EP1664103A2 - Genetic products which are differentially expressed in tumours and use thereof - Google Patents

Genetic products which are differentially expressed in tumours and use thereof

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Publication number
EP1664103A2
EP1664103A2 EP04765088A EP04765088A EP1664103A2 EP 1664103 A2 EP1664103 A2 EP 1664103A2 EP 04765088 A EP04765088 A EP 04765088A EP 04765088 A EP04765088 A EP 04765088A EP 1664103 A2 EP1664103 A2 EP 1664103A2
Authority
EP
European Patent Office
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nucleic acid
tumor
associated antigen
antibody
expression
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04765088A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Özlem TÜRECI
Ugur Sahin
Michael Koslowski
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ganymed Pharmaceuticals GmbH
Original Assignee
Ganymed Pharmaceuticals GmbH
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Filing date
Publication date
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Priority to EP10011194A priority patent/EP2322544A3/en
Priority to EP16176546.6A priority patent/EP3095791B1/en
Priority to EP10011190A priority patent/EP2336156A3/en
Priority to EP10011192A priority patent/EP2314613A3/en
Priority to EP10011193.9A priority patent/EP2327721B1/en
Publication of EP1664103A2 publication Critical patent/EP1664103A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
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    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • cancer continues to be a leading cause of death.
  • More recent therapeutic concepts aim to include the patient's own immune system in the overall therapeutic concept by using recombinant tumor vaccines and other specific measures such as antibody therapy.
  • the prerequisite for the success of such a strategy is the detection of tumor-specific or tumor-associated antigens or epitopes by the patient's immune system, the effector functions of which are to be enhanced by intervention.
  • Tumor cells differ biologically from their non-malignant cells of origin. These differences are due to genetic changes acquired during tumor development and also lead to the formation of qualitatively or quantitatively changed molecular structures in the cancer cells.
  • tumor-associated antigens are recognized by the specific immune system of the tumor-bearing host, one speaks of tumor-associated antigens.
  • tumor-associated antigens arises from the fact that the recognition of antigens on neoplastic cells by the immune system leads to the initiation of cytotoxic effector mechanisms and, in the presence of T helper cells, can cause the cancer cells to be eliminated (Pardoll, Nat. Med. 4: 525-31, 1998). Accordingly, it is a central objective of tumor immunology to define these structures on a molecular basis. The molecular nature of these antigens has long remained enigmatic.
  • CTA cancer / testis antigens
  • CTA and genes encoding it are defined by their characteristic expression pattern [Tureci et al, Mol Med Today. 3: 342-9, 1997]. They are not found in normal tissues except for testis or germ cells, but are expressed in a number of human malignancies, and not specifically for the tumor type, but with different frequencies in tumor entities of very different origins (Chen & Old, Cancer J Sei. Am. 5:16 -7, 1999). Serum reactivities against CTA are also not found in healthy controls, but only in tumor patients.
  • a strategy for identifying and providing tumor-associated expressed antigens and the nucleic acids coding therefor was pursued.
  • This strategy is based on the fact that it is actually testis-specific and therefore germ-cell-specific Genes that are normally silent in adult tissues are reactivated ectopically and illegally in tumor cells.
  • data mining a complete list of all known Testis-specific genes is first drawn up and then evaluated by expression analysis using specific RT-PCR for their aberrant activation in tumors. Datamining is a well-known method for the identification of tumor-associated genes.
  • transcriptomes from normal tissue banks are usually electronically subtracted from tumor tissue banks on the assumption that the remaining genes are tumor-specific (Schmitt et al., Nucleic Acids Res. 27: 4251-60, 1999; Vasmatzis et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 300-4, 1998. Scheurle et al, Cancer Res. 60: 4037-43, 2000).
  • the invention relates to a strategy for identifying genes differentially expressed in tumors. This combines data mining from public sequence banks ("in silico") with subsequent evaluating laboratory experiments ("wet bench”).
  • CT Cancer / Testis
  • gene products were produced independently of an immunogenic effect.
  • the tumor-associated antigens identified according to the invention have an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which is selected from the group consisting of (a) a nucleic acid which comprises a nucleic acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 -5, 19-21, 29, 31-33, 37, 39, 40, 54-57, 62, 63, 70, 74, 85-88 a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid which under stringent conditions with the nucleic acid hybridized under (a), (c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
  • a tumor-associated antigen identified according to the invention has an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-5, 19-21, 29, 31-33, 37, 39 , 40, 54-57, 62, 63, 70, 74, 85-88 is selected.
  • a tumor-associated antigen identified according to the invention comprises an amino acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6-13, 14-18, 22-24, 30, 34-36, 38, 41, 58- 61, 64, 65, 71, 75, 80-84, 89-100, 101-117 a part or derivative thereof is selected.
  • the present invention relates generally to the use of tumor-associated antigens identified according to the invention or of parts thereof, of nucleic acids coding therefor or of nucleic acids which are directed against the coding nucleic acids or of antibodies which are directed against the tumor-associated antigens or parts thereof identified according to the invention are directed for therapy and diagnosis.
  • This use can relate to individual, but also combinations of several of these antigens, functional fragments, nucleic acids, antibodies, etc., in one embodiment also in combination with other tumor-associated genes and antigens for diagnosis, therapy and follow-up.
  • Preferred diseases for therapy and / or diagnosis are those in which there is selective expression or abnormal expression of one or more of the tumor-associated antigens identified according to the invention.
  • ectopic activation of genes in tumors can also be traced back to an altered gene methylation pattern of their nucleotide sequence. For example, that alterations of methylation on cytosine contribute to this (De Smet et al, 1996 and 1999).
  • the invention also relates to nucleic acids and gene products which are expressed in association with tumor cells and which result from altered splicing (splice variants) of known genes or from altered translation using alternative open reading frames.
  • These nucleic acids comprise the sequences according to (SEQ ID NO: 2-5, 20, 21, 31-33, 54-57, 85-88) of the sequence listing.
  • the gene products include sequences according to (SEQ ID NO: 7-13, 23, 24, 34-36, 58-61, 89-100) of the sequence listing.
  • splice variants can be used as targets for the diagnosis and therapy of tumor diseases.
  • a wide variety of mechanisms can be responsible for the formation of splice variants, for example the use of variable transcription initiation sites, the use of additional exons - complete or incomplete splice of single or several exons, mutation-modified splice regulator sequences (deletion or creation of new donor / acceptor sequences), incomplete elimination of intron sequences.
  • the changed splicing of a gene leads to a changed transcript sequence (splicing variant). If a splice variant is translated in the area of its changed sequence, a modified protein results, which can differ significantly in structure and function from the original one. With tumor-associated splice variants, tumor-associated transcripts and tumor-associated proteins / antigens can arise. These can be used as molecular markers both for the detection of tumor cells and for the therapeutic targeting of tumors.
  • the detection of tumor cells can be carried out in accordance with the invention, for example after extraction of nucleic acids by PCR amplification with splice variant-specific oligonucleotides.
  • all sequence-dependent detection systems are suitable for detection.
  • these are, for example, gene chip / microarray systems, Northern blot, RNAse protection assays (RDA) and others. All detection systems have in common that the detection is based on a specific hybridization with at least one splicing variant-specific nucleic acid sequence.
  • tumor cells can also be detected by antibodies which recognize a specific epitope coded by the splice variant.
  • Peptides for immunization that are specific for this splice variant can be used for the production of the antibodies.
  • Particularly suitable for immunization are the amino acids which have clear epitope differences from the variant (s) of the gene product, which is (are) preferably formed in healthy cells.
  • the detection of the tumor cells with antibodies can be carried out on a sample isolated from the patient or as imaging with intravenously applied antibodies.
  • splice variants which have new or modified epitopes, attractive targets for immunotherapy.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an agent which recognizes the tumor-associated antigen identified according to the invention and is preferably selective for cells which have expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the agent can induce cell death, reduce cell growth, damage the cell membrane or secrete cytokines and preferably has a tumor-inhibiting activity.
  • the agent is an antisense nucleic acid that selectively hybridizes to the nucleic acid encoding the tumor associated antigen.
  • the agent is an antibody which selectively binds to the tumor-associated antigen, in particular a complement-activated antibody which selectively binds to the tumor-associated antigen.
  • the agent comprises several agents, each of which selectively recognizes different tumor-associated antigens, at least one of the tumor-associated antigens being a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the detection does not have to be directly associated with an inhibition of activity or expression of the antigen.
  • this is selectively limited to tumors Antigen preferably as a marker for recruiting effector mechanisms at this specific location.
  • the agent is a cytotoxic T lymphocyte which recognizes the antigen on an HLA molecule and lyses the cell labeled in this way.
  • the agent is an antibody which selectively binds to the tumor-associated antigen and thus recruits natural or artificial effector mechanisms for this cell.
  • the agent is a T helper lymphocyte that enhances effector functions of other cells that specifically recognize this antigen.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an agent which inhibits the expression or activity of a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the agent is an antisense nucleic acid that selectively hybridizes with the nucleic acid that codes for the tumor-associated antigen.
  • the agent is an antibody that selectively binds to the tumor-associated antigen.
  • the agent comprises several agents, each of which selectively inhibit the expression or activity of different tumor-associated antigens, at least one of the tumor-associated antigens being a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the activity of a tumor-associated antigen identified according to the invention can be any activity of a protein or peptide.
  • the activity of an enzymatic activity is like the lactate dehydrogenase activity in the case of sequences which relate to LDHC (cf. Example 1).
  • this activity relates to involvement in cellular migration and / or metastatization as in the case of the sequences relating to TPTE (cf. Example 2).
  • the therapy and diagnostic methods according to the invention can thus also aim to inhibit or reduce this activity or to test this activity.
  • the agent comprises several agents, each of which selectively increases the amount of complexes between MHC molecules and peptide epitopes of different tumor-associated antigens, at least one of the tumor-associated antigens being a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen identified according to the invention or a part thereof can be present in the pharmaceutical composition in an expression vector and can be functionally linked to a promoter.
  • An antisense nucleic acid contained in a pharmaceutical composition according to the invention can comprise a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 and 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can comprise a pharmaceutically acceptable carrier and / or an adjuvant.
  • the adjuvant can be selected from saponin, GM-CSF, CpG nucleotides, RNA, a cytokine or a chemokine.
  • a pharmaceutical composition according to the invention is preferably used for the treatment of a disease which is characterized by the selective expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen. In a preferred embodiment, the disease is cancer.
  • the invention relates to a method for diagnosing a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the procedure includes the proof (i) of one Nucleic acid coding for the tumor-associated antigen or a part thereof and / or (ii) the detection of the tumor-associated antigen or a part thereof and / or (iii) the detection of an antibody against the tumor-associated antigen or a portion thereof and / or (iv) the detection of cytotoxic or helper T lymphocytes which are specific for the tumor-associated antigen or a portion thereof in a biological sample isolated from a patient.
  • the disease is characterized by the expression or abnormal expression of several different tumor-associated antigens
  • the detection includes a detection of several nucleic acids coding for the several different tumor-associated antigens, or parts thereof, the detection of the several different tumor associated antigens or parts thereof, the detection of several antibodies which bind to the several different tumor-associated antigens or parts thereof or the detection of several cytotoxic or helper T lymphocytes which are specific for the several different tumor-associated antigens.
  • the isolated biological sample from the patient is compared with a comparable normal biological sample.
  • the diagnostic methods according to the invention can also relate to the use of the tumor-associated antigens identified according to the invention as prognostic markers in order to predict metastasis, for example by testing the migration behavior of cells and therefore a worsened course of the disease, which among other things enables the planning of a more aggressive therapy.
  • the sequences relating to TPTE are suitable for this purpose. They are also suitable for differentiating benign changes, such as hyperplasia, from tumor precursors that are already to be assessed as unfavorable, and thus to predict a tendency to cancer even before an invasive tumor has formed.
  • an increased migration behavior indicates a metastasis and / or formation of lymph node and / or distant metastases or a potential therefor.
  • the tumor-associated antigen identified according to the invention preferably has a sequence encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of: (a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence consisting of the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, and 54-57, a part or derivative thereof, is selected (b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a), (c) a nucleic acid which is related to the nucleic acid under (a) or (b) is degenerate and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
  • the tumor associated antigen preferably comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82,
  • methods of treatment according to the invention are preferably aimed at
  • the invention relates to a method for diagnosing a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, the method determining the methylation pattern and / or the degree of methylation within a nucleic acid which comprises a nucleic acid sequence which codes for the tumor-associated antigen, in particular within the non-coding regions thereof, preferably within of the promoter region thereof.
  • the tumor-associated antigen to be detected or the part thereof is present in a complex with an MHC molecule, in particular an HLA molecule.
  • Detection of an antibody or monitoring the amount of antibodies can be carried out according to the invention with a protein or peptide that binds specifically to the antibody.
  • Detection of cytolytic T cells or helper T cells or monitoring the amount of cytolytic T cells or helper T cells which are specific for complexes between an antigen or a part thereof and MHC molecules can be carried out according to the invention a cell that presents the complex between the antigen or part thereof and an MHC molecule.
  • Cell receptor can identify the specific T lymphocytes.
  • the invention relates to a method for the treatment, diagnosis or monitoring of a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising the administration of an antibody to the tumor-associated antigen or a Part of it binds and is coupled with a therapeutic or diagnostic agent.
  • the antibody can be a monoclonal antibody.
  • the antibody is a chimeric or humanized antibody or a fragment of a natural antibody.
  • the invention also relates to a method for treating a patient with a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising (i) the removal of a Sample with immunoreactive cells from the patient, (ii) contacting the sample with a host cell that expresses the tumor-associated antigen or part thereof, under conditions that produce cytolytic T cells against the tumor-associated antigen or part of this favor, and (iii) introducing the cytolytic T cells into the patient in an amount suitable for lysing cells expressing the tumor associated antigen or a portion thereof.
  • the invention also relates to the cloning of the T cell receptor of cytolytic T cells against the tumor-associated antigen. This can be transferred to other T cells, which thus obtain the desired specificity and can be introduced into the patient as in (iii).
  • the host cell endogenously expresses an HLA molecule.
  • the host cell expresses an HLA molecule and / or the tumor-associated antigen or the part thereof recombinantly.
  • the host cell is preferably non-proliferative.
  • the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, a monocyte or a macrophage.
  • the method may further include identifying an MHC molecule that presents the tumor-associated antigen or a portion thereof, the host cell expressing the identified MHC molecule and presenting the tumor-associated antigen or a portion thereof.
  • the immune response can include a B cell response or a T cell response.
  • a T cell response may include the production of cytolytic T cells and / or helper T cells that are specific for the host cells that the tumor associated Present antigen or part of it or are specific to the patient's cells expressing the tumor associated antigen or part thereof.
  • the host cells used according to the invention are preferably non-proliferative or are made non-proliferative.
  • a disease that is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen is cancer in particular.
  • the present invention further relates to a nucleic acid selected from the group consisting of (a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence consisting of the group consisting of SEQ ID NOs: 2-5, 20-21, 31-33 , 39, 54-57, 62, 63, 85-88 a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid which hybridizes with the nucleic acid under (a) under stringent conditions, (c) a nucleic acid which is related is degenerate to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
  • the invention relates to a recombinant nucleic acid molecule, in particular a DNA or RNA molecule, which comprises a nucleic acid according to the invention.
  • the invention also relates to host cells which contain a nucleic acid according to the invention or a recombinant nucleic acid molecule which comprises a nucleic acid according to the invention.
  • the invention relates to oligonucleotides that hybridize with a nucleic acid identified according to the invention and can be used as genetic probes or as "antisense" molecules.
  • Nucleic acid molecules in the form of oligonucleotide primers or competent samples which hybridize with a nucleic acid or parts thereof identified according to the invention can be used to find nucleic acids which are homologous to the nucleic acid identified according to the invention.
  • PCR amplification, Southern and Northern hybridization can be used to find homologous nucleic acids.
  • the hybridization can take place under low, better under medium and best under high-stringent conditions.
  • the term “stringent conditions” relates to conditions which allow specific hybridization between polynucleotides.
  • the invention relates to a protein or polypeptide that is encoded by a nucleic acid that is selected from the group consisting of (a) a nucleic acid that comprises a nucleic acid sequence that consists of the group consisting of SEQ ID NOs: 2 -5, 20-21, 31-33, 39, 54-57, 62, 63, 85-88 a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a) , (c) a nucleic acid that is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid that is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
  • a nucleic acid that is selected from the group consisting of (a) a nucleic acid that comprises a nucleic acid sequence that consists of the group consisting of SEQ ID NOs: 2 -5, 20-21, 31-33, 39, 54
  • the invention relates to a protein or polypeptide which comprises an amino acid sequence selected from the Group consisting of SEQ ID NOs: 7-13, 14-18, 23-24, 34-36, 58-61, 64, 65, 89-100, 101-107 a part or derivative thereof.
  • the invention relates to an immunogenic fragment of a tumor-associated antigen identified according to the invention.
  • the fragment preferably binds to a human HLA receptor or human antibody.
  • a fragment according to the invention preferably comprises a sequence of at least 6, in particular at least 8, at least 10, at least 12, at least 15, at least 20, at least 30 or at least 50, amino acids.
  • the invention relates to an agent that binds to a tumor-associated antigen identified according to the invention or to a part thereof.
  • the agent is an antibody.
  • the antibody is a chimeric, a humanized or combinatorial-made antibody or a fragment of an antibody.
  • the invention further relates to an antibody which binds selectively to a complex of (i) a tumor-associated antigen identified according to the invention or a part thereof and (ii) an MHC molecule to which the tumor-associated antigen or part identified according to the invention binds thereof, the antibody not binding to (i) or (ii) alone.
  • An antibody according to the invention can be a monoclonal antibody.
  • the antibody is a chimeric or humanized antibody or a fragment of a natural antibody.
  • the invention relates to a conjugate between an agent according to the invention which binds to a tumor-associated antigen identified according to the invention or to a part thereof, or an antibody according to the invention and a therapeutic or diagnostic agent.
  • the therapeutic or diagnostic agent is a toxin.
  • the invention relates to a kit for detecting the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising means for detecting (i) the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen, or a part thereof, (ii ) the tumor-associated antigen or a part thereof, (iii) antibodies which bind to the tumor-associated antigen or a part thereof, and / or (iv) T cells specific for a complex between the tumor-associated antigen or a part thereof and an MHC molecule.
  • the means for detecting the nucleic acid or part thereof are nucleic acid molecules for the selective amplification of the nucleic acid, which in particular comprise a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 and 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid.
  • genes are described which are selectively expressed or aberrantly expressed in tumor cells and which represent tumor-associated antigens.
  • these genes or their derivatives are preferred target structures for therapeutic approaches.
  • the therapeutic approaches can aim to inhibit the activity of the selectively expressed tumor-associated gene product. This makes sense if the aberrant or selective expression is functionally of tumor-physiological importance and its suppression is accompanied by selective damage to the corresponding cells.
  • Other therapeutic concepts consider tumor-associated antigens as markers that selectively recruit effector mechanisms with cell-damaging potential to tumor cells. The function of the target molecule itself and its role in tumor development are completely irrelevant.
  • “derivative” of a nucleic acid means that single or multiple nucleotide substitution, deletion and / or addition are present in the nucleic acid. Furthermore, the term “derivative” also includes chemical derivatization of a nucleic acid on a nucleotide base, on sugar or on phosphate. The term “derivative” also includes nucleic acids that contain nucleotides and nucleotide analogues that do not occur in nature.
  • a nucleic acid is preferably deoxyribonucleic acid (DNA) or
  • nucleic acids include genomic DNA, cDNA, mRNA, recombinantly produced and chemically synthesized molecules.
  • a nucleic acid can be present as a single-stranded or double-stranded and linear or covalently circular molecule.
  • the nucleic acids described according to the invention are preferably isolated.
  • isolated nucleic acid means that the nucleic acid (i) was amplified in vitro, for example by polymerase chain reaction (PCR), (ii) was produced recombinantly by cloning, (iii) was purified, for example by cleavage and gel electrophoretic separation or (iv) was synthesized, for example by chemical synthesis.
  • An isolated nucleic acid is a nucleic acid that is available for manipulation by recombinant DNA techniques.
  • Hybridization is preferably carried out under conditions that allow specific hybridization between polynucleotides (stringent conditions). Stringent conditions are described, for example, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Ed., 2.
  • New York described and concern, for example, hybridization at 65 ° C in
  • the membrane to which the DNA has been transferred is, for example, in 2 ⁇ SSC at room temperature and then in
  • Complementary nucleic acids according to the invention have at least 40%, in particular at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% and preferably at least 95%, at least 98 or at least 99% identity of the nucleotides.
  • nucleic acids coding for tumor-associated antigens can be present alone or in combination with other nucleic acids, in particular heterologous nucleic acids.
  • a nucleic acid is functionally associated with expression control sequences or regulatory sequences, which can be homologous or heterologous with respect to the nucleic acid.
  • a coding sequence and a regulatory sequence are "functionally 11 connected to each other, if they are covalently linked to one another, that the expression or transcription of the coding sequence is under the control or under the influence of the regulatory sequence.
  • the coding sequence is to be translated into a functional protein
  • a regulatory sequence when a regulatory sequence is functionally linked to the coding sequence, induction of the regulatory sequence leads to transcription of the coding sequence without any shifting of the reading frame in the coding sequence or to inability the coding sequence comes to be translated into the desired protein or peptide.
  • control sequence or “regulatory sequence” encompasses promoters, enhancers and other control elements which control the expression of a gene.
  • regulatory sequence encompasses promoters, enhancers and other control elements which control the expression of a gene.
  • Sequences can vary depending on species or cell type, but generally includes 5'-non-transcribed and 5'-non-translated sequences that are involved in the initiation of transcription or translation such as TATA box, capping sequence, CAAT-
  • 5'-non-transcribed regulatory sequences include a promoter region that includes a promoter sequence for transcriptional control of the functionally linked gene.
  • Regulatory sequences can also be enhancer
  • Sequences or upstream activator sequences include.
  • the tumor-associated antigens shown here can be combined with any expression control sequences and promoters.
  • the promoters of the tumor-associated gene products shown here can be combined with any other genes. This allows the selective activity of these promoters to be used.
  • a nucleic acid can be present in connection with another nucleic acid which codes for a polypeptide which controls secretion of the protein or polypeptide encoded by the nucleic acid from a host cell.
  • a nucleic acid can also be present in conjunction with another nucleic acid which codes for a polypeptide which anchors the coded protein or polypeptide on the cell membrane of the host cell or its compartmentalization in certain organelles of this cell.
  • a recombinant DNA molecule according to the invention is a vector, optionally with a promoter, which controls the expression of a nucleic acid, for example a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen according to the invention.
  • vector is used in its most general meaning and encompasses any intermediate vehicles for a nucleic acid which, for example, make it possible to introduce the nucleic acid into prokaryotic and / or into eukaryotic cells and, if appropriate, to integrate them into a genome. Such vectors are preferably replicated and / or expressed in the cell.
  • An intermediate vehicle can be adapted, for example, for use in electroporation, in microprojectile bombardment, in liposomal administration, in transfer with the aid of agrobacteria or in the insertion via DNA or RNA viruses.
  • Vectors include plasmids, phagemids, or virus genomes.
