, i. Number, as well as activity of existing within the aquatic system biofilm-producing bacteria can already after a reaction time between the bacteria and each
bakterienspezifischen Substanz von etwa 20 bis 50 Stunden, vorzugsweise nach bereits 24 Stunden, gewonnen werden. bacteria-specific substance of about 20 to 50 hours, preferably after just 24 hours, are obtained.
Neben der qualitativen sowie auch quantitativen Erfassung von Legionella In addition to the qualitative and quantitative assessment of Legionella
pneumophila innerhalb des aquatischen Systems eignet sich das lösungsgemäße Verfahren vor allem auch zur weiteren Erfassung von Bakterien der nachfolgenden Bakteriengattungen: Pseudomonas, Escherichia, Enterobacter. pneumophila within the aquatic system, the method according to the solution is especially suitable for further detection of bacteria of the following bacterial genera: Pseudomonas, Escherichia, Enterobacter.
Für den Nachweis von Bakterien der Bakteriengattung Pseudomona, so For the detection of bacteria of the bacterial genus Pseudomona, so
insbesondere das Bakterium Pseudomonas aeruginosa eignet sich als Substanz zur Initiierung der Bakterien-spezifischen Stoffwechselreaktion L-Arginin, L-Aspargin, Itakonsäure oder Putrescin. In particular, the bacterium Pseudomonas aeruginosa is suitable as a substance for Initiation of the bacteria-specific metabolic reaction L-arginine, L-asparagine, itaconic acid or putrescine.
Für den Nachweis von Bakterien der Bakteriengattung Enterobacter, so For the detection of bacteria of the bacterial genus Enterobacter, see above
insbesondere des Bakteriums Enterobacter aerogenes eignet sich als Substanz zur Initiierung der Bakterien-spezifischen Stoffwechselreaktion D-Glukosaminsäure, D- Cellobiose, ß-Methyl-D-Glukosid oder D-Mannitol. in particular the bacterium Enterobacter aerogenes is suitable as substance for the initiation of the bacteria-specific metabolic reaction D-glucosaminic acid, D-cellobiose, ß-methyl-D-glucoside or D-mannitol.
Für den Nachweis von Bakterien der Bakteriengattung Escherichia, so insbesondere des Bakteriums Escherichia coli, eignet sich als für die Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion initiierende Substanz L-Phenylalanin, a-D-Glukose oder Glukose-1 -Phosphat. For the detection of bacteria of the bacterial genus Escherichia, in particular the bacterium Escherichia coli, is suitable as the bacteria-specific metabolic reaction initiating substance L-phenylalanine, α-D-glucose or glucose-1-phosphate.
Wenigstens ein Teil, vorzugsweise alle der vorstehend genannten Substanzen, die von den genannten biofilmbauenden Bakterien katabolisiert werden, werden zum Zweck eines möglichst allumfassenden Nachweises der in einem aquatischen System enthaltenen Biofilmbauenden Bakterien eingesetzt. Flierzu werden die betreffenden Substanzen jeweils getrennt in voneinander isolierten Kavitäten einer Mikrotiterplatte gemeinsam mit einem vorstehend erläuterten, farbmetrischen Reagenz bevorratet, in die jeweils eine Probe des die biofilmbauenden Bakterien enthaltenden aquatischen Systems eingebracht wird. Die Verwendung einer Mikrotiterplatte ermöglicht eine einfache und vor allem einheitliche Handhabung und Durchführung der biochemischen Reaktion innerhalb der einzelnen Kavitäten unter einheitlichen Reaktionsbedingungen. Die Verwendung einer an sich bekannten lichttransparenten Mikrotiterplatte ermöglicht es nach Ablauf einer bestimmten Reaktionszeit eine spektralphotometrische Vermessung sämtlicher Proben innerhalb der einzelnen, voneinander isolierten Kavitäten durchzuführen. At least a portion, preferably all of the aforementioned substances, which are catabolized by said biofilm-producing bacteria are used for the purpose of as comprehensive as possible detection of the biofilm-producing bacteria contained in an aquatic system. Flierzu the respective substances are stored separately in mutually isolated wells of a microtiter plate together with an above-described colorimetric reagent, in each of which a sample of the biofilm-forming bacteria-containing aquatic system is introduced. The use of a microtiter plate allows a simple and above all uniform handling and implementation of the biochemical reaction within the individual cavities under uniform reaction conditions. The use of a light-transparent microtiter plate known per se makes it possible to carry out a spectrophotometric measurement of all samples within the individual, mutually insulated cavities after a certain reaction time.
