EP2523684A1 - Variants of the group-6 allergens of the poaceae with reduced allergenicity by mutagenesis of proline residues - Google Patents

Variants of the group-6 allergens of the poaceae with reduced allergenicity by mutagenesis of proline residues

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EP2523684A1
EP2523684A1 EP10795624A EP10795624A EP2523684A1 EP 2523684 A1 EP2523684 A1 EP 2523684A1 EP 10795624 A EP10795624 A EP 10795624A EP 10795624 A EP10795624 A EP 10795624A EP 2523684 A1 EP2523684 A1 EP 2523684A1
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EP
European Patent Office
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variants
rphl
phl
allergens
hypoallergenic
Prior art date
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Ceased
Application number
EP10795624A
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Inventor
Martin Wald
Andreas Nandy
Helmut Fiebig
Bernhard Weber
Helga Kahlert
Gerald Reese
Oliver Cromwell
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Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
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Publication date
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Publication of EP2523684A1 publication Critical patent/EP2523684A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Definitions

  • the present invention relates to the production and use of recombinant variants of the group 6 allergens of Poaceae (sweet grasses), which are characterized by a relation to the known wild-type allergens decreased IgE reactivity and at the same time a largely maintained reactivity with T lymphocytes.
  • hypoallergenic allergen variants can be specific to these hypoallergenic allergen variants.
  • a preferred embodiment of the invention relates to variants of the allergen Phl p 6 of the meadowweed grass (Phleum pratense) in which the prolines of positions 29, 30, 57, 79 are mutated individually or in combinations.
  • Type 1 allergies are of global importance. Up to 20% of the population in industrialized countries suffer from conditions such as allergic rhinitis, conjunctivitis or bronchial asthma.
  • allergies are caused by sources of various origins such as trees and grasses (pollen), fungi (spores), mites (feces), cats or dogs.
  • the allergen sources are released directly into the air (pollen, spores) or can be bound to diesel soot particles (pollen) or House dust (mite faeces, skin particles, hair) get into the air.
  • they are allergy-causing substances in the air, it is also called aerosol allergens.
  • the type 1 allergy-causing substances are proteins, glycoproteins or polypeptides. Upon ingestion via mucous membranes, these allergens react with the IgE molecules bound to the surface of mast cells in sensitized persons. If these IgE molecules are cross-linked by an allergen, this leads to the release of mediators (eg histamine, prostaglandins) and cytokines through the
  • Sweet grasses comprise over 10,000 species, of which well over 20 are known to cause allergic symptoms (Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol., 130: 87-107, Esch, 2008, Allergens and Allergen Immunotherapy , Clinical Allergy and Immunology Series, 107-126).
  • Phl p 1 Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin Immunol 92: 789-796), Phl p 5 (Matthiesen and Lowenstein, 1991, Clin Exp 21: 297-307, Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol., 98: 105-109), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch.
  • Phl p 6 is classified as a major allergen, because in about 70% of grass pollen allergy Phl p 6-reactive IgE antibodies are detectable. (Rossi et al., 2001, Allergy, 56: 1 180-85; Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163: 5489-9).
  • the proteins each having a signal peptide, each consist of 10 amino acids and differ in only two positions (Val 14 -> He and Arg 95 His, starting from the mature Phl p 6.0101), which cause a difference in molecular weight of 5 Da (11790 Because of Phl p 6.0101 versus 1 1785 Da of Phl p 6.0102; Fig. 1).
  • the pollen of other sweet grass species of the family Poaceae and especially of the subfamily Pooideae may contain major allergens that cause the
  • allergenic allergens are considered as one
  • Grassweed grasses may have been primarily sensitized by one of the other related species of the grasses. Finally, due to this cross-reactivity, one species of grasses sensitization may be sufficient to cause an allergic reaction by other related grasses.
  • Polypeptide chain of Phl p 6 shows a great similarity with an N-terminal region of the approximately 26-28 kDa Phl p 5 (Fig. 1, Fig. 2). It is believed that the allergens on a common source gene
  • the classical therapy of injection therapy in which the patient subcutaneously injects natural allergen extracts in increasing doses, has been successfully used for about 100 years.
  • the immune system of the allergic person is repeatedly confronted with allergens, whereby a reprogramming of the immune system associated with a tolerance achieved against the allergens.
  • peptides of the antigens are presented on the cell surface.
  • T cell epitopes Some particular peptides, called T cell epitopes, are recognized by antigen-specific T cells. This bond leads among other things to the expression
  • T cells with regulatory function.
  • the regulatory T cell response leads to tolerance to the allergen, down-regulation of T H 2 cytokines, restoration of the TH 1 H 2 balance, suppression of allergen-specific IgE, induction of IgG4 , IgG1 and IgA antibodies, the suppression of
  • T-cell epitopes are thus of crucial importance for the therapeutic effect of the allergen preparations in hyposensitization.
  • Sensitization patterns of patient-matched cocktails of high-purity, recombinantly-produced allergens could replace extracts from natural allergen sources, as these contain a larger number of immunogenic but non-allergenic accompanying proteins in addition to the various allergens.
  • Initial clinical trials of recombinant allergens have been successful (Jutel et al., 2005, J. Allergy Clin Immunol., 116: 608-613, Valenta & Niederberger, 2007, J. Allergy Clin Immunol 119: 826- 830).
  • Hypoallergenic variants with reduced IgE binding published., Starting from the DNA unchanged allergens could, inter alia, by
  • the object of the present invention was based on the provision of novel variants of the group 6 allergens of the Poaceae protein and DNA level, which are characterized by a reduced IgE reactivity largely retained the T-cell reactivity and therefore for the curative and preventive specific immunotherapy as well as the
  • Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 correspond, individually or in
  • Combinations are mutated, compared to the wild-type allergens decreased IgE reactivity and at the same time a largely preserved
  • the invention relates to hypoallergenic variants of group 6 allergens of the grasshopper family (Poaceae) in which the prolines corresponding in alignment to the prolongs of positions 29, 30, 57, 79 in the amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 , mutated individually or in combinations.
  • allergen variants according to the invention characterized in that the prolines are deleted or substituted.
  • hypoallergenic variants according to the invention of group 6 allergens from the subfamily Pooideae preferably from the groups Poodae and Triticodae, preferably represented by Phleum pratense, Holcus lanatus, Phalaris aquatica, Anthoxanthum odoratum, Dactylis glomerata,
  • hypoallergenic variants of tri a 6, lake c 6 and hearing v 6 according to the invention from Triticum aestivum, Seeale cereale and Hordeum vulgare.
  • group 6 allergens of the Poodae are 5-allergens Phl p 6, Poa p 6, Hol p 6, Lol p 6 and Pha a 6 from Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Holcus lanatus and Phalaris aquatica and very particularly preferred are Poa p 6 and Phl p 6, in particular Phl p 6.
  • According to the invention are also all naturally occurring isomers, polymorphs and variants of the aforementioned allergens, and their precursor proteins.
  • the prolines are mutated which, in an alignment, correspond to the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the amino acid sequence of the mature Phl p 6.0101 or its variants (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8) or the mature Phl p 6.0102 (SEQ ID NO: 2), more preferably the mature Phl p 6.0102.
  • proline could exert an influence on the protein structure
  • targeted point mutations of proline residues were the starting point for the generation of hypoallergenic mutants of allergens only in the group 2 main allergens of house dust mite
  • the amino acid sequences of the mature Phl p 6 or the two isoforms (Phl p 6.0101, GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215, Phl p 6.0102, GenBank: Y16955, UniProt: 065868) have 7 proline residues (Figure 1).
  • the proline amino acid positions 29, 30, 57, 79, and 101 are directly at the beginning or end of helices and are involved in the formation of the
  • the recombinant unmodified wild-type allergen (rPhl p 6 wt, FIG genetically modified variants of the invention produced.
  • the wild-type proteins and the hypoallergenic variants according to the invention of the further group 6 allergens of sweet grasses according to the invention, for example Poa p 6, can be prepared analogously to the preparation process shown below. These are the Proline, which in an alignment the Prolinen of the positions 29, 30, 57, 79 in the
  • Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 correspond, individually or in
  • Combinations are mutated, preferably by substitution or deletion.
  • Fragments of the invention preferably comprise 20-109 amino acids, preferably 30-100 amino acids, more preferably 40-90 amino acids.
  • Variants according to the invention additionally comprise precursor proteins such as, for example, ProPhl p 6 with an upstream, natural or artificial signal sequence, as shown, for example, in FIGS. 18, 19 and 20 (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10).
  • fusion proteins with N- or C-terminal fusion tags for example His tag as in FIGS. 5 and 6, MBP tag,
  • variants according to the invention also include homologous sequences (polymorphisms (SNPs), isoforms) with an identity of the amino acid sequence of
  • the respective group 6 wild-type allergen preferably of at least 90% to the respective group 6 wild-type allergen, more preferably of at least 95% to the respective group 6 wild-type allergen.
  • one or a few amino acids are exchanged conservatively, for example a polar amino acid is substituted by another polar amino acid or a neutral by another neutral, but variants by non-conservative substitution are also inventive.
  • Multimers preferably comprise dimers or trimers of the hypoallergenic variants of the invention joined by a
  • variants are the variants of Phl p 6.0101 according to FIGS. 17 and 18 (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) in which individual amino acids which are not relevant for the effect according to the invention are exchanged, or three amino acids at the N-terminus absence,
  • variants according to the invention are polymorphic variants such as, for example, the two isomers Phl p 6.0101 and Phl p 6.0102 itself and further variants with replacement of one or more amino acids, absence of one or more amino acids at the N- and / or C-terminus or with corresponding deletion gaps within the amino acid sequence.
  • variants with polymorphic variants such as, for example, the two isomers Phl p 6.0101 and Phl p 6.0102 itself and further variants with replacement of one or more amino acids, absence of one or more amino acids at the N- and / or C-terminus or with corresponding deletion gaps within the amino acid sequence.
  • the subject of the invention are thus also hypoallergenic variants of group 6 allergens of grasses (Poaceae), characterized in that it is a fragment or variant of a hypoallergenic variant according to the invention, or a multimer of one or more inventive, hypoallergenic variants or by in that one or more hypoallergenic variants according to the invention or their fragments, variants or multimers are constituents of a recombinant fusion protein.
  • the invention also relates to a DNA molecule coding for a hypoallergenic variant according to the invention.
  • Another object of the invention is a recombinant
  • expression control sequence is meant, for example, a promoter or a sequence segment by means of which the expression of the target protein is influenced and which is functionally connected to the target gene, but does not necessarily have to be located directly adjacent to the target gene.
  • An article according to the invention is also a non-human one
  • Host organism transformed with a DNA molecule of the invention or an expression vector of the invention is a process for producing a hypoallergenic variant according to the invention by culturing a non-human host organism according to the invention and recovering the corresponding allergen variant from the culture.
  • Suitable non-human host organisms may be pro- or
  • a preferred host organism according to the invention is E. coli.
  • proline 29 + 30 from proline 57, from proline 79 and from proline 101.
  • prolines are localized in the Phl p 6 wild-type protein in the loop regions at the beginning or end of ⁇ helices ( Figure 1, Figure 2).
  • proline 61 and proline 108 are not changed since corresponding variants show no significant activity.
  • Proline mutations in the corresponding homologous positions of the other group 6 allergens of the sweet grasses according to the invention, for example Poa p 6 on the IgE binding ability are examined out.
  • the coding DNA for these investigations is provided with a sequence coding for an N-terminal hexa-histidine fusion fraction (+ 6His) (FIG. 5, SEQ ID NO. 5, FIG. 6).
  • the tag-free, usable for pharmaceutical purposes, variants of the invention and wild-type proteins are also purified by standard methods and confirm the results of His-tag proteins.
  • sequences coding for the proteins rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His, rPhl p 6 d [P79] + 6His and rPhl p 6 d [P101] + 6His are prepared .
  • the sequences can be expressed in all known eukaryotic and prokaryotic expression systems, preferably in E. coli.
  • the proteins are purified as soluble monomers by standard methods. Finally, purity can be checked by analysis in a denaturing polyacrylamide gel (SDS-PAGE) ( Figure 7).
  • SEC secretorous polyacrylamide gel
  • RI detector refractometer
  • MALS detector multi-angle light scattering detector
  • this test procedure allows the reduced IgE-binding ability of the mutants rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His and rPhl p 6 d [P79] + 6His im
  • Another object of the present invention are therefore to provide.
  • hypoallergenic variants of group 6 allergens of the sweet grasses family in which the prolines which correspond in an alignment to the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are individually mutated.
  • a preferred subject of the present invention are hypoallergenic variants of Phl p 6 or Poa p 6, in which the prolines, which in an alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
  • Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are individually mutated.
  • a particularly preferred subject of the present invention are hypoallergenic variants of Phl p 6, in which the prolines, which in an alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
  • Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are individually mutated. Particular preference is given to hypoallergenic variants of group 6 allergens of the grasshopper family (Poaceae), in which the prolines which are aligned with the prolongs of positions 29, 30, 57, 79 in the
  • Another preferred subject matter of the present invention are hypoallergenic variants of group 6 allergens of the grass family (Poaceae) according to the invention, in which the prolines which are present in a
  • Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are individually removed.
  • Another object of the present invention are also inventive, hypoallergenic variants of group 6 allergens of the family of sweet grasses (Poaceae), in which the prolines, which in a
  • Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are individually substituted.
  • proline is exemplarily replaced by leucine (L).
  • prolines of the invention may be replaced by any amino acid.
  • hypoallergenic variants rPhl p 6 d [P29], rPhl p 6 d [P30], rPhl p 6 d [P29, 30], rPhl p 6 d [P57], rPhl p 6 d [P79], rPhl p 6 P29L, rPhl p 6 P30L.
  • rPhl p 6 P29L, P30L, rPhl p 6 P57L and rPhl p 6 P79L and the like including all the hypoallergenic variants of the invention described below, the numbering of which follows the sequence of Phl p 6, in particular mature Phl p 6.0102.
  • these examples are not limited to variants of Phl p 6 but also relate in particular Poa p 6 and the group 6 allergens of all other grasses.
  • the still detectable IgE-binding ability of the hypoallergenic variants of the group 6 allergens according to the invention can be further reduced by combining proline mutations.
  • the mutant rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His due to the greatly reduced IgE binding of the mutant rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His and the fact that the deletion of proline 57 and 79, the IgE binding ability can be partially lowered, produces nucleic acids that the Contain mutations in combinations.
  • the prolines of positions 57 and 79 are either deleted or converted into the amino acid leucine.
  • These variants encode proteins bearing proline mutations in two of the loops connecting the ⁇ helices of Phl p 6 ( Figure 2).
  • nucleic acid coding for rPhl p 6 d [P29, 30] P57L P79L + 6His is prepared to generate an allergen variant which has proline mutations in three loop regions ( Figure 2).
  • sequences are preferably expressed in E. coli and the proteins are purified by standard methods.
  • Another object of the present invention are therefore to provide.
  • hypoallergenic variants of group 6 allergens of the grasshopper family in which the prolines corresponding in alignment to the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are mutated in combinations , Preference is given to mutations by deletion and substitution by other amino acids. Each amino acid can be chosen for exchange with proline.
  • a preferred subject of the present invention are hypoallergenic variants of Phl p 6 or Poa p 6, in which the prolines, which in an alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
  • Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 correspond, are mutated in combinations.
  • a particularly preferred subject of the present invention are hypoallergenic variants of Phl p 6, in which the prolines, which in a Alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
  • Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 correspond, are mutated in combinations. Particular preference is given to hypoallergenic variants of group 6 allergens of the grasshopper family (Poaceae), in which the prolines which are aligned with the prolongs of positions 29, 30, 57, 79 in the
  • Amino acid sequence of the mature Phl p 6.0102 correspond, are mutated in combinations.
  • hypoallergenic variants according to the invention in which the prolines 29, 30, 57, 79 are removed in combinations.
  • prolines 29, 30, 57, 79 are substituted in combinations.
  • hypoallergenic variants in which the prolines 29, 30, 57, 79 are removed and / or substituted in combinations.
  • hypoallergenic variants rPhl p 6 d [P29, 30, 57], rPhl p 6 d [29, 30, 79], rPhl p 6 d [29, 30, 57, 79], rPhl p 6 d [ P29, 57], rPhl p 6 d [P30, 57], rPhl p 6 d [29, 79], rPhl p 6 d, [30, 79], rPhl p 6 d, [29, 57, 79], rPhl p 6 d [30, 57, 79], rPhl p 6 d [30, 57, 79], rPhl p 6 d [30, 57, 79], rPhl p 6 d [30, 57, 79],
  • proline is exemplarily replaced by leucine (L).
  • the prolines of the invention can be replaced by any amino acid.
  • hypoallergenic variants in which one or more prolines according to the invention are substituted by another amino acid.
  • these examples are not limited to variants of Phl p 6 but also relate in particular Poa p 6 and the group 6 allergens of all other grasses.
  • all listed hypoallergenic variants of Phl p 6 according to the invention of Phleum pratense are particularly preferred, in particular based on Phl p 6.0102.
  • T helper lymphocytes react with peptide fragments of the allergens that are generated by degradation processes in antigen-presenting cells (APC) and are presented bound to MHC class II molecules on the surface of the APC.
  • the peptides are usually 13-18 amino acids in length, but may be longer due to the MHC class 2 side-open binding site.
  • the main contact points of the peptide with the MHC class molecule can be found in a core sequence of about 7-10 amino acids.
  • the allergen-specific activation of T helper lymphocytes is the
  • the present invention therefore relates to the described allergen variants according to the invention, DNA molecules and recombinant expression vectors as medicaments.
  • hypoallergenic variants DNA molecules and amino acids
  • Recombinant expression vectors or medicaments according to the invention can be used in particular for the prophylaxis and / or treatment of diseases and disease states.
  • Medicaments according to the invention are particularly suitable for the treatment and / or prophylaxis of type 1 allergies, that is to the specific one
  • DNA molecules according to the invention and recombinant expression vectors can be used for the corresponding immunotherapeutic and prophylactic DNA vaccination.
  • the invention also provides the use of at least one hypoallergenic variant according to the invention for the preparation of a
  • Medicament for the prevention and / or therapeutic treatment of type 1 allergies the release of which is caused by group 6 allergens of grasses.
  • DNA molecule according to the invention and / or a recombinant expression vector according to the invention including mixtures thereof in all ratios for the preparation of a medicament for immunotherapeutic DNA vaccination.
  • the invention further provides pharmaceutical preparations containing at least one hypoallergenic variant according to the invention, a DNA molecule according to the invention and / or a recombinant expression vector according to the invention, including mixtures thereof in all ratios and optionally other active substances and / or adjuvants for the prevention and / or or therapeutic treatment of type 1 allergies.
  • Therapeutics can be used in human or veterinary medicine and therefore administered to humans and animals, in particular mammals such as monkeys, dogs, cats, rats or mice and in the therapeutic
  • hypoallergenic variants, DNA molecules or recombinant expression vectors according to the invention are generally used analogously to known, commercially available preparations or preparations, preferably in dosages between 0.001 and 500 mg, in hypoallergenic variants about 1-500 ⁇ g , preferably 5-200 pg per dose in the maintenance phase.
  • the preparation may be administered one or more times a day, e.g. two, three or four times a day. Typically, the doses are in one
  • SCIT subcutaneous immunotherapy
  • Short-term therapies limited number of injections before the start of the seasonal complaints, typically 4 to 7 injections
  • preseasonal therapies beginning of pollen season, typically with weekly injections during the boost phase and monthly injections with the maintenance dose until the onset of the pollen season
  • year-round therapies uptake typically up to 16 weekly Injections followed by monthly injections with the
  • the initiation of therapy may take place with or without an uptake phase. Therapy is preferably with daily doses throughout the year, but may also be preseasonal or with other regimens of application (e.g., every other day, weekly, monthly).
  • effective amount means the amount of a drug or pharmaceutical agent which elicits a biological or medical response in a tissue, system, animal or human, e.g. sought or desired by a researcher or physician.
  • the term "therapeutically effective amount” means an amount which, compared to a corresponding subject who has not received this amount, results in: improved curative treatment, cure, prevention or elimination of a disease, a disease, a disease state, suffering, interference or prevention of side effects, or even reducing the progression of a disease, condition or disorder.
  • therapeutically effective amount also includes the amounts effective to increase normal physiological function.
  • Medicinal products may be administered by any suitable route, for example oral (including buccal or sublingual), rectal, pulmonary, nasal, topical (including buccal, sublingual or transdermal), vaginal or parenteral
  • Such drugs can be prepared by any method known in the pharmaceutical art, such as, for example, the active ingredient with the carrier (s) or
  • solutions for parenteral application are in particular solutions, preferably oily or aqueous solutions, further suspensions, emulsions or
  • the allergen variants according to the invention can also be any allergen variants according to the invention.
  • the allergen variants according to the invention can also be any allergen variants according to the invention.
  • Injection preparations are used.
  • the preparations indicated may be sterilized and / or contain adjuvants such as lubricants, preservatives, stabilizers and / or wetting agents, emulsifiers, salts for influencing the osmotic pressure, buffer substances and / or several further active ingredients.
  • adjuvants such as lubricants, preservatives, stabilizers and / or wetting agents, emulsifiers, salts for influencing the osmotic pressure, buffer substances and / or several further active ingredients.
  • depot preparations for example by adsorption on aluminum hydroxide, calcium phosphate or tyrosine, can be obtained by appropriate formulation of the allergen variants according to the invention.
  • Suitable carriers are organic or inorganic substances which are suitable for parenteral administration and which do not react with group 6 allergen variants according to the invention.
  • Examples include carriers such as water, vegetable oils, benzyl alcohols, polyethylene glycols,
  • Glycerol triacetate Glycerol triacetate, gelatin, carbohydrates, such as lactose or starch,
  • Magnesium stearate, talc, lanolin or Vaseline Magnesium stearate, talc, lanolin or Vaseline.
  • parenteral administration preferably parenteral administration.
  • parenteral In the case of parenteral
  • intralymphatic administration is particularly preferred.
  • the injection can be made directly or as an addition to infusion solutions.
  • Medicaments adapted for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile injection solutions containing anti-oxidants, buffers, bacteriostats and solubilizers through which the
  • Formulation is made isotonic with the blood of the recipient to be treated, as well as aqueous and non-aqueous sterile
  • Suspensions which may contain suspending agents and thickeners.
  • the formulations may be administered in single or multiple dose containers, e.g. sealed ampoules and vials, presented and in
  • sterile carrier liquid e.g. Water for injections
  • Injection solutions and suspensions may be sterile powders
  • Granules and tablets are produced.
  • preparations or medicaments according to the invention may contain one or more further active ingredients and / or one or more
  • Amplifiers (adjuvants) included.
  • Another object of the present invention are thus provided.