  • Mammalian cells such as cells from humans, mice, hamsters, pigs, goats and primates are particularly preferred.
  • the cells can be derived from a variety of tissue types and include primary cells and cell lines. Specific examples include keratinocytes, peripheral blood leukocytes, bone marrow stem cells and embryonic stem cells.
  • the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, monocyte or a macrophage.
  • a nucleic acid can be present in the host cell in a single or in multiple copies and, in one embodiment, is expressed in the host cell.
  • RNA or of RNA and protein are preferred expression systems in mammalian cells. It also includes partial expression of nucleic acids. Furthermore, the expression can be transient or stable.
  • Preferred expression systems in mammalian cells include pcDNA3.1 and pRc / CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), which contain a selectable marker such as a gene which confers resistance to G418 (and thus enables selection of stably transfected cell lines) and the enhancer-promoter sequences of cytomegalovirus (CMV).
  • CMV cytomegalovirus
  • an expression vector can also comprise a nucleic acid sequence which codes for the HLA molecule.
  • the nucleic acid sequence encoding the HLA molecule can be on the same expression vector as the nucleic acid encoding the tumor-associated antigen or part thereof, or both nucleic acids can be on different expression vectors. In the latter case, the two expression vectors can be cotransfected into one cell. If a host cell does not express the tumor-associated antigen or part of it or the HLA molecule, both nucleic acids encoding it are transfected into the cell either on the same expression vector or on different expression vectors. If the cell already expresses the HLA molecule, only the nucleic acid sequence that codes for the tumor-associated antigen or part thereof can be transfected into the cell.
  • kits for amplifying a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen include, for example, a pair of amplification primers that hybridize to the nucleic acid encoding the tumor associated antigen.
  • the primers preferably comprise a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 and 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid and are non-overlapping in order to avoid the formation of primer dimers.
  • One of the primers will hybridize to a strand of the nucleic acid encoding the tumor associated antigen and the other primer will hybridize to the complementary strand in an arrangement that allows amplification of the nucleic acid encoding the tumor associated antigen ,
  • an “antisense molecule” also comprises a construct which contains a nucleic acid or a part thereof in a reverse orientation with respect to its natural promoter.
  • An antisense transcript of a nucleic acid or a portion thereof can duplex with the naturally occurring mRNA that specifies the enzyme, thus preventing accumulation or translation of the mRNA into the active enzyme.
  • Another option is to use ribozymes to inactivate a nucleic acid.
  • Preferred antisense oligonucleotides according to the invention have a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 and 20-30 contiguous nucleotides from the target nucleic acid and are preferably completely complementary to the target nucleic acid or a part thereof.
  • the antisense oligonucleotide hybridizes to an N-terminal or 5 'upstream site such as a translation initiation, transcription initiation or promoter site. In other embodiments, the antisense oligonucleotide hybridizes to a 3 'untranslated region or mRNA splicing site.
  • an oligonucleotide according to the invention is a "modified" oligonucleotide.
  • the oligonucleotide can be modified in various ways in order to increase its stability or therapeutic effectiveness, for example, without impairing its ability to bind to its target.
  • modified oligonucleotide means an oligonucleotide in which (i) at least two of its nucleotides are linked to one another by a synthetic internucleoside bond (ie an internucleoside bond which is not a phosphodiester bond) and / or (ii) a chemical group is covalently linked to the oligonucleotide that does not normally occur with nucleic acids.
  • Preferred synthetic Internucleoside bonds are phosphorothioates, alkylphosphonates, phosphorodithioates, phosphate esters, alkylphosphonothioates, phosphoramidates, carbamates, carbonates, phosphate triesters, acetamidates, carboxymethyl esters and peptides.
  • isolated protein or isolated polypeptide
  • isolated polypeptide mean that the protein or polypeptide is separated from its natural environment.
  • An isolated protein or polypeptide can be in a substantially purified state.
  • substantially purified means that the protein or polypeptide is essentially free of other substances with which it is present in nature or in vivo.
  • proteins and polypeptides are used, for example, for the production of antibodies and can be used in an immunological or diagnostic assay or as therapeutic agents.
  • Proteins and polypeptides described according to the invention can be isolated from biological samples such as tissue or cell homogenates and can also be expressed recombinantly in a large number of pro- or eukaryotic expression systems.
  • Amino acid insertion variants include amino- and / or carboxy-terminal fusions, as well as insertions of single or several amino acids in a certain amino acid sequence.
  • amino acid sequence variants with an insertion one or more amino acid residues are introduced into a predetermined position in an amino acid sequence, although a random insertion with suitable screening of the resulting one Product is also possible.
  • Amino acid deletion variants are characterized by the removal of one or more amino acids from the sequence.
  • Amino acid substitution variants are characterized in that at least one residue in the sequence is removed and another residue is inserted in its place. The modifications are preferably at positions in the amino acid sequence that are not conserved between homologous proteins or polypeptides.
  • amino acids are replaced by others with similar properties, such as hydrophobicity, hydrophilicity, electronegativity, volume of the side chain and the like (conservative substitution).
  • Conservative substitutions relate, for example, to the replacement of an amino acid by another amino acid, listed below in the same group as the substituted amino acid:
  • amino acid variants described above can easily be obtained using known peptide synthesis techniques such as e.g. by “Solid Phase Synthesis” (Merrifield, 1964) and similar methods or by recombinant DNA manipulation. Techniques for introducing substitution mutations at predetermined locations in DNA that have a known or partially known sequence are well known and include, for example, M13 The manipulation of DNA sequences for the production of proteins with substitutions, insertions or deletions is described in detail, for example, in Sambrook et al. (1989).
  • “derivatives” of proteins or polypeptides also include single or multiple substitutions, deletions and / or additions of any molecules which are associated with the enzyme, such as carbohydrates, lipids and / or proteins or polypeptides. Furthermore the term “derivative” also extends to all functional chemical equivalents of the proteins or polypeptides.
  • Preferred parts or fragments of a tumor-associated antigen according to the invention preferably have one of the sequences listed below, which are derived from the tumor-associated antigens identified according to the invention, and are preferably peptide epitopes which, according to the invention, in particular also for stimulating cytotoxic T-lymphocytes in vivo are suitable for the production of expanded and stimulated T lymphocytes for therapeutic adoptive transfer ex vivo.
  • sequences are in particular peptide epitopes for the MHC class I alleles given below:
  • a part or a fragment of a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen relates to the part of the nucleic acid which codes at least for the tumor-associated antigen and / or codes for a part or a fragment of the tumor-associated antigen as defined above.
  • the isolation and identification of genes coding for tumor-associated antigens also enables the diagnosis of a disease which is characterized by the expression of one or more tumor-associated antigens.
  • These methods include determining one or more nucleic acids encoding a tumor associated antigen and / or determining the encoded tumor associated antigens and / or peptides derived therefrom.
  • the nucleic acid can be determined in a conventional manner, including by polymerase chain reaction or hybridization with a labeled probe.
  • a determination of tumor-associated antigens or peptides derived therefrom can be carried out by screening patient antisera with regard to recognition of the antigen and / or the peptides. It can also be done by screening the patient's T cells for specificity for the corresponding tumor-associated antigen.
  • the present invention also enables isolation of proteins that bind to tumor-associated antigens described herein, including antibodies and cellular binding partners of the tumor-associated antigens.
  • dominant negative polypeptides are also provided in certain embodiments, which are derived from tumor-associated antigens.
  • a dominant negative polypeptide is an inactive variant of a protein that, by interacting with the cellular machinery, displaces an active protein from its interaction with the cellular machinery or competes with the active protein, thereby reducing the activity of the active protein.
  • a dominant negative receptor that binds a ligand but does not produce a signal in response to ligand binding can reduce the biological activity of the ligand.
  • a dominant negative catalytically inactive kinase that normally interacts with target proteins but does not phosphorylate the target proteins can decrease the phosphorylation of the target proteins in response to a cellular signal.
  • a dominant negative transcription factor that binds to a promoter site in the control region of a gene can however, the transcription of the gene does not increase, reducing the effect of a normal transcription factor by occupying promoter binding sites without increasing transcription.
  • the result of the expression of a dominant negative polypeptide in a cell is a decrease in the function of active proteins.
  • the person skilled in the art can produce dominant negative variants of a protein, for example by conventional mutagenesis methods and evaluating the dominant negative effect of the variant polypeptide.
  • the invention also includes substances such as polypeptides that bind to tumor-associated antigens.
  • binders can e.g. in screening assays for the detection of tumor-associated antigens and complexes of tumor-associated antigens with their binding partners as well as in the purification of the tumor-associated antigens and of complexes thereof with their binding partners.
  • substances can also be used for inhibiting the activity of tumor-associated antigens, for example by binding to such antigens.
  • binding agents such as e.g. Antibodies or antibody fragments that have the ability to selectively bind to tumor-associated antigens.
  • Antibodies include polyclonal and monoclonal antibodies that are made in a conventional manner.
  • the pFc 'and Fc regions are, for example, effectors of the complement cascade, but are not involved in antigen binding.
  • an antibody from which the Fc region was cleaved enzymatically or which was produced without the Fc region referred to as a Fab fragment
  • Fab fragments consist of a covalently bound light chain of an antibody and part of the heavy chain of Antibodies, referred to as Fd.
  • the Fd fragments are the main determinants of antibody specificity (a single Fd fragment can be associated with up to ten different light chains without changing the specificity of the antibody) and Fd fragments retain isolation the ability to bind to an epitope.
  • CDRs complementarity-determining regions
  • FRs framework regions
  • Both the Fd fragment of the heavy chain and the light chain of IgG immunoglobulins contain four framework regions (FR1 to FR4), which are each separated by three complementarity-determining regions (CDR1 to CDR3).
  • CDRs and in particular the CDR3 regions and even more the CDR3 region of the heavy chain are largely responsible for the antibody specificity.
  • non-CDR regions of a mammalian antibody can be replaced by similar regions of antibodies with the same or a different specificity, while maintaining the specificity for the epitope of the original antibody.
  • WO 92/04381 describes the production and use of humanized RSV antibodies from mouse, in which at least some of the FR regions from mouse have been replaced by FR regions of human origin. Such antibodies, including fragments of intact antibodies with an antigen binding ability, are often referred to as "chimeric" antibodies.
  • An antibody used according to the invention is preferably directed against one of the sequences shown in SEQ ID NO: 14-18, 80-84 or 101-116 of the sequence listing and / or can be obtained by immunization with these peptides.
  • the "yeast two-hybrid system” can also be used to identify polypeptides that bind to a tumor-associated antigen.
  • Tumor-associated antigens or fragments thereof described in accordance with the invention can be used for screening peptide libraries, including phage display libraries, to identify and select peptide binding partners of the tumor-associated antigens.
  • Such molecules can be used, for example, for screening assays, purification protocols, for a Interference with the function of the tumor associated antigen and for other purposes known to those skilled in the art.
  • antibodies and other binding molecules can be used, for example, for the identification of tissue which expresses a tumor-associated antigen.
  • Antibodies can also be coupled to specific diagnostic agents for imaging cells and tissues that express tumor-associated antigens. They can also be coupled to therapeutically useful substances.
  • Diagnostic agents include, but are not limited to, barium sulfate, iocetamic acid, lopanoic acid, calcium ipodate, sodium diatrizoate, meglumine diatrizoate, metrizamide, sodium tyropanoate and radiodiagnostics, including positron emitters such as fluorine-18 and carbon-11, gamma emitters such as Iodine-123, Technitium-99m, Iodine-131 and Indium-111, nuclear magnetic resonance nuclides such as fluorine and gadolinium.
  • positron emitters such as fluorine-18 and carbon-11
  • gamma emitters such as Iodine-123, Technitium-99m, Iodine-131 and Indium-111
  • nuclear magnetic resonance nuclides such as fluorine and gadolinium.
  • therapeutically useful substance means any therapeutic molecule which, if desired, is selectively guided to a cell which expresses one or more tumor-associated antigens, including anti-cancer agents, radioactive iodinated compounds, toxins, cytostatic or cytolytic drugs, etc.
  • anti-cancer agents for example, aminoglutethimide, azathioprine, bleomycin sulfate, busulfan, carmustine, chlorambucil, cisplatin, cyclophosphamide, cyclosporine, Cytarabidin, dacarbazine, dactinomycin, Daunorubin, doxorubicin, taxol, etoposide, fluorouracil, interferon- ⁇ , lomustine, mercaptopurine, methotrexate, mitotane, Procarbazin- HCl, thioguanine, vinblastine sulfate and vincristine sulfate
  • Other anticancer agents are described, for example, in Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis ' of Therapeutics", 8th edition, 1990, McGraw-Hull, Inc., in particular chapter 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A.
  • Toxins k can be proteins such as pokeweed antiviral protein, cholera toxin, pertussis toxin, ricin, gelonin, abrin, diphtheria exotoxin or Pseudomonas exotoxin.
  • Toxin residues can also be high energy emitting radionuclides such as cobalt-60.
  • TPTE tumor-associated antigens according to the invention can themselves transport substances binding to them, in particular the therapeutic antibodies described above, from the membrane into the cytoplasm and thus serve an internalization, where these substances can preferably develop their effect like a cell-destroying effect.
  • the term “patient” means human, not human primacy or another animal, in particular mammal such as cow, horse, pig, sheep, goat, dog, cat or rodent such as mouse and rat.
  • the patient is a human.
  • the term “disease” relates to any pathological condition in which tumor-associated antigens are expressed or abnormally expressed.
  • abnormal expression means that the expression is changed, preferably increased, compared to the condition in a healthy individual.
  • An increase in expression relates to an increase of at least 10%, in particular at least 20%, at least 50% or at least 100%)
  • the tumor associated antigen is only expressed in tissue of a diseased individual while expression is repressed in a healthy individual, an example of such a disease is cancer, especially seminomas, melanomas, teratomas, gliomas, colorectal, breast, prostate -, uterine, ovarian, and lung cancer.
  • a biological sample may be a tissue and / or cellular sample in accordance with the invention and may be obtained for use in the various methods described herein in a conventional manner, such as by tissue biopsy, including punch biopsy, and by drawing blood, bronchial aspirate, urine, faeces or other body fluids.
  • the term “immunoreactive cell” means a cell which can mature into an immune cell (such as a B cell, T helper cell or cytolytic T cell) with suitable stimulation.
  • Immunoreactive cells include CD34 + hematopoietic stem cells, immature and mature T cells, and immature and mature B cells. If the production of cytolytic or helper T cells recognizing a tumor associated antigen is desired, the immunoreactive cell is contacted with a cell expressing a tumor associated antigen under conditions that allow for production, differentiation and / or selection of cytolytic as well as helper T cells favor.
  • the Differentiation of T cell precursors into a cytolytic T cell upon exposure to an antigen is similar to clonal selection of the immune system.
  • Some therapeutic methods rely on a patient's immune system response that leads to lysis of antigen-presenting cells, such as cancer cells that present one or more tumor-associated antigens.
  • antigen-presenting cells such as cancer cells that present one or more tumor-associated antigens.
  • autologous cytotoxic T lymphocytes which are specific for a complex of a tumor-associated antigen and an MHC molecule, are administered to a patient with a cell abnormality.
  • the production of such cytotoxic T lymphocytes in vitro is known.
  • An example of a method for differentiating T cells can be found in WO-A-9633265.
  • a sample with cells such as blood cells is taken from the patient and the cells are brought into contact with a cell which presents the complex and can trigger an increase in cytotoxic T-lymphocytes (eg dendritic cells).
  • Another method for selecting antigen-specific cytotoxic T lymphocytes uses fluorogenic tetramers of MHC class I molecule / peptide complexes for the detection of specific clones of cytotoxic T lymphocytes (Altman et al, Science 274: 94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol 8: 413-416, 1998). Soluble MHC class I molecules are folded in vitro in the presence of ⁇ 2 microglobulin and a peptide antigen that binds to the class I molecule. After the MHC / peptide complexes have been purified, they are labeled with biotin.
  • Tetramers are formed by mixing the biotinylated peptide-MHC complexes with labeled avidin (eg phycoerythrin) at a molar ratio of 4: 1. Tetramers are then contacted with cytotoxic T lymphocytes such as peripheral blood or lymph nodes. The tetramers bind to cytotoxic T lymphocytes that recognize the peptide-antigen / MHC class I complex. Cells that bind to the tetramers can be sorted by fluorescence-controlled cell sorting for isolation of reactive cytotoxic T lymphocytes. The isolated cytotoxic T lymphocytes can then be grown in vitro.
  • cytotoxic T lymphocytes such as peripheral blood or lymph nodes.
  • Cells that bind to the tetramers can be sorted by fluorescence-controlled cell sorting for isolation of reactive cytotoxic T lymphocytes. The isolated cytotoxic T lymphocytes can then be grown in vitro.
  • T cell receptor itself.
  • cells that present the desired complex e.g. dendritic cells
  • cytotoxic T lymphocytes from healthy individuals. This leads to an increase in high-affinity specific cytotoxic T lymphocytes if the donor has not had any contact with the specific complex.
  • the high affinity T cell receptor from these increased specific T lymphocytes is cloned and can be transferred by gene transfer e.g. with retroviral vectors can be transduced as desired in T cells from other patients.
  • the above therapeutic aspects assume that at least some of the patient's abnormal cells present a complex of a tumor-associated antigen and an HLA molecule. Such cells can be identified in a manner known per se. Once cells presenting the complex have been identified, they can be combined with a sample from the patient containing cytotoxic T lymphocytes. If the cells presenting the complex are lysed by the cytotoxic T lymphocytes, it can be assumed that a tumor-associated antigen is presented.
  • Cytotoxic T lymphocytes can also be generated in vivo in a manner known per se become.
  • One method uses non-proliferative cells that express the complex.
  • the cells used will be those that normally express the complex, such as irradiated tumor cells or cells that have been transfected with one or both of the genes necessary for presentation of the complex (ie, the antigen peptide and the presenting HLA -Molecule). Different cell types can be used.
  • Vectors can also be used which carry one or both of the genes of interest. Viral or bacterial vectors are particularly preferred.
  • nucleic acids encoding a portion of a tumor-associated antigen can be operably linked to promoter and enhancer sequences that direct expression of the tumor-associated antigen or a fragment thereof in certain tissues or cell types.
  • the nucleic acid can be incorporated into an expression vector.
  • Expression vectors can be unmodified extrachromosomal nucleic acids, plasmids or viral genomes into which an insertion of exogenous nucleic acids is possible.
  • Nucleic acids encoding a tumor associated antigen can also be inserted into a retroviral genome, thereby enabling the nucleic acid to be integrated into the genome of the target tissue or cell.
  • a microorganism such as vaccinia virus, pox virus, He ⁇ es simplex virus, retrovirus or adenovirus carries the gene of interest and "infects" de facto host cells.
  • Another preferred form is the introduction of the tumor-associated antigen in the form of recombinant RNA. This can be introduced into cells, for example, by liposomal transfer or by electroporation. The resulting cells present the complex of interest and are recognized by autologous cytotoxic T lymphocytes, which then multiply.
  • an effective amount of the tumor-associated antigen can be administered to a patient, for example, by intradermal injection.
  • the injection can also take place intranodally in a lymph node (Maloy et al, Proc Natl Acad Sei USA 98: 3299-303, 2001). It can also be used in combination with reagents that facilitate absorption into dendritic cells.
  • An in vivo preferred tumor associated antigens include those that react with allogeneic cancer antisera or with T cells from many cancer patients. Of particular interest are those against which there are no spontaneous immune responses.
  • Immune responses to these can be demonstrably induced, which can lyse tumors (Keogh et al, J Immunol 167: 787-96, 2001; Appella et al, Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1: 177-84, 1995; Wentworth et al, Mol Immunol 32: 603-12, 1995).
  • one or more tumor-associated antigens or stimulating fragments thereof with one or more adjuvants for inducing an immune response or increasing an immune response are administered.
  • An adjuvant is a substance that is incorporated into, or co-administered with, the antigen that enhances the immune response.
  • Adjuvants can enhance the immune response by providing an antigen reservoir (extracellular or in macrophages), activating macrophages and stimulating certain lymphocytes.
  • Adjuvants include, but are not limited to, monophosphoryl lipid-A (MPL, SmithKline Beecham), saponins such as QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 and QS-Ll (So et al, Mol. Cells 7: 178-186, 1997), incomplete Freund's adjuvant, complete Feundsch adjuvant, vitamin E.
  • MPL monophosphoryl lipid-A
  • saponins such as QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739)
  • QS7, QS17, QS18 and QS-Ll So et al, Mol. Cells 7: 178-186, 1997)
  • incomplete Freund's adjuvant complete Feundsch adjuvant, vitamin E.
  • the peptides are preferably administered in a mixture with DQS21 / MPL.
  • the ratio of DQS21 to MPL is typically about 1:10 to 10: 1, preferably about 1: 5 to 5: 1 and in particular about 1: 1.
  • DQS21 and MPL are typically present in a vaccine formulation in a range from about 1 ⁇ g to about 100 ⁇ g.
  • cytokines can be used in vaccination due to their regulatory properties on lymphocytes.
  • cytokines include e.g. Interleukin-12 (IL-12), which has been shown to enhance the protective effects of vaccines (see Science 268: 1432-1434, 1995), GM-CSF and IL-18.
  • B7 is typically not expressed on tumor cells, so they are not effective antigen presenting cells (APCs) for T cells. Induction of B7 expression would allow tumor cells to more effectively stimulate cytotoxic T lymphocyte proliferation and effector function. Co-stimulation by a combination of B7 / IL-6 / IL-12 showed induction of IFN-gamma- and Thl-cytokine Profiles in a T cell population, which leads to a further increased T cell activity (Gajewski et al, J. Immunol 154: 5637-5648 (1995)).
  • anti-CD40 antibodies for stimulation of dendritic cells would, as expected, directly increase a response to tumor antigens that are normally outside the range of an inflammatory response or are presented by non-professional antigen presenting cells (tumor cells). In these situations, T helper and B7 co-stimulating signals are not provided. This mechanism could be used in conjunction with therapies based on antigen-pulsed dendritic cells or in situations where T helper epitopes were not defined in known TRA precursors.
  • a viral vector for the administration of a nucleic acid encoding a tumor-associated antigen is selected from the group consisting of adenoviruses, adeno-associated viruses, poxviruses, including vaccinia virus and attenuated poxviruses, Semliki Forest virus, Retroviruses, Sindbis virus and Ty virus-like particles.
  • Adenoviruses and retroviruses are particularly preferred.
  • the retroviruses are usually replication-deficient (i.e. they are unable to produce infectious particles).
  • nucleic acids can be used to introduce nucleic acids into cells according to the invention in vitro or in vivo. Such methods include transfection of nucleic acid CaPO 4 precipitates, transfection of nucleic acids associated with DEAE, transfection or infection with the above viruses that carry the nucleic acids of interest, liposome-mediated transfection, and the like. In certain embodiments, control of the nucleic acid to certain cells is preferred.
  • a carrier used to deliver a nucleic acid to a cell e.g., a retrovirus or a liposome
  • the therapeutic agents of the invention can be administered by any conventional route, including by injection or infusion.
  • the administration can take place, for example, orally, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously or transdermally.
  • Therapeutic administration of antibodies is preferably carried out through a pulmonary aerosol.
