EP1720982A1 - Technischer prozess sowie anlage zur gewinnung und/oder verkapselung von lebenden zellen aus organen - Google Patents

Technischer prozess sowie anlage zur gewinnung und/oder verkapselung von lebenden zellen aus organen

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Publication number
EP1720982A1
EP1720982A1 EP05715481A EP05715481A EP1720982A1 EP 1720982 A1 EP1720982 A1 EP 1720982A1 EP 05715481 A EP05715481 A EP 05715481A EP 05715481 A EP05715481 A EP 05715481A EP 1720982 A1 EP1720982 A1 EP 1720982A1
Authority
EP
European Patent Office
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cells
suspension
cell
beads
drops
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05715481A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rainer Pommersheim
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CAVIS MICROCAPS GmbH
Original Assignee
CAVIS MICROCAPS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CAVIS MICROCAPS GmbH filed Critical CAVIS MICROCAPS GmbH
Publication of EP1720982A1 publication Critical patent/EP1720982A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/09—Means for pre-treatment of biological substances by enzymatic treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate

Definitions

  • the invention relates to a method and to the corresponding plant for the recovery and / or encapsulation of cells from iebenden 'organs.
  • the body - the "disassembles the cells comprises, in a first step in an enzymatic process in single cells or Zellverb ände.
  • the relevant cells are then isolated from the cell mixture obtained.
  • the cells obtained in this way can then be encapsulated.
  • the invention describes a technical process and a plant that these three. Steps united.
  • liver cells from the meat industry are available in large quantities, the development of a test kit based on isolated liver cells has so far failed because single cells only remain alive for a few hours. By isolating the cells from the liver and encapsulating them. it. It is possible to prepare the cells so that they stay alive for several weeks, which means that they can be used for the first time ⁇ as part of standard test kits for toxicological examinations.
  • Another approach is to treat diseases such as diabetes mellitus with the help of the transplantation of living, encapsulated islet cells.
  • the cells are isolated from the organ and encapsulated so that they are protected against the body's immune system. In this way, foreign cells can be transplanted. If you encapsulate e.g. Pig islet cells and injected them into a diabetic patient, so. the cells would not only produce the necessary insulin, but also regulate blood sugar. A number of such attempts have been described in the literature.
  • US Pat. No. 5,079,160 describes a method for obtaining living cells from mammalian organs. This is done in such a way that in a first step the connective tissue of the organ is destroyed by an enzyme, the individual cells being released. The enzyme is inactivated by cooling. The cell suspension is then separated in a density gradient.
  • the patent also describes a laboratory arrangement for this purpose. According to the method shown here and with the laboratory arrangement shown, it is not possible to separate the organs in automated technical processes. No information is given regarding the subsequent encapsulation of the cells. i '
  • the cells or cell groups In order to make the cells or cell groups manageable, it is common practice to subsequently encapsulate them. In order to achieve this, they are mixed in a first step with a liquid, mostly water-soluble base substance, which is then dripped by suitable devices. The droplets formed are cured and include the substance or cells dissolved or suspended in them. This is usually achieved by crosslinking in a precipitation bath or by changing physical parameters. The spheres thus formed, the diameter of which is in the range from a few micrometers to a few millimeters, can then be coated.
  • a membrane capsule which is also suitable for the immobilization of enzymes and proteins, but also living cells.
  • the choice of the shell polymer can reduce the permeability of the membrane so that . also enzymes in the capsule. remain while the much smaller substrates and products can pass through the membrane. So far, however, these capsules can only be produced on a laboratory scale, i.e. in small quantities. There is also no reference to a method for cell production.
  • the object of the invention is to describe a method and the associated installation which for the first time make it possible to extract, separate and encapsulate living cells from an organ in a technical process.
  • the manufacturing process according to the invention is divided into three sections, cell extraction, cell separation and cell encapsulation:
  • the organ from which the cells are obtained is broken down into individual cells in a first. This takes place in an enzymatic process as known in principle from the literature.
  • a second process step the cell suspension obtained in the. separated.
  • the relevant for the further processing cell locations is separated using an antibody label is selected from • the mixture. If encapsulation of the cells obtained is necessary, this can be done in a further process step.
  • the encapsulation is based on the principle that the relevant cells are mixed in a first step with a liquid, mostly water-soluble base substance, from which mechanically stable, coatable particles are obtained by dropletization and hardening.
  • An iviascnine on which such a process is based consists of three modules, one for each process step: cell extraction, cell separation and cell encapsulation.
  • Fig. 1 and Fig. 1a show the basic structure of a plant in which the inventive method was implemented. All components of the machine are manufactured in such a way that the system can be sterilized by autoclaving. The cell is recovered by breaking down the organ into individual cells and / or cell groups. This is done in module ZI.
  • the exact structure and mode of operation of the cell isolation module (ZI) is shown in FIG. 2 and is explained in detail below. After isolation, the cell mixture arrives in the ZT cell separation module.
  • the structure of the module for cell separation ZT is shown schematically in Fig. 3, its operation is described in a subsequent place. Subsequent encapsulation of the relevant cells can be carried out using the ZVK module.
  • the structure of this module is shown in Fig. 4 and its operation is explained in one of the following sections.