  • a preferred subject matter of the invention are pharmaceutical preparations according to the invention, characterized in that the other active substances are allergens or variants thereof.
  • Suitable further active ingredients are other allergens,
  • allergens of the grasses especially allergens of the grasses, more preferably allergens.
  • the subfamily Pooideae preferably from the groups Poodae and Triticodae, preferably represented by Phleum pratense, Holcus lanatus, Phalahs aquatica, Dactylis glomerata, Lolium perenne, Poa pratensis, Hordeum vulgare, Seeale cereale and Triticum aestivum, for example Group 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 10-, 12- or 13-allergens and variants thereof, for example hypoallergenic variants, fragments, multimers, hybrid molecules or recombinant fusion proteins.
  • Another group 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 10-, 12- or 13-allergens and variants thereof for example hypoallergenic variants, fragments, multimers, hybrid molecules or recombinant fusion proteins.
  • the present invention relates to pharmaceutical preparations containing at least one further excipient, particularly preferably so-called potentiators.
  • active enhancers are examples of active enhancers.
  • Receptors such as e.g. Lipopolysaccharides and CpG oligonucleotides, vitamin D3, mycobacterial antigens, and molecules from parasites (e.g., schistosomes or filariae), e.g. Cystatin or ES-62.
  • kits consisting of
  • kits containing suitable containers, such as boxes or boxes, individual bottles, bags or ampoules.
  • the set may e.g. containing separate ampoules each containing a formulation according to the invention containing an effective amount of a hypoallergenic variant of the invention, a DNA molecule or a recombinant expression vector and a formulation of another drug in dissolved or in lyophilized form.
  • “Usual workup” Water is added, if necessary, adjusted to pH values between 2 and 10, if necessary, depending on the constitution of the final product.
  • hypoallergenic variants according to the invention were prepared and characterized by biotechnology.
  • hypoallergenic variants of the invention can also be chemically synthesized.
  • hypoallergenic variants according to the invention described below are likewise provided by the invention.
  • Example 1 Variants of Phl p 6 with proline deletions in a single loop region
  • average mass of the eluting particles can be calculated with an accuracy of about 5%.
  • SEC / MALS / RI can detect monomers, dimers, other multimers and aggregates.
  • Table 1 Molecular weight of Phl p 6 wild-type and Phl p 6 variants with proline deletions in loops 1, 2, 3 or 4
  • the refractive index detector (RL) OptilabrEX (Wyatt, Santa Barbara, USA) was used to determine the protein concentration online. The light scattering of the particles was determined with the multi-angle detector MiniDAWN Treos (Wyatt). The calculation of
  • DNAs are ligated into the expression vector pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) via a topoisomerase reaction. The correctness of the DNA is confirmed by sequencing.
  • the purity of the proteins produced is first checked by SDS-PAGE followed by Coomassie staining. The analysis shows a very high degree of purity of all proteins (Fig. 7).
  • Analytical gel filtration allows the separation of protein species due to their specific hydrodynamic radii.
  • An online determination of the molecular mass can be achieved by the coupling of a
  • Refractometer Rl detector
  • MALS detector multi-angle light scattering detector
  • UV-Vis spectroscopy photometer: Ultrospec 5300pro UV / VIS, GE Healthcare.
  • UV-Vis spectroscopy a wave spectrum of the protein solution in the wavelength range of 240-800 nm is recorded. Insoluble aggregates in protein solutions absorb in the range> 300 nm wavelength, while highly soluble proteins in this range do not absorb.
  • Wave spectra are typical of proteins with high solubility.
  • Proteins of the invention are thus soluble under native conditions, highly pure and monomeric.
  • a simple test method for determining the reactivity of specific IgE from allergy sera is the streak test. With this method a larger number of allergy sera can be examined in parallel.
  • test substances are bound in the same concentration and amount side by side to a strip of nitrocellulose membrane under non-denaturing conditions.
  • Membrane strips can be incubated in parallel with different types of allergy sera. After a washing step, the specifically bound IgE antibodies are transformed by a color reaction mediated by an anti-human
  • IgE / alkaline phosphatase conjugate visible on the membrane.
  • the allergen / IgE interaction in solution can be examined, which interfering masking of epitopes of the test substance can be excluded, for example by immobilization to a membrane.
  • the EAST inhibition test is carried out as follows. Microtiter plates are coated with the allergens, here rPhl p 6 wt + 6His. After removal of the unbound allergen molecules by washing, the plate is blocked with bovine serum albumin to avoid later nonspecific binding. IgE antibodies from allergic persons were incubated as single sera in a suitable dilution with the allergen-coated microtiter plates. The amount of allergen-bound IgE antibodies is elicited via an anti-HIV / alkaline phosphatase conjugate by the reaction of a
  • Substrates quantified photometrically to a colored end product The binding of the IgE antibodies is inhibited by a soluble allergen or the substance to be tested (recombinant modified allergen) depending on the concentration substance-specific.
  • the results of the IgE inhibition tests with the recombinant allergen variants of Phl p 6 shown in FIG. 10 show that a deletion of the proline residues P [29, 30], P57 and P79 causes a reduced IgE binding ability of Phl p 6.
  • the IgE-binding capacity of the mutant d [P29, 30] is significantly lower than that of d [P57] or d [P79].
  • a lower inhibitory effect indicates a loss of IgE epitopes.
  • the mutant d [P 01] shows no altered IgE binding with the serum of the grass pollen allergy P32 and only slightly reduced binding with the serum P82, which again approaches that of the wild type at high inhibitor concentration.
  • membrane-bound IgE of the effector cells and their activation is then examined in vitro.
  • Allergenic substances can bind specific IgE antibodies, which are associated with the high-affinity IgE receptors of basophilic granulocytes.
  • the crosslinking of the IgE / receptor complexes triggered by the allergen molecules leads to a
  • the granulocytes used in the test are obtained in the present example from the whole blood of the allergic P21. This allergic person
  • oligoclonal T cell lines of grass pollen allergy sufferers under stimulation with the unchanged allergen are established by conventional methods.
  • the different T cell lines are stimulated with the reference allergen rPhl p 6 wt and the modified recombinant allergen variants.
  • the Proliferation rate is determined by the incorporation of [3H] thymidine by the usual methods.
  • Phl p 6 wild-type (IUIS entry Phl p 6.0102) 29, 30; 57 and 79 are shown.
  • the deleted proline residues may be located in two or three of the loop regions which are homologous to Phl p 6.
  • the corresponding hypoallergenic variants of the Phl p 6 wild-type isomer Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215) are prepared and investigated, and analogously, the hypoallergenic variants of the further group 6 allergens of sweet grasses according to the invention and their wild-type Proteins, in particular Poa p 6, are produced and investigated.
  • the codons are chosen so that the deduced amino acid sequence is based on the mature Phl p 6.0102 ( Figure 3, Figure 4).
  • the mutations for the proline deletions are introduced by using specific oligonucleotides in the PCR reactions lacking the corresponding codons for proline.
  • the oligonucleotides are preferably chosen such that the deduced protein carries a hexa-histidine fusion portion at the 5 " end ( Figure 5, Figure 6) .
  • the DNAs are inserted into the expression vector pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) via a topoisomerase reaction. The correctness of the DNA is confirmed by sequencing. However, other common expression vectors can be used.
  • the expression of the recombinant histidine fusion proteins can be carried out in all common eukaryotic and prokaryotic expression systems, preferably in Escherichia coli (strain Top10, Invitrogen).
  • the variants are primarily purified by the specific binding of the N-terminal histidine residues to a Ni 2+ chelate matrix (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC, Material: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Subsequently, the recombinant
  • the refractive index detector (RL) OptilabrEX (Wyatt, Santa Barbara, USA) was used to determine the protein concentration online. The light scattering of the particles was determined with the multi-angle detector MiniDAWN Treos (Wyatt). The calculation of
  • Loop regions can be further reduced than is possible by the deletion of proline residues in only a single loop region.
  • the variants stimulate the proliferation of the investigated T-cell lines to a comparable extent as the unchanged allergen. It can be concluded that the important T-cell epitopes are conserved.
  • P57L + 6His, rPhl p 6 d [29, 30] P79L + 6His and rPhl p 6 d [29, 30] P57L P79L + 6His are exemplary for hypoallergenic variants of the Poaceae group 6 allergens with combinations of proline-point mutations corresponding to the amino acid positions of the Phl p 6 wild-type (IUIS entry Phl p 6.0102) 29, 30, 57 and 79.
  • Proline residues can be converted to any amino acid.
  • the corresponding hypoallergenic variants of the Phl p 6 wild-type isomer Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215) are prepared and investigated, and analogously, the hypoallergenic variants of the others can also be prepared
  • the codons are chosen so that the deduced amino acid sequence is based on the mature Phl p 6.0102 ( Figure 3, Figure 4).
  • the mutations for the Proline deletions are introduced by using specific oligonucleotides in the PCR reactions lacking the corresponding codons for proline.
  • the oligonucleotides are preferably selected such that the deduced protein carries a hexa-histidine fusion fraction at the 5 'end (FIG. 5, FIG. 6).
  • the DNAs are ligated into the expression vector pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) via a topoisomerase reaction. The correctness of the DNA was confirmed by sequencing. However, other common expression vectors can be used.
  • the expression of the recombinant histidine fusion proteins can be carried out in all common eukaryotic and prokaryotic expression systems, preferably in Escherichia coli (strain Top10, Invitrogen).
  • the variants are primarily purified by the specific binding of the N-terminal histidine residues to a Ni 2+ chelate matrix (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC, Material: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Subsequently, the recombinant proteins are concentrated from the IMAC eluate and gel filtration is performed (material: Superdex 75, GE Healthcare).
  • Strip test still show a detectable IgE binding to rPhl p 6 d [P29, 30], a predominantly massively reduced IgE reactivity with the variants rPhl p 6 d [P29, 30] P57L + 6His, rPhl p 6 d [29, 30 ] P79L + 6His and rPhl p 6 d [29, 30] P57L P79L + 6His (group "A": sera 21, 32, 83, 137, etc.).
  • the variants stimulate the proliferation of the investigated T-cell lines to a comparable extent as the unchanged allergen. It can be concluded that the important T-cell epitopes are conserved.

Abstract

The present invention relates to the preparation and the use of recombinant variants of the group-6 allergens of the poaceae which are characterized by the fact that their IgE reactivity is reduced in comparison with the known wild-type allergens while simultaneously the reactivity with T-lyphocytes is largely retained.

Description

Varianten der Gruppe 6-Allergene der Süßgräser mit reduzierter Allergenität durch Mutagenese von Prolinresten Variants of the group 6 allergens of sweet grasses with reduced allergenicity by mutagenesis of proline residues
Gebiet der Erfindung Field of the invention
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von rekombinanten Varianten der Gruppe 6-Allergene der Poaceae (Süßgräser), welche durch eine gegenüber den bekannten Wildtyp-Allergenen verringerte IgE-Reaktivität und gleichzeitig eine weitgehend erhaltene Reaktivität mit T- Lymphozyten gekennzeichnet sind. The present invention relates to the production and use of recombinant variants of the group 6 allergens of Poaceae (sweet grasses), which are characterized by a relation to the known wild-type allergens decreased IgE reactivity and at the same time a largely maintained reactivity with T lymphocytes.
Diese hypoallergenen Allergenvarianten können zur spezifischen These hypoallergenic allergen variants can be specific
Immuntherapie (Hyposensibilisierung) von Patienten mit Gräserpollenallergie oder zur präventiven Behandlung zur Vermeidung der Ausprägung von Gräserpollenallergien eingesetzt werden. Immunotherapy (hyposensitization) of patients with grass pollen allergy or for preventive treatment to avoid the expression of grass pollen allergies.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Varianten des Allergens Phl p 6 des Wiesenlieschgrases (Phleum pratense) bei denen die Proline der Positionen 29, 30, 57, 79 einzeln oder in Kombinationen mutiert sind. A preferred embodiment of the invention relates to variants of the allergen Phl p 6 of the meadowweed grass (Phleum pratense) in which the prolines of positions 29, 30, 57, 79 are mutated individually or in combinations.
Hintergrund der Erfindung Allergien vom Typ 1 haben weltweite Bedeutung. Bis zu 20% der Bevölkerung in industrialisierten Ländern leiden unter Beschwerden wie allergischer Rhinits, Konjunktivitis oder Bronchialasthma. Background of the Invention Type 1 allergies are of global importance. Up to 20% of the population in industrialized countries suffer from conditions such as allergic rhinitis, conjunctivitis or bronchial asthma.
Diese Allergien werden von Quellen unterschiedlicher Herkunft wie Bäumen und Gräser (Pollen), Pilzen (Sporen), Milben (Kot), Katzen oder Hunden hervorgerufen. Die Allergenquellen werden direkt in die Luft abgegeben (Pollen, Sporen) oder können gebunden an Dieselrußpartikel (Pollen) oder Hausstaub (Milbenkot, Hautpartikel, Haare) in die Luft gelangen. Da sie sich die Allergie auslösenden Substanzen in der Luft befinden, spricht man auch von Aeroallergenen. Bei den Typ 1 -Allergie auslösenden Substanzen handelt es sich um Proteine, Glykoproteine oder Polypeptide. Diese Allergene reagieren nach Aufnahme über Schleimhäute mit den bei sensibilisierten Personen an der Oberfläche von Mastzellen gebundenen IgE-Molekülen. Werden diese IgE-Moleküle durch ein Allergen miteinander vernetzt, führt dies zur Ausschüttung von Mediatoren (z. B. Histamin, Prostaglandine) und Zytokinen durch die These allergies are caused by sources of various origins such as trees and grasses (pollen), fungi (spores), mites (feces), cats or dogs. The allergen sources are released directly into the air (pollen, spores) or can be bound to diesel soot particles (pollen) or House dust (mite faeces, skin particles, hair) get into the air. Because they are allergy-causing substances in the air, it is also called aerosol allergens. The type 1 allergy-causing substances are proteins, glycoproteins or polypeptides. Upon ingestion via mucous membranes, these allergens react with the IgE molecules bound to the surface of mast cells in sensitized persons. If these IgE molecules are cross-linked by an allergen, this leads to the release of mediators (eg histamine, prostaglandins) and cytokines through the
Effektorzelle und damit zu den entsprechenden allergischen Symptomen.  Effector cell and thus the corresponding allergic symptoms.
Bis zu 40% der Typ 1-Allergiker zeigen spezifische IgE-Reaktivität mit Up to 40% of type 1 allergy sufferers show specific IgE reactivity
Pollenextrakten von Süßgräsern (Burney et al., 1997, J. Allergy Clin. Pollen Extracts of Sweet Grasses (Burney et al., 1997, J. Allergy Clin.
Immunol. 99:314-322; D'Amato et al., 1998, Allergy 53: 567-578; Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin Immunology, 78, 1190-2002). Die Familie der Immunol. 99: 314-322; D'Amato et al., 1998, Allergy 53: 567-578; Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin Immunology, 78, 1190-2002). The family of
Süßgräser (Poaceae) umfasst über 10000 Spezies, von denen bisher weit über 20 als Auslöser von allergischen Symptomen bekannt sind (Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107; Esch, 2008, Allergens and Allergen Immunotherapy, Clinical Allergy and Immunology Series, 107- 126). Sweet grasses (Poaceae) comprise over 10,000 species, of which well over 20 are known to cause allergic symptoms (Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol., 130: 87-107, Esch, 2008, Allergens and Allergen Immunotherapy , Clinical Allergy and Immunology Series, 107-126).
Die meisten der Allergie auslösenden Süßgräser gehören zur Unterfamilie der Pooideae. Neben den als Wildformen vorkommenden Gräserarten wie beispielsweise Holcus lanatus (Wolliges Honiggras), Phalaris aquatica Most of the allergy-causing grasses belong to the subfamily Pooideae. In addition to occurring as wild forms grass species such as Holcus lanatus (woolly honey grass), Phalaris aquatica
(Knolliges Glanzgras), Anthoxanthum odoratum (Gewöhnliches Ruchgras), Dactylis glomerata (Gewöhnliches Knäuelgras), Festuca pratensis  (Tuberous glossy grass), Anthoxanthum odoratum (Common ryegrass), Dactylis glomerata (Common ball grass), Festuca pratensis
(Wiesenschwingel), Poa pratensis (Wiesenrispengras) oder Lolium perenne (Deutsches Weidelgras) sind auch kultivierte Cerealien wie Triticum aestivum (Weizen), Seeale cereale (Roggen) und Hordeum vulgare (Gerste) bekannte Mitglieder dieser Unterfamilie. Eine der hinsichtlich ihrer Allergene am besten untersuchten Spezies der Pooideae ist das Wiesenlieschgras {Phleum pratense), welches weltweit als Wildpflanze verbreitet ist und als Weidepflanze und winterhartes Futtergras auch eine wirtschaftliche Rolle spielt. Meadow fescue, Poa pratensis or Lolium perenne are also cultivated cereals such as Triticum aestivum (wheat), Seeale cereale (rye) and Hordeum vulgare (barley) known members of this subfamily. One of the best-studied species of Pooideae in terms of allergens is the meadow worm grass {Phleum pratense), which is widespread worldwide as a wild plant and also plays an economic role as a pasture and hardy fodder grass.
In Abhängigkeit von der relativen Häufigkeit in einer Population, mit der die einzelnen Allergenmoleküle mit den IgE-Antikörpern von Allergikern reagieren, wird zwischen Major- und Minorallergenen unterschieden. Sechs Allergene des Wiesenlieschgrases können als Majorallergene angesehen werden: Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), Phl p 5 (Matthiesen und Löwenstein, 1991 , Clin. Exp. Allergy 21 : 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54), Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3): 299-304), Phl p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294; Nandy et al., Biochem. Biophys. Res. Depending on the relative frequency in a population with which the individual allergen molecules react with the IgE antibodies of allergy sufferers, a distinction is made between major and minor allergens. Six allergens of meadowweed grass can be considered as major allergens: Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin Immunol 92: 789-796), Phl p 5 (Matthiesen and Lowenstein, 1991, Clin Exp 21: 297-307, Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol., 98: 105-109), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol., 108, 49-54 Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3): 299-304), Phl p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. Valentina et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294; Nandy et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 2005, 337(2): 563-70) und Phl p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Commun., 2005, 337 (2): 563-70) and Phl p13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).
Die erste Beschreibung des Phl p 6 erfolgte bereits 1978. Eine aus The first description of the Phl p 6 was already in 1978. One out
Wiesenlieschgras-Pollen gereinigte Proteinfraktion, die als ,Ag19" bezeichnet wurde, enthielt ein ca. 15 kDa großes Allergen, das später in die offizielle Allergen-Nomenklatur eingereiht und als Phl p 6 weitergeführt wurde Meadowweed grass pollen purified protein fraction, designated "Ag19", contained an approximately 15 kDa allergen, which later ranked in the official allergen nomenclature and continued as Phl p 6
(Lowenstein, 1978, Allergy 33: 30-41 ; WHO/ IUIS Allergen Nomenklatur(Lowenstein, 1978, Allergy 33: 30-41; WHO / IUIS allergen nomenclature
Subkomitee, www.allergen.org). Phl p 6 wird als Majorallergen eingestuft, weil bei etwa 70% der Graspollenallergiker Phl p 6-reaktive IgE-Antikörper nachweisbar sind. (Rossi et al., 2001 , Allergy, 56: 1 180-85; Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9). Subcommittee, www.allergen.org). Phl p 6 is classified as a major allergen, because in about 70% of grass pollen allergy Phl p 6-reactive IgE antibodies are detectable. (Rossi et al., 2001, Allergy, 56: 1 180-85; Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163: 5489-9).
Durch physiko-chemische Untersuchungen des Allergens aus By physico-chemical examinations of the allergen
Gräserpollenextrakt konnten zwei Proteinvarianten nachgewiesen werden, die sich in ihrer Primärsequenz unterscheiden (Blume et al., 2004, Proteomics 4: 1366-71). Diese Isoformen werden auf zwei in Expressions-Bibliotheken von Wiesenlieschgras-Pollen identifizierte cDNA-Sequenzen zurückgeführt und mit den WHO/ IUIS - Bezeichnungen Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1 ; UniProt: P432 5; siehe Abb. 15 und 16 bzw. SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO: 4, mit Propeptid siehe Abb. 19 bzw. SEQ ID NO:9; Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 55-59) und Phl p 6.0102 (GenBank: Y16955; UniProt: 065868; siehe Abb. 3 und 4 bzw. bzw. SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO: 2, mit Propeptid siehe Abb. 20 bzw. SEQ ID NO:10; Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9) geführt. Die Proteine bestehen abzüglich eines Signalpeptids aus jeweils 1 10 Aminosäuren und unterscheiden sich an nur zwei Positionen (Val 14 ->· He und Arg 95 His, ausgehend von dem reifen Phl p 6.0101), die einen Unterschied im Molekulargewicht von 5 Da bewirken (11790 Da des Phl p 6.0101 gegenüber 1 1785 Da des Phl p 6.0102; Abb. 1). Grass pollen extract, two protein variants were detected, the differ in their primary sequence (Blume et al., 2004, Proteomics 4: 1366-71). These isoforms are traced back to two cDNA sequences identified in grasshopper grasshopper pollen expression libraries and labeled with the WHO / IUIS designations Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1, UniProt: P432 5, see Figures 15 and 16 and SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, with propeptide see Fig. 19 and SEQ ID NO: 9, Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol., 108: 55-59) and Phl p 6.0102 ( GenBank: Y16955, UniProt: 065868, see Figures 3 and 4 and SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively, with propeptide see Figure 20 and SEQ ID NO: 10, Vrtala et al., 1999 , J. Immunol., 15; 163: 5489-9). The proteins, each having a signal peptide, each consist of 10 amino acids and differ in only two positions (Val 14 -> He and Arg 95 His, starting from the mature Phl p 6.0101), which cause a difference in molecular weight of 5 Da (11790 Because of Phl p 6.0101 versus 1 1785 Da of Phl p 6.0102; Fig. 1).
