EP2100148A2 - Method for measuring the concentration of activated factor vii (fviia) in a sample - Google Patents
Method for measuring the concentration of activated factor vii (fviia) in a sampleInfo
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- EP2100148A2 EP2100148A2 EP07872461A EP07872461A EP2100148A2 EP 2100148 A2 EP2100148 A2 EP 2100148A2 EP 07872461 A EP07872461 A EP 07872461A EP 07872461 A EP07872461 A EP 07872461A EP 2100148 A2 EP2100148 A2 EP 2100148A2
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- EP
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- fviia
- sample
- concentration
- factor
- fvii
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
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- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96447—Factor VII (3.4.21.21)
Definitions
- the present invention relates to a method for measuring the concentration of activated factor VII (FVIIa) in a sample using a factor VII-free plasma (FVII) and at least one other factor selected from factor VIII (FVIII) factor IX (FIX) and factor XI (FXI).
- FVIIa activated factor VII
- FVII-free plasma FVII
- FIX factor IX
- FXI factor XI
- Blood coagulation is a mechanism that allows organisms to control blood shedding during vascular lesions and thus prevent bleeding. Blood coagulation occurs in cascading steps involving different proenzymes and procofactors in the blood that are converted, via proteolytic enzymes, into their activated form. In this succession of steps (or cascade) of coagulation, two pathways are distinguished, called the extrinsic pathway of coagulation and the intrinsic pathway of coagulation. Both lead to the formation of the complex, called prothrombinase, consisting of activated factor X (FXa), activated factor V (FVa), phospholipids and calcium. It is prothrombinase that activates prothrombin thrombin allowing the transformation of soluble fibrinogen into insoluble fibrin which forms the clot.
- FXa activated factor X
- FVa activated factor V
- FVIIa The extrinsic pathway involves the intervention of FVII present in the plasma. However, the latter must be activated beforehand in FVIIa to initiate the cascade of coagulation.
- FVIIa alone (uncomplexed) has low proteolytic activity. This activity is potentiated when FVIIa is complexed with tissue factor (TF), a protein associated with phospholipids, which is released during vascular injury.
- TF tissue factor
- the FVIIa-FT complex transforms factor X into factor Xa in the presence of calcium ions.
- the complex FVIIa-FT also transforms FIX into FIXa thus catalyzing the intrinsic pathway of coagulation.
- Factors IXa and Xa activate FVII in FVIIa.
- Factor Xa complexed with factor Va and phospholipids converts prothrombin to thrombin.
- Thrombin acts on fibrinogen transforming it into fibrin and also has other activities including activation of factor V in Factor Va and FVIII in FVIIIa.
- Thrombin also activates factor XIII in factor XIIIa in the presence of calcium, which allows the consolidation of the fibrin clot.
- FIXa is generated from FIX by the FXIa itself activated by activated factor XII. blood contact with an electronegative surface such as the subendothelium.
- FVIIa a vitamin K-dependent glycoprotein, therefore plays an important role in the mechanisms of coagulation, resulting in blood clot formation.
- FVIIa has the advantage of being able to act locally in the presence of the tissue factor released after lesion of tissues causing haemorrhages, even in the absence of Factor VIII or IX. This is why FVIIa has been used for many years to correct some bleeding disorders.
- FVIIa This increasing use of FVIIa has led to the development of methods to measure FVIIa activity as well as methods for determining FVIIa concentration, for example, to measure the concentration of a sample potentially containing FVIIa. or to measure the plasma concentration of FVIIa of a patient to verify that the dose of FVIIa administered is well suited to the treatment of the haemostasis disorder to be corrected, and that the treated patient is not in hypo-coagulation or hyper-coagulation.
- the best known methods for detecting FVIIa activity are the measurement of clotting time, PTT (Partial Thromboplastin Time), aPTT (activated partial thromboplastin time), the TEG (thromboelastograph) and TGT (thrombin generation test). These methods make it possible to detect the activity of FVIIa but do not make it possible to directly measure the precise concentration of FVIIa.
- thromboelastography a method frequently used by some biologists and clinicians to evaluate the effectiveness of a treatment with FVIIa is based on the use of thromboelastography. This method consists in measuring the physical properties of whole blood by mechanically analyzing clot formation as a function of time. Depending on the parameters extracted from a graph (called thrombinogram or thromboelastograph ® ) generated by the thromboelastograph, the clinician can evaluate the coagulation ability of a patient. Although accurate, this method is tedious, unsuitable for a routine and repetitive analysis, and difficult to apply to multisampling because it requires to be performed within one hour after the blood sample. In addition, this method does not allow to measure the concentration of FVIIa.
- the present invention relates to a method for in vitro or ex-vivo measurement of the concentration of FVIIa in a sample, comprising the steps of: a) mixing said sample with a human plasma lacking FVII and at least one other selected factor among FVIII, FIX and FXI; b) adding initiator components of the thrombin generation reaction comprising a source of calcium ions, a phospholipid agent and tissue factor; c) performing a thrombin generation test (TGT) on the reaction medium thus obtained to obtain a thrombinogram providing parameters; d) comparing at least one of the thrombinogram parameters with a homologous parameter of standard thrombograms, each standard thrombogram being obtained with a fixed standard concentration of FVIIa in said reaction medium, ranging from 1 ⁇ M to 5 nM, and e) deducing from step d) a measurement of the FVIIa concentration of the sample in said range.
- TGT thrombin generation test
- the Applicant has surprisingly found that the use of a plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX and FXI (double depleted plasma) makes it possible to obtain a reagent that can be used in a method for measuring the concentration of FVIIa in a sample, reliable, reproducible and easy to implement.
- a plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX and FXI double depleted plasma
- the thrombin generation test (TGT) of step c) is based on the continuous measurement of the amounts of thrombin generated and the time required to generate thrombin when initiating components of the thrombin generation reaction, in this case the source of calcium ions, the phospholipid agent and the tissue factor (FT) of step b), are brought into contact with the sample containing FVIIa mixed with a plasma devoid of FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI. As soon as all these components, thus constituting the reaction medium, of predetermined volume, is brought into contact, the thrombin generation reaction begins, which makes it possible to set the initial time of the test start (t 0 ).
- thrombin revealing agent generated.
- an agent is a fluorogenic agent that will be degraded by thrombin to give a fluorescent emitting compound, or a chromogenic agent.
- Fluorescence is detected by a device for measuring thrombin formation in the medium reaction, such as a conventional fluorimeter further comprising software adapted to collect data for tracing a thrombinogram.
- This thrombinogram is in the form of a curve, established according to the duration of the test, having a maximum corresponding to the maximum amount of thrombin generated. The more the amount of FVIIa in the sample increases, and therefore in the reaction medium, the more the time to generate the thrombin decreases and then reaches a limit value.
- the thrombogram provides data representing at least one of the thrombinogram parameters (step d)) defined as follows.
- the first of the parameters is the peak height which corresponds to the maximum of thrombin generated, as indicated above.
- the second is the lag time corresponding to the time that elapses between the start of TGT (to) and the appearance of thrombin.
- the peak time, third parameter corresponds to the time that elapses between the beginning of the TGT (t 0 ) and that corresponding to the maximum of thrombin generated.
- the velocity, fourth parameter, expressed in nM / min of formed thrombin corresponds to the peak height divided by the difference between the peak time and the lag time.
- step d) at least one of the thrombinogram parameters obtained with the method according to the invention is chosen from peak height, velocity, latency time and peak time.
- the standard thrombogram parameters are determined by performing a series of TGTs with standard samples, consisting of the same reaction medium, but each of which comprises a final standard concentration in FVIIa fixed in 1 ⁇ M and 5 nM, preferably in the range of 1 ⁇ M and 1 nM for parameters selected from peak height and velocity, preferably in the range of 1 ⁇ M and 5 ⁇ M; nM for the four parameters. It is therefore placed under the same operating conditions in order to be able to maintain the same volume of the reaction medium, although small variations in volumes are acceptable by adding the FVIIa sample. A thrombinogram is thus obtained for each reaction medium whose FVIIa content is calibrated.
- the FVIIa used to establish standard thrombogram parameters is an international standard of FVIIa (SI-FVIIa), made available by the National Institute for Biological Standards and Controls, in England (NIBSC).
- the sample of FVIIa, the plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX or FXI, the initiator components of the thrombin generation reaction can be in the form of liquid or lyophilized, the reaction medium then being prepared by dissolving in a suitable aqueous solvent, such as purified water for injection (PPI).
- a suitable aqueous solvent such as purified water for injection (PPI).
- the sample of FVIIa is in liquid form.
- phospholipidic agents are suitable in the context of the invention. They can be in the form of concentrate or lyophilisate. Preferably, they are in the form of a mixture containing predominantly or exclusively phosphatidylcholine and phosphatidylserine.
- any native, plasma, recombinant or transgenic tissue factor is suitable.
- some modified TFs in particular any truncated FT having lost its function enabling it to convert factor VII to factor VIIa while having retained its ability to act as a cofactor for factor VIIa enzymatic activity, are suitable.
- the transmembrane domain of such an FT has been suppressed, this suppression making it possible to obtain the selective deficit sought in the FT function (a such tissue factor is commercially available).
- such modified FT is used for measuring, in vitro or ex vivo, the concentration of FVIIa in a sample also containing FVII.
- the sample containing FVIIa is a therapeutic sample or not containing plasma FVIIa (pFVIIa), recombinant (rFVIIa) or transgene (TgFVIIa), in liquid or freeze-dried form.
- pFVIIa plasma FVIIa
- rFVIIa recombinant
- TgFVIIa transgene
- the sample containing FVIIa is a mammalian milk sample, particularly a transgenic mammalian milk sample producing FVIIa in its milk.
- a method for producing a transgenic protein in the milk of a transgenic animal may comprise the following steps: a DNA molecule comprising a gene encoding the transgene protein, this gene being under the control of a promoter of a transgenic animal; Protein secreted naturally in milk (such as the casein, beta-casein, lactalbumin, beta-lactoglobulin promoter or WAP promoter) is integrated into an embryo of a non-human mammal. The embryo is then placed in a female mammal of the same species. Once the mammal from the embryo has grown sufficiently, the lactation of the mammal is induced, then the milk collected. The milk then contains said transgenic protein.
- a DNA molecule comprising a gene encoding the transgene protein, this gene being under the control of a promoter of a transgenic animal
- Protein secreted naturally in milk such as the casein, beta-casein, lactalbumin, beta-lactoglobulin promoter or WAP promoter
- a plasmid containing the WAP (Whey Acidic Protein) promoter is manufactured by introduction of a sequence comprising the promoter of the WAP gene, this plasmid being made in such a way as to be able to receive a foreign gene placed under the control of the WAP promoter.
- the plasmid containing the promoter and the gene coding for the protein of the invention are used to obtain transgenic rabbits by microinjection into the male pronucleus of rabbit embryos. The embryos are then transferred into the oviduct of hormonally prepared females.
- transgenic mammal The presence of the transgenes is revealed by the Southern technique from the DNA extracted from the transgenic rabbits obtained. Concentrations in animal milk are evaluated using specific radioimmunoassays. Other documents describe methods for preparing proteins in milk of a female mammal other than man. These include, but are not limited to, US 7,045,676 (transgenic mouse) and EP 1,739,170 (production of von Willebrand factor in a transgenic mammal).
- the sample is a sample containing purified FVIIa, in liquid or freeze-dried form.
- an FVIIa may be at least 80% pure and, in particular, at least 95% or even 99% pure.
- the sample is a therapeutic sample containing purified FVIIa, in liquid or freeze-dried form.
- the method according to the invention makes it possible to measure the concentration of plasma FVIIa (pFVIIa), recombinant FVIIa (rFVIIa) or transgenic FVIIa (TgFVIIa).
- the invention relates to a method for the in vitro or ex-vivo measurement of the concentration of FVIIa in a A transgenic mammalian milk fluid comprising the steps of: a) mixing said sample with human plasma lacking FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI; b) adding initiator components of the thrombin generation reaction comprising a source of calcium ions, a phospholipid agent and tissue factor; c) perform a thrombin generation test
- TGT on the reaction medium thus obtained in order to obtain a thrombinogram providing parameters
- the invention relates to a method for the in vitro or ex-vivo measurement of the concentration of FVIIa in a sample containing purified FVIIa, comprising the steps of: a) mixing said sample with a plasma human lacking FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI; b) adding initiator components of the thrombin generation reaction comprising a source ⁇ # calcium ions, a phospholipid agent and tissue factor; c) performing a thrombin generation test (TGT) on the reaction medium thus obtained to obtain a thrombinogram providing parameters; d) comparing at least one of the thrombinogram parameters with a homologous parameter of standard thrombograms, each standard thrombogram being obtained with a fixed standard concentration of FVIIa in said reaction medium, ranging from 1 ⁇ M to 5 nM, and e) deducing from step d) a measurement of the FVIIa concentration of the sample in said range.
- TGT
- lacking means that the concentration of FVII, FVIII, FIX and / or FXI is below the detection threshold of said factor measured by conventional methods of assay well known to those skilled in the art.
