EP3601342A1 - Antibodies targeting a ligand from an immune checkpoint, with an fc fragment having an improved affinity for cd16a - Google Patents

Antibodies targeting a ligand from an immune checkpoint, with an fc fragment having an improved affinity for cd16a

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EP3601342A1
EP3601342A1 EP18711566.2A EP18711566A EP3601342A1 EP 3601342 A1 EP3601342 A1 EP 3601342A1 EP 18711566 A EP18711566 A EP 18711566A EP 3601342 A1 EP3601342 A1 EP 3601342A1
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EP
European Patent Office
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antibody
mutation
pdl1
mutations
region
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18711566.2A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Céline MONNET
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LFB SA
Original Assignee
LFB SA
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to the immunotherapy of cancers. Technological background of the invention
  • Immunotherapy the therapy of administering exogenous antibodies to patients, is nowadays widely used for the treatment of various pathologies, in particular cancers.
  • CTLA4 Cytotoxic T-lymphocyte Associated antigen 4
  • Nivolumab Opdivo®, Bristol Myers Squibb
  • Pembrolizumab Keytruda®, Merck
  • This monoclonal antibody blocks the PD1 receptor, an inhibitory immune control point present on T lymphocytes, and thus results in the activation of the immune response of said T lymphocyte.
  • Nivolumab blocks the pathway of immune escape of cancer cells by suppressing their action of inhibition of T lymphocytes via their stimulation of the PD1 receptor.
  • Nivolumab appears to exhibit antitumor activity in patients with metastatic renal cell carcinomas (Motzer et al., American Society of Clinical Oncology 33 (13): 1430-1437 (2014)); or
  • LAG3 Lymphocyte Activation Gene 3 (e.g., BMS-986016).
  • LAG3 is an inhibitory immune control point present on T lymphocytes. It is today the target of development of inhibitors, in particular of monoclonal antibodies. In a manner similar to CTLA4 and PD1, the blocking of this receptor would thus make it possible to block its inhibitory effect on the response of the effector cells, and thus activate the immune response.
  • PD1 ligand Programmed Cell Death Protein 1
  • Atezolizumab / Tecentriq is an anti-PDL1 antibody and was approved in May 2016 for the treatment of patients with bladder cancer.
  • This antibody is a IgG1 modified to be aglycosylated, without effector activities.
  • a majority of patients do not respond to these anti-ligand antibody treatments.
  • some patients experience toxicity reactions in the body after treatment. It has been observed, for example, in certain patients that anti-PDL1 antibodies induce autoantibodies in the patient, linked to the appearance of problems, for example cutaneous and hepatic problems. Finally, it has been observed that some patients become resistant to treatment.
  • the present invention thus relates to an antibody directed against at least one immune control point ligand, having a modified Fc region relative to that of a parent antibody, having an improved affinity for the FcgRIIIa (CD16a) receptor and or ADCC activity increased relative to the parent antibody.
  • an antibody is also called "anti-ligand antibody”. It is suitable for use in the treatment of cancer.
  • the invention also relates to an anti-ligand antibody composition, as well as to a pharmaceutical composition comprising at least one antibody according to the invention (anti-immune or anti-ligand control point).
  • Said composition may be suitable for use in the treatment of cancers.
  • the present invention also relates to products containing:
  • an antibody directed against an immune control point ligand or an antibody composition directed against a ligand of an immune control point
  • an antibody to an immune control point having a fragment Fc modified with respect to that of a parent antibody and having improved affinity for the FcRn receptor and optionally functional activity mediated by the decreased Fc region, said immune control point being selected from PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR,
  • the invention further relates to
  • an anti-immune control point antibody for use in the prevention or treatment of cancers in combination with an anti-ligand antibody or an anti-ligand antibody composition
  • an anti-ligand antibody or an anti-ligand antibody composition for use in the prevention or treatment of cancers in combination with an anti-immune control point antibody.
  • Figure 1 shows alignments of native human IgG1 sequences referring to positions 216 to 447 (according to the index UE) with the corresponding sequences of human IgG2 (SEQ ID NO: 7), human IgG3 (SEQ ID NO: 8) and human IgG4 (SEQ ID NO: 9).
  • the IgGI sequences refer to the G1 m1 allotype, 17 (SEQ ID NO: 6) and the G1 m3 allotype (SEQ ID NO: 10).
  • the "lower hinge CH2-CH3" domain of IgGI begins with cysteine 226 (see arrow). The CH2 domain is highlighted in gray and the CH3 domain is italicized.
  • Figure 2 shows the glycan structure of forms GO, GOF, G1 and G1 F.
  • FIG. 3 shows the expression vectors containing the heavy chain (CH) of the anti-PDL1 mutated on the Fc fragment, and the unmodified light chain (CL) of the anti-PDL1 antibody under consideration.
  • Figure 3A illustrates the vectors IGG1 AV-WT and IGG1 D-WT, while Figure 3B illustrates the vectors IGG1 A-WT and pCEP4.
  • IGF1 AV-WT corresponds to the expression vector coding for avelumab
  • IG1 D-WT corresponds to the expression vector coding for durvalumab
  • IG1 A-WT corresponds to the expression vector encoding atezolizumab.
  • the present invention relates to an antibody raised against an immune control point ligand (anti-ligand antibody), having a modified Fc region relative to that of a parent antibody, having an improved affinity for the FcgRIIIa receptor ( CD16a) and / or increased ADCC activity relative to the parent antibody.
  • anti-ligand antibody an immune control point ligand
  • CD16a FcgRIIIa receptor
  • the anti-immune control point ligand antibody allows binding to the target tumor cell.
  • the ligand present on the tumor cells eg PD-L1
  • it allows the recruitment, via the mutated Fc region (which has effector function), of effector immune cells. This results in direct cytotoxicity on the tumor cells.
  • the present invention preferably relates to an antibody directed against a ligand of an immune control point, said antibody having a Fc region mutated by compared to that of a parent antibody, having an improved affinity for the FcgRIIIa receptor (CD16a) and / or an increased ADCC activity relative to the parent antibody, said mutated Fc region comprising at least one combination of 2 mutations as follows: ) a mutation selected from 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M, 421T, 434Y and 434S; and
  • the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii).
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises at least one combination of 2 mutations:
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention may also comprise an additional mutation selected from 361D, 428L, 307A, 382V, 259I, 256N and 383N.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises the combinations of mutations chosen from N315D / A330V / N361 D / A378V / N434Y, N315D / N361D / A378V / N434Y, P230S / N315D / M428IJN434Y, T307A / N315D / A330V / E382V / N389T / N434Y, V259I / N315D / N434Y and
  • the present invention relates to an antibody directed against a ligand of an immune control point, said antibody having a Fc region mutated with respect to that of a parent antibody, having an improved affinity for the FcgRIIIa receptor (CD16a) and / or an ADCC activity increased relative to the parent antibody, said mutated Fc region comprising at least one combination of 2 mutations:
  • the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii).
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises at least one combination of 2 mutations:
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises at least one combination of 2 mutations:
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention may also comprise an additional mutation selected from 333G, 352S, 423Y, 315D, 412M and 366A.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises the combinations of mutations chosen from 248E / 378V, 333G / 378T / 397M, 396IJ421 T / 378V, 396IJ421 T, 316D / 326E / 378V, 298N / 378V, 336T / 378V, 334N / 352S / 397M / 378V, 286I / 378V / 423Y, 315D / 361H / 396L, 231V / 378V, 378T / 397M / 412M, 286Y / 352S / 378V, 290E / 366A / 378V, 286I / 396IJ421 T and 334N / 352S / 397M. More preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises the combination of 334N / 35
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises at least one combination of 2 mutations according to the first embodiment, and at least one combination according to the second embodiment.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises a combination of mutations chosen from N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y, V259I / N315D / N434Y and N315D / N361D / A378V / N434Y, as well as a combination of mutations selected from 248E / 378V, 333G / 378T / 397M, 396IJ421 T / 378V, 396L / 421T, 316D / 326E / 378V, 298N / 378V, 336T / 378V, 334N / 352S / 397M / 378V , 286I / 378V / 423Y, 315D / 361H / 396L, 231V / 378V, 378T / 397M / 412M,
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises a combination of mutations chosen from N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y, V259I / N315D / N434Y, K334N / P352S / V397M / A378V and N315D.
  • / N361 D / A378V / N434Y as well as one of the following mutations: V240M, L242K, L242G, L242F, F243L, E258R, T260A, V262A, K290G, Y296W, S298R or V302R.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises a combination of mutations chosen from N315D / A330V / N361 D / A378V / N434Y, V259I / N315D / N434Y, K334N / P352S / V397M / A378V and N315D / N361.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises a combination of mutations chosen from K334N / P352S / V397M / A378V and N315D / N361 D / A378V / N434Y, as well as at least one of the following mutations Y296W, N434Y, or Y296W / N434Y.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises a combination of mutations chosen from Y296W / K334N / P352S / V397M / A378V, Y296W / N315D / N361D / A378V / N434Y, K334N / P352S / V397M / A378V / N434Y and Y296W / K334N / P352S / V397M / A378V / N434Y.
  • antibody is meant a tetramer made of two heavy chains of 50-70 kDa each (called H chains for Heavy) and two light chains of about 25 kDa each (called chains L for Light) linked by bridges. intra and interchain disulfides and identical to each other.
  • This tetramer comprises at least two variable regions at the N-terminus of each chain (called VL for the light chains and VH for the heavy chains) and a constant region at the C-terminus called Fc, consisting of a single domain said CL for the light chain and three or four domains for the heavy chain called CH1, CH2, CH3 and possibly CH4.
  • Each domain comprises about 1 10 amino acids and is structurally comparable.
  • the 2 heavy chains are linked by disulfide bridges at CH2 and each heavy chain is linked to a light chain by a disulphide bridge between CH1 and CL.
  • the region that determines the specificity of the antibody for the antigen is carried by the variable parts, it is these parts that are responsible for the recognition of the antigen.
  • three loops are pooled to form an antigen binding site.
  • Each of the loops is called a Region Determining Complementarity (or CDR).
  • CDR Region Determining Complementarity
  • FcR Fc receptors
  • the assembly of the chains that make up an antibody makes it possible to define a characteristic three-dimensional structure in Y, where
  • the base of Y corresponds to the constant region Fc, or Fc fragment: it is recognized by the Fc receptors in order to mediate the effector functions of the antibody, and the ends of the arms of Y correspond to the respective assembly of the variable region of a light chain and of the variable region of a heavy chain, said ends constituting the Fab region and determining the specificity of the antibody for the antigen.
  • the light chain group includes two subtypes, lambda and kappa.
  • the kappa and lambda light chains are shared by all classes and subclasses. In humans, the proportion of kappa and lambda produced is in a ratio of 2 to 1.
  • IgG is the most abundant immunoglobulin in serum (75-80% of circulating antibodies). They are present as monomers and have a half-life of 21 days on average.
  • IgG1 for gamma
  • IgG2 for gamma2
  • IgG3 for gamma3
  • IgG4 for gamma4
  • These four subclasses differ in numbers and varying positions of disulfide bridges (Basic and Clinical Immunology, 5th Edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6).
  • the four subclasses of human IgG are also distinguished in their biological activity, despite very homologous structures (more than 95% sequence homology for Fc regions).
  • Antibodies include, but are not limited to, full-length immunoglobulins, monoclonal antibodies, multi-specific antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and fully human antibodies.
  • Fc or "Fc region” or “Fc fragment” refers to the constant region of a full length antibody excluding the first immunoglobulin constant region domain (CH1-CL).
  • Fc refers to the last two domains (CH2 and CH3) of IgG constant region, and to the flexible N-terminal hinge of these domains.
  • the Fc region comprises the CH2 and CH3 domains as well as the lower hinge region between CH1 and CH2.
  • the Fc region corresponds to the residue C226 to its carboxy terminal end, ie the residues of position 226 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • Analogous domains for other IgG subclasses can be determined from aligning the heavy chain or heavy chain amino acid sequences of the IgG subclasses with it with human IgG1 (see Figure 1).
  • the Fc region used may further comprise a portion of the upper hinge region located between positions 216-226 according to the EU index or equivalent in Kabat; in this case, the Fc region used corresponds to the residues of heading 216 to 447, 217 to 447, 218 to 447, 219 to 447, 220 to 447, 221 to 447, 222 to 447, 223 to 447, 224 to 447 or 225 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • the Fc region used corresponds to the residues of position 216 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • the Fc region used is chosen from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and 5.
  • the Fc region of the parent antibody has the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 5 are free of an N-terminal hinge region.
  • sequences represented in SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 and 10 respectively correspond to the sequences represented in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 5 with their hinge regions at the N-terminal.
  • the Fc region of the parent antibody is chosen from the sequences SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 and 10.
  • the Fc region of the parent antibody has a sequence corresponding to positions 1-232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6-232, 7-232, 8-232, 9-232, 10-232 or 1 1 - 232 of the sequence SEQ ID NO: 6.
  • Fv fragment is meant the smallest fragment retaining the binding properties that the antibody possesses. It consists in fact only variable regions of VL light chain and VH heavy chain, so it fixes the antigen with the same affinity as the complete antibody.
  • position is meant a position in the amino acid sequence. For the Fc region, the positions are numbered according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • amino acid or “residue” is meant one of the 20 naturally occurring amino acids or natural analogues.
  • immune control points refers to receptors on the surface of the immune effector cells capable of inhibiting (inhibitory immune control points) or stimulating the immune response (activator immune control points) after engagement with their ligands.
  • the immune control point is preferably selected from GITR, OX40, PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR.
  • activating receptor is meant, in the present invention, a surface receptor which, after interaction with its ligand, causes the triggering of a signaling pathway leading to the activation of the immune response.
  • the activator immune control point is preferably selected from GITR and OX40.
  • GITR also called tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 (TNFRSF18) or activation-inducible TNFR family receptor (AITR)
  • TNFRSF18 tumor necrosis factor receptor superfamily member 18
  • AITR activation-inducible TNFR family receptor
  • OX40 also called CD134 or Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4 (TNFRSF4)
  • TNFRSF4 Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4
  • inhibitory receptor is meant, in the present invention, a surface receptor which, after interaction with its ligand, causes the triggering of a signaling pathway leading to the inactivation of the immune response.
  • the immune control point is inhibitory. More preferentially, it is chosen from PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR.
  • PD1 Programmed Cell Death Factor 1
  • PD1 is an inhibitory receptor of the CD28 family expressed on the surface of activated T and B lymphocytes and Natural Killers. Its role is to limit the activity of effector cells in secondary lymphoid tissues or tumors, thus conferring on it a mechanism of important tumor resistance.
  • PD1 inhibits lymphocyte function when engaged with one of its ligands, PDL1 (or B7-H1 or CD274) or PDL2.
  • PDL1 is a molecule expressed on the surface of tumor cells. In case of chronic exposure to the PDL1 ligand (for example in the case of cancers), the expression of PD1 on the surface of the effector cells is increased, which then causes an anergy phenomenon.
  • Anti-PD1 antibodies are used in the treatment of cancers such as lung cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC), mesothelioma, bladder cancer, colorectal cancer, metastatic colorectal cancer , bladder cancers, breast cancers, head and neck cancers, testicular cancers, breast cancers endometrium, esophageal cancers, thymus cancers, hematological cancers, advanced hematologic cancers such as non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin lymphoma, chronic lymphoid leukemia, multiple melanoma, acute myeloid leukemia, brain tumors, glioblastomas, solid tumors, gastric adenocarcinomas, germ cell tumors, hepatocellular carcinomas, melanomas, metastatic melanomas, lymphomas, diffuse large B cell lymphomas (LDGCB), follicular lymphomas unresectable or metastatic melanomas or advanced renal cell carcinomas.
  • CTLA4 Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4
  • CTLA4 is an inhibitory receptor expressed only on the surface of T lymphocytes. Its role is to regulate the first steps of activation of T lymphocytes. Indeed, 48 hours after activation of T lymphocytes by via their receptor (TCR or T Cell Receptor), CTLA4 engages with its ligands (CD80 or CD86) which are expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs) at the level of the lymph nodes and sometimes tumors . This results in a signaling cascade leading to the inhibition of T lymphocytes.
  • the anti-CTLA4 antibodies are used in the treatment of cancers such as lung cancer, "non-small cell” lung cancers (NSCLC), carcinomas small cell lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, gastric cancer, kidney cancer, neck and head cancer, liver cancer, metastatic and non-metastatic melanoma resectable, cutaneous melanoma with lymph node involvement, renal carcinoma, myeloma, lymphoma, hepatocellular carcinoma, brain metastasis, solid tumors, mesothelioma, lymphoma or melanoma.
  • NSCLC non-small cell lung cancers
  • TIM3 T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3 is a surface-expressed receptor of ⁇ -IFN secretory T cells.
  • One of its ligands is galectin-9, which is a protein overexpressed in tumor cells. The engagement of TIM3 with galectin-9 leads to an inhibition of the immune response.
  • LAG3 lymphocyte activation gene 3
  • MHC II Major Histocompatibility Complex type II
  • APCs antigen presenting agents
  • KIR Killer-cell immunoglobulin-like receptor
  • BTLA1 B and T lymphocyte attenuator
  • CD272 T lymphocyte attenuator
  • HVEM herpesvirus entry mediator
  • A2AR are expressed in different types of effector cells of immunity, especially in T cells, as well as in endothelial cells.
  • a2AR binds to its ligand, adenosine (which accumulates in tumors), CD4 + cells express FOXP3 and thus differentiate into regulatory T cells, which has the effect of inhibiting the immune response.
  • the immune control point ligand is selected from OX40L, PDL1, PDL2, CD80, CD86, galectin-9, MHC II, MHC I, HVEM and adenosine.
  • the immune control point is selected from PD1 and CTLA4. More preferably, the immune control point is PD1.
  • the anti-immune control point antibody according to the invention is an anti-PD1 or anti-CTLA4 antibody. More preferably, the anti-immune control point antibody according to the invention is an anti-PD1 antibody.
  • the ligand is selected from PDL1, PDL2, CD80 and CD86.
  • the ligand is PDL1 or PDL2, preferentially PDL1.
  • the anti-ligand antibody according to the invention is an anti-PDL1, anti-PDL2, anti-CD80 or anti-CD86 antibody.
  • the anti-ligand antibody according to the invention is an anti-PDL1 antibody.
  • the anti-PDL1 antibody according to the invention may comprise a variable region corresponding to the sequence of a Fv fragment of a known anti-PDL1 antibody, for example the atezolizumab antibody, the durvalumab antibody or the avelumab antibody.
  • the anti-PDL1 antibody according to the invention may comprise a variable light chain sequence (VL) and a corresponding heavy chain variable sequence (VH). respectively to the VL and VH sequences of the atezolizumab antibody, the durvalumab antibody, or the avelumab antibody.
  • VH and VL sequences of the atezolizumab antibody are the sequences SEQ ID NO: 1 1 and 12 respectively;
  • sequences VH and VL of the durvalumab antibody are the sequences SEQ ID NO: 13 and 14 respectively;
  • VH and VL sequences of the avelumab antibody are the sequences SEQ ID NOs: 15 and 16 respectively.
  • the anti-PDL1 antibody according to the invention comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 1 1 and a VL of sequence SEQ ID NO: 12.
  • the anti-PDL1 antibody according to the invention comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 13 and a VL of sequence SEQ ID NO: 14.
  • the anti-PDL1 antibody according to the invention comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 15 and a VL of sequence SEQ ID NO: 16.
  • parent antibody is used to define the reference antibody that may be of natural or synthetic origin.
  • the parent antibody comprises a Fc region called "parent Fc region”.
  • Said parent Fc region is selected from the group of wild-type Fc regions and their fragments.
  • wild type or WT wild-type is meant here an amino acid sequence or a nucleotide sequence found in nature that is to say that is of natural origin, including including allelic variations, and which has not been intentionally modified by molecular biology techniques such as by mutagenesis.
  • wild type Fc regions refer in particular to the Fc region of IgGI having the sequence SEQ ID NO: 1 (G1 m1 allotype, 17), the Fc region of IgG2 having the sequence SEQ ID NO : 3, the IgG3 Fc region having the sequence SEQ ID NO: 4, the IgG4 Fc region having the sequence SEQ ID NO: 5, and the IgGI Fc region having the sequence SEQ ID NO: 1 (allotype G1 m3).
  • Wild type Fc regions also refer to the Fc regions corresponding to the sequences SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 10.
  • the parent antibody comprises a parent Fc region which is a human Fc region, preferably an Fc region of a human IgG1 or a human IgG2.
  • the parent antibody may also include preexisting amino acid changes in the Fc region (eg, Fc mutant) relative to wild type Fc regions.
  • immuno effector cells is meant cells that effect the immune mechanism and express an Fc receptor (FcR). Lymphocytes including Natural Killer (NK) cells, macrophages, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, dendritic cells, including Langerhans cells and platelets, are particularly considered as effector cells.
  • NK Natural Killer
  • mutation is meant a change of at least one amino acid of the sequence of a polypeptide, including a change of at least one amino acid in the Fc region of the parent antibody.
  • the antibody obtained then comprises a mutated Fc region relative to that of the parent antibody.
  • the mutation is a substitution, an insertion or a deletion of at least one amino acid at a particular position.
  • the mutated Fc regions may have several mutations, affecting several amino acids, preferably from two to ten.
  • substitution is meant the replacement of an amino acid by another amino acid at a particular position in a sequence of the parent antibody.
  • the 434S substitution refers to a variant (or mutant) antibody, in this case a variant for which an amino acid at position 434 is replaced by serine.
  • the following mutation label is used: "434S” or "N434S”
  • the parent antibody comprises asparagine at position 434, which is replaced by serine in the variant.
  • the preferred format is "2591 / 315D / 434Y” or "V259I / N315D / N434Y”.
  • deletion of amino acids or “deletion” is meant the deletion of an amino acid at a particular position in a sequence of the parent antibody.
  • E294del or 294del refers to the removal of glutamic acid at position 294.
  • amino acid insertion or “insertion” is meant the addition of an amino acid at a particular position in a sequence of the parent antibody.
  • insertion G> 235-236 refers to a glycine insertion between positions 235 and 236.
  • a mutated Fc variant according to the invention can be generated by any well-known mutagenesis method. For example, by overlap PCR using two sets of primers adapted to integrate the targeted mutation (s) with the codon (s) encoding the desired amino acid. Alternatively, the de novo synthesis of genes containing the nucleotide sequence comprising the mutations of interest can be used.
  • the numbering of residues in the Fc region is that of the immunoglobulin heavy chain according to the EU index or equivalent in Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991).
  • EU index or equivalent in Kabat refers to the US numbering of the residues of the human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody. This is illustrated on the IMGT website (http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu IGHGnber.html).
  • the affinity of the mutated Fc region of the antibody according to the invention for the FcgRIIIa receptor (CD16a) is increased relative to that of the parent antibody.
  • this affinity is improved relative to that of the parent antibody, a ratio of at least 2, preferably greater than 5, preferably greater than 10, preferably greater than 15, preferably greater than 20. preferably greater than 25, preferably greater than 30.
  • improved affinity for the FcgRIIIa receptor is meant the increase in the binding affinity, in vivo or in vitro, of the mutated Fc region of the invention for the FcgRIIIa (CD16a) receptor relative to the parent antibody.
  • the FcgRIIIa receptor (CD16a) is involved in ADCC and has a V / F polymorphism at position 158.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention also has a modified affinity compared to that of the parent antibody, for at least one of the following receptors: the complement C1 q, FcgRIla (CD32a) , and FcgRIIb (CD32b).
  • C1 complement q is involved in complement dependent cytotoxicity (CDC) activity.
  • the FcgRIla receptor (CD32a) is involved in platelet activation and phagocytosis; it has an H / R polymorphism at position 131.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention has an increased affinity compared to that of the parent antibody, for at least one of the following receptors: the complement C1 q, FcgRIla (CD32a), and FcgRIIb (CD32b).
  • increased affinity for a receptor is meant the increase in the binding affinity, in vivo or in vitro, of the mutated Fc region of the invention for said receptor relative to the parent antibody.
  • this affinity is improved relative to that of the parent antibody, with a ratio of at least 2, preferably greater than 5, of preferably greater than 10, preferably greater than 15, preferably greater than 20, preferably greater than 25, preferably greater than 30.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention additionally has an affinity for complement C1 greater than that of the parent antibody.
  • the antibody according to the invention has an increased CDC activity compared to that of the parent antibody.
  • the affinity of an antibody for a FcR can be evaluated by methods well known in the art. For example, one skilled in the art can determine affinity (Kd) using surface plasmon resonance (SPR). Alternatively, one skilled in the art can perform an appropriate ELISA test. An appropriate ELISA assay compares the binding forces of the parent Fc and the mutated Fc. The detected signals specific for the mutated Fc and the parent Fc are compared.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising antibodies to an immune control point ligand, having a modified Fc fragment relative to that of a parent antibody, and having improved affinity for CD16a and / or ADCC activity increased relative to the parent antibody, wherein said modified Fc fragments have at their glycosylation site N-glycans, said N-glycans having a fucosylation rate of less than 65%, preferably less than 60%, of preferably less than 55%, preferably less than 50%, more preferably less than 45%, preferably less than 40%, preferably less than 35%, preferably less than 30%, preferably less than 25%, preferably less than 20%.
  • This composition is called "composition according to the invention”.
  • fucosylation rate is meant the ratio of N-glycans present on Fc fragments exhibiting a fucose residue, relative to the total amount of N-glycans of Fc fragments within an antibody composition.
  • said antibody composition comprises a single type of antibody comprising a mutated Fc region.
  • the composition then comprises antibody molecules of identical sequence.
  • the antibody composition according to the invention is weakly fucosylated.
  • weakly fucosylated is meant a composition which comprises antibodies whose Fc fragments have on their glycosylation site (Asn 297) N-glycans having a degree of fucosylation of less than 65%, preferably less than 60%, preferably less than 55%, preferably less than 50%, more preferably less than 45%, preferably less than 40%, preferably less than 35%, preferably less than 30%, preferably less than 25%, preferably less than 20%.
  • Said N-glycans preferably have biantennary-type glycan structures, with short chains and low sialylation.
  • the glycan structure has non-intermediate terminal GIcNAc (N-acetylglucosamine).