  • Fig. 2 shows a schematic representation of the line insulation module (ZI) of the system. It works like this: The body of a newly deceased, eg animal "donor is placed in the reaction chamber RK on the sieve plate F1 (a Kobe pump for example) P2 is then via the metering pump from the reservoir EV, an enzyme solution fed to the organ Such an enzyme can..
  • ZI line insulation module
  • the machine is designed in such a way that the reaction chamber can be removed so that the organ can be placed in the chamber under sterile conditions and that the enzyme solution can be fed directly into a blood vessel of the organ via a supply line if necessary
  • Reaction chamber RK is part of a closed circuit in which a cell nutrient medium flushes it out throughout the cell isolation process, which medium is extracted from the treason tank MV via pump P1 and via valves V2 and V1 in heat exchanger WT1 to approximately 35-38 ° C. heated and passed into the chamber RK.
  • P1 can, for example, a Z ahnradpumpe or another self-priming pump with a removable pump head. The pump head can thus be autolaved together with the rest of the machine.
  • the heat exchanger WT1 is connected to a heating thermostat HT, which determines the temperature in the chamber RK via the temperature sensor TF1 and regulates it to approx. 35 - 38 ° C. At this temperature, the 'enzyme collagenase namely active and decompose the connective tissue of the organ removed so that the individual cells and are released. In order to support this process, a turbulent swirling of the nutrient medium is generated inside the chamber RK by the stirring drive RA. The released cells are captured by the nutrient medium, which flows through the chamber RK and passed via the heat exchanger WT2 into the decanting chamber DK. In this process, the nutrient medium with the cells is cooled to approx.
  • the temperature is controlled by the cooling thermostat
  • the thermostat KT is connected to the temperature sensor TF 2, which continuously detects the temperature in the decanting chamber DK and regulates it to approx. 3 - 8 ° C.
  • the feed tube of the nutrient medium (with cells) is led into the inside of the decanting chamber DK through the filter frit F2.
  • This filter frit consists, for example, of stainless steel and has a porosity that is smaller than the diameter of the cells released from the organ (for example 5 ⁇ m). In this way, the cells are separated from the nutrient medium and collect below the frit. The frit is permeable to the nutrient medium.
  • valve V3 the isolated cells are led out of the decanting chamber as cell suspension ZSR and can be fed to the cell separation module ZT. If the system is to be cleaned, the appropriate flushing solution is drawn in via V2 and pumped through the system. After one run, the flushing solution can be removed from the circuit by opening V1. .
  • the ZSR suspension obtained by cell isolation is a mixture of different cell types.
  • the suspension can be used in this form for some applications.
  • a certain type of cell must be separated from the mixture.
  • Methods for the separation of cell mixtures are described in several places in the literature.
  • separation with magnetically labeled antibodies is becoming increasingly popular. This method uses specific antibodies that contain magnetic particles. These antibodies attach themselves to certain cell types, make them magnetic, which means that they can be separated from the cell mixture in a magnetic field. If all cells are marked except for a certain cell type, this is called negative marking. In the reverse case, in which only a certain cell type is marked, it is a positive marking.
  • the present invention uses the method with specific magnetic antibodies to separate the suspension obtained from module ZI.
  • This The procedural step is technically implemented in the ZT module.
  • the structure of this module is shown schematically in FIG. 3.
  • the raw suspension ZSR from ZI is collected in a container ZS.
  • the magnetically labeled antibody from MP is added.
  • this antibody can produce either a positive or a negative label.
  • a negative marking is assumed in the further description.
  • the cell mixture marked in this way is pumped into the separation chamber TK by the pump P3.
  • P3 is, for example, a peristaltic pump or any other type of pump that is suitable for pumping cell suspensions.
  • the separation chamber has channels through which the suspension is passed. There is a magnet M underneath the chamber. If this magnet is a permanent magnet, the chamber has a mechanism that enables the magnet to be removed (SRT).
  • the magnet is an electromagnet, it has a control (SRT) with the aid of which it can be closed or closed can be switched off.
  • SRT control
  • the labeled cell suspension is exposed to a magnetic field in the chamber, whereby the labeled cells are retained.
  • VT only transports the cells that are relevant for further processing from the liquid.
  • a pure cell suspension ZS2 in cell culture medium is obtained.
  • the marked cells are now transported by the liquid and rinsed out as a cell suspension ZS1 by switching the valve VT.
  • the cells obtained can be used directly as suspension ZS1 or ZS2. With a whole series of cells, however, it is advantageous to encapsulate them in a further step. In this way, the durability of the cells can be increased and their handling can be improved.
  • the cell encapsulation module ZVK of the process is shown schematically. It allows the cells to be encapsulated both in so-called membrane capsules and in membrane-free capsules.
  • the cell suspension ZS2 is suspended or dissolved in a basic vessel solution GL, preferably sodium alginate, in a mixing vessel Ml equipped with a stirring drive RA2.
  • This basic suspension or solution is then conveyed via V8 into the pressure vessel DB and from there via V3 into the encapsulation reactor VR.
  • This can either be done by compressed air as shown in Fig. 3 (regulation via the valve DRV and manometer M), but pumps, screw conveyors etc. can also be used.
  • Beads are then formed from this suspension or solution by dropping with the help of the nozzle head DSK into a precipitation bath. This can be done either by complexing with a polyvalent salt solution such as when using alginate, or by changing physical parameters such as temperature for other raw materials. Depending on the desired size, productivity and size distribution, several methods can be used to drop the liquid. Either nozzles can be used here that have capillaries in which the drop is torn off by an air stream or else those in which the drop is torn off by vibration, electrostatic deflection, etc.