- kits or commercial reagents can be used and standard immunological methods can be used.
- the method of the invention makes it possible to measure the concentration of plasma FVIIa, recombinant FVIIa and / or transgenic FVIIa.
- the plasma used in the process according to the invention is devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX and FXI.
- Human plasma lacking FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI can be obtained in different ways.
- a plasma of hemophilia A (devoid of FVIII) which is then depleted in FVII, a hemophiliac plasma.
- B devoid of FIX
- FVII human plasma lacking FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI
- a plasma of hemophilia A devoid of FVIII
- B hemophiliac plasma
- FIX deficiency
- the method of the invention uses a human plasma that lacks
- FVIII, FIX and FXI which is an immunodepleted human plasma.
- Immunodepletion is done in different ways, for example:
- Plasma free of FVII and FVIII is obtained, for example, by depletion by means of antibodies specific for FVII, FVIII or a protein linked to one of these factors, for example, and without being limited to, with anti-FVII, anti-FVIII, von Willebrand antifactor, von Willebrand factor being a plasma protein that transports FVIII into the blood.
- Plasma free of FVII and FIX is obtained, for example, by depletion using antibodies specific for FVII, FIX.
- Plasma free of FVII and FXI is obtained, for example, by depletion using antibodies specific for FVII, FXI or a protein linked to one of these factors, such as, for example, anti-FVII and anti-FXI. .
- the human plasma lacking FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI is a human plasma chemically depleted.
- Human plasma can be depleted of FVIII, which is a Ca 2+ dependent factor, with EDTA. Once plasma depleted FVIII, EDTA is removed by methods well known to those skilled in the art, including dialysis. The depletion methods can be combined with each other to obtain the above factor depleted plasma.
- the final concentration of calcium ions in the reaction medium is between 14 and 18 mM, in particular it is 16.7 mM.
- the source of calcium ions represents any biologically compatible source, such as CaCl 2 .
- the final concentration of the phospholipidic agent in the reaction medium is between 1 and 20 ⁇ M, in particular between 3 and 5 ⁇ M, and that of the tissue factor (FT) is between 0.1 and 10 ⁇ M, in particular between 0 , 1 and 6 ⁇ M.
- the FT concentration for the implementation of the method for the in vitro or ex vivo measurement of the concentration of FVIIa in a purified FVIIa sample is between 0.1 and 10 ⁇ M. in particular between 1 and 5 ⁇ M.
- Another subject of the present invention relates to the use of a human plasma deprived of factor VII and at least one other factor selected from factor VIII, factor IX and factor XI for measuring in vitro or ex vivo the Factor VIIa concentration of a sample.
- a plasma is not only devoid of FVII but also devoid of at least one of the above factors which makes it possible to establish a correlation between the amount of FVIIa present in a sample and some TGT parameters, which was not known at this time.
- the sample whose FVIIa concentration is measured is a plasma sample, a therapeutic sample or a therapeutic sample containing recombinant or transgenic FVIIa as defined above.
- kits that can be used for carrying out the method of the invention comprising: a freeze-dried plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX and the FXI; a lyophilizate containing a phospholipidic agent and tissue factor; a source of calcium ions; and
- kit is therefore advantageously used for the implementation of the method for measuring the concentration of FVIIa in a sample of the invention.
- a device for performing the TGT it will be necessary to have a device for performing the TGT.
- the device for carrying out the thrombin generation test comprises in particular a thrombin calibrator of commercial origin, a thrombin-generating agent generated, for example a suitable fluorogenic reagent, a measuring device, for example a fluorimeter comprising, in addition, a software adapted to collect data to trace a thrombogram, and microplates.
- the kit comprises containers intended to contain the various lyophilizates. The contents of such containers are then dissolved in an aqueous solvent, such as purified water for injection (PPI), so as to obtain the effective concentrations of the components of interest for the implementation of the TGT test.
- PPI purified water for injection
- Such containers may represent microplate wells.
- the concentrations final components of interest in the reaction medium are those indicated above.
- the kit further comprises sampling devices, such as pipettes or micropipettes.
- a lyophilized plasma devoid of FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI, and the lyophilizate containing a phospholipid agent, tissue factor and a source of calcium ions are dissolved in PPI water to which various amounts of freeze-dried FVIIa are added so that the final concentration of FVIIa in the reaction medium thus obtained is in the range of 1 ⁇ M at 5 nM.
- the invention relates to a kit that can be used for carrying out the method of the invention for measuring in vivo, in vitro or ex-vivo the concentration of FVIIa of a milk sample.
- transgenic mammal comprising:
- the invention relates to a kit that can be used for implementing the method of the invention to measure in viczo or ex-vivo the concentration of FVIIa of a sample containing purified FVIIa comprising:
- Another object of the present invention relates to the use of a kit as defined above for in vivo, in vitro or ex-vivo measurement of the FVIIa concentration of a sample.
- kit is easy to use and can be stored at a temperature of 4 ° C. for at least 1 year. It suffices to provide, if necessary, with a thrombin-generating agent generated, for example a suitable fluorogenic reagent as defined above, a measuring device, for example a fluorimeter comprising software for establishing a tracing pathway. thrombinogram and microplates to implement TGT to accurately determine the unknown FVIIa concentration of a sample. This assumes, however, the establishment of standard thrombograms and a thrombogram of the sample whose FVIIa concentration is to be determined.
- a thrombin-generating agent generated, for example a suitable fluorogenic reagent as defined above
- a measuring device for example a fluorimeter comprising software for establishing a tracing pathway.
- the kit is used to measure the concentration of FVIIa of a therapeutic or non-therapeutic sample containing plasma, recombinant or transgenic FVIIa, as defined above.
- concentration of FVIIa of a therapeutic or non-therapeutic sample containing plasma, recombinant or transgenic FVIIa, as defined above.
- a polyclonal antibody made in the rabbit directed against the purified human plasma FVII was coupled to CNBr-activated Sepharose (Pharmacia), then 2mL of the obtained gel were placed in a column. The column was equilibrated with 25 mL of equilibration buffer (0.15 M NaCl, 10 mM citrate, pH 7.4). Then 6 mL of human plasma was passed over the column. Under these conditions, the FVII remains fixed on the column and the eluate is recovered.
- the column was regenerated by eluting the fixed FVII with 20 ml of regeneration buffer (50 mM NaCl, 0.1 M glycine, pH 2.4) and then the column was rebalanced with 20 ml of equilibration buffer (citrate). mM, 0.15 M NaCl, pH 7.4). These steps were repeated 7 to 8 times in order to obtain 6 mL of plasma free of FVII.
- regeneration buffer 50 mM NaCl, 0.1 M glycine, pH 2.4
- equilibration buffer mM, 0.15 M NaCl, pH 7.4
- the appropriate volume of a sample of rFVIIa (NovoSeven®-Novonordisk) is taken and added to 80 ⁇ l of FVII-free plasma obtained in Example 1, so that each reaction mixture contains a final standard concentration. between 0.02 nM and 10 nM.
- the reaction medium is obtained by mixing 20 ⁇ l of initiator factors of the thrombin generation reaction (Ca 2+ , phospholipids and FT) at final concentrations of 5 ⁇ M in FT, 4 ⁇ M in phospholipids (reagent Biodis TS 30.00).
- thrombin-specific fluorogenic agent Fluca reagent kit Biodis TS 50.00
- the TGT curves were established for final rFVIIa concentrations between 0.02 nM and 10 nM to obtain the thrombograms shown in Figure 1. They are established using a fluorimetric time measuring device. of thrombin formation (Fluoroskan - Thermo Electron) equipped with software to establish thrombinograms (Company Thrombinoscope BV), for excitation wavelength of 390 nm and detection at emission wavelength of 460 nm.
- FIGS. 2 and 3 show the respective thrombograms obtained by adding 0.1 nM to 100 nM rFVIIa in plasma deprived of FVIII alone, from the company Diagnostica Stago or hemophiliac A, and from the single FIX, originating from the Company Diagnostica Stago, respectively.
- Example 3 Obtaining a Plasma Free of FVII and FVIII, FIX or FXI
- a polyclonal antibody made in the rabbit directed against the purified human plasma FVII was coupled CNBr-activated Sepharose (Pharmacia), then 2mL of the gel obtained is placed in a column.
- the column was equilibrated with 25 mL of equilibration buffer (0.15 M NaCl, 10 mM citrate, pH 7.4).
- 6 mL of commercial plasma already depleted of FVIII or FIX or FXI, each from the Diagnostica Stago Company was passed over the column. Under these conditions, the FVII remains fixed on the column and the eluate is recovered.
- the column was regenerated by eluting the fixed FVII with 20 ml of regeneration buffer (50 mM NaCl, 0.1 M glycine, pH 2.4) and then the column was rebalanced with 20 ml of equilibration buffer (citrate). mM, 0.15 M NaCl, pH 7.4).
- EXAMPLE 4 Preparation of the Reaction Medium for Performing a Standard Thrombinogram
- the appropriate volume of a sample of rFVIIa is taken which is added to 80 ⁇ l of FVIII-free plasma, coming from the company Diagnostica Stago or being a plasma of hemophiliacs.
- A which was then depleted of FVII according to the procedure of Examples 1 and 3, so that each reaction mixture contained a final standard concentration of rFVIIa of between 1 ⁇ M and 5 nM.
- the reaction medium is obtained by mixing 20 ⁇ l of initiator factors of the thrombin generation reaction (Ca 2+ , phospholipids and FT) at final concentrations of 5 ⁇ M in FT, 4 ⁇ M in phospholipids (reagent Biodis TS 30.00). and 16.7 mM Ca 2+ , 20 ⁇ l of thrombin-specific fluorogenic agent (Fluca reagent kit Biodis TS 50.00) with plasma containing FVIIa obtained as indicated above.
- initiator factors of the thrombin generation reaction Ca 2+ , phospholipids and FT
- reagent Biodis TS 30.00 16.7 mM Ca 2+
- 20 ⁇ l of thrombin-specific fluorogenic agent Fluca reagent kit Biodis TS 50.00
- TGT curves were established for final concentrations of rFVIIa between 1 ⁇ M and 5 nM to obtain thrombograms whose various parameters (latency, peak height, peak time and velocity) are gradually corrected, in a dose-dependent manner, according to the level of FVIIa. They are established using the same fluorimetric measuring device and under the same conditions as those given in Example 2.
- Figure 4 shows the thrombograms obtained in the presence of 1 ⁇ M at 5 nM rFVIIa in plasma lacking FVII and FVIII.
- a decrease in peak thrombin formation time is observed as a function of the amount of rFVIIa present in the sample. This time reaches a limit that can be estimated at 3 minutes for a rFVIIa concentration of 1 nM. It is noted that a plasma devoid of FVII and FVIII does not generate thrombin formation.
- FIGS. 5, 6, 7 and 7bis respectively represent the variations of the peak heights, the peak time, the velocity and the lag time, as a function of the quantity of rFVIIa present in the sample and therefore in the reaction medium. .
- Example 4 The experiment of Example 4 is repeated, but using a reactive plasma lacking FIX, from the company Diagnostica Stago, which was then depleted of FVII according to the procedure of Examples 1 and 3.
- Figure 8 shows the thrombograms obtained in the presence of 5 ⁇ M at 1 nM rFVIIa in plasma lacking FVII and FIX. It is observed a decrease in the time of formation of thrombin at the peak in depending on the amount of FVIIa present in the sample. This time also reaches a limit that can be estimated at 3 minutes for an rFVIIa concentration of 1 nM. It is noted that a plasma devoid of FVII or FIX without the addition of FVIIa does not generate thrombin formation.
- FIGS. 9, 10, 11 and 12 respectively represent the variations of the peak heights, the lag time, the peak time and the velocity, as a function of the quantity of rFVIIa present in the sample and therefore in the reaction medium. .
- Example 4 The experiment of Example 4 is repeated, but using a reactive plasma free of FXI, from the company Diagnostica Stago, which was then depleted of FVII according to the procedure of Examples 1 and 3.
- Figure 13 shows the thrombograms obtained in the presence of 5 ⁇ M at 1 nM rFVIIa in plasma lacking FVII and FXI.
- a decrease in peak thrombin formation time is observed as a function of the amount of FVIIa present in the sample. It is noted that a plasma devoid of FVII and FXI does not generate thrombin formation.
- FIGS. 14, 15, 16 and 17 respectively represent the variations of the peak heights, the lag time, the peak time and the velocity, as a function of the quantity of rFVIIa present in the sample and therefore in the reaction medium. .
- the results obtained show that it is possible to establish a correlation between the FVIIa concentration and the various parameters deduced from the thrombograms.
- Example 7 Example of Measurement of the FVIIa Concentration of a Sample of Unknown Concentration
- a volume of 4 .mu.l of a sample of unknown concentration of rFVIIa was mixed with 76 .mu.l of plasma depleted of FVII and FVIII, as described above.