  • the glycan structure is chosen from the forms GO, GOF, G1 and G1 F as shown in FIG.
  • said N-glycans have glycan structures of biantenned type, with short chains, low sialylation, non-intermediate terminal GIcNAc.
  • the antibody composition has a sialic acid content of less than 25%, 20%, 15%, or 10%, preferably 5%, 4% 3%, or 2%.
  • sialylation rate is meant the ratio of N-glycans present on Fc fragments having a sialic acid residue, relative to the total amount of N-glycans of Fc fragments within an antibody composition.
  • a preferred antibody composition according to the invention comprises a content greater than 60%, preferably greater than 80% for the forms GO + G1 + GOF + G1 F, it being understood that the content of the forms GOF + G1 F is less than 50%, preferably less than 40%, preferably less than 30%.
  • the N-glycans have a content greater than 60% for the forms G0 + G1 + G0F + G1 F, the fucose content being less than 65%.
  • Antibodies directed against a ligand of an immune control point according to the invention may be prepared by any method well known in the art. Once their coding nucleic acids have been obtained, the antibodies according to the invention may be prepared by any method known in the art.
  • nucleic sequences can be cloned into host cells and then expressed. Nucleic sequences may also be incorporated into an expression vector.
  • suitable host cell lines can be used, including, but not limited to, mammalian cells, bacteria, insect cells, and yeasts.
  • the host cells may be, but not limited to, YB2 / 0 cells (ATCC, CRL-1662), SP2 / 0, YE2 / 0, PERC6, CHO cell lines, in particular CHO-K-1, CHOS, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, COS-7, HEK in particular 293-HEK, BHK, KGH6, NSO, SP2 / O-Ag 14, P3X63Ag8.653, C127, JC, LA7, ZR-45-30, hTERT, NM2C5 or UACC-812.
  • the antibody is expressed in the YB2 / 0 cell.
  • the host cells may be non-human transgenic organism cells, including transgenic animal cells modified to produce the antibody in milk, or alternatively transgenic plant cells modified to produce the antibody.
  • transgenic animal cells modified to produce the antibody in milk the expression of DNA sequences coding for the antibody directed against a ligand of an immune control point according to the invention is controlled by a mammalian casein promoter or a mammalian whey promoter, said promoter not naturally controlling the transcription of said gene, and the DNA sequences further containing a secretion sequence of the protein.
  • the secretion sequence comprises a secretion signal interposed between the coding sequence and the promoter.
  • the animal may for example be selected from sheep, goat, rabbit, sheep or cow.
  • whole anti-PDL1 IgG1 mutants according to the invention can be generated by production in the milk of a transgenic animal, for example a transgenic goat, and purification by extraction of the milk.
  • the coding sequence of the heavy chain and the coding sequence of the light chain are prepared in an expression vector under the control of a promoter specific for the mammary glands, for example a mammalian casein promoter, making it possible to direct the production and secretion of the antibody in the milk of the mammary glands.
  • a promoter specific for the mammary glands for example a mammalian casein promoter
  • the present invention also relates to products (hereinafter “products according to the invention") containing:
  • an antibody raised against an immune control point having a modified Fc fragment relative to that of a parent antibody and having an improved affinity for the FcRn receptor and optionally a functional activity mediated by the decreased Fc region, said immune control being selected from PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR, as combination products for simultaneous, separate or extended use for their use in the prevention or treatment of cancers.
  • This anti-immune control point antibody b) allows in particular the binding to the immune target cell. For example, by binding to the receptor present on T cells infiltrating tumors (eg PD1), it prevents the binding between PD1 (present on T cells) and PDL1 (present on tumor cells). This is called a neutralizing antibody.
  • the anti-immune control point antibody b) has a modified Fc fragment conferring higher affinity for the FcRn receptor.
  • the FcRn receptor corresponding to the "neonatal Fc receptor” is a protein composed of a heavy chain encoded by the FcRn gene (called FCGRT in humans) and a light chain, the 32-microglobulin molecule. It can bind the Fc region of IgG and has the characteristic of increasing the half-life of the IgG that attach to it. FcRn can be found in various organisms including, but not limited to, humans, mice, rats, rabbits and monkeys.
  • high affinity for FcRn is meant the increase in the binding affinity, in vivo or in vitro, of the mutated Fc region of the invention for FcRn, relative to that of the parent antibody.
  • the ability of the mutated Fc region of the invention to bind to a FcRn receptor can be evaluated in vitro by an ELISA assay, as described for example in the patent application WO2010 / 106180.
  • the increase in FcRn binding results in an improvement in serum retention in vivo and, therefore, an increase in half-life.
  • the anti-immune control point antibody b) (which has a higher affinity for the FcRn receptor) comprises at least two mutations, said mutations being chosen from:
  • the anti-immune control point antibody b) has an Fc region comprising at least one combination of mutations selected from 226G / 315D / 434Y, 230S / 315D / 434Y, 230T / 315D / 434Y, 230T / 264E / 434S, 230T / 389T / 434S, 241 IJ264E / 378V, 241L / 264E / 434S, 250A / 389K / 434Y, 2591 / 315D / 434Y, 284E / 378T / 396L, 264E / 378V / 434Y, 345D / 330V / 434Y, 315D / 382V / 434Y and 378V / 383N / 434Y with respect to the Fc region of said parent antibody, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat .
  • the anti-immune control point antibody b) has a Fc region comprising at least one mutation selected from 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E.
  • the anti-immune control point antibody b) has a Fc region comprising a combination of mutations selected from 307A / 315D / 330V / 382V / 389T / 434Y, 256N / 378V / 383N / 434Y, 345D / 330V / 361 D / 378V / 434Y, 2591 / 315D / 434Y, 230S / 315D / 428L / 434Y, 241 IJ264E / 307P / 378V / 433R, 250A / 389K / 434Y, 305A / 315D / 330V / 395A / 343Y, 264E / 386R / 396L / 434S / 439R, 315D / 330V / 362R / 434Y, 294del / 307P / 434Y,
  • the anti-immune control point antibody b) has an Fc region comprising the combinations of mutations chosen from N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y, P230S / N315D / M428IJN434Y,
  • the anti-immune control point antibody b) may have a functional activity mediated by the decreased Fc region, relative to that of the parent antibody.
  • Functional activity mediated by the Fc region means the effector functions mediated by the Fc region. Included in said Fc-region mediated functional activities are antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), endocytosis activity, secretion of cytokines or a combination of at least two of these activities.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCP antibody-dependent cellular phagocytosis
  • endocytosis activity secretion of cytokines or a combination of at least two of these activities.
  • the functional activity mediated by the Fc region considered in the invention is ADCC. This functional activity can be evaluated by methods well known in the art.
  • the functional activity mediated by the Fc region is in particular decreased relative to that of the parent antibody, of a ratio at least equal to 2, preferably greater than 5, preferably greater than 10, preferably greater than 15.
  • the mutated Fc region of antibody b) according to the invention preferably has a decreased affinity for at least one of the Fc region receptors ( FcR) selected from the complement C1 q and the receptors FcgRIIIa (CD16a), FcgRIla (CD32a), and FcgRIIb (CD32b).
  • FcR Fc region receptors
  • the receptors of the Fc region involved are:
  • the FcgRIIIa receptor (CD16a) which is involved in the ADCC and has a V / F polymorphism at position 158,
  • the FcgRIla receptor (CD32a), which is involved in platelet activation and phagocytosis, has an H / R polymorphism at position 131, and
  • the affinity of an antibody for a FcR can be evaluated by methods well known in the art. For example, one skilled in the art can determine affinity (Kd) using surface plasmon resonance (SPR). Alternatively, one skilled in the art can perform an appropriate ELISA test. An appropriate ELISA assay makes it possible to compare binding forces of the parent Fc and the mutated Fc. The detected signals specific for the mutated Fc and the parent Fc are compared.
  • the anti-immune control point antibody b When the anti-immune control point antibody b) exhibits a functional activity mediated by the decreased Fc region, it allows the neutralization of the binding between the control point and its ligand (for example PD1 and PDL1), without presenting any effector activity. It thus allows the blocking of the immune control point.
  • its ligand for example PD1 and PDL1
  • the anti-immune control point antibody b) has a Fc region having at least the del294 mutation.
  • the anti-immune control point antibody b) is aglycosylated.
  • it can be mutated on asparagine 297 by an amino acid preventing glycosylation, such as alanine.
  • the anti-immune control point antibody b) has a mutated Fc region having the N297A mutation relative to the parent antibody.
  • the products according to the invention contain:
  • an antibody directed against PD1 having a modified Fc fragment relative to that of a parent antibody and having an improved affinity for the FcRn receptor and optionally a functional activity mediated by the decreased Fc region,
  • the antibody directed against PD1 (antibody b) is as described above and preferably has at least the del294 mutation.
  • the anti-immune control point antibody b) when the anti-immune control point antibody b) is an anti-PD1 antibody, it comprises a variable region corresponding to the sequence of a Fv fragment of a known anti-PD1 antibody, for example the antibody nivolumab or the pembrolizumab antibody.
  • the anti-PD1 antibody according to the invention may comprise a variable light chain sequence (VL) and a heavy chain variable sequence (VH) respectively corresponding to the VL and VH sequences of the nivolumab antibody or of the antibody pembrolizumab.
  • sequences VH and VL of the nivolumab antibody are the sequences SEQ ID NOs: 17 and 18 respectively;
  • VH and VL sequences of the pembrolizumab antibody are the sequences SEQ ID NO: 19 and 20 respectively.
  • the anti-PD1 antibody according to the invention comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 17 and a VL of sequence SEQ ID NO: 18.
  • the anti-PD1 antibody according to the invention comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 19 and a VL of sequence SEQ ID NO: 20.
  • the invention also relates to a method of treating cancers, which comprises administering to a patient an anti-ligand antibody (preferably anti-PDL1) according to the invention, or a composition according to the invention (of preferably an anti-PDL1 antibody composition).
  • Any route of administration is contemplated, including parenteral routes, such as the intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, topical, or mucosal route, for example by inhalation. Enteral (oral, rectal) and intrathecal routes are also possible.
  • the intravenous route is used.
  • the antibodies according to the invention are generally formulated in pharmaceutical compositions comprising pharmaceutically acceptable excipients.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising (i) at least one anti-immune control point antibody according to the invention, or a composition according to the invention, or products according to the invention and (ii) at least a pharmaceutically acceptable excipient.
  • composition a composition having curative or preventive properties with regard to human or animal diseases.
  • the subject of the invention is also the use of an anti-ligand antibody (preferably anti-PDL1) according to the invention, or a composition according to the invention (preferably anti-PDL1 antibodies), or of products according to the invention, or a pharmaceutical composition as described in the preceding paragraph, for treating cancers.
  • an anti-ligand antibody preferably anti-PDL1
  • a composition according to the invention preferably anti-PDL1 antibodies
  • products according to the invention or a pharmaceutical composition as described in the preceding paragraph, for treating cancers.
  • the pharmaceutical compositions may be in any suitable dosage form depending on the chosen route of administration.
  • they contain a pharmaceutically acceptable excipient for a formulation that can be injected.
  • a pharmaceutically acceptable excipient for a formulation that can be injected. It may be in particular isotonic formulas, sterile, saline solutions, or freeze-dried compositions, which, during the addition of sterilized water or physiological saline as appropriate, allow the constitution of injectable solutions.
  • compositions suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions, oily formulations, and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions.
  • the form must be sterile and must be fluid to the extent that it must be injected by syringe. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms, such as bacteria and fungi.
  • the dispersions according to the invention can be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols or mixtures thereof, or in oils. Under normal conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.
  • the pharmaceutically acceptable excipient may be a solvent or dispersion medium.
  • the proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a surfactant.
  • Prevention of the action of microorganisms can be caused by various antibacterial and antifungal agents. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents. Prolonged absorption of the injectable compositions can be caused by the use in the compositions of agents delaying absorption.
  • Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active ingredients in the required amount in the appropriate solvent with several of the other ingredients listed above, if appropriate, followed by sterilization by filtration.
  • the dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile excipient that contains the basic dispersion medium and the other required ingredients from those enumerated above.
  • the preferred methods of preparation are vacuum drying and lyophilization.
  • the solutions will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in a therapeutically effective amount.
  • the formulations are easily administered in a variety of dosage forms, such as the injectable solutions described above, but drug release capsules and the like can also be used.
  • aqueous solutions For parenteral administration in an aqueous solution for example, the solution must be suitably buffered and the liquid diluent rendered isotonic with enough saline or glucose.
  • aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration.
  • sterile aqueous media that can be used are known to those skilled in the art.
  • the level of therapeutically effective dose specific for a particular patient will depend on a variety of factors, including the disorder being treated and the severity of the disease, the activity of the specific compound employed, the specific composition used, the age, the body weight, general health, sex and diet of the patient, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion of the specific compound used, the duration of treatment, or the drugs used in parallel.
  • the immune system normally recognizes tumor cells as foreign elements, which results in an anti-tumor immune response.
  • cancer cells put in place escape strategies to the immune system; they are no longer recognized or eliminated by the immune system.
  • the immune control points expressed on the surface of the effector cells of immunity constitute an important route of tumor escape. Indeed, these molecules, when they are inhibitory (which is the case for example for PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, KIR, BTLA1 and a2AR), have the function of attenuating the immune response when they are engaged with their ligands that are often expressed by tumor cells.
  • cancer any physiological condition characterized by abnormal cell proliferation.
  • the antibodies according to the invention, the compositions according to the invention, the products and the pharmaceutical composition according to the invention are thus used to treat different types of cancer.
  • cancers include non-small cell lung cancer (NSCLC), unresectable or metastatic melanoma, advanced renal cell carcinoma, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, cancer lung cancer, lymphoma, mesothelioma, colorectal cancer, metastatic colorectal cancer, breast cancer, gastric cancer, head and neck cancer, brain tumors, glioblastoma, solid tumors, cancer of the endometrium, esophageal cancers, gastric adenocarcinomas, germ cell tumors, testicular cancer, hepatocellular carcinoma, thymus cancer, diffuse large B-cell lymphoma (CBGLD), hematologic malignancies, advanced hematologic malignancies (such as non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin's lymphoma, chronic lymphoid leukemia
  • Each mutation of interest in the Fc fragment was inserted independently into an expression vector containing the anti-PDL1 heavy chain (containing the variable portion of the anti-PDL1 antibody atezolizumab, durvalumab or avelumab, and the region constant part).
  • Fc wild-type by overlap PCR using two sets of primers adapted to integrate the targeted mutation (s) with the codon (s) encoding the desired amino acid.
  • the mutations to be inserted are close to the Fc sequence, they are added via the same oligonucleotide.
  • the fragments thus obtained by PCR were combined and the resulting fragment was amplified by PCR using standard protocols.
  • the PCR product containing the entire heavy chain of anti-PDL1 mutated on the Fc fragment, was purified on 1% agarose gel (w / v), digested with the appropriate restriction enzymes and cloned into the vector.
  • expression eukaryote (HK-Gen EFSS, see Figure 3) which also contains the unmodified light chain of the anti-PDL1 antibody considered.
  • Fc variants can be prepared in an entire IgG1 format in the YB2 / 0 cell line (ATCC, CRL-1662) with anti-PDL1 specificity.
  • the steps of production by cell culture and purification of the antibodies can be carried out according to the techniques described in Example 1 of the application WO2001 / 77181 in order to produce and select antibodies characterized by a low fucosylation rate at their site of Asn 297 glycosylation on Fc.
  • the mutants may contain mutations of the variant T5A-74, C6A-74, or T5A-74A as shown in Table 1 and the mutations of a variant listed in Table 2.
  • the mutants may contain mutations of the variant T5A-74, C6A-74, or T5A-74A as shown in Table 1 and one of the following mutations: V240M, L242K, L242G, L242F, F243L, E258R, T260A , V262A, K290G, Y296W, S298R or V302R.
  • the Fc variants produced by site-directed mutagenesis according to the method of Example 1-A, can be prepared in an entire IgG1 format in a CHOS cell line (HK-Gen EFSS bicistronic vector) or HEK (using the monocistronic pCEP4 vector, a vector containing the light chain and the other similar vector containing the mutated heavy chain, see Figure 3) with anti-PDL1 specificity.
  • the steps of production by cell culture and purification of the antibodies can be carried out according to well known techniques and for example described in application WO2016 / 177984 (example 2.6 in HEK).
  • 2-2 Production of variants in the form of whole Ig in transgenic animal milk
  • the mutated anti-PDL1 whole IgG1 can also be generated by production in the milk of a transgenic animal, for example a transgenic goat, and purification by extraction of the milk.
  • the coding sequence of the heavy chain and the coding sequence of the light chain are prepared in an expression vector under the control of a promoter specific for the mammary glands, for example a mammalian casein promoter, making it possible to direct the production and secretion of the antibody in the milk of the mammary glands.
  • a promoter specific for the mammary glands for example a mammalian casein promoter
  • Example 3A Methods for characterizing FcqRIIa binding, antigenic binding and FcRn binding of IqGI anti-PDL1 variants according to the invention
  • the anti-PDL1 IgGI parent solutions or each anti-PDL1 IgG1 variant are added to each well with a final concentration of 1.25 ⁇ g of IgG / ml for FcRn or 0.25 ⁇ g of IgG / ml for other receptors, for 1 hour at 37 ° C, and then contacted with F (ab ') 2 IgG HRP goat anti-human for 1 h at 37 ° C.
  • the IgG1 bound are detected after revelation at TMB by measuring the absorbance at 450 nm.
  • FcgRIIIa CD16a
  • FcgRIlaH / R CD32aH / R
  • FcgRIIb CD32b
  • FcgRI CD64
  • Maxisorp or NiNTA immunoplates are coated with FcgRI NaV / F, FcgRI laH / R, FcgRIIb or FcgRI and saturated with 4% PBS-BSA.
  • the parent anti-PDL1 IgGI solutions or each anti-PDL1 IgG1 variant with a final concentration of 0 ⁇ g IgG / ml are contacted with goat IgG HRP F (ab ') 2's. antihuman at the same concentration for 2 hours at room temperature, with gentle agitation.
  • IgG aggregated with F (ab ') 2 are then incubated with gentle shaking for 1 hour at 30 ° C on ELISA plates saturated for FcgR. The plates are then revealed with TMB (Pierce) and the absorbances are read at 450 nm.
  • the variants of Fc C6A 74 and T5A 74A comprising the variable portion of durvalumab or atezolizurnab (respectively respectively, the respective VH and VL sequences of the durvalumab antibody are the sequences SEQ ID NO: 13 and 14, and the sequences Respective VH and VL of the atezolizumab antibody are the sequences SEQ ID NO: 11 and 12), were produced in YB2 / 0 or in CHO as in Example 1:
  • the reference checks consist of:
  • N297A the aglycosylated Fc comprising the N297A mutation
  • Fc-FES i.e. including the 3 L234F / L235E / P331 S mutations.
  • variants produced in YB2 / 0 cells show increased binding to hCD16aV and hCD16aF compared to their respective parent WT produced in CHO cells.
  • variants produced in YB2 / 0 cells show increased binding to hCD16aV and hCD16aF compared to their respective parent WT produced in CHO cells.
  • - C6A 74 has an equivalent or slightly diminished binding to hCD16aV and hCD16aF compared to the parent WT, all the way forward to a strongly increased FcRn binding;
  • T5A 74A has an equivalent uptake to hCD16aV, and slightly increased to hCD16aF, all the while leading to a strongly increased FcRn binding.
  • Example 3B Methods for characterizing FcqRIIa binding, antigenic binding and FcRn binding of other variants of IqGI anti-PDL1 according to the invention
  • Example 3A The same tests as those described in Example 3A were carried out for the following variants, comprising the variable portion of durvalumab (i.e. with respective VH and VL sequences SEQ ID NO: 13 and 14), and produced in CHO cells:
  • the parent antibody durvalumab Fc-WT was produced in CHO cells.
  • All anti-PD-L1 antibodies show strong binding to human PD-L1, and no binding to murine PD-L1.
  • the set of Durvalumab variants (the C6A-74, T5A-74 and A3A-184 variants) has an increased equivalent binding for FcRn compared to Fc-WT.
  • Durvalumab variants of A3A-184 format have the best affinity for hCD64, followed by variants of T5A-74 format, and finally to a lesser extent by C6A-74 variants.
  • Durvalumab A3A-184E and A3A-184EY variants show an equivalent and augmented binding for hCD16aF. They represent the best variants.
  • Durvalumab variants T5A-74MA, T5A-74AG, A3A-184A, A3A-184AY show increased binding for hCD16aF compared to Fc-WT produced in CHO cells.
  • Durvalumab variants C6A-74, C6A-74W, C6A-74G and T5A-74A compared to Fc-WT produced in CHO cells show a binding equivalent to hCD16aF.
  • Durvalumab A3A-184E, A3A-184EY, A3A-184A, A3A-184AY and T5A-74MA variants show increased equivalent binding for hCD16aV compared to Fc-WT.
  • the Durvalumab C6A-74W, C6A-74G, T5A-74A and T5A-74AG variants show increased binding to hCD16aV compared to Fc-WT.
  • the Durvalumab A3A-184AG and C6A-74 variants compared to Fc-WT produced in CHO cells has a binding equivalent to hCD16aV.
  • the Durvalumab A3A-184A, A3A-184AY, A3A-184E, T5A-74AG and A3A-184EY variants show a slightly increased binding to hCD32aH compared to Fc-WT.
  • All Durvalumab variants advantageously show a conserved hCD32aR binding compared to Fc-WT.
  • variants A3A-184E and A3A-184EY appear to be the best candidates with the strongest binding to hFcRn and hCD16aF / V.
  • variants A3A-184AY and T5A-74MA appear to be very good candidates also with good binding to hFcRn and hCD16aF / V.
  • These four variants show strong hCD64 binding and good hCD32aH binding.
  • these four variants can advantageously be used in the context of cancer treatment with an anti-PDL1.
  • Example 3C Method for Characterizing Half-Life Pharmacokinetic experiments were also performed in hFcRn mice which are homozygous KO for a murine FcRn allele and heterozygous for a human FcRn transgene (m FcRn hFcRnTg), in order to evaluate the half-life of atezolizumab variants (ie with respective VH and VL sequences SEQ ID No. 1 1 and 12) with Fc C6A T5A 74 or 74A according to the invention.
  • m FcRn hFcRnTg human FcRn transgene
  • each animal received a single intravenous injection of 5 mg / kg IgG at the retro-orbital sinus, in a protocol similar to that previously described (Petkova SB, et al., Enhanced half-life of genetically engineered human IgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease (Int Immunol 2006).
  • the half-life is calculated from the plasma concentrations measured during the elimination phase.
  • the half-life time can thus be obtained:
  • T1 / 2 (Ln2 x Vd) / CL, with
  • the MRT or the average residence time can be estimated. It reflects the duration of presence of the variant in the body.
  • the MRT can be obtained as follows:
  • AUC time 0 of the plasma concentration versus time curve
  • AUMC first order moment of the plasma concentration versus time curve.
  • Blood samples were taken from the retro-orbital sinus at multiple time points and IgGs titrated by ELISA.
  • Tmax maximum plasma concentration
  • AUCinf Area under the time / plasma concentration curve from T0 to infinity
  • Atezolizumab variants C6A 74 and T5A 74A show an increase in their half-life of more than 2 and 3 times compared to the parent WT respectively.
  • Atezolizumab variants C6A 74 and T5A 74A show an increase in mean residence time of more than 2 and 3 times compared to the parent WT, respectively.
  • Example 4A Methods Using Human Tumor Eukaryotic Cells as Target
  • NK cells are incubated with human tumor eukaryotic cells (such as lines A431 and A549) expressing PDL1, in the presence of different concentrations (0.005 to 5000 ng / ml) of parental anti-PDL1 IgG1 or each anti-PDL1 variant. PDL1.
  • the level of intracellular lactate dehydrogenase (LDH) released by the lysed target cells is measured.
  • Human NK cells are purified from peripheral blood of healthy volunteer donors by the negative depletion technique developed by Miltenyi.
  • the ADCC test involves the incubation of NK cells with target eukaryotic cells expressing the PDL1 antigen, in the presence of different concentrations of anti-PDL1 antibodies. After 16 hours of incubation, the cytotoxicity induced by the anti-PDL1 antibodies is measured by quantifying in cell supernatants the intracellular LDH released by the lysed target cells.
  • This method can be effectively used to evaluate the increase in ADCC activity of the antibodies selected in the present application.
  • Example 4B Activation test of Jurkat cells stably expressing the CD16 receptor on the surface (Jurkat-CD16), by anti-PDL1 antibodies, in the presence of target cells expressing PDL1 Secretion of IL-2 by Jurkat-CD16 cells in the presence of an antibody composition is known to be correlated to ADCC activity via FCYRI II (CD16) (see WO2004024768, page 3 lines 12/18, page 4 line 29 to page 5 line 2, page 8 lines 25 - 29, and especially Example 2 pages 14-15 and Figure 10).
  • the same antibodies and reference controls as those of Example 3A were characterized for their activation of Jurkat-CD16 cells, by measuring the secretion of IL-2.
  • Target cells K1 PD-L1 APC / CHO (25,000 cells / well in 50 ⁇ l) were incubated with 50 ⁇ l of increasing concentrations of anti-PDL1 antibody (0 to 1250 ng / ml final) in the presence of 50 ⁇ of Jurkat-hCD16aF cells (250,000 cells / well) and 50 ⁇ l of PMA (Phorbol-Myristate Acetate) at a final concentration of 10 ng / ml.
  • PMA Phorbol-Myristate Acetate
  • IL-2 released by Jurkat-CD16 was measured by colorimetry (for example RD System DuoSet Kit IL-2: Ref DY202-05). The data are expressed in IL-2 concentration in ⁇ g / ml.
  • the atezolizumab and durvalumab variants C6A 74 and T5A 74A allow an induction of IL-2, and thus an ADCC activity via CD16 at least equivalent to that of Fc-WT produced in YB2 / 0 corresponding, and greatly increased compared to to that of Fc-WT produced in CHO.
  • the atezolizumab and durvalumab variants produced in YB2 / 0 have a much higher activity than the reference variant atezolizumab N297A CHO and durvalumab Fc-FES CHO respectively.
