EP2326431A1 - Method for normalizing the contents of biomolecules in a sample - Google Patents

Method for normalizing the contents of biomolecules in a sample

Info

Publication number
EP2326431A1
EP2326431A1 EP09783068A EP09783068A EP2326431A1 EP 2326431 A1 EP2326431 A1 EP 2326431A1 EP 09783068 A EP09783068 A EP 09783068A EP 09783068 A EP09783068 A EP 09783068A EP 2326431 A1 EP2326431 A1 EP 2326431A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reaction
biomolecules
pcr
vessel
reaction vessel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09783068A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Christoph Erbacher
Peter GRÜNEFELD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
Publication of EP2326431A1 publication Critical patent/EP2326431A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method, a use and a device for normalizing the content of biomolecules in a sample.
  • the method, the use and the device are suitable, for example, for applications in biochemistry, molecular biology, molecular genetics, microbiology, molecular diagnostics and / or molecular forensics.
  • the standardization of the content of biomolecules in a sample plays a major role in the analysis of samples, for example in molecular diagnostics, gene expression analyzes, in drug-related transcript level analysis, molecular forensics, sequencing or genotyping.
  • biomolecules to be detected-in particular nucleic acids and / or proteins-can occur in different amounts in the sample.
  • preparatory sample treatment steps e.g. a lysis, a cell disruption, an isolation step or a reverse transcription - to provide the biomolecules concerned with different levels of efficiency.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RNA content of a sample is usually determined before the beginning of the reverse transcription, for example by means of OD or fluorescence measurements.
  • a quantification at the cDNA level is usually not carried out, since existing nucleotides, ribosomal RNA u.a. Components after completing reverse transcription complicate a quantification of the cDNA.
  • Such a quantification approach can be used in particular in so-called two-step methods in which the sample preparation (eg by lysis, cell disruption, isolation step or reverse transcription) and the sample further treatment (eg by PCR) takes place in separate steps and / or different vessels, so that a pipetting step can take place between the two steps.
  • sample preparation eg by lysis, cell disruption, isolation step or reverse transcription
  • sample further treatment eg by PCR
  • a pipetting step can take place between the two steps.
  • a pipetting step is suitable for those methods in which a possibly already prepared sample is directly subjected to a PCR process.
  • One-step methods from the prior art use an optionally spectroscopically quantified amount of biomolecules (for example mRNA).
  • biomolecules for example mRNA
  • Both the reverse transcription and the PCR procedure itself are carried out in the same reaction vessel. Since the latter is not opened during the procedure as far as possible, so the complete batch of reverse transcription is converted into the PCR reaction.
  • the biomolecule content for example, of mRNA
  • the efficiency of the sample preparation step for example, reverse transcription
  • is also subject to fluctuations which leads in some cases to very different product quantities after completion of the sample preparation step (for example, cDNA). which are then introduced into the subsequent reaction (for example PCR), and thus leads to non-reproducible reaction results.
  • the additional reaction batch volume of usually 20 .mu.l also can not be used in a customary for a PCR volume of 25 ul.
  • single-stage RT-PCRs are performed in a 50 ⁇ l or 100 ⁇ l scale.
  • the method according to the invention or the device according to the invention e.g. normalizes an absolute amount of nucleic acid by a binding area produced according to the invention in a device, instead of quantifying it with OD measurements or fluorescence measurements.
  • the so-called "housekeeper approach” is an internal or endogenous reference that can also be used to make a statement about the state of the biological system. The quality of the assay can be assessed with the housekeeper gene, because it exists for certain housekeeper genes associated with certain cell types are indicative of their level of expression.
  • Nucleic acids can then be bound.
  • a pH above the pKa value of the surface groups on the other hand, a change in the charge from the positive to the neutral or negative, so that negatively charged biomolecules, in particular nucleic acids, can be released again.
  • suitable buffers with different pH values which otherwise have low salt concentrations (“low-salt buffer”), the binding and release process can be controlled via the pH value.
  • suitable materials are not permanently covalent, for example, on the surface of
  • Micro-reaction vessels for example made of polypropylene, fasten.
  • RNA isolation of RNA from biological samples under these conditions is problematic with charge-switch materials and generally with anion exchangers due to the ubiquitous RNAs, which remain intact under the prevailing low salt conditions, degrading RNA significantly within a few seconds and providing detection difficult or even impossible.
  • nucleic acid is understood to mean, in particular but not limited to, natural, preferably linear, September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • branched or circular nucleic acids such as RNA, in particular mRNA, single-stranded and double-stranded viral RNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA or ribozymes, genomic, bacterial or viral DNA (single-stranded and double-stranded), chromosomal and episomal DNA, free-circulating nucleic acid and the like , synthetic or modified nucleic acids, for example plasmids or oligonucleotides, in particular primers, probes or standards used for the PCR, nucleic acids labeled with digoxigenin, biotin or fluorescent dyes or so-called PNAs ("peptide nucleic acids").
  • RNA in particular mRNA, single-stranded and double-stranded viral RNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA or ribozymes, genomic, bacterial or viral DNA (single-stranded and double-stranded
  • normalizing the content of biomolecules in a sample is understood to mean a step in which it is ensured that the content of biomolecules in the sample is a predetermined (according to the invention by the size and binding properties of at least part of the vessel surface, preferably at the Inside the vessel) is a measure of quantifying the content of biomolecules to a predetermined value, which implies that biomolecules beyond this level are subsequently discarded, and further implies that if the sample contains fewer biomolecules than the predetermined measure described above, the normalization is unsuccessful.
  • immobilization in the sense of the present invention is understood to mean, in particular but not limited to, a reversible immobilization to a suitable solid phase.
  • membranes are meant, in particular but not limited to, solid phases capable of reversibly binding biomolecules. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • high salt buffer in particular, but not limited to, a buffer having a high salt concentration (preferably chaotropic substances), preferably> 100 mM, more preferably> 500 mM and more preferably> 1 M.
  • high salt conditions is understood below to mean a medium which uses a high salt buffer, preferably a high salt buffer containing chaotropic salts
  • High salt preferably containing chaotropic salts
  • a polar surface as a hydrogen bond donor
  • the nucleic acids bind to this surface, where they undergo better stabilization than in water Water again a better hydrogen bond donor than the polar surface, and the nucleic acids can be detached again from the surface.
  • chaotropic substances or “chaotropic salts” are in particular - but not limited to - substances containing the secondary,
  • Tertiary and / or quaternary structure of proteins and / or nucleic acids change and at least leave the primary structure intact, the solubility more polar
  • Preferred chaotropic substances are guanidine hydrochloride, guanidinium (iso) thiocyanate, sodium iodide,
  • silica amorphous, crystalline
  • polysilicic acid with the September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • the material can be surface-functionalized.
  • the silanol groups may have been treated by silanization with silanes.
  • the surface can be hydrophobized or anionic and / or cationic groups and / or chelators can be applied.
  • a nitrilotriacetic acid (NTA) can be applied as a chelating group. This allows an adaptation of the adsorber surface to the biomolecules to be bound.
  • halogen-containing atom transfer radical initiators to the silanol groups by means of a silanization process so that polymer chains can be generated by a "grafting from” process on the silanol groups.
  • This process also referred to as graft copolymerization, requires polymerization processes in which the tendency to chain break, disproprionation or recombination has a low frequency.
  • initiators must be applied to the silanol groups. This can be done by treating the PECVD silicate layer with halogenated silanes. Alternatively, the initiators are introduced directly in the PECVD process. In the process, volatile, halogen-containing compounds are added to the process gas (precursor in the PECVD process). September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • polymers which are covalently bonded to the surface can be generated in situ.
  • Suitable monomers are radically polymerizable compounds, e.g. Acrylates, methacrylates, styrene and styrene derivatives.
  • the atom transfer radical polymerization is a form of living, radical polymerization.
  • the radicals are formed via a Cu-I / CuII redox equilibrium from an organohalide through an atom transfer process.
  • the redox balance ensures a strong reduction in the concentration of free radicals. Chain termination reactions by disproportionation or recombination are therefore strongly suppressed.
  • amplification reaction is understood to mean a process which makes it possible to at least double the concentration of one or more analytes, preferably nucleic acids.
  • thermocyclic amplification reactions A distinction is made here between isothermal and thermocyclic amplification reactions. In the former, the temperature remains the same throughout the process, while in the latter, thermal cycles are passed through which the reaction and amplification are controlled.
  • Preferred isothermal amplification reactions are e.g.
  • LAMP Loop mediated isothermal amplification
  • NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
  • TMA Transcription mediated amplification
  • thermocyclic amplification reactions are e.g.
  • Ligase chain reaction (LCR), and / or
  • PCR polymerase chain reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • an RNA matrix is added to a reaction mixture, and a first primer binds to the complementary sequence near the 3 'end of the matrix.
  • the complementary to the matrix DNA strand is polymerized with a reverse transcriptase.
  • RNase H the RNA matrix is then digested (RNase H digests only RNA in RNA-DNA hybrids, not single-stranded RNA).
  • a second primer is attached to the 5 'end of the DNA strand. This is used by the T7 RNA polymerase as a starting point for the synthesis of a DNA strand complementary to the RNA molecule, which can then be used again as the starting matrix.
  • NASBA is maintained at a constant temperature of normally 41 ° C. performs and delivers faster and better results than PCR under certain circumstances.
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • rolling circle chain reaction (RCCR) or “rolling circle amplification” (RCA) refers to an amplification method that mimics the general nucleic acid replication according to the rolling circle principle and is described inter alia in US5854033.
  • immuno-PCR is understood to mean, in particular, a method for detecting target molecules in which chimeric conjugates of target-specific antibodies and nucleic acid molecules are used.
  • target molecules are above all proteins and / or oligopeptides, since they are the simplest against these molecular species September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • target molecules may also be other biomolecule species, e.g. Oligo- and polysaccharides, or lipids, as long as against these biomolecule lekülspezies spaspezif ⁇ sche antibodies can be produced so that they can be detected using the immuno-PCR.
  • biomolecule species e.g. Oligo- and polysaccharides, or lipids
  • the nucleic acid molecules serve as markers or probes which are amplified for signal generation by means of polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the tremendous efficiency of the nucleic acid amplification and the high specificity of binding can result in a 100 to 10,000-fold increase in sensitivity compared to standard methods for detection of target molecules (e.g., ELISA methods).
  • the IPCR was developed in 1992 (Sano et al., (1992)).
  • reverse transcription is understood to mean a method for rewriting mRNA into DNA (the so-called “cDNA”), in which a reverse transcriptase (also RNA-dependent DNA polymerase) is generally used. This first synthesizes an RNA-DNA hybrid strand from a single-stranded RNA by means of an RNA-dependent DNA polymerase activity. For the subsequent degradation of the RNA portion, a separate section of the protein is responsible, the RNase H-share. This is followed by the completion of the single-stranded DNA strand to double-stranded by DNA-dependent DNA polymerase activity. The cDNA generated in this way can then be amplified and detected by means of PCR.
  • cDNA reverse transcriptase
  • a reverse transcriptase primer also requires the initiation of DNA synthesis.
  • a so-called oligo-d (T) primer is used here, ie several thymine bases, which are complementary to the poly (A) tail at the 3 'end of the mRNA.
  • RT-PCR reverse transcription followed by PCR
  • PCR also referred to as RT-PCR
  • different primers are used for reverse transcription and the subsequent PCR
  • the gene-specific primers are already used in the reverse transcription instead which are also used for the subsequent PCR and both reactions are carried out consecutively in the same vessel, making use of the fact that the reverse transcriptase used (usually of viral origin) denatures at a lower temperature than the DNA polymerase used (eg Taq polymerase), which is known to denature only at relatively high temperatures, and accordingly performs the reverse transcription at a lower temperature than the subsequent PCR
  • a so-called hot-start DNA polymerase is used, which is thermoreversibly inhibited When switching from the lower temperature level of the reverse Transcription to the higher temperature level of the PCR
  • thermoreversible inhibition may e.g. be realized by an antibody which binds in the active center of the DNA polymerase, as well as e.g. by reversible covalent or non-covalent chemical modification of the polymerase, for example with aldehydes (see, e.g., Applicant's U.S. Patent 6,183,998).
  • aldehydes see, e.g., Applicant's U.S. Patent 6,183,998.
  • Birch et al. (1996).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the quantification is performed by fluorescence measurements taken during a PCR cycle (hence the name "Real Time") .
  • the fluorescence increases proportionally with the amount of PCR products at the end of a run Cycles)
  • the quantification in the exponential phase of the PCR is carried out on the basis of the fluorescence signals obtained, only in the exponential phase of the PCR (which lasts a few cycles in one run) the correct quantification is possible, since during this phase the optimal reaction conditions prevail
  • the method differs from other quantitative PCR methods, which perform a quantitative evaluation (eg competitive PCR) only after the end of the PCR, usually involving gel electrophoretic separation of the PCR fragments.
  • dyes such as e.g. Ethidium bromide, SYBR Green I and FRET probes or so-called double-dye oligos (also referred to as TaqMan probes) in question.
  • C ⁇ value (Threshold Cycle) describes the PCR cycle at which an amplificate is detectable for the first time; In this case, the fluorescence is usually measured and the cycle is indicated, at which the latter increases significantly above the background fluorescence for the first time.
  • a low C ⁇ value indicates that even a small number of PCR cycles is sufficient for a first significant increase in fluorescence over the background noise (ie, a relatively large amount of template was present), while a high C ⁇ value accordingly indicates that there are many PCRs for this purpose - Cycles are needed (so relatively little template was present).
  • ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • proteins, viruses as well as low-molecular compounds such as hormones, toxins and pesticides can be detected in a sample (blood serum, milk, urine, etc.).
  • a sample blood serum, milk, urine, etc.
  • Antibody or antigen are previously labeled with an enzyme.
  • the enzyme catalyzed reaction serves as evidence of the presence of the antigen.
  • the so-called Substrate is reacted by the enzyme, the reaction product can usually be detected by color change, fluorescence or Chemo luminescence. Signal strength is generally a function of antigen concentration, so ELISA can also be used for quantitative detection.
  • hybrid capture assay is understood below to mean a process in which RNA: DNA hybrids are formed by incubation of the desired target DNA with an RNA sample. The hybrids are bound to a surface and then incubated with an enzyme-labeled antibody. "Hybrid Capture Assay” are used in particular in the HPV assays of Digene.
  • nested PCR is understood below to mean a method in which an already duplicated DNA fragment is amplified a second time; this process is done with a second primer pair located within the primer pair used in the first reaction.
  • Another object is to provide, for a wide range of applications, a method, a use, and a device for normalizing the level of a nucleic acid in a sample. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • Another object is to provide, for a wide range of applications, a method, a use and a device for normalizing the content of a cDNA produced by means of a reverse transcription from RNA, preferably mRNA.
  • Another object is to provide, for a wide range of applications, a method, a use and a device for normalizing the content of a nucleic acid, in particular RNA in a sample.
  • Another object is to provide a method, a use and a device for normalizing the content of a nucleic acid in a sample, which allows a repeated use of the reaction vessels.
  • a method for normalizing the content of biomolecules in a sample comprising the following steps:
  • reaction vessel having a vessel surface which is at least partially functionalized - preferably on the inside of the vessel - in such a way that it can bind biomolecules reversibly under high salt conditions, b) performing at least one sample preparation step, September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • the surface of the reaction vessel functions for the first time as an adsorption surface for the reversible binding of a defined amount of biomolecules under high salt conditions, and thus as a means of standardizing the biomolecule content in the sample. It is therefore functionalized in such a way that it can reversibly bind biomolecules under high salt conditions.
  • the type of functionalization also depends in particular on the type of biomolecules to be bound. This will be discussed below. The amount of biomolecules that can be bound to the surface is adjusted by the size of the surface, the area contacted by the sample, the nature of the chemical functionalization of that surface, the incubation time of the biomolecules with the surface, and the stringency of the binding buffer used ,
  • RNA contained in a sample can be isolated as completely and intact as possible and sent to detection.
  • a follow-up reaction is performed. This step is also taken as an opportunity to perform a normalization at the cDNA level. It compensates for variations in cellular input, RNA quality and quantity, RT efficiency, allowing the results to be compared and interpreted.
  • the normalization also has the advantage of correcting the measured expression data for differences in cellular input, RNA quality / quantity and efficiency of reverse transcription of different samples (the latter principle only effective in two-step RT PCR).
  • biomolecules are nucleic acids.
  • Nucleic acids are particularly useful with conventional amplification techniques, e.g. PCR, detectable.
  • biomolecules may also be members of any biomolecule species that are detectable with antibodies.
  • proteins intended to be detected by oligonucleotide-labeled antibodies immuno-PCR
  • ELISA ELISA
  • said at least one sample preparation step is selected from the group comprising
  • Said enzymatic reactions and / or sample treatments may preferably be digestion of a sample with RNAses, DNAses and / or proteases.
  • said at least one subsequent reaction is selected from the group comprising
  • Enzyme-Linked Imunoassay ELISA
  • ELISA Enzyme-Linked Imunoassay
  • the said amplification reaction be a reaction selected from the group
  • any other possible detection reaction for at least one of the biomolecule species mentioned above can also be provided here.
  • a particularly suitable example of the method according to the invention consists of a method comprising reverse transcription of mRNA into cDNA (sample preparation step), normalization of the cDNA formed by binding to the vascular surface (binding or standardization step), and subsequent detection amplification of the cDNA Real-time PCR (follow-up reaction). This procedure is referred to in Table 1 as "Workflow 1".
  • the reverse transcription is carried out directly in a reaction vessel according to the invention and the generated cDNA according to September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • An advantage of this method according to the invention over prior art methods is that despite the omission of quantification of the resulting cDNA amount, a normalized amount of cDNA is used for the PCR, regardless of the amount of RNA initially used. Likewise, it is possible to work in a volume of 25 ⁇ l which is customary for a PCR, which leads to a considerable cost reduction.
  • the reverse transcription as well as the subsequent PCR are preferably carried out in the same vessel as described. However, it may also be provided that, after the binding or standardization step, one or more aliquots are removed from the reaction vessel and transferred to one or more new reaction vessels in order to carry out the PCR in the other reaction vessel (s). September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • Another suitable example of the method according to the invention consists of a method comprising the sample digestion and the subsequent recovery of mRNA, for example with the QIAGEN product RNeasy, or alternatively with the isolation of mRNA, for example with the QIAGEN products Oligotex and / or TurboCapture, (Sample preparation step), the normalization of the released or isolated mRNA by binding to the vessel surface (binding or standardization step), and the subsequent reverse transcription of the mRNA in cDNA (subsequent reaction).
  • the reverse transcription may be followed by another binding or standardization step and another subsequent reaction, for example a real-time PCR of the cDNA generated (see Table 1, Workflow 6).
  • a simple hybridization reaction may be provided as a follow-up reaction;
  • the further binding or standardization step is dispensable (see Table 1, Workflow 2).
  • workflows according to the method of the invention are shown in Table 1.
  • Workflows 1-5 are one-step, because in the course of the procedure, the reaction vessel does not have to be opened to add new reagents.
  • Workflow 6 shows a two-step procedure, as it is normalized to mRNA level and cDNA level, ie between the two reactions, the vessel is opened to initiate the second binding or standardization step.
  • Both the reverse transcription and the possibly subsequent second consecutive reaction can be carried out in the same vessel as the sample preparation step. However, it can also be provided that after the first or, if appropriate, the second binding or standardization step, one or more aliquots are removed from the reaction vessel and transferred to one or more new reaction vessels in order to carry out the at least one subsequent reaction in the one or more Carry out reaction vessels.
  • biomolecules preferably RNA and / or DNA
  • a binding buffer is used in the binding or standardization step and / or b) a washing buffer is used during the washing step.
  • the at least partially functionalized vessel surface is preferably provided.
  • silanol groups a) silanol groups, b) unsaturated organic acids, c) carboxyl groups, sulfonate groups and other polar groups, and / or d) metal and semimetal oxides with hydroxyl groups
  • the said groups unlike the "batch switch materials" mentioned above, can be permanently (i.e., usually covalently) permanently attached to the surface of microreaction tubes and PCR tubes by suitable methods (see below).
  • a chaotropic substance such as guanidinium thiocyanate.
  • the cells are lysed, denaturing the proteins contained and the nucleic acids - if not yet freely available - released, and it is due to the presence of the chaotropic substance to a dissolution of the hydration shells to the nucleic acids.
  • Binding of the nucleic acids to the silica surface occurs via hydrogen bonding between the silanol groups (SiOx or SiOH groups) of the silica matrix and the negative ion charges of the phosphate backbone of the nucleic acids.
  • the remaining components of the sample can then be removed by washing.
  • the DNA or RNA is finally released again under the conditions of the PCR.
  • the binding of the nucleic acids to an anion exchange surface is based on the electrostatic interaction between the negative ion charge of the phosphate backbone of the nucleic acids and the positive surface charge of the anion exchange surface of the invention.
  • Quaternary ammonium groups belong to the category of strongly basic anion exchangers because their charge is independent of the pH of the binding buffer.
  • Primary, secondary and tertiary amines are referred to as weakly basic anion exchangers. At higher pH values, these are present in deprotonated form, resulting in the loss of the September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • silanol groups in particular SiO 2
  • metal and semimetal oxides which have hydroxyl groups on the surface, in particular titanium, aluminum and zirconium oxides, such as TiO 2 , Al 2 O 3 and ZrO 2 .
  • Nucleic acids also bind to these groups in the presence of chaotropic salts, and appropriately coated or functionalized surfaces can also be used under the given conditions to bind nucleic acids.
  • the unsaturated organic acids bound in this way provide carboxyl groups (-COO " or -COOH groups) which are capable of reversibly binding nucleic acids under high salt conditions, with the unsaturated organic acids being only the means to an end, carboxyl groups into a PECVD-coated polymer to create a polar surface with hydrogen-bond donating functionality.
