EP1670587A1 - Aktivierung und stabilisierung empfindlicher katalysatoren in segmentierten amphiphilen netzwerken - Google Patents

Aktivierung und stabilisierung empfindlicher katalysatoren in segmentierten amphiphilen netzwerken

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Publication number
EP1670587A1
EP1670587A1 EP04763877A EP04763877A EP1670587A1 EP 1670587 A1 EP1670587 A1 EP 1670587A1 EP 04763877 A EP04763877 A EP 04763877A EP 04763877 A EP04763877 A EP 04763877A EP 1670587 A1 EP1670587 A1 EP 1670587A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
catalyst
hydrophilic
segmented
amphiphilic
macromonomer
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04763877A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nico Bruns
Jörg TILLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Original Assignee
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
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Filing date
Publication date
Application filed by Albert Ludwigs Universitaet Freiburg filed Critical Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Publication of EP1670587A1 publication Critical patent/EP1670587A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/003—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a catalyst system which is capable of stabilizing and activating sensitive catalysts, such as, in particular, enzymes and peptides, so that, for example, synthesis reactions, such as in particular those for active substance synthesis, can also be carried out efficiently in organic solvents.
  • sensitive catalysts such as, in particular, enzymes and peptides
  • the present invention relates to an immobilized catalyst, the catalyst being introduced into a segmented amphiphilic polymer network with a specific nanophase separation.
  • Enzymes and other enantioselective catalysts are particularly important in drug synthesis. However, many of these catalysts cannot be used on an industrial scale because they are sensitive to the solvent used or are not very active. In the amounts used, metal catalysts or organometallic catalysts are often highly toxic to the environment due to their high heavy metal content.
  • the natural environment of biocatalysts is aqueous.
  • water is a poor solvent for many preparative reactions in organic chemistry, since most organic compounds are insoluble in this medium.
  • the removal of water from reaction mixtures is time and energy consuming due to its high boiling point and high evaporation enthalpy.
  • side reactions such as hydrolysis, racemization or polymerizations increasingly occur in aqueous solution.
  • the products formed are often unstable in the presence of water. To avoid these problems, most organic syntheses are carried out in organic solvents.
  • Amphiphilic polymers have so far rarely been used in this connection.
  • the literature describes only the immobilization of lipases by adsorption onto microporous amphiphilically modified polyallyl methacrylate-co-polyglycidyl methacrylate particles and onto copolymers of polystyrene crosslinked with divinyl and surfactant monomers; see. Yasuda et al., Macromolecular Chemistry and Physics, 2001, vol. 202 (16), pages 3189-3197, and 2002, vol. 203, pages 284-293; Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 2002, vol. 40, pages 874-884, or Journal of Chemical Engineering of Japan, 2003, vol. 35 (6), pages 519-526.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a catalyst system which is capable of stabilizing and activating enzymes, peptides and other enantioselective catalysts, so that organic Synthesis reactions, in particular those for the synthesis of active substances, can also be carried out efficiently in organic solvents, or if metal catalysts or organometallic catalysts are provided, even in aqueous solvents.
  • an immobilized catalyst or catalyst system is provided, the catalyst, in particular an enzyme or a peptide, in a segmented amphiphilic network composed of at least one hydrophilic and one hydrophobic component, which separates the nanophases from the hydrophilic and the hydrophobic Component-formed units in the range from 5 nm to 500 nm, preferably 8 to 300 nm, particularly preferably 8 to 50 nm, is introduced.
  • an immobilized catalyst can be produced by a method comprising the steps:
  • the present invention is directed to the immobilization of sensitive catalysts, such as in particular enzymes or peptides, in a segmented amphiphilic polymer network.
  • a segmented network is generally understood to mean network structures in which a polymer A acts as a macromolecular crosslinker for a polymer B.
  • the segmented, amphiphilic polymer network of the present invention has a nanophase separation, so that hydrophilic and hydrophobic units of the polymer network are adjacent in the range from 5 nm to 500 nm. In this respect the phase separation is observed or determined via AFM measurements, the three-dimensional phase separation per se is translated into a one-dimensional quantity within the scope of the present invention.
  • This nanophase separation occurs both on the surface and in the mass of the segmented, amphiphilic polymer network used according to the invention.
  • This special network configuration enables free access to the interior thereof both for catalysts such as enzymes or peptides (in the aqueous phase) and substrates (in the organic phase), which is essential for the catalyst system concept according to the invention, for example when it is used for the synthesis of active substances.
  • the nanophase separation is designed according to the invention such that the size of the domains is not smaller than the catalyst to be stored.
  • the nanophase separation can be confirmed, for example, by AFM measurements.
  • a catalyst such as, in particular, an enzyme or a peptide, can diffuse into the amphiphilic network in a hydrophilic (hydrophobic) solvent and then develop catalytic activity in another hydrophobic (hydrophilic) solvent.
  • the distribution of the catalyst in the amphiphilic polymer network used according to the invention is homogeneous.
  • FIG. 1 schematically illustrates the catalyst system concept according to the invention, in which, for example, an enzyme in a hydrophilic (aqueous) solvent diffuses into the hydrophilic phase of the amphiphilic, segmented network and then develops its catalytic activity in another hydrophobic (organic) solvent.
  • the catalyst used is an enzyme or a peptide, preferably an enzyme.
  • the class of the enzyme incorporated in the network is not specifically limited.
  • oxidoreductases, transferases, hydrolases, lyases, isomerases and ligases are suitable as enzymes.
  • peroxidases or, as their subgroup, heme enzymes, which contain the complex iron-protoporphyrin IX as a prosthetic group, and hydrolases can be used in the context of the present invention.
  • HRP horseradish peroxidase
  • CPO chloroperoxidase
  • Transport proteins such as hemoglobin and myoglobin are particularly suitable as peptides.
  • Peroxidases can catalyze a number of synthetically useful reactions, such as polymerizations of electron-rich aromatics, asymmetric sulfoxidations, and epoxidations.
  • the potential of peroxidases in the area of (asymmetrical) biotransformations is currently hardly exploited in a commercial synthesis, since these enzymes have two major disadvantages.
  • peroxidases such as heme enzymes are inactivated by peroxides.
  • the poor water solubility of many synthetically interesting substrates in peroxidases just like in most other enzymes, limits the commercial application of the enzymatic biotransformations.
  • a solution to this general problem is achieved by immobilizing or embedding such enzymes, for example peroxidases, in a segmented amphiphilic polymer matrix with the above-mentioned nanophase separation.
  • enzymes for example peroxidases
  • sensitive metal catalysts or organometallic catalysts can also be used in the context of the present invention, which are stabilized and activated by immobilization or embedding in an amphiphilic polymer matrix. Water-sensitive metal catalysts can thus be stabilized and activated by inclusion in the hydrophobic phases or regions of the segmented amphiphilic polymer networks used according to the invention.
  • the sensitive metal catalysts which can be used in the context of the present invention are the Sharpless catalyst for the asymmetric epoxidation of allyl alcohols, Grubbs catalysts for the metathesis of alkenes or alkynes or else Pd nanoparticles for the Heck reaction or for hydrogenation, to call.
  • Polymer networks are polymers in which the polymer chains are linked three-dimensionally. In a network, all polymer chains are linked to one another, there is a single large molecule.
  • networks can be synthesized by crosslinking linear polymer chains by means of a polymer-analogous reaction or by crosslinking copolymerization with a low molecular weight crosslinker. In the copolymerization, macromonomers can also be used instead of monomers. This term is understood to mean oligomers or polymers with polymerizable groups.
  • segmented polymer networks of this type are usually referred to as poly (A) -linked-poly (B), where poly (A) is a polymeric crosslinker for the monomer B.
  • Chemically cross-linked polymers are generally insoluble in all solvents. However, if you put a polymer network in a solvent that is well compatible with the polymer segments, solvent will penetrate the sample. The Polymer swells until a balance is reached between the osmotic pressure of the solvent and the elastic restoring force of the chain segments. A swollen network is called a gel.
  • the network can be swellable in a wide range of compositions both in organic solvents and in aqueous media.