Die Pollen anderer Süßgräserarten der Familie Poaceae und insbesondere der Unterfamilie Pooideae können Major-Allergene enthalten, die den The pollen of other sweet grass species of the family Poaceae and especially of the subfamily Pooideae may contain major allergens that cause the
Allergenen des Wiesenlieschgrases homolog sind. Solche Allergens of meadow grass are homologous. Such
speziesübergreifend vorkommenden Allergene werden als eine allergenic allergens are considered as one
Allergengruppe zusammengefasst. Die hohe strukturelle Homologie solcher verwandter Allergene, die letztlich auf einer ähnlichen Aminosäuresequenz basiert, bedingt eine entsprechend hohe Kreuzreaktivität der Moleküle mit IgE- Antikörpern (Lorenz et al., 2009, Int. Arch. Immunol. 148:1-17). Es ist auch bekannt das Atopiker, die allergisch auf Major-Allergene des Allergen group summarized. The high structural homology of such related allergens, which is ultimately based on a similar amino acid sequence, causes a correspondingly high cross-reactivity of the molecules with IgE antibodies (Lorenz et al., 2009, Int. Arch. Immunol., 148: 1-17). It is also known the atopic who are allergic to major allergens of the
Wiesenlieschgrases reagieren, durch eine der anderen verwandten Spezies der Süßgräser primär sensibilisiert worden sein können. Letztlich kann aufgrund dieser Kreuzreaktivität eine Sensibilisierung durch eine Gräserart ausreichen, um eine allergische Reaktion durch andere verwandte Gräser auszulösen. Grassweed grasses may have been primarily sensitized by one of the other related species of the grasses. Finally, due to this cross-reactivity, one species of grasses sensitization may be sufficient to cause an allergic reaction by other related grasses.
In Pollen des Wiesen-Rispengrases (Poa pratensis) konnte bereits ein mit Phl p 6 kreuzreaktives Gruppe 6-Allergen auf Proteinebene nachgewiesen werden (Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9; Niederberger et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 101 (2): 258-264). In pollen of meadow bluegrass (Poa pratensis), a group 6 allergen that is cross-reactive with Phl p 6 has already been detected at the protein level (Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163: 5489-9; Niederberger et al., 1998, J. Allergy Clin Immunol 101 (2): 258-264).
Neben der Kreuzreaktivität der Gruppe 6-Allergene untereinander ist auch eine Kreuzreaktivität mit Majorallergenen der Gruppe 5 bekannt. Die In addition to the cross-reactivity of the group 6 allergens with each other, a cross-reactivity with major allergens of group 5 is known. The
Polypeptidkette des Phl p 6 zeigt eine große Ähnlichkeit mit einem N- terminalen Bereich des ca. 26-28 kDa großen Phl p 5 (Abb. 1, Abb. 2). Es wird vermutet, dass die Allergene auf ein gemeinsames Ursprungsgen Polypeptide chain of Phl p 6 shows a great similarity with an N-terminal region of the approximately 26-28 kDa Phl p 5 (Fig. 1, Fig. 2). It is believed that the allergens on a common source gene
zurückzuführen sind (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 55-59). Beide Proteine bilden α-helikale Sekundärstrukturen, jedoch keine ß- Faltblatt-Strukturen aus. Eine Röntgenstrukturanalyse zeigte, dass sich die vier α-Helices des Phl p 6 zu einem charakteristischen Helixbündel falten (RCSB Protein Data Bank Eintrag: 1 NLX; Fedorov et al., 2003; Abb. 1), eine Struktur, die auch bei Fragmenten des Phl p 5 nachgewiesen werden konnte (Rajashankar et al., 2002, Acta Cryst. D58:1175-1181 ; Maglio et al., 2002,(Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol., 108: 55-59). Both proteins form α-helical secondary structures, but no β-sheet structures. An X-ray crystallographic analysis revealed that the four α-helices of Phl p 6 fold into a characteristic helical bundle (RCSB Protein Data Bank entry: 1 NLX, Fedorov et al., 2003, Fig. 1), a structure that is also found in fragments of the Phl p 5 (Rajashankar et al., 2002, Acta Cryst D58: 1175-1181; Maglio et al., 2002,
Protein Engineering 15: 635-642; Wald et al., 2007, Clin. Exp. Allergy 37:441- 450). Die Ähnlichkeit zwischen den Allergenen bewirkt, dass ein Teil der Phl p 5-reaktiven IgE-Antikörper auch an Phl p 6 bindet (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108: 49-54; Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107). Protein Engineering 15: 635-642; Wald et al., 2007, Clin. Exp. Allergy 37: 441-450). The similarity between the allergens causes some of the Phl p 5-reactive IgE antibodies also to bind to Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol., 108: 49-54, Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol., 130: 87-107).
Die Spezifische Immuntherapie (SIT) oder Hyposensibilisierung gilt als wirksamer Ansatz zur therapeutischen Behandlung von Allergien (Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6):336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562; Cox et al., 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 120:S25-85; James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088). Specific immunotherapy (SIT) or hyposensitization is considered to be an effective approach to the therapeutic treatment of allergies (Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin Immunol 102 (4)). : 558-562, Cox et al., 2007, J. Allergy Clin Immunol 120: S25-85, James & Durham, 2008, Clin Exp Allergy 38: 1074-1088).
Die klassische Therapieform der Injektionstherapie (SCIT), bei der dem Patienten natürliche Allergenextrakte in steigenden Dosen subkutan injiziert werden, wird seit etwa 100 Jahren erfolgreich angewendet. Dabei wird das Immunsystem des Allergikers wiederholt mit Allergenen konfrontiert, wodurch eine Umprogrammierung des Immunsystems verbunden mit einer Toleranz gegenüber den Allergenen erzielt wird. Nach der Aufnahme der Antigene aus den Allergenpräparaten durch antigenpräsentierende Zellen, werden Peptide der Antigene auf der Zelloberfläche präsentiert. Einige bestimmte Peptide, die sogenannte T-Zell-Epitope enthalten, werden von antigenspezifischen T- Zellen erkannt. Diese Bindung führt unter anderem zur Ausprägung The classical therapy of injection therapy (SCIT), in which the patient subcutaneously injects natural allergen extracts in increasing doses, has been successfully used for about 100 years. The immune system of the allergic person is repeatedly confronted with allergens, whereby a reprogramming of the immune system associated with a tolerance achieved against the allergens. After uptake of the antigens from the allergen preparations by antigen-presenting cells, peptides of the antigens are presented on the cell surface. Some particular peptides, called T cell epitopes, are recognized by antigen-specific T cells. This bond leads among other things to the expression
verschiedener Typen von T-Zellen mit regulatorischer Funktion. Im Laufe der SIT führt die regulatorische T-Zell-Antwort zu einer Toleranz gegenüber dem Allergen, der Abregulierung von TH2-Zytokinen, der Wiederherstellung des TH1 TH2-Gleichgewichtes, der Suppression von Allergen-spezifischem IgE, der Induktion von lgG4-, lgG1 und IgA-Antikörpem, der Suppression von different types of T cells with regulatory function. In the course of SIT, the regulatory T cell response leads to tolerance to the allergen, down-regulation of T H 2 cytokines, restoration of the TH 1 H 2 balance, suppression of allergen-specific IgE, induction of IgG4 , IgG1 and IgA antibodies, the suppression of
Effektorzellen (Mastzellen, Basophile und Eosinophile) sowie der Erneuerung des entzündeten Gewebes (Akdis et al., 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119 (4):780-789; Lärche et al., 2008, Nature Reviews 6:761-771). Die T-Zell- Epitope sind somit für die therapeutische Wirkung der Allergenpräparate bei der Hyposensibilisierung von entscheidender Bedeutung.  Effector cells (mast cells, basophils and eosinophils) and the renewal of inflamed tissue (Akdis et al., 2007, J. Allergy Clin Immunol 119 (4): 780-789; Lärche et al., 2008, Nature Reviews 6: 761 -771). The T-cell epitopes are thus of crucial importance for the therapeutic effect of the allergen preparations in hyposensitization.
Aufgrund der sowohl auf IgE- als auch auf T-Zell-Ebene vorhandenen Due to the existing at both IgE and T-cell level
Kreuzreaktivität der Majorallergene der Süßgräser ist eine erfolgreiche Cross-reactivity of the major allergens of sweet grasses is a successful one
Therapie mit einem Allergenextrakt einer einzigen repräsentativen Gräser- Spezies meist ausreichend (Mailing et al., 1993, EAACI Position Paper: Therapy with an allergen extract from a single representative grass species is usually sufficient (Mailing et al., 1993, EAACI Position Paper:
Immunotherapy, Allergy 48: 9-35; Cox et al., 2007, J Allergy Clin Immunol 120: 25-85). Immunotherapy, Allergy 48: 9-35; Cox et al., 2007, J Allergy Clin Immunol 120: 25-85).
Neben der subkutanen Immuntherapie kommt eine sublinguale Therapieform, bei der die Allergene oder Allergenderivate über die Mundschleimhaut aufgenommen werden, als Alternative für die Injektionstherapie zur klinischen Erprobung und Anwendung (James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088). Eine weitere Möglichkeit ist die Behandlung mit expressionsfähiger DNA, die für die relevanten Allergene kodiert (immuntherapeutische Vakzinierung). Experimentelle Belege für die allergenspezifische Beeinflussung der Immunantwort wurden an Nagern durch Injektion von allergenkodierender DNA erbracht (Hsu et al. 1996, Nature Medicine 2 (5):540-544, Weiss et al., 2006, Int. Aren. Allergy Immunol. 39: 332-345). Bei all diesen Therapieformen besteht eine grundsätzliche Gefahr von allergischen Reaktionen oder sogar eines anaphylaktischen Schocks (Kleine- Tebbe, 2006, Allergologie, 4:135-156). Um diese Risiken zu minimieren, werden innovative Präparate in Form von Allergoiden eingesetzt. Dabei handelt es sich um chemisch modifizierte Allergenextrakte, die deutlich reduzierte IgE-Reaktivität, jedoch identische T-Zell-Reaktivität im Vergleich zum nicht behandelten Extrakt aufweisen (Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6):336- 339, Kahlert et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol, 120: 146-157). In addition to subcutaneous immunotherapy, a sublingual therapy in which the allergens or allergen derivatives are taken up via the oral mucosa comes as an alternative to injection therapy for clinical testing and application (James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38: 1074-1088). Another possibility is treatment with expressive DNA encoding the relevant allergens (immunotherapeutic vaccination). Experimental evidence for the allergen - specific influence of the Immune responses were provided to rodents by injection of allergen-encoding DNA (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544, Weiss et al., 2006, Int, Aren, Allergy Immunol., 39: 332-345). In all these forms of therapy there is a fundamental risk of allergic reactions or even anaphylactic shock (Kleine- Tebbe, 2006, Allergologie, 4: 135-156). To minimize these risks, innovative preparations in the form of allergoids are used. These are chemically modified allergen extracts which have markedly reduced IgE reactivity but identical T cell reactivity compared to untreated extract (Fiebig 1995 Allergo J. 4 (6): 336-339, Kahlert et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol, 120: 146-157).
Eine Therapieoptimierung ist mit rekombinant hergestellten Allergenen möglich. Definierte, gegebenenfalls auf die individuellen Therapy optimization is possible with recombinant allergens. Defined, if necessary, to the individual
Sensibilisierungsmuster der Patienten abgestimmte Cocktails von hochreinen, rekombinant hergestellten Allergenen könnten Extrakte aus natürlichen Allergenquellen ablösen, da diese außer den verschiedenen Allergenen eine größere Zahl von immunogenen, aber nicht allergenen Begleitproteinen enthalten. Erste klinische Studien mit rekombinanten Allergenen wurden bereits mit Erfolg durchgeführt (Jutel et al., 2005, J. Allergy Clin. Immunol., 116: 608-613; Valenta & Niederberger, 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119: 826-830). Realistische Perspektiven, die zu einer sicheren Hyposensibilisierung mit rekombinanten Expressionsprodukten führen können, bieten gezielt mutierte rekombinante Allergene, bei denen IgE-Epitope verändert werden, ohne die für die Therapie essentiellen T-Zell-Epitope zu beeinträchtigen (Schramm et al. 1999, J. Immunol. 162:2406-2414). Diese hypoallergenen Proteine könnten in höheren Dosen während der SIT eingesetzt werden, ohne dabei die  Sensitization patterns of patient-matched cocktails of high-purity, recombinantly-produced allergens could replace extracts from natural allergen sources, as these contain a larger number of immunogenic but non-allergenic accompanying proteins in addition to the various allergens. Initial clinical trials of recombinant allergens have been successful (Jutel et al., 2005, J. Allergy Clin Immunol., 116: 608-613, Valenta & Niederberger, 2007, J. Allergy Clin Immunol 119: 826- 830). Realistic perspectives, which can lead to a safe hyposensitization with recombinant expression products, provide targeted mutant recombinant allergens in which IgE epitopes are altered without adversely affecting the T-cell epitopes essential for therapy (Schramm et al., 1999, J. Immunol 162: 2406-2414). These hypoallergenic proteins could be used in higher doses during SIT, without the
Wahrscheinlichkeit von unerwünschten IgE-vermittelten Nebenwirkungen zu erhöhen. In der Vergangenheit wurden für viele Aeroallergene (u.a. Pollen- und Increase probability of unwanted IgE-mediated side effects. In the past, many aeroallergens (including pollen and pollen) were used
Hausstaubmilben-Allergene) und Nahrungsmittelallergene solche House dust mite allergens) and food allergens such
„hypoallergenen" Varianten mit erniedrigter IgE-Bindung publiziert. Ausgehend von der DNA unveränderter Allergene konnte unter anderem durch "Hypoallergenic" variants with reduced IgE binding published., Starting from the DNA unchanged allergens could, inter alia, by
Fragmentierung, Oligomerisierung, Deletionen, Punktmutationen oder der Neukombination einzelner Abschnitte eines Allergens (DNA-Shuffling) eine rekombinante DNA hergestellt und exprimiert werden (Ferreira et al., 2006, Inflamm. & Allergy - Drug Targets 5: 5-14; Bhalla & Singh, 2008, Trends in Biotechnology 26:153-161 ; Westritschnig et al., 2007, J. Immunol. 179: 7624- 7634).  Fragmentation, oligomerization, deletions, point mutations, or recombining of individual portions of an allergen (DNA shuffling) to produce and express recombinant DNA (Ferreira et al., 2006, Inflamm. & Allergy - Drug Targets 5: 5-14, Bhalla & Singh , 2008, Trends in Biotechnology 26: 153-161; Westritschnig et al., 2007, J. Immunol. 179: 7624-7634).
Bezüglich der Gruppe 6-Allergene der Gräser ist bisher nur eine einzige Mutationsstrategie publiziert worden, bei der die ersten neunzig Nukleotide, kodierend für die Aminosäuren 1-30 des reifen Phl p 6, deletiert wurden. Das Molekül wurde als Histidin-Fusionsmolekül exprimiert, gereinigt und With regard to the group 6 allergens of grasses, only a single mutation strategy has been published so far, in which the first ninety nucleotides coding for the amino acids 1-30 of the mature Phl p 6 were deleted. The molecule was expressed as a histidine fusion molecule, purified and
hinsichtlich seiner immunologischen Eigenschaften untersucht. Die N- terminale Deletion führte zu verminderter IgE-Bindung und reduzierter examined for its immunological properties. The N-terminal deletion resulted in decreased IgE binding and reduced
Stimulierbarkeit von basophilen Granulozyten (Vrtala et al., 2007, J. Immunol. 179: 1730-1739). In einer späteren Arbeit wurde das gleiche Molekül mit einer rekombinanten Variante des Phl p 2 zu einem Hybridmolekül verbunden (Linhart et al., 2008, Biol. Chem. 389: 925-933). Eine auf Punktmutationen basierende Mutationsstrategie, wie sie für andere Allergene beschrieben wurde, ist bisher für Gräserpollen-Allergene der Gruppe 6 noch nicht publiziert worden. Stimulability of Basophilic Granulocytes (Vrtala et al., 2007, J. Immunol., 179: 1730-1739). In a later work, the same molecule was linked to a recombinant variant of Phl p 2 to form a hybrid molecule (Linhart et al., 2008, Biol. Chem. 389: 925-933). A mutation strategy based on point mutations, as described for other allergens, has not yet been published for group 6 grass pollen allergens.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand nun in der Bereitstellung neuartiger Varianten der Gruppe 6-Allergene der Poaceae auf Protein- und DNA-Ebene, die sich bei weitgehendem Erhalt der T-Zell- Reaktivität durch eine reduzierte IgE-Reaktivität auszeichnen und daher für die kurative und präventive spezifische Immuntherapie sowie die The object of the present invention was based on the provision of novel variants of the group 6 allergens of the Poaceae protein and DNA level, which are characterized by a reduced IgE reactivity largely retained the T-cell reactivity and therefore for the curative and preventive specific immunotherapy as well as the
immuntherapeutische DNA-Vakzinierung geeignet sind. Beschreibung der Erfindung Überraschend wurde gefunden, dass Varianten von Gruppe 6-Allergenen der Familie der Süßgräser (Poaceae), bei denen die Proline, die in einem immunotherapeutic DNA vaccination are suitable. DESCRIPTION OF THE INVENTION Surprisingly, it has been found that variants of group 6 allergens belong to the family of sweet grasses (Poaceae), in which the prolines that are present in a
Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, einzeln oder in Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 correspond, individually or in
Kombinationen mutiert sind, eine gegenüber den Wildtyp-Allergenen verringerte IgE-Reaktivität und gleichzeitig eine weitgehend erhaltene Combinations are mutated, compared to the wild-type allergens decreased IgE reactivity and at the same time a largely preserved
Reaktivität mit T-Lymphozyten aufweisen und damit hypoallergen sind. Reactivity with T lymphocytes and are therefore hypoallergenic.
Gegenstand der Erfindung sind demgemäß hypoallergene Varianten von Gruppe 6-Allergenen der Familie der Süßgräser (Poaceae), bei denen die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, einzeln oder in Kombinationen mutiert sind. Accordingly, the invention relates to hypoallergenic variants of group 6 allergens of the grasshopper family (Poaceae) in which the prolines corresponding in alignment to the prolongs of positions 29, 30, 57, 79 in the amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 , mutated individually or in combinations.
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Allergenvarianten, dadurch gekennzeichnet, dass die Proline deletiert oder substituiert sind. Particularly preferred are allergen variants according to the invention, characterized in that the prolines are deleted or substituted.
Bevorzugt sind erfindungsgemäße, hypoallergene Varianten von Gruppe 6- Allergenen aus der Unterfamilie der Pooideae, bevorzugt aus den Gruppen Poodae und Triticodae, bevorzugt vertreten durch Phleum pratense, Holcus lanatus, Phalaris aquatica, Anthoxanthum odoratum, Dactylis glomerata,Preference is given to hypoallergenic variants according to the invention of group 6 allergens from the subfamily Pooideae, preferably from the groups Poodae and Triticodae, preferably represented by Phleum pratense, Holcus lanatus, Phalaris aquatica, Anthoxanthum odoratum, Dactylis glomerata,
Lolium perenne, Poa pratensis, Festuca pratensis, Hordeum vulgare, Seeale cereale und Triticum aestivum. Bevorzugt handelt es sich um Lolium perenne, Poa pratensis, Festuca pratensis, Hordeum vulgare, Seeale cereale and Triticum aestivum. It is preferable
erfindungsgemäße, hypoallergene Varianten von Tri a 6, See c 6 und Hör v 6 aus Triticum aestivum, Seeale cereale und Hordeum vulgare. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße, hypoallergene Varianten von Gruppe 6- Allergenen der Poodae. Vorzugsweise sind diese Gruppe 5-Allergene Phl p 6, Poa p 6, Hol p 6, Lol p 6 und Pha a 6 aus Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Holcus lanatus und Phalaris aquatica und ganz besonders bevorzugt sind Poa p 6 und Phl p 6, insbesondere Phl p 6. Erfindungsgemäß sind auch alle natürlich vorkommenden Isomere, Polymorphe und Varianten der vorgenannten Allergene, sowie deren Vorläufer-Proteine. hypoallergenic variants of tri a 6, lake c 6 and hearing v 6 according to the invention from Triticum aestivum, Seeale cereale and Hordeum vulgare. Particular preference is given to hypoallergenic variants of group 6 allergens of the Poodae according to the invention. Preferably, these groups are 5-allergens Phl p 6, Poa p 6, Hol p 6, Lol p 6 and Pha a 6 from Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Holcus lanatus and Phalaris aquatica and very particularly preferred are Poa p 6 and Phl p 6, in particular Phl p 6. According to the invention are also all naturally occurring isomers, polymorphs and variants of the aforementioned allergens, and their precursor proteins.
Bevorzugt sind bei den erfindungsgemäßen, hypoallergenen Varianten die Proline mutiert, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Aminosäuresequenz des reifen Phl p 6.0101 oder dessen Varianten (SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8) oder des reifen Phl p 6.0102 (SEQ ID NO:2), besonders bevorzugt des reifen Phl p 6.0102, entsprechen. Preferably, in the case of the hypoallergenic variants according to the invention, the prolines are mutated which, in an alignment, correspond to the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the amino acid sequence of the mature Phl p 6.0101 or its variants (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8) or the mature Phl p 6.0102 (SEQ ID NO: 2), more preferably the mature Phl p 6.0102.
Obwohl bekannt war, dass Proline einen Einfluss auf die Proteinstruktur ausüben können, wurden gezielte Punktmutationen von Prolinresten als Ansatzpunkt für die Generation hypoallergener Mutanten von Allergenen lediglich bei dem Gruppe 2 Hauptallergen der Hausstaubmilbe Although it was known that proline could exert an influence on the protein structure, targeted point mutations of proline residues were the starting point for the generation of hypoallergenic mutants of allergens only in the group 2 main allergens of house dust mite
Dermatophaogides farinae (Der f 2, Austausch von Prolinresten durch Alanin) untersucht (Takai et al., 2000, Eur. J. Biochem. 267: 6650-6656). Die IgE- Bindungsfähigkeit und Fähigkeit zur Stimulierung von basophilen Zellen war jedoch bei drei Punktmutanten nur leicht reduziert, während die übrigen drei sich wie das unveränderte Allergen verhielten. Die Prolinmutationen zeigten somit bei Der f 2 keine oder eine nur sehr schwache Reduktion der  Dermatophaogides farinae (Der f 2, replacement of proline residues by alanine) (Takai et al., 2000, Eur. J. Biochem. 267: 6650-6656). However, the IgE-binding ability and ability to stimulate basophilic cells was only slightly reduced in three point mutants, while the remaining three behaved like the unchanged allergen. The proline mutations thus showed no or only a very slight reduction in Der f 2
Allergenität. Weitere Strategien zur Herstellung hypoallergener Mutanten durch Prolin-Austausch-Mutationen sind nicht publiziert. Somit war für den Fachmann nicht zu erwarten, dass Prolinmutationen als Ansatzpunkt für die Generation hypoallergener Mutanten von Allergenen erfolgreich sein würden. Allergenicity. Other strategies for the production of hypoallergenic mutants by proline exchange mutations have not been published. Thus, it was not expected for the skilled person that proline mutations would be successful as a starting point for the generation of hypoallergenic mutants of allergens.