Die lösungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung eines qualitativen und The solution according to the device for performing a qualitative and
quantitativen Nachweises von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien mit jeweils einer Substanz und einem farbmetrischen Reagenz enthaltenden Kavitäten zeichnet sich somit durch eine lichttransparente Mikrotiterplatte aus, wobei in wenigstens zwei Kavitäten jeweils eine Substanz enthalten ist, die sich voneinander unterscheiden und die aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: a-Ketobuttersäure-, L-Serin, L- Threonin, Brenztraubensäure Methyl Ester. Quantitative detection of contained in an aquatic system, biofilm-forming bacteria, each with a substance and a colorimetric reagent containing cavities thus characterized by a light-transparent Microtiter plate, wherein in at least two cavities each containing a substance which differ from each other and which are selected from the group of the following substances: a-ketobutyric acid, L-serine, L-threonine, pyruvic acid methyl ester.
Eine bevorzugte weitere Ausgestaltung der vorstehend zum Zwecke des Nachweises von Legionella pneumophila konzipierten Mikrotiterplatte sieht für einen weiteren Nachweis des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils eine Substanz vor, die sich jeweils unterscheiden und aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: L-Arginin, L-Asparagin, Itakonsäure, Putrescin. A further preferred embodiment of the microtiter plate designed above for the purpose of detecting Legionella pneumophila provides for a further detection of the bacterium Pseudomonas aeruginosa in at least two further cavities in each case one substance which in each case differs and are selected from the group of the following substances: Arginine, L-asparagine, itaconic acid, putrescine.
Alternativ oder in Kombination mit beiden vorstehend erläuterten, bevorzugten Ausführungsbeispielen, sieht ein weiteres Ausführungsbeispiel die zusätzliche Erfassung des Bakteriums Enterobacter aerogenes vor, bei dem in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils eine Substanz enthalten ist, die sich voneinander unterscheiden und die aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: D-Glukosaminsäure, D-Cellobiose, ß-Methyl-D-Glukosid, D-Mannitol. Alternatively or in combination with the two preferred embodiments described above, another embodiment provides for the additional detection of the bacterium Enterobacter aerogenes, in which at least two further cavities each contain a substance which is different from one another and those from the group of the following substances D-glucosaminic acid, D-cellobiose, β-methyl-D-glucoside, D-mannitol.
Ein letztes bevorzugtes Ausführungsbeispiel sieht alternativ oder in Kombination mit den vorstehend erläuterten bevorzugten Ausführungsbeispielen zum weiteren Nachweis des Bakteriums Escherichia coli in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils unterschiedliche Substanzen vor, die aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: L-Phenylalanin, a-D-Glukose, Glukose-1 -Phosphat A last preferred embodiment provides alternatively or in combination with the above-described preferred embodiments for further detection of the bacterium Escherichia coli in at least two other cavities respectively different substances, which are selected from the group of the following substances: L-phenylalanine, aD-glucose, Glucose-1-phosphate
In sämtlichen der vorstehend erläuterten Ausführungsbeispielen zur Ausbildung einer lösungsgemäßen Mikrotiterplatte ist jeweils neben den vorstehend genannten In all of the above-described embodiments for forming a microplate according to the invention, in each case in addition to those mentioned above
Substanzen jeweils ein farbmetrisches Reagenz vorzugsweise in Form von Substances in each case a colorimetric reagent, preferably in the form of
Tetrazolium Salz, vorzugsweise in Form von (2,3,5-Tripheny-2FI-Terazoliumchlorid, TTC) oder (2-(4-lodophenyl)-3-(4-Nitrophenyl)-5-(2,4-Disulfophenyl)-2FI-Tetrazolium, WST-1 ) mit mPMS (1 -Methoxy-5-Methyl-Phenazinium Methyl Sulfat, wie Elektron Mediator) enthalten. Eine bevorzugte Verwendung der lösungsgemäß ausgebildeten Mikrotiterplatte dient der qualitativen und quantitativen Bestimmung von in aquatischen Systemen enthaltenen Legionella pneumophila, vorzugsweise von wenigstens einem weiteren biofilmbauenden Bakterium der nachfolgenden Gruppe: Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli. Tetrazolium salt, preferably in the form of (2,3,5-triphenyl-2Fl-terazolium chloride, TTC) or (2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) - 2FI-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator). A preferred use of the microtiter plate designed in accordance with the invention is for the qualitative and quantitative determination of Legionella pneumophila contained in aquatic systems, preferably of at least one further biofilm-producing bacterium of the following group: Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli.