  • amphiphilic network The strong incompatibility between the polar and non-polar components or chain segments leads to phase separation, but the covalent bonds between the segments prevent macroscopic phase separation, there is only a much smaller separation, and domains in the nanometer range are formed.
  • the networks appear macroscopically homogeneous and optically clear. Amphiphilic networks are made up of immiscible, i.e. incompatible polymer chains built. The most common synthesis strategy in the prior art is the macromonomer method discussed above, which provides for the copolymerization of a macromonomer with a low molecular weight monomer and, viewed topologically, leads to segmented networks.
  • the segmented amphiphilic networks used according to the invention can be produced by copolymerizing a monomer (hydrophilic or hydrophobic) with a macromonomer (hydrophobic or hydrophilic) or by copolymerizing two macromonomers of different hydrophilicity.
  • a hydrophobic macromonomer is preferably copolymerized with a hydrophilic monomer.
  • the hydrophobic component of the segmented, amphiphilic network is not subject to any specific restriction.
  • monomers or components based on alkyl (meth) acrylates eg methyl methacrylate, n-butyl methacrylate, n-hexyl methacrylate
  • styrene vinyl acetate
  • olefins such as propylene, ethylene, isoprene, cyclooctadiene, etc.
  • Poly ( ⁇ -caprolactone) lactic acid, di-isocyanates, diols, diamines, diacids, polylactides, polypropylene fumarate, Diglycidyl ether of bisphenol A, poly-THF, polyalkyloxazolines (eg 2-phenyloxazoline), perfluoropolyethers or siloxanes such as dimethylsiloxane, etc., and copolymers of these monomers are used.
  • the hydrophobic component of the segmented, amphiphilic network is preferably a polydialkylsiloxane macromonomer, such as in particular a polydimethylsiloxane macromonomer.
  • a polydialkylsiloxane macromonomer such as in particular a polydimethylsiloxane macromonomer.
  • the molecular weight of such a polydialkylsiloxane macromonomer is not specifically limited.
  • polydialkylsiloxane macromonomers such as, for example, polydimethylsiloxane macromonomers with a molecular weight M n in the range from 500 to 1,000,000 g / mol 3 can be used.
  • PDMS (MA) 2 polydialkylsiloxane macromonomer
  • the hydrophilic component of the segmented, amphiphilic network is not subject to any specific restriction.
  • components based on monomers such as (meth) acrylate and its derivatives, diisocyanates, diols, diamines, diacids, acylamide, N-isopropylacrylamide, N-vinylcaprolactam, 2,3-dihydroxypropyl methacrylate, maleic acid, fumaric acid or vinyl acetate, or on Based on macromonomers such as poly-1, 3-dioxolane, polyethyleneimine, polypropyleneimine, polyethylene glycol, polypropylene glycol and polyoxazolines with methacrylate, epoxy, amino, isocyanato or hydroxyl end groups, etc., are used.
  • the hydrophilic component is preferably selected from (meth) acrylic acid, (meth) acrylate and their derivatives, in particular hydroxyethyl acrylate, hydroxyethyl methacrylate, dimethylacrylamide and dimethylaminoethyl methacrylate.
  • the terms (meth) acrylic acid or (meth) acrylate mean acrylic acid and methacrylic acid or acrylate and methacrylate in the following.
  • amphiphilic and non-amphiphilic Block copolymers can re, triblock copolymers (AB, ABA, BAB) are used as building blocks for the production of the segmented amphiphilic network etc., with blocks of the abovementioned monomers, for example, under the trade name Pluronic ® Available polyethylene glycol-b-polypropylene glycol-b-polyethylene glycol.
  • the amphiphilic networks provided according to the invention are usually not polymerized in bulk, but rather from a solution as gels. If the monomers are not miscible with one another and the use of phase-mediating solvents is inadequate or if one of the monomers is already insoluble in them, monomers modified with protective groups can be used in an advantageous manner. These can then be polymerized from solution or in bulk.
  • An example of this strategy is the replacement of the hydrophilic monomer methacrylic acid (MAA) by the hydrophobic trimethylsilyl methacrylate (TMSMA), which is well compatible with hydrophobic macromonomers and organic solvents.
  • precursor networks are created whose polar chain segments carry trimethylsilyl protective groups.
  • the protective groups are then split off in a second step by hydrolysis with alcohol / water mixtures.
  • segmented, amphiphilic networks which can be used in the present invention are preferably synthesized by thermally or UV-initiated free-radical copolymerization of PDMS macromonomers and (meth) acrylates or their derivatives, the preferred hydrophilic components being methacrylic acid (MAA), hydroxyethyl methacrylate ( HEMA), hydroxyethyl acrylate (HEA) and dimethylaminoethyl methacrylate (DMAEMA) are used.
  • MAA methacrylic acid
  • HEMA hydroxyethyl methacrylate
  • HEMA hydroxyethyl acrylate
  • HMA hydroxyethyl acrylate
  • DMAEMA dimethylaminoethyl methacrylate
  • MAA, HEMA and HEA can be incorporated into the polymer network in the form of their hydrophobic trimethylsilyl-protected derivatives, after which the precursor network is subsequently converted into a segmented, amphiphilic network by removing the protective groups.
  • Networks based on PHEMA-I-PIB or PMAA-I-PIB, for example, can also be produced using the synthesis strategy described above.
  • the segmented, amphiphilic networks can be prepared by radical copolymerization of a polydimethylsiloxane (PDMS) macromonomer with two methacrylate end groups and the monomer hydroxyethyl acrylate (HEA).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • HOA monomer hydroxyethyl acrylate
  • Such a copolymer has the desired phase separation. While the hydrophilic phase (poly-HEA) swells selectively in water, the hydrophobic phase (PDMS) can be swollen in solvents such as toluene or n-heptane.
  • amphiphilic networks can be loaded with enzymes, such as horseradish peroxidase (HRP) or chloroperoxidase (CPO), by incubating them in an aqueous enzyme solution. After drying, the enzyme is in the hydrophilic phase of the network and, in an HRP-catalyzed reaction such as the oxidative coupling of phenol and N, N-dimethylphenylenediamine with t-butyl hydroperoxide in n-heptane, shows more than the free enzyme 40 to 120 times higher activity and one to three times higher stability.
  • enzymes such as horseradish peroxidase (HRP) or chloroperoxidase (CPO)
  • the segmented, amphiphilic networks used according to the invention can be provided in the form of films which are loaded with the catalyst, such as an enzyme, which in turn is stabilized and activated by inclusion in the segmented, amphiphilic polymer network and thus for reactions in organic solvents is made usable.
  • the invented Immobilization of sensitive catalysts, such as enzymes, according to the invention through the use of segmented amphiphilic polymer networks in particular enables the hydrophobic phase to swell selectively in the organic solvent, while the enzyme molecules are in the hydrophilic phase and are surrounded by it in a protective manner.
  • the hydrophilic phases and thus also the enzyme molecules are usually easily accessible to substrates dissolved in the organic solvent, which increases the enzyme activity.
  • the loaded networks When such enzymes are stored in the segmented, amphiphilic polymer networks used according to the invention, the loaded networks, if provided as a film, show no noticeable loss of activity after three weeks of storage at 4 ° C.
  • the advantages of the incorporation of such catalysts, in particular enzymes, according to the invention over a support on microporous materials lies in the fact that it is an organic polymer which builds up the segmented, amphiphilic polymer network, which has any shape can enable.
  • the catalyst distribution in the carrier material is much finer than with corresponding microporous materials, since domains are in the nanometer range and the catalyst is not only on an inner surface, but is directly embedded in one of the phases.
  • step (b) of the process according to the invention the enzyme is enriched in the polymer network. This is due to the fact that enzymes have a tendency to attach to surfaces. If one considers the interfaces between the hydrophilic and the hydrophobic areas or phases of the network as a surface, the nanophase separation results in a very large “inner” surface on which the enzymes can concentrate compared to the solution from the enzyme concentration in the corresponding solution with which the polymer network is treated in step (b) and the specific chemical structure of the selected segmented amphiphilic polymer network, loads in the range of 1 to 100 ⁇ g enzyme, such as HRP, per cm 2 of polymer network are usually obtained (corresponds to 0.5 mg / cm 3 to 500 mg / cm 3 ) in the form of a film reached. In the case of horseradish peroxidase, for example, the enzyme loading can be quantified by UV / VIS spectroscopy.
