EP1711955A1 - Laboratoire sur puce comprenant un reseau micro-fluidique et un nez d'electronebulisation coplanaires - Google Patents

Laboratoire sur puce comprenant un reseau micro-fluidique et un nez d'electronebulisation coplanaires

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Publication number
EP1711955A1
EP1711955A1 EP05717692A EP05717692A EP1711955A1 EP 1711955 A1 EP1711955 A1 EP 1711955A1 EP 05717692 A EP05717692 A EP 05717692A EP 05717692 A EP05717692 A EP 05717692A EP 1711955 A1 EP1711955 A1 EP 1711955A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fluid
network
support
cover
laboratory
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05717692A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas Sarrut
Olivier Constantin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1711955A1 publication Critical patent/EP1711955A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/04—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution

Definitions

  • the invention relates to a laboratory on a chip comprising a microfluidic network and a coplanar electrospray nose. It relates in particular to the coupling of a laboratory on a chip with a mass spectrometer.
  • mass spectrometer For almost ten years, many avenues have been explored to couple different microfluidic devices to mass spectrometers. Indeed, optical detection methods such as spectrophotometry or fluorescence are not suitable for the detection of biomolecules such as proteins or peptides, detection which is of particular interest in the field of proteomics.
  • the limits are either the sensitivity or the need to prepare the sample (fluorescent labeling), which, in the case of the identification of proteins after enzymatic digestion for example, presents a problem since the peptides obtained are a priori not known.
  • Mass spectrometry is therefore often used since it gives information on the nature of the samples analyzed (intensity spectrum according to the mass / charge ratio) with very good sensitivity (femtomole / ⁇ l), and that it allows analyze complex mixtures of molecules.
  • a pre-treatment of the sample is carried out before the analysis. Through example, this pre-treatment consists of a separation of the chemical and / or biological compounds, preceded and / or followed by a concentration of the species.
  • micro-fluidic devices for enzymatic digestion Lian Ji Jin, "A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping", Lab Chip, 2003, 3, 11-18
  • capillary electrophoresis B. Zhang et al., "Microfabricated Devices for Capillary Electrophoresis-Electrospray Mass Spectrometry", Anal. Chem., Vol.
  • microfluidic / mass spectrometry coupling can be based on a technique of ionization of the sample by electronebulization or electrospray (or ESI for ElectroSpray Ionization).
  • the pre-treated liquid sample leaving the micro-fluidic chip is nebulized in an ion gas or in a multitude of charged droplets which can enter the mass spectrometer (MS) for analysis.
  • MS mass spectrometer
  • This nebulization passes through the deformation of the interface formed between the outgoing liquid and the surrounding gas (liquid meniscus / gas) and the "drop" of liquid takes a conical shape called "Taylor cone".
  • the volume of this cone constitutes a dead volume for the outgoing liquid (geometric space in which the chemical compounds can mix), which is undesirable, especially when the last stage of the pretreatment consists precisely in a separation of the compounds sample chemicals.
  • the sample is pre-treated "outside the ESI device” then placed manually (with a pipette) in a hollow needle whose end is electrically conductive ("PicoTip emitter” of New Objective for example).
  • An electric field is imposed between the conductive part of the PicoTip and the entry of the MS, which allows the formation of a Taylor cone at the exit of the PicoTip and the nebulization of the sample.
  • the “pointed” cylindrical geometry of PicoTip is ideal for the formation of a small Taylor cone, but the limits on the minimization of their size (conventionally with external diameter 360 ⁇ m and internal diameter 10 ⁇ m), those on obtaining good reproducibility by the manufacturing techniques used (stretching) and their fragility in use are the main reasons for seek to make other types of nebulization devices.
  • micro-technologies such as plane silicon technologies for example (etching, machining, deposition in thin layers and photolithography of various materials on substrates having very large lateral dimensions compared to their thickness), we often speak of "electrospray nose” (Tai et al., "MEMS electrospray nozzle for mass spectroscopy", WO-A-98/35376).
  • electrospray nose Ti et al., "MEMS electrospray nozzle for mass spectroscopy", WO-A-98/35376.
  • micro-technologies can allow ESI interfaces to be created by defining tip-like structures (such as PicoTips) but smaller (to limit the volume of the Taylor cone), more reproducible and less fragile, which is of interest in itself (see document WO-A- 00/30167).
  • micro-technologies can make it possible to produce devices integrating a fluidic network making it possible to ensure the pretreatment of the sample and an ESI type interface.
  • advantages reduction in dead output volumes, reproducibility, robustness of the ESI interface
  • an integrated preprocessing device continuous preprocessing protocol with analysis, reduction overall analysis times, minimization of reagent volumes.
  • PDMS poly (dimethylsiloxane) chip also showing through channels intended to be placed opposite an MS for nebulization of the sample.
  • the authors take advantage of the hydrophobicity of PDMS to obtain a small Taylor cone, hence the limitation of the dead output volume.
  • the proposed device does not incorporate a nebulization electrode.
  • the tests are carried out using a platinum wire immersed in the inlet tank of the ⁇ SI channel, which cannot be a good solution, that is to say without adding dead volume, for a possible integration into a fluid pre-treatment network.
  • PDMS technology remains a limited technology which does not yet allow the design of complex microfluidic networks of characteristic size of the order of a micrometer.
  • PicoTip is only 10 ⁇ m.
  • the use of polymeric materials imposes strong limits on possible chemical functionalizations or of the internal walls of the outlet channel or of a possible fluidic pre-treatment network of the sample. Indeed, until now, most of these functionalizations have been developed on silicon or on glass.
  • the manufacturing technology proposed is not collective and the nebulization electrode is produced on the outside of the ESI tip. V. Gobry et al. ("Microfabricated polymer injector for direct mass spectrometry coupling",
  • the technologies claimed for producing an electrospray nose fitted with an upstream filter are surface technologies making it possible to produce hollow structures in silicon nitride in the first case and in parylene in the second. These surface technologies are based on the use of a sacrificial layer (in phosphosilicate glass PSG), which as its name suggests, is not preserved until the end of the technological sequence. The removal of this layer, produced by chemical etching, determines the hollow structures.
  • the present invention provides a microfluidic device allowing various sample treatments and having a good interface with an ESI type mass spectrometer, which requires: - A production technology compatible with that of '' a fluid pre-treatment network (reservoirs, micro-channels, reactors ...) and an ESI interface at the output (tip geometry, minimum output dimensions ...), and this, to allow the realization of the complete device on the same support or the same set of supports seeing a technological sequence common to the two integrated entities. - An integration design without dead volumes. The integration of a nebulization electrode inside the outlet channel and near the device outlet.
  • the object of the invention is therefore a laboratory on a chip comprising a support, at least one fluid network, at least one fluid inlet orifice connected to the fluid network and at least one fluid outlet orifice connected to the fluid network, a thin layer integral with the support and in which the fluid network and an electrospray nose are made , the electrospray nose being overhanging with respect to the support and comprising a channel, one end of which is connected to the fluid network and the other end of which constitutes said fluid outlet orifice, the channel being equipped with electrical conduction means forming at minus an electrode, characterized in that the thin layer is a layer fixed by direct sealing on the support.
  • the rear face of the support that is to say that which does not support the thin layer, can advantageously be of an inert nature. It therefore does not participate in the operation of the device. In particular, it then has no electrical connection.
  • the support is made of semiconductor material
  • the electrical conduction means can be a doped part of said support.
  • the support can be of conductive material.
  • This laboratory may include a cover hermetically covering the fluid network, this cover being provided with a means of fluid access to the fluid inlet orifice.
  • the laboratory on a chip may comprise a cover hermetically covering the fluidic network, this cover being provided with a means of fluid access to the orifice fluid inlet and being provided with said electrical conduction means.
  • the cover may be of conductive material.
  • the electrical conduction means can therefore be located both in the support and in the cover and can be produced either by the support or the cover made of conductive material, or by metal tracks deposited on the support or the insulating cover, or be parts doped with support or cover in semiconductor material.
  • FIG. 1 is a diagram of a laboratory on chip according to the present invention
  • FIG. 2 shows the structure
  • FIG. 3 represents the COMOSS structure of a pre-concentration reactor used in the laboratory on chip of FIG. 1
  • FIG. 3A shows a detail of FIG. 3
  • FIG. 4 represents the COMOSS structure of a chromatography reactor used in the lab on chip of figure 1
  • figure 4A shows a detail of figure 4
  • - figure 5 is an enlarged view of a detail of figure 1 showing the ESI interface
  • - figures 6A to 6D illustrate a first embodiment of a laboratory on chip according to the present invention
  • FIGS. 7A and 7B illustrate a second embodiment of a laboratory on chip according to the present invention
  • FIGS. 7A and 7B illustrate a second embodiment of a laboratory on chip according to the present invention
  • FIGS. 8A to 8D illustrate a third embodiment of realization of a laboratory on chip according to the present invention
  • FIGS. 9A to 9H illustrate a fourth embodiment of a laboratory on chip according to the present invention
  • - FIGS. 10A and 10E illustrate a fifth mode of r realization of a laboratory on chip according to the present invention
  • FIGS. 11A to 11F illustrate a sixth embodiment of a laboratory on chip according to the present invention
  • - Figure 12 illustrates a top view of a substrate comprising a plurality of devices according to the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram of a laboratory on a chip 1 according to the present invention. This device can be 18 mm long by 5 mm wide.
  • the fluidic network We first describe the fluidic network intended to prepare a complex biological sample in order to identify its protein content.
  • This fluid network consists of a set of reservoirs and channels, a digestion, enzymatic reactor, a pre-concentration reactor and a separation reactor by liquid electro-chromatography.
  • the basic structure of all these reactors is a deep cavity provided with a large number of studs of square or hexagonal section ...
