EP1848809A2 - Use of pit emulsions in biocatalytic reactions - Google Patents

Abstract

The invention relates to the use of O/W emulsions as reaction media for biocatalytic reactions, which emulsions contain at least water, emulsifiers and an oily phase. The invention is characterized in that the emulsion is produced according to the PIT method and has a droplet size of 50 to 400 nm. The enzymes used are lyases and/or oxidoreductases.

Description

Verwendung von PIT-Emulsionen in biokatalytischen ReaktionenUse of PIT emulsions in biocatalytic reactions

Gebiet der ErfindungField of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Emulsionen, die nach dem PIT- Verfahren hergestellt werden, als Reaktionsmedium für biokatalytische Reaktionen.The present invention relates to the use of emulsions prepared by the PIT process as a reaction medium for biocatalytic reactions.

Stand der TechnikState of the art

In der chemischen und biochemischen Synthese werden vermehrt Enzyme als Katalysatoren eingesetzt. So werden in vielen Fällen aufgrund der oft milderen Reaktionsbedingungen bereits in großtechnischen Verfahren Hydrolasen, speziell Lipasen (EC 3.1.1.3) zur Fettspaltung und Umesterang eingesetzt. Geeignete biokatalytische Verfahren zur Synthese sind beispielsweise beschrieben in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, WILEY-VCH , Band I bis III, 2002; U.T. Bornscheuer, RJ. Kazlauskas in Hydrolases in Organic Synthesis. Die technische Umsetzung biokatalytischer Verfahren wird von A. Liese, K. Seelbach und C. Wandrey in Industrial Biotransformations, WILEY-VCH, 2002 beschrieben.In chemical and biochemical synthesis, enzymes are increasingly being used as catalysts. Thus, in many cases due to the often milder reaction conditions, hydrolases, especially lipases (EC 3.1.1.3) for fat cleavage and transesterification are already used in large-scale processes. Suitable biocatalytic methods for synthesis are described, for example, in K. Drauz and H. Waldmann, Enzymes Catalysis in Organic Synthesis, WILEY-VCH, Volumes I to III, 2002; U.T. Bornscheuer, RJ. Kazlauskas in Hydrolases in Organic Synthesis. The technical implementation of biocatalytic processes is described by A. Liese, K. Seelbach and C. Wandrey in Industrial Biotransformations, WILEY-VCH, 2002.

Die Bedeutung der Anwendung von Enzymen in organischen Lösemittel vor allem zur Herstellung von Feinchemikalien wächst immer weiter. In den verwendeten Zwei- oder Mehrphasensystemen können so wasserlösliche und wasserunlösliche Reaktionskomponenten in ein Gesamtsystem sinnvoll integriert werden und einen verbesserten Massentransfer gewährleisten. Oft wird eine Reaktionskomponente für einen enzymatischen Angriff durch solche Sys- teme erst verfügbar, besonders dann, wenn ein oder mehrere Ausgangsprodukte bei der Reaktionstemperatur in festem Zustand vorliegen.The importance of the use of enzymes in organic solvents, especially for the production of fine chemicals, continues to grow. In the two-phase or multi-phase systems used, water-soluble and water-insoluble reaction components can be meaningfully integrated into an overall system and ensure improved mass transfer. Often, a reaction component becomes available for enzymatic attack by such systems, especially when one or more starting materials are in a solid state at the reaction temperature.

Doch nicht nur isolierte Enzyme rinden in solchen mehrphasigen Reaktionssystemen Verwendung. Es werden vielfach ganze Mikroorganismen eingesetzt und der Enzympool dieser Mik- roorganismen für sogenannten Biotransformationen benutzt. Enzyme und Mikroorganismen in Form der ganzen Zellen oder in Form aktiver Zellbestandteile werden im Folgenden als Biokatalysatoren bezeichnet. Von Nachteil ist vielfach, dass die verwendeten Lösemittel die Reaktivitäten der eingesetzten Katalysatoren - Enzyme oder ganze Mikroorganismen sowie deren Zellbestandteile- ungünstig beeinflussen. So können die Lösemittel zur Denaturierung der Biokatalysatoren fuhren und damit die Biokatalysatorleistung vermindern oder ganz zerstören.However, it is not only isolated enzymes that are used in such multiphase reaction systems. In many cases, whole microorganisms are used and the enzyme pool of these microorganisms used for so-called biotransformations. Enzymes and microorganisms in the form of whole cells or in the form of active cell components are referred to below as biocatalysts. It is often disadvantageous that the solvents used adversely affect the reactivities of the catalysts used - enzymes or whole microorganisms and their cell constituents. Thus, the solvents can lead to denaturation of the biocatalysts and thus reduce the biocatalyst performance or destroy completely.

Für eine effiziente Umsetzung der Komponenten durch die Biokatalysatoren, die sich meistens in der wässrigen Phase befinden, ist eine große Grenzfläche zwischen der hydrophilen und der hydrophoben Phase notwendig. Eine große Oberfläche entsteht, wenn möglichst kleine Tröpfchen eine Phase beispielsweise durch Rühren oder Homogenisieren erzeugt werden.For efficient conversion of the components by the biocatalysts, which are mostly in the aqueous phase, a large interface between the hydrophilic and the hydrophobic phase is necessary. A large surface is created when the smallest possible droplets of a phase, for example, by stirring or homogenizing are generated.

Zur Beschleunigung der Reaktion ist ein Mischen / Rühren notwendig. Bei manchen Reaktionen wie z.B. Oxidationsreaktionen muss außerdem begast werden. Unerwünschter Effekt ist dabei eine Schaumbildung, die reaktionstechnische Probleme aufwerfen kann.To accelerate the reaction, mixing / stirring is necessary. For some reactions, e.g. Oxidation reactions must also be fumigated. Undesirable effect is a foaming, which can pose reaction problems.

Auch ohne Begasung des Systems sollte eine Schaumbildung vermieden werden, da Biokatalysatoren an den Grenzflächen der Schäume inaktiviert werden können.Even without fumigation of the system, foaming should be avoided since biocatalysts can be inactivated at the interfaces of the foams.

Eine intensive Durchmischung ist einerseits zur effizienten Reaktion notwendig, andererseits kann sie schädlich sein. Gefordert werden muss also ein System, das sehr hohe Grenzflächen liefern kann bei einer niedrigen Scherungrsate, geringer Rührerdrehzahl oder schonenden Mischbedingungen.On the one hand, intensive mixing is necessary for an efficient reaction, on the other hand it can be detrimental. What needs to be called for is a system that can deliver very high interfaces at a low shear rate, low agitator speed or gentle mixing conditions.

Der Nachteil bei biokatalytischen Reaktionen liegt oft in der Verfügbarkeit und Stabilität der am Prozess beteiligten Katalysatoren. Aus dem Stand der Technik sind bereits Enzyme oder Mikroorganismen bekannt, die durch Immobilisierung beispielsweise durch Mikroeinkapse- lung stabilisiert vorliegen und mehrfach Verwendung finden können. Damit die Biokatalysatoren auch für kommerzielle Anwendungen eingesetzt werden, wird vielfach nach neuen Biokatalysatoren gesucht, die eine geeignete Stabilität aufweisen. Modernere Methoden bedienen sich z.B. der „directed evolution", um das gewünschte Profil der Biokatalysatoren zu entwi- ekeln.The disadvantage of biocatalytic reactions is often the availability and stability of the catalysts involved in the process. Enzymes or microorganisms which are stabilized by immobilization, for example by microencapsulation and can be used repeatedly, are already known from the prior art. In order for the biocatalysts to be used for commercial applications, new biocatalysts with suitable stability are frequently being sought. More modern methods make use of e.g. the "directed evolution" to develop the desired profile of the biocatalysts.

Die Umsetzung von hydrophoben Verbindungen kann bereits durch den Einsatz von Wasser in Öl (W/O) Mikroemulsionen durchgeführt werden, wie es von Orlich und Schomaeker in Enzyme Microb. Technol.; 2001; 28; 1; 42-48 für die Lipase aus Candida rugosa beschrieben wird. Sehr kritisch für die erfolgreiche Umsetzung ist jedoch die Konzentration an Wasser in der Lösung sowie die Zusammensetzung der Komponenten der W/O-Mikroemulsion. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung hat somit darin bestanden, ein System für biokatalysierte Reaktionen zur Verfügung zu stellen, bei dem Lösemittel, die den Biokatalysator schädigen können, vermieden werden und dennoch Substanzen umgesetzt werden können, die sich schlecht in wässrigen Systemen lösen. Außerdem soll die Reaktion bei milden Mischbedin- gungen ablaufen, um die bereits oben beschriebenen negativen Auswirkungen zu begrenzen oder zu vermeiden.The reaction of hydrophobic compounds can already be carried out by the use of water in oil (W / O) microemulsions, as described by Orlich and Schomaeker in Enzyme Microb. Technol .; 2001; 28; 1; 42-48 for the lipase from Candida rugosa. Very critical for the successful implementation, however, is the concentration of water in the solution and the composition of the components of the W / O microemulsion. The object of the present invention was therefore to provide a system for biocatalyzed reactions in which solvents which can damage the biocatalyst can be avoided and yet substances can be reacted which dissolve poorly in aqueous systems. In addition, the reaction should proceed under mild mixing conditions in order to limit or avoid the negative effects already described above.

Im System sollte die Substratkonzentrationen variiert werden können, wobei jedoch die hohe Grenzfläche und damit die Konzentrationen an Öl und Wasser soweit konstant bleiben, dass sie keinen großen Einfluss auf die Reaktion und auf die Aktivität des Enzyms haben. Des weiteren sollten diese Systeme kostengünstig und recyclingfähig sein und den Biokatalysator nicht oder nur geringfügig in seiner Stabilität beinträchtigen. Damit sollen auch solche Enzyme verwendet werden können, die in klassisch verwendeten organischen Lösemittelsystemen eine zu geringe Stabilität zeigen.In the system, the substrate concentrations should be able to be varied, but the high interface and thus the concentrations of oil and water remain constant so far that they have no great influence on the reaction and on the activity of the enzyme. Furthermore, these systems should be inexpensive and recyclable and not or only slightly affect the biocatalyst in its stability. This should also be such enzymes can be used, which show too poor stability in classically used organic solvent systems.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von O/W-Emulsionen als Reaktionsmedium für biokatalytische Reaktionen, enthaltend mindesten Wasser, Emulgatoren sowie eine Ölpha- se, wobei die Emulsion nach dem PIT- Verfahren hergestellt wird und eine Tröpfchengröße von 50 bis 400 nm aufweist.The invention relates to the use of O / W emulsions as a reaction medium for biocatalytic reactions, containing at least water, emulsifiers and a Ölpha- se, wherein the emulsion is prepared by the PIT method and has a droplet size of 50 to 400 nm.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass O/W-Emulsionen die nach dem PIT- Verfahren hergestellt wurden, die eingangs geschilderten Anforderungen in ausgezeichneter Weise erfül- len. Das erfmdungsgemässe PIT-System zeigt die geforderten Eigenschaften.Surprisingly, it has been found that O / W emulsions which have been prepared by the PIT process, meet the requirements outlined above in an excellent manner. The erfmdungsgemässe PIT system shows the required properties.