  • enzymes are usually insoluble in organic solvents. They are usually used as lyophilisate in crystalline form or supported on certain materials.
  • the carrier materials are very often microporous materials such as silica. Takahashi et al., Chemical Materials, 2000, Vol. 12, pages 3301-3305, describes the support of horseradish peroxidase on silica, an increase in activity by a factor of 10 being achieved.
  • a horseradish peroxidase stabilized by the process according to the invention in organic solvents shows an activity which is 120 times higher than that of the pure enzyme. This is due in particular to the fact that the enzyme is “quasi-dissolved” due to the inclusion in the hydrophilic phase of the segmented, amphiphilic network.
  • Another object of the present invention relates to the use of the immobilized catalyst system according to the invention in organic synthesis, in particular the active ingredient synthesis.
  • Yet another object of the present invention relates to the use of segmented amphiphilic polymer networks which have a nanophase separation of the units formed in each case from the hydrophilic and the hydrophobic component in the range from 5 nm to 500 nm for the immobilization of catalysts, such as in particular enzymes.
  • a monomer mixture for polyhydroxyethyl acrylate-1-polydimethylsiloxane films was prepared by dissolving the photoinitiator Irgacure 651 (5 mg / ml) in freshly distilled trimethylsilyloxyethyl acrylate (TMSOEA) with shaking, plus PDMS 5 . 2 (MA) 2 was given and shaken vigorously again.
  • a strip of scotch tape was stuck onto an unmodified slide free of bubbles and wrinkles and the monomer mixture (60 ⁇ l) was applied evenly to it.
  • a “silanized” slide was then placed on the monomer mixture parallel to the scotch tape, avoiding the inclusion of air bubbles.
  • the polymerization was carried out by irradiating with a commercially available UV polymerization lamp (Heraflash from Heraeus Kulzer) (2 ⁇ 180 s from each side, each with 30 s Cooling time between exposures (total exposure time: 720 s)
  • a commercially available UV polymerization lamp Heraflash from Heraeus Kulzer
  • the tesafilm and its support were then carefully removed from the amphiphilic film and the latter was added to a MeOH / H 2 O mixture (9 ml per slide, 1: 1)
  • the washed films were then washed with MeOH and dried in a drying cabinet (50 mbar, 60 ° C.) to constant weight.
  • PHEA-I-PDMS films of the composition 91/9, 77/23, 50/50, 41/59 and 9/91 were produced.
  • Unsupported PHEA-I-PDMS films with the composition 90/10, 77/23, 50/50, 30/70 and 10/90 were produced.
  • the synthesis was carried out analogously to the method described above for the production of films covalently bound to supports. Instead of a surface-modified slide, an unmodified slide was used. After deprotection in MeOH / water, the film could be separated from it in a water bath. It was then transferred to a Teflon film and dried on it first in air, later in a drying cabinet (50 mbar, 60 ° C).
  • the area concentration of HRP was between 10 and 24 ⁇ g / cm 2 .
  • a trypsin-loaded PHEA - / - PDMS (77/23) film piece was used for the blind test.
  • the reaction solution was stirred with a stirring fish and the absorption was recorded at regular intervals (60 s or 5 min).
  • One unit was defined as the increase in absorption at the absorption maximum of 0.001 per minute with a reaction volume of 2.4 ml and a layer thickness of 1 cm.
  • the specific activities of the supported HRP were 0.02 to 0.05 U / ⁇ g enzyme, while the enzyme showed no decrease in activity over a period of approx. 40 min.
  • the activity of unsupported HRP was determined in n-heptane in two experiments with different amounts of enzyme (350 ⁇ g and 740 ⁇ g). For each of these experiments, the same amount of enzyme was weighed into several rolled rim glasses and 1.8 ml of heptane (tempered at 25 ° C.) were added in each case. The lyophilisate was then suspended by brief ultrasound treatment, dimethylaminoaniline solution (200 ⁇ l each) and phenol solution (200 ⁇ l each) were added and the reactions were started simultaneously by adding f-BuOOH solution (200 ⁇ l each). The mixture was stirred vigorously at 25 ° C. At intervals of initially 2 to 5 minutes and from a reaction time of 20 minutes, one of the batches was filtered through a syringe filter and the absorption of the filtrate was measured at 546 nm (layer thickness 1 cm).
  • CPO chloroperoxidase
  • the activity of trypsin was determined by the aminolysis of N ⁇ -benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide (Bz-L-Arg-NH-Np) by L-leucinamide (L-LeuNH 2 ) in toluene at room temperature. 7 ⁇ l of a 50 mM Bz-L-Arg-NH-Np hydrochloride solution in MeOH were added to toluene (875 ⁇ l) and a water content of 50 mM by adding 18 ⁇ l of a water-containing acetone solution (5% by volume water ) set.
  • the reaction was started by adding 100 ⁇ l of a 100 mM L-LeuNH 2 solution in toluene, which contained 2 vol% MeOH. The reaction was followed by the increase in absorption at 349 nm, a blind reaction served as background, to which an unloaded PHEA-I-PDMS polymer was added.
  • the catalyst trypsin in PHEA-I-PDMS or native trypsin
  • trypsin in PHEA-I-PDMS (77% by weight PHEA) showed a 3 order of magnitude higher conversion per amount of enzyme than unsupported native trypsin.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Katalysatorsystem, welches befähigt ist, empfindliche Katalysatoren, wie insbesondere Enzyme und Peptide, zu stabilisieren und zu aktivieren, so dass beispielsweise Synthesereaktionen, wie insbesondere solche zur Wirkstoffsynthese, auch in organischen Lösungsmitteln effizient durchgeführt werden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen immobilisierten Katalysator, wobei der Katalysator in ein segmentiertes amphiphiles Polymernetzwerk mit einer spezifischen Nanophasenseparation eingebracht ist.

Description

Aktivierung und Stabilisierung empfindlicher Katalysatoren in segmentierten amphiphilen Netzwerken
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Katalysatorsystem, welches befähigt ist, empfindliche Katalysatoren, wie insbesondere Enzyme und Peptide, zu stabilisieren und zu aktivieren, so daß beispielsweise Synthesereaktionen, wie insbesondere solche zur Wirkstoffsynthese, auch in organischen Lösungsmitteln effiziient durchgeführt werden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen immobilisierten Katalysator, wobei der Katalysator in ein segmentiertes amphiphiles Polymernetzwerk mit einer spezifischen Nanophasenseparation eingebracht ist.
Enzyme und andere enantioselektive Katalysatoren haben vor allem in der Wirkstoffsynthese große Bedeutung. Allerdings können viele dieser Katalysatoren nicht großtechnisch eingesetzt werden, da sie gegenüber dem verwendeten Lösungsmittel empfindlich sind bzw. wenig aktiv sind. Metallkatalysatoren bzw. metallorganische Katalysatoren sind in den eingesetzten Mengen beispiels eise durch ihren hohen Schwermetallgehalt häufig stark umwelttoxisch.
