EP2649448A2 - Method for detecting anti-nmda receptor autoantibodies for use in diagnostic procedures - Google Patents

Method for detecting anti-nmda receptor autoantibodies for use in diagnostic procedures

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EP2649448A2
EP2649448A2 EP11846070.8A EP11846070A EP2649448A2 EP 2649448 A2 EP2649448 A2 EP 2649448A2 EP 11846070 A EP11846070 A EP 11846070A EP 2649448 A2 EP2649448 A2 EP 2649448A2
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EP
European Patent Office
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antibodies
nmda receptor
biological sample
iga
neuropathy
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11846070.8A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Winfried STÖCKER
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Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Original Assignee
Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG filed Critical Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Publication of EP2649448A2 publication Critical patent/EP2649448A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry

Definitions

  • the present invention relates to methods for detecting anti-NMDA receptor antibodies and to kits for detecting these autoantibodies for diagnosing neuropathy, dementia, borderline personality disorder and / or primary psychoses.
  • Polyneuropathies are disorders of the peripheral nervous system. These diseases can be based on a variety of causes, which leads to a different classification of polyneuropathies.
  • the polyneuropathies are divided into toxic neuropathies, metabolic neuropathies, hereditary neuropathies and autoimmune neuropathies.
  • the prognosis and treatment depends on the cause of the polyneuropathy.
  • electrophysiological diagnostics neuroography, EMG
  • EMG electrophysiological diagnostics
  • CSF examination a nerve biopsy and molecular genetic studies available.
  • polyneuropathies in which immunological mechanisms or a malfunction of the immune system play a role. These include the actual autoimmune neuropathies, the paraneoplastic diseases of the peripheral nervous system and the vasculitic polyneuropathies. The exact assignment is extremely important for the therapeutic decision. The laboratory can provide substantial support with regard to the aetiology of polyneuropathy.
  • Gangliosides or the myelin-associated glycoprotein can give important differential diagnostic information.
  • Autoantibodies to gangliosides are considered marker antibodies for the diagnosis and differential diagnosis of peripheral autoimmune neuropathies.
  • autoimmune neuropathies has increased significantly in recent years. Accordingly, the classification has become more differentiated. Classification is based inter alia on the form of the disease, namely acute (up to 4 weeks after onset of symptoms), subacute (4-8 weeks after onset of symptoms), chronic (courses longer than 8 weeks).
  • the most important acute forms of the disease are Guillain-Barre syndrome (GBS) as well as various subtypes.
  • GGS Guillain-Barre syndrome
  • the Miller-Fisher syndrome Chronic, immune-mediated polyneuropathies (CIP) represent a heterogeneous group with predominantly motor, sensory or sensorimotor failures that can manifest symmetrically or asymmetrically.
  • CIP chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy
  • CIDP chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy
  • CIDP multifocal demyelinating sensory and motor neuropathy
  • DADS focal CIDP
  • CIAP axonal form
  • CIDP with monoclonal gammopathy of undetermined significance In the table below (taken from the homepage of the Institute for Medical Diagnostics IMD dated 12.06.2010) these syndromes are compiled with the corresponding laboratory diagnostic autoantibodies:
  • WO 2008/021408 has recently described methods of diagnosing autoimmune encephalitis or epilepsy.
  • the diagnosis of autoimmune encephalitis or epilepsy is based on the detection of autoantibodies.
  • the autoantibodies are directed against glutamate receptors (type NMDA).
  • NMDA receptors are tetrameric complexes composed of the glycine-binding NR1 subunits and the glutamate-binding NR2 subunits (NR2A-NR2D), which form receptor subtypes with different synaptic localization and different physiological and pharmacological properties ⁇ Dingledine et al., 1999, Pharmacol Rev 51, 7-61; Ishii et al., 1993, J Biol Chem 268, 2836-2843; Lynch et al., 1995, J Neurochem 64, 1462-1468; Qiu et al., 2005, J Biol Chem 280, 24923-24930).
  • anti-NMDA receptor antibodies can serve to diagnose diseases other than autoimmune anti-NMDA receptor encephalitis. While limbic encephalitis is a central nervous system (CNS) disorder, neuropathies are peripheral nervous system disorders. Thus, markers such as anti-NMDA receptor antibodies that act on the CNS would not have been suggested as markers of peripheral nervous system disease. The effects, d. H. the clinical symptoms are completely different.
  • the detection of anti-NMDA receptor antibodies class IgG is guided, the method provided in the context of this invention is directed to the detection of antibodies of the classes IgA and IgM. Because antibodies of these classes are found predominantly in patients, for example, with diseases of the peripheral nervous system. Specifically, the IgA and IgM anti-NMDA receptor antibodies are specific markers for various diseases other than anti-NMDA receptor encephalitis, and thus detection of these autoantibodies may serve to diagnose other diseases.
  • the present invention is directed to a method of detecting anti-NMDA receptor antibodies, which comprises contacting a biological sample with an antigenic polypeptide, namely NMDA receptor, or a fragment thereof, and binding IgA and / or IgM antibodies from the biological sample to the antigenic polypeptide are detected and detected.
  • the biological sample is from an individual suspected of having a peripheral nervous system disorder, particularly neuropathy, or suspected dementia suspected of having borderline personality disorder and / or a primary psychosis (a psychiatric disorder) psychotic symptoms).
  • the patients or individuals with suspected neuropathy have the following symptoms:
  • B Symptoms caused by sensitive peripheral nerves, such. B. neuropathic pain, such. Eg burning pain (causalgia), dysesthesias, tingling (paresthesia), allodynia, feeling of heat / cold on the extremities, spinal pain syndrome.
  • the symptoms A are probably caused by damage to the anterior horn cells, the symptoms B are probably caused by damage to the nerve endings.
  • Cognitive impairment include, for example, attention, memory, learning, creativity, planning and orientation.
  • the biological sample is a liquid sample. More preferably, the biological sample is serum, blood, plasma and / or cerebrospinal fluid.
  • the binding of antibodies from the biological sample to the presented antigenic polypeptide can be detected by methods known in the art.
  • Methods for detecting antibody-polypeptide complexes include, for example, immunofluorescence tests, protein microarray, ELISA, luminescence assays, blot, radioimmunoassay, Western blot or dot blot.
  • particularly preferred indirect immunofluorescence is used.
  • the biological sample is applied to cells which express the NMDA receptor. It is particularly preferred to use cells which have been transfected with eukaryotic expression vectors into which the cDNA coding for the glutamate receptor (type NM DA, subunits NR1 / NR1 and NR1 / NR2) has been inserted.
  • the glutamate receptor type NMDA, subunits NR1 and / or NR2
  • coding sequences are well known in the art and can be found in corresponding databases. Preferably, however, sequences are used which have been described in the following prior art: Dalmau et al., Ann Neural. 2007 January; 61 (1): 25-36 and EP 2057466.
  • cDNA is inserted into the expression vector comprising the following nucleotide sequence:
  • the expressed antigen has the following amino acid sequence:
  • antigens are expressed which have at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% homology to the disclosed expressed antigen.
  • an antigen is expressed that comprises the following amino acid sequence:
  • the last ten amino acids are missing.
  • cDNA is inserted into the expression vector comprising the following nucleotide sequence:
  • an antigen comprising the sequence:
  • the eukaryotic expression vectors are preferably selected from the group comprising: mammalian cell expression vectors from the family of pTriEx vectors (Merck) or pcDNA3 family (Invitrogen); Plasmid vectors containing functional promoters in mammalian cells, under the control of which the cDNA to be expressed is made (such promoters may be, for example, the chicken beta-actin or the viral CMV promoter.)
  • promoters may be, for example, the chicken beta-actin or the viral CMV promoter.
  • transfection cells are preferably used, selected from the group comprising: human or primate cells, but in principle also all mammalian cells and also other eukaryotic cells (insect cells, yeasts), such as CV1; FRhK4; COS 7; HeLa, CHO, Sf9; Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae.
  • eukaryotic cells insect cells, yeasts
  • CV1 FRhK4
  • COS 7 HeLa
  • HeLa CHO, Sf9
  • Pichia pastoris Saccharomyces cerevisiae.
  • HEK293 human embryonic kidney cells
  • the biological sample may also be contacted with tissue in which NMDA receptors are expressed.
  • tissue in which NMDA receptors are expressed are in particular brain tissue from the hippocampus and the cerebellum. Tissue sections from rat brain are particularly preferably used for this purpose.
  • the biological sample may also be contacted with cultured hippocampal neurons expressing NMDA receptors.
  • the detection of binding of antibodies from the biological sample to the antigenic polypeptide is accomplished by methods known in the art.
  • labeled antibodies directed against human antibodies are used.
  • Evidence that they are antibodies of the classes IgA and / or IgM antibodies is also carried out by methods known from the prior art.
  • the labeled detection antibody is directed against IgA and / or IgM antibodies.
  • markers to the person skilled in the art, such as fluorophores, for example fluorescein or tetramethylrhodamine, haptens, for example biotin or his tag and enzymes, for example horseradish peroxidase or alkaline phosphatase.
  • markers such as fluorophores, for example fluorescein or tetramethylrhodamine, haptens, for example biotin or his tag and enzymes, for example horseradish peroxidase or alkaline phosphatase.
  • a number of different methods are known as chemical coupling methods, in particular those which initially provide the reporter molecules with a reactive group, for example pentafluorophenyl ester, N-hydroxysuccinimide or maleimide, and then the reporter molecules activated in this way with the target molecule to be labeled, for example an antigen or protein to bring in contact.
  • reporter molecule and target molecule After the reporter molecule and target molecule have been combined, excess reporter molecule can then be removed by chemical, biochemical or physical separation techniques, such as chromatography and filtration. To utilize the various coupling methods already activated reporter molecules are commercially available for this purpose. The person skilled in the art knows further reporter molecules and coupling methods for labeling proteins. The invention therefore also provides detection antibodies labeled with reporter molecules produced by such methods.
  • This detection method is also suitable for the diagnosis of neuropathies, dementia, a borderline personality disorder or a primary psychosis, wherein the detection of IgA and / or IgM anti-NMDA receptor antibodies indicative of any of the aforementioned diseases.
  • the invention provides a method for detecting anti-NMDA receptor antibodies in a biological sample of an individual, characterized in that the biological sample is contacted with an antibody which is anti-NMDA receptor Antibodies is directed, and this binding of antibodies to antibodies against NMDA receptors is detected.
  • the antibody is directed against IgA and / or IgM anti-NMDA receptor antibodies.
  • the biological sample comes from an individual suspected of neuropathy, dementia, borderline personality disorder or primary psychosis.
  • the detection of anti-NMDA receptor antibodies indicates one of the aforementioned diseases.
  • this method is also suitable as a diagnostic method for the diagnosis of the aforementioned diseases.
  • the invention provides a method of diagnosing neuropathy characterized by examining a patient's biological sample for the presence of antibodies to an NR heteromer of an NMDA receptor by co-administering the patient's biological sample NMDA receptors are contacted to detect binding of anti-NMDA receptor antibodies to an NR heteromer of a NMDA receptor, with detection of these anti-NMDA receptor antibodies to neuropathy points.
  • samples of a patient suspected of neuropathy having the symptoms already described above are used.
  • the sample is a liquid sample. Even more preferably, this liquid sample is serum, blood, plasma and / or cerebrospinal fluid.