PIT-EmulsionenPIT emulsions

Emulsionen sind disperse Zubereitungen aus mindestens zwei nicht ineinander löslichen Flüssigkeiten von denen eine wässrig ist. Zur Homogenisierung nicht mischbarer Öl/Wasser- Phasen durch Emulgierung werden Emulgatoren beziehungsweise Emulgatorsysteme eingesetzt. Ohne Einfluss von stabilisierenden Emulgatoren würden sich die Phasen aufgrund ihrer unterschiedlichen Polaritäten wieder trennen. Die amphiphilen Emulgatoren sitzen an den Grenzflächen zwischen den fein verteilten Tröpfchen und der kohärenten Phase und verhindern durch sterische oder elektrostatische Abschirmung ihr Zusammenfließen (= Koaleszenz). Emulgatoren sind Verbindungen, die in ihrer Molekülstruktur hydrophile und lipophile Bausteine miteinander verbinden. Auswahl und Ausmaß der jeweiligen Bausteine im betroffenen Emulgatormolekül beziehungsweise Emulgatorsystem werden häufig durch den HLB- (number)Wert gekennzeichnet, der eine Aussage zur Hydrophilic-Lipophilic-Balance macht. Dabei gilt üblicherweise: Emulgatoren beziehungsweise Emulgatorsysteme mit vergleichsweise stark hydrophilen Anteilen führen zu hohen HLB-Werten und in ihrer praktischen An- wendung in der Regel zu den Wasser-basierten O/W-Emulsionen mit disperser Ölphase. E- mulgatoren beziehungsweise Emulgatorsysteme mit vergleichsweise stark lipophilen Anteilen führen zu vergleichsweise niedrigeren HLB-Werten und damit zur W/O-Invertemulsion mit geschlossener Ölphase und disperser Wasserphase.Emulsions are disperse preparations of at least two non-dissolvable liquids, one of which is aqueous. Emulsifiers or emulsifier systems are used to homogenize immiscible oil / water phases by emulsification. Without the influence of stabilizing emulsifiers, the phases would separate again because of their different polarities. The amphiphilic emulsifiers sit at the interfaces between the finely divided droplets and the coherent phase and prevent their coalescence through steric or electrostatic shielding. Emulsifiers are compounds that combine hydrophilic and lipophilic building blocks in their molecular structure. Selection and extent of the respective building blocks in the affected one Emulsifier molecule or emulsifier system are often characterized by the HLB (number) value, which makes a statement on the hydrophilic-lipophilic balance. Usually, emulsifiers or emulsifier systems with comparatively highly hydrophilic proportions lead to high HLB values and in their practical application generally to the water-based O / W emulsions with disperse oil phase. E-emulsifiers or emulsifier systems with comparatively highly lipophilic fractions lead to comparatively lower HLB values and thus to the W / O invert emulsion with closed oil phase and disperse water phase.

Es ist bekannt, daß Öl-in- Wasser-Emulsionen (O/W), die mit nichtionogenen Emulgatoren hergestellt und stabilisiert sind, bei Erwärmen eine in der Regel reversible Phaseninversion erfahren können, d.h., dass innerhalb eines bestimmten Temperaturintervalls ein Wechsel des Emulsionstyps von OAV zu W/O (Wasser-in-Öl-Emulsion) erfolgt. Da dabei das Öl zur äußeren, kontinuierlichen Phase wird, sinkt die Leitfähigkeit der Emulsion auf Null. Der Mittel- wert der Temperaturen zwischen maximaler und gerade auf Null gefallener Leitfähigkeit der Emulsion bei Temperaturerhöhung wird Phaseninversionstemperatur (PIT) und die auf diese Weise hergestellten Emulsionen werden PIT-Emulsionen genannt.It is known that oil-in-water emulsions (O / W) prepared and stabilized with nonionic emulsifiers can undergo a generally reversible phase inversion upon heating, ie, within a certain temperature interval, an emulsion type change of OAV to W / O (water-in-oil emulsion) takes place. As the oil becomes the outer, continuous phase, the conductivity of the emulsion drops to zero. The mean value of the temperatures between maximum and just zero-decayed conductivity of the emulsion as the temperature increases becomes phase inversion temperature (PIT) and the emulsions prepared in this way are called PIT emulsions.

Es ist auch bekannt, dass die Lage der PIT von vielen Faktoren abhängig ist, zum Beispiel von der Art und des Phasenvolumens der Ölkomponente, von der Hydrophilie und der Struktur der Emulgatoren und der Zusammensetzung des Emulgatorsystems.It is also known that the location of the PIT depends on many factors, for example the type and the phase volume of the oil component, the hydrophilicity and the structure of the emulsifiers and the composition of the emulsifier system.

Wesentlich für die Feinteiligkeit der PIT-Emulsion ist deren Herstellungsverfahren. In der Regel werden die Wasser- und Ölphase mit den Emulgatoren vermischt und danach auf eine Temperatur oberhalb der PIT erwärmt. Die Leitfähigkeit muß dabei auf Null fallen. Anschließend wird die Emulsion wieder auf die Ausgangstemperatur abgekühlt (in der Regel Raum- temperatur, ca. 20°C). Dabei erfolgt erst durch Überschreiten und das anschließende Unterschreiten der PIT die Ausbildung der erfindungsgemäß verwendeten Emulsion. Es ist bekannt, dass nur solche PIT-Emulsionen besonders feinteilig sind, welche bei der Phaseninversion eine Mikroemulsionsphase mit niedriger Grenzflächenspannung zwischen Öl und Wasser oder eine lamellare flüssigkristalline Phase ausbilden. Der entscheidende Schritt ist dabei immer die Rückinvertierung bei Abkühlung.Essential for the fineness of the PIT emulsion is its production process. As a rule, the water and oil phases are mixed with the emulsifiers and then heated to a temperature above the PIT. The conductivity must fall to zero. The emulsion is then cooled back to the starting temperature (usually room temperature, approx. 20 ° C). In this case, the formation of the emulsion used according to the invention takes place only when the PIT is exceeded and the subsequent drop below the PIT. It is known that only those PIT emulsions are particularly finely divided, which form a microemulsion phase with low interfacial tension between oil and water or a lamellar liquid-crystalline phase in the phase inversion. The decisive step is always the reverse inversion on cooling.

Die erfindungsgemäßen Emulsionen zeichnen sich insbesondere durch ihre Feinteiligkeit aus. Die Tröpfchengröße beträgt 50 bis 400 um. Vorzugsweise liegt die Tröpfchengröße im Bereich von 70 bis 300 nm, insbesondere im Bereich von 80 bis 250 nm und besonders bevor- zugt im Bereich von 90 bis 160 nm. Bei den Tröpfchengrößen wird eine Verteilung nach Gauss angenommen. Die Messung erfolgt beispielsweise durch Lichtstreuung oder Absorption. Diese feinverteilten Emulsionen behalten ihre Homogenität durch die Brownsche Molekularbewegung. Diese Brownsche Molekularbewegung ist eine thermische Zufallsbewegung von Teilchen < 5 μm. Sie ist die treibende Kraft der Diffusion und behindert sowohl die Sedimentation als auch das Aufrahmen (Flotation). Ein großer Vorteil besteht darin, dass energieauf- wendige Rührvorgänge vermindert werden können. Sie führt zu einer verbesserten Diffusion von Substrat und Enzym und zu verminderten Energiekosten.The emulsions according to the invention are distinguished in particular by their fineness. The droplet size is 50 to 400 μm. The droplet size is preferably in the range from 70 to 300 nm, in particular in the range from 80 to 250 nm and particularly preferably in the range from 90 to 160 nm. For the droplet sizes, a distribution according to Gauss is assumed. The measurement is carried out, for example, by light scattering or absorption. These finely divided emulsions retain their homogeneity through Brownian motion. This Brownian motion is a thermal random motion of particles <5 μm. It is the driving force of diffusion and hinders both sedimentation and flotation. A big advantage is that energy-consuming stirring processes can be reduced. It leads to an improved diffusion of substrate and enzyme and to reduced energy costs.

Die Substratkonzentrationen können variiert werden ohne dass die Tropfengröße verändert werden muss. Eine hohe Substratkonzentration kann erreicht werden, ohne dass eine Koales- zens der Tropfen auftritt. Die geringe Oberflächenspannung erhöht die Transferrate der MoIe- küle an der Öl/Wasser Grenzfläche. Die hohe Reproduzierbarkeit und Stabilität der PIT- Emulsionen ermöglicht biochemische Studien an Enzymen und deren Reaktivität sowie die Möglichkeit bereits bekannte Reaktionsbedingungen und Aktivitäten für Enzyme noch weiter zu optimieren. Die erfindungsgemäßen Emulsionen zeichnen sich dadurch aus, dass sie bei der erfmdungs- gemäßen Verwendung eine ausreichende Stabilität während der Reaktionsphase zeigen. Das beinhaltet, dass ein Zerfall der Emulsion, hergestellt nach dem PIT Verfahren, nach der gewünschten Reaktion nicht nachteilig ist und in einer bevorzugten Ausführungsform gewünscht wird. Dieses hat den Vorteil, dass eine erleichterte Aufarbeitung der Produkte erzielt werden kann.The substrate concentrations can be varied without having to change the droplet size. A high substrate concentration can be achieved without a coalescence of the droplets occurring. The low surface tension increases the transfer rate of the molecules at the oil / water interface. The high reproducibility and stability of the PIT emulsions enable biochemical studies on enzymes and their reactivity as well as the possibility to further optimize already known reaction conditions and activities for enzymes. The emulsions according to the invention are distinguished by the fact that they exhibit sufficient stability during the reaction phase during the use according to the invention. This implies that disintegration of the emulsion prepared by the PIT process is not detrimental to the desired reaction and is desired in a preferred embodiment. This has the advantage that a simplified processing of the products can be achieved.