Zudem ist die natürliche Umgebung von Biokatalysatoren, wie insbesondere Enzymen, wäßrig. Wasser ist jedoch für viele präparative Reaktionen in der organischen Chemie ein schlechtes Lösungsmittel, da die meisten organischen Verbin- düngen in diesem Medium unlöslich sind. Außerdem ist das Entfernen von Wasser aus Reaktionsgemischen aufgrund seines hohen Siedepunktes und der großen Verdampfungsenthalpie zeit- und energieaufwendig. Darüberhinaus treten in wäßriger Lösung verstärkt Nebenreaktionen wie Hydrolyse, Racemisierung bzw. Polymerisationen auf. Ferner sind die gebildeten Produkte bei Anwesenheit von Wasser oft instabil. Um diese Probleme zu umgehen, werden daher die meisten organischen Synthesen in organischen Lösungsmitteln durchgeführt. Insofern aber die natürliche Umgebung von Biokatalysatoren, wie insbesondere Enzymen, wäßrig ist, erschwert dies die Verwendung solcher Katalysatoren in organischen Lösungsmitteln, da üblicherweise Enzyme und andere Proteine in diesen instabiler und weniger aktiv sind. Enzyme sind in organischen Lösungsmitteln im wesentlichen nicht löslich, trotzdem werden sie teilweise auch zum Einsatz in diesen Medien „immobilisiert". In diesem Fall spricht man von einer Trägerung. Sie er- leichtert auch die Abtrennung der Katalysatoren, da lediglich größere Partikel abfiltriert werden müssen. Außerdem erreicht man durch eine Trägerung eine größere Oberfläche des Biokatalysators und unter anderem dadurch auch eine höhere Aktivität. Meistens wird eine Adsorption des Enzyms auf mikro- oder makroporöse Träger wie z.B. Silica, Celite oder Glas ausgenutzt. In vielen Fällen führt eine der- artige Immobilisierung jedoch nicht zum gewünschten Erfolg, da die immobilisierte Substanz aufgrund von konformellen Änderungen oder Diffusionsproblemen nicht mehr aktiv oder zugänglich ist.
Amphiphile Polymere sind in diesem Zusammenhang bis heute selten verwendet worden. In der Literatur ist lediglich die Immobilisierung von Lipasen durch Adsorption auf mikroporöse amphiphil modifizierte Polyallylmethacrylat-co- Polyglycidyl-methacrylat-Partikel sowie auf Copolymere aus mit Divinyl vernetztem Polystyrol und tensidischen Monomeren beschrieben; vgl. Yasuda et al., Macro- molecular Chemistry and Physics, 2001 , Bd. 202 (16), Seiten 3189-3197, bzw. 2002, Bd. 203, Seiten 284-293; Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 2002, Bd. 40, Seiten 874-884, bzw. Journal of Chemical Engineering of Japan, 2003, Bd. 35 (6), Seiten 519-526.
Tetrahedron Letters 44 (2003), Seiten 2379-2382, beschreibt einen Komplex bzw. Aggregat aus Pd2+ und amphiphilen Copolymeren. Chemistry Letters (8) (1991), Seiten 1303-1306, beschreibt ein System aus Meerettichperoxidase und amphiphilen Blockcopolymeren, d.h. Tensiden. Die molekulare Struktur dieses Systems ist jedoch vielmehr ein Aggregat im Sinne von inversen Mizellen. US-A-5,073,381 beschreibt amphiphile Netzwerke zur Freisetzung von Wirkstoffen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Katalysatorsystem bereitzustellen, welches befähigt ist, Enzyme, Peptide und andere enantioselektive Katalysatoren zu stabilisieren und zu aktivieren, so daß organische Synthesereaktionen, insbesondere solche zur Wirkstoffsynthese, auch in organischen Lösungsmitteln bzw. wenn Metallkatalysatoren oder metallorganische Katalysatoren vorgesehen werden, auch in wässrigen Lösungsmitteln effizient durchgeführt werden können.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Insbesondere wird ein immobilisierter Katalysator bzw. Katalysatorsystem bereit- gestellt, wobei der Katalysator, insbesondere ein Enzym oder ein Peptid, in ein aus mindestens einer hydrophilen und einer hydrophoben Komponente aufgebautes, segmentiertes amphiphiles Netzwerk, das eine Nanophasenseparation der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten im Bereich von 5 nm bis 500 nm, vorzugsweise 8 bis 300 nm, beson- ders bevorzugt 8 bis 50 nm, aufweist, eingebracht ist. Ein derartiger immobilisierter Katalysator kann durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend die Schritte:
(i) Herstellen eines segmentierten amphiphilen Polymernetzwerks durch Copo- lymerisation zweier Makromonomere unterschiedlicher Hydrophilie bzw. eines Monomers und eines Makromonomers mit jeweils unterschiedlicher Hydrophilie und
(ii) Beladen des Polymernetzwerks mit dem Katalysator.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Immobilisierung empfindlicher Katalysatoren, wie insbesondere Enzyme oder Peptide, in einem segmentierten amphiphilen Polymernetzwerk gerichtet. Unter einem segmentierten Netzwerk werden allgemein Netzwerkstrukturen verstanden, in denen ein Polymer A als ein makromolekularer Vernetzer für ein Polymer B fungiert. Das segmentierte, amphiphile Polymemetz- werk der vorliegenden Erfindung weist erfindungsgemäß eine Nanophasenseparation auf, so daß hydrophile und hydrophobe Einheiten des Polymernetzwerks im Bereich von 5 nm bis 500 nm benachbart liegen. Insofern die Phasenseparation über AFM-Messungen beobachtet bzw. bestimmt wird, wird die an sich dreidimensionale Phasenseparation im Rahmen der vorliegenden Erfindung in eine eindimensionale Größe übersetzt. Diese Nanophasenseparation ist sowohl auf der Oberfläche als auch in der Masse des erfindungsgemäß eingesetzten segmentierten, amphiphilen Polymernetzwerks gegeben. Diese spezielle Netzwerkkonfiguration ermöglicht den freien Zugang zu dessen Inneren sowohl für Katalysatoren wie Enzyme oder Peptide (in wässriger Phase) als auch Substrate (in organischer Phase), was für das erfindungsgemäße Katalysatorsystemkonzept beispielsweise bei dessen Einsatz zur Wirkstoffsynthese wesentlich ist.
Journal of Molecular Catalysis A: Chemical 129 (1998), Seiten 27-34, bzw. Journal of Molecular Catalysis A: Chemical 130 (1998), Seiten 85-93, beschreibt kata- lytisch aktive Pd-Partikel in einem amphiphilen Netzwerk, welches zwar hydrophile und hydrophobe Domänen enthält. Es handelt es sich dabei aber nicht um ein segmentiertes Netzwerk, in dem eine Phasenseparation der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten in der Größenordnung von 5 nm bis 500 nm vorliegt, da lediglich niedermolekulare Monomere zur Erzeugung des Netzwerks eingesetzt werden, so daß nur eine sehr kleinräu- mige Phasenseparation erreicht wird.
Grundsätzlich ist die Nanophasenseparation erfindungsgemäß derart gestaltet, daß die Größe der Domänen nicht kleiner als der einzulagernde Katalysator ist. Die Nanophasenseparation kann beispielsweise durch AFM-Messungen bestätigt werden. In Abhängigkeit von der Art des Lösungsmittels (wäßrig, organisch) quel- len entweder die hydrophilen oder die hydrophoben Bereiche im erfindungsgemäß eingesetzten Polymernetzwerk. Infolgedessen kann ein Katalysator, wie insbesondere ein Enzym oder ein Peptid, in einem hydrophilen (hydrophoben) Lösungsmittel in das amphiphile Netzwerk eindiffundieren und dann in einem anderen hydrophoben (hydrophilen) Lösungsmittel eine katalytische Aktivität entfalten. Die Verteilung des Katalysators im erfindungsgemäß verwendeten amphiphilen Polymernetzwerk ist homogen. Zudem gewährleistet die enge Nachbarschaft von hydrophilen und hydrophoben Bereichen geringe Diffusionswege. Beides sind Voraussetzungen für eine effiziente katalytische Reaktion. Fig. 1 veranschaulicht schematisch die erfindungsgemäße Katalysatorsystemkonzeption, worin beispielhaft ein Enzym in einem hydrophilen (wässrigen) Lösungsmittel in die hydrophile Phase des amphiphilen, segmentierten Netzwerks eindif- fundiert und dann in einem anderen hydrophoben (organischen) Lösungsmittel seine katalytische Aktivität entfaltet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der eingesetzte Katalysator ein Enzym oder ein Peptid, vorzugsweise ein Enzym. Die Klas- se des in das Netzwerk inkorporierten Enzyms unterliegt keiner spezifischen Beschränkung. So kommen im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Enzyme Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen in Frage. In besonders vorteilhafter Weise können im Rahmen der vorliegenden Erfindung Peroxidasen bzw. als deren Untergruppe Häm-Enzyme, die den Komplex Eisen-Protoporphyrin IX als prosthetische Gruppe enthalten, und Hydrolasen eingesetzt werden. Insbesondere ist hier Meerrettichperoxidase (HRP) und Chlorper- oxidase (CPO) als entsprechende Peroxidasen und Trypsin als entsprechende Hydrolase anzuführen. Als Peptid kommen insbesondere Transportproteine wie Hämoglobin und Myoglobin in Frage.