  • the drop of liquid When immersed in the precipitation bath, the drop of liquid becomes a gel and encloses the material to be encapsulated.
  • the required precipitation reagent is available.
  • the precipitation reagent is circulated via a suitable position of the valves V6 and V7 with the help of the pump P4. After the droplets have cured and the particles have hardened, the precipitation reagent is released via valves V6; V7 and V5 pumped back into the container VB1.
  • the reagent If the reagent is used up, it can also be discarded by setting V5 accordingly. Then the valves V4; V6 and V7 a washing solution is pumped into the reactor VR, which means that the beads are washed free of the excess precipitation reagent.
  • the storage containers VB2; VB3 etc. the corresponding coating solutions are pumped into the reactor VR and removed therefrom.
  • the gel particles are coated by their contact with the respective coating solutions.
  • These are dilute aqueous solutions of polymers with anionic or cationic groups such as e.g. Chitosan, polyvinylpyrrolydone, polyethyleneimine, carbocymethylcellulose, alginate, polyacrylic acid etc. which form so-called polyelectrolyte complex layers on the capsule surface.
  • the encapsulated cells are flushed out of the reactor VR as a suspension ZK via the valve AV2.
  • the capsules can then either be incubated, frozen or dried, depending on the later application.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein verfahren und auf die entsprechende Anlage zur Gewinnung und/oder Verkapselung von lebenden Zellen aus Organen. Dabei wird das Organ, das die Zellen enthält in einem ersten Schritt in einem enzymatischen Prozess in Einzelzellen oder Zellverbände zerlegt. Aus dem erhaltenen Zellgemisch werden danach die relevanten Zellen Isoliert. Die so gewonnenen Zellen können anschließend verkapselt werden. Die Erfindung beschreibt einen technischen Prozess und eine Anlage die diese drei Schritte in sich vereint.

Description

Beschreibung Technischer Prozess sowie Anlage zur Gewinnung und/oder Verkapselung von lebenden Zellen aus Organen
Die Erfindung bezieht sich, auf ein Verfahren und auf die entsprechende Anlage zur Gewinnung und/oder Verkapselung von iebenden Zellen aus' Organen. Dabei wird das Organ,- das die Zellen enthält in einem ersten Schritt in einem enzymatischen Prozess in Einzelzellen oder Zellverb'ände zerlegt. Aus dem erhaltenen Zellgemisch werden danach, die relevanten Zellen isoliert. Die so gewonnenen Zellen können anschließend verkapselt werden. Die Erfindung beschreibt einen technischen Prozess und eine Anlage die diese drei. Schritte in sich vereint.
In der Medizin oder Pharmazie aber auch in der technologischen Praxis ist es immer häufiger erforderlich lebende Zellen einzusetzen. Um deren Handhabbarkeit und auch Haltbarkelt zu verbessern werden diese in verkapselter Form verwendet.
So werden beispielsweise bei der Medikamentenentwicklung die Wirkstoffe auf ihre Wirkung in der Leber hin untersucht. Dies erfordert aufwendige Tierversuche und teure klinische Tests. Obwohl Leberzellen aus der Fleischindustrie in großen Mengen zur Verfügung stehen, ist die Entwicklung eines Testkits auf der Basis isolierter Leberzellen bisher gescheitert, da Einzelzellen- nur einige Stunden am Leben bleiben. Durch eine Isolation der Zellen aus der Leber und einer anschleißenden Verkapselung ist. es. möglich, die Zellen so zu präparieren, dass sie mehrere Wochen am Leben bleiben, wodurch sie erstmals im ■ Rahmen vonStandard-Testkits für toxikologische Untersuchungen eingesetzt werden können.
Ein anderer Ansatz. besteht darin Krankheiten wie beispielsweise den Diabetes Mellitus mit Hilfe der Transplantation von lebenden, verkapselten Inselzellen zu therapieren. Die Zellen werden aus dem Organ isoliert und so verkapselt, dass sie vor dem körpereigenen Immurisystem geschützt sind. Auf diese Weise kann man artfremde Zellen transplantieren. Verkapselt man z.B. Schweine-Inselzellen und spritzt diese einem zuckerkranken Patienten, so. würden die Zellen nicht nur das erforderliche Insulin produzieren, sondern auch den Blutzucker regeln. In der Literatur sind eine ganze Reihe derartiger Versuche beschrieben.
Bei all diesen Vorhaben müssen in' einem ersten Schritt die Zellen aus dem Organ gewonnen also isoliert werden. Bislang haben sich zwei grundlegend verschieden Methoden . in der Laborpraxis durchgesetzt: "L Ein Zerkleinern . des Organs mit. echanischen Mitteln und anschließendes Aufarbeiten der' erhaltenen Zeil- und Gewebssuspension, 2'. Ein enzymatisches Zerlegen des Organs in Einzelzellen und anschließendes Abtrennen der relevanten Zellen aus dem Gemisch.