  • nucleic acids in water If a polar surface is offered as a water-bridged donor, the nucleic acids bind to this surface because they experience better stabilization there than in water. When the salt concentration is reduced, water again becomes a better water-bridged donor than the polar surface, and the nucleic acids can be released from the surface again.
  • a reaction vessel for carrying out a method as described above, which has a vessel surface which is at least partially functionalized - preferably on the inside of the vessel - in such a way that it can reversibly bind biomolecules under the mentioned process conditions.
  • the functionalized area of the reaction vessels according to the invention preferably has an area of 0.01 mm 2 inclusive - including 10 cm 2 per
  • Reaction vessel more preferably an area of 0.01 mm 2 inclusive
  • the binding capacity of the relevant reaction vessel for the relevant biomolecules can be precisely adjusted.
  • the amount of biomolecules that are bound can also be influenced by the contact time and stringency of the binding buffer. The goal, however, is the September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • the binding capacity per reaction vessel in the range between 1 ng and including 40 ug, more preferably between 1 ng and including 4 ug, more preferably between 1 ng and including 2 ug, most preferably between 1 ng and including 500 ng.
  • the at least partially functionalized vessel surface is preferably provided that the at least partially functionalized vessel surface
  • silanol groups a) silanol groups, b) unsaturated organic acids, c) carboxyl groups, sulfonate groups and other polar groups, and / or d) metal and semimetal oxides with hydroxyl groups
  • a) are applied to the material of the reaction vessel by plasma coating, b) by wet chemical processes on the material of the reaction vessel
  • Reaction vessel are applied, and / or c) are conditioned by the properties of the material of the reaction vessel itself.
  • the application of the silanol groups according to the invention by plasma coating onto the material of the inventive reaction vessel is preferably carried out in atmospheric pressure plasma, as described, for example, in DE102006036536B3 and DE000010322696B3 of the Fraunhofer Institute for Surface Engineering and Thin Films, the contents of which are hereby incorporated by reference. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • PECVD Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition
  • CVD chemical vapor deposition
  • a strong alternating electric field is applied, by which a plasma is ignited.
  • the plasma breaks up the bonds of a gaseous deposition medium, also called reaction gas, and decomposes it into single radicals, which in the The gas phase reaction products deposit on the substrate in the form of thin layers (layer thicknesses between 50 and 300 nm.) Due to the plasma can in the PECVD process, which is often called corona discharge, a higher deposition rate at a lower deposition temperature achieved by the CVD method
  • the deposition media to be used are already in the gas phase and can thus be easily introduced from the outside of the reaction chamber gas supply system in the reaction chamber and fed to the plasma.
  • the carbonaceous gases acetylene (C 2 H 2 ) or methane are used as precursors for the production of a carbon-containing coating, such as DLC ("diamond like carbon") September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • Tetramethylsilane TMS
  • TEOS tetraethoxysilane
  • TMOS tetramethoxysilane
  • suitable precursors exist, for example, for the deposition of TiO 2 , Al 2 O 3 and ZrO 2 .
  • the precursor is fed into the discharge zone of the plasma, where the gas is split into ions and accelerated selbige. Often, oxygen is simultaneously fed to burn any organic portion in the precursor, for example, in the preparation of a silica coating with tetramethylsilane (but not, for example, in the preparation of a carbonaceous coating with acetylene).
  • gas ions then impinge on the surface of the workpiece to be coated at high speed, where they are reduced and build up the relevant coating. Frequently, covalent bonds are formed between the material of the surface and the coating materials, which ensure permanent bonding of the coating to the material.
  • the covalent attachment to PP occurs via Si-O-C and Si-C bonds.
  • the covalent attachment to PP takes place, for example, via CC and COC bonds.
  • the PECVD-V also makes it possible to generate organic polymers in the gas phase in the plasma and to deposit them on the carrier.
  • monomers e.g. Maleic anhydride, acrylates, vinyl silanes and the like.
  • polymerizable precursors are used.
  • the oxygen in the carrier gas is likewise dispensed with in order not to oxidize the organic constituents.
  • the precursor aminopropyltrimethoxysilane allows e.g. a direct preparation of silanol groups and anion exchange groups in a PECVD layer.
  • Metal and semimetal oxides can also be prepared by the PECVD process from the corresponding precursors (metal or semimetal alkoxides) in the gas phase with the addition of oxygen and, for example, deposited on polypropylene.
  • gas phase polymers of, for example, acrylates and other unsaturated compounds can be prepared and coated in situ by means of PECVD.
  • monomers eg, HEMA, acrylic acid, maleic anhydride, etc.
  • vinylsilane mixed co-polymers of an organic monomer such as maleic anhydride and a silane (vinylsilane) can also be deposited on polypropylene.
  • hydroxyl groups (geminal, vicinal), diol groups, carboxyl groups, amino groups and silanol groups are suitable chemical functions to produce surface materials having hydrogen bond donating properties on polypropylene.
  • co-polymers of maleic anhydride and vinylsilane were also prepared in situ. It is advantageous that this precursor mixture has a sufficient vapor pressure, can be polymerized in the gas phase by means of PECVD and thus forms well-adhering layers on polypropylene to the material of the reaction vessel.
  • sulfonate groups by means of PECVD can be used as precursor e.g. Styrenesulfonic acid can be used.
  • the inventors of the present invention also show that with the aid of a suitable coating apparatus, the inner surfaces of microreaction vessels, in particular PCR reaction vessels ("8-th Strips", 96-well plates, multi-well plates), disposable reaction vessels and pipette tips, with tetraethoxysilane and carboxyl-containing Copolymers of vinylsilane and maleic anhydride can be coated as precursors
  • PCR reaction vessels 8-th Strips
  • disposable reaction vessels and pipette tips with tetraethoxysilane and carboxyl-containing Copolymers of vinylsilane and maleic anhydride
  • the device shown can be used in a parallel arrangement, so that a plurality of reaction vessels can be coated simultaneously.
  • Preferred wet chemical methods for applying silanol groups to the material are e.g. Sol-gel processes.
  • the precursors are dissolved together with a defined amount of water and any catalysts in a solvent, for example water.
  • a solvent for example water.
  • TEOS tetraethoxysilane
  • Silciumdioxid precursor is used as Silciumdioxid precursor.
  • the silanol groups according to the invention are conditioned by the properties of the material of the reaction vessel according to the invention itself; for example, if the material is glass.
  • the reaction vessel is a vessel from the group comprising a) PCR vessels, PCR 8ter strips or PCR 96-well plates, b) a capillary or a microfluidic channel, c) a disposable reaction vessel, d) a pipette tip and / or e) a multi-well plate.
  • microreaction vessels mentioned may be, for example, colloquially also termed PCR reaction vessels (ABI, Thermo, etc.), possibly closable vessels having a volume of 0.1-2 ml. These are usually made of polypropylene, polyethylene, COC, PET or polycarbonate. September 16, 2009
  • a microtiter plate is a unit comprising a multiplicity of "wells" in the sense of the invention, such microtiter plates generally having between 6 and up to 1536 wells in each case Typical microtiter plate formats are shown in Table 2.
  • kit for carrying out a method as described above wherein said kit has at least
  • reagents for carrying out a sample preparation step preferably a reverse transcription (RT)
  • reagents for carrying out a subsequent reaction preferably a polymerase chain reaction (PCR)
  • PCR polymerase chain reaction
  • the washing buffer contains water, TRIS, a complexing agent, a polyol, a detergent, a polymer, copolymer and / or terpolymer.
  • the binding buffer has chaotropic substances. These are particularly preferably at least one substance selected from the group containing
  • the binding buffer for binding the cDNA to an anion exchange surface is preferably a low salt buffer.
  • a pH value below the pKa value of the surface or of the surface groups is preferably set, so that in the binding step the anion exchangers have positive surface charges and thus can bind the negatively charged nucleic acids.
  • reaction vessel according to the invention and / or a kit according to the invention for standardizing the content of biomolecules in a sample.
  • RNA preferably mRNA
  • PCR polymerase chain reaction
  • FIG. 1 shows a diagram for checking the C ⁇ values of PAXGene RNA from human whole blood using a method according to the invention
  • FIG. 3 shows a diagram for checking the C ⁇ values of QIAamp RNA from human whole blood using a reaction vessel according to the invention or comparative examples
  • FIG. 4 shows a diagram for checking the C ⁇ values of QIAamp RNA from Jurkat cells when using a reaction vessel according to the invention or comparative examples
  • FIG. 5 shows a diagram for checking the C ⁇ values of QIAamp RNA from Jurkat cells using a reaction vessel according to the invention and different incubation times
  • FIG. 7 shows a device 70 for applying a functionalized surface according to the invention to the inside of a reaction vessel.
  • the inventive surface-modified reaction vessels used (PCR vessel, 0.2 ml, thin-walled, PCR soft strips, Biozym) were coated with tetraethoxysilane (TEOS) in the atmospheric pressure plasma.
  • PCR vessel 0.2 ml, thin-walled, PCR soft strips, Biozym
  • TEOS tetraethoxysilane
  • the binding buffer used was 6M GuHCl, 0.1M potassium hydrogen phthalate pH 2.5, and as washing buffer 2% Nonidet® P40 and 0.1 mg / ml poly (methyl vinyl ether-altemalic acid) in TE buffer.
  • the PCR was performed with an ABI TaqMan® ⁇ Actin Probe Kit in an ABI 7700.
  • RNA used in the reverse transcription was quantified in advance with a nanodrop spectrophotometer ND-1000.
  • RNA used was varied in a small range (113-293 ng).
  • FIG. 2 likewise shows the results of a TaqMan® run on the cDNA from a QuantiTect cDNA synthesis of PAXGene RNA from human whole blood.
  • the amount of RNA was varied between 150 and 450 ng (columns 1-5), in each case one aliquot of the reverse transcription was pipetted into untreated vessels with PCR master mix (columns 6-10). For these aliquots, the starting amount of RNA contained therein is indicated. Compared to the first example, the amount of RNA used was varied over a wider range.
  • FIG. 3 shows the results of a TaqMan® run on the cDNA from an omniscript cDNA synthesis of QIAamp RNA from human whole blood.
  • the amount of RNA between 100 and 1 100 ng RNA was varied, it also control experiments were carried out in uncoated vessels.
  • RNA 4 shows the results of a TaqMan® run on the cDNA from an Omniscript cDNA synthesis of Jurkat RNA. In this case, the amount of RNA between 100 and 1100 ng RNA was varied, it was again carried out control experiments in uncoated vessels.
  • Fig. 5 shows the results of a TaqMan® run on the cDNA from an Omniscript cDNA synthesis of Jurkat RNA.
  • the amount of RNA was varied between 100 and 800 ng of RNA.
  • different incubation times were chosen, namely for 100-400 ng RNA 240 min, for 500-800 ng RNA 20 min.
  • FIG. 6a shows the general scheme of a workflow according to the invention, with the sample preparation step 2, the binding or standardization step 3, the washing step 4 and the follow-up reaction 6.
  • a second binding or standardization step and a second follow-up reaction may possibly follow said subsequent reaction connect (see Table 1).
  • Fig. 6b it is shown that said workflow can also be performed in a PCR strip.
  • FIG. 7 shows a device 70 for applying a functionalized surface according to the invention to the inside of a reaction vessel. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V ⁇ -V 349
  • Said device has a chamber 71 in which a flat electrode de 72 is arranged. Furthermore, the chamber has a gas introduction device for a precursor gas 73 and a coating electrode 74.
  • the precursor gas is, for example, tetraethoxysilane (TEOS).
  • TEOS tetraethoxysilane
  • the gas inlet device 73 and the coating electrode 74 are combined in the apparatus of FIG. 7 to a combined device in shape to the interior of a reaction vessel to be coated 75 (here a colloquially referred to as "Eppendorf tube” PCR microreaction vessel made of polypropylene with a volume of 0.2 ml) is adjusted.
  • a high-frequency alternating voltage is now applied (for example, 13.56 MHz) with the aid of a frequency generator 76, and a plasma ignites in the interior of the reaction vessel.
  • the plasma breaks up the bonds of the percursor gas and decomposes it into individual radicals which precipitate on the substrate where they cause the chemical precipitation reaction of silica molecules.
  • the functionalized surface produced in this way brings about the binding of the biomolecules to the inside of the reaction vessel (for example the binding of nucleic acids to silanol groups of the functionalized surface in the presence of chaotropic salts).
  • the apparatus shown is also suitable for the simultaneous coating of a plurality of reaction vessels, for example a plurality of "Eppendorf vessels" or else, for example, a multi-liter plate having a plurality of wells.
  • a plurality of reaction vessels for example a plurality of "Eppendorf vessels” or else, for example, a multi-liter plate having a plurality of wells.
  • the size of the coated area of the reaction vessels is essentially dependent on the size of the electrode and may be between 10 mm 2 and 300 mm 2 in a 0.2 ml PCR vessel.
  • Polypropylene 0.2 ml polypropylene tubes were coated with tetraethoxysilane under atmospheric pressure in the PECVD method. Binding capacities for nucleic acids of up to 500ng were generated.
  • the area created during the coating is defined, inter alia, by the size and positioning of the electrodes (cathode, anode) relative to one another in the PECVD method. It was about 150 mm 2 here .

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Abstract

The present invention relates to a method for normalizing the contents of biomolecules in a sample, comprising the following steps: a) preparing a reaction vessel with a vessel surface that is functionalized at least in sections - preferably on the inside of the vessel - in such a way that the surface can reversibly bind biomolecules under high salt conditions, b) executing at least one sample preparation step, c) binding biomolecules from the prepared sample to the vessel surface ("binding and normalizing step") under high salt conditions, d) optionally washing ("washing step"), and e) executing at least one subsequent reaction. The application also relates to a reaction vessel as is used in the above method.

Description

16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349 September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
VERFAHREN ZUR NORMIERUNG DES GEHALTS VON BIOMOLEKÜLEN IN EINER PROBEMETHOD FOR ORGANIZING THE CONTENT OF BIOMOLECULES IN A SAMPLE
GEBIET DER ERFINDUNGFIELD OF THE INVENTION
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Verwendung sowie eine Vorrichtung zur Normierung des Gehalts von Biomolekülen in einer Probe. Das Verfahren, die Verwendung sowie die Vorrichtung sind beispielsweise für Anwendungszwecke in der Biochemie, Molekularbiologie, Molekulargenetik, Mikrobiologie, Molekularen Diagnostik und/oder Molekularen Forensik geeignet.The present invention relates to a method, a use and a device for normalizing the content of biomolecules in a sample. The method, the use and the device are suitable, for example, for applications in biochemistry, molecular biology, molecular genetics, microbiology, molecular diagnostics and / or molecular forensics.
TECHNISCHER HINTERGRUNDTECHNICAL BACKGROUND
Die Normierung des Gehalts von Biomolekülen in einer Probe spielt eine große Rolle bei der Analyse von Proben, beispielsweise in der Molekularen Diagnostik, bei Genexpressionsanalysen, in der wirkstoffbezogenen Transkriptlevelanalyse, der Molekularen Forensik, der Sequenzierung oder der Genotypisierung.The standardization of the content of biomolecules in a sample plays a major role in the analysis of samples, for example in molecular diagnostics, gene expression analyzes, in drug-related transcript level analysis, molecular forensics, sequencing or genotyping.
Grund für eine Normierung ist, dass in einigen Fällen die nachzuweisenden Biomoleküle - insbesondere Nukleinsäuren und/oder Proteine - in der Probe in unterschiedlich hohen Mengen vorkommen können. Ebenso kann es sein, dass vorbereitende Probenbehandlungsschritte - z.B. eine Lyse, ein Zellaufschluß, ein Isolierungsschritt oder eine Reverse Transkription - die betreffenden Biomoleküle mit unterschiedlich hoher Effizienz bereitstellen.The reason for a standardization is that in some cases the biomolecules to be detected-in particular nucleic acids and / or proteins-can occur in different amounts in the sample. Likewise, preparatory sample treatment steps - e.g. a lysis, a cell disruption, an isolation step or a reverse transcription - to provide the biomolecules concerned with different levels of efficiency.
In beiden Fällen bedeutet dies, dass der aufgrund der vorherigen Unwägbarkeitsfaktoren unbekannte Anteil an Biomolekülen in der Probe die Reproduzierbarkeit und die Genauigkeit der weiteren Aufarbeitungs- und 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349In both cases, this means that the proportion of biomolecules in the sample unknown due to the previous uncertainty factors in the sample, the reproducibility and accuracy of further processing and September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Analyseschritte erschwert bzw. weitere Schritte zur Quantifizierung notwendig macht.Makes analysis steps more difficult or requires further steps for quantification.
Dies ist insbesondere bei der Aufarbeitung nukleinsäurehaltiger Proben von Bedeutung, die anschließend mit bekannten Verfahren (Polymerase- Kettenreaktion (PCR), Reverse Transkription, ImmunoPCR) nachgewiesen werden sollen. Hier ist es von Bedeutung, die Verfahrensparameter - also insbesondere den Gehalt an Biomolekülen in der Probe abzustimmen, um auf eine gewünschte Zyklenzahl zu kommen.This is particularly important in the workup of nucleic acid-containing samples, which are then to be detected by known methods (polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription, ImmunoPCR). Here it is important to tune the process parameters - ie in particular the content of biomolecules in the sample in order to come to a desired number of cycles.
Die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) hat sich in den letzten Jahrzehnten als System für die in-vitro-Amplifizierung von DNA etabliert. Durch die Weiterentwicklung der Technik, weg von der reinen Vervielfältigung hin zur qualitativen Analyse und der „Real-time"-PCR zur Quantifizierung, ist die PCR gleichzeitig ein weit verbreitetes Analyse- und Assaywerkzeug geworden. Eine Standardanwendung ist heute der Nachweis von sogenannter messenger RNA (mRNA), den RNA-Transkripten bestimmter Genabschnitte. Hierbei wird die Gesamtheit der vorhanden mRNA in einer Probe mit Hilfe eines Primers (häufig Poly-dT) und eines Enzyms (reverse transkriptase) wieder in DNA (cDNA) umgeschrieben und die so gebildete cDNA in einem PCR-Assay detektiert. Hierbei besteht die Möglichkeit die Assays in einem ein- oder zweistufigen Protokoll durchzuführen. Im einstufigen Protokoll werden sowohl die reverse Transkription (RT) als auch der PCR-Assay selber in dem PCR-Gerät durchgeführt, im zweistufigen Protokoll wird die reverse Transkription separat durchgeführt und ein Aliquot der Reaktion zu einem PCR-Mastermix gegeben. Jedoch kann bei unterschiedlichen Proben der mRNA-Level sehr unterschiedlich sein, ebenfalls ist die Effizienz der RT Schwankungen unterworfen. Dies führt zu teilweise sehr unterschiedlichen Mengen cDNA, die in die PCR-Reaktion eingebracht werden. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349The polymerase chain reaction (PCR) has been established in recent decades as a system for the in vitro amplification of DNA. As technology evolves, from pure duplication to qualitative analysis and real-time PCR for quantification, PCR has also become a widely used analytical and assay tool, a standard application today being the detection of so-called messenger RNA (mRNA), the RNA transcripts of certain gene segments, where all of the mRNA present in a sample is rewritten into DNA (cDNA) using a primer (often poly-dT) and an enzyme (reverse transcriptase) and the resulting cDNA In a one-step protocol, both the reverse transcription (RT) and the PCR assay itself are performed in the PCR device, in a two-step protocol reverse transcription is performed separately and an aliquot of the reaction is added to a PCR master mix Different samples of mRNA levels can be very different, as well as the efficiency of the RT is subject to fluctuations. This leads to partially very different amounts of cDNA, which are introduced into the PCR reaction. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Im Stand der Technik wird in der Regel der RNA-Gehalt einer Probe vor Beginn der Reversen Transkription bestimmt, beispielsweise mit Hilfe von OD- oder Fluoreszenz-Messungen. Eine Quantifizierung auf cDNA Niveau wird in aller Regel nicht durchgeführt, da vorhandene Nukleotide, ribosomale RNA u.a. Bestandteile nach erfolgter Reverser Transkription eine Quantifizierung der cDNA komplizieren.In the prior art, the RNA content of a sample is usually determined before the beginning of the reverse transcription, for example by means of OD or fluorescence measurements. A quantification at the cDNA level is usually not carried out, since existing nucleotides, ribosomal RNA u.a. Components after completing reverse transcription complicate a quantification of the cDNA.
Ein solcher Quantifizierungsansatz kann insbesondere in sogenannten Two-Step- Verfahren zur Anwendung kommen, bei welchen die Probenaufbereitung (z.B. durch Lyse, Zellaufschluß, Isolierungsschritt oder Reverse Transkription) und die Probenweiterbehandlung (z.B. durch PCR) in getrennten Schritten und/oder verschiedenen Gefäßen erfolgt, so dass zwischen beiden Schritten ein Pipettierschritt erfolgen kann. Ebenso eignet sich ein solcher Schritt für solche Verfahren, bei denen eine ggf. bereits aufbereitete Probe direkt einem PCR- Verfahren unterzogen wird.Such a quantification approach can be used in particular in so-called two-step methods in which the sample preparation (eg by lysis, cell disruption, isolation step or reverse transcription) and the sample further treatment (eg by PCR) takes place in separate steps and / or different vessels, so that a pipetting step can take place between the two steps. Likewise, such a step is suitable for those methods in which a possibly already prepared sample is directly subjected to a PCR process.
