EP2307452A1 - Method for optimizing proteins having the folding pattern of immunoglobulin - Google Patents

Method for optimizing proteins having the folding pattern of immunoglobulin

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Publication number
EP2307452A1
EP2307452A1 EP09772458A EP09772458A EP2307452A1 EP 2307452 A1 EP2307452 A1 EP 2307452A1 EP 09772458 A EP09772458 A EP 09772458A EP 09772458 A EP09772458 A EP 09772458A EP 2307452 A1 EP2307452 A1 EP 2307452A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
domain
protein
sequence
proteins
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09772458A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Johannes Buchner
Matthias Feige
Dorothee Ambrosius
Barbara Enenkel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim International GmbH
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International GmbH filed Critical Boehringer Ingelheim International GmbH
Publication of EP2307452A1 publication Critical patent/EP2307452A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin

Definitions

  • the present invention is an optimization method of the biophysical properties of proteins of the immunoglobulin (Ig) superfamily. It is thus eminently suitable for application to antibodies. However, it is not limited to these alone, but in principle to all members of the immunoglobulin superfamily, but also on their derivatives such.
  • Biomolecules such as proteins, polynucleotides, polysaccharides and the like are gaining increasing commercial importance as drugs, as diagnostics, as additives in foods, detergents and the like, as research reagents and for many other applications.
  • the need for such biomolecules can be, for.
  • proteins usually no longer satisfy by isolating the molecules from natural sources but requires the use of biotechnological production methods.
  • the biotechnological production of proteins typically begins with the isolation of the DNA encoding the desired protein and its cloning into a suitable expression vector. After transfection of the recombinant expression vector into suitable prokaryotic or eukaryotic expression cells and subsequent selection of transfected, recombinant cells, the latter are cultured in bioreactors and the desired protein is expressed. Subsequently, the harvest of the cells or of the culture supernatant and the workup and purification of the protein contained therein takes place.
  • Antibodies, in particular the subclass immunoglobulin G (IgG) are among the most important biopharmaceutically produced proteins. You will find a wide range of applications from basic research on diagnostics to a variety of therapies, eg. B.
  • Antibodies are complex, glycosylated protein molecules, in the case of IgG composed of two light and two heavy chains (see Figure 1). Antigen recognition and binding take place via two identical antigen-binding sites, so-called paratopes (see Figure 1).
  • the target structure of the antibody, the antigen is not only highly specifically recognized, but its binding is coupled to a multitude of so-called effector functions, which are mediated by the Fc fragment (see Figure 1).
  • Key effector functions include complement-dependent cytotoxicity (CDC) and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).
  • Each protein must undergo a structuring process, called protein folding, in order to perform its inherent function in the defined final structure.
  • This multistep structuring process which often involves folding intermediates, can lead to misfolding and aggregation.
  • diseases that are due to or associated with protein misfolding because proteins either fail to reach their native folding state or do not remain in that native state. These include z. Alzheimer's, Parkinson's and various amyloidoses. If such protein deficiencies occur in biotechnological production processes, this is at the expense of product titer, yield, quality and / or stability.
  • Antibodies belong to the so-called Ig superfamily, which is very widespread in nature.
  • Figure 2 shows the typical topology of a member of the Ig superfamily, beta2-microglobulin. Strands B, C, E and F, which are postulated as cited as the core of the folding process for Ig proteins in general, are marked. SUMMARY OF THE INVENTION
  • the present invention is a biotechnological process for the production of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that an optimization of the natural, helical elements takes place.
  • this optimization is carried out by introducing additional helix-internal salt bridges and / or the removal of Helixbrechern or helix-destabilizing residues (proline and / or glycine).
  • the invention relates to a biotechnological process for the production of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that a transplantation of the natural or optimized helical elements takes place. Preferably, this transplantation occurs in domains that have no or less optimal helical elements.
  • a transfer of one or more helical elements from at least one constant domain C L , C H 2 and / or C H 3 into at least one constant C H 1 domain and / or variable domain (eg V L or V H ).
  • the invention relates to methods for improving the biophysical properties of proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that at least one amino acid in the Ig domain is replaced by another amino acid which increases the formation probability of a HeNx, preferably an ⁇ - Helix, raised.
  • the training probability is preferably calculated with an algorithm, in particular with the algorithm AGADIR.
  • the exchanged amino acid is preferably in the region between two ⁇ -sheet strands, in particular of the type A and B and / or E and F.
  • the exchanged amino acid may be located in a region which already has a helical structure. The aim of such an amino acid exchange in an already existing helical element is then an increase in the helix formation probability of this e- lementes.
  • the helix formation can be increased, for example, by the fact that the amino acid to be exchanged in the Ig domain is proline or glycine, preferably if they are at least at the second position (i ⁇ i + 2) after the preceding ⁇ -sheet strand or at most at the last but one position (i ⁇ i-2) in front of the following ⁇ -sheet strand.
  • Proline and glycine are replaced by an amino acid which is neither proline nor glycine, preferably by alanine.
  • salt bridges by introducing an amino acid having a charged side chain spaced apart (i ⁇ i + 3), (i ⁇ i + 4) or (i ⁇ i + 5) to an amino acid having a sidechain with the opposite charge.
  • at least two amino acids are introduced for this purpose which have side chains with a charge of the same name, the distance between the exchanged amino acids being selected so that the side chains can form a salt bridge.
  • the exchanged amino acids are separated from one another by 2 (i ⁇ i + 3), 3 (i ⁇ i + 4) or more amino acids (i ⁇ i + 5).
  • glutamic acid or aspartic acid can be used, while arginine, lysine, or histidine have positively charged side chains under such conditions.
  • the position at which arginine, lysine, or histidine is introduced, or optionally already present is closer to the C-terminus than the position at which glutamic acid or aspartic acid is introduced or may already be present.
  • a double salt bridge in which a sequence is generated in which 3 amino acids are located at positions i and i + 3, i + 4 or i + 5 and i + 7, i + 8 or i + 9 in which the amino acids at the positions i and i + 7, i + 8 or i + 9 have side chains with the same charge, the amino acid at the position i + 3, i + 4 or i + 5 has a counterpart thereto.
  • 3 corresponding amino acids can be introduced by mutation, if appropriate also less, if corresponding amino acids are already present in the starting sequence.
  • a double salt bridge is located at the middle position i + 3, i + 4 or i + 5 preferably aspartic acid, Glutamic acid or arginine.
  • Preferred embodiments are characterized in that after exchange the protein has a helical element with the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO : 16), and / or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
  • the present invention relates to the transplantation of suitable helical elements into domains having no or less optimal helical elements, such as the Ig domain of the beta2 microglobulin (SEQ ID NO: 3), the variable domains (V L , V H ) or the constant domain C H 1 of immunoglobulins.
  • suitable helical elements such as the Ig domain of the beta2 microglobulin (SEQ ID NO: 3), the variable domains (V L , V H ) or the constant domain C H 1 of immunoglobulins.
  • the transplanted elements may originate, for example, from the constant immunoglobulin domains C L , C H 2 or C H 3 or be variants of such elements optimized according to the method of the invention.
  • the transplantation is preferably carried out by a method in which 4 to 12 consecutive amino acids (preferably about 10 amino acids) are replaced by an amino acid sequence of equal or greater length, wherein the introduced amino acid sequence has a higher formation probability of a HeNx than the exchanged sequence.
  • the introduced sequence is a helical element from the region between the ⁇ -sheet strands A and B and / or E and F of a C L or CH domain of an immunoglobulin.
  • Suitable helical elements have, for example, the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) from a human C H 2 domain (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15) or the optimized KAEDTLHISR sequence (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10) from the murine kappa C L domain (SEQ ID NO: 1), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) from the human lambda C L domain (SEQ ID NO : 13) or also SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11) from the human kappa C L domain (SEQ ID NO: 12).
  • the present invention relates to a method of producing a protein having an immunoglobulin folding pattern therewith characterized in that a method as described above for improving the biophysical properties of proteins having the immunoglobulin folding pattern is applied to such a protein and the modified protein obtained thereby is expressed in a host cell.
  • the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern prepared by a method of the invention as described above.
  • this is an antibody, in particular a complete immunoglobulin containing two light and two heavy chains.
  • the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one variable domain (eg V L or V H ), characterized in that it contains at least one helical element in this variable domain.
  • this helical element has the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16), or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
  • the variable domain has the ability to specifically bind to an antigen.
  • the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 2, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element of one naturally occurring in humans C H 2 domain.
  • a protein contains a C H 2 domain comprising a helical element having the sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or the Sequence contains SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
  • the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 1, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element of one naturally occurring in humans C H 1 domain.
  • a protein contains a C H 1 domain comprising a helical element having the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or the sequence SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
  • the present invention relates to a modified ⁇ 2-microglobulin having at least one helical element in an Ig domain, preferably a helical element having the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9) , TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16), or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
  • KPKDTLMISR SEQ ID NO: 8
  • KAEDTLHISR SEQ ID NO: 9
  • TKDEYERH SEQ ID NO: 10
  • TPEQWKSHRS SEQ ID NO: 16
  • SKADYEKHK SEQ ID NO: 11
  • the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern comprising at least one helical element in an Ig domain which has a higher helix formation probability than a helical element present in any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 (C L WT) or SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 (C H 2 WT).
  • a protein contains a helical element having the sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9).
  • the present invention relates to a protein as described above for medical use.
  • the present invention relates to a biotechnological method for modifying the biophysical properties of antibodies or proteins which have the immunoglobulin folding pattern, characterized in that an optimization of the natural, helical elements takes place.
  • the present invention relates to a biotechnological method for modifying the biophysical properties of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that a transplantation of the natural or optimized helical elements takes place, preferably in domains which have no or have less optimal helical elements.
  • the advantages of the present invention are a greater folding efficiency and stability, fewer defects and thus ultimately higher product yield with higher quality proteins, greater flexibility in the cleaning process, a slower rate of unfolding, especially under stress conditions, an improvement in solubility and a lower tendency to Aggregate formation of the proteins according to the invention. Due to the higher robustness for the manufacturing process, this new method is clearly superior to the prior art.
  • the present invention is therefore preferably applicable to processes for the production of recombinant antibodies and Fc fusion proteins.
  • the present invention can also be applied to other molecules of the immunoglobulin superfamily including their fragments and derivatives or fusion proteins containing domains with homology to immunoglobulin domains.
  • FIGURE 1 ANTIBODIES OF IGG SUBKLASSE
  • FIGURE 2 BETA2-MICROGLOBULIN AS A REPRESENTATIVE OF THE IG SUPERFAMILY
  • ⁇ -sheet strands B, C, E and F of the human beta2-microglobulin (SEQ ID NO: 3) are labeled.
  • FIGURE 3 IMMUNOGLOBULIN G TOPOLOGY
  • Short helical elements in the Ig topology in the context of an IgG molecule that connect the ⁇ -sheets are labeled dark.
  • FIGURE 4 LOCALIZATION OF HELICAL ELEMENTS IN THE IGG1 C L DOMAIN
  • the localization of the helical elements in a constant antibody domain using the example of a human IgGI d domain is shown.
  • the ⁇ -sheet strands A, B, C, D, E, F and G and the helical elements HeNx 1 and HeNx 2 are designated.
  • FIGURE 5 CHARACTERIZATION OF THE CL FIBER INTERMEDIATE DIATH BY NMR SPECTROSCOPY
  • the structural elements of the murine kappa d domain (SEQ ID NO: 1) are shown schematically above the peak amplitudes.
  • FIGURE 6 STRUCTURING OF THE IGG C L DOMAIN
  • FIGURE 7 CD SPECTROSCOPIC INVESTIGATION
  • C L with the beta2-microglobulin helices (C L to ⁇ 2m; SEQ ID NO: 2) shows the spectrum of an unfolded protein, all other proteins are signature of a
  • FIGURE 8 INFLUENCE OF HELICAL ELEMENTS ON BETA2 MICROGLOBULIN AMYLOID FORMATION
  • FIGURE 9 C H 2 DOMAIN OF IGG1 MOLECULAR Localization of the optimized HeNx 1 within the C H 2 domain (A) of a human IgGI molecule (C H 2 HeNx 1 mutant, SEQ ID NO: 6) and optimization of the HeNx 1 by introducing additional salt bridges and removing the helix breaker proline (B) (mutation: KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) to KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9)).
  • FIGURE 10 STRUCTURAL COMPARISON OF THE WILD TYPE C H 2 DOMAIN WITH THE HELIX1-OPTIMIZED MUTANT
  • FUV-CD spectra (A) and NUV-CD spectra (B), hence secondary and tertiary structure, are for the IgGI CH2 wild-type domain (dashed line) (C H 2 WT, SEQ ID NO: 5) and the HeNxI mutant (solid line) (C H 2 HeNxI mutant; SEQ ID NO: 6) are almost identical.
  • FIGURE 11 THERMAL STABILITY STUDY
  • the thermal stability of the wild-type C H 2 domain (dashed line) (C H 2 WT; SEQ ID NO: 5) and the Helixi mutant (solid line) (C H 2 helixi mutant; SEQ ID NO: 6 ) is measured by means of FUV-CD spectroscopy at 218 nm.
  • the heating rate is 20 ° C / h.
  • the melting point of the wild type is determined to 56.0 0 C, that of the mutant to 60.4 0 C.
  • the present invention relates to methods for improving the biophysical properties, in particular the increase in stability, the folding efficiency and the reduction of the aggregation of proteins of the immunoglobulin superfamily, and the thus-modified proteins themselves.
  • the immunoglobulin superfamily currently includes more than 760 different proteins. The most economically important group in this group are the immunoglobulins (antibodies).
  • immunoglobulins There are several classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY, IgW.
  • Other members are antigenic receptors on cell surfaces (e.g., T cells).
  • Ig domains proteins involved in antigen presentation
  • proteins involved in antigen presentation e.g., MHC molecules
  • proteins involved in antigen presentation e.g., MHC molecules
  • proteins of the immunoglobulin superfamily are characterized by common structural elements, the so-called immunoglobulin domains (Ig domains).
  • Ig domains immunoglobulin domains
  • IgG antibodies are composed of four subunits, two identical heavy and two identical light chains linked by covalent disulfide bonds to form a ysilon-shaped structure. Each light chain contains two Ig domains, a so-called variable (V L ) and a constant (C L ) Ig domain, each heavy chain containing four such Ig domains (V H , C H 1, C H 2, and C H 3).
  • V L variable
  • C L constant
  • Antibodies of classes IgM and IgE contain an additional constant domain (C H 4).
  • Ig domains have a characteristic secondary structure, the immunoglobulin folding pattern (English: "Ig-fold"), a sandwich-like structure with a hydrophobic core formed by two sheets of antiparallel ⁇ -sheet strands (see Figure 4).
  • the three-dimensional representation is reminiscent of a folded leaf: the peptide groups lie in the surfaces and the intervening C atoms in the edges of a multiply folded leaf.
  • the peptide bonds of several chains interact.
  • the hydrogen bonds necessary for stabilization form along the polypeptide backbone, which occur in pairs of two at a distance of about 7.0 A.
  • the distance between adjacent amino acids is much larger compared to the much more compact ⁇ -helix: the distance is 0.35 nm compared to 0.15 nm for the HeNx. Since the side groups are still close to each other, larger leaflet areas are usually formed only if the side group residues are relatively small and not all are loaded the same.
  • circular dichroism spectroscopy, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, and Ramachandran plot frequency random estimation (Ramachandran, GN et al., J. Mol Biol. 7, 95-99, 1963).
  • the individual ⁇ -strands are designated according to the order of their appearance in the sequence with A, B, C, D, E, F, G or C, C ", etc.
  • interactions of hydrophobic amino acids on the Inside the sandwich hydrogen bonds between the strands and, if present, a highly conserved disulfide bond between cysteine residues of the B and F bonds.
  • Strands at. The number of amino acids between the two cysteines can vary and is usually between 55 and 75 amino acids.
  • Variable domains of immunoglobulins typically contain 9, constant domains 7 ⁇ strands.
  • the sequence regions between the ⁇ -strands are formed by unstructured loops with large sequence variability or, in particular in the constant domains of immunoglobulins, by short helical elements
  • An HeNx is a right-handed or left-handed spiral secondary structure in one Protein in which every NH group in the main chain forms a hydrogen bond to a carbonyl group in the main chain
  • the distance across which the hydrogen bond spans is four amino acids (i + 4 ⁇ i hydrogen bonding)
  • ⁇ helix corresponds to a turn of 3.6 amino acid residues at a height of 1.5A (0.15 nm), so each amino acid is offset by 100 ° .Other helix forms are the 3io-helix (i + 3 ⁇ i hydrogen bond) and the ⁇ - Helix (i + 5 ⁇ i hydrogen bonding)
  • the side chains of the amino acids are located outside the HeNx, a typical HeNx in one Protein comprises about 10 amino acids (3 turns), but helical elements of
  • Helical secondary structures in proteins can be experimentally determined by methods known per se, for example by X-ray structure analysis or nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR spectroscopy). However, the probability of formation of a HeNx can also be determined using suitable algorithms based on the amino acid sequence (Mu ⁇ oz, V. & Serrano, L. (1997).) Development of the Multiple Sequence Approximation within the Agadir Model of ⁇ -Helix Formation. Bragg and Lifson-Roig Formalisms, Biopolymers 41, 495-509, Lacroix, E., Viguera AR & Serrano, L.
  • the present invention is based on the recognition that helical structures are important for the biophysical properties of proteins having immunoglobulin folding patterns.
  • biophysical properties can be improved, in particular stability (eg thermal stability, pH stability), folding efficiency and increases solubility and decreases the rate of unfolding, as well as the tendency to misfolding, aggregate or amyloid formation.
  • preceding means closer to the N-terminus of the sequence, and “subsequent” closer to the C-terminus of the sequence.
  • the present invention is a biotechnological process for the production of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that an optimization of the natural, helical elements takes place. Preferably, this optimization is carried out by introducing additional helix-internal salt bridges and / or the removal of Helixbrechern (proline and / or glycine).
  • a protein which has the immunoglobulin folding pattern is understood as meaning a protein which has at least one Ig domain of the structure described above. In particular, these are members of the immunoglobulin superfamily, and preferably immunoglobulins.
  • the invention also relates to artificial proteins which do not occur in nature but have an Ig domain, eg Fc fusion proteins such as the rheumatic active substance etanercept (TNFR: Fc).
  • Fc fusion proteins such as the rheumatic active substance etanercept (TNFR: Fc).
  • antibodies are understood not only to be immunoglobulins, as they are also found in nature and obtainable for example by immunizing mammals with an antigen, but also artificial proteins, if they have at least one Ig domain has a paratope and, either alone or together with another Ig domain, specifically binds to an antigen.
  • Ig domains are, for example, the variable domains of an immunoglobulin (V H , V L ).
  • immunoglobulins which classically consist of two light chains and two heavy chains, are those of the class IgG with heavy chains of the subtypes IgGI, IgG2, and IgG4 are preferred.
  • immunoglobulins may be monoclonal or polyclonal, include primates (especially human), rodents or sequences from other mammals, as well as represent chimeras or humanized sequences. Preferred are human or humanized immunoglobulins.
  • the immunoglobulins may also have in their domains substitutions, deletions and / or insertions of amino acids which may alter the properties of the molecule. So z.
  • effector functions such as complement dependent cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), apoptosis induction, or FcRn-mediated homeostasis may be modulated.
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • FcRn-mediated homeostasis may be modulated.
  • removal of potential deamidation, oxidation and glycosylation sites or deletion of the C-terminal lysine on the heavy chain can reduce the heterogeneity of the molecule.
  • fragments of immunoglobulins such as Fab, F (ab ') 2 or Fc fragments, Fc fusion proteins, Fc-Fc fusion proteins, single-chain antibodies consisting of a fusion of the variable domains of a light and a heavy chain (scFv )
  • Single domain antibodies consisting only of the heavy or light chain variable domain such as V H V HH or V L dAbs, including the camelid-derived domain antibodies, furthermore minibodies, diabodies, triabodies , as well as fusion proteins of such constructs.
  • fragment antigen-binding Fab
  • fragment antigen-binding Fab
  • fragment antigen-binding Fab
  • They can be produced, for example, by treatment with a protease, for example papain, from conventional antibodies or else by DNA cloning.
  • Further antibody fragments are F (ab ') 2- Fragments that can be prepared by proteolytic digestion with pepsin.
  • the variable region of the heavy and light chain are often linked together by means of a short peptide fragment of about 10 to 30 amino acids, particularly preferably 15 amino acids. In this way, a single polypeptide chain is formed in which V H and V L are linked together by a peptide linker.
  • Such antibody fragments are also referred to as a single-chain Fv fragment (scFv). Examples of scFv antibodies are known and described.
  • diabody a person skilled in the art refers to a bivalent homodimeric scFv derivative.
  • the shortening of the peptide linker in the scFv molecule to 5 to 10 amino acids results in the formation of homodimers by superposing V H / V L - Chains.
  • the diabodies can additionally be stabilized by introduced disulfide bridges. Examples of diabodies can be found in the literature.
  • minibody refers to a bivalent, homodimeric scFv derivative consisting of a fusion protein which contains the C h 13 region of an immunoglobulin, preferably IgG, particularly preferably IgGI, as the dimerization region, which links the scFv fragments via a hinge region, also from IgG, and a linker region.
  • immunoglobulin preferably IgG, particularly preferably IgGI
  • fragments designated by the skilled person as mini-antibodies which have a bi-, tri- or tetravalent structure, are likewise derivatives of scFv fragments.
  • the multimerization is achieved via di-, tri- or tetrameric "coiled-coil" structures.
  • IgNAR new antigen receptor
  • Camelidae antibodies from llamas or other animals of the family Camelidae are known, which consist of only two truncated heavy chains, each with a variable and two constant domains (Hamers-Casterman, C. et al., Nature 363, 446-448, 1993).
  • the skilled person also knows derivatives and variants of such Camelidae antibodies, which consist only of one or more variable domains of these truncated heavy chains.
  • Such molecules are also referred to as domain antibodies.
  • Single domain antibodies are also based on sequences from others Species known, for example from mouse and human, or in humanized form (Holt et al., Trends in Biotechnology 21 (11), 484-490, 2003,).
  • Variants of these domain antibodies include molecules that consist of multiple variable domains and are covalently linked by peptide linkers. To extend serum half-life, domain antibodies may also be fused to other polypeptide units, such as. B. with the Fc portion of immunoglobulins or with a protein occurring in the blood serum such as albumin.
  • helical element and "helix” are used synonymously in the context of the present invention. It is an amino acid sequence of 4 to 12 amino acids, preferably 6 to 12, particularly preferably 8, 9, or 10 amino acids which can form a helix.
  • optically is understood to mean a change in the primary structure of a protein which increases the formation probability of a helical element in this protein or creates a helical element in this protein with the aim of improving the biophysical properties of this protein, in particular its folding efficiency, stability, solubility, and propensity for aggregate formation (which is reduced by optimization)
  • a preferred method of altering the primary structure of a protein is the mutation of its amino acid sequence, ie, the replacement (substitution), the removal (deletion This is usually achieved by a corresponding modification of the deoxyribonucleic acid (DNA) coding for this amino acid sequence and subsequent expression of this (recombinant) DNA in a host cell n standard methods are available for this.
  • the invention relates to a biotechnological process for the production of antibodies or proteins which inhibit immunoglobulin folding.
  • a transplantation of natural or optimized, helical elements takes place.
  • this transplantation occurs in domains that have no or less optimal helical elements.
  • transplantation is understood as meaning the exchange of an amino acid sequence of 4 to 12 amino acids by a different length of the other amino acid sequence.
  • a transfer of one or more helical ele- ments from at least one constant domain C L , C H 2 and / or C H 3 into at least one constant C H 1 domain and / or variable domain (V L or V H ).
  • the invention relates to methods for improving the biophysical properties of proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that at least one amino acid in the Ig domain is replaced by another amino acid which increases the formation probability of a HeNx ,
  • the training probability is preferably calculated with an algorithm, in particular with the algorithm AGADIR.
  • the exchanged amino acid is preferably located in the region between two ⁇ -sheet strands, in particular of the type A and B or E and F.
  • the exchanged amino acid may be present in a region which already has a helical structure. Goal of a
  • Amino acid exchange in an already existing helical element is then an increase in the helix formation probability of this element.
  • the formation of helix can be increased, for example, by virtue of the fact that the amino acid to be exchanged in the Ig domain is proline or glycine, preferably if it is at least at the second position (i ⁇ i + 2) after the preceding ⁇ -
  • the exchanged amino acids are separated from each other by 2 (i ⁇ i + 3), 3 (i ⁇ i + 4) or more amino acids.
  • amino acids with negatively charged side chains under physiological conditions glutamic acid or aspartic acid can be used, while arginine, lysine, or histidine have positively charged side chains under such conditions.
  • the position at which arginine, lysine, or histidine is introduced, or optionally already present, is closer to the C-terminus than the position at which glutamic acid or aspartic acid is introduced or may already be present.
  • a double salt bridge in which a sequence is generated in which 3 amino acids are located at positions i and i + 3, i + 4 or i + 5 and i + 7, i + 8 or i + 9 in which the amino acids at the positions i and i + 7, i + 8 or i + 9 have side chains with the same charge, the amino acid at the position i + 3, i + 4 or i + 5 has a counterpart thereto.
  • 3 corresponding amino acids can be introduced by mutation, if appropriate also less, if corresponding amino acids are already present in the starting sequence.
  • a preferred embodiment is characterized in that the protein after replacement of a helical element with the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) from the human IgG C H 2 domain (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15) or the helix sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9) optimized therefrom, the sequence TKDEYERH (SEQ ID NO: 10) from the murine kappa C L domain (SEQ ID NO: 1), the sequence TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) from the human lambda C L domain (SEQ ID NO: 13) or the sequence SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11) from the human kappa C L domain (SEQ ID NO: 12).
  • the present invention relates to the transplantation of suitable helical elements into domains having no or less optimal helical elements, such as the Ig domain of the beta2 microglobulin (SEQ ID NO: 3), the variable domains (V L , V H ) or the constant domain C H 1 of immunoglobulins.
  • suitable helical elements such as the Ig domain of the beta2 microglobulin (SEQ ID NO: 3), the variable domains (V L , V H ) or the constant domain C H 1 of immunoglobulins.
  • the transplanted elements may originate, for example, from the constant immunoglobulin domains C L , C H 2 or C H 3 or be variants of such elements optimized according to the method of the invention.
  • the transplantation is preferably carried out by a method in which 4 to 12 consecutive amino acids (preferably about 10 amino acids) are replaced by an amino acid sequence of equal length or greater length, wherein the introduced amino acid sequence has a higher formation probability of HeNx than the exchanged sequence.
  • the introduced sequence is a helical element from the region between the ⁇ -sheet strands A and B and / or E and F of a C L or CH domain of an immunoglobulin.
  • Suitable helical elements have, for example, the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) from the human IgG C H 2 domain (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15) or the optimized helix sequence KAEDTLHISR (FIG.
  • SEQ ID NO: 9 the sequence TKDEYERH (SEQ ID NO: 10) from the murine kappa C L domain (SEQ ID NO: 1), the sequence TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) from the human lambda C L - Domain (SEQ ID NO: 13) or the sequence SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11) from the human kappa C L domain (SEQ ID NO: 12).
  • the present invention relates to a method for producing a protein having an immunoglobulin folding pattern, characterized in that a method for improving the biophysical properties of proteins having the immunoglobulin folding pattern as described above is applied to such a protein. and the modified protein thus obtained is expressed in a host cell.
  • Process for the production of proteins by expression of recombinant DNA in host cells and subsequent purification of the desired expressed protein (protein of interest) are well known to those skilled in the art.
  • eukaryotic host cells preferably mammalian cells, particularly preferably Chinese hamster ovary (Cricetulus griseus, CHO) cell lines or mouse myeloma cell lines (eg, NSO cells).
  • eukaryotic host cells preferably mammalian cells, particularly preferably Chinese hamster ovary (Cricetulus griseus, CHO) cell lines or mouse myeloma cell lines (eg, NSO cells).
  • Certain antibody formats such as, for example, domain antibodies can also be advantageously produced in prokaryotic host cells (eg E. coli) or yeast cells.
  • the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern prepared by a method of the invention as described above.
  • this is an antibody, in particular a complete immunoglobulin containing two light and two heavy chains.
  • the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one variable domain (V L or V H ), characterized in that it contains a helical element in this variable domain.