  • the neuropathy to be diagnosed is an autoimmune neuropathy. However, this autoimmune neuropathy can not be classified in the previously known classification of autoimmune neuropathies. Therefore, it can be assumed that this is a new group of autoimmune neuropathy, which is referred to below as an anti-NMDA receptor neuropathy.
  • the antibodies to be detected are directed against the NR1 subunit of NMDA receptors.
  • Particularly preferred antibodies of the classes IgA, IgM and / or IgG are detected.
  • the detection method of anti-NMDA receptor antibodies of the classes IgA and / or IgM already described above is preferably used for this diagnosis method of neuropathy. Detection of these antibodies indicates anti-NMDA receptor neuropathy.
  • the invention provides a test system for in vitro determination of antibodies to NMDA receptors comprising an antigenic polypeptide and anti-IgA and / or anti-IgM antibodies.
  • This kit is suitable for diagnosing autoimmune neuropathies, dementia, borderline personality disorder or primary psychosis.
  • the test kit contains the antigenic polypeptide used in the detection method described above, ie the antigenic polypeptide in the test kit is recombinantly expressed in human cells (see above) and / or the antigenic polypeptide becomes NMDA receptor as already described above presented to expressing tissue.
  • These tissues are tissue sections from the hippocampus and / or the cerebellum. Particularly preferred are brain tissue from rats.
  • the antigenic polypeptide may be presented by the use of cultured hippocampal neurons.
  • the detection of antibodies against NMDA receptors is used for the diagnosis of cerebellar ataxia.
  • NMDA receptor antibodies of the subclasses IgA and IgM have already been found in two patients presenting with the clinical picture of idiopathic cerebellar degeneration. In one case the diagnosis of cerebellar type multisystem atrophy (MSA-C) was made and in the other case a cerebellopathy was diagnosed.
  • MSA-C cerebellar type multisystem atrophy
  • FIG. 1 glutamate receptors (type NMDA).
  • the receptors reside in postsynaptic membranes, forming a heteromeric ligand-gated anion channel composed of the subunits NR1 and NR2.
  • Anti-glutamate receptor (type NMDA) antibodies are directed against an epitope located in the extracellular domain of the NR1 subunit.
  • A Neuropathy detected by indirect immunofluorescence (A). Positive reactions with transfected HEK293 cells expressing the glutamate receptor (type NMDA: subunit NR1), (B) untransfected HEK293 cells (negative response).
  • B Neuropathy detected by indirect immunofluorescence
  • FIG. 3 serum reactivity from the patient with (A) dementia, (B) one
  • the positive response was surface fluorescence of the transfected cells.
  • the patient was positive for subclass IgA anti-NMDA receptor antibody at a titer of 1: 32,000
  • the patient's serum had antibodies of subclasses IgA (titer 1: 32) and IgM (titer 1: 100). These could also be detected in two further course samples.
  • IgA and IgM anti-NMDA receptor antibodies Detection of IgA and IgM anti-NMDA receptor antibodies in a biological sample of a patient with a primary psychosis (paranoid hallucinatory schizophrenia)
  • Anti-NMDA receptor antibodies of class IgA (titer 1: 320) and IgM (titer 1: 32) were detected in the patient's serum.
  • Anti-NMDA receptor antibodies of the various subclasses could also be detected in 8 other patients from this subgroup of schizophrenia patients. Seventeen percent of the 53 serums of paranoid hallucinatory schizophrenia patients examined here were positive. A total of 118 sera from patients from 7 clinically differentiated areas of schizophrenia were studied.
  • Anti-NMDA receptor antibodies of subclasses IgA (titer 1: 320) and IgM (titer 1: 1000) could be detected in the patient.
  • Another study is to demonstrate the prevalence of anti-NMDA receptor antibodies of class IgA and / or IgM in patients with cerebellar ataxia.
  • IgA and / or IgM type Disease and anti-NMDAR antibodies of IgA and / or IgM type can be identified.
  • This study aims to provide a systematic approach to testing such a clinically pre-characterized collective for anti-NMDAR antibodies. All patient sera are examined in the immunofluorescence test for antibodies against glutamate receptors (type NMDA) of the classes IgA, IgG and IgM.
  • the substrate used are the rat tissues hippocampus and cerebellum, as well as HEK cells transfected with the NMDAR subunits NR1 and NR1 + NR2.
  • the multiplex approach enables detection of diverse antibodies in just one Incubation step.
  • Prof. Dr. med. Stöcker also create secondary findings for other than the originally requested parameters.
  • the IgG detection described in the literature and relevant for the diagnosis of anti-NMDA receptor encephalitis was extended by the conjugates IgA and IgM. In this way, it was found that IgA and / or IgM antibodies against NMDA receptors are occasionally detected in the patient's serum, especially in the case of queries for the detection of MAG antibodies.
  • the study described above aims to provide more accurate characterization of the clinical phenotype associated with IgA and / or IgM antibodies to the NMDA (NRI) receptor in the serum of patients with neuromuscular disease. Furthermore, the prevalence should be estimated and compared with control groups.
  • Classification according to symptoms can be maintained, whether a correlation of Antibody titer and severity of the disease can be seen and whether a correlation of AnttShat and symptoms can be detected.

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Abstract

The invention relates to a method for detecting IgA and/or IgM anti-NMDA receptor antibodies, and also to a method and an assay kit for the diagnosis of an autoimmune neuropathy, dementia, borderline personality disorder or primary psychosis.

Description

Verfahren zum Nachweis von anti-NMDA-Rezeptor Autoantikörpern zum Einsatz in Diagnoseverfahren  Method for detection of anti-NMDA receptor autoantibodies for use in diagnostic procedures
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von anti-NMDA-Rezeptor- Antikörpern sowie Testkits zum Nachweis dieser Autoantikörper zur Diagnose einer Neuropathie, einer Demenz, einer Borderline-Persönlichkeitsstörung und/oder primären Psychosen. The present invention relates to methods for detecting anti-NMDA receptor antibodies and to kits for detecting these autoantibodies for diagnosing neuropathy, dementia, borderline personality disorder and / or primary psychoses.
Hintergrund der Erfindung Background of the invention
Polyneuropathien sind Erkrankungen des peripheren Nervensystems. Diesen Erkrankungen kann eine Vielzahl von Ursachen zugrunde liegen, was zu einer unterschiedlichen Einteilung der Polyneuropathien führt. Unterteilt werden die Polyneuropathien bislang in toxische Neuropathien, metabolische Neuropathien, hereditäre Neuropathien und autoimmune Neuropathien. Die Prognose und Behandlung ist abhängig von der Ursache der Polyneuropathie. Neben einer ausführlichen Anamnese und dem neurologischen Befund kommt der elektrophysiologischen Diagnostik (Neurographie, EMG) eine erhebliche Bedeutung zu. An weiterer Diagnostik stehen noch die Liquoruntersuchung, eine Nervenbiopsie und molekulargenetische Untersuchungen zur Verfügung. Polyneuropathies are disorders of the peripheral nervous system. These diseases can be based on a variety of causes, which leads to a different classification of polyneuropathies. The polyneuropathies are divided into toxic neuropathies, metabolic neuropathies, hereditary neuropathies and autoimmune neuropathies. The prognosis and treatment depends on the cause of the polyneuropathy. In addition to a detailed medical history and neurological findings, electrophysiological diagnostics (neurography, EMG) are of considerable importance. On further diagnostics are still the CSF examination, a nerve biopsy and molecular genetic studies available.
Von besonderem Interesse sind Polyneuropathien, bei denen immunologische Mechanismen bzw. eine Fehlfunktion des Immunsystems eine Rolle spielen. Hierzu gehören die eigentlichen autoimmunen Neuropathien, die paraneoplastischen Erkrankungen des peripheren Nervensystems sowie die vaskulitischen Polyneuropathien. Die genaue Zuordnung ist für die therapeutische Entscheidung außerordentlich wichtig. Das Labor kann eine wesentliche Hilfestellung hinsichtlich der Ätiologie der Polyneuropathie geben. Of particular interest are polyneuropathies in which immunological mechanisms or a malfunction of the immune system play a role. These include the actual autoimmune neuropathies, the paraneoplastic diseases of the peripheral nervous system and the vasculitic polyneuropathies. The exact assignment is extremely important for the therapeutic decision. The laboratory can provide substantial support with regard to the aetiology of polyneuropathy.
Insbesondere bei den autoimmunen Neuropathien ist es möglich, dass dieEspecially with the autoimmune neuropathies it is possible that the
Labordiagnostik speziell durch den Nachweis von Autoantikörpern gegen bestimmteLaboratory diagnostics specifically by the detection of autoantibodies against certain
Ganglioside oder das Myelin-assoziierte Glycoprotein (MAG) wichtige differentialdiagnostische Hinweise geben kann. Autoantikörper gegen Ganglioside gelten als Markerantikörper für die Diagnostik und Differentialdiagnostik von peripheren autoimmunen Neuropathien. Weitere Antikörper sind gegen ein Glycoprotein der Zellmembran der Myelinscheiden gerichtet (Myelin-assoziiertes Glycoprotein = MAG). Gangliosides or the myelin-associated glycoprotein (MAG) can give important differential diagnostic information. Autoantibodies to gangliosides are considered marker antibodies for the diagnosis and differential diagnosis of peripheral autoimmune neuropathies. Other antibodies are directed against a myelin sheath cell membrane glycoprotein (myelin-associated glycoprotein = MAG).
Die Kenntnis über die autoimmunen Neuropathien hat in den letzten Jahren erheblich zugenommen. Entsprechend ist die Klassifikation differenzierter geworden. Eine Einteilung erfolgt u. a. aufgrund der Verlaufsform, nämlich akut (bis zu 4 Wochen nach Auftreten der Symptome), subakut (4 - 8 Wochen nach Auftreten der Symptome), chronisch (Verläufe länger als 8 Wochen). Die wichtigsten akuten Verlaufsformen sind das Guillain-Barre-Syndrom (GBS) sowie verschiedene Subtypen, z. B. das Miller-Fisher-Syndrom. Die chronischen, immunvermittelten Polyneuropathien (CIP) stellen eine heterogene Gruppe dar, mit schwerpunktmäßig motorischen, sensorischen oder sensomotorischen Ausfällen, die sich symmetrisch oder auch asymmetrisch manifestieren können. Die häufigste Form ist die chronisch- inflammatorisch-demyelinisierende Polyneuropathie (CIDP). Verschiedene Varianten der CIDP werden beschrieben: ataktische Form, multifokale CIDP (multifocal acquired demyelinating sensory and motor neuropathy = MADSAM), fokale CIDP (distal acquired demyelinating Symmetrie neuropathy = DADS), axonale Form (CIAP) sowie die CIDP mit monoklonaler Gammopathie unbestimmter Signifikanz. In der untenstehenden Tabelle (entnommen der Homepage des Instituts für Medizinische Diagnostik IMD vom 12.06.2010) sind diese Krankheitsbilder mit den entsprechenden labordiagnostisch relevanten Autoantikörpern zusammen gestellt: Knowledge about autoimmune neuropathies has increased significantly in recent years. Accordingly, the classification has become more differentiated. Classification is based inter alia on the form of the disease, namely acute (up to 4 weeks after onset of symptoms), subacute (4-8 weeks after onset of symptoms), chronic (courses longer than 8 weeks). The most important acute forms of the disease are Guillain-Barre syndrome (GBS) as well as various subtypes. The Miller-Fisher syndrome. Chronic, immune-mediated polyneuropathies (CIP) represent a heterogeneous group with predominantly motor, sensory or sensorimotor failures that can manifest symmetrically or asymmetrically. The most common form is chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Different variants of CIDP are described: ataxic form, multifocal demyelinating sensory and motor neuropathy (CIDP), focal CIDP (distal acquired demyelinating symmetry neuropathy = DADS), axonal form (CIAP) and CIDP with monoclonal gammopathy of undetermined significance. In the table below (taken from the homepage of the Institute for Medical Diagnostics IMD dated 12.06.2010) these syndromes are compiled with the corresponding laboratory diagnostic autoantibodies:
Weitere Autoantikörper spielen für die Differentialdiagnose gegenwärtig keine Rolle. Other autoantibodies currently play no role in differential diagnosis.