Überdies wurde bisher für kein Allergen untersucht, wie sich eine spezifische Deletion von Prolinresten auf die Gesamt-lgE-Bindungsfähigkeit des Moreover, no allergen has yet been tested for how a specific deletion of proline residues affects the overall IgE binding ability of the protein
Expressionsprodukts auswirkt und welche Auswirkungen auf die Aktivierung von Allergie-relevanten Effektorzellen erfolgen. Die Aminosäuresequenzen des reifen Phl p 6 beziehungsweise der zwei Isoformen (Phl p 6.0101 , GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215; Phl p 6.0102, GenBank: Y16955, UniProt: 065868) haben 7 Prolinreste (Abb. 1). Die Proline der Aminosäurepositionen 29, 30, 57, 79 und 101 liegen direkt am Beginn oder am Ende von -Helices und sind an der Ausbildung der Expression product and what effects on the activation of allergy-relevant effector cells. The amino acid sequences of the mature Phl p 6 or the two isoforms (Phl p 6.0101, GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215, Phl p 6.0102, GenBank: Y16955, UniProt: 065868) have 7 proline residues (Figure 1). The proline amino acid positions 29, 30, 57, 79, and 101 are directly at the beginning or end of helices and are involved in the formation of the
Proteinoberfläche beteiligt (Abb. 2). Der Prolinrest an Position 61 ist Bestanteil der dritten Helix während Prolin 108 nahe am C-Terminus lokalisiert ist.  Protein surface involved (Figure 2). The proline residue at position 61 is part of the third helix while proline 108 is located near the C terminus.
Ausgehend von den Aminosäuresequenzen der Phl p 6-lsoformen Phl p 6.0101 (SEQ ID NO:4) und Phl p 6.0102 (SEQ ID NO 2) werden das rekombinante nicht modifizierte Wildtyp-Allergen (rPhl p 6 wt; Abb. 4) sowie die gentechnisch veränderten, erfindungsgemäßen Varianten hergestellt. Analog zum nachfolgend dargestellten Herstellungsverfahren lassen sich auch die Wildtyp-Proteine und die erfindungsgemäßen, hypoallergenen Varianten der weiteren erfindungsgemäßen Gruppe 6-Allergene der Süßgräser, beispielsweise Poa p 6 herstellen. Dazu werden die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Starting from the amino acid sequences of the Phl p 6 isoforms Phl p 6.0101 (SEQ ID NO: 4) and Phl p 6.0102 (SEQ ID NO 2), the recombinant unmodified wild-type allergen (rPhl p 6 wt, FIG genetically modified variants of the invention produced. The wild-type proteins and the hypoallergenic variants according to the invention of the further group 6 allergens of sweet grasses according to the invention, for example Poa p 6, can be prepared analogously to the preparation process shown below. These are the Proline, which in an alignment the Prolinen of the positions 29, 30, 57, 79 in the
Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, einzeln oder in Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 correspond, individually or in
Kombinationen mutiert, bevorzugt durch Substitution oder Deletion. Combinations are mutated, preferably by substitution or deletion.
Es bietet sich an, die erfindungsgemäßen Allergenvarianten, ausgehend von der klonierten DNA-Sequenz mit Hilfe gentechnischer Methoden herzustellen. Erfindungsgemäße Herstellungsverfahren sind dem Fachmann aus It is advisable to prepare the allergen variants according to the invention, starting from the cloned DNA sequence by means of genetic engineering methods. Inventive production methods are the expert from
einschlägigen Laborvorschriften und Publikationen bekannt wie relevant laboratory regulations and publications known as
beispielsweise: E.F. Fritsch, J. Sambrook, T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. for example: E.F. Fritsch, J. Sambrook, T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Naturgemäß sind über die beschriebenen Variationen von Gruppe 6- Allergenen hinaus auch weitere Veränderungen an anderen Positionen - etwa zur Erhöhung der Hypoallergenität - möglich. Bei diesen Modifikationen kann es sich beispielsweise um Aminosäure-Insertionen, -Deletionen, -Austausche und Aufspaltungen des Proteins in Fragmente sowie Fusionen des Proteins oder seiner Fragmente mit anderen Proteinen oder Peptiden handeln, sowie Multimere durch Fusionen gleicher Proteine oder Fragmente. Of course, in addition to the described variations of group 6 allergens, other changes in other positions - such as to increase hypoallergenicity - are possible. These modifications may include, for example, amino acid insertions, deletions, exchanges, and protein breakdown into fragments, as well as protein fusions or its fragments with other proteins or peptides, as well as multimers by fusions of the same proteins or fragments.
Erfindungsgemäße Fragmente umfassen vorzugsweise 20-109 Aminosäuren, bevorzugt 30-100 Aminosäuren, besonders bevorzugt 40-90 Aminosäuren. Erfindungemäße Varianten umfassen überdies Vorläuferproteine wie beispielsweise ProPhl p 6 mit einer vorgeschalteten, natürlichen oder künstlichen Signalsequenz wie beispielsweise in den Abbildungen 18, 19 und 20 (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10) dargestellt. Fragments of the invention preferably comprise 20-109 amino acids, preferably 30-100 amino acids, more preferably 40-90 amino acids. Variants according to the invention additionally comprise precursor proteins such as, for example, ProPhl p 6 with an upstream, natural or artificial signal sequence, as shown, for example, in FIGS. 18, 19 and 20 (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10).
Erfindungsgemäß sind außerdem Fusionsproteine mit N- oder C-terminalen Fusions-Tags (z.B. His-Tag wie in Abb. 5 und 6, MBP-Tag, According to the invention, fusion proteins with N- or C-terminal fusion tags (for example His tag as in FIGS. 5 and 6, MBP tag,
Expressionskontrollsequenzen etc.), Hybridmoleküle wie beispielsweise Fusionen mit anderen Allergenen oder ihren hypoallergenen Varianten oder Fusionen von Fragmenten in beliebiger Reihenfolge. Überdies umfassen die erfindungsgemäßen Varianten auch homologe Sequenzen (Polymorphien (SNPs), Isoformen) mit einer Identität der Aminosäuresequenz von Expression control sequences, etc.), hybrid molecules such as, for example, fusions with other allergens or their hypoallergenic variants, or fusions of fragments in any order. Moreover, the variants according to the invention also include homologous sequences (polymorphisms (SNPs), isoforms) with an identity of the amino acid sequence of
wenigstens 80% zum betreffenden Gruppe 6-Wildtyp-Allergen, bevorzugt von wenigstens 90% zum betreffenden Gruppe 6-Wildtyp-Allergen, besonders bevorzugt von wenigstens 95% zum betreffenden Gruppe 6-Wildtyp-Allergen. Bevorzugt werden bei diesen Varianten eine oder wenige Aminosäuren konservativ ausgetauscht, beispielweise eine polare Aminosäure durch eine andere polare Aminosäure oder eine neutrale durch eine andere neutrale substituiert, jedoch sind auch Varianten durch nicht-konservativen Austausch erfindungsgemäß. Multimere umfassen bevorzugt Dimere oder Trimere der erfindungsgemäßen hypoallergenen Varianten verbunden durch eine at least 80% to the respective group 6 wild-type allergen, preferably of at least 90% to the respective group 6 wild-type allergen, more preferably of at least 95% to the respective group 6 wild-type allergen. Preferably, in these variants, one or a few amino acids are exchanged conservatively, for example a polar amino acid is substituted by another polar amino acid or a neutral by another neutral, but variants by non-conservative substitution are also inventive. Multimers preferably comprise dimers or trimers of the hypoallergenic variants of the invention joined by a
Linkersequenz oder direkt fusioniert.  Linker sequence or directly fused.
Beispiele solcher Varianten sind die Varianten von Phl p 6.0101 gemäß den Abbildungen 17 und 18 (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 8), bei denen einzelne für die erfindungsgemäße Wirkung nicht relevante Aminosäuren ausgetauscht sind, beziehungsweise am N-Terminus drei Aminosäuren fehlen, Examples of such variants are the variants of Phl p 6.0101 according to FIGS. 17 and 18 (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) in which individual amino acids which are not relevant for the effect according to the invention are exchanged, or three amino acids at the N-terminus absence,
beziehungsweise deren Vorläufersequenzen mit Signalpeptiden am N- Terminus und dergleichen. Weitere Beispiele für erfindungsgemäße Variaten sind polymorphe Varianten wie beispielsweise die beiden Isomere Phl p 6.0101 und Phl p 6.0102 selbst und weitere Varianten mit Austauschen einer oder mehrer Aminosäuren, Fehlen einer oder mehrer Aminosäuren am N- und/oder C-Terminus oder mit entsprechenden Deletionslücken innerhalb der Aminosäurensequenz. Ebenso erfindungsgemäß sind Varianten mit or their precursor sequences with signal peptides at the N Term and the like. Further examples of variants according to the invention are polymorphic variants such as, for example, the two isomers Phl p 6.0101 and Phl p 6.0102 itself and further variants with replacement of one or more amino acids, absence of one or more amino acids at the N- and / or C-terminus or with corresponding deletion gaps within the amino acid sequence. Likewise according to the invention are variants with
Insertionen einzelner oder mehrer Aminosäuren vereinzelt in verschiedenen Positionen oder als Gruppe in einer Position innerhalb der Insertions of single or multiple amino acids isolated in different positions or as a group in a position within the
Aminosäuresequenz oder am N- und/oder C-Terminus. Amino acid sequence or at the N and / or C-terminus.
Erfindungsgemäßer Gegenstand sind somit auch hypoallergene Varianten von Gruppe 6-Allergenen der Süßgräser (Poaceae), dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Fragment oder eine Variante einer erfindungsgemäßen, hypoallergenen Variante, oder um ein Multimer einer oder mehrerer erfindungsgemäßer, hypoallergener Varianten handelt oder dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere erfindungsgemäße, hypoallergene Varianten oder deren Fragmente, Varianten oder Multimere Bestandteil eines rekombinanten Fusionsproteins sind. Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein DNA-Molekül, das für eine erfindungsgemäße, hypoallergene Variante kodiert. The subject of the invention are thus also hypoallergenic variants of group 6 allergens of grasses (Poaceae), characterized in that it is a fragment or variant of a hypoallergenic variant according to the invention, or a multimer of one or more inventive, hypoallergenic variants or by in that one or more hypoallergenic variants according to the invention or their fragments, variants or multimers are constituents of a recombinant fusion protein. The invention also relates to a DNA molecule coding for a hypoallergenic variant according to the invention.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein rekombinanter Another object of the invention is a recombinant
Expressionsvektor, enthaltend ein solches erfmdungsgemäßes DNA-Molekül funktionell verbunden mit einer Expressions-Kontrollsequenz. Unter einer Expressions-Kontrollsequenz versteht man beispielsweise einen Promotor oder einen Sequenzabschnitt mithilfe dessen die Expression des Zielproteins beeinflusst wird und der in funktioneller Verbindung zum Zielgen steht, jedoch nicht zwangsläufig dem Zielgen in direkter Nachbarschaft lokalisiert sein muss. Ein erfindungsgemäßer Gegenstand ist auch ein nicht-menschlicher Expression vector containing such erfmdungsgemäßes DNA molecule operably linked to an expression control sequence. By expression control sequence is meant, for example, a promoter or a sequence segment by means of which the expression of the target protein is influenced and which is functionally connected to the target gene, but does not necessarily have to be located directly adjacent to the target gene. An article according to the invention is also a non-human one
Wirtsorganismus, transformiert mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül oder einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor. Ein erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen, hypoallergenen Variante durch Kultivierung eines erfindungsgemäßen nicht-menschlichen Wirtsorganismus und Gewinnung der entsprechenden Allergenvariante aus der Kultur. Geeignete nicht-menschliche Wirtsorganismen können pro- oder Host organism transformed with a DNA molecule of the invention or an expression vector of the invention. An article according to the invention is a process for producing a hypoallergenic variant according to the invention by culturing a non-human host organism according to the invention and recovering the corresponding allergen variant from the culture. Suitable non-human host organisms may be pro- or
eukaryontische, ein- oder mehrzellige Organismen wie Bakterien oder Hefen sein. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Wirtsorganismus ist E. coli. eukaryotic, single or multicellular organisms such as bacteria or yeasts. A preferred host organism according to the invention is E. coli.
Der Einfluss der Deletion einzelner oder zweier eng benachbarter Proline auf die IgE-Bindungsfähigkeit des Phl p 6 kann durch Deletion der Proline 29 + 30 von Prolin 57, von Prolin 79 und von Prolin 101 untersucht werden. Diese Proline sind im Phl p 6-Wildtypprotein in den Schleifenregionen am Beginn oder am Ende von α-Helices lokalisiert (Abb. 1 ; Abb. 2). Vorzugsweise werden Prolin 61 und Prolin 108 nicht verändert, da entsprechende Varianten keine signifikante Wirksamkeit zeigen. Analog dazu kann der Einfluss von The effect of the deletion of single or two closely spaced proline on the IgE-binding ability of Phl p 6 can be examined by deleting the proline 29 + 30 from proline 57, from proline 79 and from proline 101. These prolines are localized in the Phl p 6 wild-type protein in the loop regions at the beginning or end of α helices (Figure 1, Figure 2). Preferably, proline 61 and proline 108 are not changed since corresponding variants show no significant activity. Similarly, the influence of
Prolinmutationen in den entsprechenden homologen Positionen der weiteren erfindungsgemäßen Gruppe 6-Allergene der Süßgräser, beispielsweise Poa p 6 auf die IgE-Bindungsfähigkeit hin untersucht werden. Zu schnelleren aus ausbeutereichen Aufreinigung wird die kodierende DNA für diese Untersuchungen mit einer Sequenz kodierend für einen N-terminalen Hexa-Histidin-Fusionsanteil (+ 6His) versehen (Abb. 5, SEQ ID NO.5; Abb. 6, SEQ ID NO:6). Die Tag-freien, für pharmazeutische Zwecke einsetzbaren, erfindungsgemäßen Varianten und Wildtypproteine werden ebenfalls nach Standardmethoden gereinigt und bestätigen die Ergebnisse der His-tag Proteine. Dementsprechend werden beispielsweise Sequenzen kodierend für die Proteine rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His, rPhl p 6 d[P79] + 6His und rPhl p 6 d[P101] + 6His hergestellt. Die Sequenzen können in allen bekannten eukaryontischen und prokaryontischen Expressionssystemen, vorzugweise in E, coli exprimiert werden. Im Anschluss werden die Proteine als lösliche Monomere über Standardmethoden gereinigt. Schließlich kann Reinheit durch Analyse in einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel (SDS- PAGE) überprüft werden (Abb. 7). Die analytische Gelfiltration (SEC) mit Kopplung eines Refraktometers (Rl- Detektor) und eines Mehrwinkellichtstreu-Detektors (MALS-Detektor) erlaubt die Online-Bestimmung der Molekülmasse der eluierten Proteine Proline mutations in the corresponding homologous positions of the other group 6 allergens of the sweet grasses according to the invention, for example Poa p 6 on the IgE binding ability are examined out. For faster purification from high-yield purification, the coding DNA for these investigations is provided with a sequence coding for an N-terminal hexa-histidine fusion fraction (+ 6His) (FIG. 5, SEQ ID NO. 5, FIG. 6). The tag-free, usable for pharmaceutical purposes, variants of the invention and wild-type proteins are also purified by standard methods and confirm the results of His-tag proteins. Accordingly, for example, sequences coding for the proteins rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His, rPhl p 6 d [P79] + 6His and rPhl p 6 d [P101] + 6His are prepared , The sequences can be expressed in all known eukaryotic and prokaryotic expression systems, preferably in E. coli. Subsequently, the proteins are purified as soluble monomers by standard methods. Finally, purity can be checked by analysis in a denaturing polyacrylamide gel (SDS-PAGE) (Figure 7). Analytical gel filtration (SEC) coupled with a refractometer (RI detector) and a multi-angle light scattering detector (MALS detector) allows the on-line determination of the molecular weight of the eluted proteins
(SEC/MALS/RI-Methode). So zeigt die Analyse von rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His, rPhl p 6 d[P79] + 6His und rPhl p 6 d[P101] + 6His durch SEC/MALS/RI, dass diese erfindungsgemäßen Varianten in Lösung als reine Monomere vorliegen (Abb. 8, Tab. 1). Die IgE-Bindungsfähigkeit der erfindungsgemäßen, rekombinanten Varianten kann durch ein Verfahren bestimmt, bei dem die Proteine an einer (SEC / MALS / RI method). Thus, the analysis of rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His, rPhl p 6 d [P79] + 6His and rPhl p 6 d [P101] + 6His by SEC / MALS / RI, that these variants according to the invention are in solution as pure monomers (FIG. 8, Tab. 1). The IgE-binding ability of the recombinant variants according to the invention can be determined by a method in which the proteins on a
Nitrozellulose-Membran immobilisiert und mit IgE-Antikörpern von Nitrocellulose membrane immobilized and labeled with IgE antibodies
individuellen Seren von klinisch definierten Gräserpollenallergikern konfrontiert werden (Streifentest). Die Allergenvarianten/ Antikörperkomplexe werden anschließend durch enzymatische Reaktion gefärbt (Abb. 9). individual sera from clinically defined grass pollen allergy sufferers (strip test). The allergen variants / antibody complexes are then stained by enzymatic reaction (Figure 9).
In diesem Verfahren zeigt die Mutante rPhl p 6 d[P101] + 6His mit allen getesteten Seren eine ähnlich gute IgE-Bindung wie das unveränderte In this procedure, the mutant rPhl p 6 d [P101] + 6His shows similar IgE binding to all sera tested as the unaltered one
Allergen (Abb. 9). Daraus folgt, dass eine Deletion von Prolin 101 keinen wesentlichen Einfluss auf die IgE-Bindungsfähigkeit des Phl p 6 hat. Die IgE- Bindung der Mutanten rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His und rPhl p 6 d[P79] + 6His ist bei den Seren verschiedener Gräserpollen-Allergiker unterschiedlich stark ausgeprägt. Dies beruht auf Variationen in der Allergen (Fig. 9). It follows that a deletion of proline 101 has no significant effect on the IgE binding ability of Phl p 6. The IgE binding of the mutants rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His and rPhl p 6 d [P79] + 6His is present in the sera of various grass pollen allergy sufferers different degrees pronounced. This is due to variations in the
Zusammensetzung der IgE-Population einzelner Allergiker hinsichtlich Affinität und Epitop-Spezifität der IgE-Antikörper. Die Mutanten rPhl p 6 d[P57] + 6His und rPhl p 6 d[P79] + 6His zeigen im Vergleich zu dem nicht modifizierten rPhl p 6 wt + 6His mit den meisten Seren eine deutlich reduzierte IgE-Reaktivität. Die niedrigste IgE-Bindung wird jedoch durchgängig bei der Mutante rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His festgestellt (Abb. 9). Composition of the IgE population of individual allergic individuals with regard to affinity and epitope specificity of the IgE antibodies. The mutants rPhl p 6 d [P57] + 6His and rPhl p 6 d [P79] + 6His show markedly reduced IgE reactivity with most sera compared to the unmodified rPhl p 6 wt + 6His. However, the lowest IgE binding is consistently found in the mutant rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His (Figure 9).
Die erfindungsgemäßen, rekombinanten Varianten können überdies The recombinant variants according to the invention can moreover
hinsichtlich ihrer Bindungsfähigkeit an humane IgE-Antikörper durch IgE- Inhibitionstests (EAST) untersucht werden. Bei diesem Verfahren kann die Allergen/lgE-Interaktion in Lösung untersucht werden, womit störende for their binding ability to human IgE antibodies by IgE inhibition tests (EAST). In this procedure, the allergen / IgE interaction in solution can be studied, bringing disturbing
Maskierungen von Epitopen der Testsubstanz, etwa durch Immobilisierung an eine Membran, ausgeschlossen werden können. Masking of epitopes of the test substance, as by immobilization to a membrane, can be excluded.
Im vorliegenden Beispiel werden zwei Seren von Gräserpollen-Allergikern ausgewählt, die sich im Streifentest-Verfahren durch ihre IgE-Bindung an die Mutante rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His deutlich unterschieden. Das Serum P32 repräsentiert die Gruppe von Seren, die im Streifentes.t eine noch In the present example, two sera from grass pollen allergy sufferers are selected, which clearly differed in the strip test procedure by their IgE binding to the mutant rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His. The serum P32 represents the group of sera remaining in the stripe
nachweisbare IgE-Bindung an rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His zeigen (Gruppe„A"), während das Serum P82 als Vertreter der Gruppe der Seren (Gruppe„B") mit nicht mehr nachweisbarer Reaktivität ausgewählt wird (Abb. 9, Abb. 14). detectable IgE binding to rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His (group "A"), while serum P82 is selected as representative of the group of sera (group "B") with undetectable reactivity (Fig. 9, Fig. 14).
Mit diesem Testverfahren kann in Übereinstimmung zu den Ergebnissen des Streifentests die verringerte IgE-Bindungsfähigkeit der Mutanten rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His und rPhl p 6 d[P79] + 6His im In accordance with the results of the streak test, this test procedure allows the reduced IgE-binding ability of the mutants rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His and rPhl p 6 d [P79] + 6His im
Vergleich zu dem nicht modifizierten rPhl p 6 wt + 6His bestätigt werden (Abb. 10). Die Ergebnisse des Streifentest-Verfahrens sind somit nicht auf eine partielle Verdeckung von IgE-Epitopen zurückzuführen, sondern spiegeln die verminderte IgE-Bindungsfähigkeit gelöster Proteine korrekt wieder. Die Mutante rPhl p 6 d[P101] + 6His zeigt unter Einsatz des Serums P32 in dem kompletten Konzentrationsbereich eine IgE-Bindungsfähigkeit, die der des Wildtyp-Allergens entspricht (Abb. 10). Bei Einsatz des Serums P82 wird nur bei niedrigen Proteinkonzentrationen eine geringere IgE-Bindung festgestellt, während bei hohen Konzentrationen die IgE-Bindung wieder der des Wildtyp-Allergens entspricht (Abb. 10). Compared to the unmodified rPhl p 6 wt + 6His (FIG. 10). The results of the strip test method are therefore not due to a partial occlusion of IgE epitopes, but correctly reflect the reduced IgE binding capacity of dissolved proteins. Using the serum P32, the mutant rPhl p 6 d [P101] + 6His shows an IgE binding capacity that corresponds to that of the wild-type allergen over the complete concentration range (Figure 10). When serum P82 is used, IgE binding is found to be lower only at low protein concentrations, whereas at high concentrations, IgE binding is again comparable to that of the wild-type allergen (Figure 10).
