EP3448152A1

EP3448152A1 - Method and device for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample

Info

Publication number: EP3448152A1
Application number: EP17718477.7A
Authority: EP
Inventors: Günter R. Fuhr; Heiko Zimmermann
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2019-03-06
Also published as: JP2019515286A; CN109152355A; KR20190004727A; US20190133111A1; WO2017186332A1; DE102016005076A1

Abstract

The invention relates to a device for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample, comprising a sample container (1) having a receiving space (2) for receiving a biological sample (6) and a cover (3) for closing the receiving space. The device also comprises a chamber arranged inside the sample container, in particular in the receiving space and/or in the cover, the interior (12; 22; 32; 42) of which is not fluidically connected to the receiving space (2) and is only partially filled with at least one indicator substance (7) having a melting temperature in the region between -20 °C and -140 °C. The invention also relates to a method for monitoring the temperature of cryopreserved samples, comprising the following steps: providing a device (10; 20; 30; 40) for temperature monitoring; freezing the indicator substance/s, wherein the at least one chamber can be placed in a first position during the freezing of the indicator substance/s and in a second position after the freezing and when a temperature of the indicator substance/s is below the melting temperature, in which position a melting of the indicator substance/s leads to an at least partial shift and/or change in shape of the chamber filling, with the influence of the force of gravity.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR TEMPERATURÜBERWACHUNG METHOD AND DEVICE FOR TEMPERATURE MONITORING

EINER KRYOKONSERVIERTEN BIOLOGISCHEN PROBE A CRYOCONIZED BIOLOGICAL SAMPLE

BESCHREIBUNG DESCRIPTION

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Temperaturüber- wachung einer kryokonservierten biologischen Probe. The invention relates to a method for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample. The invention further relates to a device for temperature monitoring of a cryopreserved biological sample.

Die Tieftemperaturkonservierung (Kryokonservierung) von Zellen ist bisher die einzige Möglichkeit, Lebensprozesse auf zellulärer Ebene reversibel (vitalitätserhaltend) so anzuhalten, dass sie nach einer Erwärmung auf physiologische Temperaturen wieder anlaufen können. Die Kryokonservierung hat sich über große Biobanken in den letzten Jahrzehnten zu einem unverzichtbaren Element für Kliniken, Pharmaunternehmen, die Arterhaltung, den Umweltschutz und die Gesundheitsvorsorge entwickelt. Gelagert wird biologisches Material in tieftemperaturverträglichen Probenbehältern (Kryobehältern), z. B. Röhrchen, Straws und Beuteln, unterschiedlicher Größe. Bei der Kryokonservierung sind die gelager- ten Biomaterialien unter Aufrechterhaltung der Vitalität des Probenmaterials gefroren, zumeist bei Temperaturen unterhalb -80 °C, für Lebendsammlungen unter -140 °C bis zur Temperatur des flüssigen Stickstoffs. Für eine kryokonservierte Probe oder eine für die Kryokonservierung vorgesehene Probe wird nachfolgend auch der Begriff„Kryoprobe" verwendet. Cryopreservation of cells has so far been the only way to reversibly halt vital processes at the cellular level in such a way that they can restart after being heated to physiological temperatures. Cryopreservation has become an indispensable element for clinics, pharmaceutical companies, species conservation, environmental protection and health care through large biobanks in recent decades. Biological material is stored in low-temperature compatible sample containers (cryobanks), eg. As tubes, straws and bags, different sizes. In cryopreservation, the stored biomaterials are frozen while maintaining the vitality of the sample material, mostly at temperatures below -80 ° C, for live collections below -140 ° C to the temperature of the liquid nitrogen. For a cryopreserved sample or a sample intended for cryopreservation, the term "cryoprobe" is also used below.

Für makroskopische Proben, wie z. B. Blut oder Gewebe, sind zahlreiche Techniken zur Probenlagerung bei tiefen Temperaturen entwickelt worden. In der modernen Medizin, Gentechnik und Biologie besteht die Tendenz, zunehmend kleine Proben einer Kryokonservierung zu unterziehen. Es werden beispielsweise kleine Suspensionsvolumina (Millili- ter oder darunter) mit suspendierten Zellen oder Zellgruppen eingefroren. Die Kryokonservierung von Zellen aus In-vitro-Kulturen erfolgt in überwiegendem Maße in einer Suspension. Die meisten der biomedizinisch relevanten Zellen benötigen jedoch zu ihrer Vermehrung und geordneten Entwicklung einen Substratkontakt. Daher werden Proben ggf. nach einer Kultivierung im substratgebundenen Zustand eingefroren. For macroscopic samples, such. As blood or tissue, numerous techniques for sample storage at low temperatures have been developed. In modern medicine, genetic engineering and biology, there is a tendency to undergo increasingly small samples of cryopreservation. For example, small volumes of suspension (milliliter or below) are frozen with suspended cells or cell groups. Cryopreservation of cells from in vitro cultures predominantly takes place in a suspension. However, most of the biomedically relevant cells require theirs Propagation and orderly development of a substrate contact. Therefore, samples may be frozen after culturing in the substrate-bound state.

Die Qualität der Proben ist von ausschlaggebender Bedeutung, da sie für Zelltherapien in Kliniken, die Entwicklung von Pharmaka und biotechnologischen Produkten, als nationale Ressourcen und vieles mehr Anwendung finden. Die Lagerzeit liegt bei einigen Tagen bis zu Jahrzehnten, mit einer Tendenz zur Langzeitlagerung. Die Proben werden in gekühlten Behältern gelagert, befinden sich zumeist in Metalleinschüben und Racks, mit denen sie bei neuen Einlagerungen oder Entnahmen Temperaturschwankungen unterliegen. Bei Lebendablagen (Zellen, Zellsuspensionen und Gewebeteilen) spielt nicht nur die ununterbrochene Kühlkette eine entscheidende Rolle, sondern auch die Vermeidung großer Temperatursprünge in der Tiefkühlphase. Da es bei der Entnahme gar nicht so selten vorkommt, dass Kryobehälter sich auf Temperaturen von -80 °C bis -20 °C erwärmen, treten, obwohl sie noch gefroren sind, Qualitätsminderungen unerkannt auf, die nicht nur den Wert der Probe mindern, sondern auch bei ihrer Verwendung im klinischen Bereich zu lebensgefährlichen Situationen führen können. Selbst kurzzeitig aufgetauten Proben sieht man im wiedergefrorenen Zustand nicht an, dass sie dem Originalzustand nicht mehr entsprechen. Es geht aber vornehmlich nicht nur darum, ein Auftauen der Biomaterialien zu erkennen, sondern das Überschreiten einer Grenztemperatur im Bereich zwischen -140 °C und -20 °C zu dokumentieren. Eine Temperaturkontrolle und -dokumentation für jedeThe quality of the samples is crucial as they are used for cell therapies in clinics, the development of pharmaceuticals and biotechnology products, as national resources and much more. The storage time is several days to decades, with a tendency for long-term storage. The samples are stored in refrigerated containers, mostly in metal drawers and racks, with which they are subject to temperature fluctuations in new deposits or withdrawals. In the case of live deposits (cells, cell suspensions and tissue parts) not only the uninterrupted cold chain plays a decisive role, but also the avoidance of large temperature jumps in the frozen phase. As it is not uncommon to remove cryogenic containers at temperatures from -80 ° C to -20 ° C, even though they are still frozen, quality reductions, which not only reduce the value of the sample, but go unnoticed, are unrecognized also lead to life-threatening situations when used clinically. Even briefly thawed samples are not seen in the frozen state, that they no longer correspond to the original state. However, it is not only a question of detecting a thawing of the biomaterials, but of documenting the exceeding of a limit temperature in the range between -140 ° C and -20 ° C. A temperature control and documentation for each

Probe ist die Forderung und bislang nur selten - und wenn, dann mit hohem technischen Aufwand - zu erfüllen. Hinzu kommen umfangreiche Laboruntersuchungen nach dem Auftauen, die ebenfalls wertvolles Probenmaterial verbrauchen und selbst im Falle inzwischen wertlos gewordener Kryoproben Kosten erzeugen. Sample is the requirement and so far only rarely - and if, then with great technical effort - to meet. In addition, extensive laboratory tests after thawing, which also consume valuable sample material and even in the case of now worthless cryoprobes generate costs.

Es ist somit eine Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden können und das sich durch eine vereinfachte Verfahrensführung auszeichnet. Eine weitere Aufgabe ist es, eine Vorrichtung zur Tem- peraturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitzustellen, mit der Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden können. Eine weitere Aufgabe ist es, eine Möglichkeit bereitzustellen, um an einem möglichst einfachen Marker oder Kennzeichen erkennen zu können, ob eine Kryoprobe sich über eine definierbare Grenztemperatur, und wenn auch nur kurzzeitig, erwärmt hat. Die Grenztemperatur muss im Bereich zwischen -20 °C und -140 °C vor dem Einfrieren festlegbar sein. Dies sollte an jeder einzelnen Kryoprobe und an damit Millionen von Proben rasch und leicht erkennbar möglich sein, darf die Biomaterialien nicht verändern und sollte bereits im tiefgefrorenen Zustand erfolgen. Wenn möglich, sollte der Zustand der Probe auch im Lagerbehälter erfassbar sein, da jede Aus- und Einlagerung die Gefahr der Probenveränderung einer Vielzahl von Proben im Lagergut mit sich bringt, da in der Regel ganze Racks aufgezogen werden. Die Vorrichtung bzw. das Verfahren sollte leicht handhabbar, tieftemperaturtolerant und einstellbar sein. Es darf nur wenig oder keine Energie verbrauchen und möglichst nur geringste Kosten verursachen, da die Lagerung einer Bioprobe im gekühlten Zustand in ihren Gesamtaufwendungen nur wenige Euros kosten sollte. Diesem Anspruch müssen auch die einsetzbaren Materialien gerecht werden. It is therefore an object of the invention to provide an improved method for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample, with which disadvantages of conventional techniques can be avoided and which is characterized by a simplified process control. A further object is to provide a device for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample, with which disadvantages of conventional techniques can be avoided. Another object is to provide a way to detect the simplest possible markers or mark, whether a cryoprobe has heated above a definable limit temperature, and even if only for a short time. The limit temperature must be determinable between -20 ° C and -140 ° C before freezing. This should be possible quickly and easily recognizable on every single cryoprobe and therefore with millions of samples, must not alter the biomaterials and should already take place in the deep-frozen state. If possible, the condition of the sample should also be detectable in the storage container, as each storage and retrieval brings with it the risk of sample change of a variety of samples in the stored goods, as a rule, whole racks are raised. The device or the method should be easy to handle, low temperature tolerant and adjustable. It may consume little or no energy and possibly cause only the least cost, since the storage of a bioprobe in a refrigerated state should cost only a few Euros in its total expenditure. This requirement must also meet the applicable materials.

Diese Aufgaben werden durch Vorrichtungen und Verfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. These objects are achieved by devices and methods having the features of the independent claims. Advantageous embodiments and applications of the invention will become apparent from the dependent claims and are explained in more detail in the following description with partial reference to the figures.

Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung werden die genannten Aufgaben durch ein Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe gelöst. Zur Durchführung des Verfahrens wird eine Vorrichtung zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitgestellt. According to a first aspect of the invention, said objects are achieved by a method for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample. To carry out the method, a device for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample is provided.

Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung soll die Vorrichtung zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe als Gegenstand per se offenbart und beanspruchbar sein. Die Ausführungen betreffend die Vorrichtung, insbesondere deren vorteilhafte Ausführungsvarianten, sollen somit zur Vermeidung von Wiederholun- gen als rein vorrichtungsgemäß offenbart und als verfahrensgemäß offenbart gelten und beanspruchbar sein. Die Vorrichtung zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe umfasst einen Probenbehälter mit einem Aufnahmeraum (Probenreservoir) zur Aufnahme einer Probe, insbesondere einer biologischen Probe. Der Aufnahmehohlraum kann eine kryokonservierte biologische Probe enthalten. According to a second aspect of the invention, the device for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample as an object per se should be disclosed and claimed. The statements relating to the device, in particular its advantageous embodiments, are thus to avoid repetition as disclosed purely as a device and apply as disclosed according to the method and claimable. The device for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample comprises a sample container having a receiving space (sample reservoir) for receiving a sample, in particular a biological sample. The receiving cavity may contain a cryopreserved biological sample.

Die Vorrichtung umfasst ferner eine Kammer, deren Innenraum mit dem Aufnahmeraum nicht fluidisch verbunden ist. Der Innenraum ist ferner lediglich zum Teil mit mindestens einer Indikatorsubstanz gefüllt, wobei die Schmelztemperatur bei Normaldruck, also bei 1013,25 mbar, der Indikatorsubstanz in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt. The device further comprises a chamber whose interior is not fluidly connected to the receiving space. The interior is also only partially filled with at least one indicator substance, the melting temperature at atmospheric pressure, ie at 1013.25 mbar, the indicator substance is in a range of -20 ° C to -140 ° C.

Durch die Kammer der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird ein Zusatzkompartiment bereitgestellt, das durch die partielle Füllung mit der Indikatorsubstanz als Indikatorelement bzw. Indikatoreinrichtung verwendet werden kann, um eine unerwünschte Überschreitung der Grenztemperatur anzuzeigen. Die mit Indikatorsubstanz partiell gefüllte Kammer wird daher nachfolgend auch als Indikatoreinrichtung bezeichnet. An additional compartment is provided by the chamber of the device according to the invention, which can be used by the partial filling with the indicator substance as an indicator element or indicator device to indicate an undesirable exceeding of the limit temperature. The partially filled with indicator substance chamber is therefore hereinafter also referred to as indicator device.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Kammer im Innern des Probenbehälters, insbesondere im Aufnahmeraum und/oder im Deckel, angeordnet. Die Anordnung im Innern des Probenbehälters bietet den besonderen Vorzug, dass kein zu- sätzlicher Bauraum außerhalb des Probenbehälters vonnöten ist. Die Kammer kann jedoch auch außen am Probenbehälter angeordnet sein oder in eine Wandung des Aufnahmeraums integriert sein. According to a particularly preferred embodiment, the chamber is arranged in the interior of the sample container, in particular in the receiving space and / or in the lid. The arrangement in the interior of the sample container offers the particular advantage that no additional space outside the sample container is required. However, the chamber can also be arranged on the outside of the sample container or integrated into a wall of the receiving space.

Der Probenbehälter ist ein für eine Kryokonservierung geeigneter Behälter, beispielsweise ein Röhrchen, ein Straw (auch als Samenröhrchen bezeichnet), ein Beutel zur Blut- oder Stammzellenlagerung, eine Box oder ein anderer für eine Kryokonservierung geeigneter Behälter. Derartige Behälter werden entsprechend auch als Kryoröhrchen, Kryostraw, Kryobeutel, Kryobox oder allgemein als Kryobehälter bezeichnet. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Probenbehälter ein Kryoröhrchen. Kryoröhrchen (engl, cryogenic tubes) werden auch als Biobank- oder Kryobank- röhrchen bezeichnet. Kryoröhrchen weisen einen Aufnahmeraum auf, der einen inneren Hohlraum zur Aufnahme einer biologischen Probe ausbildet. Das Kryoröhrchen weist ferner üblicherweise einen Deckel zum Verschließen des Aufnahmeraums auf. Der Deckel kann einen Eingriff aufweisen, über den der Deckel mit einem Werkzeug gedreht werden kann. Das Kryoröhrchen kann auch ein Bodenelement aufweisen, das eine Kennung, z. B. in Form eines maschinenlesbaren Codes, aufweist. The sample container is a container suitable for cryopreservation, for example a tube, a straw (also referred to as seminal tube), a bag for storing blood or stem cells, a box or another container suitable for cryopreservation. Such containers are also referred to as cryotubes, Kryostraw, cryobags, cryobox or generally as a cryocontainer. According to a particularly preferred embodiment, the sample container is a cryotube. Cryogenic tubes are also referred to as biobank or cryobank tubes. Cryotubes have a receiving space, which has an internal Forms cavity for receiving a biological sample. The cryovial usually also has a lid for closing the receiving space. The lid may have an engagement over which the lid can be rotated with a tool. The cryotube may also include a bottom member having an identifier, e.g. B. in the form of a machine-readable code.

Das Verfahren umfasst ferner das Einfrieren der Indikatorsubstanz, wobei die Kammer zum Einfrieren der Indikatorsubstanz in eine erste Lage gebracht wird, so dass die Indikatorsubstanz im flüssigen Zustand in ein erstes Teilvolumen der Kammer fließt und dort gefriert. Danach, insbesondere vor und während der Überwachungsphase der Kryolage- rung, wird die Kammer mit der gefrorenen Indikatorsubstanz in eine zweite Lage gebracht, in der ein Schmelzen der Indikatorsubstanz durch den Einfluss der Schwerkraft zu einer Konfigurationsänderung der Kammerfüllung führt. Die Konfigurationsänderung kann eine zumindest teilweise Verlagerung der Kammerfüllung und/oder Formänderung der Kammerfüllung sein. Die Kammerfüllung kann durch die Indikatorsubstanz gebildet sein oder durch die Indikatorsubstanz und durch einen oder mehrere feste Körper, die in der Kammer angeordnet sind und eine höhere Dichte als die Indikatorsubstanz aufweisen. The method further comprises freezing the indicator substance, wherein the chamber for freezing the indicator substance is brought into a first position, so that the indicator substance in the liquid state flows into a first partial volume of the chamber and freezes there. Thereafter, in particular before and during the monitoring phase of the cryolayer, the chamber with the frozen indicator substance is brought into a second position, in which melting of the indicator substance by the influence of gravity leads to a configuration change of the chamber filling. The configuration change may be an at least partial displacement of the chamber fill and / or shape change of the chamber fill. The chamber fill may be formed by the indicator substance or by the indicator substance and by one or more solid bodies disposed in the chamber and having a higher density than the indicator substance.

Mit anderen Worten wird die Indikatorsubstanz in einer solchem Geometrie oder Lage eingefroren und die Kammer in ihrer Lage im tiefgefrorenen Zustand, z. B. bei der Lagertemperatur oder zumindest unterhalb der festgelegten Grenztemperatur bzw. Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz, verändert, so dass ein Schmelzen der Indikatorsubstanz nach der Lageveränderung zu einer sichtbaren Verlagerung der Flüssigkeit oder ihrer Begrenzungsgeometrie oder zu einer Verlagerung der in der Kammer angeordneten festen Körper führen, die nach dem Schmelzen der Indikatorsubstanz nicht mehr in dieser festgefroren sind. In other words, the indicator substance is frozen in such a geometry or position and the chamber in its position in the frozen state, for. B. at the storage temperature or at least below the specified limit temperature or melting temperature of the indicator substance, so that a melting of the indicator substance after the change in position lead to a visible displacement of the liquid or its boundary geometry or to a displacement of the fixed body arranged in the chamber, which are no longer frozen in this after melting the indicator substance.

An dieser Konfigurationsänderung der Kammerfüllung kann sofort durch Anschauen oder auch technisch automatisiert festgestellt werden, ob die Grenztemperatur überschritten wurde. Gemäß dem Verfahren besteht nun die Möglichkeit, die Vorrichtung, aufweisend den Probenbehälter mit einer kryokonservierten Probe und die mindestens eine Kammer mit der gefrorenen Indikatorsubstanz, zur Kryokonservierung zu lagern, wobei die mindestens eine Kammer zur Temperaturüberwachung in der zweiten Lage am Probenbehälter ange- ordnet ist. At this configuration change of the chamber filling can be determined immediately by watching or technically automated, whether the limit temperature has been exceeded. According to the method, it is now possible to store the device, comprising the sample container with a cryopreserved sample and the at least one chamber with the frozen indicator substance, for cryopreservation, the at least one temperature monitoring chamber being arranged in the second position on the sample container ,

Zu einem späteren Zeitpunkt kann geprüft bzw. festgestellt werden, ob eine durch Überschreiten der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz ausgelöste Konfigurationsänderung der Kammerfüllung stattgefunden hat, z. B. ob eine zumindest teilweise Verlagerung und/oder Formänderung der Kammerfüllung stattgefunden hat. At a later time can be checked or determined whether a triggered by exceeding the melting temperature of the indicator substance configuration change of the chamber filling has occurred, eg. B. whether an at least partial displacement and / or change in shape of the chamber filling has taken place.

Ist dies der Fall, kann auf ein Überschreiten der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz und somit der zu überwachenden Grenztemperatur geschlossenen werden, insbesondere auch dann, wenn die Überschreitung nur kurzzeitig aufgetreten ist. If this is the case, it can be concluded that the melting point of the indicator substance and thus the limit temperature to be monitored is exceeded, in particular even if the excess has only occurred for a short time.

Ein besonderer Vorzug der Erfindung liegt somit darin, dass eine Konfigurationsänderung der Kammerfüllung, z. B. der Indikatorsubstanz, direkt anzeigt, ob eine Kryoprobe sich über eine definierbare Grenztemperatur, und wenn auch nur kurzzeitig, erwärmt hat. Dies kann durch visuelle Sichtprüfung oder auch technisch automatisiert mittels einer entsprechend eingerichteten Messeinrichtung schnell und einfach festgestellt werden, ohne dass die Probe aus dem Probenbehälter entnommen oder aufgetaut werden muss. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann der Innenraum der Kammer in mehrere voneinander getrennte Teilräume unterteilt sein, die jeweils lediglich zum Teil mit einer Indikatorsubstanz, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis - 140 °C liegt, gefüllt sind, wobei die Indikatorsubstanzen in den Teilräumen unterschiedliche Schmelztemperaturen aufweisen. Damit können unterschiedliche Temperaturgrenzwerte überwacht werden, wobei jede Indikatorsubstanz so ausgewählt und/oder deren Mischungsverhältnis so eingestellt ist, dass ihr Schmelzpunkt einem der zu überwachenden Temperaturgrenzwerte entspricht. Diese Ausführungsform bietet den Vorteil, dass sich die erreichten Temperaturintervalle, in die die Probe gelangt ist, genauer eingrenzen lassen. Ferner können der Probenbehälter und eine Kammerwandung an mindestens einer Stelle transparent oder semi-transparent sein, so dass von außen sichtbar ist, ob eine Konfigurationsänderung, z. B. eine Lageänderung, der Indikatorsubstanz erfolgt ist. Vorzugsweise ist die gesamte Wandung des Probenbehälters und der Kammer transparent oder semi- transparent ausgeführt. A particular advantage of the invention is thus that a configuration change of the chamber filling, z. As the indicator substance, directly indicates whether a cryoprobe has heated above a definable limit temperature, and even if only for a short time. This can be quickly and easily detected by visual visual inspection or technically automated by means of a suitably equipped measuring device, without the sample must be removed or thawed from the sample container. According to a particularly preferred embodiment, the interior of the chamber may be subdivided into a plurality of separate subspaces, each of which is only partially filled with an indicator substance whose melting temperature is in a range of -20 ° C to -140 ° C, the indicator substances have different melting temperatures in the subspaces. Thus, different temperature limits can be monitored, each indicator substance is selected and / or their mixing ratio is adjusted so that their melting point corresponds to one of the monitored temperature limits. This embodiment offers the advantage that the achieved temperature intervals into which the sample has arrived can be narrowed down more precisely. Furthermore, the sample container and a chamber wall can be transparent or semi-transparent at least at one point, so that it is visible from the outside whether a configuration change, for. B. a change in position, the indicator substance is done. Preferably, the entire wall of the sample container and the chamber is made transparent or semi-transparent.