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, mögliche weitere Autoantikörper, die in der Differentialdiagnose der autoimmunen Neuropathien eine Rolle spielen könnten, bereitzustellen. It is thus an object of the present invention to provide potential additional autoantibodies which may play a role in the differential diagnosis of autoimmune neuropathies.
In der WO 2008/021408 sind kürzlich Verfahren zur Diagnose der autoimmunen Enzephalitis oder Epilepsie beschrieben worden. Die Diagnose der autoimmunen Enzephalitis oder Epilepsie basiert dabei auf der Detektion von Autoantikörpern. In diesem Fall sind die Autoantikörper gegen Glutamat-Rezeptoren (Typ NMDA) gerichtet. Die bislang bekannten NMDA-Rezeptoren sind tetramere Komplexe, die zusammengesetzt sind aus den Glycin-bindenden NR1 Untereinheiten und den Glutamat-bindenden NR2 Untereinheiten (NR2A-NR2D), welche Rezeptor-Subtypen mit unterschiedlicher synaptischer Lokalisierung und unterschiedlichen physiologischen und pharmakologischen Eigenschaften bilden {Dingledine et al., 1999, Pharmacol Rev 51 , 7-61 ; Ishii et al., 1993, J Biol Chem 268, 2836-2843; Lynch et al., 1995, J Neurochem 64, 1462-1468; Qiu et al., 2005, J Biol Chem 280, 24923- 24930). Es ist gezeigt worden, dass Autoantikörper im Serum oder im Liquor von Patienten mit einer Autoimmun-Enzephalitis spezifisch an Epitope binden, die in der extrazellulären Domäne der NR1 Untereinheit lokalisiert sind (Dalmau et al., 2008, Lancet Neurol. 7, 1091-1098). Derweilen spricht man von einer Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis. Das Vorhandensein der anti-Glutamat-Rezeptor (Typ NMDA) Autoantikörper im Serum oder im Liquor ist sehr spezifisch für diese neue und weitgehend unterdiagnostizierte Erkrankung. Die endgültige Diagnose dieser Erkrankung basiert auf dem Vorhandensein der Autoantikörper gegen den Glutamat- Rezeptor (Typ NMDA, Untereinheit NR 1) im Serum oder im Liquor. WO 2008/021408 has recently described methods of diagnosing autoimmune encephalitis or epilepsy. The diagnosis of autoimmune encephalitis or epilepsy is based on the detection of autoantibodies. In this case, the autoantibodies are directed against glutamate receptors (type NMDA). The previously known NMDA receptors are tetrameric complexes composed of the glycine-binding NR1 subunits and the glutamate-binding NR2 subunits (NR2A-NR2D), which form receptor subtypes with different synaptic localization and different physiological and pharmacological properties {Dingledine et al., 1999, Pharmacol Rev 51, 7-61; Ishii et al., 1993, J Biol Chem 268, 2836-2843; Lynch et al., 1995, J Neurochem 64, 1462-1468; Qiu et al., 2005, J Biol Chem 280, 24923-24930). It has been shown that autoantibodies in the serum or cerebrospinal fluid of patients with autoimmune encephalitis specifically bind to epitopes present in the autoimmune encephalitis extracellular domain of the NR1 subunit are localized (Dalmau et al., 2008, Lancet Neurol. 7, 1091-1098). There is now talk of anti-NMDA receptor encephalitis. The presence of anti-glutamate receptor (type NMDA) autoantibodies in serum or cerebrospinal fluid is very specific for this new and largely underdiagnosed disease. The definitive diagnosis of this disease is based on the presence of autoantibodies to the glutamate receptor (type NMDA, subunit NR 1) in serum or cerebrospinal fluid.
Es ist somit eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen markanten Marker zur Diagnose anderer Erkrankungen und ein Nachweisverfahren zur Detektion solch eines Marker bereitzustellen. Es ist weiterhin eine Aufgabe der Erfindung ein Testkit zur Durchführung solcher Verfahren bereitzustellen. It is thus a further object of the present invention to provide a prominent marker for the diagnosis of other diseases and a detection method for detecting such a marker. It is a further object of the invention to provide a test kit for carrying out such methods.
Diese Aufgaben werden durch das in den Patentansprüchen definierte Verfahren zum Nachweis von anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern gemäß Anspruch 1 und einem Verfahren zur Diagnose einer Neuropathie gemäß Anspruch 9 gelöst. Ein Testsystem zum Einsatz in diesem Verfahren ist in Anspruch 16 angegeben. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden in der Beschreibung näher erläutert. These objects are achieved by the method defined in the claims for detecting anti-NMDA receptor antibodies according to claim 1 and a method for diagnosing neuropathy according to claim 9. A test system for use in this method is given in claim 16. Advantageous developments of the invention are the subject of the dependent claims and are explained in more detail in the description.
Beschreibung der Erfindung Description of the invention
Überraschenderweise ist im Rahmen dieser Erfindung gefunden worden, dass anti- NMDA-Rezeptor Antikörper der Diagnose anderer Erkrankungen als der autoimmunen Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis dienen können. Während die limbische Enzephalitis eine Erkankung des Zentralnervensystems (ZNS) ist, sind Neuropathien Erkrankungen des peripheren Nervensystems. Somit hätte man Marker, wie anti-NMDA-Rezeptor Antikörper, die auf das ZNS wirken, nicht als Marker von Erkrankungen des peripheren Nervensystems vermutet. Die Auswirkungen, d. h. die klinischen Symptome sind gänzlich unterschiedlich. Surprisingly, it has been found in the context of this invention that anti-NMDA receptor antibodies can serve to diagnose diseases other than autoimmune anti-NMDA receptor encephalitis. While limbic encephalitis is a central nervous system (CNS) disorder, neuropathies are peripheral nervous system disorders. Thus, markers such as anti-NMDA receptor antibodies that act on the CNS would not have been suggested as markers of peripheral nervous system disease. The effects, d. H. the clinical symptoms are completely different.
Darüber hinaus liegen bei den unterschiedlichen Erkrankungen Antikörper unterschiedlicher Klassen vor. Während bei der Diagnose der Autoimmun- Enzephalitis der Nachweis von anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern der Klasse IgG geführt wird, ist das im Rahmen dieser Erfindung bereitgestellte Verfahren auf den Nachweis von Antikörpern der Klassen IgA und IgM gerichtet. Denn Antikörper dieser Klassen findet man vorwiegend bei Patienten z.B. mit Erkrankungen des peripheren Nervensystems. Speziell die anti-NMDA-Rezeptor Antikörper der Klassen IgA und IgM sind spezifische Marker für verschiedene andere Erkrankungen als der Anti- NMDA-Rezeptor Enzephalitis und somit kann der Nachweis dieser Autoantikörper der Diagnose anderer Erkrankungen dienen. In addition, there are antibodies of different classes in the different diseases. While in the diagnosis of autoimmune encephalitis the detection of anti-NMDA receptor antibodies class IgG is guided, the method provided in the context of this invention is directed to the detection of antibodies of the classes IgA and IgM. Because antibodies of these classes are found predominantly in patients, for example, with diseases of the peripheral nervous system. Specifically, the IgA and IgM anti-NMDA receptor antibodies are specific markers for various diseases other than anti-NMDA receptor encephalitis, and thus detection of these autoantibodies may serve to diagnose other diseases.
Daher richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweis von anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine biologische Probe mit einem antigenen Polypeptid, nämlich NMDA-Rezeptor, oder einem Fragment davon, in Kontakt gebracht wird und die Bindung von IgA und/ oder IgM Antikörpern aus der biologischen Probe an das antigene Polypeptid detektiert wird und nachgewiesen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt die biologische Probe aus einem Individuum mit Verdacht auf eine Erkrankung des peripheren Nervensystems, insbesondere einer Neuropathie, oder mit Verdacht auf Demenz, mit Verdacht auf eine Borderline-Persönlichkeitsstörung und/ oder einer primären Psychose (eine psychiatrische Erkrankung mit psychotischen Symptomen). Therefore, the present invention is directed to a method of detecting anti-NMDA receptor antibodies, which comprises contacting a biological sample with an antigenic polypeptide, namely NMDA receptor, or a fragment thereof, and binding IgA and / or IgM antibodies from the biological sample to the antigenic polypeptide are detected and detected. In a preferred embodiment of the invention, the biological sample is from an individual suspected of having a peripheral nervous system disorder, particularly neuropathy, or suspected dementia suspected of having borderline personality disorder and / or a primary psychosis (a psychiatric disorder) psychotic symptoms).
Bevorzugt weisen die Patienten oder die Individuen mit Verdacht auf eine Neuropathie folgende Symptome auf: Preferably, the patients or individuals with suspected neuropathy have the following symptoms:
A. Symptome, hervorgerufen durch motorisch-periphere Nerven, wie z. B. Lähmungen, Lähmungen vorübergehender Natur (schlaffe Paresen, motorische Ausfälle), Schwächeanfälle, wobei die Verteilungsmuster symmetrisch oder polyradikulär sind; Muskelkrämpfe (crampi), Faszikulationen, Bewegungsunruhe der Beine; und/oder  A. Symptoms caused by motor-peripheral nerves such. Paralysis, paralysis of a transient nature (flaccid paresis, motor failures), fainting, where the distribution patterns are symmetrical or polyradicular; Muscle spasms (crampi), fasciculations, motionlessness of the legs; and or
B. Symptome, hervorgerufen durch sensible periphere Nerven, wie z. B. neuropathische Schmerzen, wie z. B. brennende Schmerzen (Kausalgien), Missempfindungen (Dysästhesien), Kribbeln (Parästhesien), Allodynie, Hitze- /Kältegefühl an den Extremitäten, Wirbelsäulenschmerzsyndrom. Die Symptome A werden vermutlich durch eine Schädigung der Vorderhornzellen hervorgerufen, die Symptome B werden vermutlich durch eine Schädigung an den Nervenendigungen hervorgerufen. B. Symptoms caused by sensitive peripheral nerves, such. B. neuropathic pain, such. Eg burning pain (causalgia), dysesthesias, tingling (paresthesia), allodynia, feeling of heat / cold on the extremities, spinal pain syndrome. The symptoms A are probably caused by damage to the anterior horn cells, the symptoms B are probably caused by damage to the nerve endings.
Die Patienten oder Individuen mit Verdacht einer primären Psychose leiden unter Wahn und/oder Halluzinationen. Patients or individuals suspected of having primary psychosis suffer from delusions and / or hallucinations.