- the initiator components of the thrombin generation reaction (Ca 2+ , phospholipids and FT) were added to final concentrations of 5 ⁇ M FT, 4 ⁇ M phospholipid (Biodis TS 30.00 reagent), 16.7 mM Ca 2+ , and a fluorogenic agent specific for thrombin (Fluca reagent kit Biodis TS 50.00).
- TGT was performed for the different dilutions of the sample (see Table 1) so as to obtain thrombograms and the corresponding parameters: latency, peak height, peak time and velocity.
- Dilutions 1/200 to 1/5000 correspond to respective concentrations on the standard curves of 0.25 nM to 0.01 nM. Taking into account the dilution factor, the rFVIIa concentration of the unknown sample is 50 nM.
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Abstract
The invention relates to a method for measuring in vitro or ex vivo the concentration of FVII in a sample, that comprises the following steps: mixing said sample with human plasma free of FVII and of at least another factor selected from FVIII, FIX and FXI; b) adding compounds that initiate the thrombine generation reaction, including a calcium ion source, a phospholipidic agent and a tissular factor; c) carrying out a thrombine generation test (TGT) on the reaction medium thus obtained in order to a provide a thrombinogram with parameters; d) comparing at least one of the parameters of the thrombinogram with a homologous parameter of standard thrombinograms, each standard thrombinogram being obtained with a fixed reference concentration of FVIIa in said reaction medium in a range of 1 pM to 5 nM; and e) deducing from step d) a measure of the concentration of FVIIa in the sample included in said range.
Description
Procédé de mesure de la concentration de facteur VII activé (FVIIa) dans un échantillonMethod for measuring activated factor VII concentration (FVIIa) in a sample
La présente invention se rapporte à un procédé de mesure de la concentration de facteur VII activé (FVIIa) dans un échantillon en utilisant un plasma dépourvu de facteur VII (FVII) et d'au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII (FVIII), le facteur IX (FIX) et le facteur XI (FXI) .The present invention relates to a method for measuring the concentration of activated factor VII (FVIIa) in a sample using a factor VII-free plasma (FVII) and at least one other factor selected from factor VIII (FVIII) factor IX (FIX) and factor XI (FXI).
La coagulation sanguine est un mécanisme qui permet aux organismes de contrôler les effusions de sang lors de lésions vasculaires et ainsi d'éviter les hémorragies . La coagulation sanguine se déroule selon des étapes en cascade impliquant différentes proenzymes et procofacteurs présents dans le sang qui sont convertis, par l'intermédiaire d'enzymes protéolytiques, en leur forme activée. Dans cette succession d'étapes (ou cascade) de la coagulation on distingue deux voies, appelées voie extrinsèque de la coagulation et voie intrinsèque de la coagulation. Toutes deux conduisent à la formation du complexe, appelé prothrombinase, constitué de facteur X activé (FXa) , de facteur V activé (FVa), de phospholipides et de calcium. C'est la prothrombinase qui active la prothrombine en thrombine permettant la transformation du fibrinogène soluble en fibrine insoluble qui forme le caillot.Blood coagulation is a mechanism that allows organisms to control blood shedding during vascular lesions and thus prevent bleeding. Blood coagulation occurs in cascading steps involving different proenzymes and procofactors in the blood that are converted, via proteolytic enzymes, into their activated form. In this succession of steps (or cascade) of coagulation, two pathways are distinguished, called the extrinsic pathway of coagulation and the intrinsic pathway of coagulation. Both lead to the formation of the complex, called prothrombinase, consisting of activated factor X (FXa), activated factor V (FVa), phospholipids and calcium. It is prothrombinase that activates prothrombin thrombin allowing the transformation of soluble fibrinogen into insoluble fibrin which forms the clot.
La voie extrinsèque implique l'intervention du FVII présent dans le plasma. Toutefois, ce dernier doit être préalablement activé en FVIIa pour initier la cascade de la coagulation. Le FVIIa seul (non complexé) présente une faible activité protéolytique. Cette activité est potentialisée lorsque le FVIIa est complexé au facteur tissulaire (FT) , protéine associée à des phospholipides, qui est libérée lors de la lésion vasculaire. Le complexe FVIIa-FT transforme le facteur X en facteur Xa en présence d'ions calcium. Le complexe
FVIIa-FT transforme aussi le FIX en FIXa catalysant ainsi la voie intrinsèque de la coagulation. Les facteurs IXa et Xa, en retour, activent le FVII en FVIIa. Le facteur Xa complexé au facteur Va et aux phospholipides (prothrombinase) transforme la prothrombine en thrombine. La thrombine agit sur le fibrinogène en le transformant en fibrine et présente également d'autres activités parmi lesquelles l'activation du facteur V en Facteur Va et du FVIII en FVIIIa. La thrombine active également en présence de calcium le facteur XIII en facteur XIIIa qui permet la consolidation du caillot de fibrine.The extrinsic pathway involves the intervention of FVII present in the plasma. However, the latter must be activated beforehand in FVIIa to initiate the cascade of coagulation. FVIIa alone (uncomplexed) has low proteolytic activity. This activity is potentiated when FVIIa is complexed with tissue factor (TF), a protein associated with phospholipids, which is released during vascular injury. The FVIIa-FT complex transforms factor X into factor Xa in the presence of calcium ions. The complex FVIIa-FT also transforms FIX into FIXa thus catalyzing the intrinsic pathway of coagulation. Factors IXa and Xa, in turn, activate FVII in FVIIa. Factor Xa complexed with factor Va and phospholipids (prothrombinase) converts prothrombin to thrombin. Thrombin acts on fibrinogen transforming it into fibrin and also has other activities including activation of factor V in Factor Va and FVIII in FVIIIa. Thrombin also activates factor XIII in factor XIIIa in the presence of calcium, which allows the consolidation of the fibrin clot.
Alors que dans la voie extrinsèque de la coagulation le FIX est activé en FIXa par le complexe FVIIa/FT, dans la voie intrinsèque de la coagulation, le FIXa est généré à partir du FIX par le FXIa lui même activé par le facteur XII activé par le contact du sang avec une surface électronégative telle que le sous-endothélium.Whereas in the extrinsic coagulation pathway FIX is activated in FIXa by the FVIIa / FT complex, in the intrinsic pathway of coagulation, FIXa is generated from FIX by the FXIa itself activated by activated factor XII. blood contact with an electronegative surface such as the subendothelium.
Le FVIIa, une glycoprotéine dépendante de la vitamine K, joue donc un rôle important dans les mécanismes de la coagulation, aboutissant à la formation de caillot sanguin. Le FVIIa présente l'intérêt de pouvoir agir localement en présence du facteur tissulaire libéré après lésion de tissus engendrant des hémorragies, même en l'absence de Facteur VIII ou IX. C'est pourquoi le FVIIa est utilisé depuis de nombreuses années pour corriger certains troubles de la coagulation se manifestant par des saignements.FVIIa, a vitamin K-dependent glycoprotein, therefore plays an important role in the mechanisms of coagulation, resulting in blood clot formation. FVIIa has the advantage of being able to act locally in the presence of the tissue factor released after lesion of tissues causing haemorrhages, even in the absence of Factor VIII or IX. This is why FVIIa has been used for many years to correct some bleeding disorders.
La première approche fut d'obtenir le FVIIa, à partir du plasma. Mais, la production de FVIIa à partir du plasma est limitée par la disponibilité de la source d'approvisionnement et cette utilisation de plasma présente des risques de transmission d'agents pathogènes comme par exemple le prion et les virus. Ces problèmes ont été résolus par NovoNordisk Pharmaceuticals avec le développement d'un FVIIa recombinant (rFVIIa) qui est une glycoprotéine structurellement similaire au FVIIa plasmatique.
La principale indication thérapeutique pour le rFVIla (aux USA, EU et Japon) concerne le traitement du saignement spontané ou chirurgical des hémophiles A ayant développé des anticorps anti-facteur VIII et des hémophiles B ayant développé des anticorps anti- facteurs IX. En Europe, il est aussi indiqué pour son utilisation chez des patients avec une déficience congénitale en FVII et chez les patients atteints de la thrombasthénie de Glanzmann.The first approach was to obtain FVIIa from plasma. However, the production of FVIIa from plasma is limited by the availability of the source of supply and this use of plasma presents risks of transmission of pathogens such as prion and viruses. These problems have been solved by NovoNordisk Pharmaceuticals with the development of recombinant FVIIa (rFVIIa) which is a glycoprotein structurally similar to plasma FVIIa. The main therapeutic indication for rFVIla (in the USA, EU and Japan) concerns the treatment of spontaneous or surgical bleeding of hemophiliacs A having developed anti-factor VIII antibodies and hemophiliac B having developed anti-factor IX antibodies. In Europe, it is also indicated for use in patients with congenital deficiency of FVII and in patients with Glanzmann thrombasthenia.
En outre, de nombreuses publications rapportent l'efficacité du rFVIla dans le contrôle de l'hémorragie lors d'interventions chirurgicales, chez des patients qui n'ont ni déficit congénital en facteur de la coagulation ni de thrombasthénie.In addition, numerous publications report the efficacy of rFVIla in controlling hemorrhage during surgical procedures in patients who have neither congenital factor deficiency nor thrombasthenia.
Cette utilisation de plus en plus large du FVIIa a conduit à mettre au point des méthodes pour mesurer l'activité du FVIIa ainsi que des méthodes pour déterminer la concentration en FVIIa, par exemple, pour mesurer la concentration d'un échantillon contenant potentiellement du FVIIa ou pour mesurer la concentration plasmatique de FVIIa d'un patient afin de vérifier que la dose de FVIIa administrée est bien adaptée au traitement du trouble de l'hémostase à corriger, et que le patient traité ne se trouve pas en hypo-coagulation ou en hyper-coagulation.This increasing use of FVIIa has led to the development of methods to measure FVIIa activity as well as methods for determining FVIIa concentration, for example, to measure the concentration of a sample potentially containing FVIIa. or to measure the plasma concentration of FVIIa of a patient to verify that the dose of FVIIa administered is well suited to the treatment of the haemostasis disorder to be corrected, and that the treated patient is not in hypo-coagulation or hyper-coagulation.
Les méthodes les plus connues pour détecter l'activité du FVIIa sont la mesure du temps de coagulation, le PTT (Partial Thromboplastin Time - Temps Partiel de Thromboplastine) , l'aPTT (activated partial thromboplastin time - Temps partiel de Thromboplastine activé), le TEG ( thromboélastographe) et le TGT (test de génération de thrombine) . Ces méthodes permettent de détecter l'activité du FVIIa mais ne permettent pas de mesurer directement la concentration précise du FVIIa.The best known methods for detecting FVIIa activity are the measurement of clotting time, PTT (Partial Thromboplastin Time), aPTT (activated partial thromboplastin time), the TEG (thromboelastograph) and TGT (thrombin generation test). These methods make it possible to detect the activity of FVIIa but do not make it possible to directly measure the precise concentration of FVIIa.
Les mesures directes de la concentration de FVIIa pratiquées, telles que le dosage fluorogénique ou
chromogénique du FXa généré par le FVIIa, se sont révélées inappropriées car elles ne permettent pas de différencier l'effet du FVIIa et du FVII.Direct measurements of the concentration of FVIIa practiced, such as the fluorogenic assay or FVIIa generated chromogenic FXa, were found to be inappropriate because they do not differentiate the effect of FVIIa and FVII.
Un kit commercial de dosage immunologique du FVIIa est disponible (IMUBIND Factor VII ELISA kit) mais les conditions expérimentales pour la mise en œuvre de cette technique sont difficilement maîtrisables.A commercial immunoassay kit of FVIIa is available (IMUBIND Factor VII ELISA kit) but the experimental conditions for the implementation of this technique are difficult to control.
D'autres méthodes de mesure de la concentration de FVIIa sont décrites dans la littérature, comme la mesure de son activité protéolytique avec l'utilisation de FT recombinant tronqué (Staclot VIIa-rTF, Stago) (US 5,472,850, US 5,741,658, WO 1992/018870, US 5,750,358, US 5,741,658, US 5,472,850, EP 0 641 443) ou la mesure de la concentration d'un complexe FVIIa-antithrombine (WO 03/004694) . Cependant ces méthodes sont peu précises et difficiles à mettre en œuvre.Other methods of measuring the concentration of FVIIa are described in the literature, such as the measurement of its proteolytic activity with the use of truncated recombinant FT (Staclot VIIa-rTF, Stago) (US 5,472,850, US 5,741,658, WO 1992 / 018870, US 5,750,358, US 5,741,658, US 5,472,850, EP 0 641 443) or the measurement of the concentration of an FVIIa-antithrombin complex (WO 03/004694). However, these methods are not very precise and difficult to implement.