Zur besseren Erkennbarkeit kann die Indikatorsubstanz einen Indikatorzusatz enthalten, der eine Detektierbarkeit einer physikalischen Eigenschaft der Indikatorsubstanz erhöht. Der Indikatorzusatz kann beispielsweise ein Farbstoff sein, so dass die Indikatorsubstanz farbig oder gefärbt, d. h. nicht transparent, ist und so deren Form und/oder Lage besser optisch erkennbar ist. For better visibility, the indicator substance may contain an indicator additive which increases a detectability of a physical property of the indicator substance. The indicator additive can be, for example, a dye, so that the indicator substance colored or colored, d. H. is not transparent, and so their shape and / or location is better visually recognizable.

Als Farbstoff kommt grundsätzlich jeder Farbstoff in Frage, welcher mindestens die folgenden Bedingungen erfüllt: In principle, any dye which satisfies at least the following conditions is suitable as the dye:

- intensives Färbevermögen auch in kleinen Mengen und Konzentrationen (z. B. ausgehend von einer gesättigten Farblösung Zugabe im Bereich < 1 Volumen-%, in der Regel im Promille- oder Subpromille-Bereich). - intensive dyeing ability even in small amounts and concentrations (eg starting from a saturated dye solution addition in the range <1% by volume, usually in the per mil or subpromille range).

- frosttolerant - frost-tolerant

- lichtecht bei den Versand- als auch den relevanten tiefen Temperaturen - Lightfast at the shipping as well as the relevant low temperatures

- löslich in allen Bestandteilen der Indikatorsubstanz - soluble in all components of the indicator substance

- kein Entmischen beim Einfrieren - no segregation when freezing

- keine Reaktion mit Kunststoffmaterialien, welche in Kontakt mit der Indikatorsubstanz kommen. Vorzugsweise ist der Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt, welche Triphenylmethan- farbstoffe, Rhodaminfarbstoffe, insbesondere Xanthene, Azofarbstoffe sowie Phenazin- und Phenothiazinfarbstoffe umfasst. no reaction with plastic materials which come into contact with the indicator substance. Preferably, the dye is selected from the group consisting of triphenylmethane dyes, rhodamine dyes, especially xanthenes, azo dyes and phenazine and phenothiazine dyes.

In spezielleren Ausführungsformen ist der Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt, welche Oil Red, Methylrot, Brillantgrün, Rhodamin B, Neutralrot, Methylenblau oder andere Farbstoffe, die zur Anfärbung von Zellen in der Zytologie verwendet werden, umfasst. Der Indikatorzusatz können Partikel, insbesondere Nanopartikel sein, die eine Streuwirkung und/oder Polarisationswirkung der Indikatorsubstanz für auf die Indikatorsubstanz auftreffende elektromagnetische Strahlung erhöhen. Dadurch kann eine Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz mittels einer optischen Transmissionsmessung, Streu- messung und/oder Polarisationsmessung zuverlässiger detektiert werden. Der Indikatorzusatz können leitfähige Partikel sein. Durch Beimischen von leitfähigen Partikel kann die Leitfähigkeit oder Impedanz der Indikatorsubstanz beeinflusst werden. Auf diese Weise kann eine Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz mittels einer Leitfähigkeitsmessung oder Impendanzmessung detektiert werden. In more specific embodiments, the dye is selected from the group comprising Oil Red, Methyl Red, Brilliant Green, Rhodamine B, Neutral Red, Methylene Blue, or other dyes used to stain cells in cytology. The indicator additive may be particles, in particular nanoparticles, which increase a scattering effect and / or polarization effect of the indicator substance for electromagnetic radiation impinging on the indicator substance. As a result, a configuration change of the indicator substance can be detected more reliably by means of an optical transmission measurement, scattering measurement and / or polarization measurement. The indicator additive may be conductive particles. By adding conductive particles, the conductivity or impedance of the indicator substance can be influenced. In this way, a configuration change of the indicator substance can be detected by means of a conductivity measurement or impedance measurement.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann die Vorrichtung eine Messeinrichtung aufweisen, die ausgebildet ist, einen Konfigurationszustand der Kammerfüllung, z. B. eine Lage der Indikatorsubstanz in der Kammer, zu erfassen. Die Messeinrichtung kann eine optische oder optisch-elektrische Messeinrichtung sein, um z. B. mit einer optischen Transmissions-, Streulicht- oder Reflektionsmessung eine Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz festzustellen. According to a preferred embodiment, the device may comprise a measuring device which is configured to a configuration state of the chamber filling, for. As a location of the indicator substance in the chamber to detect. The measuring device may be an optical or optical-electrical measuring device to z. B. with an optical transmission, scattered light or reflection measurement to determine a configuration change of the indicator substance.

Als Indikatorsubstanz kann eine Substanz ausgewählt werden, deren Schmelztemperatur einer vorbestimmten Grenztemperatur, deren Überschreiten überwacht werden soll, ent- spricht. Die Indikatorsubstanz ist eine Flüssigkeit oder eine Mischung verschiedener Flüssigkeiten, deren Schmelzpunkt der gewünschten Grenztemperatur entspricht. Lediglich beispielhaft kann als Indikatorsubstanz eine Mischung aus Wasser (H₂0) und Ethanol (C2H6O), eine Mischung aus Wasser (H2O) und Kaliumhydroxid (KOH) oder eine Mischung aus Wasser und einem Gefrierschutzmittel gewählt werden. Das Mischungsverhältnis wird dabei gemäß dem jeweiligen Schmelzdiagramm, das den Verlauf des Schmelzpunktes in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis angibt, so eingestellt, dass der Schmelzpunkt des Flüssigkeitsgemisches den gewünschten Wert, nämlich die zu überwachende Grenztemperatur, aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Indikatorsubstanz mindestens einen Alkohol, welcher aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan- 1,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclo- pentanol, Benzylalkohol umfasst, ausgewählt ist. Besonders bevorzugt ist der mindestens eine Alkohol aus Propan-l,3-diol, Propan-l,2-diol und Butan-2-ol ausgewählt. As indicator substance it is possible to select a substance whose melting temperature corresponds to a predetermined limit temperature whose exceeding is to be monitored. The indicator substance is a liquid or a mixture of different liquids whose melting point corresponds to the desired limit temperature. By way of example only, a mixture of water (H ₂ O) and ethanol (C ₂ H 6 O), a mixture of water (H ₂ O) and potassium hydroxide (KOH) or a mixture of water and an antifreeze may be selected as the indicator substance. The mixing ratio is adjusted according to the respective melting diagram, which indicates the course of the melting point as a function of the mixing ratio, so that the melting point of the liquid mixture has the desired value, namely the limit temperature to be monitored. In a preferred embodiment, the indicator substance comprises at least one alcohol selected from the group consisting of octan-1-ol, nonan-1-ol, propan-1, 2-diol, propane-1,3-diol, butane-1,2 -diol, butane-l, 3-diol, butan-2-ol, pentane-l, 5-diol, pentan-l-ol, cyclo- pentanol, benzyl alcohol is selected. The at least one alcohol is particularly preferably selected from propan-1, 3-diol, propan-1, 2-diol and butan-2-ol.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Indikatorsubstanz mindes- tens zwei verschiedene Alkoholkomponenten: In another preferred embodiment, the indicator substance comprises at least two different alcohol components:

a) einen Alkohol, ausgewählt aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan-l,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclopentanol, Benzylalkohol umfasst; a) an alcohol selected from the group consisting of octan-1-ol, nonan-1-ol, propan-1, 2-diol, propan-1, 3-diol, butane-l, 2-diol, butane-l 3-diol, butan-2-ol, pentane-l, 5-diol, pentan-1-ol, cyclopentanol, benzyl alcohol;

b) einen Alkohol, ausgewählt aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan-l,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol,b) an alcohol selected from the group consisting of octan-1-ol, nonan-1-ol, propan-1, 2-diol, propane-1,3-diol, butane-1,2-diol, butane-1 , 3-diol, butan-2-ol, pentane-l, 5-diol, pentan-1-ol,

Cyclopentanol, Benzylalkohol umfasst, mit einem niedrigeren Schmelzpunkt als der Alkohol der Komponente a); Cyclopentanol, benzyl alcohol, having a lower melting point than the alcohol of component a);

wobei das Mischungsverhältnis der Komponenten a) und b) so eingestellt ist, dass die Schmelztemperatur der Mischung innerhalb eines Temperaturbereichs von -20 °C bis -160 °C, insbesondere von -25 °C bis -160 °C oder -50 °C bis -150 °C, liegt. wherein the mixing ratio of the components a) and b) is set so that the melting temperature of the mixture within a temperature range of -20 ° C to -160 ° C, especially from -25 ° C to -160 ° C or -50 ° C to -150 ° C, lies.

Speziellere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz eine der folgenden Kombinationen der Komponenten a) und b) umfasst: More specific embodiments are characterized in that the indicator substance comprises one of the following combinations of components a) and b):

- Octan-l-ol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; Octan-1-ol and butan-2-ol in a mixing ratio of 5 to 95% by volume;

- Octan-l-ol und Pentan-l-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; Octan-1-ol and pentan-1-ol in a mixing ratio of 5 to 95% by volume;

- Octan-l-ol und Propan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Octan-l-ol and propane-l, 2-diol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Nonan-l-ol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Nonan-1-ol and butan-2-ol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Nonan-l-ol und Propan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Nonan-l-ol and propane-l, 2-diol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Nonan-l-ol und Pentan-l-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Nonan-l-ol and pentane-l-ol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Propan-l,2-diol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; Propan-1, 2-diol and butan-2-ol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Propan-l,2-diol und Propan-l,3-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.- ; Propan-1, 2-diol and propane-l, 3-diol in a mixing ratio of 5 to 95 vol.

- Propan-l,2-diol und Butan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.- ;- Propan-l, 2-diol and butane-l, 2-diol in a mixing ratio of 5 to 95 vol.