Die lösungsgemäße Mikrotiterplatte sowie das damit verbundene lösungsgemäße Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis biofilmbauender Bakterien eignet sich in erster Linie zur Untersuchung von Wasser in Wasserverteilsystemen, d.h. umfassend von einschließlich der Quelle bis hin zum Endverbraucher, sowohl zur Versorgung von Mensch und Tier als auch in industriellen Anlagen, wie The solution according to the invention microtiter plate and the associated method according to the invention for the qualitative and quantitative detection of biofilm-forming bacteria is primarily for the study of water in water distribution systems, i. including from the source to the end user, both for human and animal care and in industrial installations such as
beispielsweise Kühltürmen etc. for example cooling towers etc.
Selbstverständlich sind auch weitere Anwendungen zur Untersuchung aquatischer Systeme hinsichtlich spezifischer Bakterienarten denkbar, so insbesondere im medizinischen, chemischen oder biochemischen Bereich, wo es gilt relevante Of course, other applications for studying aquatic systems with regard to specific types of bacteria are also conceivable, in particular in the medical, chemical or biochemical field, where relevant
Flüssigkeiten zu analysieren, die aquatische Systeme darstellen und jeweils ein Milieu zum Überleben von Biofilmbauenden Bakterien darstellen. Vor allem im medizinischen Bereich ist der Einsatz der lösungsgemäßen Mikrotiterplatte von großem Nutzen insbesondere zur Untersuchung folgender aquatischer Systeme: Körperflüssigkeiten, vor allem Urin, Liquor, Gallenflüssigkeit, Speichel, Magensaft, Muttermilch, Vaginalsekret, Tränenflüssigkeit, Nasensekret, Ejakulat. Analyze liquids that represent aquatic systems and each provide a milieu for survival of biofilm-building bacteria. Especially in the medical field, the use of the microplate according to the invention is of great use, in particular for the investigation of the following aquatic systems: body fluids, especially urine, cerebrospinal fluid, bile, saliva, gastric juice, breast milk, vaginal secretions, tear fluid, nasal secretions, ejaculate.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform zur Durchführung der In a further advantageous embodiment for carrying out the
lösungsgemäßen Nachweismethode für die vorstehenden, biofilmbauenden solution according to the invention for the above, biofilmbauenden
Bakterien, die allesamt der sogenannten gramnegativen Bakteriengruppe zuordenbar sind, werden die nachzuweisenden und im aquatischen System enthaltenen Bacteria, all of which can be assigned to the so-called gram-negative bacterial group, become the ones to be detected and contained in the aquatic system
Bakterien vor und/oder während der den Bakterien-spezifischen Stoffwechsel initiierenden biochemischen Reaktion einer chemischen und/oder Bacteria before and / or during the bacterial-specific metabolism-initiating biochemical reaction of a chemical and / or
hydromechanischen Modifikation unterzogen, bei der die Zellmembranpermeabilität der Bakterien gezielt konditioniert wird. Die chemisch und/oder hydromechanisch initiierte Modifikation führt zur Veränderung der Zelloberflächeneigenschaften und einer damit verbundenen Erhöhung der Permeabilität der Bakterienmembran. subjected to hydromechanical modification, in which the cell membrane permeability of the bacteria is specifically conditioned. The chemically and / or hydromechanically initiated modification leads to a change in the cell surface properties and an associated increase in the permeability of the bacterial membrane.
So verfügen gramnegative Bakterien in der jeweils äußeren Membran über unspezifische Transmembranproteine, so genannten Porine, die dem Stoffaustausch durch die Membran dienen. Es zeigt sich bspw., dass durch die Zugabe der grenzflächenaktiven chemischen Substanz Polysorbat 80 an die nachzuweisenden Bakterien eine signifikante Erhöhung der Permeabilität der äußeren Zellmembran der Bakterien erzielbar ist. Gram-negative bacteria in the respective outer membrane have non-specific transmembrane proteins, so-called porins, which serve for the exchange of substances through the membrane. It shows, for example, that the addition of the surface-active chemical substance Polysorbate 80 to the bacteria to be detected, a significant increase in the permeability of the outer cell membrane of the bacteria can be achieved.