  • V L or V H variable domain
  • Naturally occurring variable domains do not contain such helical elements and can be improved in their biophysical properties by introducing such elements.
  • such a variable domain contains a helical element having a greater helix formation probability than any amino acid sequence of equal length naturally occurring in a variable domain of an immunoglobulin.
  • the variable domains which are set down in the database NCBI GenBank under the accession numbers AAK19936 (IgGI VH) and AAK62672 (IgGI VL).
  • variable domain according to the invention contains a helical element having the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
  • the helical element is located between the folder strands E and F.
  • the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 2, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element of one naturally occurring in humans CH2 domain.
  • a domain can here SEQ ID NO: 5 serve.
  • such a protein contains a CH2 domain comprising a helical element having the sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), the sequence TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
  • the helical element is preferably located between the pleated sheet strands A and B and / or E and F of the CH2 domain.
  • the present invention relates to a protein which has an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 1, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element or a helical element
  • a protein which has an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 1, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element or a helical element
  • such a protein contains a C H 1 domain comprising a helical element having the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or the sequence SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
  • the helical element is preferably located between the pleated sheet strands A and B and / or E and F of the CH1 domain.
  • the present invention relates to a modified ⁇ 2-microglobulin having at least one helical element in an Ig domain, preferably a helical element having the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16), or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
  • the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern comprising at least one helical element in an Ig domain which has a higher helix formation probability than a helical element present in any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 (C L WT) or SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 (C H 2 WT).
  • a protein contains a helical element having the sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9).
  • the present invention relates to a protein which has an immunoglobulin folding pattern and which contains the sequence SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 and / or SEQ ID NO: 9.
  • the present invention relates to a protein as described above for medical use in therapy or diagnostics.
  • the medical use of antibodies and other proteins having Ig folding patterns is known to those skilled in the art and a number of such substances are approved as drugs (e.g., rituximab, trastuzumab, etanercept).
  • drugs e.g., rituximab, trastuzumab, etanercept.
  • the person skilled in the art knows methods of preparing dosage forms of such substances (for example physiologically buffered, aqueous solutions) and of administering such medicaments with a corresponding indication (for example by intravenous injection or infusion).
  • the present invention relates to a biotechnological method for modifying the biophysical properties of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that an optimization of the natural, helical elements takes place.
  • the present invention relates to a biotechnological method for modifying the biophysical properties of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that a transplantation of the natural or optimized helical elements takes place, preferably in domains that have no or less optimal helical elements.
  • the proteins of the present invention are preferably produced by recombinant expression in a host cell.
  • an expression vector is used, which is introduced into the host cell.
  • the expression vector contains the "gene of interest" which comprises a nucleotide sequence of any length encoding a product of interest
  • the gene product or “product of interest” is typically a protein, polypeptide, peptide or fragment or derivative thereof , It can also be RNA or antisense RNA.
  • the gene of interest may be in full length, in truncated form, as a fusion gene or a labeled gene. It may be genomic DNA or preferably cDNA or corresponding fragments or fusions.
  • the gene of interest may be the native gene sequence, mutated or otherwise modified. Such modifications include codon optimizations for adaptation to a particular host cell and humanization.
  • the gene of interest may e.g. encode a secreted, cytoplasmic, nuclear localized, membrane bound or cell surface bound polypeptide.
  • nucleic acid refers to an oligonucleotide, nucleotides, polynucleotides and fragments thereof, and DNA or RNA of genomic or synthetic origin which are present as a single or double strand and the coding or the non-coding Strand of a gene can represent.
  • nucleic acid sequence standard techniques, such as site-specific mutagenesis, PCR-mediated mutagenesis or de novo synthesis of oligonucleotide sequences can be used.
  • Biopharmaceutically significant proteins / polypeptides in the context of the present invention include e.g. Antibodies or immunoglobulins and other proteins having immunoglobulin folding patterns, e.g. Members of the immunoglobulin superfamily, as well as their derivatives or fragments. In general, these are substances that act as agonists or antagonists and / or can find therapeutic or diagnostic use.
  • polypeptides or "proteins” is used for amino acid sequences or proteins and refers to polymers of amino acids of any length. This term also includes proteins that are post-translationally modified by reactions such as glycosylation, phosphorylation, acetylation, or protein processing.
  • the structure of the polypeptide may be e.g. by substitutions, deletions or insertion of amino acids, fusion with other proteins, such as the Fc portion of immunoglobulins, while retaining its biological activity.
  • the polypeptides can multimerize and form homo- and heteromers.
  • expression vectors can in principle be carried out by conventional methods familiar to the person skilled in the art. There is also a description of the functional components of a vector, eg suitable promoters, enhancers, termination and polyadenylation signals, antibiotic resistance genes, selection markers, origins of replication and splice signals.
  • Conventional cloning vectors can be used for the production, for example plasmids, bacteriophages, phagemids, cosmids or viral vectors such as baculovirus, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses and herpes simplex virus, but also artificial or artificial or mini-chromosomes.
  • the eukary Ontic expression vectors also typically contain prokaryotic sequences, such as origin of replication, and antibiotic resistance genes, which allow multiplication and selection of the vector in bacteria.
  • prokaryotic sequences such as origin of replication, and antibiotic resistance genes, which allow multiplication and selection of the vector in bacteria.
  • a variety of eukaryotic and prokaryotic expression vectors containing multiple cloning sites for introducing a polynucleotide sequence are known and some are commercially available from various companies such as Stratagene, La JoIIa, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, WI, USA or BD Biosciences Clontech, Paolo Alto, CA, USA.
  • Eukaryotic or prokaryotic host cells are transfected or transformed with suitable expression vectors.
  • yeast cells and mammalian cells are preferably used as eukaryotic host cells.
  • rodent cells such as e.g. Mouse, rat and Hamster cell lines.
  • Preferred prokaryotic host cells are bacteria, more particularly Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas (P. aeruginosa, P.
  • Preferred eukaryotic host cells within the scope of the invention are hamster cells such as BHK21, BHK TK “ , CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 and CHO-DG44 cells or derivatives / derivatives of these cell lines.
  • DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 and BHK21 cells in particular CHO-DG44 and CHO-DUKX cells
  • mouse myeloma cells preferably NSO and Sp2 / 0 cells and derivatives / derivatives of these cell lines, but also derivatives and derivatives thereof
  • Cells other mammalian cells, including but not limited to human, mouse, rat Monkeys, rodents, or eukaryotic cells, including, but not limited to, yeast, insect, avian, and plant cells, may also be used as host cells for the production of biopharmaceutical proteins.
  • Transfection of the eukaryotic host cells with a polynucleotide or one of the expression vectors according to the invention is carried out by customary methods. Suitable transfection methods are e.g. liposome-mediated transfection, calcium phosphate co-precipitation, electroporation, polycation (e.g., DEAE-dextran) -mediated transfection, protoplast fusion, microinjection, and viral infections.
  • Suitable transfection methods are e.g. liposome-mediated transfection, calcium phosphate co-precipitation, electroporation, polycation (e.g., DEAE-dextran) -mediated transfection, protoplast fusion, microinjection, and viral infections.
  • prokaryotic host cells with a polynucleotide or one of the expression vectors according to the invention is carried out by customary methods. Suitable methods are for.
  • electroporation chemical treatment of cells with, for example, calcium chloride, magnesium chloride, manganese chloride, polyetyhlenglykol or dimethyl sulfoxide, bacteriophage transduction
  • a stable transfection is performed wherein the constructs are integrated into either the genome of the host cell or an artificial chromosome / minichromosome or are stably episomally contained in the host cell.
  • the transfection method which enables the optimal transfection frequency and expression of the heterologous gene in the respective host cell, is preferred.
  • the eukaryotic host cells are preferably established under serum-free conditions, adapted and cultured, optionally in media that are free of animal proteins / peptides.
  • media examples include Harn 's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma). , Iscove 's Modified Dulbecco 's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), serum-free CHO medium (Sigma).
  • yeast media may optionally be supplemented with various compounds, eg, hormones and / or other growth factors (eg insulin, transferrin, epidermal growth factor, insulin-like growth factor), salts (eg sodium chloride, calcium, magnesium, phosphate), buffers (eg HEPES), nucleosides (eg adenosine, thymidine), glutamine, glucose or others Equivalent nutrients, antibiotics and / or trace elements
  • hormones and / or other growth factors eg insulin, transferrin, epidermal growth factor, insulin-like growth factor
  • salts eg sodium chloride, calcium, magnesium, phosphate
  • buffers eg HEPES
  • nucleosides eg adenosine, thymidine
  • glutamine glucose or others
  • glucose or others Equivalent nutrients, antibiotics and / or trace elements
  • serum-free media are preferred according to the invention, media which have been supplemented with an appropriate amount of serum may also be used to culture the host cells.
  • prokaryotic host cells For the cultivation of prokaryotic host cells numerous media are known, which are also commercially available. Examples include LB, TB, M9, SOC, YT and NZ media (Sigma).
  • one or more suitable selection agents are added to the medium or suitable "drop-out" media are used which lack essential additives such as amino acids or nucleotides for growth.
  • the term "gene expression” or “expression” refers to the transcription and / or translation of a heterologous gene sequence in a host cell.
  • the expression rate can be generally determined either on the basis of the amount of the corresponding mRNA present in the host cell or on the basis of the amount of gene product produced which is encoded by the gene of interest.
  • the amount of mRNA generated by transcription of a selected nucleotide sequence can be determined, for example, by Northern blot hybridization, ribonuclease RNA protection, in situ hybridization of cellular RNA or by PCR.
  • Proteins released from a nucleotide sequence can also be by various methods, such as by ELISA, protein A HPLC, Western blot, radioimmunoassay, immunoprecipitation, detection of the biological activity of the protein, immunostaining of the protein with subsequent FACS analysis or fluorescence microscopy, direct Detection of a fluorescent protein can be determined by FACS analysis or by fluorescence microscopy.
  • the proteins of the invention are prepared in a process in which production cells are propagated and used to produce the coding gene product of interest.
  • the selected high producing cells are preferably cultured in a serum-free culture medium and preferably in suspension culture under conditions which allow expression of the gene of interest.
  • the protein / product of interest is preferably obtained as a secreted gene product from the cell culture medium.
  • the gene product can also be isolated from cell lysates. In order to obtain a pure, homogeneous product which is substantially free of other recombinant proteins and host cell proteins, usual purification steps are carried out. To do this, one often first removes cells and cell debris from the culture medium or lysate.
  • the desired gene product may then be released from contaminating soluble proteins, polypeptides and nucleic acids, e.g. by fractionation on immunoaffinity and ion exchange columns, ethanol precipitation, reverse phase HPLC or chromatography on Sephadex, silica or cation exchange resins such as DEAE.
  • Methods which lead to the purification of a heterologous protein expressed by recombinant host cells are known to the person skilled in the art and are described in the literature.
  • AFM atomic force microscopy ß 2 m: beta2-microglobulin bp: base pair
  • Chain CHO Chinese Hamster Ovary C L : constant domain of a light Ig chain
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • E. coli Escherichia coli
  • EDTA ethylenediamine-N, N, N ', N' tetraacetic acid
  • ELISA enzyme-linked immunosorbant assay
  • FUV far ultraviolet
  • GdmCl guanidine hydrochloride
  • GSH glutathione
  • GSSG glutathione disulfide
  • HSQC heteronuclear single quantum coherence
  • HC heavy chain
  • HT hypoxanthine / thymidine
  • IgG immunoglobulin G kb: kilobase LC: light chain mAb: monoclonal antibody MD: molecular dynamics MTX: methotrexate NMR: nuclear magnetic resonance NPT: neomycin phosphotransferase NUV: near-ultraviolet
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • the recombinant E. coli bacteria BL21 DE3 (Stratagene, CA, USA) are cultured overnight in selective LB medium at 37 ° C. and 300 rpm in shake flasks.
  • the recombinant bacteria are cultured in M9 minimal medium (Sigma) with 15 N ammonium chlorohd as sole nitrogen source or optionally additionally 13 C-glucose as sole carbon source.
  • the inclusion bodies are then isolated by centrifuging off the bacteria and resuspending in 100 mM Tris / HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, protease inhibitor, the cells are disrupted in a French press, with 2% v / v of Triton X-100 and stirred for 30 min at 4 ° C. Centrifugation (20,000 rpm, 30 min) isolates the inclusion bodies as pellets and then twice in 100 mM Tris / HCl, pH 7.5 , 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, protease inhibitor and in each case centrifuged off again (20,000 rpm, 30 min).
  • the inclusion body pellet is now in 100 mM Tris / HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 8 M
  • Components are then removed by centrifugation (48000g, 25 min, 20 0 C).
  • the supernatant is diluted fivefold in 50 mM sodium phosphate (pH 7.5), 4 M GdmCl and applied to a nickel chelate column (Ni-NTA, Qiagen). After washing with five column volumes, elution is carried out with 50 mM sodium phosphate (pH 4), 4 M GdmCl.
  • the refolding by dialysis is carried out in 250 mM Tris / HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 1 mM oxidized glutathione at 4 ° C overnight. Aggregates are removed by centrifugation (48000g, 25 min, 4 ° C).
  • thrombin Novagen
  • 20 mM sodium phosphate pH 7.5
  • 100 mM NaCl 100 mM EDTA.
  • CD spectroscopy CD measurements are performed in a Jasco J-715 spectropolarimeter. Measurements are carried out at 20 ° C. in PBS.
  • Remote UV CD spectra are measured from 195-250 nm at a protein concentration of 50 ⁇ M in a 0.2 mm quartz cuvette, near-UV CD spectra are measured from 250-320 nm at a protein concentration of 50-100 ⁇ M in 5 mm Measure quartz cuvettes. Measurements are carried out at 20 ° C. in PBS. Spectra are accumulated 16 times each, averaged and buffer corrected. Temperature transitions are measured at 218 nm (C H 2 WT / mutant) or 205 nm (C L , ⁇ 2 m WT / mutants) in PBS at 10 ⁇ M protein concentration in a 1 mm quartz cuvette at a heating rate of 20 ° C / h. AFM measurements
  • a 100 ⁇ M protein solution in PBS 1: 1 is mixed with buffer A (25 mM sodium acetate, 25 mM sodium phosphate, pH 1, 5 or 2.5). The final pH value is thus at pH 1, 5 or pH 3.0.
  • the solution is incubated for 7 days with gentle swirling at 37 ° C., then 20 ⁇ l of the solution are applied to fresh mica surfaces, washed three times with sterile filtered water and then analyzed in the AFM.
  • the AFM contact mode with a scanning speed of 1.5 ⁇ m / min is used. Measurements are performed on a Digital Instruments Multimode Scanning Probe Microscope and DNP-S20 tips.
  • the sequence region for the wild-type CH2 domain and CL domain is determined by PCR from a human IgGI antibody gene or the kappa chain of the murine antibody MAK33 (Augustine, JG et al., J. Biol. Chem. 276 (5 ), 3287-3294, 2001). Introduction of the P35A mutation into the d domain is via PCR mutagenesis using mutagenic primers.
  • the sequence regions for the CH2 domain of the helix-optimized CH2 mutant, ß 2 m WT and the ß 2 m mutant are de novo synthesized with the transplanted d helix (www.geneart.com).
  • helix mutations are introduced into the wild-type CH2 domain of an IgGI antibody gene via PCR mutagenesis using mutagenic primers.
  • the cells CHO-DG44 / dhfr ⁇ / ⁇ are stored permanently as suspension cells in serum-free CHO-S-SFMII medium supplemented with hypoxanthine and thymidine (HT) (Invitrogen GmbH, Düsseldorf, DE) in cell culture flasks at 37 ° C. in a humid atmosphere and 5 % CO2 cultivated.
  • HT hypoxanthine and thymidine
  • the cell numbers and the viability are determined with a Cedex (Innovatis) and the cells are then seeded in a concentration of 1 - 3 x10 5 / ml_ and passaged every 2 - 3 days.
  • CHO-DG44 Lipofectamine Plus reagent (Invitrogen) is used. A total of 1, 0-1 .mu.g of plasmid DNA, 4 .mu.l of lipofectamine and 6 .mu.l plus reagent are mixed per transfection batch according to the manufacturer's instructions and mixed in a volume of 200 .mu.l to 6 ⁇ 10 5 cells in 0.8 ml_ HT. supplemented CHO-S-SFMII medium. After incubation for 3 hours at 37 ° C. in a cell incubator, 2 ml of HT-supplemented CHO-S-SFMII medium are added.
  • the transfection batches are either harvested (transient transfection) or subjected to selection. Since one expression vector contains one DHFR and the other an NPT selection marker, the cotransfected cells are transfected for DHFR- and NPT-based selection 2 days after transfection into CHO-S-SFMII medium without added hypoxanthine and thymidine G418 (Invitrogen) was also added to the medium in a concentration of 400 ⁇ g / ml.
  • a DHFR-based gene amplification of the integrated heterologous genes is achieved by adding the selection agent MTX (Sigma) in a concentration of 5-2000 nM to an HT-free CHO-S-SFMII medium.
  • eukaryotic expression vectors are used which are based on the pAD-CMV vector (Werner, RG et al., Arzneistoff-Forschung / Drug Research 48, 870-880, 1998) and the expression of a terologist gene via the combination CMV enhancer / CMV promoter mediate.
  • the first vector pBI-26 contains the dhfr minigene, which serves as an amplifiable selection marker.
  • the dhfr minigene is replaced by an NPT gene.
  • the NPT selection marker including SV40 early promoter and TK polyadenylation signal, was isolated from the commercial plasmid pBK-CMV (Stratagene, La JoIIa, CA) as a 1640 bp Bsu36I fragment. After a replenishment reaction of the fragment ends by Klenow DNA polymerase, the fragment was ligated with the 3750 bp Bsu36l / Stul fragment of the first vector, which was also treated with Klenow DNA polymerase. Subsequently, the NPT gene was modified. It is the NPT variant F240I (Phe240lle), whose cloning is described in WO2004 / 050884.
  • the quantification of the expressed antibodies in the supernatants of stably transfected CHO-DG44 cells is carried out by ELISA according to standard protocols, on the one hand a goat anti human IgG Fc fragment (Dianova, Hamburg, DE) and on the other hand an AP-conjugated goat anti human kappa light chain antibody (Sigma) is used. As a standard purified antibody of the same isotype as the expressed antibodies.
  • the SEAP titer in culture supernatants of transiently transfected CHO-DG44 cells is quantified using the SEAP Reporter Gene Assay according to the protocol specifications of the manufacturer (Roche Diagnostics GmbH). ThermoFluor ⁇ method
  • a qPCR system (Mx3005P TM, Stratagene) is used, based on the ThermoFluor® method.
  • a solvatochromic / ambient fluorescence dye is used as an indicator of small changes in the thermal stability of proteins.
  • This fluorescent dye which has a low quantum yield in aqueous solution, interacts with hydrophobic, non-native structures of the protein which expands due to temperature increase. The interaction of the dye with already unfolded protein domains results in a significant increase in the fluorescence detected (Cummings, M.D. et al., Journal of Biomolecular Screening 854-863, 2006).
  • the measurement of the protein samples in a temperature range from 25 ° C to 95 ° C at intervals of 1 ° C per minute is carried out in a volume of 20 ⁇ l, using 2 ⁇ M protein and 4x SyproOrange (prepared from a 500Ox SyproOrange stock solution; Invitrogen) in be used in each case to be tested buffer.
  • the first step is to identify the helical elements or the corresponding loops, if no helices are present, in the immunoglobulin domain used as the target of the optimization. For example, in the case of constant antibody domains, the helices are always between the
  • proline and / or glycine residues are replaced by another amino acid, preferably alanine (if not in conflict with the one to be prioritized)
  • Point 2 occurs).
  • the replacement is only done if it is the residue to be replaced is not the first residue after the previous ⁇ -sheet strand or the last remaining before the subsequent ⁇ -sheet strand.
  • Amino acids by amino acids with charged side chains of unlike charge Any combination of arginine, lysine, histidine, aspartate or glutamate can be used.
  • the residues to be replaced must be separated by two, three or four amino acids, so that the introduced charged residues can be separated, for example. B. the numbering i and i + 3, i and i + 4 or i and i + 5 will have. All permutations of said residues are possible.
  • an introduction of arginine, lysine or histidine is closer to the C-terminus than an introduction of aspartate or glutamate.
  • double salt bridges are, if in accordance with the
  • EXAMPLE 2 INVESTIGATION OF THE PROTEIN FINDING OF THE C L DOMAIN
  • C1_P35A The proteins C L WT (SEQ ID NO: 1) and C L -P135A (SEQ ID NO: 7) are produced recombinantly in E. coli.
  • the first four N-terminal amino acids at C L WT result in each case from the selected cloning strategy in the expression vector pET28a and are naturally not present in the CL domain.
  • the folding of the CL domain after unfolding in the denaturant GdmCI, can be monitored in real time at low temperatures ( Figure 5 and 6). It turns out that the two short helical ele- ments between strand A and B as well as between strand E and F are already completely patterned in the main folding intermediate ( Figure 5 and 6). Thus, they can be postulated to play an important role in the folding process of these and other antibody domains.
  • the rate-determining step in the folding of the C L domain, before which the folding intermediate is promoted is the isomerization of the proline residue 35 from trans to ice. Therefore, this residue is exchanged for alanine, which should always be in trans. This allows the folding intermediate to be stabilized in equilibrium.
  • the proteins C L to ⁇ 2 m and ⁇ 2 m to C L and, as a control, the wild-type sequences ⁇ 2 m (SEQ ID NO: 3) and C L (SEQ ID NO: 1) are produced recombinantly in E. coli.
  • the first four N-terminal amino acids at C L WT and the first N-terminal amino acid at C L to ⁇ 2 m result in each case from the selected cloning strategy in the expression vector pET28a and are naturally not present in the CL domain.
  • EXAMPLE 4 OPTIMIZATION OF THE HUMAN IGG1 C H 2 DOMAIN
  • the CH2 domain is the weakest link in terms of stability.
  • the Fc fragment may serve as a general platform of IgG.
  • Antibodies are considered, so that an optimization of the biophysical properties of the C H 2 domain on the one hand should increase the overall stability of the Fc fragment, on the other hand is a universally applicable optimization.
  • the first HeNx of a human IgG1 CH2 domain ( Figure 9A) is chosen for optimization. Within these, additional salt bridges are introduced by targeted mutagenesis ( Figure 9B). Both C H 2 domains, wild-type (C H 2 WT; SEQ ID NO: 5) and Helixi mutant (C H 2 helixi mutant; SEQ ID NO: 6), are expressed in E. coli. The first N-terminal amino acid in the C H 2 Helixi mutant results from the chosen cloning strategy in the expression vector pET28a and does not occur naturally in the CH2 domain.
  • IgGI-WT b) pBI-26 / IgG1-HChelix1 and pBI-49 / IgG1-LC, which is responsible for an IgG1 monoclonal antibody in which the first HeNx in the human C H 2 domain is replaced by the sequence region KPKDTLMISR (FIG. SEQ ID NO: 8) is optimized against KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9)
  • CHO-DG44 cells For stable transfection of CHO-DG44 cells, co-transfection is performed with the same plasmid combinations as described above. The selection of stably transfected cells is carried out two days after transfection in HT-free medium with the addition of 400 ⁇ g / mL G418. After selection, DHFR-based gene amplification is induced by addition of 100 nM MTX. For material production, the cells are cultured in a 10-day fed-batch process in shake flasks. The purification is identical for the WT or Helixi mutant of the antibody.
  • Protein A affinity chromatography (MabSe) lect rProteinA, GE Healthcare) according to the instructions of the manufacturer, using phosphate buffer (20 mM sodium phosphate, 140 mM sodium chloride, pH 7.5, conductivity 16.5 mS / cm) for equilibration and 50 mM acetate pH 3 for elution, 3 is used.
  • the eluate is adjusted to a pH of 5.5 by addition of 1 M Tris pH 8.
  • the purification profiles for the two antibody variants are comparable.
  • the thermal stability of the antibodies is determined by the ThermoFluor® method.
  • the thermal stability of the Helixi mutant of the IgGI antibody to the IgG1 -WT antibody can be increased under both basic and acidic buffer conditions.
  • the C H 2- domain of the Helixi mutant exhibits a 8 ° C higher melting temperature compared to the CH2 domain of the IgGI-WT.
  • 100 mM acetate pH 3.4 it is even increased by 18 ° C. This significant increase in the thermal stability of immunoglobulins is of immense benefit to the biopharmaceutical production of therapeutic proteins.
  • the optimization of the natural, helical element of the CH2 domain is achieved by replacing the naturally occurring sequence region KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) (this sequence region also occurs, for example, in the C H 2 domains of human IgG2 (SEQ ID NO: 14). and IgG4 (SEQ ID NO: 15) against KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9) significantly improved the robustness of the biotechnologically engineered therapeutic proteins.
  • the increased temperature and pH stability is particularly advantageous in the process of virus inactivation to increase the product safety of therapeutic proteins since this step is performed at acid pH. Other advantages include greater flexibility in chromatography and protein formulation, less tendency for aggregation, and improved storage stability.

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Abstract

The invention relates to a method for optimizing the biophysical properties of molecules and derivatives of the Ig superfamily. The method is characterized in that as yet unrecognized helical structural elements with unknown structural, stability and folding roles have been identified as important determinants of correct and efficient structuring of antibody domains. The novel process for positively influencing the antibody properties and properties of other proteins that have the Ig folding pattern now consists of optimizing the properties of the short helical elements and in the transplantation of these elements between Ig domains.

Description

VERFAHREN ZUR OPTIMIERUNG VON PROTEINEN, DIE DAS IMMUNOGLOBULINFALTUNGSMUSTER AUFWEISEN PROCESS FOR OPTIMIZING PROTEINS HAVING THE IMMUNOGLOBULINE FOLDING PATTERN
HINTERGRUND DER ERFINDUNG TECHNISCHES GEBIETBACKGROUND OF THE INVENTION TECHNICAL FIELD
Die vorliegende Erfindung stellt ein Optimierungsverfahren der biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen der Immunglobulin (Ig)-Superfamilie dar. Sie eignet sich somit hervorragend für die Anwendung auf Antikörper. Jedoch ist sie nicht alleinig auf diese beschränkt, sondern prinzipiell auf alle Mitglieder der Immunglobu- lin-Superfamilie, aber auch auf deren Derivate, wie z. B. Fc-Fusionsproteine, übertragbar. Die Erfindung betrifft somit auch Verfahren zur Herstellung solcher Proteine sowie deren medizinische Verwendung.The present invention is an optimization method of the biophysical properties of proteins of the immunoglobulin (Ig) superfamily. It is thus eminently suitable for application to antibodies. However, it is not limited to these alone, but in principle to all members of the immunoglobulin superfamily, but also on their derivatives such. B. Fc fusion proteins, transferable. The invention thus also relates to methods for producing such proteins and their medical use.
HINTERGRUND Biomoleküle wie Proteine, Polynukleotide, Polysaccharide und dergleichen gewinnen als Medikamente, als Diagnostika, als Zusatzstoffe in Nahrungsmitteln, Waschmitteln und dergleichen, als Forschungsreagenzien und für viele weitere Anwendungen zunehmend an kommerzieller Bedeutung. Der Bedarf an solchen Biomolekülen lässt sich, z. B. im Falle von Proteinen, in aller Regel nicht mehr durch Isolierung der Moleküle aus natürlichen Quellen befriedigen sondern erfordert den Einsatz biotechnologischer Produktionsmethoden.BACKGROUND Biomolecules such as proteins, polynucleotides, polysaccharides and the like are gaining increasing commercial importance as drugs, as diagnostics, as additives in foods, detergents and the like, as research reagents and for many other applications. The need for such biomolecules can be, for. As in the case of proteins, usually no longer satisfy by isolating the molecules from natural sources but requires the use of biotechnological production methods.