- Propan-l,3-diol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; Propan-1, 3-diol and butan-2-ol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Propan-l_;3-diol und Butan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Pentan-l,5-diol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - propane-1 _; 3-diol and butane-1,2-diol in a mixing ratio of 5 to 95% by volume; - pentane-l, 5-diol and butan-2-ol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Benzylalkohol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Benzyl alcohol and butan-2-ol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Pentan-l-ol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Pentan-l-ol und Methanol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Pentan-l-ol and butan-2-ol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%; - Pentan-l-ol and methanol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Cyclopentanol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Cyclopentanol and butan-2-ol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Cyclopentanol und Propan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Cyclopentanol and propane-l, 2-diol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Cyclopentanol und Pentan-l-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Cyclopentanol and pentane-l-ol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%;

- Cyclopentanol und Butan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; wobei der angegebene Wert des Mischungsverhältnisses sich jeweils auf den Anteil der erstgenannten Komponente in der Mischung aus beiden Komponenten bezieht. - Cyclopentanol and butane-l, 2-diol in a mixing ratio of 5 to 95 vol .-%; wherein the indicated value of the mixing ratio refers in each case to the proportion of the first-mentioned component in the mixture of the two components.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst diese Indikatormischung bei- spielsweise Propan-l,2-diol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 40 bis 60 Vol.-% (ergibt eine Schmelztemperatur von ca. - 90 °C), Propan-l,2-diol und Propan-1,3- diol in einem Mischungsverhältnis von 30 bis 70 Vol.-%, oder Propan-l,3-diol und Butan- 2-ol in einem Mischungsverhältnis von 30 bis 70 Vol.-%. Vorzugsweise umfasst die Indikatorsubstanz neben dem mindestens einen Alkohol noch mindestens einen Farbstoff wie oben beschrieben. Besonders bevorzugt ist dieser Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt, welche Oil Red, Methylrot, Brillantgrün und Rhodamin B umfasst. Eine noch speziellere Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz zwei Alkohole a) und b), die aus Propan-l,3-diol, Propan-l,2-diol und Butan- 2-ol ausgewählt sind, vorzugsweise in einem Mischungsverhältnis wie oben angegeben, sowie einen Farbstoff, der aus Gruppe ausgewählt ist, welche aus Oil Red, Methylrot, Brillantgrün und Rhodamin B besteht, umfasst. In particularly preferred embodiments, this indicator mixture comprises, for example, propane-1,2-diol and butan-2-ol in a mixing ratio of 40 to 60% by volume (gives a melting temperature of about -90 ° C.), propane-1 , 2-diol and propane-1,3-diol in a mixing ratio of 30 to 70% by volume, or propane-1,3-diol and butan-2-ol in a mixing ratio of 30 to 70% by volume. In addition to the at least one alcohol, the indicator substance preferably also comprises at least one dye as described above. Most preferably, this dye is selected from the group comprising Oil Red, Methyl Red, Brilliant Green and Rhodamine B. An even more specific embodiment is characterized in that the indicator substance two alcohols a) and b), which are selected from propan-l, 3-diol, propane-l, 2-diol and butan-2-ol, preferably in a mixing ratio as above, and a dye selected from the group consisting of Oil Red, Methyl Red, Brilliant Green and Rhodamine B.

Die Konzentration des Farbstoffs in der Alkoholkomponente kann je nach Farbstoff und Alkohol stark variieren. The concentration of the dye in the alcohol component can vary widely depending on the dye and alcohol.

In der Regel soll die Konzentration bei intensiver Färbung so niedrig wie möglich gehalten werden, damit die Farbmoleküle das Gefrier- und Schmelzverhalten der Alkohole, in denen sie gelöst werden, nicht verändern oder deren Viskosität erhöhen. Die Farbstoffkon- zentration liegt dabei typischerweise in einem Bereich von < 10 Volumen-%, insbesondere < 1 % oder < 0,1 %, also im Prozent- oder Promille- bzw. Subpromillebereich. As a rule, the concentration should be kept as low as possible during intensive staining, so that the color molecules do not change or increase the viscosity of the freezing and melting behavior of the alcohols in which they are dissolved. The dye In this case, the concentration is typically in a range of <10% by volume, in particular <1% or <0.1%, ie in the percentile or per thousand or subpromute range.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung entspricht die zu überwachende Grenztem- peratur nicht direkt der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz, sondern vielmehr derjenigen Temperatur oberhalb der Schmelztemperatur, bei der die Viskosität der geschmolzenen Substanz soweit abgenommen hat, dass der erforderliche Flüssigkeitstransport stattfinden kann. Diese Temperatur wird hier auch als Schwellentemperatur bezeichnet und liegt typischerweise in einem Temperaturbereich von 3-30 °C oder 5-30°C, beispielsweise 3-10 °C, 3-20 °C, 5-10 °C oder 5-20 °C, oberhalb der nominellen Schmelztemperatur. In a variant of the present invention, the limit temperature to be monitored does not correspond directly to the melting temperature of the indicator substance, but rather to that temperature above the melting temperature at which the viscosity of the molten substance has decreased so much that the required liquid transport can take place. This temperature is also referred to herein as a threshold temperature and is typically in a temperature range of 3-30 ° C or 5-30 ° C, for example 3-10 ° C, 3-20 ° C, 5-10 ° C or 5-20 ° C, above the nominal melting temperature.

In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Indikatorsubstanz daher dadurch gekenn- zeichnet, dass die flüssige Mischung in einem Temperaturbereich von 3-30 °C oder 5-30 °C oberhalb der Schmelztemperatur eine Viskosität in einem Bereich von 10 bis 10⁶ mPa*s, vorzugsweise 10 bis 10⁴ mPa*s, aufweist. In an advantageous embodiment, the indicator substance is therefore characterized in that the liquid mixture in a temperature range of 3-30 ° C or 5-30 ° C above the melting temperature has a viscosity in a range of 10 to 10 ⁶ mPa * s, preferably 10 to 10 ⁴ mPa * s.

Der Probenbehälter kann einen Deckel aufweisen, der zum Verschließen des Aufnahme- raums vorgesehen ist. Der Deckel kann einen mit einem oberen Endbereich des Aufnahmeraums in Eingriff stehenden Schaft aufweisen. Der Schaft kann an ein Kopfteil des Deckels angeformt sein, so dass im aufgesetzten oder aufgeschraubten Zustand des Deckels das Kopfteil auf dem Aufnahmeraum aufsitzt, während der Schaft in einen oberen Endbereich des Aufnahmeraums eingreift. The sample container may have a lid, which is provided for closing the receiving space. The lid may have a shaft engaging with an upper end portion of the receiving space. The shank can be formed on a head part of the lid, so that in the mounted or screwed-on state of the lid, the head part sits on the receiving space, while the shank engages in an upper end region of the receiving space.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Kammer in den Deckel, z. B. in das Kopfteil und/oder den Schaft, integriert sein. Dies bietet den Vorteil, dass die eingebrachte Indikatoreinrichtung eine im Aufnahmeraum gelagerte Bioprobe nicht kontaminieren kann, da sie mit dieser nicht in Kontakt kommt, sondern in einem ohnehin zu benutzenden Deckel eingeschlossen ist. Ein weiterer Vorteil ist, dass die als Indikatoreinrichtung dienende Kammer zusammen mit dem Deckel räumlich getrennt vom restlichen Probenbehälter gelagert und vorbereitet (z. B. Gefrieren der Indikatorsubstanz in der ers- ten Lage) werden kann. Besonders vorteilhaft ist eine Integration der Kammer in den Schaft des Deckels. Gemäß dieser Variante weist der Schaft des Deckels einen partiell mit Indikatorsubstanz gefüllten Hohlraum auf. Insbesondere bei Kryoröhrchen ist oftmals nur ein unteres Teilvolumen des Aufnahmeraums mit der Bioprobe befüllt, so dass ein oberes Teilvolumen zur Anordnung der Indikatorsubstanz genutzt werden kann. According to a particularly preferred embodiment, the chamber in the lid, z. B. in the head part and / or the shaft to be integrated. This offers the advantage that the introduced indicator device can not contaminate a bioprobe stored in the receiving space, since it does not come into contact with it, but is enclosed in a cover which is to be used anyway. A further advantage is that the chamber serving as an indicator device is stored and prepared spatially separated from the rest of the sample container together with the lid (eg freezing of the indicator substance in the first case). th situation). Particularly advantageous is an integration of the chamber in the shank of the lid. According to this variant, the shank of the lid has a cavity partially filled with indicator substance. Especially in the case of cryotubes, often only a lower partial volume of the receiving space is filled with the bioprobe, so that an upper partial volume can be used to arrange the indicator substance.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Kammer als ein geschlossener Hohlkörper ausgeführt, der im Aufnahmeraum des Probenbehälters unterhalb des Deckels angeordnet ist. Diese Variante bietet den Vorteil, dass ein herkömmlicher Kryo- behälter verwendet werden kann. According to a further preferred embodiment, the chamber is designed as a closed hollow body, which is arranged in the receiving space of the sample container below the lid. This variant offers the advantage that a conventional cryogenic container can be used.

Bei dieser Ausführungsform kann der geschlossene Hohlkörper auf einer in dem Aufnahmeraum vorhandenen kryokonservierten biologischen Probe lose angeordnet sein, z. B. auf diese gelegt sein. In this embodiment, the closed hollow body may be loosely disposed on a cryopreserved biological sample present in the receiving space, e.g. B. be placed on this.

Eine Möglichkeit der erfindungsgemäßen Realisierung sieht vor, dass im Innenraum der Kammer mindestens ein fester Körper lose angeordnet ist, der eine höhere Dichte als die Indikatorsubstanz aufweist. Der feste Körper kann ein Metallkörper sein. Die lose Anordnung soll heißen, dass der mindestens eine Körper in den Innenraum der Kammer gelegt ist und dort, zumindest im flüssigen Aggregatszustand der Indikatorflüssigkeit, prinzipiell frei beweglich ist, es sei denn, er ist durch die Indikatorsubstanz festgefroren. One possibility of the realization according to the invention provides that in the interior of the chamber at least one solid body is arranged loosely, which has a higher density than the indicator substance. The solid body may be a metal body. The loose arrangement should mean that the at least one body is placed in the interior of the chamber and there, at least in the liquid state of aggregation of the indicator liquid, in principle, is free to move, unless he is frozen by the indicator substance.

Gemäß einer Variante kann in der Kammer lediglich ein fester Körper lose angeordnet sein, dessen Volumen größer als das der Indikatorsubstanz ist. Gemäß einer weiteren Va- riante können mindestens zwei feste Körper im Innenraum der Kammer vorhanden sind, wobei ein Volumen der festen Körper jeweils kleiner als ein Volumen der Indikatorsubstanz ist. According to a variant, only a solid body may be arranged loosely in the chamber, whose volume is greater than that of the indicator substance. According to another variant, at least two solid bodies may be present in the interior of the chamber, one volume of the solid bodies being smaller than one volume of the indicator substance in each case.