In der US-Anmeldung US 5,079,160 beispielsweise, wird ein Verfahren zur Gewinnung von lebenden Zellen aus Organen von Säugetieren beschrieben. Dies geschieht dergestalt, dass in einem ersten Schritt durch ein Enzym das Bindegewebe des Organs zerstört wird, wobei die einzelnen Zellen freigesetzt werden. Durch Abkühlen wird das Enzym inaktiviert. Die Zellsuspension wird anschließend in einem Dichtegradienten aufgetrennt. Die Patentschrift beschreibt auch eine Laboranordnung zu diesem Zweck. Nach dem hier dargestellten Verfahren und mit der dargestellten Laboranordnung ist ein Auftrennen der Organe in irn' technischen, automatisierten Verfahren nicht möglich. Auch werden keine Angaben zu einer nachträgliche Verkapselung der Zellen gemacht. i '
Um die Zellen oder Zellverbände handhabbar zu machen ist es gängige Praxis sie anschließend zu verkapseln. Um dies zu erzielen werden sie in einem ersten Schritt einer ' flüssigen, zumeist wasserlöslichen Grundsubstanz beigemischt, die dann durch geeignete Vorrichtungen vertropft wird. Die gebildeten Tropfen werden ausgehärtet und schließen den in ihnen gelösten oder suspendierten Stoff oder die Zellen mit ein. Dies wird in der Regel durch ein Vernetzten in einem Fällbad oder durch Änderung physikalischer Parameter erreicht. Die so gebildeten Kügelchen deren Durchmesser in einem Bereich von einigen Mikrometern bis einigen Millimetern liegt, können anschließend beschichtet werden.
In der Fachliteratur werden an mehreren Stellen Verfahren beschrieben, die eine Verkapselung lebender Zellen zum Gegenstand haben. So beschreibt z.B. G.Troost et.al. (G.Troost et. al. Sekt, Schaumwein, Perlewein, Stuttgart 1995) in Alginat-Kugeln immobilisierte Hefe zur Flaschengärung bei der Schaumweinherstellung. Hierdurch kann das zeitaufwendige, manuelle Abrütteln des Hefedepots durch das rasche Absinken der Kügelchen in der Sektflasche ersetzt werden. Eine Gewinnung der Zellen aus Organen ist hier, da nicht erforderlich nicht beschrieben.
F. Lim und A. Sun beschreiben in der Zeitschrift „Science Band 210, Seiten 908-910, Jahrgang 1980 eine Kapsel mit einer semipermeablen Membran zur Immobilisierung von ( lebenden Zellen bei der der Kapselkern aus einer einzigen Schicht eines Ply-I-Lysin / Alginatkomplexes umgeben ist. Bei diesen Kapseln wird eine Austreten der Zellen aus dem Kapselkern verhindert. Diese Membrankapsel eignet sich wegen ihrer relativ geringen die Membran dafür durchlässig ist. Diese Methode ist auch Gegenstand der US-Anmeldung US 4,323,457. Sie ist in der dargestellten Form nicht für einen technischen Prozess geeignet, und befasst sich auch nicht mit der Zellgewinnung.
In der Patentschrift P 43 12 970.6 wird eine Membrankapsel beschrieben, . die auch zur Immobilisierung von Enzymen und Proteinen, aber auch lebenden Zellen geeignet ist. Hier : ist der Kern, der das Immobilisat enthält mit einer mehrlagigen Hülle umgeben, wobei jede dieser Lagen der. gesamten Hülle eine gewisse Eigenschaft verleiht. Über die vorteilhafte ! Wahl der Hüllenpolymere kann die Durchlässigkeit der Membran so verringert werden, dass . auch Enzyme in der Kapsel . bleiben, währen die viel kleineren Substrate und Produkte die- Membran passieren können. Diese Kapseln können aber bislang nur im Labormaßstäb, also in kleinen Mengen hergestellt werden. Auch fehlt hier der Hinweis auf eine Methode zur Zellgewinnung.
All diese Verfahren haben entweder immer nur einer :Schritt des Prozesses, also entweder die Zellgewinnung oder die Verkapselung zum Gegenstand oder aber sie sind nur für den Labormaßstab also nicht für ein technisches Verfahren geeignet.
Ausgehend von dieser Sachlage liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Verfahren sowie die dazugehörige Anlage zu beschreiben, die es erstmals ermöglicht, lebende Zellen aus einem Organ in einem technischen Prozess zu gewinnen, aufzutrennen und zu verkapseln.
Der erfindungsgemäße Herstellungsprozess gliedert sich in drei Abschnitte, die Zellgewinnung, die Zelltrennung und die Zellverkapselung:
Das Organ aus dem die Zellen gewonnen werden, wird in einem ersten in Einzelzellen zerlegt. Dies geschieht in einem enzymatischen Prozess, wie er vom Prinzip her literaturbekannt ist. In einem zweiten Verfahrensschritt wird die erhaltene Zellsuspension im. aufgetrennt. Dabei wird die für die weitere Verarbeitung relevante Zellsorte mit Hilfe einer Antikörpermarkierung aus • dem Gemisch abgetrennt. Sollte eine Verkapselung der erhaltenen Zellen erforderlich sein, kann dies in einem weiteren Verfahrensschritt erfolgen. Die Verkapselung basiert auf dem Prinzip wonach die relevanten Zellen in einem ersten Schritt einer flüssigen, zumeist wasserlöslichen Grundsubstanz beigemischt werden, aus der darin durch Vertropfen und Aushärten mechanisch stabile, beschichtbare Partikel gewonnen werden. eine iviascnine, der ein solcher Prozess zu Grunde liegt, besteht demnach aus drei Modulen, je eines für jeden Verfahrensschritt: Zellgewinnung, Zelltrennung und Zellverkapselung.