  • Antisense nucleic acids are preferably administered by slow intravenous administration.
  • compositions according to the invention will depend on the condition to be treated, the severity of the disease, the individual parameters of the patient, including age, physiological condition, height and weight, the duration of the
  • compositions according to the invention are preferably sterile and contain an effective amount of the therapeutically active substance for producing the desired reaction or the desired effect.
  • doses of the tumor-associated antigen from 1 ng to 1 mg, preferably from 10 ng to 100 ⁇ g, are formulated and administered for treatment or for generating or increasing an immune response. If the administration of nucleic acids (DNA and RNA) which code for tumor-associated antigens is desired, doses of 1 ng to 0.1 mg are formulated and administered.
  • nucleic acids DNA and RNA
  • compositions according to the invention are generally administered in pharmaceutically acceptable amounts and in pharmaceutically acceptable compositions.
  • pharmaceutically acceptable refers to a non-toxic material that does not interfere with the action of the active ingredient in the pharmaceutical composition.
  • Such preparations can usually contain salts, buffering agents, preservatives, carriers and optionally other therapeutic agents.
  • the salts should be pharmaceutically acceptable.
  • non-pharmaceutically acceptable salts can be used for the production of pharmaceutically acceptable salts thereof and are included according to the invention.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier relates to one or more compatible solid or liquid fillers, diluents or capsule substances which are suitable for administration to a human.
  • carrier refers to an organic or inorganic ingredient, natural or synthetic, in which the active ingredient is combined to facilitate application.
  • the components of the pharmaceutical according to the invention Compositions are usually such that there is no interaction that significantly affects the desired pharmaceutical efficacy.
  • compositions according to the invention can contain suitable buffer substances such as acetic acid in a salt, citric acid in a salt, boric acid in a salt and phosphoric acid in a salt.
  • compositions are usually presented in a unitary dosage form and can be prepared in a manner known per se.
  • Pharmaceutical compositions according to the invention can be present, for example, in the form of capsules, tablets, lozenges, suspensions, syrups, elixirs or as an emulsion.
  • compositions suitable for parenteral administration usually comprise a sterile aqueous or non-aqueous preparation of the active ingredient, which is preferably isotonic with the blood of the recipient.
  • Compatible carriers and solvents are, for example, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution.
  • sterile, fixed oils are usually used as the solution or suspension medium.
  • Fig. 1 Schematic representation of the cloning of eCT.
  • Fig. 2 Splicing of LDH C. Alternative splicing events lead to the absence of exon 3 (SEQ ID NO: 2), the two exons 3 and 4 (SEQ ID NO: 3), exons 3, 6 and 7 (SEQ ID NO : 4) or exon 7 (SEQ ID NO: 5).
  • Fig. 3 Alignment of possible LDH-C proteins.
  • SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 represent franked portions of the prototype protein (SEQ ID NO: 6).
  • the protein sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: II, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 have also been changed and only contain tumor-specific epitopes (printed in bold).
  • the catalytic center is framed.
  • Fig. 4 Quantification of LDH C in different tissues by real-time PCR.
  • Fig. 5 Exon composition of TPTE variants.
  • splice variants were identified (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57), which are expressed in testicular tissue and tumors and have reading frame shifts and thus changed sequence areas.
  • Fig. 6 Alignment of the possible TPTE proteins. Alternative splicing events result in changes in the encoded protein, whereby the reading frame is basically preserved. The putative transmembrane domains are in bold, the catalytic domain is framed.
  • Fig. 8 Alignment of TSBP variants at the protein level. Reading frame shifts in the proteins which are encoded by the TSBP variants found according to the invention (SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36) lead to substantial differences from the protein described above (SEQ ID NO: 30, NM_006781) and are marked in bold.
  • Fig. 9 RT-PCR for MS4A12.
  • expression could only be detected in testis, colon and colorectal carcinoma (colon ca's).
  • colon ca's colon and colorectal carcinoma
  • Fig. 10 RT-PCR for BRCO1.
  • BRCO1 is significantly overexpressed in breast tumors compared to expression in normal mammary gland tissue.
  • Fig. 11 RT-PCR for MORC, TPX1, LDHC, SGY-1.
  • Examination of various normal tissues shows expression only in testis (1 skin, 2 small intestine, 3 colon, 4 liver, 5 lungs, 6 stomach, 7 breast, 8 kidney, 9 ovary, 10 prostate, 11 thyroid, 12 leukocytes, 13 thymus, 14 negative Control, 15 testis).
  • the examination of tumors (1-17 lung tumors, 18-29 melanomas, 30 negative controls, 31 testis) shows ectopic expression in these at different frequencies for the individual eCT.
  • MCF-7 cells were transiently transfected with an LDHC expression plasmid.
  • the antigen was detected with LDHC-specific antibodies and showed a clear colocalization with the mitochondrial respiratory chain enzyme cytochrome C oxidase.
  • Fig. 13 Predicted topology of TPTE and subcellular localization on the cell surface of MCF-7 cells.
  • the left scheme shows the 4 putative trot membrane domains (arrows) of TPTE.
  • MCF-7 cells were transiently transfected with a TPTE expression plasmid. The antigen was detected with TPTE-specific antibodies and showed a clear colocalization with MHC I molecules located on the cell surface.
  • Fig. 14 MS4A12 localization on the cell membrane. Tumor cells were transiently transfected with a GFP-tagged MS4A12 construct and showed complete colocalization with plasma membrane markers in confocal immunofluorescence microscopy.
  • Fig. 15 Western blot detection of LDHC in normal tissues.
  • the expression of LDHC is only detectable in Testis, all other normal tissues tested are negative.
  • 1- testis normal tissue, 2-skin normal tissue, 3-breast normal tissue, 4- liver normal tissue, 5-spleen normal tissue, 6-column normal tissue, 7-lung normal tissue, 8-kidney normal tissue, 9 -lymph node normal tissue
  • Fig. 16 Expression of LDHC in the HCT116 DKO cell line. HCT116 P and HCT116 DKO were stained with an LDHC-specific antibody. Endogenous LDHC is only detectable in HCT116 DKO cells.
  • Fig. 17 Mitochondrial localization of LDHC in the MCF-7 breast cancer cell line.
  • Fig. 18 Membrane localization of heterologously and endogenously expressed TPTE in cell lines.
  • (Left) NIH3T3 cells were transiently transfected with a TPTE expression plasmid.
  • TPTE was detected with specific antibodies and showed a clear colocalization with MHC I molecules located on the cell surface.
  • (Right) Endogenous TPTE in SK-Mel 37 cells was detected with a specific antibody and shows clear membrane localization.
  • Fig. 19 Quantification of TPTE mRNA expression in different tissues by real-time PCR. Expression in normal tissues is only detectable in Testis. Significant expression levels can also be found in tumors and tumor cell lines.
  • Fig. 20 Evidence of antibody specificity. Sections of testis tissue were stained with TPTE-specific antibodies. The specific detection of TPTE is prevented by blocking (right) the antibody with the peptide used for immunization.
  • Fig. 21 Immunohistochemical detection of TPTE in bronchial carcinomas. Sections of bronchial carcinomas were stained with TPTE-specific antibodies. TPTE is expressed homogeneously throughout the tumor and is located on the cell membrane.
  • Fig. 22 Detection of TPTE localization in vital cells.
  • NIH3T3 cells were transiently transfected with a TPTE expression plasmid and analyzed using time-lapse microscopy. The localization of TPTE on the membrane of cell protrusions and pseudoposias results in the immediate refraction of the membrane areas concerned.
  • TPTE enhances cell migration in chemotactic gradients.
  • (Left) Schematic representation of the Boyden chamber assay. NIH3T3 / c-erbB-2 cells were transfected with TPTE-eGFP and the migration of the cells was determined in comparison with non-transfected cells and cells transfected with empty pEGFP vector.
  • the expression of TPTE leads to a 4 to 5-fold increase in cell migration when using 10% FCS as a chemotactic.
  • the expression of TPTE leads to a significant increase in migration even at very low concentrations of PDGF.
  • Fig. 27 Western blot detection of MS4A12 in colon and colon carcinoma.
  • the specific band is normal colon tissue and is detectable in some colon carcinomas.
  • M-MagicMark Invitrogen
  • 1 -colon normal tissue 2-6-colon tumor tissue
  • Fig. 30 Quantification of BRCO1 mRNA expression in different tissues by real-time PCR.
  • the expression of BRCOl in normal tissues is restricted to the breast and testis.
  • Significant expression levels of BRCO1 are detectable in all breast cancers examined. 50% of the tumors show an overexpression of BRCOl in comparison with expressing normal tissues.
  • Fig. 31 Overexpression of BRCOl in breast cancer.
  • Real-time PCR analysis of BRCOl in breast cancer and the adjacent normal tissue shows an overexpression of BRCOl in 50% of breast cancer.
  • Fig. 32 Quantification of PCSC mRNA expression in different tissues by real-time PCR. The expression of PCSC in normal tissues is restricted to the colon, rectum and terminal ileum. Expression of PCSC is detectable in all colon carcinomas. 85% of colon carcinoma metastases show significant overexpression of PCSC compared to primary tumors.
  • Fig. 33 Evidence of the inducibility of TPTE through genomic demethylation.
  • Fig. 34 Western blot detection of TPTE in normal tissues and tumor cell lines.
  • the expression of LDHC is only detectable in testis and tumor cell lines (SK-Mel-37, LCLC-107, PC-3), all other normal tissues tested are negative.
  • the specificity of the antibody is confirmed by the detection of TPTE in transfected NIH3T3 cells (TPTE-pcDNA3.1).
  • Fig. 36 Knock-down of TPTE expression in PC-3 cells by RNAi.
  • PC-3 cells were electroporated with l ⁇ M siRNA specifically for TPTE. After 24 hours, mRNA expression was quantified using real-time RT-PCR. Non-electroporated cells and cells that were electroporated with DsRed siRNA served as a control.
  • Fig. 38 Region from position 121 to 540 of the sequence shown in SEQ ID NO: 822 of the sequence listing. Examples:
  • Candidate genes were extracted from the databases using search queries with the keywords "testis-specif -c gene”, “sperm-specific gene”, “spermatogonia-specific gene”. The search was limited to part of the total information in these databases by using “homo sapiens” for the organism and "mRNA” for the type of molecule.
  • the list of GOI found was curated by determining different names for the same sequence and eliminating such redundancies. All candidate genes, which resulted from the keyword search, were in turn examined by the "electronic Northern” (eNorthern) method with regard to their tissue distribution.
  • the eNorthern is based on the fact that the sequence of a GOI is compared with an EST (expressed sequence tag) database (Adams et al, Science 252: 1651, 1991) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ).
  • ESTs achieve a preliminary assessment of the tissue distribution of the GOI. Only those GOI who had no homology to EST from normal non-testicular tissues with the exception of placenta and fetal tissue were followed up. For this assessment, it was also taken into account that there are false-annotated cDNA banks in the public domain (Scheurle et al., Cancer Res. 60: 4037-4043, 2000) (www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm ).
  • the cDNA xProfiler of the Cancer Genome Anatomy Project of the NCBI (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler) was used as the second data mining method (Hillier et al., Genome Research 6: 807-828, 1996; Pennisi, Science 276: 1023-1024, 1997).
  • This allows pools of transcriptomes stored in databases to be related to one another by logical operators.
  • RNA extraction preparation of poly-d (T) primed cDNA and RT-PCR analysis.
  • Total RNA from native tissue material was extracted using guanidium isothiocyanate as a chaotrophic agent (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-9 , 1987). After extraction with acidic phenol and precipitation with isopropanol, the RNA was dissolved in DEPC-treated water.
  • a first-strand cDNA synthesis was carried out from 2-4 ⁇ g of total RNA in a 20 ⁇ l reaction mixture using Superscript II (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions.
  • a dT (18) oligonucleotide was used as the primer.
  • LDHC LDHC was quantified using real-time PCR.
  • the principle of quantitative real-time PCR with the ABI PRISM Sequence Detection System uses the 5'-3 'exonuclease activity of Taq DNA polymerase for the direct and specific detection of PCR products by the release of fluorescence reporter dyes.
  • a double fluorescence-labeled probe (TaqMan probe) is used in the PCR, which hybridizes to a sequence of the PCR product.
  • the probe is labeled 5 'with a reporter dye (e.g. FAM) and 3' with a quencher dye (e.g. TAMRA).
  • TPTE, MS4A12, PCSC and BRCOl The expression of TPTE, MS4A12, PCSC and BRCOl was also quantified using real-time PCR, but the PCR products were used with SYBR-Green as a reporter dye detected.
  • the reporter fluorescence of SYBR-Green is suppressed in solution and the dye is only active after binding to double-stranded DNA fragments.
  • the increase in SYBR-Green fluorescence as a result of the specific amplification using GOI-specific primers after each PCR cycle is used for the quantification.
  • the expression quantification of the target gene takes place absolutely or relative to the expression of a control gene with constant expression in the tissues to be examined.
  • LDHC Low Capacity cDNA Archive Kit
  • MS4A12 (65 °) sense CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, antisense TTCACCTTTGCCAGCATGTAG
  • PCSC (59 °) sense AGAATAGAATGTGGCCTCTAG, antisense TGCTCTTACTCCAAAAAGATG
  • the membrane is first blocked (e.g. with milk powder) and then incubated with the specific antibody at a dilution of 1: 20-1: 200 (depending on the specificity of the antibody) for 60 minutes.
  • the membrane is incubated with a second antibody coupled with a marker (e.g. enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase), which recognizes the first antibody.
  • a marker e.g. enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase
  • the target protein is then made visible on the membrane in a staining or chennuminescence reaction using an enzyme reaction (e.g. ECL, Amersham Bioscience). The result is documented by recording with a suitable camera.
  • Cells of established cell lines are used which either endogenously synthesize the target protein (detection of the RNA in RT-PCR or the protein in Western blot) or have been transfected with plasmid DNA before the IF.
  • Various methods eg electroporation, liposome-based transfection, calcium phosphate precipitation
  • the transfected plasmid can encode the unmodified protein or else can couple different amino acid markers to the target protein.
  • the most important markers are, for example, the fluorescent "green fluorescent protein” (GFP) in its differentially fluorescent forms, short peptide sequences of 6-12 amino acids, for which highly affine and specific antibodies are available.
  • GFP fluorescent "green fluorescent protein”
  • Cells that synthesize the target protein are included paraformaldehyde; Saponin or methanol fixed. If necessary, the cells can then be permeabilized by incubation with detergents (eg 0.2% Triton X-100). After fixation / permeabilization, the cells are incubated with a primary antibody which is directed against the target protein or against one of the coupled markers.
  • the mixture is incubated with a second antibody, which is coupled to a fluorescent marker (eg fluorescin, Texas Red, Dako) and which binds to the first antibody.
  • a fluorescent marker eg fluorescin, Texas Red, Dako
  • the cells marked in this way are then overlaid with glycerol and analyzed with the aid of a fluorescence microscope according to the manufacturer's instructions. Specific fluorescence emissions are achieved by specific excitation, depending on the substances used.
  • the analysis generally allows the target protein to be localized reliably, with the coupled amino acid markers or other brand proteins being stained in addition to the target protein in order to confirm the antibody quality and the target protein in double stains, the localization of which has already been described in the literature.
  • a special case is the GFP and its derivatives, which can be excited directly and fluoresce themselves, so that no antibodies are required for detection.
  • Tissue pieces with a thickness of approx. 4 ⁇ m fixed in formalin (other fixations: e.g. methanol) and embedded in paraffin are applied to a glass support and deparaffinized with xylene, for example.
  • the samples are washed with TBS-T and blocked in serum.
  • the incubation is then carried out with the first antibody (dilution: 1: 2 to 1: 2000) for 1-18 hours, with affinity-purified antibodies being used as a rule.
  • affinity-purified antibodies being used as a rule.
  • a second antibody coupled with alkaline phosphatase alternatively: eg peroxidase
  • a color reaction then takes place using the alkaline phosphatase (references: Shi et al. J Histochem Cytochem 1991 39: 741-748; Shin et al. Lab Invest. 1991 64: 693-702).
  • the reaction can be blocked by adding the immunogen beforehand.
  • the animals are usually immunized using one of four well-established methods, although other methods also exist. Immunization can be carried out with peptides that are specific for the target protein, the entire protein, with extracellular partial sequences of a protein that can be identified experimentally or via prediction programs.
  • peptides conjugated to KLH keyhole limpet hemocyanin
  • length: 8-12 amino acids are synthesized using a standardized in vitro method and these peptides are used for immunization.
  • 3 immunizations are carried out with a concentration of 5-1000 ⁇ g / immunization.
  • the immunization can also be carried out as a service by service providers.
  • Proteins can also be used for the immunization which have a molecular anchor as an aid for cleaning (for example His-Tag, Qiagen; FLAG day, Röche Diagnostics; Gst fusion proteins).
  • a molecular anchor as an aid for cleaning
  • a large number of protocols can be found, for example, in the “Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons Ltd, Wiley InterScience).
  • a cell line is available which endogenously synthesizes the desired protein, this cell line can also be used to produce the specific antiserum.
  • the immunization is carried out in 1-3 injections, each with approx. 1-5 x 10 7 cells.
  • the immunization can also be carried out by injection of DNA (DNA immunization).
  • the target gene is first cloned into an expression vector so that the target sequence is under the control of a strong eukaryotic promoter (eg CMV promoter). Subsequently, 5-100 ⁇ g of DNA are transferred as immunogen with a “gene gun” into highly perfused, capillary areas of an organism (eg mouse, rabbit). The transferred DNA is taken up by cells of the animal, the target gene is expressed and the animal finally develops an immune response against the target gene (Jung et al, Mol Cells 12: 41-49, 2001; Kasinrerk et a., Hybrid Hybridomics 21: 287-293, 2002).
  • a strong eukaryotic promoter eg CMV promoter
  • the purification of the polyclonal sera was carried out entirely in the case of the peptide antibodies or partially in the case of the antibodies against recombinant proteins as a service by the contracted companies.
  • the corresponding peptide or recombinant protein was covalently bound to a matrix, this was equilibrated after coupling with a native buffer (PBS: phosphate buffered saline) and then incubated with the raw serum. After a further washing step with PBS, the antibody was eluted with 100 mM glycine pH 2.7 and the eluate was immediately neutralized in 2 M TRIS pH 8.
  • the antibodies thus purified could then be used for the specific detection of the target proteins both by Western blotting and by immunofluorescence.
  • the Boyden Chamber is used to quantify cell migration in response to chemotactic stimuli.
  • the chamber consists of two compartments separated by a micropore membrane.
  • the cells to be examined are placed in minimal medium in the upper compartment, while the lower compartment is filled with medium which contains the corresponding chemotactic.
  • the cells move according to the gradient through the membrane and adhering to the underside of the membrane. After fixation, the transmigrated cells can be counted under the microscope.
  • the migration assay was performed to determine the promigratory potential of TPTE.
  • NIH3T3 fibroblasts transfected with TPTE-eGFP, c-erbB2 transformed were used.
  • Non-transfected cells and cells transfected with eGFP-N3 empty vector were used as control cells.
  • Transwell chambers (Becton Dickinson) with a pore size of 8.0 ⁇ M in the membrane were used for the assay.
  • 4 ⁇ 10 4 cells in 400 ⁇ l of serum-free DMEM medium were added to the upper compartment.
  • the lower compartment was filled with 800 ⁇ l DMEM medium, to which 10% FCS or PDGF-BB was added in increasing concentrations (10-300ng / ⁇ l).
  • the chambers were incubated at 37 ° for 40 h.
  • the transmigrated cells were then fixed in ice-cold methanol, the membranes were cut out and covered on slides with Hoechst core dye (DAKO) for fluorescence microscopy. Cells in five visual fields (20x magnification) per membrane were counted. All experiments were carried out in triplicate.
  • DAKO Hoechst core dye
  • RNA interference RNA interference
  • 5x10 6 cells were taken up in 250 ⁇ l serum-free X-VIVO 15 medium and electroporated with l ⁇ M of the corresponding siRNA duplexes (200V, 250 ⁇ F).
  • the TPTE mRNA expression was quantified 24 hours later using real-time RT-PCR. methylation Analysis
  • TPTE-negative cell lines BT549 mimma-Ca
  • HCTl 16 colon-Ca
  • the TPTE expression was then quantified using real-time RT-PCR.
  • DNMT DNA methyl transferase
  • DNMT1 HCT116 DNMTW -
  • DNMT3b H CT116 DNMT3W -
  • TPTE-eGFP transfected cells were incubated for 12 h in serum-free DMEM medium.
  • FCS serum-free DMEM medium.
  • pseudopodia and filopodia the cells were stimulated by adding FCS before the analysis. Images of the vital cells were taken at 30sec intervals with a üivert Olympus microscope (1X70) with a TILL IMAGO-VGA CCD camera.
  • TPTE immunofluorescence microscopy of heterologously expressed TPTE
  • the complete ORF of TPTE was cloned into pEGFP-Cl and pEGFP-N3 vectors (Clontech).
  • LDH C (SEQ ID NO: 1) and its translation product (SEQ ID NO: 6) have been described as the testis-specific isoenzyme of the lactate dehydrogenase family.
  • the sequence is published in GenBank under accession number NM_017448.
  • the enzyme forms a homotetramer with a molecular weight of 140 kDa (Goldberg, E. et al, Contraception 64 (2): 93-8, 2001; Cooker et al, Biol. Reprod. 48 (6): 1309-19, 1993; Gupta, GS, Grit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 34 (6): 361-85, 1999).
  • the expected size of the amphication product with the above-mentioned PCR primers is 824 bp. According to the invention, however, the amplification of multiple additional bands was observed in tumors, but not in testis. Since this is indicative of the presence of alternative splice variants, the entire open reading frame was amplified with LDH-C specific primers (5'-TAGCGCCTCAACTGTCGTTGG-3 ', 5'-CAACATCTGAGACACCATTCC-3') and independent full-length clones were sequenced. Alignments with the prototype ORF of the described sequence of LDH C (SEQ ID NO: 1) and the genomic sequence on chromosome 11 confirm additional splice variants (SEQ ID NO: 2-5).
  • SEQ ID NO: 14 GAVGMACAISILLKITVYLQTPE faus SEQ ID NO: 7
  • SEQ ID NO: 15 GAVGMACAISILLKWJF (from SEQ ID NO: 9)
  • SEQ ID NO: 16 GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN Thousand SEQ ID NO: 16: GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN Thousand SEQ ID NO: 16: GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN Thousand SEQ ID NO: 16: GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN Thousand SEQ ID NO: 16: GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN Thousand SEQ ID NO: 16: GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN Thousand SEQ ID NO: 16: GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN Thousand
  • SEQ ID NO: 17 MVGLLENMVILVGLYGIKEELFL (from SEQ ID NO: 12)
  • SEQ ID NO: 18 EHWKNIHKOVIORDYME thousand SEQ ID NO: 13)
  • expression levels were quantified by real-time PCR using a specific primer probe set.
  • the amplicon lies in the transition between exon 1 and 2 and thus detects all variants (SEQ ID NO: 1-5). Detect these tests too no transcripts in normal tissues other than testis. They confirm significant expression levels in tumors (Fig. 4).