Im Fall der zweistufigen PCR aus dem Stand der Technik wird die reverse Transkription in einem separaten Gefäß durchgeführt und anschließend zu einem PCR-Mastermix hinzu pipettiert. An dieser Stelle könnte die cDNA-Menge nach der reversen Transkription noch ein Mal spektroskopisch quantifiziert werden. Hierauf wird auf Grund des zusätzlichen Aufwandes aber meist verzichtet und lediglich ein Aliquot der RT-Reaktion in der qPCR eingesetzt. Um eine zu starke Verdünnung des PCR-Mastermixes zu verhindern, sollen lediglich max 10% der Mastermixmenge als Aliquot hinzu gefügt werden. Dies bedeutet, dass in einer 25 μl PCR mit 2.5 μl lediglich etwas mehr als 10% des Produktes der reversen Transkription in einer PCR Reaktion genutzt werden kann, bzw. wieder auf größere Volumina ausgewichen werden muss. Der weitere Pipettierschritt führt 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349In the case of the prior art two-step PCR, reverse transcription is performed in a separate vessel and then pipetted to a PCR master mix. At this point, the amount of cDNA after the reverse transcription could be quantified once more spectroscopically. Due to the additional effort, however, this is usually dispensed with and only an aliquot of the RT reaction is used in the qPCR. In order to prevent excessive dilution of the PCR master mix, only a maximum of 10% of the master mix should be added as an aliquot. This means that in a 25 μl PCR with 2.5 μl only slightly more than 10% of the product of the reverse transcription can be used in a PCR reaction, and / or must be switched back to larger volumes. The further pipetting step leads September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
zugleich zu einer weiteren Ungenauigkeit, wie er mit jeder manuellen Handhabung verbunden ist. Ebenso ist eine zusätzliche Gefahr der Kreuzkontamination gegeben.at the same time to another inaccuracy, as it is associated with any manual handling. There is also an additional risk of cross contamination.
Bei dem vorliegenden Verfahren ist kein zusätzliches Volumen im PCR Reaktionsansatz zu berücksichtigen, da die cDNA an eine definierte Fläche im Reaktionsgefäß reversibel gebunden wird.In the present method no additional volume in the PCR reaction mixture is to be considered, since the cDNA is reversibly bound to a defined area in the reaction vessel.
Für Verfahren, bei denen die Probenaufbereitung (z.B. durch Lyse und/oder Reverse Transkription) und die Probenweiterbehandlung (z.B. durch PCR) in ein- und demselben Gefäß erfolgen und das Gefäß nach Möglichkeit geschlossen bleiben soll (sogenannte One-Step-Verfahren), ist der vorherige Ansatz nicht praktizierbar.For processes in which the sample preparation (eg by lysis and / or reverse transcription) and the sample further treatment (eg by PCR) in one and the same vessel and the vessel is to remain closed if possible (so-called one-step method) is the previous approach is not practicable.
Bei One-Step-Verfahren aus dem Stand der Technik wird eine ggf. spektroskopisch quantifizierte Menge an Biomolekülen (beispielsweise mRNA) eingesetzt. Sowohl die Reverse Transkription als auch das PCR- Verfahren selbst werden in demselben Reaktionsgefäß durchgeführt. Da letzteres während des Verfahrens nach Möglichkeit nicht geöffnet wird, wird also der komplette Ansatz der Reversen Transkription in die PCR-Reaktion überführt. Bei den verwendeten Proben kann aber der Biomolekül-Gehalt (beispielsweise an mRNA) sehr unterschiedlich sein, und die Effizienz des Probenaufbereitungsschritts (beispielsweise der Reversen Transkription) ist zudem Schwankungen unterworfen, was zu teilweise sehr unterschiedlichen Produktmengen nach Beendigung des Probenaufbereitungsschritts führt (beispielsweise cDNA) die dann in die Folgereaktion (beispielsweise PCR) eingebracht werden, und somit zu nicht reproduzierbaren Reaktionsergebnissen führt. Durch das zusätzliche Reaktionsansatz- Volumen von üblicherweise 20 μl kann ferner nicht in einem für eine PCR üblichen Volumen von 25 μl gearbeitet werden. In der Regel werden einstufige RT-PCRs in einem 50 μl- bzw. 100 μl Maßstab durchgeführt.One-step methods from the prior art use an optionally spectroscopically quantified amount of biomolecules (for example mRNA). Both the reverse transcription and the PCR procedure itself are carried out in the same reaction vessel. Since the latter is not opened during the procedure as far as possible, so the complete batch of reverse transcription is converted into the PCR reaction. In the samples used, however, the biomolecule content (for example, of mRNA) can be very different, and the efficiency of the sample preparation step (for example, reverse transcription) is also subject to fluctuations, which leads in some cases to very different product quantities after completion of the sample preparation step (for example, cDNA). which are then introduced into the subsequent reaction (for example PCR), and thus leads to non-reproducible reaction results. The additional reaction batch volume of usually 20 .mu.l also can not be used in a customary for a PCR volume of 25 ul. As a rule, single-stage RT-PCRs are performed in a 50 μl or 100 μl scale.
- A - 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349- A - September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
In dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird z.B. eine absolute Menge Nukleinsäure durch eine erfindungsgemäß erzeugte Bindefläche in einer Vorrichtung normiert, anstatt sie mit OD Messungen bzw. Fluoreszenzmessungen zu quantifizieren. Im Gegensatz dazu stellt der sogenannte „Housekeeper-Ansatz" eine interne oder endogene Referenz dar, mit dem auch über den Zustand des biologischen Systems eine Aussage getroffen werden kann. Die Qualität des Assays kann mit dem Housekeeper-Gen beurteilt werden, denn es existieren für bestimmte Housekeeper-Gene im Zusammenhang mit bestimmten Zelltypen Richtwerte über deren Expressionslevel.In the method according to the invention or the device according to the invention, e.g. normalizes an absolute amount of nucleic acid by a binding area produced according to the invention in a device, instead of quantifying it with OD measurements or fluorescence measurements. In contrast, the so-called "housekeeper approach" is an internal or endogenous reference that can also be used to make a statement about the state of the biological system.The quality of the assay can be assessed with the housekeeper gene, because it exists for certain housekeeper genes associated with certain cell types are indicative of their level of expression.
Es muß jedoch festgestellt werden, dass bei diesem Ansatz die Genauigkeit der Normierung aufgrund etwaiger Unwägbarkeiten stark begrenzt ist. So gibt es ein ideales Housekeeper-Gen nicht, d.h. es ist in jedem Fall eine art-, typ-, stadiums- und/oder zustandsspezifische Varianz der Genexpression zu beobachten, die auch durch Verwendung mehrere Housekeeper-Gene nicht komplett ausgeschaltet werden kann.It should be noted, however, that in this approach the accuracy of normalization is severely limited due to any uncertainties. Thus, there is no ideal housekeeper gene, i. In any case, it is possible to observe a species-, type-, stadium- and / or condition-specific variance of gene expression, which can not be completely eliminated even by using several housekeeper genes.
Ferner ist aus der US20070231892 ein Verfahren für die Amplifikation von Nukleinsäuren bekannt, wobei ein Lysat einer biologischen Probe in einem Gefäß mit einer sogenannten „Charge Switch" Oberfläche kontaktiert wird, um die im Lysat enthaltenen Nukleinsäuren zu binden. Anschließend wird das ungebundenen Lysat entfernt, und die gebundenen Nukleinsäuren werden amplifiziert. Bei dem besagten „Charge Switch"-Material tritt bei Änderung des pH-Werts eine Änderung der Oberflächenladung auf. Diese Eigenschaft von schwachen Ionentauschern tritt beispielsweise bei einem pH- Wert unterhalb des pKs-Wertes der Oberflächengruppen auf, so dass diese eine positive Oberflächenladung aufweisen. Negativ geladene Biomo leküle, insbesondere 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349Furthermore, a method for the amplification of nucleic acids is known from US20070231892, wherein a lysate of a biological sample in a vessel is contacted with a so-called "charge switch" surface in order to bind the nucleic acids contained in the lysate, and then the unbound lysate is removed. and the bound nucleic acids are amplified In the case of said "batch switch" material, a change in the surface charge occurs as the pH changes. This property of weak ion exchangers, for example, occurs at a pH below the pKa of the surface groups, so that they have a positive surface charge. Negatively charged biomolecules, in particular September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Nukleinsäuren können dann gebunden werden. Bei einem pH- Wert oberhalb des pKs- Wertes der Oberflächengruppen erfolgt hingegen einer Änderung der Ladung vom positiven ins neutrale oder negative, so dass negativ geladene Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, wieder freigesetzt werden können. Mithilfe geeigneter Puffer mit verschiedenen pH- Werten, die im übrigen niedrige Salzkonzentrationen aufweisen („Niedrigsalz-Puffer"), kann also der Bindungsund Freisetzungsprozess über den pH- Wert gesteuert werden.Nucleic acids can then be bound. At a pH above the pKa value of the surface groups, on the other hand, a change in the charge from the positive to the neutral or negative, so that negatively charged biomolecules, in particular nucleic acids, can be released again. By means of suitable buffers with different pH values, which otherwise have low salt concentrations ("low-salt buffer"), the binding and release process can be controlled via the pH value.
Das besagte „Charge Switch" - Material weist insbesondere Anionentauschereigenschaften auf. Nachteilig ist bei diesem Ansatz, dass sich geeignete Materialien nicht dauerhaft z.B. kovalent, auf der Oberfläche vonIn particular, in this approach, suitable materials are not permanently covalent, for example, on the surface of
Mikroreaktionsgefäßen, beispielsweise aus Polypropylen, befestigen lassen. DieMicro-reaction vessels, for example made of polypropylene, fasten. The
Materialien werden in der Regel durch einfaches Aufschichten auf denMaterials are usually made by simply layering on the
Oberflächen immobilisiert. Allerdings ist eine dauernde Haftung an den Oberflächen nicht gewährleistet, was die Reproduzierbarkeit dieser Verfahren inSurfaces immobilized. However, a permanent adhesion to the surfaces is not guaranteed, what the reproducibility of these methods in
Frage stellt und überdies eine mehrmalige Verwendung der entsprechend beschichteten Gefäße unmöglich macht.Question and also makes repeated use of the corresponding coated vessels impossible.
Ferner ist die Isolation von RNA aus biologischen Proben unter den genannten Bedingungen mit „Charge Switch" - Materialien und generell mit Anionentauschern aufgrund der allgegenwärtigen RNAsen problematisch. Diese bleiben bei den herrschenden Niedrigsalzbedingungen intakt, so dass RNA innerhalb weniger Sekunden stark abgebaut wird und eine Nachweis erschwert oder gar unmöglich wird.Furthermore, the isolation of RNA from biological samples under these conditions is problematic with charge-switch materials and generally with anion exchangers due to the ubiquitous RNAs, which remain intact under the prevailing low salt conditions, degrading RNA significantly within a few seconds and providing detection difficult or even impossible.
DEFINITIONENDEFINITIONS
Unter dem Term „Nukleinsäure" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - natürliche, vorzugsweise lineare, 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349For the purposes of the present invention, the term "nucleic acid" is understood to mean, in particular but not limited to, natural, preferably linear, September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
verzweigte oder zirkuläre Nukleinsäuren wie RNA, insbesondere mRNA, einzelsträngige und doppelsträngige virale RNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA oder Ribozyme, genomische, bakterielle oder virale DNA (einzelsträngig und doppelsträngig), chromosomale und episomale DNA, frei zirkulierende Nukleinsäure und dergleichen, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuren, beispielsweise Plasmide oder Oligonukleotide, insbesondere für die PCR verwendete Primer, Sonden oder Standards, mit Digoxigenin, Biotin oder Fluoreszenzfarbstoffen markierte Nukleinsäuren oder sogenannte PNAs („peptide nucleic acids") verstanden.branched or circular nucleic acids such as RNA, in particular mRNA, single-stranded and double-stranded viral RNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA or ribozymes, genomic, bacterial or viral DNA (single-stranded and double-stranded), chromosomal and episomal DNA, free-circulating nucleic acid and the like , synthetic or modified nucleic acids, for example plasmids or oligonucleotides, in particular primers, probes or standards used for the PCR, nucleic acids labeled with digoxigenin, biotin or fluorescent dyes or so-called PNAs ("peptide nucleic acids").
Unter dem Term „Normierung des Gehalts von Biomolekülen in einer Probe" wird ein Schritt verstanden, bei welchem sichergestellt wird, dass der Gehalt an Biomolekülen in der Probe ein vorgegebenes (erfmdungsgemäß durch die Größe und die Bindungseigenschaften mindestens eines Teils der Gefäßoberfläche, bevorzugt an der Innenseite des Gefäßes) Maß nicht überschreitet. Dabei handelt es sich um ein Verfahren der Quantifizierung des Gehalts an Biomo lekülen auf einen vorgegebenen Wert. Dies schließt ein, dass über dieses Maß hinausgehende Biomoleküle anschließend verworfen werden; weiterhin schließt dies mit ein, dass, wenn die Probe weniger Biomo leküle enthält als das wie oben beschriebene vorgegebene maß, die Normierung nicht erfolgreich ist.The term "normalizing the content of biomolecules in a sample" is understood to mean a step in which it is ensured that the content of biomolecules in the sample is a predetermined (according to the invention by the size and binding properties of at least part of the vessel surface, preferably at the Inside the vessel) is a measure of quantifying the content of biomolecules to a predetermined value, which implies that biomolecules beyond this level are subsequently discarded, and further implies that if the sample contains fewer biomolecules than the predetermined measure described above, the normalization is unsuccessful.
Unter dem Term „Immobilisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - eine reversible Immobilisierung an eine geeignete feste Phase verstanden.The term "immobilization" in the sense of the present invention is understood to mean, in particular but not limited to, a reversible immobilization to a suitable solid phase.
Unter dem Term „Membranen" werden insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - feste Phasen, die in der Lage sind Biomoleküle reversibel zu binden, verstanden. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349By the term "membranes" are meant, in particular but not limited to, solid phases capable of reversibly binding biomolecules. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Unter dem Term „Hochsalzpuffer" wird insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - ein Puffer aufweisend eine hohe Salzkonzentration (bevorzugt chaotrope Substanzen), bevorzugt > 100 mM, bevorzugter > 500 mM und noch bevorzugter > 1 M, verstanden.By the term "high salt buffer" is meant in particular, but not limited to, a buffer having a high salt concentration (preferably chaotropic substances), preferably> 100 mM, more preferably> 500 mM and more preferably> 1 M.
Unter dem Term „Hochsalzbedingungen" wird im Folgenden ein Milieu verstanden, das einen Hochsalzpuffer verwendet, bevorzugt einen Hochsalzpuffer enthaltend chaotrope Salze. Durch Hochsalz, bevorzugt aufweisend chaotrope Salze, wird die Löslichkeit von Nukleinsäuren in Wasser herabgesetzt. Grund ist das Aufbrechen von Wasserstoffbrücken und damit verbunden eine Verringerung der Stabilisierung von Sekundär- und Tertiär- Strukturen der Nukleinsäuren in Wasser. Wird nun eine polare Oberfläche als Wasserstoffbrückendonor angeboten, binden die Nukleinsäuren an dieser Oberfläche, da sie dort eine bessere Stabilisierung erfahren als in Wasser. Wird die Salzkonzentration verringert, wird Wasser wieder ein besserer Wasserstoffbrückendonor als die polare Oberfläche, und die Nukleinsäuren lassen sich wieder von der Oberfläche ablösen.The term "high salt conditions" is understood below to mean a medium which uses a high salt buffer, preferably a high salt buffer containing chaotropic salts High salt, preferably containing chaotropic salts, reduces the solubility of nucleic acids in water due to the breaking up of hydrogen bonds and thus In the presence of a polar surface as a hydrogen bond donor, the nucleic acids bind to this surface, where they undergo better stabilization than in water Water again a better hydrogen bond donor than the polar surface, and the nucleic acids can be detached again from the surface.
Unter dem Term „chaotrope Substanzen" bzw. „chaotrope Salze" werden insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - Substanzen, die die Sekundär-,By the term "chaotropic substances" or "chaotropic salts" are in particular - but not limited to - substances containing the secondary,
Tertiär- und/oder Quartärnärstruktur von Proteinen und/oder Nukleinsäuren ändern und zumindest die Primärstruktur intakt lassen, die Löslichkeit polarerTertiary and / or quaternary structure of proteins and / or nucleic acids change and at least leave the primary structure intact, the solubility more polar
Substanzen in Wasser verringern und/oder hydrophobe Wechselwirkungen verstärken, verstanden . B evorzugte chaotrop e Sub stanzen sind Guanidinhydrochlorid, Guanidinium(iso)thiocyanat, Natriumiodid,Reduce substances in water and / or enhance hydrophobic interactions, understood. Preferred chaotropic substances are guanidine hydrochloride, guanidinium (iso) thiocyanate, sodium iodide,
Natriumperchlorat, Kaliumiodid, Natrium(iso)thiocyanat und/oder Harnstoff.Sodium perchlorate, potassium iodide, sodium (iso) thiocyanate and / or urea.
Unter dem Term „Silanolgruppen" wird insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - Siliziumoxid (amorph, kristallin) oder Polykieselsäure mit der 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349By the term "silanol groups" is in particular - but not limited to - silica (amorphous, crystalline) or polysilicic acid with the September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Zusammensetzung (Siθ2X(OH)α(OEt)ß, verstanden, wobei der stöchiometrische Faktor α dabei eine Funktion von x und ß ist (d.h.: α = 4(l-x)-ß). Siliziumdioxid bzw. Polykieselsäure kann eine oder mehrere der folgenden Bestandteile enthalten bzw. komplett auch durch folgende Oxide ersetzt sein:Composition (SiO 2 X (OH) α (OEt) ß understood, the stoichiometric factor α then a function of x and ß (ie. Α = 4 (lx) -ß) silica or polysilicic acid may be one or more of the contain the following constituents or be completely replaced by the following oxides:
• B2O3 (0 - 30 %),B 2 O 3 (0-30%),
• Al2O3 (0 - 100 %),Al 2 O 3 (0-100%),
• TiO2 (O - 100 %),TiO 2 (O - 100%),
• ZrO2 (O - 100 %),ZrO 2 (O - 100%),
Des Weiteren kann das Material oberflächenfunktionalisiert sein. Beispielsweise können die Silanolgruppen durch Silanisierung mit Silanen behandelt worden sein. Dabei kann die Oberfläche hydrophobisiert werden oder es können anionische - und/oder kationische Gruppen und/oder Chelatoren aufgebracht werden. Beispielsweise kann eine Nitrilotriessigsäure (NTA) als Chelatorgruppe aufgebracht werden. Dies ermöglicht eine Adaption der Adsorberfläche an die zu bindenden Biomoleküle.Furthermore, the material can be surface-functionalized. For example, the silanol groups may have been treated by silanization with silanes. In this case, the surface can be hydrophobized or anionic and / or cationic groups and / or chelators can be applied. For example, a nitrilotriacetic acid (NTA) can be applied as a chelating group. This allows an adaptation of the adsorber surface to the biomolecules to be bound.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, halogenhaltige Atom Transfer Radikal Initiatoren auf die Silanolgruppen mit Hilfe eines Silanisierungsprozesses aufzubringen, so dass man Polymerketten durch einen "grafting from" - Prozess an den Silanolgruppen erzeugen kann. Dieses auch Pfropf-Copolymerisation genannte Verfahren erfordert Polymerisationsprozesse, bei denen die Tendenz zu Kettenabruch, Disproprtionierung oder Rekombination eine geringe Häufigkeit aufweist. Um eine Propf-Copolymerisation durchzuführen, müssen Initiatoren auf die Silanolgruppen aufgebracht werden. Dies kann geschehen, indem die PECVD - Silikatschicht mit halogenhaltigen Silanen behandelt wird. Alternativ werden die Initiatore direkt im PECVD Prozess eingebracht. Dabei werden dem Prozessgas (Precursor im PECVD Prozess) flüchtige, halogenhaltige Verbindungen zugefügt. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349Another possibility is to apply halogen-containing atom transfer radical initiators to the silanol groups by means of a silanization process so that polymer chains can be generated by a "grafting from" process on the silanol groups. This process, also referred to as graft copolymerization, requires polymerization processes in which the tendency to chain break, disproprionation or recombination has a low frequency. To perform graft copolymerization, initiators must be applied to the silanol groups. This can be done by treating the PECVD silicate layer with halogenated silanes. Alternatively, the initiators are introduced directly in the PECVD process. In the process, volatile, halogen-containing compounds are added to the process gas (precursor in the PECVD process). September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Führt man an einer solchen halogenidhaltigen Oberfläche eine ATRP durch, können Polymere (Homopolymere, Co-Polymere, block Co-Polymere) die kovalent an der Oberläche gebunden sind in situ erzeugt werden. Geeignete Monomere sind radikalisch polymerisierbare Verbindungen wie z.B. Acrylate, Metacrylate, Styrol und Styrolderivate.If an ATRP is carried out on such a halide-containing surface, polymers (homopolymers, copolymers, block co-polymers) which are covalently bonded to the surface can be generated in situ. Suitable monomers are radically polymerizable compounds, e.g. Acrylates, methacrylates, styrene and styrene derivatives.
Die Atom Transfer Radikal Polymerisation (ATRP) ist eine Form der lebenden, radikalischen Polymerisation. Die Radikale werden über ein Cu-I/CuII Redoxgleichgewicht aus einem Organohalogenid durch eine Atomtransferprozess gebildet. Das Redoxgleichgewicht sorgt dabei für eine starke Herabsetzung der Konzentration an freien Radikalen. Kettenabbruchreaktionen durch Disproportionierung oder Rekombination sind daher stark zurückgedrängt.The atom transfer radical polymerization (ATRP) is a form of living, radical polymerization. The radicals are formed via a Cu-I / CuII redox equilibrium from an organohalide through an atom transfer process. The redox balance ensures a strong reduction in the concentration of free radicals. Chain termination reactions by disproportionation or recombination are therefore strongly suppressed.
Unter dem Begriff „Amplifikationsreaktion" wird ein Verfahren verstanden, das es ermöglicht, die Konzentration eines oder mehrerer Analyte - bevorzugt Nukleinsäuren - mindestens zu verdoppeln.The term "amplification reaction" is understood to mean a process which makes it possible to at least double the concentration of one or more analytes, preferably nucleic acids.