  • This kind of structure is known under the name of COMOSS (for "Collocated MOnolith Support Structures”).
  • COMOSS for "Collocated MOnolith Support Structures”
  • R2, R3 and R4 contain a mixture of water / acetonitrile ACN / formic acid TFA (95%; 5%; 0.1 %)
  • R5 contains a water / acetonitrile / formic acid mixture (20%; 80%; 0.1%).
  • the digest collected in the R2 tank must be concentrated before separation. For this, it is pumped by electro-osmosis to the R3 tank (trash can). All of the peptides resulting from the enzymatic digestion are then "captured" by the pre-concentration reactor 3 of small volume, hence the concentration.
  • a gradient of acetonitrile produced by mixing the buffer of R4 and that of R5 in structure 4 of the "serpentine" type (2 cm in length), then selectively detaches the peptides according to their affinity with the stationary phase (C18 for example ) of the pre-concentration reactor 3. These are again “captured” by the chromatography column 5, which is denser than the pre-concentration reactor 3.
  • the enrichment of the mixture with ACN again makes it possible to selectively unhook these peptides from the chromatography column 5, and take them, separated, to the outlet 6 of the chip 1 where the liquid is nebulized towards the inlet of a mass spectrometer not shown.
  • An affinity reactor for a given protein (not shown) can be used to capture the latter in a multi-protein mixture conveyed through this reactor.
  • the affinity reactor can be functionalized with antibodies and the elution buffer can be made up of competing proteins (vis-à-vis the antibody) with that which one wishes to "capture" in the multi-protein complex.
  • the upstream affinity reactor COMOSS structure it is intended to specifically capture a protein, a family of proteins, or a multi-protein complex in the complex biological sample.
  • the tools used for this step can be antibodies, but also for example small molecules which have specificity of interaction with the protein (s) sought.
  • the COMOSS structure of the enzymatic digestion reactor is made from a set of section studs hexagonal of 10 ⁇ m allowing to define a network of channels of approximately 5 ⁇ m. Its useful width a is constant (640 ⁇ m), but its real width b is 892 ⁇ m. The length c of the active part of the reactor is 15 mm. Its other geometric characteristics, to be read in conjunction with Figure 2, are described in the following table:
  • This structure optionally makes it possible to organize silica "beads" of a few micrometers (Beads Bangs Laboratories distributed by Serotec France for example) functionalized (Trypsin for example) in order to bring to the reactor its enzymatic properties or to increase them.
  • the enzyme grafted onto the studs can be trypsin.
  • the protocol used is that described in document FR-A-2 818 662.
  • FIG. 2A shows a detail of the zone of the reactor referenced 11 in FIG. 2.
  • the studs 12 of hexagonal section are recognized, making it possible to define the network of channels 13.
  • the reference 14 designates possibly used silica beads.
  • FIG. 3A shows a detail of the zone of the reactor referenced 21 in FIG. 3.
  • the studs 22 of square section are recognized so as to define the network of channels 23.
  • the separation reactor by liquid electro-chromatography The COMOSS structure of the separation reactor, shown in fig. 4, is made from a set of pads with a square section of 10 ⁇ m making it possible to define a network of channels of approximately 2 .mu.m. Its useful width g is constant (160 ⁇ m), but its actual width h is 310 ⁇ m.
  • the length i of the active part d ⁇ _ ⁇ reactor is 12 mm. Its other geometric characteristics, to be read in parallel with Figure 4, are described in the following table:
  • the reactor can be made in three parts of 12 mm in length each as shown in Figure 1.
  • This structure can optionally organize functionalized silica beads to provide to the reactor or increase its affinity properties (C18 grafting for example).
  • FIG. 4A shows a detail of the zone of the reactor referenced 31 in FIG. 4.
  • the studs 32 of square section are recognized making it possible to define the network of channels 33.
  • FIG. 5 is an enlarged view of the output of the chip, referenced 6 in FIG. 1.
  • the outlet channel 40 is planar and of rectilinear axis with respect to the fluid network. In other words, the outlet channel 40 remains parallel to the planes of the different substrates used for the production. This configuration avoids the dead volumes that the partial or total travel of the thickness of one or more of these substrates could cause, after having traversed a portion parallel to the planes of these substrates. This avoids any turn, which as it was underlined above is essential, in particular for transporting previously separated samples.
  • the section of the outlet channel 40 can be adapted by working preferentially on the transverse dimensions (in the plane of the substrate) of the latter, which gives the possibility of achieving “soft restrictions” avoiding dead volumes.
  • these remarks are illustrated by the existence of a “connection” 41 between the outlet of the channel of the chromatography reactor 5 and the outlet channel 40.
  • Such a restriction is essential for connecting fluid structures of “large »Dimensions (" large "volumes,” large “affinity capacity for example ”) to a structure of the ESI interface type for which, as previously pointed out, it is desirable to minimize the output surface by reaching typically dimensions on the order of a micrometer to a few micrometers.
  • the outlet channel 40 opens into a point-like structure 42, a structure with variable external section making it possible to limit the surface of the liquid / gas and liquid / solid interfaces presented by the liquid leaving with its environment, thanks to its end of small interior and exterior sections, while retaining robustness during use thanks to its wide section end.
  • the interior of the outlet channel 40 is provided with an electrode 43 making it possible to impose an electrical potential on the liquid present at the outlet of the device, which is necessary to nebulize the sample (stability of the Taylor cone) and / or participate in its electroosmotic pumping. All of these elements provide a complete flat ESI interface, since robust, without dead volumes of connection to fluidic networks and allowing the birth of a Taylor cone of good stability.
  • the fluidic network is simplified and reduced to an inlet tank, an inlet channel, a microreactor and an outlet channel with constant section opening into the tip type structure.
  • FIGS. 6A to 6D This embodiment is illustrated by FIGS. 6A to 6D. It uses only one SOI substrate. Such substrates are sold by the company "Soitec". The electrodes, the conductive tracks and the electrical contact pickups are produced in a single localized doping step of the silicon.
  • FIG. 6A shows an SOI substrate 50 consisting of a support 51 made of silicon 500 ⁇ m thick, successively supporting a layer of silicon oxide 52 4 ⁇ m thick and a thin layer 53 of silicon 25 ⁇ m thick. The thin layer 53 is locally doped to provide a first electrically conductive circuit formed from zones 54 and 55 and a second electrically conductive circuit formed from zones 56 and 57.
  • FIG. 6B illustrates the production of the fluid network in the thin layer 53.
  • the fluid network is obtained by DRIE etching (for “Deep Reactive Ion Etching”). Etching the thin layer of silicon
  • the fluid network produced comprises an inlet tank 61, an inlet channel 62, a microreactor 63 and an outlet channel 64.
  • the outlet channel defined here then has two side walls and a horizontal wall ("the ground"). Note that one end 58 of the doped area 55 is located at the bottom of the inlet tank 61 and that one end 59 of the doped area 57 is located at the bottom of part of the outlet channel 64.
  • FIG. 6C illustrates the tip clearance. This is obtained by chemical etching of the part of the oxide layer 52 located on the right part of the figure. After this etching, the tip-type structure 65 is released and forms an overhang above the support 51. It should be noted that the outlet channel 64 always comprises the ground 66. An electrical isolation step is then carried out on the fluidic network . This is obtained by a thermal oxidation of 3 ⁇ m in thickness of the silicon of the thin layer 53.
  • the support 51 of silicon must not be oxidized otherwise the tip-type structure 65 would no longer be overhanging.
  • This thermal oxidation step is necessary to electrically isolate the liquid present in the fluid network from the outside. This electrical isolation is necessary, for example, when electroosmotic pumping is used or when separation by electrophoresis or an electrochemical reaction is present in the fluid network.
  • the next step is to clear the electrical contacts. To release the electrodes (the ends 58 and 59) and the contact pickups (the zones 54 and 56), it is necessary to locally etch the layer of thermal Si0 2 (3 ⁇ m) produced previously. This step can be carried out by a laser engraving technique offered by the NovaLase Company in Pessac (Gironde, France). To obtain the on-chip laboratory according to the invention, the support 51 is cleaved as shown in FIG. 6D to release the structure of the tip type 65.
  • Second embodiment closure of the device described in the first embodiment by a structured pyrex cover. According to this embodiment, the device
  • the cover plate 71 has an end portion 72 overhanging so that the plate 71 does not cover the point-like structure 65. It also includes a through hole 73 intended to ensure fluid communication with the inlet tank 61 of the device 70.
  • the cover plate 71 can be a pyrex substrate, for example that available under the reference Corning 7740.
  • FIGS. 8A to 8D This embodiment is illustrated by FIGS. 8A to 8D. It uses only one SOI substrate.
  • FIG. 8A shows an SOI substrate 80 consisting of a support 81 of 500 ⁇ m thick silicon, successively supporting a layer of silicon oxide 82 1 ⁇ m thick and a thin layer 83 of 25 ⁇ m silicon d 'thickness.
  • FIG. 8B illustrates the construction of the fluid network in the thin layer 83.
  • the fluid network is obtained by DRIE etching.
  • the etching of the upper silicon layer 83 is: either partial in order to preserve a
  • the fluid network produced comprises an inlet tank 91, an inlet channel 92, a microreactor 93 and an outlet channel 94.
  • the etching of the thin layer 83 also defines the tip-like structure 95.
  • the tip-like structure 95 is then released by total chemical etching of the part of the oxide layer 82 which has been revealed by the etching of the layer 83 and also of that which is under the structure of type tip 95 (see FIG. 8C).
  • An electrical isolation step is then carried out on the fluid network. This is obtained by thermal oxidation of 3 ⁇ m in thickness of the silicon of the thin layer 83. Then, by "lifting-off" of metal, the contact pick-ups 84 and 86 are made, the electrodes
  • the support 81 can then be cleaved to release the pointed structure 95.