Die PIT-Emulsionen enthalten, neben Wasser noch eine Ölphase, die Verbindungen aus der Gruppe der Mineralöle und Fettsäurealkylester a) oder der nativen Öle pflanzlichen Ursprungs und deren oleochemischen Derivate b) enthält. Es handelt sich bei den Gruppen a) und b) um hydrophobe, in Wasser nicht oder nur sehr ge- ring lösliche Verbindungen, die bevorzugt die Ausgangsstoffe, also Substrate für die durch biokatalytische Katalyse gewünschten Produkte darstellen können aber auch als Hilfsstoffe eingesetzt werden können. Es handelt sich dabei im Wesentlichen um Fettsäureester, Fettal- koholether, Fettalkoholester, und Fettsäurepolyolester. Geeignete Ester der Gruppe a) leiten sich insbesondere ab von gesättigten, ungesättigten, line- aren oder verzweigten Fettsäuren mit insgesamt 7 bis 23 Kohlenstoffatomen. Es handelt sich also um Verbindungen der Formel (I)The PIT emulsions contain, in addition to water, an oil phase which contains compounds from the group of mineral oils and fatty acid alkyl esters a) or of the native oils of vegetable origin and their oleochemical derivatives b). Groups a) and b) are hydrophobic compounds which are insoluble or only sparingly soluble in water and which may preferably be the starting materials, ie substrates for the products desired by biocatalytic catalysis but may also be used as auxiliaries. These are essentially fatty acid esters, fatty alcohol ethers, fatty alcohol esters, and fatty acid polyol esters. Suitable esters of group a) are derived in particular from saturated, unsaturated, linear or branched fatty acids having a total of 7 to 23 carbon atoms. These are therefore compounds of the formula (I)

R'-COO-R² (I)R'-COO-R ² (I)

wobei R¹ für einen Alkylrest mit 6 bis 22 C-Atomen steht und R² ein Alkylrest mit 1 bis 4 C- Atomen ist, wobei Methyl- und Ethylreste besonders bevorzugt sind. Am vorteilhaftesten ist der Einsatz von Methylestern. Die Methylester der Formel (I) können auf übliche Weise, z.B. durch Umesterung von Triglyceriden mit Methanol und anschließender Destillation, erhalten werden. Geeignete Fettsäuren sind die Capron-, Heptan-, Capryl-, Perlagon-, Caprin-, Unde- can-, Laurin-, Tridecan-, Myristin-, Pentadecan-, Palmitin-, Heptadecan-, Stearin-, Nonade- can-, Arachin- und Behensäure. Ungesättigte Vertreter sind beispielsweise Lauroelein-, My- ristolein-, Palmitolein-, Petroselaidin-, Öl-, Elaidin-, Ricinol-, Linol-, konjugierte Linolsäure (CLA), insbesondere die cis9,transl 1-CLA oder die translO,cisl2-CLA, Linolaidin-, Linolen-, konjugierte Linolsäure Gadolein-, Arachidon und Erucasäure. Auch Mischungen der Methylester und/oder Ethylester dieser Säuren sind geeignet. Besonders bevorzugt ist die Verwendung solcher PIT-Emulsionen, die Methylester und/oder Ethylester aus der Gruppe Methylo- leat, Methylpamitat, Methylstearat, Methylpelargonat, Ethyloleat, Ethylpamitat, Ethylstearat und/oder Ethylpelargonat enthalten. Es können aber auch Methylester und/oder Ethylester auf Basis natürlicher Fettsäuremischungen eingesetzt werden, wie sie beispielsweise aus Lein-, Kokos-, Palm-, Palmkern-, Oliven- , Ricinus-, Rüb-, Soja- oder Sonnenblumenölen (bei Raps- und Sonnenblumenöl jeweils neue und alte Züchtungen) erhalten werden.where R ^{1 is} an alkyl radical having 6 to 22 C atoms and R ^{2 is} an alkyl radical having 1 to 4 C atoms, with methyl and ethyl radicals being particularly preferred. Most advantageous is the use of methyl esters. The methyl esters of the formula (I) can be obtained in a customary manner, for example by transesterification of triglycerides with methanol and subsequent distillation become. Suitable fatty acids are caproic, heptane, caprylic, perlagonic, capric, undecane, lauric, tridecane, myristic, pentadecane, palmitic, heptadecane, stearic, nonadecan, Arachin and behenic acid. Unsaturated representatives are, for example, lauroelein, myristolein, palmitoleic, petroselaidin, oil, elaidin, ricinoleic, linoleic, conjugated linoleic acid (CLA), in particular the cis9, transl-CLA or the translO, cis12- CLA, linoleic, linolenic, conjugated linoleic gadoleic, arachidonic and erucic acid. Mixtures of the methyl esters and / or ethyl esters of these acids are also suitable. Particular preference is given to the use of such PIT emulsions which contain methyl esters and / or ethyl esters from the group of methyl oleate, methylpamitate, methyl stearate, methyl pelargonate, ethyl oleate, ethyl pamitate, ethyl stearate and / or ethyl pelargonate. However, it is also possible to use methyl esters and / or ethyl esters based on natural fatty acid mixtures, such as, for example, from linseed, coconut, palm, palm kernel, olive, castor oil, rapeseed, soybean or sunflower oils (in the case of rape seed and sunflower oils Sunflower oil each new and old varieties) are obtained.

Geeignete Verbindungen der Gruppe b) sind, native Öle pflanzlichen Ursprungs und deren oleochemischen Derivate. Es handelt sich dabei im Wesentlichen um Mineralöle, Fettsäureester, Fettsäureether, Fettalkoholether, Fettalkoholester, Fettsäurepolyolester wie bevorzugt Triglyceride und Triglyceridmischungen, wobei das Glycerin mit längerkettigen Fettsäuren jeweils vollständig verestert ist. Besonders geeignete pflanzliche Öle sind ausgewählt aus der Gruppe Erdnuß-, Kokos- und/oder Sonnenblumenöl.Suitable compounds of group b) are native oils of plant origin and their oleochemical derivatives. These are essentially mineral oils, fatty acid esters, fatty acid ethers, fatty alcohol ethers, fatty alcohol esters, fatty acid polyol esters such as preferably triglycerides and triglyceride mixtures, the glycerol in each case being completely esterified with longer-chain fatty acids. Particularly suitable vegetable oils are selected from the group peanut, coconut and / or sunflower oil.

Wichtige Bestandteile der erfindungsgemäß verwendeten PIT-Emulsionen sind die eingesetzten Emulgatoren bzw. Emulgatorensysteme. Vorzugsweise werden als Emulgatoren nichtionische Emulgatoren, insbesondere ethoxylierte Fettalkohole und Fettsäuren eingesetzt. Zur Ausbildung von PIT-Emulsionen ist es vorteilhaft ein zweikomponentiges Emulgatorsystem, enthaltend einen hydrophilen Emulgator (A) und einen hydrophoben Coemulgator (B) einzusetzen. Als hydrophile nichtionische Emulgatoren (A) eignen sich Stoffe, die einen HLB-Wert von etwa 8 bis 18 aufweisen. Unter dem HLB-Wert (Hydrophil-Lipophil-Balance) soll ein Wert verstanden werden, der gemäßImportant constituents of the PIT emulsions used according to the invention are the emulsifiers or emulsifier systems used. The emulsifiers used are preferably nonionic emulsifiers, in particular ethoxylated fatty alcohols and fatty acids. For the formation of PIT emulsions, it is advantageous to use a two-component emulsifier system comprising a hydrophilic emulsifier (A) and a hydrophobic coemulsifier (B). Suitable hydrophilic nonionic emulsifiers (A) are substances which have an HLB value of about 8 to 18. The HLB value (hydrophilic-lipophilic balance) is to be understood as meaning a value which corresponds to

HLB = (100-L) / 5HLB = (100-L) / 5

errechnet werden kann, wobei L der Gewichtsanteil der lipophilen Gruppen, d.h. der Fettalkyl- oder Fettacylgruppen in Prozent in den Ethylenoxidanlagerungsprodukten ist.can be calculated, where L is the weight fraction of the lipophilic groups, i. is the fatty alkyl or fatty acyl groups in percent in the ethylene oxide addition products.

Fettalkoholethoxylate im Sinne der erfindungsgemäßen Lehre folgen der allgemeinen Formel (H) R³-O-(CH₂CH₂O)_n-H (II)Fatty alcohol ethoxylates according to the teaching of the invention follow the general formula (H) R ^{3 is} -O- (CH ₂ CH ₂ O) _n -H (II)

wobei R³ für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Alkylrest mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen steht und n eine Zahl von 1 bis 50 bedeutet. Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (II), in der n für eine Zahl von 1 bis 35 und insbesondere von 1 bis 15 steht. Besonders bevorzugt sind weiterhin solche Verbindungen der Formel (II), in der R³ für einen Alkylrest mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen steht.wherein R ^{3 is} a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl radical having 6 to 24 carbon atoms and n is a number from 1 to 50. Particular preference is given to those compounds of the formula (II) in which n is a number from 1 to 35 and in particular from 1 to 15. Particular preference is furthermore given to those compounds of the formula (II) in which R ^{3 is} an alkyl radical having 16 to 22 carbon atoms.

Die Verbindungen der Formel (II) werden in an sich bekannter Weise durch Umsetzung von Fettalkoholen mit Ethylenoxid unter Druck, ggf. in Gegenwart saurer oder basischer Katalysatoren erhalten. Typische Beispiele sind Capronalkohol, Caprylalkohol, 2-Ethylhexylalkohol, Caprinalkohol, Laurylalkohol, Isotridecylalkohol, Myristylalkohol, Cetylalkohol, Palmoleyl- alkohol, Stearylalkohol, Isostearylalkohol, Oleylalkohol, Elaidylalkohol, Petroselinylalkohol, Linolylalkohol, Linolenylalkohol, Elaeostearylalkohol, Arachylalkohol, Gadoleylalkohol, Be- henylalkohol, Erucylalkohol und Brassidylalkohol sowie deren technische Mischungen, die z.B. bei der Hochdruckhydrierung von technischen Methylestern auf Basis von Fetten und Ölen oder Aldehyden aus der Roelen'schen Oxosynthese sowie als Monomerfraktion bei der Dimerisierung von ungesättigten Fettalkoholen anfallen. Bevorzugt sind technische Fettalkohole mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Kokos-, Palm-, Palmkern- oder Taigfettalkohol.The compounds of the formula (II) are obtained in a manner known per se by reacting fatty alcohols with ethylene oxide under pressure, if appropriate in the presence of acidic or basic catalysts. Typical examples are caproic alcohol, capryl alcohol, 2-ethylhexyl alcohol, capric alcohol, lauryl alcohol, isotridecyl alcohol, myristyl alcohol, cetyl alcohol, palmoleyl alcohol, stearyl alcohol, isostearyl alcohol, oleyl alcohol, elaidyl alcohol, petroselinyl alcohol, linolyl alcohol, linolenyl alcohol, elaeostearyl alcohol, arachyl alcohol, gadoleyl alcohol, behenyl alcohol, erucyl alcohol and brassidyl alcohol and their technical mixtures, eg incurred in the high-pressure hydrogenation of technical methyl esters based on fats and oils or aldehydes from the Roelen oxo synthesis and as a monomer fraction in the dimerization of unsaturated fatty alcohols. Preferred are technical fatty alcohols having 12 to 18 carbon atoms, such as coconut, palm, palm kernel or Taigfettalkohol.