  • the data should be presented for antibodies that are directed against SEQ ID NO: 80. These recognize LDHC protein in Testis tissue but not in other normal tissues in the Western blot examination (Fig. 15) and thus confirm the RT-PCR data at the transcript level.
  • the specific antibody can also be used under various fixation conditions for immunofluorescence studies. RT-PCR studies showed that the colon carcinoma cell line HCT 116 P does not express LDHC. However, their DNA methyltransferase deleted variant HCT 116 DKO is positive for LDHC. Comparative staining of both cell lines with the above-mentioned antibody specifically detected the corresponding protein in an easily detectable amount in the cell lines typed as positive (Fig. 16). Accordingly, this antibody also qualifies for immunohistochemical staining of normal and tumor tissue sections by the expert. The staining of testis tissue e.g. shows a clear positivity of germ cells (Fig. 16).
  • spermatids prefer to use the citrate cycle as the main source of energy (Storey BT Biol. Reprod. 16: 549-556, 1977). It has long been known that tumor cells often cover their energy requirements through anaerobic glycolysis, ie they increasingly produce lactate, and do not use the citrate cycle and the respiratory chain even under aerobic conditions. The molecular basis of this phenomenon, which is described as the Warburg effect, has not yet been elucidated. Caused by enzyme defects in the mitochondria and the overexpression of key enzymes in glycolysis.
  • sequences of the transcript of TPTE (SEQ ID NO: 19) and its translation product (SEQ ID NO: 22) are published in GenBank under accession number NM_013315 (Walker, SM et al., Biochem. J. 360 (Pt 2): 277 -83, 2001; Guipponi M. et al., Hum. Genet. 107 (2): 127-31, 2000; Chen H. et al, Hum. Genet. 105 (5): 399-409, 1999).
  • TPTE has been described as a gene coding for a possible transmembrane tyrosine phosphatase with Testis-specific expression that is located in the pericentromeric region of chromosomes 21, 13, 15, 22, and Y (Chen, H. et al., Hum. Genet 105: 399-409, 1999). Alignment studies according to the invention additionally show homologous genomic sequences on chromosomes 3 and 7.
  • the membrane localization e.g. A prerequisite for the accessibility of therapeutic antibodies could be proven beyond any doubt by transfection of TPTE-negative cells with a fusion construct of TPTE and green fluorescent protein (Fig. 18, right). This accumulates on the membrane surface and can be shown to be colocalizing with other known membrane markers such as HLA molecules.
  • PCR primers were generated according to the invention (5 * -TGGATGTCACTCTCATCCTTG-3 'and 5'-
  • TPTE variants are activated ectopically in a number of tumor tissues; see. Table 2.
  • SEQ ID NO: 105 MNESPDPTDLAGVIIELGPNDSPQTSEFKGATEEAPAKESPHTS EFKGAARVSP (rec. Prot. Aa 1-54)
  • Fig. 21 The localization of the protein on the membrane of the cells is also confirmed here (Fig. 21).
  • the specificity of the staining was confirmed by competition experiments.
  • the specific antibody was first pre-incubated with recombinant TPTE protein and then placed on the tissue sections (eg Testis as a positive control, Fig. 20). This can successfully block the reactivity.
  • This antibody can be used to successfully stain many different primary tumor types (including breast tumors, melanomas, etc.) but not the associated normal tissue.
  • a staining of prostate tissue is also shown as an example. Normal prostate tissue is negative, while invasive as well as not yet invaded prostate tumors are positive for this molecule.
  • TPTE TPTE
  • SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57
  • TPTE TPTE
  • the TPTE genomic sequence consists of 24 exons (accession number NT_029430).
  • the transcript shown in SEQ ID NO: 19 contains all of these exons.
  • the splice variant shown in SEQ ID NO: 20 results from splicing out exon 7.
  • the splicing variant shown in SEQ ID NO: 21 shows a partial incoherence of an intron that follows exon 15.
  • SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, exons 18, 19, 20 and 21 can alternatively be spliced out. These alternative splicing events result in changes in the encoded protein, whereby the reading frame is basically retained (Fig. 6).
  • the translation product encoded by the sequence shown in SEQ ID NO: 20 has a deletion of 13 amino acids compared to the sequence shown in SEQ ID NO: 22.
  • the translation product which is encoded by the sequence shown in SEQ ID NO: 21 (SEQ ID 24) carries an additional insertion in the central region of the molecule and thus differs from the other variants by 14 amino acids.
  • the translation products of the variants SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, namely the proteins SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 are also changed.
  • TPTE is localized with class I histocompatibility antigens on the cell surface of tumor cells.
  • TPTE had only been described as a Golgi-associated protein. Due to the expression of TPTE on the cell surface of tumor cells, this tumor antigen is suitable according to the invention as an excellent target for the development of diagnostic and therapeutic monoclonal antibodies. Because of the predicted Membrane topology of TPTE are particularly suitable for this purpose according to the invention in the extracellularly exposed areas.
  • this includes the peptides FTDSKLYIPLEYRS (SEQ ID NO: 81) and FDIKLLRNIPRWT (SEQ ID NO: 82). It was also shown that TPTE promotes the migration of tumor cells. Cells that are cultivated for several hours in minimal medium without FCS tend to spontaneously develop pseudopodia and membrane protrusions. A pronounced accumulation of the protein on the membrane of this structure was demonstrated both in heterologously expressing cells (TPTE-eGFP) and in spontaneously expressing cell lines (AK staining). Furthermore, co-staining with rhodamine-phalloidin resulted in clear co-localization of TPTE with F-actin in these areas.
  • TPTE as a cell membrane-bound lipid phosphatase with substrate specificity for P ⁇ P 3,4,5 has a regulating function on the RTK-mediated signal transduction and thus exerts a modulating effect on the membrane dynamics in tumor cells.
  • TPTE-eGFP was expressed in NIH3T3 fibroblasts which, by transformation with c-erbB-2, have a constitutively activated PI-3 kinase signaling and thus an overproduction of the second messenger PIP 3.4> 5 .
  • RNA interference RNA interference
  • TPTE is a cytoplasmic protein that can be directed to the plasma membrane using PH domain-recruiting second messengers such as PIP 3,4,5
  • TPTE could perceive chemotactic gradients directly on the membrane by blocking signal transduction from modulate activated RTKs, which are often overexpressed in cancer cells, thereby conveying a spatial gradient perception.
  • Phosphatases are often involved in cell motility and migration.
  • TPTE was introduced into a TPTE-negative cell line as a fusion protein with green fluorescence protein and the distribution of this protein was observed in vivo using real-time microscopy. Cells form membrane extensions (protrusions) as a precursor to migration.
  • TPTE apparently imparts promigratory properties to a cell
  • Brast or lung tumors of a total of 58 patients were examined for expression of TPTE and compared statistically with the course of the patient's disease.
  • Those tumors that express TPTE are significantly more likely to have lymph nodes, but also distant metastases, than the TPTE-negative ones (Fig. 24).
  • TPTE plays an essential role in the metastasis of tumors. Accordingly, TPTE can be used as a marker for prognostically worse progression and tendency to metastasis. Furthermore, methods which inhibit the endogenous activity of TPTE in tumor cells, e.g. through the use of antisene RNA, different methods of RNA interference (RNAi) using expression vectors or retroviruses, as well as through the use of small molecules, lead to reduced breast stasis and are therefore therapeutically very important.
  • RNAi RNA interference
  • the electronic cloning method used according to the invention gave TSBP (SEQ ID NO: 29) and the protein derived therefrom (SEQ ID NO: 30).
  • the gene is described as Testis-specifically regulated (accession number NM_006781).
  • the gene was predicted to encode a basic protein and to be located on chromosome 6 in the vicinity of a sequence coding for an MHC complex (C6orfl0) (Stammers M. et al., Immuno genetics 51 (4-5): 373-82, 2000). According to the invention, it was shown that the sequence described above is incorrect.
  • the sequence according to the invention has significant sequence differences from the known sequence. According to the invention, 3 different splicing variants were cloned.
  • TSBP tumor marker or tumor-associated antigen
  • TSBP can therefore serve as a potential marker for tumor endothelia and for neovascular targeting.
  • the TSBP promoter can thus be cloned to another gene product whose selective expression in the lymph node is desired.
  • Analysis of TSBP antigen expression with specific antibodies confirmed the selective localization of the protein in testis and lymph nodes as well as in melanoma and bronchial carcinoma.
  • immunohistological examinations with GFP-tagged TSBP showed a pronounced perinuclear accumulation. Table 3. Expression of TSBP in tumors
  • SEQ ID NO: 106 CYQHKVTLHMITERDP (aa 60-74)
  • SEQ ID NO: 107 CRIPQVHTMDSSGKI (aa 191-204)
  • the data should be shown as an example for antibodies which are directed against SEQ ID NO: 108.
  • the specific antibody can be used under various fixation conditions for immunofluorescence studies.
  • RT-PCR studies showed that the colon carcinoma cell line HCT 116 P does not express TSBP.
  • their DNA methyltransferase deleted variant HCT 116 DKO is positive for TSBP. Comparative staining of both cell lines with the above-mentioned antibody specifically detected the corresponding protein in an easily detectable amount in the cell lines typed as positive (Fig. 25).
  • the endogenous protein is primarily localized on the core and ER membrane with a slight staining of the plasma membrane.
  • MS4A12 (SEQ ID NO: 37, accession number NM) 17716) and its translation product (SEQ ID NO: 38) are members of a multigen family related to the B cell-specific antigen CD20, the hematopoiesis cell-specific protein HTm4, and the ß - Chain of the high-affinity IgE receptor described above. All family members have at least four potential transmembrane domains as characteristics, both the C- and the N-terminus are cytoplasmic (Liang Y. et al., Immunogenetics 53 (5): 357-68, 2001; Liang Y. & Tedder, Genomics 72 (2): 119-27, 2001). According to the invention, RT-PCR tests for MS4A12 were carried out.
  • MS4A12 is therefore a cell-membrane-based differentiation antigen for normal colonic epithelium, which is also expressed in colorectal tumors and metastases.
  • a quantitative real-time PCR (40 cycles, initial denaturation 15 min 95 ° C, 30 sec 94 ° C, 30 sec 62 ° C, and 30 sec 72 ° C) was carried out with the specific primers (CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC and TTCACCTTTGCCAGCATGTAG) (Fig . 26). This not only confirms the absence of MS4A12 in the majority of normal tissues except testis and colorectal normal tissues. Rather, it reveals large amounts of transcripts in, for example, primary intestinal tumors and their metastases.
  • SEQ ID NO: 109 MMSSKPTSHAEVNETC (aa 1 - 15)
  • SEQ ID NO: 110 CGVAGQDYWAVLSGKG (aa 64 - 73)
  • SEQ ID NO: lll MMSSKPTSHAEVNETC (aa 1 - 15)
  • the data should be shown as an example for antibodies which are directed against SEQ ID NO: 11.
  • a specific band can be detected in the Western blot at the expected level in normal intestine, but in colon carcinomas but not in other normal tissues (Fig. 27).
  • the specific antibody can be used under various fixation conditions for immunofluorescence studies.
  • the corresponding protein can be detected specifically in a well-detectable amount specifically in the cell lines typified as positive and MS4A12 also expressed in a eukaryotic recombinant manner is specifically recognized (Fig. 28).
  • These experiments also confirm membrane localization.
  • This antibody was also used for immunohistochemical staining of tissue sections. As expected, the color
  • BRCOl and its translation product are not previously described.
  • the data mining method according to the invention resulted in the EST (expressed sequence tag) AI668620.
  • specific primers sense: CTTGCTCTGAGTCATCAGATG
  • antisense CACAGAATATGAGCCATACAG
  • RT-PCR studies were carried out for expression analysis.
  • specific expression was found in testicular tissue and additionally in normal mammary gland (Table 5). This antigen is repressed in all other tissues. It is also found in mammary gland tumors (20 out of 20). In breast tumors, BRCO1 is clearly overexpressed compared to the expression in normal breast gland tissue (Fig. 10).
  • BRCOl is thus a new differentiation antigen for normal mammary gland epithelium that is overexpressed in breast tumors.
  • TPX1 Acc No. NM_003296; SEQ ID NO: 40
  • SEQ ID NO: 41 The sequence of TPX1 (Acc No. NM_003296; SEQ ID NO: 40) and its translation product (SEQ ID NO: 41) are known.
  • the antigen has so far been described as only Testis-specific, namely as an element of the outer fibers and the acromosome of sperm. He has previously been assigned a role as an adhesion molecule in the attachment of sperm to Sertoli cells (O'Bryan, MK et al., Mol. Reprod. Dev. 58 (l): 116-25, 2001; Maeda, T. et al., Dev. Growth Differ. 41 (6): 715-22, 1999).
  • TPX1-specific protein sequences which are suitable for the production of diagnostic and therapeutic molecules according to the invention Peptide SREVTTNAQR (SEQ ID NO: 84).
  • BRCO2 and its translation product are not previously described.
  • the method according to the invention gave the ESTs (expressed sequence tag) BE069341, BF330573 and AA601511.
  • RT-PCR studies for expression analysis were carried out with specific primers (sense: AGACATGGCTCAGATGTGCAG, antisense: GGAAATTAGCAAGGCTCTCGC).
  • specific expression was found in testicular tissue and additionally in normal breast gland (Table 7). This gene product is transcriptionally repressed in all other tissues. It is also found in mammary tumors.
  • BRCO2 is a new differentiation gene product for normal mammary gland epithelium, which is also expressed in breast tumors.
  • Example 8 Identification of PCSC as a new tumor gene product
  • PCSC (SEQ_ID_63) and its translation product are not previously described.
  • the data mining method according to the invention resulted in the EST (expressed sequence tag) BF064073.
  • RT-PCR studies for expression analysis were carried out with specific primers (sense: TCAGGTATTCCCTGCTCTTAC, antisense: TGGGCAATTCTCTCAGGCTTG).
  • specific expression was found in normal colon and also in colon carcinoma (Table 5). This gene product is transcriptionally repressed in all other tissues.
  • PCSC encodes three putative ORFs (SEQ_ID_64, SEQ_ID_65 and SEQ_ID_117). Sequence analysis of SEQ_ID_64 revealed structural homology to CXC cytokines.
  • each cDNA contains 3 putative ORFs which code for the polypeptides shown in SEQ ID NO: 89-100.
  • PCSC is therefore a differentiation antigen for normal colon epithelium, which is also expressed in colorectal tumors and in all colon metastases investigated.
  • the PCSC expression detected according to the invention in all colorectal metastases make this tumor antigen a very interesting target for the prophylaxis and treatment of metastatic colon tumors.
  • PCR primers were generated according to the invention (5'-CTCCTATCCATGATGCTGACG-3 'and 5'-CCTGAGGATGTACAGTAAGTG-3 *) and for RT-PCR analyzes (95 ° 15min; 94 ° 1 min; 63 ° 1 min; 72 ° 1 min; 35 cycles) in a number of human tissues. It was shown that expression in normal tissues is limited to testis. According to the invention, as described for the other eCTs, SGY-1 was shown to be activated ectopically in a number of tumor tissues; see. Table 9.
  • MORC The sequences of the transcript of MORC (SEQ ID NO: 74) and its translation product (SEQ ID NO: 75) are published in GenBank under accession number XM_037008 (Inoue et al., Hum Mol Genet. Jul; 8 (7): 1201- 7, 1999). MORC is originally described as being involved in spermatogenesis. Mutation of this protein in the mouse system leads to gonadal underdevelopment.
  • PCR primers were generated according to the invention (5'-CTGAGTATCAGCTACCATCAG-3 'and 5'-TCTGTAGTCCTTCACATATCG-3') and for RT-PCR analyzes (95 ° 15min; 94 ° 1 min; 63 ° 1 min; 72 ° 1 min; 35 cycles) in a number of human tissues. It was shown that the expression in normal tissues is limited to testis. As described for the other eCT, it was possible to show according to the invention that MORC is activated in a number of tumor tissues; see. Table 10.

Abstract

The invention relates to the identification of genetic products expressed in association with tumours and to coding nucleic acids for said products. The invention also relates to the therapy and diagnosis of diseases in which the genetic products are aberrantly expressed in association with tumours, proteins, polypeptides and peptides which are expressed in association with tumours and to the coding nucleic acids for said proteins, polypeptides and peptides.

Description

Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren VerwendungGene products differentially expressed in tumors and their use
Trotz interdisziplinärer Ansätze und Ausreizung klassischer Therapiemodalitäten gehören Krebserkrankungen weiterhin zu den fuhrenden Todesursachen. Neuere therapeutische Konzepte zielen darauf ab, das patienteneigene Immunsystem durch Einsatz von rekombinanten Tumorvakzinen und anderen spezifischen Maßnahmen wie Antikörpertherapie in das therapeutische Gesamtkonzept mit einzubeziehen. Voraussetzung für den Erfolg einer solchen Strategie ist die Erkennung von Tumor-spezifischen oder Tumor-assoziierten Antigenen bzw. Epitopen durch das Immunsystem des Patienten, dessen Effektorfunktionen interventionell verstärkt werden sollen. Tumorzellen unterscheiden sich biologisch wesentlich von ihren nichtmalignen Ursprungszellen. Diese Differenzen sind durch während der Tumorentwicklung erworbene genetische Veränderungen bedingt und führen u.a. auch zur der Bildung qualitativ oder quantitativ veränderter molekularer Strukturen in den Krebszellen. Werden solche Tumor-assoziierten Strukturen vom spezifischen Immunsystem des tumortragenden Wirtes erkannt, spricht man von tumor-assoziierten Antigenen. An der spezifischen Erkennung von tumor-assoziierten Antigenen sind zelluläre und humorale Mechanismen beteiligt, die zwei miteinander funktionell vernetzte Einheiten darstellen: CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten erkennen prozessierte Antigene, die auf den Molekülen der MHC- (Major Histocompatibility complex = Histokompatibilitäts Antigene) Klassen II bzw. I präsentiert werden, während B-Lymphozyten zirkulierende Antikörpermoleküle produzieren, die direkt an unprozessierte Antigene binden. Die potentielle klinisch-therapeutische Bedeutung von tumor-assoziierten Antigenen ergibt sich aus der Tatsache, dass die Erkennung von Antigenen auf neoplastischen Zellen durch das Immunsystem zur Initiierung von cytotoxischen Effektormechanismen führt und bei Vorhandensein von T-Helferzellen die Elimination der Krebszellen bewirken kann (Pardoll, Nat. Med. 4:525-31, 1998). Entsprechend ist es eine zentrale Zielsetzung der Tumorimmunologie, diese Strukturen molekular zu definieren. Die molekulare Natur dieser Antigene blieb lange enigmatisch. Erst als entsprechende Klonierungstechniken entwickelt wurden, gelang es, durch Analyse der Zielstrukturen von cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) (van der Bruggen et al., Science 254:1643-7, 1991) bzw. mit zirkulierenden Autoantikörpern (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol 9:709-16, 1997) als Sonden cDNA-Expressionbanken von Tumoren systematisch auf tumor-assoziierte Antigene zu screenen. Hierzu wurden cDNA-Expressionsbanken aus frischem Tumorgewebe hergestellt und in geeigneten Systemen als Proteine rekombinant exprimiert. Aus Patienten isolierte Immuneffektoren, nämlich CTL-Klone mit Tumor- spezifischem Lysemuster, oder zirkulierende Autoantikörper wurden genutzt, um die respektiven Antigene zu klonieren.Despite interdisciplinary approaches and the exhaustion of classic therapy modalities, cancer continues to be a leading cause of death. More recent therapeutic concepts aim to include the patient's own immune system in the overall therapeutic concept by using recombinant tumor vaccines and other specific measures such as antibody therapy. The prerequisite for the success of such a strategy is the detection of tumor-specific or tumor-associated antigens or epitopes by the patient's immune system, the effector functions of which are to be enhanced by intervention. Tumor cells differ biologically from their non-malignant cells of origin. These differences are due to genetic changes acquired during tumor development and also lead to the formation of qualitatively or quantitatively changed molecular structures in the cancer cells. If such tumor-associated structures are recognized by the specific immune system of the tumor-bearing host, one speaks of tumor-associated antigens. The specific recognition of tumor-associated antigens involves cellular and humoral mechanisms that represent two functionally networked units: CD4 + and CD8 + T lymphocytes recognize processed antigens that are based on the molecules of the MHC (major histocompatibility complex = histocompatibility complex) ) Classes II and I are presented, while B-lymphocytes produce circulating antibody molecules that bind directly to unprocessed antigens. The potential clinical-therapeutic significance of tumor-associated antigens arises from the fact that the recognition of antigens on neoplastic cells by the immune system leads to the initiation of cytotoxic effector mechanisms and, in the presence of T helper cells, can cause the cancer cells to be eliminated (Pardoll, Nat. Med. 4: 525-31, 1998). Accordingly, it is a central objective of tumor immunology to define these structures on a molecular basis. The molecular nature of these antigens has long remained enigmatic. Only when appropriate cloning techniques were developed was it possible to analyze the target structures of cytotoxic T lymphocytes (CTL) (van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7, 1991) or with circulating autoantibodies (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol 9: 709-16, 1997) as probes to systematically screen tumor cDNA expression banks for tumor-associated antigens. For this purpose, cDNA expression banks were produced from fresh tumor tissue and expressed recombinantly as proteins in suitable systems. Immune effectors isolated from patients, namely CTL clones with tumor specific lysis pattern, or circulating autoantibodies were used to clone the respective antigens.
Durch diese Ansätze sind in den letzten Jahren eine Vielzahl von Antigenen in verschiedenen Neoplasien definiert worden. Von großem Interesse ist dabei die Klasse der Cancer/Testis- Antigene (CTA). CTA und sie kodierende Gene (Cancer/Testis-Gene oder CTG) sind durch ihr charakteristisches Expressionsmuster definiert [Tureci et al, Mol Med Today. 3:342-9, 1997]. Sie finden sich nicht in Normalgeweben bis auf Testis bzw. Keimzellen, werden jedoch in einer Reihe von humanen Malignomen exprimiert und zwar nicht tumortypspezifisch, sondern mit unterschiedlicher Häufigkeit in Tumorentitäten ganz unterschiedlicher Herkunft (Chen & Old, Cancer J Sei. Am. 5:16-7, 1999). Auch Serumreaktivitäten gegen CTA finden sich nicht in gesunden Kontrollen, sondern lediglich in Tumorpatienten. Insbesondere aufgrund ihrer Gewebeverteilung ist diese Antigenklasse von besonderem Wert für immuntherapeutische Vorhaben und wird in derzeit laufenden klinischen Patientenstudien getestet (Marchand et al., Int. J. Cancer 80:219-30, 1999; Knuth et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46: S46-51, 2000).These approaches have been used to define a large number of antigens in various neoplasias in recent years. The class of cancer / testis antigens (CTA) is of great interest. CTA and genes encoding it (Cancer / Testis genes or CTG) are defined by their characteristic expression pattern [Tureci et al, Mol Med Today. 3: 342-9, 1997]. They are not found in normal tissues except for testis or germ cells, but are expressed in a number of human malignancies, and not specifically for the tumor type, but with different frequencies in tumor entities of very different origins (Chen & Old, Cancer J Sei. Am. 5:16 -7, 1999). Serum reactivities against CTA are also not found in healthy controls, but only in tumor patients. In particular due to its tissue distribution, this class of antigen is of particular value for immunotherapeutic projects and is being tested in ongoing clinical patient studies (Marchand et al., Int. J. Cancer 80: 219-30, 1999; Knuth et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46: S46-51, 2000).