  • the substrate 100 having a face 102 on which are made, by localized doping, two electrically conductive circuits.
  • the first conductive circuit is formed zones 104 and 105 and the second conductive circuit is formed by zones 106 and 107.
  • the substrate 100 then undergoes, from the face 102, an RIE etching (for "Reactive Ion Etching") or a chemical etching by means of KOH to obtain a recess 101 in anticipation of the tip-like structure and of the cleavage of the substrate (see FIG. 9B).
  • Another silicon substrate 110 is then fixed by direct sealing on the face 102 of the substrate 100 (see FIG. 9C).
  • the substrate 110 is then thinned until a thin layer 111 is obtained (see FIG. 9D).
  • the fluid network is then produced as shown in FIG.
  • the thin layer 111 partially or totally undergoes DRIE etching.
  • the fluid network includes an inlet reservoir 121, an inlet channel 122, a microreactor 123 and an outlet channel 124.
  • the etching of the thin layer 111 also defines the tip-like structure 125.
  • a step of electrical isolation of the fluid network is then carried out. This is achieved by thermal oxidation.
  • the purpose of the next step is to clear the contact pickups 104 and 106 (see Figure 9F). For this it is necessary to locally etch the thin layer 111 and the thermal oxide. This step can be carried out by a laser engraving technique.
  • Step 9G represents the direct sealing of a cover plate 131 on the thin layer 111.
  • the cover plate 131 comprises a part d end 132 overhanging so that the plate 131 does not cover the point-like structure 125. It also has a through hole 133 intended to ensure fluid communication with the inlet reservoir 121.
  • the covering plate 131 may be a substrate pyrex.
  • This embodiment uses an SOI substrate and a pyrex substrate (“Corning” 7740) as a cover.
  • the electrodes, the conductive tracks and the electrical contact pick-ups are produced by depositing metal (aluminum, platinum, gold, etc.) and photolithography on the underside of the pyrex cover, in which they are "embedded”.
  • FIG. 10A shows an SOI substrate 140 consisting of a support 141 made of silicon 500 ⁇ m thick, successively supporting a layer of silicon oxide 142 1 ⁇ m thick and a thin layer 143 of silicon 25 ⁇ m thick.
  • FIG. 10B shows the device obtained after a step of DRIE etching of the thin layer 143. The etching makes it possible to produce the fluid network.
  • This comprises an inlet reservoir 151, an inlet channel 152, a microreactor 153 and an outlet channel 154.
  • the etching of the thin layer 143 is also carried out on two edges of the substrate 140 until the layer is revealed of oxide 142. It makes it possible to define the structure of the tip type 155.
  • This etching step is conventional in microtechnology. She uses a 5000 ⁇ thick silicon oxide mask produced in an oven at 1050 ° C in a humid atmosphere. A 1.3 ⁇ m layer of “Shipley S 1813 SP15” photosensitive resin is then spread on “SVG” track (adhesion promoter: HMDS vapor). The IX motifs are exposed, then developed with “Shipley MIF 310” on the “SVG” track. The oxide mask can then be engraved in RIE
  • FIG. 10C which shows the point-like structure 155 overhanging. This figure also shows that the oxide, previously revealed on the other edge of the substrate 140, was eliminated during the etching to reveal the edge 144 of the support 141.
  • electrical isolation from the network fluidics is obtained by thermal oxidation. This oxidation takes place in an oven at 1150 ° C in a humid atmosphere.
  • FIG. 10D represents the direct sealing of a covering plate 161 on the thin layer 143.
  • the covering plate 161 has an end portion 162 overhanging so that the plate 161 does not cover the point-like structure 155. It also includes a through hole 163 intended to ensure fluid communication with the inlet reservoir 151.
  • the cover plate 161 may be a pyrex substrate.
  • the plate 161 comprises, on the face intended to come into contact with the thin layer 143, a metal track 164 arranged so that its internal end 165 serves as an electrode for the outlet channel 154 and that its external end 166 serves as an electrical contact resumption.
  • This direct sealing step is carried out at 400 ° C.
  • the structure of the pyrex cover (engraving and "inlaying" of the metal track) is done according to the following technological stages: • Realization of the engravings for obviously cutting and "box for metal track”: - Cr / Au / Cr / Au deposit (50 A / 3000 ⁇ / 50 ⁇ / 3000 ⁇ ), spreading of photosensitive resin "Shipley S 1813 SP15" on track “SVG", thickness 1, 3 ⁇ m, - exposure of IX patterns and cutout recess, - development on track "SVG” with the developer "Shipley MIF 319", - KI / I 2 etching, - Cr etching with the solution called “Cr Etch”, - removal of the resin by “stripping” using "Posistrip” or HNO 3 fuming, spreading of photosensitive resin "Shipley S 1813 SP15” on track “SVG", thickness 1.3 ⁇ m, exposure of patterns IX ⁇ recess cutout and metal track box ', - development on “S
  • FIG. 11A shows a first silicon substrate 170 having a recess 171 in anticipation of the tip type structure and of the cleavage of this substrate.
  • the recess is obtained by RIE, DRIE or KOH engraving.
  • FIG. 11B shows that a second silicon substrate 180 has been fixed to the etched face of the substrate 170. This fixing has been obtained by direct sealing.
  • FIG. 11C shows that the second substrate has been thinned to give a thin layer 181 of silicon.
  • the fluid network is then produced as shown in FIG. 11D. During this step, the thin layer 181 undergoes DRIE etching.
  • the fluid network includes an inlet tank 191, an inlet channel 192, a microreactor 193 and an outlet channel 194.
  • the etching of the thin layer 181 also defines the tip-like structure 195 and makes it possible to reveal the edge 184 of the substrate 170.
  • an electrical isolation step is then carried out on the fluid network. This is achieved by thermal oxidation.
  • FIG. 11E represents the direct sealing of a covering plate 201 on the thin layer 181.
  • the covering plate 201 has an end portion 202 overhanging so that the plate 201 does not cover the point-like structure 195. It also includes a through hole 203 intended to ensure fluid communication with the inlet tank 191.
  • the cover plate 201 may be a pyrex substrate.
  • the plate 201 comprises, on the face intended to come into contact with the thin layer 181, a metal track 204 arranged so that its internal end 205 serves as an electrode for the outlet channel 194 and that its external end 206 serves as an electrical contact resumption.
  • FIG. 12 shows how all of the “fluid network and electrospray nose” devices 211 can be distributed on a circular substrate 210 in order to have a single object with N microfluidic devices, thus facilitating use "high speed” analyzes.
  • the fluidic networks are drawn radially, along the radii of the circular substrate 210.
  • N nose of electrospray are then distributed according to the circumference of the substrate, and it suffices to rotate it manually or automatically to carry out a sequence in mass spectrometer series 212.
  • the substrate support can be mounted on a rotary axis. The preparation of the samples can be carried out beforehand in parallel on the N devices.
  • ElectroSpray Ionization As an example, we can cite the analysis of samples in the biomedical and pharmaceutical industries: - genetic, proteomic analyzes (identification of proteins, etc.), - drug development.

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Abstract

L'invention concerne un laboratoire sur puce comprenant un réseau fluidique réalisé dans un substrat, un orifice d'entrée de fluide relié au réseau fluidique et un orifice de sortie de fluide relié au réseau fluidique. Le substrat comprend une couche plane (53) dans laquelle sont réalisés le réseau fluidique et un nez d'électronébulisation (65), le nez d'électronébulisation étant en surplomb par rapport au reste du substrat (51, 52) et comprenant un canal (64) dont une extrémité est reliée au réseau fluidique et dont l'autre extrémité constitue ledit orifice de sortie de fluide, le canal étant équipé de moyens de conduction électrique (59) formant au moins une électrode.