Fig. 1 und Fig. 1a zeigen den Grundaufbau einer Anlage bei der dem das erfindungsgemäße Verfahren umgesetzt wurde. Alle Komponenten der Maschine sind so gefertigt, dass die Anlage durch Autoklavieren sterilisiert werden kann. Die Zellqewinnunα erfolgt durch eine Zerlegung des Organs in Einzelzellen und/oder Zellverbände. Dies geschieht im Modul ZI. Der genaue Aufbau und die Funktionsweise des Zellisolationsmoduls (ZI) ist in Fig. 2 dargestellt und wird nachfolgend eingehend erläutert. Nach der Isolation gelangt das Zellgemisch in das Zeiltrennmodul ZT. Der Aufbau des Moduls zur Zelltrennung ZT ist in Fig. 3 schematisch dargestellt, seine Funktionsweise wird an einer nachfolgenden Stelle beschrieben. Eine nachträgliche Verkapselung der relevanten Zellen kann mit Hilfe des Moduls ZVK durchgeführt werden. Der Aufbau dieses Moduls ist in Fig. 4 dargestellt ist und seine Funktionsweise wird in einem der nachfolgenden Abschnitte erklärt.
Fig. 2 zeigt in einer schematischen Darstellung das Zeilisolationsmodul (ZI) der Anlage. Es funktioniert folgendermaßen: Das Organ eines frisch verstorbenen, beispielsweise tierischen" Spenders wird in der Reaktionskammer RK auf die Siebplatte F1 gelegt. Aus dem Vorratsbehälter EV wird anschließend über die Dosierpumpe (z.B. eine Kobenpumpe) P2 eine Enzymlösung dem Organ zugeleitet. Ein solches Enzym kann z.B. eine Collagenase sein. Die Maschine ist so konstruiert, dass die Reaktionskammer herausnehmbar ist, so dass das Organ unter sterilen Bedingungen in der Kammer platziert werden kann und dass die Enzymlösung bei Bedarf über eine Zuleitung direkt in ein Blutgefäß des Organs geleitet werden kann. Die Reaktionskammer RK ist Teil eines geschlossenen Kreislaufs in dem sie während des ganzen , Zellisolationsvorgangs von einem Zeilnährmedium durchspült wird. Dieses Medium wird aus dem Verratsbehälter MV über die Pumpe P1 und über die Ventile V2 und V1 in dem Wärmetauscher WT1 auf ca. 35 - 38°C erwärmt und in die Kammer RK geleitet. P1 kann beispielsweise eine Zahnradpumpe oder eine andere selbstansaugende Pumpe mit abnehmbarem Pumpenkopf sein. Der Pumpenkopf kann so zusammen mit dem Rest der Maschine autolaviert werden. Der Wärmetauscher WT1 ist an einen Heizthermostat HT angeschlossen, der über den Temperaturfühler TF1 die Temperatur in der Kammer RK ermittelt und auf ca. 35 - 38° C regelt. Bei dieser Temperatur ist das' Enzym, die Collagenase nämlich aktiv und zersetzt das Bindegewebe des Organs, wodurch die einzelnen Zellen herausgelöst und freigesetzt werden. Um diesen Vorgang zu unterstützen wird im Inneren der Kammer RK durch den Rührantrieb RA eine turbulente Verwirbelung des Nährmediums erzeugt. Die frei gewordenen Zellen werden von dem Nährmedium erfasst, das die Kammer RK durchströmt und über den Wärmetauscher WT2 in die Dekantierkammer DK geleitet. Bei diesem Vorgang wird das Nährmedium mit den Zellen auf ca. 3 - 8 °C abgekühlt, wodurch das Enzym, die Collagenase inaktiviert wird. Die Temperatur wird durch den Kältethermostat | KT geregelt. Der Thermostat KT ist mit dem Temperaturfühler TF 2 verbunden, der laufend die Temperatur in der Dekantierkammer DK ermittelt und auf ca. 3 - 8 ° C regelt. Das Einleitrohr des Nährmediums (mit Zellen) wird in das Innere der Dekantierkammer DK durch die Filterfritte F2 hindurch geführt. Diese Filterfritte besteht z.B. aus Edelstahl und hat eine Porosität die geringer ist als der Durchmesser der aus dem Organ herausgelösten Zellen (z.B. 5 μm). Auf diese Weise werden die Zellen aus den Nährmedium abgetrennt und sammeln sich unterhalb der Fritte. Die Fritte ist für das Nährmedium durchlässig. Dieses wird oberhalb der Fritte wider abgepumpt und gelangt über eine entsprechende Stellung des Ventils V2 und V1 wieder zurück in den Kreislauf. Im Kreislauf befindet sich auch noch ein Druckschalter OS der bei einem Zusetzen der Filterfritte F2 und somit einem übermäßigen Druckanstieg im System die Pumpe P1 entsprechend steuert. Durch Öffnen des Ventils V3 werden die isolierten Zellen als Zellsuspension ZSR aus der Dekantierkammer geleitet und können dem Zeiltrennmodul ZT zugeführt werden. Soll die Anlage gereinigt werden, wird über V2 die entsprechende Spüllösung angesaugt und durch das System gepumpt. Nach einem Durchlauf kann die Spüllösung durch Öffnen von V1 aus dem Kreislauf entfernt werden. ,
Die durch die Zellisolation gewonnene Suspension ZSR ist ein Gemisch aus unterschiedlichen Zelltypen. Für manche Anwendungen kann die Suspension in dieser Form eingesetzt werden. In der Regel muss jedoch aus dem Gemisch eine bestimmte Zellsorte abgetrennt werden. Methoden zur Auftrennung von Zellgemischen werden in der Literatur an mehreren Stellen beschrieben. Neben der klassischen Trennmethode in einem Dichtegradienten gefolgt von einem Abzentrifugieren der einzelnen Fraktionen setzt sich immer mehr die Trennung mit magnetisch markierten Antikörpern durch. Bei diesem Verfahren werden spezifische Antikörper eingesetzt, die magnetische Partikel enthalten. Diese Antikörper setzten sich auf bestimmten Zelltypen fest, machen diese magnetisch wodurch sie in einem Magnetfeld aus dem Zellgemisch herausgetrennt werden können. Werden alle Zellen markiert außer einem bestimmten Zelltyp spricht man von einer Negativmarkierung. Im Umgekehrten Fall, bei dem nur ein gewisser Zelltyp markiert wird handelt es sich um eine Positivmarkierung.
