EP2032705A2 - Verwendung eines plastid-lipid associated protein-promotors (pap-promotors) zur heterologen genexpression - Google Patents

Verwendung eines plastid-lipid associated protein-promotors (pap-promotors) zur heterologen genexpression

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Publication number
EP2032705A2
EP2032705A2 EP07765370A EP07765370A EP2032705A2 EP 2032705 A2 EP2032705 A2 EP 2032705A2 EP 07765370 A EP07765370 A EP 07765370A EP 07765370 A EP07765370 A EP 07765370A EP 2032705 A2 EP2032705 A2 EP 2032705A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
genes
promoter
expression
plant
nucleic acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07765370A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
George Mather Sauer
Ralf Flachmann
Christel Renate Schopfer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Priority to EP07765370A priority Critical patent/EP2032705A2/de
Publication of EP2032705A2 publication Critical patent/EP2032705A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Definitions

  • PAP promoter plastid-lipid associated protein promoter
  • the present invention relates to the use of a plastid-lipid associated protein promoter (PAP promoter) for heterologous gene expression preferably for flower-specific expression of genes in plants of the genus Tagetes, the genetically modified plants of the genus Tagetes and a process for the preparation of biosynthetic products Cultivation of genetically modified plants.
  • PAP promoter plastid-lipid associated protein promoter
  • biosynthetic products such as fine chemicals, such as amino acids, vitamins, carotenoids, but also proteins are produced through natural metabolic processes in cells and are used in many industries, including food, feed, cosmetics, feed, food and pharmaceutical industry.
  • fine chemicals / proteins include, but are not limited to, organic acids, both proteinogenic and nonproteinogenic amino acids, nucleotides and nucleosides, lipids and fatty acids, diols, carbohydrates, aromatics, vitamins, carotenoids and cofactors, as well as proteins and enzymes .
  • Their large-scale production is done partly by biotechnological methods using microorganisms that have been developed to produce and secrete large quantities of the desired substance.
  • Carotenoids are synthesized de novo in bacteria, algae, fungi and plants. In recent years, attempts are increasingly being made to use plants as production organisms for fine chemicals, in particular for vitamins and carotenoids.
  • a natural mixture of the carotenoids lutein, zeaxanthin and violaxanthin is extracted, for example, from the flowers of Marigold plants (Tagetes plants) as so-called oleoresin.
  • This oleoresin is used both as an ingredient of nutritional supplements and in the feed sector.
  • Lycopene from tomatoes is also used as a nutritional supplement.
  • Phytoene is mainly used in the cosmetic sector.
  • Ketocarotenoids ie carotenoids containing at least one keto group, such as astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3-hydroxyechinenone, 3'-hydroxyechinenone, adonirubin and adonixanthin are natural antioxidants and pigments which are used by some algae, plants and microorganisms as secondary metabolites. lite are produced.
  • ketocarotenoids and in particular astaxanthin are used as pigmenting auxiliaries in animal nutrition, in particular in trout, salmon and shrimp farming.
  • WO 0032788 describes some carotenoid biosynthesis genes from plants of the genus Tagetes and discloses how genetically modified plants of the genus Tagetes could be produced in order to obtain different carotenoid profiles in the petals and thus to selectively produce certain carotenoids. For this it is necessary to overexpress some biosynthesis genes and suppress others.
  • WO 0032788 postulates the petal-specific promoter of the ketolase from Adonis vernalis.
  • WO 05019460 describes the use of promoters selected from EPSPS promoter, B gene promoter, PDS promoter and CHRC promoter for the expression of genes in Tagetes.
  • a plastid-lipid associated protein promoter (PAP promoter) for the heterologous expression of genes in plants of the genus Tagetes has been found.
  • PAP promoter plastid-lipid associated protein promoter
  • the Brassica BNPAPX promoter is particularly useful for accumulating new ketocarotenoids not present in tagetes in i) relatively high concentration and ii) preferably in the upper, papilled epidermis of the Tagetespetals.
  • the promoter activity is considered to be weak for the lower epidermis based on the accumulation of ketocarotenoids.
  • a promoter is understood as meaning a nucleic acid with expression activity, ie a nucleic acid which, in functional linkage with a nucleic acid to be expressed, hereinafter also referred to as gene, which expresses sion, ie the transcription and translation of this nucleic acid or gene.
  • transcription is the process by which a complementary RNA molecule is produced starting from a DNA template, involving proteins such as RNA polymerase, so-called sigma factors and transcriptional regulatory proteins RNA then serves as a template in the process of translation, which then leads to the biosynthetically active protein.
  • a “functional linkage” in this context means, for example, the sequential arrangement of one of the promoters according to the invention and a nucleic acid sequence to be expressed and optionally further regulatory elements such as a terminator such that each of the regulatory elements fulfills its function in the expression of the nucleic acid sequence This does not necessarily require a direct link in the chemical sense
  • Control sequences can also exert their function on the target sequence from more distant positions or even from other DNA molecules.
  • Arrangements are preferred in which the nucleic acid sequence to be expressed or the gene to be expressed is positioned behind (that is to say at the 3 'end) of the promoter sequence according to the invention, so that both sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed is preferably less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • expression activity is understood to mean the amount of protein formed by the promoter in a specific time, that is to say the expression rate.
  • specific expression activity is meant according to the invention the amount of protein per promoter formed by the promoter in a certain time.
  • the amount of protein formed is thus increased in a certain time compared to the wild type.
  • the rate at which a biosynthetic active protein is produced is a product of the rate of transcription and translation. Both rates can be influenced according to the invention and thus influence the rate of formation of products in a microorganism.
  • heterologous gene expression means that the promoter and the gene functionally linked thereto do not naturally occur in wild-type plants in this arrangement. Heterologous gene expression thus includes the cases that the promoter or the gene to be expressed or both components are not naturally wild-type or that both the promoter and the gene to be expressed are naturally present in the wild-type plant, but at remote chromosomal positions, so that there is no functional linkage in the wild-type plant.
  • wild-type or wild-type plant is understood according to the invention to mean the corresponding starting plant of the genus Tagetes.
  • plant may be understood to mean the starting plant (wild-type) or a genetically modified plant of the genus Tagetes according to the invention or both.
  • wild-type for increasing or causing the expression activity or expression rate and for increasing the content of biosynthetic products is the plant Tagetes erecta, in particular the plant Tagetes erecta hybrid 50011 (WO 02012438) and Tagetes erecta 13819 and theirs by Mu - Tagagenese or breeding resulting derivatives as a reference organism understood.
  • PAP promoter is meant promoters naturally occurring preferentially in plants such as cucumber, tomato, oilseed rape, and others, which cause gene expression of plastid-associated proteins.
  • PAP promoters are naturally occurring preferentially in plants such as cucumber, tomato, oilseed rape, and others, which cause gene expression of plastid-associated proteins.
  • Nucleotide-derived sequence having an identity of at least 60% at the nucleic acid level with the respective sequence SEQ. ID. NO. 9, 18 or 21 or A3) has a nucleic acid sequence which corresponds to the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 9, 18 or 21 hybridized under stringent conditions or
  • the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. Figure 9 represents a promoter sequence of the hypothetical plastid-lipid associated protein 2 from Lycopersicon escolentum.
  • the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. Figure 18 represents a promoter sequence of a Brassica napus hyperthhetic plastid-lipid associated protein.
  • the nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. Figure 21 represents a promoter sequence of a hypothetical Brassica napus plastid-lipid associated protein.
  • the invention further relates to PAP promoters containing one of these sequences (SEQ ID NO: 9, 18 or 21) by substitution, insertion or deletion of nucleotides derived sequence having an identity of at least 60% at the nucleic acid level with the respective sequence SEQ. ID. NO. 9, 18 or 21.
  • Promoters can be prepared, for example, from various organisms whose genomic sequence is known by identity comparisons of the nucleic acid sequences from databases with the sequences SEQ ID NO. Find easily 9, 18 or 21.
  • Artificial PAP promoter sequences according to the invention can be prepared starting from the sequences SEQ ID NO. 9, 18 or 21 by artificial variation and mutation, for example by substitution, insertion or deletion of nucleotides easy to find.
  • substitution is understood to mean the replacement of one or more nucleotides by one or more nucleotides.
  • “Deletion” is the replacement of a nucleotide by a direct bond Insertions are insertions of nucleotides into the nucleic acid sequence which formally replaces a direct bond with one or more nucleotides.
  • Identity between two nucleic acids is understood to mean the identity of the nucleotides over the entire nucleic acid length, in particular the identity which was determined by comparison with the Vector NTI Suite 7.1 software from Informax (USA) using the Clustal method (Higgins DG, Sharp PM Biosci 1989 Apr; 5 (2): 151-1) is calculated by setting the following parameters: and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer.
  • Gap Separation penalty ranks 8 gap separation penalty off % identity for alignment delay 40 Residue specific gaps off
  • Particularly preferred PAP promoters have with the respective nucleic acid sequence SEQ. ID. NO. 9, 18 or 21 has an identity of at least 70%, more preferably at least 80%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, most preferably at least 99%.
  • PAP promoters can furthermore be obtained on the basis of the above-described nucleic acid sequences, in particular starting from the sequences SEQ ID NO. 9, 18 or 21, from various organisms whose genomic sequence is unknown, easily find by hybridization techniques in a manner known per se.
  • Another object of the invention therefore relates to PAP promoters, containing a nucleic acid sequence, which with the nucleic acid sequence SEQ. ID. No. 9, 18 or 21 hybridized under stringent conditions.
  • This nucleic acid sequence comprises at least 10, more preferably more than 12, 15, 30, 50 or more preferably more than 150 nucleotides.
  • hybridizing is meant the ability of a poly or oligonucleotide to bind under stringent conditions to a nearly complementary sequence, while under these conditions nonspecific binding between non-complementary partners is avoided.
  • sequences should preferably be 90-100% complementary.
  • the property of complementary sequences to be able to specifically bind to one another for example, in the Northern or Southern Blot technique or in the primer binding in PCR or RT-PCR advantage.
  • hybridization is carried out according to the invention under stringent conditions.
  • stringent conditions are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF, Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, ColD Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57 or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6.
  • stringent hybridization conditions are meant in particular: The overnight incubation at 42 ° C in a solution consisting of 50% formamide, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6 ), 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate and 20 g / ml denatured sheared salmon sperm DNA, followed by washing the filters with 0.1x SSC at 65 ° C.
  • promoters are understood as meaning fragments which have essentially the same promoter activity as the starting sequence.
  • substantially the same is meant a specific expression activity having at least 50%, preferably 60%, more preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 90%, most preferably 95% of the specific expression activity of the starting sequence.
  • “Fragments” are understood as meaning partial sequences of the PAP promoters described by embodiment A1), A2) or A3), these fragments preferably having more than 10, more preferably more than 12, 15, 30, 50 or particularly preferably more than 150 contiguous nucleotides of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
  • PAP promoter for the expression of genes in plants of the genus Tagetes.
  • All the above-mentioned PAP promoters can furthermore be prepared in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide units, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, p. 896-897).
  • any gene can be expressed in plants of the genus Tagetes, in particular expressing flower-specific, particularly preferably expressing petally specific.
  • Examples of preferred effect genes are genes from the biosynthesis pathway of odoriferous substances and flower colors whose expression or increased expression in plants of the genus Tagetes leads to a change in the odor and / or flower color of flowers of the plants of the genus Tagetes.
  • volatile odor components especially in flowers, has been studied in recent years on various model organisms such as Clarkia breweri and Antirhinum majus L.
  • volatile odor components will be formed within the monoterpene and phenylpropane metabolism.
  • the first case is linalool; Of the phenylpropanes, methyleneugenol, benzyl acetate, methyl benzoate and methyl salicate are derived.
  • preferred genes are selected from the group of nucleic acids encoding a linoleic synthase (LIS), nucleic acids encoding an S-adenosyl-L-Met: (iso) eugenol.
  • LIS linoleic synthase
  • IEMT O-methyltransferase
  • SAMT salicylic acid methyltransferase
  • Particularly preferred effect genes are genes from biosynthetic pathways of biosynthetic products naturally occurring in plants of the genus Tagetes, ie in wild-type type or by genetic modification of the wild type can be produced, in particular in flowers can be produced, particularly preferably in petals.
  • Preferred biosynthetic products are fine chemicals.
  • fine chemical is well known in the art and includes compounds that are produced by an organism and find applications in various industries such as, but not limited to, the pharmaceutical, agricultural, cosmetics, food and feed industries. These compounds include organic acids such as tartaric acid, itaconic acid and diaminopimelic acid, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides (as described for example in Kuiminaka, A. (1996) Nucleotides and related Compounds 6, Rehm et al., Eds.
  • VCH Weinheim and the citations contained therein
  • lipids saturated and unsaturated fatty acids (for example arachidonic acid), diols (for example propanediol and .alpha., Pp. 561-612 Butanediol), carbohydrates (eg hyaluronic acid and trehalose), aromatic compounds (eg aromatic amines, vanillin and indigo), vitamins, carotenoids and cofactors (as described in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins", p. 443-613 (1996) VCH: Weinheim and the citations therein; and Ong, AS, Niki, E. and Packer, L.
  • amino acids comprise the basic structural units of all proteins and are therefore essential for normal cell function.
  • amino acid is known in the art.
  • the proteinogenic amino acids of which there are 20 species, serve as structural units for proteins in which they are linked by peptide bonds, whereas the non-proteinogenic amino acids (of which hundreds are known) do not usually occur in proteins (see Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)).
  • the amino acids may be in the D or L configuration, although L-amino acids are usually the only type found in naturally occurring proteins.
  • Biosynthetic and degradation pathways of each of the 20 proteinogenic amino acids are well characterized in both prokaryotic and eukaryotic cells (See, for example, Stryer, L. Biochemistry, 3rd Edition, pp. 578-590 (1988)).
  • the "essential" amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, and valine
  • They have to be ingested due to the complexity of their biosynthesis are simply synthesized by biosynthesis pathways other 11 "nonessential" amino acids (alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, proline, serine and tyrosine).
  • Higher animals have the ability to synthesize some of these amino acids, however, the essential amino acids must be ingested with food for normal protein synthesis to occur.
  • Lysine is an important amino acid not only for human nutrition, but also for monogastric animals such as poultry and pigs.
  • Glutamate is most commonly used as a flavor additive (monosodium glutamate, MSG) as well as widely used in the food industry, as are aspartate, phenylalanine, glycine and cysteine.
  • Glycine, L-methionine and tryptophan are all used in the pharmaceutical industry.
  • Glutamine, valine, leucine, isoleucine, histidine, arginine, proline, serine and alanine are used in the pharmaceutical and cosmetics industries. Threonine, tryptophan and D- / L-methionine are widely used feed additives (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al., (Ed.) Biotechnology Vol. 6, chapters 14a, VCH: Weinheim).
  • amino acids are also useful as precursors for the synthesis of synthetic amino acids and proteins, such as N-acetylcysteine, S-carboxymethyl-L-cysteine, (S) -5-hydroxytryptophan, and others, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. Bd. A2, pp. 57-97, VCH, Weinheim, 1985.
  • Cysteine and glycine are each produced from serine, the former by condensation of homocysteine with serine, and the latter by transfer of the side chain ⁇ -carbon atom to tetrahydrofolate, in a serine transhydroxymethylase catalyzed reaction.
  • Phenylalanine and tyrosine are prepared from the precursors of the glycolysis and pento- sephosphatweges, erythrose-4-phosphate and Phosphoenolpyruvat in a 9-Sch ⁇ tt- Biosyntheseweg synthesized, which differs only in the last two steps after the synthesis of prephenate. Tryptophan is also produced from these two starting molecules, but its synthesis takes place in a 1 1-step pathway.
  • Tyrosine can also be prepared from phenylalanine in a reaction catalyzed by phenylalanine hydroxylase.
  • Alanine, VaNn and leucine are biosynthetic products of pyruvate, the end product of glycolysis.
  • Aspartate is formed from oxalacetate, an intermediate of the citrate cycle.
  • Asparagine, methionine, threonine and lysine are each produced by conversion of aspartate.
  • Isoleucine is formed from threonine.
  • histidine is formed from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, an activated sugar.
  • Amino acids whose amount exceeds the protein biosynthetic demand of the cell can not be stored and are instead degraded to provide intermediates for the cell's major metabolic pathways (for review, see Stryer, L., Biochemistry, 3rd Ed. Chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle", S 495-516 (1988)).
  • the cell is capable of converting unwanted amino acids into useful metabolic intermediates, amino acid production is costly in terms of energy, precursor molecules, and the enzymes necessary for their synthesis. It is not surprising, therefore, that amino acid biosynthesis is regulated by feedback inhibition, with the presence of a particular amino acid slowing or completely stopping its own production (for a review of the feedback mechanism in amino acid biosynthesis pathways, see Stryer, L., et al. Biochemistry, 3rd Ed., Chapter 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988)). The release of a particular amino acid is therefore limited by the amount of this amino acid in the cell.
  • Vitamins, carotenoids, cofactors and nutraceuticals comprise another group of molecules. Higher animals have lost the ability to synthesize them and thus need to ingest them, although they are readily synthesized by other organisms, such as bacteria. These molecules are either biologically active molecules per se or precursors of biologically active substances that serve as electron carriers or intermediates in a variety of metabolic pathways. In addition to their nutritional value, these compounds also have significant industrial value as dyes, antioxidants and catalysts or other processing aids. (For an overview of the structure, activity and industrial applications of these compounds see, for example, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996).
  • vitamin is known in the art and includes nutrients derived from an organism for normal function but can not be synthesized by this organism itself.
  • the group of vitamins may include cofactors and nutraceutical compounds.
  • cofactor includes non-proteinaceous compounds that are necessary for the occurrence of normal enzyme activity. These compounds may be organic or inorganic; the cofactor molecules of the invention are preferably organic.
  • nutraceutical includes food additives that are beneficial to the health of plants and animals, especially humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and also certain lipids (eg polyunsaturated fatty acids).
  • Preferred fine chemicals or biosynthetic products that can be produced in plants of the genus Tagetes, in particular in petals of the flowers of the plants of the genus Tagetes, are carotenoids, such as, for example, phytoene, lycopene, beta-carotene, lutein, zeaxanthin, astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3-hydroxyechinenone, 3'-hydroxyechinenone, adonirubin, violaxanthin and adonixanthin.
  • carotenoids such as, for example, phytoene, lycopene, beta-carotene, lutein, zeaxanthin, astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3-hydroxyechinenone, 3'-hydroxyechinenone, adonirubin, violaxanthin and adonixanthin.
  • ketocarotenoids such as astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3-hydroxyechinenone, 3'-hydroxyechinenone, adonirubin, and adonixanthin.
  • Thiamine (Vitamin Bi) is made by chemically coupling pyrimidine and thiazole
  • Riboflavin (vitamin B2) is synthesized from guanosine 5'-triphosphate (GTP) and ribose 5'-phosphate. In turn, riboflavin is used to synthesize flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • the family of compounds collectively referred to as "vitamin B6" eg, pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal-5'-phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride) are all derivatives of the common structural unit 5-hydroxy-6-methylpyridine.
  • Panthothenate (pantothenic acid, R - (+) - N- (2,4-dihydroxy-3,3-dimethyl-1-oxobutyl) - ⁇ -alanine) can be prepared either by chemical synthesis or by fermentation.
  • the last steps in pantothenate biosynthesis consist of the ATP-driven condensation of ⁇ -alanine and pantoic acid.
  • the enzymes responsible for the biosynthetic steps for the conversion to pantoic acid, to ⁇ -alanine and to the condensation in pantothenic acid are known.
  • the metabolically active form of pantothenate is coenzyme A, whose biosynthesis proceeds through 5 enzymatic steps.
  • Pantothenate pyridoxal-5'-phosphate, cysteine and ATP are the precursors of coenzyme A. These enzymes not only catalyze the formation of pantothenate but also the production of (R) -pantoic acid, (R) -pantolactone, (R) - Panthenol (provitamin B 5 ), pantethein (and its derivatives) and coenzyme A.
  • the biosynthesis of biotin from the precursor molecule pimeloyl-CoA in microorganisms has been extensively studied, and several of the genes involved have been identified. It has been found that many of the corresponding proteins are involved in Fe cluster synthesis and belong to the class of nifS proteins.
  • the lipoic acid is derived from octanoic acid and serves as a coenzyme in energy metabolism, where it becomes part of the pyruvate dehydrogenase complex and the ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase complex.
  • the folates are a group of substances that are all derived from folic acid, which in turn is derived from L-glutamic acid, p-aminobenzoic acid and 6-methylpterin.
  • the biosynthesis of folic acid and its derivatives, starting from the metabolic intermediates guanosine 5'-triphosphate (GTP), L-glutamic acid and p-aminobenzoic acid has been extensively studied in certain microorgan
  • Corrinoids such as the cobalamins and especially vitamin B12
  • the porphyrins belong to a group of chemicals that are characterized by a tetrapyrrolic ring system.
  • the biosynthesis of vitamin B12 is sufficiently complex that it has not yet been fully characterized, but now much of the involved enzymes and substrates are known.
  • Nicotinic acid (nicotinate) and nicotinamide are pyridine derivatives, also referred to as "niacin”.
  • Niacin is the precursor of the important coenzymes NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adrenine dinucleotide phosphate) and their reduced forms.
  • purine and pyrimidine metabolism and their corresponding proteins are important targets for the treatment of tumors and viral infections.
  • purine or pyrimidine includes nitrogenous bases which are part of the nucleic acids, coenzymes and nucleotides.
  • nucleotide includes the basic structural units of the nucleic acid molecules that comprise a nitrogenous base, a pentose sugar (in RNA, the sugar is ribose, in DNA, the sugar is D-deoxyribose) and phosphoric acid.
  • nucleoside includes molecules which serve as precursors of nucleotides, but unlike the nucleotides have no phosphoric acid moiety.
  • RNA and DNA synthesis By inhibiting the biosynthesis of these moieties or mobilizing them to form nucleic acid molecules, it is possible to inhibit RNA and DNA synthesis; If this activity is purposefully inhibited in carcinogenic cells, the ability to divide and replicate tumor cells can be inhibited.
  • nucleotides that do not form nucleic acid molecules but serve as energy stores (i.e., AMPs) or coenzymes (i.e., FAD and NAD).
  • the purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides also have other uses: as intermediates in the biosynthesis of various fine chemicals (eg thiamine, S-adenosyl-methionine, folates or riboflavin), as energy sources for the cell (eg ATP or GTP) and for chemicals themselves are commonly used as flavor enhancers (eg, IMP or GMP) or for many medical applications (see, for example, Kuninaka, A., (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol.