Die Patienten mit Verdacht auf eine Demenz leiden unter einer Störung der kognitiven Fähigkeiten. Diese umfassen zum Beispiel die Aufmerksamkeit, die Erinnerung, das Lernen, die Kreativität, das Planen und die Orientierung. Patients with suspected dementia suffer from cognitive impairment. These include, for example, attention, memory, learning, creativity, planning and orientation.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die biologische Probe eine flüssige Probe. Noch bevorzugter handelt es sich bei der biologischen Probe um Serum, Blut, Plasma und/ oder Liquor. In a preferred embodiment of the invention, the biological sample is a liquid sample. More preferably, the biological sample is serum, blood, plasma and / or cerebrospinal fluid.
Die Bindung von Antikörpern aus der biologischen Probe an das dargebotene antigene Polypeptid kann durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren nachgewiesen werden. Verfahren zum Nachweis von Antikörper-Polypeptid- Komplexe umfassen zum Beispiel Immunfluoreszenztests, Protein Microarray, ELISA, Lumineszenstests, Blot, Radioimmuntest, Westernblot oder Dotblot. Besonders bevorzugt wird jedoch die indirekte Immunfluoreszenz eingesetzt. The binding of antibodies from the biological sample to the presented antigenic polypeptide can be detected by methods known in the art. Methods for detecting antibody-polypeptide complexes include, for example, immunofluorescence tests, protein microarray, ELISA, luminescence assays, blot, radioimmunoassay, Western blot or dot blot. However, particularly preferred indirect immunofluorescence is used.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die biologische Probe auf Zellen aufgebracht, die den NMDA-Rezeptor exprimieren. Besonders bevorzugt werden Zellen genutzt, welche mit eukaryotischen Expressionsvektoren, in die cDNA codierend für den Glutamat-Rezeptor (Typ NM DA; Untereinheiten NR1/NR1 und NR1/NR2) insertiert worden ist, transfiziert worden sind. Für den Glutamat-Rezeptor (Typ NMDA; Untereinheiten NR1 und/oder NR2) codierende Sequenzen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt und in entsprechenden Datenbanken zu finden. Bevorzugt werden jedoch Sequenzen genutzt, die in folgendem Stand der Technik beschrieben worden sind: Dalmau et al., Ann Neural. 2007 January; 61 (1): 25-36 und EP 2057466. ln einer noch spezielleren Ausführungsform wird cDNA in den Expressionsvektor insertiert, die die folgende Nukleotid-Sequenz umfasst:In a particularly preferred embodiment of the invention, the biological sample is applied to cells which express the NMDA receptor. It is particularly preferred to use cells which have been transfected with eukaryotic expression vectors into which the cDNA coding for the glutamate receptor (type NM DA, subunits NR1 / NR1 and NR1 / NR2) has been inserted. For the glutamate receptor (type NMDA, subunits NR1 and / or NR2) coding sequences are well known in the art and can be found in corresponding databases. Preferably, however, sequences are used which have been described in the following prior art: Dalmau et al., Ann Neural. 2007 January; 61 (1): 25-36 and EP 2057466. In a more specific embodiment, cDNA is inserted into the expression vector comprising the following nucleotide sequence:
In einer weiteren Ausführungsform weist das exprimierte Antigen folgende Aminosäure-Sequenz auf: In a further embodiment, the expressed antigen has the following amino acid sequence:
ln einer weiteren Ausführungsform werden Antigene exprimiert, die mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% Homologie zu dem offenbarten exprimierten Antigen aufweisen. In another embodiment, antigens are expressed which have at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% homology to the disclosed expressed antigen.
In einer noch weiteren Ausführungsform wird ein Antigen exprimiert, dass folgende Aminosäure-Sequenz umfasst: In yet another embodiment, an antigen is expressed that comprises the following amino acid sequence:
In einer noch spezielleren Ausführungsform fehlen die letzten zehn Aminosäuren. In a more specific embodiment, the last ten amino acids are missing.
In einer noch spezielleren Ausführungsform wird cDNA in den Expressionsvektor insertiert, die die folgende Nukleotid-Sequenz umfasst: In a more specific embodiment, cDNA is inserted into the expression vector comprising the following nucleotide sequence:
In einer noch weiteren Ausführungsform wird ein Antigen exprimiert, das folgende Sequenz umfasst: In yet another embodiment, an antigen is expressed comprising the sequence:
Die eukaryotischen Expressionsvektoren werden bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend: Säugerzell-Expressionsvektoren aus der Familie der pTriEx- Vektoren (Merck) bzw. pcDNA3-Familie (Invitrogen); Plasmid-Vektoren, die in Säugerzellen funktionelle Promotoren enthalten, unter deren Kontrolle die zu exprimierende cDNA gestellt wird (solche Promotoren können z.B. der„Chicken Beta-Actin" oder der virale CMV-Promotor sein). Es gibt eine Vielzahl kommerzieller Expressionssysteme, die dem Fachmann bekannt sind, die sich für die Herstellung des rekombinanten Proteins einsetzen lassen. So ist auch eine Virus-vermittelte Antigendarstellung oder die Herstellung stabil transformierter Zelllinien möglich. The eukaryotic expression vectors are preferably selected from the group comprising: mammalian cell expression vectors from the family of pTriEx vectors (Merck) or pcDNA3 family (Invitrogen); Plasmid vectors containing functional promoters in mammalian cells, under the control of which the cDNA to be expressed is made (such promoters may be, for example, the chicken beta-actin or the viral CMV promoter.) There are a variety of commercial expression systems available Those skilled in the art are familiar with those who can be used for the production of the recombinant protein, thus also a virus-mediated antigen presentation or the production of stably transformed cell lines is possible.
Für die Transfektion werden vorzugsweise Zellen genutzt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend: Humane- bzw. Primaten-Zellen, aber grundsätzlich auch alle Säugerzellen sowie auch weitere eukaryotische Zellen (Insektenzellen, Hefen), wie z.B. CV1 ; FRhK4; COS7; HeLa, CHO, Sf9; Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae. Besonders bevorzugt werden jedoch humane embryonale Nierenzellen (HEK293) für die Transfektion genutzt. Die transfizierten Zellen sind bevorzugt auf Deckgläschen ausgesät. For transfection cells are preferably used, selected from the group comprising: human or primate cells, but in principle also all mammalian cells and also other eukaryotic cells (insect cells, yeasts), such as CV1; FRhK4; COS 7; HeLa, CHO, Sf9; Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae. However, particularly preferred are human embryonic kidney cells (HEK293) used for transfection. The transfected cells are preferably seeded on coverslips.
Wahlweise kann die biologische Probe aber auch mit Gewebe in Kontakt gebracht werden, in welchem NMDA-Rezeptoren exprimiert vorliegen. Dies sind insbesondere Hirngewebe aus dem Hippocampus und dem Cerebellum. Besonders bevorzugt werden Gewebeschnitte aus Rattengehirn hierfür genutzt. Optionally, however, the biological sample may also be contacted with tissue in which NMDA receptors are expressed. These are in particular brain tissue from the hippocampus and the cerebellum. Tissue sections from rat brain are particularly preferably used for this purpose.
Wahlweise kann die biologische Probe aber auch mit kultivierten Neuronen aus dem Hippocampus in Kontakt gebracht werden, welche NMDA-Rezeptoren exprimieren. Optionally, however, the biological sample may also be contacted with cultured hippocampal neurons expressing NMDA receptors.
Die Detektion der Bindung von Antikörpern aus der biologischen Probe an das antigene Polypeptid erfolgt durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren. Zum Beispiel werden in den Detektionsschritt markierte Antikörper eingesetzt, die gegen humane Antikörper gerichtet sind. Der Nachweis, dass es sich um Antikörper der Klassen IgA und/ oder IgM Antikörper handelt, erfolgt auch durch aus den Stand der Technik bekannte Verfahren. Zum Beispiel ist der markierte Detektionsantikörper gegen Antikörper der Klassen IgA und/ oder IgM gerichtet. The detection of binding of antibodies from the biological sample to the antigenic polypeptide is accomplished by methods known in the art. For example, in the detection step, labeled antibodies directed against human antibodies are used. Evidence that they are antibodies of the classes IgA and / or IgM antibodies is also carried out by methods known from the prior art. For example, the labeled detection antibody is directed against IgA and / or IgM antibodies.
Als Marker sind dem Fachmann eine Reihe unterschiedlicher Verbindungen bekannt, wie Fluorophore, beispielsweise Fluorescein oder Tetramethylrhodamin, Haptene, beispielsweise Biotin oder His-Tag und Enzyme, beispielsweise Meerrettich- Peroxidase oder alkalische Phosphatase. Als chemische Kopplungsverfahren sind eine Reihe unterschiedlicher Verfahren bekannt, insbesondere solche, die die Reportermoleküle zunächst mit einer reaktiven Gruppe, beispielsweise Pentafluorophenyl Ester, N-Hydroxysuccinimid oder Maleimid, versehen und die so aktivierten Reportermoleküle dann mit dem zu markierenden Zielmolekül, beispielsweise einem Antigen oder Protein, in Kontakt bringen. Nach der Verbindung von Reportermolekül und Zielmolekül kann überschüssiges Reportermolekül anschließend durch chemische, biochemische oder physikalische Trenntechniken, beispielsweise Chromatographie und Filtration, entfernt werden. Zur Nutzung der verschiedenen Kopplungsverfahren sind zu diesem Zweck bereits aktivierte Reportermoleküle, kommerziell erhältlich. Der Fachmann kennt weitere Reportermoleküle und Kopplungsverfahren zur Markierung von Proteinen. Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch mit solchen Verfahren hergestellte mit Reportermolekülen markierte Detektionsantikörper. A number of different compounds are known as markers to the person skilled in the art, such as fluorophores, for example fluorescein or tetramethylrhodamine, haptens, for example biotin or his tag and enzymes, for example horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. A number of different methods are known as chemical coupling methods, in particular those which initially provide the reporter molecules with a reactive group, for example pentafluorophenyl ester, N-hydroxysuccinimide or maleimide, and then the reporter molecules activated in this way with the target molecule to be labeled, for example an antigen or protein to bring in contact. After the reporter molecule and target molecule have been combined, excess reporter molecule can then be removed by chemical, biochemical or physical separation techniques, such as chromatography and filtration. To utilize the various coupling methods already activated reporter molecules are commercially available for this purpose. The person skilled in the art knows further reporter molecules and coupling methods for labeling proteins. The invention therefore also provides detection antibodies labeled with reporter molecules produced by such methods.
Dieses Nachweisverfahren eignet sich auch zur Diagnose von Neuropathien, Demenz, einer Borderline-Persönlichkeitsstörung oder einer primären Psychose, wobei der Nachweis von IgA und/ oder IgM anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern auf eine der vorgenannten Erkrankungen hinweist. This detection method is also suitable for the diagnosis of neuropathies, dementia, a borderline personality disorder or a primary psychosis, wherein the detection of IgA and / or IgM anti-NMDA receptor antibodies indicative of any of the aforementioned diseases.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von anti- NMDA-Rezeptor Antikörpern in einer biologischen Probe eines Individuums vor, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die biologische Probe mit einem Antikörper in Kontakt gebracht wird, welcher gegen anti-NMDA-Rezeptor Antikörper gerichtet ist, und diese Bindung von Antikörper an Antikörper gegen NMDA- Rezeptoren detektiert wird. Bevorzugt ist der Antikörper gegen IgA und/ oder IgM anti-NMDA-Rezeptor-Antikörper gerichtet. Die biologische Probe entstammt aus einem Individuum mit Verdacht auf eine Neuropathie, eine Demenz, eine Borderline- Persönlichkeitsstörung oder eine primäre Psychose. Der Nachweis von anti-NMDA- Rezeptor Antikörpern weist auf eine der vorgenannten Erkrankungen hin. Somit eignet sich dieses Verfahren auch als Diagnoseverfahren zur Diagnose der vorgenannten Erkrankungen. In a further aspect, the invention provides a method for detecting anti-NMDA receptor antibodies in a biological sample of an individual, characterized in that the biological sample is contacted with an antibody which is anti-NMDA receptor Antibodies is directed, and this binding of antibodies to antibodies against NMDA receptors is detected. Preferably, the antibody is directed against IgA and / or IgM anti-NMDA receptor antibodies. The biological sample comes from an individual suspected of neuropathy, dementia, borderline personality disorder or primary psychosis. The detection of anti-NMDA receptor antibodies indicates one of the aforementioned diseases. Thus, this method is also suitable as a diagnostic method for the diagnosis of the aforementioned diseases.