Eine Reduktion der IgE-Bindungsfähigkeit des Phl p 6 ist somit prinzipiell auch durch Deletion des Prolinrestes 101 möglich, doch ist dieser Effekt scheinbar so gering, dass er im Streifentest-Verfahren überhaupt nicht und durch IgE- Inhibitionstest nur bei geringen Konzentrationen nachweisbar ist (Abb. 9, Abb. 10). Die verringerte IgE-Bindungsfähigkeit der Mutanten rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His und rPhl p 6 d[P79] + 6His ist hingegen im Streifentest- Verfahren mit der Mehrheit der Allergiker-Seren leicht nachweisbar und bei den IgE-lnhibitionstests in dem gesamten untersuchten Konzentrationsbereich gegeben (Abb. 9, Abb. 10). A reduction of the IgE-binding ability of Phl p 6 is thus in principle also possible by deletion of proline residue 101, but this effect is apparently so small that it can not be detected at all in the strip test method and only at low concentrations by IgE inhibition test (FIG 9, Fig. 10). The reduced IgE-binding capacity of the mutants rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His and rPhl p 6 d [P79] + 6His, on the other hand, is in the stripe test procedure with the majority of allergy sufferers. Sera are easily detectable and given in the IgE inhibition tests throughout the concentration range examined (Figure 9, Figure 10).
Dies beweist grundsätzlich, dass die Deletion von Prolinresten der Gruppe 6- Allergene die IgE-Bindungsfähigkeit reduzieren kann. Andererseits hat nur die Deletion bestimmter Proline eine relevant erniedrigte IgE-Bindung zur Folge. Mittels eines Tests mit basophilen Granulozyten eines klinisch definierten Gräserpollen-Allergikers kann die Auswirkung der reduzierten IgE- Bindungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Varianten auf die Aktivierung von humanen Effektorzellen in vitro untersucht werden. Die in dem Test eingesetzten Granulozyten werden aus dem Vollblut eines Allergikers, im vorliegenden Bespiel des Allergikers P21 gewonnen. Dieser Allergiker repräsentiert solche Allergiker, deren IgE-Antikörper im Streifentest- Verfahren eine nachweisbare Bindung an rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His zeigen (Gruppe ,A"; Abb. 9, 14). This basically proves that the deletion of proline residues of the group 6 allergens can reduce the IgE binding ability. On the other hand, only the deletion of certain prolines results in a significantly reduced IgE binding. By means of a test with basophilic granulocytes of a clinically defined grass pollen allergy, the effect of the reduced IgE binding ability of the variants according to the invention on the activation of human effector cells in vitro can be investigated. The granulocytes used in the test are obtained from the whole blood of an allergic person, in the present example of the allergic P21. This allergic person represents those allergic persons whose IgE antibodies are in the strip test. Show a detectable binding to rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His (group, A "; Fig. 9, 14).
Bei gleicher Konzentration des rekombinanten Wildtyp-Allergens und der erfindungsgemäßen Varianten rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His, und Phl p 6 d[P79] + 6His rPhl p 6 d[P29, 30]+ 6His zeigen die erfindungsgemäßen Varianten eine geringere Bindung an At the same concentration of the recombinant wild-type allergen and the variants according to the invention rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His, and Phl p 6 d [P79] + 6His rPhl p 6 d [P29 , 30] + 6His show the variants according to the invention a lower binding
membrangebundene IgE-Antikörper und daraus resultierend eine drastisch verminderte Aktivierung von basophilen Granulozyten (Abb. 11). membrane-bound IgE antibodies resulting in a drastically reduced activation of basophilic granulocytes (Figure 11).
Die Ergebnisse beweisen somit eine funktionell reduzierte Allergenität der Mutanten rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His und rPhl p 6 d[P79] + 6His. Somit kann mit diesem Test bestätigt werden, dass The results thus demonstrate a functionally reduced allergenicity of the mutants rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His and rPhl p 6 d [P79] + 6His. Thus, this test can confirm that
Prolinmutationen auch in diesen beiden Regionen des Phl p 6 zumindest bei einem Teil von Allergikern die IgE-Bindungsfähigkeit senkt. Proline mutations also in these two regions of Phl p 6 lowers the IgE binding ability of at least a part of allergy sufferers.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Another object of the present invention are therefore
hypoallergene Varianten von Gruppe 6-Allergenen der Familie der Süßgräser {Poaceae), bei denen die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, einzeln mutiert sind. hypoallergenic variants of group 6 allergens of the sweet grasses family (Poaceae), in which the prolines which correspond in an alignment to the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are individually mutated.
Ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind hypoallergene Varianten von Phl p 6 oder Poa p 6, bei denen die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der A preferred subject of the present invention are hypoallergenic variants of Phl p 6 or Poa p 6, in which the prolines, which in an alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, einzeln mutiert sind.  Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are individually mutated.
Ein besonders bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind hypoallergene Varianten von Phl p 6, bei denen die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der A particularly preferred subject of the present invention are hypoallergenic variants of Phl p 6, in which the prolines, which in an alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, einzeln mutiert sind. Besonders bevorzugt sind hypoallergene Varianten von Gruppe 6-Allergenen der Familie der Süßgräser (Poaceae), bei denen die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are individually mutated. Particular preference is given to hypoallergenic variants of group 6 allergens of the grasshopper family (Poaceae), in which the prolines which are aligned with the prolongs of positions 29, 30, 57, 79 in the
Aminosäuresequenz des reifen Phl p 6.0102 (SEQ ID NO:2) entsprechen, mutiert entfernt sind. Amino acid sequence of the mature Phl p 6.0102 (SEQ ID NO: 2) correspond mutated are removed.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind erfindungsgemäße, hypoallergene Varianten von Gruppe 6-Allergenen der Familie der Süßgräser (Poaceae), bei denen die Proline, die in einem Another preferred subject matter of the present invention are hypoallergenic variants of group 6 allergens of the grass family (Poaceae) according to the invention, in which the prolines which are present in a
Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, einzeln entfernt sind.  Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are individually removed.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind außerdem erfindungsgemäße, hypoallergene Varianten von Gruppe 6-Allergenen der Familie der Süßgräser (Poaceae), bei denen die Proline, die in einem Another object of the present invention are also inventive, hypoallergenic variants of group 6 allergens of the family of sweet grasses (Poaceae), in which the prolines, which in a
Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, einzeln substituiert sind. Hier wird Prolin beispielhaft durch Leucin (L) ausgetauscht. Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are individually substituted. Here proline is exemplarily replaced by leucine (L).
Erfindungsgemäß können jedoch die erfindungsgemäßen Proline durch jede Aminosäure ausgetauscht sein. According to the invention, however, the prolines of the invention may be replaced by any amino acid.
Erfindungsgemäß sind insbesondere die hypoallergenen Varianten rPhl p 6 d[P29], rPhl p 6 d[P30], rPhl p 6 d[P29, 30], rPhl p 6 d[P57], rPhl p 6 d[P79], rPhl p 6 P29L, rPhl p 6 P30L. rPhl p 6 P29L, P30L, rPhl p 6 P57L und rPhl p 6 P79L und dergleichen einschließlich aller nachfolgend beschriebenen, erfindungsgemäßen, hypoallergenen Varianten, wobei die Nummerierung der Sequenz des Phl p 6, insbesondere des reifen Phl p 6.0102 folgt. In particular, according to the invention, the hypoallergenic variants rPhl p 6 d [P29], rPhl p 6 d [P30], rPhl p 6 d [P29, 30], rPhl p 6 d [P57], rPhl p 6 d [P79], rPhl p 6 P29L, rPhl p 6 P30L. rPhl p 6 P29L, P30L, rPhl p 6 P57L and rPhl p 6 P79L and the like, including all the hypoallergenic variants of the invention described below, the numbering of which follows the sequence of Phl p 6, in particular mature Phl p 6.0102.
Weiterhin sind diese Beispiele nicht auf Varianten des Phl p 6 beschränkt sondern betreffen auch insbesondere Poa p 6 und die Gruppe 6-Allergene aller übrigen Süßgräser. Darüber hinaus kann die noch nachweisbare IgE-Bindungsfähigkeit der erfindungsgemäßen, hypoallergenen Varianten der Gruppe 6-Allergene durch Kombination von Prolinmutationen weiter reduziert werden. So werden aufgrund der stark verminderten IgE-Bindung der Mutante rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His und die Tatsache, dass auch durch die Deletion der Proline 57 und 79 die IgE-Bindungsfähigkeit partiell erniedrigt werden kann, Nukleinsäuren erzeugt, die die Mutationen in Kombinationen enthalten. Basierend auf der DNA der Mutante rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His werden die Proline der Positionen 57 und 79 entweder deletiert oder in die Aminosäure Leucin umgewandelt. Furthermore, these examples are not limited to variants of Phl p 6 but also relate in particular Poa p 6 and the group 6 allergens of all other grasses. In addition, the still detectable IgE-binding ability of the hypoallergenic variants of the group 6 allergens according to the invention can be further reduced by combining proline mutations. Thus, due to the greatly reduced IgE binding of the mutant rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His and the fact that the deletion of proline 57 and 79, the IgE binding ability can be partially lowered, produces nucleic acids that the Contain mutations in combinations. Based on the DNA of the mutant rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, the prolines of positions 57 and 79 are either deleted or converted into the amino acid leucine.
Dementsprechend werden Sequenzen kodierend für die Proteine rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His und rPhl p 6 d[P29, 30, 79] + 6His sowie rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His und rPhl p 6 d[P29, 30] P79L + 6His hergestellt. Diese Varianten kodieren für Proteine, die Prolin-Mutationen in zwei der Schleifen tragen, die die α-Helices des Phl p 6 verbinden (Abb. 2). Accordingly, sequences encoding the proteins rPhl p 6 d [P29, 30, 57] + 6His and rPhl p 6 d [P29, 30, 79] + 6His and rPhl p 6 d [P29, 30] P57L + 6His and rPhl p 6 d [P29, 30] P79L + 6His prepared. These variants encode proteins bearing proline mutations in two of the loops connecting the α helices of Phl p 6 (Figure 2).
Es werden zudem eine Nukleinsäure kodierend für rPhl p 6 d[P29, 30] P57L P79L + 6His hergestellt, um eine Allergenvariante zu erzeugen die Prolin- Mutationen in drei Schleifenregionen besitzt (Abb. 2). Wie oben bereits erwähnt, werden die Sequenzen vorzugsweise in E. coli exprimiert und die Proteine über Standardmethoden gereinigt. In addition, a nucleic acid coding for rPhl p 6 d [P29, 30] P57L P79L + 6His is prepared to generate an allergen variant which has proline mutations in three loop regions (Figure 2). As mentioned above, the sequences are preferably expressed in E. coli and the proteins are purified by standard methods.
Die Reinheit wird ebenfalls durch SDS-PAGE und durch SEC/MALS/RI untersucht (Abb. 12, Abb. 13). Alle erfindungsgemäßen Proteine können so mit hoher Reinheit und Löslichkeit dargestellt werden. Purity is also examined by SDS-PAGE and by SEC / MALS / RI (Figure 12, Figure 13). All proteins according to the invention can thus be prepared with high purity and solubility.
Die SEC/MALS/RI-Methode enthüllt für obengennannte Mutanten deutliche Unterschiede bezüglich der Eigenschaft Dimere auszubilden (Abb. 13, Tab. 2). Die für die Proteine rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His, rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His und rPhl p 6 d[P29, 30] P57L P79L + 6His bestimmten The SEC / MALS / RI method reveals significant differences in the property of forming dimers for the aforementioned mutants (Figure 13, Tab. 2). For the proteins rPhl p 6 d [P29, 30, 57] + 6His, rPhl p 6 d [P29, 30] P57L + 6His and rPhl p 6 d [P29, 30] P57L P79L + 6His
Molekülmassen zeigen einen klare Tendenz zur Ausbildung von Dimeren auf. Die Proteine rPhl p 6 d[P29, 30, 79] + 6His und rPhl p 6 d[P29, 30] P79L + 6His werden nur in der monomeren Form nachgewiesen (Tab. 2). Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, dass die Veränderung der Position Prolin 57, nicht aber Prolin 79, rPhl p 6 d[P29, 30] so verändert, dass eine Molecular masses show a clear tendency to form dimers. The proteins rPhl p 6 d [P29, 30, 79] + 6His and rPhl p 6 d [P29, 30] P79L + 6His are detected only in the monomeric form (Table 2). From this result it can be concluded that the change of the position proline 57, but not proline 79, rPhl p 6 d [P29, 30] changed so that a
Dimerisierungstendenz induziert wird. Dimerisierungstendenz is induced.
Die Bestimmung der IgE-Bindungsfähigkeit durch das Streifentest-Verfahren zeigt überraschenderweise tatsächlich, dass die Seren von Allergikern der„A"- Gruppe, die eine nachweisbare IgE-Bindung zu rPhl p 6 d[P29, 30] aufweisen, eine deutlich verringerte IgE-Bindung zu den optimierten Varianten haben (Abb. 14). Ob die Proline 57 und 79 deletiert oder gegen eine andere Surprisingly, indeed, the determination of IgE binding capacity by the strip test method shows that the sera of allergy sufferers of the "A" group, which have a detectable IgE binding to rPhl p 6 d [P29, 30], have a markedly reduced IgE Binding to the optimized variants have (Fig. 14) Whether the Proline 57 and 79 deleted or against another
Aminosäure ausgetauscht sind, hat auf die Reduktion der IgE- Bindungsfähigkeit offensichtlich ebenso wenig Einfluss, wie die Fähigkeit zur Ausbildung von Dimeren. Es ist somit gezeigt, dass eine gleichzeitig Amino acid are exchanged, obviously has no influence on the reduction of IgE binding ability as well as the ability to form dimers. It is thus shown that one at a time
vorhandene Veränderung mehrerer Aminosäurereste aus der Gruppe der Proline 29, 30, 57 und 79 die IgE-Bindung weiter deutlich verringert. existing change of several amino acid residues from the group of prolines 29, 30, 57 and 79 further reduces IgE binding significantly.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Another object of the present invention are therefore
hypoallergene Varianten von Gruppe 6-Allergenen der Familie der Süßgräser (Poaceae), bei denen die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, in Kombinationen mutiert sind. Bevorzugt sind Mutationen durch Deletion und durch Substitution durch andere Aminosäuren. Dabei kann jede Aminosäure zum Austausch gegen Prolin gewählt werden. Ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind hypoallergene Varianten von Phl p 6 oder Poa p 6, bei denen die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der hypoallergenic variants of group 6 allergens of the grasshopper family (Poaceae) in which the prolines corresponding in alignment to the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are mutated in combinations , Preference is given to mutations by deletion and substitution by other amino acids. Each amino acid can be chosen for exchange with proline. A preferred subject of the present invention are hypoallergenic variants of Phl p 6 or Poa p 6, in which the prolines, which in an alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, in Kombinationen mutiert sind.  Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 correspond, are mutated in combinations.
Ein besonders bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind hypoallergene Varianten von Phl p 6, bei denen die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der A particularly preferred subject of the present invention are hypoallergenic variants of Phl p 6, in which the prolines, which in a Alignment of the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the
Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, in Kombinationen mutiert sind. Besonders bevorzugt sind hypoallergene Varianten von Gruppe 6-Allergenen der Familie der Süßgräser (Poaceae), bei denen die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 correspond, are mutated in combinations. Particular preference is given to hypoallergenic variants of group 6 allergens of the grasshopper family (Poaceae), in which the prolines which are aligned with the prolongs of positions 29, 30, 57, 79 in the
Aminosäuresequenz des reifen Phl p 6.0102 (SEQ ID NO:2) entsprechen, in Kombinationen mutiert sind. Amino acid sequence of the mature Phl p 6.0102 (SEQ ID NO: 2) correspond, are mutated in combinations.
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße, hypoallergene Varianten bei denen die Proline 29, 30, 57, 79 in Kombinationen entfernt sind. Besonders bevorzugt sind auch erfindungsgemäße, hypoallergene Varianten bei denen die Proline 29, 30, 57, 79 in Kombinationen substituiert sind. Particular preference is given to hypoallergenic variants according to the invention in which the prolines 29, 30, 57, 79 are removed in combinations. Particular preference is also given to hypoallergenic variants according to the invention in which the prolines 29, 30, 57, 79 are substituted in combinations.
Besonders bevorzugt sind außerdem erfindungsgemäße, hypoallergene Varianten bei denen die Proline 29, 30, 57, 79 in Kombinationen entfernt und/oder substituiert sind. Erfindungsgemäß sind daher insbesondere die hypoallergenen Varianten rPhl p 6 d[P29, 30, 57], rPhl p 6 d[29, 30, 79], rPhl p 6 d[29, 30, 57, 79], rPhl p 6 d[P29, 57], rPhl p 6 d[P30, 57], rPhl p 6 d[29, 79], rPhl p 6 d[30, 79], rPhl p 6 d[29, 57, 79], rPhl p 6 d[30, 57, 79], rPhl p 6 d[P29, 30] P57L, rPhl p 6 d[29, 30] P79L, rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L, rPhl p 6 d[P29] P30L, rPhl p 6 d[P30] P29L, rPhl p 6 d[P57] P29L P30L, rPhl p 6 d[P79] P29L P30L, rPhl p 6 d[P57, 79] P29L P30L, rPhl p 6 P29L P30L P57L, rPhl p 6 P29L P30L P79L, rPhl p 6 P29L P30L P57L P79L und dergleichen einschließlich aller nachfolgend beschriebenen, erfindungsgemäßen, hypoallergenen Varianten, wobei die Nummerierung der Sequenz des Phl p 6, insbesondere des reifen Phl p 6.0102 folgt. Hier wird Prolin beispielhaft durch Leucin (L) ausgetauscht. Erfindungsgemäß können jedoch die erfindungsgemäßen Proline durch jede Aminosäure ausgetauscht werden. Erfindungsgemäß sind demnach alle oben aufgeführten hypoallergenen Varianten bei denen ein oder mehrere erfindungsgemäße Proline durch eine andere Aminosäure substituiert sind. Weiterhin sind diese Beispiele nicht auf Varianten des Phl p 6 beschränkt sondern betreffen auch insbesondere Poa p 6 und die Gruppe 6-Allergene aller übrigen Süßgräser. Besonders bevorzugt sind jedoch alle aufgeführten erfindungsgemäßen, hypoallergenen Varianten von Phl p 6 von Phleum pratense, insbesondere basierend auf Phl p 6.0102. Also particularly preferred are hypoallergenic variants according to the invention in which the prolines 29, 30, 57, 79 are removed and / or substituted in combinations. According to the invention, in particular the hypoallergenic variants rPhl p 6 d [P29, 30, 57], rPhl p 6 d [29, 30, 79], rPhl p 6 d [29, 30, 57, 79], rPhl p 6 d [ P29, 57], rPhl p 6 d [P30, 57], rPhl p 6 d [29, 79], rPhl p 6 d, [30, 79], rPhl p 6 d, [29, 57, 79], rPhl p 6 d [30, 57, 79], rPhl p 6 d [P29, 30] P57L, rPhl p 6 d [29, 30] P79L, rPhl p 6 d [29, 30] P57L P79L, rPhl p 6 d [P29] P30L, rPhl p 6 d [P30] P29L, rPhl p 6 d [P57] P29L P30L, rPhl p 6 d [P79] P29L P30L, rPhl p 6 d [P57, 79] P29L P30L, rPhl p 6 P29L P30L P57L, rPhl p 6 P29L P30L P79L, rPhl p 6 P29L P30L P57L P79L and the like, including all the hypoallergenic variants of the invention described below, the numbering of which follows the sequence of Phl p 6, in particular the mature Phl p 6.0102. Here proline is exemplarily replaced by leucine (L). According to the invention, however, the prolines of the invention can be replaced by any amino acid. Accordingly, all of the above are according to the invention hypoallergenic variants in which one or more prolines according to the invention are substituted by another amino acid. Furthermore, these examples are not limited to variants of Phl p 6 but also relate in particular Poa p 6 and the group 6 allergens of all other grasses. However, all listed hypoallergenic variants of Phl p 6 according to the invention of Phleum pratense are particularly preferred, in particular based on Phl p 6.0102.
T-Helfer-Lymphozyten reagieren mit Peptidfragmenten der Allergene, die durch Abbauprozesse in Antigenpräsentierenden Zellen (APZ) entstehen und gebunden an MHC-Klasse Il-Moleküle an der Oberfläche der APZ präsentiert werden. Die Peptide haben in der Regel eine Länge von 13-18 Aminosäuren, können aufgrund der seitlich offenen Bindestelle des MHC-Klasse 2 jedoch auch länger sein. Die Hauptkontaktpunkte des Peptides mit dem MHC-Klasse Molekül sind in einer Kernsequenz von etwa 7-10 Aminosäuren zu finden. Die allergenspezifische Aktivierung der T-Helfer-Lymphozyten ist die T helper lymphocytes react with peptide fragments of the allergens that are generated by degradation processes in antigen-presenting cells (APC) and are presented bound to MHC class II molecules on the surface of the APC. The peptides are usually 13-18 amino acids in length, but may be longer due to the MHC class 2 side-open binding site. The main contact points of the peptide with the MHC class molecule can be found in a core sequence of about 7-10 amino acids. The allergen-specific activation of T helper lymphocytes is the
Vorrausetzung für deren Proliferation und funktionellen Differenzierung (z.B. Treg, TH1 und TH2). Die Fähigkeit eines Allergens oder einer Allergenvariante zur Stimulierung von allergenspezifischen T-Lymphozyten wird als ein Schlüssel für deren therapeutische Wirksamkeit angesehen. Prerequisite for their proliferation and functional differentiation (eg Treg, TH1 and T H 2). The ability of an allergen or allergen variant to stimulate allergen-specific T lymphocytes is considered a key to their therapeutic efficacy.
Alle auf Basis der von Phl p 6 beziehungsweise von Phl p 6.0102 erzeugten und hier dargestellten Allergenvarianten zeigen in Experimenten einen weitgehenden Erhalt entscheidender T-Zell-Epitope. All based on the allergen variants generated by Phl p 6 and Phl p 6.0102 and shown here show in experiments a substantial preservation of crucial T-cell epitopes.
Es werden somit erstmals Varianten der Gruppe-6-Allergene der Poaceae beschrieben, die durch die Veränderung von Prolinresten neuartige Thus, for the first time, variants of the group 6 allergens of the Poaceae are described, which are novel due to the modification of proline residues
Proteineigenschaften aufweisen. Die betroffenen Prolinreste sind in  Have protein properties. The affected proline residues are in
Schleifenregionen lokalisiert. Nur die Veränderung bestimmter Prolinreste führt zu den neuartigen Varianten, die sich bei weitgehendem Erhalt der T- Zell-Reaktivität durch eine reduzierte IgE-Reaktivität auszeichnen und daher für die kurative und präventive spezifische Immuntherapie geeignet sind. Entsprechende DNA-Moleküle sind für die immuntherapeutische Vakzinierung geeignet. Loop regions isolated. Only the modification of certain proline residues leads to the novel variants, which are characterized by a reduced IgE reactivity when the T cell reactivity is largely preserved and are therefore suitable for curative and preventive specific immunotherapy. Corresponding DNA molecules are suitable for immunotherapeutic vaccination.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb die beschriebenen, erffindungsgemäßen Allergenvarianten, DNA-Moleküle und rekombinanten Expressionsvektoren als Arzneimittel. The present invention therefore relates to the described allergen variants according to the invention, DNA molecules and recombinant expression vectors as medicaments.