Peroxidasen können eine Reihe synthetisch nützlicher Reaktionen katalysieren, wie z.B. Polymerisationen elektronenreicher Aromaten, asymmetrische Sulfoxida- tionen und Epoxidierungen. Das Potential der Peroxidasen im Bereich der (asymmetrischen) Biotransformationen wird derzeit kaum in einer kommerziellen Synthese ausgenutzt, da diese Enzyme zwei große Nachteile aufweisen. Zum einen werden Peroxidasen wie Häm-Enzyme durch Peroxide inaktiviert. Zum anderen limitiert die schlechte Wasserlöslichkeit vieler synthetisch interessanter Substrate bei Peroxidasen genauso wie bei den meisten anderen Enzymen die kommerzielle Anwendung der enzymatischen Biotransformationen. Eine Lösung dieses allgemeinen Problems wird erfindungsgemäß durch das Immobilisieren bzw. Einbetten solcher Enzyme wie beispielsweise Peroxidasen in eine segmentierte amphiphile Polymermatrix mit der vorstehenden Nanophasenseparation erreicht. Neben solchen Enzymen können im Rahmen der vorliegenden Erfindung aber auch empfindliche Metallkatalysatoren bzw. metallorganische Katalysatoren eingesetzt werden, die durch das Immobilisieren bzw. Einbetten in eine amphiphile Polymermatrix stabilisiert und aktiviert werden. So können wasserempfindliche Metallkatalysatoren durch Einschluß in die hydrophoben Phasen bzw. Bereiche der erfindungsgemäß verwendeten, segmentierten amphiphilen Polymernetzwerke stabilisiert und aktiviert werden. Als empfindliche Metallkatalysatoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind der Shar- pless-Katalysator zur asymmetrischen Epoxidation von Allylalkoholen, Grubbs- Katalysatoren zur Metathese von Alkenen bzw. Alkinen oder auch Pd- Nanoteilchen zur Heck-Reaktion oder zur Hydrierung, zu nennen.
Polymernetzwerke sind Polymere, bei denen die Polymerketten dreidimensional untereinander verknüpft sind. Bei einem Netzwerk sind sämtliche Polymerketten miteinander verknüpft, es liegt ein einziges großes Molekül vor. Die Synthese von Netzwerken kann prinzipiell durch Vernetzung von linearen Polymerketten mittels Polymer-analoger Reaktion oder durch eine vernetzende Copolymerisation mit einem niedermolekularen Vernetzer erfolgen. Bei der Copolymerisation können anstelle von Monomeren auch Makromonomere eingesetzt werden. Unter diesem Begriff versteht man Oligo- oder Polymere mit polymerisierbaren Gruppen. Durch die Copolymerisation eines an beiden Endgruppen mit einer polymerisierbaren Gruppe modifizierten Makromonomers und einem niedermolekularen Monomer entstehen Netzwerke mit einer segmentierten Topologie, die zwischen der von gepfropften bzw. Kammpolymeren und der von interpenetrierenden Netzwerken angesiedelt ist. Derartig aufgebaute segmentierte Polymernetzwerke, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, werden üblicherweise mit Poly(A)-linked-Poly(B) bezeichnet, wobei Poly(A) ein polymerer Vernetzer für das Monomer B ist.
Chemisch vernetzte Polymere sind in allen Lösungsmitteln grundsätzlich unlöslich. Gibt man jedoch ein Polymernetzwerk in ein Lösungsmittel, welches mit den Polymersegmenten gut verträglich ist, so dringt Lösungsmittel in die Probe ein. Das Polymer quillt, bis sich ein Gleichgewicht zwischen dem osmotischen Druck des Lösungsmittels und der elastischen Rückstellkraft der Kettensegmente eingestellt hat. Ein gequollenes Netzwerk bezeichnet man als Gel.
Ist nun bei einem aus zwei Komponenten aufgebauten Netzwerk die eine Komponente hydrophil und die andere hydrophob, so ist das Netzwerk in einem weiten Bereich von Zusammensetzungen sowohl in organischen Lösungsmitteln als auch in wäßrigen Medien quellbar. Man spricht dann von einem amphiphilen Netzwerk. Die starke Unverträglichkeit zwischen den polaren und unpolaren Komponenten bzw. Kettensegmenten führt zu einer Phasenseparation, dabei verhindern allerdings die kovalenten Bindungen zwischen den Segmenten eine makroskopische Phasentrennung, es kommt lediglich zu einer viel kleinräumigeren Trennung, und es bilden sich Domänen im Nanometerbereich. Die Netzwerke erscheinen dadurch makroskopisch homogen und optisch klar. Amphiphile Netzwerke sind aus miteinander nicht mischbaren, d.h. unverträglichen Polymerketten aufgebaut. Als häufigste Synthesestrategie ist im Stand der Technik die vorstehend diskutierte Makromonomermethode zu finden, welche die Copolymerisation eines Makromonomeren mit einem niedermolekularen Monomer vorsieht und, topologisch betrachtet, zu segmentierten Netzwerken führt.
Die erfindungsgemäß verwendeten segmentierten amphiphilen Netzwerke können durch Copolymerisation eines Monomers (hydrophil oder hydrophob) mit einem Makromonomer (hydrophob oder hydrophil) bzw. durch Copolymerisation zweier Makromonomere unterschiedlicher Hydrophilie erzeugt werden. Vorzugsweise wird in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein hydrophobes Makromonomer mit einem hydrophilen Monomer copolymerisiert.
Die hydrophobe Komponente des segmentierten, amphiphilen Netzwerks unterliegt keiner spezifischen Beschränkung. So können beispielsweise Monomere bzw. Komponenten auf Basis von Alkyl(meth)acrylaten (z.B. Methylmethacrylat, n- Butylmethcrylat, n-Hexylmethycrylat), Styrol, Vinylacetat, Olefinen (wie z.B. Pro- pylen, Ethylen, Isopren, Cyclooctadien, etc.), Poly(ε-Caprolacton), Milchsäure, Di- isocyanaten, Diolen, Diaminen, Disäuren, Polylactiden, Polypropylenfumarat, Diglycidylethem von Bisphenol A, Poly-THF, Polyalkyloxazolinen (z.B. 2- Phenyloxazolin), Perfluorpolyethern oder Siloxanen wie Dimethylsiloxan, etc., sowie Copolymeren dieser Monomere zum Einsatz kommen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die hydrophobe Komponente des segmentierten, amphiphi- len Netzwerks vorzugsweise ein Polydialkylsiloxan-Makromonomer wie insbesondere ein Polydimethylsiloxan-Makromonomer. Das Molekulargewicht eines solchen Polydialkylsiloxan-Makromonomers unterliegt wiederum keiner spezifischen Beschränkung. Beispielsweise können Polydialkylsiloxan-Makromonomere wie z.B. Polydimethylsiloxan-Makromonomere mit einem Molekulargewicht Mn im Be- reich von 500 bis 1.000.000 g/mol3 eingesetzt werden. Üblicherweise wird zur Synthese des segmentierten, amphiphilen Netzwerks ein α,ω- endgruppenfunktionalisiert.es Polydialkylsiloxan-Makromonomer, beispielsweise ein bifunktionelles ,ω-Methacryloyloxypropyl-funktionalisiertes PDMS- Makromonomer (PDMS(MA)2) mit einem Molekulargewicht Mn im Bereich von 500 bis 1.000.000 g/mol3 eingesetzt.