Allerdings nutzen die oben dargestellten klassischen Verfahren zur Antigenidentifizierung Immuneffektoren (zirkulierende Autoantikörper oder CTL-Klone) aus Patienten mit in der Regel bereits fortgeschrittenem Krebs als Sonden. Aus einer Reihe von Daten geht hervor, dass Tumoren z.B. zur Tolerisierung und Anergisierung von T-Zellen führen können und gerade im Verlauf der Erkrankung diejenigen Spezifitäten aus dem Immuneffektorenrepertoire verloren gehen, die eine effektive Immunerkennung bewirken könnten. Aus laufenden Patientenstudien hat sich noch kein gesicherter Beweis für eine tatsächliche Wirkung der bisher entdeckten und genutzten tumor-assoziierten Antigene ergeben. Entsprechend kann nicht ausgeschlossen werden, dass spontane Immunantworten evozierende Proteine die falschen Zielstrukturen sind.However, the classic antigen identification methods outlined above use immunoeffectors (circulating autoantibodies or CTL clones) from patients with usually advanced cancer as probes. A number of data show that tumors e.g. can lead to the tolerance and anergization of T cells and especially in the course of the disease those specificities from the immune effector repertoire that could cause effective immune recognition are lost. From ongoing patient studies, no reliable evidence has yet been obtained for an actual effect of the previously discovered and used tumor-associated antigens. Accordingly, it cannot be ruled out that spontaneous immune-evoking proteins are the wrong target structures.
Es war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung Zielstrukturen für eine Diagnose und Therapie von Krebserkrankungen bereitzustellen.It was the object of the present invention to provide target structures for diagnosis and therapy of cancer.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.This object is achieved by the subject matter of the claims.
Erfindungsgemäß wurde eine Strategie für eine Identifizierung und Bereitstellung Tumorassoziiert exprimierter Antigene und der dafür kodierenden Nukleinsäuren verfolgt. Diese Strategie beruht auf der Tatsache, dass eigentlich Testis- und damit Keimzell-spezifische Gene, die normalerweise in adulten Geweben silent sind, in Tumorzellen ektop und unerlaubt reaktiviert werden. Durch Datamining wird zunächst eine möglichst komplette Liste aller bekannten Testis-spezifischen Gene aufgestellt und diese sodann durch Expressionsanalysen mittels spezifischer RT-PCR auf ihre aberrante Aktivierung in Tumoren evaluiert. Datamining ist ein bekanntes Verfahren zur Identifizierung von Tumor-assoziierten Genen. Bei den herkömmlichen Strategien werden allerdings in der Regel Transkriptome von Normalgewebebanken elektronisch von Tumorgewebsbanken subtrahiert unter der Annahme, dass die verbleibenden Gene Tumor-spezifisch sind (Schmitt et al., Nucleic Acids Res. 27:4251-60, 1999; Vasmatzis et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 95:300-4, 1998. Scheurle et al, Cancer Res. 60:4037-43, 2000).According to the invention, a strategy for identifying and providing tumor-associated expressed antigens and the nucleic acids coding therefor was pursued. This strategy is based on the fact that it is actually testis-specific and therefore germ-cell-specific Genes that are normally silent in adult tissues are reactivated ectopically and illegally in tumor cells. By means of data mining, a complete list of all known Testis-specific genes is first drawn up and then evaluated by expression analysis using specific RT-PCR for their aberrant activation in tumors. Datamining is a well-known method for the identification of tumor-associated genes. With conventional strategies, however, transcriptomes from normal tissue banks are usually electronically subtracted from tumor tissue banks on the assumption that the remaining genes are tumor-specific (Schmitt et al., Nucleic Acids Res. 27: 4251-60, 1999; Vasmatzis et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 300-4, 1998. Scheurle et al, Cancer Res. 60: 4037-43, 2000).
Das erfindungsgemäße Konzept, das sich als viel erfolgreicher erwiesen hat, beruht jedoch darauf, Datamining zur elektronischen Extraktion aller Testis-spezifischer Gene zu nutzen und diese sodann auf ektope Expression in Tumoren zu evaluieren.The concept according to the invention, which has proven to be much more successful, however, is based on using data mining for the electronic extraction of all Testis-specific genes and then evaluating these for ectopic expression in tumors.
Somit betrifft die Erfindung in einem Aspekt eine Strategie zur Identifizierung von differentiell in Tumoren exprimierten Genen. Diese kombiniert Datamining von öffentlichen Sequenzbanken ("in silico") mit darauffolgenden evaluierenden labor-experimentellen ("wet bench") Untersuchungen.Thus, in one aspect, the invention relates to a strategy for identifying genes differentially expressed in tumors. This combines data mining from public sequence banks ("in silico") with subsequent evaluating laboratory experiments ("wet bench").
Eine kombinierte Strategie basierend auf zwei unterschiedlichen biomformatischen Skripten ermöglichte erfindungsgemäß die Identifizierung neuer Mitglieder der Cancer/Testis (CT) Genklasse. Diese sind bisher als rein Testis-, Keimzell-, oder Spermien-spezifisch eingestuft worden. Die Erkenntnis, dass diese Gene aberrant in Tumorzellen aktiviert werden, erlaubt, ihnen eine substantiell neue Qualität mit funlctionellen Implikationen zuzuordnen. Die Identifizierung und Bereitstellung dieser tumor-assoziierten Gene und der dadurch kodiertenA combined strategy based on two different biomformat scripts enabled the identification of new members of the Cancer / Testis (CT) gene class according to the invention. So far, these have been classified as purely testis, germ cell or sperm specific. The knowledge that these genes are activated aberrantly in tumor cells allows them to be assigned a substantially new quality with functional implications. The identification and provision of these tumor-associated genes and the codes encoded thereby
Genprodukte erfolgte erfindungsgemäß unabhängig von einer immunogenen Wirkung.According to the invention, gene products were produced independently of an immunogenic effect.
Die erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigene weisen eine Aminosäuresequenz auf, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-5, 19-21, 29, 31-33, 37, 39, 40, 54-57, 62, 63, 70, 74, 85-88 einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist. In einer bevorzugten Ausführungsform weist ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen eine Aminosäuresequenz auf, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1-5, 19-21, 29, 31-33, 37, 39, 40, 54-57, 62, 63, 70, 74, 85-88 ausgewählt ist. In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst ein erfmdungsgemäß identifiziertes tumor-assoziiertes Antigen eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 6-13, 14-18, 22-24, 30, 34-36, 38, 41, 58-61, 64, 65, 71, 75, 80-84, 89-100, 101-117 einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist.The tumor-associated antigens identified according to the invention have an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which is selected from the group consisting of (a) a nucleic acid which comprises a nucleic acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 -5, 19-21, 29, 31-33, 37, 39, 40, 54-57, 62, 63, 70, 74, 85-88 a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid which under stringent conditions with the nucleic acid hybridized under (a), (c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c). In a preferred embodiment, a tumor-associated antigen identified according to the invention has an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-5, 19-21, 29, 31-33, 37, 39 , 40, 54-57, 62, 63, 70, 74, 85-88 is selected. In a further preferred embodiment, a tumor-associated antigen identified according to the invention comprises an amino acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6-13, 14-18, 22-24, 30, 34-36, 38, 41, 58- 61, 64, 65, 71, 75, 80-84, 89-100, 101-117 a part or derivative thereof is selected.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigenen oder von Teilen davon, von dafür kodierenden Nukleinsäuren oder von Nukleinsäuren, die gegen die kodierenden Nukleinsäuren gerichtet sind oder von Antikörpern, die gegen die erfmdungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigene oder Teile davon gerichtet sind, für die Therapie und Diagnose. Diese Nutzung kann einzelne, aber auch Kombinationen von mehreren dieser Antigene, funktionalen Fragmente, Nukleinsäuren, Antikörper etc betreffen, in einer Ausführungsform auch in Kombination mit anderen tumor-assoziierten Genen und Antigenen für eine Diagnose, Therapie und Verlaufskontrolle. Bevorzugte Erkrankungen für eine Therapie und/oder Diagnose sind solche, bei denen eine selektive Expression oder abnormale Expression von einem oder mehreren der erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigenen vorliegt.The present invention relates generally to the use of tumor-associated antigens identified according to the invention or of parts thereof, of nucleic acids coding therefor or of nucleic acids which are directed against the coding nucleic acids or of antibodies which are directed against the tumor-associated antigens or parts thereof identified according to the invention are directed for therapy and diagnosis. This use can relate to individual, but also combinations of several of these antigens, functional fragments, nucleic acids, antibodies, etc., in one embodiment also in combination with other tumor-associated genes and antigens for diagnosis, therapy and follow-up. Preferred diseases for therapy and / or diagnosis are those in which there is selective expression or abnormal expression of one or more of the tumor-associated antigens identified according to the invention.
Die ektope Aktivierung von Genen in Tumoren kann auch zurückführbar sein auf ein verändertes Genmethylierungsmuster ihrer Nukleotidsequenz. So ist z.B. beschrieben worden, dass Alterationen der Methylierung am Cytosin hierzu beitragen (De Smet et al, 1996 und 1999).The ectopic activation of genes in tumors can also be traced back to an altered gene methylation pattern of their nucleotide sequence. For example, that alterations of methylation on cytosine contribute to this (De Smet et al, 1996 and 1999).
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren und Genprodukte, die tumorzellassoziiert exprimiert werden und die durch verändertes Spleißen (Spleißvarianten) bekannter Gene bzw. durch veränderte Translation unter Nutzung alternativer offener Leserahmen entstehen. Diese Nukleinsäuren umfassen die Sequenzen gemäß (SEQ ID NO:2-5, 20, 21, 31-33, 54-57, 85-88) des Sequenzprotokolls. Ferner umfassen die Genprodukte Sequenzen gemäß (SEQ ID NO:7- 13, 23, 24, 34-36, 58-61, 89-100) des Sequenzprotokolls. Die erfindungsgemäßen Spleißvarianten sind erfϊndungsgemäß als Targets für die Diagnostik und Therapie von Tumorerkrankungen verwendbar.The invention also relates to nucleic acids and gene products which are expressed in association with tumor cells and which result from altered splicing (splice variants) of known genes or from altered translation using alternative open reading frames. These nucleic acids comprise the sequences according to (SEQ ID NO: 2-5, 20, 21, 31-33, 54-57, 85-88) of the sequence listing. Furthermore, the gene products include sequences according to (SEQ ID NO: 7-13, 23, 24, 34-36, 58-61, 89-100) of the sequence listing. The invention According to the invention, splice variants can be used as targets for the diagnosis and therapy of tumor diseases.
Für die Entstehung von Spleißvarianten können verschiedenste Mechanismen ursächlich sein, beispielsweise die Nutzung variabler Transkriptionsinitiationsstellen die Nutzung zusätzlicher Exons - vollständiges oder unvollständiges Aus Spleißen von einzelnen oder mehreren Exons, über Mutation veränderte Spleißregulatorsequenzen (Deletion bzw. Schaffung neuer Donor/Acceptorsequenzen), die unvollständige Elimination von Intronsequenzen.A wide variety of mechanisms can be responsible for the formation of splice variants, for example the use of variable transcription initiation sites, the use of additional exons - complete or incomplete splice of single or several exons, mutation-modified splice regulator sequences (deletion or creation of new donor / acceptor sequences), incomplete elimination of intron sequences.
Das veränderte Spleißen eines Gens führt zu einer veränderten Transkriptsequenz (Spleißvariante). Wird eine Spleißvariante im Bereich ihrer veränderten Sequenz translatiert, resultiert ein verändertes Protein, welches sich von dem ursprünglichen in Struktur und Funktion deutlich unterscheiden kann. Bei tumorassoziierten Spleißvarianten können tumorassoziierte Transkripte und tumorassoziierte Proteine/ Antigene entstehen. Diese können als molekulare Marker sowohl zum Nachweis von Tumorzellen als auch zum therapeutischen Targeting von Tumoren genutzt werden. Die Detektion von Tumorzellen z.B. im Blut, Serum, Knochenmark, Sputum, Bronchial-Lavage, Körpersekreten und Gewebsbiopsien kann erfmdungs gemäß z.B. nach Extraktion von Nukleinsäuren durch PCR-Amplifikation mit Spleißvariantenspezifischen Oligonukleotiden erfolgen. Zum Nachweis eignen sich erfindungsgemäß alle Sequenz-abhängigen Detektionssysteme. Neben der PCR sind diese z.B. Genchip-/Microarraysysteme, Northern-Blot, RNAse protection assays (RDA) und andere. Allen Detektionssystemen ist gemeinsam, dass die Detektion auf einer spezifischen Hybridisierung mit mindestens einer Spleißvarianten-spezifischen Nukleinsäuresequenz basiert. Die Detektion von Tumorzellen kann jedoch auch erfindungsgemäß durch Antikörper erfolgen, die ein durch die Spleißvariante kodiertes spezifisches Epitop erkennen. Für die Herstellung der Antikörper können Peptide zur Immunisierung verwendet werden, die für diese Spleißvariante spezifisch sind. Für die Immunisierung eignen sich besonders die Aminosäuren, die deutliche Epitopunterschiede zu der Variante(n) des Genprodukts aufweisen, welche(s) bevorzugt in gesunden Zellen gebildet wird. Der Nachweis der Tumorzellen mit Antikörper kann dabei an einer vom Patienten isolierten Probe oder als Imaging mit intravenös applizierten Antikörpern erfolgen. Neben der diagnostischen Nutzbarkeit stellen Spleißvarianten, die neue oder veränderte Epitope aufweisen, attraktive Targets für die Immuntherapie dar. Die erfindungsgemäßen Epitope können zum Targeting von therapeutisch wirksamen monoklonalen Antikörpern oder T-Lymphozyten genutzt werden. Bei der passiven Immuntherapie werden hierbei Antikörper oder T-Lymphozyten adoptiv transferriert, die Spleißvarianten-spezifische Epitope erkennen. Die Generierung von Antikörpern kann wie bei anderen Antigenen auch unter Nutzung von Standardtechnologien (Immunisierung von Tieren, Panningstrategien zur Isolation von rekombinanten Antikörpern) unter Nutzung von Polypeptiden, die diese Epitope beinhalten, erfolgen. Alternativ können zur Immunisierung Nukleinsäuren genutzt werden, die für Oligo- oder Polypeptide kodieren, die diese Epitope beinhalten. Verschiedene Techniken zur in vitro oder in vivo Generierung von epitopspezifischen T-Lymphozyten sind bekannt und ausführlich beschrieben z.B. (Kessler JH, et al. 2001, Sahin et al, 1997) und basieren ebenfalls auf der Nutzung von Oligo- oder Polypeptide, die die Spleißvarianten-spezifischen Epitope beinhalten oder Nukleinsäuren, die für diese kodieren. Oligo-oder Polypeptiden, die die Spleißvarianten- spezifischen Epitope beinhalten oder Nukleinsäuren, die für diese Polypeptide kodieren sind auch für die Nutzung als pharmazeutisch wirksame Substanzen bei der aktiven Immuntherapie (Vakzinierung, Vakzintherapie) verwendbar.The changed splicing of a gene leads to a changed transcript sequence (splicing variant). If a splice variant is translated in the area of its changed sequence, a modified protein results, which can differ significantly in structure and function from the original one. With tumor-associated splice variants, tumor-associated transcripts and tumor-associated proteins / antigens can arise. These can be used as molecular markers both for the detection of tumor cells and for the therapeutic targeting of tumors. The detection of tumor cells, for example in the blood, serum, bone marrow, sputum, bronchial lavage, body secretions and tissue biopsies, can be carried out in accordance with the invention, for example after extraction of nucleic acids by PCR amplification with splice variant-specific oligonucleotides. According to the invention, all sequence-dependent detection systems are suitable for detection. In addition to PCR, these are, for example, gene chip / microarray systems, Northern blot, RNAse protection assays (RDA) and others. All detection systems have in common that the detection is based on a specific hybridization with at least one splicing variant-specific nucleic acid sequence. According to the invention, however, tumor cells can also be detected by antibodies which recognize a specific epitope coded by the splice variant. Peptides for immunization that are specific for this splice variant can be used for the production of the antibodies. Particularly suitable for immunization are the amino acids which have clear epitope differences from the variant (s) of the gene product, which is (are) preferably formed in healthy cells. The detection of the tumor cells with antibodies can be carried out on a sample isolated from the patient or as imaging with intravenously applied antibodies. In addition to the diagnostic Usability are splice variants which have new or modified epitopes, attractive targets for immunotherapy. The epitopes according to the invention can be used to target therapeutically effective monoclonal antibodies or T-lymphocytes. In passive immunotherapy, antibodies or T-lymphocytes are adopted adoptively that recognize splicing variant-specific epitopes. As with other antigens, the generation of antibodies can also take place using standard technologies (immunization of animals, panning strategies for isolating recombinant antibodies) using polypeptides which contain these epitopes. Alternatively, nucleic acids which code for oligo- or polypeptides which contain these epitopes can be used for the immunization. Various techniques for the in vitro or in vivo generation of epitope-specific T-lymphocytes are known and described in detail, for example (Kessler JH, et al. 2001, Sahin et al, 1997) and are also based on the use of oligo- or polypeptides, which are the splice variants -specific epitopes or nucleic acids encoding them. Oligo or polypeptides which contain the splicing variant-specific epitopes or nucleic acids which code for these polypeptides can also be used for use as pharmaceutically active substances in active immunotherapy (vaccination, vaccine therapy).
In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Mittel, das das erfindungsgemäß identifizierte Tumor-assoziierte Antigen erkennt und vorzugsweise selektiv für Zellen ist, die eine Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens aufweisen. Das Mittel kann in bestimmten Ausführungsformen die Induktion des Zelltods, die Reduktion des Zellwachstums, die Schädigung der Zellmembran oder die Sekretion von Zytokinen bewirken und weist vorzugsweise eine tumorhemmende Aktivität auf. In einer Ausführungsform ist das Mittel eine Antisense-Nukleinsäure, die selektiv mit der Nukleinsäure hybridisiert, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert. In einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel ein Antikörper, der selektiv an das Tumor-assoziierte Antigen bindet, insbesondere ein komplementaktivierter Antikörper, der selektiv an das Tumor-assoziierte Antigen bindet. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Mittel mehrere Mittel, die jeweils selektiv verschiedene Tumor-assoziierte Antigene erkennen, wobei mindestens eines der Tumorassoziierten Antigene ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen ist. Die Erkennung muss nicht direkt mit einer Hemmung von Aktivität oder Expression des Antigens einhergehen. In diesem Aspekt der Erfindung dient das selektiv auf Tumoren beschränkte Antigen vorzugsweise als Markierung zur Rekrutierung von Effektormechanismen an diesen spezifischen Ort. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel ein cytotoxischer T- Lymphozyt, der das Antigen auf einem HLA-Molekül erkennt und die derartig markierte Zelle lysiert. In einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel ein Antikörper, der selektiv an das Tumor-assoziierte Antigen bindet und somit natürliche oder artifizielle Effektormechanismen zu dieser Zelle rekrutiert. In einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel ein T-Helfer-Lymphozyt, der Effektorfunktionen von anderen Zellen, die spezifisch dieses Antigen erkennen, stärkt.In one aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an agent which recognizes the tumor-associated antigen identified according to the invention and is preferably selective for cells which have expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention. In certain embodiments, the agent can induce cell death, reduce cell growth, damage the cell membrane or secrete cytokines and preferably has a tumor-inhibiting activity. In one embodiment, the agent is an antisense nucleic acid that selectively hybridizes to the nucleic acid encoding the tumor associated antigen. In a further embodiment, the agent is an antibody which selectively binds to the tumor-associated antigen, in particular a complement-activated antibody which selectively binds to the tumor-associated antigen. In a further embodiment, the agent comprises several agents, each of which selectively recognizes different tumor-associated antigens, at least one of the tumor-associated antigens being a tumor-associated antigen identified according to the invention. The detection does not have to be directly associated with an inhibition of activity or expression of the antigen. In this aspect of the invention, this is selectively limited to tumors Antigen preferably as a marker for recruiting effector mechanisms at this specific location. In a preferred embodiment, the agent is a cytotoxic T lymphocyte which recognizes the antigen on an HLA molecule and lyses the cell labeled in this way. In a further embodiment, the agent is an antibody which selectively binds to the tumor-associated antigen and thus recruits natural or artificial effector mechanisms for this cell. In another embodiment, the agent is a T helper lymphocyte that enhances effector functions of other cells that specifically recognize this antigen.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Mittel, das die Expression oder Aktivität eines erfindungsgemäß identifizierten Tumorassoziierten Antigens hemmt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel eine Antisense-Nukleinsäure, die selektiv mit der Nukleinsäure hybridisiert, die für das Tumorassoziierte Antigen kodiert. In einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel ein Antikörper, der selektiv an das Tumor-assoziierte Antigen bindet. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Mittel mehrere Mittel, die jeweils selektiv die Expression oder Aktivität verschiedener Tumor-assoziierter Antigene hemmen, wobei mindestens eines der Tumorassoziierten Antigene ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen ist.In one aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition comprising an agent which inhibits the expression or activity of a tumor-associated antigen identified according to the invention. In a preferred embodiment, the agent is an antisense nucleic acid that selectively hybridizes with the nucleic acid that codes for the tumor-associated antigen. In another embodiment, the agent is an antibody that selectively binds to the tumor-associated antigen. In a further embodiment, the agent comprises several agents, each of which selectively inhibit the expression or activity of different tumor-associated antigens, at least one of the tumor-associated antigens being a tumor-associated antigen identified according to the invention.
Die Aktivität eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens kann eine jegliche Aktivität eines Proteins oder Peptids sein. In einer Ausfuhrungsform ist die Aktivität eines enzymatische Aktivität wie die Laktatdehydrogenaseaktivität im Fall von Sequenzen, die LDHC betreffen (vgl. Beispiel 1). In einer weiteren Ausführungsform betrifft diese Aktivität eine Beteiligung bei einer zellulären Migration und/oder Metastatisierung wie im Fall der TPTE betreffenden Sequenzen (vgl. Beispiel 2). Somit können die erfindungsgemäßen Therapie- und Diagnosverfahren auch auf Hemmung oder Reduktion dieser Aktivität oder auf ein Testen dieser Aktivität abzielen.The activity of a tumor-associated antigen identified according to the invention can be any activity of a protein or peptide. In one embodiment, the activity of an enzymatic activity is like the lactate dehydrogenase activity in the case of sequences which relate to LDHC (cf. Example 1). In a further embodiment, this activity relates to involvement in cellular migration and / or metastatization as in the case of the sequences relating to TPTE (cf. Example 2). The therapy and diagnostic methods according to the invention can thus also aim to inhibit or reduce this activity or to test this activity.