Die obigen Ausführungen und Definitionen zu der erfindungsgemäß verwendeten biologischen Probe, dem verwendeten antigenen Polypeptid und/ oder dem verwendeten Detektionsantikörper gelten auch im Zusammenhang mit den folgenden weiteren Aspekten der Erfindung, insbesondere dem Verfahren zur Diagnose einer Neuropathie und dem Testsystem/ Testkit zum Einsatz in einem dieser Verfahren. The above statements and definitions for the biological sample used according to the invention, the antigenic polypeptide used and / or the detection antibody used also apply in connection with the following further aspects of the invention, in particular the method for the diagnosis of neuropathy and the test system / test kit for use in one this procedure.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Neuropathie vor, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine biologische Probe eines Patienten auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen ein NR-Heteromer eines NMDA-Rezeptors untersucht wird, indem die biologische Probe des Patienten mit NMDA-Rezeptoren in Kontakt gebracht wird, die Bindung von anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern an ein NR-Heteromer eines NMDA-Rezeptors nachgewiesen werden, wobei der Nachweis dieser anti-NMDA-Rezeptor Antikörper auf eine Neuropathie hinweist. Bevorzugt werden Proben eines Patienten mit Verdacht auf eine Neuropathie eingesetzt, der die bereits oben beschriebenen Symptome aufweist. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Probe um eine flüssige Probe. Noch weiter bevorzugt handelt es sich bei dieser flüssigen Probe um Serum, Blut, Plasma und/ oder Liquor. Bei der zu diagnostizierenden Neuropathie handelt es sich um eine Autoimmun-Neuropathie. Diese Autoimmun-Neuropathie lässt sich jedoch nicht in die bislang bekannte Klassifikation der autoimmunen Neuropathien einordnen. Daher kann vermutet werden, dass es sich um eine neue Gruppe einer Autoimmun- Neuropathie handelt, es wird im Folgenden von einer Anti-NMDA-Rezeptor Neuropathie gesprochen. In a further aspect, the invention provides a method of diagnosing neuropathy characterized by examining a patient's biological sample for the presence of antibodies to an NR heteromer of an NMDA receptor by co-administering the patient's biological sample NMDA receptors are contacted to detect binding of anti-NMDA receptor antibodies to an NR heteromer of a NMDA receptor, with detection of these anti-NMDA receptor antibodies to neuropathy points. Preferably, samples of a patient suspected of neuropathy having the symptoms already described above are used. Most preferably, the sample is a liquid sample. Even more preferably, this liquid sample is serum, blood, plasma and / or cerebrospinal fluid. The neuropathy to be diagnosed is an autoimmune neuropathy. However, this autoimmune neuropathy can not be classified in the previously known classification of autoimmune neuropathies. Therefore, it can be assumed that this is a new group of autoimmune neuropathy, which is referred to below as an anti-NMDA receptor neuropathy.
In einer noch spezielleren Ausführungsform der Erfindung sind die nachzuweisenden Antikörper gegen die NR1-Untereinheit von NMDA-Rezeptoren gerichtet. Besonders bevorzugt werden Antikörper der Klassen IgA, IgM und/ oder IgG nachgewiesen. Bevorzugt wird für dieses Diagnoseverfahren einer Neuropathie das bereits oben beschriebene Nachweisverfahren von anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern der Klassen IgA und/ oder IgM eingesetzt. Der Nachweis dieser Antikörper deutet auf eine Anti- NMDA-Rezeptor Neuropathie hin. In a more specific embodiment of the invention, the antibodies to be detected are directed against the NR1 subunit of NMDA receptors. Particularly preferred antibodies of the classes IgA, IgM and / or IgG are detected. The detection method of anti-NMDA receptor antibodies of the classes IgA and / or IgM already described above is preferably used for this diagnosis method of neuropathy. Detection of these antibodies indicates anti-NMDA receptor neuropathy.
In einem noch weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Testsystem zur in vitro- Bestimmung von Antikörpern gegen NMDA-Rezeptoren vor, welches ein antigenes Polypeptid umfasst und anti-lgA und/ oder anti-lgM Antikörper. Dieses Testkit ist zur Diagnose von Autoimmun-Neuropathien, einer Demenz, der Borderline- Persönlichkeitsstörung oder einer primären Psychose geeignet. Vorzugsweise enthält das Testkit das in das oben beschriebene Nachweisverfahren eingesetzte antigene Polypetid, d.h., das antigene Polypeptid in dem Testkit wird in humanen Zellen rekombinant exprimiert (s.o.), und/ oder das antigene Polypeptid wird, wie bereits oben schon beschrieben, in NMDA-Rezeptor exprimierendem Gewebe dargeboten. Bei diesen Geweben handelt es sich um Gewebeschnitte aus dem Hippocampus und/ oder dem Cerebellum. Besonders bevorzugt handelt es sich um Gehirngewebe aus Ratten. Des Weiteren kann das antigene Polypeptid durch die Verwendung von kultivierten Neuronen aus dem Hippocampus dargeboten werden. ln einer speziellen Weiterbildung der Erfindung wird der Nachweis von Antikörper gegen NMDA-Rezeptoren zur Diagnose einer cerebellären Ataxie verwendet. In yet another aspect, the invention provides a test system for in vitro determination of antibodies to NMDA receptors comprising an antigenic polypeptide and anti-IgA and / or anti-IgM antibodies. This kit is suitable for diagnosing autoimmune neuropathies, dementia, borderline personality disorder or primary psychosis. Preferably, the test kit contains the antigenic polypeptide used in the detection method described above, ie the antigenic polypeptide in the test kit is recombinantly expressed in human cells (see above) and / or the antigenic polypeptide becomes NMDA receptor as already described above presented to expressing tissue. These tissues are tissue sections from the hippocampus and / or the cerebellum. Particularly preferred are brain tissue from rats. Furthermore, the antigenic polypeptide may be presented by the use of cultured hippocampal neurons. In a specific development of the invention, the detection of antibodies against NMDA receptors is used for the diagnosis of cerebellar ataxia.
Bei der Durchführung von Laboruntersuchungen sind bereits bei zwei Patienten, die das Krankheitsbild einer idiopathischen cerebellären Degeneration aufweisen, NMDA-Rezeptor Antikörper der Subklassen IgA und IgM gefunden worden. In einem Fall wurde die Diagnose einer Multisystematrophie vom cerebellären Typ (MSA-C) gestellt und im anderen Fall eine Cerebellopathie diagnostiziert. When conducting laboratory tests, NMDA receptor antibodies of the subclasses IgA and IgM have already been found in two patients presenting with the clinical picture of idiopathic cerebellar degeneration. In one case the diagnosis of cerebellar type multisystem atrophy (MSA-C) was made and in the other case a cerebellopathy was diagnosed.
Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens näher erläutert. Es zeigen: In the following the invention will be explained in more detail with reference to the figures without limiting the general concept of the invention. Show it:
Figur 1 : Glutamatrezeptoren (Typ NMDA). Die Rezeptoren befinden sich in postsynaptischen Membranen, bilden einen heteromeren liganden- gesteuerten Anionenkanal, der aus den Untereinheiten NR1 und NR2 zusammengesetzt ist. Anti-Glutamatrezeptor (Typ NMDA) Antikörper sind gegen ein Epitop gerichtet, welches in der extra zellulären Domäne der NR1 Untereinheit lokalisiert ist. FIG. 1: glutamate receptors (type NMDA). The receptors reside in postsynaptic membranes, forming a heteromeric ligand-gated anion channel composed of the subunits NR1 and NR2. Anti-glutamate receptor (type NMDA) antibodies are directed against an epitope located in the extracellular domain of the NR1 subunit.
Figur 2: Serum Reaktivität vom Patienten mit einer Anti-NMDA-Rezeptor Figure 2: Serum reactivity from the patient with an anti-NMDA receptor
Neuropathie, detektiert durch indirekte Immunfluoreszenz (A). Positive Reaktionen mit transfizierten HEK293-Zellen, welche den Glutamatrezeptor (Typ NMDA: Untereinheit NR1) exprimieren, (B) Nicht-transfizierte HEK293-Zellen (Negativreaktion).  Neuropathy detected by indirect immunofluorescence (A). Positive reactions with transfected HEK293 cells expressing the glutamate receptor (type NMDA: subunit NR1), (B) untransfected HEK293 cells (negative response).
Figur 3: Serum Reaktivität vom Patienten mit einer (A) Demenz, (B) einer Figure 3: serum reactivity from the patient with (A) dementia, (B) one
Borderline-Persönlichkeitsstörung.  Borderline personality disorder.
Beispiele: Examples:
Beispiel 1: Example 1:
Nachweis von IgA anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern in einer biologischen Probe eines Patienten mit Verdacht auf eine Neuropathie. Material und Methoden: Detection of IgA anti-NMDA receptor antibodies in a biological sample of a patient suspected of neuropathy. Material and methods:
1. Kultivierung von HEK293 Zellen auf Glas- Deckgläsern  1. Cultivation of HEK293 cells on glass coverslips
2. Insertion von cDNA codierend für die NR1/ NR1 bzw. NR1/ NR2B Untereinheit des NMDA-Rezeptors in ein Plasmid und anschließende Transfektion der HEK293 Zellen mit dem Vektorkonstrukt  2. Insertion of cDNA coding for the NR1 / NR1 or NR1 / NR2B subunit of the NMDA receptor into a plasmid and subsequent transfection of the HEK293 cells with the vector construct
3. Zunächst weitere Kultivierung der HEK293 Zellen auf Deckgläsern, dann Kulturabbruch durch Fixierung mit Aceton und anschließende Fragmentierung der Deckgläser in Biochips  3. First, further cultivation of the HEK293 cells on coverslips, then culture termination by fixation with acetone and subsequent fragmentation of the coverslips in biochips
4. Zusammenstellung verschiedener Biochips zu einem Mosaik. Verwendung von transfizierten Zellen zusammen mit untransfizierten Zellen, Gefrierschnitten aus Ratten-Hippocampus und Ratten-Cerebellum als Substrate für die indirekte Immunfluoreszenz  4. Compilation of different biochips into a mosaic. Use of transfected cells together with untransfected cells, frozen sections of rat hippocampus and rat cerebellum as substrates for indirect immunofluorescence
5. Patientenwahl: Im März 2010 wurde bei einem 44-jährigen Patienten mit dem Verdacht auf autoimmun bedingte Polyneuropathie das angeforderte Antikörpernachweisspektrum von MAG- und Gangliosid-Antikörpern um anti- NMDA-Rezeptor Antikörper aller Subklassen erweitert  5. Patient choice: In March 2010, the requested antibody detection spectrum of MAG and ganglioside antibodies in a 44-year-old patient suspected of having autoimmune polyneuropathy was extended by anti-NMDA receptor antibodies of all subclasses
6. Verfahren der indirekten Immunfluoreszenz. Inkubation der Mosaik-tragenden Objektträger mit Patientenserum. Nachweis der Patientenantikörper der einzelnen Subklassen mittels Fluoreszenzfarbstoff-markierter anti-lgA oder anti-lgM Antikörper. Verdünnungsreihe (mit Ausgangsverdünnug 1 :10) zur Bestimmung des Antikörpertiters  6. Method of indirect immunofluorescence. Incubate the mosaic-bearing slides with patient serum. Detection of the patient antibodies of the individual subclasses by means of fluorescent dye-labeled anti-IgA or anti-IgM antibodies. Dilution series (with starting dilution 1:10) for the determination of the antibody titer
7. Im Patientenserum wurden Antikörper der Klasse IgA mit einem Titer von 1 :100 detektiert. Auch die 3 Folgeproben wiesen ausschließlich anti-NMDA- Rezeptor Antikörper der Subklasse IgA auf.  7. In the patient serum antibodies of class IgA were detected with a titer of 1: 100. The 3 episodes also showed only anti-NMDA receptor antibodies of the subclass IgA.