  • EXAMPLE 5 Anti-tumoral effect of the IqGI anti-PDL1 variants according to US Pat.
  • An in vivo tumor model can be used to analyze the effect of anti-PDL1 variants on animal survival.
  • C57BL / 6 nude mice receive intravenous injections of C4198-GFP leukemic cells. The mice are then separated into 3 groups. On days 1, 4 and 7, the mice are treated with PBS (vehicle) or with 10 mg / kg of parent anti-PDL1 IgGI (reference) or anti-PDL1 variant at 200 ⁇ by intraperitoneal injection. The mice are observed twice a week throughout the duration of the study (76 days) and in the long term, the survival rate of the mice is measured. This protocol can thus make it possible to confirm, in vivo, the advantage of using a modified anti-PDL1 antibody to exhibit CD16a binding and / or an improved ADCC activity, compared to an unmodified parent antibody.
  • HTM humanized mouse model
  • anti-PDL1 variants as described in Examples 1 or 2
  • anti-PD1 ie variant del294 or N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y or E294del / T307P / N434Y or V259I / N315D / N434Y or V259l / E294Del / N315D / N434Y or N297A, especially including VH and VL nivolumab or pembrolizumab as described in the description above) on the survival of animals.
  • This model is characterized by the development of a mature human immune system and the growth of human cancer cells that have been previously co-transplanted with human hematopoietic stem cells.
  • NOD-scid IL2Rvnull (NSG) mice can be obtained, for example from Jackson Laboratories, and then housed in a specialized facility without pathogen. Neonates will be irradiated (1 Gy) during their first 48 hours of life and 3 hours later transplanted by intrahepatic injection with 2.5x10 5 human CD34 + cells isolated from umbilical cord blood (CB) in the presence of 3x10 6 C4198-Luc tumor cells (expressing luciferase for bioluminescence monitoring).
  • CB umbilical cord blood
  • the monitoring of the effectiveness of the treatment is carried out in bioluminescence, the survival of the animals as well as the survival in the absence of tumors are monitored. Blood samples are taken during the study to ensure the effectiveness of the combination of antibodies on survival.

Abstract

The invention relates to an antibody targeting at least one ligand from an immune checkpoint, having a region Fc that is mutated in relation to that of a parent antibody and has an improved affinity for the receptor FcgRIIIa (CD16a) and/or a higher ADCC activity than the parent antibody.

Description

Anticorps pour le traitement de cancers  Antibodies for the treatment of cancers
La présente invention concerne l'immunothérapie de cancers. Arrière-plan technologique de l'invention The present invention relates to the immunotherapy of cancers. Technological background of the invention
L'immunothérapie, thérapie consistant à administrer à des patients des anticorps exogènes, est aujourd'hui largement utilisée pour le traitement de diverses pathologies, notamment des cancers.  Immunotherapy, the therapy of administering exogenous antibodies to patients, is nowadays widely used for the treatment of various pathologies, in particular cancers.
Au cours des dernières années, les connaissances concernant la biologie et l'immunologie des cancers n'ont cessé d'évoluer. Il est désormais reconnu que le système immunitaire est impliqué dans les réponses anti-tumorales notamment par reconnaissance des cellules cancéreuses par les cellules immunitaires. Cette reconnaissance peut avoir pour conséquence un contrôle, voire une élimination tumorale. Cependant, les cellules effectrices de l'immunité possèdent à leur surface des récepteurs appelés points de contrôle immunitaires. Ces récepteurs ont pour but de moduler (inhiber ou activer) la réponse immunitaire notamment, pour maintenir la tolérance du soi. Il est à présent connu que les cellules cancéreuses empruntent ce mécanisme d'échappement pour résister au système immunitaire, notamment en exprimant à leur surface des ligands des récepteurs desdits points de contrôle immunitaires qui entraîneront une inhibition de la réponse de la cellule effectrice immunitaire lors de leur reconnaissance par celle-ci (Pardoll et al., Nat. Rev. Cancer. 12 :252-264 (2012)). Une nouvelle approche de l'immunothérapie contre les cancers est alors née pour contre-attaquer ce phénomène d'échappement immunitaire en rétablissant la réponse immunitaire et donc le rejet tumoral. Ainsi, depuis quelques années, des anticorps dirigés contre ces points de contrôle immunitaires sont développés. Les principaux anticorps commercialisés ou en développement visent :  In recent years, knowledge about the biology and immunology of cancer has continued to evolve. It is now recognized that the immune system is involved in anti-tumor responses including the recognition of cancer cells by immune cells. This recognition may result in control or even tumor elimination. However, the effector cells of immunity have on their surface receptors called immune control points. These receptors aim to modulate (inhibit or activate) the immune response in particular, to maintain self tolerance. It is now known that cancer cells use this escape mechanism to resist the immune system, in particular by expressing on their surface ligands receptors of said immune control points which will cause an inhibition of the immune effector cell response when their recognition by it (Pardoll et al., Nat Rev. Cancer 12: 252-264 (2012)). A new approach to immunotherapy against cancer was then born to counter-attack this immune escape phenomenon by restoring the immune response and therefore the tumor rejection. Thus, in recent years, antibodies against these immune control points are developed. The main antibodies marketed or under development are:
- Cytotoxic T-Lymphocyte Associated antigen 4 (CTLA4) : cela est le cas de l'Ipilimumab (Yervoy®, Bristol Myers Squibb). Cet anticorps monoclonal entraîne le blocage du récepteur CTLA4, point de contrôle immunitaire inhibiteur présent sur les lymphocytes T, et a ainsi pour conséquence l'activation de la réponse immunitaire dudit lymphocyte T. En d'autres termes, l'Ipilimumab bloque la voie d'échappement immunitaire des cellules cancéreuses en supprimant leur action d'inhibition des lymphocytes T via leur stimulation du récepteur CTLA4. Une étude clinique a permis de mettre en évidence pour la première fois que des patients atteints de mélanomes métastatiques traités avec un anticorps anti-CTLA4 - Cytotoxic T-lymphocyte Associated antigen 4 (CTLA4): this is the case of Ipilimumab (Yervoy®, Bristol Myers Squibb). This monoclonal antibody blocks the CTLA4 receptor, an inhibitory immune control point present on T lymphocytes, and thus results in the activation of the immune response of said T lymphocyte. In other words, Ipilimumab blocks the immune escape of cancer cells by suppressing their T-cell blocking action via their CTLA4 receptor stimulation. Clinical study found for the first time that patients with metastatic melanoma treated with anti-CTLA4 antibody
(Ipilimumab), voient leur durée de vie augmentée (Hodi et al., N Engl. J. Med., 363 71 1 -723 (2010) et 363 :1290 (2010) (erratum) ; Robert et al., N Engl. J. Med.,364 :2517-2526 (201 1 )) ; (Ipilimumab), have increased their lifespan (Hodi et al., N Engl J. Med. 363 71 1 -723 (2010) and 363: 1290 (2010) (erratum); Robert et al., N Engl. J. Med., 364: 2517-2526 (201 1));
- Programmed Cell Death Protein 1 (PD1 ): cela est le cas du Nivolumab (Opdivo®, Bristol Myers Squibb) et du Pembrolizumab (Keytruda®, Merck). Cet anticorps monoclonal entraîne le blocage du récepteur PD1 , point de contrôle immunitaire inhibiteur présent sur les lymphocytes T, et a ainsi pour conséquence l'activation de la réponse immunitaire dudit lymphocyte T. En d'autres termes, le Nivolumab bloque la voie d'échappement immunitaire des cellules cancéreuses en supprimant leur action d'inhibition des lymphocytes T via leur stimulation du récepteur PD1 . Le Nivolumab semble notamment présenter une activité antitumorale chez des patients dans le cas de carcinomes à cellules rénales métastatiques (Motzer et al., American Society of Clinical Oncology 33 (13) : 1430- 1437 (2014)) ; ou  - Programmed Cell Death Protein 1 (PD1): this is the case of Nivolumab (Opdivo®, Bristol Myers Squibb) and Pembrolizumab (Keytruda®, Merck). This monoclonal antibody blocks the PD1 receptor, an inhibitory immune control point present on T lymphocytes, and thus results in the activation of the immune response of said T lymphocyte. In other words, Nivolumab blocks the pathway of immune escape of cancer cells by suppressing their action of inhibition of T lymphocytes via their stimulation of the PD1 receptor. In particular, Nivolumab appears to exhibit antitumor activity in patients with metastatic renal cell carcinomas (Motzer et al., American Society of Clinical Oncology 33 (13): 1430-1437 (2014)); or
- Lymphocyte Activation Gene 3 (LAG3) (e.g., BMS-986016). LAG3 est un point de contrôle immunitaire inhibiteur présent sur les lymphocytes T. C'est aujourd'hui la cible de développement d'inhibiteurs, notamment d'anticorps monoclonaux. De façon similaire à CTLA4 et PD1 , le blocage de ce récepteur permettrait ainsi de bloquer son effet inhibiteur de la réponse des cellules effectrices, et ainsi activer la réponse immunitaire.  Lymphocyte Activation Gene 3 (LAG3) (e.g., BMS-986016). LAG3 is an inhibitory immune control point present on T lymphocytes. It is today the target of development of inhibitors, in particular of monoclonal antibodies. In a manner similar to CTLA4 and PD1, the blocking of this receptor would thus make it possible to block its inhibitory effect on the response of the effector cells, and thus activate the immune response.
Plus récemment, des anticorps dirigés contre des ligands de points de contrôle immunitaires ont été développés. Les principaux anticorps commercialisés ou en développement visent le ligand de PD1 (Programmed Cell Death Protein 1 ) présent sur les cellules présentatrices d'antigène, et les cellules tumorales. Par exemple, Atezolizumab/Tecentriq (Genentech/Roche) est un anticorps anti-PDL1 et a été approuvé en mai 2016 pour le traitement de patients ayant développé un cancer de la vessie. Cet anticorps est un lgG1 modifié pour être aglycosylé, sans activités effectrices. Néanmoins à ce jour, une majorité de patients ne répond pas ou peu à ces traitements par anticorps anti-ligand de points de contrôle. De plus, certains patients font face à des réactions de toxicité dans l'organisme après administration du traitement. Il a été par exemple observé chez certains patients, que les anticorps anti-PDL1 induisent des auto-anticorps chez le patient, liés à l'apparition de problèmes par exemple cutanés et hépatiques. Enfin, il a été observé que certains patients deviennent résistants au traitement. More recently, antibodies to immune control point ligands have been developed. The main commercialized or developing antibodies target PD1 ligand (Programmed Cell Death Protein 1) present on antigen-presenting cells and tumor cells. For example, Atezolizumab / Tecentriq (Genentech / Roche) is an anti-PDL1 antibody and was approved in May 2016 for the treatment of patients with bladder cancer. This antibody is a IgG1 modified to be aglycosylated, without effector activities. Nevertheless, to date, a majority of patients do not respond to these anti-ligand antibody treatments. In addition, some patients experience toxicity reactions in the body after treatment. It has been observed, for example, in certain patients that anti-PDL1 antibodies induce autoantibodies in the patient, linked to the appearance of problems, for example cutaneous and hepatic problems. Finally, it has been observed that some patients become resistant to treatment.
Il existe aujourd'hui un besoin d'optimiser les approches d'immunothérapie utilisées pour bloquer ces points de contrôle immunitaire, ceci notamment pour obtenir un effet clinique plus efficace et/ou moins toxique. En particulier, il existe un besoin d'obtenir des anticorps dirigés contre un ligand de point de contrôle immunitaire, possédant des propriétés effectrices améliorées, et présentant avantageusement une demi-vie améliorée dans l'organisme permettant un effet prolongé anti-tumoral, tout en étant bien tolérés par l'organisme. Notamment, de tels anticorps à demi-vie améliorée peuvent être avantageusement administrés en plus faible dose, avec la même efficacité ou une efficacité supérieure, ce qui permet de limiter les effets secondaires observés chez certains patients. There is now a need to optimize the immunotherapy approaches used to block these immune control points, in particular to obtain a more effective and / or less toxic clinical effect. In particular, there is a need to obtain antibodies directed against an immune control point ligand, having improved effector properties, and advantageously having an improved half-life in the body allowing a prolonged anti-tumor effect, while being well tolerated by the body. In particular, such improved half-life antibodies can advantageously be administered in lower doses, with the same efficacy or higher efficacy, which makes it possible to limit the side effects observed in certain patients.
Résumé de l'invention Summary of the invention
La présente invention se rapporte ainsi à un anticorps dirigé contre au moins un ligand d'un point de contrôle immunitaire, possédant une région Fc modifiée par rapport à celle d'un anticorps parent, ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l'anticorps parent. Un tel anticorps est appelé aussi « anticorps anti-ligand ». Il est adapté pour une utilisation dans le traitement d'un cancer. The present invention thus relates to an antibody directed against at least one immune control point ligand, having a modified Fc region relative to that of a parent antibody, having an improved affinity for the FcgRIIIa (CD16a) receptor and or ADCC activity increased relative to the parent antibody. Such an antibody is also called "anti-ligand antibody". It is suitable for use in the treatment of cancer.
L'invention se rapporte également à une composition d'anticorps anti-ligand, ainsi qu'à une composition pharmaceutique comprenant au moins un anticorps selon l'invention (anti-point de contrôle immunitaire ou anti-ligand). Ladite composition peut convenir pour une utilisation dans le traitement de cancers. The invention also relates to an anti-ligand antibody composition, as well as to a pharmaceutical composition comprising at least one antibody according to the invention (anti-immune or anti-ligand control point). Said composition may be suitable for use in the treatment of cancers.
La présente invention se rapporte également à des produits contenant : The present invention also relates to products containing:
a) un anticorps dirigé contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire, ou une composition d'anticorps dirigés contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire, et b) un anticorps dirigé contre un point de contrôle immunitaire, possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d'un anticorps parent et ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcRn et optionnellement une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, ledit point de contrôle immunitaire étant choisi parmi PD1 , CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 et a2AR, a) an antibody directed against an immune control point ligand, or an antibody composition directed against a ligand of an immune control point, and b) an antibody to an immune control point, having a fragment Fc modified with respect to that of a parent antibody and having improved affinity for the FcRn receptor and optionally functional activity mediated by the decreased Fc region, said immune control point being selected from PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR,
comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers. as combination products for simultaneous, separate or extended use for their use in the prevention or treatment of cancers.
L'invention concerne encore : The invention further relates to
un anticorps anti-point de contrôle immunitaire pour son utilisation pour la prévention ou le traitement de cancers en combinaison avec un anticorps anti-ligand ou une composition d'anticorps anti-ligand; et un anticorps anti-ligand ou une composition d'anticorps anti-ligand, pour son utilisation pour la prévention ou le traitement de cancers en combinaison avec un anticorps anti-point de contrôle immunitaire. Légende des figures an anti-immune control point antibody for use in the prevention or treatment of cancers in combination with an anti-ligand antibody or an anti-ligand antibody composition; and an anti-ligand antibody or an anti-ligand antibody composition for use in the prevention or treatment of cancers in combination with an anti-immune control point antibody. Legend of figures
La figure 1 montre des alignements de séquences d'IgGI humaine native se référant aux positions 216 à 447 (selon l'indice UE) avec les séquences correspondantes d'lgG2 humaine (SEQ ID NO: 7), lgG3 humaine (SEQ ID NO: 8) et lgG4 humaine (SEQ ID NO: 9). Les séquences d'IgGI se réfèrent à l'allotype G1 m1 ,17 (SEQ ID NO: 6) et à l'allotype G1 m3 (SEQ ID NO: 10). Le domaine "charnière inférieure CH2-CH3" d'IgGI commence à la cystéine 226 (voir flèche). Le domaine CH2 est surligné en gris et le domaine CH3 est en italique.  Figure 1 shows alignments of native human IgG1 sequences referring to positions 216 to 447 (according to the index UE) with the corresponding sequences of human IgG2 (SEQ ID NO: 7), human IgG3 (SEQ ID NO: 8) and human IgG4 (SEQ ID NO: 9). The IgGI sequences refer to the G1 m1 allotype, 17 (SEQ ID NO: 6) and the G1 m3 allotype (SEQ ID NO: 10). The "lower hinge CH2-CH3" domain of IgGI begins with cysteine 226 (see arrow). The CH2 domain is highlighted in gray and the CH3 domain is italicized.
La figure 2 montre la structure glycannique des formes GO, GOF, G1 et G1 F.  Figure 2 shows the glycan structure of forms GO, GOF, G1 and G1 F.
La figure 3 montre les vecteurs d'expression contenant la chaîne lourde (CH) de l'anti- PDL1 muté sur le fragment Fc, et la chaîne légère (CL) non modifiée de l'anticorps anti- PDL1 considéré. La figure 3A illustre les vecteurs IGG1 AV-WT et IGG1 D-WT, tandis que la figure 3B illustre les vecteurs IGG1 A-WT et pCEP4. FIG. 3 shows the expression vectors containing the heavy chain (CH) of the anti-PDL1 mutated on the Fc fragment, and the unmodified light chain (CL) of the anti-PDL1 antibody under consideration. Figure 3A illustrates the vectors IGG1 AV-WT and IGG1 D-WT, while Figure 3B illustrates the vectors IGG1 A-WT and pCEP4.
« IGG1 AV-WT » correspond au vecteur d'expression codant pour l'avelumab ; « IGG1 D- WT » correspond au vecteur d'expression codant pour le durvalumab ; et « IGG1 A-WT » correspond au vecteur d'expression codant pour l'atezolizumab.  "IGG1 AV-WT" corresponds to the expression vector coding for avelumab; "IGG1 D-WT" corresponds to the expression vector coding for durvalumab; and "IGG1 A-WT" corresponds to the expression vector encoding atezolizumab.
Description détaillée detailed description
Caractéristique des anticorps  Characteristic of antibodies
La présente invention se rapporte à un anticorps dirigé contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire (anticorps anti-ligand), possédant une région Fc modifiée par rapport à celle d'un anticorps parent, ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l'anticorps parent.  The present invention relates to an antibody raised against an immune control point ligand (anti-ligand antibody), having a modified Fc region relative to that of a parent antibody, having an improved affinity for the FcgRIIIa receptor ( CD16a) and / or increased ADCC activity relative to the parent antibody.
L'anticorps anti-ligand de point de contrôle immunitaire permet la liaison à la cellule cible tumorale. Par exemple, en se liant au ligand présent sur les cellules tumorales (par exemple PD-L1 ), il permet le recrutement, via la région Fc mutée (qui présente une fonction effectrice), de cellules immunitaires effectrices. Cela aboutit à une cytotoxicité directe sur les cellules tumorales. La présente invention se rapporte de préférence à un anticorps dirigé contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire, ledit anticorps possédant une région Fc mutée par rapport à celle d'un anticorps parent, ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l'anticorps parent, ladite région Fc mutée comprenant au moins une combinaison de 2 mutations suivantes: i) une mutation choisie parmi 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M, 421 T, 434Y et 434S ; et The anti-immune control point ligand antibody allows binding to the target tumor cell. For example, by binding to the ligand present on the tumor cells (eg PD-L1), it allows the recruitment, via the mutated Fc region (which has effector function), of effector immune cells. This results in direct cytotoxicity on the tumor cells. The present invention preferably relates to an antibody directed against a ligand of an immune control point, said antibody having a Fc region mutated by compared to that of a parent antibody, having an improved affinity for the FcgRIIIa receptor (CD16a) and / or an increased ADCC activity relative to the parent antibody, said mutated Fc region comprising at least one combination of 2 mutations as follows: ) a mutation selected from 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M, 421T, 434Y and 434S; and
ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, 226Y, 227S, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 231 V, 234P, 241 L, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261 R, 262A, 263A, 264E, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, ii) at least one mutation selected from 226G, 226Y, 227S, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 231V, 234P, 241L, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 264E, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P , 308A, 308I, 308G, 309P,
312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 330V, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361 H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 389K, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421 T, 421 S,312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 330V, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 389K, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S,
423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431 V, 431 T, 434K, 434Y, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P et 447N, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434Y, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P and 447N,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii). the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii).
Selon un premier mode de réalisation, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes: According to a first embodiment, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises at least one combination of 2 mutations:
i) une mutation choisie parmi 378V, 378T, 434Y et 434S; et  i) a mutation selected from 378V, 378T, 434Y and 434S; and
ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, ii) at least one mutation selected from 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K,
434Y et 434S, 434Y and 434S,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii). Selon le paragraphe précédent, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention peut également comprendre une mutation additionnelle choisie parmi 361 D, 428L, 307A, 382V, 259I, 256N et 383N.  the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii). According to the preceding paragraph, the mutated Fc region of the antibody according to the invention may also comprise an additional mutation selected from 361D, 428L, 307A, 382V, 259I, 256N and 383N.
Plus préférentiellement, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend les combinaisons de mutations choisies parmi N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y, N315D/N361 D/A378V/N434Y, P230S/N315D/M428IJN434Y, T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y, V259I/N315D/N434Y etMore preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises the combinations of mutations chosen from N315D / A330V / N361 D / A378V / N434Y, N315D / N361D / A378V / N434Y, P230S / N315D / M428IJN434Y, T307A / N315D / A330V / E382V / N389T / N434Y, V259I / N315D / N434Y and
T256N/A378V/S383N/N434Y. T256N / A378V / S383N / N434Y.
Selon un second mode de réalisation, la présente invention se rapporte à un anticorps dirigé contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire, ledit anticorps possédant une région Fc mutée par rapport à celle d'un anticorps parent, ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l'anticorps parent, ladite région Fc mutée comprenant au moins une combinaison de 2 mutations suivantes: According to a second embodiment, the present invention relates to an antibody directed against a ligand of an immune control point, said antibody having a Fc region mutated with respect to that of a parent antibody, having an improved affinity for the FcgRIIIa receptor (CD16a) and / or an ADCC activity increased relative to the parent antibody, said mutated Fc region comprising at least one combination of 2 mutations:
i) une mutation choisie parmi 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M et 421 T ; et  i) a mutation selected from 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M and 421T; and
ii) au moins une mutation choisie parmi 226Y, 227S, 230S, 231 V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261 R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361 H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 41 OR, 412M, 414R, 421 T, 421 S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431 V, 431 T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P et 447N,  ii) at least one mutation selected from 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 41OR, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P and 447N,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii). the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii).
Plus préférentiellement selon ce second mode, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes: More preferentially according to this second mode, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises at least one combination of 2 mutations:
i) une mutation choisie parmi 378V, 378T, 326E, 397M, 334N, 396L, 434Y et 434S ; et  i) a mutation selected from 378V, 378T, 326E, 397M, 334N, 396L, 434Y and 434S; and
ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 316D, 330V, 362V, 397M, 334N, 248E, 231 V, 246R, 336T, 421 T, 361 H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y, 298N, 389T, 389K, 434Y et 434S,  ii) at least one mutation selected from 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 316D, 330V, 362V, 397M, 334N, 248E, 231V, 246R, 336T, 421T; , 361H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y, 298N, 389T, 389K, 434Y and 434S,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii). Plus préférentiellement, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes: the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii). More preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises at least one combination of 2 mutations:
i) une mutation choisie parmi 378V, 326E, 397M, 334N et 396L ; et  i) a mutation selected from 378V, 326E, 397M, 334N and 396L; and
ii) au moins une mutation choisie parmi 316D, 397M, 334N, 248E, 231 V, 246R, 336T, 421 T, 361 H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y et ii) at least one mutation selected from 316D, 397M, 334N, 248E, 231V, 246R, 336T, 421T, 361H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y and
298N, 298N,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii). Selon le paragraphe précédent, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention peut également comprendre une mutation additionnelle choisie parmi 333G, 352S, 423Y, 315D, 412M et 366A. the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii). According to the preceding paragraph, the mutated Fc region of the antibody according to the invention may also comprise an additional mutation selected from 333G, 352S, 423Y, 315D, 412M and 366A.
Plus préférentiellement, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend les combinaisons de mutations choisies parmi 248E/378V, 333G/378T/397M, 396IJ421 T/378V, 396IJ421 T, 316D/326E/378V, 298N/378V, 336T/378V, 334N/352S/397M/378V, 286I/378V/423Y, 315D/361 H/396L, 231 V/378V, 378T/397M/412M, 286Y/352S/378V, 290E/366A/378V, 286I/396IJ421 T et 334N/352S/397M. Plus préférentiellement, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend la combinaison de mutations 334N/352S/397M/378V.  More preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises the combinations of mutations chosen from 248E / 378V, 333G / 378T / 397M, 396IJ421 T / 378V, 396IJ421 T, 316D / 326E / 378V, 298N / 378V, 336T / 378V, 334N / 352S / 397M / 378V, 286I / 378V / 423Y, 315D / 361H / 396L, 231V / 378V, 378T / 397M / 412M, 286Y / 352S / 378V, 290E / 366A / 378V, 286I / 396IJ421 T and 334N / 352S / 397M. More preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises the combination of 334N / 352S / 397M / 378V mutations.
De préférence, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend au moins une combinaison de 2 mutations selon le premier mode de réalisation, et au moins une combinaison selon le second mode de réalisation. Preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises at least one combination of 2 mutations according to the first embodiment, and at least one combination according to the second embodiment.
Ainsi, de préférence, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend une combinaison de mutations choisie parmi N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y, V259I/N315D/N434Y et N315D/N361 D/A378V/N434Y, ainsi qu'une combinaison de mutations choisie parmi 248E/378V, 333G/378T/397M, 396IJ421 T/378V, 396L/421 T, 316D/326E/378V, 298N/378V, 336T/378V, 334N/352S/397M/378V, 286I/378V/423Y, 315D/361 H/396L, 231 V/378V, 378T/397M/412M, 286Y/352S/378V, 290E/366A/378V, 286I/396L/421 T et 334N/352S/397M.  Thus, preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises a combination of mutations chosen from N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y, V259I / N315D / N434Y and N315D / N361D / A378V / N434Y, as well as a combination of mutations selected from 248E / 378V, 333G / 378T / 397M, 396IJ421 T / 378V, 396L / 421T, 316D / 326E / 378V, 298N / 378V, 336T / 378V, 334N / 352S / 397M / 378V , 286I / 378V / 423Y, 315D / 361H / 396L, 231V / 378V, 378T / 397M / 412M, 286Y / 352S / 378V, 290E / 366A / 378V, 286I / 396L / 421T and 334N / 352S / 397M.