Fettsäureethoxylate, die ebenfalls als Emulgatorkomponente (A) in Betracht kommen, folgen vorzugsweise der Formel (III),Fatty acid ethoxylates, which are also suitable as emulsifier component (A), preferably follow the formula (III),

R⁴CO₂(CH₂CH₂O)_1nH (III)R ⁴ CO ₂ (CH ₂ CH ₂ O) _1n H (III)

in der R⁴ für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen und m für Zahlen von 5 bis 50 und vorzugsweise 12 bis 35 steht. Typische Beispiele sind Anlagerungsprodukte von 10 bis 30 Mol Ethylenoxid an Laurinsäure, Isotridecansäure, My- ristinsäure, Palmitinsäure, Palmoleinsäure, Stearinsäure, Isostearinsäure, Ölsäure, Elaidinsäu- re, Petroselinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Elaeostearinsäure, Arachinsäure, Gadoleinsäure, Behensäure und Erucasäure sowie deren technische Mischungen, die z.B. bei der Druckspaltung von natürlichen Fetten und Ölen oder bei der Reduktion von Aldehyden aus der Roelen- schen Oxosynthese anfallen. Vorzugsweise werden Anlagerungsprodukte von 10 bis 30 Mol Ethylenoxid an Fettsäuren mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen eingesetzt.in which R ^{4 is} a linear or branched alkyl radical having 12 to 22 carbon atoms and m is a number from 5 to 50 and preferably 12 to 35. Typical examples are adducts of 10 to 30 moles of ethylene oxide with lauric acid, isotridecanoic acid, myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, isostearic acid, oleic acid, elaidic acid, petroselinic acid, linoleic acid, linolenic acid, elaeostearic acid, arachidic acid, gadoleic acid, behenic acid and erucic acid, and the like technical mixtures which are obtained, for example, in the pressure splitting of natural fats and oils or in the reduction of aldehydes from Roelen's oxosynthesis. Preferably, addition products of 10 to 30 moles of ethylene oxide are used to fatty acids having 16 to 18 carbon atoms.

Partialglyceride, die als Emulgatorkomponente (B) in Betracht kommen, folgen vorzugsweise der Formel (IV), CH₂O(CH₂CH₂O)_x-COR⁵ Partial glycerides, which are suitable as emulsifier component (B), preferably follow the formula (IV), CH ₂ O (CH ₂ CH ₂ O) _x -COR ⁵

CH-O(CH2CH2O)yH (IV) ICH-O (CH 2 CH 2 O) y H (IV) I

CH2O(CH2CH2O)z-HCH2O (CH2CH2O) z-H

in der COR⁵ für einen linearen oder verzweigten Acylrest mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen und x, y und z in Summe für 0 oder für Zahlen von 1 bis 50, vorzugsweise 15 bis 35 steht. Typische Beispiele für im Sinne der Erfindung geeignete Partialglyceride sind Laurin- säuremonoglycerid, Kokosfettsäuremonoglycerid, Palmitinsäuremonoglycerid, Stearinsäure- monoglycerid, Isostearinsäuremonoglycerid, Ölsäuremonoglycerid, konjugierte Linolsäure- monoglyceride und Talgfettsäuremonoglycerid sowie deren Addukte mit 5 bis 50 und vorzugsweise 20 bis 30 Mol Ethylenoxid. Vorzugsweise werden Monoglyceride bzw. technische Mono/Diglyceridgemische mit überwiegendem Monoglyceridanteil der Formel (IV) eingesetzt, in der COR⁵ für einen linearen Acylrest mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen steht.in which COR ^{5 is} a linear or branched acyl radical having 12 to 22 carbon atoms and x, y and z are in total 0 or numbers of 1 to 50, preferably 15 to 35. Typical examples of suitable for the purposes of the invention partial glycerides are lauric acid monoglyceride, Kokosfettsäuremonoglycerid, Palmitinsäuremonoglycerid, stearic acid monoglyceride, Isostearinsäuremonoglycerid, Ölsäuremonoglycerid, conjugated Linolsäure- monoglycerides and Talgfettsäuremonoglycerid and their adducts with 5 to 50 and preferably 20 to 30 moles of ethylene oxide. Preferably monoglycerides or technical mono / Diglyceridgemische are used with predominantly Monoglyceridanteil of formula (IV), in which COR ^{5 is} a linear acyl radical having 16 to 18 carbon atoms.

Üblicherweise werden Emulgatormischungen eingesetzt, die die Komponenten (A) und (B) im Gewichtsverhältnis 10 : 90 bis 90 : 10, vorzugsweise 25 : 75 bis 75 : 25 und insbesondere 40 : 60 bis 60 : 40 enthalten.Usually, emulsifier mixtures are used which contain the components (A) and (B) in a weight ratio of 10:90 to 90:10, preferably 25:75 to 75:25 and especially 40:60 to 60:40.

Als weitere geeignete Emulgatoren kommen beispielsweise nichtionogene Tenside aus einer der folgenden Gruppen in Frage:Suitable further emulsifiers are, for example, nonionic surfactants from one of the following groups:

• Anlagerungsprodukte von 2 bis 30 Mol Ethylenoxid vorzugsweise 4 bis 10 Mol Ethylenoxid und/ oder 0 bis 5 Mol Propylenoxid an lineare Fettalkohole mit 8 bis 22 C- Atomen;Addition products of 2 to 30 moles of ethylene oxide, preferably 4 to 10 moles of ethylene oxide and / or 0 to 5 moles of propylene oxide, to linear fatty alcohols having 8 to 22 carbon atoms;

• Glycerinmono- und -diester und Sorbitanmono- und -diester von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen und deren Ethylenoxidanlage- rungsprodukte mit 1 bis 30 Mol Ethylenoxid;Glycerol mono- and diesters and sorbitan mono- and diesters of saturated and unsaturated fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and their ethylene oxide investment products with 1 to 30 moles of ethylene oxide;

• Alkylmono- und -oligoglycoside mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alkylrest und deren ethoxylierte Analoga;• alkyl mono- and oligoglycosides having 8 to 22 carbon atoms in the alkyl radical and their ethoxylated analogs;

• Anlagerungsprodukte von 15 bis 60 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl; • Polyol- und insbesondere Polyglycerinester wie z.B. Polyglycerinpolyricinoleat oderAdducts of 15 to 60 moles of ethylene oxide with castor oil and / or hydrogenated castor oil; Polyol and in particular polyglycerol esters such as e.g. Polyglycerol polyricinoleate or

Polyglycerinpoly-12-hydroxystearat. Ebenfalls geeignet sind Gemische von Verbindungen aus mehreren dieser Substanzklassen;Polyglycerol poly-12-hydroxy. Also suitable are mixtures of compounds of several of these classes of substances;

• Anlagerungsprodukte von 2 bis 15 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl; • Partialester auf Basis linearer, verzweigter, ungesättigter bzw. gesättigter C_12/22~ Fettsäuren, Ricinolsäure sowie 12-Hydroxystearinsäure und Glycerin, Polyglycerin, Pentaerythrit, Dipentaerythrit, Zuckeralkohole (z.B. Sorbit) sowie Polyglucoside (z.B. Cellulose); • Wollwachsalkohole;Addition products of 2 to 15 moles of ethylene oxide with castor oil and / or hydrogenated castor oil; • partial esters based on linear, branched, unsaturated or saturated C _12/2 2-fatty acids, ricinoleic acid and 12-hydroxystearic acid and glycerol, polyglycerol, pentaerythritol, dipentaerythritol, sugar alcohols (eg sorbitol) and polyglucosides (eg cellulose); • wool wax alcohols;

• Polyalkylenglycole.• polyalkylene glycols.

Die Anlagerungsprodukte von Ethylenoxid und/oder von Propylenoxid an Glycerinmono- und -diester sowie Sorbitanmono- und -diester von Fettsäuren oder an Ricinusöl stellen bekannte, im Handel erhältliche Produkte dar. Es handelt sich dabei um Homologengemische, deren mittlerer Alkoxylierungsgrad dem Verhältnis der Stoffmengen von Ethylenoxid und/oder Propylenoxid und Substrat, mit denen die Anlagerungsreaktion durchgeführt wird, entspricht.The addition products of ethylene oxide and / or of propylene oxide to glycerol mono- and diesters and sorbitan mono- and diesters of fatty acids or castor oil are known, commercially available products. These are homolog mixtures whose average degree of alkoxylation corresponds to the ratio of the amounts of Ethylene oxide and / or propylene oxide and substrate, with which the addition reaction is carried out corresponds.