8. Die positive Reaktion stellte sich als Oberflächen-Fluoreszenz der transfizierten Zellen dar.  8. The positive response was surface fluorescence of the transfected cells.
9. Von Anfang Januar bis Ende Juni 2010 wurden bei 33 Patienten mit Symptomen einer Neuropathie (Durchschnittsalter 70 Jahre, Altersspanne: 44 - 88 Jahre) Antikörper gegen NMDA-Rezeptoren nachgewiesen. Bei 79% der Proben konnten Antikörper der Klasse IgA (33%), IgM (21 %) und IgA+lgM (25%) nachgewiesen werden. Beispiel 2: 9. From early January to late June 2010, antibodies to NMDA receptors were detected in 33 patients with symptoms of neuropathy (mean age 70 years, age range 44-88 years). In 79% of the samples antibodies of class IgA (33%), IgM (21%) and IgA + IgM (25%) could be detected. Example 2:
Nachweis von IgA anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern in einer biologischen Probe einer Patientin mit Demenz  Detection of IgA anti-NMDA receptor antibodies in a biological sample of a patient with dementia
1. Kultivierung von HEK293 Zellen auf Glas-Deckgläsern 1. Cultivation of HEK293 cells on glass coverslips
2. Insertion von cDNA codierend für die NR1/ NR1 bzw. NR1/ NR2B Untereinheit des NMDA-Rezeptors in ein Plasmid und anschließende Transfektion der HEK293 Zellen mit dem Vektorkonstrukt  2. Insertion of cDNA coding for the NR1 / NR1 or NR1 / NR2B subunit of the NMDA receptor into a plasmid and subsequent transfection of the HEK293 cells with the vector construct
3. Zunächst weitere Kultivierung der HEK293 Zellen auf Deckgläsern, dann Kulturabbruch durch Fixierung mit Aceton und anschließende Fragmentierung der Deckgläser in Biochips  3. First, further cultivation of the HEK293 cells on coverslips, then culture termination by fixation with acetone and subsequent fragmentation of the coverslips in biochips
4. Zusammenstellung verschiedener Biochips zu einem Mosaik. Verwendung von transfizierten Zellen zusammen mit untransfizierten Zellen, Gefrierschnitten aus Ratten-Hippocampus und Ratten-Cerebellum als Substrate für die indirekte Immunfluoreszenz  4. Compilation of different biochips into a mosaic. Use of transfected cells together with untransfected cells, frozen sections of rat hippocampus and rat cerebellum as substrates for indirect immunofluorescence
5. Bei einer 64-jährigen Patientin mit Symptomen einer Demenz wurde im Januar 2010 ein Globaltest zum Nachweis anti-neuronaler Antikörper aller Subklassen durchgeführt.  5. In a 64-year-old female patient with symptoms of dementia, a global test was performed in January 2010 to detect anti-neuronal antibodies of all subclasses.
6. Verfahren der indirekten Immunfluoreszenz, siehe oben.  6. Method of indirect immunofluorescence, see above.
7. Die Patientin zeigte sich positiv für anti-NMDA-Rezeptor Antikörper der Subklasse IgA mit einem Titer von 1 :32.000  7. The patient was positive for subclass IgA anti-NMDA receptor antibody at a titer of 1: 32,000
8. Von Januar bis August 2010 wurden regelmäßig Serum- und/oder Liquor- Verlaufproben dieser Patientin analysiert. In allen 10 Proben wies die Patientin ausschließlich Antikörper der Subklasse IgA auf, der Antikörpertiter im Serum liegt derzeit bei 1 :1000.  8. From January to August 2010, serum and / or cerebrospinal fluid samples from this patient were analyzed on a regular basis. In all 10 samples the patient only showed antibodies of the subclass IgA, the serum antibody titer is currently 1: 1000.
9. Bei 3 weiteren Patienten, deren klinische Symptomatik der einer Frontotemporalen Demenz entsprach, wurden seit Februar 2010 anti-NMDA- Rezeptor Antikörper der Klasse IgA nachgewiesen. In einer Studie im September 2010 wurde daher Serum und Liquor von 22 Patienten mit Frontotemporaler Demenz (Durchschnittsalter: 66 Jahre, Altersspanne: 48 - 85 Jahre) auf anti-NMDA-Rezeptor Antikörper getestet. 19 Patienten wiesen positives Serum und/ oder Liquor auf (86%), dabei konnte man bei 10 Patienten IgA Antikörper (53%) und bei 7 IgA und IgM Antikörper (37%) detektieren. Beispiel 3: 9. In 3 other patients whose clinical symptoms were similar to those of frontotemporal dementia, since February 2010 anti-NMDA receptor IgA antibodies have been detected. Therefore, in a study in September 2010, serum and cerebrospinal fluid of 22 patients with frontotemporal dementia (mean age: 66 years, age range: 48-85 years) were tested for anti-NMDA receptor antibodies. 19 patients had positive serum and / or cerebrospinal fluid (86%); in 10 patients IgA antibodies (53%) and 7 IgA and IgM antibodies (37%) could be detected. Example 3:
Nachweis von IqA und IgM anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern in einer biologischen Probe einer Patientin mit einer Borderline-Persönlichkeitsstörung  Detection of IqA and IgM anti-NMDA receptor antibodies in a biological sample from a patient with borderline personality disorder
1. Kultivierung von HEK293 Zellen auf Glas-Deckgläsern 1. Cultivation of HEK293 cells on glass coverslips
2. Insertion von cDNA codierend für die NR1/ NR1 bzw. NR1/ NR2B Untereinheit des NMDA-Rezeptors in ein Plasmid und anschließende Transfektion der HEK293 Zellen mit dem Vektorkonstrukt  2. Insertion of cDNA coding for the NR1 / NR1 or NR1 / NR2B subunit of the NMDA receptor into a plasmid and subsequent transfection of the HEK293 cells with the vector construct
3. Zunächst weitere Kultivierung der HEK293 Zellen auf Deckgläsern, dann Kulturabbruch durch Fixierung mit Aceton und anschließende Fragmentierung der Deckgläser in Biochips  3. First, further cultivation of the HEK293 cells on coverslips, then culture termination by fixation with acetone and subsequent fragmentation of the coverslips in biochips
4. Zusammenstellung verschiedener Biochips zu einem Mosaik. Verwendung von transfizierten Zellen zusammen mit untransfizierten Zellen, Gefrierschnitten aus Ratten-Hippocampus und Ratten-Cerebellum als Substrate für die indirekte Immunfluoreszenz  4. Compilation of different biochips into a mosaic. Use of transfected cells together with untransfected cells, frozen sections of rat hippocampus and rat cerebellum as substrates for indirect immunofluorescence
5. Ende März 2010 wurde bei einer Patientin mit einer Borderline- Persönlichkeitsstörung ein umfangreiches Screening auf anti-neuronale Antikörper durchgeführt, darunter auch anti-NMDA-Rezeptor Antikörper.  5. At the end of March 2010, a patient with borderline personality disorder was screened for anti-neuronal antibodies, including anti-NMDA receptor antibodies.
6. Verfahren der indirekten Immunfluoreszenz, siehe oben.  6. Method of indirect immunofluorescence, see above.
7. Das Serum der Patientin wies Antikörper der Subklassen IgA (Titer 1 :32) und IgM (Titer 1:100) auf. Diese konnten auch in zwei weiteren Verlaufsproben nachgewiesen werden.  7. The patient's serum had antibodies of subclasses IgA (titer 1: 32) and IgM (titer 1: 100). These could also be detected in two further course samples.
Beispiel 4: Example 4:
Nachweis von IgA und IgM anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern in einer biologischen Probe eines Patienten mit einer primären Psychose (paranoid-halluzinatorische Schizophrenie)  Detection of IgA and IgM anti-NMDA receptor antibodies in a biological sample of a patient with a primary psychosis (paranoid hallucinatory schizophrenia)
1. Kultivierung von HEK293 Zellen auf Glas-Deckgläsern 2. Insertion von cDNA codierend für die NR1/ NR1 bzw. NR1/ NR2B Untereinheit des NMDA-Rezeptors in ein Plasmid und anschließende Transfektion der HE 293 Zellen mit dem Vektorkonstrukt 1. Cultivation of HEK293 cells on glass coverslips 2. Insertion of cDNA coding for the NR1 / NR1 or NR1 / NR2B subunit of the NMDA receptor into a plasmid and subsequent transfection of the HE 293 cells with the vector construct
3. Zunächst weitere Kultivierung der HEK293 Zellen auf Deckgläsern, dann Kulturabbruch durch Fixierung mit Aceton und anschließende Fragmentierung der Deckgläser in Biochips  3. First, further cultivation of the HEK293 cells on coverslips, then culture termination by fixation with acetone and subsequent fragmentation of the coverslips in biochips
4. Zusammenstellung verschiedener Biochips zu einem Mosaik. Verwendung von transfizierten Zellen zusammen mit untransfizierten Zellen, Gefrierschnitten aus Ratten-Hippocampus und Ratten-Cerebellum als Substrate für die indirekte Immunfluoreszenz  4. Compilation of different biochips into a mosaic. Use of transfected cells together with untransfected cells, frozen sections of rat hippocampus and rat cerebellum as substrates for indirect immunofluorescence
5. Ende August 2010 wurde im Rahmen einer Studie bei einem 45-jährigen männlichen Patienten mit paranoid-halluzinatorischer Schizophrenie ein Nachweis auf anti-NMDA-Rezeptor Antikörper durchgeführt  5. At the end of August 2010, a demonstration of anti-NMDA receptor antibody was performed in a 45-year-old male patient with paranoid hallucinatory schizophrenia
6. Verfahren der indirekten Immunfluoreszenz, siehe oben.  6. Method of indirect immunofluorescence, see above.
7. Im Serum des Patienten konnten anti-NMDA-Rezeptor Antikörper der Klasse IgA (Titer 1 :320) und IgM (Titer 1 :32) nachgewiesen werden.  7. Anti-NMDA receptor antibodies of class IgA (titer 1: 320) and IgM (titer 1: 32) were detected in the patient's serum.