Man unterscheidet hier zwischen isothermalen und thermocyclischen Amplifikationsreaktionen. Bei ersteren bleibt die Temperatur während des gesamten Verfahren stets gleich, während bei letzterer thermische Zyklen durchlaufen werden, mit deren Hilfe die Reaktion und die Amplifikation gesteuert wird.A distinction is made here between isothermal and thermocyclic amplification reactions. In the former, the temperature remains the same throughout the process, while in the latter, thermal cycles are passed through which the reaction and amplification are controlled.
Bevorzugte isothermale Amplifikationsreaktionen sind z.B.Preferred isothermal amplification reactions are e.g.
• Loop mediated isothermal amplification (LAMP),Loop mediated isothermal amplification (LAMP),
• Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA),Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA),
• Rolling Circle Chain Reaction (RCCR), oder Rolling Circle Amplification (RCA), und/oder 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349• Rolling Circle Chain Reaction (RCCR), or Rolling Circle Amplification (RCA), and / or September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
• Transcription mediated amplification (TMA)Transcription mediated amplification (TMA)
Bevorzugte thermocyclische Amplifikationsreaktionen sind z.B.Preferred thermocyclic amplification reactions are e.g.
• Ligase-Kettenreaktion (LCR), und/oderLigase chain reaction (LCR), and / or
• Polymerase Ketttenreaktion (PCR)Polymerase chain reaction (PCR)
Unter dem Term „Polymerase Kettenreaktion" (PCR) wird ein Verfahren zur in vzYro-Vervielfältigung von Nukleinsäuren verstanden, wie es z.B. in Bartlett & Stirling (2003) beschrieben ist.The term "polymerase chain reaction" (PCR) is understood to mean a process for the in vitro amplification of nucleic acids, as described, for example, in Bartlett & Stirling (2003).
Unter dem Term „Ligase-Kettenreaktion" (LCR) wird ein Nachweisverfahren für geringste Mengen von Nukleinsäuren verstanden, das ähnlich wie die Polymerase- Kettenreaktion funktioniert, nur unter Verwendung eines anderen Enzyms (anstatt der Polymerase eine Ligase). Zwei Proben pro DNA-Strang werden zu einer Probe ligiert. Die entstehenden, oft nur 30-50 bp langen Amplifikate eines Zyklus dienen in den folgenden Zyklen selbst wieder als Ansatzpunkt für die supplementierten Primer.By the term "ligase chain reaction" (LCR) is meant a detection method for minute amounts of nucleic acids that functions similarly to the polymerase chain reaction, using only a different enzyme (a ligase instead of the polymerase) .Two samples per DNA strand The resulting amplicon, often only 30-50 bp, of one cycle will serve as a starting point for the supplemented primers in the following cycles.
Unter dem Term „Loop-mediated Isothermal Amplification" (LAMP) wird eine Methode zur isothermalen Nukleinsäureamplifikation verstanden, bei welcher 6 verschiedene Primer eingesetzt werden, die bestimmte Regionen auf der Target- Sequenz erkennen und daran binden. LAMP nutzt eine DNA-Polymerase mit Strand-displacement Aktivität und läuft bei einer konstanten Temperatur von etwa 650C ab. Amplifikation und Detektion der Target-Sequenz findet in einem einzigen Schritt statt.The term "loop-mediated isothermal amplification" (LAMP) is understood to mean an isothermal nucleic acid amplification method in which 6 different primers are used, which recognize and bind to specific regions on the target sequence LAMP uses a DNA polymerase with Strand - Displacement activity and runs at a constant temperature of about 65 0 C. Amplification and detection of the target sequence takes place in a single step.
Unter dem Term „Nucleic Acid Sequence Based Amplification" (NASBA), wird ein Verfahren zur Amplifikation von RNA verstanden (Compton 1991). Dabei 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349The term "nucleic acid sequence based amplification" (NASBA), a method for the amplification of RNA understood (Compton 1991) September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
wird eine RNA-Matrix zu einem Reaktionsgemisch gegeben, und ein erster Primer bindet an die komplementäre Sequenz im Bereich des 3 '-Endes der Matrix. Anschließend wird mit einer Reversen Transkriptase der zur Matrix komplementäre DNA- Strang polymerisiert. Mit Hilfe von RNase H wird dann die RNA-Matrix verdaut (RNase H verdaut nur RNA in RNA-DNA Hybriden, nicht single-stranded RNA). Anschließend wird ein zweiter Primer an das 5' Ende des DNA-Stranges gebunden. Dieser wird von der T7 RNA Polymerase als Startpunkt für die Synthese eines zum DNA-Strang komplementären RNA-Moleküls verwendet, welches dann wieder als Ausgangsmatrix verwendet werden kann. NASBA wird bei einer konstanten Temperatur von normalerweise 41°C. durchgeführt und liefert unter bestimmten Umständen schnellere und bessere Resultate als PCR.For example, an RNA matrix is added to a reaction mixture, and a first primer binds to the complementary sequence near the 3 'end of the matrix. Subsequently, the complementary to the matrix DNA strand is polymerized with a reverse transcriptase. With the help of RNase H, the RNA matrix is then digested (RNase H digests only RNA in RNA-DNA hybrids, not single-stranded RNA). Subsequently, a second primer is attached to the 5 'end of the DNA strand. This is used by the T7 RNA polymerase as a starting point for the synthesis of a DNA strand complementary to the RNA molecule, which can then be used again as the starting matrix. NASBA is maintained at a constant temperature of normally 41 ° C. performs and delivers faster and better results than PCR under certain circumstances.
Unter dem Term „Transcription Mediated Amplifϊcation" (TMA) wird ein von der US-Firma Gen-Probe entwickeltes isothermales Amplifikationsverfahren verstanden, das der NASBA ähnlich ist und bei dem ebenfalls RNA Polymerase und Reverse Transkriptase verwendet werden (Hill, 2001)The term "Transcription Mediated Amplification" (TMA) is understood to mean an isothermal amplification method developed by the US company Gen-Probe which is similar to NASBA and also uses RNA polymerase and reverse transcriptase (Hill, 2001).
Der Term „Rolling Circle Chain Reaction" (RCCR) oder "Rolling circle Amplifϊcation" (RCA) betrifft ein Amplifikationsverfahren, das die allgemeine Nukleinsäure-Replikation nach dem rolling-circle-Prinzip imitiert und unter anderem in der US5854033 beschrieben ist.The term "rolling circle chain reaction" (RCCR) or "rolling circle amplification" (RCA) refers to an amplification method that mimics the general nucleic acid replication according to the rolling circle principle and is described inter alia in US5854033.
Unter dem Term „Immuno-PCR (IPCR)" wird insbesondere ein Verfahren zum Nachweis von Targetmolekülen verstanden, bei welchem chimäre Konjugate aus targetspezifischen Antikörpern und Nukleinsäuremolekülen verwendet werden.The term "immuno-PCR (IPCR)" is understood to mean, in particular, a method for detecting target molecules in which chimeric conjugates of target-specific antibodies and nucleic acid molecules are used.
Naturgemäß handelt es sich bei besagten Targetmolekülen vor allem um Proteine und/oder Oligopeptide, da sich gegen diese Molekülspezies am einfachsten 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349Naturally, said target molecules are above all proteins and / or oligopeptides, since they are the simplest against these molecular species September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
hochspezifϊsche Antikörper herstellen lassen. Es kann sich jedoch bei besagten Targetmolekülen auch um andere Biomolekülspezies handeln, wie z.B. Oligo- und Polysaccharide, oder Lipide, solange sich gegen diese Biomo lekülspezies hochspezifϊsche Antikörper herstellen lassen, so dass diese mithilfe der Immuno- PCR nachweisen lassen.have highly specific antibodies produced. However, said target molecules may also be other biomolecule species, e.g. Oligo- and polysaccharides, or lipids, as long as against these biomolecule lekülspezies hochspezifϊsche antibodies can be produced so that they can be detected using the immuno-PCR.
Die Nukleinsäuremoleküle dienen dabei als Marker bzw. Sonden, die zur Signalerzeugung mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifϊziert werden. Die enorme Effizienz der Nukleinsäureamplifϊkation und die hohe Spezifität der Bindung kann zu einer 100- bis 10.000-fachen Sensitivitätssteigerung verglichen mit Standard-Verfahren zum Nachweis von Targetmolekülen (z.B. ELISA- Verfahren) führen. Die IPCR wurde 1992 entwickelt (Sano et al. (1992)).The nucleic acid molecules serve as markers or probes which are amplified for signal generation by means of polymerase chain reaction (PCR). The tremendous efficiency of the nucleic acid amplification and the high specificity of binding can result in a 100 to 10,000-fold increase in sensitivity compared to standard methods for detection of target molecules (e.g., ELISA methods). The IPCR was developed in 1992 (Sano et al., (1992)).
Unter dem Term „Reverse Transkription" wird ein Verfahren zum Umschreiben von mRNA in DNA (die sogenannte „cDNA") verstanden, bei welchem in der Regel eine Reverse Transkriptase (auch RNA-abhängige DNA-Po lymerase) zum Einsatz kommt. Diese synthetisiert zunächst von einer einzelsträngigen RNA einen RNA-DNA-Hybridstrang mittels einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase- Aktivität. Für den folgenden Abbau des RNA- Anteils ist ein eigener Abschnitt des Proteins zuständig, der RNase-H-Anteil. Es folgt die Vervollständigung des einzelsträngigen DNA-Stranges zum doppelsträngigen durch DNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität. Die auf diese Weise generierte cDNA kann dann mittels PCR amplifiziert und nachgewiesen werden.The term "reverse transcription" is understood to mean a method for rewriting mRNA into DNA (the so-called "cDNA"), in which a reverse transcriptase (also RNA-dependent DNA polymerase) is generally used. This first synthesizes an RNA-DNA hybrid strand from a single-stranded RNA by means of an RNA-dependent DNA polymerase activity. For the subsequent degradation of the RNA portion, a separate section of the protein is responsible, the RNase H-share. This is followed by the completion of the single-stranded DNA strand to double-stranded by DNA-dependent DNA polymerase activity. The cDNA generated in this way can then be amplified and detected by means of PCR.
Wie andere DNA-Po lymerasen benötigt auch eine Reverse Transkriptase Primer zur Initiation der DNA-Synthese. Oftmals wird hier ein so genannter Oligo-d(T)- Primer verwendet, also mehrere Thymin-Basen, welche komplementär zum Poly(A)-Schwanz am 3'-Ende der mRNA sind. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349Like other DNA polymerases, a reverse transcriptase primer also requires the initiation of DNA synthesis. Often, a so-called oligo-d (T) primer is used here, ie several thymine bases, which are complementary to the poly (A) tail at the 3 'end of the mRNA. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Die Kombination aus Reverser Transkription und anschließender PCR (auch als RT-PCR bezeichnet) wird häufig verwendet, um den Gehalt einer oder mehrerer mRNAs , in einer Prob e na chzuweis en , b e isp ie l sweis e in der Genexpressionsanalyse, bei der Erstellung von Genexpressionsprofilen und dergleichen. Bei der sogenannten „Two-Step RT-PCR" werden dabei unter anderem unterschiedliche Primer für die Reverse Transkription und die anschließende PCR verwendet, während bei der "One-Step RT-PCR" statt dessen bereits in der Reversen Transkription die genspezifischen Primer verwendet werden können, die auch für die anschließende PCR verwendet werden, und beide Reaktionen werden hintereinander im selben Gefäß ausgeführt. Dabei macht man sich zunutze, dass die verwendete Reverse Transkriptase (in der Regel viralen Ursprungs) bei einer niedrigeren Temperatur denaturiert als die verwendete DNA- Polymerase (z.B. Taq-Polymerase), die bekanntermaßen erst bei verhältnismäßig hohen Temperaturen denaturiert, und führt entsprechend die Reverse Transkription bei einer niedrigeren Temperatur durch als die anschließende PCR. Bevorzugt verwendet man dabei eine sogenannte Hot-Start-DNA-Polymerase, die thermoreversibel gehemmt ist. Beim Umschalten vom niedrigeren Temperaturniveau der Reversen Transkription auf das höhere Temperaturniveau der PCR wird dabei einerseits die Reverse Transkriptase denaturiert, andererseits wird die DNA-Polymerase durch Aufhebung der thermoreversiblen Hemmung aktiviert. Besagte thermoreversible Hemmung kann z.B. durch einen im aktiven Zentrum der DNA-Polymerase bindenden Antikörper verwirklicht sein, ebenso aber auch z.B. durch reversible kovalente oder nicht-kovalente chemische Modifikation der Polymerase, beispielsweise mit Aldehyden (siehe z.B. US6183998 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung). Für eine Übersicht siehe auch Birch et al. (1996).The combination of reverse transcription followed by PCR (also referred to as RT-PCR) is often used to characterize the content of one or more mRNAs in a probabilistic assay in gene expression analysis Gene expression profiles and the like. In the case of the so-called "two-step RT-PCR", different primers are used for reverse transcription and the subsequent PCR, while in the "one-step RT-PCR" the gene-specific primers are already used in the reverse transcription instead which are also used for the subsequent PCR and both reactions are carried out consecutively in the same vessel, making use of the fact that the reverse transcriptase used (usually of viral origin) denatures at a lower temperature than the DNA polymerase used (eg Taq polymerase), which is known to denature only at relatively high temperatures, and accordingly performs the reverse transcription at a lower temperature than the subsequent PCR Preferably, a so-called hot-start DNA polymerase is used, which is thermoreversibly inhibited When switching from the lower temperature level of the reverse Transcription to the higher temperature level of the PCR on the one hand denatured the reverse transcriptase, on the other hand, the DNA polymerase is activated by reversing the thermoreversible inhibition. Said thermoreversible inhibition may e.g. be realized by an antibody which binds in the active center of the DNA polymerase, as well as e.g. by reversible covalent or non-covalent chemical modification of the polymerase, for example with aldehydes (see, e.g., Applicant's U.S. Patent 6,183,998). For an overview see also Birch et al. (1996).
Unter dem Term „Real-Time-PCR" auch quantitative PCR oder qPCR (nicht zu verwechseln mit revers transkribierter PCR) wird ein Verfahren verstanden, das 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349Under the term "real-time PCR" also quantitative PCR or qPCR (not to be confused with reverse transcribed PCR) is understood a method that September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
auf dem Prinzip der bekannten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht, und zusätzlich die Quantifizierung der amplifizierten DNA ermöglicht. Die Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen durchgeführt, die während eines PCR-Zyklus erfasst werden (daher der Name „Real Time"). Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Am Ende eines Laufs (der aus mehreren Zyklen besteht) wird anhand von erhaltenen Fluoreszenzsignalen die Quantifizierung in der exponentiellen Phase der PCR vorgenommen. Nur in der exponentiellen Phase der PCR (die wenige Zyklen in einem Lauf dauert) ist die korrekte Quantifizierung möglich, da während dieser Phase die optimale Reaktionsbedingungen herrschen. Diese Methode unterscheidet sich somit von anderen quantitativen PCR-Methoden, die erst nach Ablauf der PCR eine quantitative Auswertung (z. B. kompetitive PCR), meist unter Einbeziehung einer gelelektrophoretischen Auftrennung der PCR- Fragmente, vornehmen.based on the principle of the known polymerase chain reaction (PCR), and in addition allows the quantification of the amplified DNA. The quantification is performed by fluorescence measurements taken during a PCR cycle (hence the name "Real Time") .The fluorescence increases proportionally with the amount of PCR products at the end of a run Cycles), the quantification in the exponential phase of the PCR is carried out on the basis of the fluorescence signals obtained, only in the exponential phase of the PCR (which lasts a few cycles in one run) the correct quantification is possible, since during this phase the optimal reaction conditions prevail Thus, the method differs from other quantitative PCR methods, which perform a quantitative evaluation (eg competitive PCR) only after the end of the PCR, usually involving gel electrophoretic separation of the PCR fragments.
Für die Detektion kommen Farbstoffe wie z.B. Ethidiumbromid, SYBR Green I sowie FRET-Sonden oder sogenannte Double-Dye-Oligos (auch als TaqMan- Sonden bezeichnet) in Frage.For detection, dyes such as e.g. Ethidium bromide, SYBR Green I and FRET probes or so-called double-dye oligos (also referred to as TaqMan probes) in question.
Der Begriff „Cτ-Wert" (Threshold Cycle = „Schwellenwert-Zyklus") bezeichnet den PCR-Zyklus beschreibt, an dem erstmals ein Amplifikat nachweisbar ist; hierbei wird in der Regel die Fluoreszenz gemessen und der Zyklus angegeben, bei welcher letztere erstmalig signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt.The term "C τ value" (Threshold Cycle) describes the PCR cycle at which an amplificate is detectable for the first time; In this case, the fluorescence is usually measured and the cycle is indicated, at which the latter increases significantly above the background fluorescence for the first time.
In der Anfangsphase einer PCR-Reaktion ist die Menge an Template (d.h. an zu amplifϊziernder DNA) noch begrenzt, während in der Schlußphase der Amplifϊkation die Menge der Produkte derart ansteigt, dass es zur Hemmung durch diese kommt, Produktfragmente zunehmend miteinander hybridisieren und 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349In the initial phase of a PCR reaction, the amount of template (ie DNA to be amplified) is still limited, while in the final phase of the amplification, the amount of products increases to inhibit them, product fragments increasingly hybridize to each other and September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
die Edukte langsam verbraucht werden. Nur in der dazwischenliegenden Phase besteht ein exponentieller Zusammenhang zwischen Anzahl der Amplifikationszyklen und Amplifϊkatmenge („exponentielle Phase"). Für die Bestimmung des Zeitpunkts, an welchem die exponentielle Phase beginnt, macht man sich den erwähnten Cτ-Wert zunutze.the educts are consumed slowly. Only in the intermediate phase is there an exponential relationship between the number of cycles of amplification and the amount of amplificate ("exponential phase") .To determine the point in time at which the exponential phase begins, one makes use of the mentioned Cτ value.
Ein niedriger Cτ-Wert gibt überdies an, dass bereits eine geringe PCR- Zyklenzahl für einen erstmaligen signifikanten Anstieg der Fluoreszenz über das Grundrauschen ausreichend ist (also relativ viel Template vorhanden war), während ein hoher Cτ-Wert dementsprechend angibt, dass hierfür viele PCR- Zyklen benötigt werden (also relativ wenig Template vorhanden war).Moreover, a low Cτ value indicates that even a small number of PCR cycles is sufficient for a first significant increase in fluorescence over the background noise (ie, a relatively large amount of template was present), while a high Cτ value accordingly indicates that there are many PCRs for this purpose - Cycles are needed (so relatively little template was present).
Unter dem Term „ELISA" (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) wird ein immunologisches Nachweisverfahren verstanden, das auf einer enzymatischen Farbreaktion basiert.The term "ELISA" (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) is understood to mean an immunological detection method based on an enzymatic color reaction.
Mit Hilfe des ELISA können Proteine, Viren aber auch niedermolekulare Verbindungen wie Hormone, Toxine und Pestizide in einer Probe (Blutserum, Milch, Urin, etc.) nachgewiesen werden. Hierbei macht man sich die Eigenschaft spezifischer Antikörper zu Nutze, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Antikörper oder Antigen werden zuvor mit einem Enzym markiert. Die durch das Enzym katalysierte Reaktion dient als Nachweis für das Vorhandensein des Antigens . Das sog . Substrat wird vom Enzym umgesetzt, das Reaktionsprodukt kann üblicherweise durch Farbumschlag, Fluoreszenz oder Chemo lumineszenz nachgewiesen werden. Die Signalstärke ist im allgemeinen eine Funktion der Antigenkonzentration, so dass ELISA auch für quantitative Nachweise verwendet werden kann. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349With the help of the ELISA, proteins, viruses as well as low-molecular compounds such as hormones, toxins and pesticides can be detected in a sample (blood serum, milk, urine, etc.). This makes use of the property of specific antibodies that bind to the substance to be detected (antigen). Antibody or antigen are previously labeled with an enzyme. The enzyme catalyzed reaction serves as evidence of the presence of the antigen. The so-called Substrate is reacted by the enzyme, the reaction product can usually be detected by color change, fluorescence or Chemo luminescence. Signal strength is generally a function of antigen concentration, so ELISA can also be used for quantitative detection. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Unter dem Begriff "Hybrid Capture Assay" (HCA) wird im Folgenden ein Verfahren verstanden, bei dem RNA:DNA-Hybride durch Inkubation der gesuchten Ziel-DNA mit einer RNA-Probe gebildet werden. Die Hybride werden an eine Oberfläche gebunden und dann mit einem enzymgelabelten Antikörper inkubiert. "Hybrid Capture Assay" werden insbesondere in den HPV-Assays der Firma Digene verwendet.The term "hybrid capture assay" (HCA) is understood below to mean a process in which RNA: DNA hybrids are formed by incubation of the desired target DNA with an RNA sample. The hybrids are bound to a surface and then incubated with an enzyme-labeled antibody. "Hybrid Capture Assay" are used in particular in the HPV assays of Digene.
Unter dem Begriff "Nested PCR" wird im Folgenden ein Verfahren verstanden, bei dem ein bereits vervielfältigtes DNA-Fragment ein weiteres Mal amplifziert wird; dieser Vorgang erfolgt mit einem zweiten Primerpaar, das innerhalb des in der ersten Reaktion verwendeten Primerpaars angeordnet ist.The term "nested PCR" is understood below to mean a method in which an already duplicated DNA fragment is amplified a second time; this process is done with a second primer pair located within the primer pair used in the first reaction.