Die hydrophile Komponente des segmentierten, amphiphilen Netzwerks unterliegt keiner spezifischen Beschränkung. So können beispielsweise Komponenten auf Basis von Monomeren, wie (Meth)acrylat und dessen Derivate, Diisocyanate, Diole, Diamine, Disäuren, Acylamid, N-Isopropylacrylamid, N-Vinylcaprolactam, 2,3-Dihydroxypropylmethycrylat, Maleinsäure, Fumarsäure oder Vinylacetat, oder auf Basis von Makromonomeren wie Poly-1 ,3-dioxolan, Polyethylenimin, Polypro- pylenimin, Polyethylenglycol, Polypropylenglycol und Polyoxazolinen mit Methacrylat-, Epoxy, Amino-, Isocyanato- oder Hydroxylendgruppen, etc., zum Einsatz kommen. Die hydrophile Komponente wird vorzugsweise aus (Meth)acrylsäure, (Meth)acrylat und deren Derivaten, insbesondere Hydroxyethyl- acrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Dimethylacrylamid und Dimethylaminoethyl- methacrylat, ausgewählt. Mit den Bezeichnungen (Meth)acrylsäure bzw. (Meth)acrylat sind hier im folgenden Acrylsäure und Methacrylsäure bzw. Acrylat und Methacrylat gemeint. Selbstverständlich können auch amphiphile und nicht-amphiphile Blockcopolyme- re, Triblockcopolymere usw. (AB, ABA, BAB) als Bausteine zur Erzeugung des segmentierten, amphiphilen Netzwerks eingesetzt werden, und zwar mit Blöcken aus den vorgenannten Monomeren, beispielsweise ein unter dem Handelsnamen Pluronic® erhältliches Polyethylenglycol-b-Polypropylenglycol-b-Polyethylenglycol.
Um zu verhindern, daß die starke Unverträglichkeit zwischen den unterschiedlichen Kettensegmenten nicht schon bei der Synthese zu einer makroskopischen Phasentrennung führt, werden die erfindungsgemäß vorgesehenen amphiphilen Netzwerke üblicherweise nicht in Masse, sondern aus einer Lösung als Gele po- lymerisiert. Wenn die Monomere nicht miteinander mischbar sind und die Verwendung von Phasen vermittelnden Lösungsmitteln nicht ausreichend ist bzw. wenn eines der Monomere bereits in diesem unlöslich ist, so können in vorteilhafter Weise Schutzgruppen-modifizierte Monomere eingesetzt werden. Diese können dann aus Lösung oder in Masse polymerisiert werden. Ein Beispiel für diese Strategie ist der Ersatz des hydrophilen Monomers Methacrylsäure (MAA) durch das hydrophobe Trimethylsilylmethacrylat (TMSMA), welches mit hydrophoben Makromonomeren und organischen Lösungsmitteln gut verträglich ist. Es entstehen dann zunächst Vorläufernetzwerke, deren polare Kettensegmente Trime- thylsilyl-Schutzgruppen tragen. Um daraus ein segmentiertes, amphiphiles Netzwerk zu erhalten, werden die Schutzgruppen dann in einem zweiten Schritt durch Hydrolyse mit Alkohol/Wasser-Gemischen abgespalten.
Vorzugsweise werden die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren segmen- tierten, amphiphilen Netzwerke durch thermisch oder UV-initiierte radikalische Copolymerisation von PDMS-Makromonomeren und (Meth)acrylaten- bzw. deren Derivate synthetisiert, wobei als hydrophile Komponenten vorzugsweise Methacrylsäure (MAA), Hydroxyethylmethacrylat (HEMA), Hydroxyethylacrylat (HEA) und Dimethylaminoethylmethacrylat (DMAEMA) zum Einsatz kommen. MAA, HEMA und HEA können dabei in Form ihrer hydrophoben Trimethylsiiyl- geschützten Derivate ins Polymernetzwerk inkorporiert werden, wonach das Vorläufernetzwerk anschließend durch Entfernung der Schutzgruppen in ein segmentiertes, amphiphiles Netzwerk überführt wird. Mittels der vorstehend ausgeführten Synthesestrategie können beispielsweise auch PHEMA-I-PIB bzw. PMAA-I-PIB basierende Netzwerke hergestellt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die segmentierten, amphiphilen Netzwerke durch radikalische Copolymerisation eines Polydimethylsiloxan (PDMS)-Makromonomers mit zwei Methacrylat- Endgruppen und des Monomers Hydroxyethylacrylat (HEA) hergestellt werden. Ein derartiges Copolymerisat weist die gewünschte Phasenseparation auf. Wäh- rend die hydrophile Phase (Poly-HEA) selektiv in Wasser quillt, kann die hydrophobe Phase (PDMS) in Lösungsmitteln wie Toluol oder n-Heptan gequollen werden. Derartige amphiphile Netzwerke können erfindungsgemäß mit Enzymen, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase (HRP) oder Chlorperoxidase (CPO), beladen werden, indem sie in einer wäßrigen Enzymlösung inkubiert werden. Nach dem Trocknen befindet sich das Enzym in der hydrophilen Phase des Netzwerks und zeigt bei einer HRP-katalysierten Reaktion wie beispielsweise der oxidativen Kupplung von Phenol und N,N-Dimethylphenylendiamin mit t-Butylhydroperoxid in n-Heptan gegenüber dem freien Enzym eine um mehr als das 40 bis 120-fache höhere Aktivität und eine bis dreimal höhere Stabilität. Bei der CPO-katalysierten Reaktion bezüglich der oxidativen Kupplung von Phenol und N,N- Dimethylphenylendiamin mit t-Butylhydroperoxid in n-Heptan wurde gegenüber dem freien Enzym eine um mehr als das 18-fache höhere Aktivität und eine bis zwanzigmal höhere Stabilität beobachtet. Eine derartig überraschende vorteilhafte Eigenschaft wird jedoch nicht bei einer Trägerung der jeweiligen Enzyme in Netz- werken, die aus PHEA und einem kurzkettigen Vernetzer aufgebaut sind und demgemäß keine Nanophasenseparation im erforderlichen Bereich zeigen, beobachtet.
Die erfindungsgemäß verwendeten segmentierten, amphiphilen Netzwerke kön- nen in Form von Filmen bereitgestellt werden, welche mit dem Katalysator wie z.B. einem Enzym beladen sind, der wiederum durch den Einschluß in das segmentierte, amphiphile Polymernetzwerk stabilisiert und aktiviert wird und damit für Reaktionen in organischen Lösungsmitteln einsetzbar gemacht wird. Die erfin- dungsgemäße Immobilisierung empfindlicher Katalysatoren wie z.B. Enzyme durch die Verwendung segmentierter amphiphiler Polymernetzwerke ermöglicht insbesondere, daß im organischen Lösungsmittel selektiv die hydrophobe Phase quillt, während sich die Enzymmoleküle in der hydrophilen Phase befinden und von dieser schützend umschlossen werden. Somit sind die hydrophilen Phasen und damit auch die Enzymmoleküle üblicherweise leicht für im organischen Lösungsmittel gelöste Substrate zugänglich, wodurch die Enzymaktivität gesteigert wird.
Bei Einlagerung solcher Enzyme in die erfindungsgemäß verwendeten segmentierten, amphiphilen Polymernetzwerke zeigen die beladenen Netzwerke, wenn als Film bereitgestellt, nach drei Wochen Lagerung bei 4°C keinen merklichen Aktivitätsverlust. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Einlagerung von derartigen Katalysatoren, wie insbesondere Enzymen, gegenüber einer Trägerung an mikroporö- sen Materialien wie z.B. Silica, liegt insbesondere darin, daß es sich um ein organisches Polymer handelt, welches das segmentierte, amphiphile Polymernetzwerk aufbaut, was eine beliebige Formgebung ermöglichen kann. Zudem ist die Katalysatorverteilung im Trägermaterial viel feiner als bei entsprechenden mikroporösen Materialien, da Domänen im Nanometerbereich vorliegen und sich der Katalysator nicht nur auf einer inneren Oberfläche befindet, sondern direkt in eine der Phasen eingelagert ist. In Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt es insofern zu einer Anreicherung des Enzyms im Polymernetzwerk. Dies ist darauf zurückzuführen, daß Enzyme die Tendenz besitzen, sich an Oberflächen anzulagern. Fasst man die Grenzflächen zwischen den hydrophilen und den hydropho- ben Bereichen bzw. Phasen des Netzwerkes als Oberfläche auf, so ergibt sich durch die Nanophasenseparation eine sehr große „innere" Oberfläche, an der sich die Enzyme im Vergleich zur Lösung aufkonzentrieren können. In Abhängigkeit von der Enzymkonzentration in der entsprechenden Lösung, mit welcher das Polymernetzwerk in Schritt (b) behandelt wird, und dem spezifischen chemischen Aufbau des gewählten segmentierten amphiphilen Polymernetzwerks werden üblicherweise Beladungen im Bereich von 1 bis 100 μg Enzym, wie z.B. HRP, pro cm2 Polymernetzwerk (entspricht 0,5 mg/cm3 bis 500 mg/cm3) in der Form eines Films erreicht. Die Quantifizierung der Enzymbeladung kann z.B. im Falle von Meerret- tichperoxidase durch UV/VIS-Spektroskopie erfolgen.