Des weiteren betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Mittel umfasst, das bei einer Verabreichung selektiv die Menge an Komplexen zwischen einem HLA-Molekül und einem Peptidepitop aus dem erfindungsgemäß identifizierten Tumorassoziierten Antigen erhöht. Das Mittel umfasst in einer Ausführungsform einen oder mehrere Bestandteile, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus (i) dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon, (ii) einer Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon kodiert, (iii) einer Wirtszelle, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimiert, und (iv) isolierten Komplexen zwischen Peptidepitopen aus dem Tumor-assoziierten Antigen und einem MHC-Molekül. In einer Ausführungsform umfasst das Mittel mehrere Mittel, die jeweils selektiv die Menge an Komplexen zwischen MHC- Molekülen und Peptidepitopen verschiedener Tumor-assoziierter Antigene erhöhen, wobei mindestens eines der Tumor-assoziierten Antigene ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen ist.The invention further relates to a pharmaceutical composition which comprises an agent which, when administered, selectively increases the amount of complexes between an HLA molecule and a peptide epitope from the tumor-associated antigen identified according to the invention. In one embodiment, the agent comprises one or more components selected from the group consisting of (i) the tumor-associated antigen or a part thereof, (ii) a nucleic acid which is responsible for the tumor-associated antigen or encodes a portion thereof, (iii) a host cell expressing the tumor associated antigen or a portion thereof, and (iv) isolated complexes between peptide epitopes from the tumor associated antigen and an MHC molecule. In one embodiment, the agent comprises several agents, each of which selectively increases the amount of complexes between MHC molecules and peptide epitopes of different tumor-associated antigens, at least one of the tumor-associated antigens being a tumor-associated antigen identified according to the invention.
Des weiteren betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen oder mehrer Bestandteile umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus (i) einem erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon, (ii) einer Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon kodiert, (iii) einem Antikörper, der an ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon bindet, (iv) einer Antisense-Nukleinsäure, die spezifisch mit einer Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumorassoziiertes Antigen kodiert, hybridisiert, (v) einer Wirtszelle, die ein erfmdungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon exprimiert, und (vi) isolierten Komplexen zwischen einem erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem HLA-Molekül.The invention further relates to a pharmaceutical composition which comprises one or more constituents which are selected from the group consisting of (i) a tumor-associated antigen identified according to the invention or a part thereof, (ii) a nucleic acid which is suitable for an according to the invention encoded identified tumor-associated antigen or a part thereof, (iii) an antibody which binds to a tumor-associated antigen or a part thereof identified according to the invention, (iv) an antisense nucleic acid which is specific with a nucleic acid which is suitable for an according to the invention encoded, hybridized, identified, tumor-associated antigen, (v) a host cell which expresses a tumor-associated antigen or a part thereof identified according to the invention, and (vi) isolated complexes between a tumor-associated antigen or a part thereof and a HLA molecule ,
Eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon kodiert, kann in der pharmazeutische Zusammensetzung in einem Expressionsvektor vorliegen und funktioneil mit einem Promotor verbunden sein.A nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen identified according to the invention or a part thereof can be present in the pharmaceutical composition in an expression vector and can be functionally linked to a promoter.
Eine in einer erfmdungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Wirtszelle kann das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon sekretieren, auf der Oberfläche exprimieren oder kann zusätzlich ein HLA-Molekül exprimieren, das an das Tumorassoziierte Antigen oder den Teil davon bindet. In einer Ausfuhrungsform exprimiert die Wirtszelle das HLA-Molekül endogen. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die Wirtszelle das HLA-Molekül und/oder das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon rekombinant. Vorzugsweise ist die Wirtszelle nicht-proliferativ. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage. Ein in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltener Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein. In weiteren Ausführungsformen ist der Antikörper ein chimärer oder humanisierter Antikörper, ein Fragment eines natürlichen Antikörpers, oder ein synthetischer Antikörper, die durch kombinatorische Techniken hergestellt werden können. Der Antikörper kann mit einem therapeutisch oder diagnostisch nützlichen Mittel gekoppelt sein.A host cell contained in a pharmaceutical composition according to the invention can secrete the tumor-associated antigen or the part thereof, or can express it on the surface or can additionally express an HLA molecule which binds to the tumor-associated antigen or the part thereof. In one embodiment, the host cell expresses the HLA molecule endogenously. In a further embodiment, the host cell expresses the HLA molecule and / or the tumor-associated antigen or part thereof recombinantly. Preferably the host cell is non-proliferative. In a preferred embodiment, the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, a monocyte or a macrophage. An antibody contained in a pharmaceutical composition according to the invention can be a monoclonal antibody. In further embodiments, the antibody is a chimeric or humanized antibody, a fragment of a natural antibody, or a synthetic antibody that can be produced by combinatorial techniques. The antibody can be coupled to a therapeutically or diagnostically useful agent.
Eine in einer erfmdungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Antisense- Nukleinsäure kann eine Sequenz von 6-50, insbesondere 10-30, 15-30 und 20-30 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für das erfindungsgemäß identifizierte Tumor-assoziierte Antigen kodiert, umfassen.An antisense nucleic acid contained in a pharmaceutical composition according to the invention can comprise a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 and 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen identified according to the invention.
In weiteren Ausfuhrungsformen bindet ein durch eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung entweder direkt oder durch die Expression einer Nukleinsäure bereitgestelltes Tumor-assoziiertes Antigen oder ein Teil davon an MHC-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen, wobei die Bindung vorzugsweise eine cytolytische Reaktion hervorruft und/oder eine Cytokinausschüttung induziert.In further embodiments, a tumor-associated antigen or a part thereof provided by a pharmaceutical composition according to the invention binds either directly or by expression of a nucleic acid to MHC molecules on the surface of cells, the binding preferably causing a cytolytic reaction and / or a cytokine release induced.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein Adjuvans umfassen. Das Adjuvans kann aus Saponin, GM- CSF, CpG-Nukleotiden, RNA, einem Zytokin oder einem Chemokin ausgewählt sein. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise zur Behandlung einer Erkrankung eingesetzt, die sich durch die selektive Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erkrankung Krebs.A pharmaceutical composition according to the invention can comprise a pharmaceutically acceptable carrier and / or an adjuvant. The adjuvant can be selected from saponin, GM-CSF, CpG nucleotides, RNA, a cytokine or a chemokine. A pharmaceutical composition according to the invention is preferably used for the treatment of a disease which is characterized by the selective expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen. In a preferred embodiment, the disease is cancer.
Des weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung oder Diagnose einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines oder mehrerer Tumor-assoziierter Antigene auszeichnet. In einer Ausfülirungsform umfasst die Behandlung die Verabreichung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung.The invention further relates to methods for the treatment or diagnosis of a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of one or more tumor-associated antigens. In one embodiment, the treatment comprises the administration of a pharmaceutical composition according to the invention.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet. Das Verfahren umfasst den Nachweis (i) einer Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teils davon und/oder (ii) den Nachweis des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon, und/oder (iii) den Nachweis eines Antikörpers gegen das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon und/oder (iv) den Nachweis von cytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon spezifisch sind in einer aus einem Patienten isolierten biologischen Probe. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Nachweis (i) die Kontaktierung der biologischen Probe mit einem Mittel, das spezifisch an die Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder den Teil davon, an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon, an den Antikörper oder an cytotoxische oder Helfer-T-Lymphozyten, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder Teile davon spezifisch sind, bindet und (ii) den Nachweis der Komplexbildung zwischen dem Mittel und der Nukleinsäure oder dem Teil davon, dem Tumor-assoziierten Antigen oder dem Teil davon, dem Antikörper oder den cytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten. In einer Ausfuhrungsform zeichnet sich die Erkrankung durch die Expression oder abnormale Expression mehrerer verschiedener Tumor-assoziierter Antigene aus und der Nachweis umfasst einen Nachweis mehrerer Nukleinsäuren, die für die mehreren verschiedenen Tumorassoziierten Antigene kodieren, oder von Teilen davon, den Nachweis der mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder von Teilen davon, den Nachweis mehrerer Antikörper, die an die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder an Teile davon binden oder den Nachweis mehrerer cytotoxischer oder Helfer-T-Lymphozyten, die für die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene spezifisch sind. In einer weiteren Ausführungsform wird die isolierte biologische Probe aus dem Patienten mit einer vergleichbaren normalen biologischen Probe verglichen.In one aspect, the invention relates to a method for diagnosing a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention. The procedure includes the proof (i) of one Nucleic acid coding for the tumor-associated antigen or a part thereof and / or (ii) the detection of the tumor-associated antigen or a part thereof and / or (iii) the detection of an antibody against the tumor-associated antigen or a portion thereof and / or (iv) the detection of cytotoxic or helper T lymphocytes which are specific for the tumor-associated antigen or a portion thereof in a biological sample isolated from a patient. In certain embodiments, detection (i) comprises contacting the biological sample with an agent that specifically targets the nucleic acid encoding the tumor-associated antigen or the portion thereof, the tumor-associated antigen or the portion thereof binds the antibody or to cytotoxic or helper T lymphocytes specific for the tumor-associated antigen or portions thereof, and (ii) evidence of complex formation between the agent and the nucleic acid or portion thereof, the tumor-associated antigen or the part thereof, the antibody or the cytotoxic or helper T lymphocytes. In one embodiment, the disease is characterized by the expression or abnormal expression of several different tumor-associated antigens, and the detection includes a detection of several nucleic acids coding for the several different tumor-associated antigens, or parts thereof, the detection of the several different tumor associated antigens or parts thereof, the detection of several antibodies which bind to the several different tumor-associated antigens or parts thereof or the detection of several cytotoxic or helper T lymphocytes which are specific for the several different tumor-associated antigens. In a further embodiment, the isolated biological sample from the patient is compared with a comparable normal biological sample.
Die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren können auch eine Nutzung der erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigene als prognostische Marker betreffen, um eine Metastatisierung z.B. durch Testen des Migrationsverhalten von Zellen und daher einen verschlechterten Krankheitsverlauf zu prädizieren, wodurch unter anderem die Planung einer aggressiveren Therapie ermöglicht wird. Insebsondere sind die TPTE betreffenden Sequenzen (vgl. Beispiel 2) für diesen Zweck geeignet. Sie sind auch dafür geeignet, noch gutartige Veränderungen z.B. Hyperplasien von bereits ungünstig zu wertenden Tumor- Vorstufen abzugrenzen und somit eine Krebsneigung vorherzusehen noch bevor ein invasiver Tumor sich gebildet hat. In dieser Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, wobei das Verfahren eine Bewertung des Migrationsverhaltens von Zellen aus einem Patienten umfasst. In besonders bevorzugten Ausführungsformen dient das Verfahren einer Bestimmung des Ausmaßes oder einer Prädiktion einer Metastatisierung und/oder von Lymphknoten- und/oder Fernmetastasen, wobei ein erhöhtes Migrationsverhalten von Zellen in bestimmten Ausführungsformen darauf hinweist, dass der getestete Patient an der Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeiclmet, erkrankt ist, daran erkranken wird und/oder ein Potential für eine derartige Erkrankung aufweist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen weist ein erhöhtes Migrationsverhalten auf eine Metastatisierung und/oder Bildung von Lymphknoten- und/oder Fernmetastasen oder ein Potential dafür hin. In dieser Ausführungsform weist das erfindungsgemäß identifizierte Tumor-assoziierte Antigen vorzugsweise eine Sequenz auf, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, und 54-57, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist. Das Tumor-assoziierte Antigen umfaßt vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, und 103-105, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist.The diagnostic methods according to the invention can also relate to the use of the tumor-associated antigens identified according to the invention as prognostic markers in order to predict metastasis, for example by testing the migration behavior of cells and therefore a worsened course of the disease, which among other things enables the planning of a more aggressive therapy. In particular, the sequences relating to TPTE (cf. Example 2) are suitable for this purpose. They are also suitable for differentiating benign changes, such as hyperplasia, from tumor precursors that are already to be assessed as unfavorable, and thus to predict a tendency to cancer even before an invasive tumor has formed. In this embodiment, the invention relates to a method for diagnosing a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, the method comprising an evaluation of the migration behavior of cells from a patient. In particularly preferred embodiments, the method is used to determine the extent or prediction of metastasis and / or of lymph node and / or distant metastases, wherein an increased migration behavior of cells in certain embodiments indicates that the tested patient is suffering from the disease that is being caused the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention is indicated, is diseased, becomes ill and / or has a potential for such a disease. In particularly preferred embodiments, an increased migration behavior indicates a metastasis and / or formation of lymph node and / or distant metastases or a potential therefor. In this embodiment, the tumor-associated antigen identified according to the invention preferably has a sequence encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of: (a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence consisting of the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, and 54-57, a part or derivative thereof, is selected (b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a), (c) a nucleic acid which is related to the nucleic acid under (a) or (b) is degenerate and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c). The tumor associated antigen preferably comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, and 103-105, a portion or derivative thereof.
Erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung zielen in diesem Aspekt vorzugsweise auf dieIn this aspect, methods of treatment according to the invention are preferably aimed at
Verabreichung von pharmazeutischen Zusammensetzungen ab, die das Migrationsverhalten normalisieren, vorzugsweise hemmen.Administration of pharmaceutical compositions that normalize, preferably inhibit migration behavior.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, wobei das Verfahren eine Bestimmung des Methylierungsmusters und/oder des Grades an Methylierung innerhalb einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, insbesondere innerhalb der nicht-kodierenden Bereiche davon, bevorzugt innerhalb des Promotorbereiches davon umfaßt. Vorzugsweise weist das erfindungsgemäß identifizierte Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz auf, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, und 54-57, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist, und die Bestimmung erfolgt bezüglich dieser Nukleinsäure, vorzugsweise innerhalb des Promotorbereiches davon, und insbesondere innerhalb der in SEQ ID NO:822 gezeigten Sequenz, insbesondere innerhalb der Nukleotide von Position 121 bis 540 der in SEQ ID NO:822 gezeigten Sequenz (TPTE Promotorsequenz auf Chromosom 21; Position -36S/+952 bezogen auf den Transkriptionsstart). Das Tumor-assoziierte Antigen umfaßt vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, und 103-105, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist. Eine im Vergleich zu einer Kontrolle geringere Methylierung oder eine fehlende Methylierung weist vorzugsweise darauf hin, dass der getestete Patient an der Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, erkrankt ist, daran erkranken wird und/oder ein erhöhtes Potential für eine derartige Erkrankung aufweist.In a further embodiment, the invention relates to a method for diagnosing a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, the method determining the methylation pattern and / or the degree of methylation within a nucleic acid which comprises a nucleic acid sequence which codes for the tumor-associated antigen, in particular within the non-coding regions thereof, preferably within of the promoter region thereof. The tumor-associated antigen identified according to the invention preferably has a sequence which is encoded by a nucleic acid which is selected from the group consisting of: (a) a nucleic acid which comprises a nucleic acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 19-21, and 54-57, a part or derivative thereof, (b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a), (c) a nucleic acid which is related to the nucleic acid under (a) or (b) is degenerate and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c), and the determination is carried out with respect to this nucleic acid, preferably within the promoter region thereof, and in particular within the sequence shown in SEQ ID NO: 822, in particular within the nucleotides from positions 121 to 540 of the sequence shown in SEQ ID NO: 822 (TPTE promoter sequence on chromosome 21; position -36S / + 952 based on the start of transcription). The tumor associated antigen preferably comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, and 103-105, a portion or derivative thereof. A lower methylation or a lack of methylation compared to a control preferably indicates that the tested patient is ill with the disease, which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, and / or has an increased potential for such a disease.
Erfmdungsgemäße Verfahren zur Behandlung zielen in diesem Aspekt vorzugsweise auf die Verabreichung von pharmazeutischen Zusammensetzungen ab, die das Methylierungsmuster und/oder den Grad der Methylierung normalisieren, vorzugsweise erhöhen.In this aspect, methods of treatment according to the invention are preferably aimed at the administration of pharmaceutical compositions which normalize, preferably increase, the methylation pattern and / or the degree of methylation.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Regression, des Verlaufs oder des Ausbruchs einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend die Überwachung einer Probe aus einem Patienten, der die Erkrankung aufweist oder in Verdacht steht, an der Erkrankung zu erkranken in Bezug auf einen oder mehrere Parameter, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus (i) der Menge der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teil davon, (ii) der Menge des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon, (iii) der Menge an Antikörpern, die an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon binden, und (iv) der Menge an cytolytischen T-Zellen oder Helfer-T-Zellen, die für einen Komplex zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem MHC-Molekül spezifisch sind. Vorzugsweise umfasst das Verfahren die Bestimmung des oder der Parameter zu einem ersten Zeitpunkt in einer ersten Probe und zu einem zweiten Zeitpunkt in einer weiteren Probe, wobei durch einen Vergleich der beiden Proben der Verlauf der Erkrankung ermittelt wird. In bestimmten Ausführungsformen zeichnet sich die Erkrankung durch die Expression oder abnormale Expression mehrerer verschiedener Tumor-assoziierter Antigene aus und die Überwachung umfasst eine Überwachung (i) der Menge mehrerer Nukleinsäuren, die für die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene kodieren, oder von Teilen davon und/oder (ii) der Menge der mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder von Teilen davon und/oder (iii) der Menge mehrerer Antikörper, die an die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder an Teile davon binden, und/oder (iv) der Menge mehrerer cytolytischer T-Zellen oder Helfer-T-Zellen, die für Komplexe zwischen den mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigenen oder von Teilen davon und MHC- Molekülen spezifisch sind.In a further aspect, the invention relates to a method for determining the regression, the course or the outbreak of a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising the monitoring of a sample from a patient who the Disease or is suspected of developing the disease with respect to one or more parameters selected from the group consisting of (i) the amount of nucleic acid encoding the tumor associated antigen or a portion thereof , (ii) the amount of the tumor-associated antigen or a part thereof, (iii) the amount of antibodies which bind to the tumor-associated antigen or a part thereof, and (iv) the amount of cytolytic T-cells or helper T-cells specific for a complex between the tumor-associated antigen or a part thereof and an MHC molecule. The method preferably comprises determining the parameter or parameters at a first point in time in a first sample and at a second point in time in a further sample, the course of the disease being determined by comparing the two samples. In certain embodiments, the disease is characterized by the expression or abnormal expression of several different tumor-associated antigens, and the monitoring comprises monitoring (i) the amount of several nucleic acids coding for the several different tumor-associated antigens, or parts thereof and / or (ii) the amount of the several different tumor-associated antigens or parts thereof and / or (iii) the amount of several antibodies which bind to the several different tumor-associated antigens or parts thereof, and / or (iv) the amount of multiple cytolytic T cells or helper T cells that are specific for complexes between the multiple different tumor-associated antigens or parts thereof and MHC molecules.
Ein Nachweis einer Nukleinsäure oder eines Teils davon oder eine Überwachung der Menge einer Nukleinsäure oder eines Teils davon kann erfindungsgemäß mit einer Polynukleotid- Sonde erfolgen, die spezifisch mit der Nukleinsäure oder dem Teil davon hybridisiert oder kann durch selektive Amplifikation der Nukleinsäure oder des Teils davon erfolgen. In einer Ausführungsform umfasst die Polynukleotid-Sonde eine Sequenz von 6-50, insbesondere 10- 30, 15-30 und 20-30 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure.Detection of a nucleic acid or a part thereof or monitoring the amount of a nucleic acid or part thereof can be carried out according to the invention with a polynucleotide probe which hybridizes specifically with the nucleic acid or part thereof or can be carried out by selective amplification of the nucleic acid or part thereof , In one embodiment, the polynucleotide probe comprises a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 and 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid.
In bestimmten Ausführungsformen liegt das nachzuweisende Tumor-assoziierte Antigen oder der Teil davon intrazellulär oder auf der Zelloberfläche vor. Ein Nachweis eines Tumorassoziierten Antigens oder eines Teils davon oder eine Überwachung der Menge eines Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon kann erfmdungsgemäß mit einem Antikörper erfolgen, der spezifisch an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon bindet.In certain embodiments, the tumor-associated antigen to be detected or the part thereof is present intracellularly or on the cell surface. Detection of a tumor-associated antigen or a part thereof or monitoring the amount of a tumor-associated antigen or part thereof can be carried out according to the invention with an antibody which specifically binds to the tumor-associated antigen or part thereof.
In weiteren Ausführungsformen liegt das nachzuweisende Tumor-assoziierte Antigen oder der Teil davon in einem Komplex mit einem MHC-Molekül, insbesondere einem HLA- Molekül vor. Ein Nachweis eines Antikörpers oder die Überwachung der Menge an Antikörpern kann erfindungsgemäß mit einem Protein oder Peptid erfolgen, das spezifisch an den Antikörper bindet.In further embodiments, the tumor-associated antigen to be detected or the part thereof is present in a complex with an MHC molecule, in particular an HLA molecule. Detection of an antibody or monitoring the amount of antibodies can be carried out according to the invention with a protein or peptide that binds specifically to the antibody.
Ein Nachweis von cytolytischen T-Zellen oder Helfer-T-Zellen oder die Überwachung der Menge an cytolytischen T-Zellen oder Helfer-T-Zellen, die für Komplexe zwischen einem Antigen oder einem Teil davon und MHC-Molekülen spezifisch sind, kann erfindungsgemäß mit einer Zelle erfolgen, die den Komplex zwischen dem Antigen oder dem Teil davon und einem MHC-Molekül präsentiert.Detection of cytolytic T cells or helper T cells or monitoring the amount of cytolytic T cells or helper T cells which are specific for complexes between an antigen or a part thereof and MHC molecules can be carried out according to the invention a cell that presents the complex between the antigen or part thereof and an MHC molecule.