AUFGABE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNGOBJECT OF THE PRESENT INVENTION
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die beschriebenen, sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zumindest weitgehend zu überwinden und insbesondere für eine weite Spanne von Anwendungen ein Verfahren, eine Verwendung und/oder eine Vorrichtung zur Normierung des Gehalts von Biomolekülen in einer Probe zu schaffen.It is an object of the present invention to at least largely overcome the described disadvantages resulting from the prior art and, in particular for a wide range of applications, a method, a use and / or a device for normalizing the content of biomolecules in a sample to accomplish.
Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein besser geeignetes Verfahren, eine Verwendung und/oder eine Vorrichtung zur Normierung von Biomolekülen in einer Probe zu schaffen, dass sich für die Verwendung mit den oben erwähnten One-Step- und Two-Step Verfahren eignet.In particular, it is an object of the present invention to provide a more suitable method, use and / or apparatus for normalizing biomolecules in a sample suitable for use with the above-mentioned one-step and two-step methods.
Weitere Aufgabe ist es, für eine weite Spanne von Anwendungen ein Verfahren, eine Verwendung und eine Vorrichtung zur Normierung des Gehalts an einer Nukleinsäure in einer Probe zu schaffen. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349Another object is to provide, for a wide range of applications, a method, a use, and a device for normalizing the level of a nucleic acid in a sample. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Weitere Aufgabe ist es, für eine weite Spanne von Anwendungen ein Verfahren, eine Verwendung und eine Vorrichtung zur Normierung des Gehalts an einer cDNA, hergestellt mittels einer Reversen Transkription aus RNA, bevorzugt mRNA zu schaffen.Another object is to provide, for a wide range of applications, a method, a use and a device for normalizing the content of a cDNA produced by means of a reverse transcription from RNA, preferably mRNA.
Weitere Aufgabe ist es, für eine weite Spanne von Anwendungen ein Verfahren, eine Verwendung und eine Vorrichtung zur Normierung des Gehalts an einer Nukleinsäure, insbesondere RNA in einer Probe zu schaffen.Another object is to provide, for a wide range of applications, a method, a use and a device for normalizing the content of a nucleic acid, in particular RNA in a sample.
Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren, eine Verwendung und/oder eine Vorrichtung zur Normierung von Biomolekülen in einer Probe zu schaffen, dass sich durch eine hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auszeichnet.In particular, it is an object of the present invention to provide a method, a use and / or a device for normalization of biomolecules in a sample, which is characterized by a high accuracy and reproducibility.
Weitere Aufgabe ist es, für ein Verfahren, eine Verwendung und eine Vorrichtung zur Normierung des Gehalts an einer Nukleinsäure in einer Probe zu schaffen, die bzw. das eine mehrmalige Verwendung der Reaktionsgefäße ermöglicht.Another object is to provide a method, a use and a device for normalizing the content of a nucleic acid in a sample, which allows a repeated use of the reaction vessels.
Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren gemäß dem unabhängigen Verfahrensanspruch der vorliegenden Erfindung gelöst. Demgemäß wird ein Verfahren zur Normierung des Gehalts von Biomolekülen in einer Probe, aufweisend die folgenden Schritte:These objects are achieved by a method according to the independent method claim of the present invention. Accordingly, a method for normalizing the content of biomolecules in a sample, comprising the following steps:
a) Bereitstellung eines Reaktionsgefäßes mit einer Gefäßoberfläche, die mindestens abschnittsweise - bevorzugt an der Innenseite des Gefäßes - dergestalt funktionalisiert ist, dass sie Biomoleküle unter Hochsalzbedingungen reversibel binden kann, b) Durchführen mindestens eines Probenaufbereitungsschritts, 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349a) providing a reaction vessel having a vessel surface which is at least partially functionalized - preferably on the inside of the vessel - in such a way that it can bind biomolecules reversibly under high salt conditions, b) performing at least one sample preparation step, September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
c) Bindung von Biomo lekülen aus der aufbereiteten Probe an die Gefäßoberfläche („Binde- bzw. Normierungsschritt") unter Hochsalzbedingungen, d) ggf. Waschen („Waschschritt"), und e) Durchführung mindestens einer Folgereaktion.c) binding of biomolecules from the prepared sample to the vessel surface ("binding or standardization step") under high salt conditions, d) optionally washing ("washing step"), and e) carrying out at least one subsequent reaction.
Im Gegensatz zu aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren fungiert hier erstmalig die Oberfläche des Reaktionsgefäßes als Adsorptionsfläche für die reversible Bindung einer definierten Menge an Biomolekülen unter Hochsalzbedingungen, und damit als Mittel zur Normierung des Biomolekülgehalts in der Probe. Sie ist daher dergestalt funktionalisiert, dass sie Biomoleküle unter Hochsalzbedingungen reversibel binden kann. Die Art der Funktionalisierung richtet sich dabei insbesondere auch nach der Art der zu bindenden Biomoleküle. Hierauf wird weiter unten noch eingegangen. Die Menge an Biomo lekülen die auf der Fläche gebunden werden können, wird durch die Größe der Fläche, die durch die Probe kontaktierte Fläche, die Art der chemischen Funktionalisierung dieser Fläche, die Inkubationszeit der Biomoleküle mit der Fläche und die Stringenz des dabei verwendeten Bindepuffers eingestellt.In contrast to methods known from the prior art, the surface of the reaction vessel functions for the first time as an adsorption surface for the reversible binding of a defined amount of biomolecules under high salt conditions, and thus as a means of standardizing the biomolecule content in the sample. It is therefore functionalized in such a way that it can reversibly bind biomolecules under high salt conditions. The type of functionalization also depends in particular on the type of biomolecules to be bound. This will be discussed below. The amount of biomolecules that can be bound to the surface is adjusted by the size of the surface, the area contacted by the sample, the nature of the chemical functionalization of that surface, the incubation time of the biomolecules with the surface, and the stringency of the binding buffer used ,
Die genannten Hochsalzbedingungen (siehe obige Definition) tragen überdies dazu bei, dass etwaige RNAsen deaktiviert werden. Auf diese Weise ist gewährleistet, dass - anders als unter den bei Charge Switch"-Materialien und generell Anionentauschern herrschenden Niedrigsalzbedingungen - in einer Probe enthaltene RNA möglichst vollständig und intakt isoliert und dem Nachweis zugeführt werden kann.The above-mentioned high salt conditions (see above definition) also contribute to the deactivation of any RNAses. This ensures that, unlike the low-salt conditions prevailing in charge-switch materials and generally anion exchangers, RNA contained in a sample can be isolated as completely and intact as possible and sent to detection.
Im Stand der Technik ist bei den sogenannten „Two- Step- Verfahren", wie bereits oben erläutert wurde, mindestens ein zusätzlicher Pipettierschritt zur Überführung der isolierten Biomo leküle in ein neues Reaktionsgefäß erforderlich, bevor ggf. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349In the prior art, in the so-called "two-step method", as already explained above, at least one additional pipetting step for transferring the isolated biomolecules into a new reaction vessel is required, before September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
eine Folgereaktion durchgeführt wird. Dieser Schritt wird auch zum Anlass genommen, eine Normierung auf cDNA Level durchzuführen. Hierbei werden Schwankungen des zellulären Inputs, der RNA Qualität und Quantität, der RT Effizienz ausgeglichen, sodass die Ergebnisse miteinander vergleich- und interpretierbar werden.a follow-up reaction is performed. This step is also taken as an opportunity to perform a normalization at the cDNA level. It compensates for variations in cellular input, RNA quality and quantity, RT efficiency, allowing the results to be compared and interpreted.
Bei dem One-Step RT-PCR Verfahren würde man mit der hier vorgestellten Verfahren auf das RNA Inputlevel normieren, da die cDNA in situ synthetisiert wird und direkt mit der Polymerase weiter umgesetzt wird. Hierbei können Schwankungen des zellulären Inputs, der RNA Qualität und Quantität ausgeglichen werden.In the one-step RT-PCR method, one would standardize with the method presented here on the RNA input level, since the cDNA is synthesized in situ and is further reacted directly with the polymerase. Here, fluctuations in cellular input, RNA quality and quantity can be compensated.
Die mit diesen Schritten verbundenen Nachteile, die bereits oben beschrieben sind, entfallen bei dem erfindungs gemäßen Verfahren. Die Biomoleküle binden reversibel an die Oberfläche des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes, bis es zu einer Absättigung der erfindungsgemäßen Oberfläche und auf diese Weise zu einer Normierung der Biomolekül-Menge kommt. Bei dem erfmdungsgemäßen Verfahren ist aus diesem Grund kein gesonderter Quantifizierungsschritt der isolierten Biomolekül-Menge erforderlich. Außerdem kann eine Folgereaktion direkt in dem erfindungsgemäßen Reaktionsgefäß ohne zusätzliche Pipettierschritte durchgeführt werden.The disadvantages associated with these steps, which are already described above, omitted in the inventive method. The biomolecules bind reversibly to the surface of the reaction vessel according to the invention until it comes to a saturation of the surface according to the invention and in this way to a normalization of the biomolecule amount. For this reason, no separate quantification step of the amount of biomolecule isolated is required in the method according to the invention. In addition, a subsequent reaction can be carried out directly in the reaction vessel according to the invention without additional pipetting steps.
Die Normalisierung hat des Weiteren den Vorteil die gemessenen Expressionsdaten bezüglich Differenzen im zellulären Input, der RNA Qualität/Quantität und Effizienz der Reversen Transkription verschiedener Proben (letzteres Prinzip nur bei Two-Step RT PCR wirksam) zu korrigieren.The normalization also has the advantage of correcting the measured expression data for differences in cellular input, RNA quality / quantity and efficiency of reverse transcription of different samples (the latter principle only effective in two-step RT PCR).
Bevorzugt ist vorgesehen, dass die erwähnte Folgereaktion in demselben Gefäß durchgeführt wird wie der Probenaufbereitungsschritt. Dies ist aber nicht 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349It is preferably provided that the mentioned subsequent reaction is carried out in the same vessel as the sample preparation step. This is not September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
unbedingt erforderlich. Es kann z.B. vorgesehen sein, dass nach dem Binde- bzw. Normierungsschritt ein oder mehrere Aliquots aus dem Reaktionsgefäß entnommen und in ein oder mehrere neue Reaktionsgefäße überführt werden, um die mindestens eine Folgereaktion in dem bzw. den weiteren Reaktionsgefäßen durchzuführen.absolutely necessary. It can e.g. be provided that after the binding or standardization step one or more aliquots are removed from the reaction vessel and transferred to one or more new reaction vessels to perform the at least one subsequent reaction in the other or the other reaction vessels.
Besonders bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass es sich bei besagten Biomolekülen um Nukleinsäuren handelt.It is particularly preferred to provide that said biomolecules are nucleic acids.
Nukleinsäuren sind insbesondere mit herkömmlichen Amplifikations verfahren, wie z.B. PCR, nachweisbar.Nucleic acids are particularly useful with conventional amplification techniques, e.g. PCR, detectable.
Es kann sich bei besagten Biomolekülen aber auch generell um Mitglieder jeglicher Biomolekülspezies handeln, die mit Antikörpern nachweisbar sind. Hier ist insbesondere an Proteine gedacht, die sich mit Oligonukleotid-markierten Antikörpern („Immuno-PCR") oder mit ELISA nachweisen lassen (siehe unten).In general, however, said biomolecules may also be members of any biomolecule species that are detectable with antibodies. In particular, proteins intended to be detected by oligonucleotide-labeled antibodies ("immuno-PCR") or by ELISA are considered here (see below).
Ferner ist b evorzugt vorgesehen, dass besagter mindestens eine Probenaufbereitungsschritt ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltendFurthermore, it is preferably provided that said at least one sample preparation step is selected from the group comprising
• Zelllyse,• cell lysis,
• Zellaufschluß,• cell disruption,
• Isolierung von Biomolekülen,• isolation of biomolecules,
• Aufreinigung von Biomolekülen, • Reverse Transkription (RT) von RNA in DNA, und/oder• purification of biomolecules, • reverse transcription (RT) of RNA into DNA, and / or
• Enzymatische Reaktionen und/oder Probenbehandlungen. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349• Enzymatic reactions and / or sample treatments. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Bei besagten enzymatischen Reaktionen und/oder Probenbehandlungen kann es sich bevorzugt um Verdau einer Probe mit RNAsen, DNAsen und/oder Proteasen handeln.Said enzymatic reactions and / or sample treatments may preferably be digestion of a sample with RNAses, DNAses and / or proteases.
Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass besagte mindestens eine Folgereaktion ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltendFurthermore, it is preferably provided that said at least one subsequent reaction is selected from the group comprising
• Amplifikationsreaktionen• Amplification reactions
• Enzyme-Linked Imunoassay (ELISA), und/oderEnzyme-Linked Imunoassay (ELISA), and / or
• Hybrid Capture Assay.• Hybrid Capture Assay.
Besonders bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass es sich bei der besagten Amplifϊkationsreaktion um eine Reaktion ausgewählt aus der GruppeIt is particularly preferred that the said amplification reaction be a reaction selected from the group
• Polymerase-Kettenreaktion (PCR),Polymerase chain reaction (PCR),
• Nested PCR • Reverse Transkription (RT),• Nested PCR • Reverse Transcription (RT),
• Immuno-PCR• Immuno-PCR
Generell kann hier jedoch auch jede andere mögliche Nachweisreaktion für mindestens eine der genannten Biomolekülspezies vorgesehen sein.In general, however, any other possible detection reaction for at least one of the biomolecule species mentioned above can also be provided here.
Ein besonders geeignetes Beispiel für das erfindungsgemäße Verfahren besteht aus einem Verfahren aufweisend eine Reverse Transkription von mRNA in cDNA (Probenaufbereitungsschritt), die Normierung der gebildeten cDNA durch Binden an die Gefäßoberfläche (Binde- bzw. Normierungsschritt), und die anschließende nachweisende Amplifikation der cDNA durch Real-Time-PCR (Folgereaktion). Dieses Verfahren wird in Tabelle 1 als „Workflow 1" bezeichnet.A particularly suitable example of the method according to the invention consists of a method comprising reverse transcription of mRNA into cDNA (sample preparation step), normalization of the cDNA formed by binding to the vascular surface (binding or standardization step), and subsequent detection amplification of the cDNA Real-time PCR (follow-up reaction). This procedure is referred to in Table 1 as "Workflow 1".
In einem solchen Verfahren wird die Reverse Transkription direkt in einem erfindungsgemäßen Reaktionsgefäß durchgeführt und die generierte cDNA nach 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349In such a method, the reverse transcription is carried out directly in a reaction vessel according to the invention and the generated cDNA according to September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
einer Inkubation reversibel an die erfϊndungsgemäße Oberfläche gebunden. Die Oberfläche wird auf diese Weise abgesättigt, und so können definierte Mengen an cDNA gebunden werden. Überschüssige cDNA wird während des anschließenden Waschschritts entfernt. Nach besagtem Waschritte kann die cDNA in demselben Reaktionsgefäß der Real-Time-PCR unterzogen werden.an incubation reversibly bound to the erfϊndungsgemäße surface. The surface is saturated in this way, and so defined amounts of cDNA can be bound. Excess cDNA is removed during the subsequent washing step. After said washing steps, the cDNA can be subjected to real-time PCR in the same reaction vessel.
Vorteil dieses erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber Verfahren aus dem Stand der Technik ist, dass nach der Reversen Transkription weder eine Quantifizierung der resultierenden cDNA-Menge, noch ein zusätzlicher Pipettierschritt in ein neues Reaktionsgefäß erforderlich ist. Es kommt somit zu einer Vereinfachung bzw. Verkürzung des Protokolls und folglich zu einer erheblichen Verringerung des Arbeitsaufwandes und/oder der Arbeitskosten, sowie zu einer Reduktion der Gefahr von Kreuzkontaminationen und/oder Ungenauigkeiten verursacht durch den zusätzlichen Pipettierschritt.Advantage of this method according to the invention over prior art methods is that after the reverse transcription neither a quantification of the resulting cDNA amount, nor an additional pipetting step is required in a new reaction vessel. There is thus a simplification or shortening of the protocol and consequently a considerable reduction in the workload and / or the labor costs, as well as a reduction in the risk of cross-contamination and / or inaccuracies caused by the additional pipetting step.
Vorteil dieses erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber Verfahren aus dem Stand der Technik ist weiterhin, dass hierbei trotz eines Verzichts auf eine Quantifizierung der resultierenden cDNA-Menge eine, unabhängig von der ursprünglich eingesetzten RNA-Menge, normierte Menge an cDNA für die PCR verwendet wird. Ebenso kann hierbei in einem für eine PCR üblichen Volumen von 25 μl gearbeitet werden, was zu einer erheblichen Kostensenkung führt.An advantage of this method according to the invention over prior art methods is that despite the omission of quantification of the resulting cDNA amount, a normalized amount of cDNA is used for the PCR, regardless of the amount of RNA initially used. Likewise, it is possible to work in a volume of 25 μl which is customary for a PCR, which leads to a considerable cost reduction.
Die Reverse Transkription als auch die anschließende PCR werden wie beschrieben bevorzugt in demselben Gefäß durchgeführt. Es kann aber auch vorgesehen sein, dass nach dem Binde- bzw. Normierungsschritt ein oder mehrere Aliquots aus dem Reaktionsgefäß entnommen und in ein oder mehrere neue Reaktionsgefäße überführt werden, um die PCR in dem bzw. den weiteren Reaktionsgefäßen durchzuführen. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349The reverse transcription as well as the subsequent PCR are preferably carried out in the same vessel as described. However, it may also be provided that, after the binding or standardization step, one or more aliquots are removed from the reaction vessel and transferred to one or more new reaction vessels in order to carry out the PCR in the other reaction vessel (s). September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Ein weiteres geeignetes Beispiel für das erfindungsgemäße Verfahren besteht aus einem Verfahren aufweisend den Probenaufschluß und die anschließende Gewinnung von mRNA, beispielsweise mit dem QIAGEN-Produkt RNeasy, oder alternativ mit der Isolation von mRNA, beispielsweise mit den QIAGEN- Produkten Oligotex und/oder TurboCapture, (Probenaufbereitungsschritt), die Normierung der freigesetzten bzw. Isolierten mRNA durch Binden an die Gefäßoberfläche (Binde- bzw. Normierungsschritt), und die anschließende Reverse Transkription der mRNA in cDNA (Folgereaktion). An die Reverse Transkription kann sich ggf. ein weiterer Binde- bzw. Normierungsschritt und eine weitere Folgereaktion anschließen, beispielsweise eine Real-Time-PCR der erzeugten cDNA (siehe Tabelle 1, Workflow 6).Another suitable example of the method according to the invention consists of a method comprising the sample digestion and the subsequent recovery of mRNA, for example with the QIAGEN product RNeasy, or alternatively with the isolation of mRNA, for example with the QIAGEN products Oligotex and / or TurboCapture, (Sample preparation step), the normalization of the released or isolated mRNA by binding to the vessel surface (binding or standardization step), and the subsequent reverse transcription of the mRNA in cDNA (subsequent reaction). The reverse transcription may be followed by another binding or standardization step and another subsequent reaction, for example a real-time PCR of the cDNA generated (see Table 1, Workflow 6).
Alternativ kann als Folgereaktion eine einfache Hybridisierungsreaktion vorgesehen sein; in diesem Fall ist der weitere Binde- bzw. Normierungsschritt verzichtbar (siehe Tabelle 1, Workflow 2).Alternatively, a simple hybridization reaction may be provided as a follow-up reaction; In this case, the further binding or standardization step is dispensable (see Table 1, Workflow 2).
Weitere Beispiele für Workflows gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gehen aus Tabelle 1 hervor. Dabei handelt es sich bei den Workflows 1 - 5 um One-Step-V erfahren, da im Laufe des Verfahrens das Reaktionsgefäß nicht geöffnet werden muß, um neue Reagenzien hinzuzugeben. Workflow 6 zeigt ein Two-Step-Verfahren, da hier auf mRNA-Level und cDNA-Level normiert wird, d.h. zwischen den beiden Reaktionen das Gefäß geöffnet wird, um den zweiten Binde- bzw. Normierungsschritt einzuleiten. Further examples of workflows according to the method of the invention are shown in Table 1. Workflows 1-5 are one-step, because in the course of the procedure, the reaction vessel does not have to be opened to add new reagents. Workflow 6 shows a two-step procedure, as it is normalized to mRNA level and cDNA level, ie between the two reactions, the vessel is opened to initiate the second binding or standardization step.
16. September 2009September 16, 2009
QIAGEN GmbH QIAGEN GmbH
Tabelle 1 Table 1
16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Sowohl die Reverse Transkription als auch die ggf. anschließende zweite Folgereaktion (insbesondere die PCR) können dabei in demselben Gefäß durchgeführt werden wie der Probenaufbereitungsschritt. Es kann aber auch vorgesehen sein, dass nach dem ersten oder ggf. dem zweiten Binde- bzw. Normierungsschritt ein oder mehrere Aliquots aus dem Reaktionsgefäß entnommen und in ein oder mehrere neue Reaktionsgefäße überführt werden, um die mindestens eine Folgereaktion in dem bzw. den weiteren Reaktionsgefäßen durchzuführen.Both the reverse transcription and the possibly subsequent second consecutive reaction (in particular the PCR) can be carried out in the same vessel as the sample preparation step. However, it can also be provided that after the first or, if appropriate, the second binding or standardization step, one or more aliquots are removed from the reaction vessel and transferred to one or more new reaction vessels in order to carry out the at least one subsequent reaction in the one or more Carry out reaction vessels.
Bei besagtem Normierungsschritt könnten beispielsweise - je nach der Größe der modifizierten Oberfläche und den eingestellten Bindungsbedingungen - 10 bis 50 ng Biomoleküle (bevorzugt RNA und/oder DNA) aus der Probe isoliert werden.In said standardization step, for example, depending on the size of the modified surface and the set binding conditions, 10 to 50 ng of biomolecules (preferably RNA and / or DNA) could be isolated from the sample.