Diese Anordnungen besitzen den Vorteil, dass selbst Flüssigkeiten mit einem Schmelz- punkt unter -100 °C, weiter vorzugsweise weit unter -100 °C, verwendet werden können, die dann zumeist eine recht hohe Viskosität besitzen. Die Indikatorsubstanz würde dann nicht an der Wand zum Boden der Kammer fließen, sondern in einem oberen Teil der Kammer verbleiben. Der oder die in der Kammer lose angeordneten gewichtigen Körper hingegen fallen aus der Flüssigkeit heraus auf den Boden. Dies kann z. B. durch eine zweckmäßig ausgeführte Messeinrichtung, z. B. einen optischen Sensor, einen Sensor zur Messung der Leitfähigkeit etc. detektiert werden. Eine visuelle Bestimmung des Zustands ist ebenfalls möglich. These arrangements have the advantage that even liquids with a melting point below -100 ° C, more preferably far below -100 ° C, can be used, which then usually have a rather high viscosity. The indicator substance would then not flow on the wall to the bottom of the chamber, but in an upper part of the Remain chamber. On the other hand, the weightless body or bodies loosely arranged in the chamber fall out of the liquid onto the ground. This can be z. B. by a suitably designed measuring device, for. As an optical sensor, a sensor for measuring the conductivity, etc. are detected. A visual determination of the condition is also possible.

Mit dem Begriff Probenbehälter wird insbesondere ein für eine Kryokonservierung ausgelegter Behälter bezeichnet. Der Probenbehälter ist vorzugsweise unter Verwendung tief- temperaturverträglichen Kunststoffmaterials für Temperaturen unter -140 °C hergestellt. Das Kunststoffmaterial kann ohne Veränderung und ohne Schaden wiederholte Temperaturwechsel tolerieren. Es wird vorzugsweise ein Kunststoffmaterial verwendet, dessen Wasseraufnahmefähigkeit < 1 % der Eigenmasse, insbesondere < 0.1 % der Eigenmasse beträgt. Erfindungsgemäße Kryospeicherelemente basieren beispielsweise auf Polyurethan oder Polyethylen. The term sample container refers in particular to a container designed for cryopreservation. The sample container is preferably produced using low-temperature-compatible plastic material for temperatures below -140.degree. The plastic material can tolerate repeated temperature changes without change and without damage. A plastic material is preferably used whose water absorption capacity is <1% of the intrinsic mass, in particular <0.1% of the intrinsic mass. Cryogenic storage elements according to the invention are based, for example, on polyurethane or polyethylene.

Mit dem Begriff„biologische Probe" wird biologisches Material wie Zellen, Gewebe, Zellbestandteile, biologische Makromoleküle etc. bezeichnet, welches im Probenbehälter der Kryokonservierung unterzogen wird - ggf. in einer Suspension und/oder im Verbund mit einem Substratmaterial. Im Aufnahmeraum kann somit ein Substrat angeordnet sein, das zur adhärenten Aufnahme biologischer Zellen, die Teil der biologischen Probe sind, eingerichtet ist. The term "biological sample" refers to biological material such as cells, tissue, cell constituents, biological macromolecules, etc. which is subjected to cryopreservation in the sample container, possibly in a suspension and / or composite with a substrate material Substrate arranged for the adherence of biological cells, which are part of the biological sample, is arranged.

Die zuvor beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen und Merkmale der Erfindung sind miteinander kombinierbar. Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen: The preferred embodiments and features of the invention described above can be combined with one another. Further details and advantages of the invention will be described below with reference to the accompanying drawings. Show it:

FIG. 1-4 schematische Ansichten verschiedener Ausführungsbeispiele eine Vorrichtung zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe; FIG. 5 ein Ablaufdiagramm zur Illustration eines Ausführungsbeispiels eines Verfahrens zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe; FIG. 1-4 are schematic views of various embodiments of apparatus for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample; FIG. 5 is a flowchart illustrating an embodiment of a method for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample;

FIG. 6A, 6B, 7A jeweils ein Schmelzdiagramm eines Flüssigkeitsgemisches; FIG. FIGS. 6A, 6B, 7A are each a melting diagram of a liquid mixture;

FIG. 7B eine Tabelle mit Schmelzpunkten einiger reiner Flüssigkeiten; und FIG. 7B is a table with melting points of some pure liquids; and

FIG. 8 eine Mischbarkeitsmatrix von Lösemitteln. FIG. Figure 8 shows a miscibility matrix of solvents.

Gleiche oder funktional äquivalente Elemente sind in allen Figuren mit denselben Bezugszeichen bezeichnet und werden zum Teil nicht gesondert beschrieben. Identical or functionally equivalent elements are denoted by the same reference numerals in all figures and are in part not described separately.

Die schematischen Schnittansichten A bis E der Figur 1 illustrieren ein erstes Ausfüh- rungsbeispiel der Erfindung. The schematic sectional views A to E of FIG. 1 illustrate a first embodiment of the invention.

Hierbei ist in Figur 1A ein zylindrisches Aufnahmeteil 1 eines Kryoröhrchens im Schnitt dargestellt. Der durch das zylindrische Aufnahmeteil 1 gebildete Aufnahmehohlraum 2 ist hier bereits mit der Bioprobe 6 befüllt worden. Die Bioprobe 6 kann z. B. eine Zellsuspen- sion sein. In Figur 1B ist der über ein Gewinde 8 aufschraubbare Deckel 3 für das Kryo- röhrchen 1, 3 gezeigt, der auf dem Kopf steht und der das Aufnahmeteil 1 verschließt und oben optional einen Eingriff 4 besitzt, über den der Deckel 3 mit einem Werkzeug (nicht gezeigt) im Fall der Automatisierung gedreht werden kann. Der Deckel enthält im einschraubbaren Teil, d. h. im Schaft 5, der in das Aufnahmevolumen 2 im verschraubten Zustand eingreift, eine Kammer 11, die ein Hohlvolumen 12 ausbildet. Dieses ist partiell mit einer Indikatorsubstanz 7 in Form einer Flüssigkeit oder einer Flüssigkeitsmischung befüllt, deren Gefrierpunkt/Schmelzpunkt im Bereich von -20 °C bis -100 °C über das Mischungsverhältnis so gewählt ist, dass der Schmelzpunkt den Wert eines zu überwachenden Temperaturgrenzwerts aufweist. Dies wird nachfolgend noch anhand der Figuren 5 bis 8 näher erläutert. Für die Lagerung einer solchen Bioprobe 6 wird das Kryoröhrchen 1 im offenen Zustand, wie in Figur 1A gezeigt, und der Deckel 3 in der kopfstehenden Position, wie in Figur 1B gezeigt auf die Lagertemperatur tiefgefroren. Dabei sammelt sich die Indikatorsubstanz 7 zunächst im flüssigen Aggregatszustand unter Einfluss der Schwerkraft im Teilvolumen 12b des Hohlvolumens 12 der Kammer 11 und gefriert dort bei der Abkühlung auf die Lagertemperatur oder auf eine Temperatur, die zumindest unterhalb der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 7 liegt. Here, a cylindrical receiving part 1 of a cryotube is shown in section in FIG. 1A. The receiving cavity 2 formed by the cylindrical receiving part 1 has already been filled with the bioprobe 6 here. The bioprobe 6 can, for. B. be a cell suspension. FIG. 1B shows the cover 3, which can be screwed on via a thread 8, for the cryotube 1, 3, which is upside down and which closes the receiving part 1 and optionally has an engagement 4 above, via which the cover 3 can be fitted with a tool (FIG. not shown) in the case of automation can be rotated. The lid contains in the screw-in part, ie in the shaft 5, which engages in the receiving volume 2 in the screwed state, a chamber 11 which forms a hollow volume 12. This is partially filled with an indicator substance 7 in the form of a liquid or a liquid mixture whose freezing point / melting point in the range of -20 ° C to -100 ° C is selected via the mixing ratio such that the melting point has the value of a temperature limit to be monitored. This will be explained in more detail below with reference to FIGS. 5 to 8. For the storage of such an organic sample 6, the cryovial 1 is frozen in the open state, as shown in Figure 1A, and the lid 3 is frozen to the storage temperature in the inverted position as shown in Figure 1B. In this case, the indicator substance 7 first collects in the liquid state under the influence of gravity in the partial volume 12b of the hollow volume 12 of the chamber 11 and freezes there during the cooling to the storage temperature or to a temperature which is at least below the melting temperature of the indicator substance 7.

Bei der Lagertemperatur, mindestens aber unterhalb der Schmelztemperatur der Indika- torsubstanz 7, wird der aufschraubbare Deckel 3 um 180° gedreht und wie in Figur IC und Figur 1D zum Verschließen des in Figur 1A gezeigten zylindrischen Aufnahmeteils 1 eingeschraubt. Die im Teilvolumen 12b festgefrorene Indikatorsubstanz 7 verbleibt im oberen Teilvolumen 12b der Kammer. Das untere Teilvolumen 12a ist im Wesentlichen frei von Indikatorsubstanz 7. At the storage temperature, but at least below the melting temperature of the indicator substance 7, the screw-on cover 3 is rotated by 180 ° and, as in FIG. 1C and FIG. 1D, screwed in to close the cylindrical receiving part 1 shown in FIG. 1A. The indicator substance 7 frozen in the partial volume 12b remains in the upper partial volume 12b of the chamber. The lower partial volume 12 a is substantially free of indicator substance 7.

Die so gebildete Vorrichtung 10 zur Temperaturüberwachung kann nun kryogelagert werden. In dieser Form, zumeist senkrecht in Aufnahmen stehend, wird die Vorrichtung 10 in den Tieftemperaturbehältern gelagert. Wird nun die Bioprobe 6 bei irgendeiner Manipulation oder Havariesituation im Lagertank über den Schmelzpunkt der Indikatorsubstanz 7 gebracht, so wird diese flüssig, tropft nach unten, und es ergibt sich das in Figur IE dargestellte Bild. Ist die Probe dagegen korrekt gelagert worden, befindet sich die Indikatorsubstanz nach einem Lagervorgang weiterhin in dem Teilbereich 12a der Kammer 11. Der Zustand ist in Figur 1D dargestellt. Auf diese Weise ist leicht eine unstatthafte Erwärmung der Probe 6 erkennbar. Die Lage der Indikatorsubstanz innerhalb der Kammer 11 ist optisch durch Ansehen detektierbar. Über eine horizontale Detektion, schematisch dargestellt durch die gestrichelte Linie 100, kann bei transparenter oder semi-transparenter Ausführung des Kryoröhrchens 1, 3 die Position der Indikatorsubstanz 7 auch auf automatisiert optischem Weg bestimmt werden. The device 10 for temperature monitoring thus formed can now be cryothorged. In this form, usually standing vertically in recordings, the device 10 is stored in the cryogenic containers. If the bioprobe 6 is now brought above the melting point of the indicator substance 7 during any manipulation or accident situation in the storage tank, it becomes liquid, drips downwards, and the picture shown in FIG. IE results. On the other hand, if the sample has been stored correctly, the indicator substance continues to be located in the partial region 12a of the chamber 11 after a storage process. The state is shown in FIG. 1D. In this way, an inadmissible heating of the sample 6 is easily recognizable. The location of the indicator substance within the chamber 11 is optically detectable by sight. Through a horizontal detection, shown schematically by the dashed line 100, the position of the indicator substance 7 can also be determined in an automated optical way in the case of transparent or semi-transparent design of the cryotube 1, 3.