Durch die vorgenommene Membranmodifikation wird zumindest der durch die äußere Membran erfolgende Elektronen- oder Protonen- Austausch mit der aquatischen Umgebung unterstützt, wodurch die durch die wenigstens eine Substanz initiierbare Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion mit einer signifikant höheren Effizienz und einer damit verbundenen zeitlichen Beschleunigung des gesamten Nachweisverfahrens durchgeführt werden kann. Die durch die Membranmodifikation bedingte Steigerung der stofflichen Durchlässigkeit der äußeren Zellmembran führt auch zu einer Steigerung des Nachweisvermögens bzw. einer Verbesserung der sensorischen Sensitivität der lösungsgemäßen Nachweismethode. So können geringe Konzentrationen von Bakterien in einer Probe nachgewiesen werden und dies innerhalb sehr kurzer Nachweisdauern von deutlich unter 24 h. As a result of the membrane modification made, at least the exchange of electrons or protons by the outer membrane with the aquatic environment is supported, whereby the bacteria-specific metabolic reaction which can be initiated by the at least one substance has a significantly higher efficiency and an associated temporal acceleration of the entire detection method can be carried out. The increase in the material permeability of the outer cell membrane caused by the membrane modification also leads to an increase in the detection capability or an improvement in the sensory sensitivity of the detection method according to the invention. Thus, low concentrations of bacteria can be detected in a sample and this within a very short detection periods of well below 24 h.
Im Zusammenhang mit der Verwendung von Polysorbat 80 wurde bereits die bioenergetische Aktivität, d.h. das zeitlich katabolische Verhalten von Legionella pneumophila durch Messen der Raten des Elektronenflusses in und durch die Elektronentransportketten bei unterschiedlichen metabolischen Substraten, bspw. von L-Serin, L-Threonin, a-Ketobuttersäure und Brenztraubensäure Methyl Ester gemessen. Gleichwohl jede der Substanzen verschiedenen Elektronentransport- ketten durch die Zellwand besitzen, wandern die Elektronen stets jeweils vom Anfang zum distalen Teil der Elektronentransportkette, wo ein Redoxfarbstoff als terminaler Elektronen- bzw. Protonen-Akzeptor fungiert, der bei Reduktion den Farbstoff entsprechend umwandelt, und dessen Farbänderung in der beschriebenen Weise spektrophotometrisch erfasst werden kann. In connection with the use of polysorbate 80, the bioenergetic activity, ie the temporal catabolic behavior of Legionella pneumophila, has already been determined by measuring the rates of electron flow into and through the electron transport chains on different metabolic substrates, for example of L-serine, L-threonine, a Ketobutyric acid and pyruvic acid methyl ester. Although each of the substances has different electron transport chains through the cell wall, the electrons always migrate from the beginning to the distal part of the electron transport chain, where a redox dye as the terminal Electron or proton acceptor acts, which converts the dye according to reduction, and the color change can be detected in the manner described spectrophotometrically.
Alternativ oder in Kombination zur Verwendung von Polysorbat 80 als ein die Alternatively or in combination to use polysorbate 80 as one of
Zelloberflächeneigenschaften veränderndes chemisches Mittel, eignen sich auch Biotenside, um die Zellmembranpermeabilität der Bakterien entsprechend zu konditionieren. Allen voran Rhamnolipid oder Surfactin. Cell surfactant altering chemical agent, biosurfactants are also suitable for conditioning the cell membrane permeability of the bacteria. First of all rhamnolipid or surfactin.
Eine mit den vorstehenden, chemischen Maßnahmen vergleichbare Möglichkeit zur Einflussnahme auf die Membranpermeabilität bzw. auf die in der äußeren Membran der gramnegativen Bakterien enthaltenen Porine, besteht in der Applikation hydrodynamischer Kräfte auf die im aquatischen System enthaltenen Bakterien, nämlich durch Einkoppeln von Ultraschallwellen in das aquatische System. So zeigen Versuche, dass gramnegative Bakterien bei einer Ultraschallwellenapplikation mit einer Wirkdauer von ca. 15 Minuten über eine erhöhte Zellmembranpermeabilität verfügen. Ein besonders vorteilhafter Effekt stellt sich bei der Kombination der Ultraschallwellenapplikation mit wenigstens einer der vorstehend erläuterten, chemischen Zellmembrankonditionierungen an den jeweils nachzuweisenden gramnegativen Bakterien ein. A comparable possibility with the above, chemical measures to influence the membrane permeability or to the porins contained in the outer membrane of Gram-negative bacteria, consists in the application of hydrodynamic forces on the bacteria contained in the aquatic system, namely by coupling ultrasonic waves in the aquatic System. Thus, experiments show that gram-negative bacteria have increased cell membrane permeability in an ultrasound wave application with a duration of action of about 15 minutes. A particularly advantageous effect arises in the combination of the ultrasonic wave application with at least one of the above-explained, chemical cell membrane conditioning of the respectively to be detected Gram-negative bacteria.