8. Auch bei 8 weiteren Patienten aus dieser Untergruppe Schizophrenie- Erkrankter konnten anti-NMDA-Rezeptor Antikörper der verschiedenen Subklassen detektiert werden. 17% der hier untersuchten 53 Seren von paranoid-halluzinatorischen Schizophrenie-Patienten erwiesen sich als positiv. Insgesamt wurden 118 Seren von Patienten aus 7 klinisch differenzierten Teilbereichen der Schizophrenie untersucht.  8. Anti-NMDA receptor antibodies of the various subclasses could also be detected in 8 other patients from this subgroup of schizophrenia patients. Seventeen percent of the 53 serums of paranoid hallucinatory schizophrenia patients examined here were positive. A total of 118 sera from patients from 7 clinically differentiated areas of schizophrenia were studied.
Beispiel 5: Example 5:
Nachweis von IqA und IqM anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern in einer biologischen Probe eines Patienten mit einer cerebellären Ataxie  Detection of IqA and IqM anti-NMDA receptor antibodies in a biological sample of a patient with cerebellar ataxia
1. Kultivierung von HEK293 Zellen auf Glas-Deckgläsern 1. Cultivation of HEK293 cells on glass coverslips
2. Insertion von cDNA codierend für die NR1/ NR1 bzw. NR1/ NR2B Untereinheit des NMDA-Rezeptors in ein Plasmid und anschließende Transfektion der HEK293 Zellen mit dem Vektorkonstrukt 3. Zunächst weitere Kultivierung der HEK293 Zellen auf Deckgläsern, dann Kulturabbruch durch Fixierung mit Aceton und anschließende Fragmentierung der Deckgläser in Biochips 2. Insertion of cDNA coding for the NR1 / NR1 or NR1 / NR2B subunit of the NMDA receptor into a plasmid and subsequent transfection of the HEK293 cells with the vector construct 3. First, further cultivation of the HEK293 cells on coverslips, then culture termination by fixation with acetone and subsequent fragmentation of the coverslips in biochips
4. Zusammenstellung verschiedener Biochips zu einem Mosaik. Verwendung von transfizierten Zellen zusammen mit untransfizierten Zellen, Gefrierschnitten aus Ratten-Hippocampus und Ratten-Cerebellum als Substrate für die indirekte Immunfluoreszenz.  4. Compilation of different biochips into a mosaic. Use of transfected cells together with untransfected cells, frozen sections of rat hippocampus and rat cerebellum as substrates for indirect immunofluorescence.
5. Bei einem 47-jährigen Patienten mit Symptomen einer Multisystematrophie vom cerebellären Typ (MSA-C) wurde im September 2010 ein umfassender Test zum Nachweis anti-neuronaler Antikörper aller Subklassen durchgeführt. 5. In a 47-year-old patient with symptoms of cerebellar-type multisystem atrophy (MSA-C), a comprehensive test was performed in September 2010 to detect anti-neuronal antibodies of all subclasses.
6. Verfahren der indirekten Immunfluoreszenz, siehe oben. 6. Method of indirect immunofluorescence, see above.
7. Bei dem Patienten konnten anti-NMDA-Rezeptor Antikörper der Subklassen IgA (Titer 1 :320) und IgM (Titer 1 :1000) detektiert werden.  7. Anti-NMDA receptor antibodies of subclasses IgA (titer 1: 320) and IgM (titer 1: 1000) could be detected in the patient.
8. Bereits im Oktober 2010 ging eine weitere Serumprobe eines 68-jährigen Patienten mit einer idiopathischen cerebellären degenerativen Erkrankung ein, die ebenfalls NMDA-Rezeptor Antikörper der Subklassen IgA und IgM mit gleichem Titer aufwies.  8. Already in October 2010, another serum sample of a 68-year-old patient with idiopathic cerebellar degenerative disease, who also had NMDA receptor antibodies of the subclasses IgA and IgM at the same titre, was admitted.
Beispiel 6: Example 6:
Mit Hilfe einer weiteren Untersuchung soll die Prävalenz von Anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern der Klasse IgA- und/oder IgM bei Patienten mit cerebellärer Ataxie nachgewiesen werden.  Another study is to demonstrate the prevalence of anti-NMDA receptor antibodies of class IgA and / or IgM in patients with cerebellar ataxia.
Hierzu werden insgesamt 88 Proben von Patienten, die Auffälligkeiten in Bezug auf das Vorhandensein einer cerebellären Ataxie aufweisen, untersucht. Die folgenden verschiedenen Subtypen einer cerebellären Ataxie sind in den Proben vorhanden: For this purpose, a total of 88 samples from patients with abnormalities in the presence of cerebellar ataxia are examined. The following different subtypes of cerebellar ataxia are present in the samples:
1. genetisch bedingte Ataxie: 37 Patienten  1. genetic ataxia: 37 patients
2. Sporadische cerebelläre Ataxie: 31 Patienten  2. Sporadic cerebellar ataxia: 31 patients
3. Multisystematrophie vom cerebellären Typ: 20 Patienten  3. Cerebellar type multisystem atrophy: 20 patients
Bislang konnten 3 Patienten mit einer idiopathischen cerebellär degenerativen So far, 3 patients with idiopathic cerebellar degenerative
Erkrankung und Anti-NMDAR-Antikörper vom IgA und/oder IgM-Typ identifiziert werden. Diese Studie soll den systematischen Ansatz zur Austestung eines solchen klinisch vorcharakterisierten Kollektivs auf Anti-NMDAR-Antikörper bieten. Sämtliche Patientenseren werden im Immunfluoreszenztest auf Antikörper gegen Glutamatrezeptoren (Typ NMDA) der Klassen IgA, IgG und IgM untersucht. Als Substrat dienen die Rattengewebe Hippocampus und Kleinhirn, sowie mit den NMDAR-Untereinheiten NR1 , sowie NR1+ NR2 transfizierte HEK-Zellen. Disease and anti-NMDAR antibodies of IgA and / or IgM type can be identified. This study aims to provide a systematic approach to testing such a clinically pre-characterized collective for anti-NMDAR antibodies. All patient sera are examined in the immunofluorescence test for antibodies against glutamate receptors (type NMDA) of the classes IgA, IgG and IgM. The substrate used are the rat tissues hippocampus and cerebellum, as well as HEK cells transfected with the NMDAR subunits NR1 and NR1 + NR2.
Untersucht wird die Prävalenz von Anti-NMDAR-Antikörpern im gesamten Kollektiv, ob eine Korrelation von Antikörperklasse und Symptomatik erkennbar ist und ob eine Korrelation von Antikörpertiter und Schwere der Erkrankung nachgewiesen werden kann. The prevalence of anti-NMDAR antibodies in the entire collective is examined, whether a correlation of antibody class and symptoms is recognizable and whether a correlation of antibody titer and severity of the disease can be detected.
Beispiel 7: Example 7:
Mit Hilfe einer weiteren Untersuchung soll die Prävalenz von Anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern der Klasse IgA- und/oder IgM bei Patienten mit Neuropathie  With the help of a further investigation, the prevalence of anti-NMDA receptor antibodies of class IgA and / or IgM in patients with neuropathy
nachgewiesen werden. be detected.
Im Rahmen der Untersuchung findet retrospektiv eine Datenanalyse von The study retrospectively includes a data analysis of
Serumproben statt, die seit Einführung des Testsystems ,Anti-Glutamat-Rezeptor (Typ NMDA) UFT" im klinisch-immunologischen Labor Prof. Dr. Stöcker eingegangen sind. In die Datenabfrage werden Proben einbezogen, die Serum samples have been taken since the introduction of the test system "Anti-glutamate receptor (type NMDA) UFT" in the Clinical-Immunological Laboratory of Prof. Dr. Stöcker
(1) mit dem Analyseauftrag zum Nachweis von Antikörpern gegen MAG und/oder Ganglioside eingeschickt wurden und  (1) were sent in with the analysis order for the detection of antibodies to MAG and / or gangliosides, and
(2) in Form eines multiparametrischen Ansatzes auf verschiedenen Substraten im Immunofluoreszenztest inkubiert wurden.  (2) were incubated in the form of a multiparametric approach on different substrates in the immunofluorescence test.
Aufgrund der Analysenanfrage kann von dem klinischen Hintergrund einer Due to the analysis request may be of the clinical background of a
Neuropathie ausgegangen werden. Sobald Anti-NMDA-Rezeptor Antikörper der Klasse IgA und/oder IgM als Nebenbefund nachweisen werden, erfolgt eine Neuropathy are assumed. As soon as anti-NMDA receptor antibodies of class IgA and / or IgM are detected as incidental finding, a
Nachfrage beim Einsender respektive beim behandelnden Arzt zur Klinik des Demand to the consignor or the attending physician to the clinic of the
Patienten durch einen Neurologen. Patients by a neurologist.
Der Multiplex-Ansatz ermöglicht durch die Kombination verschiedener IIFT-Substrate auf einem Reaktionsfeld den Nachweis diverser Antikörper in nur einem Inkubationsschritt. Dadurch lassen sich in der standardisierten Abarbeitung von Analyseaufträgen im Labor Prof. Dr. Stöcker auch Nebenbefunde für andere als den ursprünglich angeforderten Parameter erstellen. Aus wissenschaftlichem Interesse wurde dort bei den neurologischen Parametern der in der Literatur beschriebene und für die Diagnostik einer Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis relevante IgG-Nachweis zusätzlich um die Konjugate IgA und IgM erweitert. Auf diese Weise zeigte sich, dass vor allem bei Anfragen zum Nachweis von MAG-Antikörpern gelegentlich IgA und/oder IgM-Antikörper gegen NMDA-Rezeptoren im Patientenserum detektiert werden. Im Zeitraum von Januar - Juni 2010 konnten bereits 33 Patienten mit Verdacht auf die Symptomatik einer Neuropathie (Durchschnittsalter 70 Jahre, Altersspanne: 44 - 88 Jahre) und Antikörpern gegen NMDA-Rezeptoren identifiziert werden. Bei 79% der Proben konnten Antikörper der Klasse IgA (33%), IgM (21%) und IgA+lgM (25%) nachgewiesen werden. Klinische Informationen wurden von den behandelnden Ärzten für 15 Patienten erteilt. Anhand des klinischen Syndroms und elektrophysiologischer Befunde ist eine Einteilung dieser Patienten in die folgenden 5 Gruppen möglich: By combining different IIFT substrates on one reaction field, the multiplex approach enables detection of diverse antibodies in just one Incubation step. Thus, in the standardized processing of analysis orders in the laboratory Prof. Dr. med. Stöcker also create secondary findings for other than the originally requested parameters. For scientific reasons, the IgG detection described in the literature and relevant for the diagnosis of anti-NMDA receptor encephalitis was extended by the conjugates IgA and IgM. In this way, it was found that IgA and / or IgM antibodies against NMDA receptors are occasionally detected in the patient's serum, especially in the case of queries for the detection of MAG antibodies. In the period from January to June 2010, 33 patients with suspected symptoms of neuropathy (mean age 70 years, age range 44-88 years) and antibodies to NMDA receptors were identified. In 79% of the samples antibodies of class IgA (33%), IgM (21%) and IgA + IgM (25%) could be detected. Clinical information was provided by treating physicians for 15 patients. Based on the clinical syndrome and electrophysiological findings, it is possible to classify these patients into the following 5 groups:
1. Polyradikulitis/-pathie und/oder distal demyelinisierende Polyneuropathie 1. Polyradiculitis / pathology and / or distal demyelinating polyneuropathy
2. distal-symmetrische axonale sensomotorische Neuropathie 2. Distal-symmetric axonal sensomotor neuropathy
3. rein motorische Neuropathie axonal oder demyelinisierend  3. purely motor neuropathy axonal or demyelinating
4. Crampus-Faszikulations-Syndrom (ohne neurographische Auffälligkeiten) 4. Crampus fasciculation syndrome (without neurographic abnormalities)
5. Sonstiges Syndrom 5. Other syndrome
Mit der zuvor beschriebenen Studie soll die genauere Charakterisierung des klinischen Phänotyps einhergehend mit IgA und/oder IgM-Antikörpern gegen NMDA- (NRI)-Rezeptor im Serum von Patienten mit neuromuskulären Erkrankungen erfolgen. Desweiteren soll die Prävalenz abgeschätzt und mit Kontrollgruppen verglichen werden. The study described above aims to provide more accurate characterization of the clinical phenotype associated with IgA and / or IgM antibodies to the NMDA (NRI) receptor in the serum of patients with neuromuscular disease. Furthermore, the prevalence should be estimated and compared with control groups.