Die vorliegende Erfindung nutzt zur Auftrennung des aus dem Modul ZI gewonnenen Suspension die Methode mit spezifischen, magnetischen Antikörpern. Dieser Verfahrensschritt ist im Modul ZT technisch umgesetzt. Der Aufbau dieses Moduls ist in Fig. 3 schematisch dargestellt.
Das Zellternnmodul aus Fig. 3 arbeitet wie folgt: Die Rohsuspension ZSR aus ZI wird in einem Behälter ZS aufgefangen. Hier wird der magnetisch markierte Antikörper aus MP zudosiert. Dieser Antikörper kann je nach weiterer Verwendung der Zellen entweder eine Positiv- oder eine Negativmarkierung bewirken. Als Beispiel wird bei der weiteren Beschreibung von einer Negativmarkierung ausgegangen. Das so markierte Zellgemisch wird durch die Pumpe P3 in die Trennkammer TK gepumpt. P3 ist beispielsweise eine Schlauchpumpe oder jede andere, die aufgrund ihrer Bauart zum Pumpen von Zellsuspensionen geeignet ist. Die Trennkammer besitzt Kanäle, durch die die Suspension geleitet wird. Unterhalb der Kammer befindet sich ein Magnet M. Ist dieser Magnet ein Permanentmagnet besitzt die Kammer einen Mechanismus, der ein Entfernen des Magneten ermöglicht (SRT).-Ist der Magnet ein Elektromagnet besitzt dieser eine Steuerung (SRT) mit Hilfe derer er zu- oder abgeschaltet werden kann. Die markierte Zellsuspension wird in der Kammer einem Magnetfeld ausgesetzt wodurch die markierten Zellen zurückgehalten werden. Über VT werden bei einer Negativmarkierung nur noch die für die weitere Verarbeitung relevanten Zellen von der Flüssigkeit transportiert. Man erhält eine sortenreine Zellsuspension ZS2 in Zellnährmedium. Durch Entfernen des Magnetfeldes werden nun auch die markierten Zellen von der Flüssigkeit weitertransportiert und über ein Umstellen des Ventils VT als Zellsuspension ZS1 ausgespült.
Die erhaltenen Zellen können direkt als Suspension ZS1 oder ZS2 verwendet werden. Bei einer ganzen Reihe von Zellen ist es aber von Vorteil, sie in einem weiteren Schritt zu verkapseln. Auf diese, Weise kann die Haltbarkeit der Zellen erhöht und deren Handling verbessert werden.
In Fig. 4 ist das Zellverkapselungsmodul ZVK der Prozesses schematisch dargestellt. Es erlaubt eine Verkapselung der Zellen sowohl in sogenannten Membrankapseln aber auch in membranlosen Kapseln. Die Zellsuspension ZS2 wird in einem Mischgefäß Ml, das mit einem Rührantrieb RA2 ausgestattet ist in einer Grundstofflösung GL, vorzugsweise Natriumalginat suspendiert oder gelöst. Diese Grundstoff Suspension oder -lösung wird danach in dann über V8 in den Druckbehälter DB und von da über V3 in den Verkapselungsreaktor VR befördert. Dies kann entweder wie in Fig. 3 gezeigt durch Druckluft erfolgen (Regelung über das Ventil DRV und Manometer M), es können aber auch Pumpen, Förderschnecken usw. verwendet werden. Aus dieser Suspension oder Lösung werden dann durch Eintropfen mit Hilfe des Düsenkopfes DSK in ein Fällbad, Kügelchen geformt. Dies kann entweder durch Komplexieren mit einer mehrwertigen Salzlösung wie z.B. bei der Verwendung von Alginat erfolgen, oder durch die Änderung physikalischer Parameter wie z.B. Temperatur bei anderen Grundstoffen. Zum Vertropfen der Flüssigkeit können je nach gewünschter Größe, Produktivität und Größenverteilung mehrere Verfahren eingesetzt werden. Hierbei können entweder Düsen Verwendung finden, die Kapillaren besitzen, bei denen der Tropfen über einen Luftstrom abgerissen wird oder aber auch solche bei denen der Tropfenabriss über Vibration, elektrostatische Ablenkung usw. erfolgt.