Zur Auswahl geeigneter Emulgatorsysteme kann es zweckmäßig sein, rechnerisch die Ermitt- lung der PIT des jeweiligen Systems durchzuführen. Insbesondere gilt das aber auch für potentielle Optimierungen in der Auswahl der Emulgatoren beziehungsweise Emulgatorsysteme und ihrer Anpassung an die durch sonstige Überlegungen zum technischen Handeln vorgegebene Auswahl und Abmischung von wäßriger Phase einerseits und Typ der Ölphase andererseits. Entsprechendes Fachwissen ist aus an sich ganz anderen Bereichen, insbesondere aus dem Bereich der Kosmetika-Herstellung, entwickelt worden. Verwiesen wird insbesondere auf die Veröffentlichung TH.Förster, W. von Rybinski, H.Tesmann und A.Wadle "Calculation of optimum emulsißer mixtures for phase Inversion emulsification" , in International Journal of Cosmetic Science 16, 84-92 (1994). Dargestellt ist hier im einzelnen wie auf rechnerischem Weg für vorgegebene 3 -Komponenten-Systeme aus einer Ölphase, einer Wasserphase und einem Emulgator auf der Basis des für die Ölphase charakteristischen EACN- Wertes (equiva- lent alkane carbon number) der Temperaturbereich der Phaseninversion (PIT) über die CAPICO-Methode (calculation of phase inversion in concentrates) errechnet werden kann. Diese Veröffentlichung Förster et al. bezieht insbesondere wiederum wesentliche Literatur für den hier angeschnittenen Themenkomplex ein, die im Zusammenhang mit der Offenbarung dieser Veröffentlichung Förster et al. zu sehen ist. Im einzelnen wird dann anhand zahlreicher Beispiele dargestellt, wie mittels der CAPICO-Methode im Rahmen des EACN-Konzepts die Auswahl und Optimierung der Emulgatoren/Emulgatorsysteme zur optimalen Einstellung vorgegebener Werte für den Temperaturbereich der Phaseninversion zugänglich wird. Die erfindungsgemäß verwendeten PIT-Emulsionen enthalten vorzugsweise von 20 bis 90 Gew.-% Wasser, insbesondere von 30 bis 80 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 30 bis 60 Gew.-%. Der Rest auf 100 Gew.-% entfallt auf die Ölphase sowie Emulgatoren und ggf. weitere Hilfs- und Zusatzstoffe. Die Ölphase selbst ist vorzugsweise in Mengen von 10 bis 80 Gew.-%, insbesondere von 40 bis 70 Gew.-% enthalten. Dabei enthält die Ölphase vorzugsweise ausschließlich die Komponenten a) oder b) bzw. Mischungen dieser Komponenten. Die Emulgatoren, bzw. Emulgatorensysteme sind vorzugsweise in Mengen von 1 bis 25 Gew.-%, insbesondere in Mengen von 5 bis 20 und besonders bevorzugt in Mengen von 5 bis 15 Gew.-% enthalten. Die erfindungsgemäß verwendeten Emulsionen weisen vorzugswei- se Phaseninversionstemperaturen im Bereich von 20 bis 95 °C und insbesondere von 30 bis 95 ⁰C auf.In order to select suitable emulsifier systems, it may be expedient to perform the computation of the PIT of the respective system. In particular, however, this also applies to potential optimizations in the selection of emulsifiers or emulsifier systems and their adaptation to the selection and mixing of aqueous phase, on the one hand, and the type of oil phase, on the other hand, prescribed by other considerations of technical practice. Corresponding expertise has been developed from quite different areas, especially in the field of cosmetics production. Reference is made in particular to the publication TH.Förster, W. von Rybinski, H.Tesmann and A.Wadle "Calculation of optimal emulsifier mixtures for phase inversion emulsification", in International Journal of Cosmetic Science 16, 84-92 (1994). The temperature range of the phase inversion (PIT.) Is shown here in detail as well as mathematically for given 3-component systems from an oil phase, a water phase and an emulsifier on the basis of the characteristic EACN value (equiva- lent alkane carbon number) ) can be calculated using the CAPICO method (calculation of phase inversion in concentrates). This publication Förster et al. again, in particular, addresses essential literature for the subject matter presented here which, in connection with the disclosure of this publication Förster et al. you can see. In detail, it will then be illustrated by means of numerous examples how the selection and optimization of the emulsifier / emulsifier systems for the optimal setting of predefined values for the temperature range of the phase inversion can be made accessible by means of the CAPICO method within the framework of the EACN concept. The PIT emulsions used according to the invention preferably contain from 20 to 90% by weight of water, in particular from 30 to 80% by weight and very particularly preferably from 30 to 60% by weight. The rest to 100 wt .-% attributable to the oil phase and emulsifiers and optionally other auxiliaries and additives. The oil phase itself is preferably contained in amounts of from 10 to 80% by weight, in particular from 40 to 70% by weight. The oil phase preferably contains exclusively the components a) or b) or mixtures of these components. The emulsifiers or emulsifier systems are preferably present in amounts of from 1 to 25% by weight, in particular in amounts of from 5 to 20 and particularly preferably in amounts of from 5 to 15% by weight. The emulsions used in the invention have vorzugswei- se to phase inversion temperatures in the range of 20 to 95 ° C and especially from 30 to 95 ⁰ C.

Die erfindungsgemäß verwendeten Emulsionen werden entsprechend den Eigenschaften der Edukte durch die richtige Auswahl und Zusammensetzung an Ölkomponente und Emulgatoren entwickelt. Bevorzugt ist dass Emulsionen verwendet werden, die Fettsäurealkylester oder Fettalkohol- ether und ein Emulgatorgemisch auf Basis ethoxylierter Hydroxyfettsäuretriglyceride enthalten.The emulsions used according to the invention are developed according to the properties of the educts by the correct selection and composition of oil component and emulsifiers. Preference is given to using emulsions which comprise fatty acid alkyl esters or fatty alcohol ethers and an emulsifier mixture based on ethoxylated hydroxyfatty acid triglycerides.

Unter den erfindungsgemäß verwendeten Biokatalysatoren sind im Sinne der Erfindung En- zyme oder ganze Zellen oder Zellteile zu verstehen. Sie sind in der Lage, an Grenzflächen katalytisch zu reagieren. Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind die Biokatalysatoren als isolierte Enzyme.According to the invention, the biocatalysts used according to the invention are enzymes or whole cells or cell parts. They are able to react catalytically at interfaces. For the purposes of the invention, the biocatalysts are preferred as isolated enzymes.

Vorzugsweise werden Enzyme aus der Gruppe der Lyasen und/oder Oxidoreduktasen eingesetzt die entweder allein oder in Kombination mit mehreren Enzymen eingesetzt werden kön- nen.Preferably, enzymes from the group of lyases and / or oxidoreductases are used which can be used either alone or in combination with a plurality of enzymes.

Lyasen sind in der IUBMB-Klassifikation Vertreter der 4. Hauptgruppe der Enzyme. Man unterscheidet 4 wichtige Subklassen (C-C, C-O, C-N₃ C-S-Lyasen, EC 4.1 bis 4.4). Lyasen spalten nichthydrolytisch bestimmte Gruppen von ihrem Substrat ab oder fügen diese an, und zwar unter Zurücklassung einer Doppelbindung oder Addition von Gruppen an Doppelbin- düngen.Lyases are in the IUBMB classification representatives of the 4th main group of enzymes. There are four important subclasses (CC, CO, CN ₃ CS lyases, EC 4.1 to 4.4). Lyases non-hydrolytically cleave or add certain groups from their substrate, leaving a double bond or adding groups to double bonds.

Die Oxidoreduktasen stellen die erste der 6 Hauptgruppen der Enzyme dar, sie katalysieren Redόx-Reaktionen. Die Untergruppe richtet sich meist nach der Art des Elektronendonors und ist in Untergruppen wiederum nach der Art des Elektronenakzeptors unterteilt. Die systematischen Benennungen werden nach dem Muster: DonoriÄkzeptor-Oxidoreduktase gebildet. Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind Lyasen ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird von Hydroxynitrilasen, Nitrilasen, Nitril-Hydratasen, Oxynitrilasen, Carboxylasen und Aldolasen. Die Oxidoreduktasen sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe die gebildet wird von Dehydrogenase, Hydroxylase, Laccase, Lipoxygenase, Reduktase, Oxidase, Peroxidase und Oxygenase.The oxidoreductases are the first of the 6 main groups of enzymes that catalyze Redόx reactions. The subgroup depends mostly on the type of electron donor and is divided into subgroups again according to the type of electron acceptor. The systematic names are formed according to the pattern: DonoriAcceptor oxidoreductase. Preferred in the context of the invention are lyases selected from the group formed by hydroxynitrilases, nitrilases, nitrile hydratases, oxynitrilases, carboxylases and aldolases. The oxidoreductases are preferably selected from the group formed by dehydrogenase, hydroxylase, laccase, lipoxygenase, reductase, oxidase, peroxidase and oxygenase.

Besonders bevorzugt als Enzyme im Sinne der Biokatalysatoren sind Hydroxynitril-Lyasen.Particularly preferred as enzymes in the sense of biocatalysts are hydroxynitrile lyases.

Typische Beispiele für geeignete Enzyme, die jedoch nicht einschränkend sein sollen, sind Lyasen und/oder Oxidoreduktasen von Organismen die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Alcaligenes, Aspergillus, Aeromonas aerophila, Bacillus, Candida Chro- mobacterium viscosum, Fusarium solani, Geotrichum candidum, Hevea. Issatchenkia orien- talis (Candida krusei), Kluyveromyces marxianus (C. kefyr, C. pseudotropicalis), Linum, Manihot. Mucor javanicus, Nocardia, Penicilium camenberti, Penicilium roqueforti, Pichia, Pseudomonas, Pseudomonas, Prunus, Rhizomucor, Rhizopus, Sorghum und Thermomyces sowie deren Gemischen.. Bevorzugt sind Lyasen und/oder Oxidoreduktasen aus den Organismen Alcaligenes, Candida, Chromobacterium, Nocardia. Rhizomucor, Prunus, Linum, Sorghum, Hevea Manihot, Pseudomonas, Rhizopus und Thermomyces. Besonders bevorzugt sind Enzyme aus Prunus amygdalus, Prunus serotina, Prunus domestica, Prunus avium, Prunus persica, Malus pumila, Linum usitatissimum, Sorghum bicolor, Hevea brasiliensis und Mani- hot esculenta.Typical examples of suitable enzymes, but not by way of limitation, are lyases and / or oxidoreductases of organisms selected from the group formed by Alcaligenes, Aspergillus, Aeromonas aerophila, Bacillus, Candida Chromobacterium viscosum, Fusarium solani, Geotrichum candidum, Hevea. Issatchenkia orientalis (Candida krusei), Kluyveromyces marxianus (C. kefyr, C.pseudotropicalis), Linum, Manihot. Mucor javanicus, Nocardia, Penicilium camenberti, Penicilium roqueforti, Pichia, Pseudomonas, Pseudomonas, Prunus, Rhizomucor, Rhizopus, Sorghum and Thermomyces and mixtures thereof. Preferred are lyases and / or oxidoreductases from the organisms Alcaligenes, Candida, Chromobacterium, Nocardia. Rhizomucor, Prunus, Linum, Sorghum, Hevea Manihot, Pseudomonas, Rhizopus and Thermomyces. Particularly preferred are enzymes from Prunus amygdalus, Prunus serotina, Prunus domestica, Prunus avium, Prunus persica, Malus pumila, Linum usitatissimum, Sorghum bicolor, Hevea brasiliensis and Manioc esculenta.