  • fine chemicals eg thiamine, S-adenosyl-methionine, folates or riboflavin
  • energy sources for the cell eg ATP or GTP
  • chemicals themselves are commonly used as flavor enhancers (eg, IMP or GMP) or for many medical applications (see, for example, Kuninaka, A., (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol.
  • Enzymes involved in purine, pyrimidine, nucleoside or nucleotide metabolism are also increasingly serving as targets against the chemicals used in crop protection, including fungicides, herbicides and herbicides Insecticides are being developed.
  • the purine nucleotides are synthesized via a series of steps via the inosine-5'-phosphate (IMP) intermediate from ribose-5-phosphate, resulting in the production of guanosine 5'-phosphate.
  • AMP adenosine 5'-monophosphate
  • These compounds are also used as energy stores, so that their degradation provides energy for many different biochemical processes in the cell.
  • the Pyrimidinbiosynthe- se via the formation of uridine 5'-monophosphate (UMP) from ribose-5-phosphate.
  • UMP is converted to cytidine 5'-triphosphate (CTP).
  • the deoxy forms of all nucleotides are prepared in a one-step reduction reaction from the diphosphate ribose form of the nucleotide to the diphosphate deoxyribose form of the nucleotide. After phosphorylation, these molecules can participate in DNA synthesis.
  • Trehalose consists of two glucose molecules linked together by ⁇ , ⁇ -1, 1 bonding. It is commonly used in the food industry as a sweetener, as an additive for dried or frozen foods, and in beverages. However, it is also used in the pharmaceutical, cosmetics and biotechnology industries (see, for example, Nishimoto et al., (1998) U.S. Patent No. 5,759,610; Singer, MA and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, CLA and Panek, AD Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; and Shiosaka, MJ Japan 172
  • Trehalose is produced by enzymes from many microorganisms and naturally released into the surrounding medium from which it can be recovered by methods known in the art.
  • biosynthetic products are selected from the group of organic acids, proteins, nucleotides and nucleosides, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, lipids and fatty acids, diols, carbohydrates, aromatic compounds, vitamins and cofactors, enzymes and proteins.
  • Preferred organic acids are tartaric acid, itaconic acid and diaminopimelic acid
  • nucleosides and nucleotides are described, for example, in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds, pp. 561-612, Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., Ed. VCH: Weinheim and the citations contained therein.
  • Preferred biosynthetic products are also lipids, saturated and unsaturated fatty acids such as arachidonic acid, diols such as propanediol and butanediol, carbohydrates such as hyaluronic acid and trehalose, aromatic compounds such as aromatic amines, vanillin and indigo, vitamins and cofactors as described, for example in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim and the citations contained therein; and Ong, AS, Niki, E. and Packer, L.
  • genes which are expressed with the promoters of the invention in plants of the genus Tagetes are therefore genes selected from the group of nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of Nucleotides and nucleosides, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of organic acids, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of lipids and fatty acids, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of diols, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of carbohydrates, nucleic acids encoding Protein from the biosynthetic pathway of aromatic compound, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of vitamins, nucleic acids encoding a protein from the biosynthetic pathway of carotenoids, in particular ketocar
  • Preferred fine chemicals or biosynthetic products that can be produced in plants of the genus Tagetes, in particular in petals of the flowers of the plants of the genus Tagetes, are carotenoids, such as, for example, phytoene, lycopene, beta-carotene, lutein, zeaxanthin, astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3
  • carotenoids such as, for example, phytoene, lycopene, beta-carotene, lutein, zeaxanthin, astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3
  • ketocarotenoids such as astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3-hydroxyechinenone, 3'-hydroxyechinenone, adonirubin, and adonixanthin.
  • Very particularly preferred genes which are expressed with the promoters according to the invention in plants of the genus Tagetes are accordingly genes which encode proteins from the biosynthesis pathway of carotenoids.
  • nucleic acids encoding a phytoene desaturase (phytoene dehydrogenase)
  • nucleic acids encoding a preprophytic synthase nucleic acids encoding a zeta-carotene desaturase
  • nucleic acids encoding a crtISO protein nucleic acids encoding a phytoene desaturase (phytoene dehydrogenase)
  • nucleic acids encoding a preprophytic synthase nucleic acids encoding a zeta-carotene desaturase
  • nucleic acids encoding a crtISO protein nucleic acids encoding a zeta-carotene desaturase
  • nucleic acids encoding a 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase nucleic acids encoding a 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase
  • Nucleic acids encoding a hydroxymethylbutenyl diphosphate synthase nucleic acids encoding a FtsZ protein and nucleic acids encoding a MinD protein.
  • a ketolase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of introducing a keto group on the optionally substituted ⁇ -ionone ring of carotenoids.
  • ketolase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of converting ⁇ -carotene into canthaxanthin.
  • nucleic acids encoding a ketolase and the corresponding ketolases are, for example, sequences
  • Haematoccus pluvialis in particular from Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille (Accession NO: X86782, SEQ ID No. 24) Haematoccus pluvialis, NIES-144 (Accession NO: D45881) Agrobacterium aurantiacum (Accession NO: D584209) Alicaligenes spec. (Accession NO: D58422) Paracoccus marcusii (Accession NO: Y151 12)
  • Paracoccus sp. MBIC1143 (Accession NO: D58420, P54972)
  • Brevundimonas aurantiaca (Accession NO: AY166610, AAN86030)
  • Nodularia spumigena NSOR10 (Accession NO: AY210783, AAO64399)
  • Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Accession NO: NZ_AABC01000195, ZP_0011 1258); Nostoc punctiforme ATCC 29133
  • Deinococcus radiodurans R1 (Accession NO: E75561, AE001872) Synechococcus sp. WH 8102, nucleic acid: Acc.-No. NZ_AAB D01000001, base pair 1, 354,725-1, 355,528
  • a ⁇ -cyclase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of converting a terminal, linear residue of lycopene into a ⁇ -ionone ring.
  • a ⁇ -cyclase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of converting ⁇ -carotene into ⁇ -carotene.
  • ⁇ -cyclase genes are nucleic acids encoding a ⁇ -cyclase from tomato (Accession X86452), as well as ⁇ -cyclases of the following accession numbers:
  • AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina]
  • AAG 10429 beta cyclase [Tagetes erecta]
  • CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus]
  • AAM45381 beta cyclase [Tagetes erecta]
  • ZP_001050 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris st. CCMP1378]
  • ZP_001046 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris st. CCMP1378]
  • ZP_001 134 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus str. MIT9313]
  • BAA29250 393a a long hypothetical protein [Pyrococcus horikoshii] BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3]
  • AAF78200 lycopene cyclase [Bradyrhizobium sp. ORS278] BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv. Milletiae]
  • AAA21262 dycopene cyclase [Pantoea agglomerans]
  • AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina]
  • CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus]
  • a particularly preferred ⁇ -cyclase is also the chromoplast-specific ⁇ -cyclase from tomato (AAG21133)
  • a hydroxylase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of introducing anhydroxy group on the optionally substituted ⁇ -ionone ring of carotenoids.
  • a hydroxylase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity, .beta.-carotene in zeaxanthin or canthaxanthin in
  • hydroxylase gene examples include:
  • a particularly preferred hydroxylase is also the hydroxylase from tomato (Accession Y14810, CrtR-b2)
  • HMG-CoA reductase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of converting 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A into mevalonate.
  • a 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase is meant a protein having the enzymatic activity of converting hydroxyethyl-ThPP and glyceraldehyde-3-phosphate to 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate.
  • an i-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase is meant a protein having the enzymatic activity, 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate in 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate convert
  • an isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase a protein which has the enzymatic activity of converting isopentenyl diphosphate to dimethylallyl phosphate.
  • a geranyl diphosphate synthase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of converting isopentenyl diphosphate and dimethylallyl phosphate into geranyl diphosphate.
  • a farnesyl-diphosphate synthase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of sequentially converting 2-molecule-sopentenyl-diphosphate with dimethylallyl-diphosphate and the resulting geranyl diphosphate into farnesyl-diphosphate
  • a geranylgeranyl diphosphate synthase is understood to mean a protein which has the enzymatic activity of converting farnesyl diphosphate and isopentenyl diphosphate into geranyl geranyl diphosphate.
  • phytoene synthase a protein having the enzymatic activity to convert geranyl geranyl diphosphate to phytoene.
  • a phytoene desaturase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of converting phytoene into phytofluene and / or phytofluene into ⁇ -carotene (zeta carotene).
  • a zeta-carotene desaturase is understood as meaning a protein which has the enzymatic activity of converting ⁇ -carotene into neurosporin and / or neurosporin into lycopene.
  • crtlSO protein a protein having the enzymatic activity to convert 7,9,7 ', 9'-tetra-cis-lycopene to all-trans-lycopene.
  • FtsZ protein is understood as meaning a protein which has a cell division and plasticity division promoting effect and has homologies to tubulin proteins.
  • MinD protein a protein that has a multifunctional role in cell division. It is a membrane-associated ATPase and can show an oscillating movement from pole to pole within the cell.
  • HMG CoA reductase genes are:
  • Examples of i-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase genes are:
  • Examples of 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase genes are:
  • isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase genes are:
  • geranyl diphosphate synthase genes are:
  • Examples of farnesyl diphosphate synthase genes are:
  • Arabidopsis thaliana contains two difentially expressed farnesyl diphosphate synthase genes, J. Biol. Chem. 271 (13), 7774-7780 (1996), as well as other farnesyl diphosphate synthase genes from other organisms the following accession numbers:
  • geranylgeranyl diphosphate synthase genes are:
  • phytoene synthase genes examples include:
  • phytoene desaturase genes are:
  • zeta-carotene desaturase genes are:
  • a nucleic acid encoding a Narcissus pseudonarcissus zeta-carotene desaturase ACCESSION # AJ224683, published by AI-Babili, S., Oelschlegel. and Beyer.P .: A cDNA encoding beta carotene desaturase (Accession No. AI224683) from Narcissus pseudonarcissus L. (PGR98-103), Plant Physiol.117, 719-719 (1998), and other zeta-carotene desaturase Genes from other organisms with the following accession numbers:
  • crtlSO genes are:
  • FtsZ genes are:
  • MinD genes are:
  • the invention further relates to a genetically modified plant of the genus Tagetes, wherein the genetic modification leads to an increase or causation of the expression rate of at least one gene in comparison to the wild type and is conditioned by the regulation of the expression of this gene in the plant by the present invention.
  • a genetically modified plant of the genus Tagetes wherein the genetic modification leads to an increase or causation of the expression rate of at least one gene in comparison to the wild type and is conditioned by the regulation of the expression of this gene in the plant by the present invention.
  • lick promoters a genetically modified plant of the genus Tagetes, wherein the genetic modification leads to an increase or causation of the expression rate of at least one gene in comparison to the wild type and is conditioned by the regulation of the expression of this gene in the plant by the present invention.
  • the regulation of the expression of genes in the plant by the promoters according to the invention is achieved by
  • nucleic acid constructs containing at least one promoter according to the invention and functionally linked one or more genes to be expressed introduces genes into the plant.
  • nucleic acid constructs containing at least one promoter according to the invention and functionally linked one or more genes to be expressed are introduced into the plant.
  • the integration of the nucleic acid constructs in the plant of the genus Tagetes can take place intrachromosomally or extrachromosomally.
  • Preferred promoters of the invention and preferred genes to be expressed are described above.
  • the transformation can be done singly or through multiple constructs in the combinations of genetic alterations.
  • the transgenic plants are preferably produced by transformation of the starting plants, with a nucleic acid construct which contains at least one of the promoters according to the invention described above, which are functionally linked to an effect gene to be expressed and optionally further regulatory signals.
  • nucleic acid constructs in which the promoters and effect genes according to the invention are functionally linked, will also be expression cassettes in the following called.
  • the expression cassettes may contain further regulatory signals, ie regulatory nucleic acid sequences which control the expression of the effect genes in the host cell.
  • an expression cassette comprises upstream, i. at the 5 'end of the coding sequence, at least one promoter of the invention and downstream, i. at the 3 'end, a polyadenylation signal and optionally other regulatory elements operably linked to the intermediate coding sequence of the effect gene for at least one of the genes described above.
  • Operative linkage is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and optionally further regulatory elements such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequence as intended.
  • nucleic acid constructs, expression cassettes and vectors for plants and methods for the production of transgenic plants, as well as the transgenic plants of the genus Tagetes themselves are described by way of example.
  • sequences are targeting sequences for ensuring subcellular localization in the apoplast, vacuole, plastids, mitochondria, endoplasmic reticulum (ER), nucleus, oil bodies or other compartments, and Translational enhancers such as the 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus (GaIMe et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).
  • the preparation of an expression cassette is preferably carried out by fusion of at least one promoter according to the invention with at least one gene, preferably with one of the effect genes described above, and preferably a nucleic acid inserted after promoter and nucleic acid sequence which codes for a plastid-specific transit peptide, and before a polyadenylation signal according to common recombination and cloning techniques, as described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Colden Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989) and in TJ.
  • nucleic acids encoding a plastid transit peptide ensure localization in plastids and in particular in chromoplasts.
  • expression cassettes whose nucleic acid sequence encodes an effectgen product fusion protein, wherein part of the fusion protein is a transit peptide which controls the translocation of the polypeptide.
  • Preferred for the chromoplasts are specific transit peptides, which are cleaved enzymatically after translocation of the effect genes into the chromoplasts of the effect gene product part.
  • the transit peptide derived from the plastidic Nicotiana tabacco transketolase or other transit peptide e.g., the Rubisco minor subunit transit peptide (rbcS) or the ferredoxin NADP oxidoreductase, as well as the isopentenyl pyrophosphate isomerase-2 or its functional equivalent.
  • rbcS Rubisco minor subunit transit peptide
  • ferredoxin NADP oxidoreductase as well as the isopentenyl pyrophosphate isomerase-2 or its functional equivalent.
  • a plastid transit peptide examples include the transit peptide of the plastidic isopentenyl pyrophosphate isomerase-2 (IPP-2) from Arabisopsis thaliana and the transit peptide of the small subunit of ribulose bisphosphate carboxylase (rbcS) from pea (Guerineau, F, Woolston, S, Brooks, L, Mullineaux, P (1988) An expression case for targeting foreign proteins into the chloroplasts, Nucl. Acids Res. 16: 1 1380).
  • IPP-2 plastidic isopentenyl pyrophosphate isomerase-2
  • rbcS ribulose bisphosphate carboxylase
  • nucleic acids according to the invention may be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural nucleic acid constituents, as well as consist of different heterologous gene segments of different organisms.
  • Preferred, as described above, are synthetic nucleotide sequences with codons that are preferred by plants. These plant-preferred codons can be determined from codons with the highest protein abundance that are expressed in most interesting plant species.
  • various DNA fragments can be manipulated to obtain a nucleotide sequence which conveniently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the promoter and terminator regions may be provided in the direction of transcription with a linker or polylinker containing one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6 restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp.
  • the promoter may be both native or homologous as well as foreign or heterologous to the host plant.
  • the expression cassette preferably contains in the 5'-3 'transcription direction the promoter, a coding nucleic acid sequence or a nucleic acid construct and a region for transcriptional termination. Different termination areas are interchangeable with each other.
  • Examples of a terminator are the 35S terminator (Guerineau et al., (1988) Nucl Acids Res. 16: 1 1380), the nos terminator (Depicker A, Sting S, Dhaese P, Zambryski P, Goodman HM, Nopaline synthase : JM Appl Genet., 1982; 1 (6): 561-73) or the ocs Terminator (Gielen, J, de Beuckeleer, M, Seurinck, J, Debroek, H, de Greve, H, Lemmers, M. van Montagu, M., Schell, J. (1984) The complete sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch ⁇ . EMBO J. 3: 835-846).
  • manipulations that provide appropriate restriction sites or remove the excess DNA or restriction sites may be employed.
  • deletions or substitutions such as e.g. Transitions and trans-versions may be used in vitro mutagenesis, primer-repair, restriction or ligation.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of the T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACH ⁇ (Gielen et al., EMBO J. 3 (US Pat. 1984), 835 ff) or functional equivalents.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • Suitable methods for the transformation of plants are the protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun - the so-called "particle bombardment” method, the electropo- ration, incubation of dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and Agrobacterium-mediated gene transfer, as described above.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 as well in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225).
  • the construct to be expressed is cloned into a vector suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711) or more preferably pSUN2, pSUN3, pSUN4 or pSUN5 (WO 02/00900).
  • a vector suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711) or more preferably pSUN2, pSUN3, pSUN4 or pSUN5 (WO 02/00900).
  • Agrobacteria transformed with an expression plasmid can be used in a known manner to transform plants, e.g. by bathing wounded leaves, leaf pieces or cotyledons in an agrobacteria solution and then cultivating in suitable media.
  • the fused expression cassette is cloned into a vector, for example pBin19 or in particular pSUN5 and pSUN3, which is suitable for being transformed into Agrobacterium tumefaciens.
  • Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner for the transformation of plants, in particular of crop plants, for example by bathing wounded leaves, leaf pieces or cotyledons in an Agrobacterium solution and then cultivating them in suitable media.
  • Leaf pieces or cotyledons can be regenerated in a known manner transgenic plants containing one or more genes integrated into the expression cassette.
  • an expression cassette is inserted as an insertion into a recombinant vector whose vector DNA contains additional functional regulatory signals, for example sequences for replication or integration.
  • Suitable vectors are described, inter alia, in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press), Chap. 6/7, pp. 71-119 (1993).
  • the expression cassettes can be cloned into suitable vectors that allow their replication, for example, in E. coli.
  • suitable cloning vectors include pJIT1 17 (Guerineau et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16: 11380), pBR332, pUC series, M13mp series and pACYC184.
  • Particularly suitable are binary vectors which can replicate both in E. coli and in Agrobacteria.
  • nucleic acids encoding a ketolase nucleic acids encoding a ⁇ -hydroxylase
  • nucleic acids encoding a ⁇ -cyclase nucleic acids encoding an ⁇ -cyclase
  • nucleic acids encoding an epoxidase nucleic acids encoding an HMG-CoA.
  • nucleic acids encoding an (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase nucleic acids encoding an i-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase, nucleic acids encoding an i-deoxy-D Xylose-5-phosphate reductoisomerase, nucleic acids encoding an isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase, nucleic acids encoding a geranyl diphosphate synthase, nucleic acids encoding a farnesyl diphosphate synthase, nucleic acids encoding a geranyl geranyl diphosphate synthase , Nucleic acids encoding a phytoene synthase, nucleic acids encoding a phytoene desaturase, nucleic acids encoding a prepitiate synthase, encoding nucleic acids e zeta-caroten
  • Preferred genetically modified plants of the genus Tagetes are Marigold, Tagetes erecta, Tagetes patula, Tagetes lucida, Tagetes pringlei, Tagetes palmeri, Tagetes minuta or Tagetes campanulata.
  • metabolic pathways that lead to a specific biosynthetic product by causing or increasing the transcription rate or expression rate of genes of this biosynthetic pathway by the increased amount of protein to increased overall activity of these proteins of the desired biosynthetic pathway and thus by an increased metabolic flux to ge - wish biosynthetic product leads.
  • the transcription rate or expression rate of various genes must be increased or reduced.
  • At least one increased or induced expression rate of a gene can be attributed to a promoter according to the invention.
  • the invention therefore relates to a process for the preparation of biosynthetic products by culturing genetically modified plants of the genus Tagetes according to the invention.
  • the invention relates in particular to a process for the preparation of carotenoids by culturing genetically modified plants of the genus Tagetes according to the invention, characterized in that the genes to be expressed are selected from the group of nucleic acids encoding a ketolase, nucleic acids encoding a ⁇ -hydroxylase, encoding nucleic acids ⁇ -cyclase, nucleic acids encoding an ⁇ -cyclase, nucleic acids encoding an epoxidase, nucleic acids encoding an HMG-CoA reductase, nucleic acids encoding an (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase, Nucleic acids encoding a 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase, nucleic acids encoding a 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase, nucleic acids encoding an isopentenyl diphosphate ⁇ is
  • the carotenoids are preferably selected from the group phytoene, phytofluene, lycopene, lutein, beta-carotene, zeaxanthin, astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3-hydroxyechinenone, 3'-hydroxyechinenone, adonirubin, violaxanthin and adonixanthin.
  • the invention further relates to a process for the preparation of Ketoca- rotinoiden by culturing genetically modified plants of the genus Tagetes according to the invention, characterized in that the genes to be expressed are selected from the group of nucleic acids encoding a ketolase, nucleic acids encoding a ß-hydroxylase, Nucleic acids encoding a ⁇ -cyclase, nucleic acids encoding an ⁇ -cyclase, nucleic acids encoding an epoxidase, nucleic acids encoding an HMG-CoA reductase, nucleic acids encoding an (E) -4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase , Nucleic acids encoding a 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase, nucleic acids encoding a 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate reductoisomerase, nucleic acids encoding an isopen
  • Carotene desaturase nucleic acids encoding a crtlSO protein, nucleic acids encoding a FtsZ protein and nucleic acids encoding a MinD protein.
  • ketocarotenoids are preferably selected from the group astaxanthin, canthaxanthin, echinenone, 3-hydroxyechinenone, 3'-hydroxyechinenone, adonirubin, and adonixanthin.
  • the culturing step of the genetically modified plants is harvesting of the plants and isolation of the biosynthetic products, in particular carotenoids, preferably ketocarotenoids from the plants, preferably from the petals of the plants, connected.
  • the genetically modified plants of the genus Tagetes are grown in known manner on nutrient media and harvested accordingly.
  • ketocarotenoids from the harvested petals is carried out, for example, in a conventional manner, for example by drying and subsequent extraction and optionally further chemical or physical purification processes, such as precipitation methods, crystallography, thermal separation methods, such as rectification or physical separation methods, such as chromatography ,
  • the isolation of ketocarotenoids from the petals is for example preferably by organic solvents such as acetone, hexane, heptane, ether or tert-methyl butyl ether. Further isolation methods of ketocarotenoids, in particular of petals, are described, for example, in Egger and Kleinig (Phytochemistry (1967) 6, 437-440) and Egger (Phytochemistry (1965) 4, 609-618).
  • ketocarotenoid is astaxanthin.
  • ketocarotenoids are obtained in the process according to the invention in petals in the form of their mono- or diesters with fatty acids.
  • Some proven fatty acids are e.g. Myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linolenic acid, and lauric acid (Kamata and Simpson (1987) Comp. Biochem. Physiol., Vol. 86B (3), 587-591).
  • Genetically modified plants or parts of plants according to the invention which can be consumed by humans and animals, in particular petals with an increased content of biosynthetic products, in particular carotenoids, in particular ketocarotenoids, in particular astaxanthin, can also be used, for example, directly or according to known processing as foodstuffs or feedstuffs. and food supplements.