Beim Eintauchen ins Fällbad wird der Flüssigkeitstropfen zum Gel und schließt das zu verkapselnde Material ein. Das benötigte Fällreagens wird vor. Beginn des Tropfvorgangs über die Ventile V4, V6, V7 mit Hilfe der Pumpe P4 aus dem Vorratsbehälter VB1 in den Verkapselungsreaktor befördert. Durch eine tangentiale Einleitung der Flüssigkeit auf zusätzliches Rühren verzichtet werden. Während des Vertropfens wird das Fällreagens über eine geeignete Stellung der Ventile V6 und V7 mit Hilfe der Pumpe P4 im Kreis geführt. Nach Beendigung des Vertropfens und des Aushärtens der Partikel wird das Fällreagens über die Ventile V6; V7 und V5 wieder in den Behälter VB1 zurückgepumpt. Ist das Reagens verbraucht kann es auch durch eine entsprechende Stellung von V5 verworfen werden. Danach wird über die Ventile V4; V6 und V7 eine Waschlösung in den Reaktor VR gepumpt wodurch die Kügelchen von dem überschüssigen Fällreagens befreit also gewaschen werden.
Ist eine Beschichtung der Kügelchen gewünscht können in einem ähnlichen Vorgang aus den Vorratsbehältern VB2; VB3 usw. die entsprechenden Beschichtungslösungen in den Reaktor VR gepumpt und daraus wieder entfernt werden. Die Beschichtung der Gelpartikel erfolgt durch deren Kqntakt mit den jeweiligen Beschichtungslösungen. Dies sind verdünnte wäßrige Lösungen von Polymeren mit anionischen bzw. kationischen Gruppen wie z.B. Chitosan, Polyvinylpyrrolydon, Polyethylenimin, Carbocymethylcellulose, Alginat, Polyacrylsäure usw. die auf der Kapseloberfläche sogenannte Polyelektrolytkomplex- Schichten bilden. Durch wiederholtes Eintauchen der Partikel in diese Lösungen werden, wie in P 43 12970.6 beschrieben, mehrere Lagen der Kapselhülle gebildet.
Die verkapselten Zellen werden über das Ventil AV2 aus dem Reaktor VR als Suspensior ZK ausgeschwemmt. Je nach späterem Einsatzgebiet können die Kapseln danach entwedei inkubiert, eingefroren oder getrocknet werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren und Anlage zur Gewinnung und/oder Verkapselung von lebenden Zellen aus Organen dadurch gekennzeichnet, dass das Organ, das die Zellen enthält in einem enzymatischen Prozess in Einzelzellen und/oder Zellverbände zerlegt'wird, •aus dem "so erhalten . Zellgemisch anschließend die relevanten Zellen abgetrennt werden und diese danach verkapselt werden können.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es mehrere oder alle der | folgenden Schritte umfasst, die auch mehrmals wiederholt werden können: - ' Umspülen eines Organs mit einer auf ca. 35 - 38? C erwärmten . Nährflüssigkeit Heraustrennen von Zellen aus dem Organ mit Hilfe eine Enzyms Weitertransport der herausgelösten Zellen durch die Nährflüssigkeit in . Form einer Suspension Abkühlen der dadurch resultierenden Zellsύspension auf ca.3 - 8° C Aufkonzentrieren der .Zellsuspension durch ein Abtrennen der Zellen aus der Suspension mit Hilfe einer porösen Fritte. Rückführen der Nährflüssigkeit nach Abtrennung der Zellen in einen Kreislauf Markieren bestimmter Zelltypen in der konzentrierten Suspension mit Hilfe magnetisch markierter Antikörper Abtrennen der so markierten Zellen aus- der Suspension in einem Magnetfeld Suspendieren der relevanten Zellfraktion in einem Grundstoff Vertropfen dieser Grundstoff Suspension Fällen der Tropfen -' Spülen und Suspendieren der durch Fällung entstandenen Kügelchen in ' einer Waschflüssigkeit - • Umspülen der Kügelchen mit "einer polykätionischen Poly nerlösuhg und Ausbilden einer kationischen Ladung auf der Kugeloberfläche . Waschen der Kügelchen mit einer Waschflüssigkeit Waschen der. Kügelchen mit einer Detergenzlösung Umspülen der Kügelchen mit einer polyanionischen Polymerlösung und Ausbilden einer anionischen Ladung auf der Kugeloberfläche Spülen und Suspendieren der durch Fällung entstandenen Kügelchen in einer Waschflüssigkeit Suspendieren der durch Fällung entstandenen Kügelchen mit den Zellen in einem Zeilnährmedium Inkubieren der Kügelchen mit den Zellen Einfrieren der Kügelchen mit den Zellen Trocknen der Kügelchen mit den Zellen
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet dass das zur Zellisolation eingesetzte Enzym eine Collagenase ist
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3 dadurch gekennzeichnet, dass der Grundstoff in den die Zellen zur Verkapselung eingerührt werden ein löslicher Naturstoff oder Kunststoff ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass der Grundstoff durch ein mechanisches Hilfsmittel vorzugsweise eine Förderschnecke oder eine Pumpe in eine Vorrichtung zur Tropfenerzeugung befördert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass der Grundstoff pneumatisch in eine Vorrichtung zur Tropfenerzeugung befördert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zur Tropfenbildung Teil eines Reaktionsgefäßes ist
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Grundstoff durch Vibration, durch einen Luftstrom, durch eine Rotationsbewegung (Zentrifugalkräfte) und/oder durch Emulgieren Tropfen gebildet werden.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass die gebildeten Tropfen chemisch, z.B. durch den Einfluss von Salzen gefällt werden können.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, dass die gebildeten Tropfen physikalisch, z.B. durch Temperaturänderung gefällt werden können.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet, dass die gefällten Tropfen die aus einem Organ gewonnenen lebenden Zellen enthalten.