Bevorzugt sind jeweils die enantioselektiven Enzyme. Besonders bevorzugt ist (S)-selektive Hydroxynitrilase aus Blättern von Hevea brasiliensis und die (R)-selektive Hydroxynitrilase aus Prunus amygdalus. hi einer bevorzugten Ausführungsform sind die Lyasen pflanzlicher Herkunft. Dabei können sie aus sämtlichen Bestandteilen der Pflanzen, bevorzugt sowohl aus den Blättern, dem Stamm oder Stengel, als auch der Frucht isoliert werden. Die Oxidoreduktasen sind bevorzugt aus mikrobieller Herkunft.Preference is given in each case to the enantioselective enzymes. Particularly preferred is (S) -selective hydroxynitrilase from leaves of Hevea brasiliensis and the (R) -selective hydroxynitrilase from Prunus amygdalus. In a preferred embodiment, the lyases are of plant origin. They can be isolated from all components of the plants, preferably both from the leaves, the stem or stalk, as well as the fruit. The oxidoreductases are preferably of microbial origin.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Enzyme können in unterschiedlichen Formen eingesetzt werden. Prinzipiell sind alle dem Fachmann gebräuchlichen Darreichungsformen von Enzymen anwendbar. Unter die Definition „Enzym" fallen erfindungsgemäß auch die Begriffe Protein und Enzym-Protein. Erfindungsgemäß ist sowohl das Enzymprotein als auch das Gesamtprotein welches in einem Teil der Proteinsequenz die Funktion des erfindungsgemäßen Proteins beinhaltet anzuwenden. Vorzugsweise werden die Enzyme in reiner Form oder als techni- sches Enzympräparat entweder immobilisiert auf Trägermaterial und/oder in Lösung, insbesondere in wässriger Lösung eingesetzt und in sogenannten "repeated batches" wiederverwendet. Ebenfalls bevorzugt sind kristallisierte Enzyme, sogenannte CLECs, beispielweise zu W 2The enzymes to be used according to the invention can be used in various forms. In principle, all dosage forms of enzymes customary to the person skilled in the art can be used. According to the invention, the term "enzyme" also includes the terms protein and enzyme protein According to the invention, both the enzyme protein and the total protein which comprises the function of the protein according to the invention in a part of the protein sequence are preferably used The enzyme preparation used is either immobilized on a carrier material and / or in solution, in particular in aqueous solution, and reused in so-called "repeated batches." Also preferred are crystallized enzymes, so-called CLECs, for example W 2

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beziehen von der Firma Altus. Der Anteil an aktivem Enzym in den jeweiligen technischen Enzympräparaten variiert von Hersteller zu Hersteller. Der Anteil liegt jedoch im Mittel zwischen 1 und 10 % aktivem Enzym.obtained from the company Altus. The proportion of active enzyme in the respective technical enzyme preparations varies from manufacturer to manufacturer. The proportion is, however, on average between 1 and 10% active enzyme.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Enzyme werden in einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung eingesetzt mit einer Aktivität von 20 - 5000 U/ml wässrige Phase, berechnet als reines Enzym oder als Enzympräparat, hu Besonderen liegen die einzusetzenden Aktivitäten bei 30 - 3000 U/ml wässriger Phase. Im Sinne der Erfindung handelt es sich bei den biokatalytischen Reaktionen bevorzugt um C- C- Verknüpfungen, C-N Verknüpfung, C-O Verknüpfung oder C-S Verknüpfung. Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind enantioselektive Reaktionen, die zu chiralen Verbindungen führen mit einer enantiomeren Reinheit von 98-99 ee. Die chiralen Verbindungen lassen sich erhalten durch die Verwendung von enantioselektiven Enzymen. Die Herstellung chiraler Verbindungen ist im Sinne der Erfindung bevorzugt.The enzymes to be used according to the invention are used in a further embodiment of the invention having an activity of 20-5000 U / ml aqueous phase, calculated as pure enzyme or as an enzyme preparation, in particular the activities to be employed are 30-3000 U / ml aqueous phase. For the purposes of the invention, the biocatalytic reactions are preferably C-C linkages, C-N linkage, C-O linkage or C-S linkage. Preferred within the meaning of the invention are enantioselective reactions which lead to chiral compounds with an enantiomeric purity of 98-99 ee. The chiral compounds can be obtained by the use of enantioselective enzymes. The preparation of chiral compounds is preferred for the purposes of the invention.

Im Sinne der Erfindung werden durch die biokatalytischen Reaktionen unter Verwendung der erfindungsgemäßen PIT-Emulsion Feinchemikalien als Zwischenprodukte für kosmetische und/oder pharmazeutische Produkte und/oder als Zwischenprodukte für die Anwendung in Agro-Bereichen hergestellt. Im Besonderen handelt es sich bei den Feinchemikalien um Cy- anhydrine, insbesondere um enantiomerenreine Cyanhydrine. Die Herstellung von enantiome- renreinen Cyanhydrinen sowohl in der (S)- als auch in (R)-Konfϊguration eröffnet vielfaltige Möglichkeiten für stereoselektive Folgereaktion wie beispielsweise die Hydrolyse zu chiralen Hydroxysäuren.For the purposes of the invention, the biocatalytic reactions using the PIT emulsion according to the invention produce fine chemicals as intermediates for cosmetic and / or pharmaceutical products and / or as intermediates for use in agro-areas. In particular, the fine chemicals are cyanhydrins, in particular enantiomerically pure cyanohydrins. The preparation of enantiomerically pure cyanohydrins in both the (S) and (R) configurations opens up many possibilities for stereoselective sequential reactions such as hydrolysis to chiral hydroxy acids.

Die erfindungsgemäßen O/W-Emulsionen, enthaltend mindesten Wasser, Emulgatoren sowie eine Ölphase und hergestellt nach dem PIT- Verfahren eignen sich hervorragend für die Verwendung als Reaktionsmedium für biokatalytische Reaktionen. Hieraus lässt sich direkt ein weiterer Gegenstand der Erfindung ableiten. Es handelt sich um ein Verfahren zur biokatalytischen C-C- Verknüpfungen, C-N Verknüpfung, C-O Verknüpfung oder C-S Verknüpfung, bei dem O/W-Emulsionen als Reaktionsmedium eingesetzt werden, die nach dem PIT- Verfahren hergestellt werden. Die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Emulsionen entsprechen in ihren Bestandteilen, Bedingungen und näheren Ausführungsformen den Emulsionen, die bereits für die Verwendung dieser O/W-Emulsionen näher beschrieben wurden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt Feinchemikalien als Zwischenprodukte für kosmetische und/oder pharmazeutische Produkte und/oder als Zwischenprodukte für die Anwendung in Agro-Bereichen hergestellt. Ln Besonderen werden Cyanhydrine hergestellt. Bei diesem Verfahren kann man es sich zu nutze mache, dass die nicht wasserlöslichen Substrate, in der Ölphase der PIT-Emulsion löslich werden und so der biokatalytischen Reaktion zugänglich sind.The O / W emulsions according to the invention containing at least water, emulsifiers and an oil phase and prepared by the PIT process are outstandingly suitable for use as reaction medium for biocatalytic reactions. From this, a further object of the invention can be derived directly. It is a process for biocatalytic C [BOND] C bonds, CN linking, CO linking or CS linking, in which O / W emulsions are used as the reaction medium, which are prepared by the PIT process. The emulsions used for the process according to the invention correspond in their constituents, conditions and further embodiments to the emulsions which have already been described in detail for the use of these O / W emulsions. The process according to the invention preferably produces fine chemicals as intermediates for cosmetic and / or pharmaceutical products and / or as intermediates for use in agro-areas. In particular, cyanohydrins are produced. In this process, one can take advantage of the fact that the non-water-soluble substrates become soluble in the oil phase of the PIT emulsion and are thus accessible to the biocatalytic reaction.

Die PIT-Emulsionen enthaltend das Substrat werden erfindungsgemäß dem Reaktionsgefäß welches die Biokatalysatoren immobilisiert oder nicht immobilisiert sowie ggf. weitere Hilfsund Zusatzstoffe enthält, zudosiert. Die Einzelheiten dieses Verfahrens, insbesondere die Menge an Biokatalysator und der zudosierten Emulsion, ergeben sich aus der Art der Biokatalysator und der gewählten PIT-Emulsion und können vom Fachmann an die spezifischen Gegebenheiten angepasst werden. Durch Erhitzen des Systems kann eine Phasentrennung er- reicht werden und das Produkt in der Ölphase in einfacher Weise von der wässrigen Phase getrennt werden. Durch die Verwendung von Festbettreaktoren enthaltend das Enzym ist eine Abtrennung und Wiederverwendung des Enzyms gegeben.According to the invention, the PIT emulsions comprising the substrate are added to the reaction vessel which immobilizes or does not immobilize the biocatalysts and optionally contains further auxiliaries and additives. The details of this process, in particular the amount of biocatalyst and the metered emulsion, arise from the nature of the biocatalyst and the selected PIT emulsion and can be adapted by the skilled person to the specific circumstances. By heating the system, a phase separation can be achieved and the product in the oil phase can be easily separated from the aqueous phase. By using fixed bed reactors containing the enzyme, separation and reuse of the enzyme is provided.

Die Feinteiligkeit der Öltröpfchen führt zu einer großen Oberfläche zwischen Öl- und Wasserphase und ermöglicht so einen schnellen Kontakt und eine erhöhte Reaktionsrate zwischen den Biokatalysatoren und der die Substrate enthaltenden Ölphase.The fineness of the oil droplets results in a large surface area between the oil and water phases, allowing for rapid contact and reaction rate between the biocatalysts and the oil phase containing the substrates.

hl einer besonderen Ausfuhrungsform dieses Verfahrens werden Enzyme eingesetzt, die bereits für die Verwendung der erfindungsgemäßen O/W-Emulsion aufgelistet wurden. Die erfindungsgemäßen Reaktionsbedingungen der biokatalytischen Reaktion richten sich nach dem optimalen Reaktionsbereich der ausgewählten Enzyme und nach den verwendeten Emulsionen. Im Besonderen handelt es sich um Bedingungen bei denen unter anderem die Reaktionstemperatur zwischen 4 und 50 °C, bevorzugt eine Temperatur zwischen 15 und 40 °C, insbesondere eine Temperatur von 20 °C gewählt wird.In a particular embodiment of this process, enzymes are used which have already been listed for the use of the O / W emulsion according to the invention. The reaction conditions of the biocatalytic reaction according to the invention depend on the optimum reaction range of the selected enzymes and on the emulsions used. In particular, these are conditions in which, inter alia, the reaction temperature between 4 and 50 ° C, preferably a temperature between 15 and 40 ° C, in particular a temperature of 20 ° C is selected.