Erfindungsgemäß ist weiterhin bevorzugt vorgesehen, dassAccording to the invention, it is further preferred that
a) beim Binde- bzw. Normierungsschritt ein Bindepuffer verwendet wird und/oder b) beim Waschschritt ein Waschpuffer verwendet wird.a) a binding buffer is used in the binding or standardization step and / or b) a washing buffer is used during the washing step.
Weiterhin ist bevorzugt vorgesehen, dass die mindestens abschnittsweise funktionalisierte GefäßoberflächeFurthermore, it is preferably provided that the at least partially functionalized vessel surface
a) Silanolgruppen, b) ungesättigte organische Säuren, c) Carboxylgruppen, Sulfonatgruppen und andere polare Gruppen, und/oder d) Metall - und Halbmetalloxide mit Hydroxylgruppena) silanol groups, b) unsaturated organic acids, c) carboxyl groups, sulfonate groups and other polar groups, and / or d) metal and semimetal oxides with hydroxyl groups
aufweist. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349having. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Die besagten Gruppen können im Gegensatz zu den eingangs erwähnten „Charge Switch-Materialien" durchweg mit geeigneten Verfahren (siehe unten) dauerhaft (d.h. in der Regel kovalent) an die Oberfläche von Mikroreaktionsgefäßen und PCR-Gefäßen gebunden werden.The said groups, unlike the "batch switch materials" mentioned above, can be permanently (i.e., usually covalently) permanently attached to the surface of microreaction tubes and PCR tubes by suitable methods (see below).
Die Bindung von Nukleinsäuren an Silika-Matrices ist unter dem Begriff „Boom- Prinzip" bekannt und z.B. in der EP819696 beschrieben (siehe auch Vogelstein & Gillespie (1979), sowie Boom et al. (1990).The binding of nucleic acids to silica matrices is known by the term "boom principle" and described, for example, in EP819696 (see also Vogelstein & Gillespie (1979), and Boom et al. (1990).
Zur selektiven Bindung von Nukleinsäuren aus einer Probe wird letztere in einem Puffer, der eine chaotrope Substanz wie zum Beispiel Guanidiniumthiocyanat enthält, inkubiert. Dabei werden ggf. die Zellen lysiert, die enthaltenen Proteine denaturiert und die Nukleinsäuren - falls noch nicht frei vorliegend - freigesetzt, und es kommt aufgrund der Präsenz der chaotropen Substanz zu einer Auflösung der Hydrathüllen um die Nukleinsäuren. Die Bindung der Nukleinsäuren an die S ilikaober fläche geschieht über Wasserstoffbrücken zwischen den Silanolgruppen (SiOx- oder SiOH-Gruppen) der Silika-Matrix und der negativen Ionenladungen des Phosphatrückgrats der Nukleinsäuren. Die übrigen Bestandteile der Probe können anschließend durch Waschen entfernt werden. Die DNA bzw. RNA wird schließlich unter den Bedingungen der PCR wieder freigesetzt.For selectively binding nucleic acids from a sample, the latter is incubated in a buffer containing a chaotropic substance such as guanidinium thiocyanate. In this case, if necessary, the cells are lysed, denaturing the proteins contained and the nucleic acids - if not yet freely available - released, and it is due to the presence of the chaotropic substance to a dissolution of the hydration shells to the nucleic acids. Binding of the nucleic acids to the silica surface occurs via hydrogen bonding between the silanol groups (SiOx or SiOH groups) of the silica matrix and the negative ion charges of the phosphate backbone of the nucleic acids. The remaining components of the sample can then be removed by washing. The DNA or RNA is finally released again under the conditions of the PCR.
Die Bindung der Nukleinsäuren an eine Anionenaustauscher-Oberfläche beruht auf der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen der negativen Ionenladung des Phosphatrückgrats der Nukleinsäuren und der positiven Oberflächenladung der erfindungsgemäßen Anionenaustauscher-Oberfläche. Quartäre Ammoniumgruppen gehören zur Sparte der stark basischen Anionenautauscher, da ihre Ladung unabhängig vom pH- Wert des Bindepuffers ist. Primäre, sekundäre sowie tertiäre Amine werden als schwach basische Anionenaustauscher bezeichnet. Bei höheren pH- Werten liegen diese in deprotonierter Form vor, was zum Verlust der 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349The binding of the nucleic acids to an anion exchange surface is based on the electrostatic interaction between the negative ion charge of the phosphate backbone of the nucleic acids and the positive surface charge of the anion exchange surface of the invention. Quaternary ammonium groups belong to the category of strongly basic anion exchangers because their charge is independent of the pH of the binding buffer. Primary, secondary and tertiary amines are referred to as weakly basic anion exchangers. At higher pH values, these are present in deprotonated form, resulting in the loss of the September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Austauscherfunktion führt. Das Austauschvermögen schwach basischer Anionenaustauscher ist somit sehr stark vom pH- Wert des verwendeten Bindepuffers abhängig.Exchanger function leads. The exchange capacity of weakly basic anion exchangers is thus very much dependent on the pH of the binding buffer used.
Ähnliche Phänomene wie für Silanolgruppen, insbesondere SiO2 beobachtet man auch für Metall - und Halbmetalloxide, die über Hydroxylgruppen an der Oberfläche verfügen, insbesondere Titan-, Aluminium- und Zirkonoxide, wie TiO2, AI2O3 und ZrO2. Auch an diese Gruppen binden Nukleinsäuren in Anwesenheit chaotroper Salze, und entsprechend beschichtete oder funktionalisierte Oberflächen können unter den gegebenen Bedingungen ebenfalls verwendet werden, um Nukleinsäuren zu binden.Similar phenomena as for silanol groups, in particular SiO 2 , are also observed for metal and semimetal oxides which have hydroxyl groups on the surface, in particular titanium, aluminum and zirconium oxides, such as TiO 2 , Al 2 O 3 and ZrO 2 . Nucleic acids also bind to these groups in the presence of chaotropic salts, and appropriately coated or functionalized surfaces can also be used under the given conditions to bind nucleic acids.
Die genannten ungesättigten organischen Säuren müssen polymerisierbar sein, also mindestens eine ungesättigte C=C Bindung enthalten („Vinyloge Gruppen"), wie z.B. Maleinsäure. Außerdem könne sie nicht in reiner Form verwendet werden, da sie sonst z.B. nicht auf Polypropylen haften. Sie werden daher in Verbindung mit Vinylsilan beispielsweise durch PECVD-V erfahren auf die Oberflächen aufgebracht.The said unsaturated organic acids must be polymerizable, ie contain at least one unsaturated C = C bond ("vinylogous groups"), such as maleic acid, Moreover, they can not be used in pure form, since otherwise they do not adhere to polypropylene Therefore, applied in conjunction with vinyl silane, for example by PECVD-V experienced on the surfaces.
Dabei stellen die auf diese Weise gebundenen ungesättigten organischen Säuren Carboxylgruppen (-COO" oder -COOH-Gruppen) zur Verfügung, die in der Lage sind, unter Hochsalzbedingungen Nukleinsäuren reversibel zu binden. Dabei sind die ungesättigten organischen Säuren nur das Mittel zum Zweck, Carboxylgruppen in ein PECVD-beschichtetes Polymer einzuführen, um eine polare Oberfläche mit einer Wasserstoffbrückendonor-Funktionalität zu erzeugen.The unsaturated organic acids bound in this way provide carboxyl groups (-COO " or -COOH groups) which are capable of reversibly binding nucleic acids under high salt conditions, with the unsaturated organic acids being only the means to an end, carboxyl groups into a PECVD-coated polymer to create a polar surface with hydrogen-bond donating functionality.
Durch Hochsalz wird die Löslichkeit von Nukleinsäuren in Wasser herabgesetzt. Grund ist das Aufbrechen von Wasserstoffbrücken und damit verbunden eine Verringerung der Stabilisierung von Sekundär- und Tertiär- Strukturen der 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349High salt lowers the solubility of nucleic acids in water. Reason is the breaking of hydrogen bonds and with it a reduction of the stabilization of secondary and tertiary structures of the September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Nukleinsäuren in Wasser. Wird nun eine po lare Ob erfläche als Wasser stoffbrückendonor angeboten, binden die Nukleinsäuren an dieser Oberfläche, da sie dort eine bessere Stabilisierung erfahren als in Wasser. Wird die Salzkonzentration verringert, wird Wasser wieder ein besserer Wasser stoffbrückendonor als die polare Oberfläche, und die Nukleinsäuren lassen sich wieder von der Oberfläche ablösen.Nucleic acids in water. If a polar surface is offered as a water-bridged donor, the nucleic acids bind to this surface because they experience better stabilization there than in water. When the salt concentration is reduced, water again becomes a better water-bridged donor than the polar surface, and the nucleic acids can be released from the surface again.
Ferner ist erfindungsgemäß ein Reaktionsgefäß zur Durchführung eines wie oben beschriebenen Verfahrens vorgesehen, das eine Gefäßoberfläche aufweist, die mindestens abschnittsweise - bevorzugt an der Innenseite des Gefäßes - dergestalt funktionalisiert ist, das s sie Biomoleküle unter den genannten Verfahrensbedingungen reversibel binden kann.Furthermore, according to the invention, a reaction vessel is provided for carrying out a method as described above, which has a vessel surface which is at least partially functionalized - preferably on the inside of the vessel - in such a way that it can reversibly bind biomolecules under the mentioned process conditions.
Der erfmdungsgemäß funktionalisierte Bereich der Reaktionsgefäße nimmt dabei bevorzugt eine Fläche von einschließlich 0,01 mm2 - einschließlich 10 cm2 proThe functionalized area of the reaction vessels according to the invention preferably has an area of 0.01 mm 2 inclusive - including 10 cm 2 per
Reaktionsgefäß ein, besonders bevorzugt eine Fläche von einschließlich 0,01 mm2 Reaction vessel, more preferably an area of 0.01 mm 2 inclusive
- einschließlich 1 cm2, ganz besonders bevorzugt eine Fläche von einschließlichincluding 1 cm 2 , most preferably an area of inclusive
0,01 mm2 - einschließlich 500 mm2 und noch bevorzugter eine Fläche von besonders bevorzugt 0,01 mm2 - besonders bevorzugt 100 mm2 ein. Dies bedeutet z.B., dass eine 96 - well PCR Platte, ein PCR 8-ter Strip oder eine Multititerplatte die besagte beschichtete Fläche multipliziert mit der Anzahl ihrer Wells aufweist.0.01 mm 2 - including 500 mm 2, and more preferably an area of more preferably 0.01 mm 2 - more preferably 100 mm 2 . This means, for example, that a 96-well PCR plate, a PCR 8-th strip or a multi-well plate has the said coated area multiplied by the number of its wells.
Durch gezielte Einstellung der Beschaffenheit (insbesondere Art und Dichte der funktionellen Gruppen) und der Dimensionierung der funktionalisierten Fläche kann die Bindungskapazität des betreffenden Reaktionsgefäßes für die betreffenden Biomoleküle genau eingestellt werden. Neben der Fläche kann auch über die Kontaktzeit und die Stringenz des Bindepuffers die Menge an Biomolekülen, die gebunden werden, beeinflusst werden. Das Ziel ist jedoch, die 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349By deliberately adjusting the nature (in particular the type and density of the functional groups) and the dimensioning of the functionalized surface, the binding capacity of the relevant reaction vessel for the relevant biomolecules can be precisely adjusted. In addition to the area, the amount of biomolecules that are bound can also be influenced by the contact time and stringency of the binding buffer. The goal, however, is the September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Normierung durch eine komplette Absättigung der zur Verfügung gestellten Fläche im Reaktionsgefäß mit Biomolekülen zu erreichen.To achieve normalization by a complete saturation of the available area in the reaction vessel with biomolecules.
Bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass die Bindungskapazität pro Reaktionsgefäß im Bereich zwischen einschließlich 1 ng und einschließlich 40 μg, besonders bevorzugt zwischen einschließlich 1 ng und einschließlich 4 μg, noch bevorzugter zwischen einschließlich 1 ng und einschließlich 2 μg, ganz besonders bevorzugt zwischen einschließlich 1 ng und einschließlich 500 ng liegt.Preferably, it is provided that the binding capacity per reaction vessel in the range between 1 ng and including 40 ug, more preferably between 1 ng and including 4 ug, more preferably between 1 ng and including 2 ug, most preferably between 1 ng and including 500 ng.
Setzt man beispielsweise eine Bindungskapazität von 50 ng pro Reaktionsgefäß voraus, so bedeutet dies, dass für den Fall, dass die betreffende Probe, die zuvor z.B. einer Lyse, einem Zellaufschluß, einem Isolierungsschritt oder einer Reversen Transkription unterzogen wurde, mehr als 50 ng der betreffenden Biomolekülspezies aufweist, der überschüssige Anteil an Biomolekülen nicht gebunden und beim anschließenden Waschschritt entfernt wird. Es geht also u.U. die Information über der quantitativen Anteil des bzw. der betreffenden Biomoleküls verloren. Der Verlust der absoluten quantitativen Information ist jedoch für einen Großteil der möglichen Anwendungsszenarien verschmerzbar.Assuming, for example, a binding capacity of 50 ng per reaction vessel, this means that in the case where the sample in question, which was previously used e.g. has undergone lysis, cell disruption, isolation step or reverse transcription, more than 50 ng of the biomolecule species concerned, the excess fraction of biomolecules is unbound and removed in the subsequent washing step. So it is u.U. lost the information about the quantitative part of the biomolecule (s) concerned. However, the loss of absolute quantitative information is tolerable for much of the possible application scenarios.
Umgekehrt würde dies bedeuten, dass, wenn die Probe weniger als 50 ng der betreffenden Biomolekülspezies aufweist, die Bindungskapazität nicht voll ausgeschöpft wird und folglich keine Normierung durchführbar ist.Conversely, this would mean that, if the sample contains less than 50 ng of the biomolecule species concerned, the binding capacity is not fully utilized and hence normalization is not feasible.
Dies bedeutet, dass man in der Praxis dazu neigen wird, die Bindungskapazität so einzustellen (siehe oben), dass man sich tendenziell eher unterhalb bzw. an der unteren Grenze der erwarteten Menge an Biomolekülen in der Probe bewegen wird. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349This means that, in practice, one will tend to adjust the binding capacity (see above), tending to move below the lower limit of the expected amount of biomolecules in the sample. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Bevorzugt ist dabei vorgesehen, dass die mindestens abschnittsweise funktionalisierte GefäßoberflächeIt is preferably provided that the at least partially functionalized vessel surface
a) Silanolgruppen, b) ungesättigte organische Säuren, c) Carboxylgruppen, Sulfonatgruppen und andere polare Gruppen, und/oder d) Metall - und Halbmetalloxide mit Hydroxylgruppena) silanol groups, b) unsaturated organic acids, c) carboxyl groups, sulfonate groups and other polar groups, and / or d) metal and semimetal oxides with hydroxyl groups
aufweist.having.
Dabei ist bevorzugt vorgesehen, dass die oben genannten funktionellen GruppenIt is preferably provided that the above-mentioned functional groups
a) durch Plasmabeschichtung auf das Material des Reaktionsgefäßes aufgebracht sind, b) durch nasschemische Verfahren auf d as M at eri a l de sa) are applied to the material of the reaction vessel by plasma coating, b) by wet chemical processes on the material of the reaction vessel
Reaktionsgefäßes aufgebracht sind, und/oder c) durch die Eigenschaften des Materials des Reaktionsgefäßes selbst bedingt sind.Reaction vessel are applied, and / or c) are conditioned by the properties of the material of the reaction vessel itself.
Die Aufbringung der erfϊndungsgemäßen Silanolgruppen durch Plasmabeschichtung auf das Material des erfϊndungsgemäßen Reaktionsgefäßes erfolgt bevorzugt im Atmosphärendruckplasma, wie z.B. beschrieben in der DE102006036536B3 und DE000010322696B3 des Fraunhofer-Instituts für Schicht- und Oberflächentechnik IST, auf deren Inhalt hier vollumfänglich verwiesen wird. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349The application of the silanol groups according to the invention by plasma coating onto the material of the inventive reaction vessel is preferably carried out in atmospheric pressure plasma, as described, for example, in DE102006036536B3 and DE000010322696B3 of the Fraunhofer Institute for Surface Engineering and Thin Films, the contents of which are hereby incorporated by reference. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Dieses Verfahren wird auch als „Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition" (PECVD) bezeichnet. Hierbei handelt es sich um eine Sonderform der chemischen Gasphasenabscheidung (CVD), bei der die Abscheidung von dünnen Schichten auf einer Oberfläche mittels Plasma unterstützter chemischer Reaktionen bewerkstelligt wird. Dazu wird in einer Reaktionskammer zwischen dem zu beschichtenden Substrat und einer Gegenelektrode ein starkes elektrisches Wechselfeld angelegt, durch das ein Plasma gezündet wird. Das Plasma bewirkt ein Aufbrechen der Bindungen eines gasförmigen Abscheidungsmediums, auch Reaktionsgas genannt, und zersetzt dieses in einzelne Radikale, die in der Gasphase weiterreagieren. Die Gasphasenreaktionprodukte scheiden sich auf dem Substrat in Form dünner Schichten ab (Schichtdicken zwischen 50 und 300 nm. Auf Grund des Plasmas kann beim PECVD-Verfahren, das auch oft Koronaentladung genannt wird, eine höhere Abscheiderate bei einer gleichzeitig geringeren Abscheidetemperatur als mit dem CVD-Verfahren erreicht werdenThis process is also known as "Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition" (PECVD), a special form of chemical vapor deposition (CVD), in which the deposition of thin films on a surface is accomplished by plasma assisted chemical reactions In a reaction chamber between the substrate to be coated and a counterelectrode a strong alternating electric field is applied, by which a plasma is ignited.The plasma breaks up the bonds of a gaseous deposition medium, also called reaction gas, and decomposes it into single radicals, which in the The gas phase reaction products deposit on the substrate in the form of thin layers (layer thicknesses between 50 and 300 nm.) Due to the plasma can in the PECVD process, which is often called corona discharge, a higher deposition rate at a lower deposition temperature achieved by the CVD method
Grundsätzlich ist es Voraussetzung für die Abscheidung eines bestimmten Materials, dass dieses in einem gasförmigen Aggregatzustand verfügbar gemacht werden kann; häufig geschieht dies mithilfe eines sogenannten Precursors, also einer Verbindung, die bei einer bestimmten Temperatur einen gewissen Dampfdruck besitzen muß, und die das abzuscheidende Material in chemisch gebundener Form enthält. Auf diese Weise befinden sich die zu verwendenden Abscheidungsmedien bereits in der Gasphase und können so leicht aus dem außerhalb der Reaktionskammer liegenden Gasversorgungssystem in die Reaktionskammer eingeleitet und dem Plasma zugeführt werden. So verwendet man für als Precursor für die Herstellung einer kohlenstoffhaltigen Beschichtung, wie z.B. DLC („Diamond like carbon"), die kohlenstoffhaltigen Gase Acetylen (C2H2) oder Methan. Für die Herstellung einer Silikabeschichtung kommt z.B. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349Basically, it is a prerequisite for the deposition of a particular material that this can be made available in a gaseous state of matter; Often this is done by means of a so-called precursor, ie a compound which must have a certain vapor pressure at a certain temperature, and which contains the material to be deposited in chemically bound form. In this way, the deposition media to be used are already in the gas phase and can thus be easily introduced from the outside of the reaction chamber gas supply system in the reaction chamber and fed to the plasma. For example, the carbonaceous gases acetylene (C 2 H 2 ) or methane are used as precursors for the production of a carbon-containing coating, such as DLC ("diamond like carbon") September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Tetramethylsilan (TMS), Tetraethoxysilan (TEOS) oder Tetramethoxysilan (TMOS) in Frage. Weitere geeignete Precursor existieren beispielsweise für die Abscheidung von TiO2, Al2O3 und ZrO2.Tetramethylsilane (TMS), tetraethoxysilane (TEOS) or tetramethoxysilane (TMOS) in question. Other suitable precursors exist, for example, for the deposition of TiO 2 , Al 2 O 3 and ZrO 2 .
Der Precursor wird dabei in die Entladungszone des Plasmas eingespeist, wo das Gas in Ionen aufgespalten und selbige beschleunigt werden. Häufig wird gleichzeitig Sauerstoff eingespeist, um einen etwaigen organischen Anteil im Precursor zu verbrennen, beispielsweise bei der Herstellung einer Silikabeschichtung mit Tetramethylsilan (nicht jedoch beispielsweise bei der Herstellung einer kohlenstoffhaltigen Beschichtung mit Acetylen).The precursor is fed into the discharge zone of the plasma, where the gas is split into ions and accelerated selbige. Often, oxygen is simultaneously fed to burn any organic portion in the precursor, for example, in the preparation of a silica coating with tetramethylsilane (but not, for example, in the preparation of a carbonaceous coating with acetylene).
Die Gasionen prallen dann mit hoher Geschwindigkeit auf die Oberfläche des zu beschichteten Werkstücks auf, wo sie reduziert werden und die betreffende Beschichtung aufbauen. Häufig werden dabei kovalente Bindungen zwischen dem Material der Oberfläche und den Beschichtungsmaterialien aufgebaut, die eine dauerhafte Bindung der Beschichtung an das Material gewährleisten.The gas ions then impinge on the surface of the workpiece to be coated at high speed, where they are reduced and build up the relevant coating. Frequently, covalent bonds are formed between the material of the surface and the coating materials, which ensure permanent bonding of the coating to the material.
So entstehen im Plasma an einer Polypropylen- Oberfläche durch homolytische Spaltung von C-C und C-H Bindungen Radikale am Polypropylen (PP). Diese können beispielsweise mit dem Sauerstoff, Silicium oder Kohlenstoff des Beschichtungsmaterials kovalente Bindungen eingehen.Thus, in the plasma on a polypropylene surface by homolytic cleavage of C-C and C-H bonds radicals on the polypropylene (PP). These can, for example, enter into covalent bonds with the oxygen, silicon or carbon of the coating material.