Die meisten Enzyme sind üblicherweise in organischen Lösungsmitteln unlöslich. Sie werden üblicherweise als Lyophilisat kristallin oder auf bestimmten Materialien geträgert eingesetzt. Bei den Trägermaterialien handelt es sich sehr häufig um mikroporöse Materialien wie Silica. Takahashi et al., Chemical Materials, 2000, Bd. 12, Seiten 3301-3305, beschreibt die Trägerung von Meerrettichperoxidase an Silica, wobei eine Steigerung der Aktivität um den Faktor 10 erreicht wird. Demge- genüber zeigt eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren stabilisierte Meerrettichperoxidase in organischen Lösungsmitteln eine gegenüber dem reinen Enzym um das 120-fache gesteigerte Aktivität. Dies ist insbesondere darauf zurückzuführen, daß das Enzym durch den Einschluß in die hydrophile Phase des segmentierten, amphiphilen Netzwerks „quasi-gelöst" vorliegt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen immobilisierten Katalysatorsystems in der organischen Synthese, insbesondere der Wirkstoffsysnthese.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von segmentierten amphiphilen Polymernetzwerken, die eine Nanophasenseparation der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten im Bereich von 5 nm bis 500 nm aufweisen, zur Immobilisierung von Katalysatoren, wie insbesondere Enzymen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiele
1. Modifizierung von Glasoberflächen mit Methacrylatgruppen
Mit einem Glasschneider wurden Objektträger (mit Mattrand, Länge: 7,6 cm) auf die Breite eines Tesafilms (1 ,5 cm) zurechtgeschnitten und anschließend mit Pi- ranha-Lösung (45 ml konz. H2S04 und H202-Lösung (30 %) im Verhältnis 3:2) in einem Färbetrog und unter Einwirkung von Ultraschall angeätzt.
Anschließend wurden sie mit Wasser gespült und an Luft getrocknet. Die so vor- behandelten Objektträger wurden in einem Färbetrog mit einer Lösung von 3- Methacryloyltrimethoxysilan (50 ml, 20 Vol.-% in Toluol) versetzt und bei Raumtemperatur 2 h geschüttelt. Danach überführte man sie in einen weiteren, mit Wasser (50 ml) gefüllten Trog, behandelte sie für 5 min mit Ultraschall, tauschte das Wasser aus (50 ml) und behandelte erneut mit Ultraschall (5 min). Abschlie- ßend wurden die Objektträger mit Wasser gespült, an Luft getrocknet und über Nacht bei Raumtemperatur gelagert.
2. Herstellung dünner, kovalent an Oberflächen gebundener Filme
Ein Monomergemisch für Polyhydroxyethylacrylat-l-polydimethylsiloxan-Filme (PHEA-I-PDMS) wurde hergestellt, indem der Photoinitiator Irgacure 651 (5 mg/ml) in frisch destilliertem Trimethylsilyloxyethylacrylat (TMSOEA) unter Schütteln gelöst, dazu PDMS5.2(MA)2 gegeben und erneut kräftig geschüttelt wurde.
Auf einen un modifizierten Objektträger wurde blasen- und faltenfrei ein Streifen Tesafilm geklebt und auf diesen das Monomergemisch (60 μl) gleichmäßig aufgetragen. Anschließend wurde ein „silanisierter" Objektträger parallel zum Tesafilm unter Vermeidung eines Luftblaseneinschlusses auf das Monomergemisch gelegt. Die Polymerisation erfolgte durch Bestrahlen mit einer handelsüblichen UV- Polymerisationslampe (Heraflash der Fa. Heraeus Kulzer) (2 x 180 s von jeder Seite mit jeweils 30 s Abkühlzeit zwischen den Belichtungen; Gesamtbelichtungszeit: 720 s). Der Tesafilm wurde dann mitsamt dessen Träger vorsichtig von dem amphiphilen Film gelöst und letzterer in ein MeOH/H20 Gemisch (9 ml pro Objektträger, 1 :1 ) gegeben. Darin wurde er bei Raumtemperatur für mindestens 12 h unter Schütteln und mit zweimaligen Wechseln des Lösungsmittels inkubiert. Anschließend wurden die geträgerten Filme mit MeOH gewaschen und im Trockenschrank (50 mbar, 60°C) bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Auf diese Weise wurden PHEA-I-PDMS-Filme der Zusammensetzung 91/9, 77/23, 50/50, 41/59 bzw. 9/91 hergestellt.
3. Herstellung dünner, ungeträgerter PHEA-I-PDMS-Filme
Es wurden ungeträgerte PHEA-I-PDMS-Filme der Zusammensetzung 90/10, 77/23, 50/50, 30/70 bzw. 10/90 hergestellt. Die Synthese erfolgte analog zu der oben für die Herstellung von kovalent an Träger gebundene Filme beschriebenen Methode. Anstelle eines oberflächenmodifizierten Objektträgers wurde ein unmo- difizierter verwendet, der Film ließ sich nach dem Entschützen in MeOH/Wasser von diesem im Wasserbad trennnen. Anschließend wurde er auf eine Teflonfolie überführt und auf dieser zunächst an Luft, später im Trockenschrank (50 mbar, 60°C) getrocknet.
4. Beladung von dünnen, kovalent an Träger gebundenen amphiphilen Netzwerken mit Enzymen
Von den vorstehend erhaltenen Filmen wurde das Mattrandende des Objektträ- gers mit einem Glasschneider entfernt, die Träger mit dem Film nach oben zeigend in eine eigens dafür gefertigte Teflonwanne (Innenabmessungen: 5,7 x 1 ,7 cm, Tiefe: 1 ,5 cm) gelegt und mit Enzymlösung (2 ml, c = 1 mg/ml bzw. 25 μmol/l, Meerrettichperoxidase (HRP) in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7) versetzt. Anschließend wurde bei T = 4°C unter Schütteln für mindestens 16 h inkubiert, dann der Film aus dem Beladungsbad genommen, mit einem Papiertuch getrocknet, mit Phosphatpuffer gespült (3 x 5 ml) und erneut mit einem Papiertuch getrocknet. Zum abschließenden Trocknen wurde der beladene Film an Luft stehen gelassen (30 min). Die Lagerung der Filme erfolgte bei 4°C. 5. Aktivitätsbestimmung geträgerter und suspendierter HRP am Beispiel der oxidativen Kupplung von Dimethylaminoanilin und Phenol in Heptan
Aktivitätsassays mit Dimethvlaminoanilin und Phenol wurden in n-Heptan durch- geführt. Es wurden die folgenden Lösungen angesetzt: 1. Dimethylaminoanilin-Lösung (2,724 mg/ml, 20,00 mM in n-Heptan) 2. Phenol-Lösung (1 ,882 mg/ml, 20,00 mM in n-Heptan) 3. te/t-Butylhydroperoxid (10 mM in n-Heptan): 9,10 μl einer fe/f-BuOOH-Lösung (ca. 5,5 M in Dekan) wurden mit Heptan auf 5 ml aufgefüllt.
Die Konzentrationen im Assayvolumen betrugen (s.u.): c(Dimethylaminoanilin) = 1 ,67 mM, c(Phenol) = 1 ,67 mM, c (H202 bzw. f-BuOOH) = 0,83 mM.