Kurze Beschreibung der Erfindung Brief description of the invention
Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen  The invention will hereinafter be understood without limitation of the general
Erfindungsgedankens anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die Zeichnung exemplarisch beschrieben. Es zeigt: Invention concept described using an exemplary embodiment with reference to the drawings by way of example. It shows:
Fig. 1 schematisierte Darstellung zur Verteilung unterschiedlicher Substanzen innerhalb von Kavitäten einer Mikrotiterplatte. Fig. 1 is a schematic representation of the distribution of different substances within cavities of a microtiter plate.
Wege zur Ausführung der Erfindung, gewerbliche Verwendbarkeit Ways to carry out the invention, industrial usability
Figur 1 zeigt eine tabellarische Anordnung bestehend auf vier Spalten (1 , 2, 3, 4) und acht Zeilen (A-H), in der 32 Felder unterscheidbar voneinander durch eine individuelle Spalten- und Zeilenzugehörigkeit adressierbar sind. Die tabellarische Anordnung illustriert stark schematisiert eine Mikrotiterplatte, deren Kavitäten durch die 32 Felder repräsentiert sind. Figure 1 shows a tabular arrangement consisting of four columns (1, 2, 3, 4) and eight rows (AH), in the 32 fields distinguishable from each other by a individual column and row membership are addressable. The tabular arrangement illustrates very schematically a microtiter plate whose cavities are represented by the 32 fields.
Ausgewählte Felder bzw. Kavitäten einer durch die tabellarische Anordnung repräsentierten Mikrotiterplatte enthalten jeweils die aus Figur 1 entnehmbaren Substanzen, die jeweils eine Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion zu initiieren vermögen. Jeweils unterhalb der in den einzelnen Feldern/Kavitäten angegebenen Substanzen ist in Fettdruck der Name jenes Bakteriums angegeben, das die Selected fields or cavities of a microtiter plate represented by the tabular arrangement contain in each case the substances which can be taken from FIG. 1 and each of which is able to initiate a bacteria-specific metabolic reaction. In each case below the substances indicated in the individual fields / cavities, the name of the bacterium is given in bold type
Substanz im aquatischen System im Wege einer Stoffwechselreaktion reduziert. Repräsentativ sei in diesem Zusammenhang die in Zeile A Spalte 2 befindliche Kavität genannt, in der zum Nachweis des Bakteriums Enterobacter aerogenes die Substanz ß-Methyl-D-Glukosid enthalten ist. Substance in the aquatic system reduced by way of a metabolic reaction. Representative in this context is the cavity located in column A column 2 mentioned, in which for the detection of the bacterium Enterobacter aerogenes the substance ß-methyl-D-glucoside is included.
Neben den zwölf mit unterschiedlichen Substanzen belegten Feldern/Kavitäten ist in einer Kavität, vorzugsweise in der Kavität A/1 , Wasser als neutrales Puffermedium bevorratet, anhand dem im Rahmen einer photometrischen Messung ein In addition to the twelve fields / cavities occupied with different substances, water is stored as a neutral buffer medium in one cavity, preferably in the well A / 1, on the basis of a photometric measurement
Referenzabgleich mit einer sogenannten Null-Probe vorgenommen werden kann. Reference adjustment can be made with a so-called zero-sample.
Gemeinsam mit den in den Kavitäten bevorratenden Substanzen befindet sich in jeder Kavität ein farbmetrisches Reagenz in Form eines Redox-Indikators, vorzugsweise Tetrazolium Salz, bspw. in Form von (2,3,5-Tripheny-2FI- Terazoliumchlorid, TTC) oder (2-(4-lodophenyl)-3-(4-Nitrophenyl)-5-(2,4- Disulfophenyl)-2FI-Tetrazolium, WST-1 ) mit mPMS (1 -Methoxy-5-Methyl- Phenazinium Methyl Sulfat, wie Elektron Mediator). Together with the substances stored in the cavities, a colorimetric reagent in the form of a redox indicator, preferably tetrazolium salt, is present in each well, for example in the form of (2,3,5-triphenyl-2Fl-terazolium chloride, TTC) or (2 - (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2-FI-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator).