Die für einen Nachweis oder für eine Überwachung verwendete Polynukleotid-Sonde, der Antikörper, das Protein oder Peptid oder die Zelle sind vorzugsweise nachweisbar markiert. In bestimmten Ausführungsformen ist der nachweisbare Marker ein radioaktiver Marker oder ein Enzymmarker. Der Nachweis von T-Lymphozyten kann zusätzlich erfolgen durch Nachweis ihrer Proliferation, ihrer Zytokinproduktion, sowie ihret cytotoxischen Aktivität, die ausgelöst wird durch die spezifische Stimulation mit dem Komplex aus MHC und tumorassoziiertem Antigen oder Teilen davon. Der Nachweis von T-Lymphozyten kann ferner erfolgen durch ein rekombinantes MHC-Molekül oder auch ein Komplex aus mehreren MHC-Molekülen, die beladen sind mit dem jeweiligen immunogenen Fragment aus einem oder mehreren der tumorassoziierten Antigene und durch Kontaktierung des spezifischen T-The polynucleotide probe used for detection or monitoring, the antibody, the protein or peptide or the cell are preferably marked in a detectable manner. In certain embodiments, the detectable label is a radioactive label or an enzyme label. T-lymphocytes can also be detected by detecting their proliferation, their cytokine production and their cytotoxic activity, which is triggered by the specific stimulation with the complex of MHC and tumor-associated antigen or parts thereof. T lymphocytes can also be detected by a recombinant MHC molecule or also a complex of several MHC molecules which are loaded with the respective immunogenic fragment from one or more of the tumor-associated antigens and by contacting the specific T
Zell-Rezeptors die spezifischen T-Lymphozyten identifizieren können.Cell receptor can identify the specific T lymphocytes.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung, Diagnose oder Überwachung einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend die Verabreichung eines Antikörpers, der an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon bindet und mit einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel gekoppelt ist. Der Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein. In weiteren Ausführungsformen ist der Antikörper ein chimärer oder humanisierter Antikörper oder ein Fragment eines natürlichen Antikörpers.In a further aspect, the invention relates to a method for the treatment, diagnosis or monitoring of a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising the administration of an antibody to the tumor-associated antigen or a Part of it binds and is coupled with a therapeutic or diagnostic agent. The antibody can be a monoclonal antibody. In further embodiments, the antibody is a chimeric or humanized antibody or a fragment of a natural antibody.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfmdungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend (i) die Entfernung einer Probe mit immunreaktiver Zellen aus dem Patienten, (ii) die Kontaktierung der Probe mit einer Wirtszelle, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimiert, unter Bedingungen, die eine Produktion cytolytischer T-Zellen gegen das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon begünstigen, und (iii) das Einbringen der cytolytischen T- Zellen in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, Zellen zu lysieren, die das Tumorassoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimieren. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Klonierung des T-Zell-Rezeptors von cytolytischen T-Zellen gegen das Tumor-assoziierte Antigen. Dieser kann in andere T-Zellen transferiert werden, die damit die erwünschte Spezifität erhalten und wie unter (iii) in den Patienten eingebracht werden können.The invention also relates to a method for treating a patient with a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising (i) the removal of a Sample with immunoreactive cells from the patient, (ii) contacting the sample with a host cell that expresses the tumor-associated antigen or part thereof, under conditions that produce cytolytic T cells against the tumor-associated antigen or part of this favor, and (iii) introducing the cytolytic T cells into the patient in an amount suitable for lysing cells expressing the tumor associated antigen or a portion thereof. The invention also relates to the cloning of the T cell receptor of cytolytic T cells against the tumor-associated antigen. This can be transferred to other T cells, which thus obtain the desired specificity and can be introduced into the patient as in (iii).
In einer Ausführungsform exprimiert die Wirtszelle ein HLA-Molekül endogen. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die Wirtszelle ein HLA-Molekül und/oder das Tumorassoziierte Antigen oder den Teil davon rekombinant. Vorzugsweise ist die Wirtszelle nicht- proliferativ. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Antigen- präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage.In one embodiment, the host cell endogenously expresses an HLA molecule. In a further embodiment, the host cell expresses an HLA molecule and / or the tumor-associated antigen or the part thereof recombinantly. The host cell is preferably non-proliferative. In a preferred embodiment, the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, a monocyte or a macrophage.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor- assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend (i) die Identifizierung einer für ein erfmdungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen kodierenden Nukleinsäure, die von Zellen exprimiert wird, die mit der Erkrankung assoziiert sind, (ii) die Transfektion einer Wirtszelle mit der Nukleinsäure oder einem Teil davon, (iii) die Kultivierung der transfizierten Wirtszelle für eine Expression der Nukleinsäure (dies ist bei Erreichen einer hohen Transfektionsrate nicht obligat), und (iv) das Einbringen der Wirtszellen oder eines Extrakts davon in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, die Immunreaktion gegen die Zellen des Patienten, die mit der Erkrankung assoziiert sind, zu erhöhen. Das Verfahren kann ferner die Identifizierung eines MHC-Moleküls, das das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentiert, umfassen, wobei die Wirtszelle das identifizierte MHC- Molekül exprimiert und das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentiert. Die Immunreaktion kann eine B-Zellen-Reaktion oder eine T-Zellen-Reaktion umfassen. Des weiteren kann eine T-Zellen-Reaktion die Produktion von cytolytischen T-Zellen und/oder Helfer-T-Zellen umfassen, die spezifisch für die Wirtszellen sind, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentieren oder spezifisch für Zellen des Patienten sind, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimieren.In a further aspect, the invention relates to a method for treating a patient with a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen, comprising (i) the identification of a nucleic acid coding for a tumor-associated antigen identified according to the invention, which is expressed by cells associated with the disease, (ii) the transfection of a host cell with the nucleic acid or a part thereof, (iii) the cultivation of the transfected host cell for expression of the nucleic acid (this is not the case when a high transfection rate is reached obligate), and (iv) introducing the host cells or an extract thereof into the patient in an amount suitable to increase the immune response against the patient's cells associated with the disease. The method may further include identifying an MHC molecule that presents the tumor-associated antigen or a portion thereof, the host cell expressing the identified MHC molecule and presenting the tumor-associated antigen or a portion thereof. The immune response can include a B cell response or a T cell response. Furthermore, a T cell response may include the production of cytolytic T cells and / or helper T cells that are specific for the host cells that the tumor associated Present antigen or part of it or are specific to the patient's cells expressing the tumor associated antigen or part thereof.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumorassoziierten Antigens auszeichnet, umfassend (i) die Identifikation von Zellen aus dem Patienten, die abnormale Mengen des Tumor-assoziierten Antigens exprimieren, (ii) die Isolierung einer Probe der Zellen, (iii) die Kultivierung der Zellen und (iv) das Einbringen der Zellen in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, eine Immunreaktion gegen die Zellen auszulösen.The invention also relates to a method for the treatment of a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising (i) the identification of cells from the patient which express abnormal amounts of the tumor-associated antigen, (ii ) isolating a sample of the cells, (iii) culturing the cells and (iv) introducing the cells into the patient in an amount suitable to elicit an immune response against the cells.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäß verwendeten Wirtszellen nicht-proliferativ oder werden nicht-proliferativ gemacht. Eine Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, ist insbesondere Krebs.The host cells used according to the invention are preferably non-proliferative or are made non-proliferative. A disease that is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen is cancer in particular.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 2-5, 20-21, 31-33, 39, 54-57, 62, 63, 85-88 einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist. Des weiteren betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure die für ein Protein oder Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 7-13, 14-18, 23-24, 34-36, 58-61, 64, 65, 89-100, 101-107 einem Teil oder Derivat davon.The present invention further relates to a nucleic acid selected from the group consisting of (a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence consisting of the group consisting of SEQ ID NOs: 2-5, 20-21, 31-33 , 39, 54-57, 62, 63, 85-88 a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid which hybridizes with the nucleic acid under (a) under stringent conditions, (c) a nucleic acid which is related is degenerate to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c). The invention further relates to a nucleic acid which codes for a protein or polypeptide which comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7-13, 14-18, 23-24, 34-36, 58-61, 64, 65, 89-100, 101-107 a part or derivative thereof.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Promotorsequenzen von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Diese können funktionell mit einem anderen Gen vorzugsweise in einem Expressionsvektor verbunden werden, und somit die selektive Expression dieses Gens in entsprechenden Zellen gewährleisten.In a further aspect, the invention relates to promoter sequences of nucleic acids according to the invention. These can be functionally linked to another gene, preferably in an expression vector, and thus ensure the selective expression of this gene in corresponding cells.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, insbesondere DNA- oder RNA-Molekül, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst. Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst, enthalten.In a further aspect, the invention relates to a recombinant nucleic acid molecule, in particular a DNA or RNA molecule, which comprises a nucleic acid according to the invention. The invention also relates to host cells which contain a nucleic acid according to the invention or a recombinant nucleic acid molecule which comprises a nucleic acid according to the invention.
Die Wirtszelle kann ferner eine Nukleinsäure umfassen, die für ein HLA-Molekül kodiert. In einer Ausfuhrungsform exprimiert die Wirtszelle das HLA-Molekül endogen. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die Wirtszelle das HLA-Molekül und/oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen Teil davon rekombinant. Vorzugsweise ist die Wirtszelle nicht-proliferativ. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage.The host cell may further comprise a nucleic acid encoding an HLA molecule. In one embodiment, the host cell expresses the HLA molecule endogenously. In a further embodiment, the host cell expresses the HLA molecule and / or the nucleic acid according to the invention or a part thereof recombinantly. Preferably the host cell is non-proliferative. In a preferred embodiment, the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, a monocyte or a macrophage.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Oligonukleotide, die mit einer erfindungsgemäß identifizierten Nukleinsäure hybridisieren und als genetische Sonden oder als "Antisense"-Moleküle verwendet werden können. Nukleinsäuremoleküle in der Form von Oligonukleotid-Primern oder kompetenten Proben, die mit einer erfindungsgemäß identifizierten Nukleinsäure oder Teilen davon hybridisieren, können zum Auffinden von Nukleinsäuren verwendet werden, die zu der erfindungsgemäß identifizierten Nukleinsäure homolog sind. PCR-Amplifikation, Southern- und Northern-Hybridisierung können zum Auffinden homologer Nukleinsäuren eingesetzt werden. Die Hybridisierung kann unter niedrig-, besser unter mittel- und am besten unter hoch-stringenten Bedingungen erfolgen. Der Begriff „stringente Bedingungen" betrifft erfindungsgemäß Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung zwischen Polynukleotiden erlauben.In a further embodiment, the invention relates to oligonucleotides that hybridize with a nucleic acid identified according to the invention and can be used as genetic probes or as "antisense" molecules. Nucleic acid molecules in the form of oligonucleotide primers or competent samples which hybridize with a nucleic acid or parts thereof identified according to the invention can be used to find nucleic acids which are homologous to the nucleic acid identified according to the invention. PCR amplification, Southern and Northern hybridization can be used to find homologous nucleic acids. The hybridization can take place under low, better under medium and best under high-stringent conditions. According to the invention, the term “stringent conditions” relates to conditions which allow specific hybridization between polynucleotides.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Protein oder Polypeptid, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 2-5, 20-21, 31-33, 39, 54-57, 62, 63, 85-88 einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Protein oder Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 7-13, 14-18, 23-24, 34-36, 58-61, 64, 65, 89-100, 101- 107 einem Teil oder Derivat davon.In a further aspect, the invention relates to a protein or polypeptide that is encoded by a nucleic acid that is selected from the group consisting of (a) a nucleic acid that comprises a nucleic acid sequence that consists of the group consisting of SEQ ID NOs: 2 -5, 20-21, 31-33, 39, 54-57, 62, 63, 85-88 a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a) , (c) a nucleic acid that is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid that is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c). In a preferred embodiment, the invention relates to a protein or polypeptide which comprises an amino acid sequence selected from the Group consisting of SEQ ID NOs: 7-13, 14-18, 23-24, 34-36, 58-61, 64, 65, 89-100, 101-107 a part or derivative thereof.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein immunogenes Fragment eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens. Das Fragment bindet vorzugsweise an einen menschlichen HLA-Rezeptor oder menschlichen Antikörper. Vorzugsweise umfasst ein erfmdungsgemäßes Fragment eine Sequenz von mindestens 6, insbesondere mindestens 8, mindestens 10, mindestens 12, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 30 oder mindestens 50 Aminosäuren.In a further aspect, the invention relates to an immunogenic fragment of a tumor-associated antigen identified according to the invention. The fragment preferably binds to a human HLA receptor or human antibody. A fragment according to the invention preferably comprises a sequence of at least 6, in particular at least 8, at least 10, at least 12, at least 15, at least 20, at least 30 or at least 50, amino acids.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Mittel, das an ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder an einen Teil davon bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel ein Antikörper. In weiteren Ausführungsformen ist der Antikörper ein chimärer, ein humanisierter oder mit kombinatorischen Techniken hergestellte Antikörper oder ein Fragment eines Antiköφers. Des weiteren betrifft die Erfindung einen Antikörper, der selektiv an einen Komplex aus (i) einem erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und (ii) einem MHC- Molekül bindet, an das das erfmdungsgemäß identifizierte Tumor-assoziierte Antigen oder der Teil davon bindet, wobei der Antiköper nicht alleine an (i) oder (ii) bindet. Ein erfindungsgemäßer Antiköφer kann ein monoklonaler Antiköφer sein. In weiteren Ausführungsformen ist der Antiköφer ein chimärer oder humanisierter Antiköφer oder ein Fragment eines natürlichen Antiköφers.In a further aspect, the invention relates to an agent that binds to a tumor-associated antigen identified according to the invention or to a part thereof. In a preferred embodiment, the agent is an antibody. In further embodiments, the antibody is a chimeric, a humanized or combinatorial-made antibody or a fragment of an antibody. The invention further relates to an antibody which binds selectively to a complex of (i) a tumor-associated antigen identified according to the invention or a part thereof and (ii) an MHC molecule to which the tumor-associated antigen or part identified according to the invention binds thereof, the antibody not binding to (i) or (ii) alone. An antibody according to the invention can be a monoclonal antibody. In further embodiments, the antibody is a chimeric or humanized antibody or a fragment of a natural antibody.
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Konjugat zwischen einem erfindungsgemäßen Mittel, das an ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen oder an einen Teil davon bindet, oder einem erfmdungsgemäßen Antiköφer und einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel. In einer Ausführungsform ist das therapeutische oder diagnostische Mittel ein Toxin.Furthermore, the invention relates to a conjugate between an agent according to the invention which binds to a tumor-associated antigen identified according to the invention or to a part thereof, or an antibody according to the invention and a therapeutic or diagnostic agent. In one embodiment, the therapeutic or diagnostic agent is a toxin.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit zum Nachweis der Expression oder abnormalen Expression eines erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigens, umfassend Mittel zum Nachweis (i) der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teils davon, (ii) des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon, (iii) von Antiköφern, die an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon binden, und/oder (iv) von T-Zellen, die für einen Komplex zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem MHC-Molekül spezifisch sind. In einer Ausführungsform sind die Mittel zum Nachweis der Nukleinsäure oder des Teils davon Nukleinsäuremoleküle für die selektive Amplifikation der Nukleinsäure, die insbesondere eine Sequenz von 6-50, insbesondere 10-30, 15-30 und 20-30 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure umfassen.In a further aspect, the invention relates to a kit for detecting the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen identified according to the invention, comprising means for detecting (i) the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen, or a part thereof, (ii ) the tumor-associated antigen or a part thereof, (iii) antibodies which bind to the tumor-associated antigen or a part thereof, and / or (iv) T cells specific for a complex between the tumor-associated antigen or a part thereof and an MHC molecule. In one embodiment, the means for detecting the nucleic acid or part thereof are nucleic acid molecules for the selective amplification of the nucleic acid, which in particular comprise a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 and 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid.
Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention
Erfmdungsgemäß werden Gene beschrieben, die in Tumorzellen selektiv exprimiert oder aberrant exprimiert werden und Tumor-assoziierte Antigene darstellen.According to the invention, genes are described which are selectively expressed or aberrantly expressed in tumor cells and which represent tumor-associated antigens.
Erfindungsgemäß sind diese Gene oder ihre Derivate bevorzugte Zielstrukturen für therapeutische Ansätze. Konzeptionell können die therapeutischen Ansätze auf eine Hemmung der Aktivität des selektiv exprimierten tumor-assoziierten Genproduktes zielen. Dies ist dann sinnvoll, wenn die aberrante respektive selektive Expression funktionell von tumoφathogenetischer Bedeutung ist und ihre Unterbindung mit einer selektiven Schädigung der entsprechenden Zellen einhergeht. Andere therapeutische Konzepte betrachten tumorassoziierte Antigene als Markierungen, die Effektormechanismen mit zeilschädigendem Potential selektiv zu Tumorzellen rekrutieren. Hierbei ist die Funktion des Zielmoleküls selbst und seine Rolle bei der Tumorentstehung vollkommen unerheblich.According to the invention, these genes or their derivatives are preferred target structures for therapeutic approaches. Conceptually, the therapeutic approaches can aim to inhibit the activity of the selectively expressed tumor-associated gene product. This makes sense if the aberrant or selective expression is functionally of tumor-physiological importance and its suppression is accompanied by selective damage to the corresponding cells. Other therapeutic concepts consider tumor-associated antigens as markers that selectively recruit effector mechanisms with cell-damaging potential to tumor cells. The function of the target molecule itself and its role in tumor development are completely irrelevant.
Mit "Derivat" einer Nukleinsäure ist erfindungsgemäß gemeint, dass einzelne oder multiple Nukleotidsubstitution, -deletion und/oder -addition in der Nukleinsäure vorliegen. Weiterhin umfasst der Begriff „Derivat" auch eine chemische Derivatisierung einer Nukleinsäure an einer Nukleotidbase, am Zucker oder am Phosphat. Der Begriff „Derivat" umfasst auch Nukleinsäuren, die nicht in der Natur vorkommende Nukleotide und Nukleotidanaloga enthalten.According to the invention, “derivative” of a nucleic acid means that single or multiple nucleotide substitution, deletion and / or addition are present in the nucleic acid. Furthermore, the term “derivative” also includes chemical derivatization of a nucleic acid on a nucleotide base, on sugar or on phosphate. The term “derivative” also includes nucleic acids that contain nucleotides and nucleotide analogues that do not occur in nature.
Eine Nukleinsäure ist erfmdungsgemäß vorzugsweise Desoxyribonukleinsäure (DNA) oderAccording to the invention, a nucleic acid is preferably deoxyribonucleic acid (DNA) or
Ribonukleinsäure (RNA). Nukleinsäuren umfassen erfindungsgemäß genomische DNA, cDNA, mRNA, rekombinant hergestellte und chemisch synthetisierte Moleküle. Eine Nukleinsäure kann erfmdungsgemäß als einzelsträngiges oder doppelsträngiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen. Die erfindungsgemäß beschriebenen Nukleinsäuren sind vorzugsweise isoliert. Der Begriff "isolierte Nukleinsäure" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Nukleinsäure (i) in vitro amplifiziert wurde, zum Beispiel durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), (ii) rekombinant durch Klonierung produziert wurde, (iii) gereinigt wurde, zum Beispiel durch Spaltung und gelelektrophoretische Auftrennung oder (iv) synthetisiert wurde, zum Beispiel durch chemische Synthese. Eine isolierte Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die für eine Manipulierung durch rekombinante DNA-Techniken zur Verfügung steht.Ribonucleic acid (RNA). According to the invention, nucleic acids include genomic DNA, cDNA, mRNA, recombinantly produced and chemically synthesized molecules. According to the invention, a nucleic acid can be present as a single-stranded or double-stranded and linear or covalently circular molecule. The nucleic acids described according to the invention are preferably isolated. According to the invention, the term “isolated nucleic acid” means that the nucleic acid (i) was amplified in vitro, for example by polymerase chain reaction (PCR), (ii) was produced recombinantly by cloning, (iii) was purified, for example by cleavage and gel electrophoretic separation or (iv) was synthesized, for example by chemical synthesis. An isolated nucleic acid is a nucleic acid that is available for manipulation by recombinant DNA techniques.
Eine Nukleinsäure ist dann zu einer anderen Nukleinsäure „komplementär", wenn die beiden Sequenzen miteinander hybridisieren und ein stabiles Duplex eingehen können, wobei dieA nucleic acid is "complementary" to another nucleic acid if the two sequences hybridize with one another and can form a stable duplex, the
Hybridisierung vorzugsweise unter Bedingungen erfolgt, die eine spezifische Hybridisierung zwischen Polynukleotiden erlauben (stringente Bedingungen). Stringente Bedingungen sind beispielsweise in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Hrsg., 2.Hybridization is preferably carried out under conditions that allow specific hybridization between polynucleotides (stringent conditions). Stringent conditions are described, for example, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Ed., 2.
Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 oder Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc.,Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Ed., John Wiley & Sons, Inc.,
New York beschrieben und betreffen beispielsweise die Hybridisierung bei 65°C inNew York described and concern, for example, hybridization at 65 ° C in
Hybridisierungspuffer (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02%Hybridization buffer (3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02%
Rinderserumalbumin, 2,5mM NaH2PO4 (pH7), 0,5% SDS, 2mM EDTA). SSC ist 0,15 MBovine serum albumin, 2.5mM NaH 2 PO 4 (pH7), 0.5% SDS, 2mM EDTA). SSC is 0.15M
Natriumchlorid/ 0,15 M Natriumeitrat, pH 7. Nach der Hybridisierung wird die Membran, auf die die DNA übertragen wurde beispielsweise in 2 x SSC bei Raumtemperatur und sodann inSodium chloride / 0.15 M sodium citrate, pH 7. After the hybridization, the membrane to which the DNA has been transferred is, for example, in 2 × SSC at room temperature and then in
0,1 - 0,5 x SSC/ 0,1 x SDS bei Temperaturen bis 68°C gewaschen.Washed 0.1 - 0.5 x SSC / 0.1 x SDS at temperatures up to 68 ° C.
Komplementäre Nukleinsäuren weisen erfindungsgemäß mindestens 40%, insbesondere mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% und vorzugsweise mindestens 95%, mindestens 98 oder mindestens 99% Identität der Nukleotide auf.Complementary nucleic acids according to the invention have at least 40%, in particular at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% and preferably at least 95%, at least 98 or at least 99% identity of the nucleotides.
Nukleinsäuren, die für Tumor-assoziierte Antigene kodieren, können erfindungsgemäß alleine oder in Kombination mit anderen Nukleinsäuren, insbesondere heterologen Nukleinsäuren, vorliegen. In bevorzugten Ausfuhrungsformen liegt eine Nukleinsäure funktionell in Verbindung mit Expressionskontrollsequenzen oder regulatorischen Sequenzen vor, die in Bezug zu der Nukleinsäure homolog oder heterolog sein können. Eine kodierende Sequenz und eine regulatorische Sequenz sind dann "funktionell11 miteinander verbunden, falls sie derart kovalent miteinander verknüpft sind, dass die Expression oder Transkription der kodierenden Sequenz unter der Kontrolle oder unter dem Einfluss der regulatorischen Sequenz steht. Falls die kodierende Sequenz in ein funktionelles Protein translatiert werden soll, führt bei einer funktioneilen Verbindung einer regulatorischen Sequenz mit der kodierenden Sequenz eine Induktion der regulatorischen Sequenz zu einer Transkription der kodierenden Sequenz, ohne dass es zu einer Leserasterverschiebung in der kodierenden Sequenz oder zu einem Unvermögen der kodierenden Sequenz kommt, in das gewünschte Protein oder Peptid translatiert zu werden.According to the invention, nucleic acids coding for tumor-associated antigens can be present alone or in combination with other nucleic acids, in particular heterologous nucleic acids. In preferred embodiments, a nucleic acid is functionally associated with expression control sequences or regulatory sequences, which can be homologous or heterologous with respect to the nucleic acid. A coding sequence and a regulatory sequence are "functionally 11 connected to each other, if they are covalently linked to one another, that the expression or transcription of the coding sequence is under the control or under the influence of the regulatory sequence. If the coding sequence is to be translated into a functional protein, when a regulatory sequence is functionally linked to the coding sequence, induction of the regulatory sequence leads to transcription of the coding sequence without any shifting of the reading frame in the coding sequence or to inability the coding sequence comes to be translated into the desired protein or peptide.