  • the genetically modified plants can be used for the production of biosynthetic product, in particular carotenoid, in particular ketocarotenoid, in particular astaxanthin-containing extracts and / or for the preparation of feed and food supplements and of cosmetics and pharmaceuticals.
  • the genetically modified plants of the genus Tagetes in comparison to the wild type, have an increased content of the desired biosynthetic products, in particular carotenoids, in particular ketocarotenoids, in particular astaxanthin.
  • an increased content is also understood as meaning a caused content of ketocarotenoids or astaxanthin.
  • Amplification of a DNA corresponding to the entire primary sequence of the LEPAP2 promoter from Lycopersicum esculentum was isolated by means of "thermal interlaced (TAIL) PCR" (Liu et al., 1995 Plant J 457-463, Tsukeli et al., 1996 Plant J 479- 489) isolated from Lycopersicum escultentum var. Moneymaker.
  • TAIL thermal interlaced
  • the "TAIL-PCR" method can be used to isolate unknown DNA fragments flanking a known DNA sequence, in this example the sequence upstream of the 5 ' end of the genomic sequence was isolated corresponding to the tomato EST clone EST554295 (SEQ ID No. 01) (Accession BI934406, tomato flower, anthesis Lycopersicon esculentum cDNA clone cTOD19B12 5 'end, mRNA sequence). Three different primers with antisense orientation to tomato EST clone EST554295 were derived. These primers were used individually in successive PCR reactions with any degenerate primer.
  • the "TAIL-PCR” is performed according to an adapted protocol of the method of Liu et al. (1995 Plant J 8 (3): 457-463) and Tsugeki et al. (1996 Plant J 10 (3): 479-489).
  • the following master mix data per reaction batch
  • Taq polymerase (TAKARA)
  • the product of the PCR reaction is diluted 1:50 and 1 ⁇ l of each diluted sample is used for a second PCR reaction (secondary PCR).
  • second PCR the following master mix (data per reaction mixture) is used:
  • the PCR product of the secondary PCR reaction is diluted 1:10 and 1 ⁇ l of each diluted sample is used for a third PCR reaction (tertiary PCR).
  • master mix data per reaction mixture
  • the primers LEPAP2-F (SEQ ID NO: 07) and LEPAP2-R (SEQ ID NO: 08) were derived from the sequence of the insert of pCRLEPAP2TAIL to obtain the correct sequence of the LEPP2 promoter from Lycopersicum escultentum (excluding those due to multiple TAIL PCR rounds inserted mutations). For this purpose, these primers were used in a specific PCR reaction with genomic DNA from Lycopersiconesculentum as "template”.
  • the PCR conditions were the following:
  • the PCR for amplification of the LEPAP2 promoter from Lycopersicum escultentum was carried out in a 50 ⁇ l reaction mixture which contained:
  • the PCR amplification with SEQ ID no. 07 and SEQ ID no. 08 resulted in a 777 bp fragment consisting of the promoter sequence of the PAP2 gene from Lycopersicum escultentum (SEQ ID 09).
  • this PCR product was cloned into the PCR cloning vector pCR2.1 (Invitrogen) and the clone pCRLEPAP2 was obtained.
  • pJIT117 was modified by replacing the 35S terminator with the CAT terminator (cathepsin D inhibitor gene) from Solanum tuberosum (position 9-34 of database entry AX696004, SEQ 16 of patents WO03008596).
  • the DNA fragment containing the CAT terminator region was amplified by PCR using the genomic DNA from Solanum tuberosum (preparation according to Galbiati M et al. (2000) Funct Integral Genomics: 25-233) and the primer CAT-1 (SEQ ID No. 25) and CAT-2 (SEQ ID No. 26).
  • the PCR conditions were the following:
  • the PCR for amplifying the DNA containing the cathepsin D inhibitor gene (CAT) terminator region was carried out in a 50 ⁇ l reaction mixture containing:
  • the PCR was carried out under the following cycle conditions:
  • the 237 bp amplicon (SEQ ID NO: 27) was cloned using standard methods into the PCR cloning vector pCR 2.1 (Invitrogen) and the plasmid pCAT was obtained.
  • the cloning of the CAT terminator into the vector pJIT1 17 was carried out by isolating the Sall / Spel fragment from pCAT and ligation into the Sall / Spel cut vector pJIT117.
  • the clone is called pJCAT.
  • the cloning of the LEPAP2 promoter into the vector pJCAT was carried out by isolating the 777bp Kpnl / HindIII fragment which encodes the LEPAP2 promoter from pCRLEPAP2 and ligation into the KpnI / HindIII cut vector pJCAT.
  • the resulting clone, which contains the LEPAP2 promoter in the correct orientation with the rbcs transit peptide, is called pJLEPAP2CAT.
  • Example 2 Amplification of a DNA corresponding to the complete primary sequence of the Brassica napus BNPAP2 promoter.
  • the DNA coding for the plant Brassica napus PAP2 promoter was purified by thermal interlaced (TAIL) PCR (Liu et al 1995 Plant J 457-463, Tsugeki et al 1996 Plant J 479-489).
  • isolated from Brassica napus TAIL-PCR can be used to isolate unknown DNA fragments flanking a known DNA sequence
  • sequences were isolated in the genome upstream of the corresponding 5 ' end of the known rapeseed cDNA sequence AF290564 ("Brassica rapa plastid-lipid associated protein PAP2 mRNA, complete cds;""SEQ ID NO: 10.")
  • Three different primers antisense to the rape cDNA AF290564 were deduced These primers were used individually in successive PCR reactions with any degenerate primer. For a first'TAIL-PCR 'reaction, the following master mix (data per reaction mixture) is used.
  • 20.2 ⁇ l of this master mix are added by pipette into 1 ⁇ l of a preparation of genomic DNA from Brassica napus (preparation according to Galbiati M et al. (2000) Funct Integral Genomics: 25-34) in a PCR vessel and mixed well by pipetting.
  • the primary PCR reaction is carried out under the following conditions: 94 ° C for 1 min four cycles at 94 ° C for 10s, 62 ° C for 1 min and 72 ° C for 150s 94 ° C for 10s, 25 ° C for 3 min, 0.2 ° C / s to 72 ° C and 72 ° C for 150s fourteen cycles at 94 ° C for 10s, 69 ° C for 1min, 72 ° C for 150s, 94 ° C for 10s, 68 ° C for 1 min, 72 ° C for 150s, 94 ° C for 10s, 44 ° C for 1 min and 72 ° C for 150s • 72 ° C for 5 min, then 4 ° C until further use.
  • the product of the primary PCR reaction is diluted 1:50 and 1 ⁇ l of the dilution is used for a second PCR reaction (secondary PCR).
  • second PCR the following master mix (data per reaction mixture) is used: 1 1 ⁇ l sterile H2O (bidistilled)
  • Taq polymerase (TAKARA)
  • the PCR amplification with SEQ ID no. 13 and SEQ ID NO. 14 resulted in a 1564 bp fragment consisting of the promoter and a short section at the 5 'terminus of the coding sequence of the Brassica napus BNPAP2 gene (Seq ID No. 15).
  • the PCR product was cloned into the PCR cloning vector pCR 2.1 (Invitrogen) and the clone pCRBNPAP2TAIL was obtained.
  • the primers BNPAP2-F2 (SEQ ID NO: 16) and BNPAP2-R2 (SEQ ID NO: 17) were derived from pCRBNPAP2TAIL based on the sequence of the insert to obtain the correct sequence of the Brassica napus BNPAP2 promoter (lacking multiple TAIL PCR rounds inserted mutations). For this purpose, these primers were used in a specific PCR reaction with genomic DNA from Brassica napus as "template.” The PCR conditions were the following:
  • This clone was subsequently used for cloning into the expression vector pJIT1 17 (Guerineau et al 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380).
  • the cloning was carried out by isolating the 958 bp KpnI / HindIII fragment from pCRBNPAP2 and ligation into the KpnI / HindIII cut vector pJIT1 17.
  • the resulting clone containing the BNPAP2 promoter in the correct orientation with the rbcs transit peptide is designated pJBNPAP2.
  • Example 3 Amplification of a DNA corresponding to the complete primary sequence of the Brassica napus BNPAPX promoter.
  • the DNA encoding the Brassica napus PAPX promoter was amplified by PCR from Brassica napus.
  • Primers BNPAP2-F2 (SEQ ID NO: 19) and BNPAP2-R1 (SEQ ID NO: 20) were derived from pCRBNPAP2TAIL based on the sequence of the insert. For this purpose, these primers were used in a specific PCR reaction with genomic DNA from Brassica napus as a "template".
  • the PCR conditions were the following:
  • the PCR amplification with SEQ ID no. 19 and SEQ ID NO. Compound 20 resulted in a 1043 bp fragment consisting of the promoter of the Brassica napus PAPX gene (SEQ ID No. 21).
  • the PCR product was cloned into the PCR cloning vector pCR 2.1 (Invitrogen) and the clone pCRBNPAPX was obtained. This clone was subsequently used for cloning into the expression vector pJIT1 17 (Guerineau et al 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380).
  • the expression vector pJIT1 17 was modified by the 35S terminator by the OCS terminator (octopine synthase) of the Ti plasmid pTi15955 from Agrobacterium tumefaciens (database entry X00493 from position 12.541-12.350, Gielen et al. (1984) EMBO J. 3 835-846).
  • the DNA fragment containing the OCS terminator region (SEQ ID NO: 30) was purified by PCR using the plasmid pHELLSGATE (database entry AJ31 1874, Wesley et al., (2001) Plant J. 27 581-590, according to standard methods E. coli isolated) as well as the primer OCS-1 (SEQ ID No. 28) and OCS-2 (SEQ ID No. 29).
  • the PCR for the amplification of the DNA which contains the octopine synthase (OCS) terminator region (SEQ ID 30), was carried out in a 50 ⁇ l reaction mixture containing: 2 ⁇ l of a preparation of pHELLSGATE plasmid DNA
  • the PCR was carried out under the following cycle conditions:
  • the 204 bp amplicon was cloned into the PCR cloning vector pCR 2.1 (Invitrogen) using standard methods and the plasmid pOCS was obtained.
  • Sequencing of the clone pOCS confirmed a sequence which corresponds to a sequence section on the Ti plasmid pTi 15955 from Agrobacterium tumefaciens (database entry X00493) from position 12.541 to 12.350.
  • the cloning of the OCS terminator into the vector pJIT1 17 was carried out by isolation of the Sall / Spel fragment from pOCS and ligation into the Sall-Spel cut vector pJIT117. The clone is called pJOCS.
  • the cloning of the BNPAPX promoter into the vector pJOCS was carried out by isolating the Kpnl / HindIII fragment, which codes for the BNPAPX promoter, from pCRBNPAPX and ligation into the KpnI / HindIII cut vector pJOCS.
  • the resulting clone, containing the BNPAPX promoter in the correct orientation with the rbcs transit peptide, is designated pJBNPAPXOCS.
  • the cDNA coding for the ketolase from Haematococcus pluvialis was obtained by the method described below from Haematococcus pluvialis suspension cultures (strain 192.80 of the "Collection of algae cultures of the University of Göttingen”).
  • RNA from Haematococcus pluvialis cells were isolated from a suspension culture which was cultured for 2 weeks in indirect daylight and room temperature.
  • the medium used was "aematococcus medium" (1.2 g / l sodium acetate, 2 g / l yeast extract, 0.2 g / l MgCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.02% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, pH 6.8, after autoclaving: addition of 400 mg / l L-asparagine, 10 mg / l FeSO 4 XH 2 O.)
  • the Haematococcus pluvialis cells were harvested from the above culture, frozen in liquid nitrogen, and pulverized in a mortar, and then 100 mg of the frozen pulverized algal cells were transferred to a reaction vessel and suspended in 0.8 ml of Trizol buffer (Life Technologies) .This suspension was extracted with 0.2 ml of chloroform After centrifuging at 12,000 ⁇ g for 15
  • RNA concentration was determined photometrically.
  • cDNA synthesis 2.5 ⁇ g of total RNA were denatured at 60 ° C. for 10 minutes, cooled on ice for 2 minutes and purified by means of a cDNA kit ("ready-to-go-you-prime-beads", Pharmacia Biotech). according to the manufacturer's instructions using an antisense-specific primer (PR1 SEQ ID NO: 22) into cDNA rewritten.
  • PR1 SEQ ID NO: 22 an antisense-specific primer
  • the nucleic acid encoding a Haematococcus pluvialis ketolase (strain 192.80) was purified by Haematococcus pluvialis polymerase chain reaction (PCR) using a sense-specific primer (PR1 SEQ ID NO: 22) and an antisense-specific primer (PR2 SEQ ID NO. 23) with the cDNA from the above-described synthesis reaction as a template amplified.
  • PCR Haematococcus pluvialis polymerase chain reaction
  • the PCR conditions were the following:
  • the PCR was performed under the following cycling conditions: 1X 94 ° C 2 minutes 35X 94 ° C 1 minute 53 ° C 2 minutes
  • the PCR amplification with SEQ ID NO. 22 and SEQ ID NO. 23 resulted in a 997 bp fragment encoding a protein consisting of the entire primary sequence of a ketolase (SEQ ID NO: 24).
  • the PCR product was cloned into the PCR cloning vector pCR2.1 (Invitrogen) and the clone pCRKETO2 was obtained.
  • the clone pCRKETO2 was used for cloning into the expression vector pJLE-
  • PAP2CAT (see above) used.
  • the cloning was carried out by isolation of the 997 bp SphI fragment from pCRKETO2 and ligation into the SphI-cut vector pJLEPAP2.
  • the clone containing the Haematococcus pluvialis ketolase in the correct orientation as an N-terminal translational fusion with the rbcs transit peptide is called pLEPAPBKT.
  • pS5LEPAP2BKT contains the LEPAP2 promoter from Lycopersicon esculentum, the Pisum sativum rbcS transit peptide, Haematococcus pluvialis ketolase, and the polyadenylation signal from the Agrobacterium tumefaciens octopine synthase.
  • the clone pCRKETO2 was further used for cloning into the expression vector pJBNPAP2 (see above).
  • the cloning was carried out by isolating the 997 bp SphI fragment from pCRKETO2 and ligation into the SphI-cut vector pJBNPAP2.
  • the clone containing the Haematococcus pluvialis ketolase in the correct orientation as an N-terminal translational fusion with the rbcs transit peptide is called pBNPAP2BKT.
  • pS5BNPAP2BKT 1 contains the Brassica napus BNPAP2 promoter, the Pisum sativum rbcS transit peptide, Haematococcus pluvialis ketolase, and the polyadenylation signal from the Agrobacterium tumefaciens octopine synthase.
  • the clone pCRKETO2 was therefore used for cloning into the expression vector pJBNPAPXOCS (see above).
  • the cloning was carried out by isolating the 997 bp SphI fragment from pCRKETO2 and ligation into the SphI cut vector pJBNPAPX.
  • the clone which contains the sequence of Haematococcus pluvialis ketolase in the correct orientation as N-terminal translational fusion with the rbcs transspeptide, is called pBNPAPXBKT.
  • the expression vector for the Agrobacterium-mediated transformation of the Hematococcus pluvialis ketone gene in Tagetes erecta under expression control of the BN PAPX promoter was produced using the binary vector pSUN5 (WO02 / 00900).
  • pS5BNPAPXBKT contains the Brassica napus BNPAPX promoter, the Pisum sativum rbcS transit peptide, Haematococcus pluvialis ketolase, and the polyadenylation signal from the Agrobacterium tumefaciens octopine synthase.
  • Tagetessamen obtained from the IPK Genbank, Gatersleben, Germany, listed there under TAG76, also available from ornamental plant collection, Erfurt: assortment number: 8184.00
  • MS medium Murashige and Skoog, Physiol, Plant 15 (1962), 473-497
  • the germination takes place in a temperature tur / light / time interval of 18 to 28 ° C / 20-200 ⁇ E / m 2 s for 3 to 16 weeks, but preferably at 21 ° C, 20 to 70 ⁇ E / m 2 s, for 4 to 8 weeks.
  • a selectable marker gene preferably bar or pat
  • trait or reporter genes is grown overnight (for example, pS5BNPAPXBKT and pS5LEPAP2BKT) and used for co-cultivation with the leaf material.
  • the growth of the bacterial strain can be carried out as follows: A single colony of the corresponding strain is dissolved in YEB (0.1% yeast extract, 0.5% beef extract, 0.5% peptone, 0.5% sucrose, 0.5% magnesium sulfate x 7 H2O) was inoculated with 25 mg / l kanamycin and grown at 28 ° C for 16 to 20 h. Subsequently, the bacterial suspension is harvested by centrifugation at 6000 g for 10 min and resuspended in liquid MS medium such that an OD ⁇ oo of about 0.1 to 0.8 resulted. This suspension is used for C cultivation with the leaf material.
  • the MS medium in which the leaves have been stored is replaced by the bacterial suspension.
  • the incubation of the leaflets in the agrobacteria suspension was carried out for 30 min with gentle shaking at room temperature.
  • the infected explants are placed on an agar medium (eg 0.8% Plant Agar (Duchefa, NL) solidified MS medium with growth regulators, such as 3 mg / l benzylaminopurine (BAP) and 1 mg / l indolylacetic acid (IAA).
  • BAP Plant Agar
  • IAA 1 mg / l indolylacetic acid
  • the orientation of the leaves on the medium is meaningless.
  • the cultivation of the explants takes place for 1 to 8 days, but preferably for 6 days, with the following conditions being applicable: light intensity: 30 to 80 mmol / m 2 ⁇ sec, temperature : 22 to 24 ° C., light / dark change of 16/8 hours
  • the co-cultured explants are transferred to fresh MS medium, preferably with the same growth regulators, this second medium additionally containing an antibiotic for suppressing bacterial growth Timentin in a concentration of 200 to 500 mg / l is very suitable for this purpose, as the second selective component is one for the selection of the transformation success used.
  • Phosphinothricin in a concentration of 1 to 5 mg / l selected very efficiently, but other selective components according to the method to be used are conceivable.
  • the explants are transferred to fresh medium until shoot buds and small shoots develop, which are then spotted on the same basal medium including Timentin and PPT or alternative components with growth regulators, e.g. 0.5 mg / l indolyl butyric acid (IBA) and 0.5 mg / l gibberillic acid GA3, are transferred to the rooting. Rooted shoots can be transferred to the greenhouse.
  • growth regulators e.g. 0.5 mg / l indolyl butyric acid (IBA) and 0.5 mg / l gibberillic acid GA3
  • Days, preferably 3 to 4 are preincubated on the above-described medium for co-culture. Subsequently, the infection, co-culture and selective regeneration as described above.
  • the pH value for regeneration (normally 5.8) can be lowered to pH 5.2. This improves the control of agrobacterial growth.
  • Liquid culture medium can also be used for the entire procedure.
  • the culture can also be incubated on commercially available carriers that are positioned on the liquid medium.
  • plants were obtained, for example, which are referred to below as MS259-11, MS259-23, MS259-28.
  • a lipase solution 50 mg / ml Candida rugosa type 7 lipase (Sigma)
  • 595 ⁇ l lipase solution 50 mg / ml Candida rugosa type 7 lipase (Sigma)
  • another 595 ⁇ l lipase was added with renewed incubation of at least 5 hours at 37 ° C.
  • 700 mg of Na 2 SO 4 are dissolved in the solution.
  • the carotenoids are extracted by vigorous mixing into the organic phase. This shaking is repeated until the organic phase remains colorless.
  • the petroleum ether fractions are combined and the petroleum ether is evaporated. Free carotenoids are taken up in 100-120 ⁇ l of acetone.
  • free carotenoids can be identified on the basis of retention time and UV-VIS spectra.
  • the bile salts or bile salts used are 1: 1 mixtures of cholate and deoxycholate. b) Working instructions for reprocessing if only small amounts of carotenoid esters are present in the plant material
  • hydrolysis of the carotenoid esters by lipase from Candida rugosa can be achieved after separation by thin layer chromatography. For this, 50-100 mg of plant material are extracted three times with about 750 ⁇ l of acetone. The solvent extract is concentrated by rotary evaporation under vacuum (elevated temperatures of 40-50 0 C are tolera- bel). This is followed by addition of 300 .mu.l petroleum ether acetone (ratio 5: 1) and thorough mixing. Suspended solids are sedimented by centrifugation (1-2 minutes). The upper phase is transferred to a new reaction vessel. The remainder is again extracted with 200 ⁇ l Petrolethe ⁇ Aceton (ratio 5: 1) and suspended solids are removed by centrifugation.
  • the two extracts are combined (volume 500 ⁇ l) and the solvents evaporated.
  • the residue is resuspended in 30 ⁇ l of petroleum ether acetone (ratio 5: 1) and applied to a thin-layer plate (silica gel 60, Merck). If more than one application is required for preparative analytical purposes, several aliquots of 50-100 mg fresh weight each should be processed as described for TLC.
  • the thin-layer plate is developed in petroleum ether acetone (ratio 5: 1). Carotenoid bands can be visually identified by their color. Individual carotenoid bands are scratched out and can be pooled for preparative-analytical purposes.
  • acetone With acetone, the carotenoids are eluted from the silica material; the solvent is evaporated in vacuo.
  • the residue is dissolved in 495 ⁇ l acetone, 17 mg Bile salts (Sigma), 4.95 ml 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) and 149 ⁇ l (3M NaCl, 75 mM CaCb) are added. After thorough mixing is equilibrated at 37 0 C for 30 min.
  • Na2SO4 anhydrous
  • petroleum ether is shaken out for about 1 minute and the mixture is centrifuged at 3500 revolutions / minute for 5 minutes.
  • the upper phase is transferred to a new reaction vessel and the shaking is repeated until the upper phase is colorless.
  • the combined petroleum ether phase is concentrated in vacuo (temperatures of 40-50 0 C are possible).
  • the residue is dissolved in 120 ⁇ l of acetone, possibly by means of ultrasound.
  • the dissolved carotenoids can be separated by HPLC using a C30 column and quantitated by reference substances.
  • Violaxanthin about 1 1, 7 min, astaxanthin about 17.7 min, adonixanthin about 19 min, adonirubin about 19.9 min, zeaxanthin about 21 min.
  • Table 1 Carotenoids in petals of transgenic Tagetes bearing the names MS259 and MS301
  • the data represent the percentages of individual carotenoids in a carotenoid extract produced with fresh petals of fully flowered flowers. All data thus refer to the fresh weight.