Die in Figur 1 illustrierte geometrische Anordnung der einzelnen auf die The illustrated in Figure 1 geometric arrangement of the individual on the
unterschiedlichen Kavitäten verteilten Substanzen ist nicht einschränkend zu verstehen, selbstverständlich sind alternative räumliche Verteilungen der Substanzen in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte weitgehend beliebig möglich. Auch können die in Figur 1 nicht mit Substanzen befüllten Felder/Kavitäten, bspw. A/3, B/1 , B/2, B/3, C/1 etc., mit weiteren oder den bereits in der Mikrotiterplatte verteilt angeordneten Substanzen aufgefüllt werden. Substances distributed in different cavities are not to be understood as limiting, of course, alternative spatial distributions of the substances in the wells of a microtiter plate are largely possible. The fields / cavities filled with substances in FIG. 1, for example A / 3, B / 1, B / 2, B / 3, can also C / 1, etc., with further or already distributed in the microtiter plate substances are filled.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung mittels biochemischer Reaktion der Bakterien mit wenigstens einer Substanz, die eine Bakterien-spezifische Stoffwechselreaktion initiiert, sowie einem von der Stoffwechselreaktion beeinflussbaren farbmetrischen Reagenz, dessen spektrometrische Eigenschaften gemessen und dem Nachweis zugrunde gelegt. 1. A method for the qualitative and quantitative detection of contained in an aquatic system, biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus by biochemical reaction of the bacteria with at least one substance that initiates a bacteria-specific metabolic reaction, and a influenced by the metabolic reaction colorimetric reagent whose spectrometric properties measured and based on evidence.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , 2. The method according to claim 1,
dadurch gekennzeichnet, dass die im aquatischen System enthaltenen Bakterien zu einer der nachfolgenden Bakterienarten zuordenbar sind: Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes. characterized in that the bacteria contained in the aquatic system can be assigned to one of the following types of bacteria: Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes.
3. Verfahren nach Anspruch 2, 3. The method according to claim 2,
dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Reaktion zum Nachweis der Bakterien der Bakteriengattung Legionella, insbesondere des Bakteriums Legionella pneumophila, mit wenigstens einer der nachfolgenden Substanzen durchgeführt wird: a-Ketobuttersäure, L-Serin, L-Threonin, Brenztraubensäure Methyl Ester. characterized in that the biochemical reaction for detecting the bacteria of the bacterial genus Legionella, in particular the bacterium Legionella pneumophila, is carried out with at least one of the following substances: a-ketobutyric acid, L-serine, L-threonine, pyruvic acid methyl ester.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, 4. The method according to claim 2 or 3,
dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Reaktion zum Nachweis der Bakterien der Bakteriengattung Pseudomonas, insbesondere des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa, mit wenigstens einer der nachfolgenden Substanzen durchgeführt wird: L-Arginin, L-Asparagin, Itakonsäure, Putrescin. characterized in that the biochemical reaction for detecting the bacteria of the bacterial genus Pseudomonas, in particular of the bacterium Pseudomonas aeruginosa, is carried out with at least one of the following substances: L-arginine, L-asparagine, itaconic acid, putrescine.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, 5. The method according to any one of claims 2 to 4,
dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Reaktion zum Nachweis der Bakterien der Bakteriengattung Enterobacter, insbesondere des Bakteriums characterized in that the biochemical reaction for detecting the bacteria of the bacterial genus Enterobacter, in particular of the bacterium
Enterobacter aerogenes, mit wenigstens einer der nachfolgenden Substanzen durchgeführt wird: D-Glucosaminsäure, D-Cellobiose, ß-Methyl-D-Glukosid, D- Mannitol. Enterobacter aerogenes, with at least one of the following substances: D-glucosaminic acid, D-cellobiose, ß-methyl-D-glucoside, D-mannitol.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, 6. The method according to any one of claims 2 to 5,
dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Reaktion zum Nachweis der Bakterien der Bakteriengattung Escherichia, insbesondere des Bakteriums characterized in that the biochemical reaction for detecting the bacteria of the bacterial genus Escherichia, in particular the bacterium
Escherichia coli, mit wenigstens einer der nachfolgenden Substanzen durchgeführt wird: D-Mannitol, L-Phenyloalanin, a-D-Glukose, Glukose-1 -Phosphat. Escherichia coli, with at least one of the following substances: D-mannitol, L-phenyloalanine, α-D-glucose, glucose-1-phosphate.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 7. The method according to any one of claims 1 to 6,
dadurch gekennzeichnet, dass als farbmetrische Reagenz ein Redoxindikator verwendet wird. characterized in that a redox indicator is used as the colorimetric reagent.
8. Verfahren nach Anspruch 7, 8. The method according to claim 7,
dadurch gekennzeichnet, dass als Redoxindikator Tetrazolium Salz, in Form von (2,3,5-Tripheny-2H-Terazoliumchlorid, TTC) oder in Form von (2-(4-lodophenyl)-3-(4- Nitrophenyl)-5-(2,4-Disulfophenyl)-2FI-Tetrazolium, WST-1 ) mit mPMS (1 -Methoxy-5- Methyl-Phenazinium Methyl Sulfat, wie Elektron Mediator) verwendet wird. characterized in that as the redox indicator tetrazolium salt, in the form of (2,3,5-triphenyl-2H-terazolium chloride, TTC) or in the form of (2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2FI-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator).