Description

LABORATOIRE SUR PUCE COMPRENANT UN RESEAU MICRO- FLUIDIQUE ET UN NEZ D'ELECTRONEBULISATION COPLANAIRES
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE L'invention se rapporte à un laboratoire sur puce comprenant un réseau micro-fluidique et un nez d'électronébulisation coplanaires. Elle concerne en particulier le couplage d'un laboratoire sur puce avec un spectromètre de masse. Depuis bientôt dix ans, de nombreuses voies ont été explorées pour coupler différents dispositifs micro-fluidiques aux spectromètres de masse. En effet, les méthodes de détection optiques comme la spectrophotométrie ou la fluorescence ne sont pas adaptées à la détection de biomolécules comme les protéines ou les peptides, détection qui intéresse particulièrement le domaine de la protéomique. Les limites sont soit la sensibilité, soit la nécessité de préparer l'échantillon (marquage fluorescent), ce qui, dans le cas de l'identification de protéines après digestion enzymatique par exemple, présente un problème puisque les peptides obtenus ne sont a priori pas connus. La spectrométrie de masse est donc souvent retenue puisqu'elle donne des informations sur la nature des échantillons analysés (spectre d'intensité selon le rapport masse/charge) avec une très bonne sensibilité (femtomole/μl) , et qu'elle permet d' analyser des mélanges complexes de molécules . Pour cela, il est souvent nécessaire qu'un pré-traitement de l'échantillon soit réalisé en amont de l'analyse. Par exemple, ce pré-traitement consiste en une séparation des composés chimiques et/ou biologique, précédée et/ou suivie d'une concentration des espèces. Pour réaliser ce pré-traitement en continu avec l'analyse en un temps minimum et en minimisant les volumes de réactifs utilisés, les progrès récemment réalisés dans le domaine de la micro-fluidique peuvent être mis à profit. A titre d'exemples, des dispositifs micro-fluidiques de digestion enzymatique (Lian Ji Jin, "A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping", Lab Chip, 2003, 3, 11-18) , d' électrophorèse capillaire (B. Zhang et al., " Microfabricated Devices for Capillary Electrophoresis-Electrospray Mass Spectrometry", Anal. Chem., vol. 71, n°15, 1999, 3259-3264) ou de séparation 2D (J.D. Ramsey, "High-efficiency Two dimensional Séparations of Protein Digests on icrofluidic Devices", Anal. Chem., 2003, 75, 3758-3764 ou N. Gottschlich et al., "Two-Dimentional Electrochromatography / Capillary Electrophoresis on a Microchip", Anal. Chem.2001, 73, 2669-2674) ont déjà été présentés. Le couplage microfluidique / spectrométrie de masse peut reposer sur une technique d'ionisation de l'échantillon par electronebulisation ou électrospray (ou ESI pour ElectroSpray Ionization) . A pression atmosphérique et plongé dans d'un champ électrique intense, l'échantillon liquide pré-traité sortant de la puce micro-fluidique est nébulisé en un gaz d'ions ou en une multitudes de gouttelettes chargées pouvant entrer dans le spectromètre de masse (MS) pour analyse. Cette nébulisation passe par la déformation de l'interface formée entre le liquide sortant et le gaz environnant (ménisque liquide/gaz) et la « goutte » de liquide prend une forme conique appelée « cône de Taylor ». Le volume de ce cône constitue un volume mort pour le liquide sortant (espace géométrique dans lequel les composés chimiques peuvent se mélanger) , ce qui n'est pas souhaitable, surtout quand la dernière étape du pré-traitement consiste justement en une séparation des composés chimiques de l'échantillon. C'est pourquoi on cherche toujours à minimiser la taille de ce cône, et cela passe entre autres par la réduction des dimensions intérieures et extérieures du canal de sortie de la puce micro-fluidique. Classiquement, au cours d'une analyse par spectrométrie de masse, l'échantillon est pré-traité « hors dispositif ESI » puis placé manuellement (à la pipette) dans une aiguille creuse dont l'extrémité est électriquement conductrice (« PicoTip emitter » de New Objective par exemple) . Un champ électrique est imposé entre la partie conductrice du PicoTip et l'entrée du MS, ce qui permet la formation d'un cône de Taylor à la sortie du PicoTip et la nébulisation de l'échantillon. La géométrie cylindrique « pointue » des PicoTip est idéale pour la formation d'un petit cône de Taylor, mais les limites sur la minimisation de leur taille (classiquement de diamètre extérieur 360 μm et de diamètre intérieur 10 μm) , celles sur l'obtention d'une bonne reproductibilité par les techniques de fabrication utilisées (étirement) et leur fragilité à l'utilisation sont les principales raisons pour chercher à réaliser d'autres types de dispositifs de nébulisation. Dans la littérature, lorsque ces dispositifs sont élaborés par des micro-technologies comme les technologies planes du silicium par exemple (gravure, usinages, dépôts en couches minces et photolithographie de matériaux divers sur des substrats présentant des dimensions latérales très grandes devant leur épaisseur) , on parle souvent de « nez electrospray » (Tai et al., "MEMS electrospray nozzle for mass spectroscopy", WO-A-98/35376) . L'enjeu de telles réalisations est double. D'une part, les micro-technologies peuvent permettre de réaliser des interfaces ESI en définissant des structures de type pointe (comme les PicoTips) mais plus petites (pour limiter le volume du cône de Taylor) , plus reproductibles et moins fragiles, ce qui présente un intérêt en soi (voir le document WO-A- 00/30167) . D'autre part, les micro-technologies peuvent permettre de réaliser des dispositifs intégrant un réseau fluidique permettant d'assurer le prétraitement de l'échantillon et une interface de type ESI. Outre les avantages précédemment cités (diminution des volumes morts de sortie, reproductibilité, robustesse de l'interface ESI), on bénéficie de ceux liés à un dispositif de pré-traitement intégré (protocole de pré-traitement en continu avec l'analyse, diminution des temps globaux d'analyse, minimisation des volumes de réactifs) . Néanmoins, une telle intégration pose trois problèmes majeurs de conception technologique : Premièrement, la technologie de réalisation du dispositif doit être compatible avec celle d'un réseau fluidique de pré-traitement (réservoirs, micro-canaux, réacteurs...) et d'une interface ESI (géométrie en pointes, dimensions de sortie minimales...) , et ce', pour permettre de réaliser le dispositif complet sur un même support ou un même ensemble de supports voyant un enchaînement technologique commun aux deux entités intégrées. - En second lieu, elle doit être pensée pour ne pas rajouter de volume mort supplémentaire à ceux qui pourraient exister dans le réseau fluidique de pré-traitement et dans l'interface ESI pris séparément. - Enfin, elle doit fournir à l'interface ESI une électrode de nébulisation sans ajouter de volume mort au système. Cette électrode de nébulisation peut être localisée soit à l'extérieur de la structure en pointe (M. Svederberg et al., "Sheathless Electrospray from Polymer Microchips", Anal. Chem., 2003, 75, 3934-3940), soit à l'intérieur du canal de sortie et à proximité de la sorte du dispositif. Dans le premier cas, un champ électrique est imposé uniquement à l'extérieur du dispositif, dans la portion d'air (ou d'un autre gaz) située entre l'extrémité de la pointe et l'entrée du MS . Dans le second cas, un champ électrique existe aussi à l'intérieur du dispositif, dans le segment de liquide situé entre l'électrode et l'extrémité de la pointe. Pour l'implantation d'une électrode externe, il est souvent rapporté (R.B. Cole, "Electrospray ionization mass spectrometry : fundamentals, instrumention and applications", John iley & Sons : New York, 1997) qu'une difficulté majeure est de lui assurer une robustesse suffisante. En effet, les dépôts conducteurs réalisés à cet effet se dégradent très souvent trop rapidement sous l'action des champs électriques intenses .
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
Dès 1997, R.S. Ramsey et J.M. Ramsey, ("Generating Electrospray from Microchip Devices Using Electroosmotic Pumping", Anal. Chem., 1997, 69, 1174- 1178) ont proposé une puce microfluidique en verre dont les flux de liquide sont générés par pompage électro- osmotique et dont le canal de sortie débouche dans la tranche du composant à géométrie plane. Sous l'assistance d'une surpression imposée en amont, il se forme en sortie de puce une goutte d'échantillon de 12 ni, qui, sous l'action d'un champ électrique intense, forme un cône de Taylor en se nébulisant. Cette approche simple pose le problème d'un volume mort de liquide important (12 ni), d'où une limite de sensibilité du dispositif. Plus récemment, K. Huikko et al. ("Poly (dimethylsiloxane) electrospray devices fabricated with diamond-like- carbon- poly (dimethylsiloxane) coated SU-8 masters", Lab Chip,
2003, 3, 67-72) ont proposé une puce en poly (dimethylsiloxane) (PDMS) présentant elle aussi des canaux débouchants destinés à être mis en regard d'un MS pour nébulisation de l'échantillon. Les auteurs tirent profit de l' hydrophobie du PDMS pour l'obtention d'un petit cône de Taylor d'où la limitation du volume mort de sortie. Néanmoins, le dispositif proposé n'intègre pas d'électrode de nébulisation. Les tests sont réalisés en utilisant un fil de platine plongeant dans le réservoir d'entrée du canal de l'ΞSI, ce qui ne peut pas constituer une bonne solution, c'est-à-dire sans ajout de volume mort, pour une éventuelle intégration à un réseau fluidique de pré-traitement. Par ailleurs, la technologie PDMS reste une technologie limitée qui ne permet pas encore la conception de réseaux micro-fluidiques complexes et de taille caractéristique de l'ordre du micromètre. Ceci impose une forte limitation quant au dessin des entités micro- fluidiques nécessaires aux pré-traitements d'échantillons (concentration, séparation...). M.Svederberg et al. ("Sheathless Electrospray from Polymer Microchips", Anal. Chem.,
2003, 75, 3934-3940) proposent des dispositifs en polymère qui présentent des géométries très intéressantes pour la réalisation de nez électrospray (pointes 2D ou 3D) mais les dimensions du canal de sortie (1O0 μm de largeur X 70 μm de hauteur) obtenues par leur technologie d'usinage sont redhibitoires pour la réalisation d'un dispositif à faibles volumes morts.
En effet, on rappelle que le diamètre de sortie d'un
PicoTip est de seulement 10 μm. En outre, l'utilisation de matériaux polymères impose de fortes limites quant à d'éventuelles fonctionnalisations chimiques ou biologiques des parois internes du canal de sortie ou d'un éventuel réseau fluidique de pré-traitement d'échantillon. En effet, jusqu'à maintenant, la plupart de ces fonctionnalisations ont été développées sur silicium ou sur verre. Par ailleurs, la technologie de fabrication proposée n'est pas collective et l'électrode de nébulisation est réalisée sur la partie extérieure de la pointe d'ESI. V. Gobry et al. ( "Microfabricated polymer injector for direct mass spectrometry coupling",
Proteomics 2002, 2, 405-412), J. Kameoka et al. ("An electrospray ionization source for intégration with microfluidic", Anal. Chem. 2002, 74, 5897-5901) et J.