Actuellement une méthode fréquemment employée par certains biologistes et cliniciens pour évaluer l'efficacité d'un traitement avec le FVIIa est basée sur l'utilisation de la thromboélastographie. Cette méthode consiste à mesurer les propriétés physiques d'un sang total en analysant de manière mécanique la formation du caillot en fonction du temps. Selon les paramètres extraits d'un graphique (appelé thrombinogramme ou thromboélastographe®) généré par le thromboélastographe, le clinicien peut évaluer l'aptitude à la coagulation d'un patient. Bien que précise, cette méthode est fastidieuse, peu adaptée à une analyse routinière et répétitive, et difficilement applicable à un multiéchantillonnage car elle nécessite d'être effectuée dans l'heure qui suit le prélèvement sanguin. De plus, cette méthode ne permet pas de mesurer la concentration de FVIIa.Currently a method frequently used by some biologists and clinicians to evaluate the effectiveness of a treatment with FVIIa is based on the use of thromboelastography. This method consists in measuring the physical properties of whole blood by mechanically analyzing clot formation as a function of time. Depending on the parameters extracted from a graph (called thrombinogram or thromboelastograph ® ) generated by the thromboelastograph, the clinician can evaluate the coagulation ability of a patient. Although accurate, this method is tedious, unsuitable for a routine and repetitive analysis, and difficult to apply to multisampling because it requires to be performed within one hour after the blood sample. In addition, this method does not allow to measure the concentration of FVIIa.
Il existe donc un réel besoin de disposer d'un procédé efficace et facile à mettre en oeuvre pour mesurer la concentration de FVIIa, par exemple pour mesurer la concentration d'un échantillon contenant potentiellement du FVIIa ou pour mesurer la
concentration plasmatique de FVIIa d'un patient afin de vérifier que la dose thérapeutique de FVIIa administrée est bien adaptée au traitement du trouble de l'hémostase à corriger et que le patient traité ne se trouve pas en hypo-coagulation ou en hyper-coagulation, comme indiqué ci-dessus .There is therefore a real need to have an efficient and easy process for measuring the concentration of FVIIa, for example to measure the concentration of a sample potentially containing FVIIa or to measure the concentration of FVIIa. plasma concentration of FVIIa of a patient to verify that the therapeutic dose of FVIIa administered is well adapted to the treatment of the haemostasis disorder to be corrected and that the treated patient is not in hypo-coagulation or hyper-coagulation, as indicated above.
La présente invention concerne un procédé de mesure in vitro ou ex-vivo de la concentration de FVIIa dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger ledit échantillon avec un plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI ; b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine comprenant une source d'ions calcium, un agent phospholipidique et du facteur tissulaire ; c) effectuer un test de génération de thrombine (TGT) sur le milieu réactionnel ainsi obtenu afin d'obtenir un thrombinogramme fournissant des paramètres ; d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme à un paramètre homologue de thrombinogrammes standards, chaque thrombinogramme standard étant obtenu avec une concentration étalon fixée de FVIIa dans ledit milieu réactionnel, comprise dans une plage allant de 1 pM à 5 nM, et e) déduire de l'étape d) une mesure de la concentration de FVIIa de l'échantillon comprise dans ladite plage.The present invention relates to a method for in vitro or ex-vivo measurement of the concentration of FVIIa in a sample, comprising the steps of: a) mixing said sample with a human plasma lacking FVII and at least one other selected factor among FVIII, FIX and FXI; b) adding initiator components of the thrombin generation reaction comprising a source of calcium ions, a phospholipid agent and tissue factor; c) performing a thrombin generation test (TGT) on the reaction medium thus obtained to obtain a thrombinogram providing parameters; d) comparing at least one of the thrombinogram parameters with a homologous parameter of standard thrombograms, each standard thrombogram being obtained with a fixed standard concentration of FVIIa in said reaction medium, ranging from 1 μM to 5 nM, and e) deducing from step d) a measurement of the FVIIa concentration of the sample in said range.
La Demanderesse a trouvé de manière surprenante que l'utilisation d'un plasma dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI (plasma doublement dépiété) permet d'obtenir un réactif utilisable dans un procédé de mesure de la concentration de FVIIa dans un échantillon, fiable, reproductible et facile à mettre en œuvre.
En effet, par le procédé de l'invention, il est maintenant possible d'établir une corrélation entre la concentration de FVIIa dans un échantillon et certains paramètres d'un test de génération de thrombine. Grâce à cette corrélation établie par des thrombinogrammes standards, c'est-à-dire effectués avec des concentrations étalons et variables en FVIIa dans le milieu réactionnel, il est possible de déterminer la concentration en FVIIa inconnue dans un échantillon, par comparaison des données fournies par l'intermédiaire de thrombinogammes standards et de celles fournies par le thrombinogramme de l'échantillon à mesurer.The Applicant has surprisingly found that the use of a plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX and FXI (double depleted plasma) makes it possible to obtain a reagent that can be used in a method for measuring the concentration of FVIIa in a sample, reliable, reproducible and easy to implement. Indeed, by the method of the invention, it is now possible to correlate the concentration of FVIIa in a sample and some parameters of a thrombin generation test. Thanks to this correlation established by standard thrombograms, that is to say carried out with standard and variable concentrations of FVIIa in the reaction medium, it is possible to determine the concentration of unknown FVIIa in a sample, by comparison of the data provided. thrombinograms and those provided by the thrombinogram of the sample to be measured.
Le test de la génération de thrombine (TGT) de l'étape c) , connu de l'homme du métier, est basé sur la mesure en continu des quantités de thrombine générée et du temps nécessaire pour générer la thrombine lorsque des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine, dans le cas présent la source d'ions calcium, l'agent phospholipidique et le facteur tissulaire (FT) de l'étape b) , sont mis en présence avec l'échantillon contenant du FVIIa mélangé à un plasma dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI. Dès que l'ensemble de ces composants, constituant ainsi le milieu réactionnel, de volume prédéterminé, est mis en contact, la réaction de génération de thrombine débute, ce qui permet de fixer le temps initial du début de test (t0) . Bien entendu, la teneur en chacun des composants est choisie de façon à ce que cette réaction puisse se produire. Ce test est avantageusement mis en œuvre à l'aide d'un agent de révélation de la thrombine générée. Un tel agent est un agent fluorogénique qui va être dégradé par la thrombine pour donner un composé émettant une fluorescence, ou un agent chromogénique .The thrombin generation test (TGT) of step c), known to those skilled in the art, is based on the continuous measurement of the amounts of thrombin generated and the time required to generate thrombin when initiating components of the thrombin generation reaction, in this case the source of calcium ions, the phospholipid agent and the tissue factor (FT) of step b), are brought into contact with the sample containing FVIIa mixed with a plasma devoid of FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI. As soon as all these components, thus constituting the reaction medium, of predetermined volume, is brought into contact, the thrombin generation reaction begins, which makes it possible to set the initial time of the test start (t 0 ). Of course, the content of each of the components is chosen so that this reaction can occur. This test is advantageously carried out using a thrombin revealing agent generated. Such an agent is a fluorogenic agent that will be degraded by thrombin to give a fluorescent emitting compound, or a chromogenic agent.
La fluorescence est détectée par un dispositif de mesure de la formation de thrombine dans le milieu
réactionnel, tel qu'un fluorimètre classique comprenant en outre un logiciel adapté pour recueillir des données permettant de tracer un thrombinogramme . Ce thrombinogramme se présente sous forme d'une courbe, établie en fonction de la durée du test, présentant un maximum correspondant à la quantité maximale de thrombine générée. Plus la quantité en FVIIa dans l'échantillon augmente, et donc dans le milieu réactionnel, plus le temps pour générer la thrombine diminue pour atteindre ensuite une valeur limite.Fluorescence is detected by a device for measuring thrombin formation in the medium reaction, such as a conventional fluorimeter further comprising software adapted to collect data for tracing a thrombinogram. This thrombinogram is in the form of a curve, established according to the duration of the test, having a maximum corresponding to the maximum amount of thrombin generated. The more the amount of FVIIa in the sample increases, and therefore in the reaction medium, the more the time to generate the thrombin decreases and then reaches a limit value.
Le thrombinogramme permet de fournir les données représentant au moins l'un des paramètres du thrombinogramme (étape d) ) définis de la façon suivante . Le premier des paramètres est la hauteur de pic qui correspond au maximum de thrombine générée, comme indiqué plus haut. Le deuxième est le temps de latence correspondant au temps qui s ' écoule entre le début du TGT (to) et l'apparition de la thrombine. Le temps au pic, troisième paramètre, correspond au temps qui s'écoule entre le début du TGT (t0) et celui correspondant au maximum de thrombine générée . La vélocité, quatrième paramètre, exprimée en nM/min de thrombine formée, correspond à la hauteur de pic divisée par la différence entre le temps au pic et le temps de latence. Ces paramètres peuvent être directement fournis par le dispositif de mesure de la formation de la thrombine .The thrombogram provides data representing at least one of the thrombinogram parameters (step d)) defined as follows. The first of the parameters is the peak height which corresponds to the maximum of thrombin generated, as indicated above. The second is the lag time corresponding to the time that elapses between the start of TGT (to) and the appearance of thrombin. The peak time, third parameter, corresponds to the time that elapses between the beginning of the TGT (t 0 ) and that corresponding to the maximum of thrombin generated. The velocity, fourth parameter, expressed in nM / min of formed thrombin, corresponds to the peak height divided by the difference between the peak time and the lag time. These parameters can be directly provided by the device for measuring the formation of thrombin.
Par conséquent, à l'étape d) , l'un au moins des paramètres du thrombinogramme obtenu avec le procédé selon l'invention est choisi parmi la hauteur de pic, la vélocité, le temps de latence et le temps au pic.Therefore, in step d), at least one of the thrombinogram parameters obtained with the method according to the invention is chosen from peak height, velocity, latency time and peak time.
Selon l'invention, les paramètres de thrombinogrammes standards sont déterminés en réalisant une série de TGT avec des échantillons étalons, constitués du même milieu réactionnel, mais dont chacun comprend une
concentration étalon finale en FVIIa fixée dans la gamine de 1 pM et 5 nM, de préférence dans la gamme de 1 pM et 1 nM pour les paramètres choisis parmi la hauteur de pic et la vélocité, de préférence dans la gamme de 1 pM et 5 nM pour les quatre paramètres . On se place donc dans les mêmes conditions opératoires afin de pouvoir conserver un même volume du milieu réactionnel, bien que de faibles variations de volumes soient acceptables par l'ajout de l'échantillon de FVIIa. On obtient donc un thrombinogramme pour chaque milieu réactionnel dont la teneur en FVIIa est étalonnée.According to the invention, the standard thrombogram parameters are determined by performing a series of TGTs with standard samples, consisting of the same reaction medium, but each of which comprises a final standard concentration in FVIIa fixed in 1 μM and 5 nM, preferably in the range of 1 μM and 1 nM for parameters selected from peak height and velocity, preferably in the range of 1 μM and 5 μM; nM for the four parameters. It is therefore placed under the same operating conditions in order to be able to maintain the same volume of the reaction medium, although small variations in volumes are acceptable by adding the FVIIa sample. A thrombinogram is thus obtained for each reaction medium whose FVIIa content is calibrated.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le FVIIa utilisé pour établir les paramètres de thrombinogrammes standards est un standard international de FVIIa (SI- FVIIa), mis à disposition par l'Institut National des Standards Biologiques et des Contrôles, en Angleterre (NIBSC) .In one embodiment of the invention, the FVIIa used to establish standard thrombogram parameters is an international standard of FVIIa (SI-FVIIa), made available by the National Institute for Biological Standards and Controls, in England ( NIBSC).
A partir de chaque thrombinogramme standard, il est établi des courbes étalons de variation de chacun des paramètres ci-dessus en fonction de la concentration finale en FVIIa dans le milieu réactionnel.From each standard thrombinogram, standard curves of variation of each of the above parameters are established as a function of the final concentration of FVIIa in the reaction medium.
Les paramètres ci-dessus obtenus pour un échantillon dont la concentration en FVIIa est inconnue sont ensuite comparés à ceux homologues obtenus précédemment (étape d) ) . On déduit ainsi directement la concentration de FVIIa de l'échantillon mesuré quel que soit le paramètre utilisé, car celle-ci est déterminée par comparaison avec des courbes de concentrations standards étalons, c'est-à-dire établies à partir de thombinogrammes standards.The above parameters obtained for a sample whose concentration of FVIIa is unknown are then compared with those obtained previously (step d)). The FVIIa concentration of the measured sample is thus directly deduced, whatever the parameter used, because this is determined by comparison with standard standard concentration curves, that is to say based on standard thombinograms.
Dans le cadre de l'invention, l'échantillon de FVIIa, le plasma dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, FIX ou FXI, les composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine peuvent être sous forme liquide ou lyophilisée, le milieu réactionnel étant alors préparé
par dissolution dans un solvant aqueux approprié, tel que l'eau purifiée pour injection (PPI).In the context of the invention, the sample of FVIIa, the plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX or FXI, the initiator components of the thrombin generation reaction can be in the form of liquid or lyophilized, the reaction medium then being prepared by dissolving in a suitable aqueous solvent, such as purified water for injection (PPI).