Ein weiterer Vorteil der Vorrichtung 10 ist die Wiederverwendbarkeit der Deckel 11 und die Verwendung von als Indikatorsubstanz 7 verwendeten Markerflüssigkeiten mit einem frei wählbaren Gefrierpunkt. Für Lebendablagen empfiehlt sich eine Schmelztemperatur um -80 °C, da hier eine deutliche Rekristallisation des Eises in den Zellen und um diese herum auftritt, die zu einer Qualitätsminderung der Kryoprobe führt. Für biologische Flüssigkeiten und Lagerung von genetischem Material, das bei -80 °C gelagert wird, ist ein Schmelzpunkt um -30 °C zu empfehlen. Another advantage of the device 10 is the reusability of the lid 11 and the use of marker liquids used as an indicator substance 7 with a freely selectable freezing point. For live storage, a melting point of -80 ° C is recommended, as there is a significant recrystallization of the ice in and around the cells, which leads to a reduction in the quality of the cryoprobe. For biological fluids and storage of genetic material stored at -80 ° C, a melting point of -30 ° C is recommended.

Figur 2 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung 20 zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe. Die Vorrichtung 20 umfasst wiederum ein Kryoröhrchen als Probenbehälter und eine im Innern des Kryoröhrchens anordenbare Indikatoreinrichtung 21 in Form eines partiell mit Indikatorsubstanz 7 gefüllten Hohlzylinders 21 bzw. 21a. FIG. 2 shows a further exemplary embodiment of a device 20 for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample. The device 20 in turn comprises a cryotube as a sample container and an indicator device 21 which can be arranged in the interior of the cryotube in the form of a hollow cylinder 21 or 21 a partially filled with indicator substance 7.

In Figur 2A ist ein Kryoröhrchen gezeigt, das beispielsweise auch tiefgefroren sein kann. Das Kryoröhrchen umfasst wiederum ein zylindrisches Aufnahmeteil 1, das einen Auf- nahmehohlraum 2 ausbildet, der hier bereits mit der Bioprobe 6 befüllt worden ist. Das Kryoröhrchen umfasst ferner einen Deckel 3 für das Kryoröhrchen, der das Aufnahmeteil 1 verschließt. In Figure 2A, a cryotube is shown, which may for example also be frozen. The cryovial again comprises a cylindrical receiving part 1, which forms a receiving cavity 2, which has already been filled with the bioprobe 6 here. The cryotube further comprises a cover 3 for the cryotube, which closes the receiving part 1.

Für die zukünftige Detektion der Überschreitung einer kritischen Grenztemperatur wird ein verschlossener Hohlzylinder 21 benutzt, der partiell mit einer Indikatorsubstanz 7 befüllt ist und auf diese Weise als Indikatoreinrichtung zur Temperaturüberwachung genutzt werden kann. Die Indikatorsubstanz 7 ist wieder so gewählt, dass ihr Schmelzpunkt im Bereich von -20 °C bis -100 °C liegt und den Wert eines zu überwachenden Temperaturgrenzwerts aufweist. For the future detection of the exceeding of a critical limit temperature, a closed hollow cylinder 21 is used, which is partially filled with an indicator substance 7 and can be used in this way as an indicator device for temperature monitoring. The indicator substance 7 is again selected so that its melting point is in the range of -20 ° C to -100 ° C and has the value of a temperature limit to be monitored.

Der Hohlzylinder 21 wird in der in Figur 1B gezeigten Stellung außerhalb vom Kryoröhrchen eingefroren. Die Indikatorsubstanz sammelt sich im unteren Teilvolumen 22b und friert dort fest. Danach wird das in Figur 1A gezeigte Kryoröhrchen 1, 23 geöffnet, indem der Deckel 23 abgeschraubt wird, der Hohlzylinder 21 wird um 180° gedreht auf die bereits gefrorene Bioprobe 6 gegeben und das Kryoröhrchen 1, 23 wieder verschlossen, so dass sich das in Figur IC dargestellte Bild ergibt. Der Hohlzylinder 21 liegt somit lose auf der Bioprobe, in einer Ausrichtung, in der sich die Indikatorsubstanz zunächst im gefrorenen Zustand oben im Hohlraum 22 befindet. Wurde anschließend die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 7 erreicht, befindet sich die Flüssigkeit wieder am Boden des Zylinders 21, im Teilvolumen 21a, woran erkennbar ist, dass eine kritische Grenztemperatur überschritten wurde. The hollow cylinder 21 is frozen in the position shown in Figure 1B outside of the cryotube. The indicator substance collects in the lower partial volume 22b and freezes there. Thereafter, the cryotube 1, 23 shown in Figure 1A is opened by the lid 23 is unscrewed, the hollow cylinder 21 is rotated by 180 ° on the already frozen bioprobe 6 and the cryotube 1, 23 closed again, so that in Figure IC shown image results. The hollow cylinder 21 thus lies loosely on the bioprobe, in an orientation in which the indicator substance is initially in the frozen state at the top in the cavity 22. Subsequently, when the melting temperature of the indicator substance 7 has been reached, the liquid is again at the bottom of the cylinder 21, in the partial volume 21a, as can be seen that a critical limit temperature has been exceeded.

In Figur 2D ist alternativ ein Vierkammerholzylinder 21a dargestellt, der statt des Hohlzy- linders 21 analog verwendet werden kann und in gleicher Weise in ein Kryoröhrchen 1, 23 eingeführt werden kann. Hierbei ist der Innenraum des Hohlzylinders 21 durch Trennwände 25 in vier fluidisch getrennte Teilhohlräume unterteilt, die jeweils partiell mit einer Indikatorsubstanz gefüllt sind. Die Indikatorsubstanzen 7a, 7b, 7c, 7d in den Teilhohlräumen sind jedoch verschieden und weisen verschiedene Schmelzpunkte auf. FIG. 2D alternatively shows a four-chamber wood cylinder 21a which, instead of the hollow cylinder 21, can be used analogously and can be introduced into a cryotube 1, 23 in the same way. Here, the interior of the hollow cylinder 21 is divided by partitions 25 into four fluidly isolated part cavities, which are each partially filled with an indicator substance. However, the indicator substances 7a, 7b, 7c, 7d in the partial cavities are different and have different melting points.

Zweckmäßigerweise wählt man eine Staffelung der Schmelzpunkte der Indikatorsubstanzen 7a, 7b, 7c, 7d, z. B. -20 °C für die Indikatorsubstanz 7a, -50 °C für die Indikatorsubstanz 7b, -80 °C für die Indikatorsubstanz 7c und -110 °C für die Indikatorsubstanz 7d. Findet man nun bei einer Kontrolle die gefrorenen Indikatorsubstanzen 7a bis 7c noch im oberen Bereich 22b des Hohlzylinders, die Indikatorsubstanz 7d aber am Boden (Teilbereich 22a), dann wurde bei der Probe 6 eine Temperatur von -110 °C überschritten. Befindet sich auch die Indikatorsubstanz 7c am Boden, wurden -80 °C überschritten, befinden sich alle Markerflüssigkeiten 7a bis 7d am Boden, sind sogar -20 °C überschritten worden. Appropriately, one chooses a staggering of the melting points of the indicator substances 7a, 7b, 7c, 7d, z. Eg -20 ° C for the indicator substance 7a, -50 ° C for the indicator substance 7b, -80 ° C for the indicator substance 7c and -110 ° C for the indicator substance 7d. If the frozen indicator substances 7a to 7c are still found in the upper region 22b of the hollow cylinder during an inspection, but the indicator substance 7d is found on the bottom (partial region 22a), a temperature of -110 ° C. was exceeded for the sample 6. If the indicator substance 7c is also on the ground, when -80 ° C has been exceeded, all marker liquids 7a to 7d are on the ground and have even been exceeded at -20 ° C.

Der in den Aufnahmeraum 2 eingebrachte Hohlzylinder 21 oder 21a sollte auf seiner Oberfläche steril sein bzw. anderweitig keim- und kontaminationsfrei gemacht werden. The introduced into the receiving space 2 hollow cylinder 21 or 21a should be sterile on its surface or otherwise made germ and contamination free.

Figur 3 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung 30 zur Temperaturüber- wachung einer kryokonservierten biologischen Probe. Die Besonderheit dieser Vorrichtung 30 im Vergleich zu der in Figur 1 gezeigten Vorrichtung 10 liegt darin, dass die in den Deckel 3 des Kryoröhrchens integrierte Kammer 31 nicht nur partiell mit einer Indika- torsubstanz 7 gefüllt ist, sondern ferner kleine feste Körper 33 enthält, die lose in den Innenraum bzw. Hohlraum 32 der Kammer 33 eingebracht sind. FIG. 3 shows a further exemplary embodiment of a device 30 for temperature monitoring of a cryopreserved biological sample. The peculiarity of this device 30 in comparison with the device 10 shown in FIG. 1 is that the chamber 31 integrated in the lid 3 of the cryotube is not only partially covered with an indicium. torsubstanz 7 is filled, but also contains small solid body 33 which are loosely inserted into the interior or cavity 32 of the chamber 33.

So zeigt Figur 3A das Aufnahmeteil 1 eines Kryoröhrchens im Schnitt analog zu Figur 1A. Die in den Schaft 5 des auf dem Kopf stehenden Deckels 3 integrierte Kammer ist, wie in Figur 3B gezeigt, nur am Boden mit einer Indikatorsubstanz 7 befüllt. In dieser befinden sich kleine Körper 33 mit vergleichbar höherer Dichte als die Indikatorsubstanz und damit höherem Gewicht. Die Körper 33 können beispielsweise Metallkugeln sein. Das Aufnahmeteil 1 und der auf dem Kopf stehende Deckel 3 werden nun auf die Lagertemperatur gebracht. Dadurch frieren die kleinen Körper 33 in der Indikatorflüssigkeit 7 ein. Wird nun der Deckel wie in Figur 1 um 180° gedreht aufgeschraubt, wie in Figur 3C dargestellt, dann befindet sich die Kammerfüllung, bestehend aus der gefrorenen Indikatorsubstanz 7 mit den fixierten kleinen Körpern 33, an der Decke des Hohlraumes 32 der Kammer 31. Wird die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 7 bei der Kryolagerung nicht überschritten, ergibt sich ein Bild wie in Figur 3D gezeigt. Der Konfiguration der Kammerfüllung hat sich nicht verändert, sowohl die Indikatorsubstanz 7 als auch die darin festgefrorenen kleinen Körper 33 befinden sich an der Decke des Hohlraumes 32 der Kammer 31. Wird die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 7 überschritten, fallen zumindest die gewichtigen Körper 33 auf den Boden des Hohlraumes 32 der Kammer 31, wie in Figur 3E dargestellt. Diese Anordnung besitzt den Vorteil, dass selbst Flüssigkeiten mit einem Schmelzpunkt weit unter -100 °C verwendet werden können, die dann zumeist eine recht hohe Viskosität besitzen. Die Indikatorsubstanz 7 würde dann nicht an der Wand zum Boden des Hohlraums 32 fließen, sondern im oberen Teil verbleiben. Die gewichtigenThus, Figure 3A shows the receiving part 1 of a cryotube in section analogous to Figure 1A. The chamber which is integrated into the shaft 5 of the upside-down cover 3 is, as shown in FIG. 3B, filled with an indicator substance 7 only at the bottom. In this are small body 33 with comparable higher density than the indicator substance and thus higher weight. The bodies 33 may be, for example, metal balls. The receiving part 1 and the upside-down cover 3 are now brought to the storage temperature. As a result, the small bodies 33 freeze in the indicator liquid 7. Now, if the lid is screwed rotated by 180 ° as shown in Figure 1, as shown in Figure 3C, then the chamber filling, consisting of the frozen indicator substance 7 with the fixed small bodies 33, on the ceiling of the cavity 32 of the chamber 31st does not exceed the melting temperature of the indicator substance 7 during the cryogenic storage, the result is a picture as shown in FIG. 3D. The configuration of the chamber filling has not changed, both the indicator substance 7 and the frozen therein small body 33 are located on the ceiling of the cavity 32 of the chamber 31. If the melting temperature of the indicator substance 7 is exceeded, fall at least the weighty body 33 to the ground the cavity 32 of the chamber 31, as shown in Figure 3E. This arrangement has the advantage that even liquids with a melting point far below -100 ° C can be used, which then usually have a fairly high viscosity. The indicator substance 7 would then not flow on the wall to the bottom of the cavity 32, but remain in the upper part. The weighty ones