Die biotechnologische Herstellung von Proteinen beginnt typischerweise mit der Isolierung der DNA, die für das gewünschte Protein kodiert, und deren Klonierung in einen geeigneten Expressionsvektor. Nach Transfektion des rekombinanten Expressionsvektors in geeignete prokaryontische oder eukaryontische Expressionszellen und anschließender Selektion transfizierter, rekombinanter Zellen werden letztere in Bioreaktoren kultiviert und das gewünschte Protein zur Expression gebracht. Anschließend erfolgt die Ernte der Zellen bzw. des Kulturüberstandes und die Aufarbeitung und Reinigung des darin enthaltenen Proteins. Antikörper, insbesondere die Subklasse Immunglobulin G (IgG), gehören zu den wichtigsten biopharmazeutisch hergestellte Proteinen. Sie finden ein breites Anwendungsspektrum von Grundlagenforschung über Diagnostik bis hin zu einer Vielzahl von Therapien, z. B. in der Tumorbekämpfung. Antikörper sind komplexe, glykosylierte Proteinmoleküle, im Falle von IgG aus zwei leichten und zwei schweren Ketten zusammengesetzt (siehe Abbildung 1 ). Die Antigenerkennung und Bindung erfolgt dabei über zwei identische Antigenbindungsstellen, so genannte Pa- ratope (siehe Abbildung 1 ). Die Zielstruktur des Antikörpers, das Antigen, wird dabei von diesem nicht nur hochspezifisch erkannt, sondern seine Bindung ist dar- über hinaus noch an eine Vielzahl von so genannten Effektorfunktionen gekoppelt, welche durch das Fc-Fragment vermittelt werden (siehe Abbildung 1 ). Zu den wichtigsten Effektorfunktionen zählen unter anderem die Aktivierung des Komplementsystems (complement-dependent cytotoxicity: CDC) und die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (antibody-dependent cell-mediated cytotoxici- ty: ADCC).The biotechnological production of proteins typically begins with the isolation of the DNA encoding the desired protein and its cloning into a suitable expression vector. After transfection of the recombinant expression vector into suitable prokaryotic or eukaryotic expression cells and subsequent selection of transfected, recombinant cells, the latter are cultured in bioreactors and the desired protein is expressed. Subsequently, the harvest of the cells or of the culture supernatant and the workup and purification of the protein contained therein takes place. Antibodies, in particular the subclass immunoglobulin G (IgG), are among the most important biopharmaceutically produced proteins. You will find a wide range of applications from basic research on diagnostics to a variety of therapies, eg. B. in the fight against tumors. Antibodies are complex, glycosylated protein molecules, in the case of IgG composed of two light and two heavy chains (see Figure 1). Antigen recognition and binding take place via two identical antigen-binding sites, so-called paratopes (see Figure 1). The target structure of the antibody, the antigen, is not only highly specifically recognized, but its binding is coupled to a multitude of so-called effector functions, which are mediated by the Fc fragment (see Figure 1). Key effector functions include complement-dependent cytotoxicity (CDC) and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).
Trotz der vielfältigen Anwendungsbereiche finden Antikörper noch nicht eine solch weite Verbreitung wie es wünschenswert wäre, vor allem aufgrund der sehr hohen Herstellungskosten. Es werden deshalb verschiedenste Strategien zur Verbesse- rung des Moleküls und der Herstellprozesse verfolgt. Angriffspunkte für die Verbesserung der biologischen Eigenschaften eines Antikörpers sind beispielsweise Modifikationen der Affinität und Antigenspezifität sowie die Modulierung der Fc- Effektorfunktionen. Andere Ansätze zielen auf die Reduktion der Molekülhetero- genität, die z.B. durch Vorläufer, hydrolytische Abbauprodukte, enzymatische Ab- Spaltung von C-terminalen Aminosäureresten von Proteinen, Desaminierungen, unterschiedliche Glykosylierungsmuster oder falsch verknüpfte Disulfidbrücken verursacht wird, oder die Verbesserung der physikochemischen Eigenschaften von Antikörpern, wie beispielsweise Stabilität und Löslichkeit, ab. Optimierungen der Eigenschaften von Antikörpern besitzen somit ein potentiell äußerst breites Anwendungsspektrum. Ein jedes Protein muss einen Strukturierungsprozess, als Proteinfaltung bezeichnet, durchlaufen, um seine in der definierten finalen Struktur inhärente Funktion ausüben zu können. In diesem mehrstufigen Strukturierungsprozess, der häufig über Faltungsintermediate führt, kann es zu Missfaltungen und Aggregationen kommen. Es gibt eine Vielzahl von Erkrankungen, die auf Proteinmissfaltungen zurückzuführen bzw. damit assoziiert sind, weil Proteine entweder ihren nativen Faltungszustand nicht erreichen bzw. nicht in diesem nativen Zustand verbleiben. Dazu gehören z. B. Alzheimer, Parkinson und diverse Amyloidosen. Treten solche Proteinmissfaltungen bei biotechnologischen Produktionsprozessen auf, so geht das zu Lasten von Produkttiter, -ausbeute, - qualität und/oder -Stabilität.Despite the wide variety of applications, antibodies are not yet as widespread as would be desirable, especially due to the very high production costs. Therefore, various strategies for improving the molecule and the production processes are pursued. Examples of targets for improving the biological properties of an antibody are modifications of the affinity and antigen specificity as well as the modulation of the Fc effector functions. Other approaches aim at the reduction of molecular heterogeneity caused by, for example, precursors, hydrolytic degradation products, enzymatic cleavage of C-terminal amino acid residues of proteins, deamination, different glycosylation patterns or mismatched disulfide bridges, or improvement of physicochemical properties of antibodies such as stability and solubility. Optimizations of the properties of antibodies thus have a potentially extremely broad spectrum of applications. Each protein must undergo a structuring process, called protein folding, in order to perform its inherent function in the defined final structure. This multistep structuring process, which often involves folding intermediates, can lead to misfolding and aggregation. There are a variety of diseases that are due to or associated with protein misfolding because proteins either fail to reach their native folding state or do not remain in that native state. These include z. Alzheimer's, Parkinson's and various amyloidoses. If such protein deficiencies occur in biotechnological production processes, this is at the expense of product titer, yield, quality and / or stability.
Eine Vielzahl von wissenschaftlichen Arbeiten hat sich bereits mit der Aufklärung des Strukturierungsprozesses von Antikörpern, als Antikörperfaltung bezeichnet, befasst (Goto, Y. and Hamaguchi, K., Journal of Molecular Biology 156, 891 - 910, 1982; Thies, M.J.W, et al., Journal of Molecular Biology 293, 67 - 79, 1999; Feige, MJ. et al., Journal of Molecular Biology 365, 1232 - 1244, 2007; Feige, MJ. et al., Journal of Molecular Biology 344, 107 - 118, 2004). Antikörper gehören zu der in der Natur sehr weit verbreiteten sogenannten Ig-Superfamilie. Neben den Faltungsstudien an Antikörpern und deren Fragmenten wurden auch andere Mitglie- der dieser Ig-Superfamilie in ihrem Faltungsprozess eingehend untersucht (Cota, E. et al., Journal of Molecular Biology 305, 1185 - 1194, 2001 ; Hamill, SJ. et al., Journal of Molecular Biology 297, 165 - 178, 2000; Paci, E. at al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 394 - 399, 2003). Als aktueller Stand der Forschung hat sich dabei folgendes Bild entwickelt: Die Strukturierung der Proteine der Ig-Superfamilie beginnt um einige hydrophobe Aminosäuren im Kern der Faltblattstruktur (v. a. Strang B, C, E und F) und findet dann seinen Abschluss in der kompletten Strukturierung ausgehend von diesem Faltungskern. In Abbildung 2 ist die typische Topologie eines Mitglieds der Ig- Superfamilie, beta2-Mikroglobulin, dargestellt. Markiert sind die Stränge B, C, E und F, welche wie angeführt als Kern des Faltungsprozesses für Ig-Proteine im Allgemeinen postuliert werden. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGA variety of scientific papers have already addressed the elucidation of the structuring process of antibodies, termed antibody folding (Goto, Y. and Hamaguchi, K., Journal of Molecular Biology 156, 891-910, 1982, Thies, MJW, et al , Journal of Molecular Biology 293, 67-79, 1999; Fig, MJ et al., Journal of Molecular Biology 365, 1232-1244, 2007; Fig, MJ., Et al., Journal of Molecular Biology 344, 107. 118, 2004). Antibodies belong to the so-called Ig superfamily, which is very widespread in nature. In addition to folding studies on antibodies and their fragments, other members of this Ig superfamily have also been extensively studied in their folding process (Cota, E. et al., Journal of Molecular Biology 305, 1185-1194, 2001, Hamill, SJ et al , Journal of Molecular Biology 297, 165-178, 2000, Paci, E. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 394-399, 2003). As a current state of research, the following picture has developed: The structuring of the proteins of the Ig superfamily begins by some hydrophobic amino acids in the core of the leaflet structure (especially strand B, C, E and F) and then concludes in the complete structuring starting from this convolution kernel. Figure 2 shows the typical topology of a member of the Ig superfamily, beta2-microglobulin. Strands B, C, E and F, which are postulated as cited as the core of the folding process for Ig proteins in general, are marked. SUMMARY OF THE INVENTION
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Optimierung der natürlichen, heli- kalen Elemente erfolgt. Vorzugsweise erfolgt diese Optimierung durch Einführung zusätzlicher helix-interner Salzbrücken und/oder die Entfernung von Helixbrechern bzw. helix-destabilisierenden Resten (Prolin und/oder Glycin).The present invention is a biotechnological process for the production of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that an optimization of the natural, helical elements takes place. Preferably, this optimization is carried out by introducing additional helix-internal salt bridges and / or the removal of Helixbrechern or helix-destabilizing residues (proline and / or glycine).
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transplantation der natürlichen oder optimierten, helikalen Elemente erfolgt. Vorzugsweise erfolgt diese Transplantation in Domänen, die über keine oder weniger optimale helikale EIe- mente verfügen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt dabei eine Übertragung eines oder mehrerer helikaler Elemente aus mindestens einer konstanten Domäne CL, CH2 und/oder CH3 in mindestens eine konstante CH1 - Domäne und/oder variable Domäne (z.B. VL oder VH).In a further aspect, the invention relates to a biotechnological process for the production of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that a transplantation of the natural or optimized helical elements takes place. Preferably, this transplantation occurs in domains that have no or less optimal helical elements. In a particularly preferred embodiment, a transfer of one or more helical elements from at least one constant domain C L , C H 2 and / or C H 3 into at least one constant C H 1 domain and / or variable domain (eg V L or V H ).
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verbesserung der biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen, die das Immunglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Aminosäure in der Ig-Domäne durch eine andere Aminosäure ausgetauscht wird, die die Ausbildungswahrscheinlichkeit einer HeNx, bevorzugt einer α-Helix, erhöht. Dabei wird die Ausbildungswahrscheinlichkeit vorzugsweise mit einem Algorithmus berechnet, insbesondere mit dem Algorithmus AGADIR. Bevorzugt befindet sich die ausgetauschte Aminosäure im Bereich zwischen zwei ß-Faltblattsträngen, insbesondere vom Typ A und B und/oder E und F. Dabei kann sich die ausgetauschte Aminosäure in einem Bereich befinden, der bereits eine helikale Struktur aufweist. Ziel eines solchen Aminosäureaustausches in einem schon vorhandenen helikalen E- lement ist dann eine Erhöhung der Helixausbildungswahrscheinlichkeit dieses E- lementes. Die Helixbildung kann beispielsweise dadurch erhöht werden, dass die auszutauschende Aminosäure in der Ig-Domäne Prolin oder Glycin ist, vorzugsweise wenn sie sich mindestens an zweiter Position (i→i+2) nach dem vorangehenden ß-Faltblattstrang oder höchstens an vorletzter Position (i→i-2) vor dem nachfolgenden ß-Faltblattstrang befindet. Prolin und Glycin werden dabei durch eine Aminosäure ersetzt, die weder Prolin noch Glycin ist, vorzugsweise durch A- lanin. Eine weitere Möglichkeit ist die Einführung von Salzbrücken dadurch, dass eine Aminosäure, die eine geladene Seitenketten aufweist, so eingeführt wird, dass sie sich im Abstand (i→i+3), (i→i+4) oder (i→i+5) zu einer Aminosäure be- findet, die eine Seitenkette mit gegennamiger Ladung aufweist. Gegebenenfalls werden dafür mindestens zwei Aminosäuren eingeführt, die Seitenketten mit gegennamiger Ladung aufweisen, wobei der Abstand zwischen den ausgetauschten Aminosäuren so gewählt wird, dass die Seitenketten eine Salzbrücke ausbilden können. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die ausgetauschten Amino- säuren durch 2 (i→i+3), 3 (i→i+4) oder mehr Aminosäuren voneinander getrennt (i→ i+5). Als Aminosäuren mit unter physiologischen Bedingungen negativ geladener Seitenketten können Glutaminsäure oder Asparaginsäure verwendet werden, während Arginin, Lysin, oder Histidin unter solchen Bedingungen positiv geladene Seitenketten aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die Position, an der Arginin, Lysin, oder Histidin eingeführt wird oder gegebenenfalls schon vorhanden ist, näher am C-Terminus als die Position, an der Glutaminsäure oder Asparaginsäure eingeführt wird oder gegebenenfalls schon vorhanden ist. Es kann auch eine doppelte Salzbrücke eingeführt werden, in dem eine Sequenz erzeugt wird, bei der sich 3 Aminosäuren an den Positionen i und i+3, i+4 oder i+5 sowie i+7, i+8 oder i+9 befinden, wobei die Aminosäuren an den Positionen i und i+7, i+8 oder i+9 Seitenketten mit gleichnamiger Ladung aufweisen, die Aminosäure an der Position i+3, i+4 oder i+5 eine dazu gegennamige. Zu diesem Zweck können 3 entsprechende Aminosäuren durch Mutation eingeführt werden, gegebenenfalls auch weniger, wenn schon entsprechende Aminosäuren in der Ausgangssequenz vorhanden sind. In einer solchen doppelten Salzbrücke befindet sich an der mittleren Position i+3, i+4 oder i+5 bevorzugt Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Arginin. Bevorzugte Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet, dass das Protein nach dem Austausch ein helikales Element mit der Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16), und/oder SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ) enthält.In a further aspect, the invention relates to methods for improving the biophysical properties of proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that at least one amino acid in the Ig domain is replaced by another amino acid which increases the formation probability of a HeNx, preferably an α- Helix, raised. The training probability is preferably calculated with an algorithm, in particular with the algorithm AGADIR. The exchanged amino acid is preferably in the region between two β-sheet strands, in particular of the type A and B and / or E and F. The exchanged amino acid may be located in a region which already has a helical structure. The aim of such an amino acid exchange in an already existing helical element is then an increase in the helix formation probability of this e- lementes. The helix formation can be increased, for example, by the fact that the amino acid to be exchanged in the Ig domain is proline or glycine, preferably if they are at least at the second position (i → i + 2) after the preceding β-sheet strand or at most at the last but one position (i → i-2) in front of the following β-sheet strand. Proline and glycine are replaced by an amino acid which is neither proline nor glycine, preferably by alanine. Another possibility is the introduction of salt bridges by introducing an amino acid having a charged side chain spaced apart (i → i + 3), (i → i + 4) or (i → i + 5) to an amino acid having a sidechain with the opposite charge. If appropriate, at least two amino acids are introduced for this purpose which have side chains with a charge of the same name, the distance between the exchanged amino acids being selected so that the side chains can form a salt bridge. In a preferred embodiment, the exchanged amino acids are separated from one another by 2 (i → i + 3), 3 (i → i + 4) or more amino acids (i → i + 5). As amino acids with negatively charged side chains under physiological conditions, glutamic acid or aspartic acid can be used, while arginine, lysine, or histidine have positively charged side chains under such conditions. In a preferred embodiment, the position at which arginine, lysine, or histidine is introduced, or optionally already present, is closer to the C-terminus than the position at which glutamic acid or aspartic acid is introduced or may already be present. It is also possible to introduce a double salt bridge in which a sequence is generated in which 3 amino acids are located at positions i and i + 3, i + 4 or i + 5 and i + 7, i + 8 or i + 9 in which the amino acids at the positions i and i + 7, i + 8 or i + 9 have side chains with the same charge, the amino acid at the position i + 3, i + 4 or i + 5 has a counterpart thereto. For this purpose, 3 corresponding amino acids can be introduced by mutation, if appropriate also less, if corresponding amino acids are already present in the starting sequence. In such a double salt bridge is located at the middle position i + 3, i + 4 or i + 5 preferably aspartic acid, Glutamic acid or arginine. Preferred embodiments are characterized in that after exchange the protein has a helical element with the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO : 16), and / or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Transplantation geeigneter helikaler Elemente in Domänen, die über keine oder weniger optimale helikale Elemente verfügen, wie beispielsweise die Ig-Domäne des beta2- Mikroglobulins (SEQ ID NO:3), die variablen Domänen (VL, VH) oder die konstante Domäne CH1 von Immunglobulinen. Die transplantierten Elemente können dabei beispielsweise aus den konstanten Immunglobulindomänen CL, CH2 oder CH3 stammen oder nach erfindungsgemäßen Verfahren optimierte Varianten solcher Elemente sein. Die Transplantation erfolgt vorzugsweise durch ein Verfahren, bei dem 4 bis 12 aufeinanderfolgende Aminosäuren (vorzugsweise etwa 10 Aminosäuren) durch eine Aminosäuresequenz gleicher oder größerer Länge ausgetauscht werden, wobei die eingeführte Aminosäuresequenz eine höhere Ausbildungswahrscheinlichkeit einer HeNx aufweist als die ausgetauschte Sequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die eingeführte Sequenz ein he- likales Element aus dem Bereich zwischen den ß-Faltblattsträngen A und B und/oder E und F einer CL- oder CH-Domäne eines Immunglobulins. Geeignete helikale Elemente haben beispielsweise die Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8) aus einer humanen CH2-Domäne (SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:14 oder SEQ ID NO:15) oder die daraus optimierte KAEDTLHISR Sequenz (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10) aus der murinen kappa CL-Domäne (SEQ ID NO:1 ), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) aus der humanen lambda CL-Domäne (SEQ ID NO:13) oder auch SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ) aus der humanen kappa CL- Domäne (SEQ ID NO:12).In a further aspect, the present invention relates to the transplantation of suitable helical elements into domains having no or less optimal helical elements, such as the Ig domain of the beta2 microglobulin (SEQ ID NO: 3), the variable domains (V L , V H ) or the constant domain C H 1 of immunoglobulins. The transplanted elements may originate, for example, from the constant immunoglobulin domains C L , C H 2 or C H 3 or be variants of such elements optimized according to the method of the invention. The transplantation is preferably carried out by a method in which 4 to 12 consecutive amino acids (preferably about 10 amino acids) are replaced by an amino acid sequence of equal or greater length, wherein the introduced amino acid sequence has a higher formation probability of a HeNx than the exchanged sequence. In a preferred embodiment, the introduced sequence is a helical element from the region between the β-sheet strands A and B and / or E and F of a C L or CH domain of an immunoglobulin. Suitable helical elements have, for example, the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) from a human C H 2 domain (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15) or the optimized KAEDTLHISR sequence (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10) from the murine kappa C L domain (SEQ ID NO: 1), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) from the human lambda C L domain (SEQ ID NO : 13) or also SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11) from the human kappa C L domain (SEQ ID NO: 12).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das ein Immunglobulinfaltungsmuster aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren zur Verbesserung der biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen, die das Immunglobulin- faltungsmuster aufweisen, auf ein solches Protein angewendet wird und das dadurch erhaltene modifizierte Protein in einer Wirtszelle exprimiert wird.In a further aspect, the present invention relates to a method of producing a protein having an immunoglobulin folding pattern therewith characterized in that a method as described above for improving the biophysical properties of proteins having the immunoglobulin folding pattern is applied to such a protein and the modified protein obtained thereby is expressed in a host cell.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster aufweist, hergestellt mit einem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben. Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen Antikörper, insbesondere um ein komplettes Immunglobulin, enthaltend zwei leichte und zwei schwere Ketten.In a further aspect, the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern prepared by a method of the invention as described above. Preferably, this is an antibody, in particular a complete immunoglobulin containing two light and two heavy chains.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster und mindestens eine variable Domäne (z.B. VL oder VH) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein helikales Element in dieser variablen Domäne enthält. Bevorzugt hat dieses helikale Element die Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEY- ERH (SEQ ID NO:10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16), oder SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ). In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung hat die variable Domäne die Fähigkeit, spezifisch an ein Antigen zu binden.In a further aspect, the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one variable domain (eg V L or V H ), characterized in that it contains at least one helical element in this variable domain. Preferably, this helical element has the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16), or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11). In a preferred aspect of the invention, the variable domain has the ability to specifically bind to an antigen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster und mindestens eine konstante Domäne vom Typ CH2 aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein helikales Element in dieser konstanten Domäne enthält, das eine höhere Helixausbildungswahrscheinlichkeit aufweist als ein helikales Element einer natürlicherweise im Menschen vorkommenden CH2-Domäne. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein solches Protein eine CH2-Domäne, die ein helikales Element mit der Sequenz KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) oder der Sequenz SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ) enthält. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster und mindestens eine konstante Domäne vom Typ CH1 aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein helikales Element in dieser konstanten Domäne enthält, das eine höhere Helixausbildungswahrscheinlichkeit aufweist als ein helikales Element einer natürlicherweise im Menschen vorkommenden CH1 -Domäne. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein solches Protein eine CH1 -Domäne, die ein helikales Element mit der Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) oder der Sequenz SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ) enthält.In a further aspect, the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 2, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element of one naturally occurring in humans C H 2 domain. In a preferred embodiment, such a protein contains a C H 2 domain comprising a helical element having the sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or the Sequence contains SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11). In a further aspect, the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 1, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element of one naturally occurring in humans C H 1 domain. In a preferred embodiment, such a protein contains a C H 1 domain comprising a helical element having the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or the sequence SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein modifiziertes ß2- Mikroglobulin, das mindestens ein helikales Element in einer Ig-Domäne aufweist, bevorzugt ein helikales Element mit der Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16), oder SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ).In a further aspect, the present invention relates to a modified β2-microglobulin having at least one helical element in an Ig domain, preferably a helical element having the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9) , TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16), or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster aufweist, das mindestens ein helikales Element in einer Ig-Domäne aufweist, das eine höhere Helixausbildungswahrscheinlichkeit hat als ein helikales Element, das in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:12 bzw. SEQ ID NO:13 (CL WT) oder SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:14 bzw. SEQ ID NO:15 (CH2 WT) enthalten ist. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein solches Protein ein helikales Element mit der Sequenz KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9).In a further aspect, the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern comprising at least one helical element in an Ig domain which has a higher helix formation probability than a helical element present in any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 (C L WT) or SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 (C H 2 WT). In a preferred embodiment, such a protein contains a helical element having the sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein wie vorstehend beschrieben zur medizinischen Verwendung.In a further aspect, the present invention relates to a protein as described above for medical use.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Modifizierung der biophysikalischen Eigenschaften von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunoglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Optimierung der natürlichen, helikalen Elemente erfolgt.In a further aspect, the present invention relates to a biotechnological method for modifying the biophysical properties of antibodies or proteins which have the immunoglobulin folding pattern, characterized in that an optimization of the natural, helical elements takes place.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Modifizierung der biophysikalischen Eigenschaften von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunoglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transplantation der natürlichen oder optimierten, helikalen Elemente erfolgt, und zwar bevorzugt in Domänen, die über keine oder weniger optimale helikale Elemente verfügen.In a further aspect, the present invention relates to a biotechnological method for modifying the biophysical properties of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that a transplantation of the natural or optimized helical elements takes place, preferably in domains which have no or have less optimal helical elements.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung liegen in einer größeren Faltungseffizienz und Stabilität, weniger Missfaltungen und damit letztendlich höherer Produktausbeute bei gleichzeitig qualitativ hochwertigeren Proteinen, einer größeren Flexibilität im Reinigungsprozess, einer langsameren Entfaltungsgeschwindigkeit insbe- sondere unter Stressbedingungen, einer Verbesserung der Löslichkeit sowie einer geringeren Neigung zu Aggregatbildung der erfindungsgemäßen Proteine. Aufgrund der höheren Robustheit für den Herstellprozess ist dieses neue Verfahren dem bisherigem Stand der Technik deutlich überlegen. Die vorliegende Erfindung lässt sich deshalb bevorzugt auf Prozesse zur Herstellung von rekombinanten An- tikörpern und Fc-Fusionsproteinen anwenden. Die vorliegende Erfindung lässt sich jedoch auch auf andere Moleküle der Immunglobuline-Superfamilie inklusive deren Fragmenten und Derivaten oder Fusionsproteinen, die Domänen mit Homologie zu Immunglobulin-Domänen enthalten, anwenden.The advantages of the present invention are a greater folding efficiency and stability, fewer defects and thus ultimately higher product yield with higher quality proteins, greater flexibility in the cleaning process, a slower rate of unfolding, especially under stress conditions, an improvement in solubility and a lower tendency to Aggregate formation of the proteins according to the invention. Due to the higher robustness for the manufacturing process, this new method is clearly superior to the prior art. The present invention is therefore preferably applicable to processes for the production of recombinant antibodies and Fc fusion proteins. However, the present invention can also be applied to other molecules of the immunoglobulin superfamily including their fragments and derivatives or fusion proteins containing domains with homology to immunoglobulin domains.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGENDESCRIPTION OF THE FIGURES
ABBILDUNG 1 : ANTIKÖRPER DER IGG SUBKLASSEFIGURE 1: ANTIBODIES OF IGG SUBKLASSE
Die zwei leichten Ketten sind hell, die schweren Ketten dunkler dargestellt. Die für die Antigenbindung verantwortlichen Bereiche (Paratope), die Glykosylierung der CH2-Domäne sowie der die Effektorfunktionen vermittelnde Fc Teil sind markiert. ABBILDUNG 2: BETA2-MIKROGLOBULIN ALS REPRÄSENTANT DER IG- SUPERFAMILIEThe two light chains are bright, the heavy chains darker. The areas responsible for antigen binding (paratopes), the glycosylation of the CH2 domain and the effector functions mediating Fc part are marked. FIGURE 2: BETA2-MICROGLOBULIN AS A REPRESENTATIVE OF THE IG SUPERFAMILY
Die ß-Faltblattstränge B, C, E und F des humanen beta2-Mikroglobulins (SEQ ID NO: 3) sind markiert.Β-sheet strands B, C, E and F of the human beta2-microglobulin (SEQ ID NO: 3) are labeled.
ABBILDUNG 3: IMMUNOGLOBULIN G TOPOLOGIEFIGURE 3: IMMUNOGLOBULIN G TOPOLOGY
Kurze helikale Elemente in der Ig-Topologie im Kontext eines IgG Moleküls, die die ß-Faltblätter miteinander verbinden, sind dunkel markiert.Short helical elements in the Ig topology in the context of an IgG molecule that connect the β-sheets are labeled dark.
ABBILDUNG 4: LOKALISIERUNG DER HELIKALEN ELEMENTE IN DER IGG1 CL-DOMÄNEFIGURE 4: LOCALIZATION OF HELICAL ELEMENTS IN THE IGG1 C L DOMAIN
In der Abbildung ist die Lokalisierung der helikalen Elemente in einer konstanten Antikörperdomäne am Beispiel einer humanen IgGI d-Domäne gezeigt. Die ß- Faltblattstränge A, B, C, D, E, F und G sowie die helikalen Elemente HeNx 1 und HeNx 2 sind bezeichnet.In the figure, the localization of the helical elements in a constant antibody domain using the example of a human IgGI d domain is shown. The β-sheet strands A, B, C, D, E, F and G and the helical elements HeNx 1 and HeNx 2 are designated.
ABBILDUNG 5: CHARAKTERISIERUNG DES CL-FALTUNGSINTERME-DIATS MITTELS NMR-SPEKTROSKOPIEFIGURE 5: CHARACTERIZATION OF THE CL FIBER INTERMEDIATE DIATH BY NMR SPECTROSCOPY
Dargestellt sind die im ersten NMR-Spektrum während der Rückfaltung erhaltenen Peakamplituden für jeden zugeordneten Rest im Vergleich zu den nativen Pea- kamplituden nach Vervollständigung der Rückfaltung. Die Strukturelemente der murinen kappa d-Domäne (SEQ ID NO:1 ) sind schematisch oberhalb der Peakamplituden dargestellt.Shown are the peak amplitudes obtained in the first NMR spectrum during refolding for each assigned residue compared to the native peak amplitudes after completion of the refolding. The structural elements of the murine kappa d domain (SEQ ID NO: 1) are shown schematically above the peak amplitudes.