  • Epoxides means the total amount of Epoxides Violaxanthin, Antheraxanthin and Neoxanthin “Asta” is called astaxanthin
  • Phoenico refers to phoenicoxanthin, also synonymous with adonirubin
  • Zea refers to zeaxanthin
  • Cantha refers to canthaxanthin
  • 3'-hydroxy refers to 3'-hydroxyechinenone
  • b-crypto refers to beta-cryptoxanthin
  • Ketos means the total amount of all ketocarotenoids (canthaxanthin, phoenicoxanthin, astaxanthin, adonixanthin, echinenone and 3'- and 3-hydroxyechinenone.

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Abstract

Verwendung eines Plastid-lipid associated Protein-Promotors (PAP-Promotors) zur heterologen Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes.

Description

Verwendung eines Plastid-lipid associated Protein-Promotors (PAP-Promotors) zur heterologen Genexpression
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Plastid-lipid associated Protein-Promotors (PAP-Promotors) zur heterologen Genexpression vorzugsweise zur blütenspezifischen Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes, die genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes sowie ein Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten durch Kultivierung der genetisch veränderten Pflanzen.
Stand der Technik
Verschiedene biosynthetische Produkte, wie beispielsweise Feinchemikalien, wie unter anderem Aminosäuren, Vitamine, Carotinoide, aber auch Proteine werden über natürliche Stoffwechselprozesse in Zellen hergestellt und werden in vielen Industriezweigen verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik-, Feed-, Food- und pharmazeutischen Industrie.
Diese Substanzen, die zusammen als Feinchemikalien/Proteine bezeichnet werden, umfassen unter anderem organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nichtproteinogene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlenhydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine, Carotinoide und Cofaktoren, sowie Proteine und Enzyme. Ihre Produktion im Großmaßstab erfolgt zum Teil mittels biotechnologischer Verfahren unter Verwendung von Mikroorganismen, die entwickelt wurden, um große Mengen der jeweils gewünschten Substanz zu produzieren und sezernieren.
Carotinoide werden de novo in Bakterien, Algen, Pilzen und Pflanzen synthetisiert. In den letzten Jahren wird zunehmend versucht, auch Pflanzen als Produktionsorganismen für Feinchemikalien, insbesondere für Vitamine und Carotinoide zu nutzen.
Ein natürliches Gemisch aus den Carotinoiden Lutein, Zeaxanthin und Violaxanthin wird beispielsweise aus den Blüten von Marigold Pflanzen (Tagetes Pflanzen) als sogenanntes Oleoresin extrahiert. Dieses Oleoresin findet Anwendung sowohl als Inhaltsstoff von Nahrungsergänzungsmitteln als auch im Feed-Bereich.
Lycopin aus Tomaten findet ebenso Anwendung als Nahrungsergänzungsmit- tel.während Phytoen überwiegend im kosmetischen Bereich verwendet wird.
Ketocarotinoide, also Carotinoide, die mindestens eine Keto-Gruppe enthalten, wie beispielsweise Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'- Hydroxyechinenon, Adonirubin und Adonixanthin sind natürliche Antioxidantien und Pigmente, die von einigen Algen, Pflanzen und Mikroorganismen als Sekundärmetabo- lite produziert werden.
Aufgrund ihrer farbgebenden Eigenschaften werden die Ketocarotinoide und insbesondere Astaxanthin als Pigmentierhilfsstoffe in der Tierernährung, insbesondere in der Forellen-, Lachs- und Shrimpszucht verwendet.
Ein wirtschaftliches biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von natürlichen, biosynthetischen Produkten und insbesondere Carotinoiden ist daher von großer Bedeutung.
WO 0032788 beschreibt einige Carotinoid-Biosynthesegene aus Pflanzen der Gattung Tagetes und offenbart, wie genetisch veränderte Pflanzen der Gattung Tagetes hergestellt werden könnten, um in den Petalen verschiedene Carotinoidprofile zu erhalten und damit gezielt bestimmte Carotinoide herzustellen. Dazu ist es nötig, einige Bio- synthesegene überzuexprimieren und andere zu unterdrücken.
Zur Überexpression der neu gefundenen Carotinoid-Biosynthesgene in Pflanzen der Gattung Tagetes wird in WO 0032788 der petalenspezifische Promotor der Ketolase aus Adonis vernalis postuliert. WO 05019460 beschreibt die Verwendung von Promotoren ausgewählt unter EPSPS Promotor, B-Gene Promotor, PDS Promotor und CHRC Promotor zur Expression von Genen in Tagetes.
Die bisher verwendeten Promotoren können jedoch noch nicht alle Anforderungen erfüllen, die an eine hohe Expression in Tagetes gestellt werden. Daher bestand das Bedürfnis, Promotoren bereitzustellen, die die Anforderungen besser erfüllen.
Beschreibung der Erfindung
Gefunden wurde die Verwendung eines Plastid-lipid associated Protein-Promotors (PAP-Promotors) zur heterologen Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes. Insbesondere eignet sich die Verwendung zur blütenspezifischen und besonderes bevorzugt zur petalenspezifischen heterologen Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes. Insbesondere eignet sich der BNPAPX-Promotor aus Brassica besonders dazu, neue bisher in Tagetes nicht vorhandene Ketocarotinoide in i) relativ hoher Konzentration und ii) bevorzugt in der oberen, mit Papillen besetzten Epidermis der Tagetespetalen zu akkumulieren. Die Promotor-Aktivität ist für die untere Epidermis, basierend auf der Akkumulation von Ketocarotinoiden, als schwach einzustufen.
Unter einem Promotor wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressionsaktivität verstanden, also eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure, im folgenden auch Gen bezeichnet, die Expres- sion, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert.
Unter „Transkription" wird erfindungsgemäß der Prozess verstanden, durch den aus- gehend von einer DNA-Matrize ein komplementäres RNA-Molekül hergestellt wird. An diesem Prozess sind Proteine wie die RNA-Polymerase, sogenannte Sigma-Faktoren und transkriptionelle Regulatorproteine beteiligt. Die synthetisierte RNA dient dann als Matrize im Prozess der Translation, der dann zum biosynthetisch aktiven Protein führt.
Unter einer „funktionellen Verknüpfung" versteht man in diesem Zusammenhang beispielsweise die sequentielle Anordnung einer der erfindungsgemäßen Promotoren und einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische
Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz oder das zu exprimierende Gen hinter (d.h. am 3'-Ende) der er- findungsgemäßen Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kova- lent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare. Unter „Expressionsaktivität" wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge Protein, also die Expressionsrate, verstanden.
Unter „spezifischer Expressionsaktivität" wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge Protein pro Promotor verstanden.
Bei einer „verursachten Expressionsaktivität" oder „verursachten Expressionsrate" im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp die Bildung eines Proteins verursacht, das im Wildtyp so nicht vorhanden war.
Bei einer „erhöhten Expressionsaktivität" oder „erhöhten Expressionsrate" im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit die gebildete Menge des Proteins erhöht.
Die Bildungsrate, mit der ein biosynthetsich aktives Protein hergestellt wird, ist ein Pro- dukt aus der Rate der Transkription und der Translation. Beide Raten können erfindungsgemäß beeinflusst werden und damit die Rate der Bildung von Produkten in einem Mikroorganismus beeinflussen. Unter „heterologer" Genexpression wird erfindungsgemäß verstanden, dass der Promotor und das damit funktionell verknüpfte Gen in dieser Anordnung natürlicherweise nicht in Wildtyppflanzen vorkommen. Heterologe Genexpression umfasst somit die Fälle, dass der Promotor oder das zu exprimierende Gen oder beide Komponenten nicht natürlicherweise im Wildtyp der entsprechenden Pflanze vorkommen, oder aber dass sowohl Promotor als auch das zu exprimierende Gen natürlicherweise in der Wildtyppflanze vorhanden sind, jedoch auf entfernt liegenden chromosomalen Positionen, so dass keine funktionelle Verknüpfung in der Wildtyppflanze vorliegt.
Unter dem Begriff "Wildtyp" oder „Wildtyppflanze" wird erfindungsgemäß die entspre- chende Ausgangspflanze der Gattung Tagetes verstanden.
Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff "Pflanze" die Ausgangspflanze (Wildtyp) oder eine erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanze der Gattung Tagetes oder beides verstanden werden.
Vorzugsweise wird unter "Wildtyp" für die Erhöhung oder Verursachung der Expressionsaktivität oder Expressionsrate und für die Erhöhung des Gehalts an biosynthetischen Produkten die Pflanze Tagetes erecta, insbesondere die Pflanze Tagetes erecta Hybrid 50011 (WO 02012438), sowie die Tagetes erecta 13819 und deren durch Mu- tagenese oder Züchtung entstehenden Derivate als Referenzorganismus verstanden.
Unter einem „PAP-Promotor" werden Promotoren verstanden, die natürlicherweise vorzugsweise in Pflanzen wie Gurke, Tomate, Raps und weiteren vorkommen und die Genexpression von Plastiden-assozierten Proteinen verursachen. Bevorzugte PAP-Promotoren enthalten
A1 ) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 9, 18 oder 21 oder
A2) eine von diesen Sequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von
Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nukleinsäureebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 9, 18 oder 21 aufweist oder A3) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 9, 18 oder 21 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
A4) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A1 ), A2) oder A3)
Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 9 stellt eine Promotorsequenz des hypothetischen Plastid-lipid associated Protein 2 aus Lycopersicon escolentum dar.
Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 18 stellt eine Promotorsequenz eines hypo- thetischen Plastid-lipid associated Protein aus Brassica napus dar. Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 21 stellt eine Promotorsequenz eines hypothetischen Plastid-lipid associated Protein aus Brassica napus dar.
Die Erfindung betrifft weiterhin PAP- Promotoren, enthaltend eine von diesen Sequenzen (SEQ. ID. NO. 9, 18 oder 21) durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nukleinsäu- reebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 9,18 oder 21 aufweist.
Weitere natürliche erfindungsgemäße Beispiele für erfindungsgemäße PAP-
Promotoren lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO. 9, 18 oder 21 leicht auffinden.
Künstliche erfindungsgemäße PAP-Promotor-Sequenzen lassen sich ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO. 9, 18 oder 21 durch künstliche Variation und Mutation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden leicht auffinden.
Die folgenden Definition und Bedingungen der Identitätsvergleiche und Hybridisie- rungsbedingungen gelten für alle Nukleinsäuren, also alle Promotoren und Gene der Beschreibung.
Unter dem Begriff "Substitution" ist der Austausch einer oder mehrerer Nukleotide durch ein oder mehrere Nukleotide zu verstehen. „Deletion" ist das Ersetzen eines Nukleotides durch eine direkte Bindung. Insertionen sind Einfügungen von Nukleotiden in die Nukleinsäuresequenz, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Nukleotide ersetzt wird.
Unter Identität zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2): 151-1 ) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Multiple alignment parameter:
Gap opening penalty 10 Gap extension penalty 10
Gap Separation penalty ränge 8 Gap Separation penalty off % identity for alignment delay 40 Residue specific gaps off
Hydrophilic residue gap off
Transition weighing 0
Pairwise alignment parameter:
FAST algorithm on
K-tuple size 1
Gap penalty 3 Window size 5
Number of best diagonals 5
Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO. 9, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 60 % aufweist.
Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Se- quenz SEQ ID NO. 18 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO. 18, insbesondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine I- dentität von mindestens 60 % aufweist.
Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 60 % mit der Sequenz SEQ ID NO. 21 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO. 21 , insbesondere nach obigen Programmlogarithmus, mit obigem Parametersatz eine I- dentität von mindestens 60 % aufweist. Besonders bevorzugte PAP-Promotoren weisen mit der jeweiligen Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 9, 18 oder 21 eine Identität von mindestens 70%, bevorzugter mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 92%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, besonders bevorzugt mindestens 99% auf.
Weitere natürliche Beispiele für PAP-Promotoren lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO. 9, 18 oder 21 , aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher PAP-Promotoren, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. No. 9, 18 oder 21 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst mindestens 10, bevorzugter mehr als 12, 15, 30, 50 oder besonders bevorzugt mehr als 150 Nukleotide.
Unter "hybridisieren" versteht man die Fähigkeit eines PoIy- oder Oligonukleotids, unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen vorzugsweise zu 90-100% komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot- Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze.
Die Hybridisierung erfolgt erfinungsgemäß unter stringenten Bedingungen. Solche Hy- bridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, CoId Spring Harbor Labo- ratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 beschrieben.
Unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden: Die über Nacht Inkubation bei 42°C in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium Citrat), 50 mM Natrium Phosphat (ph7,6), 5x Denhardt Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescherte Lachssper- mien-DNA, gefolgt von einem Waschen der Filter mit 0,1x SSC bei 65°C.
Unter einem „funktionell äquivalenten Fragment" werden für Promotoren Fragmente verstanden, die im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen wie die Ausgangssequenz.
Unter „im wesentlichen gleich" wird eine spezifische Expressionsaktivität verstanden, die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%, bevorzugter 80%, bevor- zugter 90%, besonders bevorzugt 95% der spezifischen Expressionsaktivität der Ausgangssequenz aufweist.
Unter „Fragmente" werden Teilsequenzen der durch Ausführungsform A1 ), A2) oder A3) beschriebenen PAP-Promotoren verstanden. Vorzusgweise weisen diese Frag- mente mehr als 10, bevorzugter aber mehr als 12,15, 30, 50 oder besonders bevorzugt mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 , 2 oder 3 auf.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 9, 18 oder 21 als PAP-Promotor, d.h. zur Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes. Alle vorstehend erwähnten PAP-Promotoren sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebau- steine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Mit den erfindungsgemäßen Promotoren läßt sich prinzipiell jedes Gen in Pflanzen der Gattung Tagetes exprimieren, insbesondere blütenspezifisch exprimieren, besonders bevorzugt petalenspezifisch exprimieren.
Diese in Pflanzen der Gattung Tagetes zu exprimierenden Gene werden im folgenden auch „Effektgene" genannt.
Bevorzugte Effektgene sind beispielsweise Gene aus dem Biosynthesweg von Ge- ruchsstoffen und Blütenfarben, deren Expression oder erhöhte Expression in Pflanzen der Gattung Tagetes zu einer Veärnderung der Geruchs und/oder der Blütenfarbe von Blüten der Pflanzen der Gattung Tagetes führt.
Die Biosynthese von flüchtigen Geruchskomponenten, speziell in Blüten, wurde in den letzten Jahren an verschiedenen Modellorganismen wie Clarkia breweri und Antirhinum majus L. Studiert. Flüchtige Geruchskomponenten werden beispielsweise innerhalb des Monoterpen- und Phenylpropan-Stoffwechsels gebildet werden. Im ersten Fall handelt es sich um Linalool; von den Phenylpropanen sind Methyleneugenol, Benzyla- cetat, Methylbenzoat und Methylsalicat abgeleitet.
Für die Biosynthese von Linalool, (ISo)Methyleigenol, Benzylacetat und Methylsalicinat sind bevorzugte Gene ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend eine Lina- lool-Synthase (LIS), Nukleinsäuren kodierend eine S-Adenosyl-L-Met:(iso)-Eugenol-O- Methyltransferase (IEMT), Nukleinsäuren kodierend eine Acetyl-CoA-Benzylalkohol- Acetyltransferase und Nukleinsäuren kodierend eine S-Adenosyl-L-Met:Salicylsäure- Methyltransferase (SAMT). Nukleinsäurensequenzen und Proteinsequenzen zu den genannten enzymatischen Aktivitäten sind in Dudareva et al. Plant Cell 8 (1996), 1137- 1 148; Wang et al. Plant Physiol. 114 (1997), 213-221 und Dudareva et al. Plant J. 14 (1998) 297-304) beschrieben.
Besonders bevorzugte Effektgene sind Gene aus Biosyntheswegen von biosynthetischen Produkten, die in Pflanzen der Gattung Tagetes natürlicherweise, d.h. im Wild- typ oder durch genetische Veränderung des Wildtyps hergestellt werden können, insbesondere in Blüten hergestellt werden können, besonders bevorzugt in Petalen hergestellt werden können.
Bevorzugte biosynthetische Produkte sind Feinchemikalien.
Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Verbindungen, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw., jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts-, Kosmetik , Food und Feed-Industrie. Diese Verbindungen umfassen organische Säuren, wie beispielsweise Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopimelinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Ku- ninaka, A. (1996) Nucleotides and related Compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten), Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidonsäure), Diole (bspw. Propan- diol und Butandiol), Kohlenhydrate (bspw. Hyaluronsäure und Trehalose), aromatische Verbindungen (bspw. aromatische Amine, Vanillin und Indigo), Vitamine, Carotinoide und Cofaktoren (wie beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebenen Chemikalien). Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert.
I. Aminosäure-Metabolismus und Verwendungen
Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zellfunktionen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind, wohingegen die nicht-proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Die Aminosäuren können in der D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vorfindet. Biosynthese- und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin), so bezeichnet, da sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosynthese mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Bio- syntheseswege in die übrigen 11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu synthetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenommen werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.
Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren interessante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen Anwendungen in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschafts- und pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mono- natriumglutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet. Threonin, Tryptophan und D-/L- Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechnology Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim). Man hat entdeckt, daß sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S)-5-Hydroxytryptophan und anderen, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.
Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakteriellen Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation, s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533 - 606). Glutamat wird durch reduktive Aminierung von α- Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im Citronensäure-Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthese von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren und beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt bei der Glykolyse), und ergibt nach Oxidations-, Transaminie- rungs- und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homocystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seitenketten-ß-Kohlenstoffatoms auf Tetrahydrofolat, in einer durch Serintranshydroxymethylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glycolyse- und Pento- sephosphatweges, Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat in einem 9-Schιϊtt- Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Prephenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 1 1-Schritt- Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalaninhydroxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, VaNn und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat, einem aktivierten Zucker.
Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden stattdessen abgebaut, so daß Zwischenproduk- te für die Haupt-Stoffwechselwege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäureproduktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure- Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für einen Überblick über den Rückkopplungs-Mechanismus bei Aminosäure- Biosynthesewegen, siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer bestimmten Aminosäure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.
II. Vitamine, Carotinoide, Cofaktoren und Nutrazeutika-Metabolismus sowie Verwendungen
Vitamine, Carotinoide, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenträger oder Zwischenprodukte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Verarbeitungs-Hilfsstoffe. (Für einen Überblick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Der Begriff "Nutrazeutikum" umfaßt Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren).
Bevorzugte Feinchemikalien oder biosynthetische Produkte, die in Pflanzen der Gattung Tagetes, insbesondere in Petalen der Blüten der Pflanzen der Gattung Tagetes hergestellt werden können, sind Carotinoide, wie beispielsweise Phytoen, Lycopin, beta-Carotin, Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3- Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adonirubin, Violaxanthin und Adonixanthin.
Besonders bevorzugte Carotinoide sind Ketocarotinoide, wie beispielsweise Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adonirubin, und Adonixanthin.
Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ullmann's Encyclopedia of Indus- trial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S).
Thiamin (Vitamin Bi) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol-
Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B2) wird aus Guanosin-5'-triphosphat (GTP) und Ribose-5'-phosphat synthetisiert. Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavin- mononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin B6" bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5'-phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxin- hydrochlorid), sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6- methylpyridin. Panthothenat (Pantothensäure, R-(+)-N-(2,4-Dihydroxy-3,3-dimethyl-1- oxobutyl)-ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP-getriebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure. Die für die Biosyntheseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Alanin und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5'-phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, sondern auch die Produktion von (R)-Pantoinsäure, (R)-Pantolacton, (R)-Panthenol (Provi- tamin B5), Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.
Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganismen ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene i- dentifiziert. Es hat sich herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster-Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine gehören. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Energie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des α-Ketoglutaratdehydrogenasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Substanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L- Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthese der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den metabolischen Stoffwechselzwischenprodukten Guanosin-5'-triphosphat (GTP), L-Glutaminsäure und p- Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.
Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin B12) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin B12 ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht vollständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der beteiligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als "Niacin" bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinamidade- nindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen.
Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größtenteils auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien ebenfalls durch großangelegte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind, wie Riboflavin, Vitamin Be, Pantothenat und Biotin. Nur Vitamin B12 wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert. In-vitro-Verfahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.
IM. Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen
Gene für den Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Beg- riff "Purin" oder "Pyrimidin" umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteil der Nukleinsäuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff "Nukleotid" beinhaltet die grundlegenden Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose-Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D- Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff "Nukleosid" umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser MoIe- küle oder ihrer Mobilisation zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es möglich, die RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese Aktivität zielgerichtet bei kanzerogenen Zellen gehemmt, läßt sich die Teilungs- und Replikations-Fähigkeit von Tumorzellen hemmen.
Es gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energiespeicher (d.h. AMP) oder als Coenzyme (d.h. FAD und NAD) dienen.
Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese medizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin- und/oder Pyrimidin- Metabolismus beeinflußt wird (bspw. Christopherson, R. I. und Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic a- gents", Med. Res. Reviews 10: 505-548). Untersuchungen an Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medikamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressionsmittel oder Antiproliferantien verwendet werden können (Smith, J. L. "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Biochem. Soc. Transact. 23 (1995) 877-902). Die Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatzmöglichkeiten: als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener Feinchemikalien (z.B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin), als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, werden gewöhnlich als Geschmacksverstärker verwendet (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen (siehe bspw. Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim, S. 561-612). Enzyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden entwickelt werden.
Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für Ll- bersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides"; Kap. 8 in : Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York). Der Purin-Metabolismus, das Objekt intesiver Forschung, ist für das normale Funktionieren der Zelle essentiell. Ein gestörter Purin-Metabolismus in höhe- ren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide werden über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung lnosin-5'-phosphat (IMP) aus Ribose-5-phosphat synthetisiert, was zur Produktion von Guanosin-5'- monophosphat (GMP) oder Adenosin-5'-monophosphat (AMP) führt, aus denen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphatformen leicht herstellen lassen. Diese Verbindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die Pyrimidinbiosynthe- se erfolgt über die Bildung von Uridin-5'-monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat. UMP wiederum wird in Cytidin-5'-triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduktionsreaktion aus der Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyriboseform des Nukleotides hergestellt. Nach der Phosphorylierung können diese Moleküle an der DNA- Synthese teilnehmen.
IV. Trehalose-Metabolismus und Verwendungen
Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über α,α-1 ,1-Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für getrocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken verwendet. Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik- und Biotechnologie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishimoto et al., (1998) US-Patent Nr. 5 759 610; Singer, M.A. und Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A. und Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; und Shiosaka, M. J. Japan 172
(1997) 97-102). Trehalose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.
Besonders bevorzugte biosynthetische Produkte sind ausgewählt aus der Gruppe organische Säuren, Proteine, Nukleotide und Nukleoside, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Cofaktoren, Enzyme und Proteine.
Bevorzugte organische Säuren sind Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopimelinsäure
Bevorzugte Nukleoside und Nukleotide sind beispielsweise beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related Compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten.