Erfindungsgemäße, hypoallergene Varianten, DNA-Moleküle und According to the invention, hypoallergenic variants, DNA molecules and
rekombinanten Expressionsvektoren beziehungsweise erfindungsgemäße Arzneimittel können insbesondere zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung von Krankheiten und Krankheitszuständen verwendet werden. Recombinant expression vectors or medicaments according to the invention can be used in particular for the prophylaxis and / or treatment of diseases and disease states.
Erfindungsgemäße Arzneimittel eignen sich besonders zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Typ 1 -Allergien, das heißt zur spezifischen Medicaments according to the invention are particularly suitable for the treatment and / or prophylaxis of type 1 allergies, that is to the specific one
Immuntherapie (Hyposensibilisierung) von Patienten mit Gräserpollenallergie oder zur präventiven Immuntherapie von Gräserpollenallergien an deren Auslösung Gruppe 6-Allergene von Spezies der Poaceae beteiligt sind. Immunotherapy (hyposensitization) of patients with grass pollen allergy or for the preventive immunotherapy of grass pollen allergies in their release group 6 allergens of species of the Poaceae are involved.
Erfindungsgemäße DNA-Moleküle und rekombinanten Expressionsvektoren können zur entsprechenden immuntherapeutischen und -prophylaktischen DNA-Vakzinierung eingesetzt werden. DNA molecules according to the invention and recombinant expression vectors can be used for the corresponding immunotherapeutic and prophylactic DNA vaccination.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung wenigstens einer erfindungsgemäßen, hypoallergenen Variante zur Herstellung eines The invention also provides the use of at least one hypoallergenic variant according to the invention for the preparation of a
Arzneimittels zur Prävention und/oder therapeutischen Behandlung von Typ-1 Allergien, an deren Auslösung Gruppe 6-Allergene der Süßgräser ursächlich beteiligt sind. Medicament for the prevention and / or therapeutic treatment of type 1 allergies, the release of which is caused by group 6 allergens of grasses.
Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung wenigstens eines According to the invention, the use of at least one
erfindungsgemäßen DNA-Moleküls und/oder eines erfindungsgemäßen, rekombinanten Expressionsvektors einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen zur Herstellung eines Arzneimittels zur immuntherapeutischen DNA-Vakzinierung. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße, hypoallergene Variante, ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül und/oder einen erfindungsgemäßen, rekombinanten Expressionsvektor, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen und gegebenenfalls weitere Wirk- und/oder Hilfsstoffe zur Prävention und/oder therapeutischen Behandlung von Typ-1 Allergien. DNA molecule according to the invention and / or a recombinant expression vector according to the invention including mixtures thereof in all ratios for the preparation of a medicament for immunotherapeutic DNA vaccination. The invention further provides pharmaceutical preparations containing at least one hypoallergenic variant according to the invention, a DNA molecule according to the invention and / or a recombinant expression vector according to the invention, including mixtures thereof in all ratios and optionally other active substances and / or adjuvants for the prevention and / or or therapeutic treatment of type 1 allergies.
Insbesondere eigenen sich erfindungsgemäße, pharmazeutische In particular, pharmaceutical according to the invention own
Zubereitungen zur Prävention und/oder therapeutischen Behandlung von Typ- 1 Allergien, an deren Auslösung Gruppe 6-Allergene der Süßgräser ursächlich beteiligt sind. Preparations for the prevention and / or therapeutic treatment of type 1 allergies, in the initiation of which group 6 allergens of grasses are causally involved.
Pharmazeutische Zubereitungen im Sinne dieser Erfindung können als Pharmaceutical preparations in the sense of this invention can be described as
Therapeutika in der Human- oder Veterinärmedizin verwendet werden und demnach an Menschen und Tiere, insbesondere Säugetiere wie Affen, Hunde, Katzen, Ratten oder Mäuse verabreicht und bei der therapeutischen Therapeutics can be used in human or veterinary medicine and therefore administered to humans and animals, in particular mammals such as monkeys, dogs, cats, rats or mice and in the therapeutic
Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers sowie bei der Treatment of the human or animal body as well as in the
Bekämpfung der oben aufgeführten Krankheiten verwendet werden. Sie können weiterhin als Diagnostika oder als Reagenzien Verwendung finden. Combating the diseases listed above. They can still be used as diagnostic agents or as reagents.
Bei Verwendung von erfindungsgemäßen Zubereitungen oder Arzneimittel werden die erfindungsgemäßen hypoallergenen Varianten, DNA-Moleküle oder rekombinanten Expressionsvektoren in der Regel analog zu bekannten, käuflich erhältlichen Zubereitungen oder Präparaten verwendet, vorzugsweise in Dosierungen zwischen 0,001 und 500 mg, bei hypoallergenen Varianten etwa 1-500 pg, bevorzugt 5-200 pg pro Dosis in der Erhaltungsphase. Die Zubereitung kann ein- oder mehrmals pro Tag verabreicht werden, z.B. zwei-, drei- oder viermal am Tag. Typischerweise werden die Dosen in einer When using preparations or medicaments according to the invention, the hypoallergenic variants, DNA molecules or recombinant expression vectors according to the invention are generally used analogously to known, commercially available preparations or preparations, preferably in dosages between 0.001 and 500 mg, in hypoallergenic variants about 1-500 μg , preferably 5-200 pg per dose in the maintenance phase. The preparation may be administered one or more times a day, e.g. two, three or four times a day. Typically, the doses are in one
Aufdosierungsphase bis zur Erhaltungsdosis gesteigert. Hierfür sind  Increased dosage phase to the maintenance dose. For this are
verschiedene Schemata der Aufdosierung und Erhaltung möglich. Diese können beispielsweise bei der subkutanen Immuntherapie (SCIT)  various schemes of dosing and conservation possible. These can be used, for example, in subcutaneous immunotherapy (SCIT).
Kurzzeittherapien (begrenzte Anzahl von Injektionen vor Beginn der saisonalen Beschwerden, typischerweise 4 - 7 Injektionen), präsaisonale Therapien (Beginn der Therapie vor der Pollensaison, typischerweise mit wöchentlichen Injektionen während der Steigerungsphase und monatlichen Injektionen mit der Erhaltungsdosis bis zum Beginn der Pollensaison) oder ganzjährige Therapien (Aufdosierungsphase typischerweise mit bis zu 16 wöchentlichen Injektionen gefolgt von monatlichen Injektionen mit der Short-term therapies (limited number of injections before the start of the seasonal complaints, typically 4 to 7 injections), preseasonal therapies (beginning of pollen season, typically with weekly injections during the boost phase and monthly injections with the maintenance dose until the onset of the pollen season) or year-round therapies (uptake typically up to 16 weekly Injections followed by monthly injections with the
Erhaltungsdosis, bei Bedarf reduzierte Dosis während der Pollensaison) umfassen. Bei der sublingualen Immuntherapie mit wässrigen, oder festen Präparaten (Tabletten, Wafer etc.) kann die Einleitung der Therapie mit oder ohne Aufdosierungsphase stattfinden. Die Therapie erfolgt bevorzugt mit täglichen Dosen ganzjährig, kann aber auch präsaisonal oder mit anderen Applikationsschemata (z.B. jeden zweiten Tag, wöchentlich, monatlich) durchgeführt werden. Der Ausdruck "wirksame Menge" bedeutet die Menge eines Arzneimittels oder eines pharmazeutischen Wirkstoffes, die eine biologische oder medizinische Antwort in einem Gewebe, System, Tier oder Menschen hervorruft, die z.B. von einem Forscher oder Mediziner gesucht oder angestrebt wird. Maintenance dose, if necessary reduced dose during the pollen season). In sublingual immunotherapy with aqueous or solid preparations (tablets, wafers, etc.), the initiation of therapy may take place with or without an uptake phase. Therapy is preferably with daily doses throughout the year, but may also be preseasonal or with other regimens of application (e.g., every other day, weekly, monthly). The term "effective amount" means the amount of a drug or pharmaceutical agent which elicits a biological or medical response in a tissue, system, animal or human, e.g. sought or desired by a researcher or physician.
Darüber hinaus bedeutet der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" eine Menge, die, verglichen zu einem entsprechenden Subjekt, das diese Menge nicht erhalten hat, folgendes zur Folge hat: verbesserte Heilbehandlung, Heilung, Prävention oder Beseitigung einer Krankheit, eines Krankheitsbildes, eines Krankheitszustandes, eines Leidens, einer Störung oder Verhinderung von Nebenwirkungen oder auch die Verminderung des Fortschreitens einer Krankheit, eines Leidens oder einer Störung. Die Bezeichnung "therapeutisch wirksame Menge" umfasst auch die Mengen, die wirkungsvoll sind, die normale physiologische Funktion zu erhöhen. Moreover, the term "therapeutically effective amount" means an amount which, compared to a corresponding subject who has not received this amount, results in: improved curative treatment, cure, prevention or elimination of a disease, a disease, a disease state, suffering, interference or prevention of side effects, or even reducing the progression of a disease, condition or disorder. The term "therapeutically effective amount" also includes the amounts effective to increase normal physiological function.
Arzneimittel lassen sich zur Verabreichung über einen beliebigen geeigneten Weg, beispielsweise auf oralem (einschließlich buccalem bzw. sublingualem), rektalem, pulmonalem, nasalem, topischem (einschließlich buccalem, sublingualem oder transdermalem), vaginalem oder parenteralem Medicinal products may be administered by any suitable route, for example oral (including buccal or sublingual), rectal, pulmonary, nasal, topical (including buccal, sublingual or transdermal), vaginal or parenteral
(einschließlich subkutanem, intramuskulärem, intravenösem oder (including subcutaneous, intramuscular, intravenous or
intradermalem) Wege, anpassen. Solche Arzneimittel können mit allen im pharmazeutischen Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, indem beispielsweise der Wirkstoff mit dem bzw. den Trägerstoff(en) oder intradermal) routes. Such drugs can be prepared by any method known in the pharmaceutical art, such as, for example, the active ingredient with the carrier (s) or
Hilfsstoff(en) zusammengebracht wird. Excipient (s) is brought together.
Zur parenteralen Anwendung dienen insbesondere Lösungen, vorzugsweise ölige oder wässrige Lösungen, ferner Suspensionen, Emulsionen oder For parenteral application are in particular solutions, preferably oily or aqueous solutions, further suspensions, emulsions or
Implantate. Die erfindungsgemäßen Allergenvarianten können auch Implants. The allergen variants according to the invention can also
lyophilisiert und die erhaltenen Lyophilisate z.B. zur Herstellung von lyophilized and the resulting lyophilisates e.g. for production of
Injektionspräparaten verwendet werden. Die angegebenen Zubereitungen können sterilisiert sein und/oder Hilfsstoffe wie Gleit-, Konservierungs-, Stabilisierungs- und/oder Netzmittel, Emulgatoren, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Puffersubstanzen und/oder mehrere weitere Wirkstoffe enthalten. Weiterhin können durch entsprechende Formulierung der erfindungsgemäßen Allergenvarianten Depotpräparate, beispielsweise durch Adsorption an Aluminiumhydroxid, Kalziumphosphat oder Tyrosin erhalten werden. Injection preparations are used. The preparations indicated may be sterilized and / or contain adjuvants such as lubricants, preservatives, stabilizers and / or wetting agents, emulsifiers, salts for influencing the osmotic pressure, buffer substances and / or several further active ingredients. Furthermore, depot preparations, for example by adsorption on aluminum hydroxide, calcium phosphate or tyrosine, can be obtained by appropriate formulation of the allergen variants according to the invention.
Als Trägerstoffe kommen organische oder anorganische Substanzen in Frage, die sich für die parenterale Applikation eignen und mit erfindungsgemäßen Gruppe 6-Allergenvarianten nicht reagieren. Beispiele hierfür sind Trägerstoffe wie Wasser, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Polyethylenglykole, Suitable carriers are organic or inorganic substances which are suitable for parenteral administration and which do not react with group 6 allergen variants according to the invention. Examples include carriers such as water, vegetable oils, benzyl alcohols, polyethylene glycols,
Glycerintriacetat, Gelatine, Kohlenhydrate, wie Lactose oder Stärke,  Glycerol triacetate, gelatin, carbohydrates, such as lactose or starch,
Magnesiumstearat, Talk, Lanolin oder Vaseline. Magnesium stearate, talc, lanolin or Vaseline.
Zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel eignet sich For administration of the medicaments according to the invention is suitable
vorzugsweise die parenterale Applikation. Im Falle der parenteralen  preferably parenteral administration. In the case of parenteral
Applikation sind die intravenöse, subkutane, intradermale oder Application are the intravenous, subcutaneous, intradermal or
intralymphatische Applikation besonders bevorzugt. Im Falle der intravenösen Applikation kann die Injektion direkt oder auch als Zusatz zu Infusionslösungen erfolgen. intralymphatic administration is particularly preferred. In case of intravenous Application, the injection can be made directly or as an addition to infusion solutions.
Zu den an die parenterale Verabreichung angepassten Arzneimitteln gehören wässrige und nichtwässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und Lösungsvermittler enthalten, durch die die Medicaments adapted for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile injection solutions containing anti-oxidants, buffers, bacteriostats and solubilizers through which the
Formulierung isotonisch mit dem Blut des zu behandelnden Empfängers gemacht wird, enthalten, sowie wässrige und nichtwässrige sterile Formulation is made isotonic with the blood of the recipient to be treated, as well as aqueous and non-aqueous sterile
Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdicker enthalten können. Die Formulierungen können in Einzeldosis- oder Mehrfachdosisbehältern, z.B. versiegelten Ampullen und Fläschchen, dargereicht und in Suspensions which may contain suspending agents and thickeners. The formulations may be administered in single or multiple dose containers, e.g. sealed ampoules and vials, presented and in
gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, so dass nur die Zugabe der sterilen Trägerflüssigkeit, z.B. Wasser für Injektionszwecke, unmittelbar vor Gebrauch erforderlich ist. Rezepturmäßig hergestellte lyophilized state, so that only the addition of the sterile carrier liquid, e.g. Water for injections, needed immediately before use. Prescribed
Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Injection solutions and suspensions may be sterile powders,
Granulaten und Tabletten hergestellt werden. Granules and tablets are produced.
Falls erwünscht, können erfindungsgemäße Zubereitungen oder Medikamente einen oder mehrere weitere Wirkstoffe und/oder einen oder mehrere If desired, preparations or medicaments according to the invention may contain one or more further active ingredients and / or one or more
Wirkverstärker (Ajuvantien) enthalten. Amplifiers (adjuvants) included.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Another object of the present invention are thus
pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend weitere Wirk- und/oder pharmaceutical preparations containing further active ingredients and / or
Hilfsstoffe. Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den weiteren Wirkstoffen um Allergene oder Varianten davon handelt.  Excipients. A preferred subject matter of the invention are pharmaceutical preparations according to the invention, characterized in that the other active substances are allergens or variants thereof.
Beispiele für geeignete weitere Wirkstoffe sind andere Allergene,  Examples of suitable further active ingredients are other allergens,
insbesondere Allergene der Süßgräser, besonders bevorzugt Allergene aus . der Unterfamilie der Pooideae, bevorzugt aus den Gruppen Poodae und Triticodae, bevorzugt vertreten durch Phleum pratense, Holcus lanatus, Phalahs aquatica, Dactylis glomerata, Lolium perenne, Poa pratensis, Hordeum vulgare, Seeale cereale und Triticum aestivum, beispielsweise Gruppe 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 10-, 12- oder 13-Allergene und Varianten davon, beispielsweise hypoallergene Varianten, Fragmente, Multimere, Hybridmoleküle oder rekombinanten Fusionsproteine. Ein weiterer especially allergens of the grasses, more preferably allergens. the subfamily Pooideae, preferably from the groups Poodae and Triticodae, preferably represented by Phleum pratense, Holcus lanatus, Phalahs aquatica, Dactylis glomerata, Lolium perenne, Poa pratensis, Hordeum vulgare, Seeale cereale and Triticum aestivum, for example Group 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 10-, 12- or 13-allergens and variants thereof, for example hypoallergenic variants, fragments, multimers, hybrid molecules or recombinant fusion proteins. Another
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend wenigstens einen weiteren Hilfsstoff, besonders bevorzugt sogenannte Wirkverstärker. Beispiele für Wirkverstärker sind The present invention relates to pharmaceutical preparations containing at least one further excipient, particularly preferably so-called potentiators. Examples of active enhancers are
Aluminiumhydroxid, Monophosphoryl-Lipid A, Aktivatoren von Toll-like Aluminum hydroxide, monophosphoryl lipid A, activators of Toll-like
Rezeptoren wie z.B. Lipopolysaccharide und CpG-Oligonukleotide, Vitamin D3, mycobakterielle Antigene und Moleküle aus Parasiten (z.B. Schistosomen oder Filarien), wie z.B. Cystatin oder ES-62. Receptors such as e.g. Lipopolysaccharides and CpG oligonucleotides, vitamin D3, mycobacterial antigens, and molecules from parasites (e.g., schistosomes or filariae), e.g. Cystatin or ES-62.
Ein Gegenstand der Erfindung sind auch Sets (Kits) bestehend aus An object of the invention are also kits consisting of
getrennten Packungen von separate packs of
a) einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung, enthaltend eine wirksame Menge einer erfindungsgemäßen, hypoallergenen Variante,a) a pharmaceutical preparation according to the invention containing an effective amount of a hypoallergenic variant according to the invention,
DNA-Moleküls oder rekombinanten Expressionsvektors DNA molecule or recombinant expression vector
b) einer pharmazeutischen Zubereitung, enthaltend eine wirksamen Menge eines weiteren pharmazeutischen Wirkstoffs und/oder Wirkverstärkers. Das Set enthält geeignete Behälter, wie Schachteln oder Kartons, individuelle Flaschen, Beutel oder Ampullen. Das Set kann z.B. separate Ampullen enthalten, in denen jeweils eine erfindungsgemäße Formulierung, enthaltend eine wirksame Menge einer erfindungsgemäßen, hypoallergenen Variante, eines DNA-Moleküls oder eines rekombinanten Expressionsvektors und einer Formulierung eines weiteren Arzneimittelwirkstoffs in gelöster oder in lyophylisierter Form vorliegt. b) a pharmaceutical preparation containing an effective amount of another active pharmaceutical ingredient and / or potentiator. The kit contains suitable containers, such as boxes or boxes, individual bottles, bags or ampoules. The set may e.g. containing separate ampoules each containing a formulation according to the invention containing an effective amount of a hypoallergenic variant of the invention, a DNA molecule or a recombinant expression vector and a formulation of another drug in dissolved or in lyophilized form.
Auch ohne weitere Ausführungsformen wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen sind deshalb lediglich als beschreibende, keineswegs aber als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung Even without further embodiments, it is assumed that a person skilled in the art can make the most of the above description. The preferred embodiments are therefore intended to be merely descriptive, but not limiting in any way
aufzufassen. Die folgenden Beispiele sollen somit die Erfindung erläutern, ohne sie zu begrenzen. Sofern nichts anderes angegeben ist, bedeuten Prozentangaben Gewichtsprozent. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben. specific. The following examples are thus intended to illustrate the invention without limiting it. Unless otherwise indicated, percentages are by weight. All temperatures are in degrees Celsius.
"Übliche Aufarbeitung": Man gibt, falls erforderlich, Wasser hinzu, stellt, falls erforderlich, je nach Konstitution des Endprodukts auf pH-Werte zwischen 2 und 10 ein. "Usual workup": Water is added, if necessary, adjusted to pH values between 2 and 10, if necessary, depending on the constitution of the final product.
Die folgenden erfindungsgemäßen, hypoallergenen Varianten wurden biotechnologisch hergestellt und charakterisiert. Die Herstellung und The following hypoallergenic variants according to the invention were prepared and characterized by biotechnology. The production and
Charakterisierung der Substanzen ist jedoch auch auf anderen Wegen für den Fachmann durchführbar. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen, hypoallergenen Varianten auch chemisch synthetisiert werden. Die  However, characterization of the substances is also feasible in other ways for the skilled person. For example, the hypoallergenic variants of the invention can also be chemically synthesized. The
nachfolgend beschriebenen, erfindungsgemäßen, hypoallergenen Varianten sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. The hypoallergenic variants according to the invention described below are likewise provided by the invention.
Beispiel 1: Varianten des Phl p 6 mit Prolin-Deletionen in einer einzelnen Schleifenregion Example 1: Variants of Phl p 6 with proline deletions in a single loop region
Die Herstellung der Varianten rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His, und rPhl p 6 d[P79] + 6His sowie deren immunologische The preparation of the variants rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His, and rPhl p 6 d [P79] + 6His and their immunological
Charakterisierung ist im Folgenden dargestellt. Analog wird das rekombinante unveränderte Allergen (rPhl p 6 wt + 6His) hergestellt und untersucht und analog können auch die hypoallergenen Varianten der weiteren Characterization is shown below. Analogously, the recombinant unmodified allergen (rPhl p 6 wt + 6His) is prepared and analyzed, and analogously, the hypoallergenic variants of the others can also be prepared
erfindungsgemäßen Gruppe 6-Allergene der Süßgräser sowie deren Wildtyp- Proteine, insbesondere Poa p 6, hergestellt und untersucht werden. Group 6 allergens of sweet grasses and their wild-type proteins, in particular Poa p 6, according to the invention and are investigated.
Gentechnische Konstruktion: Genetic Engineering:
Die Synthese der für die Varianten kodierenden DNA erfolgt durch die  The synthesis of the DNA coding for the variants is carried out by the
Verbindung langer überlappender DNA-Oligonukleotide und der Amplifizierung der DNA durch ein PCR-Standardverfahren. Die Kodons werden so gewählt, Konzentration eines Partikels durch den Rl-Detektor bestimmt und die Connecting long overlapping DNA oligonucleotides and amplifying the DNA by a standard PCR procedure. The codons are chosen Concentration of a particle determined by the Rl detector and the
Lichtstreuung des Partikels durch den MALS-Detektor aufgezeichnet (Wen et al., 1996, Anal. Biochem. 240:155-166). Aus diesen Daten kann die Light scattering of the particle was recorded by the MALS detector (Wen et al., 1996, Anal. Biochem. 240: 155-166). From this data, the
durchschnittliche Masse der eluierenden Partikel mit einer Genauigkeit von etwa 5% berechnet werden. Durch SEC/MALS/RI können Monomere, Dimere andere Multimere und Aggregate nachgewiesen werden. average mass of the eluting particles can be calculated with an accuracy of about 5%. SEC / MALS / RI can detect monomers, dimers, other multimers and aggregates.