ABBILDUNG 6: STRUKTURIERUNG DER IGG CL -DOMÄNEFIGURE 6: STRUCTURING OF THE IGG C L DOMAIN
Der Grad der Strukturierung im Faltungsintermediat der murinen kappa CL- Domäne (SEQ ID NO:1 ) ist mittels NMR-Spektroskopie bestimmt. Nativ strukturierte Bereiche sind dunkel dargestellt. ABBILDUNG 7: CD-SPEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG Die CD-spektroskopische Untersuchung der murinen kappa d-Domäne (Striche) (CL WT; SEQ ID NO:1 ), der d-Domäne mit den humanen beta2-Mikroglobulin- Loops (Striche & Punkte) (CL to ß2m; SEQ ID NO:2) sowie von humanem beta2- Mikroglobulin (Linie) (ß2m WT; SEQ ID NO: 3) und beta2-Mikroglobulin mit den CL-Helices (Punkte) (ß2m to CL ; SEQ ID NO: 4) wird bei 200C in PBS durchgeführt. CL mit den beta2-Mikroglobulin-Helices (CL to ß2m; SEQ ID NO:2) zeigt das Spektrum eines entfalteten Proteins, alle anderen Proteine weisen die Signatur eines beta-Faltblattproteins auf.The degree of structuring in the folding intermediate of the murine kappa C L domain (SEQ ID NO: 1) is determined by means of NMR spectroscopy. Native structured areas are shown dark. FIGURE 7: CD SPECTROSCOPIC INVESTIGATION The CD spectroscopic study of the murine kappa d domain (lines) (C L WT, SEQ ID NO: 1), the d domain with the human beta 2 microglobulin loops (bars & dots) (C L to β2m, SEQ ID NO: 2) as well as of human beta2-microglobulin (line) (β2m WT, SEQ ID NO: 3) and beta2-microglobulin with the C L -helices (points) (β2m to C L ; SEQ ID NO: 4) is carried out at 20 ° C. in PBS. C L with the beta2-microglobulin helices (C L to β2m; SEQ ID NO: 2) shows the spectrum of an unfolded protein, all other proteins are signature of a beta-sheet protein.
ABBILDUNG 8: EINFLUSS DER HELIKALEN ELEMENTE AUF DIE BETA2- MIKROGLOBULIN AMYLOIDBILDUNGFIGURE 8: INFLUENCE OF HELICAL ELEMENTS ON BETA2 MICROGLOBULIN AMYLOID FORMATION
AFM-Messungen verdeutlichen die Reduktion der Amyloidbildung unter allen Bedingungen bei beta2-mikroglobulin (ß2m WT; SEQ ID NO: 3) durch Transplanta- tion der d-Helices (ß2m to CL ; SEQ ID NO: 4). Messungen werden bei pH 1.5, 3.0 sowie in PBS in An- und Abwesenheit von Seeds (= durch Ultraschallbehandlung fragmentierte Fibrillen durchgeführt.AFM measurements illustrate the reduction in amyloid formation under all conditions in beta2-microglobulin (β2m WT, SEQ ID NO: 3) by transplantation of the d-helices (β2m to C L , SEQ ID NO: 4). Measurements are performed at pH 1.5, 3.0 and in PBS in the presence and in the absence of seeds (= fibrils fragmented by ultrasound treatment).
ABBILDUNG 9: CH2-DOMÄNE EINES IGG1 -MOLEKÜLS Lokalisierung der optimierten HeNx 1 innerhalb der CH2-Domäne (A) eines humanen IgGI -Moleküls (CH2 HeNx 1 Mutante; SEQ ID NO:6) sowie durchgeführte Optimierung der HeNx 1 mittels Einführung zusätzlicher Salzbrücken und Entfernung des Helixbrechers Prolin (B) (Mutation: KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) zu KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9)).FIGURE 9: C H 2 DOMAIN OF IGG1 MOLECULAR Localization of the optimized HeNx 1 within the C H 2 domain (A) of a human IgGI molecule (C H 2 HeNx 1 mutant, SEQ ID NO: 6) and optimization of the HeNx 1 by introducing additional salt bridges and removing the helix breaker proline (B) (mutation: KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) to KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9)).
ABBILDUNG 10: STRUKTURELLER VERGLEICH DER WILDTYP-CH2-DOMÄNE MIT DER HELIX1 -OPTIMIERTEN MUTANTEFIGURE 10: STRUCTURAL COMPARISON OF THE WILD TYPE C H 2 DOMAIN WITH THE HELIX1-OPTIMIZED MUTANT
FUV-CD Spektren (A) sowie NUV-CD Spektren (B), folglich Sekundär- und Tertiärstruktur, sind für den IgGI CH2-Wildtypdomäne (gestrichelte Linie) (CH2 WT; SEQ ID NO: 5) sowie die HeNxI -Mutante (durchgezogene Linie) (CH2 HeNxI Mutante; SEQ ID NO: 6) nahezu identisch. ABBILDUNG 11 : THERMISCHE STABILITÄTSUNTERSUCHUNG Die thermische Stabilität der Wildtyp CH2 Domäne (gestrichelte Linie) (CH2 WT; SEQ ID NO: 5) sowie der Helixi Mutante (durchgezogene Linie) (CH2 Helixi Mutante; SEQ ID NO: 6) wird mittels FUV-CD Spektroskopie bei 218 nm vermessen. Die Heizrate beträgt 20°C/h. Der Schmelzpunkt des Wildtyps wird zu 56.0 0C ermittelt, derjenige der Mutante zu 60.4 0C.FUV-CD spectra (A) and NUV-CD spectra (B), hence secondary and tertiary structure, are for the IgGI CH2 wild-type domain (dashed line) (C H 2 WT, SEQ ID NO: 5) and the HeNxI mutant (solid line) (C H 2 HeNxI mutant; SEQ ID NO: 6) are almost identical. FIGURE 11: THERMAL STABILITY STUDY The thermal stability of the wild-type C H 2 domain (dashed line) (C H 2 WT; SEQ ID NO: 5) and the Helixi mutant (solid line) (C H 2 helixi mutant; SEQ ID NO: 6 ) is measured by means of FUV-CD spectroscopy at 218 nm. The heating rate is 20 ° C / h. The melting point of the wild type is determined to 56.0 0 C, that of the mutant to 60.4 0 C.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Im Rahmen dieser Erfindungsbeschreibung verwendete Begriffe und Bezeichnungen haben folgende im Anschluss definierte Bedeutungen. Die allgemeinen Ausführungsformen „enthaltend" oder „enthält" schließt die speziellere Ausführungs- form „bestehend aus" mit ein. Ferner werden „Einzahl" und „Mehrzahl" nicht begrenzend verwendet.Terms and designations used in the context of this description of the invention have the following defined meanings. The general embodiments "containing" or "containing" include the more specific embodiment "consisting of." Further, "singular" and "plural" are not limited.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verbesserung der biophysikalischen Eigenschaften, insbesondere der Erhöhung der Stabilität, der Faltungseffi- zienz und der Verringerung der Aggregatbildung von Proteinen der Immunglobu- lin-Superfamilie, sowie die dergestalt modifizierten Proteine selbst. Zur Immunglo- bulin-Superfamilie zählen derzeit mehr als 760 verschiedene Proteine. Die wirtschaftlich wichtigste Gruppe darin bilden die Immunglobuline (Antikörper). Es gibt verschiedene Klassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY, IgW. Weitere Mitglieder sind Antigenrezeptoren auf Zelloberflächen (z.B. T-ZeII-The present invention relates to methods for improving the biophysical properties, in particular the increase in stability, the folding efficiency and the reduction of the aggregation of proteins of the immunoglobulin superfamily, and the thus-modified proteins themselves. The immunoglobulin superfamily currently includes more than 760 different proteins. The most economically important group in this group are the immunoglobulins (antibodies). There are several classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY, IgW. Other members are antigenic receptors on cell surfaces (e.g., T cells).
Rezeptoren), Ko-Rezeptoren und ko-stimulatohsche Moleküle des Immunsystems, Proteine, die an der Antigenpräsentation beteiligt sind (z.B. MHC-Moleküle), sowie bestimmte Zytokinrezeptoren und intrazelluläre Muskelproteine. Proteine der Im- munglobulin-Superfamilie sind durch gemeinsame strukturelle Elemente gekenn- zeichnet, den sogenannten Immunglobulindomänen (Ig-Domänen). Die Ig-Receptors), co-receptors and co-stimulatory molecules of the immune system, proteins involved in antigen presentation (e.g., MHC molecules), as well as certain cytokine receptors and intracellular muscle proteins. Proteins of the immunoglobulin superfamily are characterized by common structural elements, the so-called immunoglobulin domains (Ig domains). The Ig
Domänen haben eine gemeinsame Grundstruktur. Sie bestehen typischerweise aus etwa 70 bis 110 Aminosäuren (es gibt aber auch Beispiele mit über 200 Aminosäuren) und enthalten häufig eine intramolekulare Disulfidbrücke. Antikörper der Klasse IgG beispielsweise sind aus vier Untereinheiten aufgebaut, je zwei identischen schweren und zwei identischen leichten Ketten, die durch kovalente Disul- fidbrücken zu einer ypsilon-förmigen Struktur miteinander verknüpft sind. Jede leichte Kette enthält dabei zwei Ig-Domänen, ein sogenannte variable (VL)und eine konstante (CL) Ig-Domäne, jede schwere Kette vier solcher Ig-Domänen (VH, CH1 , CH2, und CH3). Antikörper der Klassen IgM und IgE enthalten eine zusätzliche konstante Domäne (CH4). Ig-Domänen besitzen eine charakteristische Sekundär- struktur, das Immunglobulinfaltungsmuster (englisch „Ig-fold"), eine sandwichartige Struktur mit hydrophobem Kern, die von zwei Flächen (englisch „sheets") antiparalleler ß-Faltblattstränge gebildet wird (siehe Abbildung 4). Die dreidimensionale Darstellung erinnert an ein gefaltetes Blatt: Die Peptidgruppen liegen in den Flächen und die dazwischen liegenden C-Atome in den Kanten eines mehrfach gefal- teten Blattes. Dabei treten die Peptidbindungen mehrerer Ketten in Wechselwirkung. Es bilden sich die zur Stabilisierung notwendigen Wasserstoffbrückenbindungen entlang des Polypeptidrückgrats, welche in Zweierpaaren im Abstand von ca. 7,0 A vorkommen. Beim Faltblatt ist der Abstand zwischen benachbarten Aminosäuren im Vergleich zur deutlich kompakteren α-Helix viel größer: Der Abstand beträgt 0,35 nm im Vergleich zu 0,15 nm bei der HeNx. Da die Seitengruppen dabei dennoch dicht beieinander liegen, werden größere Faltblattbereiche in der Regel nur dann gebildet, wenn die Seitengruppenreste relativ klein sind und nicht alle gleich geladen sind. Zur Identifizierung von b-Faltblättern können CD („circular dichroism")-Spektroskopie, NMR („nuclear magnetic resonance")-Spektroskopie und zur statistischen Abschätzung der Häufigkeit der Ramachandran-Plot (Rama- chandran, G. N. et al., J. Mol. Biol. 7, 95 - 99, 1963) herangezogen werden. Die einzelnen ß-Stränge werden nach der Reihenfolge ihres Erscheinens in der Sequenz mit A, B, C, D, E, F, G bzw. C, C" etc. bezeichnet. Zur Stabilisierung der Ig- Faltung tragen Wechselwirkungen hydrophober Aminosäuren auf der Innenseite des Sandwiches, Wasserstoffbrücken zwischen den Strängen sowie, falls vorhanden, eine hochkonservierte Disulfidbindung zwischen Cysteinresten der B- und F- Stränge bei. Die Anzahl der zwischen den beiden Cysteinen liegenden Aminosäuren kann dabei variieren und liegt in der Regel zwischen 55 und 75 Aminosäuren. Variable Domänen von Immunglobulinen enthalten typischerweise 9, konstante Domänen 7 ß-Stränge.Domains share a common structure. They typically exist from about 70 to 110 amino acids (but there are also examples with over 200 amino acids) and often contain an intramolecular disulfide bridge. For example, IgG antibodies are composed of four subunits, two identical heavy and two identical light chains linked by covalent disulfide bonds to form a ysilon-shaped structure. Each light chain contains two Ig domains, a so-called variable (V L ) and a constant (C L ) Ig domain, each heavy chain containing four such Ig domains (V H , C H 1, C H 2, and C H 3). Antibodies of classes IgM and IgE contain an additional constant domain (C H 4). Ig domains have a characteristic secondary structure, the immunoglobulin folding pattern (English: "Ig-fold"), a sandwich-like structure with a hydrophobic core formed by two sheets of antiparallel β-sheet strands (see Figure 4). The three-dimensional representation is reminiscent of a folded leaf: the peptide groups lie in the surfaces and the intervening C atoms in the edges of a multiply folded leaf. The peptide bonds of several chains interact. The hydrogen bonds necessary for stabilization form along the polypeptide backbone, which occur in pairs of two at a distance of about 7.0 A. In the leaflet, the distance between adjacent amino acids is much larger compared to the much more compact α-helix: the distance is 0.35 nm compared to 0.15 nm for the HeNx. Since the side groups are still close to each other, larger leaflet areas are usually formed only if the side group residues are relatively small and not all are loaded the same. For the identification of b-sheets, circular dichroism spectroscopy, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, and Ramachandran plot frequency random estimation (Ramachandran, GN et al., J. Mol Biol. 7, 95-99, 1963). The individual β-strands are designated according to the order of their appearance in the sequence with A, B, C, D, E, F, G or C, C ", etc. For stabilizing the Ig-folding, interactions of hydrophobic amino acids on the Inside the sandwich, hydrogen bonds between the strands and, if present, a highly conserved disulfide bond between cysteine residues of the B and F bonds. Strands at. The number of amino acids between the two cysteines can vary and is usually between 55 and 75 amino acids. Variable domains of immunoglobulins typically contain 9, constant domains 7β strands.
Die Sequenzbereiche zwischen den ß-Strängen werden durch unstrukturierte Schleifen (englisch „loops") mit großer Sequenzvariabilität oder, insbesondere in den konstanten Domänen von Immunglobulinen, durch kurze helikale Elemente gebildet. Eine HeNx ist eine rechts- oder linkshändige spiralförmige Sekundärstruk- tur in einem Protein, bei dem jede NH-Gruppe der Hauptkette eine Wasserstoffbrückenbindung zu einer Carbonylgruppe der Hauptkette eingeht. In der rechtshändigen α-Helix beträgt der Abstand, den die Wasserstoffbrückenbindung überspannt, vier Aminosäuren (i+4→i Wasserstoffbrückenbindung). In der α-Helix entspricht eine Windung 3,6 Aminosäureresten bei einer Höhe von 1 ,5 A (0,15 nm); jede Aminosäure ist also um 100° versetzt. Weitere Helixformen sind die 3io-Helix (i+3→i Wasserstoffbrückenbindung) und die π-Helix (i+5→i Wasserstoffbrückenbindung). Die Seitenketten der Aminosäuren befinden sich dabei außerhalb der HeNx. Eine typische HeNx in einem Protein umfasst etwa 10 Aminosäuren (3 Windungen), doch sind auch helikale Elemente von nur 4 Aminosäuren oder Helices aus bis zu 40 Aminosäuren bekannt. Helikale Sekundärstrukturen in Proteinen lassen sich mit an sich bekannten Methoden experimentell bestimmen, beispielsweise durch Röntgenstrukturanalyse oder Kernresonanzspektroskopie (NMR- Spektropskopie). Die Ausbildungswahrscheinlichkeit einer HeNx lässt sich aber auch mit geeigneten Algorithmen auf Basis der Aminosäuresequenz bestimmen (Muήoz, V. & Serrano, L. (1997). Development of the Multiple Sequence Approximation within the Agadir Model of α-Helix Formation. Comparison with Zimm- Bragg and Lifson-Roig Formalisms. Biopolymers 41 , 495-509; Lacroix, E., Viguera AR & Serrano, L. (1998). Elucidating the folding problem of a-helices: Local motifs, long-range electrostatics, ionic strength dependence and prediction of NMR pa- rameters. J. Mol. Biol. 284, 173-191 ). Der in den vorstehend genannten Literaturstellen beschriebene Algorithmus AGADIR ist dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Im Fall konstanter Immunglobulindomänen sind helikale E- lemente zwischen den ß-Faltblattsträngen A und B sowie E und F lokalisiert.The sequence regions between the β-strands are formed by unstructured loops with large sequence variability or, in particular in the constant domains of immunoglobulins, by short helical elements An HeNx is a right-handed or left-handed spiral secondary structure in one Protein in which every NH group in the main chain forms a hydrogen bond to a carbonyl group in the main chain In the right-handed α-helix, the distance across which the hydrogen bond spans is four amino acids (i + 4 → i hydrogen bonding) In the α helix corresponds to a turn of 3.6 amino acid residues at a height of 1.5A (0.15 nm), so each amino acid is offset by 100 ° .Other helix forms are the 3io-helix (i + 3 → i hydrogen bond) and the π- Helix (i + 5 → i hydrogen bonding) The side chains of the amino acids are located outside the HeNx, a typical HeNx in one Protein comprises about 10 amino acids (3 turns), but helical elements of only 4 amino acids or helices of up to 40 amino acids are also known. Helical secondary structures in proteins can be experimentally determined by methods known per se, for example by X-ray structure analysis or nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR spectroscopy). However, the probability of formation of a HeNx can also be determined using suitable algorithms based on the amino acid sequence (Muήoz, V. & Serrano, L. (1997).) Development of the Multiple Sequence Approximation within the Agadir Model of α-Helix Formation. Bragg and Lifson-Roig Formalisms, Biopolymers 41, 495-509, Lacroix, E., Viguera AR & Serrano, L. (1998) Elucidating the folding problem of a-helices: Local motifs, long-range electrostatics, ionic strength dependence and prediction of NMR parameters. J. Mol. Biol. 284, 173-191). The AGADIR algorithm described in the abovementioned references is within the scope of the present invention Invention preferred. In the case of constant immunoglobulin domains, helical elements are located between the β-sheet strands A and B as well as E and F.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass helikale Strukturen wichtig für die biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen sind, die Immunglo- bulinfaltungsmuster aufweisen. Durch Optimierung solcher helikalen Elemente, insbesondere Veränderungen der Aminosäuresequenz, die eine Erhöhung der Ausbildungswahrscheinlichkeit der HeNx, bevorzugt einer α-Helix, bewirken, können biophysikalische Eigenschaften verbessert werden, insbesondere können so die Stabilität (z.B. thermische Stabilität, pH-Stabilität), die Faltungseffizienz und die Löslichkeit erhöht und die Entfaltungsgeschwindigkeit sowie die Neigung zu Missfaltungen, Aggregat- bzw. Amyloidbildungen verringert werden.The present invention is based on the recognition that helical structures are important for the biophysical properties of proteins having immunoglobulin folding patterns. By optimizing such helical elements, in particular changes in the amino acid sequence, which cause an increase in the formation probability of HeNx, preferably an α-helix, biophysical properties can be improved, in particular stability (eg thermal stability, pH stability), folding efficiency and increases solubility and decreases the rate of unfolding, as well as the tendency to misfolding, aggregate or amyloid formation.
Soweit im folgenden auf „vorangehende" oder „nachfolgende" Positionen in Ami- noäuresequenzen Bezug genommen wird, bedeutet „vorangehend" näher am N- Terminus der Sequenz, und „nachfolgend" näher am C-Terminus der Sequenz.As used herein to refer to "preceding" or "succeeding" positions in amino acid sequences, "preceding" means closer to the N-terminus of the sequence, and "subsequent" closer to the C-terminus of the sequence.
Mittels hochauflösender NMR-Spektroskopie konnte der Faltungsweg einer Antikörperdomäne mit nahezu atomarer Auflösung aufgeklärt werden (siehe Abbildung 5 und 6). Dies wurde dadurch ermöglicht, dass die Faltung dieser Domäne, der d-Domäne, durch die Isomerisierung der Tyr34-Pro35 Bindung in den nativen cis- Zustand limitiert wird. Bei niedrigen Temperaturen ist dieser Prozess äußerst langsam und somit der Faltungsweg direkt der NMR-Spektroskopie zugänglich. Dabei zeigte sich, dass sich auf dem Weg zur nativen Struktur eine partiell gefalte- te Struktur ausbildet, ein sogenanntes Faltungsintermediat. Von großer Bedeutung ist dabei, dass in dem Faltungsintermediat die kurzen helikalen Elemente der Domäne bereits vollkommen strukturiert sind, alle anderen Bereiche des Proteins jedoch nur partiell. In Abbildung 5 und 6 ist dieser Sachverhalt dargestellt und es wird ersichtlich, dass insbesondere die kurzen helikalen Elemente der Antikörper- domäne hoch strukturiert sind, die als Faltungsnukleus postulierten Stränge B, C, E und F hingegen geringer. Durch eine Optimierung der Eigenschaften der helika- len Elemente können die biophysikalischen Eigenschaften von Antikörpern (z. B. Stabilität, Löslichkeit, Faltungseffizienz) positiv beeinflusst werden, ebenso durch eine Transplantation der helikalen Elemente zwischen den Domänen, beispielsweise in die variablen Domänen, welche nicht über die helikalen Elemente verfü- gen. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die Tatsache, dass eine Optimierung eines im Wesentlichen über Faltblattstruktur verfügenden Proteins über kurze heli- kale Elemente erfolgt, welche in ihren Eigenschaften wesentlich besser verstanden und folglich leichter zu modifizieren sind als Faltblattstrukturen.High-resolution NMR spectroscopy revealed the folding pathway of an almost atomic-resolution antibody domain (see Figures 5 and 6). This was made possible by the fact that the folding of this domain, the d-domain, is limited by the isomerization of the Tyr34-Pro35 bond into the native cis state. At low temperatures, this process is extremely slow, making the folding path directly accessible to NMR spectroscopy. It turned out that on the way to the native structure a partially folded structure is formed, a so-called folding intermediate. Of great importance is that in the folding intermediate the short helical elements of the domain are already completely structured, but all other areas of the protein are only partially. In Figure 5 and 6, this situation is shown and it can be seen that, in particular, the short helical elements of the antibody domain are highly structured, whereas the strands B, C, E and F postulated as folding nuclei are lower. By optimizing the properties of the helical For example, the biophysical properties of antibodies (eg, stability, solubility, folding efficiency) can be positively influenced, as well as by transplantation of the helical elements between the domains, for example, into the variable domains which do not have the helical elements. A further advantage of the invention is the fact that an optimization of a protein essentially having a sheet structure takes place via short helical elements which are much better understood in their properties and consequently easier to modify than sheet structures.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Optimierung der natürlichen, helikalen Elemente erfolgt. Vorzugsweise erfolgt diese Optimierung durch Einführung zusätzlicher helix-interner Salzbrücken und/oder die Entfernung von Helixbrechern (Prolin und/oder Glycin). Unter einem Protein, die das Immunoglobulinfaltungs- muster aufweisen, wird im Rahmen dieser Erfindung ein Protein verstanden, das mindestens eine Ig-Domäne der vorstehend beschriebenen Struktur aufweist. Insbesondere sind dies Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie, und dabei bevorzugt Immunglobuline. Gegenstand der Erfindung sind aber auch artifizielle Protei- ne, die so in der Natur nicht vorkommen, aber eine Ig-Domäne aufweisen, z.B. Fc- Fusionsproteine wie der Rheuma-Wirkstoff Etanercept (TNFR:Fc). Unter Antikörpern werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nicht nur Immunglobuline verstanden, wie sie auch in der Natur vorkommen und beispielsweise durch Immunisierung von Säugetieren mit einem Antigen erhältlich sind, son- dem auch artifizielle Proteine, soweit sie mindestens eine Ig-Domäne aufweisen, die ein Paratop aufweist und, entweder allein oder zusammen mit einer weiteren Ig-Domäne, spezifisch an ein Antigen bindet. Solche Ig-Domänen sind beispielsweise die variablen Domänen eines Immunglobulins (VH, VL).The present invention is a biotechnological process for the production of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that an optimization of the natural, helical elements takes place. Preferably, this optimization is carried out by introducing additional helix-internal salt bridges and / or the removal of Helixbrechern (proline and / or glycine). In the context of this invention, a protein which has the immunoglobulin folding pattern is understood as meaning a protein which has at least one Ig domain of the structure described above. In particular, these are members of the immunoglobulin superfamily, and preferably immunoglobulins. However, the invention also relates to artificial proteins which do not occur in nature but have an Ig domain, eg Fc fusion proteins such as the rheumatic active substance etanercept (TNFR: Fc). In the context of the present invention, antibodies are understood not only to be immunoglobulins, as they are also found in nature and obtainable for example by immunizing mammals with an antigen, but also artificial proteins, if they have at least one Ig domain has a paratope and, either alone or together with another Ig domain, specifically binds to an antigen. Such Ig domains are, for example, the variable domains of an immunoglobulin (V H , V L ).
Unter den Immunglobulinen, die klassisch aus zwei leichten und zwei schweren Ketten bestehen, sind solche der Klasse IgG mit schweren Ketten der Subtypen IgGI , lgG2, und lgG4 bevorzugt. Solche Immunglobuline können monoklonaler oder polyklonaler Natur sein, Primaten- (insbesondere Human-), Nager- oder Sequenzen anderer Säugetiere enthalten, sowie Chimäre oder humanisierte Sequenzen darstellen. Bevorzugt sind humane oder humanisierte Immunglobuline. Die Immunglobuline können zudem in ihren Domänen zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Optimierungsverfahren Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen von Aminosäuren aufweisen, die die Eigenschaften des Moleküls verändern können. So können z. B. Effektorfunktionen wie beispielsweise Komplementabhängige Zytotoxizität (CDC), Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC), Apoptoseinduktion oder FcRn-vermittelte Homöostase moduliert werden. Durch die Entfernung von potentiellen Deamidierungs-, Oxidierungs- und Glykosy- lierungsstellen oder Deletion des C-terminalen Lysins an der schweren Ketten kann beispielsweise die Heterogenität des Moleküls reduziert werden.Among the immunoglobulins, which classically consist of two light chains and two heavy chains, are those of the class IgG with heavy chains of the subtypes IgGI, IgG2, and IgG4 are preferred. Such immunoglobulins may be monoclonal or polyclonal, include primates (especially human), rodents or sequences from other mammals, as well as represent chimeras or humanized sequences. Preferred are human or humanized immunoglobulins. In addition to the optimization methods according to the invention, the immunoglobulins may also have in their domains substitutions, deletions and / or insertions of amino acids which may alter the properties of the molecule. So z. For example, effector functions such as complement dependent cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), apoptosis induction, or FcRn-mediated homeostasis may be modulated. For example, removal of potential deamidation, oxidation and glycosylation sites or deletion of the C-terminal lysine on the heavy chain can reduce the heterogeneity of the molecule.
Neben kompletten Immunglobulinen ist dem Fachmann eine Vielzahl davon abgeleiteter Proteine bekannt, die Ig-Domänen enthalten. So kennt er beispielsweise Fragmente von Immunglobulinen wie Fab, F(ab')2 oder Fc-Fragmente, Fc- Fusionsproteine, Fc-Fc-Fusionsproteine, einkettige Antikörper, die aus einer Fusion der variablen Domänen einer leichten und einer schweren Kette bestehen (scFv), Einzeldomänenantikörper (englisch Single domain antibodies, dAbs), die nur aus der variablen Domäne einer schweren oder leichten Kette bestehen wie VH VHH, oder VL dAbs, einschließlich der von Cameliden abgeleiteten Domänen- Antikörper, ferner Minibodies, Diabodies, Triabodies, sowie Fusionsproteine solcher Konstrukte.In addition to complete immunoglobulins, the skilled worker is aware of a large number of derived proteins containing Ig domains. For example, he knows fragments of immunoglobulins such as Fab, F (ab ') 2 or Fc fragments, Fc fusion proteins, Fc-Fc fusion proteins, single-chain antibodies consisting of a fusion of the variable domains of a light and a heavy chain (scFv ) Single domain antibodies (dAbs) consisting only of the heavy or light chain variable domain such as V H V HH or V L dAbs, including the camelid-derived domain antibodies, furthermore minibodies, diabodies, triabodies , as well as fusion proteins of such constructs.
Fab-Fragmente (Fragment antigen-binding = Fab) bestehen aus den variablen Regionen beider Ketten, die durch die angrenzenden konstanten Regionen zusammengehalten werden. Sie können z.B. durch Behandlung mit einer Protease, wie beispielsweise Papain, aus konventionellen Antikörpern erzeugt werden oder aber auch durch DNA-Klonierung. Weitere Antikörperfragmente sind F(ab')2- Fragmente, die durch proteolytischen Verdau mit Pepsin hergestellt werden können.Fab fragments (fragment antigen-binding = Fab) consist of the variable regions of both chains, which are held together by the adjacent constant regions. They can be produced, for example, by treatment with a protease, for example papain, from conventional antibodies or else by DNA cloning. Further antibody fragments are F (ab ') 2- Fragments that can be prepared by proteolytic digestion with pepsin.