Alternativement, de préférence, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend une combinaison de mutations choisie parmi N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y, V259I/N315D/N434Y, K334N/P352S/V397M/A378V et N315D/N361 D/A378V/N434Y, ainsi que l'une des mutations suivantes : V240M, L242K, L242G, L242F, F243L, E258R, T260A, V262A, K290G, Y296W, S298R ou V302R. De préférence, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend une combinaison de mutations choisie parmi N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y, V259I/N315D/N434Y, K334N/P352S/V397M/A378V et N315D/N361 D/A378V/N434Y, ainsi qu'au moins l'une des mutations suivantes : K290G, Y296W ou N434Y. Alternatively, preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises a combination of mutations chosen from N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y, V259I / N315D / N434Y, K334N / P352S / V397M / A378V and N315D. / N361 D / A378V / N434Y, as well as one of the following mutations: V240M, L242K, L242G, L242F, F243L, E258R, T260A, V262A, K290G, Y296W, S298R or V302R. Preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises a combination of mutations chosen from N315D / A330V / N361 D / A378V / N434Y, V259I / N315D / N434Y, K334N / P352S / V397M / A378V and N315D / N361. D / A378V / N434Y, as well as at least one of the following mutations: K290G, Y296W or N434Y.
De préférence, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend une combinaison de mutations choisie parmi K334N/P352S/V397M/A378V et N315D/N361 D/A378V/N434Y, ainsi qu'au moins l'une des mutations suivantes Y296W, N434Y, ou Y296W/N434Y.  Preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises a combination of mutations chosen from K334N / P352S / V397M / A378V and N315D / N361 D / A378V / N434Y, as well as at least one of the following mutations Y296W, N434Y, or Y296W / N434Y.
De préférence, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention comprend une combinaison de mutations choisie parmi Y296W/K334N/P352S/V397M/A378V, Y296W/N315D/N361 D/A378V/N434Y, K334N/P352S/V397M/A378V/N434Y et Y296W/K334N/P352S/V397M/A378V/N434Y. Par « anticorps » on entend un tétramère fait de deux chaînes lourdes de 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light) liées par des ponts disulfures intra et intercaténaires et identiques entre elles. Ce tétramère comprend au moins deux régions variables à l'extrémité N-terminale de chaque chaîne (dites VL pour les chaînes légères et VH pour les chaînes lourdes) et une région constante en extrémité C-terminale dite Fc, constituée d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines pour la chaîne lourde appelés CH1 , CH2, CH3 et éventuellement CH4. Preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention comprises a combination of mutations chosen from Y296W / K334N / P352S / V397M / A378V, Y296W / N315D / N361D / A378V / N434Y, K334N / P352S / V397M / A378V / N434Y and Y296W / K334N / P352S / V397M / A378V / N434Y. By "antibody" is meant a tetramer made of two heavy chains of 50-70 kDa each (called H chains for Heavy) and two light chains of about 25 kDa each (called chains L for Light) linked by bridges. intra and interchain disulfides and identical to each other. This tetramer comprises at least two variable regions at the N-terminus of each chain (called VL for the light chains and VH for the heavy chains) and a constant region at the C-terminus called Fc, consisting of a single domain said CL for the light chain and three or four domains for the heavy chain called CH1, CH2, CH3 and possibly CH4.
Chaque domaine comprend environ 1 10 acides aminés et est structuré de manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées par des ponts disulfures au niveau des CH2 et chaque chaîne lourde est liée à une chaîne légère par un pont disulfure entre le CH1 et le CL. La région qui détermine la spécificité de l'anticorps pour l'antigène est portée par les parties variables, ce sont ces parties qui sont responsables de la reconnaissance de l'antigène. Dans chaque région variable, trois boucles sont rassemblées pour former un site de liaison à l'antigène. Chacune des boucles est appelée une Région Déterminant la Complémentarité (ou CDR). Quant aux parties constantes, elles se lient de préférence aux récepteurs Fc (FcR) des cellules effectrices. L'assemblage des chaînes qui composent un anticorps permet de définir une structure tridimensionnelle caractéristique en Y, où Each domain comprises about 1 10 amino acids and is structurally comparable. The 2 heavy chains are linked by disulfide bridges at CH2 and each heavy chain is linked to a light chain by a disulphide bridge between CH1 and CL. The region that determines the specificity of the antibody for the antigen is carried by the variable parts, it is these parts that are responsible for the recognition of the antigen. In each variable region, three loops are pooled to form an antigen binding site. Each of the loops is called a Region Determining Complementarity (or CDR). As for the constant parts, they preferentially bind to the Fc receptors (FcR) of the effector cells. The assembly of the chains that make up an antibody makes it possible to define a characteristic three-dimensional structure in Y, where
- la base du Y correspond à la région constante Fc, ou fragment Fc : elle est reconnue par les récepteurs Fc afin de médier les fonctions effectrices de l'anticorps, et - les extrémités des bras du Y correspondent à l'assemblage respectif de la région variable d'une chaîne légère et de la région variable d'une chaîne lourde, lesdites extrémités constituant la région Fab et déterminant la spécificité de l'anticorps pour l'antigène. the base of Y corresponds to the constant region Fc, or Fc fragment: it is recognized by the Fc receptors in order to mediate the effector functions of the antibody, and the ends of the arms of Y correspond to the respective assembly of the variable region of a light chain and of the variable region of a heavy chain, said ends constituting the Fab region and determining the specificity of the antibody for the antigen.
Il existe cinq types de chaînes lourdes (alpha, gamma, delta, epsilon, mu), qui déterminent les classes d'immunoglobulines (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM). Le groupe de la chaîne légère comprend deux sous-types, lambda et kappa. Les chaînes légères kappa et lambda sont partagées par toutes les classes et sous-classes. Chez l'homme, la proportion de kappa et lambda produite se situe dans un rapport de 2 pour 1 . There are five types of heavy chains (alpha, gamma, delta, epsilon, mu), which determine immunoglobulin classes (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM). The light chain group includes two subtypes, lambda and kappa. The kappa and lambda light chains are shared by all classes and subclasses. In humans, the proportion of kappa and lambda produced is in a ratio of 2 to 1.
Les IgG sont les immunoglobulines les plus abondantes dans le sérum (75-80% des anticorps circulants). Elles sont présentes sous forme de monomères et présentent une demi-vie de 21 jours en moyenne.  IgG is the most abundant immunoglobulin in serum (75-80% of circulating antibodies). They are present as monomers and have a half-life of 21 days on average.
Il existe quatre types de chaînes lourdes gamma, ce qui détermine quatre sous-classes d'IgG (lgG1 pour gammal , lgG2 pour gamma2, lgG3 pour gamma3 et lgG4 pour gamma4). Ces quatre sous-classes diffèrent par des nombres et des positions variables des ponts disulfures (Basic and Clinical Immunology, Sème édition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 et Chapitre 6).  There are four types of heavy gamma chains, which determines four IgG subclasses (IgG1 for gamma, IgG2 for gamma2, IgG3 for gamma3 and IgG4 for gamma4). These four subclasses differ in numbers and varying positions of disulfide bridges (Basic and Clinical Immunology, 5th Edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6).
Les quatre sous-classes des IgG humaines se distinguent également au niveau de leur activité biologique, malgré des structures très homologues (plus de 95% d'homologie de séquence pour les régions Fc). The four subclasses of human IgG are also distinguished in their biological activity, despite very homologous structures (more than 95% sequence homology for Fc regions).
Les anticorps comprennent notamment les immunoglobulines pleine longueur, les anticorps monoclonaux, les anticorps multi-spécifiques, les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps entièrement humains. Antibodies include, but are not limited to, full-length immunoglobulins, monoclonal antibodies, multi-specific antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and fully human antibodies.
Le terme "Fc" ou "région Fc" ou "fragment Fc" désigne la région constante d'un anticorps de longueur totale à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (CH1 -CL). Ainsi Fc fait référence aux deux derniers domaines (CH2 et CH3) de région constante d'IgG, et à la charnière flexible N-terminale de ces domaines. Pour une lgG1 humaine, la région Fc comprend les domaines CH2 et CH3 ainsi que la région charnière inférieure entre CH1 et CH2. Ainsi, la région Fc correspond au résidu C226 jusqu'à son extrémité carboxy-terminale, soit les résidus de la position 226 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. Les domaines analogues pour d'autres sous-classes d'IgG peuvent être déterminés à partir de l'alignement des séquences d'acides aminés des chaînes lourdes ou des fragments de chaînes lourdes des sous-classes d'IgG avec elle d'une lgG1 humaine (voir figure 1 ). La région Fc utilisée peut comprendre en outre une partie de la région charnière supérieure, située entre les positions 216 à 226 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat ; dans ce cas, la région Fc utilisée correspond aux résidus de la position 216 à 447, 217 à 447, 218 à 447, 219 à 447, 220 à 447, 221 à 447, 222 à 447, 223 à 447, 224 à 447 ou 225 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence dans ce cas, la région Fc utilisée correspond aux résidus de la position 216 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. The term "Fc" or "Fc region" or "Fc fragment" refers to the constant region of a full length antibody excluding the first immunoglobulin constant region domain (CH1-CL). Thus Fc refers to the last two domains (CH2 and CH3) of IgG constant region, and to the flexible N-terminal hinge of these domains. For human IgG1, the Fc region comprises the CH2 and CH3 domains as well as the lower hinge region between CH1 and CH2. Thus, the Fc region corresponds to the residue C226 to its carboxy terminal end, ie the residues of position 226 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat. Analogous domains for other IgG subclasses can be determined from aligning the heavy chain or heavy chain amino acid sequences of the IgG subclasses with it with human IgG1 (see Figure 1). The Fc region used may further comprise a portion of the upper hinge region located between positions 216-226 according to the EU index or equivalent in Kabat; in this case, the Fc region used corresponds to the residues of heading 216 to 447, 217 to 447, 218 to 447, 219 to 447, 220 to 447, 221 to 447, 222 to 447, 223 to 447, 224 to 447 or 225 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat. Preferably in this case, the Fc region used corresponds to the residues of position 216 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat.
De préférence, la région Fc utilisée est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4 et 5. De préférence, la région Fc de l'anticorps parent a pour séquence SEQ ID NO : 1 . Les séquences représentées en SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4 et 5 sont exemptes de région charnière en N-terminal. Preferably, the Fc region used is chosen from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and 5. Preferably, the Fc region of the parent antibody has the sequence SEQ ID NO: 1. The sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 5 are free of an N-terminal hinge region.
Les séquences représentées en SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10 correspondent respectivement aux séquences représentées en SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4 et 5 avec leurs régions charnières en N-terminal. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, la région Fc de l'anticorps parent est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10. De préférence, la région Fc de l'anticorps parent a une séquence correspondant aux positions 1 -232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6-232, 7-232, 8-232, 9-232, 10-232 ou 1 1 - 232 de la séquence SEQ ID NO : 6.  The sequences represented in SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 and 10 respectively correspond to the sequences represented in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 5 with their hinge regions at the N-terminal. Also, in a particular embodiment, the Fc region of the parent antibody is chosen from the sequences SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 and 10. Preferably, the Fc region of the parent antibody has a sequence corresponding to positions 1-232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6-232, 7-232, 8-232, 9-232, 10-232 or 1 1 - 232 of the sequence SEQ ID NO: 6.
Par « fragment Fv » on désigne le plus petit fragment gardant les propriétés de liaison que possède l'anticorps. Il est en effet constitué uniquement des régions variables de chaîne légère VL et de chaîne lourde VH, il fixe donc l'antigène avec la même affinité que l'anticorps complet. By "Fv fragment" is meant the smallest fragment retaining the binding properties that the antibody possesses. It consists in fact only variable regions of VL light chain and VH heavy chain, so it fixes the antigen with the same affinity as the complete antibody.
Par « position » on entend une position dans la séquence d'acides aminés. Pour la région Fc, les positions sont numérotées selon l'indice de l'UE ou équivalent dans Kabat. Par « acide aminé » ou « résidu » on entend l'un des 20 acides aminés naturels ou des analogues naturels. By "position" is meant a position in the amino acid sequence. For the Fc region, the positions are numbered according to the EU index or equivalent in Kabat. By "amino acid" or "residue" is meant one of the 20 naturally occurring amino acids or natural analogues.
Les termes « points de contrôle immunitaires » se réfèrent à des récepteurs situés en surface des cellules effectrices de l'immunité capables d'inhiber (points de contrôle immunitaires inhibiteurs) ou de stimuler la réponse immunitaire (points de contrôle immunitaires activateurs) après engagement avec leurs ligands. Le point de contrôle immunitaire est de préférence choisi parmi GITR, OX40, PD1 , CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 et a2AR. The term "immune control points" refers to receptors on the surface of the immune effector cells capable of inhibiting (inhibitory immune control points) or stimulating the immune response (activator immune control points) after engagement with their ligands. The immune control point is preferably selected from GITR, OX40, PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR.
Par « récepteur activateur » on entend, dans la présente invention, un récepteur de surface qui, après interaction avec son ligand, entraîne le déclenchement d'une voie de signalisation conduisant à l'activation de la réponse immunitaire. Le point de contrôle immunitaire activateur est choisi de préférence parmi GITR et OX40. By "activating receptor" is meant, in the present invention, a surface receptor which, after interaction with its ligand, causes the triggering of a signaling pathway leading to the activation of the immune response. The activator immune control point is preferably selected from GITR and OX40.
GITR, également appelé tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 (TNFRSF18) ou activation-inducible TNFR family receptor (AITR), est une protéine dont l'expression est accrue lorsque les cellules T sont activées. GITR, also called tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 (TNFRSF18) or activation-inducible TNFR family receptor (AITR), is a protein whose expression is increased when T cells are activated.
OX40, également appelé CD134 ou Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4 (TNFRSF4), est une protéine qui n'est pas exprimée de façon constitutive sur les cellules T naïves. Elle est exprimée lorsque ces dernières sont activées. Son ligand OX40L, est de même exprimé sur les cellules présentatrices d'antigène activées. OX40, also called CD134 or Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4 (TNFRSF4), is a protein that is not constitutively expressed on naive T cells. It is expressed when they are activated. Its OX40L ligand is likewise expressed on activated antigen presenting cells.
Par « récepteur inhibiteur » on entend, dans la présente invention, un récepteur de surface qui, après interaction avec son ligand, entraîne le déclenchement d'une voie de signalisation conduisant à l'inactivation de la réponse immunitaire. By "inhibitory receptor" is meant, in the present invention, a surface receptor which, after interaction with its ligand, causes the triggering of a signaling pathway leading to the inactivation of the immune response.
De préférence, le point de contrôle immunitaire est inhibiteur. Plus préférentiellement, il est choisi parmi PD1 , CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 et a2AR.  Preferably, the immune control point is inhibitory. More preferentially, it is chosen from PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR.
PD1 (Programmed cell Death factor 1 ) est un récepteur inhibiteur de la famille CD28 exprimé à la surface des lymphocytes T et B activés et des Natural Killer. Son rôle est de limiter l'activité des cellules effectrices dans les tissus lymphoïdes secondaires ou les tumeurs, lui conférant ainsi un mécanisme de résistance tumorale important. PD1 inhibe les fonctions lymphocytaires lorsqu'il est engagé avec un de ses ligands, PDL1 (ou B7-H1 ou CD274) ou PDL2. PDL1 est une molécule exprimée à la surface des cellules tumorales. En cas d'exposition chronique au ligand PDL1 (par exemple dans le cas de cancers), l'expression de PD1 à la surface des cellules effectrices est augmentée, ce qui entraîne alors un phénomène d'anergie. Les anticorps anti-PD1 sont utilisés dans le traitement de cancers tels que les cancers du poumon, les cancers du poumon « non à petites cellules » (NSCLC), les mésothéliomes, les cancers de la vessie, les cancers colorectaux, les cancers colorectaux métastatiques, les cancers de la vessie, les cancers du sein, les cancers de la tête et du cou, les cancers des testicules, les cancers de l'endomètre, les cancers de l'œsophage, les cancers du thymus, les cancers hématologiques, les cancers hématologiques avancés tels que les lymphomes non- hodgkiniens, les lymphomes hodgkiniens, les leucémies lymphoïdes chroniques, les mélanomes multiples, les leucémies myéloïdes aiguës, les tumeurs du cerveau, les glioblastomes, les tumeurs solides, les adénocarcinomes gastriques, les tumeurs des cellules germinales, les carcinomes hépatocellulaires, les mélanomes, les mélanomes métastatiques, les lymphomes, les lymphomes diffus à grandes cellules B (LDGCB), les lymphomes folliculaires les mélanomes non résécable ou métastatiques ou encore les carcinomes de cellules rénales avancés. PD1 (Programmed Cell Death Factor 1) is an inhibitory receptor of the CD28 family expressed on the surface of activated T and B lymphocytes and Natural Killers. Its role is to limit the activity of effector cells in secondary lymphoid tissues or tumors, thus conferring on it a mechanism of important tumor resistance. PD1 inhibits lymphocyte function when engaged with one of its ligands, PDL1 (or B7-H1 or CD274) or PDL2. PDL1 is a molecule expressed on the surface of tumor cells. In case of chronic exposure to the PDL1 ligand (for example in the case of cancers), the expression of PD1 on the surface of the effector cells is increased, which then causes an anergy phenomenon. Anti-PD1 antibodies are used in the treatment of cancers such as lung cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC), mesothelioma, bladder cancer, colorectal cancer, metastatic colorectal cancer , bladder cancers, breast cancers, head and neck cancers, testicular cancers, breast cancers endometrium, esophageal cancers, thymus cancers, hematological cancers, advanced hematologic cancers such as non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin lymphoma, chronic lymphoid leukemia, multiple melanoma, acute myeloid leukemia, brain tumors, glioblastomas, solid tumors, gastric adenocarcinomas, germ cell tumors, hepatocellular carcinomas, melanomas, metastatic melanomas, lymphomas, diffuse large B cell lymphomas (LDGCB), follicular lymphomas unresectable or metastatic melanomas or advanced renal cell carcinomas.
CTLA4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) est un récepteur inhibiteur exprimé uniquement à la surface des lymphocytes T. Son rôle est de réguler les premières étapes d'activation des lymphocytes T. En effet, 48 heures après activation des lymphocytes T par l'intermédiaire de leur récepteur (TCR ou T Cell Receptor), CTLA4 s'engage avec ses ligands (CD80 ou CD86) qui sont exprimés à la surface des cellules présentatrices d'antigène (CPA) au niveau des ganglions lymphatiques et parfois des tumeurs. Ceci entraîne une cascade de signalisation conduisant à l'inhibition des lymphocytes T. Les anticorps anti-CTLA4 sont utilisés dans le traitement de cancers tels que le cancer du poumon, les cancers du poumon « à non petites cellules » (NSCLC), les carcinomes du poumon à petites cellules, les cancers du sein, les cancers du pancréas, les cancers de la prostate, les cancers gastriques, les cancers du rein, les cancers du cou et de la tête, les cancers du foie, les mélanomes métastatiques ou non résécables, les mélanomes cutanés avec atteinte des ganglions lymphatiques, les carcinomes rénaux, les myélomes, les lymphomes, les carcinomes hépatocellulaires, les métastases cérébrales, les tumeurs solides, mésothéliomes, les lymphomes ou encore les mélanomes. CTLA4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) is an inhibitory receptor expressed only on the surface of T lymphocytes. Its role is to regulate the first steps of activation of T lymphocytes. Indeed, 48 hours after activation of T lymphocytes by via their receptor (TCR or T Cell Receptor), CTLA4 engages with its ligands (CD80 or CD86) which are expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs) at the level of the lymph nodes and sometimes tumors . This results in a signaling cascade leading to the inhibition of T lymphocytes. The anti-CTLA4 antibodies are used in the treatment of cancers such as lung cancer, "non-small cell" lung cancers (NSCLC), carcinomas small cell lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, gastric cancer, kidney cancer, neck and head cancer, liver cancer, metastatic and non-metastatic melanoma resectable, cutaneous melanoma with lymph node involvement, renal carcinoma, myeloma, lymphoma, hepatocellular carcinoma, brain metastasis, solid tumors, mesothelioma, lymphoma or melanoma.
TIM3 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3) est un récepteur exprimé en surface des lymphocytes T sécréteurs d'IFN γ. Un de ses ligands est la galectine-9, qui est une protéine surexprimée dans les cellules tumorales. L'engagement de TIM3 avec la galectine-9 conduit à une inhibition de la réponse immunitaire. TIM3 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3) is a surface-expressed receptor of γ-IFN secretory T cells. One of its ligands is galectin-9, which is a protein overexpressed in tumor cells. The engagement of TIM3 with galectin-9 leads to an inhibition of the immune response.
LAG3 (lymphocyte activation gene 3) aussi nommée CD223 est une molécule exprimée en surface des lymphocytes T. Son seul ligand connu est le Complexe Majeur d'Histocompatibilité de type II (CMH II) qui peut être surexprimé dans certains cancers mais aussi par les cellules présentatrices d'antigène (CPA) (macrophages et cellules dendritiques) infiltrées au niveau des tumeurs. L'engagement de LAG3 avec son récepteur entraîne un phénomène d'anergie. LAG3 (lymphocyte activation gene 3), also called CD223, is a molecule expressed on the surface of T lymphocytes. Its only known ligand is the Major Histocompatibility Complex type II (MHC II), which can be overexpressed in certain cancers, but also by cells. antigen presenting agents (APCs) (macrophages and dendritic) infiltrated at the level of tumors. The commitment of LAG3 with its receiver causes an anergy phenomenon.
KIR (Killer-cell immunoglobulin-like receptor) est une molécule exprimée en surface des Natural Killers, des lymphocytes T et des CPA. Lorsque KIR se lie à son ligand, le CMH de type I (CMH I), la réponse effectrice des Natural Killers est atténuée au niveau des tumeurs. Killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR) is a surface-expressed molecule of Natural Killers, T-cells and APCs. When KIR binds to its ligand, MHC type I (MHC I), the effector response of Natural Killers is attenuated in tumors.
BTLA1 (B and T lymphocyte attenuator), aussi appelé CD272, est une molécule exprimée en surface des lymphocytes. Son ligand, la molécule HVEM (herpesvirus entry mediator), est exprimé dans certains types de tumeurs (notamment dans le cas des mélanomes). BTLA1 (B and T lymphocyte attenuator), also called CD272, is a molecule expressed on the surface of lymphocytes. Its ligand, the HVEM molecule (herpesvirus entry mediator), is expressed in certain types of tumors (especially in the case of melanomas).
Les a2AR sont exprimés dans différents types de cellules effectrices de l'immunité, notamment dans les lymphocytes T, ainsi que dans les cellules endothéliales. Lorsque l'a2AR se lie à son ligand, l'adénosine (qui s'accumule dans les tumeurs), les cellules CD4+ expriment FOXP3 et se différentient ainsi en cellules T régulatrices, ce qui a pour conséquence d'inhiber la réponse immunitaire. A2AR are expressed in different types of effector cells of immunity, especially in T cells, as well as in endothelial cells. When a2AR binds to its ligand, adenosine (which accumulates in tumors), CD4 + cells express FOXP3 and thus differentiate into regulatory T cells, which has the effect of inhibiting the immune response.
De préférence, le ligand du point de contrôle immunitaire est choisi parmi OX40L, PDL1 , PDL2, CD80, CD86, la galectine-9, le CMH II, le CMH I, HVEM et l'adénosine. Preferably, the immune control point ligand is selected from OX40L, PDL1, PDL2, CD80, CD86, galectin-9, MHC II, MHC I, HVEM and adenosine.
Plus préférentiellement, le point de contrôle immunitaire est choisi parmi PD1 et CTLA4. Plus préférentiellement, le point de contrôle immunitaire est PD1 . Ainsi, préférentiellement, l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire selon l'invention est un anticorps anti-PD1 ou anti-CTLA4. Plus préférentiellement, l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire selon l'invention est un anticorps anti-PD1 .  More preferably, the immune control point is selected from PD1 and CTLA4. More preferably, the immune control point is PD1. Thus, preferentially, the anti-immune control point antibody according to the invention is an anti-PD1 or anti-CTLA4 antibody. More preferably, the anti-immune control point antibody according to the invention is an anti-PD1 antibody.
De préférence, le ligand est choisi parmi PDL1 , PDL2, CD80 et CD86. De préférence, le ligand est PDL1 ou PDL2, préférentiellement PDL1 . Ainsi, préférentiellement, l'anticorps anti-ligand selon l'invention est un anticorps anti-PDL1 , anti-PDL2, anti-CD80 ou anti- CD86. De préférence, l'anticorps anti-ligand selon l'invention est un anticorps anti-PDL1 .  Preferably, the ligand is selected from PDL1, PDL2, CD80 and CD86. Preferably, the ligand is PDL1 or PDL2, preferentially PDL1. Thus, preferentially, the anti-ligand antibody according to the invention is an anti-PDL1, anti-PDL2, anti-CD80 or anti-CD86 antibody. Preferably, the anti-ligand antibody according to the invention is an anti-PDL1 antibody.
L'anticorps anti-PDL1 selon l'invention peut comprendre une région variable correspondant à la séquence d'un fragment Fv d'un anticorps anti-PDL1 connu, par exemple l'anticorps atezolizumab, l'anticorps durvalumab, ou l'anticorps avelumab. Ainsi, l'anticorps anti-PDL1 selon l'invention peut comprendre une séquence variable de chaîne légère (VL) et une séquence variable de chaîne lourde (VH) correspondant respectivement aux séquences VL et VH de l'anticorps atezolizumab, de l'anticorps durvalumab, ou de l'anticorps avelumab. The anti-PDL1 antibody according to the invention may comprise a variable region corresponding to the sequence of a Fv fragment of a known anti-PDL1 antibody, for example the atezolizumab antibody, the durvalumab antibody or the avelumab antibody. . Thus, the anti-PDL1 antibody according to the invention may comprise a variable light chain sequence (VL) and a corresponding heavy chain variable sequence (VH). respectively to the VL and VH sequences of the atezolizumab antibody, the durvalumab antibody, or the avelumab antibody.