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'échantillon de FVIIa est sous forme liquide. Pour l'établissement de thrombinogrammes standards, il suffit de prélever le volume approprié à mélanger avec le plasma doublement dépiété considéré, pour obtenir les concentrations finales désirées dans le milieu réactionnel . Ceci peut également être effectué par ajout d'un volume constant de l'échantillon de FVIIa dans ledit plasma, mais de concentrations différentes.According to a particular embodiment of the invention, the sample of FVIIa is in liquid form. For the establishment of standard thrombograms, it is sufficient to take the appropriate volume to mix with the doubly depleted plasma considered, to obtain the desired final concentrations in the reaction medium. This can also be done by adding a constant volume of the FVIIa sample in said plasma, but of different concentrations.
Il est également possible d'établir plusieurs thrombinogrammes pour un échantillon contenant une teneur en FVIIa à déterminer, par dilution successive de celui-ci et ajout d'un même volume dans le plasma doublement dépiété considéré, le volume du milieu réactionnel étant maintenu constant. La comparaison des résultats des paramètres obtenus avec ceux des standards, et du fait de la connaissance des rapports de dilution, permet de fournir la teneur en FVIIa avec précision.It is also possible to establish several thrombograms for a sample containing an FVIIa content to be determined, by successive dilution thereof and addition of the same volume in the doubly depleted plasma considered, the volume of the reaction medium is kept constant. Comparing the results of the parameters obtained with those of the standards, and because of the knowledge of the dilution ratios, makes it possible to provide the FVIIa content precisely.
Divers agents phospholipidiques conviennent dans le cadre de l'invention. Ils peuvent se présenter sous la forme de concentré ou de lyophilisât. De préférence, ils sont sous la forme d'un mélange contenant majoritairement ou exclusivement de la phosphatidylcholine et de la phosphatidylsérine .Various phospholipidic agents are suitable in the context of the invention. They can be in the form of concentrate or lyophilisate. Preferably, they are in the form of a mixture containing predominantly or exclusively phosphatidylcholine and phosphatidylserine.
De même, tout facteur tissulaire (FT) natif, plasmatique, recombinant ou transgénique convient. De plus, certains FT modifiés, en particulier tout FT tronqué ayant perdu sa fonction lui permettant de convertir le facteur VII en facteur VIIa tout en ayant conservé sa capacité d'agir comme cofacteur de l'activité enzymatique du facteur VIIa conviennent. En particulier, le domaine transmembranaire d'un tel FT à été supprimé, cette suppression permettant d'obtenir le déficit sélectif recherché dans la fonction du FT (un
tel facteur tissulaire est disponible dans le commerce). Dans un mode de réalisation de l'invention, un tel FT modifié est utilisé pour la mesure, in vitro ou ex-vivo de la concentration de FVIIa dans un échantillon contenant aussi du FVII.Likewise, any native, plasma, recombinant or transgenic tissue factor (TF) is suitable. In addition, some modified TFs, in particular any truncated FT having lost its function enabling it to convert factor VII to factor VIIa while having retained its ability to act as a cofactor for factor VIIa enzymatic activity, are suitable. In particular, the transmembrane domain of such an FT has been suppressed, this suppression making it possible to obtain the selective deficit sought in the FT function (a such tissue factor is commercially available). In one embodiment of the invention, such modified FT is used for measuring, in vitro or ex vivo, the concentration of FVIIa in a sample also containing FVII.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'échantillon contenant du FVIIa est un échantillon thérapeutique ou non contenant du FVIIa plasmatique (pFVIIa) , recombinant (rFVIIa) ou transgénique (TgFVIIa), sous forme liquide ou lyophilisée.According to one embodiment of the invention, the sample containing FVIIa is a therapeutic sample or not containing plasma FVIIa (pFVIIa), recombinant (rFVIIa) or transgene (TgFVIIa), in liquid or freeze-dried form.
Dans un mode de réalisation particulier, l'échantillon contenant du FVIIa est un échantillon de lait de mammifère, en particulier un échantillon de lait de mammifère transgénique produisant du FVIIa dans son lait.In a particular embodiment, the sample containing FVIIa is a mammalian milk sample, particularly a transgenic mammalian milk sample producing FVIIa in its milk.
Une méthode de production d'une protéine transgénique dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN comprenant un gène codant pour la protéine transgénique, ce gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta-caséine, de la lactalbumine, de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP) est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors ladite protéine transgénique .A method for producing a transgenic protein in the milk of a transgenic animal may comprise the following steps: a DNA molecule comprising a gene encoding the transgene protein, this gene being under the control of a promoter of a transgenic animal; Protein secreted naturally in milk (such as the casein, beta-casein, lactalbumin, beta-lactoglobulin promoter or WAP promoter) is integrated into an embryo of a non-human mammal. The embryo is then placed in a female mammal of the same species. Once the mammal from the embryo has grown sufficiently, the lactation of the mammal is induced, then the milk collected. The milk then contains said transgenic protein.
Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par
introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l 'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus . Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques. D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y limiter, les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170 (production de facteur von Willebrand dans un mammifère transgénique) .An example of a process for the preparation of protein in the milk of a female mammal other than the human is given in EP 0 527 063, the teaching of which may be repeated for the production of the protein of the invention. . A plasmid containing the WAP (Whey Acidic Protein) promoter is manufactured by introduction of a sequence comprising the promoter of the WAP gene, this plasmid being made in such a way as to be able to receive a foreign gene placed under the control of the WAP promoter. The plasmid containing the promoter and the gene coding for the protein of the invention are used to obtain transgenic rabbits by microinjection into the male pronucleus of rabbit embryos. The embryos are then transferred into the oviduct of hormonally prepared females. The presence of the transgenes is revealed by the Southern technique from the DNA extracted from the transgenic rabbits obtained. Concentrations in animal milk are evaluated using specific radioimmunoassays. Other documents describe methods for preparing proteins in milk of a female mammal other than man. These include, but are not limited to, US 7,045,676 (transgenic mouse) and EP 1,739,170 (production of von Willebrand factor in a transgenic mammal).
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'échantillon est un échantillon contenant du FVIIa purifié, sous forme liquide ou lyophilisée. A titre d'exemple, un tel FVIIa peut être pur à au moins 80% et, en particulier, à au moins 95%, voire 99%. En particulier, l'échantillon est un échantillon thérapeutique contenant du FVIIa purifié, sous forme liquide ou lyophilisée.In another particular embodiment, the sample is a sample containing purified FVIIa, in liquid or freeze-dried form. By way of example, such an FVIIa may be at least 80% pure and, in particular, at least 95% or even 99% pure. In particular, the sample is a therapeutic sample containing purified FVIIa, in liquid or freeze-dried form.
Le procédé selon l'invention permet la mesure de la concentration de FVIIa plasmatique (pFVIIa) , de FVIIa recombinant (rFVIIa) ou de FVIIa transgénique (TgFVIIa) .The method according to the invention makes it possible to measure the concentration of plasma FVIIa (pFVIIa), recombinant FVIIa (rFVIIa) or transgenic FVIIa (TgFVIIa).
Ainsi selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé pour la mesure in vitro ou ex-vivo de la concentration de FVIIa dans un
eciidiicx-L±on αe lait de mammifère transgénique, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger ledit échantillon avec un plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI ; b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine comprenant une source d'ions calcium, un agent phospholipidique et du facteur tissulaire ; c) effectuer un test de génération de thrombineThus, according to one particular embodiment, the invention relates to a method for the in vitro or ex-vivo measurement of the concentration of FVIIa in a A transgenic mammalian milk fluid comprising the steps of: a) mixing said sample with human plasma lacking FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI; b) adding initiator components of the thrombin generation reaction comprising a source of calcium ions, a phospholipid agent and tissue factor; c) perform a thrombin generation test
(TGT) sur le milieu réactionnel ainsi obtenu afin d'obtenir un thrombinogramme fournissant des paramètres ; d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme à un paramètre homologue de thrombinogrammes standards, chaque thrombinogramme standard étant obtenu avec une concentration étalon fixée de FVIIa dans ledit milieu réactionnel, comprise dans une plage allant de 1 pM à 5 nM, et e) déduire de l'étape d) une mesure de la concentration de FVIIa de l'échantillon comprise dans ladite plage.(TGT) on the reaction medium thus obtained in order to obtain a thrombinogram providing parameters; d) comparing at least one of the thrombinogram parameters with a homologous parameter of standard thrombograms, each standard thrombogram being obtained with a fixed standard concentration of FVIIa in said reaction medium, ranging from 1 μM to 5 nM, and e) deducing from step d) a measurement of the FVIIa concentration of the sample in said range.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé pour la mesure in vitro ou ex-vivo de la concentration de FVIIa dans un échantillon contenant du FVIIa purifié, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger ledit échantillon avec un plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI ; b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine comprenant une
source α# ions calcium, un agent phospholipidique et du facteur tissulaire ; c) effectuer un test de génération de thrombine (TGT) sur le milieu réactionnel ainsi obtenu afin d'obtenir un thrombinogramme fournissant des paramètres ; d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme à un paramètre homologue de thrombinogrammes standards, chaque thrombinogramme standard étant obtenu avec une concentration étalon fixée de FVIIa dans ledit milieu réactionnel, comprise dans une plage allant de 1 pM à 5 nM, et e) déduire de l'étape d) une mesure de la concentration de FVIIa de l'échantillon comprise dans ladite plage.According to another particular embodiment, the invention relates to a method for the in vitro or ex-vivo measurement of the concentration of FVIIa in a sample containing purified FVIIa, comprising the steps of: a) mixing said sample with a plasma human lacking FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI; b) adding initiator components of the thrombin generation reaction comprising a source α # calcium ions, a phospholipid agent and tissue factor; c) performing a thrombin generation test (TGT) on the reaction medium thus obtained to obtain a thrombinogram providing parameters; d) comparing at least one of the thrombinogram parameters with a homologous parameter of standard thrombograms, each standard thrombogram being obtained with a fixed standard concentration of FVIIa in said reaction medium, ranging from 1 μM to 5 nM, and e) deducing from step d) a measurement of the FVIIa concentration of the sample in said range.
Le terme « dépourvu » signifie que la concentration en FVII, FVIII, FIX et/ou FXI est en dessous du seuil de détection dudit facteur mesuré par les méthodes classiques de dosage bien connues de l'homme de l'art. On peut par exemple utiliser des kits ou réactifs commerciaux et mettre en œuvre des méthodes immunologiques classiques.The term "lacking" means that the concentration of FVII, FVIII, FIX and / or FXI is below the detection threshold of said factor measured by conventional methods of assay well known to those skilled in the art. For example, kits or commercial reagents can be used and standard immunological methods can be used.
Le procédé de l'invention permet de mesurer la concentration de FVIIa plasmatique, de FVIIa recombinant et/ou de FVIIa transgénique.The method of the invention makes it possible to measure the concentration of plasma FVIIa, recombinant FVIIa and / or transgenic FVIIa.
Selon un mode de réalisation préféré, le plasma utilisé dans le procédé selon l'invention est dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI.According to a preferred embodiment, the plasma used in the process according to the invention is devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX and FXI.
Le plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI peut être obtenu de différentes manières. Dans le procédé selon l'invention, on peut utiliser, par exemple, un plasma d'hémophile A (dépourvu de FVIII) qui est ensuite dépiété en FVII, un plasma d'hémophile
B (dépourvu de FIX) qui est ensuite dépiété en FVII ou un plasma de patient ayant un déficit complet en facteur XI qui est ensuite dépiété en FVII.Human plasma lacking FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI can be obtained in different ways. In the process according to the invention, it is possible to use, for example, a plasma of hemophilia A (devoid of FVIII) which is then depleted in FVII, a hemophiliac plasma. B (devoid of FIX) which is then depleted in FVII or a patient plasma having a complete factor XI deficiency which is then depleted in FVII.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention utilise un plasma humain dépourvu deAccording to one particular embodiment, the method of the invention uses a human plasma that lacks
FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi leFVII and at least one other factor selected from the
FVIII, le FIX et le FXI qui est un plasma humain immunodéplété .FVIII, FIX and FXI which is an immunodepleted human plasma.
L' immunodéplétion se fait de différentes manières comme par exemple :Immunodepletion is done in different ways, for example:
Le plasma dépourvu de FVII et FVIII est obtenu, par exemple, par déplétion au moyen d'anticorps spécifiques du FVII, du FVIII ou d'une protéine liée à un de ces facteurs comme par exemple, et sans s'y limiter, avec des anti-FVII, anti-FVIII, antifacteur Willebrand, le facteur Willebrand étant une protéine plasmatique qui transporte le FVIII dans le sang.Plasma free of FVII and FVIII is obtained, for example, by depletion by means of antibodies specific for FVII, FVIII or a protein linked to one of these factors, for example, and without being limited to, with anti-FVII, anti-FVIII, von Willebrand antifactor, von Willebrand factor being a plasma protein that transports FVIII into the blood.