Durch Genklonierung oder de novo Gensynthese können auch verkürzte Antikör- perfragmente hergestellt werden, die nur aus den variablen Region der schweren (VH) und der leichten Kette (VL) bestehen. Diese werden als Fv-Fragmente (Fragment variable = Fragment des variablen Teils) bezeichnet. Da bei diesen Fv- Fragmenten die kovalente Verbindung über die Cysteinreste der konstanten Ketten nicht möglich ist, werden diese Fv-Fragmente oft anderweitig stabilisiert. Dazu werden die variablen Region der schweren und leichten Kette häufig mittels eines kurzen Peptidfragments von ca. 10 - 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt 15 Aminosäuren, miteinander verknüpft. Auf diese Weise entsteht eine einzelne Polypeptidkette, in der VH und VL durch einen Peptidlinker miteinander verbunden sind. Solche Antikörperfragmente werden auch als single-chain Fv-Fragment (scFv) bezeichnet. Beispiele von scFv-Antikörpern sind bekannt und beschrieben.By gene cloning or de novo gene synthesis also shortened antibody fragments can be produced, which consist only of the variable region of the heavy (V H ) and the light chain (V L ). These are referred to as Fv fragments (fragment variable = fragment of the variable part). Since covalent attachment via the cysteine residues of the constant chains is not possible with these Fv fragments, these Fv fragments are often otherwise stabilized. For this, the variable region of the heavy and light chain are often linked together by means of a short peptide fragment of about 10 to 30 amino acids, particularly preferably 15 amino acids. In this way, a single polypeptide chain is formed in which V H and V L are linked together by a peptide linker. Such antibody fragments are also referred to as a single-chain Fv fragment (scFv). Examples of scFv antibodies are known and described.
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Strategien entwickelt um multi- mere scFv-Derivate herzustellen. Die Intention besteht in der Erzeugung von re- kombinanten Antikörpern mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften und verstärkter Bindungsavidität. Zur Erreichung der Multimerisierung der scFv- Fragmente werden diese als Fusionsproteine mit Multimerisierungsdomänen hergestellt. Als Multimerisierungsdomänen können dabei z.B. die Chi3-Region eines IgGs oder Helixstrukturen („coiled coil structure") wie die Leucin-Zipper-Domänen fungieren. In anderen Strategien wird die Interaktion zwischen den VH- und VL- Regionen des scFv-Fragments für eine Multimerisierung genutzt (z.B. Dia-, Tri- und Pentabodies).In recent years, various strategies have been developed to produce multimeric scFv derivatives. The intention is to produce recombinant antibodies with improved pharmacokinetic properties and enhanced binding avidity. To achieve multimerization of the scFv fragments, these are prepared as fusion proteins with multimerization domains. For example, the C h i3 region of an IgG or coiled coil structures may function as multimerization domains, such as the leucine zipper domains, In other strategies, the interaction between the V H and V L regions of the scFv domain Fragments used for a multimerization (eg slide, tri- and pentabodies).
Als „Diabody" bezeichnet ein Fachmann ein bivalentes homodimeres scFv- Derivat. Die Verkürzung des Peptidlinkers im scFv-Moleküle auf 5 - 10 Aminosäu- ren resultiert in der Bildung von Homodimeren durch Überlagerung von VH/VL- Ketten. Die Diabodies können zusätzlich durch eingeführte Disulfidbrücken stabilisiert werden. Beispiele von Diabodies finden sich in der Literatur.As a "diabody", a person skilled in the art refers to a bivalent homodimeric scFv derivative. The shortening of the peptide linker in the scFv molecule to 5 to 10 amino acids results in the formation of homodimers by superposing V H / V L - Chains. The diabodies can additionally be stabilized by introduced disulfide bridges. Examples of diabodies can be found in the literature.
Als „Minibody" bezeichnet der Fachmann ein bivalentes, homodimeres scFv- Derivat. Es besteht aus einem Fusionsprotein, das die Chi3-Region eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG, besonders bevorzugt IgGI , als Dimerisierungs- region enthält. Diese verbindet die scFv-Fragmente über eine Hinge-Region, e- benfalls von IgG, und eine Linker-Region.As a "minibody", the person skilled in the art refers to a bivalent, homodimeric scFv derivative consisting of a fusion protein which contains the C h 13 region of an immunoglobulin, preferably IgG, particularly preferably IgGI, as the dimerization region, which links the scFv fragments via a hinge region, also from IgG, and a linker region.
Mit „Thabody" bezeichnet der Fachmann ein trivalentes homothmeres scFv-The person skilled in the art refers to a trivalent homotheric scFv by "thabody".
Derivat. Die direkte Fusion von VH-VL ohne Verwendung einer Linkersequenz führt zur Ausbildung von Trimeren.Derivative. The direct fusion of V H -V L without the use of a linker sequence leads to the formation of trimers.
Bei den vom Fachmann als Mini-Antikörper bezeichneten Fragmenten, die eine bi-, tri- oder tetravalente Struktur haben, handelt es sich ebenfalls um Derivate von scFv-Fragmenten. Die Multimerisierung wird dabei über di-, tri- oder tetramere „coiled coil"-Strukturen erzielt.The fragments designated by the skilled person as mini-antibodies, which have a bi-, tri- or tetravalent structure, are likewise derivatives of scFv fragments. The multimerization is achieved via di-, tri- or tetrameric "coiled-coil" structures.
Dem Fachmann sind auch Immunglobuline aus Haien und Rochen bekannt, die als IgNAR („new antigen receptor") bezeichnet werden. Diese bilden ein Dimer einer Kette, die aus einer variablen und fünf konstanten Regionen besteht (Flajnik, M. F., Nature Reviews, Immunology 2, 688 - 698, 2002).Also known to those of skill in the art are shark and ray immunoglobulins called "new antigen receptor" (IgNAR), which form a dimer of a chain consisting of one variable and five constant regions (Flajnik, MF, Nature Reviews, Immunology 2 , 688 - 698, 2002).
Zudem sind dem Fachmann auch Antikörper aus Lamas oder anderen Tieren der Familie Camelidae bekannt, die lediglich aus zwei verkürzten schweren Ketten mit jeweils einer variablen und zwei konstanten Domänen bestehen (Hamers- Casterman, C. et al., Nature 363, 446 - 448, 1993). Der Fachmann kennt auch Derivate und Varianten solcher Camelidae-Antikörper, die lediglich aus einer oder mehreren variablen Domänen dieser verkürzten schweren Ketten bestehen. SoI- che Moleküle werden auch als Domänen-Antikörper (domain antibodies) bezeichnet. Einzeldomänen-Antikörper sind auch auf Basis von Sequenzen aus anderen Spezies bekannt, z.B. aus Maus und Mensch, bzw. in humanisierter Form (Holt et al., Trends in Biotechnology 21 (11 ), 484 - 490, 2003,). Varianten dieser Domänen- Antikörper schließen Moleküle ein, die aus mehreren variablen Domänen bestehen und durch Peptidlinker kovalent miteinander verbunden sind. Zur Verlänge- rung der Halbwertszeit im Serum können Domänen-Antikörper auch mit anderen Polypeptideinheiten fusioniert werden, wie z. B. mit dem Fc-Teil von Immunglobulinen oder mit einem im Blutserum vorkommenden Protein wie beispielsweise Albumin.In addition, the expert also antibodies from llamas or other animals of the family Camelidae are known, which consist of only two truncated heavy chains, each with a variable and two constant domains (Hamers-Casterman, C. et al., Nature 363, 446-448, 1993). The skilled person also knows derivatives and variants of such Camelidae antibodies, which consist only of one or more variable domains of these truncated heavy chains. Such molecules are also referred to as domain antibodies. Single domain antibodies are also based on sequences from others Species known, for example from mouse and human, or in humanized form (Holt et al., Trends in Biotechnology 21 (11), 484-490, 2003,). Variants of these domain antibodies include molecules that consist of multiple variable domains and are covalently linked by peptide linkers. To extend serum half-life, domain antibodies may also be fused to other polypeptide units, such as. B. with the Fc portion of immunoglobulins or with a protein occurring in the blood serum such as albumin.
Die Begriffe „helikales Element" und „Helix" werden im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung synonym verwendet. Es handelt sich dabei um eine Aminosäuresequenz von 4 bis 12 Aminosäuren, vorzugsweise 6 bis 12, besonders bevorzugt 8, 9, oder 10 Aminosäuren, die eine Helix ausbilden können.The terms "helical element" and "helix" are used synonymously in the context of the present invention. It is an amino acid sequence of 4 to 12 amino acids, preferably 6 to 12, particularly preferably 8, 9, or 10 amino acids which can form a helix.
Unter „Optimierung" wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Veränderung der Primärstruktur eines Proteins verstanden, durch die die Ausbildungswahrscheinlichkeit eines helikalen Elements in diesem Protein erhöht oder ein helikales Element in diesem Protein geschaffen wird mit dem Ziel, die biophysikalischen Eigenschaften dieses Proteins, insbesondere seine Faltungseffizienz, Stabilität, Löslichkeit und Neigung zu Aggregatbildung (die durch die Optimierung verringert wird), zu verbessern. Eine bevorzugte Methode, die Primärstruktur eines Proteins zu verändern, ist die Mutation seiner Aminosäuresequenz, also der Austausch (Substitution), die Entfernung (Deletion) oder Einfügung (Insertion) mindestens einer Aminosäure. Dies wird normalerweise durch eine entsprechende Ver- änderung der diese Aminosäuresequenz kodierenden Desoxyribonukleinsäure (DNS, engl. DNA) und anschließender Expression dieser (rekombinanten) DNS in einer Wirtszelle erreicht. Dem Fachmann stehen dafür Standardmethoden zur Verfügung.In the context of the present invention, "optimization" is understood to mean a change in the primary structure of a protein which increases the formation probability of a helical element in this protein or creates a helical element in this protein with the aim of improving the biophysical properties of this protein, in particular its folding efficiency, stability, solubility, and propensity for aggregate formation (which is reduced by optimization) A preferred method of altering the primary structure of a protein is the mutation of its amino acid sequence, ie, the replacement (substitution), the removal (deletion This is usually achieved by a corresponding modification of the deoxyribonucleic acid (DNA) coding for this amino acid sequence and subsequent expression of this (recombinant) DNA in a host cell n standard methods are available for this.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunglobulinfaltungs- muster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transplantation der natürlichen oder optimierten, helikalen Elemente erfolgt. Vorzugsweise erfolgt diese Transplantation in Domänen, die über keine oder weniger optimale helikale Elemente verfügen. Unter Transplantation wird in diesem Zusammenhang der Aus- tausch einer Aminosäuresequenz von 4 bis 12 Aminosäuren durch eine gleich lange andere Aminosäuresequenz verstanden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt dabei eine Übertragung eines oder mehrerer helikaler E- lemente aus mindestens einer konstanten Domäne CL, CH2 und/oder CH3 in mindestens eine konstante CH1 Domäne und/oder variable Domäne (VL oder VH).In a further aspect, the invention relates to a biotechnological process for the production of antibodies or proteins which inhibit immunoglobulin folding. have pattern, characterized in that a transplantation of natural or optimized, helical elements takes place. Preferably, this transplantation occurs in domains that have no or less optimal helical elements. In this context, transplantation is understood as meaning the exchange of an amino acid sequence of 4 to 12 amino acids by a different length of the other amino acid sequence. In a particularly preferred embodiment, a transfer of one or more helical ele- ments from at least one constant domain C L , C H 2 and / or C H 3 into at least one constant C H 1 domain and / or variable domain (V L or V H ).
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verbesserung der biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen, die das Immunglobulinfaltungs- muster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Aminosäure in der Ig-Domäne durch eine andere Aminosäure ausgetauscht wird, die die Ausbil- dungswahrscheinlichkeit einer HeNx erhöht. Dabei wird die Ausbildungswahrscheinlichkeit vorzugsweise mit einem Algorithmus berechnet, insbesondere mit dem Algorithmus AGADIR. Bevorzugt befindet sich die ausgetauschte Aminosäure im Bereich zwischen zwei ß-Faltblattsträngen, insbesondere vom Typ A und B o- der E und F. Dabei kann sich die ausgetauschte Aminosäure in einem Bereich be- finden, der bereits eine helikale Struktur aufweist. Ziel einesIn a further aspect, the invention relates to methods for improving the biophysical properties of proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that at least one amino acid in the Ig domain is replaced by another amino acid which increases the formation probability of a HeNx , The training probability is preferably calculated with an algorithm, in particular with the algorithm AGADIR. The exchanged amino acid is preferably located in the region between two β-sheet strands, in particular of the type A and B or E and F. The exchanged amino acid may be present in a region which already has a helical structure. Goal of a
Aminosäureaustausches in einem schon vorhandenen helikalen Element ist dann eine Erhöhung der Helixausbildungswahrscheinlichkeit dieses Elementes. Die He- lixbildung kann beispielsweise dadurch erhöht werden, dass die auszutauschende Aminosäure in der Ig-Domäne Prolin oder Glycin ist, vorzugsweise wenn sie sich mindestens an zweiter Position (i→i+2) nach dem vorangehenden ß-Amino acid exchange in an already existing helical element is then an increase in the helix formation probability of this element. The formation of helix can be increased, for example, by virtue of the fact that the amino acid to be exchanged in the Ig domain is proline or glycine, preferably if it is at least at the second position (i → i + 2) after the preceding β-
Faltblattstrang oder höchstens an vorletzter Position (i→i-2) vor dem nachfolgenden ß-Faltblattstrang befindet. Prolin oder Glycin werden dabei durch eine Aminosäure ersetzt, die weder Prolin noch Glycin ist, vorzugsweise durch Alanin. Eine weitere Möglichkeit ist die Einführung von Salzbrücken dadurch, dass eine Amino- säure, die eine geladene Seitenketten aufweist, so eingeführt wird, dass sie sich im Abstand (i→i+3), (i→i+4) oder (i→i+5)zu einer Aminosäure befindet, die eine Seitenkette mit gegennamiger Ladung aufweist. Gegebenenfalls werden dafür mindestens zwei Aminosäuren eingeführt, die Seitenketten mit gegennamiger Ladung aufweisen, wobei der Abstand zwischen den ausgetauschten Aminosäuren so gewählt wird, dass die Seitenketten eine Salzbrücke ausbilden können. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die ausgetauschten Aminosäuren durch 2 (i→i+3), 3 (i→i+4) oder mehr Aminosäuren voneinander getrennt. Als Aminosäuren mit unter physiologischen Bedingungen negativ geladener Seitenketten können Glutaminsäure oder Asparaginsäure verwendet werden, während Arginin, Lysin, oder Histidin unter solchen Bedingungen positiv geladene Seitenketten auf- weisen. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die Position, an der Arginin, Lysin, oder Histidin eingeführt wird oder gegebenenfalls schon vorhanden ist, näher am C-Terminus als die Position, an der Glutaminsäure oder Asparaginsäure eingeführt wird oder gegebenenfalls schon vorhanden ist. Es kann auch eine doppelte Salzbrücke eingeführt werden, in dem eine Sequenz erzeugt wird, bei der sich 3 Aminosäuren an den Positionen i und i+3, i+4 oder i+5 sowie i+7, i+8 oder i+9 befinden, wobei die Aminosäuren an den Positionen i und i+7, i+8 oder i+9 Seitenketten mit gleichnamiger Ladung aufweisen, die Aminosäure an der Position i+3, i+4 oder i+5 eine dazu gegennamige. Zu diesem Zweck können 3 entsprechende Aminosäuren durch Mutation eingeführt werden, gegebenenfalls auch weniger, wenn schon entsprechende Aminosäuren in der Ausgangssequenz vorhanden sind. In einer solchen doppelten Salzbrücke befindet sich an der mittleren Position i+3, i+4 oder i+5 bevorzugt Asparaginsäure, Glutaminsäure, oder Arginin. Eine bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass das Protein nach dem Austausch ein helikales Element mit der Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8) aus der humanen IgG CH2-Domäne (SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO:15) oder der daraus optimierten Helixsequenz KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), der Sequenz TKDEYERH (SEQ ID NO:10) aus der murinen kappa CL- Domäne (SEQ ID NO:1 ), der Sequenz TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) aus der humanen lambda CL-Domäne (SEQ ID NO:13) oder der Sequenz SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ) aus der humanen kappa CL-Domäne (SEQ ID NO:12) enthält. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Transplantation geeigneter helikaler Elemente in Domänen, die über keine oder weniger optimale helikale Elemente verfügen, wie beispielsweise die Ig-Domäne des beta2- Mikroglobulins (SEQ ID NO:3), die variablen Domänen (VL, VH) oder die konstante Domäne CH1 von Immunglobulinen. Die transplantierten Elemente können dabei beispielsweise aus den konstanten Immunglobulindomänen CL, CH2 oder CH3 stammen oder nach erfindungsgemäßen Verfahren optimierte Varianten solcher Elemente sein. Die Transplantation erfolgt vorzugsweise durch ein Verfahren, bei dem 4 bis 12 aufeinander folgende Aminosäuren (vorzugsweise etwa 10 Amino- säuren) durch eine Aminosäuresequenz gleicher Länge oder größerer Länge ausgetauscht werden, wobei die eingeführte Aminosäuresequenz eine höhere Ausbildungswahrscheinlichkeit einer HeNx aufweist als die ausgetauschte Sequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die eingeführte Sequenz ein he- likales Element aus dem Bereich zwischen den ß-Faltblattsträngen A und B und/oder E und F einer CL- oder CH-Domäne eines Immunglobulins. Geeignete helikale Elemente haben beispielsweise die Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) aus der humanen IgG CH2-Domäne (SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO:15) oder die daraus optimierten Helixsequenz KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), die Sequenz TKDEYERH (SEQ ID NO:10) aus der murinen kappa CL- Domäne (SEQ ID NO:1 ), die Sequenz TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) aus der humanen lambda CL-Domäne (SEQ ID NO:13) oder die Sequenz SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ) aus der humanen kappa CL-Domäne (SEQ ID NO:12).Or at least at the penultimate position (i → i-2) in front of the following β-sheet strand. Proline or glycine are replaced by an amino acid which is neither proline nor glycine, preferably alanine. Another possibility is the introduction of salt bridges in that an amino acid having a charged side chain is introduced so that they are separated by (i → i + 3), (i → i + 4) or (i → i + 5) to an amino acid containing a Side chain with counter charge has. If appropriate, at least two amino acids are introduced for this purpose which have side chains with a charge of the same name, the distance between the exchanged amino acids being selected so that the side chains can form a salt bridge. In a preferred embodiment, the exchanged amino acids are separated from each other by 2 (i → i + 3), 3 (i → i + 4) or more amino acids. As amino acids with negatively charged side chains under physiological conditions, glutamic acid or aspartic acid can be used, while arginine, lysine, or histidine have positively charged side chains under such conditions. In a preferred embodiment, the position at which arginine, lysine, or histidine is introduced, or optionally already present, is closer to the C-terminus than the position at which glutamic acid or aspartic acid is introduced or may already be present. It is also possible to introduce a double salt bridge in which a sequence is generated in which 3 amino acids are located at positions i and i + 3, i + 4 or i + 5 and i + 7, i + 8 or i + 9 in which the amino acids at the positions i and i + 7, i + 8 or i + 9 have side chains with the same charge, the amino acid at the position i + 3, i + 4 or i + 5 has a counterpart thereto. For this purpose, 3 corresponding amino acids can be introduced by mutation, if appropriate also less, if corresponding amino acids are already present in the starting sequence. In such a double salt bridge is located at the middle position i + 3, i + 4 or i + 5 preferably aspartic acid, glutamic acid, or arginine. A preferred embodiment is characterized in that the protein after replacement of a helical element with the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) from the human IgG C H 2 domain (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15) or the helix sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9) optimized therefrom, the sequence TKDEYERH (SEQ ID NO: 10) from the murine kappa C L domain (SEQ ID NO: 1), the sequence TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) from the human lambda C L domain (SEQ ID NO: 13) or the sequence SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11) from the human kappa C L domain (SEQ ID NO: 12). In a further aspect, the present invention relates to the transplantation of suitable helical elements into domains having no or less optimal helical elements, such as the Ig domain of the beta2 microglobulin (SEQ ID NO: 3), the variable domains (V L , V H ) or the constant domain C H 1 of immunoglobulins. The transplanted elements may originate, for example, from the constant immunoglobulin domains C L , C H 2 or C H 3 or be variants of such elements optimized according to the method of the invention. The transplantation is preferably carried out by a method in which 4 to 12 consecutive amino acids (preferably about 10 amino acids) are replaced by an amino acid sequence of equal length or greater length, wherein the introduced amino acid sequence has a higher formation probability of HeNx than the exchanged sequence. In a preferred embodiment, the introduced sequence is a helical element from the region between the β-sheet strands A and B and / or E and F of a C L or CH domain of an immunoglobulin. Suitable helical elements have, for example, the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) from the human IgG C H 2 domain (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15) or the optimized helix sequence KAEDTLHISR (FIG. SEQ ID NO: 9), the sequence TKDEYERH (SEQ ID NO: 10) from the murine kappa C L domain (SEQ ID NO: 1), the sequence TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) from the human lambda C L - Domain (SEQ ID NO: 13) or the sequence SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11) from the human kappa C L domain (SEQ ID NO: 12).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Her- Stellung eines Proteins, das ein Immunglobulinfaltungsmuster aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren zur Verbesserung der biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen, die das Immunglobulinfaltungsmuster aufweisen auf ein solches Protein angewendet wird, und das dadurch erhaltene modifizierte Protein in einer Wirtszelle exprimiert wird. Verfahren zur Herstellung von Proteinen durch Expression rekombinanter DNS in Wirtszellen und anschließender Reinigung des gewünschten exprimierten Proteins (Protein von Interesse) sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Insbesondere sind dem Fachmann Verfahren zur Expression von Immunglobulinen in eukaryontischen Wirtszellen, vorzugsweise Säugerzellen, besonders bevorzugt Zelllinien aus dem Ovar des chinesischen Hamsters (Cricetulus griseus, CHO-Zellen) oder Zelllinien aus Myelomzellen der Maus (z.B. NSO-Zellen) bekannt. Bestimmte Antikörperformate wie beispielsweise Domänen-Antikörper lassen sich auch vorteilhaft in pro- karyontischen Wirtszellen (z.B. E. coli) oder Hefezellen herstellen.In a further aspect, the present invention relates to a method for producing a protein having an immunoglobulin folding pattern, characterized in that a method for improving the biophysical properties of proteins having the immunoglobulin folding pattern as described above is applied to such a protein. and the modified protein thus obtained is expressed in a host cell. Process for the production of proteins by expression of recombinant DNA in host cells and subsequent purification of the desired expressed protein (protein of interest) are well known to those skilled in the art. In particular, methods are known to the person skilled in the art for the expression of immunoglobulins in eukaryotic host cells, preferably mammalian cells, particularly preferably Chinese hamster ovary (Cricetulus griseus, CHO) cell lines or mouse myeloma cell lines (eg, NSO cells). Certain antibody formats such as, for example, domain antibodies can also be advantageously produced in prokaryotic host cells (eg E. coli) or yeast cells.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster aufweist, hergestellt mit einem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben. Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen Antikörper, insbesondere um ein komplettes Immunglobulin, enthaltend zwei leichte und zwei schwere Ketten.In a further aspect, the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern prepared by a method of the invention as described above. Preferably, this is an antibody, in particular a complete immunoglobulin containing two light and two heavy chains.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster und mindestens eine variable Domäne (VL oder VH) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein helikales Element in dieser variablen Domäne enthält. Natürlicherweise vorkommende variable Domänen enthalten solche helikalen Elemente nicht und können durch Einführung solcher Elemente in ihren biophysikalischen Eigenschaften verbessert werden. In einer Ausführungsform enthält eine solche variable Domäne ein helikales Element mit einer größeren Helixausbildungswahrscheinlichkeit als jede Aminosäuresequenz gleicher Länge, die natürlicherweise in einer variablen Domäne eines Immunglobulins vorkommt. Als Referenz für solche natürlicherweise vorkommende variable Domänen können hier die variablen Domänen dienen, die in der Datenbank NCBI GenBank unter den Zugangsnummern AAK19936 (IgGI VH) und AAK62672 (IgGI VL) niedergelegt sind. In bevorzugten Ausführungsformen enthält die erfindungsgemäße variable Domäne ein helikales Element mit der Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) oder SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11 ). Besonders bevorzugt befindet sich das helikale Element zwischen den Faltblattsträngen E und F.In a further aspect, the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one variable domain (V L or V H ), characterized in that it contains a helical element in this variable domain. Naturally occurring variable domains do not contain such helical elements and can be improved in their biophysical properties by introducing such elements. In one embodiment, such a variable domain contains a helical element having a greater helix formation probability than any amino acid sequence of equal length naturally occurring in a variable domain of an immunoglobulin. As a reference for such naturally occurring variable domains can serve here the variable domains, which are set down in the database NCBI GenBank under the accession numbers AAK19936 (IgGI VH) and AAK62672 (IgGI VL). In preferred embodiments, the variable domain according to the invention contains a helical element having the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11). Especially Preferably, the helical element is located between the folder strands E and F.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster und mindestens eine konstante Domäne vom Typ CH2 aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein helikales Element in dieser konstanten Domäne enthält, das eine höhere Helixausbildungswahrscheinlichkeit aufweist als ein helikales Element einer natürlicherweise im Menschen vorkommenden CH2-Domäne. Als Referenz für eine solche Domäne kann hier SEQ ID NO: 5 dienen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein solches Protein eine CH2-Domäne, die ein helikales Element mit der Sequenz KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), der Sequenz TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) oder SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ) enthält. Bevorzugt befindet sich das helikale Element dabei zwischen den Faltblattsträngen A und B und/oder E und F der CH2-Domäne.In a further aspect, the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 2, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element of one naturally occurring in humans CH2 domain. As a reference for such a domain can here SEQ ID NO: 5 serve. In a preferred embodiment, such a protein contains a CH2 domain comprising a helical element having the sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), the sequence TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11). The helical element is preferably located between the pleated sheet strands A and B and / or E and F of the CH2 domain.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster und mindestens eine konstante Domäne vom Typ CH1 aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein helikales Element in dieser konstanten Domäne enthält, das eine höhere Helixausbildungswahrscheinlichkeit aufweist als ein helikales Element bzw. jeder Aminosäuresequenz gleicher Länge einer natürlicherweise im Menschen vorkommenden CH1 -Domäne. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein solches Protein eine CH1 -Domäne, die ein helikales Element mit der Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) oder der Sequenz SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ) enthält. Bevorzugt befindet sich das helikale Element dabei zwischen den Faltblattsträngen A und B und/oder E und F der CH1-Domäne.In a further aspect, the present invention relates to a protein which has an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 1, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element or a helical element Each amino acid sequence of the same length of a naturally occurring in the human C H 1 domain. In a preferred embodiment, such a protein contains a C H 1 domain comprising a helical element having the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or the sequence SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11). The helical element is preferably located between the pleated sheet strands A and B and / or E and F of the CH1 domain.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein modifiziertes ß2- Mikroglobulin, das mindestens ein helikales Element in einer Ig-Domäne aufweist, bevorzugt ein helikales Element mit der Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16), oder SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ).In another aspect, the present invention relates to a modified β2-microglobulin having at least one helical element in an Ig domain, preferably a helical element having the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16), or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunoglobulinfaltungsmuster aufweist, das mindestens ein helikales Element in einer Ig-Domäne aufweist, das eine höhere Helixausbildungswahrscheinlichkeit hat als ein helikales Element, das in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:12 bzw. SEQ ID NO: 13 (CL WT) oder SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 bzw. SEQ ID NO: 15 (CH2 WT) enthalten ist. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein solches Protein ein helikales Element mit der Sequenz KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9).In a further aspect, the present invention relates to a protein having an immunoglobulin folding pattern comprising at least one helical element in an Ig domain which has a higher helix formation probability than a helical element present in any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 (C L WT) or SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 (C H 2 WT). In a preferred embodiment, such a protein contains a helical element having the sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, das ein Immunoglobulinfaltungsmuster aufweist, und das die Sequenz SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und/oder SEQ ID NO: 9 enthält.In a further aspect, the present invention relates to a protein which has an immunoglobulin folding pattern and which contains the sequence SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 and / or SEQ ID NO: 9.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein wie vorstehend beschrieben zur medizinischen Verwendung in Therapie oder Diagnostik. Die medizinische Verwendung von Antikörpern und anderen Proteinen mit Ig- Faltungsmustern ist dem Fachmann bekannt und eine Reihe solcher Substanzen ist als Arzneimittel zugelassen (z.B. Rituximab, Trastuzumab, Etanercept). Insbesondere kennt der Fachmann Verfahren, Darreichungsformen solcher Substanzen (beispielsweise physiologisch gepufferte, wässrige Lösungen) herzustellen und solche Arzneimittel bei entsprechender Indikation darzureichen (beispielsweise durch intravenöse Injektion oder Infusion).In another aspect, the present invention relates to a protein as described above for medical use in therapy or diagnostics. The medical use of antibodies and other proteins having Ig folding patterns is known to those skilled in the art and a number of such substances are approved as drugs (e.g., rituximab, trastuzumab, etanercept). In particular, the person skilled in the art knows methods of preparing dosage forms of such substances (for example physiologically buffered, aqueous solutions) and of administering such medicaments with a corresponding indication (for example by intravenous injection or infusion).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Modifizierung der biophysikalischen Eigenschaften von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Optimierung der natürlichen, helikalen Elemente erfolgt. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Modifizierung der biophysikalischen Eigenschaften von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch ge- kennzeichnet, dass eine Transplantation der natürlichen oder optimierten, helika- len Elemente erfolgt, und zwar bevorzugt in Domänen, die über keine oder weniger optimale helikale Elemente verfügen.In a further aspect, the present invention relates to a biotechnological method for modifying the biophysical properties of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that an optimization of the natural, helical elements takes place. In a further aspect, the present invention relates to a biotechnological method for modifying the biophysical properties of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that a transplantation of the natural or optimized helical elements takes place, preferably in domains that have no or less optimal helical elements.