Dabei entsteht die kovalente Anbindung des Beschichtungsmaterials an die Polypropylen-Oberfläche. Im Fall von SiO2-Beschichtungen mit TEOS als Precursor erfolgt die kovalente Anbindung an PP über Si-O-C- und Si-C- Bindungen. Im Fall von organischen Monomeren als Precursoren erfolgt die kovalente Anbindung an PP beispielsweise über C-C- und C-O-C- Bindungen.This results in the covalent attachment of the coating material to the polypropylene surface. In the case of SiO 2 coatings with TEOS as precursor, the covalent attachment to PP occurs via Si-O-C and Si-C bonds. In the case of organic monomers as precursors, the covalent attachment to PP takes place, for example, via CC and COC bonds.
Auch bei Nichtausbildung von kovalenten Bindungen werden auf diese Weise jedoch überaus dauerhafte Beschichtungen erzielt. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349Even with non-formation of covalent bonds, however, extremely durable coatings are achieved in this way. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Das PECVD-V erfahren ermöglicht es überdies auch, organische Polymere in der Gasphase im Plasma zu erzeugen und auf dem Träger abzuscheiden. Hier können Monomere wir z.B . Maleinsäureanhydrid, Acrylate, Vinylsilane u.a. polymerisierbare Precursoren (Monomere) eingesetzt werden. Dabei wird ebenfalls auf den Sauerstoff im Trägergas verzichtet, um die organischen Bestandteile nicht zu oxidieren.Moreover, the PECVD-V also makes it possible to generate organic polymers in the gas phase in the plasma and to deposit them on the carrier. Here, monomers, e.g. Maleic anhydride, acrylates, vinyl silanes and the like. polymerizable precursors (monomers) are used. In this case, the oxygen in the carrier gas is likewise dispensed with in order not to oxidize the organic constituents.
Es sind mit diesem Verfahren aber auch Silanolgruppenhaltige Schichten abscheidbar, die direkt zu Anionentauscherschichten führen. Der Precursor Aminopropyltrimethoxysilan ermöglicht z.B. eine direkte Herstellung von Silanolgruppen und Anionentauschergruppen in einer PECVD-Schicht.However, it is also possible with this method to deposit layers containing silanol groups, which lead directly to anion exchanger layers. The precursor aminopropyltrimethoxysilane allows e.g. a direct preparation of silanol groups and anion exchange groups in a PECVD layer.
Durch die Wahl geeigneter Precursoren können auch Carboxylgruppenhaltige Silikaschichten erzeugt werden.By choosing suitable precursors, it is also possible to produce silicon layers containing carboxyl groups.
Mit den Precursoren Vinyltrimethoxysilan und Maleinsäureanhydrid ist es ebenfalls möglich, auf Polypropylen entsprechende Carboxylgruppenhaltige Schichten zu generieren.With the precursors vinyltrimethoxysilane and maleic anhydride, it is likewise possible to generate corresponding carboxyl-containing layers on polypropylene.
Metall - und Halbmetalloxide lassen sich lassen sich ebenfalls über das PECVD- Verfahren aus den entsprechenden Precursoren (Metall bzw.- Halbmetall- Alkoxiden) in der Gasphase unter Zugabe von Sauerstoff herstellen und beispielsweise auf Polypropylen abscheiden.Metal and semimetal oxides can also be prepared by the PECVD process from the corresponding precursors (metal or semimetal alkoxides) in the gas phase with the addition of oxygen and, for example, deposited on polypropylene.
Neben den Metall bzw. - Halbmetall- Alkoxiden können auch Gasphasenpolymere aus z.B. Acrylaten u.a. ungesättigten Verbindungen mittels PECVD in situ hergestellt und beschichtet werden. Durch geschickte Wahl der Monomere (z.B. HEMA, Acrylsäure. Maleinsäureanhydrid, usw.) und Vinylsilan sind auch gemischte Co-Polymere eines organischen Monomers wie Maleinsäureanhydrid und eines Silanes (Vinylsilan) auf Polypropylen abscheidbar. In diesem Fall 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349In addition to the metal or - semimetal alkoxides, gas phase polymers of, for example, acrylates and other unsaturated compounds can be prepared and coated in situ by means of PECVD. By judicious choice of monomers (eg, HEMA, acrylic acid, maleic anhydride, etc.) and vinylsilane, mixed co-polymers of an organic monomer such as maleic anhydride and a silane (vinylsilane) can also be deposited on polypropylene. In this case September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
erzeugt man ein Polymer, das sowohl über Carboxylgruppen als auch über Silanolgruppen verfügt.To produce a polymer which has both carboxyl groups and silanol groups.
Besonders Hydroxylgruppen (geminal, vicinal), Diolgruppen, Carboxylgruppen, Aminogruppen und Silanolgruppen sind geeignete chemische Funktionen um Oberflächenmaterialien mit Wasserstoffbrückendonoreigenschaften auf Polypropylen herzustellen.Especially hydroxyl groups (geminal, vicinal), diol groups, carboxyl groups, amino groups and silanol groups are suitable chemical functions to produce surface materials having hydrogen bond donating properties on polypropylene.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden auch in situ Co-Polymere von Maleinsäureanhydrid und Vinylsilan hergestellt. Vorteilhaft ist, dass dieses Precursorgemisch einen ausreichenden Dampfdruck besitzt, mittels PECVD in der Gasphase polymerisierbar ist und auf Polypropylen also dem Material des Reaktionsgefäßes gut haftende Schichten bildet.In the context of the present invention, co-polymers of maleic anhydride and vinylsilane were also prepared in situ. It is advantageous that this precursor mixture has a sufficient vapor pressure, can be polymerized in the gas phase by means of PECVD and thus forms well-adhering layers on polypropylene to the material of the reaction vessel.
Zur Abscheidung von Sulfonatgruppen mittels PECVD kann als Precursor z.B. Styrolsulfonsäure verwendet werden.For the deposition of sulfonate groups by means of PECVD can be used as precursor e.g. Styrenesulfonic acid can be used.
Im Gegensatz zu den oben bereits erwähnten CVD-Verfahren bleibt bei PECVD- Verfahren die Temperatur etwa bei Raumtemperatur. PECVD-V erfahren eignen sich daher auch für die Beschichtung von Kunststoffen, wie z.B. Polypropylen und Polyethylen, die häufig für die erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße verwendet werdenIn contrast to the above-mentioned CVD method, the temperature remains at about room temperature in PECVD method. PECVD-V experienced are therefore also suitable for the coating of plastics, such. Polypropylene and polyethylene, which are often used for the reaction vessels according to the invention
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung zeigen überdies, dass mit Hilfe einer geeigneten Beschichtungsvorrichtung die inneren Oberflächen von Mikroreaktionsgefäßen, insbesondere PCR-Reaktionsgefäßen („8-ter Strips", 96- Well Platten, Multititerplatten), Einweg-Reaktionsgefäßen und Pipettenspitzen, mit Tetraethoxysilan und carboxylhaltigen Copolymeren aus Vinylsilan und Maleinsäureanhydrid als Precursoren beschichtet werden kann. Eine entsprechende Vorrichtung ist in Fig. 7 gezeigt. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349The inventors of the present invention also show that with the aid of a suitable coating apparatus, the inner surfaces of microreaction vessels, in particular PCR reaction vessels ("8-th Strips", 96-well plates, multi-well plates), disposable reaction vessels and pipette tips, with tetraethoxysilane and carboxyl-containing Copolymers of vinylsilane and maleic anhydride can be coated as precursors A corresponding device is shown in FIG. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Die gezeigte Vorrichtung lässt sich im Übrigen in paralleler Anordnung einsetzen, so dass mehrere Reaktionsgefäße gleichzeitig beschichtet werden können.Incidentally, the device shown can be used in a parallel arrangement, so that a plurality of reaction vessels can be coated simultaneously.
Bevorzugte nasschemische Verfahren zur Aufbringung von Silanolgruppen auf das Material sind z.B. Sol-Gel-Prozesse. Dabei werden die Precurser zusammen mit einer definierten Menge an Wasser und eventuellen Katalysatoren in einem Lösungsmittel, beispielsweise Wasser, gelöst. Vorzugsweise wird Tetraethoxysilan (TEOS) als Silciumdioxid-Precurser verwendet.Preferred wet chemical methods for applying silanol groups to the material are e.g. Sol-gel processes. The precursors are dissolved together with a defined amount of water and any catalysts in a solvent, for example water. Preferably, tetraethoxysilane (TEOS) is used as Silciumdioxid precursor.
Insbesondere kann aber auch vorgesehen sein, dass die erfindungsgemäßen Silanolgruppen durch die Eigenschaften des Materials des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes selbst bedingt sind; beispielsweise dann, wenn es sich bei dem Material um Glas handelt.In particular, however, it can also be provided that the silanol groups according to the invention are conditioned by the properties of the material of the reaction vessel according to the invention itself; for example, if the material is glass.
Erfindungsgemäß ist ferner bevorzugt vorgesehen, dass es sich bei dem Reaktionsgefäß um ein Gefäß aus der Gruppe enthaltend a) PCR Gefäße, PCR 8ter Strips oder PCR 96-well Platten, b) eine Kapillare oder einen mikrofluidischen Kanal, c) ein Einweg-Reaktionsgefäß, d) eine Pipettenspitze und/oder e) eine Multititerplatte handelt.According to the invention, it is further preferably provided that the reaction vessel is a vessel from the group comprising a) PCR vessels, PCR 8ter strips or PCR 96-well plates, b) a capillary or a microfluidic channel, c) a disposable reaction vessel, d) a pipette tip and / or e) a multi-well plate.
Bei den erwähnten Mikroreaktionsgefäße kann es sich beispielsweise um umgangssprachlich auch als PCR-Reaktionsgefäße (ABI, Thermo etc.) bezeichnete, ggf. verschließbare Gefäße mit einem Volumen von 0,1 - 2 ml handeln. Diese sind in der Regel aus Polypropylen, Polyethylen, COC, PET oder Polycarbonat gefertigt. 16. September 2009The microreaction vessels mentioned may be, for example, colloquially also termed PCR reaction vessels (ABI, Thermo, etc.), possibly closable vessels having a volume of 0.1-2 ml. These are usually made of polypropylene, polyethylene, COC, PET or polycarbonate. September 16, 2009
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Ähnliches gilt im übrigen für die erwähnten Pipettenspitzen, die in der Regel als Einmalartikel in Verbindung mit automatischen Pipetten (umgangssprachlich oft auch als „Eppendorf-Pipettten" bezeichnet) Verwendung finden.The same applies, moreover, to the aforementioned pipette tips, which are generally used as disposable items in conjunction with automatic pipettes (colloquially often also referred to as "Eppendorf pipettes").
Bei einer Mikrotiterplatte handelt es sich um eine Einheit aufweisend eine Vielzahl von Reaktionsgefäßen („Wells") im Sinne der Erfindung. Solche Mikrotiterplatten weisen in der Regel zwischen einschließlich 6 und einschließlich 1536 Wells auf. Typische Mikrotiterplatten-Formate sind in Tabelle 2 gezeigt.A microtiter plate is a unit comprising a multiplicity of "wells" in the sense of the invention, such microtiter plates generally having between 6 and up to 1536 wells in each case Typical microtiter plate formats are shown in Table 2.
Tabelle 2Table 2
Ferner ist ein Kit zur Durchführung eines wie oben beschriebenen Verfahrens vorgesehen, wobei besagtes Kit mindestens aufweistFurther provided is a kit for carrying out a method as described above, wherein said kit has at least
a) einen Bindepuffer, b) einen Waschpuffer, 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349a) a binding buffer, b) a washing buffer, September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
c) ggf. Reagenzien zur Durchführung eines Probenaufbereitungsschritts, bevorzugt einer Reversen Transkription (RT) d) ggf. Reagenzien zur Durchführung einer Folgereaktion, bevorzugt einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) e) sowie ggf. mindestens ein Reaktionsgefäß gemäß obigerc) optionally reagents for carrying out a sample preparation step, preferably a reverse transcription (RT) d) optionally reagents for carrying out a subsequent reaction, preferably a polymerase chain reaction (PCR) e) and optionally at least one reaction vessel according to the above
Beschreibung.Description.
Weiterhin ist bevorzugt vorgesehen, dass der Waschpuffer Wasser, TRIS, einen Komplexbildner, ein Polyol, ein Detergenz, ein Polymer, Copolymer und/oder Terpolymer enthält.Furthermore, it is preferably provided that the washing buffer contains water, TRIS, a complexing agent, a polyol, a detergent, a polymer, copolymer and / or terpolymer.
Ferner ist bevorzugt vorgesehen, dass der Bindepuffer chaotrope Substanzen aufweist. Hierbei handelt es sich besonders bevorzugt um mindestens eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe enthaltendFurthermore, it is preferably provided that the binding buffer has chaotropic substances. These are particularly preferably at least one substance selected from the group containing
• Guanidinhydro chlorid,Guanidine hydrochloride,
• Guanidinium(iso)thiocyanat,Guanidinium (iso) thiocyanate,
• Natriumiodid,Sodium iodide,
• Kaliumiodid, • Natrium(iso)thiocyanat und/oderPotassium iodide, sodium (iso) thiocyanate and / or
• Harnstoff,• urea,
oder einer Mischung derselben.or a mixture thereof.
Der Bindepuffer zur Bindung der cDNA an eine Anionenaustauscher-Oberfläche ist bevorzugt ein Niedrigsalzpuffer. Dabei wird bevorzugt ein pH Wert unterhalb des pKs- Wertes der Oberfläche bzw. der Oberflächengruppen eingestellt, sodass im Bindeschritt die Anionentauscher positive Oberflächenladungen aufweisen und so die negativ geladenen Nukleinsäuren binden können. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349The binding buffer for binding the cDNA to an anion exchange surface is preferably a low salt buffer. In this case, a pH value below the pKa value of the surface or of the surface groups is preferably set, so that in the binding step the anion exchangers have positive surface charges and thus can bind the negatively charged nucleic acids. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Vorgesehen ist ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes und/oder eines erfindungsgemäßen Kits zur Normierung des Gehalts von Biomolekülen in einer Probe.It is further intended to use a reaction vessel according to the invention and / or a kit according to the invention for standardizing the content of biomolecules in a sample.
Bevorzugt handelt es sich dabei um cDNA, die mittels einer Reversen Transkription (RT) aus RNA, bevorzugt mRNA, in dem erfindungsgemäßen Reaktionsgefäß hergestellt wurde, wobei die cDNA anschließend einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unterzogen wird.This is preferably cDNA which has been prepared by means of a reverse transcription (RT) from RNA, preferably mRNA, in the reaction vessel according to the invention, the cDNA then being subjected to a polymerase chain reaction (PCR).
DlSCLAIMERDlSCLAIMER
Die vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausführungsbeispielen beschriebenen erfindungsgemäß zu verwendenden Komponenten unterliegen in ihrer Größe, Formgestaltung, Materialauswahl und technischen Konzeption keinen besonderen Ausnahmebedingungen, so dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschränkt Anwendung finden können. Ferner haben die nachfolgenden Beispiele keinerlei beschränkende Wirkung auf den Schutzbereich dieser Anmeldung; letzterer wird ausschließlich durch die Ansprüche definiert. The above-mentioned and the claimed components to be used according to the invention described in the exemplary embodiments are not subject to special exceptions in their size, shape design, material selection and technical design, so that the selection criteria known in the field of application can be used without restriction. Furthermore, the following examples have no limiting effect on the scope of this application; the latter is defined exclusively by the claims.
16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
ZEICHNUNGEN UND BEISPIELEDRAWINGS AND EXAMPLES
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung der zugehörigen Figuren und Beispiele, in denen - beispielhaft - mehrere Ausführungsbeispiele sowie Einsatzmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung dargestellt sind.Further details, features and advantages of the subject matter of the invention will become apparent from the subclaims and from the following description of the accompanying figures and examples, in which - by way of example - several embodiments and applications of the present invention are shown.
Fig. 1 zeigt ein Diagramm zur Überprüfung der Cτ-Werte von PAXGene-RNA aus humanem Vollblut bei Verwendung eines erfindungsgemäßenFIG. 1 shows a diagram for checking the Cτ values of PAXGene RNA from human whole blood using a method according to the invention
Reaktionsgefäßes,Reaction vessel
Fig. 2 zeigt ein Diagramm zur Überprüfung der Cτ-Werte von PAXGene-RNA aus humanem Vollblut bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes bzw. Vergleichsbeispiele,2 shows a diagram for checking the Cτ values of PAXGene RNA from human whole blood when using a reaction vessel according to the invention or comparative examples,
Fig. 3 zeigt ein Diagramm zur Überprüfung der Cτ-Werte von QIAamp-RNA aus humanem Vollblut bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes bzw. Vergleichsbeispiele,3 shows a diagram for checking the Cτ values of QIAamp RNA from human whole blood using a reaction vessel according to the invention or comparative examples,
Fig. 4 zeigt ein Diagramm zur Überprüfung der Cτ-Werte von QIAamp-RNA aus Jurkatzellen bei Verwendung eines erfmdungsgemäßen Reaktionsgefäßes bzw. Vergleichsbeispiele,4 shows a diagram for checking the Cτ values of QIAamp RNA from Jurkat cells when using a reaction vessel according to the invention or comparative examples,
Fig. 5 zeigt ein Diagramm zur Überprüfung der Cτ-Werte von QIAamp-RNA aus Jurkatzellen bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes und unterschiedlichen Inkubationszeiten,5 shows a diagram for checking the Cτ values of QIAamp RNA from Jurkat cells using a reaction vessel according to the invention and different incubation times,
Fig. 6 zeigt das generelle Schema eines erfmdungsgemäßen Workflows, und 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 3496 shows the general scheme of a workflow according to the invention, and September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Fig.7 zeigt eine Vorrichtung 70 zur Aufbringung einer erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche auf die Innenseite eines Reaktionsgefäßes.7 shows a device 70 for applying a functionalized surface according to the invention to the inside of a reaction vessel.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert, soll aber nicht darauf beschränkt sein.The present invention is further illustrated by the following embodiments, but is not intended to be limited thereto.
Beispiel 1example 1
Es wurde wie folgt vorgegangen:The procedure was as follows:
Die verwendeten erfmdungsgemäßen Oberflächen-modifizierten Reaktionsgefäße (PCR-Gefäß, 0,2 ml, dünnwandig, PCR soft strips, Biozym) wurden mit Tetraethoxysilan (TEOS) im Atmosphärendruckplasma beschichtet.The inventive surface-modified reaction vessels used (PCR vessel, 0.2 ml, thin-walled, PCR soft strips, Biozym) were coated with tetraethoxysilane (TEOS) in the atmospheric pressure plasma.
In den durchgeführten Versuchen wurde sowohl PAXGene- und QIAamp-RNA aus humanem Vollblut als auch QIAamp-RNA aus Jurkatzellen eingesetzt. Die Reverse Transkription wurde sowohl mit Hilfe des QIAGEN-QuantiTect- als auch des Omniscript-Kits mit einem Poly-dT-Primer durchgeführt.Both PAXGene and QIAamp RNA from human whole blood and Jurassic cell QIAamp RNA were used in the experiments. Reverse transcription was performed using both the QIAGEN QuantiTect and Omniscript kit with a poly-dT primer.
Als Bindepuffer wurde 6M GuHCl, 0.1M Kaliumhydrogenphthalat pH 2.5 und als Waschpuffer 2% Nonidet® P40 und 0.1 mg/mL Poly(methyl vinyl ether-alt- maleinsäure) in TE-Puffer verwendet. Die PCR wurde mit einem ABI TaqMan® ßActin Probe Kit in einem ABI 7700 durchgeführt.The binding buffer used was 6M GuHCl, 0.1M potassium hydrogen phthalate pH 2.5, and as washing buffer 2% Nonidet® P40 and 0.1 mg / ml poly (methyl vinyl ether-altemalic acid) in TE buffer. The PCR was performed with an ABI TaqMan® βActin Probe Kit in an ABI 7700.
Das Versuchsprotokoll ist in Tabelle 3 gezeigt: 16. September 2009The experimental protocol is shown in Table 3: September 16, 2009
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Tabelle 3Table 3
Die in der Reversen Transkription verwendete RNA wurde vorab mit einem Nanodrop Spektrophotometer ND-1000 quantifiziert.The RNA used in the reverse transcription was quantified in advance with a nanodrop spectrophotometer ND-1000.
Als Kontrollen wurden jeweils Aliquots der RT -Ansätze in unbeschichteten PCR- Gefäßen untersucht, die Aliquots der RT-Reaktionen wurden dafür direkt zu dem PCR-Mastermix pipettiert.Aliquots of the RT mixtures in uncoated PCR tubes were examined in each case as controls, and the aliquots of the RT reactions were pipetted directly to the PCR master mix.
In den PCR-Experimenten wurde jeweils eine Achtfachbestimmung durchgeführt, d.h. die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert aus acht Einzelwerten und die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.In each of the PCR experiments, an eight-fold determination was performed, i. the values given correspond to the average of eight individual values and the error bars indicate the standard deviation.
Beispiel 2Example 2
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse eines TaqMan®-Laufs auf die cDNA aus einer QuantiTect cDNA Synthese von PAXGene-RNA aus humanem Vollblut. Hierbei 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 3491 shows the results of a TaqMan® run on the cDNA from a QuantiTect cDNA synthesis of PAXGene RNA from human whole blood. in this connection September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
wurde die Menge der eingesetzten RNA in einem kleinen Bereich variiert (113 - 293 ng).the amount of RNA used was varied in a small range (113-293 ng).