Bevorzugte biosynthetische Produkte sind weiterhin Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, wie beispielsweise Arachidonsäure, Diole wie beispielsweise Propandiol und Butandiol, Kohlenhydrate, wie beispielsweise Hyaluronsäure und Trehalose, aromatische Verbindungen, wie beispielsweise aromatische Amine, Vanillin und Indigo, Vitamine und Cofaktoren, wie beispielsweise beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lip- ids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), Enzyme Polyketide (Cane et al. (1998) Science 282: 63-68), und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN:
0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebenen Chemikalien.
Besonders bevorzugte Gene, die mit den erfindungsgemäßen Promotoren in Pflanzen der Gattung Tagetes exprimiert werden sind demnach Gene, ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinoge- nen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Kohlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Carotinoiden, insbesondere Ketocarotinoiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen.
Bevorzugte Feinchemikalien oder biosynthetische Produkte, die in Pflanzen der Gattung Tagetes, insbesondere in Petalen der Blüten der Pflanzen der Gattung Tagetes hergestellt werden können, sind Carotinoide, wie beispielsweise Phytoen, Lycopin, beta-Carotin, Lutein, Zeaxanthin, Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-
Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adonirubin, Violaxanthin und Adonixanthin.
Besonders bevorzugte Carotinoide sind Ketocarotinoide, wie beispielsweise Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adoni- rubin, und Adonixanthin.
Ganz besonders bevorzugte Gene, die mit den erfindungsgemäßen Promotoren in Pflanzen der Gattung Tagetes exprimiert werden sind demnach Gene die Proteine aus dem Biosyntheseweg von Carotinoiden kodieren.
Insbesondere bevorzugt sind Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxylase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine ε-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeaxanthin-Epoxidase, Nukleinsäuren kodierend eine Antheraxanthin- Epoxidase, Nukleinsäuren kodierend eine Neoxanthin-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine (E)-4-Hydroxy-3- Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5- Phosphat-Reduktoisomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat- Δ-Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-
Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase (Phytoendehydrogena- se) , Nukleinsäuren kodierend eine Prephytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend ein crtISO Protein,
Nukleinsäuren kodierend eine 4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-D-erythritol-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine 4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-D-erythritol-Kinase,
Nukleinsäuren kodierend eine 2-Methyl-D-erythritol 2,4 cyclodiphosphate-Synthase,
Nukleinsäuren kodierend eine Hydroxymethylbutenyldiphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein.
Unter einer Ketolase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-lonon-Ring von Carotinoiden eine Keto- Gruppe einzuführen.
Insbesondere wird unter einer Ketolase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Canthaxanthin umzuwandeln.
Beispiele für Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, und die entsprechenden Ketola- sen, sind beispielsweise Sequenzen aus
Haematoccus pluvialis, insbesondere aus Haematoccus pluvialis Flotow em. Wille (Accession NO: X86782, SEQ ID No. 24) Haematoccus pluvialis, NIES-144 (Accession NO: D45881) Agrobacterium aurantiacum (Accession NO: D584209) Alicaligenes spec. (Accession NO: D58422) Paracoccus marcusii (Accession NO: Y151 12)
Synechocystis sp. Strain PC6803 (Accession NO: NP442491 ) Bradyrhizobium sp. (Accession NO: AF218415) Nostoc sp. Strain PCC7120 (Accession NO: AP003592, BAB74888) Haematococcus pluvialis (Accession NO: AF534876, AAN03484)
Paracoccus sp. MBIC1143 (Accession NO: D58420, P54972)
Brevundimonas aurantiaca (Accession NO: AY166610, AAN86030)
Nodularia spumigena NSOR10 (Accession NO: AY210783, AAO64399)
Nostoc punctiforme ATCC 29133 (Accession NO: NZ_AABC01000195, ZP_0011 1258); Nostoc punctiforme ATCC 29133
Deinococcus radiodurans R1 (Accession NO: E75561 , AE001872) Synechococcus sp. WH 8102, Nukleinsäure: Acc.-No. NZ_AAB D01000001 , Basenpaar 1 ,354,725-1 ,355,528
Unter einer ß-Cyclase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, einen endständigen, linearen Rest von Lycopin in einen ß-lonon-Ring zu über- führen.
Insbesondere wird unter einer ß-Cyclase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, γ-Carotin in ß-Carotin umzuwandeln.
Beispiele für ß-Cyclase-Gene sind Nukleinsäuren, kodierend eine ß-Cyclase aus Tomate (Accession X86452)., sowie ß-Cyclasen der folgenden Accession Nummern:
S66350 lycopene beta-cyclase (EC 5.5.1.-) - tomato
CAA60119 lycopene synthase [Capsicum annuum] S66349 lycopene beta-cyclase (EC 5.5.1.-) - common tobacco
CAA57386 lycopene cyclase [Nicotiana tabacum]
AAM21 152 lycopene beta-cyclase [Citrus sinensis]
AAD38049 lycopene cyclase [Citrus x paradisi]
AAN86060 lycopene cyclase [Citrus unshiu] AAF44700 lycopene beta-cyclase [Citrus sinensis]
AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina]
AAG 10429 beta cyclase [Tagetes erecta]
AAA81880 lycopene cyclase
AAB53337 Lycopene beta cyclase AAL92175 beta-lycopene cyclase [Sandersonia aurantiaca]
CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus]
AAM45381 beta cyclase [Tagetes erecta]
AAO18661 lycopene beta-cyclase [Zea mays]
AAG21 133 chromoplast-specific lycopene beta-cyclase [Lycopersicon esculentum] AAF18989 lycopene beta-cyclase [Daucus carota]
ZP_001 140 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus str. MIT9313]
ZP_001050 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1378]
ZP_001046 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus subsp. pastoris str. CCMP1378]
ZP_001 134 hypothetical protein [Prochlorococcus marinus str. MIT9313]
ZP_001 150 hypothetical protein [Synechococcus sp. WH 8102]
AAF10377 lycopene cyclase [Deinococcus radiodurans]
BAA29250 393aa long hypothetical protein [Pyrococcus horikoshii] BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3]
AAL01999 lycopene cyclase [Xanthobacter sp. Py2]
ZP_000190 hypothetical protein [Chloroflexus aurantiacus]
ZP_000941 hypothetical protein [Novosphingobium aromaticivorans]
AAF78200 lycopene cyclase [Bradyrhizobium sp. ORS278] BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv. milletiae]
CAA64855 lycopene cyclase [Streptomyces griseus]
AAA21262 dycopene cyclase [Pantoea agglomerans]
C37802 crtY protein - Erwinia uredovora
BAB79602 crtY [Pantoea agglomerans pv. milletiae] AAA64980 lycopene cyclase [Pantoea agglomerans]
AAC44851 lycopene cyclase
BAA09593 Lycopene cyclase [Paracoccus sp. MBIC1 143]
ZP_000941 hypothetical protein [Novosphingobium aromaticivorans]
CAB56061 lycopene beta-cyclase [Paracoccus marcusii] BAA20275 lycopene cyclase [Erythrobacter longus]
ZP_000570 hypothetical protein [Thermobifida fusca]
ZP_000190 hypothetical protein [Chloroflexus aurantiacus]
AAK07430 lycopene beta-cyclase [Adonis palaestina] CAA67331 lycopene cyclase [Narcissus pseudonarcissus]
AAB53337 Lycopene beta cyclase
BAC77673 lycopene beta-monocyclase [marine bacterium P99-3]
Eine besonders bevorzugte ß-Cyclase ist weiterhin die chromoplastenspezifische ß- Cyclase aus Tomate (AAG21133)
Unter einer Hydroxylase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, am, gegebenenfalls substituierten, ß-lonon-Ring von Carotinoiden eine Hy- droxy-Gruppe einzuführen.
Insbesondere wird unter einer Hydroxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, ß-Carotin in Zeaxanthin oder Canthaxanthin in
Astaxanthin umzuwandeln.
Beispiele für ein Hydroxylase-Gene sind:
eine Nukleinsäure, kodierend eine Hydroxylase aus Haematococcus pluvialis, Accession AX038729, WO 0061764); sowie Hydroxylasen der folgenden Accession Nummern:
|emb|CAB55626.1 , CAA70427.1 , CAA70888.1 , CAB55625.1 , AF499108J ,
AF315289J , AF296158J , AAC49443.1 , NPJ94300.1 , N P_200070.1 , AAG 10430.1 , CAC06712.1 , AAM88619.1 , CAC95130.1 , AAL80006.1 , AF162276J , AAO53295.1 , AAN85601.1 , CRTZ_ERWHE, CRTZ_PANAN, BAB79605.1 , CRTZ_ALCSP, CRTZ_AGRAU, CAB56060.1 , ZP_00094836.1 , AAC44852.1 , BAC77670.1 , NP_745389.1 , NP_344225.1 , NP_849490.1 , ZP_00087019.1 , NP_503072.1 , NP_852012.1 , N P_1 15929.1 , ZP_00013255.1
Eine besonders bevorzugte Hydroxylase ist weiterhin die Hydroxylase aus Tomate (Accession Y14810, CrtR-b2)
Unter einer HMG-CoA-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzym-A in Mevalonat umzuwandeln.
Unter einer (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl- Diphosphat in Isopentenyldiphosphat und Dimethylallyldiphosphate umzuwandeln.
Unter einer 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Hydroxyethyl-ThPP und Glycerinaldehyd-3- Phosphat in 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat umzuwandeln. Unter einer i-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat in 2- C-methyl-D-erythritol 4-Phosphat umzuwandeln
Unter einer Isopentenyl-Diphosphat-Δ- Isomerase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Isopentenyl-Diphosphat in Dimethylallylphosphat umzuwandeln.
Unter einer Geranyl-Diphosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzy- matische Aktivität aufweist, Isopentenyl-Diphosphat und Dimethylallylphosphat in Ge- ranyl-Diphosphat umzuwandeln.
Unter einer Farnesyl-Diphosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, sequentiell 2 Molekülelsopentenyl-Diphosphatmit Dimethy- lallyl-Diphosphat und dem resultierenden Geranyl-Diphosphat in Farnesyl-Diphosphat umzuwandeln
Unter einer Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Farnesyl-Diphosphat und Isopentenyl-Diphosphat in Geranyl-Geranyl-Diphosphat umzuwandeln.
Unter einer Phytoen-Synthase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Geranyl-Geranyl-Diphosphat in Phytoen umzuwandeln.
Unter einer Phytoen-Desaturase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Phytoen in Phytofluen und/oder Phytofluen in ζ-Carotin (Zetacarotin) umzuwandeln.
Unter einer Zeta-Carotin-Desaturase wird ein Protein verstanden, das die enzymati- sehe Aktivität aufweist, ζ-Carotin in Neurosporin und/oder Neurosporin in Lycopin umzuwandeln.
Unter einem crtlSO-Proteins wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, 7,9,7',9'-tetra-cis-Lycopin in all-trans-Lycopin umzuwandeln.
Unter einem FtsZ-Protein wird ein Protein verstanden, das eine Zellteilungs und Plasti- denteilungs-fördernde Wirkung hat und Homologien zu Tubulinproteinen aufweist.
Unter einem MinD -Protein wird ein Protein verstanden, das eine multifunktionele Rolle bei der Zellteilung aufweist. Es ist eine Membran-assoziierte ATPase und kann innerhalb der Zelle eine oszillierende Bewegung von Pol zu Pol zeigen. Beispiele für HMG-CoA-Reduktase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine HMG-CoA-Reduktase aus Arabidopsis thaliana, Accession NM_106299; sowie weitere HMG-CoA-Reduktase -Gene aus anderen Or- ganismen mit den folgenden Accession Nummern:
P54961, P54870, P54868, P54869, 002734, P22791, P54873, P54871, P23228, P13704, P54872, Q01581, P17425, P54874, P54839, P14891, P34135, 064966, P29057, P48019, P48020, P12683, P43256, Q9XEL8, P34136, 064967, P29058, P48022, Q41437, P12684, Q00583, Q9XHL5, Q41438, Q9YAS4, 076819, 028538, Q9Y7D2, P54960, 051628, P48021, Q03163, P00347, P14773, Q12577, Q59468, P04035, 024594, P09610, Q58116, 026662, Q01237, Q01559, Q12649, 074164, 059469, P51639, Q10283, 008424, P20715, P13703, P13702, Q96UG4, Q8SQZ9, 015888, Q9TUM4, P93514, Q39628, P93081, P93080, Q944T9, Q40148, Q84MM0, Q84LS3, Q9Z9N4, Q9KLM0
Beispiele für (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut- 2-enyl-Diphosphat-Reduktase aus Arabidopsis thaliana (lytB/ISPH), ACCESSION AY168881, sowie weitere (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase - Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
T04781 , AF270978J , NP_485028.1, NP_442089.1, NP_681832.1, ZP_00110421.1, ZP_00071594.1, ZP_00114706.1, ISPH_SYNY3, ZP_00114087.1, ZP_00104269.1, AF398145_1 , AF398146_1 , AAD55762.1 , AF514843J , NP_622970.1 , NP_348471.1 , NP_562001.1, NP_223698.1, NP_781941.1, ZP_00080042.1, NP_859669.1, NP_214191.1, ZP_00086191.1, ISPH_VIBCH, NP_230334.1, NP_742768.1, NP_302306.1, ISPH_MYCLE, NP_602581.1, ZP_00026966.1, NP_520563.1, NP_253247.1, NP_282047.1, ZP_00038210.1, ZP_00064913.1, CAA61555.1, ZP_00125365.1, ISPH_ACICA, EAA24703.1, ZP_00013067.1, ZP_00029164.1, NP_790656.1, NP_217899.1, NP_641592.1, NP_636532.1, NP_719076.1, NP_660497.1, NP_422155.1, NP_715446.1, ZP_00090692.1, NP_759496.1, ISPH_BURPS, ZP_00129657.1, NP_215626.1, NP_335584.1, ZP_00135016.1, NP_789585.1, NP_787770.1, NP_769647.1, ZP_00043336.1, NP_242248.1, ZP_00008555.1, NP_246603.1, ZP_00030951.1, NP_670994.1, NP_404120.1, NP_540376.1, NP_733653.1, NP_697503.1, NP_840730.1, NP_274828.1, NP_796916.1, ZP_00123390.1, NP_824386.1, NP_737689.1, ZP_00021222.1, NP_757521.1, NP_390395.1, ZP_00133322.1, CAD76178.1, NP_600249.1, NP_454660.1, NP_712601.1, NP_385018.1, NP_751989.1 Beispiele für i-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase -Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine i-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase aus Lyco- persicon esculentum, ACCESSION #AF143812 sowie weitere 1-Deoxy-D-Xylose-5- Phosphat-Synthase -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
AF143812J, DXS_CAPAN, CAD22530.1, AF182286J, NPJ93291.1, T52289, AAC49368.1, AAP14353.1, D71420, DXS_ORYSA, AF443590J, BAB02345.1, CAA09804.2, NP_850620.1, CAD22155.2, AAM65798.1, NP_566686.1, CAD22531.1, AAC33513.1.CAC08458.1, AAG10432.1, T08140, AAP14354.1, AF428463J, ZP_00010537.1, NP_769291.1, AAK59424.1, NP_107784.1, NP_697464.1, NP_540415.1, NPJ96699.1, NP_384986.1, ZP_00096461.1, ZP_00013656.1, NP_353769.1, BAA83576.1, ZP_00005919.1, ZP_00006273.1, NP_420871.1, AAM48660.1, DXS_RHOCA, ZP_00045608.1, ZP_00031686.1, NP_841218.1, ZP_00022174.1, ZP_00086851.1, NP_742690.1, NP_520342.1, ZP_00082120.1, NP_790545.1, ZP_00125266.1, CAC17468.1, NP_252733.1, ZP_00092466.1, NP_439591.1, NP_414954.1, NP_752465.1, NP_622918.1, NP_286162.1, NP_836085.1, NP_706308.1, ZP_00081148.1, NP_797065.1, NP_213598.1, NP_245469.1,ZP_00075029.1, NP_455016.1, NP_230536.1, NP_459417.1, NP_274863.1, NP_283402.1, NP_759318.1, NP_406652.1, DXS_SYNLE,
DXS_SYNP7, NP_440409.1, ZP_00067331.1, ZP_00122853.1, NP_717142.1, ZP_00104889.1, NP_243645.1, NP_681412.1, DXS_SYNEL, NP_637787.1, DXS_CHLTE, ZP_00129863.1, NP_661241.1, DXS_XANCP, NP_470738.1, NP_484643.1,ZP_00108360.1, NP_833890.1, NP_846629.1, NP_658213.1, NP_642879.1, ZP_00039479.1, ZP_00060584.1, ZP_00041364.1, ZP_00117779.1, NP_299528.1
Beispiele für 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase aus Arabidopsis thaliana, ACCESSION #AF148852, sowie weitere 1-Deoxy-D-Xylose- 5-Phosphat-Reduktoisomerase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
AF148852, AY084775, AY054682, AY050802, AY045634, AY081453, AY091405, AY098952, AJ242588, AB009053, AY202991, NP_201085.1, T52570, AF331705_1, BAB16915.1 , AF367205J , AF250235_1 , CAC03581.1 , CAD22156.1 , AF182287J , DXR-MENPI, ZP_00071219.1, NP_488391.1, ZP_00111307.1, DXR_SYNLE, AAP56260.1, NP_681831.1, NP_442113.1, ZP_00115071.1, ZP_00105106.1, ZP_00113484.1, NP_833540.1, NP_657789.1, NP_661031.1, DXR_BACHD, NP_833080.1, NP_845693.1, NP_562610.1, NP_623020.1, NP_810915.1, NP_243287.1, ZP_00118743.1, NP_464842.1, NP_470690.1, ZP_00082201.1, NP_781898.1, ZP_00123667.1, NP_348420.1, NP_604221.1, ZP_00053349.1, ZP_00064941.1, NP_246927.1, NP_389537.1, ZP_00102576.1, NP_519531.1, AF124757_19, DXR_ZYMMO, NP_713472.1, NP_459225.1, NP_454827.1, ZP_00045738.1, NP_743754.1, DXR_PSEPK, ZP_O0130352.1, NP_702530.1, NP_841744.1, NP_438967.1, AF514841J, NP_706118.1, ZP_00125845.1, NP_404661.1, NP_285867.1, NP_240064.1, NP_414715.1, ZP_00094058.1, NP_791365.1, ZP_00012448.1, ZP_00015132.1, ZP_00091545.1, NP_629822.1, NP_771495.1, NP_798691.1, NP_231885.1, NP_252340.1, ZP_00022353.1, NP_355549.1, NP_420724.1, ZP_00085169.1, EAA17616.1, NP_273242.1, NP_219574.1, NP_387094.1, NP_296721.1, ZP_00004209.1, NP_823739.1, NP_282934.1, BAA77848.1, NP_660577.1, NP_760741.1, NP_641750.1, NP_636741.1, NP_829309.1, NP_298338.1, NP_444964.1, NP_717246.1, NP_224545.1, ZP_00038451.1, DXR_KITGR, NP_778563.1.
Beispiele für Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase aus Adonis palaestina clone AplPI28, (ipiAal), ACCESSION #AF188060, veröffentlicht durch Cun- ningham.F.X. Jr. and Gantt.E.: Identification of multi-gene families encoding isopente- nyl diphosphate isomerase in plants by heterologous complementation in Escherichia coli, Plant Cell Physiol.41 (1), 119-123 (2000) sowie weitere Isopentenyl-Diphosphat- Δ-Isomerase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
Q38929, 048964, Q39472, Q13907, 035586, P58044, 042641, 035760, Q10132, P15496, Q9YB30, Q8YNH4, Q42553, 027997, P50740, 051627, 048965, Q8KFR5, Q39471, Q39664, Q9RVE2, Q01335, Q9HHE4, Q9BXS1, Q9KWF6, Q9CIF5, Q88WB6, Q92BX2, Q8Y7A5, Q8TT35 Q9KK75, Q8NN99, Q8XD58, Q8FE75, Q46822, Q9HP40, P72002, P26173, Q9Z5D3, Q8Z3X9, Q8ZM82, Q9X7Q6, 013504, Q9HFW8, Q8NJL9, Q9UUQ1, Q9NH02, Q9M6K9, Q9M6K5, Q9FXR6, 081691, Q9S7C4, Q8S3L8, Q9M592, Q9M6K3, Q9M6K7, Q9FV48, Q9LLB6, Q9AVJ1 , Q9AVG8, Q9M6K6, Q9AVJ5, Q9M6K2, Q9AYS5, Q9M6K8, Q9AVG7, Q8S3L7, Q8W250, Q94IE1, Q9AVI8, Q9AYS6, Q9SAY0, Q9M6K4, Q8GVZ0, Q84RZ8, Q8KZ12, Q8KZ66, Q8FND7, Q88QC9, Q8BFZ6, BAC26382, CAD94476.
Beispiele für Geranyl-Diphosphat-Synthase -Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase aus Arabidopsis tha- liana, ACCESSION #Y17376, Bouvier.F., Suire.C, d'Harlingue.A., Backhaus, R.A. and Camara.B.; Molecular cloning of geranyl diphosphate synthase and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells, Plant J.24 (2), 241-252 (2000) sowie weitere Geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Ac- cession Nummern:
Q9FT89, Q8LKJ2, Q9FSW8, Q8LKJ3, Q9SBR3, Q9SBR4, Q9FET8, Q8LKJ1 , Q84LG1. Q9JK86
Beispiele für Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase aus Arabidopsis thaliana (FPS1), ACCESSION #1180605, veröffentlicht durch Cunillera.N., Arro.M., De- lourme.D., Karst, F., Boronat.A- und Ferrer.A.: Arabidopsis thaliana contains two diffe- rentially expressed farnesyl-diphosphate synthase genes, J. Biol. Chem. 271 (13), 7774-7780 (1996), sowie weitere Farnesyl-Diphosphat-Synthase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
P53799, P37268, Q02769, Q09152, P49351 , 024241 , Q43315, P49352, 024242, P49350, P08836, P14324, P49349, P08524, 066952, Q08291 , P54383, Q45220, P57537, Q8K9A0, P22939, P45204, 066126, P55539, Q9SWH9, Q9AVI7, Q9FRX2, Q9AYS7, Q94IE8, Q9FXR9, Q9ZWF6, Q9FXR8, Q9AR37, O50009,Q94IE9,Q8RVK7, Q8RVQ7, 004882, Q93RA8, Q93RB0, Q93RB4, Q93RB5,Q93RB3, Q93RB1 , Q93RB2, Q920E5.