Les séquences sont les suivantes : The sequences are as follows:
- les séquences VH et VL de l'anticorps atezolizumab sont les séquences SEQ ID NO :1 1 et 12 respectivement ;  the VH and VL sequences of the atezolizumab antibody are the sequences SEQ ID NO: 1 1 and 12 respectively;
- les séquences VH et VL de l'anticorps durvalumab sont les séquences SEQ ID NO :13 et 14 respectivement ; et  the sequences VH and VL of the durvalumab antibody are the sequences SEQ ID NO: 13 and 14 respectively; and
- les séquences VH et VL de l'anticorps avelumab sont les séquences SEQ ID NO :15 et 16 respectivement.  the VH and VL sequences of the avelumab antibody are the sequences SEQ ID NOs: 15 and 16 respectively.
Ainsi, de préférence, l'anticorps anti-PDL1 selon l'invention comprend un VH de séquence SEQ ID NO :1 1 et un VL de séquence SEQ ID NO :12. Thus, preferably, the anti-PDL1 antibody according to the invention comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 1 1 and a VL of sequence SEQ ID NO: 12.
Alternativement, de préférence, l'anticorps anti-PDL1 selon l'invention comprend un VH de séquence SEQ ID NO :13 et un VL de séquence SEQ ID NO :14.  Alternatively, preferably, the anti-PDL1 antibody according to the invention comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 13 and a VL of sequence SEQ ID NO: 14.
Alternativement, de préférence, l'anticorps anti-PDL1 selon l'invention comprend un VH de séquence SEQ ID NO :15 et un VL de séquence SEQ ID NO :16. Alternatively, preferably, the anti-PDL1 antibody according to the invention comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 15 and a VL of sequence SEQ ID NO: 16.
Le terme « anticorps parent » est utilisé pour définir l'anticorps de référence qui peut être d'origine naturelle ou synthétique. Dans le contexte de la présente invention, l'anticorps parent comprend une région Fc dite « région Fc parente ». Ladite région Fc parente est choisie parmi le groupe de régions Fc de type sauvage et leurs fragments. Par « type sauvage » ou WT (pour « wild-type »), on entend ici une séquence d'acides aminés ou une séquence nucléotidique que l'on trouve dans la nature c'est à dire qui est d'origine naturelle, y compris des variations alléliques, et qui n'a pas été intentionnellement modifiée par des techniques de biologie moléculaire telles que par mutagenèse. Par exemple, les régions Fc de « type sauvage » se réfèrent notamment à la région Fc de l'IgGI ayant la séquence SEQ ID NO :1 (allotype G1 m1 ,17), la région Fc d'lgG2 ayant la séquence SEQ ID NO : 3, la région Fc d'lgG3 ayant la séquence SEQ ID NO : 4, la région Fc d'lgG4 ayant la séquence SEQ ID NO : 5, et la région Fc d'IgGI ayant la séquence SEQ ID NO :1 (allotype G1 m3). Les régions Fc de « type sauvage » se réfèrent également aux régions Fc correspondant aux séquences SEQ ID NO : 6 à SEQ ID NO : 10. De préférence, l'anticorps parent comprend une région Fc parente qui est une région Fc humaine, de préférence une région Fc d'une lgG1 humaine ou d'une lgG2 humaine. L'anticorps parent peut également comprendre des modifications d'acides aminés préexistantes dans la région Fc (par exemple un mutant Fc) par rapport à des régions Fc de type sauvage. Par « cellules effectrices immunitaires », on entend les cellules qui effectuent le mécanisme immunitaire et expriment un récepteur Fc (FcR). Sont considérées notamment comme cellules effectrices les lymphocytes dont les cellules Natural Killer (NK), les macrophages, les monocytes, les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les mastocytes, les cellules dendritiques dont les cellules de Langerhans et les plaquettes. The term "parent antibody" is used to define the reference antibody that may be of natural or synthetic origin. In the context of the present invention, the parent antibody comprises a Fc region called "parent Fc region". Said parent Fc region is selected from the group of wild-type Fc regions and their fragments. By "wild type" or WT ("wild-type") is meant here an amino acid sequence or a nucleotide sequence found in nature that is to say that is of natural origin, including including allelic variations, and which has not been intentionally modified by molecular biology techniques such as by mutagenesis. For example, the "wild type" Fc regions refer in particular to the Fc region of IgGI having the sequence SEQ ID NO: 1 (G1 m1 allotype, 17), the Fc region of IgG2 having the sequence SEQ ID NO : 3, the IgG3 Fc region having the sequence SEQ ID NO: 4, the IgG4 Fc region having the sequence SEQ ID NO: 5, and the IgGI Fc region having the sequence SEQ ID NO: 1 (allotype G1 m3). "Wild type" Fc regions also refer to the Fc regions corresponding to the sequences SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 10. Preferably, the parent antibody comprises a parent Fc region which is a human Fc region, preferably an Fc region of a human IgG1 or a human IgG2. The parent antibody may also include preexisting amino acid changes in the Fc region (eg, Fc mutant) relative to wild type Fc regions. By "immune effector cells" is meant cells that effect the immune mechanism and express an Fc receptor (FcR). Lymphocytes including Natural Killer (NK) cells, macrophages, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, dendritic cells, including Langerhans cells and platelets, are particularly considered as effector cells.
Par « mutation » on entend un changement d'au moins un acide aminé de la séquence d'un polypeptide, notamment un changement d'au moins un acide aminé dans la région Fc de l'anticorps parent. L'anticorps obtenu comprend alors une région Fc mutée par rapport à celle de l'anticorps parent. De préférence, la mutation est une substitution, une insertion ou une délétion d'au moins un acide aminé à une position particulière. Les régions Fc mutées peuvent présenter plusieurs mutations, touchant plusieurs acides aminés, de préférence de deux à dix. By "mutation" is meant a change of at least one amino acid of the sequence of a polypeptide, including a change of at least one amino acid in the Fc region of the parent antibody. The antibody obtained then comprises a mutated Fc region relative to that of the parent antibody. Preferably, the mutation is a substitution, an insertion or a deletion of at least one amino acid at a particular position. The mutated Fc regions may have several mutations, affecting several amino acids, preferably from two to ten.
Par «substitution», on entend le remplacement d'un acide aminé par un autre acide aminé à une position particulière dans une séquence de l'anticorps parent. Par exemple, la substitution 434S se réfère à un anticorps variant (ou mutant), en l'occurrence un variant pour lequel un acide aminé à la position 434 est remplacé par la sérine. De préférence, le libellé suivant de mutation est utilisé: « 434S » ou « N434S », et signifie que l'anticorps parent comprend l'asparagine en position 434, qui est remplacé par la sérine dans le variant. Dans le cas d'une combinaison de substitutions, le format préféré est le suivant: « 2591/315D/434Y » ou « V259I/N315D/N434Y ». Cela signifie qu'il existe trois substitutions dans le variant, en positions 259, 315 et 434, et que l'acide aminé en position 259 de l'anticorps parent, à savoir la valine, est remplacé par l'isoleucine, que l'acide aminé en position 315 de l'anticorps parent, soit l'asparagine, est remplacé par l'acide aspartique et que l'acide aminé en position 434 de l'anticorps parent, soit l'asparagine, est remplacé par la tyrosine. By "substitution" is meant the replacement of an amino acid by another amino acid at a particular position in a sequence of the parent antibody. For example, the 434S substitution refers to a variant (or mutant) antibody, in this case a variant for which an amino acid at position 434 is replaced by serine. Preferably, the following mutation label is used: "434S" or "N434S", and means that the parent antibody comprises asparagine at position 434, which is replaced by serine in the variant. In the case of a combination of substitutions, the preferred format is "2591 / 315D / 434Y" or "V259I / N315D / N434Y". This means that there are three substitutions in the variant, at positions 259, 315 and 434, and that the amino acid at position 259 of the parent antibody, namely valine, is replaced by isoleucine, that the The amino acid at position 315 of the parent antibody, asparagine, is replaced by aspartic acid and the amino acid at position 434 of the parent antibody, asparagine, is replaced by tyrosine.
Par «délétion d'acides aminés» ou «délétion», on entend la suppression d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de l'anticorps parent. Par exemple, E294del ou 294del désigne la suppression de l'acide glutamique en position 294.  By "deletion of amino acids" or "deletion" is meant the deletion of an amino acid at a particular position in a sequence of the parent antibody. For example, E294del or 294del refers to the removal of glutamic acid at position 294.
Par « insertion d'acide aminé » ou « insertion », on entend l'addition d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de l'anticorps parent. Par exemple, l'insertion G>235-236 désigne une insertion de glycine entre les positions 235 et 236.  By "amino acid insertion" or "insertion" is meant the addition of an amino acid at a particular position in a sequence of the parent antibody. For example, insertion G> 235-236 refers to a glycine insertion between positions 235 and 236.
Un variant Fc muté selon l'invention peut être généré par toute méthode de mutagenèse bien connue. Par exemple, par PCR de chevauchement en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la ou les mutation(s) ciblées avec le(s) codon(s) codant l'acide aminé souhaité. Alternativement, la synthèse de novo de gènes contenant la séquence nucléotidique comprenant les mutations d'intérêt, peut être utilisée. A mutated Fc variant according to the invention can be generated by any well-known mutagenesis method. For example, by overlap PCR using two sets of primers adapted to integrate the targeted mutation (s) with the codon (s) encoding the desired amino acid. Alternatively, the de novo synthesis of genes containing the nucleotide sequence comprising the mutations of interest can be used.
Tout au long de la présente demande, la numérotation des résidus dans la région Fc est celle de la chaîne lourde d'immunoglobuline selon l'index EU ou équivalent dans Kabat et al. (Séquences of Proteins of Immunological Interest, 5e éd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, dans le Maryland, 1991 ). L'expression «index EU ou équivalent dans Kabat» fait référence à la numérotation EU des résidus de l'anticorps humain lgG1 , lgG2, lgG3 ou lgG4. Cela est illustré sur le site IMGT (http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu IGHGnber.html). Throughout this application, the numbering of residues in the Fc region is that of the immunoglobulin heavy chain according to the EU index or equivalent in Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991). The term "EU index or equivalent in Kabat" refers to the US numbering of the residues of the human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody. This is illustrated on the IMGT website (http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu IGHGnber.html).
L'affinité de la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) est augmentée par rapport à celle de l'anticorps parent. The affinity of the mutated Fc region of the antibody according to the invention for the FcgRIIIa receptor (CD16a) is increased relative to that of the parent antibody.
De préférence, cette affinité est améliorée par rapport à celle de l'anticorps parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30. Preferably, this affinity is improved relative to that of the parent antibody, a ratio of at least 2, preferably greater than 5, preferably greater than 10, preferably greater than 15, preferably greater than 20. preferably greater than 25, preferably greater than 30.
Par « affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) », on entend l'augmentation de l'affinité de liaison, in vivo ou in vitro, de la région Fc mutée de l'invention pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) par rapport à l'anticorps parent. Le récepteur FcgRIIIa (CD16a) est impliqué dans l'ADCC et présente un polymorphisme V/F en position 158. By "improved affinity for the FcgRIIIa receptor (CD16a)" is meant the increase in the binding affinity, in vivo or in vitro, of the mutated Fc region of the invention for the FcgRIIIa (CD16a) receptor relative to the parent antibody. The FcgRIIIa receptor (CD16a) is involved in ADCC and has a V / F polymorphism at position 158.
De préférence, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention présente en outre une affinité modifiée par rapport à celle de l'anticorps parent, pour au moins l'un des récepteurs suivants : le complément C1 q, FcgRIla (CD32a), et FcgRIIb (CD32b). Le complément C1 q est impliqué dans l'activité de cytotoxicité dépendante du complément (CDC). Le récepteur FcgRIla (CD32a) est, quant à lui, impliqué dans l'activation plaquettaire et la phagocytose ; il présente un polymorphisme H/R en position 131 . Preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention also has a modified affinity compared to that of the parent antibody, for at least one of the following receptors: the complement C1 q, FcgRIla (CD32a) , and FcgRIIb (CD32b). C1 complement q is involved in complement dependent cytotoxicity (CDC) activity. The FcgRIla receptor (CD32a) is involved in platelet activation and phagocytosis; it has an H / R polymorphism at position 131.
De préférence, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention présente une affinité augmentée par rapport à celle de l'anticorps parent, pour au moins l'un des récepteurs suivants : le complément C1 q, FcgRIla (CD32a), et FcgRIIb (CD32b). Par « affinité augmentée » pour un récepteur, on entend l'augmentation de l'affinité de liaison, in vivo ou in vitro, de la région Fc mutée de l'invention pour ledit récepteur par rapport à l'anticorps parent. Dans ce cas, cette affinité est améliorée par rapport à celle de l'anticorps parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30. Preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention has an increased affinity compared to that of the parent antibody, for at least one of the following receptors: the complement C1 q, FcgRIla (CD32a), and FcgRIIb (CD32b). By "increased affinity" for a receptor is meant the increase in the binding affinity, in vivo or in vitro, of the mutated Fc region of the invention for said receptor relative to the parent antibody. In this case, this affinity is improved relative to that of the parent antibody, with a ratio of at least 2, preferably greater than 5, of preferably greater than 10, preferably greater than 15, preferably greater than 20, preferably greater than 25, preferably greater than 30.
De préférence, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention présente en outre une affinité pour le complément C1 q augmentée par rapport à celle de l'anticorps parent. Ainsi, de préférence, l'anticorps selon l'invention présente une activité CDC augmentée par rapport à celle de l'anticorps parent.  Preferably, the mutated Fc region of the antibody according to the invention additionally has an affinity for complement C1 greater than that of the parent antibody. Thus, preferably, the antibody according to the invention has an increased CDC activity compared to that of the parent antibody.
L'affinité d'un anticorps pour un FcR peut être évaluée par des procédés bien connus de l'art antérieur. Par exemple, l'homme de l'art peut déterminer l'affinité (Kd) en utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR). Alternativement, l'homme de l'art peut effectuer un test ELISA approprié. Un dosage ELISA approprié permet de comparer les forces de liaison du Fc parent et du Fc muté. Les signaux détectés spécifiques du Fc muté et du Fc parent sont comparés. La présente invention se rapporte également à une composition comprenant des anticorps dirigés contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire, possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d'un anticorps parent, et ayant une affinité améliorée pour CD16a et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l'anticorps parent, dans laquelle lesdits fragments Fc modifiés possèdent sur leur site de glycosylation des N-glycannes, lesdits N-glycannes présentant un taux de fucosylation inférieur à 65%, de préférence inférieur à 60%, de préférence inférieur à 55%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 45%, de préférence inférieur à 40%, de préférence inférieur à 35%, de préférence inférieur à 30%, de préférence inférieur à 25%, de préférence inférieur à 20%. Cette composition est appelée « composition selon l'invention ». The affinity of an antibody for a FcR can be evaluated by methods well known in the art. For example, one skilled in the art can determine affinity (Kd) using surface plasmon resonance (SPR). Alternatively, one skilled in the art can perform an appropriate ELISA test. An appropriate ELISA assay compares the binding forces of the parent Fc and the mutated Fc. The detected signals specific for the mutated Fc and the parent Fc are compared. The present invention also relates to a composition comprising antibodies to an immune control point ligand, having a modified Fc fragment relative to that of a parent antibody, and having improved affinity for CD16a and / or ADCC activity increased relative to the parent antibody, wherein said modified Fc fragments have at their glycosylation site N-glycans, said N-glycans having a fucosylation rate of less than 65%, preferably less than 60%, of preferably less than 55%, preferably less than 50%, more preferably less than 45%, preferably less than 40%, preferably less than 35%, preferably less than 30%, preferably less than 25%, preferably less than 20%. This composition is called "composition according to the invention".
Par taux de fucosylation, on entend le ratio de N-glycannes présents sur les fragments Fc présentant un résidu fucose, par rapport à la quantité totale de N-glycannes des fragments Fc au sein d'une composition d'anticorps. By fucosylation rate is meant the ratio of N-glycans present on Fc fragments exhibiting a fucose residue, relative to the total amount of N-glycans of Fc fragments within an antibody composition.
De manière préférentielle, ladite composition d'anticorps comprend un seul type d'anticorps comprenant une région Fc mutée. En d'autres termes, la composition comprend alors des molécules d'anticorps de séquence identique. Preferably, said antibody composition comprises a single type of antibody comprising a mutated Fc region. In other words, the composition then comprises antibody molecules of identical sequence.
De préférence, la composition d'anticorps selon l'invention est faiblement fucosylée. Par « faiblement fucosylée » on entend une composition qui comprend des anticorps dont les fragments Fc présentent sur leur site de glycosylation (Asn 297) des N-glycannes présentant un taux de fucosylation inférieur à 65%, de préférence inférieur à 60%, de préférence inférieur à 55%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 45%, de préférence inférieur à 40%, de préférence inférieur à 35%, de préférence inférieur à 30%, de préférence inférieur à 25%, de préférence inférieur à 20%. Lesdits N- glycannes présentent de préférence des structures glycanniques de type biantennées, avec des chaînes courtes et une faible sialylation. De préférence, la structure glycannique présente des GIcNAc (N-Acétylglucosamine) terminaux non intercalaires. De préférence, la structure glycannique est choisie parmi les formes GO, GOF, G1 et G1 F telles que montrées en Figure 2. Preferably, the antibody composition according to the invention is weakly fucosylated. By "weakly fucosylated" is meant a composition which comprises antibodies whose Fc fragments have on their glycosylation site (Asn 297) N-glycans having a degree of fucosylation of less than 65%, preferably less than 60%, preferably less than 55%, preferably less than 50%, more preferably less than 45%, preferably less than 40%, preferably less than 35%, preferably less than 30%, preferably less than 25%, preferably less than 20%. Said N-glycans preferably have biantennary-type glycan structures, with short chains and low sialylation. Preferably, the glycan structure has non-intermediate terminal GIcNAc (N-acetylglucosamine). Preferably, the glycan structure is chosen from the forms GO, GOF, G1 and G1 F as shown in FIG.
Ainsi, de préférence, lesdits N-glycannes présentent des structures glycanniques de type biantennées, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, des GIcNAc terminaux non intercalaires. Plus particulièrement, la composition d'anticorps présente une teneur en acide sialique inférieure à 25%, 20%, 15%, ou 10%, de préférence 5%, 4% 3% ou 2%. Par taux de sialylation, on entend le ratio de N-glycannes présents sur les fragments Fc présentant un résidu d'acide sialique, par rapport à la quantité totale de N-glycannes des fragments Fc au sein d'une composition d'anticorps. Thus, preferably, said N-glycans have glycan structures of biantenned type, with short chains, low sialylation, non-intermediate terminal GIcNAc. More particularly, the antibody composition has a sialic acid content of less than 25%, 20%, 15%, or 10%, preferably 5%, 4% 3%, or 2%. By sialylation rate is meant the ratio of N-glycans present on Fc fragments having a sialic acid residue, relative to the total amount of N-glycans of Fc fragments within an antibody composition.
Une composition d'anticorps préférée selon l'invention comprend une teneur supérieure à 60%, de préférence supérieure à 80% pour les formes GO + G1 + GOF + G1 F, étant entendu que la teneur des formes GOF + G1 F est inférieure à 50%, de préférence inférieure à 40%, de préférence inférieure à 30%. De préférence, les N-glycannes présentent une teneur supérieure à 60% pour les formes G0+G1 +G0F+G1 F, la teneur en fucose étant inférieure à 65%. Les anticorps dirigés contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire selon l'invention peuvent être préparés par tout procédé bien connu de l'art antérieur. Une fois leurs acides nucléiques codants obtenus, les anticorps selon l'invention peuvent être préparés par tout procédé connu dans la technique.  A preferred antibody composition according to the invention comprises a content greater than 60%, preferably greater than 80% for the forms GO + G1 + GOF + G1 F, it being understood that the content of the forms GOF + G1 F is less than 50%, preferably less than 40%, preferably less than 30%. Preferably, the N-glycans have a content greater than 60% for the forms G0 + G1 + G0F + G1 F, the fucose content being less than 65%. Antibodies directed against a ligand of an immune control point according to the invention may be prepared by any method well known in the art. Once their coding nucleic acids have been obtained, the antibodies according to the invention may be prepared by any method known in the art.
Dans un mode de réalisation, les séquences nucléiques peuvent être clonées dans des cellules-hôtes puis exprimées. Les séquences nucléiques peuvent également être incorporées dans un vecteur d'expression. Une large variété de lignées de cellules-hôtes appropriées peut être utilisée, y compris, mais sans s'y limiter, des cellules de mammifères, des bactéries, des cellules d'insectes et des levures. Les cellules-hôtes peuvent être, mais à titre non limitatif, les cellules YB2/0 (ATCC, CRL- 1662), SP2/0, YE2/0, PERC6, des lignées cellulaires CHO, en particulier CHO-K-1 , CHOS, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil- 2, Jurkat, Vero, COS-7, HEK en particulier 293-HEK, BHK, KGH6, NSO, SP2/0-Ag 14, P3X63Ag8.653, C127, JC, LA7, ZR-45-30, hTERT, NM2C5 ou UACC-812. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'anticorps est exprimé dans la cellule YB2/0. In one embodiment, the nucleic sequences can be cloned into host cells and then expressed. Nucleic sequences may also be incorporated into an expression vector. A wide variety of suitable host cell lines can be used, including, but not limited to, mammalian cells, bacteria, insect cells, and yeasts. The host cells may be, but not limited to, YB2 / 0 cells (ATCC, CRL-1662), SP2 / 0, YE2 / 0, PERC6, CHO cell lines, in particular CHO-K-1, CHOS, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, COS-7, HEK in particular 293-HEK, BHK, KGH6, NSO, SP2 / O-Ag 14, P3X63Ag8.653, C127, JC, LA7, ZR-45-30, hTERT, NM2C5 or UACC-812. In a preferred embodiment of the invention, the antibody is expressed in the YB2 / 0 cell.
Alternativement, les cellules hôtes peuvent être des cellules d'organisme transgénique non humain, notamment des cellules d'animaux transgéniques modifiés pour produire l'anticorps dans le lait, ou bien encore des cellules de plantes transgéniques modifiées pour produire l'anticorps. Dans le cas de cellules d'animaux transgéniques modifiés pour produire l'anticorps dans le lait, l'expression de séquences d'ADN codant pour l'anticorps dirigé contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire selon l'invention est contrôlée par un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, ledit promoteur ne contrôlant pas naturellement la transcription dudit gène, et les séquences d'ADN contenant en outre une séquence de sécrétion de la protéine. La séquence de sécrétion comprend un signal de sécrétion interposé entre la séquence codante et le promoteur. L'animal peut par exemple être choisi parmi le mouton, la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache. Alternatively, the host cells may be non-human transgenic organism cells, including transgenic animal cells modified to produce the antibody in milk, or alternatively transgenic plant cells modified to produce the antibody. In the case of transgenic animal cells modified to produce the antibody in milk, the expression of DNA sequences coding for the antibody directed against a ligand of an immune control point according to the invention is controlled by a mammalian casein promoter or a mammalian whey promoter, said promoter not naturally controlling the transcription of said gene, and the DNA sequences further containing a secretion sequence of the protein. The secretion sequence comprises a secretion signal interposed between the coding sequence and the promoter. The animal may for example be selected from sheep, goat, rabbit, sheep or cow.
Selon ce mode de réalisation, de préférence, des lgG1 entières anti-PDL1 mutées selon l'invention peuvent être générées par production dans le lait d'un animal transgénique, par exemple une chèvre transgénique, et purification par extraction du lait. Pour cela, la séquence codante de la chaîne lourde et la séquence codante de la chaîne légère sont préparées dans un vecteur d'expression sous contrôle d'un promoteur spécifique des glandes mammaires, par exemple un promoteur de caséine de mammifère, permettant de diriger la production et la sécrétion de l'anticorps dans le lait des glandes mammaires. Un tel procédé est notamment décrit dans la demande EP0741515.  According to this embodiment, preferably whole anti-PDL1 IgG1 mutants according to the invention can be generated by production in the milk of a transgenic animal, for example a transgenic goat, and purification by extraction of the milk. For this, the coding sequence of the heavy chain and the coding sequence of the light chain are prepared in an expression vector under the control of a promoter specific for the mammary glands, for example a mammalian casein promoter, making it possible to direct the production and secretion of the antibody in the milk of the mammary glands. Such a method is described in particular in application EP0741515.
La présente invention se rapporte également à des produits (ci-après « produits selon l'invention ») contenant : The present invention also relates to products (hereinafter "products according to the invention") containing:
a) un anticorps dirigé contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire selon l'invention, ou une composition selon l'invention, et a) an antibody directed against a ligand of an immune control point according to the invention, or a composition according to the invention, and
b) un anticorps dirigé contre un point de contrôle immunitaire, possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d'un anticorps parent et ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcRn et optionnellement une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, ledit point de contrôle immunitaire étant choisi parmi PD1 , CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 et a2AR, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers. b) an antibody raised against an immune control point, having a modified Fc fragment relative to that of a parent antibody and having an improved affinity for the FcRn receptor and optionally a functional activity mediated by the decreased Fc region, said immune control being selected from PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR, as combination products for simultaneous, separate or extended use for their use in the prevention or treatment of cancers.
Cet anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) permet notamment la liaison à la cellule cible immunitaire. Par exemple, en se liant au récepteur présent sur les lymphocytes T infiltrant les tumeurs (par exemple PD1 ), il empêche la liaison entre PD1 (présent sur les lymphocytes T) et PDL1 (présent sur les cellules tumorales). On parle alors d'un anticorps neutralisant. L'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) possède un fragment Fc modifié lui conférant une affinité supérieure pour le récepteur FcRn. This anti-immune control point antibody b) allows in particular the binding to the immune target cell. For example, by binding to the receptor present on T cells infiltrating tumors (eg PD1), it prevents the binding between PD1 (present on T cells) and PDL1 (present on tumor cells). This is called a neutralizing antibody. The anti-immune control point antibody b) has a modified Fc fragment conferring higher affinity for the FcRn receptor.