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, 9. The method according to any one of claims 1 to 8,
dadurch gekennzeichnet, dass die spektrometrischen Eigenschaften des characterized in that the spectrometric properties of
farbmetrischen Reagenz im aquatischen System im Wege einer optischen Colorimetric reagent in the aquatic system by way of an optical
Spektrophotometrie erfasst werden, bei der eine dem die Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung enthaltenden aquatischen System zuordenbare optische Extinktion gemessen wird, zum Erhalt eines absoluten Extinktionswertes und/oder einer zeitlich veränderlichen Extinktionsfunktion. Spectrophotometry can be detected, in which an optical extinction attributable to the bacteria of at least one bacterial genus can be measured optical extinction, to obtain an absolute extinction value and / or a time-varying extinction function.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 10. The method according to any one of claims 1 to 9,
dadurch gekennzeichnet, dass die biochemische Reaktion unter Bedingungen einer mikroaerophilen Bebrütung bei einer Temperatur im Bereich zwischen 25°C und 45°C, vorzugsweise bei 37 °C, durchgeführt wird. characterized in that the biochemical reaction under conditions of microaerophilic incubation at a temperature in the range between 25 ° C and 45 ° C, preferably at 37 ° C, is performed.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 11. The method according to any one of claims 1 to 10,
dadurch gekennzeichnet, dass die spektrophotometrischen- Eigenschaften des farbmetrischen Reagenz im aquatischen System nach einer Reaktionszeit der biochemischen Reaktion von 20 Stunden bis 50 Stunden, vorzugsweise nach 24 Stunden, gemessen werden. characterized in that the spectrophotometric properties of the colorimetric reagent in the aquatic system after a reaction time of biochemical reaction from 20 hours to 50 hours, preferably after 24 hours.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , 12. The method according to any one of claims 1 to 11,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von voneinander isolierten Kavitäten verwendet wird, in denen jeweils eine der wenigstens einen Substanz sowie das farbmetrische Reagenz bevorratet werden, und dass jeweils eine Probe des die biofilmbauenden Bakterien wenigstens einer Bakteriengattung enthaltenden aquatischen Systems in die Kavitäten der characterized in that a microtiter plate with a plurality of mutually insulated cavities is used, in each of which one of the at least one substance and the colorimetric reagent are stored, and that in each case a sample of the biofilm-forming bacteria of at least one bacterial genus containing aquatic system in the cavities of
Mikrotiterplatte eingebracht wird. Microtiter plate is introduced.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, 13. The method according to any one of claims 1 to 12,
dadurch gekennzeichnet, dass vor und/oder während der Durchführung characterized in that before and / or during the implementation
der biochemischen Reaktion die Bakterien einer chemischen und/oder the biochemical reaction the bacteria of a chemical and / or
hydromechanischen Modifikation unterzogen werden. be subjected to hydromechanical modification.
14. Verfahren nach Anspruch 13, 14. The method according to claim 13,
dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Modifikation durch Zugabe wenigstens eines chemischen Mittels an die Bakterien erfolgt, das aus den nachfolgenden Mitteln auswählbar ist: Polysorbat 80, Rhamnolipid, Surfactin. characterized in that the chemical modification is carried out by adding at least one chemical agent to the bacteria selectable from the following: polysorbate 80, rhamnolipid, surfactin.
15. Verfharen nach Anspruch 13 oder 14, 15. Verfharen according to claim 13 or 14,
dadurch gekennzeichnet, dass die hydromechanische Modifikation durch characterized in that the hydromechanical modification by
Applikation von Ultraschallwellen an die Bakterien erfolgt. Application of ultrasonic waves to the bacteria takes place.
16. Mikrotiterplatte zur Durchführung eines qualitativen und quantitativen 16. Microtiter plate for performing a qualitative and quantitative
Nachweises von in einem aquatischen System enthaltenen, biofilmbauenden Bakterien mit jeweils einer Substanz und einem farbmetrischen Reagenz Detection of biofilm-forming bacteria contained in an aquatic system, each with one substance and one colorimetric reagent
enthaltenden Kavitäten, containing cavities,
dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens zwei Kavitäten jeweils eine Substanz enthalten ist, die sich unterscheiden und aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: a-Ketobuttersäure, L-Serin, L-Threonin, Brenztraubensäure Methyl Ester. characterized in that in each case a substance is contained in at least two cavities, which differ and from the group of the following Substances selected are: a-ketobutyric acid, L-serine, L-threonine, pyruvic acid methyl ester.