Beispiele für Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase -Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase aus Sinaps alba, ACCESSION #X98795, veröffentlicht durch Bonk.M., Hoffmann, B., Von Lintig.J., Schledz.M., AI-Babili,S., Hobeika.E., Kleinig, H. and Beyer.P.: Chloroplast import of four carotenoid biosynthetic enzymes in vitro reveals differential fates prior to membrane binding and oligomeric assembly, Eur. J. Biochem. 247 (3), 942-950 (1997), sowie weitere Geranyl-geranyl-Diphosphat-Synthase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
P22873, P34802 ,P56966, P80042, Q42698, Q92236, 095749, Q9WTN0, Q50727, P24322, P39464, Q9FXR3, Q9AYN2, Q9FXR2, Q9AVG6, Q9FRW4, Q9SXZ5, Q9AVJ7, Q9AYN1 , Q9AVJ4, Q9FXR7, Q8LSC5, Q9AVJ6, Q8LSC4, Q9AVJ3, Q9SSU0, Q9SXZ6, Q9SST9, Q9AVJ0, Q9AVI9, Q9FRW3, Q9FXR5, Q94IF0, Q9FRX1 , Q9K567, Q93RA9, Q93QX8, CAD95619, EAA31459
Beispiele für Phytoen-Synthase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Phytoen-Synthase aus Erwinia uredovora, ACCESSION # D90087; veröffentlicht durch Misawa.N., Nakagawa.M., Kobayashi.K., Yama- no,S., lzawa,Y.,Nakamura,K. und Harashima.K.: Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli; J. Bacteriol. 172 (12), 6704-6712 (1990), sowie weitere Phytoen- Synthase -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
CAB39693, BAC69364, AAF10440, CAA45350, BAA20384, AAM72615, BAC09112, CAA48922, P_001091 , CAB84588, AAF41518, CAA48155, AAD38051 , AAF33237, AAG10427, AAA34187, BAB73532, CAC19567, AAM62787, CAA55391 , AAB65697, AAM45379, CAC27383, AAA32836, AAK07735, BAA84763, P_000205, AAB60314, P_001163, P_000718, AAB71428, AAA34153, AAK07734, CAA42969, CAD76176, CAA68575, P_000130, P_001142, CAA47625, CAA85775, BAC14416, CAA79957, BAC76563, P_000242, P_000551 , AAL02001 , AAK 15621 , CAB94795, AAA91951 , P_000448
Beispiele für Phytoen-Desaturase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Phytoen-Desaturase aus Erwinia uredovora, ACCESSION # D90087; veröffentlicht durch Misawa.N., Nakagawa.M., Kobayashi.K., Yamano.S., lzawa,Y.,Nakamura,K. und Harashima.K.: Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products ex- pressed in Escherichia coli; J. Bacteriol. 172 (12), 6704-6712 (1990), sowie weitere Phytoen-Desaturase -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
AAL15300, A39597, CAA42573, AAK51545, BAB08179, CAA48195, BAB82461 , AAK92625, CAA55392, AAG10426, AAD02489, AAO24235, AAC12846, AAA99519, AAL38046, CAA60479, CAA75094, ZP_001041 , ZP_001163, CAA39004, CAA44452, ZP_001142, ZP_000718, BAB82462, AAM45380, CAB56040, ZP_001091 , BAC09113, AAP79175, AAL80005, AAM72642, AAM72043, ZP_000745, ZP_001 141 , BAC07889, CAD55814, ZP_001041 , CAD27442, CAE00192, ZP_001163, ZP_000197, BAA18400, AAG10425, ZP_0011 19, AAF13698, 2121278A, AAB35386, AAD02462, BAB68552, CAC85667, AAK51557, CAA12062, AAG51402, AAM63349, AAF85796, BAB74081 , AAA91 161 , CAB56041 , AAC48983, AAG14399, CAB65434, BAB73487, ZP_001 117, ZP_000448, CAB39695, CAD76175, BAC69363, BAA17934, ZP_000171 , AAF65586, ZP_000748, BAC07074, ZP_001133, CAA64853, BAB74484, ZP_001 156, AAF23289, AAG28703, AAP09348, AAM71569, BAB69140, ZP_000130, AAF41516, AAG18866, CAD95940, NP_656310, AAG10645, ZP_000276, ZP_000192, ZP_000186, AAM94364, EAA31371 , ZP_000612, BAC75676, AAF65582
Beispiele für Zeta-Carotin-Desaturase-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase aus Narcissus pseudonar- cissus, ACCESSION #AJ224683, veröffentlicht durch AI-Babili,S., Oelschlegel.J. and Beyer.P.: A cDNA encoding for beta carotene desaturase (Accession No.AJ224683) from Narcissus pseudonarcissus L.. (PGR98-103), Plant Physiol.117, 719-719 (1998), sowie weitere Zeta-Carotin-Desaturase-Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
Q9R6X4, Q38893, Q9SMJ3, Q9SE20, Q9ZTP4, 049901, P74306, Q9FV46, Q9RCT2, ZDS_NARPS, BAB68552.1, CAC85667.1, AF372617J, ZDS_TARER, CAD55814.1, CAD27442.1, 2121278A, ZDS_CAPAN, ZDS_LYCES, NPJ87138.1, AAM63349.1, ZDS_ARATH, AAA91161.1, ZDS_MAIZE, AAG14399.1, NP_441720.1, NP_486422.1, ZP_00111920.1 , CAB56041.1, ZP_00074512.1, ZP_00116357.1 , NP_681127.1, ZP_00114185.1,ZP_00104126.1, CAB65434.1, NP_662300.1
Beispiele für crtlSO-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine crtlSO aus Lycopersicon esculentum; ACCESSION #AF416727, veröffentlicht durch Isaacson.T., Ronen, G., Zamir.D. and Hirschberg, J.: Cloning of tangerine from tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the pro- duction of beta-carotene and xanthophylls in plants; Plant Cell 14 (2), 333-342 (2002), sowie weitere crtlSO -Gene aus anderen Organismen mit den folgenden Accession Nummern:
AAM53952
Beispiele für FtsZ-Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine FtsZ aus Tagetes erecta, ACCESSION #AF251346, veröffentlicht durch Moehs.C.P., Tian,L, Osteryoung.K.W. and Dellapenna.D.: Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal development
Plant Mol. Biol.45 (3), 281-293 (2001), sowie weitere FtsZ -Gene aus anderen Orga- nismen mit den folgenden Accession Nummern:
CAB89286.1, AF205858J, NP_200339.1, CAB89287.1, CAB41987.1, AAA82068.1, T06774,AF383876_1 , BAC57986.1, CAD22047.1, BAB91150.1, ZP_00072546.1, NP_440816.1,T51092, NP_683172.1, BAA85116.1, NP_487898.1, JC4289, BAA82871.1, NP_781763.1, BAC57987.1, ZP_00111461.1, T51088, NPJ90843.1, ZP_00060035.1, NP_846285.1, AAL07180.1, NP_243424.1, NP_833626.1, AAN04561.1, AAN04557.1, CAD22048.1, T51089, NP_692394.1, NP_623237.1, NP_565839.1, T51090, CAA07676.1, NP_113397.1, T51087, CAC44257.1, E84778, ZP_00105267.1, BAA82091.1, ZP_00112790.1, BAA96782.1, NP_348319.1, NP_471472.1, ZP_00115870.1, NP_465556.1, NP_389412.1, BAA82090.1, NP_562681.1, AAM22891.1, NP_371710.1, NP_764416.1, CAB95028.1, FTSZ_STRGR, AF120117J, NP_827300.1, JE0282, NP_626341.1, AAC45639.1, NP_785689.1, NP_336679.1, NP_738660.1, ZP_00057764.1, AAC32265.1, NP_814733.1, FTSZ_MYCKA, NP_216666.1, CAA75616.1, NP_301700.1, NP_601357.1, ZP_00046269.1, CAA70158.1, ZP_00037834.1, NP_268026.1, FTSZ_ENTHR, NP_787643.1, NP_346105.1, AAC32264.1, JC5548, AAC95440.1, NP_710793.1, NP_687509.1, NP_269594.1, AAC32266.1, NP_720988.1, NP_657875.1 , ZP_00094865.1 , ZP_00080499.1 , ZP_00043589.1 , JC7087, NP_660559.1 , AAC46069.1 , AF179611_14, AAC44223.1 , NP_404201.1.
Beispiele für MinD -Gene sind:
Eine Nukleinsäure, kodierend eine MinD aus Tagetes erecta, ACCESSION #AF251019, veröffentlicht durch Moehs.C.P., Tian.L, Osteryoung.K.W. und Dellapen- na,D.: Analysis of carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal deve- lopment; Plant Mol. Biol.45 (3), 281 -293 (2001 ), sowie weitere MinD -Gene mit den folgenden Accession Nummern:
NPJ97790.1, BAA90628.1, NP_038435.1, NP_045875.1, AAN33031.1, NP_050910.1, CAB53105.1, NP_050687.1, NP_682807.1, N P_487496.1, ZP_00111708.1, ZP_00071109.1, NP_442592.1, NP_603083.1, NP_782631.1, ZP_00097367.1, ZP_00104319.1, NP_294476.1, NP_622555.1, NP_563054.1, NP_347881.1, ZP_00113908.1, NP_834154.1, NP_658480.1, ZP_00059858.1, NP_470915.1, NP_243893.1, NP_465069.1, ZP_00116155.1, NP_390677.1, NP_692970.1, NP_298610.1, NP_207129.1, ZP_00038874.1, NP_778791.1, NP_223033.1, NP_641561.1, NP_636499.1, ZP_00088714.1, NP_213595.1, NP_743889.1, NP_231594.1, ZP_00085067.1, NP_797252.1, ZP_00136593.1, NP_251934.1, NP_405629.1, NP_759144.1, ZP_00102939.1, NP_793645.1, NP_699517.1, NP_460771.1, NP_860754.1, NP_456322.1, NP_718163.1, NP_229666.1, NP_357356.1, NP_541904.1, NP_287414.1, N P_660660.1, ZP_00128273.1, NPJ03411.1, NP_785789.1, NP_715361.1, AF149810J, NP_841854.1,
NP_437893.1, ZP_00022726.1, EAA24844.1, ZP_00029547.1, NP_521484.1, NP_240148.1, NP_770852.1, AF345908_2, NP_777923.1, ZP_00048879.1, NP_579340.1, NP_143455.1, NPJ26254.1, NPJ42573.1, NP_613505.1, NPJ27112.1, NP_712786.1, NP_578214.1, NP_069530.1, NP_247526.1, AAA85593.1, NP_212403.1, NP_782258.1, ZP_00058694.1, NP_247137.1, NP_219149.1, NP_276946.1, N P_614522.1, ZP_00019288.1, CAD78330.1
Die Erfindung betrifft ferner eine genetisch veränderte Pflanze der Gattung Tagetes, wobei die genetische Veränderung zu einer Erhöhung oder Verursachung der Expres- sionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp führt und bedingt ist durch die Regulation der Expression dieses Gens in der Pflanze durch die erfindungsgemä- ßen Promotoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes wird die Regulation der Expression von Genen in der Pflanze durch die erfindungsgemäßen Promotoren dadurch erreicht, dass man
a) einen oder mehrere erfindungsgemäße Promotoren in das Genom der Pflanze einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten erfindungsgemäßen Promotoren erfolgt oder
b) ein oder mehrere Gene in das Genom der Pflanze einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Promotoren erfolgt oder
c) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen Promotor und funktionell verknüpft eine oder mehrere zu exprimieren- de Gene in die Pflanze einbringt.
In einer bevorzugten Ausführungsform bringt man gemäß Merkmal c) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen Promotor und funktionell verknüpft eine oder mehrere zu exprimierende Gene, in die Pflanze ein. Die Integration der Nukleinsäurekonstrukte in der Pflanze der Gattung Tagetes kann dabei intrachromosomal oder extrachromosomal erfolgen.
Bevorzugte erfindungsgemäße Promotoren und bevorzugte zu exprimierende Gene (Effektgene) sind vorstehend beschrieben.
Im folgenden wird exemplarisch die Herstellung der genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes mit erhöhter oder verursachter Expressionsrate eines Effektgens beschrieben.
Die Transformation kann bei den Kombinationen von genetischen Veränderungen einzeln oder durch Mehrfachkonstrukte erfolgen.
Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch Transformation der Ausgangspflanzen, mit einem Nukleinsäurekonstrukt, das mindestens einen der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Promotoren enthält, die mit einem zu exprimierenden Effektgen und gegebenenfalls weiteren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind.
Diese Nukleinsäurekonstrukte, in denen die erfindungsgemäßen Promotoren und Effektgene funktionell verknüpft sind, werden im folgenden auch Expressionskassetten genannt.
Die Expressionskassetten können weitere Regulationssignale enthalten, also regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der Effektgene in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, mindestens einen erfindungsgemäßen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungs- signal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz des Effektgens für mindestens eines der vor- stehend beschriebenen Gene operativ verknüpft sind.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, das jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der ko- dierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Im folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäurekonstrukte, Expressionskassetten und Vektoren für Pflanzen und Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, sowie die transgenen Pflanzen der Gattung Tagetes selbst beschrieben.
Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten, aber nicht darauf beschränkten Sequenzen, sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Piastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärkern wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (GaIMe et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693 -8711 ).
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt vorzugsweise durch Fusion mindestens eines erfindungsgemäßen Promotors mit mindestens einem Gen, vorzugsweise mit einem der vorstehend beschriebenen Effektgene, und vorzugsweise einer nach Promotor und Nukleinsäure-Sequenz inserierten Nukleinsäure, die für ein plastiden- spezifisches Transitpeptid kodiert, sowie vor einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Mania- tis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in TJ. Silhavy, M. L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987), beschrieben sind. Die vorzugsweise insertierte Nukleinsäuren, kodierend ein plastidäres Transitpeptid, gewährleisten die Lokalisation in Piastiden und insbesondere in Chromoplasten.
Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren Nukleinsäure- Sequenz für ein Effektgen-Produkt-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chromoplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation der Effektgene in die Chromoplasten vom Effektgenprodukt-Teil enzymatisch abgespalten werden.
Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären Nicotiana taba- cum Transketolase oder einem anderen Transitpeptid (z.B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco (rbcS) oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase als auch der Isopentenylpyrophosphat lsomerase-2 oder dessen funktionellem Äquivalent abgeleitet ist.
Weitere Beispiele für ein plastidäres Transitpeptid sind das Transitpeptid der plastidären Isopentenyl-pyrophosphat lsomerase-2 (IPP-2) aus Arabisopsis thaliana und das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat Carboxylase (rbcS) aus Erbse (Guerineau, F, Woolston, S, Brooks, L, Mullineaux, P (1988) An expression cas- sette for targeting foreign proteins into the chloroplasts. Nucl. Acids Res. 16: 1 1380).
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen Nukleinsäure- Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden.
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adap- toren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkrip- tionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allge- meinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet vorzugsweise in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäurekonstrukt und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Beispiele für einen Terminator sind der 35S-Terminator (Guerineau et al. (1988) Nucl Acids Res. 16: 1 1380), der nos Terminator (Depicker A, Stachel S, Dhaese P, Zam- bryski P, Goodman HM. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1982;1 (6):561-73) oder der ocs Terminator (Gielen, J, de Beuckeleer, M, Seurinck, J, Debroek, H, de Greve, H, Lemmers, M, van Montagu, M, Schell, J (1984) The complete sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAchδ. EMBO J. 3: 835-846).
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Trans- Versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primer-repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden.
Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Li- gation zur Verfügung gestellt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti- Plasmids pTiACHδ entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet.
Dazu können an sich bekannte Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt werden.
Geeignete Methoden zur Transformation von Pflanzen sind die Protoplastentransfor- mation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektropo- ration, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der, vorstehend beschriebene, durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben.
Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711 ) oder besonders bevorzugt pSUN2, pSUN3, pSUN4 oder pSUN5 (WO 02/00900).
Mit einem Expressionsplasmid transformierte Agrobakterien können in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter, Blattstücke oder Keimblätter in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Zur bevorzugten Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, im folgenden auch transgene Pflanzen bezeichnet, wird die fusionierte Expressionskassette in einen Vek- tor, beispielsweise pBin19 oder insbesondere pSUN5 und pSUN3 kloniert, der geeignet ist, in Agrobacterium tumefaciens transformiert zu werden. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter, Blattstücke oder Keimblätter in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter,
Blattstücken oder Keimblättern können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein oder mehrere in die Expressionskassette integrierte Gene enthalten.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Effektgenen wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71 -1 19 (1993) beschrieben. Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u.a. pJIT1 17 (Guerineau et al. (1988) Nucl. Acids Res.16 :11380), pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Bevorzugte erfindungsgemäße Promotoren und bevorzugte Effektgene sind vorste- hend beschrieben.
Insbesondere bevorzugt sind Effektgene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxylase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine ε-Cyclase, Nuklein- säuren kodierend eine Epoxidase, Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA- Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine (E)-4-Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl- Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine i-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine i-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat- Reduktoisomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat-Δ- Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Ge- ranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend eine Prephytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin-Desaturase, Nuk- leinsäuren kodierend ein crtlSO Protein, Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein.
Bevorzugte, genetisch veränderte Pflanzen der Gattung Tagetes sind Marigold, Tagetes erecta, Tagetes patula, Tagetes lucida, Tagetes pringlei, Tagetes palmeri, Tagetes minuta oder Tagetes campanulata.
Durch die erfindungsgemäßen Promotoren ist es mit Hilfe der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren möglich, in den vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes die Stoffwechselwege zu spezifischen biosynthetischen Produkten zu regulieren.
Dazu werden beispielsweise Stoffwechselwege, die zu einem spezifischen biosynthetischen Produkt führen, durch Verursachung oder Erhöhung der Transkriptionrate bzw. Expressionsrate von Genen dieses Biosyntheseweges verstärkt, indem die erhöhte Proteinmenge zu einer erhöhten Gesamtaktivität dieser Proteine des gewünschten Biosyntheseweges und damit durch einem verstärkten Stoffwechselfluß zu dem ge- wünschen biosynthetischen Produkt führt. Je nach gewünschtem biosynthetischen Produkt muss die Transkriptionsrate bzw. Expressionsrate verschiedener Gene erhöht bzw. reduziert werden. In der Regel ist es vorteilhaft, die Transkriptionsrate bzw. Expressionsrate mehrere Gene zu verändern, d.h. die Transkriptionsrate bzw. Expressionsrate einer Kombination von Gene zu Erhö- hen und/oder die Transkriptionsrate bzw. Expressionsrate einer Kombination von Gene zu reduzieren.
In den erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen ist mindestens eine erhöhte oder verursachte Expressionsrate eines Gens auf einen erfindungsgemäßen Promo- tor zurückzuführen.
Weitere, zusätzliche veränderte, d.h. zusätzlich erhöhte oder zusätzlich reduzierte Expressionsraten von weiteren Genen in genetisch veränderten Pflanzen können, müssen aber nicht auf die erfindungsgemäßen Promotoren zurück gehen.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten durch Kultivierung von erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden durch Kultivierung von erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes, dadurch gekennzeichnet, dass die zu exprimierenden Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxylase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase, Nukleinsäuren kodie- rend eine ε-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine Epoxidase, Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine (E)-4-Hydroxy-3- Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5- Phosphat-Reduktoisomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl-Diphosphat- Δ-Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend eine Prephytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-Carotin- Desaturase, Nukleinsäuren kodierend ein crtlSO Protein, Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein.
Die Carotinoide sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Phytoen, Phytofluen, Lycopin, Lutein, beta-Carotin, Zeaxanthin, Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3- Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adonirubin, Violaxanthin und Adonixanthin. Insbeondere betrifft die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Ketoca- rotinoiden durch Kultivierung von erfindungsgemäßen genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes, dadurch gekennzeichnet, dass die zu exprimierenden Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren, kodierend eine Ketolase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Hydroxylase, Nukleinsäuren kodierend eine ß-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine ε-Cyclase, Nukleinsäuren kodierend eine Epoxidase, Nukleinsäuren kodierend eine HMG-CoA-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine (E)-4- Hydroxy-3-Methylbut-2-enyl-Diphosphat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine 1- Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Deoxy-D- Xylose-5-Phosphat-Reduktoisomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Isopentenyl- Diphosphat-Δ-Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Diphosphat- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Farnesyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Geranyl-Geranyl-Diphosphat-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Phytoen-Desaturase, Nuklein- säuren kodierend eine Prephytoen-Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Zeta-
Carotin-Desaturase, Nukleinsäuren kodierend ein crtlSO Protein, Nukleinsäuren kodierend ein FtsZ Protein und Nukleinsäuren kodierend ein MinD Protein.
Die Ketocarotinoide sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Astaxanthin, Canthaxanthin, Echinenon, 3-Hydroxyechinenon, 3'-Hydroxyechinenon, Adonirubin, und Adonixanthin.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten, insbesondere Carotinoiden, vorzugsweise Ketocarotinoiden, wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der genetisch veränderten Pflanzen ein Ernten der Pflanzen und ein Isolieren der biosynthetischen Produkte, insbesondere Carotinoide, vorzugsweise Ketocarotinoide aus den Pflanzen, vorzugsweise aus den Petalen der Pflanzen, angeschlossen.
Die genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes werden in an sich bekannter Weise auf Nährböden gezogen und entsprechend geerntet.
Die Isolierung von Ketocarotinoiden aus den geernteten Blütenblättern erfolgt beispielsweise in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Trocknung und an- schließender Extraktion und gegebenenfalls weiterer chemischer oder physikalischer Reinigungsprozesse, wie beispielsweise Fällungsmethoden, Kristallographie, thermische Trennverfahren, wie Rektifizierverfahren oder physikalische Trennverfahren, wie beispielsweise Chromatographie. Die Isolierung von Ketocarotinoiden aus den Blütenblättern erfolgt beispielsweise bevorzugt durch organische Lösungsmittel wie Aceton, Hexan, Heptan, Ether oder tert.-Methylbutylether. Weitere Isolierverfahren von Ketocarotinoiden, insbesondere aus Blütenblättern, sind beispielsweise in Egger und Kleinig (Phytochemistry (1967) 6, 437-440) und Egger (Phytochemistry (1965) 4, 609-618) beschrieben.
Ein besonders bevorzugtes Ketocarotinoid ist Astaxanthin.
Die Ketocarotinoide fallen im erfindungsgemäßen Verfahren in Blütenblättern in Form ihrer Mono- oder Diester mit Fettsäuren an. Einige nachgewiesene Fettsäuren sind z.B. Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolensäure, und Laurinsäure (Kamata und Simpson (1987) Comp. Biochem. Physiol. Vol. 86B(3), 587-591 ).