Le récepteur FcRn correspondant au « neonatal Fc receptor » est une protéine composée d'une chaîne lourde codée par le gène FcRn (appelé FCGRT chez l'Homme) et d'une chaîne légère, la molécule de 32-microglobuline. Il peut lier la région Fc des IgG et a pour caractéristique d'augmenter la demi-vie des IgG qui s'y fixent. Le FcRn peut être retrouvé chez différents organismes y compris, sans s'y limiter, les humains, les souris, les rats, les lapins et les singes.  The FcRn receptor corresponding to the "neonatal Fc receptor" is a protein composed of a heavy chain encoded by the FcRn gene (called FCGRT in humans) and a light chain, the 32-microglobulin molecule. It can bind the Fc region of IgG and has the characteristic of increasing the half-life of the IgG that attach to it. FcRn can be found in various organisms including, but not limited to, humans, mice, rats, rabbits and monkeys.
Par « affinité supérieure pour le FcRn » on entend l'augmentation de l'affinité de liaison, in vivo ou in vitro, de la région Fc mutée de l'invention pour le FcRn, par rapport à celle de l'anticorps parent. La capacité de la région Fc mutée de l'invention à se lier à un récepteur FcRn peut être évaluée in vitro par un test ELISA, comme décrit par exemple dans la demande de brevet WO2010/106180. L'augmentation de la liaison au FcRn se traduit par une amélioration de la rétention de sérum in vivo et, par conséquent, une augmentation de la demi-vie.  By "higher affinity for FcRn" is meant the increase in the binding affinity, in vivo or in vitro, of the mutated Fc region of the invention for FcRn, relative to that of the parent antibody. The ability of the mutated Fc region of the invention to bind to a FcRn receptor can be evaluated in vitro by an ELISA assay, as described for example in the patent application WO2010 / 106180. The increase in FcRn binding results in an improvement in serum retention in vivo and, therefore, an increase in half-life.
De préférence, l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) (qui présente une affinité supérieure pour le récepteur FcRn) comprend au moins deux mutations, lesdites mutations étant choisies parmi: Preferably, the anti-immune control point antibody b) (which has a higher affinity for the FcRn receptor) comprises at least two mutations, said mutations being chosen from:
(i) une modification choisie parmi 378V, 378T, 434Y et 434S et  (i) a modification selected from 378V, 378T, 434Y and 434S and
(ii) au moins une modification choisie parmi 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, (ii) at least one modification selected from 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L,
241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii). De préférence, l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une région Fc comprenant au moins une combinaison de mutations choisies parmi 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241 IJ264E/378V, 241 L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 284E/378T/396L, 264E/378V/434Y, 345D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y par rapport à la région Fc dudit anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y and 434S, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not not on the same amino acid as the mutation (ii). Preferably, the anti-immune control point antibody b) has an Fc region comprising at least one combination of mutations selected from 226G / 315D / 434Y, 230S / 315D / 434Y, 230T / 315D / 434Y, 230T / 264E / 434S, 230T / 389T / 434S, 241 IJ264E / 378V, 241L / 264E / 434S, 250A / 389K / 434Y, 2591 / 315D / 434Y, 284E / 378T / 396L, 264E / 378V / 434Y, 345D / 330V / 434Y, 315D / 382V / 434Y and 378V / 383N / 434Y with respect to the Fc region of said parent antibody, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat .
De préférence, l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une région Fc comprenant au moins une mutation choisie parmi 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231 T, 241 L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361 D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421 T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S et 439R par rapport à la région Fc dudit anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Preferably, the anti-immune control point antibody b) has a Fc region comprising at least one mutation selected from 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 259I, 264E. , 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 308I, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S and 439R relative to the Fc region of said antibody parent, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
De préférence, l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une région Fc comprenant une combinaison de mutations choisies parmi 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 345D/330V/361 D/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 241 IJ264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y, 305A/315D/330V/395A/343Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y,Preferably, the anti-immune control point antibody b) has a Fc region comprising a combination of mutations selected from 307A / 315D / 330V / 382V / 389T / 434Y, 256N / 378V / 383N / 434Y, 345D / 330V / 361 D / 378V / 434Y, 2591 / 315D / 434Y, 230S / 315D / 428L / 434Y, 241 IJ264E / 307P / 378V / 433R, 250A / 389K / 434Y, 305A / 315D / 330V / 395A / 343Y, 264E / 386R / 396L / 434S / 439R, 315D / 330V / 362R / 434Y, 294del / 307P / 434Y,
305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y,305A / 315D / 330V / 389K / 434Y, 315D / 327V / 330V / 397M / 434Y,
230T/241 L/264E/265G/378V/421 T, 264E/396L/415N/434S, 227IJ264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y, 230IJ241 IJ243IJ264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y,230T / 241 L / 264E / 265G / 378V / 421 T, 264E / 396L / 415N / 434S, 227IJ264E / 378V / 434S, 264E / 378T / 396L, 230T / 315D / 362R / 426T / 434Y, 226G / 315D / 330V / 434Y, 230IJ241 IJ243IJ264E / 307P / 378V, 250A / 315D / 325S / 330V / 434Y,
290E/315D/342R/382V/434Y, 241 L/315D/330V/392R/434Y,290E / 315D / 342R / 382V / 434Y, 241L / 315D / 330V / 392R / 434Y,
241 IJ264E/307P/378W/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K,241 IJ264E / 307P / 378W / 434S, 230T / 264E / 403T / 434S, 264E / 378V / 416K,
230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y,230T / 315D / 362E / 434Y, 226G / 315D / 434Y, 226G / 315D / 362R / 434Y,
226G/264E/347R/370R/378V/434S, 3081/315D/330V/382V/434Y, 230T/264E/378V/434S, 231 T/241 L/264E/378T/397M/434S, 230L/264E/378W/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421 T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S et 230T/303A/322R/389T/404IJ434S par rapport audit anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. 226G / 264E / 347R / 370R / 378V / 434S, 3081 / 315D / 330V / 382V / 434Y, 230T / 264E / 378V / 434S, 231T / 241L / 264E / 378T / 397M / 434S, 230L / 264E / 378W / 434S, 230T / 315D / 330V / 386K / 434Y, 226G / 315D / 330V / 389T / 434Y, 267R / 307P / 378V / 421T / 434Y, 230S / 315D / 387T / 434Y, 230S / 264E / 352S / 378V / 434S and 230T / 303A / 322R / 389T / 404IJ434S relative to said parent antibody, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
De préférence, l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une région Fc comprenant les combinaisons de mutations choisies parmi N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y, P230S/N315D/M428IJN434Y,Preferably, the anti-immune control point antibody b) has an Fc region comprising the combinations of mutations chosen from N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y, P230S / N315D / M428IJN434Y,
E294del/T307P/N434Y, T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y,E294del / T307P / N434Y, T307A / N315D / A330V / E382V / N389T / N434Y,
V259I/N315D/N434Y, V259l/E294Del/N315D/N434Y et T256N/A378V/S383N/N434Y. L'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) peut présenter une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, par rapport à celle de l'anticorps parent. V259I / N315D / N434Y, V259I / E294Del / N315D / N434Y and T256N / A378V / S383N / N434Y. The anti-immune control point antibody b) may have a functional activity mediated by the decreased Fc region, relative to that of the parent antibody.
Par « activité fonctionnelle médiée par la région Fc » on entend les fonctions effectrices médiées par la région Fc. Sont comprises dans lesdites activités fonctionnelles médiées par la région Fc la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), la cytotoxicité dépendante du complément (CDC), la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), l'activité d'endocytose, la sécrétion de cytokines ou une combinaison d'au moins deux de ces activités. De préférence, l'activité fonctionnelle médiée par la région Fc considérée dans l'invention est l'ADCC. Cette activité fonctionnelle peut être évaluée par des procédés bien connus de l'art antérieur. L'activité fonctionnelle médiée par la région Fc est en particulier diminuée par rapport à celle de l'anticorps parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30. La région Fc mutée de l'anticorps b) selon l'invention a de préférence une affinité diminuée pour au moins un des récepteurs de la région Fc (FcR) choisi parmi le complément C1 q et les récepteurs FcgRIIIa (CD16a), FcgRIla (CD32a), et FcgRIIb (CD32b). Les récepteurs de la région Fc impliqués sont :  Functional activity mediated by the Fc region means the effector functions mediated by the Fc region. Included in said Fc-region mediated functional activities are antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), endocytosis activity, secretion of cytokines or a combination of at least two of these activities. Preferably, the functional activity mediated by the Fc region considered in the invention is ADCC. This functional activity can be evaluated by methods well known in the art. The functional activity mediated by the Fc region is in particular decreased relative to that of the parent antibody, of a ratio at least equal to 2, preferably greater than 5, preferably greater than 10, preferably greater than 15. , preferably greater than 20, preferably greater than 25, preferably greater than 30. The mutated Fc region of antibody b) according to the invention preferably has a decreased affinity for at least one of the Fc region receptors ( FcR) selected from the complement C1 q and the receptors FcgRIIIa (CD16a), FcgRIla (CD32a), and FcgRIIb (CD32b). The receptors of the Fc region involved are:
- C1 q qui est impliqué dans l'activité CDC,  - C1 q who is involved in the CDC activity,
- le récepteur FcgRIIIa (CD16a) qui est lui impliqué dans l'ADCC et présente un polymorphisme V/F en position 158,  the FcgRIIIa receptor (CD16a) which is involved in the ADCC and has a V / F polymorphism at position 158,
- le récepteur FcgRIla (CD32a) qui est quant à lui impliqué dans l'activation plaquettaire et la phagocytose, il présente un polymorphisme H/R en position 131 , et  the FcgRIla receptor (CD32a), which is involved in platelet activation and phagocytosis, has an H / R polymorphism at position 131, and
- le récepteur FcgRIIb (CD32b) qui est impliqué dans l'inhibition de l'activité cellulaire.  the FcgRIIb receptor (CD32b) which is involved in the inhibition of cellular activity.
L'affinité d'un anticorps pour un FcR peut être évaluée par des procédés bien connus de l'art antérieur. Par exemple, l'homme de l'art peut déterminer l'affinité (Kd) en utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR). Alternativement, l'homme de l'art peut effectuer un test ELISA approprié. Un dosage ELISA approprié permet de comparer les forces de liaison du Fc parent et du Fc muté. Les signaux détectés spécifiques du Fc muté et du Fc parent sont comparés. The affinity of an antibody for a FcR can be evaluated by methods well known in the art. For example, one skilled in the art can determine affinity (Kd) using surface plasmon resonance (SPR). Alternatively, one skilled in the art can perform an appropriate ELISA test. An appropriate ELISA assay makes it possible to compare binding forces of the parent Fc and the mutated Fc. The detected signals specific for the mutated Fc and the parent Fc are compared.
Lorsque l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, il permet la neutralisation de la liaison entre le point de contrôle et son ligand (par exemple PD1 et PDL1 ), sans présenter d'activité effectrice. Il permet ainsi le blocage du point de contrôle immunitaire. When the anti-immune control point antibody b) exhibits a functional activity mediated by the decreased Fc region, it allows the neutralization of the binding between the control point and its ligand (for example PD1 and PDL1), without presenting any effector activity. It thus allows the blocking of the immune control point.
De préférence, l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) présente une région Fc ayant au moins la mutation del294. Preferably, the anti-immune control point antibody b) has a Fc region having at least the del294 mutation.
De préférence, selon un autre mode de réalisation, l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) est aglycosylé. Par exemple, il peut être muté sur l'asparagine 297 par un acide aminé empêchant la glycosylation, tel que l'alanine. Ainsi, de préférence, l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) possède une région Fc mutée présentant la mutation N297A par rapport à l'anticorps parent. Preferably, according to another embodiment, the anti-immune control point antibody b) is aglycosylated. For example, it can be mutated on asparagine 297 by an amino acid preventing glycosylation, such as alanine. Thus, preferably, the anti-immune control point antibody b) has a mutated Fc region having the N297A mutation relative to the parent antibody.
De préférence, les produits selon l'invention contiennent : Preferably, the products according to the invention contain:
a) un anticorps dirigé contre PDL1 selon l'invention, ou une composition selon l'invention comprenant des anticorps dirigés contre PDL1 , et a) an antibody directed against PDL1 according to the invention, or a composition according to the invention comprising antibodies directed against PDL1, and
b) un anticorps dirigé contre PD1 , possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d'un anticorps parent et ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcRn et optionnellement une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, b) an antibody directed against PD1, having a modified Fc fragment relative to that of a parent antibody and having an improved affinity for the FcRn receptor and optionally a functional activity mediated by the decreased Fc region,
comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers. as combination products for simultaneous, separate or extended use for their use in the prevention or treatment of cancers.
L'anticorps dirigé contre PD1 (anticorps b) est tel que décrit ci-avant et de préférence présente au moins la mutation del294.  The antibody directed against PD1 (antibody b) is as described above and preferably has at least the del294 mutation.
De préférence, lorsque l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire b) est un anticorps anti-PD1 , il comprend une région variable correspondant à la séquence d'un fragment Fv d'un anticorps anti-PD1 connu, par exemple l'anticorps nivolumab ou l'anticorps pembrolizumab. Ainsi, l'anticorps anti-PD1 selon l'invention peut comprendre une séquence variable de chaîne légère (VL) et une séquence variable de chaîne lourde (VH) correspondant respectivement aux séquences VL et VH de l'anticorps nivolumab ou de l'anticorps pembrolizumab. Preferably, when the anti-immune control point antibody b) is an anti-PD1 antibody, it comprises a variable region corresponding to the sequence of a Fv fragment of a known anti-PD1 antibody, for example the antibody nivolumab or the pembrolizumab antibody. Thus, the anti-PD1 antibody according to the invention may comprise a variable light chain sequence (VL) and a heavy chain variable sequence (VH) respectively corresponding to the VL and VH sequences of the nivolumab antibody or of the antibody pembrolizumab.
Les séquences sont les suivantes : - les séquences VH et VL de l'anticorps nivolumab sont les séquences SEQ ID NO :17 et 18 respectivement ; et The sequences are as follows: the sequences VH and VL of the nivolumab antibody are the sequences SEQ ID NOs: 17 and 18 respectively; and
- les séquences VH et VL de l'anticorps pembrolizumab sont les séquences SEQ ID NO :19 et 20 respectivement.  the VH and VL sequences of the pembrolizumab antibody are the sequences SEQ ID NO: 19 and 20 respectively.
Ainsi, de préférence, l'anticorps anti-PD1 selon l'invention comprend un VH de séquence SEQ ID NO :17 et un VL de séquence SEQ ID NO :18. Thus, preferably, the anti-PD1 antibody according to the invention comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 17 and a VL of sequence SEQ ID NO: 18.
Alternativement, de préférence, l'anticorps anti-PD1 selon l'invention comprend un VH de séquence SEQ ID NO :19 et un VL de séquence SEQ ID NO :20. L'invention concerne également une méthode de traitement de cancers, qui comprend l'administration à un patient d'un anticorps anti-ligand (de préférence anti-PDL1 ) selon l'invention, ou d'une composition selon l'invention (de préférence une composition d'anticorps anti-PDL1 ). Toute voie d'administration est envisagée, notamment des voies parentérales, telles que la voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intradermique, topique, ou par voie mucosale, par exemple par inhalation. Les voies entérales (orale, rectale) et intrathécale sont également possibles. De préférence, la voie intraveineuse est utilisée.  Alternatively, preferably, the anti-PD1 antibody according to the invention comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 19 and a VL of sequence SEQ ID NO: 20. The invention also relates to a method of treating cancers, which comprises administering to a patient an anti-ligand antibody (preferably anti-PDL1) according to the invention, or a composition according to the invention (of preferably an anti-PDL1 antibody composition). Any route of administration is contemplated, including parenteral routes, such as the intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, topical, or mucosal route, for example by inhalation. Enteral (oral, rectal) and intrathecal routes are also possible. Preferably, the intravenous route is used.
Les anticorps selon l'invention sont généralement formulés au sein de compositions pharmaceutiques comprenant des excipients pharmaceutiquement acceptables. The antibodies according to the invention are generally formulated in pharmaceutical compositions comprising pharmaceutically acceptable excipients.
L'invention se rapporte également à une composition pharmaceutique comprenant (i) au moins un anticorps anti-point de contrôle immunitaire selon l'invention, ou une composition selon l'invention, ou des produits selon l'invention et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising (i) at least one anti-immune control point antibody according to the invention, or a composition according to the invention, or products according to the invention and (ii) at least a pharmaceutically acceptable excipient.
Par « composition pharmaceutique », on entend une composition possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales.  By "pharmaceutical composition" is meant a composition having curative or preventive properties with regard to human or animal diseases.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps anti-ligand (de préférence anti-PDL1 ) selon l'invention, ou d'une composition selon l'invention (de préférence d'anticorps anti-PDL1 ), ou de produits selon l'invention, ou d'une composition pharmaceutique telle que décrite au paragraphe précédent, pour traiter les cancers. The subject of the invention is also the use of an anti-ligand antibody (preferably anti-PDL1) according to the invention, or a composition according to the invention (preferably anti-PDL1 antibodies), or of products according to the invention, or a pharmaceutical composition as described in the preceding paragraph, for treating cancers.
Les compositions pharmaceutiques peuvent se présenter sous toute forme galénique adaptée en fonction de la voie d'administration choisie. De préférence, elles contiennent un excipient pharmaceutiquement acceptable pour une formulation susceptible d'être injectée. Il peut s'agir en particulier de formules isotoniques, stériles, de solutions salines, ou de compositions lyophilisées, qui, lors de l'addition d'eau stérilisée ou de sérum physiologique selon les cas, permettent la constitution de solutés injectables. The pharmaceutical compositions may be in any suitable dosage form depending on the chosen route of administration. Preferably, they contain a pharmaceutically acceptable excipient for a formulation that can be injected. It may be in particular isotonic formulas, sterile, saline solutions, or freeze-dried compositions, which, during the addition of sterilized water or physiological saline as appropriate, allow the constitution of injectable solutions.
Les formes pharmaceutiques appropriées pour une utilisation injectable comprennent des solutions aqueuses stériles ou des dispersions, des formulations huileuses, et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions injectables stériles ou de dispersions. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide dans la mesure où elle doit être injectée par seringue. Elle doit être stable dans les conditions de fabrication et de stockage et doit être préservée contre l'action contaminante de microorganismes, comme les bactéries et les champignons.  Pharmaceutical forms suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions, oily formulations, and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions. In all cases, the form must be sterile and must be fluid to the extent that it must be injected by syringe. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms, such as bacteria and fungi.
Les dispersions selon l'invention peuvent être préparées dans du glycérol, des polyéthylèneglycols liquides ou leurs mélanges, ou dans des huiles. Dans des conditions normales de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent un conservateur pour empêcher la croissance des micro-organismes.  The dispersions according to the invention can be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols or mixtures thereof, or in oils. Under normal conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.
L'excipient pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant ou milieu de dispersion. La fluidité convenable peut être maintenue, par exemple, par l'utilisation d'un tensioactif. La prévention de l'action de micro-organismes peut être provoquée par divers agents antibactériens et antifongiques. Dans de nombreux cas, il sera préférable d'inclure des agents isotoniques. L'absorption prolongée des compositions injectables peut être provoquée par l'utilisation dans les compositions d'agents retardant l'absorption.  The pharmaceutically acceptable excipient may be a solvent or dispersion medium. The proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a surfactant. Prevention of the action of microorganisms can be caused by various antibacterial and antifungal agents. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents. Prolonged absorption of the injectable compositions can be caused by the use in the compositions of agents delaying absorption.
Les solutions injectables stériles sont préparées en incorporant les substances actives en quantité requise dans le solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients énumérés ci-dessus, le cas échéant, suivie d'une stérilisation par filtration. En règle générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un excipient stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas de poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les procédés de préparation préférés sont le séchage sous vide et la lyophilisation. Lors de la formulation, les solutions seront administrées d'une manière compatible avec la formulation posologique et en une quantité thérapeutiquement efficace. Les formulations sont facilement administrées dans une variété de formes galéniques, telles que les solutions injectables décrites ci-dessus, mais les capsules de libération de médicament et similaires peuvent également être utilisés. Pour l'administration parentérale dans une solution aqueuse par exemple, la solution doit être convenablement tamponnée et le diluant liquide rendu isotonique avec suffisamment de solution saline ou de glucose. Ces solutions aqueuses particulières conviennent particulièrement pour une administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale. À cet égard, les milieux aqueux stériles qui peuvent être utilisés sont connus de l'homme de l'art. Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active ingredients in the required amount in the appropriate solvent with several of the other ingredients listed above, if appropriate, followed by sterilization by filtration. In general, the dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile excipient that contains the basic dispersion medium and the other required ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum drying and lyophilization. During formulation, the solutions will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in a therapeutically effective amount. The formulations are easily administered in a variety of dosage forms, such as the injectable solutions described above, but drug release capsules and the like can also be used. For parenteral administration in an aqueous solution for example, the solution must be suitably buffered and the liquid diluent rendered isotonic with enough saline or glucose. These particular aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration. In this regard, sterile aqueous media that can be used are known to those skilled in the art.
Le niveau de dose thérapeutiquement efficace spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la gravité de la maladie, l'activité du composé spécifique employé, la composition spécifique utilisée, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le moment de l'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion du composé spécifique utilisé, la durée du traitement, ou encore les médicaments utilisés en parallèle. The level of therapeutically effective dose specific for a particular patient will depend on a variety of factors, including the disorder being treated and the severity of the disease, the activity of the specific compound employed, the specific composition used, the age, the body weight, general health, sex and diet of the patient, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion of the specific compound used, the duration of treatment, or the drugs used in parallel.
Indications indications
Le système immunitaire reconnaît normalement les cellules tumorales comme des éléments étrangers, ce qui a pour conséquence d'entraîner une réponse immunitaire anti- tumorale. Cependant, il arrive que les cellules cancéreuses mettent en place des stratégies d'échappement au système immunitaire ; elles ne sont alors plus reconnues ou éliminées par le système immunitaire. Les points de contrôle immunitaires exprimés en surface des cellules effectrices de l'immunité constituent une voie importante de l'échappement tumoral. En effet, ces molécules, lorsqu'elles sont inhibitrices (ce qui est le cas par exemple pour PD1 , CTLA4, LAG3, TIM3, KIR, BTLA1 et a2AR), ont pour fonction d'atténuer la réponse immunitaire lorsqu'elles sont engagées avec leurs ligands qui sont souvent exprimés par les cellules tumorales.  The immune system normally recognizes tumor cells as foreign elements, which results in an anti-tumor immune response. However, it happens that cancer cells put in place escape strategies to the immune system; they are no longer recognized or eliminated by the immune system. The immune control points expressed on the surface of the effector cells of immunity constitute an important route of tumor escape. Indeed, these molecules, when they are inhibitory (which is the case for example for PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, KIR, BTLA1 and a2AR), have the function of attenuating the immune response when they are engaged with their ligands that are often expressed by tumor cells.
Par « cancer » on entend toute condition physiologique caractérisée par une prolifération cellulaire anormale. By "cancer" is meant any physiological condition characterized by abnormal cell proliferation.
Les anticorps selon l'invention, les compositions selon l'invention, les produits et la composition pharmaceutique selon l'invention, sont ainsi utilisés pour traiter différents types de cancers. Des exemples de cancers incluent notamment des cancers du poumon « non à petites cellules » (NSCLC), des mélanomes non résécables ou métastatiques, des carcinomes des cellules rénales avancés, des cancers de la vessie, les cancers du rein, des mélanomes, des cancers du poumon, des lymphomes, des mésothéliomes, des cancers colorectaux, les cancers colorectaux métastatiques, des cancers du sein, des cancers gastriques, des cancer de la tête et du cou, des tumeurs du cerveau, des glioblastomes, des tumeurs solides, des cancers de l'endomètre, des cancers de l'œsophage, des adénocarcinomes gastriques, des tumeurs des cellules germinales, des cancers des testicules, des carcinomes hepatocellulaires, des cancers du thymus, des lymphomes diffus à grande cellules B (LDGCB), des cancers hématologiques, des cancers hématologiques avancés (tels que les lymphomes non hodgkiniens, les lymphomes hodgkiniens, les leucémies lymphoïdes chroniques, les mélanomes multiples, les leucémies myéloïdes aiguës), les astrocytomes, les mélanomes de l'uvée, les sarcomes solides, les cancers de l'épithélium ovarien, les cancers péritonéaux primaires, les cancers des trompes de Fallope, des cancers du col de l'utérus, des cancers de l'anus, des cancers ovariens, des cancers urogénitaux, des cancers urothéliaux, des cancers génito-urinaires, des néoplasmes urogénitaux, des tumeurs thoraciques, des carcinomes adrénocorticaux, des cancers biliaires, des lymphomes folliculaires, des cancers du pancréas, des cancers de la prostate, des métastases cérébrales, des cancers du foie, des adénocarcinomes cervical, des tumeurs stromales gastrointestinales, des cancers du cerveau métastatiques, des carcinomes des cellules de Merkel, le sarcome synovial, les fibrosarcomes, cette liste n'étant pas exhaustive. The antibodies according to the invention, the compositions according to the invention, the products and the pharmaceutical composition according to the invention are thus used to treat different types of cancer. Examples of cancers include non-small cell lung cancer (NSCLC), unresectable or metastatic melanoma, advanced renal cell carcinoma, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, cancer lung cancer, lymphoma, mesothelioma, colorectal cancer, metastatic colorectal cancer, breast cancer, gastric cancer, head and neck cancer, brain tumors, glioblastoma, solid tumors, cancer of the endometrium, esophageal cancers, gastric adenocarcinomas, germ cell tumors, testicular cancer, hepatocellular carcinoma, thymus cancer, diffuse large B-cell lymphoma (CBGLD), hematologic malignancies, advanced hematologic malignancies (such as non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin's lymphoma, chronic lymphoid leukemia, multiple melanomas, acute myeloid leukemias), astrocytomas, uveal melanomas, solid sarcomas, ovarian epithelial cancers, primary peritoneal cancers, fallopian tube cancers, cervical cancer uterine cancers, anal cancers, ovarian cancers, urogenital cancers, urothelial cancers, genitourinary cancers, urogenital neoplasms, thoracic tumors, adrenocortical carcinomas, biliary cancers, follicular lymphomas, pancreases, prostate cancers, brain metastases, liver cancers, cervical adenocarcinomas, stro tumors gastrointestinal males, metastatic brain cancers, Merkel cell carcinomas, synovial sarcoma, fibrosarcomas, this list is not exhaustive.