Körper 33 hingegen fallen aus der flüssig gewordenen Indikatorsubstanz 7 heraus auf den Boden, wie in Figur 3E gezeigt. Dies kann z. B. durch einen Sensor (Leitfähigkeit, optisch etc.) detektiert werden. Eine visuelle Bestimmung des Zustands ist ebenfalls möglich. Figur 4 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung 40 zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe. Die Besonderheit dieser Vorrichtung 40 im Vergleich zu der in Figur 3 gezeigten Vorrichtung 30 liegt darin, dass sich in der in den Deckel 3 integrierten Kammer 41 neben der Indikatorsubstanz ein vergleichsweise großer und schwerer Körper 43 befindet anstelle von mehreren kleinen Körpern. By contrast, bodies 33 fall out of the liquid indicator substance 7 onto the ground, as shown in FIG. 3E. This can be z. B. by a sensor (conductivity, optical, etc.) can be detected. A visual determination of the condition is also possible. FIG. 4 shows a further exemplary embodiment of a device 40 for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample. The peculiarity of this device 40 compared to the device 30 shown in Figure 3 is that in the in the lid 3 integrated chamber 41 in addition to the indicator substance, a comparatively large and heavy body 43 is instead of several small bodies.

In Figur 4A ist wieder das Aufnahmeteil 1 eines Kryoröhrchens für eine Bioprobe 6 im Schnitt gezeigt. Figur 4B zeigt wieder einen auf dem Kopf stehenden Deckel 3 des Kryoröhrchens, in dessen Inneren wieder eine Kammer 41 integriert ist, die einen Hohlraum 42 ausbildet, der partiell mit einer Indikatorsubstanz 7 gefüllt ist. Ferner ist in den Hohlraum 42 lose ein großer und schwerer Körper 43 eingebracht. Das Einfrieren der Indikatorsubstanz und Lagern der Vorrichtung 40 erfolgt analog wie für die Vorrichtung 30. Ana- log zur der in Figur 3 gezeigten Vorrichtung ist hier das Ablösen des großen Körpers 43 bei Überschreitung der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 7 noch weniger störanfällig, gleichzeitig gibt er durch sein Herabsinken entweder eine optisch transparente Strecke frei oder blockiert diese. Die optisch transparente Strecke ist schematisch durch die gestrichelte Linie 100 in Figur 4E dargestellt. In FIG. 4A, the receiving part 1 of a cryovial for a bioprobe 6 is again shown in section. FIG. 4B again shows an upside-down lid 3 of the cryotube, in the interior of which again a chamber 41 is integrated, which forms a cavity 42 which is partially filled with an indicator substance 7. Furthermore, a large and heavy body 43 is loosely inserted into the cavity 42. The freezing of the indicator substance and storage of the device 40 is analogous to the device 30. Analogous to the device shown in Figure 3, the detachment of the large body 43 is even less susceptible to interference when exceeding the melting temperature of the indicator substance 7, at the same time he passes his sinking either an optically transparent route free or blocked. The optically transparent path is shown schematically by dashed line 100 in FIG. 4E.

Figur 5 illustriert anhand eines Ablaufdiagramms ein Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe. In Schritt Sl wird eine Vorrichtung zur Temperaturüberwachung bereitgestellt, beispielsweise eine der Vorrichtungen 10, 20, 30, 30 oder 40. Hierbei ist je nach Temperaturgrenzwert, der bei der Kryolagerung überwacht werden soll, eine geeignete Flüssigkeit oder ein Flüssigkeitsgemisch als Indikatorsubstanz 7 auszuwählen. FIG. 5 illustrates, with reference to a flow chart, a method for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample. In step S1, a device for temperature monitoring is provided, for example one of the devices 10, 20, 30, 30 or 40. In this case, depending on the temperature limit to be monitored during the cryopreservation, a suitable liquid or liquid mixture is selected as the indicator substance 7.

Über die Auswahl geeigneter Flüssigkeiten und das Mischungsverhältnis von Flüssigkeiten kann deren Schmelzpunkt auf einen gewünschten Wert, insbesondere in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C festgelegt werden. Through the selection of suitable liquids and the mixing ratio of liquids, their melting point can be set to a desired value, in particular in a range from -20 ° C to -140 ° C.

Beispielhaft ist in Figur 6A der Verlauf des Schmelzpunktes als Funktion des Mischungsverhältnisses aus einem Alkohol und Wasser angegeben, mit dem bei moderater Viskositätserhöhung mit abfallender Temperatur ein Temperaturbereich zwischen 0 °C und -118 °C abgedeckt werden kann. Soll z. B. ein Temperaturgrenzwert von -118 °C überwacht werden, kann der Ethanolanteil auf 93,5 % festgelegt werden. Schmelzpunkte bis zu einem Wert von knapp unter -60 °C können auch durch Zumischung von Kaliumhydroxid (KOH) zu Wasser eingestellt werden, was in Figur 6B anhand eines Schmelzdiagramms gezeigt ist. Auch eine Mischung aus Wasser und Gefrierschutzmittel kann als Indikatorsubstanz verwendet werden, was durch das Schmelzdiagramm der Figur 7A illustriert ist. Die Tabelle der Figur 7B führt Gefrierpunkte/Schmelzpunkte weiterer reiner Flüssigkeiten auf, die alleine oder als Mischung mit einer anderen Flüssigkeit als Indikatorsub- stanz verwendet werden können. Weitere als Indikatorsubstanz geeignete Flüssigkeitsgemische sind Chloroform-Zyklohexan-Gemische oder andere mischbare Flüssigkeiten, die z. B. aus der Mischbarkeitsmatrix von Lösemitteln der Figur 8 entnommen werden können. Vornehmlich werden Flüssigkeiten und Plastikmaterialien mit guter Benetzbarkeit und niedriger Viskosität bei niedrigen Temperaturen ausgewählt, um die Lageveränderung möglichst umfangreich und die Zusatzkompartimente klein zu gestalten. By way of example, FIG. 6A shows the curve of the melting point as a function of the mixing ratio of an alcohol and water, with which a temperature range between 0 ° C and -118 ° C can be covered with a moderate increase in viscosity with decreasing temperature. Should z. B. a temperature limit of -118 ° C are monitored, the ethanol content can be set to 93.5%. Melting points up to a value of just below -60 ° C can also be adjusted by admixing potassium hydroxide (KOH) to water, which is shown in FIG. 6B by means of a melting diagram is shown. A mixture of water and cryoprotectant may also be used as the indicator substance, as illustrated by the melting diagram of Figure 7A. The table of FIG. 7B lists freezing points / melting points of further pure liquids which can be used alone or as a mixture with another liquid as an indicator substance. Other suitable as indicator substance liquid mixtures are chloroform-cyclohexane mixtures or other miscible liquids, the z. B. from the miscibility matrix of solvents of Figure 8 can be removed. Primarily, liquids and plastic materials with good wettability and low viscosity at low temperatures are selected to make the change in position as large as possible and the Zusatzkompartimente small.

Falls mehrere Temperaturgrenzwerte bei der Kryolagerung überwacht werden sollen bzw. falls die erreichten Temperaturintervalle, in die die Probe gelangt ist, genauer eingegrenzt werden sollen, können entsprechend mehrere verschiedene Indikatorsubstanzen mit verschiedenen Schmelzpunkten verwendet werden, die dann in verschiedenen Teilhohlräumen der Kammer vorgesehen sind. In Schritt S2 wird dann die Indikatorsubstanz in der Kammer eingefroren, wobei die Kammer während des Einfrierens der Indikatorsubstanz in eine erste Lage gebracht wird. Bei verschiedenen Indikatorsubstanzen und mehreren Kammern werden diese analog jeweils in die erste Lage gebracht und eingefroren. Die erste Lage entspricht bei den Ausführungsbeispielen der Figuren 1, 3 und 4 jeweils einer Stellung des Deckels 3, bei der dieser auf dem Kopf steht, wie in Figur 1B, 3B oder 4B dargestellt ist. If several temperature limit values are to be monitored during the cryogenic storage or if the temperature intervals reached by the sample are to be narrowed down more precisely, it is possible to use a plurality of different indicator substances with different melting points, which are then provided in different partial cavities of the chamber. In step S2, the indicator substance is then frozen in the chamber, wherein the chamber is brought into a first position during the freezing of the indicator substance. In the case of different indicator substances and a plurality of chambers, these are each brought into the first position in an analogous manner and frozen. In the exemplary embodiments of FIGS. 1, 3 and 4, the first layer corresponds in each case to a position of the cover 3 in which it is turned upside down, as shown in FIG. 1B, 3B or 4B.

Danach wird in Schritt S3 die mindestens eine Kammer mit der gefrorenen Indikatorsubstanz in eine zweite Lage gebracht und im Innen des Probenbehälters angeordnet. Gemäß den in den Figuren 1 bis 4 gezeigten Ausführungsbeispielen ist die zweite Lage um 180° gedreht zur ersten Lage. Gemäß den in den Figuren 1, 3 und 4 gezeigten Ausführungsbei- spielen wird die Kammer durch Verschrauben des Deckels 3 mit dem Aufnahmeteil 1 in die zweite Lage gebracht. Bei der Ausführungsvariante der Figur 2 wird der Hohlzylinder um 180° gedreht auf die gefrorene Bioprobe 6 im Aufnahmeraum 2 gelegt. In diesem Zustand kann die Vorrichtung mit einer Kryoprobe im Aufnahmeraum des Probenbehälters bei einer Lagertemperatur unterhalb der Schmelztemperatur gelagert werden (Schritt S4). Thereafter, in step S3, the at least one chamber with the frozen indicator substance is brought into a second position and arranged in the interior of the sample container. According to the embodiments shown in Figures 1 to 4, the second layer is rotated by 180 ° to the first layer. According to the Ausführungsbei- shown in Figures 1, 3 and 4, the chamber is brought by screwing the lid 3 with the receiving part 1 in the second position. In the embodiment of Figure 2, the hollow cylinder is rotated by 180 ° placed on the frozen bio sample 6 in the receiving space 2. In this state, the device can be stored with a cryoprobe in the receiving space of the sample container at a storage temperature below the melting temperature (step S4).