Es folgen weitere Definitionen und Erläuterungen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung von Bedeutung sind:Further definitions and explanations follow, which are important in connection with the present invention:
Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt durch rekombinante Expression in einer Wirtszelle hergestellt. Dabei wird eine Expressionsvektor verwendet, der in die Wirtszelle eingebracht wird. Der Expressionsvektor enthält das „Gen von Interesse", das eine Nukleotidsequenz beliebiger Länge umfasst, die für ein Produkt von Interesse kodiert. Das Genprodukt oder auch „Produkt von Interesse" ist in der Regel ein Protein, Polypeptid, Peptid bzw. Fragment oder Derivat davon. Es kann aber auch RNA oder antisense RNA sein. Das Gen von Interesse kann in voller Länge, in verkürzter Form, als Fusionsgen oder markiertes Gen vor- liegen. Es kann sich um genomische DNA oder vorzugsweise cDNA bzw. entsprechende Fragmente oder Fusionen handeln. Das Gen von Interesse kann die nati- ve Gensequenz darstellen, mutiert oder auf sonstige Weise modifiziert sein. Derartige Modifikationen schließen Kodon-Optimierungen zur Anpassung an eine bestimmte Wirtszelle und eine Humanisierung ein. Das Gen von Interesse kann z.B. für ein sekretiertes, zytoplasmatisches, kernlokalisiertes, membrangebundenes oder zelloberflächen-gebundenes Polypeptid kodieren.The proteins of the present invention are preferably produced by recombinant expression in a host cell. In this case, an expression vector is used, which is introduced into the host cell. The expression vector contains the "gene of interest" which comprises a nucleotide sequence of any length encoding a product of interest The gene product or "product of interest" is typically a protein, polypeptide, peptide or fragment or derivative thereof , It can also be RNA or antisense RNA. The gene of interest may be in full length, in truncated form, as a fusion gene or a labeled gene. It may be genomic DNA or preferably cDNA or corresponding fragments or fusions. The gene of interest may be the native gene sequence, mutated or otherwise modified. Such modifications include codon optimizations for adaptation to a particular host cell and humanization. The gene of interest may e.g. encode a secreted, cytoplasmic, nuclear localized, membrane bound or cell surface bound polypeptide.
Der Ausdruck „Nukleinsäure", „Nukleotidsequenz" oder „Nukleinsäuresequenz" bezeichnet ein Oligonukleotid, Nukleotide, Polynukleotide und deren Fragmente sowie DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die als Einzeloder Doppelstrang vorliegen und den kodierenden oder den nicht-kodierenden Strang eines Gens repräsentieren kann. Zur Modifikation von Nukleinsäurese- quenzen können Standardtechniken, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese, PCR- vermittelte Mutagenese oder de novo Synthese aus Oligonukleotidsequenzen eingesetzt werden.The term "nucleic acid", "nucleotide sequence" or "nucleic acid sequence" refers to an oligonucleotide, nucleotides, polynucleotides and fragments thereof, and DNA or RNA of genomic or synthetic origin which are present as a single or double strand and the coding or the non-coding Strand of a gene can represent. For modification of nucleic acid sequences standard techniques, such as site-specific mutagenesis, PCR-mediated mutagenesis or de novo synthesis of oligonucleotide sequences can be used.
Biopharmazeutisch bedeutsame Proteine/Polypeptide im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfassen z.B. Antikörper bzw. Immunglobuline und andere Proteine mit Immunglobulin-Faltungsmuster, z.B. Mitglieder der Immunglobulin- Superfamilie, sowie deren Derivate bzw. Fragmente. Im Allgemeinen sind dies Substanzen, die als Agonisten oder Antagonisten wirken und/oder therapeutische oder diagnostische Anwendung finden können.Biopharmaceutically significant proteins / polypeptides in the context of the present invention include e.g. Antibodies or immunoglobulins and other proteins having immunoglobulin folding patterns, e.g. Members of the immunoglobulin superfamily, as well as their derivatives or fragments. In general, these are substances that act as agonists or antagonists and / or can find therapeutic or diagnostic use.
Der Ausdruck „Polypeptide" oder „Proteine" wird für Aminosäuresequenzen oder Proteine verwendet und bezeichnet Polymere von Aminosäuren beliebiger Länge. Dieser Ausdruck schließt auch Proteine ein, die posttranslational durch Reaktionen wie beispielsweise Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung oder Pro- teinprozessierung modifiziert werden. Die Struktur des Polypeptids kann z.B. durch Substitutionen, Deletionen oder Insertion von Aminosäuren, Fusion mit anderen Proteinen, wie beispielsweise mit dem Fc-Teil von Immunglobulinen, unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität modifiziert werden. Zudem können die Polypeptide multimehsieren und Homo- und Heteromere bilden.The term "polypeptides" or "proteins" is used for amino acid sequences or proteins and refers to polymers of amino acids of any length. This term also includes proteins that are post-translationally modified by reactions such as glycosylation, phosphorylation, acetylation, or protein processing. The structure of the polypeptide may be e.g. by substitutions, deletions or insertion of amino acids, fusion with other proteins, such as the Fc portion of immunoglobulins, while retaining its biological activity. In addition, the polypeptides can multimerize and form homo- and heteromers.
Die Herstellung von Expressionsvektoren kann grundsätzlich nach herkömmlichen, dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen. Dort findet sich auch eine Beschreibung der funktionellen Komponenten eines Vektors, z.B. geeigneter Promotoren, Enhancer, Terminations- und Polyadenylierungssignale, Antibiotikare- sistenzgene, Selektionsmarker, Replikationsstartpunkte und Spleisssignale. Zur Herstellung können herkömmliche Klonierungsvektoren verwendet werden, z.B. Plasmide, Bakteriophagen, Phagemide, Cosmide oder virale Vektoren wie Bacu- lovirus, Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren und Herpes Simplex- Virus, aber auch künstliche oder artifizielle oder Mini-Chromosomen. Die eukary- ontischen Expressionsvektoren enthalten typischerweise auch prokaryontische Sequenzen wie z.B. Replikationsursprung und Antibiotikaresistenzgene, die die Vermehrung und Selektion des Vektors in Bakterien ermöglichen. Eine Vielzahl von eukaryontischen und prokaryontischen Expressionsvektoren, die multiple KIo- nierungsstellen zur Einführung einer Polynukleotidsequenz enthalten, sind bekannt und einige sind kommerziell bei verschiedenen Firmen wie Stratagene, La JoIIa, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, Wl, USA oder BD Biosciences Clontech, PaIo Alto, CA, USA erhältlich.The production of expression vectors can in principle be carried out by conventional methods familiar to the person skilled in the art. There is also a description of the functional components of a vector, eg suitable promoters, enhancers, termination and polyadenylation signals, antibiotic resistance genes, selection markers, origins of replication and splice signals. Conventional cloning vectors can be used for the production, for example plasmids, bacteriophages, phagemids, cosmids or viral vectors such as baculovirus, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses and herpes simplex virus, but also artificial or artificial or mini-chromosomes. The eukary Ontic expression vectors also typically contain prokaryotic sequences, such as origin of replication, and antibiotic resistance genes, which allow multiplication and selection of the vector in bacteria. A variety of eukaryotic and prokaryotic expression vectors containing multiple cloning sites for introducing a polynucleotide sequence are known and some are commercially available from various companies such as Stratagene, La JoIIa, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, WI, USA or BD Biosciences Clontech, Paolo Alto, CA, USA.
Eukaryontische oder prokaryontische Wirtszellen werden mit geeigneten Expressionsvektoren transfiziert bzw. transformiert. Als eukaryontische Wirtszellen werden vorzugsweise Hefezellen und Säugerzellen verwendet. Bei ersteren insbesondere Kluyveromyces, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris und Hanse- nula, bei letzteren insbesondere Nagerzellen wie z.B. Mäuse-, Ratten- und Hams- ter-Zelllinien. Als prokaryontische Wirtszellen werden vorzugsweise Bakterien, insbesonedere Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas (P. aeruginosa, P. putida) , Streptomyces, Schizosaccharomyces, Lactococcus lactis, Salmonella typhimurium und Agrobacterium tumefaciens, wobei Escherichia coli besonders bevorzugt ist verwendet. Die erfolgreiche Transfektion bzw. Transformation der entsprechenden Zellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor resultiert in transformierten, genetisch modifizierten, rekombinanten oder transgenen Zellen, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.Eukaryotic or prokaryotic host cells are transfected or transformed with suitable expression vectors. As eukaryotic host cells, yeast cells and mammalian cells are preferably used. In the case of the former, in particular Kluyveromyces, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris and Hanse-nula, in the latter case in particular rodent cells, such as e.g. Mouse, rat and Hamster cell lines. Preferred prokaryotic host cells are bacteria, more particularly Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas (P. aeruginosa, P. putida), Streptomyces, Schizosaccharomyces, Lactococcus lactis, Salmonella typhimurium and Agrobacterium tumefaciens, with Escherichia coli being particularly preferred. Successful transfection or transformation of the corresponding cells with an expression vector according to the invention results in transformed, genetically modified, recombinant or transgenic cells, which are likewise the subject of the present invention.
Im Rahmen der Erfindung bevorzugte eukaryontische Wirtszellen sind Hamster- zellen wie z.B. BHK21 , BHK TK", CHO, CHO-K1 , CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 und CHO-DG44 Zellen oder Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien. Besonders bevorzugt sind CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 und BHK21 Zellen, insbesondere CHO-DG44 und CHO-DUKX Zellen. Ebenfalls geeignet sind Myelomzellen der Maus, vorzugsweise NSO und Sp2/0 Zellen sowie Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien. Aber auch Derivate und Abkömmlinge dieser Zellen, andere Säugerzellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Zelllinien von Mensch, Maus, Ratte, Affen, Nagetieren, oder eukaryontische Zellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hefe-, Insekten- , Vogel- und Pflanzenzellen, können ebenfalls als Wirtszellen zur Produktion von biopharmazeutischen Proteinen verwendet werden.Preferred eukaryotic host cells within the scope of the invention are hamster cells such as BHK21, BHK TK " , CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 and CHO-DG44 cells or derivatives / derivatives of these cell lines. DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 and BHK21 cells, in particular CHO-DG44 and CHO-DUKX cells Also suitable are mouse myeloma cells, preferably NSO and Sp2 / 0 cells and derivatives / derivatives of these cell lines, but also derivatives and derivatives thereof Cells, other mammalian cells, including but not limited to human, mouse, rat Monkeys, rodents, or eukaryotic cells, including, but not limited to, yeast, insect, avian, and plant cells, may also be used as host cells for the production of biopharmaceutical proteins.
Die Transfektion der eukaryontischen Wirtszellen mit einem Polynukleotid oder einem der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren, erfolgt nach üblichen Methoden. Geeignete Transfektionsmethoden sind z.B. die Liposomen-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Copräzipitation, Elektroporation, Polykationen (z.B. DEAE-Dextran)-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Mikroinjektion und virale Infektionen.Transfection of the eukaryotic host cells with a polynucleotide or one of the expression vectors according to the invention is carried out by customary methods. Suitable transfection methods are e.g. liposome-mediated transfection, calcium phosphate co-precipitation, electroporation, polycation (e.g., DEAE-dextran) -mediated transfection, protoplast fusion, microinjection, and viral infections.
Die Transformation von prokaryontischen Wirtszellen mit einem Polynukleotid oder einem der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren erfolgt nach üblichen Methoden. Geeignete Methoden sind z. B. Elektroporation, chemische Behandlung der Zellen mit beispielsweise Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Manganchlorid, Po- lyetyhlenglykol oder Dimethylsulfoxid, Bakteriophagen-TransduktionThe transformation of prokaryotic host cells with a polynucleotide or one of the expression vectors according to the invention is carried out by customary methods. Suitable methods are for. As electroporation, chemical treatment of cells with, for example, calcium chloride, magnesium chloride, manganese chloride, polyetyhlenglykol or dimethyl sulfoxide, bacteriophage transduction
Erfindungsgemäß wird vorzugsweise eine stabile Transfektion durchgeführt, wobei die Konstrukte entweder in das Genom der Wirtszelle oder ein artifizielles Chro- mosom/Minichromosom integriert werden oder in stabiler Weise episomal in der Wirtszelle enthalten sind. Die Transfektionsmethode, die die optimale Transfekti- onsfrequenz und Expression des heterologen Gens in der jeweiligen Wirtszelle ermöglicht, ist dabei bevorzugt.Preferably, according to the present invention, a stable transfection is performed wherein the constructs are integrated into either the genome of the host cell or an artificial chromosome / minichromosome or are stably episomally contained in the host cell. The transfection method, which enables the optimal transfection frequency and expression of the heterologous gene in the respective host cell, is preferred.
Die eukaryontischen Wirtszellen werden vorzugsweise unter serumfreien Bedingungen etabliert, adaptiert und kultiviert, gegebenenfalls in Medien, die frei von tierischen Proteinen /Peptiden sind. Beispiele für im Handel erhältliche Medien sind Harn 's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Mo- dified Eagle's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), serumfreies CHO-Medium (Sig- ma), proteinfreies CHO-Medium (Sigma), YM (Sigma), YPD (Invitrogen) und synthetische „Drop-out" Hefemedien (Sigma). Jedes dieser Medien kann gegebenenfalls mit verschiedenen Verbindungen ergänzt werden, z.B. Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (z.B. Insulin, Transferrin, epidermalem Wachstums- faktor, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor), Salzen (z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium, Phosphat), Puffern (z.B. HEPES), Nukleosiden (z.B. Adenosin, Thy- midin), Glutamin, Glukose oder anderen äquivalenten Nährstoffen, Antibiotika und/oder Spurenelementen. Obwohl erfindungsgemäß serumfreie Medien bevorzugt sind, können zur Züchtung der Wirtszellen auch Medien verwendet werden, die mit einer geeigneten Menge an Serum versetzt wurden.The eukaryotic host cells are preferably established under serum-free conditions, adapted and cultured, optionally in media that are free of animal proteins / peptides. Examples of commercially available media are Harn 's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma). , Iscove 's Modified Dulbecco 's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), serum-free CHO medium (Sigma). ma), protein-free CHO medium (Sigma), YM (Sigma), YPD (Invitrogen) and synthetic "drop-out" yeast media (Sigma) Each of these media may optionally be supplemented with various compounds, eg, hormones and / or other growth factors (eg insulin, transferrin, epidermal growth factor, insulin-like growth factor), salts (eg sodium chloride, calcium, magnesium, phosphate), buffers (eg HEPES), nucleosides (eg adenosine, thymidine), glutamine, glucose or others Equivalent nutrients, antibiotics and / or trace elements Although serum-free media are preferred according to the invention, media which have been supplemented with an appropriate amount of serum may also be used to culture the host cells.
Für die Kultivierung von prokaryontischen Wirtszellen sind zahlreiche Medien bekannt, die auch im Handel erhältlich sind. Beispiele hierfür sind LB-, TB-, M9-, SOC-, YT- und NZ-Medien (Sigma).For the cultivation of prokaryotic host cells numerous media are known, which are also commercially available. Examples include LB, TB, M9, SOC, YT and NZ media (Sigma).
Zur Selektion von genetisch modifizierten Zellen, die ein oder mehrere Selekti- onsmarkergene exprimieren, wird dem Medium ein oder mehrere geeignete Selektionsmittel zugefügt bzw. geeignete „Drop-out" Medien verwendet, denen für das Wachstum essentielle Zusätze wie beispielsweise Aminosäuren oder Nukleotide fehlen.For the selection of genetically modified cells which express one or more selectable marker genes, one or more suitable selection agents are added to the medium or suitable "drop-out" media are used which lack essential additives such as amino acids or nucleotides for growth.
Genexpression und Selektion hoch produzierender Wirtszellen: Der Ausdruck „Genexpression" oder „Expression" bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation einer heterologen Gensequenz in einer Wirtszelle. Die Expressionsra- te kann hierbei allgemein bestimmt werden, entweder auf Basis der Menge der entsprechenden mRNA, die in der Wirtszelle vorhanden ist, oder auf Basis der produzierten Menge an Genprodukt, das von dem Gen von Interesse kodiert wird. Die Menge der durch Transkription einer ausgewählten Nukleotidsequenz erzeugten mRNA kann beispielsweise durch Northern Blot Hybridisierung, Ribonuklease- RNA-Protektion, in situ Hybridisierung von zellulärer RNA oder durch PCR-Gene Expression and Selection of High Producing Host Cells: The term "gene expression" or "expression" refers to the transcription and / or translation of a heterologous gene sequence in a host cell. The expression rate can be generally determined either on the basis of the amount of the corresponding mRNA present in the host cell or on the basis of the amount of gene product produced which is encoded by the gene of interest. The amount of mRNA generated by transcription of a selected nucleotide sequence can be determined, for example, by Northern blot hybridization, ribonuclease RNA protection, in situ hybridization of cellular RNA or by PCR.
Methoden (z.B. quantitativer PCR) bestimmt werden. Proteine, die von einer aus- gewählten Nukleotidsequenz kodiert werden, können ebenfalls durch verschiedene Methoden, wie z.B. durch ELISA, Protein A HPLC, Western Blot, Radioimmu- nassay, Immunpräzipitation, Nachweis der biologischen Aktivität des Proteins, Immunfärbung des Proteins mit nachfolgender FACS-Analyse oder Fluoreszenz- mikroskopie, direkte Detektion eines fluoreszierenden Proteins mittel FACS- Analyse oder durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden.Methods (eg quantitative PCR) can be determined. Proteins released from a nucleotide sequence can also be by various methods, such as by ELISA, protein A HPLC, Western blot, radioimmunoassay, immunoprecipitation, detection of the biological activity of the protein, immunostaining of the protein with subsequent FACS analysis or fluorescence microscopy, direct Detection of a fluorescent protein can be determined by FACS analysis or by fluorescence microscopy.
In einem weiteren Aspekt werden die erfindungsgemäßen Proteine hergestellt in einem Verfahren, bei dem Produktionszellen vermehrt und zur Herstellung des kodierenden Genprodukts von Interesse verwendet werden. Hierzu werden die selektionierten hoch produzierenden Zellen vorzugsweise in einem serumfreien Kulturmedium und vorzugsweise in Suspensionskultur unter Bedingungen gezüchtet, die eine Expression des Gens von Interesse erlauben. Das Protein/Produkt von Interesse wird dabei vorzugsweise als sekretiertes Genprodukt aus dem ZeII- kulturmedium gewonnen. Bei Expression des Proteins ohne Sekretionssignal kann das Genprodukt aber auch aus Zelllysaten isoliert werden. Um ein reines, homogenes Produkt zu erhalten, das im Wesentlichen frei ist von anderen rekombinan- ten Proteinen und Wirtszellproteinen, werden übliche Reinigungsschritte durchgeführt. Hierzu entfernt man häufig zunächst Zellen und Zelltrümmer aus dem KuI- turmedium oder Lysat. Das gewünschte Genprodukt kann dann von kontaminierenden löslichen Proteinen, Polypeptiden und Nukleinsäuren befreit werden, z.B. durch Fraktionierung an Immunaffinitäts- und lonenaustauschsäulen, Ethanolfäl- lung, Umkehrphasen-HPLC oder Chromatographie an Sephadex, Silica oder Kationenaustauscherharzen wie DEAE. Methoden, die zur Reinigung eines von re- kombinanten Wirtszellen exprimierten heterologen Proteins führen, sind dem Fachmann bekannt und sind in der Literatur beschrieben.In a further aspect, the proteins of the invention are prepared in a process in which production cells are propagated and used to produce the coding gene product of interest. For this, the selected high producing cells are preferably cultured in a serum-free culture medium and preferably in suspension culture under conditions which allow expression of the gene of interest. The protein / product of interest is preferably obtained as a secreted gene product from the cell culture medium. However, upon expression of the protein without secretion signal, the gene product can also be isolated from cell lysates. In order to obtain a pure, homogeneous product which is substantially free of other recombinant proteins and host cell proteins, usual purification steps are carried out. To do this, one often first removes cells and cell debris from the culture medium or lysate. The desired gene product may then be released from contaminating soluble proteins, polypeptides and nucleic acids, e.g. by fractionation on immunoaffinity and ion exchange columns, ethanol precipitation, reverse phase HPLC or chromatography on Sephadex, silica or cation exchange resins such as DEAE. Methods which lead to the purification of a heterologous protein expressed by recombinant host cells are known to the person skilled in the art and are described in the literature.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand nicht-beschränkender Ausführungsbeispiele näher erläutert. BEISPIELEIn the following the invention will be explained in more detail by way of non-limiting embodiments. EXAMPLES
ABKÜRZUNGENABBREVIATIONS
AFM: atomic force microscopy ß2m: beta2-Mikroglobulin bp: BasenpaarAFM: atomic force microscopy ß 2 m: beta2-microglobulin bp: base pair
CD: circular dichroismCD: circular dichroism
CH2: zweite konstante Domäne einer schweren Ig-C H 2: second constant domain of a severe Ig
Kette CHO: Chinese Hamster Ovary CL: konstante Domäne einer leichten Ig-KetteChain CHO: Chinese Hamster Ovary C L : constant domain of a light Ig chain
DHFR: Dihydrofolat-Reduktase E. coli: Escherichia coli EDTA: Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure ELISA: enzyme-linked immunosorbant assay FUV: Fern-Ultraviolett GdmCI: Guanidin Hydrochlorid GSH: Glutathion GSSG: Glutathiondisulfid HSQC: heteronuclear Single quantum coherence HC: heavy chain HT: Hypoxanthin/Thymidin ig: ImmunglobulinDHFR: dihydrofolate reductase E. coli: Escherichia coli EDTA: ethylenediamine-N, N, N ', N' tetraacetic acid ELISA: enzyme-linked immunosorbant assay FUV: far ultraviolet GdmCl: guanidine hydrochloride GSH: glutathione GSSG: glutathione disulfide HSQC: heteronuclear single quantum coherence HC: heavy chain HT: hypoxanthine / thymidine ig: immunoglobulin
IgG: Immunglobulin G kb: Kilobase LC: light chain mAk: monoklonaler Antikörper MD: molecular dynamics MTX: Methotrexat NMR: nuclear magnetic resonance NPT: Neomycin-Phosphotransferase NUV: Nah-UltraviolettIgG: immunoglobulin G kb: kilobase LC: light chain mAb: monoclonal antibody MD: molecular dynamics MTX: methotrexate NMR: nuclear magnetic resonance NPT: neomycin phosphotransferase NUV: near-ultraviolet
PCR: Polymerase chain reactionPCR: Polymerase chain reaction
SEAP: secreted alkaline PhosphataseSEAP: secreted alkaline phosphatase
WT: WildtypWT: wild type
METHODENMETHODS
Proteinherstellung in Bakterien und ReinigungProtein production in bacteria and purification
Zur Expression der Proteine werden die rekombinanten E.co//-Bakterien BL21 DE3 (Stratagene, CA, USA) über Nacht in selektivem LB-Medium bei 37°C und 300 rpm in Schüttelkolben kultiviert. Zur Herstellung von Isotopen-markierten Proteine für NMR-Messungen werden die rekombinanten Bakterien in M9- Minimalmedium (Sigma) mit 15N-Ammoniumchlohd als einzige Stickstoffquelle bzw. ggf. zusätzlich 13C-Glucose als einzige Kohlenstoffquelle kultiviert.For expression of the proteins, the recombinant E. coli bacteria BL21 DE3 (Stratagene, CA, USA) are cultured overnight in selective LB medium at 37 ° C. and 300 rpm in shake flasks. For the production of isotope-labeled proteins for NMR measurements, the recombinant bacteria are cultured in M9 minimal medium (Sigma) with 15 N ammonium chlorohd as sole nitrogen source or optionally additionally 13 C-glucose as sole carbon source.