La liste des séquences décrites dans la présente demande est la suivante : The list of sequences described in this application is as follows:
L'invention est maintenant illustrée par les exemples qui suivent, qui ne sont nullement limitatifs. Exemple 1 : Production des variants d'IqGI anti-PDL1 selon l'invention en cellules YB2/0  The invention is now illustrated by the following examples, which are in no way limiting. Example 1 Production of the variants of IqGI anti-PDL1 according to the invention in YB2 / 0 cells
A/ Construction des variants Fc : A / Construction of Fc variants:
Chaque mutation d'intérêt dans le fragment Fc a été insérée indépendamment dans un vecteur d'expression contenant la chaîne lourde anti-PDL1 (contenant la partie variable de l'anticorps anti-PDL1 atezolizumab, durvalumab ou avelumab, et la partie constante de région Fc wild-type) par PCR de chevauchement en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la ou les mutation(s) ciblées avec le(s) codon(s) codant l'acide aminé souhaité. Avantageusement, quand les mutations à insérer sont proches sur la séquence du Fc, elles sont ajoutées via un même oligonucléotide. Les fragments ainsi obtenus par PCR ont été associés et le fragment résultant a été amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR, contenant la chaîne lourde entière de l'anti-PDL1 muté sur le fragment Fc, a été purifié sur gel d'agarose 1 % (w/v), digéré avec les enzymes de restriction adéquates et cloné dans le vecteur d'expression eucaryote (HK-Gen EFSS, voir figure 3) qui contient également la chaîne légère non modifiée de l'anticorps anti-PDL1 considéré. Each mutation of interest in the Fc fragment was inserted independently into an expression vector containing the anti-PDL1 heavy chain (containing the variable portion of the anti-PDL1 antibody atezolizumab, durvalumab or avelumab, and the region constant part). Fc wild-type) by overlap PCR using two sets of primers adapted to integrate the targeted mutation (s) with the codon (s) encoding the desired amino acid. Advantageously, when the mutations to be inserted are close to the Fc sequence, they are added via the same oligonucleotide. The fragments thus obtained by PCR were combined and the resulting fragment was amplified by PCR using standard protocols. The PCR product, containing the entire heavy chain of anti-PDL1 mutated on the Fc fragment, was purified on 1% agarose gel (w / v), digested with the appropriate restriction enzymes and cloned into the vector. expression eukaryote (HK-Gen EFSS, see Figure 3) which also contains the unmodified light chain of the anti-PDL1 antibody considered.
B/ Production des variants sous forme d'Ig entière dans YB2/0 : B / Production of variants as whole Ig in YB2 / 0:
Les variants Fc peuvent être préparés dans un format lgG1 entière dans la lignée cellulaire YB2/0 (ATCC, CRL-1662) avec la spécificité anti-PDL1 . Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps peuvent être réalisées selon les techniques décrites dans l'exemple 1 de la demande WO2001/77181 afin de produire et sélectionner des anticorps caractérisés par un faible taux de fucosylation au niveau de leur site de glycosylation Asn 297 sur le Fc.  Fc variants can be prepared in an entire IgG1 format in the YB2 / 0 cell line (ATCC, CRL-1662) with anti-PDL1 specificity. The steps of production by cell culture and purification of the antibodies can be carried out according to the techniques described in Example 1 of the application WO2001 / 77181 in order to produce and select antibodies characterized by a low fucosylation rate at their site of Asn 297 glycosylation on Fc.
Les combinaisons de mutations suivantes sont de préférence sélectionnées pour produire les anti-PDL1 dans YB2/0 : The following combinations of mutations are preferably selected to produce anti-PDL1 in YB2 / 0:
dans la demande WO2010/106180  in the application WO2010 / 106180
Exemple 2 : Production des variants d'IqGI anti-PDL1 selon l'invention en cellules CHOS ou HEK, ou dans le lait d'animaux transgéniques Example 2 Production of the variants of IqGI anti-PDL1 according to the invention in CHOS or HEK cells, or in the milk of transgenic animals
Les combinaisons de mutations suivantes sont de préférence sélectionnées : The following combinations of mutations are preferably selected:
Tableau 2 : Mutants d'IqGI anti-PDL1 sélectionnés selon la méthode décrite dans la demande WO2016/177984  Table 2: Mutants of IqGI anti-PDL1 selected according to the method described in application WO2016 / 177984
Avantageusement, les mutants peuvent contenir les mutations du variant T5A-74, C6A- 74, ou T5A-74A telles que présentées dans le tableau 1 et les mutations d'un variant listé en tableau 2. Advantageously, the mutants may contain mutations of the variant T5A-74, C6A-74, or T5A-74A as shown in Table 1 and the mutations of a variant listed in Table 2.
Alternativement, les mutants peuvent contenir les mutations du variant T5A-74, C6A-74, ou T5A-74A tel que présentées dans le tableau 1 et l'une des mutations suivantes : V240M, L242K, L242G, L242F, F243L, E258R, T260A, V262A, K290G, Y296W, S298R ou V302R. Alternatively, the mutants may contain mutations of the variant T5A-74, C6A-74, or T5A-74A as shown in Table 1 and one of the following mutations: V240M, L242K, L242G, L242F, F243L, E258R, T260A , V262A, K290G, Y296W, S298R or V302R.
2-1/ Production des variants sous forme d'Ig entière dans CHO ou HEK 2-1 / Production of variants in the form of whole Ig in CHO or HEK
Les variants Fc, produits par mutagenèse dirigée selon la méthode de l'exemple 1 -A, peuvent être préparés dans un format lgG1 entière dans une lignée cellulaire CHOS (vecteur bicistronique HK-Gen EFSS) ou HEK (en utilisant le vecteur pCEP4 monocistronique, un vecteur contenant la chaîne légère et l'autre vecteur similaire contenant la chaîne lourde mutée, voir figure 3) avec la spécificité anti-PDL1 . Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps peuvent être réalisées selon les techniques bien connues et par exemple décrites dans la demande WO2016/177984 (exemple 2.6 dans HEK). 2-2/ Production des variants sous forme d'Ig entière dans le lait d'animal transgénique The Fc variants, produced by site-directed mutagenesis according to the method of Example 1-A, can be prepared in an entire IgG1 format in a CHOS cell line (HK-Gen EFSS bicistronic vector) or HEK (using the monocistronic pCEP4 vector, a vector containing the light chain and the other similar vector containing the mutated heavy chain, see Figure 3) with anti-PDL1 specificity. The steps of production by cell culture and purification of the antibodies can be carried out according to well known techniques and for example described in application WO2016 / 177984 (example 2.6 in HEK). 2-2 / Production of variants in the form of whole Ig in transgenic animal milk
Les lgG1 entières anti-PDL1 mutées peuvent également être générées par production dans le lait d'un animal transgénique, par exemple une chèvre transgénique, et purification par extraction du lait. Pour cela, la séquence codante de la chaîne lourde et la séquence codante de la chaîne légère sont préparées dans un vecteur d'expression sous contrôle d'un promoteur spécifique des glandes mammaires, par exemple un promoteur de caséine de mammifère, permettant de diriger la production et la sécrétion de l'anticorps dans le lait des glandes mammaires. Un tel procédé est notamment décrit dans la demande EP0741515.  The mutated anti-PDL1 whole IgG1 can also be generated by production in the milk of a transgenic animal, for example a transgenic goat, and purification by extraction of the milk. For this, the coding sequence of the heavy chain and the coding sequence of the light chain are prepared in an expression vector under the control of a promoter specific for the mammary glands, for example a mammalian casein promoter, making it possible to direct the production and secretion of the antibody in the milk of the mammary glands. Such a method is described in particular in application EP0741515.
Exemple 3A : Méthodes permettant la caractérisation de la liaison au FcqRllla, de la liaison antiqénique et de la liaison au FcRn des variants d'IqGI anti-PDL1 selon l'invention Example 3A: Methods for characterizing FcqRIIa binding, antigenic binding and FcRn binding of IqGI anti-PDL1 variants according to the invention
Les tests de liaison au FcgRIIIa, au ligand PDL1 et au FcRn sont réalisés selon les méthodes décrites dans la demande WO2010/106180. Brièvement, les liaisons des lgG1 au FcgRIIIa, au ligand PDL1 et au FcRn sont mesurées par un test ELISA classique. Pour cela des immunoplaques Maxisorp sont revêtues avec des antigènes PDL1 (pH = 7.4) ou des FcRn (pH = 6.0). Ensuite, les solutions d'IgGI anti-PDL1 parent ou de chaque variant lgG1 anti-PDL1 sont ajoutées dans chaque puits avec une concentration finale de 1 ,25μg d'IgG/mL pour FcRn ou 0,25μg d'IgG/mL pour les autres récepteurs, pendant 1 h à 37°C, puis sont mises en contact avec des F(ab')2 d'IgG HRP de chèvre anti-humaine pendant 1 h à 37°C. Les lgG1 liées sont détectées après révélation au TMB par mesure de l'absorbance à 450 nm. FcgRIIIa, ligand PDL1 and FcRn binding assays are performed according to the methods described in application WO2010 / 106180. Briefly, IgG1 binding to FcgRIIIa, PDL1 ligand and FcRn are measured by standard ELISA. For this, Maxisorp immunoplates are coated with PDL1 antigens (pH = 7.4) or FcRn (pH = 6.0). Next, the anti-PDL1 IgGI parent solutions or each anti-PDL1 IgG1 variant are added to each well with a final concentration of 1.25 μg of IgG / ml for FcRn or 0.25 μg of IgG / ml for other receptors, for 1 hour at 37 ° C, and then contacted with F (ab ') 2 IgG HRP goat anti-human for 1 h at 37 ° C. The IgG1 bound are detected after revelation at TMB by measuring the absorbance at 450 nm.
Pour la liaison au FcgRIIIa (CD16a), FcgRIlaH/R (CD32aH/R), FcgRIIb (CD32b) ou FcgRI (CD64), des immunoplaques Maxisorp ou NiNTA sont revêtues avec des FcgRI NaV/F, FcgRI laH/R, FcgRIIb ou FcgRI, et saturée en PBS-BSA 4%. Ensuite, les solutions d'IgGI anti-PDL1 parent ou de chaque variant lgG1 anti-PDL1 avec une concentration finale de 0^g d'IgG/mL sont mises en contact avec des F(ab')2 d'IgG HRP de chèvre antihumaine à la même concentration pendant 2 heures à température ambiante, sous faible agitation. Les IgG agrégées aux F(ab')2 sont ensuite incubées sous agitation douce pendant 1 heure à 30°C sur les plaques ELISA saturées pour le FcgR. Les plaques sont ensuite révélées avec TMB (Pierce) et les absorbances sont lues à 450 nm. Les variants de Fc C6A 74 et T5A 74A, comprenant la partie variable du durvalumab ou de l'atezolizurnab (i.e. respectivement, les séquences VH et VL respectives de l'anticorps durvalumab sont les séquences SEQ ID NO :13 et 14, et les séquences VH et VL respectives de l'anticorps atezolizumab sont les séquences SEQ ID NO :1 1 et 12), ont été produits dans YB2/0 ou dans CHO comme dans l'exemple 1 : For binding to FcgRIIIa (CD16a), FcgRIlaH / R (CD32aH / R), FcgRIIb (CD32b) or FcgRI (CD64), Maxisorp or NiNTA immunoplates are coated with FcgRI NaV / F, FcgRI laH / R, FcgRIIb or FcgRI and saturated with 4% PBS-BSA. Next, the parent anti-PDL1 IgGI solutions or each anti-PDL1 IgG1 variant with a final concentration of 0 μg IgG / ml are contacted with goat IgG HRP F (ab ') 2's. antihuman at the same concentration for 2 hours at room temperature, with gentle agitation. IgG aggregated with F (ab ') 2 are then incubated with gentle shaking for 1 hour at 30 ° C on ELISA plates saturated for FcgR. The plates are then revealed with TMB (Pierce) and the absorbances are read at 450 nm. The variants of Fc C6A 74 and T5A 74A, comprising the variable portion of durvalumab or atezolizurnab (respectively respectively, the respective VH and VL sequences of the durvalumab antibody are the sequences SEQ ID NO: 13 and 14, and the sequences Respective VH and VL of the atezolizumab antibody are the sequences SEQ ID NO: 11 and 12), were produced in YB2 / 0 or in CHO as in Example 1:
Le contrôles de référence sont constitués par : The reference checks consist of:
- Fc-WT produit en YB2/0,  - Fc-WT produced in YB2 / 0,
- Fc-WT produit en CHO, mais aussi  - Fc-WT produced in CHO, but also
- le Fc aglycosylé comprenant la mutation N297A (appelé « N297A ») produit en CHO, et the aglycosylated Fc comprising the N297A mutation (called "N297A") produced in CHO, and
- le Fc-FES (i.e. comprenant les 3 mutations L234F/L235E/P331 S). Fc-FES (i.e. including the 3 L234F / L235E / P331 S mutations).
Puis leurs liaisons au FcgRIIIa humain (hCD16aV et hCD16aF) et au FcRn humain (hFcRn) ont été mesurées. Their binding to human FcgRIIIa (hCD16aV and hCD16aF) and human FcRn (hFcRn) was then measured.
Les résultats sont les suivants The results are as follows
Les résultats montrent que les variants C6A 74 et T5A 74A ont tous les deux une liaison équivalente à hFcRn, qui est fortement augmentée (plus de 12 fois), comparé à leur parent WT respectif. The results show that variants C6A 74 and T5A 74A both have a binding equivalent to hFcRn, which is greatly increased (more than 12 fold), compared to their respective parent WT.
Il ressort que tous les variants produits en cellules YB2/0 présentent une liaison accrue à hCD16aV et à hCD16aF comparé à leur parent WT respectif produit en cellules CHO. Pour les variants produits en cellules YB2/0 : It appears that all variants produced in YB2 / 0 cells show increased binding to hCD16aV and hCD16aF compared to their respective parent WT produced in CHO cells. For variants produced in YB2 / 0 cells:
- C6A 74 présente une liaison équivalente ou légèrement diminuée à hCD16aV et hCD16aF comparé au parent WT, tout en avant une liaison au FcRn fortement augmentée ;  - C6A 74 has an equivalent or slightly diminished binding to hCD16aV and hCD16aF compared to the parent WT, all the way forward to a strongly increased FcRn binding;
- T5A 74A présente une liaison éguivalente à hCD16aV, et légèrement augmentée à hCD16aF, tout en avant une liaison au FcRn fortement augmentée.  T5A 74A has an equivalent uptake to hCD16aV, and slightly increased to hCD16aF, all the while leading to a strongly increased FcRn binding.
Des résultats similaires sont obtenus avec le durvalumab et l'atezolizurnab ; ils présentent une liaison augmentée à hFcRn et à hCD16aV/F. Similar results are obtained with durvalumab and atezolizurnab; they show increased binding to hFcRn and hCD16aV / F.
Exemple 3B : Méthodes permettant la caractérisation de la liaison au FcqRllla, de la liaison antiqénique et de la liaison au FcRn d'autres variants d'IqGI anti-PDL1 selon l'invention Example 3B: Methods for characterizing FcqRIIa binding, antigenic binding and FcRn binding of other variants of IqGI anti-PDL1 according to the invention
Les mêmes tests que ceux décrits à l'exemple 3A ont été effectués pour les variants suivants, comprenant la partie variable du durvalumab (i.e. avec séquences VH et VL respectives SEQ ID NO :13 et 14), et produits dans des cellules CHO: The same tests as those described in Example 3A were carried out for the following variants, comprising the variable portion of durvalumab (i.e. with respective VH and VL sequences SEQ ID NO: 13 and 14), and produced in CHO cells:
L'anticorps parent durvalumab Fc-WT a été produit en cellules CHO. The parent antibody durvalumab Fc-WT was produced in CHO cells.
Puis leurs liaisons à PD-L1 humain et murin, au FcgRIIIa humain (hCD16aV et hCD16aF), à hFcRn, à CD64 humain (hCD64), et aux hCD32aH/aR/b, sont mesurées. Then their binding to human and murine PD-L1, human FcgRIIIa (hCD16aV and hCD16aF), hFcRn, human CD64 (hCD64), and hCD32aH / aR / b were measured.
Les résultats sont les suivants : The results are as follows:
Tous les anticorps anti-PD-L1 présentent une forte liaison à PD-L1 humain, et aucune liaison à PD-L1 murin. All anti-PD-L1 antibodies show strong binding to human PD-L1, and no binding to murine PD-L1.
L'ensemble des variants Durvalumab (soit les variants de format C6A-74, T5A-74 et A3A- 184) présente une liaison équivalente augmentée pour FcRn comparé à Fc-WT. Les variants Durvalumab de format A3A-184 présentent la meilleure affinité pour hCD64, suivis par les variants de format T5A-74, puis enfin dans une moindre mesure par les variants de format C6A-74.  The set of Durvalumab variants (the C6A-74, T5A-74 and A3A-184 variants) has an increased equivalent binding for FcRn compared to Fc-WT. Durvalumab variants of A3A-184 format have the best affinity for hCD64, followed by variants of T5A-74 format, and finally to a lesser extent by C6A-74 variants.
Les variants Durvalumab A3A-184E et A3A-184EY présentent une liaison équivalente et augmentée pour hCD16aF. Ils représentent les meilleurs variants. Les variants Durvalumab T5A-74MA, T5A-74AG, A3A-184A, A3A-184AY présentent une liaison augmentée pour hCD16aF comparé à Fc-WT produit dans des cellules CHO. The Durvalumab A3A-184E and A3A-184EY variants show an equivalent and augmented binding for hCD16aF. They represent the best variants. Durvalumab variants T5A-74MA, T5A-74AG, A3A-184A, A3A-184AY show increased binding for hCD16aF compared to Fc-WT produced in CHO cells.
Les variants Durvalumab C6A-74, C6A-74W, C6A-74G et T5A-74A comparé à Fc-WT produit en cellules CHO présentent une liaison équivalente à hCD16aF.  Durvalumab variants C6A-74, C6A-74W, C6A-74G and T5A-74A compared to Fc-WT produced in CHO cells show a binding equivalent to hCD16aF.
Les variants Durvalumab A3A-184E, A3A-184EY, A3A-184A, A3A-184AY et T5A-74MA présentent une liaison équivalente augmentée pour hCD16aV comparé à Fc-WT. Durvalumab A3A-184E, A3A-184EY, A3A-184A, A3A-184AY and T5A-74MA variants show increased equivalent binding for hCD16aV compared to Fc-WT.
Les variants Durvalumab C6A-74W, C6A-74G, T5A-74A et T5A-74AG présentent une liaison augmentée à hCD16aV comparé à Fc-WT.  The Durvalumab C6A-74W, C6A-74G, T5A-74A and T5A-74AG variants show increased binding to hCD16aV compared to Fc-WT.
Les variants Durvalumab A3A-184AG et C6A-74 comparé à Fc-WT produit en cellules CHO a une liaison équivalente à hCD16aV.  The Durvalumab A3A-184AG and C6A-74 variants compared to Fc-WT produced in CHO cells has a binding equivalent to hCD16aV.
Les variants Durvalumab A3A-184A, A3A-184AY, A3A-184E, T5A-74AG et A3A-184EY présentent une liaison légèrement augmentée à hCD32aH comparé à Fc-WT. The Durvalumab A3A-184A, A3A-184AY, A3A-184E, T5A-74AG and A3A-184EY variants show a slightly increased binding to hCD32aH compared to Fc-WT.
Les variants Durvalumab C6A-74, T5A-74MA, C6A-74W, C6A-74G et T5A-74A comparé à Fc-WT présentent une liaison équivalente à hCD32aH.  The variants Durvalumab C6A-74, T5A-74MA, C6A-74W, C6A-74G and T5A-74A compared to Fc-WT have a binding equivalent to hCD32aH.
Tous les variants Durvalumab montrent avantageusement une liaison conservée à hCD32b comparé à Fc-WT. All Durvalumab variants advantageously show a conserved binding to hCD32b compared to Fc-WT.
Tous les variants Durvalumab montrent avantageusement une liaison conservée à hCD32aR comparé à Fc-WT. En conclusion, les variants A3A-184E et A3A-184EY semblent les meilleurs candidats avec la plus forte liaison à hFcRn et hCD16aF/V. Les variants A3A-184AY et T5A-74MA semblent de très bons candidats également avec une bonne liaison à hFcRn et hCD16aF/V. Ces quatre variants présentent une forte liaison à hCD64 et une bonne liaison à hCD32aH. Ainsi, ces quatre variants peuvent avantageusement être utilisés dans le cadre d'un traitement du cancer par un anti-PDL1 . All Durvalumab variants advantageously show a conserved hCD32aR binding compared to Fc-WT. In conclusion, variants A3A-184E and A3A-184EY appear to be the best candidates with the strongest binding to hFcRn and hCD16aF / V. Variants A3A-184AY and T5A-74MA appear to be very good candidates also with good binding to hFcRn and hCD16aF / V. These four variants show strong hCD64 binding and good hCD32aH binding. Thus, these four variants can advantageously be used in the context of cancer treatment with an anti-PDL1.
Exemple 3C : Méthode permettant la caractérisation de la demi-vie Des expériences de pharmacocinétique ont également été effectuées chez les souris hFcRn qui sont homozygotes KO pour un allèle du FcRn murin et hétérozygote pour un transgène de FcRn humain (m FcRn hFcRnTg), afin d'évaluer la demi-vie des variants atezolizumab (i.e. avec séquences VH et VL respectives SEQ ID NO :1 1 et 12) avec Fc C6A 74 ou T5A 74A selon l'invention. Example 3C: Method for Characterizing Half-Life Pharmacokinetic experiments were also performed in hFcRn mice which are homozygous KO for a murine FcRn allele and heterozygous for a human FcRn transgene (m FcRn hFcRnTg), in order to evaluate the half-life of atezolizumab variants (ie with respective VH and VL sequences SEQ ID No. 1 1 and 12) with Fc C6A T5A 74 or 74A according to the invention.
Pour ces études pharmacocinétiques, chaque animal a reçu une seule injection intraveineuse d'IgG à 5 mg/kg au niveau du sinus rétro-orbital, dans un protocole similaire à celui décrit précédemment (Petkova SB, et al. Enhanced half-life of genetically engineered human lgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease. Int Immunol 2006). For these pharmacokinetic studies, each animal received a single intravenous injection of 5 mg / kg IgG at the retro-orbital sinus, in a protocol similar to that previously described (Petkova SB, et al., Enhanced half-life of genetically engineered human IgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease (Int Immunol 2006).
Généralement la demi-vie est calculée à partir des concentrations plasmatiques mesurées durant la phase d'élimination. Generally the half-life is calculated from the plasma concentrations measured during the elimination phase.
Le temps de demi-vie peut être ainsi obtenu : The half-life time can thus be obtained:
- par résolution d'équation: - by solving the equation:
T1/2 = (Ln2 x Vd) / CL, avec  T1 / 2 = (Ln2 x Vd) / CL, with
Vd = volume de distribution = Dose / concentration plasmatique initiale  Vd = volume of distribution = initial dose / plasma concentration
CL = Clairance = Dose / AUC (aire sous la courbe) - par analyse graphique en déterminant sur l'axe des ordonnées (concentration en μg/ml) l'intervalle de temps écoulé entre la concentration C1 et la concentration C2. Il est impératif de tracer cette courbe en échelle semi-logarithmique afin de s'assurer de l'alignement des points expérimentaux dans cette dernière phase dite d'élimination. La durée d'exploration de cette pente doit être suffisamment longue pour permettre une estimation précise de la demi-vie. Une fois la pente de la phase d'élimination mesurée (ke ou constante d'élimination), la demi-vie peut être calculée comme suit : CL = Clearance = Dose / AUC (area under the curve) - by graphical analysis by determining on the ordinate axis (concentration in μg / ml) the time interval between the C1 concentration and the C2 concentration. It is imperative to draw this curve on a semi-logarithmic scale in order to ensure the alignment of the experimental points in this last so-called phase of elimination. The duration of exploration of this slope must be long enough to allow an accurate estimation of the half-life. Once the slope of the phase of elimination measured (k e or elimination constant), the half-life can be calculated as follows:
T1/2 = Ln2 / ke = 0.693 / ke Par ailleurs, le MRT ou le temps moyen de résidence peut être estimé. Il traduit la durée de présence du variant dans l'organisme. T1 / 2 = Ln2 / k e = 0.693 / k e Furthermore, the MRT or the average residence time can be estimated. It reflects the duration of presence of the variant in the body.
Le MRT peut être obtenu comme suit : The MRT can be obtained as follows:
MRT = AUC / AUMC, avec MRT = AUC / AUMC, with
AUC = moment d'ordre 0 de la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps  AUC = time 0 of the plasma concentration versus time curve
AUMC = moment d'ordre 1 de la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps.  AUMC = first order moment of the plasma concentration versus time curve.
Des échantillons de sang ont été prélevés à partir du sinus rétro-orbital à de multiples points de temps et les IgGs titrées par ELISA. Blood samples were taken from the retro-orbital sinus at multiple time points and IgGs titrated by ELISA.
Les résultats sont les suivants The results are as follows
Les paramètres analysés sont définis ci-dessous :  The parameters analyzed are defined below:
T1/2 : demi-vie  T1 / 2: half-life
Cmax: concentration maximale obtenu à un temps donné, correspondant au temps  Cmax: maximum concentration obtained at a given time, corresponding to time
de concentration plasmatique maximale (Tmax) maximum plasma concentration (Tmax)
AUCinf : Aire sous la courbe temps/concentration plasmatique de T0 à l'infini  AUCinf: Area under the time / plasma concentration curve from T0 to infinity
Vd : Volume de distribution Vd: Distribution volume
Cl : Clairance Cl: Clearance
MRT: temps moyen de résidence  MRT: average residence time
Ils montrent que les variants atezolizumab C6A 74 et T5A 74A présentent une augmentation de leur demi-vie de plus de 2 et 3 fois par rapport au parent WT respectivement. Par ailleurs, les variants atezolizumab C6A 74 et T5A 74A présentent une augmentation du temps moyen de résidence de plus de 2 et 3 fois par rapport au parent WT, respectivement. They show that Atezolizumab variants C6A 74 and T5A 74A show an increase in their half-life of more than 2 and 3 times compared to the parent WT respectively. In addition, Atezolizumab variants C6A 74 and T5A 74A show an increase in mean residence time of more than 2 and 3 times compared to the parent WT, respectively.