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen oder Pflanzenteile, wie insbesondere Blütenblätter mit erhöhtem Gehalt an biosynthetischen Produkten, insbesondere Carotinoide, insbesondere Ketocarotinoide, insbesondere Astaxanthin, können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Prozessierung als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Futter- und Nah- rungsergänzungsmittel verwendet werden.
Ferner können die genetisch veränderten Pflanzen zur Herstellung von biosyntheti- sehen Produkt-, insbesondere Carotinoid-, insbesondere Ketocarotinoid-, insbesondere Astaxanthin-haltigen Extrakten und/oder zur Herstellung von Futter- und Nahrungser- gänzungsmitteln sowie von Kosmetika und Pharmazeutika verwendet werden.
Die genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes weisen im Vergleich zum Wildtyp einen erhöhten Gehalt an dem gewünschten biosynthetischen Produkten, insbesondere Carotinoide, insbesondere Ketocarotinoide, insbesondere Astaxanthin auf.
Unter einem erhöhten Gehalt wird in diesem Fall auch ein verursachter Gehalt an Ketocarotinoiden, bzw. Astaxanthin verstanden.
Experimenteller Teil Beispiel 1 :
Amplifikation einer DNA, die der gesamten Primärsequenz des LEPAP2-Promotors aus Lycopersicum esculentum entspricht. Die DNA-Sequenz, die für den PAP2 Promotor aus Lycopersicum escultentum kodiert, wurde mittels „Thermal-interlaced (TAIL-) PCR" (Liu et al. 1995 Plant J 457-463, Tsu- geki et al. 1996 Plant J 479-489) aus Lycopersicum escultentum var. Moneymaker isoliert.
Die Methode der „TAIL-PCR" kann dazu verwendet werden, unbekannte DNA Frag- mente zu isolieren, die eine bekannte DNA-Sequenz flankieren. In diesem Beispiel wurde die Sequenz isoliert, die upstream des 5'-Endes der genomischen Sequenz lokalisiert ist, die dem Tomaten EST-Klon EST554295 (SEQ ID No. 01 ) (Accession BI934406, tomato flower, anthesis Lycopersicon esculentum cDNA clone cTOD19B12 5' end, mRNA sequence) entspricht. Drei verschiedene Primer mit antisense- Orientierung zum Tomaten EST-Klon EST554295 wurden abgeleitet. Diese Primer wurden einzeln in aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen mit einem beliebigen degenerierten Primer eingesetzt.
Die "TAIL-PCR" wird entsprechend einem adaptierten Protokoll der Methode von Liu et al. (1995 Plant J 8(3):457-463) und Tsugeki et al. (1996 Plant J 10(3):479-489) durchgeführt. Für eine erste PCR-Reaktion wird folgender Mastermix (Angaben pro Reakti- onsansatz) eingesetzt.
1 1 μl steriles H2O (bidestilliert)
2 μl Primer-Stammlösung des spezifischen Primers LEPAP2-TAIL-1 (5mM) (SEQ ID No. 02)
3 μl AD1 Primer-Stammlösung (2OmM) (SEQ ID No. 05) 2 μl 10x PCR-Puffer (TAKARA))
2 μl 10x dNTP-Mix (2 mM)
0,2 μl Taq Polymerase (TAKARA)
20,2 μl dieses Mastermixes werden in einem PCR-Gefäß zu 1 μl einer Präparation ge- nomischer DNA aus Lycopersicum escultentum var. Moneymaker (Präparation gemäß Galbiati M et al. (2000) Funct Integr Genomics: 25-34) hinzupipettiert und durch Pipettieren gut gemischt. Die primäre PCR-Reaktion wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
94°C für 1 min • vier Zyklen mit 94°C für 10s, 62°C für 1 min und 72°C für 150s
94°C für 10s, 25°C für 3 min, 0,2°C/s bis 72°C und 72°C für 150s vierzehn Zyklen mit 94°C für 10s, 69°C für 1 min, 72°C für 150s, 94°C für 10s, 68°C für 1 min, 72°C für 150s, 94°C für 10s, 44°C für 1 min und 72°C für 150s 72°C für 5 min, dann 4°C bis zur Weiterverwendung.
Das Produkt der PCR-Reaktion wird 1 :50 verdünnt und je 1 μl jeder verdünnten Probe für eine zweite PCR-Reaktion (sekundäre PCR) verwendet. Dazu wird folgender Mastermix (Angaben pro Reaktionsansatz) eingesetzt:
1 1 μl steriles H2O (bidestilliert) 2 μl Primer-Stammlösung des spezifischen Primers LEPAP2-TAIL-2 (5mM) (SEQ ID No. 03)
2 μl AD1 Primer-Stammlösung (2OmM) (SEQ ID No. 05) 2 μl 1 Ox PCR-Puffer (TAKARA) 2 μl 10x dNTP-Mix (2 mM) 0,2 μl Taq Polymerase (TAKARA)
Je 19,2 μl des zweiten Mastermix werden zu je 1 μl des 1 :50 verdünnten primären PCR-Produktes gegeben und die sekundäre PCR unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
1 1 Zyklen mit 94°C für 10s, 64°C für 1 min, 72°C für 150s, 94°C für 10s, 64°C für 1 min, 72°C für 150s, 94°C für 10s, 44°C für 1 min, 72°C für 150s, • 72°C für 5min, dann 4°C bis zur Weiterverwendung.
Das PCR-Produkt der sekundären PCR-Reaktion wird 1 :10 verdünnt und je 1 μl jeder verdünnten Probe für eine dritte PCR-Reaktion (tertiäre PCR) verwendet. Dazu wird folgender Mastermix (Angaben pro Reaktionsansatz) eingesetzt:
18 μl steriles H2O (bidestilliert) 3 μl 10x PCR-Puffer (TAKARA) 3 μl 10x dNTP-Mix (2 mM)
2 μl Primer-Stammlösung des spezifischen Primers LEPAP2-TAIL-3 (5mM) (SEQ ID No. 04)
3 μl AD1 Primer-Stammlösung (2OmM) (SEQ ID No. 05) 0,5 μl Taq Polymerase (TAKARA)
Je 29,5 μl dieses Mastermixes werden zu je 1 μl des 1 :10 verdünnten sekundären PCR-Produktes gegeben und die tertiäre PCR wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
19 Zyklen mit 94°C für 15s, 44°C für 1 min, 72°C für 150s, • 72°C für 5 min, dann 4°C bis zur Weiterverwendung.
Die oben beschriebene PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 04 und SEQ ID No. 05 resultierte in einem 997 bp-Fragment, welches aus dem Promotor und einem kurzen Abschnitt am 5'-Terminus der kodierenden DNA-Sequenz des LEPAP2 Gens aus Lyco- persicum escultentum besteht (Seq ID No. 6). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde dieses Fragment in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) klo- niert und der Klon pCRLEPAP2TAIL erhalten.
Die Primer LEPAP2-F (SEQ ID NO. 07) und LEPAP2-R (SEQ ID NO. 08) wurden basierend auf der Sequenz des Inserts von pCRLEPAP2TAIL abgeleitet, um die korrekte Sequenz des LEPAP2 Promotors von Lycopersicum escultentum (ohne die aufgrund multipler TAIL-PCR-Runden eingefügten Mutationen) zu amplifizieren. Hierzu wurden diese Primer in einer spezifischen PCR-Reaktion mit genomischer DNA von Lycopersi- con esculentum als „template" eingesetzt. Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der LEPAP2 Promotor aus Lycopersicum escultentum, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten war:
2 μl einer Lycopersicum escultentum DNA 5 μl 10x dNTP-Mix (2 mM) 5 μl LEPAP2-F (5mM) (SEQ ID NO. 07) 5 μl LEPAP2-R (5mM) (SEQ ID NO. 08) 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 μl Taq Polymerase (TAKARA) 27.8 μl Aqua dest.
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 07 und SEQ ID No. 08 resultierte in einem 777 Bp-Fragment, das aus der Promotorsequenz des PAP2 Gens aus Lycopersicum escultentum besteht (SEQ ID 09). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde dieses PCR-Produkt in den PCR-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pCRLEPAP2 erhalten.
Dieser Klon wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJIT117 (Gueri- neau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380) verwendet. pJIT1 17 wurde modifiziert, indem der 35S-Terminator durch den CAT-Terminator (cathepsin D inhibitor gene) von Solanum tuberosum (Position 9-34 von Datenbankeintrag AX696004, SEQ 16 von Patente WO03008596) ersetzt wurde.
Das DNA-Fragment, das die CAT-Terminatorregion beinhaltet, wurde mittels PCR un- ter Verwendung des genomischer DNA aus Solanum tuberosum (Präparation gemäß Galbiati M et al. (2000) Funct Integr Genomics: 25-233) sowie der Primer CAT-1 (SEQ ID No. 25) und CAT-2 (SEQ ID No. 26) hergestellt.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR zur Amplifikation der DNA, die die cathepsin D inhibitor gene (CAT) Terminatorregion (SEQ ID 27) beinhaltet, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten waren:
2 μl einer Präparation Solanum tuberosum DNA (hergestellt wie oben beschrieben) 5 μl 10x dNTP-Mix (2 mM)
5 μl CAT-1 (SEQ ID No. 25) (5 mM) 5 μl CAT-2 (SEQ ID No. 26) (5 mM) 5 μl 10X PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 μl Pfu Polymerase (TAKARA) 27.8 μl Aqua dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
1X 940C 2 Minuten 35X 940C 1 Minute 5O0C 1 Minute 720C 1 Minute
1X 720C 10 Minuten
Das 237 bp Amplifikat (SEQ ID NO. 27) wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pCAT erhalten.
Die Klonierung des CAT-Terminators in den Vektor pJIT1 17 erfolgte durch Isolierung des Sall/Spel-Fragmentes aus pCAT und Ligierung in den Sall/Spel geschnittenen Vektor pJIT117. Der Klon heißt pJCAT.
Die Klonierung des LEPAP2 Promotors in den Vektor pJCAT erfolgte durch Isolierung des 777bp Kpnl/Hindlll-Fragmentes, welches den LEPAP2-Promotor kodiert, aus pCRLEPAP2 und Ligierung in den Kpnl/Hindlll geschnittenen Vektor pJCAT. Der resultierende Klon, der den LEPAP2 Promotor in der korrekten Orientierung mit dem rbcs Transitpeptid enthält, trägt die Bezeichnung pJLEPAP2CAT.
Beispiel 2: Amplifikation einer DNA, die der vollständigen Primärsequenz des BNPAP2-Promotors aus Brassica napus entspricht.
Die DNA, die für den PAP2-Promotor der Pflanze Brassica napus kodiert, wurde mittels „Thermal-interlaced (TAIL-) PCR" (Liu et al. 1995 Plant J 457-463, Tsugeki et al. 1996 Plant J 479-489) aus Brassica napus isoliert. TAIL-PCR kann dazu verwendet werden, unbekannte DNA Fragmente zu isolieren, die eine bekannte DNA Sequenz flankieren. In diesem Beispiel wurden Sequenzen isoliert, die im Genom upstream des entsprechenden 5'-Endes der bekannten Raps cDNA- Sequenz AF290564 ("Brassica rapa plastid-lipid associated protein PAP2 mRNA, com- plete cds; nuclear gene for plastid product") (SEQ ID No. 10) lokalisiert sind. Drei ver- schiedene Primer mit antisense-Orientierung zum Raps-cDNA AF290564 wurden abgeleitet. Diese Primer wurden einzeln in aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen mit einem beliebigen degenerierten Primer eingesetzt. Für eine erste'TAIL-PCR" -Reaktion wird folgender Mastermix (Angaben pro Reaktionsansatz) eingesetzt.
1 1 μl steriles H2O (bidestilliert)
2 μl Primer-Stammlösung des spezifischen Primers BNPAP2-TAIL-1 (5mM) (SEQ ID No. 11 )
3 μl AD1 Primer-Stammlösung (2OmM) (SEQ ID No. 14) 2 μl 1 Ox PCR-Puffer (TAKARA))
2 μl 10x dNTP-Mix (2 mM) 0,2 μl Taq Polymerase (TAKARA)
20,2 μl dieses Mastermixes werden in einem PCR-Gefäß zu 1 μl einer Präparation genomischer DNA aus Brassica napus (Präparation gemäß Galbiati M et al. (2000) Funct Integr Genomics: 25-34) hinzupipettiert und durch Pipettieren gut gemischt. Die primäre PCR-Reaktion wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: • 94°C für 1 min vier Zyklen mit 94°C für 10s, 62°C für 1 min und 72°C für 150s 94°C für 10s, 25°C für 3 min, 0,2°C/s bis 72°C und 72°C für 150s vierzehn Zyklen mit 94°C für 10s, 69°C für 1 min, 72°C für 150s, 94°C für 10s, 68°C für 1 min, 72°C für 150s, 94°C für 10s, 44°C für 1 min und 72°C für 150s • 72°C für 5 min, dann 4°C bis zur Weiterverwendung.
Das Produkt der primären PCR-Reaktion wird 1 :50 verdünnt und je 1 μl der Verdünnungfür eine zweite PCR-Reaktion (sekundäre PCR) verwendet. Dazu wird folgender Mastermix (Angaben pro Reaktionsansatz) eingesetzt: 1 1 μl steriles H2O (bidestilliert)
2 μl Primer-Stammlösung des spezifischen Primers BNPAP2-TAIL-2 (5mM) (SEQ ID No. 12)
2 μl AD1 Primer-Stammlösung (2OmM) (SEQ ID No. 14) 2 μl 10x-PCR-Puffer (TAKARA) 2 μl 10xdNTP-Mix (2 mM)
0,2 μl Taq Polymerase (TAKARA)
Je 19,2 μl des zweiten Mastermix werden zu je 1 μl des 1 :50 verdünnten primären PCR-Produktes gegeben und die sekundäre PCR wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
1 1 Zyklen mit 94°C für 10s, 64°C für 1 min, 72°C für 150s, 94°C für 10s, 64°C für 1 min, 72°C für 150s, 94°C für 10s, 44°C für 1 min, 72°C für 150s, 72°C für 5min, dann 4°C bis zur Weiterverwendung. Das PCR-Produkt der sekundären PCR-Reaktion wird 1 :10 verdünnt und je 1 μl der Verdünnung für eine dritte PCR-Reaktion (tertiäre PCR) verwendet. Dazu wird folgender Mastermix (Angaben pro Reaktionsansatz) eingesetzt:
18 μl steriles H2O (bidestilliert)
3 μl 10x-PCR-Puffer (TAKARA)
3 μl 10x dNTP-Mix (2 mM)
2 μl Primer-Stammlösung des spezifischen Primers BNPAP2-TAIL-3 (5mM) (SEQ ID
No. 13) 3 μl AD1 Primer-Stammlösung (2OmM) (SEQ ID No. 14) 0,5 μl Taq Polymerase (TAKARA)
Je 29,5μl dieses Mastermixes werden zu je 1 μl des 1 :10 verdünnten sekundären PCR- Produktes gegeben und die tertiäre PCR wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: • 19 Zyklen mit 94°C für 15s, 44°C für 1 min, 72°C für 150s, 72°C für 5 min, dann 4°C bis zur Weiterverwendung.
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 13 und SEQ ID No. 14 resultierte in einem 1564 bp-Fragment, welches aus dem Promotor und einem kurzen Abschnitt am 5'-Terminus der kodierenden Sequenz des BNPAP2 Gens von Brassica napus besteht (Seq ID No. 15). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das PCR-Produkt in den PCR- Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pCRBNPAP2TAIL erhalten.
Die Primer BNPAP2-F2 (SEQ ID NO. 16) und BNPAP2-R2 (SEQ ID NO. 17) wurden basierend auf der Sequenz des Inserts von pCRBNPAP2TAIL abgeleitet, um die korrekte Sequenz des BNPAP2 Promotors von Brassica napus (ohne die aufgrund multipler TAIL-PCR-Runden eingefügten Mutationen) zu amplifizieren. Hierzu wurden diese Primer in einer spezifischen PCR-Reaktion mit genomischer DNA von Brassica napus als „template" eingesetzt. Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
2 μl einer Präparation von Brassica napus DNA (hergestellt wie oben beschrieben) 5 μl 10x dNTP-Mix (2 mM) 5 μl BNPAP2-F2 (SEQ ID NO. 16) (5 mM) 5 μl BNPAP2-R2 (SEQ ID NO. 17) (5 mM) 5 μl 1 OX PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 μl Taq Polymerase (TAKARA) 27.8 μl Aqua dest. Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 16 und SEQ ID No. 17 resultierte in einem 960 bp-Fragment, das dem Promotor des PAP2-Gens von Brassica napus entspricht (Seq ID No. 18). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das PCR-Produkt in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pCRBNPAP2 erhalten.
Dieser Klon wurde anschließend für die Klonierung in den Expressionsvektor pJIT1 17 (Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 958Bp Kpnl/Hindlll-Fragmentes aus pCRBNPAP2 und Ligierung in den Kpnl/Hindlll geschnittenen Vektor pJIT1 17. Der resultierende Klon, der den BNPAP2 Promotor in der korrekten Orientierung mit dem rbcs Transitpeptid enthält, trägt die Bezeichnung pJBNPAP2.
Beispiel 3: Amplifikation einer DNA, die der vollständigen Primärsequenz des BNPAPX-Promotors aus Brassica napus entspricht.
Die DNA, die für den PAPX-Promotor aus Brassica napus kodiert, wurde mittels PCR aus Brassica napus amplifiziert. Die Primer BNPAP2-F2 (SEQ ID NO. 19) und BNPAP2-R1 (SEQ ID NO. 20) wurden basierend auf der Sequenz des Inserts von pCRBNPAP2TAIL abgeleitet. Hierzu wurden diese Primer in einer spezifischen PCR- Reaktion mit genomischer DNA von Brassica napus als „template" eingesetzt.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
2 μl einer Präparation von Brassica napus DNA (hergestellt wie oben beschrieben)
5 μl 10x dNTP-Mix (2 mM)
5 μl BNPAP2-F2 (SEQ ID NO. 19) (5 mM)
5 μl BNPAP2-R1 (SEQ ID NO. 20) (5 mM)
5 μl 1 OX PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 μl Taq Polymerase (TAKARA)
27.8 μl Aqua dest.
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID No. 19 und SEQ ID No. 20 resultierte in einem 1043 Bp-Fragment, das aus dem Promotor des PAPX-Gens von Brassica napus besteht (SEQ ID No. 21 ) . Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das PCR-Produkt in den PCR-Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pCRBNPAPX erhalten. Dieser Klon wurde anschließend für die Klonierung in den Expressionsvektor pJIT1 17 (Guerineau et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16: 11380) verwendet. Der Expressionsvektor pJIT1 17 wurde modifiziert, indem der 35S-Terminator durch den OCS-Terminator (Octopine Synthase) des Ti-Plasmides pTi15955 von Agrobacterium tumefaciens (Da- tenbankeintrag X00493 von Position 12,541-12,350, Gielen et al. (1984) EMBO J. 3 835-846) ersetzt wurde.
Das DNA-Fragment, das die OCS-Terminatorregion (SEQ ID No. 30) beinhaltet, wurde mittels PCR unter Verwendung des Plasmides pHELLSGATE (Datenbankeintrag AJ31 1874, Wesley et al. (2001 ) Plant J. 27 581-590, nach Standardmethoden aus E.coli isoliert) sowie der Primer OCS-1 (SEQ ID No. 28) und OCS-2 (SEQ ID No. 29) hergestellt.
Die PCR zur Amplifikation der DNA, die die Octopin Synthase (OCS) Terminatorregion (SEQ ID 30) beinhaltet, erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz, in dem enthalten waren: 2 μl einer Präparation pHELLSGATE plasmid DNA
5 μl 10x dNTP-Mix (2 mM)
5 μl OCS-1 (SEQ ID No. 28) (5 mM)
5 μl OCS-2 (SEQ ID No. 29) (5 mM)
5 μl 1 OX PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 μl Pfu Polymerase (TAKARA)
27.8 μl Aqua dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
1X 940C 2 Minuten 35X 940C 1 Minute 5O0C 1 Minute 720C 1 Minute 1X 720C 10 Minuten
Das 204 bp Amplifikat wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR- Klonierungsvektor pCR 2.1 (Invitrogen) kloniert und das Plasmid pOCS erhalten.
Sequenzierung des Klons pOCS bestätigte eine Sequenz, die mit einem Sequenzab- schnitt auf dem Ti-Plasmid pTi 15955 von Agrobacterium tumefaciens (Datenbankeintrag X00493) von Position 12.541 bis 12.350 übereinstimmt. Die Klonierung des OCS-Terminators in den Vektor pJIT1 17 erfolgte durch Isolierung des Sall/Spel-Fragmentes aus pOCS und Ligierung in den Sall-Spel geschnittenen Vektor pJIT117. Der Klon heißt pJOCS.
Die Klonierung des BNPAPX-Promotors in den Vektor pJOCS erfolgte durch Isolierung des Kpnl/Hindlll-Fragmentes, welches für den BNPAPX-Promotor kodiert, aus pCRBNPAPX und Ligierung in den Kpnl/Hindlll geschnittenen Vektor pJOCS. Der resultierende Klon, der den BNPAPX Promotor in der korrekten Orientierung mit dem rbcs Transitpeptid enthält, trägt die Bezeichnung pJBNPAPXOCS.
Beispiel 4:
Amplifikation einer cDNA, die für die gesamte Primärsequenz der Ketolase aus Hae- matococcus pluvialis Flotow em. Wille kodiert
Die cDNA, die für die Ketolase aus Haematococcus pluvialis kodiert, wurde mittels der nachfolgend beschriebenen Methode aus Haematococcus pluvialis Suspensionskulturen (Stamm 192.80 der "Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen") erhalten.
Für die Präparation von Total-RNA aus Haematococcus pluvialis wurden Zellen aus einer Suspensionskultur isoliert, die 2 Wochen bei indirektem Tageslicht und Raumtemperatur kultiviert wurde. Als Medium wurde Ηaematococcus-Medium" verwendet (1.2 g/l Natriumacetat, 2 g/l Hefeextrakt, 0.2 g/l MgCI2x6H2O, 0.02 CaCI2x2H2O; pH 6.8; nach Autoklavieren: Zugabe von 400 mg/l L-Asparagin, 10 mg/l FeSO4XH2O). Die Haematococcus pluvialis-Zellen wurden aus der oben genannten Kultur geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser pulverisiert. Anschließend wurden 100 mg der gefrorenen, pulverisierten Algenzellen in ein Reaktionsgefäß überführt und in 0.8 ml Trizol-Puffer (LifeTechnologies) resuspendiert. Diese Suspension wurde mit 0.2 ml Chloroform extrahiert. Nach 15minütiger Zentrifugation bei 12000xg wurde der wässrige Überstand abgenommen, in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die RNA wurde mit einem Volumenanteil Isopropanol gefällt, das Pellet nach Zentrifugation und Abnahme des Überstandes mit 75% Ethanol gewaschen anschließend in DEPC Wasser (DEPC-Wassser: über Nacht Inkubation von Wasser mit 1/1000 Volumenanteil Diethylpyrocarbonat bei Raumtemperatur, anschließend autoklavieren) gelöst. Die RNA-Konzentration wurde photometrisch bestimmt. Für die cDNA-Synthese wurden 2.5 μg Gesamt-RNA für 10 min bei 60°C denaturiert, für 2 min auf Eis abgekühlt und mittels eines cDNA-Kits („Ready-to-go-you-prime- beads", Pharmacia Biotech) nach Herstellerangaben unter Verwendung eines anti- sense-spezifischen Primers (PR1 SEQ ID NO. 22) in cDNA umgeschrieben.