Analysiert werden die epidemiologischen und klinischen Charakteristika der  The epidemiological and clinical characteristics of the
Patienten, Unterschiede der Antikörper-Titer und-Isotypen zwischen den Gruppen. Patients, differences in antibody titres and isotypes between groups.
Anhand der Versuche soll insbesondere geklärt werden, wieviele Anti-NMDAR- Antikörper positive Nebenbefunde sich unter den Anfragen zum Nachweis von MAG- und/oder Gangliosid-Antikörpern ermitteln lassen, ob sich die Hypothese der On the basis of the experiments it should be clarified, in particular, how many anti-NMDAR antibodies positive secondary findings can be determined among the inquiries for the detection of MAG and / or ganglioside antibodies, whether the hypothesis of the
Einteilung nach Symptomatik aufrecht erhalten lässt, ob eine Korrelation von Antikörpertiter und Schwere der Erkrankung zu erkennen ist und ob eine Korrelation von Anttkörperklasse und Symptomatik nachgewiesen werden kann. Classification according to symptoms can be maintained, whether a correlation of Antibody titer and severity of the disease can be seen and whether a correlation of Anttkörperklasse and symptoms can be detected.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum Nachweis von anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern in einer biologischen Probe gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte A method for detecting anti-NMDA receptor antibodies in a biological sample characterized by the method steps
a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einem antigenen Polypeptid, nämlich NMDA-Rezeptor, oder einem Fragment davon, b) Detektieren der Bindung von IgA und/ oder IgM Antikörpern aus der biologischen Probe an das antigene Polypeptid.  a) contacting the biological sample with an antigenic polypeptide, namely NMDA receptor, or a fragment thereof, b) detecting the binding of IgA and / or IgM antibodies from the biological sample to the antigenic polypeptide.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die biologische Probe aus einem Individuum mit Verdacht auf einer Erkrankung des peripheren Nervensystems, insbesondere einer Neuropathie, oder mit Verdacht auf Demenz, oder mit Verdacht auf eine Borderline-Persönlichkeitsstörung und/ oder primären Psychosen (psychatrischen Erkrankungen mit psychotischen Symptomen) stammt. 2. The method of claim 1, wherein the biological sample from an individual suspected of peripheral nervous system disease, in particular neuropathy, or suspected dementia, or with suspected borderline personality disorder and / or primary psychosis (psychiatric disorders with psychotic symptoms).
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüchen, wobei das Individuum, aus dem die biologische Probe stammt, Symptome aufweist ausgewählt aus der Gruppe umfassend: A method according to any one of the preceding claims, wherein the individual from which the biological sample is derived has symptoms selected from the group comprising:
i) Lähmungen, Lähmungen vorübergehender Natur, Schwäche- Anfälle, Taubheitsgefühle, Muskelkrämpfe (Crampi), Faszikulationen, Bewegungsunruhe der Beine, Neuropathische Schmerzen: brennende Schmerzen (Kausalgien), Mißempfindungen (Dysästhesien), Kribbeln (Parästhesien), Allodynie, Hitze/ Kältegefühl an den Extremitäten, Wirbelsäulen Schmerzsyndrom, und/ oder  i) paralysis, paralysis of a transient nature, weaknesses, numbness, cramps, fasciculations, movement of the legs, neuropathic pain: burning pain (causalgia), discomfort (dysesthesia), tingling (paresthesia), allodynia, heat / cold sensation the extremities, spinal pain syndrome, and / or
ii) Wahn, Halluzinationen; und/ oder  ii) delusion, hallucinations; and or
iii) Störung der kognitiven Fähigkeiten.  iii) Disruption of cognitive ability.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die biologische Probe eine flüssige Probe ist. A method according to any one of the preceding claims, wherein the biological sample is a liquid sample.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Probe Serum, Blut, Plasma und/ oder Liquor ist. 5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the sample is serum, blood, plasma and / or cerebrospinal fluid.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das antigene Polypeptid, nämlich NMDA-Rezeptor, A method according to any one of the preceding claims, wherein the antigenic polypeptide, namely NMDA receptor,
i) als antigenes Substrat in Zellen rekombinant exprimiert wird, und/ oder  i) is expressed recombinantly as an antigenic substrate in cells, and / or
ii) in Gewebe vorliegt, nämlich Hippocampus und Cerebellum Gewebe, und/ oder  ii) is present in tissue, namely hippocampus and cerebellum tissue, and / or
iii) in kultivierten Hippocampus-Neuronen vorliegt.  iii) is present in cultured hippocampal neurons.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei für die rekombinante Expression in Zellen die cDNAs kodierend für den NMDA-Rezeptor, nämlich kodierend für die Untereinheiten NR1/NR1 und NR1/NR2, in einen eukaryotischen Expressions- Vektor insertiert wurden und in HEK293 Zellen exprimiert wurden. 7. The method according to claim 6, wherein for recombinant expression in cells, the cDNAs coding for the NMDA receptor, namely coding for the subunits NR1 / NR1 and NR1 / NR2, were inserted into a eukaryotic expression vector and cells were expressed in HEK293 ,
8. Verfahren zum Nachweis von anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern in einer biologischen Probe eines Individuums mit Verdacht auf einer Erkrankung des peripheren Nervensystems, insbesondere einer Neuropathie, oder mit Verdacht auf Demenz, oder mit Verdacht auf eine Borderline- Persönlichkeitsstörung und/ oder primären Psychosen (psychiatrischen Erkrankungen mit psychotischen Symptomen), gekennzeichnet durch die Verf a h ren ssch ritte 8. A method for detecting anti-NMDA receptor antibodies in a biological sample of an individual suspected of having a peripheral nervous system disorder, in particular neuropathy, or suspected dementia, or suspected borderline personality disorder and / or primary psychosis (psychiatric disorders with psychotic symptoms) characterized by the procedural stages
a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einem Antikörper gerichtet gegen IgA und/ oder IgM anti-NMDA-Rezeptor Antikörper, b) Detektieren der Bindung von Antikörpern an das antigene Polypeptid, nämlich den Antikörpern gegen NMDA-Rezeptoren, wobei der Nachweis von anti-NMDA-Rezeptor Antikörper auf eine der vorgenannten Erkrankungen hinweist.  a) contacting the biological sample with an antibody directed against IgA and / or IgM anti-NMDA receptor antibodies, b) detecting the binding of antibodies to the antigenic polypeptide, namely the antibodies against NMDA receptors, wherein the detection of anti-NMDA Receptor antibodies to one of the aforementioned diseases.
9. Verfahren zur Diagnose einer Neuropathie, gekennzeichnet durch die Verfa h renssch ritte 9. A method for diagnosing a neuropathy characterized by the procedural steps
a) Untersuchung einer biolog. Probe auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen ein NR-Heteromer eines NMDA-Rezeptors, b) Nachweis der Bindung der anti-NMDA-Rezeptor Antikörper an ein NR-Heteromer eines NMDA-Rezeptors, wobei der Nachweis dieser anti-NMDA-Rezeptor Antikörper auf eine Neuropathie hinweist. a) investigation of a biolog. Sample for the presence of antibodies to an NR heteromer of an NMDA receptor, b) detection of binding of the anti-NMDA receptor antibodies to an NR heteromer of an NMDA receptor, detection of these anti-NMDA receptor antibodies indicates neuropathy.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die biologische Probe eine Probe ist, die aus einem Patienten mit Symptomen erhalten wurde, ausgewählt aus der Gruppe umfassend: Lähmungen, Lähmungen vorübergehender Natur, Schwäche-Anfälle, Taubheitsgefühle, Muskelkrämpfe (Crampi), Faszikulationen, Bewegungsunruhe der Beine, Neuropathische Schmerzen: brennende Schmerzen (Kausalgien), Mißempfindungen (Dysästhesien), Kribbeln (Parästhesien), Allodynie, Hitze/ Kältegefühl an den Extremitäten und/ oder Wirbelsäulen Schmerzsyndrom. 10. The method of claim 9, wherein the biological sample is a sample obtained from a patient with symptoms selected from the group comprising: paralysis, temporary paralysis, weakness seizures, numbness, cramps, fasciculations, motor unrest Legs, Neuropathic pain: burning pain (causalgia), sensation of sensation (dysesthesia), tingling (paresthesia), allodynia, feeling of heat / cold on the extremities and / or spine pain syndrome.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei es sich bei der biologischen Probe um eine flüssige Probe handelt. A method according to any one of claims 9 or 10, wherein the biological sample is a liquid sample.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , wobei die biologische Probe Serum, Blut, Plasma und/ oder Liquor ist. 12. The method according to any one of claims 9 to 11, wherein the biological sample is serum, blood, plasma and / or cerebrospinal fluid.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Antikörper gegen die NR1 -Untereinheit von NMDA-Rezeptoren gerichtet sind. The method of any one of claims 9 to 12, wherein the antibodies are directed against the NR1 subunit of NMDA receptors.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei Antikörper der Klasse IgA und/ oder IgM nachgewiesen werden. 14. The method according to any one of claims 9 to 13, wherein antibodies of class IgA and / or IgM are detected.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei die Neuropathie eine Autoimmun-Neuropathie ist. The method of any of claims 9 to 14, wherein the neuropathy is an autoimmune neuropathy.
16. Testkit zur Untersuchung biologischen Materials auf das Vorhandensein von IgA und/ oder IgM anti-NMDA-Rezeptor Antikörpern, umfassend 16. Test kit for testing biological material for the presence of IgA and / or IgM anti-NMDA receptor antibodies, comprising
a) antigenes Polypeptid, nämlich NMDA-Rezeptor, wobei das Polypeptid rekombinant in mit für NMDA-Rezeptoren codierenden cDNAs transfizierten Zellen exprimiert wird, und/ oder das antigene Polypeptid in Gewebe vorliegt  a) antigenic polypeptide, namely NMDA receptor, wherein the polypeptide is recombinantly expressed in cells transfected with cDNAs encoding NMDA receptors, and / or the antigenic polypeptide is present in tissue
b) anti-human IgA und/ oder IgM-Antikörper. b) anti-human IgA and / or IgM antibodies.
17. Testkit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Testkit zur Diagnose von Autoimmun Neuropathien, Demenz, der Borderline- Persönlichkeitsstörung und primärer Psychosen ist. 17. Test kit according to claim 16, characterized in that it is a test kit for the diagnosis of autoimmune neuropathies, dementia, borderline personality disorder and primary psychoses.
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