Exemple 4 : Méthode permettant de tester l'activité ADCC des variants d'IqGI anti- PDL1 selon l'invention EXAMPLE 4 Method for Testing ADCC Activity of IqGI Anti-PDL1 Variants According to the Invention
Exemple 4A : Méthodes utilisant des cellules eucaryotes tumorales humaines comme cible Example 4A: Methods Using Human Tumor Eukaryotic Cells as Target
Des cellules NK sont incubées avec des cellules eucaryotes tumorales humaines (telles que les lignées A431 et A549) exprimant PDL1 , en présence de différentes concentrations (0.005 à 5000 ng/ml) d'IgGI anti-PDL1 parent ou de chaque variant lgG1 anti-PDL1 . Le niveau de lactate déshydrogénase (LDH) intracellulaire libéré par les cellules cibles lysées est mesuré.  NK cells are incubated with human tumor eukaryotic cells (such as lines A431 and A549) expressing PDL1, in the presence of different concentrations (0.005 to 5000 ng / ml) of parental anti-PDL1 IgG1 or each anti-PDL1 variant. PDL1. The level of intracellular lactate dehydrogenase (LDH) released by the lysed target cells is measured.
Des cellules NK humaines sont purifiées à partir de sang périphérique de donneurs volontaires sains par la technique de déplétion négative développée par Miltenyi. Le test ADCC comprend l'incubation de cellules NK avec des cellules eucaryotes cibles exprimant l'antigène PDL1 , en présence de différentes concentrations d'anticorps anti- PDL1 . Après 16 heures d'incubation, la cytotoxicité induite par les anticorps anti-PDL1 est mesurée en quantifiant dans les surnageants cellulaires la LDH intracellulaire libérée par les cellules cibles lysées.  Human NK cells are purified from peripheral blood of healthy volunteer donors by the negative depletion technique developed by Miltenyi. The ADCC test involves the incubation of NK cells with target eukaryotic cells expressing the PDL1 antigen, in the presence of different concentrations of anti-PDL1 antibodies. After 16 hours of incubation, the cytotoxicity induced by the anti-PDL1 antibodies is measured by quantifying in cell supernatants the intracellular LDH released by the lysed target cells.
Cette méthode peut être efficacement utilisée pour évaluer l'augmentation de l'activité ADCC des anticorps sélectionnés dans le cadre de la présente demande.  This method can be effectively used to evaluate the increase in ADCC activity of the antibodies selected in the present application.
Exemple 4B : Test d'activation des cellules Jurkat exprimant stablement le récepteur CD16 en surface (Jurkat-CD16), par des anticorps anti-PDL1 , en présence de cellules cibles exprimant PDL1 La sécrétion d'IL-2 par les cellules Jurkat-CD16 en présence d'une composition d'anticorps est connue pour être corrélée à l'activité ADCC via FCYRI I I (CD16) (voir WO2004024768, page 3 lignes 12/18, page 4 ligne 29 à page 5 ligne 2, page 8 lignes 25- 29, et surtout l'Exemple 2 pages 14-15 et la Figure 10). Les mêmes anticorps et contrôles de référence que ceux de l'exemple 3A ont été caractérisés pour leur activation de cellules Jurkat-CD16, par mesure de la sécrétion d'IL- 2. Des cellules cibles K1 PD-L1 aAPC/CHO (25 000 cellules/puits dans 50 μΙ) ont été incubées avec 50 μΙ de concentrations croissantes d'anticorps anti-PDL1 (0 à 1250 ng/ml finale) en présence de 50μΙ de cellules Jurkat-hCD16aF (250 000 cellules/puits) et 50μΙ de PMA (Phorbol-Myristate Acétate) à une concentration finale de 10 ng/ml. Example 4B: Activation test of Jurkat cells stably expressing the CD16 receptor on the surface (Jurkat-CD16), by anti-PDL1 antibodies, in the presence of target cells expressing PDL1 Secretion of IL-2 by Jurkat-CD16 cells in the presence of an antibody composition is known to be correlated to ADCC activity via FCYRI II (CD16) (see WO2004024768, page 3 lines 12/18, page 4 line 29 to page 5 line 2, page 8 lines 25 - 29, and especially Example 2 pages 14-15 and Figure 10). The same antibodies and reference controls as those of Example 3A were characterized for their activation of Jurkat-CD16 cells, by measuring the secretion of IL-2. Target cells K1 PD-L1 APC / CHO (25,000 cells / well in 50 μl) were incubated with 50 μl of increasing concentrations of anti-PDL1 antibody (0 to 1250 ng / ml final) in the presence of 50 μΙ of Jurkat-hCD16aF cells (250,000 cells / well) and 50 μl of PMA (Phorbol-Myristate Acetate) at a final concentration of 10 ng / ml.
Après 16 heures d'incubation à 37°C, la quantité d'IL-2 relarguée par Jurkat-CD16 a été mesurée par colorimétrie (par exemple RD System DuoSet Kit IL-2 :Réf DY202-05). Les données sont exprimées en concentration d'IL-2 en pg/ml. After 16 hours of incubation at 37 ° C., the amount of IL-2 released by Jurkat-CD16 was measured by colorimetry (for example RD System DuoSet Kit IL-2: Ref DY202-05). The data are expressed in IL-2 concentration in μg / ml.
Les résultats sont les suivants (exprimés en Quantité d'anticorps requise pour induire 1000pg d'IL-2 (environ 50% du taux maximal obtenu dans ce test)) : The results are as follows (expressed as the amount of antibody required to induce 1000 μg of IL-2 (approximately 50% of the maximum rate obtained in this test)):
Ils montrent que les variants atezolizumab et durvalumab C6A 74 et T5A 74A permettent une induction d'IL-2, et ainsi une activité ADCC via CD16 au moins équivalente à celle de Fc-WT produit en YB2/0 correspondant, et très augmentée par rapport à celle de Fc-WT produit en CHO. Par ailleurs, les variants atezolizumab et durvalumab produits en YB2/0 ont une activité très supérieure au variant de référence atezolizumab N297A CHO et durvalumab Fc-FES CHO respectivement- Exemple 5 : Effet anti-tumoral des variants d'IqGI anti-PDL1 selon l'invention sur des modèles in vivo Un modèle de tumeur in vivo peut être utilisé pour analyser l'effet des variants anti-PDL1 sur la survie des animaux. Au jour 0, des souris nude C57BL/6 reçoivent des injections intraveineuses de cellules leucémiques C4198-GFP. Les souris sont ensuite séparées en 3 groupes. Aux jours 1 , 4 et 7, les souris sont traitées avec du PBS (véhicule) ou avec 10mg/kg d'IgGI anti-PDL1 parent (référence) ou de variant anti-PDL1 à raison de 200μΙ_ par injection intrapéritonéale. Les souris sont observées deux fois par semaine pendant toute la durée de l'étude (76 jours) et à terme, le taux de survie des souris est mesuré. Ce protocole peut ainsi permettre de confirmer, in vivo, l'avantage d'utiliser un anticorps anti-PDL1 modifié pour présenter une liaison au CD16a et/ou une activité ADCC améliorée, par rapport à un anticorps parent non modifié. They show that the atezolizumab and durvalumab variants C6A 74 and T5A 74A allow an induction of IL-2, and thus an ADCC activity via CD16 at least equivalent to that of Fc-WT produced in YB2 / 0 corresponding, and greatly increased compared to to that of Fc-WT produced in CHO. Moreover, the atezolizumab and durvalumab variants produced in YB2 / 0 have a much higher activity than the reference variant atezolizumab N297A CHO and durvalumab Fc-FES CHO respectively. EXAMPLE 5 Anti-tumoral effect of the IqGI anti-PDL1 variants according to US Pat. invention on in vivo models An in vivo tumor model can be used to analyze the effect of anti-PDL1 variants on animal survival. At day 0, C57BL / 6 nude mice receive intravenous injections of C4198-GFP leukemic cells. The mice are then separated into 3 groups. On days 1, 4 and 7, the mice are treated with PBS (vehicle) or with 10 mg / kg of parent anti-PDL1 IgGI (reference) or anti-PDL1 variant at 200 μΙ by intraperitoneal injection. The mice are observed twice a week throughout the duration of the study (76 days) and in the long term, the survival rate of the mice is measured. This protocol can thus make it possible to confirm, in vivo, the advantage of using a modified anti-PDL1 antibody to exhibit CD16a binding and / or an improved ADCC activity, compared to an unmodified parent antibody.
Exemple 6 : Effet anti-tumoral de la combinaison des variants d'IgGI anti-PDL1 et anti-PD1 selon l'invention sur des modèles in vivo EXAMPLE 6 Anti-tumoral effect of the combination of anti-PDL1 and anti-PD1 IgGI variants according to the invention on in vivo models
1 -Génération d'un modèle d'étude reproductif d'une situation pathologique chez l'homme Un modèle de souris humanisée (humanized tumor mouse model (HTM)) peut être utilisé pour analyser l'effet de la combinaison des variants anti-PDL1 (tels que décrits en exemples 1 ou 2) et anti-PD1 (i.e. variant del294 ou N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y ou E294del/T307P/N434Y ou V259I/N315D/N434Y ou V259l/E294Del/N315D/N434Y ou N297A, notamment comprenant les VH et VL du nivolumab ou du pembrolizumab tel que décrit dans la description ci-avant) sur la survie des animaux. 1 -Generation of a Reproductive Study Model of a Pathological Situation in Man A humanized mouse model (HTM) can be used to analyze the effect of the combination of anti-PDL1 variants (as described in Examples 1 or 2) and anti-PD1 (ie variant del294 or N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y or E294del / T307P / N434Y or V259I / N315D / N434Y or V259l / E294Del / N315D / N434Y or N297A, especially including VH and VL nivolumab or pembrolizumab as described in the description above) on the survival of animals.
Ce modèle est caractérisé par le développement d'un système immunitaire mature humain et la croissance de cellules de cancers humaines qui ont été au préalable co- transplantées avec les cellules souches hématopoïétiques humaines.  This model is characterized by the development of a mature human immune system and the growth of human cancer cells that have been previously co-transplanted with human hematopoietic stem cells.
Brièvement, des souris NOD-scid IL2Rvnull (NSG) peuvent être obtenues, par exemple auprès des Laboratoires Jackson, puis hébergées dans un établissement spécialisé sans pathogène. Les nouveau-nés seront irradiés (1 Gy) pendant leurs 48 premières heures de vie et 3 heures plus tard transplantées par injection intra-hépatique avec 2,5x105 cellules CD34+ humaines isolées à partir de sang du cordon ombilical (CB) en présence de cellules tumorales 3x106 C4198-Luc (exprimant la luciférase pour un suivi en bioluminescence). Briefly, NOD-scid IL2Rvnull (NSG) mice can be obtained, for example from Jackson Laboratories, and then housed in a specialized facility without pathogen. Neonates will be irradiated (1 Gy) during their first 48 hours of life and 3 hours later transplanted by intrahepatic injection with 2.5x10 5 human CD34 + cells isolated from umbilical cord blood (CB) in the presence of 3x10 6 C4198-Luc tumor cells (expressing luciferase for bioluminescence monitoring).
2-Méthode pouvant être utilisée pour tester l'activité de la combinaison d'anticorps Dès que la tumeur est visible par bioluminescence (IVIS), les souris HTM sont traitées avec 20 mg/kg d'une combinaison de variants anti-PD1 et anti-PDL1 tous les 3 jours par voie intraveineuse. 2-Method that can be used to test the activity of the antibody combination As soon as the tumor is visible by bioluminescence (IVIS), the HTM mice are treated with 20 mg / kg of a combination of anti-PD1 and anti-PDL1 variants every 3 days intravenously.
Le suivi de l'efficacité du traitement est réalisé en bioluminescence, la survie des animaux ainsi que la survie en absence de tumeurs sont monitorées. Des prélèvements sanguins sont réalisés au cours de l'étude afin de s'assurer de l'efficacité de la combinaison d'anticorps sur la survie.  The monitoring of the effectiveness of the treatment is carried out in bioluminescence, the survival of the animals as well as the survival in the absence of tumors are monitored. Blood samples are taken during the study to ensure the effectiveness of the combination of antibodies on survival.
Conclusion : Conclusion:
Le modèle murin HTM peut être avantageusement utilisé pour évaluer in vivo l'avantage de combiner :  The HTM murine model can be advantageously used to evaluate in vivo the advantage of combining:
- les effets cytotoxiques d'un anticorps anti-PDL1 modifié pour présenter une liaison au CD16a et/ou une activité ADCC améliorée,  the cytotoxic effects of a modified anti-PDL1 antibody to present a CD16a binding and / or an improved ADCC activity,
- les effets neutralisants d'un anticorps anti-PD1 dans le cadre d'un traitement antitumoral.  the neutralizing effects of an anti-PD1 antibody in the context of antitumour treatment.

Claims

REVENDICATIONS 1 . Anticorps dirigé contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire, possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d'un anticorps parent et ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcgRIIIa (CD16a) et/ou une activité ADCC augmentée par rapport à l'anticorps parent. CLAIMS 1. Antibody directed against an immune control point ligand, having a modified Fc fragment relative to that of a parent antibody and having improved affinity for the FcgRIIIa receptor (CD16a) and / or increased ADCC activity relative to the parent antibody.
2. Anticorps selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le fragment Fc modifié comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes: 2. Antibody according to claim 1, characterized in that the modified Fc fragment comprises at least one combination of 2 mutations:
i) une mutation choisie parmi 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M, 421 T, 434Y et 434S ; et  i) a mutation selected from 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M, 421T, 434Y and 434S; and
ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, 226Y, 227S, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 231 V, 234P, 241 L, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261 R, 262A, 263A, 264E, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 330V, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361 H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 389K, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421 T, 421 S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431 V, 431 T, 434K, 434Y, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P et 447N,  ii) at least one mutation selected from 226G, 226Y, 227S, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 231V, 234P, 241L, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 264E, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P , 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 330V, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H , 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 389K, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I , 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434Y, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G , 440N, 442F, 442P and 447N,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).  the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii).
3. Anticorps selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le fragment Fc modifié comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes: 3. Antibody according to claim 1 or 2, characterized in that the modified Fc fragment comprises at least one combination of 2 mutations:
i) une mutation choisie parmi 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M et 421 T; et  i) a mutation selected from 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M and 421T; and
ii) au moins une mutation choisie parmi 226Y, 227S, 230S, 231 V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261 R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361 H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 41 OR, 412M, 414R, 421 T, 421 S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431 V, 431 T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P et 447N, ii) at least one mutation selected from 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 243I, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 286I, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 308I, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 323I, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 363I, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 393I, 394P, 396L, 397I, 397M, 398P, 405V, 405L, 41OR, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N , 442F, 442P and 447N,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).  the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii).
4. Anticorps selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que le fragment Fc modifié comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes: 4. Antibody according to claim 2 or 3, characterized in that the modified Fc fragment comprises at least one combination of 2 mutations:
i) une mutation choisie parmi 378V, 378T, 434Y et 434S; et  i) a mutation selected from 378V, 378T, 434Y and 434S; and
ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).  ii) at least one mutation selected from 226G, 228L, 228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y and 434S, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that mutation (i) does not take place on the same amino acid as mutation (ii).
5. Anticorps selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que le fragment Fc modifié comprend au moins une combinaison de 2 mutations suivantes: Antibody according to claim 1 to 3, characterized in that the modified Fc fragment comprises at least one combination of 2 mutations:
i) une mutation choisie parmi 378V, 326E, 397M, 334N et 396L ; et  i) a mutation selected from 378V, 326E, 397M, 334N and 396L; and
ii) au moins une mutation choisie parmi 316D, 397M, 334N, 248E, 231 V, 246R, 336T, 421 T, 361 H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y et 298N,  ii) at least one mutation selected from 316D, 397M, 334N, 248E, 231V, 246R, 336T, 421T, 361H, 366A, 439R, 290E, 394P, 307P, 378V, 378T, 286I, 286Y and 298N,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).  the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii).
6. Anticorps selon la revendication 1 à 5, caractérisé en ce que le fragment Fc modifié comprend : Antibody according to claim 1 to 5, characterized in that the modified Fc fragment comprises:
- soit une combinaison de mutations choisie parmi N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y, N315D/N361 D/A378V/N434Y, P230S/N315D/M428L/N434Y, T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y, V259I/N315D/N434Y et T256N/A378V/S383N/N434Y ;  or a combination of mutations chosen from N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y, N315D / N361D / A378V / N434Y, P230S / N315D / M428L / N434Y, T307A / N315D / A330V / E382V / N389T / N434Y, V259I / N315D / N434Y and T256N / A378V / S383N / N434Y;
- soit la combinaison de mutations K334N/P352S/V397M/A378V;  - the combination of mutations K334N / P352S / V397M / A378V;
- soit une combinaison de mutations choisie parmi N315D/A330V/N361 D/A378V/N434Y, V259I/N315D/N434Y, K334N/P352S/V397M/A378V et N315D/N361 D/A378V/N434Y, et au moins l'une des mutations suivantes : K290G, Y296W ou N434Y. or a combination of mutations chosen from N315D / A330V / N361 D / A378V / N434Y, V259I / N315D / N434Y, K334N / P352S / V397M / A378V and N315D / N361 D / A378V / N434Y, and at least one of the mutations following: K290G, Y296W or N434Y.
7. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il a une affinité améliorée par rapport à celle de l'anticorps parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30. 7. Antibody according to one of claims 1 to 6, characterized in that it has an improved affinity compared to that of the parent antibody, a ratio of at least 2, preferably greater than 5, of preferably greater than 10, preferably greater than 15, preferably greater than 20, preferably greater than 25, preferably greater than 30.
8. Composition comprenant des anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, lesdits fragments Fc modifiés possédant sur leur site de glycosylation des N-glycannes, caractérisés en ce que lesdits N-glycannes présentent un taux de fucosylation inférieur à 65%, de préférence inférieur à 60%, de préférence inférieur à 55%, de préférence inférieur à 50%, de préférence encore inférieur à 45%, de préférence inférieur à 40%, de préférence inférieur à 35%, de préférence inférieur à 30%, de préférence inférieur à 25%, de préférence inférieur à 20%. 8. Composition comprising antibodies according to one of claims 1 to 7, said modified Fc fragments having at their glycosylation site N-glycans, characterized in that said N-glycans have a degree of fucosylation of less than 65%, preferably less than 60%, preferably less than 55%, preferably less than 50%, more preferably less than 45%, preferably less than 40%, preferably less than 35%, preferably less than 30%, preferably less than 25%, preferably less than 20%.
9. Composition selon la revendication 8, lesdits fragments Fc possédant sur leur site de glycosylation Asn 297 des N-glycannes, caractérisée en ce que lesdits N-glycannes présentent une structure glycannique de type biantenné, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, et des N-acétylglucosamines terminaux non intercalaires. 9. Composition according to claim 8, said Fc fragments having N-glycans at their glycosylation site Asn 297, characterized in that said N-glycans have a glycan structure of biantenné type, with short chains, weak sialylation, and terminal N-acetylglucosamines not intercalated.
10. Composition selon l'une des revendications 8 ou 9, lesdits fragments Fc possédant sur leur site de glycosylation Asn 297 des N-glycannes, caractérisée en ce que lesdits N-glycannes présentent une teneur supérieure à 60% pour les formes G0+G1 +G0F+G1 F, la teneur des formes G0F+G1 F étant inférieure à 50%. 10. Composition according to one of claims 8 or 9, said Fc fragments having at their glycosylation site Asn 297 N-glycans, characterized in that said N-glycans have a content greater than 60% for G0 + G1 forms. + G0F + G1 F, the content of forms G0F + G1 F being less than 50%.
11. Composition selon l'une des revendications 8 ou 9, lesdits fragments Fc possédant sur leur site de glycosylation Asn 297 des N-glycannes, caractérisée en ce que lesdits N-glycannes présentent une teneur supérieure à 60% pour les formes G0+G1 +G0F+G1 F, la teneur en fucose étant inférieure à 65%. 11. Composition according to one of claims 8 or 9, said Fc fragments having at their glycosylation site Asn 297 N-glycans, characterized in that said N-glycans have a content greater than 60% for G0 + G1 forms. + G0F + G1 F, the fucose content being less than 65%.
12. Composition selon la revendication 10 ou 1 1 , lesdits fragments Fc possédant sur leur site de glycosylation Asn 297 des N-glycannes, caractérisée en ce que lesdits N- glycannes présentent une teneur inférieure à 40% pour les formes G1 F+G0F. 12. Composition according to claim 10 or 1 1, said Fc fragments having at their glycosylation site Asn 297 N-glycans, characterized in that said N-glycans have a content of less than 40% for the forms G1 F + G0F.
13. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 7 ou composition selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisée en ce que le ligand du point de contrôle immunitaire est choisi parmi PDL1 , OX40L, PDL2, CD80, CD86, la galectine-9, le CMH II, le CMH I, HVEM et l'adénosine, de préférence le ligand est PDL1 . 13. Antibody according to one of claims 1 to 7 or composition according to one of claims 8 to 12, characterized in that the ligand of the control point Immune is selected from PDL1, OX40L, PDL2, CD80, CD86, galectin-9, MHC II, MHC I, HVEM and adenosine, preferably the ligand is PDL1.
14. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 7 ou 13 ou composition selon l'une des revendications 8 à 13, caractérisée en ce que l'anticorps est un anti-PDL1 comprenant une séquence variable de chaîne légère (VL) et une séquence variable de chaîne lourde (VH) correspondant respectivement aux séquences VL et VH de l'anticorps atezolizumab, de l'anticorps durvalumab, ou de l'anticorps avelumab, et de préférence un VH de séquence SEQ ID NO :1 1 et un VL de séquence SEQ ID NO :12, ou un VH de séquence SEQ ID NO :13 et un VL de séquence SEQ ID NO :14, ou un VH de séquence SEQ ID NO :15 et un VL de séquence SEQ ID NO :16. The antibody according to one of claims 1 to 7 or 13 or a composition according to one of claims 8 to 13, characterized in that the antibody is an anti-PDL1 comprising a variable light chain sequence (VL) and a heavy chain variable sequence (VH) respectively corresponding to the VL and VH sequences of the atezolizumab antibody, the durvalumab antibody, or the avelumab antibody, and preferably a VH of sequence SEQ ID NO: 1 1 and a VL of sequence SEQ ID NO: 12, or a VH of sequence SEQ ID NO: 13 and a VL of sequence SEQ ID NO: 14, or a VH of sequence SEQ ID NO: 15 and a VL of sequence SEQ ID NO: 16.
15. Produits contenant : 15. Products containing:
a) un anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, 13 ou 14, ou une composition d'anticorps selon l'une des revendications 8 à 14, et a) an antibody according to one of claims 1 to 7, 13 or 14, or an antibody composition according to one of claims 8 to 14, and
b) un anticorps dirigé contre un point de contrôle immunitaire, possédant un fragment Fc modifié par rapport à celui d'un anticorps parent et ayant une affinité améliorée pour le récepteur FcRn et optionnellement une activité fonctionnelle médiée par la région Fc diminuée, ledit point de contrôle immunitaire étant choisi parmi PD1 , CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 et a2AR, b) an antibody raised against an immune control point, having a modified Fc fragment relative to that of a parent antibody and having an improved affinity for the FcRn receptor and optionally a functional activity mediated by the decreased Fc region, said immune control being selected from PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR,
comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement des cancers. as combination products for simultaneous, separate or extended use for their use in the prevention or treatment of cancers.
16. Produits selon la revendication 15 caractérisés en ce que le ligand de point de contrôle immunitaire selon a) est PDL1 et en ce que le point de contrôle immunitaire selon b) est PD1 , et de préférence l'anticorps b) anti-PD1 comprend un VH de séquence SEQ ID NO :17 et un VL de séquence SEQ ID NO :18, ou bien comprend un VH de séquence SEQ ID NO :19 et un VL de séquence SEQ ID NO :20. Products according to claim 15, characterized in that the immune control point ligand according to a) is PDL1 and in that the immune control point according to b) is PD1, and preferably the antibody b) anti-PD1 comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 17 and a VL of sequence SEQ ID NO: 18, or else comprises a VH of sequence SEQ ID NO: 19 and a VL of sequence SEQ ID NO: 20.
17. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, 13 ou 14, ou composition d'anticorps selon l'une des revendications 7 à 14, ou produits selon la revendication 15 ou 16, caractérisés en ce que les anticorps parents comprennent un fragment Fc parent qui est un fragment Fc humain, de préférence un fragment Fc d'une lgG1 humaine ou d'une lgG2 humaine. 17. Antibody according to one of claims 1 to 7, 13 or 14, or antibody composition according to one of claims 7 to 14, or products according to claim 15 or 16, characterized in that the parent antibodies comprise a Fc parent fragment which is a human Fc fragment, preferably an Fc fragment of a human IgG1 or a human IgG2.
18. Composition pharmaceutique comprenant (i) au moins un anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, 13 ou 14, ou une composition selon l'une des revendications 7 à 14, ou des produits selon l'une des revendications 15 ou 16, et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 18. A pharmaceutical composition comprising (i) at least one antibody according to one of claims 1 to 7, 13 or 14, or a composition according to one of claims 7 to 14, or products according to one of claims 15 or 16, and (ii) at least one pharmaceutically acceptable excipient.
19. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, 13 ou14, ou composition selon l'une des revendications 7 à 14, produits selon la revendication 15 ou 16, ou composition pharmaceutique selon la revendication 18, pour son utilisation dans le traitement des cancers. 19. Antibody according to one of claims 1 to 7, 13 or 14, or composition according to one of claims 7 to 14, products according to claim 15 or 16, or pharmaceutical composition according to claim 18, for its use in the treatment cancers.
EP18711566.2A 2017-03-20 2018-03-19 Antibodies targeting a ligand from an immune checkpoint, with an fc fragment having an improved affinity for cd16a Withdrawn EP3601342A1 (en)

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