Die Nukleinsäure, die für eine Ketolase aus Haematococcus pluvialis (Stamm 192.80) kodiert, wurde mittels „Polymerase chain reaction" (PCR) aus Haematococcus pluvialis unter Verwendung eines sense-spezifischen Primers (PR1 SEQ ID NO. 22) und eines antisense-spezifischen Primers (PR2 SEQ ID NO. 23) mit der cDNA aus der oben be- schriebenen Synthesereaktion als template amplifiziert.
Die PCR-Bedingungen waren die folgenden:
4 μl einer Haematococcus pluvialis cDNA (hergestellt wie oben beschrieben) 5 μl 10x dNTP-Mix (2 mM)
5 μl PR1 (SEQ ID No. 22) (5 mM) 5 μl PR2 (SEQ ID No. 23) (5 mM) 5 μl 1 OX PCR-Puffer (TAKARA) 0.25 μl Pfu Polymerase (TAKARA) 25.8 μl Aqua dest.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 1X 94°C 2 Minuten 35X 94°C 1 Minute 53°C 2 Minuten
72°C 3 Minuten 1X 72°C 10 Minuten
Die PCR-Amplifikation mit SEQ ID NO. 22 und SEQ ID NO. 23 resultierte in einem 997 bp-Fragment, das für ein Protein, bestehend aus der gesamten Primärsequenz einer Ketolase, kodiert (SEQ ID NO. 24). Unter Verwendung von Standardmethoden wurde das PCR-Produkt in den PCR-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert und der Klon pCRKETO2 erhalten.
Die Sequenzierung des Klons pCRKETO2 mit dem T7- und dem SP6-Primer bestätigte eine Sequenz, die sich lediglich in den drei Codons 73, 1 14 und 119 in je einer Base von der publizierten Sequenz X86782 unterscheidet. Diese Nukleotidaustausche wurden in einem unabhängigem Amplifikationsexperiment reproduziert und repräsentieren somit die Nukleotidsequenz der Ketolase verwendeten Haematococcus pluvialis Stamm 192.80.
Beispiel 5:
Herstellung von Expressionsvektoren zur blütenspezifischen Expression der Ketolase aus Haematococcus pluvialis in Tagetes erecta.
Der Klon pCRKETO2 wurde für die Klonierung in den Expressionsvektor pJLE-
PAP2CAT (siehe oben) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 997 Bp Sphl-Fragmentes aus pCRKETO2 und Ligierung in den Sphl geschnittenen Vektor pJLEPAP2. Der Klon, der die Haematococcus pluvialis Ketolase in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcs Transitpeptid enthält, trägt die Bezeichnung pLEPAPBKT.
Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transformation der LE PAP2-kontrollierten Ketolase aus Haematococcus pluvialis in Tagetes erecta erfolgte unter Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900).
Zur Herstellung des Expressionsvektors pS5LEPAP2BKT wurde das Kpnl Fragment aus pLEPAPBKT mit dem Kpnl geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert. pS5LEPAP2BKT beinhaltet den LEPAP2-Promotor aus Lycopersicon esculentum, das rbcS- Transitpeptid aus Pisum sativum, die Ketolase aus Haematococcus pluvialis und das Polyadenylierungssignal der Octopin-Synthase aus Agrobacerium tumefaciens.
Der Klon pCRKETO2 wurde weiterhin für die Klonierung in den Expressionsvektor pJBNPAP2 (siehe oben) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 997 Bp Sphl-Fragmentes aus pCRKETO2 und Ligierung in den Sphl geschnittenen Vektor pJBNPAP2. Der Klon, der die Haematococcus pluvialis Ketolase in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcs-Transitpeptid enthält, trägt die Bezeichnung pBNPAP2BKT.
Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transfor- mation der BN PAP2-kontrollierten Expression der Ketolase aus Haematococcus pluvi- alis in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900).
Zur Herstellung des Expressionsvektors pS5BNPAP2BKT wurde das Kpnl-Fragment aus pBNPAP2BKT mit dem Kpnl geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert. pS5BNPAP2BKT 1 beinhaltet den BNPAP2-Promotor aus Brassica napus, das rbcS Transitpeptid aus Pisum sativum, die Ketolase aus Haematococcus pluvialis und das Polyadenylierungs- signal der Octopin-Synthase aus Agrobacterium tumefaciens.
Der Klon pCRKETO2 wurde daher für die Klonierung in den Expressionsvektor pJBNPAPXOCS (siehe oben) verwendet. Die Klonierung erfolgte durch Isolierung des 997 Bp Sphl-Fragmentes aus pCRKETO2 und Ligierung in den Sphl geschnittenen Vektor pJBNPAPX. Der Klon, der die Seqeunz der Haematococcus pluvialis Ketolase in der korrekten Orientierung als N-terminale translationale Fusion mit dem rbcs Tran- sitpeptid enthält, trägt die Bezeichnung pBNPAPXBKT.
Die Herstellung eines Expressionsvektors für die Agrobacterium-vermittelte Transformation der unter Expressionskontrolle des BN PAPX-Promotors stehenden Ketolase aus Haematococcus pluvialis in Tagetes erecta erfolgte unter der Verwendung des binären Vektors pSUN5 (WO02/00900).
Zur Herstellung des Expressionsvektors pS5BNPAPXBKT wurde das Kpnl-Fragment aus pBNPAPXBKT in den Kpnl geschnittenen Vektor pSUN5 ligiert. pS5BNPAPXBKT beinhaltet den BNPAPX Promotor aus Brassica napus, das rbcS Transitpeptid aus Pisum sativum, die Ketolase aus Haematococcus pluvialis und das Polyadenylierungs- signal der Octopin-Synthase aus Agrobacterium tumefaciens.
Beispiel 6:
Herstellung transgener Tagetes Pflanzen
Die Transformation von Tagetes folgt im Wesenetlichen der in WO 01/46445 beschrieben Methodik. Tagetessamen der Linie „Zitronenprinz" (erhalten von der IPK- Genbank, Gatersleben, Germany; dort unter TAG76 gelistet; auch erhältlich von Zierpflanzensammlung; Erfurt: Sortimentsnummer: 8184,00) werden sterilisiert und auf Keimungsmedium (MS-Medium; Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15(1962), 473- 497) pH 5,8, 2 % Saccharose) aufgelegt. Die Keimung erfolgt in einem Tempera- tur/Licht/Zeitintervall von 18 bis 28°C/20-200 μE/m2s für 3 bis 16 Wochen, bevorzugt jedoch bei 21 °C, 20 bis 70 μE/m2s, für 4 bis 8 Wochen.
Alle Blätter der sich bis dahin entwickelten in vitro Pflanzen werden geerntet und quer zur Mittelrippe geschnitten. Die dadurch entstehenden Blattexplantate mit einer Größe von 10 bis 60 mm2 werden im Verlaufe der Präparation in flüssigem MS-Medium bei Raumtemperatur für maximal 2 h aufbewahrt.
Ein beliebiger Agrobacterium tumefaciens Stamm, bevorzugt aber ein supervirulenter Stamm, wie z.B. EHA105 mit einem entsprechenden Binärplasmid, das ein Selekti- onsmarkergen (bevorzugt bar oder pat) sowie ein oder mehrere Trait- oder Reportergene tragen kann, wird (beispielsweise pS5BNPAPXBKT und pS5LEPAP2BKT), über Nacht angezogen und für die Co-Kultivierung mit dem Blattmaterial verwendet. Die Anzucht des Bakterienstammes kann wie folgt erfolgen: Eine Einzelkolonie des ent- sprechenden Stammes wird in YEB (0,1 % Hefeextrakt, 0,5 % Rindfleischextrakt, 0,5 % Pepton, 0,5 % Saccharose, 0,5 % Magnesiumsulfat x 7 H2O) mit 25 mg/l Kanamycin angeimpft und bei 28°C für 16 bis 20 h angezogen. Anschließend wird die Bakteriensuspension durch Zentrifugation bei 6000 g für 10 min geerntet und derart in flüssigem MS Medium resuspendiert, dass eine ODβoo von ca. 0,1 bis 0,8 entstand. Diese Sus- pension wird für die C-Kultivierung mit dem Blattmaterial verwendet.
Unmittelbar vor der Co-Kultivierung wird das MS-Medium, in dem die Blätter aufbewahrt worden sind, durch die Bakteriensuspension ersetzt. Die Inkubation der Blättchen in der Agrobakteriensuspension erfolgte für 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Anschließend werden die infizierten Explantate auf ein mit Agar (z.B. 0,8 % Plant Agar (Duchefa, NL) verfestigtes MS-Medium mit Wachstumsregulatoren, wie beispielsweise 3 mg/l Benzylaminopurin (BAP) sowie 1 mg/l Indolylessigsäure (IAA) aufgelegt. Die Orientierung der Blätter auf dem Medium ist bedeutungslos. Die Kultivierung der Explantate findet für 1 bis 8 Tage, bevorzugt aber für 6 Tage statt, da- bei können folgende Bedingungen angewendet werden: Lichtintensität: 30 bis 80 mMol/m2 x sec, Temperatur: 22 bis 240C, hell/dunkel-Wechsel von 16/8 Stunden. Anschließend werden die co-kultivierten Explantate auf frisches MS-Medium, bevorzugt mit den gleichen Wachstumsregulatoren übertragen, wobei dieses zweite Medium zusätzlich ein Antibiotikum zur Unterdrückung des Bakterienwachstums enthält. Timentin in einer Konzentration von 200 bis 500 mg/l ist für diesen Zweck sehr geeignet. Als zweite selektive Komponente wird eine für die Selektion des Transformationserfolges eingesetzt. Phosphinothricin in einer Konzentration von 1 bis 5 mg/l selektiert sehr effizient, aber auch andere selektive Komponenten gemäß des zu verwendenden Verfahrens sind denkbar.
Nach jeweils ein bis drei Wochen erfolgt der Transfer der Explantate auf frisches Medium bis sich Sprossknospen und kleine Sprosse entwickeln, die dann auf das gleiche Basalmedium einschließlich Timentin und PPT oder alternative Komponenten mit Wachstumsregulatoren, nämlich z.B. 0,5 mg/l Indolylbuttersäure (IBA) und 0,5 mg/l Gibberillinsäure GA3, zur Bewurzelung übertragen werden. Bewurzelte Sprosse kön- nen ins Gewächshaus überführt werden.
Zusätzlich zu der beschriebenen Methode sind folgende vorteilhafte Modifikationen möglich:
• Bevor die Explantate mit den Bakterien infiziert werden, können sie für 1 bis 12
Tage, bevorzugt 3 bis 4, auf das oben beschriebene Medium für die Co-Kultur vo- rinkubiert werden. Anschließend erfolgt die Infektion, Co-Kultur und selektive Regeneration wie oben beschrieben.
• Der pH Wert für die Regeneration (normalerweise 5,8) kann auf pH 5,2 gesenkt werden. Dadurch wird die Kontrolle des Agrobakterienwachstums verbessert.
• Die Zugabe von AgNCh (3 - 10 mg/l) zum Regenerationsmedium verbessert den Zustand der Kultur einschließlich der Regeneration selbst.
• Komponenten, die die Phenolbildung reduzieren und dem Fachmann bekannt sind, wie z.B. Zitronensäure, Ascorbinsäure, PVP u.v.a.m., wirken sich positiv auf die Kultur aus.
• Für das gesamte Verfahren kann auch flüssiges Kulturmedium Verwendung finden. Die Kultur kann auch auf handelsüblichen Trägern, die auf dem flüssigen Medium positioniert werden inkubiert werden.
Gemäß der oben beschriebenen Transformationsmethode wurden mit folgenden Ex- pressionskonstrukten folgende Linien erhalten: Nach Transformation mit dem binären Vektor pS5LEPAP2BKT wurden beispielsweise folgende Pflanzen erhalten: MS301-10, MS301-16, MS301-19.
Nach Transformation mit dem binären Vektor pS5BNPAPXBKT wurden beispielsweise Pflanzen erhalten, die im Folgenden mit MS259-11 , MS259-23, MS259-28 bezeichnet werden.
Beispiel 7:
Enzymatische Lipase-katalysierte Hydrolyse von Carotinoidestern aus Pflanzenmaterial und Identifizierung der Carotinoide
Allgemeine Arbeitsvorschrift
a) Gemörsertes Pflanzenmaterial, z.B. Petalenmaterial (30-100 mg Frischgewicht), wird mit 100% Aceton (dreimal 500μl; jeweils etwa 15 Minuten schütteln) extrahiert. Das Lösungsmittel wird evaporiert. Carotinoide werden anschließend in 495 μl Aceton aufgenommen, 4,95 ml Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH7.4) zugegeben und gut gemischt. Danach erfolgt die Zugabe von ca. 17 mg Bile-Salze (Sigma) und 149 μl einer NaCI/CaCb-Lösung (3M NaCI und 75 mM CaCI2). Die Suspension wird für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Für die enzymatische Hydrolyse der Carotinoidester wird 595 μl einer Lipaselösung (50 mg/ml Lipase Typ7 von Candida rugosa (Sigma)) zugegeben und unter Schütteln bei 37C inkubiert. Nach etwa 21 Stunden erfolgte nochmals eine Zugabe von 595 μl Lipase mit erneuter Inkubation von mindestens 5 Stunden bei 37°C. Anschließend werden etwa ca. 700 mg Na2SO4 in der Lösung gelöst. Nach Zugabe von 1800 μl Petrolether werden die Carotinoide durch kräftig Mischen in die organische Phase extrahiert. Dieses Ausschütteln wird solange wiederholt, bis die organische Phase farblos bleibt. Die Petroletherfraktionen werden vereinigt und der Petrolether evaporiert. Freie Carotinoide werden in 100-120 μl Aceton aufgenommen. Mittels HPLC und C30-reverse phase-Säule können freie Carotinoide aufgrund von Retenti- onszeit und UV-VIS-Spektren identifiziert werden.
Die verwendeten Bile-Salze oder Gallensäuresalze sind 1 :1 Mischungen von Cholat und Desoxycholat. b) Arbeitsvorschrift für Aufarbeitung, wenn nur geringe Mengen an Carotinoidestern im Pflanzenmaterial vorhanden sind
Alternativ kann die Hydrolyse der Carotinoidester durch Lipase aus Candida rugosa nach Trennung mittels Dünnschichtchromatographie erreicht werden. Dazu werden 50- 100mg Pflanzenmaterial dreimal mit etwa 750μl Aceton extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wird im Vakuum einrotiert (erhöhte Temperaturen von 40-500C sind tolera- bel). Danach erfolgt Zugabe von 300μl PetroletheπAceton (Verhältnis 5:1 ) und gute Durchmischung. Schwebstoffe werden durch Zentrifugation (1-2 Minuten) sedimentiert. Die obere Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Das verbleibende Rest wird erneut mit 200μl PetroletheπAceton (Verhältnis 5:1 ) extrahiert und Schwebstoffe werden durch Zentrifugation entfernt. Die beiden Extrakte werden zusammengeführt (Volumen 500μl) und die Lösungsmittel evaporiert. Der Rückstand wird in 30μl PetroletheπAceton (Verhältnis 5:1 ) resuspendiert und auf eine Dünnschichtplatte (Silica-Gel 60, Merck) aufgetragen. Falls mehr als eine Auftragung für präparativ-analytische Zwecke erforderlich ist, sollten mehrere Aliquots mit jeweils 50-100 mg Frischgewicht in der beschriebenen Weise für die dünnschichtchromatographische Trennung aufbereitet werden.
Die Dünnschichtplatte wird in PetroletheπAceton (Verhältnis 5:1 ) entwickelt. Caroti- noidbanden können visuell aufgrund ihrer Farbe identifiziert werden. Einzelne Caroti- noidbanden werden ausgekratzt und können für präparativ-analytische Zwecke gepoolt werden. Mit Aceton werden die Carotinoide vom Silica-Material eluiert; das Lösungsmittel wird im Vakuum evaporiert. Zur Hydrolyse der Carotinoidester wird der Rückstand in 495μl Aceton gelöst, 17mg Bile-Salze (Sigma), 4,95ml 0.1 M Kaliumphosphat- puffer (pH 7,4) und 149μl (3M NaCI, 75mM CaCb) zugegeben. Nach guter Durchmischung wird 30min bei 370C äquilibriert. Danach erfolgt die Zugabe von 595μl Lipase von Candida rugosa (Sigma, Stammlösung von 50mg/ml in 5mM CaCb). Über Nacht erfolgt die Inkubation mit Lipase unter Schütteln bei 370C. Nach etwa 21 Stunden wird nochmals die gleiche Menge an Lipase zugegeben; für mindestens 5 Stunden wird nochmals bei 370C unter Schütteln inkubiert. Dann erfolgt die Zugabe von 700mg
Na2SÜ4 (wasserfrei); mit 1800μl Petrolether wird für ca. 1 Minute ausgeschüttelt und die Mischung bei 3500 Umdrehungen/Minute für 5 Minuten zentrifugiert. Die obere Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Ausschütteln so lange wiederholt, bis die obere Phase farblos ist. Die vereinigte Petrolether-Phase wird im Vaku- um eingeengt (Temperaturen von 40-500C sind möglich). Der Rückstand wird in 120μl Aceton, eventuell mittels Ultraschall, gelöst. Die gelösten Carotinoide können mittels HPLC unter Verwendung einer C30-Säule getrennt und anhand von Referenzsubstanzen quantifiziert werden.
Beispiel 8: HPLC-Analyse freier Carotinoide
Die Analyse der nach der Arbeitsvorschriften in Beispiel 6 erhaltenen Proben erfolgt unter folgenden Bedingungen:
HPLC-Bedingungen:
Trennsäule: Prontosil C30-Säule, 250 x 4,6 mm, (Bischoff, Leonberg, Germany) Flussrate: 1.0 ml/min
Eluenten: Laufmittel A - 100% Methanol
Laufmittel B - 80% Methanol, 0.2% Ammoniumacetat
Laufmittel C - 100% t-Butyl-methylether Detektion: 300-530 nm Gradientenprofil:
Einige typische Retentionszeiten für erfindungsgemäß gebildete Carotinoide sind z.B.:
Violaxanthin etwa 1 1 , 7 min, Astaxanthin etwa 17,7 min, Adonixanthin etwa 19 min, Adonirubin etwa 19,9 min, Zeaxanthin etwa 21 min.
Nach Transformation mit dem binären Vektor pS5BNPAPXBKT wurden beispielsweise Pflanzen erhalten, die im Folgenden mit MS259 bezeichnet werden; nach Transformation mit dem binären Vektor pS5LEPAP2BKT wurden Pflanzen erhalten, die mit MS301 bezeichnet werden. Diese Pflanzen akkumulieren neugebildete Ketocarotinoide, die zuvor nicht in den Blütenblättern von Tagetes enthalten waren.
Tabelle 1 : Carotinoide in Blütenblättern transgener Tagetes, die die Bezeichnungen MS259 und MS301 tragen
Die Daten repräsentieren die prozentualen Anteile individueller Carotinoide in einem Carotinoid-Extrakt, der mit frischen Petalen vollständig aufgeblühter Blüten hergesetllt wurde. Alle Daten beziehen sich somit auf das Frischgewicht.
Legende:
"Epoxides" bedeutet die Gesamtmenge der Epoxide Violaxanthin, Antheraxanthin und Neoxanthin "Asta" bezeischnet Astaxanthin
„Phoenico" bezeichnet Phoenicoxanthin, auch synonym mit Adonirubin „Zea" bezeichnet Zeaxanthin „Cantha" bezeichnet Canthaxanthin ,,3'-Hydroxy" bezeichnet 3'-Hydroxyechinenon „b-Crypto" bezeichnet beta-Cryptoxanthin
"Ketos" bedeutet die Gesamtmenge aller Ketocarotinoide (Canthaxanthin, Phoenicoxanthin, Astaxanthin, Adonixanthin, Echinenon und 3'- und 3-Hydroxyechinenon.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Plastid-lipid associated Protein-Promotors (PAP-Promotors) zur heterologen Expression von Genen in Pflanzen der Gattung Tagetes.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Expression spezifisch in Blüten, insbesondere in Petalen erfolgt.
3. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der PAP- Promo- tor
A1 ) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 9, 18 oder 21 enthält, oder
A2) eine von diesen Sequenzen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % auf Nukleinsäureebene mit der jeweiligen Sequenz SEQ. ID. NO. 9, 18 oder 21 aufweist oder
A3) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 9, 18 oder 21 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder
A4) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A1 ), A2) oder A3).
4. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der PAP-Promotor mit einem Ketolase-Gen funktionell verknüpft ist.
5. Genetisch veränderte Pflanze der Gattung Tagetes, wobei die genetische Veränderung zu einer Erhöhung oder Verursachung der Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp führt und bedingt ist durch die Regulation der Expression dieses Gens in der Pflanze durch einen PAP-Promotor gemäß Anspruch 1.
6. Genetisch veränderte Pflanze nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Regulation der Expression von Genen in der Pflanze durch Promotoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch erreicht wird, dass man
a) eine oder mehrere Promotoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in das Genom der Pflanze einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Promotoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 erfolgt oder
b) ein oder mehrere Gene in das Genom der Pflanze einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrol- Ie der endogenen Promotoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 erfolgt oder c) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend mindestens einen Promotor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Gene, in die Pflanze einbringt.
7. Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten durch Kultivierung von genetisch veränderten Pflanzen der Gattung Tagetes gemäß einem der Ansprüche 5 bis 6.
8. Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden durch Kultivierung von genetisch veränderten Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zu exprimierenden Gene mindestens eine Ketolase enthalten.
9. Verfahren nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass eine Ketolase aus Haematococcus verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 zur Herstellung von Astaxanthin und Astaxanthinde- rivaten.
1 1. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem KuI- tivieren die genetisch veränderten Pflanzen oder Pflanzenteile erntet und anschließend die Carotinoide aus den genetisch veränderten Pflanzen oder Pflanzenteilen isoliert.
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