Anschließend werden die „inclusion bodies" isoliert. Hierzu werden die Bakterien abzentrifugiert und in 100 mM Tris/HCI, pH 7,5, 10 mM EDTA, 100 mM NaCI, Pro- teaseinhibitor resuspendiert. Die Zellen werden in einer French Press aufgeschlossen, mit 2% v/v Triton X-100 versetzt und 30 min bei 4°C gerührt. Durch Zentrifugation (20.000 rpm, 30min) werden die „inclusion bodies" als Pellet isoliert und anschließend zweimal in 100 mM Tris/HCI, pH 7,5, 10 mM EDTA, 100 mM NaCI, Proteaseinhibitor resuspendiert und jeweils wieder abzentrifugiert (20.000 rpm, 30min). Für die Proteine ß2m WT (SEQ ID NO: 3), ß2m to CL (SEQ ID NO:4), CH2 WT (SEQ ID NO: 5) und CH2 Helixi -Mutante (SEQ ID NO: 6) wird das „inclusion body"-Pellet nun in 100 mM Tris/HCI, pH 8,0, 10 mM EDTA, 8 MThe inclusion bodies are then isolated by centrifuging off the bacteria and resuspending in 100 mM Tris / HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, protease inhibitor, the cells are disrupted in a French press, with 2% v / v of Triton X-100 and stirred for 30 min at 4 ° C. Centrifugation (20,000 rpm, 30 min) isolates the inclusion bodies as pellets and then twice in 100 mM Tris / HCl, pH 7.5 , 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, protease inhibitor and in each case centrifuged off again (20,000 rpm, 30 min). For the proteins β 2 m WT (SEQ ID NO: 3), β 2 m to C L (SEQ ID NO: 4), C H 2 WT (SEQ ID NO: 5) and C H 2 Helixi mutant (SEQ ID NO: 6), the inclusion body pellet is now in 100 mM Tris / HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 8 M
Harnstoff resuspendiert und auf eine Q-Sepharose Säule aufgetragen, welche in 100 mM Tris/HCI, pH 8,0, 10 mM EDTA, 5 M Harnstoff äquilibriert wurde. Alle Proteine befinden sich jeweils im Durchlauf und werden über Nacht in 250 mM Tris/HCI, pH 8,0, 100 mM Arginin, 10 mM EDTA, 1 mM GSSG, 0,5 mM GSH bei 4°C mittels Dialyse zurückgefaltet. Anschließend wird das Protein aufkonzentriert und final über eine in PBS äquilibrierte Superdex75pg Gelfiltrationssäule gereinigt. Für die Reinigung der Proteine CL WT (SEQ ID NO: 1 ), CL P35A (SEQ ID NO: 7) und CL to ß2im (SEQ ID NO:2), die einen N-terminalen His-Tag enthalten, werden die "inclusion bodies" in 100 mM Natriumphosphat (pH 7,5), 6 M GdmCI, 20 mM ß -Mercaptoethanol für zwei Stunden bei 200C solubilisiert. UnlöslicheUrea and applied to a Q-sepharose column equilibrated in 100 mM Tris / HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 5 M urea. All proteins are in the run and are refolded overnight in 250 mM Tris / HCl, pH 8.0, 100 mM arginine, 10 mM EDTA, 1 mM GSSG, 0.5 mM GSH at 4 ° C by dialysis. The protein is then concentrated and finally purified on a Superdex75pg gel filtration column equilibrated in PBS. For the purification of the proteins C L WT (SEQ ID NO: 1), C L P35A (SEQ ID NO: 7) and C L to β 2 im (SEQ ID NO: 2), which contain an N-terminal His tag , the "inclusion bodies" in 100 mM sodium phosphate (pH 7.5), 6 M GdmCl, 20 mM ß-mercaptoethanol solubilized for two hours at 20 0 C. insoluble
Komponenten werden danach durch Zentrifugation entfernt (48000g, 25 min, 200C). Der Überstand wird fünffach in 50 mM Natriumphosphat (pH 7,5), 4 M GdmCI verdünnt und auf eine Nickelchelatsäule (Ni-NTA, Qiagen) aufgetragen. Nach Waschen mit fünf Säulenvolumen erfolgt die Elution mit 50 mM Natriumphosphat (pH 4), 4 M GdmCI. Die Rückfaltung mittels Dialyse erfolgt in 250 mM Tris/HCI, pH 8,0, 5 mM EDTA, 1 mM oxidiertem Glutathion bei 4°C über Nacht. Aggregate werden durch Zentrifugation (48000g, 25 min, 4°C) entfernt. Zur Entfernung des N-terminalen His-Tags werden 0,25 Units Thrombin (Novagen) für 16 Stunden bei 4°C pro Milligramm Protein zugegeben. Nach wiederholter Zentri- fugation werden die Proteine final über eine in 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5), 100 mM NaCI, 1 mM EDTA äquilibrierte Superdex75pg Gelfiltrationssäule gereinigt.Components are then removed by centrifugation (48000g, 25 min, 20 0 C). The supernatant is diluted fivefold in 50 mM sodium phosphate (pH 7.5), 4 M GdmCl and applied to a nickel chelate column (Ni-NTA, Qiagen). After washing with five column volumes, elution is carried out with 50 mM sodium phosphate (pH 4), 4 M GdmCl. The refolding by dialysis is carried out in 250 mM Tris / HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 1 mM oxidized glutathione at 4 ° C overnight. Aggregates are removed by centrifugation (48000g, 25 min, 4 ° C). To remove the N-terminal His tag, 0.25 units of thrombin (Novagen) are added for 16 hours at 4 ° C per milligram of protein. After repeated centrifugation, the proteins are finally purified over a Superdex75pg gel filtration column equilibrated in 20 mM sodium phosphate (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA.
CD-Spektroskopie CD-Messungen werden in einem Jasco J-715 Spektropolarimeter durchgeführt. Messungen werden bei 200C in PBS durchgeführt.CD spectroscopy CD measurements are performed in a Jasco J-715 spectropolarimeter. Measurements are carried out at 20 ° C. in PBS.
Fern-UV CD Spektren werden von 195-250 nm bei einer Proteinkonzentration von 50 μM in einer 0,2 mm Quartzküvette vermessen, Nah-UV CD-Spektren werden von 250-320 nm bei einer Protein konzentration von 50-100 μM in 5 mm Quartzkü- vetten vermessen. Messungen werden bei 200C in PBS durchgeführt. Spektren werden jeweils 16fach akkumuliert, gemittelt und pufferkorrigiert. Temperaturübergänge werden bei 218 nm (CH2 WT/Mutante) respektive 205 nm (CL, ß2m WT/Mutanten) in PBS bei 10 μM Proteinkonzentration in einer 1 mm Quartzküvet- te.mit einer Heizrate von 20°C/h vermessen. AFM-MessungenRemote UV CD spectra are measured from 195-250 nm at a protein concentration of 50 μM in a 0.2 mm quartz cuvette, near-UV CD spectra are measured from 250-320 nm at a protein concentration of 50-100 μM in 5 mm Measure quartz cuvettes. Measurements are carried out at 20 ° C. in PBS. Spectra are accumulated 16 times each, averaged and buffer corrected. Temperature transitions are measured at 218 nm (C H 2 WT / mutant) or 205 nm (C L , β 2 m WT / mutants) in PBS at 10 μM protein concentration in a 1 mm quartz cuvette at a heating rate of 20 ° C / h. AFM measurements
Für Fibrillisationsexperimente wird eine 100 μM Proteinlösung in PBS 1 :1 mit Puffer A (25 mM Natriumacetat, 25 mM Natriumphosphat, pH 1 ,5 oder 2,5) gemischt. Der finale pH-Wert liegt damit bei pH 1 ,5 respektive pH 3,0. Die Lösung wird für 7 Tage unter leichtem Schwenken bei 37°C inkubiert, anschließend 20 μl_ der Lösung auf frische Mica-Oberflächen aufgetragen, drei Mal mit steril filtriertem Wasser gewaschen und anschließend im AFM analysiert. Es wird der AFM- Kontaktmodus mit einer Scangeschwindigkeit von 1 ,5 μm/min verwendet. Messungen werden an einem Digital Instruments Multimode Scanning Probe Mikro- skop und DNP-S20 Spitzen durchgeführt. „Seeds" werden aus beta2-Mikroglobulin Fibrillen (pH 1 ,5) durch l Ominütige Inkubation im Ultraschallbad generiert. Für „Seeding"-Expehmente werden 2 μl „Seeds" zu 100 μL Ansatz gegeben.For fibrillization experiments, a 100 μM protein solution in PBS 1: 1 is mixed with buffer A (25 mM sodium acetate, 25 mM sodium phosphate, pH 1, 5 or 2.5). The final pH value is thus at pH 1, 5 or pH 3.0. The solution is incubated for 7 days with gentle swirling at 37 ° C., then 20 μl of the solution are applied to fresh mica surfaces, washed three times with sterile filtered water and then analyzed in the AFM. The AFM contact mode with a scanning speed of 1.5 μm / min is used. Measurements are performed on a Digital Instruments Multimode Scanning Probe Microscope and DNP-S20 tips. "Seeds" are generated from beta2-microglobulin fibrils (pH 1, 5) by incubation in an ultrasonic bath for 1 min .. For "seeding" experiments, 2 μl of "seeds" are added to 100 μl of preparation.
NMR-Messungen Alle Spektren werden, so nicht anders erwähnt, bei 25°C in Bruker DMX600, DMX750 und AVANCE900-Spektrometern vermessen. Assignments werden mittels Standard-Tripelresonanzspektren vorgenommen. Für Rückfaltungsexperimen- te und Echtzeit-HSQC Messungen wird CL in 2 M Guadiniumchlorid entfaltet und anschließend 1 :10 mit eiskaltem PBS verdünnt. Die HSQC-Messungen während des Faltungsprozesses werden bei 2°C alle 14 min durchgeführt und mittels SPARKY analysiert.NMR measurements All spectra are measured, unless otherwise stated, at 25 ° C in Bruker DMX600, DMX750 and AVANCE900 spectrometers. Assignments are made using standard triple resonance spectra. For refolding experiments and real-time HSQC measurements, C L is deployed in 2 M guadinium chloride and then diluted 1:10 with ice-cold PBS. The HSQC measurements during the folding process are carried out at 2 ° C every 14 min and analyzed by SPARKY.
GensyntheseGene Synthesis
Der Sequenzbereich für die Wildtyp- CH2-Domäne und -CL-Domäne wird mittels PCR aus einem humanen IgGI -Antikörpergen bzw. der kappa-Kette des murinen Antikörpers MAK33 (Augustine, J. G. et al., J. Biol. Chem. 276 (5), 3287 - 3294, 2001 ) amplifiziert. Die Einführung der P35A-Mutation in die d-Domäne erfolgt ü- ber PCR-Mutagenese unter Verwendung von mutagenen Primern. Zur Expression in E. coli werden die Sequenzbereiche für die CH2-Domäne der helixoptimierten CH2-Mutante, ß2m-WT und die ß2m-Mutante mit der transplantierten d-Helix de novo synthetisiert (www.geneart.com). Für die Expression des kompletten Anti- körpers in CHO-DG44-Zellen erfolgt die Einführung der Helix-Mutationen in die Wildtyp- CH2-Domäne eines IgGI- Antikörpergens über PCR-Mutagenese unter Verwendung von mutagenen Primern.The sequence region for the wild-type CH2 domain and CL domain is determined by PCR from a human IgGI antibody gene or the kappa chain of the murine antibody MAK33 (Augustine, JG et al., J. Biol. Chem. 276 (5 ), 3287-3294, 2001). Introduction of the P35A mutation into the d domain is via PCR mutagenesis using mutagenic primers. For expression in E. coli, the sequence regions for the CH2 domain of the helix-optimized CH2 mutant, ß 2 m WT and the ß 2 m mutant are de novo synthesized with the transplanted d helix (www.geneart.com). For the expression of the complete anti- In CHO-DG44 cells, helix mutations are introduced into the wild-type CH2 domain of an IgGI antibody gene via PCR mutagenesis using mutagenic primers.
Eukaryontische Zellkultur und TransfektionEukaryotic cell culture and transfection
Die Zellen CHO-DG44/dhfr~/~ werden permanent als Suspensionszellen in serumfreiem und mit Hypoxanthin und Thymidin (HT) supplementiertem CHO-S-SFMII Medium (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) in Zellkulturflaschen bei 37°C in feuchter Atmosphäre und 5% CO2 kultiviert. Die Zellzahlen sowie die Viabilität werden mit einem Cedex (Innovatis) bestimmt und die Zellen dann in einer Konzentration von 1 - 3 x105/ml_ eingesät und alle 2 - 3 Tage passagiert.The cells CHO-DG44 / dhfr ~ / ~ are stored permanently as suspension cells in serum-free CHO-S-SFMII medium supplemented with hypoxanthine and thymidine (HT) (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) in cell culture flasks at 37 ° C. in a humid atmosphere and 5 % CO2 cultivated. The cell numbers and the viability are determined with a Cedex (Innovatis) and the cells are then seeded in a concentration of 1 - 3 x10 5 / ml_ and passaged every 2 - 3 days.
Zur Transfektion von CHO-DG44 wird Lipofectamine Plus Reagenz (Invitrogen) eingesetzt. Pro Transfektionsansatz wird dabei insgesamt 1 ,0 - 1 ,1 μg Plasmid- DNA, 4 μl_ Lipofectamine und 6 μl_ Plus-Reagenz nach den Angaben des Herstellers gemischt und in einem Volumen von 200 μl_ zu 6x105 Zellen in 0,8 ml_ HT- supplementiertem CHO-S-SFMII Medium gegeben. Nach dreistündiger Inkubation bei 37°C in einem Zellinkubator erfolgt eine Zugabe von 2 ml_ HT- supplementiertem CHO-S-SFMII Medium. Nach einer Kultivierungszeit von 48 Stunden werden die Transfektionsansätze entweder geerntet (transiente Transfektion) oder einer Selektion unterworfen. Da der eine Expressionsvektor einen DHFR- und der andere einen NPT-Selektionsmarker enthält, werden die co- transfizierten Zellen zur DHFR- und NPT-basierten Selektion 2 Tage nach Transfektion in CHO-S-SFMII Medium ohne Hypoxanthin- und Thymidinzusatz transfe- riert und dem Medium außerdem noch G418 (Invitrogen) in einer Konzentration von 400 μg/mL zugesetzt.For the transfection of CHO-DG44 Lipofectamine Plus reagent (Invitrogen) is used. A total of 1, 0-1 .mu.g of plasmid DNA, 4 .mu.l of lipofectamine and 6 .mu.l plus reagent are mixed per transfection batch according to the manufacturer's instructions and mixed in a volume of 200 .mu.l to 6 × 10 5 cells in 0.8 ml_ HT. supplemented CHO-S-SFMII medium. After incubation for 3 hours at 37 ° C. in a cell incubator, 2 ml of HT-supplemented CHO-S-SFMII medium are added. After a cultivation time of 48 hours, the transfection batches are either harvested (transient transfection) or subjected to selection. Since one expression vector contains one DHFR and the other an NPT selection marker, the cotransfected cells are transfected for DHFR- and NPT-based selection 2 days after transfection into CHO-S-SFMII medium without added hypoxanthine and thymidine G418 (Invitrogen) was also added to the medium in a concentration of 400 μg / ml.
Eine DHFR-basierte Genamplifikation der integrierten heterologen Gene wird durch Zugabe des Selektionsagens MTX (Sigma) in einer Konzentration von 5 - 2000 nM zu einem HT-freien CHO-S-SFMII Medium erreicht. ExpressionsvektorenA DHFR-based gene amplification of the integrated heterologous genes is achieved by adding the selection agent MTX (Sigma) in a concentration of 5-2000 nM to an HT-free CHO-S-SFMII medium. expression vectors
Für die Expression in CHO-DG44 werden eukaryontische Expressionsvektoren eingesetzt, die auf dem pAD-CMV Vektor basieren (Werner, R. G. et al., Arzneimit- tel-Forschung/Drug Research 48, 870 - 880, 1998) und die Expression eines he- terologen Gens über die Kombination CMV Enhancer/CMV Promotor vermitteln. Der erste Vektor pBI-26 enhält das dhfr-Minigen, das als amplifzierbarer Selekti- onsmarker dient. Im zweiten Vektor pBI-49 ist das dhfr-Minigen durch ein NPT- Gen ersetzt. Hierzu wurde der NPT-Selektionsmarker, inklusive SV40 early Promotor und TK-Polyadenylierungssignal, aus dem kommerziellen Plasmid pBK- CMV (Stratagene, La JoIIa, CA, USA) als 1640 bp Bsu36l-Fragment isoliert. Nach einer Auffüllreaktion der Fragmentenden durch Klenow-DNA-Polymerase wurde das Fragment mit dem 3750 bp Bsu36l/Stul-Fragment des ersten Vektors, das ebenfalls mit Klenow-DNA-Polymerase behandelt wurde, ligiert. Nachfolgend wurde das NPT-Gen modifiziert. Es handelt sich dabei um die NPT-Variante F240I (Phe240lle), deren Klonierung in WO2004/050884 beschrieben ist.For expression in CHO-DG44, eukaryotic expression vectors are used which are based on the pAD-CMV vector (Werner, RG et al., Arzneimittel-Forschung / Drug Research 48, 870-880, 1998) and the expression of a terologist gene via the combination CMV enhancer / CMV promoter mediate. The first vector pBI-26 contains the dhfr minigene, which serves as an amplifiable selection marker. In the second vector, pBI-49, the dhfr minigene is replaced by an NPT gene. For this, the NPT selection marker, including SV40 early promoter and TK polyadenylation signal, was isolated from the commercial plasmid pBK-CMV (Stratagene, La JoIIa, CA) as a 1640 bp Bsu36I fragment. After a replenishment reaction of the fragment ends by Klenow DNA polymerase, the fragment was ligated with the 3750 bp Bsu36l / Stul fragment of the first vector, which was also treated with Klenow DNA polymerase. Subsequently, the NPT gene was modified. It is the NPT variant F240I (Phe240lle), whose cloning is described in WO2004 / 050884.
Für die Expression in Escherichia coli BL21 DE3 (Stratagene, CA, USA) wird der Vektor pET28a (Novagen) verwendet.For expression in Escherichia coli BL21 DE3 (Stratagene, CA, USA) the vector pET28a (Novagen) is used.
ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay)ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay)
Die Quantifizierung der exprimierten Antikörper in den Überständen von stabil transfizierten CHO-DG44 Zellen erfolgt mittels ELISA nach Standardprotokollen, wobei zum einen ein Ziege anti Human IgG Fc-Fragment (Dianova, Hamburg, DE) und zum anderen ein AP-konjugierter Ziege anti Human Kappa light chain Anti- körper (Sigma) eingesetzt wird. Als Standard dient gereinigter Antikörper vom jeweils gleichen Isotyp wie die exprimierten Antikörper.The quantification of the expressed antibodies in the supernatants of stably transfected CHO-DG44 cells is carried out by ELISA according to standard protocols, on the one hand a goat anti human IgG Fc fragment (Dianova, Hamburg, DE) and on the other hand an AP-conjugated goat anti human kappa light chain antibody (Sigma) is used. As a standard purified antibody of the same isotype as the expressed antibodies.
SEAP-AssaySEAP assay
Der SEAP-Titer in Kulturüberständen von transient transfizierten CHO-DG44- Zellen wird unter Verwendung des SEAP Reporter Gene Assays nach den Protokollvorgaben des Herstellers quantifiziert (Roche Diagnostics GmbH). ThermoFluorΘ-MethodeThe SEAP titer in culture supernatants of transiently transfected CHO-DG44 cells is quantified using the SEAP Reporter Gene Assay according to the protocol specifications of the manufacturer (Roche Diagnostics GmbH). ThermoFluorΘ method
Um die thermische Stabilität der optimierten Proteine/Immunglobuline zu analysieren, wird ein qPCR-System (Mx3005P™; Stratagene) verwendet, basierend auf der ThermoFluor®-Methode. Dabei wird ein solvatochromischer/ umgebungssensitiver Fluoreszenz-Farbstoff als Indikator von geringen Änderungen in der thermischen Stabilität von Proteinen verwendet. Dieser Fluoreszenz-Farbstoff, welcher eine geringe Quantumausbeute in wässriger Lösung aufweist, interagiert mit hydrophoben, nicht-nativen Strukturen des sich aufgrund Temperaturerhöhung entfal- tenden Proteins. Die Interaktion des Farbstoffs mit bereits entfalteten Protein- Domänen resultiert im signifikanten Anstieg der detektierten Fluoreszenz (Cum- mings M. D. et al., Journal of Biomolecular Screening 854 - 863, 2006).To analyze the thermal stability of the optimized proteins / immunoglobulins, a qPCR system (Mx3005P ™, Stratagene) is used, based on the ThermoFluor® method. A solvatochromic / ambient fluorescence dye is used as an indicator of small changes in the thermal stability of proteins. This fluorescent dye, which has a low quantum yield in aqueous solution, interacts with hydrophobic, non-native structures of the protein which expands due to temperature increase. The interaction of the dye with already unfolded protein domains results in a significant increase in the fluorescence detected (Cummings, M.D. et al., Journal of Biomolecular Screening 854-863, 2006).
Die Messung der Proteinproben in einem Temperaturbereich von 25°C bis 95°C in Intervallen von 1 °C pro Minute erfolgt in einem Volumen von 20 μl_, wobei 2 μM Protein und 4x SyproOrange (aus einer 500Ox SyproOrange-Stammlösung hergestellt; Invitrogen) in dem jeweils zu testenden Puffer eingesetzt werden.The measurement of the protein samples in a temperature range from 25 ° C to 95 ° C at intervals of 1 ° C per minute is carried out in a volume of 20 μl, using 2 μM protein and 4x SyproOrange (prepared from a 500Ox SyproOrange stock solution; Invitrogen) in be used in each case to be tested buffer.
BEISPIEL 1 : PROTOKOLL ZUR VERBESSERUNG DER BIOPHYSIKA-LISCHEN EIGENSCHAFTEN VON IMMUNGLOBULIN-DOMÄNENEXAMPLE 1: Protocol for improving the biophysical properties of immunobulvalene domains
Als erster Schritt gilt es, die helikalen Elemente respektive die korrespondierenden Loops, falls keine Helices vorhanden sind, in der als Ziel der Optimierung zu Grunde gelegten Immunglobulindomäne zu identifizieren. Im Fall konstanter Anti- körperdomänen sind die Helices beispielsweise stets zwischen dem ß-The first step is to identify the helical elements or the corresponding loops, if no helices are present, in the immunoglobulin domain used as the target of the optimization. For example, in the case of constant antibody domains, the helices are always between the
Faltblattstrang A und B sowie E und F (Abbildung 4) lokalisiert. Nach Identifizierung dieser Bereiche erfolgt die Optimierung nach folgendem Schema:Leaflet A and B and E and F (Figure 4). After identifying these areas, the optimization is carried out according to the following scheme:
1. Alle Prolin- und/oder Glycinreste werden durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Alanin, ersetzt (wenn kein Konflikt mit dem zu priorisierenden1. All proline and / or glycine residues are replaced by another amino acid, preferably alanine (if not in conflict with the one to be prioritized)
Punkt 2 auftritt). Die Ersetzung wird nur vorgenommen, wenn es sich bei dem zu ersetzenden Rest nicht um den ersten Rest nach dem vorherigen ß-Faltblattstrang oder den letzten Rest vor dem nachfolgenden ß- Faltblattstrang handelt.Point 2 occurs). The replacement is only done if it is the residue to be replaced is not the first residue after the previous β-sheet strand or the last remaining before the subsequent β-sheet strand.
2. Anschließend werden die Helices durch die Einführung zusätzlicher SaIz- brücken stabilisiert. Dies geschieht durch das Ersetzen zuvor vorhandener2. Then the helices are stabilized by the introduction of additional bridge bridges. This is done by replacing previously existing ones
Aminosäuren durch Aminosäuren mit geladenen Seitenketten ungleichnamiger Ladung. Jede Kombination von Arginin, Lysin, Histidin, Aspartat oder Glutamat kann hierbei zum Einsatz kommen. Die zu ersetzenden Rest müssen dabei, um eine Ausbildung der Salzbrücke in der HeNx zu gewähr- leisten, durch zwei, drei oder vier Aminosäuren separiert sein, so dass die eingeführten geladenen Reste z. B. die Nummerierung i und i+3, i und i+4 oder i und i+5 aufweisen werden. Alle Permutationen von genannten Resten sind möglich. Bevorzugt erfolgt jedoch eine Einführung von Arginin, Lysin oder Histidin näher am C-Terminus als eine Einführung von Aspartat oder Glutamat. Auch doppelte Salzbrücken sind, falls im Einklang mit derAmino acids by amino acids with charged side chains of unlike charge. Any combination of arginine, lysine, histidine, aspartate or glutamate can be used. In order to ensure formation of the salt bridge in the HeNx, the residues to be replaced must be separated by two, three or four amino acids, so that the introduced charged residues can be separated, for example. B. the numbering i and i + 3, i and i + 4 or i and i + 5 will have. All permutations of said residues are possible. Preferably, however, an introduction of arginine, lysine or histidine is closer to the C-terminus than an introduction of aspartate or glutamate. Also double salt bridges are, if in accordance with the
Helixlänge und allen anderen genannten Punkten, prinzipiell möglich, z. B. werden Rest i und i+3, i+4 oder i+5 sowie i+7, i+8 oder i+9 wie zuvor beschrieben ersetzt. Reste i und i+7, i+8 oder i+9 besitzen dabei jeweils die gleiche Ladung, der Rest i+3, i+4 oder i+5 die gegennamige. An Position i+3, i+4 oder i+5 sind bevorzugt Aspartat, Glutamat oder Arginin zu verwenden. In diesem Schritt sind nur lösungsmittelexponierte, auf der Oberfläche des Proteins lokalisierte Reste zu ersetzen.Helix length and all other points mentioned, in principle possible, for. For example, residual i and i + 3, i + 4 or i + 5 and i + 7, i + 8 or i + 9 are replaced as previously described. Residues i and i + 7, i + 8 or i + 9 each have the same charge, the remainder i + 3, i + 4 or i + 5 the counterpart. At position i + 3, i + 4 or i + 5 it is preferable to use aspartate, glutamate or arginine. In this step, only solvent-exposed residues located on the surface of the protein should be replaced.
3. Alle restlichen nicht unter die unter 1. und/oder 2. geschilderten Optimierungen fallenden Reste werden nun durch Aminosäuren ersetzt, welche zu einer Erhöhung der Ausbildungswahrscheinlichkeit einer α-Helix führen. Zu3. All remaining residues not covered by the optimizations described under 1. and / or 2. are now replaced by amino acids, which lead to an increase in the formation probability of an α-helix. To
Grunde gelegt wird dabei der Computeralgorithmus Agadir (Internetadresse: http://'^^ sta.rt-.html) oder jeder andere Algorithmus zur Vorhersage der Ausbildungswahrscheinlichkeit einer α-Helix. In diesem Schritt sind nur lösungsmittelex- ponierte, auf der Oberfläche des Proteins lokalisierte Reste zu ersetzen. Für variable Antikörperdomänen und/oder andere Immunoglobulindomänen, in welchen generell keine helikalen Elemente zu finden sind, sind die korrespondierenden Loops zunächst durch eine HeNx aus einer konstanten Antikörperdomäne, präferentiell der CL Domänen der IgGI Subklasse des gleichen Organismus, aus welchen die zu optimierenden Moleküle stammen, zu ersetzen. Anschließend wird die Optimierung nach obigem Protokoll durchgeführt.The basis for this is the computer algorithm Agadir (Internet address: http: // '^^ sta.rt-.html) or any other algorithm for predicting the formation probability of an α-helix. In this step only solvent-exposed residues located on the surface of the protein have to be replaced. For variable antibody domains and / or other immunoglobulin domains in which no helical elements are generally found, the corresponding loops are first by a HeNx from a constant antibody domain, preferentially the C L domains of the IgGI subclass of the same organism, from which the molecules to be optimized come to replace. Subsequently, the optimization is carried out according to the above protocol.