17. Mikrotiterplatte nach Anspruch 16, 17. Microtiter plate according to claim 16,
dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils eine Substanz enthalten ist, die sich unterscheiden und aus der Gruppe der characterized in that in each case one substance is contained in at least two further cavities, which differ and from the group of
nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: L-Arginin, L-Asparagin, Itakonsäure, Putrescin. the following substances are selected: L-arginine, L-asparagine, itaconic acid, putrescine.
18. Mikrotiterplatte nach Anspruch 16 oder 17, 18. Microtiter plate according to claim 16 or 17,
dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils eine Substanz enthalten ist, die sich unterscheiden und aus der Gruppe der characterized in that in each case one substance is contained in at least two further cavities, which differ and from the group of
nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: D-Glukosaminsäure, D-Cellobiose, ß- Methyl-D-Glukosid, D-Mannitol. the following substances are selected: D-glucosaminic acid, D-cellobiose, ß-methyl-D-glucoside, D-mannitol.
19. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 16 bis Anspruch 18, 19. Microtiter plate according to one of claims 16 to claim 18,
dadurch gekennzeichnet, dass in wenigstens zwei weiteren Kavitäten jeweils unterschiedliche Substanzen enthalten sind, die aus der Gruppe der nachfolgenden Substanzen ausgewählt sind: - und a-D-Glukose. characterized in that at least two further cavities each contain different substances which are selected from the group of the following substances: and α-D-glucose.
20. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 16 bis 19, 20. Microtiter plate according to one of claims 16 to 19,
dadurch gekennzeichnet, dass in den Kavitäten als farbmetrische Reagenz ein Redoxindikator in Form von Tetrazolium Salz (2,3,5-Tripheny-2H-Terazoliumchlorid, TTC) oder (2-(4-lodophenyl)-3-(4-Nitrophenyl)-5-(2,4-Disulfophenyl)-2H-Tetrazolium, WST-1 ) mit mPMS (1 -Methoxy-5-Methyl-Phenazinium Methyl Sulfat, wie Elektron Mediator) enthalten ist. characterized in that in the cavities as a colorimetric reagent, a redox indicator in the form of tetrazolium salt (2,3,5-tripheny-2H-terazolium chloride, TTC) or (2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) - 5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, WST-1) with mPMS (1-methoxy-5-methyl-phenazinium methyl sulfate, such as electron mediator).
21. Verwendung der Mirkotiterplatte nach Anspruch 16 zum qualitativen und quantitativen Nachweis von in einem aquatischen System enthaltenen Legionella pneumophila. 21. Use of the microtiter plate according to claim 16 for the qualitative and quantitative detection of Legionella pneumophila contained in an aquatic system.
22. Verwendung der Mikrotiterplatte nach Anspruch 20 zum qualitativen und quantitativen Nachweis von biofilmbauenden Bakterien, von denen wenigstens eine Bakterienart der nachfolgenden Bakterienarten in einem aquatischen System enthalten sind: Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli. 22. Use of the microtiter plate according to claim 20 for the qualitative and quantitative detection of biofilm-forming bacteria, of which at least one bacterial species of the following bacterial species are contained in an aquatic system: Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli.
23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22 zur Untersuchung von Wasser als aquatisches System, das aus Wasserverteilsystemen für Mensch und Tier, industriellen Anlagen und Kühltürmen entnehmbar ist. 23. Use according to claim 21 or 22 for the study of water as an aquatic system, which is removable from water distribution systems for humans and animals, industrial plants and cooling towers.
24. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22 im medizinischen, chemischen oder biochemischen Bereich zur Untersuchung von Flüssigkeiten als aquatisches System. 24. Use according to claim 21 or 22 in the medical, chemical or biochemical field for the investigation of liquids as an aquatic system.
25. Verwendung nach Anspruch 24, 25. Use according to claim 24,
dadurch gekennzeichnet, dass im medizinischen Bereich Körperflüssigkeiten, vor allem Urin, Liquor, Gallenflüssigkeit, Speichel, Magensaft, Muttermilch, characterized in that in the medical field body fluids, especially urine, cerebrospinal fluid, bile, saliva, gastric juice, breast milk,
Vaginalsekret, Tränenflüssigkeit, Nasensekret, Ejakulat, als aquatisches System untersucht werden. Vaginal secretions, tear fluid, nasal secretions, ejaculate, can be studied as an aquatic system.
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