Sollten unerwünschte Nebenreaktion ablaufen, die nicht durch den Biokatalysator bedingt sind, kann die Temperatur zur Reduzierung der Nebenreaktionen auf Temperaturen zwischen 0° und 20°C reduziert werden. In diesen Fällen wird eine Temperatur zwischen 3°C bis 15° C bevorzugt. If unwanted side reactions occur that are not due to the biocatalyst, the temperature can be reduced to temperatures between 0 ° and 20 ° C to reduce side reactions. In these cases, a temperature between 3 ° C to 15 ° C is preferred.

BeispieleExamples

Herstellbeispiel HlProduction Example Hl

Enzyme und Chemikalien R-Oxynitrilase (EC 4.1.2.10, R-mandelonitril Lyase, R-Aceton-cyanhydrine Lyase) aus Pru- nus amygdalus (38 U/ml-Lösung FLUKA);Enzymes and chemicals R-oxynitrilase (EC 4.1.2.10, R-mandelonitrile lyase, R-acetone-cyanohydrine lyase) from Prusius amygdalus (38 U / ml solution FLUKA);

R-(+)-Madelonitril (>99% Aldrich); Benzaldehyd (>99 %, redestilliert, Aldrich); KCN (analytischer Grad, FLUKA) Natriumphosphat (Prolabo); Eumulgin HRE 40 (von Cognis); Methyl oleat (von Cognis); Cetiol OE (CETIOL® OE₁ INCI: Dicaprylyl Ether von Cognis); Ultrareines Wasser (Milipore MiIIiQ+); Ethanol (Carlo Erba).R - (+) - Madelonitrile (> 99% Aldrich); Benzaldehyde (> 99%, redistilled, Aldrich); KCN (analytical grade, FLUKA) sodium phosphate (prolabo); Eumulgin HRE 40 (from Cognis); Methyl oleate (ex Cognis); Cetiol OE (CETIOL® OE ₁ INCI: dicaprylyl ether from Cognis); Ultra-pure water (Milipore MiIIiQ +); Ethanol (Carlo Erba).

PIT Emulsionen:PIT emulsions:

Zwei PIT-Emulsionen wurden hergestellt. Eine beinhaltet Benzaldehyd aufgelöst in Methylo- leat, die andere beinhaltet Benzaldehyd aufgelöst in Cetiol OE. Die endgültige Zusammenset- zung war: 0,5 g Methyloleat oder Cetiol OE / 0,5 g Eumulgin HRE 40 / 0,4 ml Benzaldehyd / 1,4 ml Wasser. Die PIT-Emulsion wurde weiterhin verdünnt durch Zugabe von 1 ml Wasser. Beide Emulsionen bleiben bei 4° C für Wochen stabil. Für jedes Experiment wurden frische Emulsionen präpariert um den Abbau von Benzaldehyd zu vermeiden.Two PIT emulsions were prepared. One contains benzaldehyde dissolved in methyloleate, the other contains benzaldehyde dissolved in cetiol OE. The final composition was: 0.5 g methyloleate or cetiol OE / 0.5 g eumulgin HRE 40 / 0.4 ml benzaldehyde / 1.4 ml water. The PIT emulsion was further diluted by adding 1 ml of water. Both emulsions remain stable at 4 ° C for weeks. For each experiment, fresh emulsions were prepared to avoid the degradation of benzaldehyde.

Reaktion:Reaction:

Das Reaktionsmedium wurde gebildet durch: 1,2 ml Phosphatpuffer (pH 5,7, 50 mM); 0,4 ml Cyanidlösung, (5 g KCN in 10 ml Wasser); 0,2 ml PIT-Emulsion; 0,2 ml (7.6 U) Enzyme oder 0,2 ml Puffer. Die Reaktionen wurden durchgeführt in geschlossenen (Teflonschicht) 4 ml Wheaton-Fläschen ohne Rühren mit Ausnahme der Stichprobe.The reaction medium was formed by: 1.2 ml of phosphate buffer (pH 5.7, 50 mM); 0.4 ml cyanide solution, (5 g KCN in 10 ml water); 0.2 ml PIT emulsion; 0.2 ml (7.6 U) of enzymes or 0.2 ml of buffer. The reactions were carried out in closed (Teflon layer) 4 ml Wheaton vials without stirring except for the random sample.

Nach verschiedenen Reaktionszeiten, wurden 10 μl Proben von jedem Reaktionsmedium genommen und zu 1,5 ml Ethanol in Microtubes hinzugefügt. Die Tubes wurden für zwei Minuten zentrifugiert bei 10.000 x g um die Proteinablagerungen vom Medium mit Enzymen abzu- trennen. Das Absorptionsvermögen des Überstandes bei 283 nm wurde paarweise in Quartz- küvetten in einem Beckman DU 530 Spektrophotometer gemessen.After different reaction times, 10 μl of samples were taken from each reaction medium and added to 1.5 ml of ethanol in microtubes. The tubes were centrifuged for 2 minutes at 10,000 xg to remove the protein deposits from the medium with enzymes. separate. The absorbance of the supernatant at 283 nm was measured in pairs in quartz cuvettes in a Beckman DU 530 spectrophotometer.

Ergebnisse und Diskussionen: Zur Festlegung der Reaktionskinetik wurde eine spektrophotometrische Methode basierend auf einem spezifischen Absorptionsmaximum von Benzaldehyd bei 283 nm genutzt. Das Absorptionsspektrum in Ethanol von Benzaldehyd und dem Reaktionsprodukt Mandelonitril (20- mal höher konzentriert) wurde bestimmt. Der Extinktionskoeffizient bei 283 nm von Benzaldehyd in Ethanol wurde ermittelt bei 1130 m-¹ cm-¹.Results and Discussion: To determine the reaction kinetics, a spectrophotometric method based on a specific absorption maximum of benzaldehyde at 283 nm was used. The absorption spectrum in ethanol of benzaldehyde and the reaction product mandelonitrile (20 times higher concentrated) was determined. The extinction coefficient at 283 nm of benzaldehyde in ethanol was determined to be 1130 m ^-1 cm ^-1 .

Zwei unabhängige Serien von Experimenten wurden durchgeführt. Jede Serie verglich Reaktionen mit und ohne Enzyme für PIT-Systeme, enthaltend Eumulgin HRE 40, Benzaldehyd und entweder Methyloleate oder Cetiol OE. Reaktionen der ersten Serie wurden 2 Stunden bei 20°C, dann bei 4°C durchgeführt. Die zweite Serie wurde die ganze Zeit über bei 4⁰C inku- biert. Die sehr niedrige Reaktionstemperatur (4⁰C) wurde gewählt um die unkatalysierten Reaktionen zu limitieren. Ohne Cyanide wurde keine Reaktion beobachtet. Es ist zu bemerken, dass sich eine gelb-orange Farbe in den Tubes enthaltend Cyanide entwickelt (mit oder ohne Enzyme), auch wenn Citratpuffer gegen Phosphatpuffer ausgewechselt wurde. Diese Farbe korrespondiert vermutlich zur Absorptionsspitze mit einem Maximum von 385. Die Färbung war mit Phosphatpuffer geringer als mit Citratpuffer. Experimente zeigten, dass diese Farben sich auch ohne PIT-Emulsionen und auch ohne Enzyme entwickeln, welches eine chemische Reaktion mit den Verunreinigungen der Pufferzusammensetzungen zeigen könnte.Two independent series of experiments were performed. Each series compared reactions with and without enzymes for PIT systems containing Eumulgin HRE 40, benzaldehyde and either methyloleate or cetiol OE. Reactions of the first series were carried out at 20 ° C for 2 hours, then at 4 ° C. The second series was biert all the time at 4 ⁰ C incubators. The very low reaction temperature (4 ⁰ C) was chosen to limit the uncatalyzed reactions. Without cyanide, no reaction was observed. It should be noted that a yellow-orange color develops in the tubes containing cyanides (with or without enzymes), even if citrate buffer has been replaced with phosphate buffer. This color probably corresponds to the absorption peak with a maximum of 385. The staining was lower with phosphate buffer than with citrate buffer. Experiments showed that these colors also develop without PIT emulsions and also without enzymes, which could show a chemical reaction with the impurities of the buffer compositions.

Die Kinetik wurde bestimmt für Experimente bei 20° C und anschließend 4⁰C und Experi- mente bei 4°C. Der Unterschied im Absorptionsvermögen bei 283 nm zwischen Reaktions- medium mit und ohne Enzyme wurde bestimmt. Dieser Unterschied deckt sich mit der Absorptionsmaximum von Benzaldehyd. Enzym katalysierte Bioconversionen von Benzaldehyd wurde auf diese Weise beobachtet mit beiden Benzaldehyd/Methyloleaten und Benzalde- hyd/Cetiol PIT-Emulsionen. Die Reaktionsgeschwindigkeit der Benzaldehydumwandlung war 0,30 μmol/ml/h in Gegenwart von Benzaldehyden/Cetiol Systemen bei 4⁰C und 0,14 μmol/ml/h mit Benzaldehyd/Methyloleaten bei 4⁰C. The kinetics were determined for experiments at 20 ° C and then 4 ⁰ C and experiments at 4 ° C. The difference in absorbance at 283 nm between reaction medium with and without enzymes was determined. This difference coincides with the absorption maximum of benzaldehyde. Enzyme-catalyzed bioconversions of benzaldehyde were observed in this way with both benzaldehyde / methyloleates and benzaldehyde / cetiol PIT emulsions. The reaction rate was the Benzaldehydumwandlung 0.30 micromol / ml / h in the presence of benzaldehydes / Cetiol systems at 4 ⁰ C and 0.14 micromol / ml / h with benzaldehyde / methyloleates at 4 ⁰ C.