Bei der SEC/MALS/RI-Analyse wird deutlich, dass die Proteine, die jeweils in einem einzigen Peak eluieren, unter nativen Bedingungen als reine Monomere vorliegen (Abb. 8; Tab. 1). The SEC / MALS / RI analysis shows that the proteins that elute in a single peak are native monomers under pure conditions (Figure 8, Table 1).
Tabelle 1: Molekulargewicht des Phl p 6-Wildtyps und der Phl p 6-Varianten mit Prolin-Deletionen in Schleifen 1, 2, 3 oder 4 Table 1: Molecular weight of Phl p 6 wild-type and Phl p 6 variants with proline deletions in loops 1, 2, 3 or 4
1 Kalkuliertes Molekulargewicht auf Grundlage der Aminosäuresequenz mit Start-Methionin (Software: EditSeq 6.0; DNA-Star Inc., Madison, USA). 1 Calculated molecular weight based on the amino acid sequence with starting methionine (Software: EditSeq 6.0, DNA Star Inc., Madison, USA).
2 Bestimmung der Partikelmasse durch Gelfiltration (SEC). Angegeben ist der Durchschnitt der Masse der eluierten Proteinpartikel im gesetzten Peakfenster. 2 Determination of particle mass by gel filtration (SEC). Indicated is the average of the mass of the eluted protein particles in the set peak window.
Zur Online-Bestimmung der Proteinkonzentration wurde der Brechungsindex-Detektor (Rl) OptilabrEX (Wyatt, Santa Barbara, USA) eingesetzt. Die Lichtstreuung der Partikel wurde mit dem Mehrwinkeldetektor MiniDAWN Treos (Wyatt) bestimmt. Die Berechnung der The refractive index detector (RL) OptilabrEX (Wyatt, Santa Barbara, USA) was used to determine the protein concentration online. The light scattering of the particles was determined with the multi-angle detector MiniDAWN Treos (Wyatt). The calculation of
Partikelmasse erfolgte mit der Software ASTRA 5.3.2.17 (Wyatt) über Debeye-Formalismus mit einem angenommenen Brechungsindexinkrement von 0,180 ml/ g. SEC-Säule: Superdex 200 GL 10/ 300 (GE Healthcare, Uppsala, Schweden). Laufmittel: 20 mM Natriumphosphat- Puffer pH 7,2 mit 150 mM NaCI. dass die deduzierte Aminosäuresequenz auf der des reifen Phl p 6.0102 basiert (Abb. 3, Abb. 4). Die Mutationen für die Prolin-Deletionen werden eingeführt, indem spezifische Oligonukleotide in den PCR-Reaktionen eingesetzt werden, denen die entsprechenden Kodons für Prolin fehlen. Diese Oligonukleotide werden so gewählt, dass das deduzierte Protein am 5^-Ende einen Hexa-Histidin-Fusionsanteil trägt (Abb. 5, Abb. 6). Particulate mass was measured using ASTRA 5.3.2.17 (Wyatt) software via Debeye formalism with an assumed refractive index increment of 0.180 ml / g. SEC column: Superdex 200 GL 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Eluent: 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 with 150 mM NaCl. that the deduced amino acid sequence is based on the mature Phl p 6.0102 (Figure 3, Figure 4). The mutations for the proline deletions are introduced by using specific oligonucleotides in the PCR reactions lacking the corresponding codons for proline. These oligonucleotides are selected so that the deduced protein at the 5 -end ^ carries a hexa-histidine fusion component (Fig. 5, Fig. 6).
Diese DNAs werden in den Expressionsvektor pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) über eine Topoisomerase-Reaktion ligiert. Die Richtigkeit der DNA wird durch Sequenzierung bestätigt. These DNAs are ligated into the expression vector pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) via a topoisomerase reaction. The correctness of the DNA is confirmed by sequencing.
Expression und Reinigung: Expression and purification:
Die Expression der rekombinanten Histidin-Fusionsproteine erfolgt in  The expression of the recombinant histidine fusion proteins takes place in
Escherichia coli (Stamm Top10; Invitrogen). rPhl p 6 wt + 6 His sowie die Varianten werden durch die spezifische Bindung der N-terminalen Escherichia coli (strain Top10; Invitrogen). rPhl p 6 wt + 6 His and the variants are due to the specific binding of the N-terminal
Histidinreste an eine Ni2+-Chelat-Matrix (Immobilized-Metal-Ion-Affinity- Chromatography, IMAC; Material: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala,  Histidine residues on a Ni2 + chelate matrix (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC; Material: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala,
Schweden) primär gereinigt. Anschließend werden die rekombinanten Sweden) primarily cleaned. Subsequently, the recombinant
Proteine aus dem IMAC-Eluat konzentriert und eine Gelfiltration durchgeführt (Material: Superdex 75; GE Healthcare). Concentrated proteins from the IMAC eluate and gel filtration (material: Superdex 75, GE Healthcare).
Biochemische Analytik: Biochemical analysis:
Die Reinheit der hergestellten Proteine wird zunächst durch ein SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung überprüft. Die Analyse zeigt einen sehr hohen Reinheitsgrad aller Proteine auf (Abb. 7).  The purity of the proteins produced is first checked by SDS-PAGE followed by Coomassie staining. The analysis shows a very high degree of purity of all proteins (Fig. 7).
Die analytische Gelfiltration (SEC) erlaubt die Trennung von Proteinspezies aufgrund ihrer spezifischen hydrodynamischen Radii. Eine Online- Bestimmung der Molekülmasse kann durch die Kopplung eines Analytical gel filtration (SEC) allows the separation of protein species due to their specific hydrodynamic radii. An online determination of the molecular mass can be achieved by the coupling of a
Refraktometers (Rl-Detektor) und eines Mehrwinkellichtstreu-Detektors (MALS-Detektor) an das Chromatographiesystem erreicht werden  Refractometer (Rl detector) and a multi-angle light scattering detector (MALS detector) can be achieved to the chromatography system
(SEC/MALS/RI-Methode). Dabei wird die zum Messzeitpunkt gegebene Die Abwesendheit unlöslicher Proteinaggregate wird auch durch UV-Vis- Spektroskopie überprüft (Fotometer: Ultrospec 5300pro UV/VIS; GE- Healthcare). Bei der UV-Vis Spektroskopie wird ein Wellenspektrum der Proteinlösung im Wellenbereich von 240-800 nm aufgenommen. Unlösliche Aggregate in Proteinlösungen absorbieren im Bereich >300 nm Wellenlänge, während hochlösliche Proteine in diesem Bereich nicht absorbieren. Die (SEC / MALS / RI method). Here, the given at the time of measurement The absence of insoluble protein aggregates is also monitored by UV-Vis spectroscopy (photometer: Ultrospec 5300pro UV / VIS, GE Healthcare). In UV-Vis spectroscopy, a wave spectrum of the protein solution in the wavelength range of 240-800 nm is recorded. Insoluble aggregates in protein solutions absorb in the range> 300 nm wavelength, while highly soluble proteins in this range do not absorb. The
Wellenspektren sind typisch für Proteine mit hoher Löslichkeit. Die Wave spectra are typical of proteins with high solubility. The
erfindungsgemäßen Proteine sind somit unter nativen Bedingungen löslich, hochrein und monomer. Proteins of the invention are thus soluble under native conditions, highly pure and monomeric.
Nachweis der Reduzierten IgE-Bindung: Detection of reduced IgE binding:
Eine einfache Testmethode zur Bestimmung der Reaktivität von spezifischem IgE aus Allergikerseren ist der Streifentest. Mit dieser Methode kann eine größere Anzahl von Allergikerseren parallel untersucht werden.  A simple test method for determining the reactivity of specific IgE from allergy sera is the streak test. With this method a larger number of allergy sera can be examined in parallel.
Dafür werden die Testsubstanzen in gleicher Konzentration und Menge nebeneinander an einen Streifen von Nitrocellulose-Membran unter nicht- denaturierenden Bedingungen gebunden. Eine Reihe solcher For this purpose, the test substances are bound in the same concentration and amount side by side to a strip of nitrocellulose membrane under non-denaturing conditions. A number of such
Membranstreifen kann parallel mit unterschiedlichen Allergikerseren inkubiert werden. Nach einem Waschschritt werden die spezifisch gebundenen IgE- Antikörper durch eine Farbreaktion, vermittelt von einem Anti-human  Membrane strips can be incubated in parallel with different types of allergy sera. After a washing step, the specifically bound IgE antibodies are transformed by a color reaction mediated by an anti-human
IgE/Alkalische Phosphatase-Konjugat, auf der Membran sichtbar.  IgE / alkaline phosphatase conjugate, visible on the membrane.
Die Ergebnisse mit den Phl p 6-Varianten unter Einsatz von 8 individuellen Gräserpollen-Allergikerseren sind in Abb. 9 dargestellt. Als eine wichtige Kontrolle wird zunächst die IgE-Bindung des rekombinanten Allergens mit und ohne Histidin-Fusionsanteil untersucht. Beide Proteine zeigen die gleiche IgE- Bindungsfähigkeit. Der für die Studien verwendete N-terminale Histidin- Fusionsanteil stört demnach nicht die Bindung von IgE an Phl p 6. Die Mutante rPhl p 6 d[P101] + 6His zeigt mit allen getesteten Seren eine ähnlich gute IgE-Bindung wie das unveränderte Allergen (Abb. 9). Daraus folgt, dass eine Deletion von Prolin 101 keinen wesentlichen Einfluss auf die IgE-Bindungsfähigkeit des Phl p 6 hat. Die IgE-Bindung der Mutanten rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His und rPhl p 6 d[P79] + 6His ist bei den Seren verschiedener Gräserpollen-Allergiker unterschiedlich stark ausgeprägt. Dies beruht auf Variationen in der Zusammensetzung der IgE- Population einzelner Allergiker hinsichtlich Affinität und Epitop-Spezifität der IgE-Antikörper. Die Mutanten rPhl p 6 d[P57] + 6His und rPhl p 6 d[P79] + 6His zeigen im Vergleich zu dem nicht modifizierten rPhl p 6 wt + 6His mit den meisten Seren eine deutlich reduzierte IgE-Reaktivität. Die niedrigste IgE- Bindung wirdr jedoch durchgängig bei der Mutante rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His festgestellt (Abb. 9). Die Untersuchung der IgE-Bindungsfähigkeit gelöster Testsubstanzen erfolgt mit einem EAST-Hemmtest (Enzyme Allergosorbent Test). Bei diesem The results with the Phl p 6 variants using 8 individual grass pollen allergy sera sera are shown in FIG. 9. As an important control, the IgE binding of the recombinant allergen with and without histidine fusion content is examined first. Both proteins show the same IgE binding ability. The N-terminal histidine fusion fraction used for the studies does not interfere with the binding of IgE to Phl p 6. The mutant rPhl p 6 d [P101] + 6His shows similar IgE binding to all sera tested as the unchanged allergen (Figure 9). It follows that a deletion of proline 101 has no significant effect on the IgE binding ability of Phl p 6. The IgE binding of the mutants rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [P57] + 6His and rPhl p 6 d [P79] + 6His is different in the sera of various grass pollen allergy sufferers. This is due to variations in the composition of the IgE population of individual allergic individuals with regard to the affinity and epitope specificity of the IgE antibodies. The mutants rPhl p 6 d [P57] + 6His and rPhl p 6 d [P79] + 6His show markedly reduced IgE reactivity with most sera compared to the unmodified rPhl p 6 wt + 6His. However, the lowest IgE binding is consistently found in the mutant rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His (Figure 9). The investigation of the IgE binding capacity of dissolved test substances is carried out with an EAST inhibition test (Enzyme Allergosorbent Test). In this
Verfahren kann die Allergen/lgE-Interaktion in Lösung untersucht werden, womit störende Maskierungen von Epitopen der Testsubstanz etwa durch Immobilisierung an eine Membran ausgeschlossen werden kann. Method, the allergen / IgE interaction in solution can be examined, which interfering masking of epitopes of the test substance can be excluded, for example by immobilization to a membrane.
Der EAST-Hemmtest wird wie folgt ausgeführt. Mikrotiterplatten werden mit den Allergenen, hier rPhl p 6 wt + 6His, beschichtet. Nach Entfernung der nicht gebundenen Allergenmoleküle durch Waschen wird die Platte zur Vermeidung späterer unspezifischer Bindungen mit Rinderserum-Albumin blockiert. IgE-Antikörper von Allergikern wurden als Einzelseren in geeigneter Verdünnung mit den Allergen-beschichteten Mikrotiterplatten inkubiert. Die Menge der allergengebundenen IgE-Antikörper wird über ein Anti- hlgG/Alkalische Phosphatase-Konjugat durch die Umsetzung eines The EAST inhibition test is carried out as follows. Microtiter plates are coated with the allergens, here rPhl p 6 wt + 6His. After removal of the unbound allergen molecules by washing, the plate is blocked with bovine serum albumin to avoid later nonspecific binding. IgE antibodies from allergic persons were incubated as single sera in a suitable dilution with the allergen-coated microtiter plates. The amount of allergen-bound IgE antibodies is elicited via an anti-HIV / alkaline phosphatase conjugate by the reaction of a
Substrates zu einem farbigen Endprodukt photometrisch quantifiziert. Die Bindung der IgE-Antikörper wird durch ein lösliches Allergen bzw. die zu prüfende Substanz (rekombinantes modifiziertes Allergen) in Abhängigkeit von der Konzentration substanzspezifisch gehemmt. Die in Abb. 10 dargestellten Ergebnisse der IgE-lnhibitionstests mit den rekombinanten Allergenvarianten des Phl p 6 zeigen, dass durch Deletion der Prolinreste P[29, 30], P57 und P79 eine verminderte IgE-Bindungsfähigkeit des Phl p 6 verursacht wird. Die IgE-Bindungsfähigkeit der Mutante d[P29, 30] ist dabei deutlich geringer als die von d[P57] oder d[P79]. Eine niedrigere Hemmwirkung deutet auf einen Verlust von IgE-Epitopen hin. Die Mutante d[P 01] zeigt mit dem Serum des Gräserpollen-Allergikers P32 keine veränderte IgE-Bindung und mit dem Serum P82 eine nur geringfügig verminderte Bindung, die sich bei hoher Inhibitorkonzentration wieder der des Wildtyps annähert. Substrates quantified photometrically to a colored end product. The binding of the IgE antibodies is inhibited by a soluble allergen or the substance to be tested (recombinant modified allergen) depending on the concentration substance-specific. The results of the IgE inhibition tests with the recombinant allergen variants of Phl p 6 shown in FIG. 10 show that a deletion of the proline residues P [29, 30], P57 and P79 causes a reduced IgE binding ability of Phl p 6. The IgE-binding capacity of the mutant d [P29, 30] is significantly lower than that of d [P57] or d [P79]. A lower inhibitory effect indicates a loss of IgE epitopes. The mutant d [P 01] shows no altered IgE binding with the serum of the grass pollen allergy P32 and only slightly reduced binding with the serum P82, which again approaches that of the wild type at high inhibitor concentration.
Nachweis der Reduktion der Funktionellen Allergenität: Evidence of the reduction of functional allergenicity:
Die funktionelle Wirkung von Mutanten bei der Vernetzung von The functional effect of mutants in the cross-linking of
membrangebundenem IgE der Effektorzellen und deren Aktivierung wird anschließend in vitro untersucht. membrane-bound IgE of the effector cells and their activation is then examined in vitro.
Für den Basophilen-Aktivierungstest wird heparinisiertes Vollblut von For the basophil activation test heparinized whole blood of
Grasspollen-Allergikern mit verschiedenen Konzentrationen der Grass pollen allergy sufferers with different concentrations of
Testsubstanzen inkubiert. Dabei können allergene Substanzen spezifische IgE-Antkörper, welche mit den hochaffinen IgE-Rezeptoren der basophilen Granulozyten assoziert sind, binden. Die durch die Allergenmoleküle ausgelöste Vernetzung der IgE/ Rezeptor-Komplexe führt zu einer Test substances incubated. Allergenic substances can bind specific IgE antibodies, which are associated with the high-affinity IgE receptors of basophilic granulocytes. The crosslinking of the IgE / receptor complexes triggered by the allergen molecules leads to a
Signaltransduktion, die in der Degranulation der Effektorzellen und somit dem Auslösen der allergischen Reaktionen in vivo resultiert. Die Allergen-induzierte Aktivierung von basophilen Immunozyten kann in vitro durch Quantifizierung der Expression eines mit der Signaltransduktion der IgE-Rezeptor-Vernetzung gekoppelten Oberflächenproteins (CD203c) nachgewiesen werden (Kahlert et al., Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceedings of the EAACI 2002 (2003) Naples, Italy 739-744). Die Zahl der exprimierten Oberflächenproteine auf einer Zelle und der Prozentwert der aktivierten Zellen eines Zellpools wird über die Bindung eines Signal transduction, which results in the degranulation of effector cells and thus the triggering of allergic reactions in vivo. Allergen-Induced Activation of Basophil Immunocytes Can Be Established in Vitro by Quantification of the Expression of a Surface Protein Coupled to IgE Receptor Crosslink Signaling (CD203c) Kahlert et al., Clinical Immunology and Allergy in Medicine Proceedings of the EAACI 2002 (2003) Naples, Italy 739-744). The number of expressed surface proteins on a cell and the percentage of activated cells of a cell pool is determined by the binding of a cell
fluoreszensmarkierten monoklonalen Antikörpers an das Oberflächenprotein und anschließende Analyse durch Fluoreszensaktivierte Durchflusszytometrie hochsensitiv gemessen. fluorescently labeled monoclonal antibody to the surface protein and subsequent analysis by fluorescence-activated flow cytometry highly sensitive measured.
Die in dem Test eingesetzten Granulozyten werden im vorliegenden Beispiel aus dem Vollblut des Allergikers P21 gewonnen. Dieser Allergiker The granulocytes used in the test are obtained in the present example from the whole blood of the allergic P21. This allergic person
repräsentiert solche Allergiker, deren IgE-Antikörper im Streifentest-Verfahren eine nachweisbare Bindung an rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His zeigen (Gruppe„A")- represents those allergic persons whose IgE antibodies show a detectable binding to rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His in the strip test method (group "A") -
Bei gleicher Konzentration unveränderten, rekombinanten Allergens und des rPhl p 6 d[P29, 30]+ 6His zeigt letzteres bei beiden Spendern eine geringere Bindung an membrangebundene IgE-Antikörper und daraus resultierend eine drastisch verminderte Aktivierung von basophilen Granulozyten (Abb. 11.). At the same concentration of unchanged, recombinant allergens and the rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, the latter shows less binding to membrane-bound IgE antibodies in both donors, resulting in a drastically reduced activation of basophilic granulocytes (Figure 11).
Die Ergebnisse beweisen somit eine funktionell reduzierte Allergenität der Mutante rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His. Die Mutanten rPhl p 6 d[P57] + 6His und rPhl p 6 d[P79] + 6His zeigen bei Spender P21 eine klar verringerte The results thus demonstrate a functionally reduced allergenicity of the mutant rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His. The mutants rPhl p 6 d [P57] + 6His and rPhl p 6 d [P79] + 6His show a distinctly reduced in donor P21
Aktivierung der Basophilen Zellen. Somit kann mit diesem Test bestätigt werden, dass Prolinmutationen auch in diesen beiden Regionen des Phl p 6 zumindest bei einem Teil von Allergikern die IgE-Bindungsfähigkeit senkt. Activation of basophil cells. Thus, it can be confirmed with this test that proline mutations also in these two regions of Phl p 6 lowers the IgE binding ability of at least a part of allergy sufferers.
T-Zell-Reaktivität der Varianten: T cell reactivity of variants:
Zur Untersuchung der T-Zell-Reaktivität werden oligoklonale T-Zell-Linien von Gräserpollen-Allergikern unter Stimulation mit dem unveränderten Allergen nach üblichen Verfahren etabliert. In einem Proliferationstest werden die unterschiedlichen T-Zell-Linien mit dem Referenzallergen rPhl p 6 wt sowie den modifizierten rekombinanten Allergenvarianten stimuliert. Die Proliferationsrate wird durch den Einbau von [3H]-Thymidin mit den üblichen Verfahren bestimmt. To investigate T cell reactivity, oligoclonal T cell lines of grass pollen allergy sufferers under stimulation with the unchanged allergen are established by conventional methods. In a proliferation test, the different T cell lines are stimulated with the reference allergen rPhl p 6 wt and the modified recombinant allergen variants. The Proliferation rate is determined by the incorporation of [3H] thymidine by the usual methods.
Die Varianten rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[57] + 6His und rPhl p 6 d[79] + 6His stimulieren in die untersuchten T-Zell-Linien in vergleichbarem Maße zur Proliferation durch das unveränderte Allergen. Daraus kann ein Erhalt der wichtigen T-Zell-Epitope gefolgert werden. The variants rPhl p 6 d [P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d [57] + 6His and rPhl p 6 d [79] + 6His stimulate in the investigated T cell lines to a comparable extent to the proliferation by the unmodified allergen. It can be concluded that the important T-cell epitopes are conserved.
Beispiel 2: Varianten des Phl p 6 mit Kombinationen von Prolindeletionen in mehreren Schleifenregionen Example 2: Variants of Phl p 6 with combinations of proline deletions in several loop regions
Im Folgenden ist die Herstellung und immunologische Charakterisierung der Varianten rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His und rPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6His beispielhaft für hypoallergene Varianten der Gruppe-6-Allergene der Poaceae mit Kombinationen von Prolin-Deletionen entsprechend den In the following, the preparation and immunological characterization of the variants rPhl p 6 d [P29, 30, 57] + 6His and rPhl p 6 d [29, 30, 79] + 6His is an example of hypoallergenic variants of the group 6 allergens of the Poaceae Combinations of Proline Deletions According to the
Aminosäurepositionen des Phl p 6 Wildtyps (IUIS Eintrag Phl p 6.0102) 29, 30; 57 und 79 dargestellt. Die deletierten Prolinreste können sich dabei in zwei oder drei der zu Phl p 6 homologen Schleifenregionen befinden. Analog werden die entsprechenden hypoallergenen Varianten des Phl p 6 Wildtyp- Isomers Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1 , UniProt: P43215) hergestellt und untersucht und analog können auch die hypoallergenen Varianten der weiteren erfindungsgemäßen Gruppe 6-Allergene der Süßgräser sowie deren Wildtyp-Proteine, insbesondere Poa p 6, hergestellt und untersucht werden. Amino acid positions of Phl p 6 wild-type (IUIS entry Phl p 6.0102) 29, 30; 57 and 79 are shown. The deleted proline residues may be located in two or three of the loop regions which are homologous to Phl p 6. Analogously, the corresponding hypoallergenic variants of the Phl p 6 wild-type isomer Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215) are prepared and investigated, and analogously, the hypoallergenic variants of the further group 6 allergens of sweet grasses according to the invention and their wild-type Proteins, in particular Poa p 6, are produced and investigated.