Wen et al. (Electrophoresis 2000, 21, 191-197) proposent aussi la réalisation de nez électrospray en matériaux polymères à géométrie bidimensionnelle adaptée à la formation d'un cône de Taylor stable et limitant les volumes morts . Mais la technologie utilisée ne propose pas l'intégration d'une électrode de nébulisation. Les tests sont réalisés à l'aide d'un fil d'or plongeant dans un réservoir d'entrée du dispositif. Une autre approche consiste en l'adaptation de la sortie du canal de séparation pour permettre d'accueillir un PicoTip du commerce (Y. Tachibana et al., "Robust and simple interface for microchip electrophoresis-mass spectrometry", J. of Chromatography, 1011 (2003), 181-192). Cela passe par l'utilisation d'une pièce métallique et/ou plastique jouant un rôle de liaison dans l'assemblage des deux entités. Ce genre d'assemblage présente des volumes morts importants et ne résout pas le problème de l'utilisation des PicoTips du commerce présentant une certaine irreproductibilité en dimensions et une grande fragilité à l'utilisation. Deux documents d'une équipe du « California Institute Of Technology » peuvent aussi être cités : Tai et al., "MEMS electrospray nozzle for mass spe'ctroscopy", O-A-98/35376 et Tai et al., "Polymer- based electrospray nozzle for mass spectrometry", WO-A-00/30167. Les technologies revendiquées pour réaliser un nez électrospray muni d'un filtre amont sont des technologies de surface permettant de réaliser des structures creuses dans du nitrure de silicium dans le premier cas et dans du parylène dans le second. Ces technologies de surface reposent sur l'utilisation d'une couche sacrificielle (en verre au phosphosilicate PSG), qui comme son nom l'indique, n'est pas conservée jusqu'à la fin de l'enchaînement technologique. Le retrait de cette couche, réalisée par gravure chimique, détermine les structures creuses. D'un point de vue géométrique, ces technologies sont intéressantes (formes en pointes du nez) , mais elles ne proposent pas l'intégration d'électrodes de nébulisation et les auteurs utilisent la voie classique du fil de platine plongeant dans un réservoir d'entrée pour tester leur système, ce qui est rédhibitoire pour l'obtention d'un système fluidique complet (pré-traitement et nez électrospray) à faibles volumes morts. Enfin, J.E. Moon et al. dans le brevet américain No. 6 464 866 revendiquent un système d' analyse chimique fabriqué par microtechnologie à partir de deux substrats , de préférence en silicium, et comprenant un système de chromatographie liquide et un dispositif d' électrospray . Le dispositif divulgué dans ce document comporte une pointe du nez électrospray perpendiculaire au plan des substrats utilisés . Cette disposition n ' évite donc pas les volumes morts dus aux changements de direction .
EXPOSE DE L' INVENTION La prés ente invention propose un dispositif micro-fluidique permettant divers traitements d' échantillons et disposant d' une bonne interface avec un spectromètre de masse de type ESI , ce qui nécessite : - Une technologie de réalisation compatible avec celle d' un réseau fluidique de pré-traitement (réservoirs , micro-canaux, réacteurs...) et d' une interface ESI en sortie (géométrie en pointes , dimensions de sortie minimales...) , et ce, pour permettre de réaliser le dispositif complet sur un même support ou un même ensemble de supports voyant un enchaînement technologique commun aux deux entités intégrées . - Une conception d' intégration sans volumes morts . L' intégration d' une électrode de nébulisation à l' intérieur du canal de sortie et en proximité de la sortie du dispositif . L ' invention a donc pour obj et un laboratoire sur puce comprenant un support , au moins un réseau fluidique, au moins un orifice d'entrée de fluide relié au réseau fluidique et au moins un orifice de sortie de fluide relié au réseau fluidique, une couche mince solidaire du support et dans laquelle sont réalisés le réseau fluidique et un nez d'électronébulisation, le nez d'électronébulisation étant en surplomb par rapport au support et comprenant un canal dont une extrémité est reliée au réseau fluidique et dont l'autre extrémité constitue ledit orifice de sortie de fluide, le canal étant équipé de moyens de conduction électrique formant au moins une électrode, caractérisé en ce que la couche mince est une couche fixée par scellement direct sur le support. La face arrière du support, c'est-à-dire celle qui ne supporte pas la couche mince, peut avantageusement être de nature inerte. Elle ne participe alors pas au fonctionnement du dispositif. En particulier, elle ne présente alors pas de connexion électrique . Si le support est en matériau semiconducteur, les moyens de conduction électrique peuvent être une partie dopée dudit support. Le support peut être en matériau conducteur. Ce laboratoire peut comprendre un capot recouvrant hermétiquement le réseau fluidique, ce capot étant pourvu d'un moyen d'accès fluidique à l'orifice d'entrée de fluide. Selon une autre disposition, le laboratoire sur puce peut comprendre un capot recouvrant hermétiquement le réseau fluidique, ce capot étant pourvu d'un moyen d'accès fluidique à l'orifice d'entrée de fluide et étant pourvu desdits moyens de conduction électrique. Le capot peut être en matériau conducteur. Il peut être en matériau semiconducteur, les moyens de conduction électrique pouvant alors comprendre une partie dopée du capot. L'utilisation d'un capot permet de rendre le réseau fluidique étanche . Les moyens de conduction électrique peuvent donc se situer tant dans le support que dans le capot et peuvent être réalisés soit par le support ou le capot en matériau conducteur, soit par des piste métalliques déposées sur le support ou le capot isolant, soit être des parties dopées du support ou du capot en matériau semiconducteur.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages et particularités apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre d'exemple non limitatif, accompagnée des dessins annexés parmi lesquels : la figure 1 est un schéma d'un laboratoire sur puce selon la présente invention, - la figure 2 représente la structure
COMOSS d'un réacteur de digestion enzymatique utilisé dans le laboratoire sur puce de la figure 1, la figure 2A. montre un détail de la figure 2, la figure 3 représente la structure COMOSS d'un réacteur de pré-concentration utilisé dans le laboratoire sur puce de la figure 1, la figure 3A montre un détail de la figure 3, la figure 4 représente la structure COMOSS d'un réacteur de chromatographie utilisé dans le laboratoire sur puce de la figure 1, la figure 4A montre un détail de la figure 4, - la figure 5 est une vue agrandie d'un détail de la figure 1 montrant l'interface ESI, - les figures 6A à 6D illustrent un premier mode de réalisation d'un laboratoire sur puce selon la présente invention, les figures 7A et 7B, illustrent un deuxième mode de réalisation d'un laboratoire sur puce selon la présente invention, les figures 8A à 8D illustrent un troisième mode de réalisation d'un laboratoire sur puce selon la présente invention, les figures 9A à 9H illustrent un quatrième mode de réalisation d'un laboratoire sur puce selon la présente invention, - les figures 10A et 10E illustrent un cinquième mode de réalisation d'un laboratoire sur puce selon la présente invention, les figures 11A à 11F illustrent un sixième mode de réalisation d'un laboratoire sur puce selon la présente invention, - la figure 12 illustre une vue de dessus d'un substrat comprenant une pluralité de dispositifs selon la présente invention.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
La figure 1 est un schéma d'un laboratoire sur puce 1 selon la présente invention. Ce dispositif peut avoir 18 mm de longueur sur 5 mm de largeur.
Le réseau fluidique On décrit d'abord le réseau fluidique destiné à préparer un échantillon biologique complexe afin d'en identifier le contenu protéique. Ce réseau fluidique est constitué d'un ensemble de réservoirs et de canaux, d'un réacteur de digestion, enzymatique, d'un réacteur de pré-concentration et d'un réacteur de séparation par électro-chromatograjphie liquide. La structure de base de tous ces réacteurs est une cavité profonde munie d'un grand nombre de plots de section carrée ou hexagonale ...Ce genre de structure est connue sous le nom de COMOSS (pour "Collocated MOnolith Support Structures") . On peut se référer à ce sujet à l'article de Bing He et al. intitulé "Fabrication of nanocolumns for liquid chromatography", Anal. Chem. 1998, 70, 3790-3797. Pour tous les réacteurs, on tire avantage des grands rapports surface;/volume développés par ces structures COMOSS, rapports qui augmentent les probabilités de « rencontre » entre les molécules des phases mobiles (protéines par exemple pour le réacteur de digestion enzymatique) et celles des phases stationnaires (trypsine par exemple pour le réacteur de digestion enzymatique) . Après pré-remplissage complet du réseau fluidique par du tampon, l'échantillon biologique (protéine) est déposé dans le réservoir RI, puis pompé en électroosmose du réservoir RI vers le réservoir R2 à travers le réacteur de digestion enzymatique 2 . Des réservoirs de grands volumes sont disposés entre les différents réacteurs du réseau fluidique afin de permettre un changement de tampon entre deux étapes consécutives du protocole. Ainsi, RI contient du bicarbonate d'ammonium ( [NH4HCO3] =25 mM; pH = 7,8), R2, R3 et R4 contiennent un mélange eau/acétonitrile ACN/acide formique TFA (95% ; 5% ; 0,1%), tandis que R5 contient un mélange eau/acétonitrile/acide formique (20% ; 80% ; 0,1%) . Le digest récupéré dans le réservoir R2 doit être concentré avant séparation. Pour cela, il est pompé en électro-osmose vers le réservoir R3 (poubelle). L'ensemble des peptides résultant de la digestion enzymatique est alors « capté » par le réacteur de pré-concentration 3 de faible volume, d'où la concentration. Un gradient d' acétonitrile, réalisé par mélange du tampon de R4 et de celui de R5 dans la structure 4 de type « serpentin » (2cm de longueur) , vient ensuite décrocher sélectivement les peptides selon leur affinité avec la phase stationnaire (C18 par exemple) du réacteur de pré-concentration 3 . Ceux-ci sont « captés » de nouveau par la colonne de chromatographie 5 , plus dense que le réacteur de pré- concentration 3. L'enrichissement du mélange en ACN permet de nouveau de décrocher sélectivement ces peptides de la colonne de chromatographie 5 , et de les emmener, séparés, vers la sortie 6 de la puce 1 où le liquide est nébulisé vers l'entrée d'un spectromètre de masse non représenté. Un réacteur d' affinité à une protéine donnée (non représenté) peut servir à capter celle-ci dans un mélange mutli-protéique véhiculé à travers ce réacteur. Pour cela, on peut intégrer en amont du réseau fluidique décrit ci-dessus un ensemble réservoirs/réacteur d'affinité/réacteur de concentration fonctionnant selon les mêmes principes fluidiques que précédemment décrit . Le réacteur d'affinité peut être fonctionnalisé d'anticorps et le tampon d'élution peut être constitué de protéines concurrentes (vis-à-vis de l'anticorps) à celle qu'on souhaite « capter » dans le complexe multi-protéique .