BEISPIEL 2: UNTERSUCHUNG DER PROTEINFALTUNG DER CL-DOMÄNE Um wichtige Determinanten des Faltungsweges einer Antikörperdomäne zu bestimmen, werden hoch auflösende strukturelle Untersuchungen an der murinen MAK33 d-Domäne sowie einer Punktmutante (Cι_-P35A) durchgeführt. Die Proteine CL WT (SEQ ID NO:1 ) und CL-P135A (SEQ ID NO:7) werden rekombinant in E. coli hergestellt. Die ersten vier N-terminalen Aminosäuren bei CL WT resultieren dabei jeweils aus der gewählten Klonierungsstrategie in den Expressionsvektor pET28a und kommen natürlicherweise in der CL-Domäne nicht vor. Mittels NMR- Spektroskopie kann die Faltung der CL-Domäne, nach Entfaltung in dem Denatu- rierungsmittel GdmCI, in Echtzeit bei niedrigen Temperaturen verfolgt werden (Abbildung 5 und 6). Dabei stellt sich heraus, dass die beiden kurzen helikalen E- lemente zwischen Strang A und B sowie zwischen Strang E und F bereits in dem Hauptfaltungsintermediat komplett strukturiert sind (Abbildung 5 und 6). Es kann somit postuliert werden, dass diese eine wichtige Rolle in dem Faltungsprozess dieser und anderer Antikörperdomänen spielen. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Faltung der CL-Domäne, vor welchem das Faltungsintermediat po- puliert wird, ist dabei die Isomehsierung des Prolinrests 35 von trans nach eis. Deshalb wird dieser Rest gegen Alanin, welches stets in trans vorliegen sollte, ausgetauscht. Dadurch kann das Faltungsintermediat im Gleichgewicht stabilisiert werden. NMR-Untersuchungen an diesem bestätigen die kinetischen Untersuchungen an der WT- CL-Domäne: Die beiden kurzen Helices sind die einzigen komplett strukturierten Elemente in der CL-Domäne. BEISPIEL 3: TRANSPLANTATION HELIKALER ELEMENTE Eine Übertragung der helikalen Elemente, vor allem aus den konstanten Domänen CL, CH2 und CH3 in die CH1 -Domäne (verfügt über nur gering ausgeprägte HeIi- ces) sowie die variablen Domänen (verfügen über keine Helices) eines Antikör- pers stellt einen möglichen Ansatz dar. Zur zusätzlichen oder alternativen Optimierung der Helices eignen sich beispielsweise zusätzliche helix-interne Salzbrücken sowie das Entfernen von Helixbrechern (Prolinreste oder Glycinreste). Anhand von Arbeiten an der d-Domäne der leichten kappa Kette eines murinen IgGs sowie beta2-Mikroglobulin kann die Machbarkeit dieses Ansatzes demonstriert werden. Durch genetische Modifikation werden die beiden helikalen Elemente in CL (Abbildung 5), die die ß-Faltblattstränge A und B bzw. E und F verbinden, gegen die korrespondierenden unstrukturierten Bereiche aus beta2-Mikroglobulin (Abbildung 2) ersetzt (CL to ß2in; SEQ ID NO: 2). Umgekehrt werden die unstrukturierten Bereiche in beta2-Mikrogobulin durch die korrespondierenden helikalen Elemente aus CL ersetzt (ß2m to CL;SEQ ID NO: 4) . Die Proteine CL to ß2m und ß2m to CL sowie als Kontrolle die Wildtypsequenzen ß2m (SEQ ID NO: 3) und CL (SEQ ID NO: 1 ) werden rekombinant in E. coli hergestellt. Die ersten vier N-terminalen Aminosäuren bei CL WT bzw. die erste N-terminale Aminosäure bei CL to ß2m resultieren dabei jeweils aus der gewählten Klonierungsstrategie in den Expressionsvektor pET28a und kommen natürlicherweise in der CL-Domäne nicht vor. Mittels CD- Spektroskopie kann gezeigt werden, dass CL in Abwesenheit seiner Helices (= CL to ß2m) nicht mehr in seine native Struktur falten kann, beta2-Mikroglobulin hingegen deutlich weniger aggregationsanfällig wird, wenn die CL-Helices in die beta2- Mikroglobulin Sequenz verpflanzt werden (ß2m to CL) (siehe Abbildung 7 und 8). Darüber hinaus zeigen Molekulardynamiksimulationen, dass sich auch im Kontext des beta2-Mikroglobulin-Proteins die CL-Helices strukturieren und diese somit in der Tat robuste Faltungselemente darstellen. Sowohl eine essentielle Rolle für die Strukturierung von Antikörperdomänen als auch ein positiver Einfluss auf die Ig- Topologie kann mit diesen beispielhaften Messungen nachgewiesen werden. BEISPIEL 4: OPTIMIERUNG DER HUMANEN IGG1 CH2-DOMÄNE Innerhalb des IgG Fc-Fragments (Abbildung 1 ) stellt die CH2-Domäne das schwächste Glied in Bezug auf die Stabilität dar. Darüber hinaus kann das Fc- Fragment als generelle Plattform von IgG-Antikörpern angesehen werden, so dass eine Optimierung der biophysikalischen Eigenschaften der CH2-Domäne zum einen die gesamte Stabilität des Fc-Fragments erhöhen sollte, zum anderen eine universell einsetzbare Optimierung darstellt.EXAMPLE 2: INVESTIGATION OF THE PROTEIN FINDING OF THE C L DOMAIN In order to determine important determinants of the folding pathway of an antibody domain, high-resolution structural investigations are carried out on the murine MAK33 d domain and a point mutant (C1_P35A). The proteins C L WT (SEQ ID NO: 1) and C L -P135A (SEQ ID NO: 7) are produced recombinantly in E. coli. The first four N-terminal amino acids at C L WT result in each case from the selected cloning strategy in the expression vector pET28a and are naturally not present in the CL domain. By NMR spectroscopy, the folding of the CL domain, after unfolding in the denaturant GdmCI, can be monitored in real time at low temperatures (Figure 5 and 6). It turns out that the two short helical ele- ments between strand A and B as well as between strand E and F are already completely patterned in the main folding intermediate (Figure 5 and 6). Thus, they can be postulated to play an important role in the folding process of these and other antibody domains. The rate-determining step in the folding of the C L domain, before which the folding intermediate is promoted, is the isomerization of the proline residue 35 from trans to ice. Therefore, this residue is exchanged for alanine, which should always be in trans. This allows the folding intermediate to be stabilized in equilibrium. NMR studies on this confirm the kinetic studies on the WT C L domain: the two short helices are the only fully-structured elements in the C L domain. EXAMPLE 3: TRANSPLANTATION OF HELICULAR ELEMENTS A transfer of the helical elements, in particular from the constant domains C L , C H 2 and C H 3 into the C H 1 domain (has only slightly pronounced hei ces) and the variable domains ( have no helices) of an antibody represents a possible approach. For additional or alternative optimization of the helices are, for example, additional helix-internal salt bridges and the removal of Helixbrechern (proline residues or glycine). On the basis of work on the d-domain of the kappa light chain of a murine IgG and beta2-microglobulin, the feasibility of this approach can be demonstrated. By genetic modification, the two helical elements in C L (Figure 5), which connect the β-sheet strands A and B or E and F, are replaced by the corresponding unstructured regions of beta2-microglobulin (Figure 2) (C L to ß 2 in; SEQ ID NO: 2). Conversely, the unstructured regions in beta2-microgobulin are replaced by the corresponding helical elements from C L (β 2 m to C L , SEQ ID NO: 4). The proteins C L to β 2 m and β 2 m to C L and, as a control, the wild-type sequences β 2 m (SEQ ID NO: 3) and C L (SEQ ID NO: 1) are produced recombinantly in E. coli. The first four N-terminal amino acids at C L WT and the first N-terminal amino acid at C L to β 2 m result in each case from the selected cloning strategy in the expression vector pET28a and are naturally not present in the CL domain. By means of CD spectroscopy can be shown that C L in the absence of its helices (= C L to beta 2 m) can not fold into its native structure, beta2-microglobulin is significantly less prone to aggregation, however, when the CL-helices in the beta2 - Microglobulin sequence are transplanted (ß 2 m to C L ) (see Figure 7 and 8). In addition, molecular dynamics simulations show that the CL helices also structure in the context of the beta2-microglobulin protein, and thus indeed constitute robust folding elements. Both an essential role for the structuring of antibody domains and a positive influence on the Ig topology can be demonstrated with these exemplary measurements. EXAMPLE 4: OPTIMIZATION OF THE HUMAN IGG1 C H 2 DOMAIN Within the IgG Fc fragment (Figure 1), the CH2 domain is the weakest link in terms of stability. In addition, the Fc fragment may serve as a general platform of IgG. Antibodies are considered, so that an optimization of the biophysical properties of the C H 2 domain on the one hand should increase the overall stability of the Fc fragment, on the other hand is a universally applicable optimization.
Für dieses Beispiel wird die erste HeNx einer humanen IgGI CH2-Domäne (Abbil- düng 9A) zur Optimierung gewählt. Innerhalb dieser werden durch gezielte Muta- genese zusätzliche Salzbrücken eingeführt (Abbildung 9B). Beide CH2-Domänen, Wildtyp (CH2 WT; SEQ ID NO: 5) und Helixi -Mutante (CH2 Helixi Mutante; SEQ ID NO: 6), werden in E. coli exprimiert. Die erste N-terminale Aminosäure bei der CH2 Helixi Mutante resultiert dabei aus der gewählten Klonierungsstrategie in den Expressionsvektor pET28a und kommt natürlicherweise in der CH2-Domäne nicht vor.For this example, the first HeNx of a human IgG1 CH2 domain (Figure 9A) is chosen for optimization. Within these, additional salt bridges are introduced by targeted mutagenesis (Figure 9B). Both C H 2 domains, wild-type (C H 2 WT; SEQ ID NO: 5) and Helixi mutant (C H 2 helixi mutant; SEQ ID NO: 6), are expressed in E. coli. The first N-terminal amino acid in the C H 2 Helixi mutant results from the chosen cloning strategy in the expression vector pET28a and does not occur naturally in the CH2 domain.
Analysen, die mit den gereinigten Proteinen durchgeführt werden, zeigen, dass durch diesen Ansatz eine CH2-Domäne generiert werden kann, welche in Bezug auf die Sekundärstruktur sowie die Tertiärstruktur gegenüber der Wildtyp-Domäne nahezu unverändert ist (Abbildung 10), jedoch einen um 4-5°C erhöhten Schmelzpunkt aufweist (Abbildung 11 ). Darüber hinaus kann durch die Optimierung der ersten HeNx eine höhere Ausbeute bei der Rückfaltung der rekombinanten CH2- Domäne erreicht werden, was direkt für eine optimierte Faltungseigenschaft dieser mutierten Domäne spricht.Analyzes carried out with the purified proteins show that this approach can generate a C H 2 domain that is nearly unchanged in the secondary structure and tertiary structure compared to the wild-type domain (Figure 10), but one increased melting point by 4-5 ° C (Figure 11). In addition, optimization of the first HeNx can result in a higher yield in the refolding of the recombinant C H 2 domain, directly suggesting an optimized folding property of this mutant domain.
BEISPIEL 5: EXPRESSION VON OPTIMIERTEN ANTIKÖRPERN IN CHO- ZELLENEXAMPLE 5: EXPRESSION OF OPTIMIZED ANTIBODIES IN CHOCOLES
Durch transiente Transfektion von CHO-DG44-Zellen wird zunächst überprüft, ob der Austausch des helikalen Sequenzelements KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) in der CH2-Domäne eines IgGI -Antikörpergens gegen das helix-optimierte Sequenzelement KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9) einen Einfluss auf die Expression des IgGI -Moleküls hat. Es wird eine Co-Transfektion mit folgenden Plasmidkombinati- onen durchgeführt: a) Kontrollplasmide pBI-26/lgG1 -HC und pBI-49/lgG1 -LC, die für einen monoklonalen IgGI -Antikörper mit dem Sequenzbereich KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) in der CH2-Domäne (= Wildtypkonfiguration; nachfolgend alsBy transiently transfecting CHO-DG44 cells, it is first checked whether the replacement of the helical sequence element KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) in the CH2 domain of an IgGI antibody gene against the helix-optimized sequence element KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9) an influence on the expression of the IgGI molecule has. A co-transfection with the following plasmid combinations is carried out: a) control plasmids pBI-26 / IgG1-HC and pBI-49 / IgG1-LC which are suitable for an IgG1 monoclonal antibody with the sequence range KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) in the CH2 domain (= wild-type configuration, hereinafter referred to as
IgGI -WT bezeichnet) b) pBI-26/lgG1-HChelix1 und pBI-49/lgG1-LC, die für einen monoklonalen IgGI -Antikörper, in der die erste HeNx in der humanen CH2-Domäne durch Substitution des Sequenzbereichs KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8) gegen KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9) optimiert wirdIgGI-WT) b) pBI-26 / IgG1-HChelix1 and pBI-49 / IgG1-LC, which is responsible for an IgG1 monoclonal antibody in which the first HeNx in the human C H 2 domain is replaced by the sequence region KPKDTLMISR (FIG. SEQ ID NO: 8) is optimized against KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9)
Pro Kombination werden jeweils 3 Pools transfiziert, wobei in jeder Co- Transfektion äquimolare Mengen beider Plasmide eingesetzt. Nach 48 h Kultivierung erfolgt die Ernte und die Bestimmung des IgGI -Titers im Zellkulturüberstand mittels ELISA. Unterschiede in der Transfektionseffizienz werden durch Co- Transfektion mit einem SEAP-Expressionsplasmid (Zugabe von jeweils 100 ng Plasmid-DNA pro Transfektionsansatz) und nachfolgender Messung der SEAP- Aktivität korrigiert. Insgesamt werden 2 unabhängige Transfektionsserien durchgeführt. Es kann gezeigt werden, dass die Mutationen im Helix-Bereich der CH2- Domäne das IgGI -Molekül keinen negativen Einfluss auf die Expression des Antikörpers haben. Die erhaltenen Produktmengen sind vergleichbar mit der von IgGI -Wildtyp transfizierten Zellen.In each case 3 pools are transfected per combination, with equimolar amounts of both plasmids being used in each co-transfection. After 48 hours of culture, harvesting and determination of the IgGI titer in the cell culture supernatant are carried out by means of ELISA. Differences in transfection efficiency are corrected by cotransfection with a SEAP expression plasmid (addition of 100 ng of plasmid DNA per transfection mixture) and subsequent measurement of SEAP activity. A total of 2 independent transfection series are carried out. It can be shown that the mutations in the helix region of the C H 2 domain do not adversely affect the IgGI molecule on the expression of the antibody. The product quantities obtained are comparable to the cells transfected by IgGI wildtype.
Für eine stabile Transfektion von CHO-DG44-Zellen wird eine Co-Transfektion mit den gleichen Plasmidkombinationen wie oben beschrieben durchgeführt. Die Selektion stabil transfizierter Zellen erfolgt zwei Tage nach der Transfektion in HT- freiem Medium mit Zusatz von 400 μg/mL G418. Nach erfolgter Selektion wird durch Zugabe von 100 nM MTX eine DHFR-basierte Genamplifikation induziert. Für die Materialproduktion werden die Zellen in einem 10tägigen Fed-Batch- Prozess in Schüttelkolben kultiviert. Für die WT- bzw. Helixi -Mutante des Antikörpers ist die Reinigung identisch. Die Protein A-Affinitätschromatographie (MabSe- lect rProteinA, GE Healthcare) erfolgt gemäß den Angaben des Herstellers, wobei zur Äquilibrierung Phosphatpuffer (20 mM Natriumphosphat, 140 mM Natriumchlo- rid, pH 7,5, Leitfähigkeit 16,5 mS/cm) und zur Elution 50 mM Acetat pH 3,3 verwendet wird. Das Eluat wird durch Zugabe von 1 M Tris pH 8 auf einen pH von 5,5 eingestellt. Die Reinigungsprofile für die beiden Antikörpervarianten sind dabei vergleichbar.For stable transfection of CHO-DG44 cells, co-transfection is performed with the same plasmid combinations as described above. The selection of stably transfected cells is carried out two days after transfection in HT-free medium with the addition of 400 μg / mL G418. After selection, DHFR-based gene amplification is induced by addition of 100 nM MTX. For material production, the cells are cultured in a 10-day fed-batch process in shake flasks. The purification is identical for the WT or Helixi mutant of the antibody. Protein A affinity chromatography (MabSe) lect rProteinA, GE Healthcare) according to the instructions of the manufacturer, using phosphate buffer (20 mM sodium phosphate, 140 mM sodium chloride, pH 7.5, conductivity 16.5 mS / cm) for equilibration and 50 mM acetate pH 3 for elution, 3 is used. The eluate is adjusted to a pH of 5.5 by addition of 1 M Tris pH 8. The purification profiles for the two antibody variants are comparable.
Die thermische Stabilität der Antikörper wird mit der ThermoFluor®-Methode bestimmt. Durch die Optimierung des natürlichen, helikalen Elements in der CH2- Domäne kann die thermische Stabilität der Helixi -Mutante des IgGI -Antikörpers gegenüber dem lgG1 -WT-Antikörper sowohl unter basischen als auch unter sauren Pufferbedingungen gesteigert werden. In PBS bei pH 7,1 zeigt die CH2- Domäne der Helixi -Mutante im Vergleich zur CH2-Domäne des IgGI -WTs eine um 8°C höhere Schmelztemperatur. Und in 100 mM Acetat pH 3,4 ist sie sogar um 18°C erhöht. Diese signifikante Erhöhung der thermischen Stabilität der Immunglobuline ist von immensem Vorteil für die biopharmazeutische Herstellung von therapeutischen Proteinen. Dabei führt die Optimierung des natürlichen, helikalen Elements der CH2-Domäne durch Austausch des natürlicherweise vorkommenden Sequenzbereichs KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8) (dieser Sequenzbereich kommt beispielsweise auch in den CH2-Domänen von humanen lgG2 (SEQ ID NO:14) und lgG4 (SEQ ID NO:15) vor) gegen KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9) zu einer signifikant verbesserten Robustheit der biotechnologisch hergestellten therapeutischen Proteinen. Die erhöhte Temperatur- und pH-Stabilität ist besonders vorteilhaft beim Prozessschritt der Virusinaktivierung zur Erhöhung der Produktsi- cherheit von therapeutischen Proteinen, da dieser Schritt bei saurem pH durchgeführt wird. Weitere Vorteile liegen in der größeren Flexibilität in der Chromatographie und bei der Proteinformulierung, der geringere Aggregationsneigung und der verbesserten Lagerungsstabilität. The thermal stability of the antibodies is determined by the ThermoFluor® method. By optimizing the natural, helical element in the C H 2 domain, the thermal stability of the Helixi mutant of the IgGI antibody to the IgG1 -WT antibody can be increased under both basic and acidic buffer conditions. In PBS at pH 7.1, the C H 2- domain of the Helixi mutant exhibits a 8 ° C higher melting temperature compared to the CH2 domain of the IgGI-WT. And in 100 mM acetate pH 3.4, it is even increased by 18 ° C. This significant increase in the thermal stability of immunoglobulins is of immense benefit to the biopharmaceutical production of therapeutic proteins. The optimization of the natural, helical element of the CH2 domain is achieved by replacing the naturally occurring sequence region KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8) (this sequence region also occurs, for example, in the C H 2 domains of human IgG2 (SEQ ID NO: 14). and IgG4 (SEQ ID NO: 15) against KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9) significantly improved the robustness of the biotechnologically engineered therapeutic proteins. The increased temperature and pH stability is particularly advantageous in the process of virus inactivation to increase the product safety of therapeutic proteins since this step is performed at acid pH. Other advantages include greater flexibility in chromatography and protein formulation, less tendency for aggregation, and improved storage stability.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder Protei- nen, die das Immunoglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Optimierung der natürlichen, helikalen Elemente erfolgt.1. Biotechnological process for the production of antibodies or proteins, which have the immunoglobulin folding pattern, characterized in that an optimization of the natural, helical elements takes place.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Optimierung durch Einführung zusätzlicher helix-interner Salzbrücken und/oder die Entfernung von Helixbrechern erfolgt.2. The method according to claim 1, characterized in that the optimization is carried out by introducing additional helix-internal salt bridges and / or the removal of Helixbrechern.
3. Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunoglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transplantation der natürlichen oder optimierten, heli- kalen Elemente erfolgt.3. Biotechnological process for the production of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that a transplantation of the natural or optimized helical elements takes place.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Übertragung eines oder mehrerer helikaler Elemente aus mindestens einer konstanten Domäne CL, CH2 und/oder CH3 in mindestens eine konstante CH1 Domäne und/oder variable Domäne erfolgt.4. The method according to claim 3, characterized in that a transfer of one or more helical elements from at least one constant domain C L , C H 2 and / or C H 3 takes place in at least one constant C H 1 domain and / or variable domain.
5. Verfahren zur Verbesserung der biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen, die das Immunglobulinfaltungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Aminosäure in der Ig-Domäne durch eine andere Aminosäure ausgetauscht wird, die die Ausbildungswahrscheinlichkeit einer HeNx erhöht.5. A method for improving the biophysical properties of proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that at least one amino acid in the Ig domain is replaced by another amino acid which increases the formation probability of a HeNx.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausbildungswahrscheinlichkeit mit einem Algorithmus berechnet wird. 6. The method according to claim 5, characterized in that the training probability is calculated using an algorithm.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass sich die ausgetauschte Aminosäure im Bereich zwischen zwei ß-Faltblattsträngen befindet.7. The method according to claim 5 or 6, characterized in that the exchanged amino acid is in the range between two ß-Faltblattsträngen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sich die ausgetauschte^) Aminosäure(n) im Bereich zwischen zwei ß-Faltblattsträngen vom Typ A und B und/oder zwischen zwei ß-Faltblattsträngen vom Typ E und F befindet.8. The method according to claim 7, characterized in that the exchanged ^) amino acid (s) is in the range between two ß-pleated sheet strands of the type A and B and / or between two ß-pleated sheet strands of the type E and F.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die ausgetauschte(n) Aminosäure(n) in einem Bereich befindet, der bereits eine helikale Struktur aufweist.9. The method according to any one of claims 5 to 8, characterized in that the exchanged (s) amino acid (s) is located in an area which already has a helical structure.
10.Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Prolin oder Glycin gegen eine Aminosäure ausgetauscht wird, die weder Prolin noch Glycin ist.10.A method according to any one of claims 5 to 9, characterized in that proline or glycine is replaced by an amino acid which is neither proline nor glycine.
11.Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Aminosäure, die eine geladene Seitenketten aufweist, so einge- führt wird, dass sie sich im Abstand (i→i+3), (i→i+4) oder (i→i+5) zu einer11.A method according to any one of claims 5 to 9, characterized in that an amino acid having a charged side chains is introduced so that they at a distance (i → i + 3), (i → i + 4) or (i → i + 5) to one
Aminosäure befindet, die eine Seitenkette mit gegennamiger Ladung aufweist.Amino acid is located, which has a side chain with opposite charge.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass dabei mindes- tens zwei Aminosäuren eingeführt werden, die Seitenketten mit gegennamiger Ladung aufweisen, wobei der Abstand zwischen den beiden Aminosäuren so gewählt wird, dass die Seitenketten eine Salzbrücke ausbilden können. 12. The method according to claim 11, characterized in that at least two amino acids are introduced which have side chains with the same charge, wherein the distance between the two amino acids is selected so that the side chains can form a salt bridge.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden ausgetauschten Aminosäuren durch 2 oder mehr Aminosäuren voneinander getrennt sind ((i→i+3), (i→i+4) oder (i→i+5)).13. The method according to claim 12, characterized in that the two exchanged amino acids are separated by 2 or more amino acids ((i → i + 3), (i → i + 4) or (i → i + 5)).
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei einer der beiden eingeführten Aminosäuren um Glutaminsäure o- der Asparaginsäure, und bei der anderen Aminosäure um Arginin, Lysin, oder Histidin handelt.14. The method according to claim 12 or 13, characterized in that it is one of the two introduced amino acids glutamic acid or aspartic acid, and the other amino acid is arginine, lysine, or histidine.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass dabei die Position, an der Arginin, Lysin, oder Histidin eingeführt wird oder gegebenenfalls schon vorhanden ist, näher am C-Terminus liegt als die Position, an der Glutaminsäure oder Asparaginsäure eingeführt wird oder gegebenenfalls schon vorhanden ist.15. The method according to any one of claims 11 to 14, characterized in that the position at which arginine, lysine, or histidine is introduced or optionally already present, closer to the C-terminus than the position at which glutamic acid or aspartic acid introduced or may already be present.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sequenz erzeugt wird, bei der bis zu 3 Aminosäuren an den Positionen i und i+3, i+4 oder i+5 sowie i+7, i+8 oder i+9 eingeführt werden, wobei die Aminosäuren and den Positionen i und i+7, i+8 oder i+9 Seiten- ketten mit gleichnamiger Ladung aufweisen, die Aminosäuren an der Position i+3, i+4 oder i+5 eine dazu gegennamige.16. The method according to any one of claims 11 to 15, characterized in that a sequence is generated in which up to 3 amino acids at positions i and i + 3, i + 4 or i + 5 and i + 7, i + 8 or i + 9, wherein the amino acids at the positions i and i + 7, i + 8 or i + 9 have side chains with the same charge, the amino acids at the position i + 3, i + 4 or i + 5 a counterpart to it.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass an der mittleren Position i+3, i+4 oder i+5 Asparaginsäure, Glutaminsäure, oder Arginin eingeführt wird oder gegebenenfalls schon vorhanden ist.17. The method according to claim 16, characterized in that at the middle position i + 3, i + 4 or i + 5 aspartic acid, glutamic acid, or arginine is introduced or optionally already present.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein nach dem Austausch ein helikales Element mit der Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ), und/oder18. The method according to any one of claims 1 to 17, characterized in that the protein after the exchange of a helical element with the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11), and / or
TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) enthält. TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16).
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass 4 bis 12 aufeinanderfolgende Aminosäuren durch eine Aminosäuresequenz gleicher oder größerer Länge ausgetauscht werden, wobei die eingeführte Aminosäuresequenz eine höhere Ausbildungswahrscheinlichkeit einer HeNx aufweist als die ausgetauschte Sequenz.19. The method according to any one of claims 1 to 18, characterized in that 4 to 12 consecutive amino acids are replaced by an amino acid sequence of equal or greater length, wherein the introduced amino acid sequence has a higher formation probability of HeNx than the exchanged sequence.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die eingeführte Sequenz ein helikales Element aus der konstanten Domäne einer leich- ten (CL) oder schweren (CH) Immunglobulinkette ist.20. The method according to claim 19, characterized in that the introduced sequence is a helical element from the constant domain of a light (C L ) or heavy (C H ) immunoglobulin chain.
21.Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die eingeführte Sequenz ein helikales Element aus dem Bereich zwischen den ß- Faltblattsträngen A und B und/oder E und F einer CL- oder CH-Domäne ei- nes Immunglobulins ist.21.A method according to claim 20, characterized in that the inserted sequence is a helical element from the region between the β-sheet strands A and B and / or E and F of a C L or CH domain of an immunoglobulin.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die eingeführte Sequenz die Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) oder KPKDTLMISR22. The method according to any one of claims 19 to 21, characterized in that the introduced sequence of the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or KPKDTLMISR
(SEQ ID NO:8) enthält.(SEQ ID NO: 8).
23. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das ein Immunglobulinfaltungs- muster aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 auf dieses Protein angewendet wird, und das dadurch erhaltene Protein in einer Wirtszelle exprimiert wird.23. A method for producing a protein having an immunoglobulin folding pattern, characterized in that a method according to any one of claims 1 to 22 is applied to this protein, and the protein thereby obtained is expressed in a host cell.
24. Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster aufweist, hergestellt mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23. 24. A protein having an immunoglobulin folding pattern prepared by a method according to any one of claims 1 to 23.
25. Protein nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Antikörper handelt.25. Protein according to claim 24, characterized in that it is an antibody.
26. Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster und mindestens eine variable Domäne aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein helikales Element in dieser variablen Domäne enthält.26. A protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one variable domain, characterized in that it contains a helical element in this variable domain.
27. Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster und mindestens eine konstante Domäne vom Typ CH2 aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein helikales Element in dieser konstanten Domäne enthält, das eine höhere Helixausbildungswahrscheinlichkeit aufweist als ein helikales Element in einer CH2 -Domäne mit der Sequenz SEQ ID NO: 5.27. A protein which has an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 2, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element in a C H 2 domain the sequence SEQ ID NO: 5.
28. Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster und mindestens eine kon- stante Domäne vom Typ CH1 aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein helikales Element in dieser konstanten Domäne enthält, das eine höhere Helixausbildungswahrscheinlichkeit aufweist als ein helikales Element in einer natürlicherweise im Menschen vorkommenden CH1 -Domäne.28. A protein having an immunoglobulin folding pattern and at least one constant domain of the type C H 1, characterized in that it contains a helical element in this constant domain which has a higher helix formation probability than a helical element in a naturally occurring species in man C H 1 domain.
29. Protein nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte he- likale Element die Sequenz KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) oder SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ) enthält.29. Protein according to claim 27, characterized in that said he- cal element is the sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
30. Protein nach Anspruch 26 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte helikale Element die Sequenz KPKDTLMISR (SEQ ID NO:8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9), TKDEYERH (SEQ ID NO:10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO:16) oder SKADYEKHK (SEQ ID NO:11 ) enthält. 30. Protein according to claim 26 or 28, characterized in that said helical element has the sequence KPKDTLMISR (SEQ ID NO: 8), KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9), TKDEYERH (SEQ ID NO: 10), TPEQWKSHRS (SEQ ID NO: 16) or SKADYEKHK (SEQ ID NO: 11).
31. Protein, das ein Immunglobulinfaltungsmuster aufweist, das mindestens ein helikales Element in einer Ig-Domäne aufweist, das eine höhere Helixaus- bildungswahrscheinlichkeit hat als ein helikales Element, das in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:12 bzw. SEQ ID NO: 13 (CL WT) oder SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 bzw. SEQ ID NO:15 (CH2 WT) enthalten ist.31. A protein which has an immunoglobulin folding pattern which has at least one helical element in an Ig domain which has a higher helix formation probability than a helical element which is present in one of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 (C L WT) or SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 (C H 2 WT).
32. Protein nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass das besagte he- likale Element die Sequenz KAEDTLHISR (SEQ ID NO:9) enthält.32. Protein according to claim 31, characterized in that said he- cal element contains the sequence KAEDTLHISR (SEQ ID NO: 9).
33. Protein nach einem der Ansprüche 24 bis 31 zur medizinischen Verwendung.33. Protein according to one of claims 24 to 31 for medical use.
34. Biotechnologisches Verfahren zur Modifizierung der biophysikalischen Ei- genschaften von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunoglobulinfal- tungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Optimierung der natürlichen, helikalen Elemente erfolgt.34. Biotechnological method for modifying the biophysical properties of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that an optimization of the natural, helical elements takes place.
35. Biotechnologisches Verfahren zur Modifizierung der biophysikalischen Ei- genschaften von Antikörpern oder Proteinen, die das Immunoglobulinfal- tungsmuster aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transplantation der natürlichen oder optimierten, helikalen Elemente erfolgt. 35. Biotechnological method for modifying the biophysical properties of antibodies or proteins having the immunoglobulin folding pattern, characterized in that a transplantation of the natural or optimized, helical elements takes place.
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