Die Kodons werden so gewählt, dass die deduzierte Aminosäuresequenz auf der des reifen Phl p 6.0102 basiert (Abb. 3, Abb. 4). Die Mutationen für die Prolin-Deletionen werden eingeführt, indem spezifische Oligonukleotide in den PCR-Reaktionen eingesetzt wurden, denen die entsprechenden Kodons für Prolin fehlen. Die Oligonukleotide werden vorzugweise so gewählt, dass das deduzierte Protein am 5"-Ende einen Hexa-Histidin-Fusionsanteil trägt (Abb. 5, Abb. 6). Die DNAs werden in den Expressionsvektor pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) über eine Topoisomerase-Reaktion ligiert. Die Richtigkeit der DNA wird durch Sequenzierung bestätigt. Es können jedoch auch andere gängige Expressionsvektoren verwendet werden. Die Expression der rekombinanten Histidin-Fusionsproteine kann in allen gängigen eukaryontischen und prokaryontischen Expressionssystemen erfolgen, vorzugweise erfolgt die Expression in Escherichia coli (Stamm Top10; Invitrogen). Die Varianten werden durch die spezifische Bindung der N-terminalen Histidinreste an eine Ni2+-Chelat-Matrix (Immobilized-Metal-Ion- Affinity-Chromatography, IMAC; Material: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Schweden) primär gereinigt. Anschließend werden die rekombinanten The codons are chosen so that the deduced amino acid sequence is based on the mature Phl p 6.0102 (Figure 3, Figure 4). The mutations for the proline deletions are introduced by using specific oligonucleotides in the PCR reactions lacking the corresponding codons for proline. The oligonucleotides are preferably chosen such that the deduced protein carries a hexa-histidine fusion portion at the 5 " end (Figure 5, Figure 6) .The DNAs are inserted into the expression vector pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) via a topoisomerase reaction. The correctness of the DNA is confirmed by sequencing. However, other common expression vectors can be used. The expression of the recombinant histidine fusion proteins can be carried out in all common eukaryotic and prokaryotic expression systems, preferably in Escherichia coli (strain Top10, Invitrogen). The variants are primarily purified by the specific binding of the N-terminal histidine residues to a Ni 2+ chelate matrix (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC, Material: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Subsequently, the recombinant
Proteine aus dem IMAC-Eluat konzentriert und eine Gelfiltration durchgeführt (Material: Superdex 75; GE Healthcare). Biochemische Analytik: Concentrated proteins from the IMAC eluate and gel filtration (material: Superdex 75, GE Healthcare). Biochemical analysis:
Die Reinheit der hergestellten Proteine wird zunächst durch ein SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung überprüft. Die Analyse zeigte einen sehr hohen Reinheitsgrad aller Proteine auf (Abb. 12). Die Analytische SEC, bei der die Proteine unter nativen Bedingungen untersucht werden, zeigt, dass die Proteine in einem einzigen Peak eluieren. Hochmolekulare Aggregate werden nicht detektiert (Abb. 13.). Die Online- Bestimmung der Molekülmasse durch MALS/ Rl führt zu dem Ergebnis, dass rPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6His rein monomer vorliegt, während das eluierte rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His eine Mischung aus Monomeren und Dimeren darstellt (Abb. 13; Tab. 2). Die mit UV-Vis-Spektroskopie aufgenommenen Wellenspektren beider Proteine sind jedoch typisch für Proteine mit hoher Löslichkeit. Beide Proteine sind somit unter nativen Bedingungen löslich, rein und frei von Präzipitaten und erfüllen damit die wesentlichen Vorraussetzungen für eine genaue Analyse ihrer spezifischen IgE-Bindungsfähigkeit. Tabelle 2: Molekulargewicht der Phl p 6-Mutanten mit Mutationen in mehreren Schleifen The purity of the proteins produced is first checked by SDS-PAGE followed by Coomassie staining. The analysis showed a very high degree of purity of all proteins (Figure 12). Analytical SEC, which studies the proteins under native conditions, shows that the proteins elute in a single peak. High molecular aggregates are not detected (Figure 13). The online determination of the molecular mass by MALS / Rl leads to the result that rPhl p 6 d [29, 30, 79] + 6His is pure monomer, while the eluted rPhl p 6 d [P29, 30, 57] + 6His a Mixture of monomers and dimers (Figure 13, Table 2). However, the wave spectra of both proteins recorded with UV-vis spectroscopy are typical of proteins with high solubility. Both proteins are soluble under native conditions, pure and free of precipitates, and thus fulfill the essential requirements for an accurate analysis of their specific IgE binding capacity. Table 2: Molecular weight of the Phl p 6 mutants with mutations in several loops
1 Kalkuliertes Molekulargewicht auf Grundlage der Aminosäuresequenz mit Start-Methionin (Software: EditSeq 6.0; DNA-Star Inc., Madison, USA). 1 Calculated molecular weight based on the amino acid sequence with starting methionine (Software: EditSeq 6.0, DNA Star Inc., Madison, USA).
2 Bestimmung der Partikelmasse durch Gelfiltration (SEC). Angegeben ist der Durchschnitt der Masse der eluierten Proteinpartikel im gesetzten Peakfenster. 2 Determination of particle mass by gel filtration (SEC). Indicated is the average of the mass of the eluted protein particles in the set peak window.
Zur Online-Bestimmung der Proteinkonzentration wurde der Brechungsindex-Detektor (Rl) OptilabrEX (Wyatt, Santa Barbara, USA) eingesetzt. Die Lichtstreuung der Partikel wurde mit dem Mehrwinkeldetektor MiniDAWN Treos (Wyatt) bestimmt. Die Berechnung der The refractive index detector (RL) OptilabrEX (Wyatt, Santa Barbara, USA) was used to determine the protein concentration online. The light scattering of the particles was determined with the multi-angle detector MiniDAWN Treos (Wyatt). The calculation of
Partikelmasse erfolgte mit der Software ASTRA 5.3.2.17 (Wyatt) über Debeye-Formalismus mit einem angenommenen Brechungsindexinkrement von 0,180 ml/ g. SEC-Säule: Superdex 200 GL 10/ 300 (GE Healthcare, Uppsala, Schweden). Laufmittel: 20 mM Natriumphosphat- Puffer pH 7,2 mit 150 mM NaCI.  Particulate mass was measured using ASTRA 5.3.2.17 (Wyatt) software via Debeye formalism with an assumed refractive index increment of 0.180 ml / g. SEC column: Superdex 200 GL 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Eluent: 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 with 150 mM NaCl.
Nachweis der Reduzierten IgE-Bindung: Detection of reduced IgE binding:
Die Ergebnisse eines Streifentests mit rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His und rPhl p 6 d[29, 30, P79] + 6His unter Einsatz von 18 individuellen Gräserpollen- Allergikerseren sind in Abb. 14 dargestellt. Überraschenderweise zeigt sich, dass die Seren von Allergikern, die im Streifentest noch eine nachweisbare IgE-Bindung zu rPhl p 6 d[P29, 30] aufweisen, eine überwiegend massiv verringerte IgE-Reaktivität mit den Varianten rPhl p 6 d[P29, 30, 57] + 6His und rPhl p 6 d[29, 30, 79] + 6His aufweisen (Gruppe„A": Seren 21 , 32, 83, 137 etc.). The results of a strip test with rPhl p 6 d [P29, 30, 57] + 6His and rPhl p 6 d [29, 30, P79] + 6His using 18 individual grass pollen allergy sera are shown in FIG. Surprisingly, it has been shown that the sera of allergy sufferers which still show a detectable IgE binding to rPhl p 6 d [P29, 30] in the strip test show a predominantly massively reduced IgE reactivity with the variants rPhl p 6 d [P29, 30 57] + 6His and rPhl p 6 d [29, 30, 79] + 6His (group "A": sera 21, 32, 83, 137, etc.).
Es ist damit klar gezeigt, dass die IgE-Bindungsfähigkeit des Phl p 6 durch mehrere kombinierte Deletionen von Prolinen aus verschiedenen It is thus clearly shown that the IgE binding ability of Phl p 6 is due to several combined deletions of prolines from different
Schleifenregionen weiter verringert werden kann, als es durch die Deletion von Prolinresten in nur einer einzelnen Schleifenregion möglich ist.  Loop regions can be further reduced than is possible by the deletion of proline residues in only a single loop region.
T-Zell-Reaktivität der Varianten: T cell reactivity of variants:
Die Varianten stimulieren die Proliferation der untersuchten T-Zell-Linien in vergleichbarem Maße wie das unveränderte Allergen. Daraus kann ein Erhalt der wichtigen T-Zell-Epitope gefolgert werden. The variants stimulate the proliferation of the investigated T-cell lines to a comparable extent as the unchanged allergen. It can be concluded that the important T-cell epitopes are conserved.
Beispiel 3: Varianten des Phl p 6 mit Kombinationen von Prolin- Punktmutationen in mehreren Schleifenregionen Example 3: Variants of Phl p 6 with combinations of proline-point mutations in several loop regions
Im Folgenden ist die Herstellung und immunologische Charakterisierung der Varianten rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His, rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6His und rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6His beispielhaft für hypoallergene Varianten der Gruppe-6-Allergene der Poaceae mit Kombinationen von Prolin- Punktmutationen entsprechend den Aminosäurepositionen des Phl p 6 Wildtyps (IUIS Eintrag Phl p 6.0102) 29, 30 57 und 79 dargestellt. Die In the following the production and immunological characterization of the variants rPhl p 6 d [P29, 30] P57L + 6His, rPhl p 6 d [29, 30] P79L + 6His and rPhl p 6 d [29, 30] P57L P79L + 6His are exemplary for hypoallergenic variants of the Poaceae group 6 allergens with combinations of proline-point mutations corresponding to the amino acid positions of the Phl p 6 wild-type (IUIS entry Phl p 6.0102) 29, 30, 57 and 79. The
Prolinreste können in jede Aminosäure umgewandelt sein. Analog werden die entsprechenden hypoallergenen Varianten des Phl p 6 Wildtyp-Isomers Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1 , UniProt: P43215) hergestellt und untersucht und analog können auch die hypoallergenen Varianten der weiteren Proline residues can be converted to any amino acid. Analogously, the corresponding hypoallergenic variants of the Phl p 6 wild-type isomer Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215) are prepared and investigated, and analogously, the hypoallergenic variants of the others can also be prepared
erfindungsgemäßen Gruppe 6-Allergene der Süßgräser sowie deren Wildtyp- Proteine, insbesondere Poa p 6, hergestellt und untersucht werden. Group 6 allergens of sweet grasses and their wild-type proteins, in particular Poa p 6, according to the invention and are investigated.
Die Kodons werden so gewählt, dass die deduzierte Aminosäuresequenz auf der des reifen Phl p 6.0102 basiert (Abb. 3, Abb. 4). Die Mutationen für die Prolin-Deletionen werden eingeführt indem spezifische Oligonukleotide in den PCR-Reaktionen eingesetzt wurden, denen die entsprechenden Kodons für Prolin fehlen. Die Oligonukleotide werden vorzugsweise so gewählt, dass das deduzierte Protein am 5 -Ende einen Hexa-Histidin-Fusionsanteil trägt (Abb. 5, Abb. 6). The codons are chosen so that the deduced amino acid sequence is based on the mature Phl p 6.0102 (Figure 3, Figure 4). The mutations for the Proline deletions are introduced by using specific oligonucleotides in the PCR reactions lacking the corresponding codons for proline. The oligonucleotides are preferably selected such that the deduced protein carries a hexa-histidine fusion fraction at the 5 'end (FIG. 5, FIG. 6).
Die DNAs werden in den Expressionsvektor pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) über eine Topoisomerase-Reaktion ligiert. Die Richtigkeit der DNA wurde durch Sequenzierung bestätigt. Es können jedoch auch andere gängige Expressionsvektoren verwendet werden. The DNAs are ligated into the expression vector pTrcHis2 Topo (Invitrogen, Carlsbad, USA) via a topoisomerase reaction. The correctness of the DNA was confirmed by sequencing. However, other common expression vectors can be used.
Die Expression der rekombinanten Histidin-Fusionsproteine kann in allen gängigen eukaryontischen und prokaryontischen Expressionssystemen erfolgen, vorzugweise erfolgt die Expression in Escherichia coli (Stamm Top10; Invitrogen). Die Varianten werden durch die spezifische Bindung der N-terminalen Histidinreste an eine Ni2+-Chelat-Matrix (Immobilized-Metal-Ion- Affinity-Chromatography, IMAC; Material: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Schweden) primär gereinigt. Anschließend werden die rekombinanten Proteine aus dem IMAC-Eluat konzentriert und eine Gelfiltration durchgeführt (Material: Superdex 75; GE Healthcare). The expression of the recombinant histidine fusion proteins can be carried out in all common eukaryotic and prokaryotic expression systems, preferably in Escherichia coli (strain Top10, Invitrogen). The variants are primarily purified by the specific binding of the N-terminal histidine residues to a Ni 2+ chelate matrix (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC, Material: HiTrap, GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Subsequently, the recombinant proteins are concentrated from the IMAC eluate and gel filtration is performed (material: Superdex 75, GE Healthcare).
Biochemische Analytik: Biochemical analysis:
Die Reinheit der hergestellten Proteine wird zunächst durch ein SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung überprüft. Die Analyse zeigt einen sehr hohen Reinheitsgrad aller Proteine auf (Abb. 12).  The purity of the proteins produced is first checked by SDS-PAGE followed by Coomassie staining. The analysis shows a very high degree of purity of all proteins (Figure 12).
Die Analytische SEC, bei der die Proteine unter nativen Bedingungen untersucht werden, zeigt dass die Proteine in einem einzigen Peak eluieren. Hochmolekulare Aggregate werden nicht detektiert (Abb. 13.) Die Online- Bestimmung der Molekülmasse durch MALS/ Rl führt zu dem Ergebnis, dass rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6His rein monomer vorliegt, während das eluierte rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His eine Mischung aus Monomeren und Dimeren darstellt. rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6His liegt überwiegend als Dimer vor (Abb. 13; Tab. 2). Analytical SEC, which studies the proteins under native conditions, shows that the proteins elute in a single peak. High molecular weight aggregates are not detected (Figure 13). The online determination of the molecular mass by MALS / Rl leads to the conclusion that rPhl p 6 d [29, 30] P79L + 6His is pure monomer, whereas the eluted rPhl p 6 d [P29, 30] P57L + 6His a mixture of monomers and dimers represents. rPhl p 6 d [29, 30] P57L P79L + 6His predominantly exists as a dimer (Figure 13, Tab.
Die mit UV-Vis-Spektroskopie aufgenommenen Wellenspektren aller Proteine sind typisch für Proteine mit hoher Löslichkeit. Die drei Proteine sind somit unter nativen Bedingungen löslich, rein und frei von Präzipitaten und erfüllen damit die wesentlichen Vorraussetzungen für eine genaue Analyse ihrer spezifischen IgE-Bindungsfähigkeit. Nachweis der reduzierten IgE-Bindung: The wave spectra of all proteins recorded with UV-Vis spectroscopy are typical of proteins with high solubility. The three proteins are thus soluble under native conditions, pure and free of precipitates, and thus fulfill the essential prerequisites for an accurate analysis of their specific IgE-binding capacity. Detection of reduced IgE binding:
Die Ergebnisse eines Streifentests mit rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His, rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6His und rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6His unter Einsatz von 18 individuellen Gräserpollen-Allergikerseren sind in Abb. 12 dargestellt.  The results of a strip assay with rPhl p 6 d [P29, 30] P57L + 6His, rPhl p 6 d [29, 30] P79L + 6His and rPhl p 6 d [29, 30] P57L P79L + 6His using 18 individual grass pollen Allergic sera are shown in Fig. 12.
Überraschenderweise zeigt sich, dass die Seren von Allergikern, die im Surprisingly, it turns out that the serums of allergy sufferers in the
Streifentest noch eine nachweisbare IgE-Bindung zu rPhl p 6 d[P29, 30] aufweisen, eine überwiegend massiv verringerte IgE-Reaktivität mit den Varianten rPhl p 6 d[P29, 30] P57L + 6His, rPhl p 6 d[29, 30] P79L + 6His und rPhl p 6 d[29, 30] P57L P79L + 6His aufweisen (Gruppe„A": Seren 21 , 32, 83, 137 etc.). Strip test still show a detectable IgE binding to rPhl p 6 d [P29, 30], a predominantly massively reduced IgE reactivity with the variants rPhl p 6 d [P29, 30] P57L + 6His, rPhl p 6 d [29, 30 ] P79L + 6His and rPhl p 6 d [29, 30] P57L P79L + 6His (group "A": sera 21, 32, 83, 137, etc.).
Es ist damit klar gezeigt, dass die IgE-Bindungsfähigkeit des Phl p 6 durch mehrere kombinierte Punktmutationen von Prolinen aus verschiedenen Schleifenregionen weiter verringert werden kann, als es durch die Thus, it is clearly shown that the IgG binding ability of Phl p 6 can be further reduced by several combined point mutations of prolines from different loop regions than are given by the
Punktmutation von Prolinresten in nur einer einzelnen Schleifenregion möglich ist.  Point mutation of proline residues in only a single loop region is possible.
T-Zell-Reaktivität der Varianten: T cell reactivity of variants:
Die Varianten stimulieren die Proliferation der untersuchten T-Zell-Linien in vergleichbarem Maße wie das unveränderte Allergen. Daraus kann ein Erhalt der wichtigen T-Zell-Epitope gefolgert werden.  The variants stimulate the proliferation of the investigated T-cell lines to a comparable extent as the unchanged allergen. It can be concluded that the important T-cell epitopes are conserved.

Claims

Patentansprüche claims
1. Hypoallergene Variante eines Gruppe 6-Allergens der Familie der 1. Hypoallergenic variant of a group 6 allergen of the family
Süßgräser (Poaceae), bei der die Proline, die in einem Alignment den Prolinen der Positionen 29, 30, 57, 79 in der Aminosäuresequenz des Wildtyp-Phl p 6 entsprechen, einzeln oder in Kombinationen mutiert sind.  Sweet grasses (Poaceae) in which the prolines corresponding in alignment to the prolines of positions 29, 30, 57, 79 in the amino acid sequence of the wild-type Phl p 6 are mutated individually or in combinations.
2. Hypoallergene Variante gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Gruppe 6-Allergen Phl p 6 ist. 2. Hypoallergenic variant according to claim 1, characterized in that the group 6 allergen Phl p is 6.
3. Hypoallergene Variante gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch 3. Hypoallergenic variant according to claim 1 or 2, characterized
gekennzeichnet, dass es sich um ein Fragment oder eine Variante einer hypoallergenen Variante gemäß Anspruch 1 oder 2 oder um ein Multimer einer oder mehrerer hypoallergener Varianten gemäß Anspruch 1 oder 2 handelt oder dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere  characterized in that it is a fragment or a variant of a hypoallergenic variant according to claim 1 or 2 or a multimer of one or more hypoallergenic variants according to claim 1 or 2 or characterized in that one or more
hypoallergene Varianten gemäß Anspruch 1 oder 2 oder deren Fragmente, Varianten oder Multimere Bestandteil eines rekombinanten  Hypoallergenic variants according to claim 1 or 2 or their fragments, variants or multimers part of a recombinant
Fusionsproteins sind.  Fusion protein are.
4. DNA-Molekül, das für eine hypoallergenen Variante gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 kodiert. 4. DNA molecule coding for a hypoallergenic variant according to one or more of claims 1 to 3.
5. Rekombinanter Expressionsvektor, enthaltend ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 4, funktionell verbunden mit einer Expressions-Kontrollsequenz. 5. Recombinant expression vector containing a DNA molecule according to claim 4, operably linked to an expression control sequence.
6. Nicht-menschlicher Wirtsorganismus, transformiert mit einem DNA-Molekül gemäß Anspruch 4 oder einem rekombinanten Expressionsvektor gemäß Anspruch 5. 6. A non-human host organism transformed with a DNA molecule according to claim 4 or a recombinant expression vector according to claim 5.
7. Verfahren zur Herstellung einer hypoallergenen Variante gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 3 durch Kultivierung eines nichtmenschlichen Wirtsorganismus gemäß Anspruch 6 und Gewinnung der entsprechenden Allergenvariante aus der Kultur. 7. A method for producing a hypoallergenic variant according to one or more of claims 1 to 3 by culturing a non-human host organism according to claim 6 and obtaining the corresponding allergen variant from the culture.
8. Hypoallergene Variante gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 3 als Arzneimittel. 8. Hypoallergenic variant according to one or more of claims 1 to 3 as a medicament.
9. DNA-Molekül gemäß Anspruch 4 als Arzneimittel. 9. DNA molecule according to claim 4 as a medicament.
10. Rekombinanter Expressionsvektor gemäß Anspruch 5 als Arzneimittel. 10. Recombinant expression vector according to claim 5 as a medicament.
11.Verwendung wenigstens einer hypoallergenen Variante gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention und/oder therapeutischen Behandlung von Typ-1 Allergien, an deren Auslösung Gruppe 6-Allergene der Süßgräser ursächlich beteiligt sind. 11.The use of at least one hypoallergenic variant according to one or more of claims 1 to 3 for the manufacture of a medicament for the prevention and / or therapeutic treatment of type 1 allergies, in the initiation of which group 6 allergens of grasses are causally involved.
12. Verwendung wenigstens eines DNA-Moleküls gemäß Anspruch 4 und/oder eines rekombinanten Expressionsvektors gemäß Anspruch 5 zur 12. Use of at least one DNA molecule according to claim 4 and / or a recombinant expression vector according to claim 5 to
Herstellung eines Arzneimittels zur immuntherapeutischen DNA- Vakzinierung.  Preparation of a medicament for immunotherapeutic DNA vaccination.
13. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend wenigstens eine hypoallergene Variante gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wenigstens ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 4 und/oder wenigstens einen 13. Pharmaceutical preparation containing at least one hypoallergenic variant according to one or more of claims 1 to 3, at least one DNA molecule according to claim 4 and / or at least one
rekombinanten Expressionsvektor gemäß Anspruch 5 und gegebenenfalls weitere Wirk- und/oder Hilfsstoffe zur Prävention und/oder therapeutischen Behandlung von Typ-1 Allergien.  Recombinant expression vector according to claim 5 and optionally further active ingredients and / or adjuvants for the prevention and / or therapeutic treatment of type 1 allergies.
14. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 13, dadurch 14. Pharmaceutical preparation according to claim 13, characterized
gekennzeichnet, dass es sich bei den weiteren Wirkstoffen um Allergene der Süßgräser oder Varianten davon handelt.  in that the further active ingredients are allergens of the grasses or variants thereof.
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