12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass die gefällten Tropfen in dem Fällbad in Schwebe gehalten werden
13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die gefällten Tropfen in dem Fällbad durch Rühren in Schwebe gehalten werden.
14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13 dadurch gekennzeichnet; dass die gefällten Tropfen in dem Fällbad durch die Fließgeschwindigkeit des umgebenden Mediums in Schwebe gehalten werden.
15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass die gefällten Tropfen durch Umspülen mit geeigneten Polymerlösungen beschichtet werden.
16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 15 dadurch gekennzeichnet, dass die gefällten Tropfen während des Beschichtens in Schwebe gehalten werden
17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 16 dadurch gekennzeichnet, «dass die gefällten Tropfen während des Beschichtens durch Rühren in Schwebe gehalten werden.
18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17 dadurch gekennzeichnet, dass die gefällten Tropfen während des Beschichtens durch die Fließgeschwindigkeit des umgebenden i Mediums in Schwebe gehalten werden.
19. Verfahren nach Anspruch 1 bis 18 dadurch gekennzeichnet, dass die beschichteten Kügelchen eine Hülle aufweisen, die den Kern und somit das verkapselte Material vollständig umschließt.
20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 19 dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle der beschichteten Kügelchen aus einer oder mehrerer radial angeordneten Schichten besteht.
21. Verfahren nach Anspruch 1 bis 20 dadurch gekennzeichnet, dass Schichten der Hülle Bereiche unterschiedlicher Dichte sein können.
22. Verfahren nach Anspruch 1 bis 21 dadurch gekennzeichnet, dass die beschichteten Kügelchen ungetrocknet, also feucht gelagert und verwendet werden können.
23. Verfahren nach Anspruch 1 bis 22 dadurch gekennzeichnet, dass die beschichteten Kügelchen gefriergetrocknet werden können.
24. Verfahren nach Anspruch 1 bis 23 dadurch gekennzeichnet, dass die beschichteten Kügelchen luftgetrocknet werden können.
,
25. Verfahren nach Anspruch 1 bis 24 dadurch gekennzeichnet, dass zum Fällen und/oder Beschichten eingesetzten Lösungen entweder als Konzentrate oder gebrauchsfertig, in verdünnter Form verwendet werden.
26. Anlage nach Anspruch 1, die nach einem Verfahren nach Anspruch 1 bis 25 arbeitet, dadurch -gekennzeichnet, dass sie mehrere der folgenden Hauptkomponenten aufweisl::
- Reaktionskammer zur Aufnahme des Organs mit Siebplatte und Rührwerk (RK) - Kälte- (KT) und Heizthermostat (HT) - Wärmetauscher zum Temperieren der Flüssigkeiten (WT1 , WT2) - Dekantiergefäß mit poröser Fritte und Rohrdurchleitung (DK) - Kammer zur Trennung von markierten Gemischen im Magnetfeld (TK) - Mischbehälter für den Grundstoff und die Zellen (MI) - Vorratsbehälter für das Fällbad (VB1) - Vorratsbehälter für die Beschichtungslösungen (VB2, VB3, usw.) - Reaktionsgefäß für die Vertropfung und Fällung der Grundstoff-Zellsuspension (VR) - Vorrichtung zum Trocknen der beschichteten Kügelchen - Pumpen (P1, P,2, P3) und Ventile (V1, V2,...) - Entsprechende Steuer- und Regelteile
27. Anlage nach Anspruch 1 bis 26 dadurch gekennzeichnet, dass sie gemäß Fig. 1 bzw. Fig. 1 a arbeitet und/oder ihre Komponenten gemäß Fig." 1 bzw. Fig. 1 a angeordnet und/oder miteinander verbunden sind.
28. Anlage nach Anspruch 1 bis 27 dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Zeilisolationsmodul besitzt, das gemäß Fig. 2 arbeitet und/oder dessen Komponenten gemäß Fig. 2 angeordnet und/oder miteinander verbunden sind.
29. Anlage nach Anspruch 1 bis 28 dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Zelltrennmodul besitzt, das gemäß Fig'.< 3 arbeitet und/oder dessen Komponenten gemäß Fig. 3 angeordnet und/oder miteinander verbunden sind.
30. Anlage nach Anspruch 1 bis 29 dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Zellverkapselungsmodul .besitzt, das -, gemäß. Fig.., 4. ..arbeitet ünd/όder dessen Komponenten gemäß. Fig..4 angeordnet und/oder miteinander verbunden sind.
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