Le plasma dépourvu de FVII et FIX est obtenu, par exemple, par déplétion au moyen d'anticorps spécifiques du FVII, du FIX.Plasma free of FVII and FIX is obtained, for example, by depletion using antibodies specific for FVII, FIX.
Le plasma dépourvu de FVII et FXI est obtenu, par exemple, par déplétion au moyen d'anticorps spécifiques du FVII, du FXI ou d'une protéine liée à un de ces facteurs comme, par exemple, des anti-FVII et anti-FXI.Plasma free of FVII and FXI is obtained, for example, by depletion using antibodies specific for FVII, FXI or a protein linked to one of these factors, such as, for example, anti-FVII and anti-FXI. .
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI est un plasma humain dépiété chimiquement. Le plasma humain peut être dépiété en FVIII, qui est un facteur Ca2+ dépendant, avec de l'EDTA. Une fois le plasma dépiété en FVIII, l'EDTA est éliminé par des méthodes bien connues de l'homme de l'art, notamment par dialyse.
Les méthodes de déplétion peuvent être combinées entre elles afin d'obtenir le plasma dépiété en facteurs ci-dessus.According to a particular embodiment of the invention, the human plasma lacking FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI is a human plasma chemically depleted. Human plasma can be depleted of FVIII, which is a Ca 2+ dependent factor, with EDTA. Once plasma depleted FVIII, EDTA is removed by methods well known to those skilled in the art, including dialysis. The depletion methods can be combined with each other to obtain the above factor depleted plasma.
De préférence, à l'étape b) , la concentration finale en ions calcium dans le milieu réactionnel est comprise entre 14 et 18 mM, en particulier elle est de 16,7 mM. La source d'ions calcium représente toute source biologiquement compatible, telle que le CaCl2. La concentration finale de l'agent phospholipidique dans le milieu réactionnel est comprise entre 1 et 20 μM, en particulier entre 3 et 5 μM, et celle du facteur tissulaire (FT) est comprise entre 0,1 et 10 pM, en particulier entre 0,1 et 6 pM. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la concentration en FT pour la mise en œuvre du procédé pour la mesure in vitro ou ex vivo de la concentration de FVIIa dans un échantillon de FVIIa purifié est comprise entre 0,1 et 10 pM, en particulier entre 1 et 5 pM.Preferably, in step b), the final concentration of calcium ions in the reaction medium is between 14 and 18 mM, in particular it is 16.7 mM. The source of calcium ions represents any biologically compatible source, such as CaCl 2 . The final concentration of the phospholipidic agent in the reaction medium is between 1 and 20 μM, in particular between 3 and 5 μM, and that of the tissue factor (FT) is between 0.1 and 10 μM, in particular between 0 , 1 and 6 μM. In a particular embodiment of the invention, the FT concentration for the implementation of the method for the in vitro or ex vivo measurement of the concentration of FVIIa in a purified FVIIa sample is between 0.1 and 10 μM. in particular between 1 and 5 μM.
Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un plasma humain dépourvu de facteur VII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII, le facteur IX et le facteur XI pour mesurer in vitro ou ex-vivo la concentration de facteur VIIa d'un échantillon.Another subject of the present invention relates to the use of a human plasma deprived of factor VII and at least one other factor selected from factor VIII, factor IX and factor XI for measuring in vitro or ex vivo the Factor VIIa concentration of a sample.
Comme montré précédemment, c'est le fait qu'un plasma soit non seulement dépourvu de FVII mais également dépourvu d'au moins l'un des facteurs ci-dessus qui rend possible l'établissement d'une corrélation entre la quantité de FVIIa présente dans un échantillon et certains paramètres du TGT, ce qui n'avait pas été connu à ce j our .As shown previously, it is the fact that a plasma is not only devoid of FVII but also devoid of at least one of the above factors which makes it possible to establish a correlation between the amount of FVIIa present in a sample and some TGT parameters, which was not known at this time.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon dont on mesure la concentration en FVIIa est un échantillon plasmatique, un échantillon thérapeutique ou un échantillon thérapeutique contenant
du FVIIa recombinant ou transgénique, tel que défini plus haut .According to a preferred embodiment of the invention, the sample whose FVIIa concentration is measured is a plasma sample, a therapeutic sample or a therapeutic sample containing recombinant or transgenic FVIIa as defined above.
Un autre objet de la présente invention est un kit susceptible d'être utilisé pour la mise en œuvre du procédé de l'invention comprenant : un plasma lyophilisé dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI ; - un lyophilisât contenant un agent phospholipidique et du facteur tissulaire ; une source d'ions calcium ; etAnother subject of the present invention is a kit that can be used for carrying out the method of the invention comprising: a freeze-dried plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX and the FXI; a lyophilizate containing a phospholipidic agent and tissue factor; a source of calcium ions; and
- un échantillon de FVIIa lyophilisé pour déterminer au moins l'un des paramètres de thrombinogrammes standards .a freeze-dried sample of FVIIa to determine at least one of the standard thrombogram parameters.
Un tel kit est donc avantageusement utilisé pour la mise en œuvre du procédé de mesure de la concentration de FVIIa dans un échantillon de l'invention. A cette fin, il sera toutefois nécessaire de se munir d'un dispositif pour effectuer le TGT.Such a kit is therefore advantageously used for the implementation of the method for measuring the concentration of FVIIa in a sample of the invention. For this purpose, however, it will be necessary to have a device for performing the TGT.
Le dispositif pour réaliser le test de génération de thrombine comprend notamment un calibrateur de thrombine d'origine commerciale, un agent de révélation de la thrombine générée, par exemple un réactif fluorogénique approprié, un appareil de mesure, par exemple un fluorimètre comprenant en outre un logiciel adapté pour recueillir des données permettant de tracer un thrombinogramme, et des microplaques. Avantageusement, le kit comprend des récipients destinés à contenir les différents lyophilisats . Le contenu de tels récipients est ensuite dissout dans un solvant aqueux, telle que l'eau purifiée pour injection (PPI) , de façon à obtenir les concentrations efficaces des composants d'intérêt pour la mise en œuvre du test TGT. De tels récipients peuvent représenter des puits de microplaques. De préférence, les concentrations
finales des composants d'intérêt dans le milieu réactionnel sont celles indiquées précédemment.The device for carrying out the thrombin generation test comprises in particular a thrombin calibrator of commercial origin, a thrombin-generating agent generated, for example a suitable fluorogenic reagent, a measuring device, for example a fluorimeter comprising, in addition, a software adapted to collect data to trace a thrombogram, and microplates. Advantageously, the kit comprises containers intended to contain the various lyophilizates. The contents of such containers are then dissolved in an aqueous solvent, such as purified water for injection (PPI), so as to obtain the effective concentrations of the components of interest for the implementation of the TGT test. Such containers may represent microplate wells. Preferably, the concentrations final components of interest in the reaction medium are those indicated above.
De préférence, le kit comprend en outre des dispositifs de prélèvement, tels que des pipettes ou des micropipettes .Preferably, the kit further comprises sampling devices, such as pipettes or micropipettes.
Comme mentionné plus haut, pour la mise en œuvre du procédé selon un mode préféré, un plasma lyophilisé dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI, et le lyophilisât contenant un agent phospholipidique, du facteur tissulaire et une source d'ions calcium sont dissous dans de l'eau PPI auxquels on ajoute différentes quantités de FVIIa lyophilisé de façon à ce que la concentration finale en FVIIa dans le milieu réactionnel ainsi obtenu soit compris dans la gamme de 1 pM à 5 nM.As mentioned above, for the implementation of the method according to a preferred embodiment, a lyophilized plasma devoid of FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI, and the lyophilizate containing a phospholipid agent, tissue factor and a source of calcium ions are dissolved in PPI water to which various amounts of freeze-dried FVIIa are added so that the final concentration of FVIIa in the reaction medium thus obtained is in the range of 1 μM at 5 nM.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un kit susceptible d'être utilisé pour la mise en œuvre du procédé de 1 ' invention pour mesurer in vivo, in vitro ou ex-vivo la concentration de FVIIa d'un échantillon de lait de mammifère transgénique comprenant :In a particular embodiment, the invention relates to a kit that can be used for carrying out the method of the invention for measuring in vivo, in vitro or ex-vivo the concentration of FVIIa of a milk sample. transgenic mammal comprising:
- un plasma lyophilisé dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI ;a lyophilized plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX and FXI;
- un lyophilisât contenant un agent phospholipidique et du facteur tissulaire ;a lyophilizate containing a phospholipidic agent and tissue factor;
- une source d'ions calcium ; et - un échantillon de FVIIa lyophilisé pour déterminer au moins l'un des paramètres de thrombinogrammes standards .a source of calcium ions; and a freeze-dried sample of FVIIa to determine at least one of the standard thrombogram parameters.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un kit susceptible d'être utilisé pour la mise en œuvre du procédé de l'invention pour mesurer in
viczo ou ex-vivo la concentration de FVIIa d'un échantillon contenant du FVIIa purifié comprenant :In a particular embodiment, the invention relates to a kit that can be used for implementing the method of the invention to measure in viczo or ex-vivo the concentration of FVIIa of a sample containing purified FVIIa comprising:
- un plasma lyophilisé dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI ;a lyophilized plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX and FXI;
- un lyophilisât contenant un agent phospholipidique et du facteur tissulaire ;a lyophilizate containing a phospholipidic agent and tissue factor;
- une source d'ions calcium ; eta source of calcium ions; and
- un échantillon de FVIIa lyophilisé pour déterminer au moins l'un des paramètres de thrombinogrammes standards .a freeze-dried sample of FVIIa to determine at least one of the standard thrombogram parameters.
Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un kit tel que défini précédemment pour la mesure in vivo, in vitro ou ex-vivo de la concentration en FVIIa d'un échantillon.Another object of the present invention relates to the use of a kit as defined above for in vivo, in vitro or ex-vivo measurement of the FVIIa concentration of a sample.
Un tel kit est simple d'emploi et peut être stocké à une température de 40C pendant au moins 1 an. Il suffit de se munir, le cas échéant, d'un agent de révélation de la thrombine générée, par exemple un réactif fluorogénique approprié comme défini plus haut, un appareil de mesure, par exemple un fluorimètre comprenant un logiciel permettant d'établir un tracé d'un thrombinogramme et des microplaques pour mettre en œuvre le TGT afin de déterminer avec précision la concentration inconnue en FVIIa d'un échantillon. Cela suppose toutefois l'établissement de thrombinogrammes standards et d'un thrombinogramme de l'échantillon dont on souhaite déterminer la concentration en FVIIa.Such a kit is easy to use and can be stored at a temperature of 4 ° C. for at least 1 year. It suffices to provide, if necessary, with a thrombin-generating agent generated, for example a suitable fluorogenic reagent as defined above, a measuring device, for example a fluorimeter comprising software for establishing a tracing pathway. thrombinogram and microplates to implement TGT to accurately determine the unknown FVIIa concentration of a sample. This assumes, however, the establishment of standard thrombograms and a thrombogram of the sample whose FVIIa concentration is to be determined.
Selon un mode de réalisation particulier, le kit est utilisé pour mesurer la concentration de FVIIa d'un échantillon thérapeutique ou non contenant du FVIIa plasmatique, recombinant ou transgénique, comme défini précédemment .
Les exemples ci-dessous illustrent l'invention sans en limiter la portée.According to a particular embodiment, the kit is used to measure the concentration of FVIIa of a therapeutic or non-therapeutic sample containing plasma, recombinant or transgenic FVIIa, as defined above. The examples below illustrate the invention without limiting its scope.
Exemples Exemple 1 : obtention d'un plasma dépourvu de FVIIEXAMPLES EXAMPLE 1 Preparation of a Plasma Free of FVII
Un anticorps polyclonal fabriqué dans le lapin dirigé contre le FVII plasmatique humain purifié a été couplé à du Sépharose activé au CNBr (Pharmacia) , puis 2mL du gel obtenu sont placés dans une colonne. La colonne a été équilibrée avec 25 mL de tampon d'équilibrage (NaCl 0,15 M, citrate 10 mM, pH 7,4). Ensuite, 6 mL de plasma humain ont été passés sur la colonne. Dans ces conditions, le FVII reste fixé sur la colonne et l'éluat est récupéré. La colonne a été régénérée en éluant le FVII fixé avec 20 mL de tampon de régénération (NaCl 50 mM; glycine 0,1 M ; pH 2,4) puis la colonne a été rééquilibrée avec 20 mL de tampon d'équilibrage (citrate 10 mM; NaCl 0,15 M ; pH 7,4). Ces étapes ont été répétées 7 à 8 fois afin d'obtenir 6 mL de plasma dépourvu de FVII .A polyclonal antibody made in the rabbit directed against the purified human plasma FVII was coupled to CNBr-activated Sepharose (Pharmacia), then 2mL of the obtained gel were placed in a column. The column was equilibrated with 25 mL of equilibration buffer (0.15 M NaCl, 10 mM citrate, pH 7.4). Then 6 mL of human plasma was passed over the column. Under these conditions, the FVII remains fixed on the column and the eluate is recovered. The column was regenerated by eluting the fixed FVII with 20 ml of regeneration buffer (50 mM NaCl, 0.1 M glycine, pH 2.4) and then the column was rebalanced with 20 ml of equilibration buffer (citrate). mM, 0.15 M NaCl, pH 7.4). These steps were repeated 7 to 8 times in order to obtain 6 mL of plasma free of FVII.