Nachfolgend kann durch Prüfung des Zustands der Kammerfüllung zu einem beliebigen Zeitpunkt während des Lagervorgangs überprüft werden, ob eine unerwünschte, wenn auch nur zeitweise, Erwärmung der Kryoprobe stattgefunden hat (Schritt S5). Hierzu wird geprüft, ob eine durch einen Schmelzvorgang verursachte zumindest teilweise Verlagerung und/oder Formänderung der Kammerfüllung stattgefunden hat, wie dies vorstehend bereits bei den Figuren 1 bis 4 erläutert wurde. Ist dies der Fall, kann auf ein Überschreiten der zu überwachenden Grenztemperatur(en) geschlossen werden. Subsequently, it can be checked by checking the state of the chamber filling at any time during the storage process, whether an undesirable, albeit temporary, heating of the cryoprobe has taken place (step S5). For this purpose, it is checked whether an at least partial displacement and / or shape change of the chamber filling caused by a melting process has taken place, as has already been explained above in FIGS. 1 to 4. If this is the case, it can be concluded that the limit temperature (s) to be monitored have been exceeded.

Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsbeispiele beschrieben worden ist, ist es für einen Fachmann ersichtlich, dass verschiedene Änderungen ausgeführt werden können und Äquivalente als Ersatz verwendet werden können, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen. Folglich soll die Erfindung nicht auf die offenbarten Ausführungsbeispiele begrenzt sein, sondern soll alle Ausführungsbeispiele umfassen, die in den Bereich der beigefügten Patentansprüche fallen. Insbesondere beansprucht die Erfindung auch Schutz für den Gegenstand und die Merkmale der Unteransprüche unabhängig von den in Bezug genommenen Ansprüchen. Although the invention has been described with reference to particular embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that various changes may be made and equivalents may be substituted for without departing from the scope of the invention. Accordingly, the invention should not be limited to the disclosed embodiments, but should include all embodiments which fall within the scope of the appended claims. In particular, the invention also claims protection of the subject matter and the features of the subclaims independently of the claims referred to.

Claims

ANSPRÜCHE 1. Vorrichtung (10; 20; 30; 40) zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe, umfassend CLAIMS 1. Apparatus (10; 20; 30; 40) for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample comprising

a) einen Probenbehälter (1), aufweisend einen Aufnahmeraum (2) zur Aufnahme einer biologischen Probe (6), und einen Deckel (3) zum Verschließen des Aufnahmeraums; und b) eine im Innern des Probenbehälters, insbesondere im Aufnahmeraum und/oder im Deckel, angeordnete Kammer (11; 21; 21a; 31; 41), deren Innenraum (12; 22; 32; 42) mit dem Aufnahmeraum (2) nicht fluidisch verbunden ist und lediglich zum Teil mit mindestens einer Indikatorsubstanz (7) gefüllt ist, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt. a) a sample container (1), comprising a receiving space (2) for receiving a biological sample (6), and a lid (3) for closing the receiving space; and b) a chamber (11; 21; 21a; 31; 41) arranged in the interior of the sample container, in particular in the receiving space and / or in the lid, the interior space (12; 22; 32; 42) of which does not correspond to the receiving space (2) is fluidically connected and only partially filled with at least one indicator substance (7) whose melting temperature is in a range of -20 ° C to -140 ° C.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenbehälter (1) ein Kryoröhrchen ist. 2. Apparatus according to claim 1, characterized in that the sample container (1) is a cryotube.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Innenraum (22a) der Kammer (21a) in mehrere voneinander getrennte Teilräume unterteilt ist, die jeweils lediglich zum Teil mit einer Indikatorsubstanz (7a, 7b, 7c, 7d), deren 3. Apparatus according to claim 1 or 2, characterized in that the interior (22 a) of the chamber (21 a) is divided into a plurality of separate subspaces, each only partially with an indicator substance (7 a, 7 b, 7 c, 7 d) whose

Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt, gefüllt sind, wobei die Indikatorsubstanzen (7a, 7b, 7c, 7d) in den Teilräumen unterschiedliche Melting temperature in a range of -20 ° C to -140 ° C are filled, wherein the indicator substances (7a, 7b, 7c, 7d) in the subspaces different

Schmelztemperaturen aufweisen. Have melting temperatures.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, a) dass der Deckel (3) einen mit einem oberen Endbereich des Aufnahmeraums (2) in Eingriff stehenden Schaft (5) aufweist und 4. Device according to one of the preceding claims, characterized in that a) that the lid (3) has a with an upper end portion of the receiving space (2) in engagement shaft (5) and

b) dass die Kammer (11; 31; 41) in den Schaft (5) integriert ist. b) that the chamber (11; 31; 41) is integrated in the shaft (5).

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die5. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the

Kammer als ein geschlossener Hohlkörper (21; 21a) ausgeführt ist, der im Aufnahmeraum (2) des Probenbehälters (1) unterhalb des Deckels (3) angeordnet ist. Chamber is designed as a closed hollow body (21, 21a) which is arranged in the receiving space (2) of the sample container (1) below the lid (3).

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der geschlossene Hohlkörper (21; 21a) auf einer in dem Aufnahmeraum vorhandenen kryokonservierten biologischen Probe (6) lose angeordnet ist. 6. Device according to claim 5, characterized in that the closed hollow body (21; 21a) is arranged loosely on a cryopreserved biological sample (6) present in the receiving space.

7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Innenraum der Kammer (31; 41) mindestens ein fester Körper (33; 43) lose angeordnet ist, der eine höhere Dichte als die Indikatorsubstanz (7) aufweist. 7. Device according to one of the preceding claims, characterized in that in the interior of the chamber (31; 41) at least one solid body (33; 43) is arranged loosely, which has a higher density than the indicator substance (7).

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz (7) unterhalb von -100 °C liegt. 8. The device according to claim 7, characterized in that the melting temperature of the indicator substance (7) is below -100 ° C.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass in der Kammer (41) ein fester Körper (43) lose angeordnet ist, dessen Volumen größer als das der , Indikatorsubstanz (7) ist. 9. Apparatus according to claim 7 or 8, characterized in that in the chamber (41) a solid body (43) is arranged loosely, whose volume is greater than that of the indicator substance (7).

10. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, 10. Apparatus according to claim 7 or 8, characterized in that

a) dass mindestens zwei feste Körper (33) im Innenraum (32) vorhanden sind; und b) dass ein Volumen der festen Körper (33) jeweils kleiner als ein Volumen der a) that at least two solid bodies (33) in the interior (32) are present; and b) that each volume of the solid bodies (33) is less than one volume of the

Indikatorsubstanz (7) ist. Indicator substance (7).

11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, a) dass eine Kammerwandung an mindestens einer Stelle transparent oder semitransparent ist; und/oder 11. Device according to one of the preceding claims, characterized in that a) that a chamber wall is transparent or semitransparent at least at one point; and or

b) dass die Indikatorsubstanz farbig ist. b) that the indicator substance is colored.

12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine optische, elektrische oder optoelektrische Messeinrichtung, die ausgebildet ist, eine Lage der Indikatorsubstanz und/oder des festen Körpers in der Kammer zu erfassen. 12. Device according to one of the preceding claims, characterized by an optical, electrical or opto-electrical measuring device which is designed to detect a position of the indicator substance and / or the solid body in the chamber.

13. Verfahren zur Temperaturüberwachung von kryokonservierten Proben, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Vorrichtung (10; 20; 30; 40) zur Temperaturüberwachung nach einem der vorhergehenden Ansprüche; 13. A method of monitoring the temperature of cryopreserved samples comprising the steps of: a) providing a device (10; 20; 30; 40) for temperature monitoring according to one of the preceding claims;

b) Einfrieren der Indikatorsubstanz(en), wobei b) freezing the indicator substance (s), wherein

die mindestens eine Kammer während des Einfrierens der Indikatorsubstanz(en) in eine erste Lage gebracht wird und nach dem Einfrieren und bei einer Temperatur der the at least one chamber is brought into a first position during the freezing of the indicator substance (s) and, after freezing and at a temperature of

Indikatorsubstanz(en) unterhalb der Schmelztemperatur in eine zweite Lage gebracht wird, in der ein Schmelzen der Indikatorsubstanz(en) durch den Einfluss der Schwerkraft zu einer zumindest teilweisen Verlagerung und/oder Formänderung der Kammerfüllung führt. Indicator substance (s) is brought below the melting temperature in a second position in which a melting of the indicator substance (s) by the influence of gravity leads to an at least partial displacement and / or shape change of the chamber filling.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Substanz als Indikatorsubstanz ausgewählt wird, deren Schmelztemperatur oder deren Schwellentemperatur, bei der die Viskosität der geschmolzenen Indikatorsubstanz einen bestimmten Zielwert unterschreitet, einer vorbestimmten Grenztemperatur, deren Überschreiten überwacht werden soll, entspricht. 14. The method according to claim 13, characterized in that a substance is selected as the indicator substance, the melting temperature or the threshold temperature at which the viscosity of the molten indicator substance falls below a certain target value, a predetermined limit temperature whose exceeding is to be monitored corresponds.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, gekennzeichnet durch a) das Lagern einer kryokonservierten Probe in dem Probenbehälter; und 15. The method of claim 13 or 14, characterized by a) storing a cryopreserved sample in the sample container; and

b) das Feststellen, ob eine durch ein zeitweises Überschreiten der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz erfolgte zumindest teilweise Verlagerung und/oder Formänderung der Kammerfüllung stattgefunden hat. b) determining whether an at least partial displacement and / or change in shape of the chamber filling has taken place due to a temporary exceeding of the melting temperature of the indicator substance.

16. Vorrichtung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz mindestens einen Alkohol, welcher aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan-l,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan- 1,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclopentanol, Benzylalkohol umfasst, ausgewählt ist, sowie optional mindestens einen Farbstoff umfasst. 16. The device or method according to any one of the preceding claims, characterized in that the indicator substance at least one alcohol, which from the group, the octan-l-ol, nonan-1-ol, propane-l, 2-diol, propane-l , 3-diol, butane-l, 2-diol, butane-1,3-diol, butane-2-ol, pentane-l, 5-diol, pentan-l-ol, cyclopentanol, benzyl alcohol, is selected, as well as optionally comprises at least one dye.

17. Vorrichtung oder Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, welche Triphenylmethanfarbstoffe, 17. A device or method according to claim 16, characterized in that the dye is selected from the group consisting of Triphenylmethanfarbstoffe,

Rhodaminfarbstoffe, insbesondere Xanthene, Azofarbstoffe sowie Phenazin- und Rhodamine, especially xanthene, azo dyes and phenazine and

Phenothiazinfarbstoffe umfasst. Phenothiazine dyes.

18. Vorrichtung oder Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz mindestens zwei Alkoholkomponenten, welche aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan-l,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclopentanol, Benzylalkohol umfasst, ausgewählt sind, umfasst und/oder die Indikatorsubstanz mindestens einen Farbstoff umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche Oil Red, Methylrot, Brillantgrün, Rhodamin B, Neutralrot, Methylenblau oder andere Farbstoffe, die zur Anfärbung von Zellen in der Zytologie verwendet werden, umfasst. 18. The device or method according to claim 16 or 17, characterized in that the indicator substance at least two alcohol components selected from the group consisting of octan-1-ol, nonan-1-ol, propane-l, 2-diol, propane-l , 3-diol, butane-l, 2-diol, butane-l, 3-diol, butan-2-ol, pentane-l, 5-diol, pentan-l-ol, cyclopentanol, benzyl alcohol and / or the indicator substance comprises at least one dye selected from the group consisting of Oil Red, Methyl Red, Brilliant Green, Rhodamine B, Neutral Red, Methylene Blue or other dyes used to stain cells in cytology.