S le réacteur d'affinité amont De structure COMOSS, il est destiné à capter de manière spécifique une protéine, une famille de protéines, ou un complexe multi-protéique dans l'échantillon biologique complexe. Les outils utilisés pour cette étape peuvent être des anticorps, mais aussi par exemple des petites molécules qui ont une spécificité d'interaction avec la (les) protéine (s) recherchée (s) .
S le réacteur de digestion enzymatique La structure COMOSS du réacteur de digestion enzymatique, représenté à la figure 2, est réalisée à partir d'un ensemble de plots de section hexagonale de 10 μm permettant de définir un réseau de canaux d'environ 5 μm. Sa largeur utile a est constante (640 μm) , mais sa largeur réelle b fait 892 μm . La longueur c de la partie active du réacteur fait 15 mm. Ses autres caractéristiques géométriques, à lire en parallèle avec la figure 2, sont décrites dans le tableau suivant :
Cette structure permet éventuellement d'organiser des « billes » de silice de quelques micromètres (Billes Bangs Laboratories distribuées par Serotec France par exemple) fonctionnalisées (Trypsine par exemple) afin d'apporter au réacteur ses propriétés enzymatiques ou de les accroître. A titre d'exemple, l'enzyme greffée sur les plots peut être de la trypsine. Le protocole utilisé est celui décrit dans le document FR-A-2 818 662. La figure 2A montre un détail de la zone du réacteur référencée 11 sur la figure 2. On reconnaît les plots 12 de section hexagonale permettant de définir le réseau de canaux 13. La référence 14 désigne des billes de silice éventuellement utilisées. le réacteur de pré-concentration La structure COMOSS du réacteur de pré- concentration, représenté à la figure 3, est réalisée à partir d'un ensemble de plots de section carrée de 10 μm permettant de définir un réseau de canaux d'environ 2 μm. Sa largeur utile d est constante (160 μm) , mais sa largeur réelle e fait 310 μm. La longueur f de la partie active du réacteur fait 170 μm . Ses autres caractéristiques géométriques, à lire en parallèle avec la figure 3, sont décrites dans le tableau suivant :
Cette structure permet éventuellement d'organiser des billes de silice fonctionnalisées afin d' apporter au réacteur ou d' en ac croître ses propriétés d' affinité (greffage C18 par exeπvg- le) . La figure 3A montre un détail de la zone du réacteur référencée 21 sur la figure 3 . On reconnaît les plots 22 de section carrée pe rmettant de définir le réseau de canaux 23 . le réacteur de séparation par électro- chromatographie liquide La structure COMOSS du réacteur de séparation, représenté à la figuire 4, est réalisée à partir d'un ensemble de plots de section carrée de 10 μm permettant de définir u_n réseau de canaux d'environ 2 μm. Sa largeur utile g est constante (160 μm) , mais sa largeur h réelle fait 310 μm. La longueur i de la partie active dτ_ι réacteur fait 12 mm. Ses autres caractéristiques géométriques, à lire en parallèle avec la figure 4, sont décrites dans le tableau suivant :
Pour un gain de place, le réacteur peut être réalisé en trois parties de 12 mm de longueur chacune comme le montre la figure 1. Cette structure permet éventuellement d' organiser des billes de silice fonctionnalisées afin d' apporter au réacteur ou d' en accroître ses propriétés d'affinité (greffage C18 par exemple). La figure 4A montre un détail de la zone du réacteur référencée 31 sur la figure 4. On reconnaît les plots 32 de section carrée permettant de définir le réseau de canaux 33.
Interface ESI La figure 5 est une vue agrandie de la sortie de la puce, référencée 6 sur la figure 1. Le canal de sortie 40 est planaire et d'axe rectiligne par rapport au réseau fluidique. En d'autres termes, le canal de sortie 40 reste parallèle aux plans des différents substrats utilisés pour la réalisation. Cette configuration évite les volumes morts que pourrait occasionner le parcours partiel ou total de l'épaisseur de l'un ou de plusieurs de ces substrats, après avoir parcouru une portion parallèle aux plans de ces substrats. On évite ainsi tout virage, ce qui comme il a été souligné précédemment est primordial, notamment pour véhiculer des échantillons antérieurement séparés. La section du canal de sortie 40 peut être adaptée en travaillant préférentiellement sur les cotes transversales (dans le plan du substrat) de celui-ci, ce qui donne la possibilité de réaliser « des restrictions douces » évitant les volumes morts. Sur la figure 5, ces propos sont illustrés par l'existence d'un « raccord » 41 entre la sortie du canal du réacteur de chromatographie 5 et le canal de sortie 40. Une telle restriction est indispensable pour raccorder des structures fluidiques de « grosses » dimensions (« gros » volumes, « grosse » capacité d'affinité par exemple...) à une structure du type interface ESI pour qui, comme on l'a souligné précédemment, il est souhaitable de minimiser la surface de sortie en atteignant typiquement des dimensions de l'ordre du micromètre à quelques micromètres. En bout de dispositif, le canal de sortie 40 débouche dans une structure de type pointe 42, structure à section extérieure variable permettant de limiter la surface des interfaces liquide / gaz et liquide / solide présentée par le liquide sortant avec son environnement, grâce à son extrémité de faibles sections intérieures et extérieures, tout en conservation une robustesse lors de son utilisation grâce à son extrémité de large section. Enfin, l'intérieur du canal de sortie 40 est muni d'une électrode 43 permettant d'imposer un potentiel électrique au liquide se présentant à la sortie du dispositif, ce qui est nécessaire pour nébuliser l'échantillon (stabilité du cône de Taylor) et/ou participer à son pompage électroosmotique . L'ensemble de ces éléments fournit une interface ESI plane complète, puisque robuste, sans volumes morts de raccordement aux réseaux fluidiques et permettant la naissance d'une cône de Taylor de bonne stabilité . On va maintenant décrire différents modes de réalisation du dispositif microfluidique muni d'une structure d'électronébulisation selon l'invention. Seul le mode de réalisation préféré, le cinquième, sera décrit en détail. Pour plus de clarté, ces descriptions sont faites à l'échelle d'une puce (un dispositif), mais les différentes filières technologiques sont réalisées sur des substrats pouvant comporter plusieurs dispositifs
(substrats circulaires de 100 mm par exemple) . Dans ces descriptions, le réseau fluidique est simplifié et réduit à un réservoir d'entrée, un canal d'entrée, un microréacteur et un canal de sortie à section constante débouchant dans la structure de type pointe. L'homme de l'art dessinera le réseau fluidique qu'il souhaite, par exemple celui décrit précédemment .
Premier mode de réalisation Ce mode de réalisation est illustré par les figures 6A à 6D. Il n'utilise qu'un seul substrat SOI. De tels substrats sont commercialisés par la société « Soitec ». Les électrodes, les pistes conductrices et les reprises de contact électrique sont réalisées en une seule étape de dopage localisé du silicium. La figure 6A montre un substrat SOI 50 constitué d'un support 51 en silicium de 500 μm d'épaisseur, supportant successivement une couche d'oxyde de silicium 52 de 4 μm d'épaisseur et une couche mince 53 de silicium de 25 μm d'épaisseur. La couche mince 53 est dopée localement pour fournir un premier circuit électriquement conducteur formé des zones 54 et 55 et un deuxième circuit électriquement conducteur formé des zones 56 et 57. Le dopage de la couche mince de silicium 53 est réalisé à travers un masque de résine photosensible (ou d'oxyde de silicium) sur l'intégralité de l'épaisseur de cette couche. La figure 6B illustre la réalisation du réseau fluidique dans la couche mince 53. Le réseau fluidique est obtenu par gravure DRIE (pour « Deep Reactive Ion Etching ») . La gravure de la couche mince de silicium
53 est partielle (20 μm) dans la partie destinée à constituer le réseau fluidique afin de conserver une portion de piste de silicium dopé (5 μm) au fond de certaines zones du réseau fluidique (en particulier près de sa sortie pour réaliser l'électrode de nébulisation) . Le réseau fluidique réalisé comprend un réservoir d'entrée 61, un canal d'entrée 62, un microréacteur 63 et un canal de sortie 64. Au niveau de la structure de type pointe, le canal de sortie définit ici présente alors deux parois latérales et une paroi horizontale (« le sol ») . On remarque qu'une extrémité 58 de la zone dopée 55 est située au fond du réservoir d'entrée 61 et qu'une extrémité 59 de la zone dopée 57 est située au fond d'une partie du canal de sortie 64. Cette étape constitue une étape clef puisqu'elle rend possible une continuité en profondeur du réseau fluidique et du canal de sortie. Ainsi, une connectique à « zéro volume mort » est rendue possible. Ce sera le cas dans tous les autres modes de réalisation. La figure 6C illustre le dégagement de la pointe. Ceci est obtenu par gravure chimique de la partie de la couche d'oxyde 52 située sur la partie droite de la figure. Après cette gravure, la structure de type pointe 65 est libérée et forme un surplomb au-dessus du support 51. Il faut noter que le canal de sortie 64 comporte toujours le sol 66. On réalise ensuite une étape d' isolation électrique du réseau fluidique. Ceci est obtenu par une oxydation thermique de 3 μm d'épaisseur du silicium de la couche mince 53. Le support 51 en silicium ne doit pas être oxydé sinon la structure de type pointe 65 ne serait plus en surplomb. Cette étape d'oxydation thermique est nécessaire pour isoler électriquement le liquide présent dans le réseau fluidique de l'extérieur. Cette isolation électrique est nécessaire, par exemple, lorsque le pompage électroosmotique est utilisé ou qu'une séparation par électrophorèse ou qu'une réaction électrochimique siègent dans le réseau fluidique. L'étape suivante consiste à dégager les contacts électriques. Pour dégager les électrodes (les extrémités 58 et 59) et les reprises de contact (les zones 54 et 56) , il est nécessaire de graver localement la couche de Si02 thermique (3 μm) réalisée précédemment. Cette étape peut être réalisée par une technique de gravure par laser proposée par la Société NovaLase de Pessac (Gironde, France) . Pour obtenir le laboratoire sur puce selon l'invention, le support 51 est clivé comme le montre la figure 6D pour dégager la structure de type pointe 65.