Die Reaktionen laufen bei 20°C um mindestens Faktor 20 schneller ab. Die Daten zeigen, dass eine Enzymumsetzung in PIT Systemen mit einer Lyase möglich ist.The reactions take place at 20 ° C faster by at least 20 times. The data show that enzyme conversion is possible in PIT systems with a lyase.

Weitere Ergebnisse:Further results:

Bei niedrigen Temperaturen und ohne Rühren wurde die gleiche Reaktion mit Lyase aus Hevea brasiliensis durchgeführt. Auch mit dieser Lyase konnte die Reaktion von Benzaldehyd mit Cyanid in einer PIT-Emulsion erfolgreich durchgeführt werden. Benzaldehyd wurde entweder in Methyloleat oder in Cetiol OE gelöst. Die Reaktion in Gegenwart von Benzalde- hyd/Cetiol OE war doppelt so schnell wie die Reaktion in Methyloleat. At low temperatures and without stirring, the same reaction was carried out with lyase from Hevea brasiliensis. Also with this lyase, the reaction of benzaldehyde with cyanide in a PIT emulsion could be successfully carried out. Benzaldehyde was dissolved in either methyl oleate or cetiol OE. The reaction in the presence of benzaldehyde / cetiol OE was twice as fast as the reaction in methyl oleate.

Claims

Patentansprüche claims

1. Verwendung von O/W-Emulsionen als Reaktionsmedium für biokatalytische Reaktionen, enthaltend mindesten Wasser, Emulgatoren sowie eine Ölphase, dadurch gekennzeichnet, dass die Emulsion nach dem PIT- Verfahren hergestellt wird und eine Tröpfchengröße von 50 bis 400 nm aufweist.1. Use of O / W emulsions as reaction medium for biocatalytic reactions, containing at least water, emulsifiers and an oil phase, characterized in that the emulsion is prepared by the PIT method and has a droplet size of 50 to 400 nm.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ölphase Verbindungen enthält, ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird von Mineralölen, Fettsäurealky- lester, Fettalkoholethern, Fettalkoholester, und Fettsäurepolyolesterr2. Use according to claim 1, characterized in that the oil phase contains compounds selected from the group formed by mineral oils, fatty acid alkyl esters, fatty alcohol ethers, fatty alcohol esters, and fatty acid polyol esters

3. Verwendung nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Emulsion hergestellt nach dem PIT- Verfahren eine ausreichende Stabilität während der Reaktionsphase zeigt.3. Use according to claim 1 and / or 2, characterized in that the emulsion prepared by the PIT method shows sufficient stability during the reaction phase.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Emulsio- nen verwendet werden, die Fettsäurealkylester der Formel (I) enthalten4. Use according to any one of claims 1 to 3, characterized in that emulsions are used which contain fatty acid alkyl esters of the formula (I)

R1-COO-R2 (I) wobei Rl für einen Alkylrest mit 6 bis 22 C- Atomen steht und R2 einen Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen bedeutet.R 1 is -COO-R 2 (I) where R 1 is an alkyl radical having 6 to 22 C atoms and R 2 is an alkyl radical having 1 to 4 C atoms.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Emulsio- nen verwendet werden, die die Ölphase in Mengen von 10 bis 80 Gew.-%, vorzugsweise5. Use according to any one of claims 1 to 4, characterized in that emulsions are used which NEN the oil phase in amounts of 10 to 80 wt .-%, preferably

20 bis 50 Gew.-% enthalten.Contain 20 to 50 wt .-%.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Emulsionen verwendet werden, die Wasser in Mengen von 20 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise von 30 bis 80 Gew.-% und insbesondere von 30 bis 70 Gew.-% enthalten.6. Use according to one of claims 1 to 5, characterized in that emulsions are used, the water in amounts of 20 to 90 wt .-%, preferably from 30 to 80 wt .-% and in particular from 30 to 70 wt. % contain.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Emulsionen verwendet werden, die Fettsäurealkylester oder Fettalkoholether und ein Emulgator- gemisch auf Basis ethoxylierter Hydroxyfettsäuretriglyceride enthalten.7. Use according to any one of claims 1 to 6, characterized in that emulsions are used which contain fatty acid alkyl esters or fatty alcohol ethers and an emulsifier mixture based on ethoxylated hydroxy fatty acid triglycerides.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Emulsionen verwendet werden, die ein Emulgatorsystem, enthaltend hydrophile Emulgatoren mit HLB-Werten von 8 bis 18 in Kombination mit hydrophoben Coemulgatoren enthalten. 8. Use according to one of claims 1 to 7, characterized in that emulsions are used which contain an emulsifier system comprising hydrophilic emulsifiers having HLB values of 8 to 18 in combination with hydrophobic coemulsifiers.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Emulsionen verwendet werden, deren Emulgatorsysteme Mengenverhältnisse zwischen hydrophilen Emulgatoren und Coemulgatoren von 10 : 90 bis 90 : 10 aufweisen.9. Use according to any one of claims 1 to 8, characterized in that emulsions are used whose emulsifier systems have ratios between hydrophilic emulsifiers and coemulsifiers of 10:90 to 90:10.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Emulsio- nen verwendet werden, die Emulgatoren in Mengen von 1 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise in Mengen von 5 bis 20 Gew.-% und insbesondere in Mengen von 5 bis 15 Gew.-% enthalten.10. Use according to one of claims 1 to 9, characterized in that emulsions nen are used, the emulsifiers in amounts of 1 to 25 wt .-%, preferably in amounts of 5 to 20 wt .-% and in particular in amounts of 5 to 15 wt .-% included.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Enzymen um Lyasen und/oder Oxidoreduktasen handelt.11. Use according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the enzymes are lyases and / or oxidoreductases.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyasen ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Hydroxynitrilasen, Nitrilasen, Nitril-Hydratasen, Oxynitrilasen und Aldolasen und das die Oxidoreduktasen ausgewählt sind aus der Gruppe die gebildet wird von Dehydrogenase, Hydroxylase, Laccase, Lipoxygenase, Reduktase, Oxidase, Peroxidase und Oxygenase.12. Use according to claim 11, characterized in that the lyases are selected from the group consisting of hydroxynitrilases, nitrilases, nitrile hydratases, oxynitrilases and aldolases and that the oxidoreductases are selected from the group formed by dehydrogenase, hydroxylase , Laccase, lipoxygenase, reductase, oxidase, peroxidase and oxygenase.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 und 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Lyasen, und Oxidoreduktasen erhältlich sind aus Organismen die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Alcaligenes, Aspergillus, Aeromonas aerophila, Bacillus, Candida Chromobacterium viscosum, Fusarium solani, Geotrichum candidum, Hevea. Is- satchenkia orientalis (Candida krusei), Kluyveromyces marxianus (C kefyr, C. pseu- dotropicalis), Linum, Manihot. Mucor javanicus, Nocardia, Penicilium camenberti, Peni- cilium roqueforti, Pichia, Pseudomonas, Pseudomonas, Prunus, Rhizomucor, Rhizopus, Sorghum und Thermomyces sowie deren Gemischen.13. Use according to one of claims 11 and 12, characterized in that the lyases, and oxidoreductases are obtainable from organisms selected from the group formed by Alcaligenes, Aspergillus, Aeromonas aerophila, Bacillus, Candida Chromobacterium viscosum, Fusarium solani, Geotrichum candidum, Hevea. Is-satchenkia orientalis (Candida krusei), Kluyveromyces marxianus (C kefyr, C. pseudotropicalis), Linum, Manihot. Mucor javanicus, Nocardia, Penicilium camenberti, Penicilium roqueforti, Pichia, Pseudomonas, Pseudomonas, Prunus, Rhizomucor, Rhizopus, Sorghum and Thermomyces, and mixtures thereof.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyasen pflanzlicher Herkunft sind.14. Use according to any one of claims 11 to 13, characterized in that the lyases are of vegetable origin.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Enzyme eingesetzt werden mit einer Aktivität von 20 - 5000 U/ml wässrige Phase berechnet als reines Enzym oder als Enzympräparat.15. Use according to one of claims 11 to 14, characterized in that the one or more enzymes are used with an activity of 20 - 5000 U / ml aqueous phase calculated as pure enzyme or as an enzyme preparation.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den biokatalytischen Reaktionen um C-C Verknüpfung, C-N Verknüpfung, C-O Verknüp- rung oder C-S Verknüpfung handelt. 16. Use according to one of claims 1 to 15, characterized in that the biocatalytic reactions are CC linkage, CN linkage, CO linkage or CS linkage.

17. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass bei der biokatalytischen Reaktion durch enantioselektive Enzyme chirale Verbindungen hergestellt werden.17. Use according to one of claims 1 to 16, characterized in that in the biocatalytic reaction by enantioselective enzymes chiral compounds are prepared.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass bei der biokatalytischen Reaktion Feinchemikalien als Zwischenprodukte für kosmetische und/oder pharmazeutische Produkte und/oder als Zwischenprodukte für die Anwendung in Agro-bereiche hergestellt werden.18. Use according to one of claims 1 to 17, characterized in that in the biocatalytic reaction fine chemicals are prepared as intermediates for cosmetic and / or pharmaceutical products and / or as intermediates for use in agro-areas.

19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Feinchemikalien um Cyanhydrine, handelt.19. Use according to claim 18, characterized in that the fine chemicals are cyanohydrins.

20. Verfahren zur biokatalytischen C-C Verknüpfung, C-N Verknüpfung, C-O Verknüpfung oder C-S Verknüpfung dadurch gekennzeichnet, dass O/W-Emulsionen als Reaktionsmedium eingesetzt werden nach Anspruch 1 bis 10.20. A method for biocatalytic C-C linkage, C-N linkage, C-O linkage or C-S linkage characterized in that O / W emulsions are used as the reaction medium according to claim 1 to 10.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass bei der biokatalytischen Reaktion Feinchemikalien als Zwischenprodukte für kosmetische und/oder pharmazeutische Produkte und/oder als Zwischenprodukte für die Anwendung in Agro-Bereichen hergestellt werden.21. The method according to claim 20, characterized in that in the biocatalytic reaction fine chemicals are produced as intermediates for cosmetic and / or pharmaceutical products and / or as intermediates for use in agro-areas.

22. Verfahren nach Anspruch 20 und/oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Feinchemikalien um Cyanhydrine, handelt.22. Process according to claim 20 and / or 21, characterized in that the fine chemicals are cyanohydrins.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass Enzyme nach Anspruch 11 bis 14 eingesetzt werden. 23. The method according to any one of claims 20 to 22, characterized in that enzymes are used according to claim 11 to 14.