Als Ergebnis ist festzustellen, dass überraschenderweise bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes nach dem Übergang von 135 auf 180 ng eingesetzter RNA ein relativ einheitliches Cτ-Niveau zwischen 18,4 und 19,1 und somit eine Normierung der CT- Werte erreicht wurde.As a result it can be stated that, surprisingly, when using a reaction vessel according to the invention after the transition from 135 to 180 ng of RNA used, a relatively uniform Cτ level between 18.4 and 19.1 and thus normalization of the C T values was achieved.
Beispiel 3Example 3
In Fig. 2 sind ebenfalls die Ergebnisse eines TaqMan®-Laufs auf die cDNA aus einer QuantiTect cDNA Synthese von PAXGene-RNA aus humanem Vollblut gezeigt. Die RNA Menge wurde hierbei zwischen 150 und 450 ng variiert (Spalten 1-5), zusätzlich wurde jeweils ein Aliquot der Reversen Transkription in unbehandelten Gefäßen mit PCR-Mastermix einpipettiert (Spalten 6-10). Für diese Aliquots ist die darin enthaltene Startmenge RNA angegeben. Im Vergleich zum ersten Beispiel wurde die Menge eingesetzter RNA über einen größeren Bereich variiert.FIG. 2 likewise shows the results of a TaqMan® run on the cDNA from a QuantiTect cDNA synthesis of PAXGene RNA from human whole blood. In this case, the amount of RNA was varied between 150 and 450 ng (columns 1-5), in each case one aliquot of the reverse transcription was pipetted into untreated vessels with PCR master mix (columns 6-10). For these aliquots, the starting amount of RNA contained therein is indicated. Compared to the first example, the amount of RNA used was varied over a wider range.
Als Ergebnis ist festzustellen, dass bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes bei einem Einsatz von 150 bis 450 ng RNA ebenfalls ein relativ einheitliches Cτ-Niveau zwischen 17,9 und 18,9 und somit eine Normierung der Cτ-Werte erreicht wurde . Die Kontrollversuche in unbehandelten Reaktionsgefäßen haben gezeigt, dass - wie erwartet - je mehr RNA als Ausgangsmaterial für die Reverse Transkription eingesetzt wurde, desto mehr nahmen die entsprechenden CT- Werte ab. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349As a result, it should be noted that when using a reaction vessel according to the invention with a use of 150 to 450 ng RNA also a relatively uniform Cτ level between 17.9 and 18.9 and thus a normalization of the Cτ values was achieved. The control experiments in untreated reaction vessels have shown that, as expected, the more RNA was used as starting material for the reverse transcription, the more the corresponding C T values decreased. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Beispiel 4Example 4
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse eines TaqMan®-Laufs auf die cDNA aus einer Omniscript cDNA Synthese von QIAamp-RNA aus humanem Vollblut. Hierbei wurde die RNA-Menge zwischen 100 und 1 100 ng RNA variiert, es wurden ebenfalls Kontrollversuche in unbeschichteten Gefäßen durchgeführt.3 shows the results of a TaqMan® run on the cDNA from an omniscript cDNA synthesis of QIAamp RNA from human whole blood. Here, the amount of RNA between 100 and 1 100 ng RNA was varied, it also control experiments were carried out in uncoated vessels.
Als Ergebnis ist festzustellen, dass bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes bei einem Einsatz von 100 bis 1100 ng RNA ein relativ einheitliches Cτ-Niveau um 17,2 eintrat und somit ebenfalls eine Normierung der Cτ-Werte erreicht wurde . Die Kontrollversuche in unbehandelten Reaktionsgefäßen haben gezeigt, dass - wie erwartet - je mehr RNA als Ausgangsmaterial für die Reverse Transkription eingesetzt wurde, desto mehr verringerten sich die entsprechenden Cτ-Werte.As a result, it should be noted that when using a reaction vessel according to the invention with a use of 100 to 1100 ng RNA a relatively uniform Cτ level by 17.2 entered and thus also a normalization of the Cτ values was reached. The control experiments in untreated reaction tubes have shown that, as expected, the more RNA was used as starting material for the reverse transcription, the more the corresponding Cτ values decreased.
Beispiel 5Example 5
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines TaqMan®-Laufs auf die cDNA aus einer Omniscript cDNA Synthese von Jurkat-RNA. Hierbei wurde die RNA-Menge zwischen 100 und 1100 ng RNA variiert, es wurden erneut Kontrollversuche in unbeschichteten Gefäßen durchgeführt.4 shows the results of a TaqMan® run on the cDNA from an Omniscript cDNA synthesis of Jurkat RNA. In this case, the amount of RNA between 100 and 1100 ng RNA was varied, it was again carried out control experiments in uncoated vessels.
Als Ergebnis ist ebenfalls festzustellen, dass bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes bei einem Einsatz von 100 bis 1100 ng RNA eine Normierung der Cτ-Werte erfolgte. Die Kontrollversuche in unbehandelten Reaktionsgefäßen haben wiederum gezeigt, dass je mehr RNA als Ausgangsmaterial für die Reverse Transkription eingesetzt wurde, desto mehr verringerten sich die entsprechenden Cτ-Werte. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349As a result, it should also be noted that when using a reaction vessel according to the invention with a use of 100 to 1100 ng RNA was carried out a normalization of the Cτ values. The control experiments in untreated reaction vessels again showed that the more RNA used as starting material for the reverse transcription, the more the corresponding Cτ values decreased. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Beispiel 6Example 6
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse eines TaqMan®-Laufs auf die cDNA aus einer Omniscript cDNA Synthese von Jurkat-RNA. Hierbei wurde die RNA-Menge zwischen 100 und 800 ng RNA variiert. Zusätzlich wurden unterschiedliche Inkubationszeiten gewählt, nämlich für 100 - 400 ng RNA 240 min, für 500 - 800 ng RNA 20 min.Fig. 5 shows the results of a TaqMan® run on the cDNA from an Omniscript cDNA synthesis of Jurkat RNA. In this case, the amount of RNA was varied between 100 and 800 ng of RNA. In addition, different incubation times were chosen, namely for 100-400 ng RNA 240 min, for 500-800 ng RNA 20 min.
Als Ergebnis ist festzustellen, dass überraschenderweise durch eine Verlängerung der Inkubationszeiten von 20 auf 240 min bereits der Cτ-Wert der geringsten RNA-Menge (100 ng) auf das Niveau der Sättigung der größeren RNA-Mengen (500 bis 800 ng) mit 20-minütiger Inkubationszeit gebracht werden konnte. Ebenso ist aus diesem Beispiel zu ersehen, dass bei mittleren eingesetzten RNA- Mengen von 300 bis 400 ng und langen Inkubationszeiten von 240 min eine Sättigung auf ein relativ niedriges Cτ-Niveau von 15,9 zu erzielen war.As a result, surprisingly, by extending the incubation times from 20 to 240 minutes, the Cτ value of the least amount of RNA (100 ng) has already reached the level of saturation of the larger amounts of RNA (500 to 800 ng) with 20- minute incubation time could be brought. Likewise, it can be seen from this example that with mean amounts of RNA used of 300 to 400 ng and long incubation times of 240 minutes, saturation to a relatively low Cτ level of 15.9 was achieved.
Fig. 6a zeigt das generelle Schema eines erfindungsgemäßen Workflows, mit dem Probenaufbereitungsschritt 2, dem Binde- bzw. Normierungsschritt 3, dem Waschschritt 4 und der Folgereaktion 6. An besagte Folgereaktion kann sich ggf. ein zweiter Binde- bzw. Normierungsschritt und eine zweite Folgereaktion anschließen (siehe Tabelle 1).6a shows the general scheme of a workflow according to the invention, with the sample preparation step 2, the binding or standardization step 3, the washing step 4 and the follow-up reaction 6. A second binding or standardization step and a second follow-up reaction may possibly follow said subsequent reaction connect (see Table 1).
In Fig. 6b ist gezeigt, das besagter Workflow auch in einem PCR-Strip durchgeführt werden kann.In Fig. 6b it is shown that said workflow can also be performed in a PCR strip.
Fig. 7 zeigt eine Vorrichtung 70 zur Aufbringung einer erfindungsgemäß funktionalisierten Oberfläche auf die Innenseite eines Reaktionsgefäßes. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349FIG. 7 shows a device 70 for applying a functionalized surface according to the invention to the inside of a reaction vessel. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Besagte Vorrichtung weist eine Kammer 71 auf, in welcher eine flächige Elektro de 72 angeordnet ist . Weiterhin weist die Kammer eine Gaseinleitungseinrichtung für ein Precursorgas 73 sowie eine Beschichtungselektrode 74 auf. Bei dem Precursorgas handelt es sich beispielsweise um Tetraethoxysilan (TEOS). Die Gaseinleitungseinrichtung 73 und die Beschichtungselektrode 74 sind in der Vorrichtung gemäß Fig. 7 zu einer kombinierten Einrichtung zusammengefasst, die in ihrer Form an den Innenraum eines zu beschichtenden Reaktionsgefäßes 75 (hier ein umgangssprachlich als „Eppendorf-Gefäß" bezeichnetes PCR-Mikroreaktionsgefäß aus Polypropylen mit einem Volumen von 0,2 ml) angepaßt ist.Said device has a chamber 71 in which a flat electrode de 72 is arranged. Furthermore, the chamber has a gas introduction device for a precursor gas 73 and a coating electrode 74. The precursor gas is, for example, tetraethoxysilane (TEOS). The gas inlet device 73 and the coating electrode 74 are combined in the apparatus of FIG. 7 to a combined device in shape to the interior of a reaction vessel to be coated 75 (here a colloquially referred to as "Eppendorf tube" PCR microreaction vessel made of polypropylene with a volume of 0.2 ml) is adjusted.
Zwischen flächiger Elektrode 72 und der Beschichtungselektrode 74 wird mit Hilfe eines Frequenzgenerators 76 nun eine hochfrequente Wechselspannung angelegt (beispielsweise 13.56 MHz), und es entzündet sich ein Plasma im Inneren des Reaktionsgefäßes. Das Plasma bewirkt ein Aufbrechen der Bindungen des Percursor-Gases, und zersetzt dieses in einzelne Radikale, die sich auf dem Substrat niederschlagen und dort die chemische Abscheidereaktion von Silikamolekülen bewirken.Between the planar electrode 72 and the coating electrode 74, a high-frequency alternating voltage is now applied (for example, 13.56 MHz) with the aid of a frequency generator 76, and a plasma ignites in the interior of the reaction vessel. The plasma breaks up the bonds of the percursor gas and decomposes it into individual radicals which precipitate on the substrate where they cause the chemical precipitation reaction of silica molecules.
Die so hergestellte funktionalisierte Oberfläche bewirkt bei der Verwendung des erfindungsgemäß funktionalisierten Reaktionsgefäßes die Bindung der Biomoleküle an die Innenseite des Reaktionsgefäßes (beispielsweise die Bindung von Nukleinsäuren an Silanolgruppen der funktionalisierten Oberfläche in Anwesenheit chaotroper Salze).When using the functionalized reaction vessel according to the invention, the functionalized surface produced in this way brings about the binding of the biomolecules to the inside of the reaction vessel (for example the binding of nucleic acids to silanol groups of the functionalized surface in the presence of chaotropic salts).
Die gezeigte Vorrichtung eignet sich im Übrigen auch für die zeitgleiche Beschichtung mehrere Reaktionsgefäße, so z.B. mehrerer „Eppendorf-Gefäße" oder auch z.B. einer Multititer-Platte mit mehreren Wells. 16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349Incidentally, the apparatus shown is also suitable for the simultaneous coating of a plurality of reaction vessels, for example a plurality of "Eppendorf vessels" or else, for example, a multi-liter plate having a plurality of wells. September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349
Die Größe der beschichteten Fläche der Reaktionsgefäße ist im wesentlichen abhängig von der Größe der Elektrode und kann in einem 0,2 ml PCR-Gefäß zwischen 10 mm2 und 300 mm2 betragen.The size of the coated area of the reaction vessels is essentially dependent on the size of the electrode and may be between 10 mm 2 and 300 mm 2 in a 0.2 ml PCR vessel.
Beispiel 7Example 7
PCR-Gefäße aus Polypropylen mit 0,2 ml Volumen wurden mit Tetraethoxysilan im PECVD-Verfahren unter Atmosphärendruck beschichtet. Dabei wurden Bindekapazitäten für Nukleinsäuren von bis zu 500ng erzeugt.Polypropylene 0.2 ml polypropylene tubes were coated with tetraethoxysilane under atmospheric pressure in the PECVD method. Binding capacities for nucleic acids of up to 500ng were generated.
Die bei der Beschichtung erzeugte Fläche wird u.a. durch Größe und Positionierung der Elektroden (Kathode, Anode) zueinander beim PECVD- Verfahren definiert. Sie betrug hier etwa 150 mm2. The area created during the coating is defined, inter alia, by the size and positioning of the electrodes (cathode, anode) relative to one another in the PECVD method. It was about 150 mm 2 here .
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Claims

16. September 2009 QIAGEN GmbH V\-V 349PATENTANSPRÜCHE September 16, 2009 QIAGEN GmbH V \ -V 349PATENTENSPOURCE
1. Verfahren zur Normierung des Gehalts von Biomolekülen in einer Probe, aufweisend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung eines Reaktionsgefäßes mit einer Gefäßoberfläche, die mindestens abschnittsweise - bevorzugt an der Innenseite des Gefäßes - dergestalt funktionalisiert ist, dass sie Biomo leküle unter Hochsalzbedingungen reversibel binden kann, b) Durchführen mindestens eines Probenaufbereitungsschritts, c) Bindung von Biomo lekülen aus der aufbereiteten Probe an die Gefäßoberfläche („Binde- bzw. Normierungsschritt") unter Hochsalzbedingungen, d) ggf. Waschen („Waschschritt"), und e) Durchführung mindestens einer Folgereaktion.1. A method for normalizing the content of biomolecules in a sample, comprising the following steps: a) providing a reaction vessel with a vessel surface which is functionalized at least in sections - preferably on the inside of the vessel - in such a way that they reversibly bind biomolecules under high salt conditions b) performing at least one sample preparation step, c) binding biomolecules from the prepared sample to the vessel surface ("bonding or standardization step") under high salt conditions, d) optionally washing ("washing step"), and e) carrying out at least a follow-up action.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagten Biomolekülen um Nukleinsäuren handelt.2. Method according to claim 1, characterized in that said biomolecules are nucleic acids.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagter mindestens eine Probenaufbereitungsschritt ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltendA method according to claim 1 or 2, characterized in that said at least one sample preparation step is selected from the group comprising
• Zelllyse,• cell lysis,
• Zellaufschluß, • Isolierung von Biomolekülen,• cell disruption, • isolation of biomolecules,
• Aufreinigung von Biomolekülen,• purification of biomolecules,
• Reverse Transkription von RNA in DNA, und/oderReverse transcription of RNA into DNA, and / or
• Enzymatische Reaktionen und/oder Probenbehandlungen. • Enzymatic reactions and / or sample treatments.
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4. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass besagte mindestens eine Folgereaktion ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that said at least one subsequent reaction is selected from the group containing
• Amplifikationsreaktionen, • Enzyme-Linked Imunoassay (ELISA), und/oder• Amplification reactions, • Enzyme-linked immunoassay (ELISA), and / or
• Hybrid Capture Assay.• Hybrid Capture Assay.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der besagten Amplifikationsreaktion um eine Reaktion ausgewählt aus der5. The method according to claim 4, characterized in that it is in the said amplification reaction to a reaction selected from
Gruppegroup
• Polymerase-Kettenreaktion (PCR),Polymerase chain reaction (PCR),
• Reverse Transkription (RT),Reverse transcription (RT),
• Loop mediated isothermal amplification (LAMP), • Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA),• Loop mediated isothermal amplification (LAMP), • Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA),
• Rolling Circle Chain Reaction (RCCR), oder Rolling Circle Amplification (RCA),Rolling Circle Chain Reaction (RCCR), or Rolling Circle Amplification (RCA),
• Transcription mediated amplification (TM A)Transcription mediated amplification (TM A)
• Ligase-Kettenreaktion (LCR) • Nested PCR, und/oder• Ligase Chain Reaction (LCR) • Nested PCR, and / or
• Immuno-PCR handelt.• Immuno-PCR acts.
6. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass a) beim Binde- bzw. Normierungsschritt ein Bindepuffer verwendet wird und/oder b) beim Waschschritt ein Waschpuffer verwendet wird. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a) in the binding or standardization step, a binding buffer is used and / or b) a washing buffer is used in the washing step.
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7. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens abschnittsweise funktionalisierte Gefäßoberfläche a) Silanolgruppen, b) ungesättigte organische Säuren, c) Carboxylgruppen, Sulfonatgruppen und andere polare Gruppen, und/oder d) Metall - und Halbmetalloxide mit Hydroxylgruppen aufweist.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the at least partially functionalized vessel surface a) silanol groups, b) unsaturated organic acids, c) carboxyl groups, sulfonate groups and other polar groups, and / or d) metal and semimetal oxides having hydroxyl groups ,
8. Reaktionsgefäß zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäß eine Gefäßoberfläche aufweist, die mindestens abschnittsweise - bevorzugt an der Innenseite des Gefäßes - dergestalt funktionalisiert ist, dass sie8. Reaction vessel for carrying out a method according to one of the preceding claims, characterized in that the reaction vessel has a vessel surface which is at least partially - preferably functionalized on the inside of the vessel - such that they
Biomoleküle unter den genannten Verfahrensbedingungen reversibel binden kann.Biomolecules can bind reversibly under the process conditions mentioned.
9. Reaktionsgefäß gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens abschnittsweise funktionalisierte Gefäßoberfläche a) Silanolgruppen, b) ungesättigte organische Säuren, c) Carboxylgruppen, Sulfonatgruppen und andere polare Gruppen, und/oder d) Metall - und Halbmetalloxide mit Hydroxylgruppen aufweist.9. Reaction vessel according to claim 8, characterized in that the at least partially functionalized vessel surface comprises a) silanol groups, b) unsaturated organic acids, c) carboxyl groups, sulfonate groups and other polar groups, and / or d) metal and semimetal oxides with hydroxyl groups.
10. Reaktionsgefäß gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die in Anspruch 9 genannten funktionellen Gruppen 10. Reaction vessel according to claim 9, characterized in that the functional groups mentioned in claim 9
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a) durch Plasmabeschichtung auf das Material des Reaktionsgefäßes aufgebracht sind, b) durch nass chemis che Verfahren auf das M aterial des Reaktionsgefäßes aufgebracht sind, und/oder c) durch die Eigenschaften des Materials des Reaktionsgefäßes selbst bedingt sind.a) are applied to the material of the reaction vessel by plasma coating, b) are applied by wet chemis che process on the M aterial of the reaction vessel, and / or c) are conditioned by the properties of the material of the reaction vessel itself.
11. Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der vorherigen11. Kit for carrying out a method according to one of the preceding
Ansprüche aufweisend mindestensClaims at least
a) einen Bindepuffer, b) einen Waschpuffer, c) ggf. Reagenzien zur Durchführung eines Probenaufbereitungsschritts, bevorzugt einer Reversen Transkription (RT) d) ggf. Reagenzien zur Durchführung einer Folgereaktion, bevorzugt einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) e) sowie ggf. mindestens ein Reaktionsgefäß gemäß einem der Ansprüche 8 - 10.a) a binding buffer, b) a wash buffer, c) optionally reagents for carrying out a sample preparation step, preferably a reverse transcription (RT) d) optionally reagents for carrying out a subsequent reaction, preferably a polymerase chain reaction (PCR) e) and optionally at least one reaction vessel according to one of claims 8-10.
12. Kit bzw. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Waschpuffer Wasser, TRIS, einen Komplexbildner, ein Polyol, ein Detergenz, ein Polymer, Copolymer und/oder Terpolymer enthält.12. Kit or method according to one of the preceding claims, characterized in that the washing buffer contains water, TRIS, a complexing agent, a polyol, a detergent, a polymer, copolymer and / or terpolymer.
13. Kit bzw. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindepuffer chaotrope Substanzen aufweist. 13. Kit or method according to one of the preceding claims, characterized in that the binding buffer has chaotropic substances.
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14. Kit bzw. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der chaotropen Substanz um mindestens eine Substanz handelt, die ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend14. Kit or method according to claim 13, characterized in that the chaotropic substance is at least one substance which is selected from the group comprising
• Guanidinhydro chlorid, • Guanidinium(iso)thiocyanat,Guanidine hydrochloride, guanidinium (iso) thiocyanate,
• Natriumiodid,Sodium iodide,
• Kaliumiodid,Potassium iodide,
• Natrium(iso)thiocyanat und/oder• Sodium (iso) thiocyanate and / or
• Harnstoff, oder einer Mischung derselben.• Urea, or a mixture thereof.
15. Verwendung eines Reaktionsgefäßes und/oder eines Kits gemäß einem der vorherigen Ansprüche zur Normierung des Gehalts von Biomolekülen in einer Probe.15. Use of a reaction vessel and / or a kit according to one of the preceding claims for normalization of the content of biomolecules in a sample.
16. Verwendung eines Reaktionsgefäßes und/oder eines Kits gemäß einem der vorherigen Ansprüche zur Normierung des Gehalts an cDNA, die mittels einer Reversen Transkription (RT) aus RNA, bevorzugt mRNA, in dem besagten Reaktionsgefäß hergestellt wurde, wobei die cDNA anschließend einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unterzogen wird.16. Use of a reaction vessel and / or a kit according to one of the preceding claims for standardization of the content of cDNA which has been produced by means of a reverse transcription (RT) of RNA, preferably mRNA, in said reaction vessel, the cDNA subsequently being polymerase- Chain reaction (PCR) is subjected.
17. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen, bevorzugt Nukleinsäuren, besonders bevorzugt RNA, aufweisend Verfahrensschritte gemäß einem der vorherigen Ansprüche. 17. A method for the detection of biomolecules, preferably nucleic acids, more preferably RNA, comprising method steps according to one of the preceding claims.
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