Second mode de réalisation : fermeture par un capot de pyrex structuré du dispositif décrit dans le premier mode de réalisation Selon ce mode de réalisation, le dispositif
70 (voir la figure 7A) obtenu par le premier mode de réalisation, avant l'étape de clivage finale est scellé à une plaque de recouvrement 71. La plaque de recouvrement 71 comporte une partie d'extrémité 72 en surplomb pour que la plaque 71 ne recouvre pas la structure de type pointe 65. Elle comporte également un trou traversant 73 destiné à assurer une communication fluidique avec le réservoir d'entrée 61 du dispositif 70. La plaque de recouvrement 71 peut être un substrat de pyrex, par exemple celui disponible sous la référence Corning 7740. Une fois le scellement obtenu, on procède à trois clivages. Un premier clivage de la plaque 71 et un clivage du support 51 du dispositif 70 permet de libérer le nez d'électronébulisation. Un deuxième clivage de la plaque 71 permet de libérer les reprises de contact 54 et 56.
Troisième mode de réalisation (variante du premier mode de réalisation) Ce mode de réalisation est illustré par les figures 8A à 8D. Il n'utilise qu'un seul substrat SOI.
Les électrodes, les pistes conductrices et les reprises de contact électrique sont réalisées en une seule étape de "lift-off" de métal (aluminium, platine, or, etc.). La figure 8A montre un substrat SOI 80 constitué d'un support 81 en silicium de 500 μm d'épaisseur, supportant successivement une couche d'oxyde de silicium 82 de 1 μm d'épaisseur et une couche mince 83 de silicium de 25 μm d'épaisseur. La figure 8B illustre la réalisation du réseau fluidique dans la couche mince 83. Le réseau fluidique est obtenu par gravure DRIE. La gravure de la couche supérieure de silicium 83 est : soit partielle afin de conserver un
« sol » de silicium au canal de sortie et notamment à la portion du canal de sortie débouchant dans la structure de type pointe (comme représenté pour le premier et le second mode de réalisation) , - soit totale afin de réaliser un canal de sortie de type « fente » au niveau de la structure de type pointe (comme représenté sur la figure 8B) . Par ailleurs, dans ce dernier cas, la gravure peut être éventuellement poursuivie à travers la couche d'oxyde 82, puis dans le support en silicium
81 , afin de réaliser un réseau fluidique de grande profondeur . Le réseau fluidique réalisé comprend un réservoir d'entrée 91, un canal d'entrée 92, un microréacteur 93 et un canal de sortie 94. La gravure de la couche mince 83 définit également la structure de type pointe 95. La structure de type pointe 95 est ensuite dégagée par gravure chimique totale de la partie de la couche d'oxyde 82 qui a été révélée par la gravure de la couche 83 et aussi de celle qui se trouve sous la structure de type pointe 95 (voir la figure 8C) . On réalise ensuite une étape d'isolation électrique du réseau fluidique. Ceci est obtenu par une oxydation thermique de 3 μm d'épaisseur du silicium de la couche mince 83. On réalise ensuite, par "lift-off" de métal, les reprises de contact 84 et 86, les électrodes
88 (au fond du réservoir d'entrée) et 89 (dans le canal du nez d'électronébulisation) ainsi que les pistes conductrices 85 et 87 reliant chaque électrode à sa reprise de contact correspondante (voir la figure 8D) .
Le support 81 peut alors être clivé pour dégager la structure en pointe 95.
Quatrième mode de réalisation (variante du second mode de réalisation) : Il s'agit d'une variante du second mode de réalisation dans lequel l'utilisation d'un substrat SOI est remplacée par l'utilisation de deux substrats de silicium. La figure 9A montre un substrat de silicium
100 présentant une face 102 sur laquelle sont réalisés, par dopage localisé, deux circuits électriquement conducteurs. Le premier circuit conducteur est formé des zones 104 et 105 et le deuxième circuit conducteur est formé des zones 106 et 107. Le substrat 100 subit ensuite, à partir de la face 102, une gravure RIE (pour "Reactive Ion Etching") ou une gravure chimique au moyen de KOH pour obtenir un évidement 101 en prévision de la structure de type pointe et du clivage du substrat (voir la figure 9B) . Un autre substrat 110 en silicium est ensuite fixé par scellement direct sur la face 102 du substrat 100 (voir la figure 9C) . Le substrat 110 est ensuite aminci jusqu'à obtenir une couche mince 111 (voir la figure 9D) . Le réseau fluidique est ensuite réalisé comme cela est montré à la figure 9E. Au cours de cette étape, la couche mince 111 subit partiellement ou totalement une gravure DRIE. Le réseau fluidique comprend un réservoir d'entrée 121, un canal d'entrée 122, un microréacteur 123 et un canal de sortie 124. La gravure de la couche mince 111 définit également la structure de type pointe 125. Comme pour les modes de réalisation précédents, on réalise ensuite une étape d'isolation électrique du réseau fluidique. Ceci est obtenu par une oxydation thermique. L'étape suivante a pour objet de dégager les reprises de contact 104 et 106 (voir la figure 9F) . Pour cela il est nécessaire de graver localement la couche mince 111 et l'oxyde thermique. Cette étape peut être réalisée par une technique de gravure par laser. Elle permet de dégager également les électrodes 128 et 129 respectivement situées au fond du réservoir d'entrée 121 et au fond du canal de sortie 124. L'étape 9G représente le scellement direct d'une plaque de recouvrement 131 sur la couche mince 111. La plaque de recouvrement 131 comporte une partie d'extrémité 132 en surplomb pour que la plaque 131 ne recouvre pas la structure de type pointe 125. Elle comporte également un trou traversant 133 destiné à assurer une communication fluidique avec le réservoir d'entrée 121. La plaque de recouvrement 131 peut être un substrat de pyrex. Une fois le scellement obtenu, on procède au dégagement de la structure de type pointe 125 et des reprises de contact 104 et 106. Un premier clivage de la plaque 131 et un clivage du substrat 100 permet de libérer la nez d'électronébulisation. Un deuxième clivage de la plaque 131 permet de libérer les reprises de contact 104 et 106.
Cinquième mode de réalisation : Ce mode de réalisation utilise un substrat SOI et un substrat de pyrex (« Corning » 7740) comme capot. Les électrodes, les pistes conductrices et les reprises de contact électriques sont réalisées par dépôt de métal (aluminium, platine, or...) et photo- litographie sur la face inférieure du capot de pyrex, dans lequel elles sont « incrustées ». La figure 10A montre un substrat SOI 140 constitué d'un support 141 en silicium de 500 μm d'épaisseur, supportant successivement une couche d'oxyde de silicium 142 de 1 μm d'épaisseur et une couche mince 143 de silicium de 25 μm d'épaisseur. La figure 10B montre le dispositif obtenu après une étape de gravure DRIE de la couche mince 143. La gravure permet de réaliser le réseau fluidique. Celui-ci comprend un réservoir d'entrée 151, un canal d'entrée 152, un microréacteur 153 et un canal de sortie 154. La gravure de la couche mince 143 est également réalisée sur deux bords du substrat 140 jusqu'à révéler la couche d'oxyde 142. Elle permet de définir la structure de type pointe 155. Cette étape de gravure est classique en microtechnologie. Elle utilise un masque d'oxyde de silicium de 5000Â d'épaisseur réalisé dans un four à 1050 °C en atmosphère humide. Une couche de 1,3 μm de résine photosensible « Shipley S 1813 SP15 » est ensuite étalée sur piste « SVG » (promoteur d'adhérence : HMDS vapeur). Les motifs IX sont insolés, puis développés par du « Shipley MIF 310 » sur piste « SVG ». Le masque d'oxyde peut alors être gravé en RIE
(pour "Reactive Ion Etching") sous un mélange CHF3/02, par une « Nextral 330 » par exemple. La résine est ensuite éliminée (par le procédé appelé "stripping") par du Posistrip ou du HN03 fumant. Le silicium est alors gravé en DRIE sous un mélange SF6/O2 à 110°C par une « Alacatel ICP 601E » par exemple. Enfin, le masque d'oxyde est décapé par du HF 10% jusqu'à démouillage. La structure de type pointe est ensuite dégagée par gravure chimique de la couche d'oxyde 142. Cette gravure chimique peut se faire dans un bain appelé BOE (pour "Buffer Oxide Etchant" : HF/NH4F) . On obtient le dispositif représenté à la figure 10C qui montre la structure de type pointe 155 en surplomb. Cette figure montre aussi que l'oxyde, précédemment révélé sur l'autre bord du substrat 140, a été éliminé au cours de la gravure pour révéler le bord 144 du support 141. Comme pour les modes de réalisation précédents, une isolation électrique du réseau fluidique est obtenue par oxydation thermique. Cette oxydation a lieu dans un four à 1150 °C en atmosphère humide . La figure 10D représente le scellement direct d'une plaque de recouvrement 161 sur la couche mince 143. La plaque de recouvrement 161 comporte une partie d'extrémité 162 en surplomb pour que la plaque 161 ne recouvre pas la structure de type pointe 155. Elle comporte également un trou traversant 163 destiné à assurer une communication fluidique avec le réservoir d'entrée 151. La plaque de recouvrement 161 peut être un substrat de pyrex. La figure 10D montre aussi que la plaque 161 comporte, sur la face destinée à venir en contact avec la couche mince 143, une piste métallique 164 disposée de façon que son extrémité interne 165 serve d'électrode pour le canal de sortie 154 et que son extrémité externe 166 serve de reprise de contact électrique . Cette étape de scellement direct se fait à 400°C. Elle nécessite une bonne préparation des surface, à savoir : - un polissage de la plaque de pyrex par une solution de KOH / HF 1% contenant une suspension de silice colloïdale, suivi d'un nettoyage classique RCVA SCI (NH4OHJH202/H20 1/4/20 à 70°C), un nettoyage du substrat de silicium oxydé par un caro (H2SO,j/H202 2/1 à 140°C) suivi d'un nettoyage classique RCVA SCI (NH4OH/H202/H20 1/4/20 à 70°C) . La structuration du capot de pyrex (gravure et « incrustation » de la piste métallique) se fait selon les étapes technologiques suivantes : • Réalisation des gravures pour évidemment de découpe et « caisson pour piste métallique » : - dépôt Cr/Au/Cr/Au (50 A / 3000 Â / 50 Â/ 3000 Â) , étalement de résine photosensible « Shipley S 1813 SP15 » sur piste « SVG », épaisseur 1 , 3 μm, - insolation des motifs IX et évidement découpe' , - développement sur piste « SVG » avec le développeur « Shipley MIF 319 », - gravure Au KI/I2, - gravure Cr avec la solution appelée "Cr Etch", - élimination de la résine par "stripping" en utilisant du « Posistrip » ou du HNO3 fumant, étalement de résine photosensible « Shipley S 1813 SP15 » sur piste « SVG », épaisseur 1,3 μm, insolation des motifs IX λévidement découpe et caisson piste métallique' , - développement sur piste « SVG » au moyen du développeur « Shipley MIF 319 », - gravure Au KI/I2, - gravure Cr avec la solution appelée "Cr Etch", - gravure du verre sur 25 μm par du HF 10%, - élimination de la résine par "stripping" en utilisant du « Posistrip » ou du HN03 fumant.