Exemple 2 : préparation du milieu réactionnel pour réaliser un thrombinogramme standardExample 2 Preparation of the Reaction Medium for Performing a Standard Thrombinogram
On prélève le volume adéquat d'un échantillon de rFVIIa (NovoSeven®-Novonordisk) que l'on ajoute à 80 μl de plasma dépourvu de FVII obtenu à l'Exemple 1, de façon à ce que chaque mélange réactionnel contienne une concentration finale étalon comprise entre 0,02 nM et 10 nM. Le milieu réactionnel est obtenu par mélange de 20 μl de facteurs initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Ca2+, phospholipides et FT) à des concentrations finales de 5 pM en FT, 4 μM en phospholipides, (réactif Biodis TS 30.00) et 16,7 mM en Ca2+, de 20 μl d'agent fluorogénique spécifique de la thrombine (réactif Fluca kit Biodis TS 50.00) avec le plasma contenant du rFVIIa ci-dessus.
Les courbes de TGT ont été établies pour des concentrations finales de rFVIIa comprises entre 0,02 nM et 10 nM de manière à obtenir les thrombinogrammes montrés à la Figure 1. Ils sont établis à l'aide d'un dispositif fluorimétrique de mesure du temps de formation de la thrombine (Fluoroskan - Thermo Electron) muni d'un logiciel pour établir les thrombinogrammes (Société Thrombinoscope BV) , pour une longueur d'onde d'excitation de 390 nm et de détection à une longueur d'onde d'émission de 460 nm.The appropriate volume of a sample of rFVIIa (NovoSeven®-Novonordisk) is taken and added to 80 μl of FVII-free plasma obtained in Example 1, so that each reaction mixture contains a final standard concentration. between 0.02 nM and 10 nM. The reaction medium is obtained by mixing 20 μl of initiator factors of the thrombin generation reaction (Ca 2+ , phospholipids and FT) at final concentrations of 5 μM in FT, 4 μM in phospholipids (reagent Biodis TS 30.00). and 16.7 mM Ca 2+ , 20 μl of thrombin-specific fluorogenic agent (Fluca reagent kit Biodis TS 50.00) with the plasma containing rFVIIa above. The TGT curves were established for final rFVIIa concentrations between 0.02 nM and 10 nM to obtain the thrombograms shown in Figure 1. They are established using a fluorimetric time measuring device. of thrombin formation (Fluoroskan - Thermo Electron) equipped with software to establish thrombinograms (Company Thrombinoscope BV), for excitation wavelength of 390 nm and detection at emission wavelength of 460 nm.
Cette figure montre que les différents thrombinogrammes établis pour le plasma dépourvu du seul FVII ne permettent pas d'obtenir une corrélation entre la concentration de rFVIIa et le temps de formation de la thrombine mesuré au pic. En effet, on n'observe pas de variation notable entre ce temps au pic et la quantité de rFVIIa, ni même une variation significative de la hauteur des pics en fonction de cette quantité. Les figures 2 et 3 présentent les thrombinogrammes respectifs obtenus en ajoutant de 0,1 nM à 100 nM de rFVIIa dans du plasma dépourvu du seul FVIII, provenant de la Société Diagnostica Stago ou d'hémophiles A, et du seul FIX, provenant de la Société Diagnostica Stago, respectivement.This figure shows that the different thrombograms established for the plasma devoid of the single FVII do not make it possible to obtain a correlation between the concentration of rFVIIa and the thrombin formation time measured at peak. Indeed, there is no noticeable variation between this peak time and the amount of rFVIIa, nor even a significant variation in peak height as a function of this amount. FIGS. 2 and 3 show the respective thrombograms obtained by adding 0.1 nM to 100 nM rFVIIa in plasma deprived of FVIII alone, from the company Diagnostica Stago or hemophiliac A, and from the single FIX, originating from the Company Diagnostica Stago, respectively.
Ces figures montrent que les différents thrombinogrammes établis pour les plasmas dépourvus des seuls FVIII et de FIX respectivement ne permettent pas d'obtenir une corrélation entre la concentration de FVIIa et le temps de formation de la thrombine mesuré au pic. En effet, on n'observe pas de variation notable de ce temps au pic, à savoir qu'il est quasi constant en fonction de la quantité de FVIIa ajoutée.These figures show that the different thrombograms established for plasmas lacking only FVIII and FIX respectively do not make it possible to obtain a correlation between the concentration of FVIIa and the thrombin formation time measured at peak. Indeed, there is no noticeable variation of this time at the peak, namely that it is almost constant as a function of the amount of FVIIa added.
Exemple 3: obtention d'un plasma dépourvu de FVII et FVIII, FIX ou FXIExample 3: Obtaining a Plasma Free of FVII and FVIII, FIX or FXI
Un anticorps polyclonal fabriqué dans le lapin dirigé contre le FVII plasmatique humain purifié a été couplé
à du Sépharose activé au CNBr (Pharmacia) , puis 2mL du gel obtenu est placé dans une colonne. La colonne a été équilibrée avec 25 mL de tampon d'équilibrage (NaCl 0,15 M, citrate 10 mM, pH 7,4). Ensuite, 6 mL de plasma commercial déjà dépiété en FVIII ou en FIX ou en FXI, chacun provenant de la Société Diagnostica Stago, ont été passés sur la colonne. Dans ces conditions, le FVII reste fixé sur la colonne et l'éluat est récupéré. La colonne a été régénérée en éluant le FVII fixé avec 20 mL de tampon de régénération (NaCl 50 mM; glycine 0,1 M ; pH 2,4) puis la colonne a été rééquilibrée avec 20 mL de tampon d'équilibrage (citrate 10 mM; NaCl 0,15 M ; pH 7,4).A polyclonal antibody made in the rabbit directed against the purified human plasma FVII was coupled CNBr-activated Sepharose (Pharmacia), then 2mL of the gel obtained is placed in a column. The column was equilibrated with 25 mL of equilibration buffer (0.15 M NaCl, 10 mM citrate, pH 7.4). Then, 6 mL of commercial plasma already depleted of FVIII or FIX or FXI, each from the Diagnostica Stago Company, was passed over the column. Under these conditions, the FVII remains fixed on the column and the eluate is recovered. The column was regenerated by eluting the fixed FVII with 20 ml of regeneration buffer (50 mM NaCl, 0.1 M glycine, pH 2.4) and then the column was rebalanced with 20 ml of equilibration buffer (citrate). mM, 0.15 M NaCl, pH 7.4).
Ces étapes ont été répétées 7 à 8 fois afin d'obtenir 6 mL de plasma doublement dépiété en FVIII, FIX ou FXI et en FVII.These steps were repeated 7 to 8 times to obtain 6 mL of double depleted plasma in FVIII, FIX or FXI and in FVII.
Exemple 4 : préparation du milieu réactionnel pour réaliser un thrombinogramme standard On prélève le volume adéquat d'un échantillon de rFVIIa que l'on ajoute à 80 μl de plasma dépourvu de FVIII, provenant de la Société Diagnostica Stago ou étant un plasma d'hémophiles A, qui a été ensuite dépiété de FVII selon la procédure des Exemples 1 et 3 , de façon à ce que chaque mélange réactionnel contienne une concentration finale étalon de rFVIIa comprise entre 1 pM et 5 nM.EXAMPLE 4 Preparation of the Reaction Medium for Performing a Standard Thrombinogram The appropriate volume of a sample of rFVIIa is taken which is added to 80 μl of FVIII-free plasma, coming from the company Diagnostica Stago or being a plasma of hemophiliacs. A, which was then depleted of FVII according to the procedure of Examples 1 and 3, so that each reaction mixture contained a final standard concentration of rFVIIa of between 1 μM and 5 nM.
Le milieu réactionnel est obtenu par mélange de 20 μl de facteurs initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Ca2+, phospholipides et FT) à des concentrations finales de 5 pM en FT, 4 μM en phospholipides, (réactif Biodis TS 30.00) et 16,7 mM en Ca2+, de 20 μl d'agent fluorogénique spécifique de la thrombine (réactif Fluca kit Biodis TS 50.00) avec le plasma contenant du FVIIa obtenu comme indiqué ci- dessus .The reaction medium is obtained by mixing 20 μl of initiator factors of the thrombin generation reaction (Ca 2+ , phospholipids and FT) at final concentrations of 5 μM in FT, 4 μM in phospholipids (reagent Biodis TS 30.00). and 16.7 mM Ca 2+ , 20 μl of thrombin-specific fluorogenic agent (Fluca reagent kit Biodis TS 50.00) with plasma containing FVIIa obtained as indicated above.
Les courbes de TGT ont été établies pour des concentrations finales de rFVIIa comprises entre 1 pM
et 5 nM de manière à obtenir des thrombinogrammes dont les divers paramètres (temps de latence, hauteur de pic, temps au pic et vélocité) sont progressivement corrigés, de façon dose-dépendante, en fonction du taux de FVIIa. Ils sont établis à l'aide du même dispositif de mesure fluorimétrique et dans les mêmes conditions que celles données à l'Exemple 2.TGT curves were established for final concentrations of rFVIIa between 1 μM and 5 nM to obtain thrombograms whose various parameters (latency, peak height, peak time and velocity) are gradually corrected, in a dose-dependent manner, according to the level of FVIIa. They are established using the same fluorimetric measuring device and under the same conditions as those given in Example 2.
La figure 4 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 1 pM à 5 nM de rFVIIa dans du plasma dépourvu en FVII et FVIII. Il est observé une diminution du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de la quantité de rFVIIa présente dans l'échantillon. Ce temps atteint une limite que l'on peut estimer à 3 minutes pour une concentration en rFVIIa de 1 nM. On note qu'un plasma dépourvu de FVII et de FVIII ne génère pas de formation de thrombine.Figure 4 shows the thrombograms obtained in the presence of 1 μM at 5 nM rFVIIa in plasma lacking FVII and FVIII. A decrease in peak thrombin formation time is observed as a function of the amount of rFVIIa present in the sample. This time reaches a limit that can be estimated at 3 minutes for a rFVIIa concentration of 1 nM. It is noted that a plasma devoid of FVII and FVIII does not generate thrombin formation.
Les figures 5, 6, 7 et 7bis représentent respectivement les variations des hauteurs du pic, du temps au pic, de la vélocité et du temps de latence, en fonction de la quantité de rFVIIa présente dans l'échantillon et donc dans le milieu réactionnel.FIGS. 5, 6, 7 and 7bis respectively represent the variations of the peak heights, the peak time, the velocity and the lag time, as a function of the quantity of rFVIIa present in the sample and therefore in the reaction medium. .
Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre la concentration de FVIIa et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes entre 1 pM et 5 nM.The results obtained show that it is possible to establish a correlation between the concentration of FVIIa and the various parameters deduced from thrombograms between 1 μM and 5 nM.
Les mêmes résultats ont été obtenus avec une concentration en FT de 1 pM (résultats non montrés) .The same results were obtained with a FT concentration of 1 μM (results not shown).
Exemple 5Example 5
L'expérience de l'Exemple 4 est reprise, mais en utilisant un plasma réactif dépourvu de FIX, provenant de la Société Diagnostica Stago, qui a ensuite été dépiété de FVII selon la procédure des Exemples 1 et 3. La figure 8 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 5 pM à 1 nM de rFVIIa dans du plasma dépourvu en FVII et FIX. Il est observé une diminution du temps de formation de la thrombine au pic en
fonction de la quantité de FVIIa présente dans l'échantillon. Ce temps atteint également une limite que l'on peut estimer à 3 minutes pour une concentration en rFVIIa de 1 nM. On note qu'un plasma dépourvu de FVII ou de FIX sans l'ajout de FVIIa ne génère pas de formation de thrombine .The experiment of Example 4 is repeated, but using a reactive plasma lacking FIX, from the company Diagnostica Stago, which was then depleted of FVII according to the procedure of Examples 1 and 3. Figure 8 shows the thrombograms obtained in the presence of 5 μM at 1 nM rFVIIa in plasma lacking FVII and FIX. It is observed a decrease in the time of formation of thrombin at the peak in depending on the amount of FVIIa present in the sample. This time also reaches a limit that can be estimated at 3 minutes for an rFVIIa concentration of 1 nM. It is noted that a plasma devoid of FVII or FIX without the addition of FVIIa does not generate thrombin formation.
Les figures 9, 10, 11 et 12 représentent respectivement les variations des hauteurs du pic, du temps de latence, du temps au pic et de la vélocité, en fonction de la quantité de rFVIIa présente dans l'échantillon et donc dans le milieu réactionnel.FIGS. 9, 10, 11 and 12 respectively represent the variations of the peak heights, the lag time, the peak time and the velocity, as a function of the quantity of rFVIIa present in the sample and therefore in the reaction medium. .
Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre la concentration de FVIIa et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes .The results obtained show that it is possible to establish a correlation between the FVIIa concentration and the various parameters deduced from the thrombograms.
Exemple 6Example 6
L'expérience de l'Exemple 4 est reprise, mais en utilisant un plasma réactif dépourvu de FXI, provenant de la Société Diagnostica Stago, qui a ensuite été dépiété de FVII selon la procédure des Exemples 1 et 3.The experiment of Example 4 is repeated, but using a reactive plasma free of FXI, from the company Diagnostica Stago, which was then depleted of FVII according to the procedure of Examples 1 and 3.
La figure 13 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 5 pM à 1 nM de rFVIIa dans du plasma dépourvu en FVII et FXI. Il est observé une diminution du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de la quantité de FVIIa présente dans l'échantillon. On note qu'un plasma dépourvu de FVII et de FXI ne génère pas de formation de thrombine. Les figures 14, 15, 16 et 17 représentent respectivement les variations des hauteurs du pic, du temps de latence, du temps au pic et de la vélocité, en fonction de la quantité de rFVIIa présente dans l'échantillon et donc dans le milieu réactionnel. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre la concentration de FVIIa et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes .
Exemple 7 : exemple de mesure de la concentration de FVIIa d'un échantillon de concentration inconnueFigure 13 shows the thrombograms obtained in the presence of 5 μM at 1 nM rFVIIa in plasma lacking FVII and FXI. A decrease in peak thrombin formation time is observed as a function of the amount of FVIIa present in the sample. It is noted that a plasma devoid of FVII and FXI does not generate thrombin formation. FIGS. 14, 15, 16 and 17 respectively represent the variations of the peak heights, the lag time, the peak time and the velocity, as a function of the quantity of rFVIIa present in the sample and therefore in the reaction medium. . The results obtained show that it is possible to establish a correlation between the FVIIa concentration and the various parameters deduced from the thrombograms. Example 7: Example of Measurement of the FVIIa Concentration of a Sample of Unknown Concentration
Un volume de 4 μl d'un échantillon de concentration inconnue de rFVIIa a été mélangé avec 76 μl de plasma dépiété en FVII et FVIII, tel que décrit précédemment. On y a ajouté les composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Ca2+, phospholipides et FT) à des concentrations finales de 5 pM en FT, 4 μM en phospholipides (réactif Biodis TS 30.00), 16,7 mM en Ca2+, et un agent fluorogénique spécifique de la thrombine (réactif Fluca kit Biodis TS 50.00).A volume of 4 .mu.l of a sample of unknown concentration of rFVIIa was mixed with 76 .mu.l of plasma depleted of FVII and FVIII, as described above. The initiator components of the thrombin generation reaction (Ca 2+ , phospholipids and FT) were added to final concentrations of 5 μM FT, 4 μM phospholipid (Biodis TS 30.00 reagent), 16.7 mM Ca 2+ , and a fluorogenic agent specific for thrombin (Fluca reagent kit Biodis TS 50.00).
Différentes dilutions de l'échantillon de concentration inconnue de rFVIIa ont été effectuées (voir Tableau 1) et un volume constant de 4 μl de ces échantillons dilués a été ajouté dans 76 μl de plasma dépiété en FVII et FVIII, puis on a incorporé 20 μl de composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine et 20 μl de l'agent fluorogénique spécifique de la thrombine pour obtenir un volume total de 120 μl en milieu réactionnel.Different dilutions of the sample of unknown concentration of rFVIIa were carried out (see Table 1) and a constant volume of 4 μl of these diluted samples was added in 76 μl of plasma depleted in FVII and FVIII, then 20 μl was incorporated. initiator components of the thrombin generation reaction and 20 .mu.l of the thrombin-specific fluorogenic agent to obtain a total volume of 120 .mu.l in the reaction medium.
Un TGT a été réalisé pour les différentes dilutions de l'échantillon (voir Tableau 1) de manière à obtenir des thrombinogrammes et les différents paramètres correspondant : temps de latence, hauteur de pic, temps au pic et vélocité.TGT was performed for the different dilutions of the sample (see Table 1) so as to obtain thrombograms and the corresponding parameters: latency, peak height, peak time and velocity.
Parallèlement, on a préparé différents échantillons de concentration étalon connue de rFVIIa pour un volume de 4 μl que l 'on a mélangé avec 76 μl de plasma dépiété en FVII et FVIII de façon à obtenir des concentrations finales en rFVIIa comprises entre 1 pM et 5 nM pour un volume de 80 μl . On y a ajouté 20 μl de facteurs initiateurs de la réaction de génération de thrombineIn parallel, different samples of known standard concentration of rFVIIa were prepared for a volume of 4 μl and mixed with 76 μl of FVII and FVIII-depleted plasma in order to obtain final rFVIIa concentrations between 1 μM and 5 μL. nM for a volume of 80 μl. 20 μl of initiator factors of the thrombin generation reaction were added thereto
(Ca2+, phospholipides et FT) à des concentrations finales de 5 pM en FT, 4 μM en phospholipides (réactif Biodis TS 30.00), 16,7 mM en Ca2+ et 20 μl d'agent fluorogénique spécifique de la thrombine (réactif Fluca kit Biodis TS 50.00). Les paramètres de thrombinogrammes standards ont été mesurés de manière à
tracer des courbes étalon des valeurs de chacun des paramètres en fonction du -log de la concentration finale en rFVIIa (voir figures 5, 6, 7 et 7bis) .(Ca 2+ , phospholipids and FT) at final concentrations of 5 μM in FT, 4 μM in phospholipids (Biodis TS 30.00 reagent), 16.7 mM in Ca 2+ and 20 μl of fluorogenic thrombin-specific agent ( Fluca reagent kit Biodis TS 50.00). Standard thrombogram parameters were measured to plot standard curves of the values of each of the parameters as a function of the -log of the final concentration of rFVIIa (see Figures 5, 6, 7 and 7a).
Les valeurs des paramètres obtenues pour les différentes dilutions de l'échantillon de concentration inconnue de rFVIIa ont été reportées sur les différentes courbes étalon standard.The parameter values obtained for the different dilutions of the unknown concentration sample of rFVIIa were plotted on the different standard standard curves.
Les dilutions 1/200 à 1/5000 correspondent à des concentrations respectives sur les courbes étalon de 0,25 nM à 0,01 nM. En tenant compte du facteur de dilution, la concentration en rFVIIa de l'échantillon inconnu est de 50 nM.
Dilutions 1/200 to 1/5000 correspond to respective concentrations on the standard curves of 0.25 nM to 0.01 nM. Taking into account the dilution factor, the rFVIIa concentration of the unknown sample is 50 nM.
Tableau 1 : Valeur des différents paramètres pour l'échantillon de concentration en FVIIa inconnueTable 1: Value of the different parameters for the unknown FVIIa concentration sample
Kt
kt
Claims
1. Procédé de mesure in vitro ou ex-vivo de la concentration de facteur VIIa (FVIIa) dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger ledit' échantillon avec un plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII (FVIII), le facteur IX (FIX) et le facteur XI1. A method for measuring in vitro or ex vivo the concentration of factor VIIa (FVIIa) in a sample, comprising the steps of: a) mixing said sample with a human plasma deficient in FVII and at least one other factor selected from factor VIII (FVIII), factor IX (FIX) and factor XI
(FXI) ; b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine comprenant une source d'ions calcium, un agent phospholipidique et du facteur tissulaire ; c) effectuer un test de génération de thrombine (TGT) sur le milieu réactionnel ainsi obtenu afin d'obtenir un thrombinogramme fournissant des paramètres ; d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme à un paramètre homologue de thrombinogrammes standards, chaque thrombinogramme standard étant obtenu avec une concentration étalon fixée de FVIIa dans ledit milieu réactionnel, comprise dans une plage allant de 1 pM à 5 nM, et e) déduire de l'étape d) une mesure de la concentration de FVIIa de l'échantillon comprise dans ladite plage.(FXI); b) adding initiator components of the thrombin generation reaction comprising a source of calcium ions, a phospholipid agent and tissue factor; c) performing a thrombin generation test (TGT) on the reaction medium thus obtained to obtain a thrombinogram providing parameters; d) comparing at least one of the thrombinogram parameters with a homologous parameter of standard thrombograms, each standard thrombogram being obtained with a fixed standard concentration of FVIIa in said reaction medium, ranging from 1 μM to 5 nM, and e) deducing from step d) a measurement of the FVIIa concentration of the sample in said range.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les paramètres de thrombinogrammes standards sont déterminés en réalisant une série de test de génération de thrombine TGT avec des échantillons étalons, constitués du même milieu réactionnel, chacun desdits échantillons comprenant une concentration étalon finale en FVIIa fixée dans la gamme de 1 pM et 5 nM. The method of claim 1, wherein the standard thrombogram parameters are determined by performing a series of TGT thrombin generation assays with standard samples, consisting of the same reaction medium, each of said samples comprising a final fixed FVIIa final concentration. in the range of 1 μM and 5 nM.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 , caractérisé en ce que à l'étape d) l'un au moins des paramètres du thrombinogramme est choisi parmi la hauteur de pic, la vélocité, le temps de latence et le temps au pic.3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that in step d) at least one of the thrombinogram parameters is chosen from peak height, velocity, latency time and peak time.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'échantillon contenant du FVIIa est un échantillon de lait de mammifère transgénique ou un échantillon contenant du FVIIa purifié.4. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the sample containing FVIIa is a sample of transgenic mammalian milk or a sample containing purified FVIIa.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le FVIIa est un FVIIa plasmatique (pFVIIa) , un FVIIa recombinant (rFVIIa) ou un FVIIa transgénique (TgFVIIa) .5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the FVIIa is a plasma FVIIa (pFVIIa), a recombinant FVIIa (rFVIIa) or a transgenic FVIIa (TgFVIIa).
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI est un plasma humain immunodéplété .6. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the human plasma devoid of FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI is an immunodepleted human plasma.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI est un plasma humain dépiété chimiquement.7. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the human plasma devoid of FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI is a human plasma chemically depleted.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le plasma humain dépourvu de facteur VIII est dépiété chimiquement avec de l'EDTA.8. The method of claim 7, characterized in that human plasma lacking factor VIII is chemically depleted with EDTA.
9. Kit susceptible d'être utilisé pour la mise en œuvre du procédé tel que défini selon l'une des revendications 1 à 8, comprenant : un plasma lyophilisé dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII le9. Kit may be used for carrying out the method as defined in one of claims 1 to 8, comprising: a lyophilized plasma free of FVII and at least one other factor selected from FVIII the
FIX et le FXI ; un lyophilisât contenant un agent phospholipidique et du facteur tissulaire ; 1 une source d'ions calcium ; etFIX and FXI; a lyophilizate containing a phospholipidic agent and tissue factor; 1 a source of calcium ions; and
- un échantillon de FVIIa lyophilisé de concentration connue pour déterminer au moins l ' un des paramètres de thrombinogrammes standards.a sample of freeze-dried FVIIa of known concentration for determining at least one of the standard thrombogram parameters.
10. Utilisation d'un kit tel que défini selon la revendication 9, pour la mesure in vitro ou ex-vivo de la concentration en FVIIa d'un échantillon.10. Use of a kit as defined in claim 9, for the in vitro or ex-vivo measurement of the FVIIa concentration of a sample.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'échantillon est un échantillon de lait de mammifère transgénique ou un échantillon contenant du FVIIa purifié.11. Use according to claim 10, characterized in that the sample is a sample of transgenic mammalian milk or a sample containing purified FVIIa.
12. Utilisation selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisée en ce que le FVIIa est un FVIIa plasmatique (pFVIIa) , un FVIIa recombinant (rFVIIa) ou un FVIIa transgénique (TgFVIIa) .12. Use according to one of claims 10 and 11, characterized in that the FVIIa is a plasma FVIIa (pFVIIa), a recombinant FVIIa (rFVIIa) or a transgenic FVIIa (TgFVIIa).
13. Utilisation d'un plasma humain dépourvu de FVII et d'au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI pour mesurer in vitro ou ex-vivo la concentration de FVIIa d'un échantillon.13. Use of a human plasma lacking FVII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI to measure in vitro or ex-vivo the concentration of FVIIa of a sample.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'échantillon est un échantillon de lait de mammifère transgénique ou un échantillon contenant du FVIIa purifié.14. Use according to claim 13, characterized in that the sample is a sample of transgenic mammalian milk or a sample containing purified FVIIa.
15. Utilisation selon l'une des revendications 13 et 14, caractérisée en ce que le FVIIa est un FVIIa plasmatique (pFVIIa) , un FVIIa recombinant (rFVIIa) ou un FVIIa transgénique (TgFVIIa) . 15. Use according to one of claims 13 and 14, characterized in that the FVIIa is a plasma FVIIa (pFVIIa), a recombinant FVIIa (rFVIIa) or a transgenic FVIIa (TgFVIIa).
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