Aktivitätsassay von HRP-beladenen amphiphilen Filmen:
Aktivitätsassays wurden mit HRP-beladenen PHEA-/-PDMS-Filmstücken der Zusammensetzung 77/23 (A(Film) = 0,7 - 1 ,3 cm2) in n-Heptan durchgeführt. Die Flächenkonzentration an HRP lag zwischen 10 bis 24 μg/cm2. Für den Blindver- such wurde ein mit Trypsin beladenes PHEA-/-PDMS (77/23)-Filmstück verwendet. Die Filmstücke wurden in eine Küvette (d = 1 cm) gegeben, Lösungsmittel (1 ,8 ml), Dimethylaminoanilin-Lösung (200 μl) und Phenol-Lösung (200 μl) zugesetzt und die Reaktion durch Zugabe von f-BuOOH-Lösung (200 μl) gestartet. Die Aktivität des Enzyms wurde durch die Zunahme der Absorption im Absorptions- maximum des gebildeten Farbstoffes (λmax = 546 nm) gegen reines Lösungsmittel als Hintergrund gemessen. Dazu wurde die Reaktionslösung mit einem Rührfisch gerührt und in regelmäßigen Abständen (60 s bzw. 5 min) die Absorption aufgezeichnet.
Aus dem linearen Bereich der Reaktionen (tRxn = 30 - 70 min) kann unter Berücksichtigung der Blindreaktion nach der folgenden Gleichung die spezifische Aktivität bestimmt werden: ^S46 m ^*Blind,546nm Δt Δt ssppeezz 1000 [U/μg] A(Film) • c Fläche
Eine Unit wurde definiert als die Zunahme der Absorption im Absorptionsmaximum um 0,001 pro Minute bei einem Reaktionsvolumen von 2,4 ml und einer Schichtdicke von 1 cm.
Die spezifischen Aktivitäten der geträgerten HRP betrugen 0,02 bis 0,05 U/μg Enzym, während das Enzym über einen Zeitraum von ca. 40 min keine Abnahme der Aktivität zeigte.
Aktivitätsassay von ungeträgerter HRP
Die Aktivität von ungeträgerter HRP wurde in n-Heptan in zwei Versuchen mit unterschiedlichen Enzymmengen bestimmt (350 μg und 740 μg). Für jeden dieser Versuche wurde in mehreren Rollrandgläsern die gleiche Enzymmenge eingewogen und jeweils 1 ,8 ml Heptan (auf 25 °C temperiert) zugegeben. Anschließend suspendierte man das Lyophilisat durch kurze Ultraschallbehandlung gab Dimethylaminoanilin-Lösung (je 200 μl) und Phenol-Lösung (je 200 μl) zu und startete die Reaktionen simultan durch Zugabe von f-BuOOH-Lösung (je 200 μl). Man rührte kräftig bei 25 °C. In zeitlichen Abständen von zunächst 2 bis 5 min und ab einer Reaktionszeit von 20 min wurde jeweils einer der Ansätze durch einen Spritzenfilter filtriert und die Absorption des Filtrats bei 546 nm gemessen (Schichtdicke 1 cm).
Die spezifische Aktivität ergibt sich gemäß nachstehender Gleichung unter Berücksichtigung der Blindreaktion (s.o.) aus dem linearen Bereich der Reaktionen
^5.6κm -Blind,546nm Die spezifische Aktivität von suspendierter HRP lag bei 0,0004 bis 0,0005 U/μg Enzym, während die Aktivität über ca. 20 min keine Abnahme der Aktivität zeigte.
Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Chlorperoxidase (CPO) als Katalysator bzw. Enzym erzielt.
Beladung von PHEA-I-PDMS-Filmen mit weiteren Enzymen bzw. Peptiden:
Durchführung: siehe Ausführungsbeispiel für Meerrettichperoxidase Lösungen jeweils in Acetatpuffer (pH 5,0, 0,1 M) Trypsin: 1 mg/ml, 42 μmol/ml Myoglobin: 1 mg/ml, 53 μmol/mol Hämoglobin: 1 mg/ml, 15,5 μmol/ml
Trypsin-Aktivitätsassay:
Die Aktivität von Trypsin wurde durch die Aminolyse von Nα-Benzoyl-L-Arginin-p- Nitroanilid (Bz-L-Arg-NH-Np) durch L-Leucinamid (L-LeuNH2) in Toluol bei Raumtemperatur bestimmt. Dazu wurden 7 μl einer 50 mM Bz-L-Arg-NH-Np- Hydrochlorid-Lösung in MeOH zu Toluol (875 μl) gegeben und ein Wassergehalt von 50 mM durch Zugabe von 18 μl einer wasserhaltigen Acetonlösung (5 Vol.-% Wasser) eingestellt. Nach Zugabe des Katalysators (Trypsin in PHEA-I-PDMS bzw. natives Trypsin) wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100 μl einer 100 mM L-LeuNH2-Lösung in Toluol, die 2 vol% MeOH enthielt, gestartet. Die Reakti- on wurde durch die Zunahme der Absorption bei 349 nm verfolgt, als Hintergrund diente eine Blindreaktion, zu der ein unbeladenes PHEA-I-PDMS-Polymer zugegeben wurde.
Trypsin in PHEA-I-PDMS (77 Gew.% PHEA) zeigte nach 24 h einen um 3 Grö- ßenordnungen höheren Umsatz pro Menge Enzym als ungeträgertes natives Trypsin.

Claims

Ansprüche
1. Immobilisierter Katalysator, wobei der Katalysator in ein aus mindestens einer hydrophilen und einer hydrophoben Komponente aufgebautes, segmentiertes amphiphiles Netzwerk, das eine Nanophasenseparation der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten im Bereich von 5 nm bis 500 nm aufweist, eingebracht ist.
2. Katalysator nach Anspruch 1 , wobei der Katalysator ein Enzym oder ein Peptid ist.
3. Katalysator nach Anspruch 2, wobei das Enzym eine Peroxidase, insbeson- dere Meerrettichperoxidase oder Chlorperoxidase, oder eine Hydrolase, insbesondere Trypsin, ist
4. Katalysator nach Anspruch 2, wobei das Peptid ein Transportprotein, insbesondere Myoglobin oder Hämoglobin, ist.
5. Katalysator nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die hydrophobe Komponente ein Polydialkylsiloxan-Makromonomer mit einem Molekulargewicht Mn im Bereich von 500 bis 1.000.000 g/mol3 ist.
6. Katalysator nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die hydrophile Komponente aus (Meth)acrylsäure, (Meth)acrylat oder deren Derivaten ausgewählt ist.
7. Verfahren zur Herstellung des immobilisierten Katalysators nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Schritte:
(i) Herstellen eines segmentierten, amphiphilen Polymernetzwerks durch Copolymerisation zweier Makromonomere unterschiedlicher Hydrophi- lie bzw. eines Monomers und eines Makromonomers mit jeweils unterschiedlicher Hydrophilie und
(ii) Beladen des Polymernetzwerks mit dem Katalysator.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin in Schritt (i) ein hydrophobes Makromo- nomer mit einem hydrophilen Monomer umgesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das hydrophobe Makromonomer ein α,ω- endgruppenfunktionalisiertes Polydialkylsiloxan-Makromonomer mit einem Molekulargewicht Mn im Bereich von 500 bis 1.000.000 g/mol3 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei das hydrophile Monomer aus (Meth)acrylsäure, (Meth)acrylat oder deren Derivaten, insbesondere Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Dimethylacrylamid oder Di- methylaminoethylmethacrylat, ausgewählt ist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 7 bis 10, worin das Polymernetzwerk in Schritt (i) durch UV-initiierte radikalische Copolymerisa- tion in Masse durchgeführt wird.
12. Verwendung des immobilisierten Katalysators nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6 in der organischen Synthese, insbesondere der Wirkstoffsynthese.
13. Verwendung von segmentierten amphiphilen Polymernetzwerken, die eine Nanophasenseparation der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten im Bereich von 5 nm bis 500 nm aufweisen, zur Immobilisierung von Katalysatoren wie insbesondere Enzymen und Peptiden.
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