• Réalisation de la piste métallique « incrustée » : - gravure "full sheet" Au KI/I2, - gravure "full sheet" Cr avec la solution "Cr Etch", - gravure du verre sur 5000 Â avec une solution HF 10%, - décapage Au KI/I2, - décapage Cr avec la solution "Cr Etch", - dépôt Cr/Au 50 Â/3000 Â, polissage jusqu'à l'or et le verre coplanaires, - dépôt Si02 par PECVD à 300°C - « STS Multiplex », - densification de l'oxyde en four sous gaz neutre .
• Ouverture des contacts : étalement de résine photosensible
« Shipley S 1813 SP15 » sur piste « SVG » épaisseur 1,3 μm, - insolation des motifs IX, - développement sur piste « SVG » avec le développeur « Shipley MIF 319 », gravure du Si02 par le procédé RIE « Nextral 330 » - gaz CHF3/02, - élimination de la résine par "stripping" en utilisant du Posistrip ou du HN03 fumant. Une fois le scellement obtenu, on procède au dégagement de la structure de type pointe 155 et de la reprise de contact 166 par clivage du support 141 (voir la figure 10E) . Un premier clivage permet de libérer le nez d'électronébulisation. Un deuxième clivage permet de libérer la reprise de contact.
Sixième mode de réalisation (variante du cinquième mode de réalisation) : Il s'agit d'une variante du cinquième mode de réalisation dans laquelle l'utilisation d'un substrat SOI est remplacée par l'utilisation de deux substrats de silicium. La figure 11A montre un premier substrat en silicium 170 présentant un evidement 171 en prévision de la structure de type pointe et du clivage de ce substrat. L' evidement est obtenu par gravure RIE, DRIE ou KOH. La figure 11B montre qu'un deuxième substrat 180 en silicium a été fixé sur la face gravée du substrat 170. Cette fixation a été obtenue par scellement direct. La figure 11C montre que le deuxième substrat a été aminci pour donner une couche mince 181 en silicium. Le réseau fluidique est ensuite réalisé comme cela est montré à la figure 11D. Au cours de cette étape, la couche mince 181 subit une gravure DRIE. Le réseau fluidique comprend un réservoir d'entrée 191, un canal d'entrée 192, un microréacteur 193 et un canal de sortie 194. La gravure de la couche mince 181 définit également la structure de type pointe 195 et permet de révéler le bord 184 du substrat 170. Comme pour les modes de réalisation précédents, on réalise ensuite une étape d'isolation électrique du réseau fluidique. Ceci est obtenu par une oxydation thermique. La figure 11E représente le scellement direct d'une plaque de recouvrement 201 sur la couche mince 181. La plaque de recouvrement 201 comporte une partie d'extrémité 202 en surplomb pour que la plaque 201 ne recouvre pas la structure de type pointe 195. Elle comporte également un trou traversant 203 destiné à assurer une communication fluidique avec le réservoir d'entrée 191. La plaque de recouvrement 201 peut être un substrat en pyrex. La figure 11E montre aussi que la plaque 201 comporte, sur la face destinée à venir en contact avec la couche mince 181, une piste métallique 204 disposée de façon que son extrémité interne 205 serve d'électrode pour le canal de sortie 194 et que son extrémité externe 206 serve de reprise de contact électrique . Une fois le scellement obtenu (voir la figure 11F) , on procède au dégagement de la structure de type pointe 195 et de la reprise de contact 206 par clivage du substrat 170. Un premier clivage permet de libérer le nez d'électronébulisation. Un deuxième clivage permet de libérer la reprise de contact.
Montage pour le pompage électroosmotique En vue d' imposer de manière externe un pompage électroosmotique dans les différents réacteurs du dispositif micro-fluidique, on peut utiliser une carte à pointes réalisée par la société MESATRONIC S.A. de Voiron (Isère, France) . Une telle carte est un circuit électrique pouvant tenir aux hautes tensions (lOkV) et muni d'un ensemble de pointes en platine venant tremper simultanément dans les différents réservoirs du dispositif. Différents potentiels électriques peuvent donc être imposées en divers points du dispositif afin d'en gérer les différents flux.
Utilisation de l'invention La figure 12 montre comment l'ensemble des dispositifs « réseau fluidique et nez d'électronébulisation » 211 peuvent être répartis sur un substrat circulaire 210 afin de disposer d'un objet unique à N dispositifs microfluidiques, facilitant ainsi un usage à « haut débit » d'analyses. Dans cette configuration, les réseaux fluidiques sont dessinés radialement, selon les rayons du substrat circulaire 210. N nez d'électronébulisation sont alors répartis selon la circonférence du substrat, et il suffit de faire tourner manuellement ou automatiquement celui-ci pour réaliser un enchaînement en série d'analyses au spectrometre de masse 212. Pour cela, le support du substrat pourra être monté sur un axe rotatif. La préparation des échantillons, elle, peut être réalisée au préalable en parallèle sur les N dispositifs .
Applications industrielles Les applications possibles de l'invention sont toutes celles qui utilisent pour méthode de détection la spectrometrie de masse avec pour interface la technique d'ionisation par électrospray (ESI pour
"ElectroSpray Ionisation"). On peut citer à titre d'exemple l'analyse d' échantillons dans le secteur biomédical et l'industrie pharmaceutique : - analyses génétiques, protéomique (identification de protéines...) , - développement de médicaments .

Claims

REVENDICATIONS
1. Laboratoire sur puce comprenant un support (51, 81, 100, 141, 170) , au moins un réseau fluidique, au moins un orifice d'entrée de fluide relié au réseau fluidique et au moins un orifice de sortie de fluide relié au réseau fluidique, une couche mince (53, 83, 111, 143, 181) solidaire du support et dans laquelle sont réalisés le réseau fluidique et un nez d'électronébulisation (65, 95, 125, 155, 195), le nez d'électronébulisation étant en surplomb par rapport au support et comprenant un canal (64, 94, 124, 154, 194) dont une extrémité est reliée au réseau fluidique et dont l'autre extrémité constitue ledit orifice de sortie de fluide, le canal étant équipé de moyens de conduction électrique (59, 89, 129, 165, 205) formant au moins une électrode, caractérisé en ce que la couche mince (111, 181) est une couche fixée par scellement direct sur le support (100, 170) .
2. Laboratoire sur puce selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support (100) étant en matériau semi-conducteur, les moyens de conduction électrique (129) sont une partie dopée dudit support.
3. Laboratoire sur puce selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est en matériau conducteur.
4. Laboratoire sur puce selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend un capot (131, 201) recouvrant hermétiquement le réseau fluidique, ce capot étant pourvu d'un moyen d'accès fluidique (133, 203) à l'orifice d'entrée de fluide.
5. Laboratoire sur puce selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un capot (201) recouvrant hermétiquement le réseau fluidique, ce capot étant pourvu d'un moyen d'accès fluidique (203) à l'orifice d'entrée de fluide et étant pourvu desdits moyens de conduction électrique (205) .
6. Laboratoire sur puce selon la revendication 5, caractérisé en ce que le capot est en matériau conducteur.
7. Laboratoire sur puce selon la revendication 5, caractérisé en ce que le capot est en matériau semiconducteur, les moyens de conduction électrique comprenant une partie dopée du capot.
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