Der Begriff „Expressionskontrollsequenz" oder „regulatorische Sequenz" umfasst erfindungsgemäß Promotoren, Enhancer und andere Kontrollelemente, die die Expression eines Gens steuern. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind dieAccording to the invention, the term “expression control sequence” or “regulatory sequence” encompasses promoters, enhancers and other control elements which control the expression of a gene. In certain embodiments of the invention, the
Expressionskontrollsequenzen regulierbar. Die genaue Struktur von regulatorischenExpression control sequences adjustable. The exact structure of regulatory
Sequenzen kann speziesabhängig oder zelltypusabhängig variieren, umfasst jedoch im allgemeinen 5'-nicht-transkribierte und 5'-nicht-translatierte Sequenzen, die an der Initiation der Transkription bzw. Translation beteiligt sind wie TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT-Sequences can vary depending on species or cell type, but generally includes 5'-non-transcribed and 5'-non-translated sequences that are involved in the initiation of transcription or translation such as TATA box, capping sequence, CAAT-
Sequenz und ähnliches. Insbesondere umfassen 5'-nicht-transkribierte Regulationssequenzen eine Promotorregion, die eine Promotorsequenz für eine transkriptionelle Kontrolle des funktionell verbundenen Gens einschließt. Regulatorische Sequenzen können auch Enhancer-Sequence and the like. In particular, 5'-non-transcribed regulatory sequences include a promoter region that includes a promoter sequence for transcriptional control of the functionally linked gene. Regulatory sequences can also be enhancer
Sequenzen oder stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen umfassen.Sequences or upstream activator sequences include.
Zum einen können also die hier dargestellten tumorassoziierten Antigene mit beliebigen Expressionskontrollsequenzen und Promotoren kombiniert werden. Zum anderen aber können erfindungsgemäß die Promotoren der hier dargestellten tumor-assoziierten Genprodukte mit beliebigen anderen Genen kombiniert werden. Dies erlaubt, die selektive Aktivität dieser Promotoren zu nutzen.On the one hand, the tumor-associated antigens shown here can be combined with any expression control sequences and promoters. On the other hand, according to the invention, the promoters of the tumor-associated gene products shown here can be combined with any other genes. This allows the selective activity of these promoters to be used.
Des weiteren kann eine Nukleinsäure erfindungsgemäß in Verbindung mit einer anderen Nukleinsäure vorliegen, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Sekretion des durch die Nukleinsäure kodierten Proteins oder Polypeptids aus einer Wirtszelle steuert. Auch kann eine Nukleinsäure erfindungsgemäß in Verbindung mit einer anderen Nukleinsäure vorliegen, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Verankerung des kodierten Proteins oder Polypeptids auf der Zellmembran der Wirtszelle oder seine Kompartimentalisierung in bestimmte Organellen dieser Zelle herbeiführt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein rekombinantes DNA-Molekül erfindungsgemäß ein Vektor, gegebenenfalls mit einem Promotor, der die Expression einer Nukleinsäure, z.B. einer Nukleinsäure, die für eine erfmdungsgemäßes Tumor-assoziiertes Antigen kodiert, steuert. Der Begriff "Vektor" wird dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst jegliche intermediären Vehikel für eine Nukleinsäure, die es z.B. ermöglichen die Nukleinsäure in prokaryotische und/oder in eukaryotische Zellen einzubringen und gegebenenfalls in ein Genom zu integrieren. Solche Vektoren werden vorzugsweise in der Zelle repliziert und/oder exprimiert. Ein intermediäres Vehikel kann z.B. für den Gebrauch bei der Elektroporation, beim Mikroprojektilbeschuss, bei der liposomalen Verabreichung, beim Transfer mit Hilfe von Agrobakterien oder bei der Insertion über DNA- oder RNA- Viren angepasst sein. Vektoren umfassen Plasmide, Phagemide oder Virusgenome.Furthermore, according to the invention, a nucleic acid can be present in connection with another nucleic acid which codes for a polypeptide which controls secretion of the protein or polypeptide encoded by the nucleic acid from a host cell. According to the invention, a nucleic acid can also be present in conjunction with another nucleic acid which codes for a polypeptide which anchors the coded protein or polypeptide on the cell membrane of the host cell or its compartmentalization in certain organelles of this cell. In a preferred embodiment, a recombinant DNA molecule according to the invention is a vector, optionally with a promoter, which controls the expression of a nucleic acid, for example a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen according to the invention. The term "vector" is used in its most general meaning and encompasses any intermediate vehicles for a nucleic acid which, for example, make it possible to introduce the nucleic acid into prokaryotic and / or into eukaryotic cells and, if appropriate, to integrate them into a genome. Such vectors are preferably replicated and / or expressed in the cell. An intermediate vehicle can be adapted, for example, for use in electroporation, in microprojectile bombardment, in liposomal administration, in transfer with the aid of agrobacteria or in the insertion via DNA or RNA viruses. Vectors include plasmids, phagemids, or virus genomes.
Die Nukleinsäuren, die für ein erfindungsgemäß identifiziertes Tumor-assoziiertes Antigen kodieren, können für eine Transfektion von Wirtszellen eingesetzt werden. Mit Nukleinsäuren ist dabei sowohl rekombinante DNA wie auch RNA gemeint. Rekombinante RNA kann durch in-vitro-Transkription von einer DNA-Matritze hergestellt werden. Sie kann des weiteren vor Applikation durch stabilisierende Sequenzen, Capping und Poly-Adenylierung modifiziert werden. Der Begriff „Wirtszelle" betrifft erfindungsgemäß jede Zelle, die mit einer exogenen Nukleinsäure transformierbar oder transfizierbar ist. Der Begriff „Wirtszellen" umfasst erfindungsgemäß prokaryontische (z.B. E. coli) oder eukaryontische (z.B. dendritische Zellen, B-Zellen, CHO-Zellen, COS-Zellen, K562-Zellen, Hefezellen und Insektenzellen). Besonders bevorzugt sind Säugerzellen wie Zellen aus Mensch, Maus, Hamster, Schwein, Ziege, Primaten. Die Zellen können aus einer Vielzahl von Gewebetypen abgeleitet sein und umfassen primäre Zellen und Zelllinien. Spezifische Beispiele umfassen Keratinozyten, periphere Blutleukozyten, Stammzellen des Knochenmarks und embryonale Stammzellen. In weiteren Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, Monozyt oder ein Makrophage. Eine Nukleinsäure kann in der Wirtszelle in einer einzigen oder in mehreren Kopien vorliegen und wird in einer Ausführungsform in der Wirtszelle exprimiert.The nucleic acids which code for a tumor-associated antigen identified according to the invention can be used for a transfection of host cells. Nucleic acids mean both recombinant DNA and RNA. Recombinant RNA can be produced by in vitro transcription from a DNA template. It can also be modified before application by stabilizing sequences, capping and poly-adenylation. According to the invention, the term “host cell” relates to any cell that can be transformed or transfected with an exogenous nucleic acid. According to the invention, the term “host cells” includes prokaryotic (eg E. coli) or eukaryotic (eg dendritic cells, B cells, CHO cells, COS) Cells, K562 cells, yeast cells and insect cells). Mammalian cells such as cells from humans, mice, hamsters, pigs, goats and primates are particularly preferred. The cells can be derived from a variety of tissue types and include primary cells and cell lines. Specific examples include keratinocytes, peripheral blood leukocytes, bone marrow stem cells and embryonic stem cells. In further embodiments, the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, monocyte or a macrophage. A nucleic acid can be present in the host cell in a single or in multiple copies and, in one embodiment, is expressed in the host cell.
Der Begriff "Expression" wird erfindungsgemäß in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst die Produktion von RNA oder von RNA und Protein. Er umfasst auch eine teilweise Expression von Nukleinsäuren. Des weiteren kann die Expression transient oder stabil erfolgen. Bevorzugte Expressionssysteme in Säugerzellen umfassen pcDNA3.1 und pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), die einen selektierbaren Marker enthalten wie ein Gen, das eine Resistenz gegenüber G418 verleiht (und somit eine Selektion stabil transfizierter Zelllinien ermöglicht) und die Enhancer-Promotor-Sequenzen von Cytomegalovirus (CMV).The term "expression" is used according to the invention in its most general meaning and encompasses the production of RNA or of RNA and protein. It also includes partial expression of nucleic acids. Furthermore, the expression can be transient or stable. Preferred expression systems in mammalian cells include pcDNA3.1 and pRc / CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), which contain a selectable marker such as a gene which confers resistance to G418 (and thus enables selection of stably transfected cell lines) and the enhancer-promoter sequences of cytomegalovirus (CMV).
In den Fällen der Erfindung, in denen ein HLA-Molekül ein Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon präsentiert, kann ein Expressionsvektor auch eine Nukleinsäuresequenz umfassen, das für das HLA-Molekül kodiert. Die Nukleinsäuresequenz, die für das HLA- Molekül kodiert, kann auf demselben Expressionsvektor wie die Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon kodiert, vorliegen oder beide Nukleinsäuren können auf verschiedenen Expressionsvektoren vorliegen. Im letzteren Fall können die beiden Expressionsvektoren in eine Zelle cotransfiziert werden. Falls eine Wirtszelle weder das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon noch das HLA-Molekül exprimiert, werden beide dafür kodierenden Nukleinsäuren entweder auf demselben Expressionsvektor oder auf verschiedenen Expressionsvektoren in die Zelle transfiziert. Falls die Zelle bereits das HLA- Molekül exprimiert, kann nur die Nukleinsäuresequenz, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon kodiert, in die Zelle transfiziert werden.In the cases of the invention in which an HLA molecule presents a tumor-associated antigen or a part thereof, an expression vector can also comprise a nucleic acid sequence which codes for the HLA molecule. The nucleic acid sequence encoding the HLA molecule can be on the same expression vector as the nucleic acid encoding the tumor-associated antigen or part thereof, or both nucleic acids can be on different expression vectors. In the latter case, the two expression vectors can be cotransfected into one cell. If a host cell does not express the tumor-associated antigen or part of it or the HLA molecule, both nucleic acids encoding it are transfected into the cell either on the same expression vector or on different expression vectors. If the cell already expresses the HLA molecule, only the nucleic acid sequence that codes for the tumor-associated antigen or part thereof can be transfected into the cell.
Erfindungsgemäß umfasst sind Kits zur Amplifikation einer Nukleinsäure, die für ein Tumor- assoziiertes Antigen kodiert. Solche Kits umfassen beispielsweise ein Paar von Amplifikationsprimern, die an die Nukleinsäure hybridisieren, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert. Die Primer umfassen vorzugsweise eine Sequenz von 6-50, insbesondere 10- 30, 15-30 und 20-30 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure und sind nicht- überlappend, um die Bildung von Primer-Dimeren zu vermeiden. Einer der Primer wird an einen Strang der Nukleinsäure hybridisieren, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, und der andere Primer wird an den komplementären Strang in einer Anordnung hybridisieren, die eine Amplifikation der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, erlaubt.The invention comprises kits for amplifying a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen. Such kits include, for example, a pair of amplification primers that hybridize to the nucleic acid encoding the tumor associated antigen. The primers preferably comprise a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 and 20-30 contiguous nucleotides from the nucleic acid and are non-overlapping in order to avoid the formation of primer dimers. One of the primers will hybridize to a strand of the nucleic acid encoding the tumor associated antigen and the other primer will hybridize to the complementary strand in an arrangement that allows amplification of the nucleic acid encoding the tumor associated antigen ,
"Antisense"-Moleküle oder „Antisense"-Nukleinsäuren können zur Regulierung, insbesondere der Reduktion der Expression einer Nukleinsäure verwendet werden. Der Begriff "Antisense-Molekül" oder "Antisense-Nukleinsäure" betrifft erfindungsgemäß ein Oligonukleotid, das ein Oligoribonukleotid, Oligodesoxyribonukleotid, modifiziertes Oligoribonukleotid oder modifiziertes Oligodesoxyribonukleotid ist und das unter physiologischen Bedingungen an DNA, die ein bestimmtes Gen umfasst, oder mRNA dieses Gens hybridisiert, wodurch die Transkription dieses Gens und/oder die Translation dieser mRNA gehemmt wird. Ein "Antisense-Molekül" umfasst erfindungsgemäß auch ein Konstrukt, das eine Nukleinsäure oder einen Teil davon in reverser Orientierung in Bezug auf ihren natürlichen Promotor enthält. Ein Antisense-Transkript einer Nukleinsäure oder eines Teils davon kann eine Duplex mit der natürlich vorkommenden mRNA, die das Enzym spezifiziert, eingehen und so eine Akkumulation von oder die Translation der mRNA in das aktive Enzym verhindern. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Ribozymen zur Inaktivierung einer Nukleinsäure. Bevorzugte erfindungsgemäße Antisense-Oligonukleotide weisen eine Sequenz von 6-50, insbesondere 10-30, 15-30 und 20-30 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Ziel-Nukleinsäure auf und sind vorzugsweise vollständig zu der Ziel- Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär.“Antisense” molecules or “antisense” nucleic acids can be used for regulation, in particular the reduction of the expression of a nucleic acid. According to the invention, the term “antisense molecule” or “antisense nucleic acid” relates to an oligonucleotide that modifies an oligoribonucleotide, oligodeoxyribonucleotide Oligoribonucleotide or modified oligodeoxyribonucleotide is and that under physiological conditions on DNA, which comprises a specific gene, or mRNA of this gene hybridizes, whereby the transcription of this gene and / or the translation of this mRNA is inhibited. According to the invention, an “antisense molecule” also comprises a construct which contains a nucleic acid or a part thereof in a reverse orientation with respect to its natural promoter. An antisense transcript of a nucleic acid or a portion thereof can duplex with the naturally occurring mRNA that specifies the enzyme, thus preventing accumulation or translation of the mRNA into the active enzyme. Another option is to use ribozymes to inactivate a nucleic acid. Preferred antisense oligonucleotides according to the invention have a sequence of 6-50, in particular 10-30, 15-30 and 20-30 contiguous nucleotides from the target nucleic acid and are preferably completely complementary to the target nucleic acid or a part thereof.
In bevorzugten Ausführungsformen hybridisiert das Antisense-Oligonukleotid mit einer N- terminalen oder 5'-stromaufwärts gelegenen Stelle wie einer Translationsinitiations-, Transkriptionsinitiations- oder Promotorstelle. In weiteren Ausfulirungsformen hybridisiert das Antisense-Oligonukleotid mit einer 3'-nicht-translatierten Region oder mRNA-Splicing- Stelle.In preferred embodiments, the antisense oligonucleotide hybridizes to an N-terminal or 5 'upstream site such as a translation initiation, transcription initiation or promoter site. In other embodiments, the antisense oligonucleotide hybridizes to a 3 'untranslated region or mRNA splicing site.
In einer Ausführungsform besteht ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid aus Ribonukleotiden, Desoxyribonukleotiden oder einer Kombination davon. Dabei sind das 5'- Ende eines Nukleotids und das 3'-Ende eines anderen Nukleotids durch eine Phosphodiesterbindung miteinander verknüpft. Diese Oligonukleotide können in herkömmlicher Weise synthetisiert oder rekombinant produziert werden.In one embodiment, an oligonucleotide according to the invention consists of ribonucleotides, deoxyribonucleotides or a combination thereof. The 5 'end of one nucleotide and the 3' end of another nucleotide are linked to one another by a phosphodiester bond. These oligonucleotides can be synthesized in a conventional manner or produced recombinantly.
In bevorzugten Ausführungsformen ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid ein "modifiziertes" Oligonukleotid. Dabei kann das Oligonukleotid, um beispielsweise seine Stabilität oder therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen, auf verschiedenste Art und Weise modifiziert sein ohne dass seine Fähigkeit, an sein Ziel zu binden, beeinträchtigt wird. Der Begriff "modifiziertes Oligonukleotid" bedeutet erfindungsgemäß ein Oligonukleotid bei dem (i) mindestens zwei seiner Nukleotide durch eine synthetische Internukleosidbindung (d.h. eine Internukleosidbindung, die keine Phosphodiesterbindung ist) miteinander verknüpft sind und/oder (ii) eine chemische Gruppe kovalent mit dem Oligonukleotid verbunden ist, die normalerweise nicht bei Nukleinsäuren auftritt. Bevorzugte synthetische Internukleosidbindungen sind Phosphorothioate, Alkylphosphonate, Phosphorodithioate, Phosphatester, Alkylphosphonothioate, Phosphoramidate, Carbamate, Carbonate, Phosphattriester, Acetamidate, Carboxymethylester und Peptide.In preferred embodiments, an oligonucleotide according to the invention is a "modified" oligonucleotide. The oligonucleotide can be modified in various ways in order to increase its stability or therapeutic effectiveness, for example, without impairing its ability to bind to its target. According to the invention, the term “modified oligonucleotide” means an oligonucleotide in which (i) at least two of its nucleotides are linked to one another by a synthetic internucleoside bond (ie an internucleoside bond which is not a phosphodiester bond) and / or (ii) a chemical group is covalently linked to the oligonucleotide that does not normally occur with nucleic acids. Preferred synthetic Internucleoside bonds are phosphorothioates, alkylphosphonates, phosphorodithioates, phosphate esters, alkylphosphonothioates, phosphoramidates, carbamates, carbonates, phosphate triesters, acetamidates, carboxymethyl esters and peptides.
Der Begriff "modifiziertes Oligonukleotid" umfasst auch Oligonukleotide mit einer kovalent modifizierten Base und/oder Zucker. "Modifizierte Oligonukleotide" umfassen beispielsweise Oligonukleotide mit Zuckerresten, die kovalent an organische Gruppen mit einem geringen Molekulargewicht gebunden sind, die keine Hydroxylgruppe an der 3 '-Position und keine Phosphatgruppe an der 5'-Position sind. Modifizierte Oligonukleotide können beispielsweise einen 2'-O-alkylierten Riboserest oder einen anderen Zucker anstelle von Ribose wie Arabinose umfassen.The term “modified oligonucleotide” also includes oligonucleotides with a covalently modified base and / or sugar. "Modified oligonucleotides" include, for example, oligonucleotides with sugar residues that are covalently bound to low molecular weight organic groups that are not a hydroxyl group at the 3 'position and not a phosphate group at the 5' position. Modified oligonucleotides can include, for example, a 2'-O-alkylated ribose residue or another sugar instead of ribose such as arabinose.
Die erfindungsgemäß beschriebenen Proteine und Polypeptide sind vorzugsweise isoliert. Die Begriffe "isoliertes Protein" oder "isoliertes Polypeptid" bedeuten, dass das Protein oder Polypeptid von seiner natürlichen Umgebung getrennt ist. Ein isoliertes Protein oder Polypeptid kann in einem im wesentlichen aufgereinigten Zustand vorliegen. Der Begriff "im wesentlichen aufgereinigt" bedeutet, dass das Protein oder Polypeptid im wesentlichen frei von anderen Substanzen vorliegt, mit denen es in der Natur oder in vivo vorliegt.The proteins and polypeptides described according to the invention are preferably isolated. The terms "isolated protein" or "isolated polypeptide" mean that the protein or polypeptide is separated from its natural environment. An isolated protein or polypeptide can be in a substantially purified state. The term "substantially purified" means that the protein or polypeptide is essentially free of other substances with which it is present in nature or in vivo.
Solche Proteine und Polypeptide dienen beispielsweise der Herstellung von Antiköφern und sind in einem immunologischen oder diagnostischen Assay oder als Therapeutika einsetzbar. Erfindungsgemäß beschriebene Proteine und Polypeptide können aus biologischen Proben wie Gewebe- oder Zellhomogenaten isoliert werden und können auch rekombinant in einer Vielzahl pro- oder eukaryontischer Expressionssysteme exprimiert werden.Such proteins and polypeptides are used, for example, for the production of antibodies and can be used in an immunological or diagnostic assay or as therapeutic agents. Proteins and polypeptides described according to the invention can be isolated from biological samples such as tissue or cell homogenates and can also be expressed recombinantly in a large number of pro- or eukaryotic expression systems.
„Derivate" eines Proteins oder Polypeptids oder einer Aminosäuresequenz im Sinne dieser Erfindung umfassen Aminosäure-Insertionsvarianten, Aminosäure-Deletionsvarianten und/oder Aminosäure-Substitutionsvarianten.“Derivatives” of a protein or polypeptide or an amino acid sequence in the sense of this invention include amino acid insertion variants, amino acid deletion variants and / or amino acid substitution variants.
Aminosäure-Insertionsvarianten umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, sowie Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren in einer bestimmten Aminosäuresequenz. Bei Aminosäure-Sequenzvarianten mit einer Insertion werden ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in einer Aminosäuresequenz eingebracht, obwohl eine zufällige Insertion mit geeignetem Screening des resultierenden Produkts auch möglich ist. Aminosäure-Deletionsvarianten sind durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz charakterisiert. Aminosäure- Substitutionsvarianten zeichnen sich dadurch aus, dass wenigstens ein Rest in der Sequenz entfernt und ein anderer Rest an dessen Stelle eingefügt wird. Vorzugsweise befinden sich die Modifikationen an Positionen in der Aminosäuresequenz, die zwischen homologen Proteinen oder Polypeptiden nicht konserviert sind. Vorzugsweise werden Aminosäuren durch andere mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, Volumen der Seitenkette und ähnliches (konservative Substitution). Konservative Substitutionen betreffen beispielsweise den Austausch einer Aminosäure durch eine andere, nachstehend in derselben Gruppe wie die substituierte Aminosäure aufgeführte Aminosäure:Amino acid insertion variants include amino- and / or carboxy-terminal fusions, as well as insertions of single or several amino acids in a certain amino acid sequence. In amino acid sequence variants with an insertion, one or more amino acid residues are introduced into a predetermined position in an amino acid sequence, although a random insertion with suitable screening of the resulting one Product is also possible. Amino acid deletion variants are characterized by the removal of one or more amino acids from the sequence. Amino acid substitution variants are characterized in that at least one residue in the sequence is removed and another residue is inserted in its place. The modifications are preferably at positions in the amino acid sequence that are not conserved between homologous proteins or polypeptides. Preferably amino acids are replaced by others with similar properties, such as hydrophobicity, hydrophilicity, electronegativity, volume of the side chain and the like (conservative substitution). Conservative substitutions relate, for example, to the replacement of an amino acid by another amino acid, listed below in the same group as the substituted amino acid:
1. kleine aliphatische, nicht-polare oder leicht-polare Reste: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)1. small aliphatic, non-polar or slightly polar residues: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. negativ geladene Reste und ihre Amide: Asn, Asp, Glu, Gin2. negatively charged residues and their amides: Asn, Asp, Glu, Gin
3. positiv geladene Reste: His, Arg, Lys 4. große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val (Cys) 5. große aromatische Reste: Phe, Tyr, Tφ.3. positively charged residues: His, Arg, Lys 4. large aliphatic, non-polar residues: Met, Leu, Ile, Val (Cys) 5. large aromatic residues: Phe, Tyr, Tφ.
Drei Reste sind aufgrund ihrer besonderen Rolle für die Proteinarchitektur in Klammern gesetzt. Gly ist der einzige Rest ohne eine Seitenkette und verleiht der Kette somit Flexibilität. Pro besitzt eine ungewöhnliche Geometrie, die die Kette stark einschränkt. Cys kann eine Disulfidbrücke bilden.Three residues are enclosed in parentheses due to their special role in protein architecture. Gly is the only remnant without a side chain and thus gives the chain flexibility. Pro has an unusual geometry that severely restricts the chain. Cys can form a disulfide bridge.
Die oben beschriebenen Aminosäure-Varianten können leicht mit Hilfe von bekannten Peptidsynthesetechniken wie z.B. durch „Solid Phase Synthesis" (Merrifield, 1964) und ähnliche Verfahren oder durch rekombinante DNA-Manipulation hergestellt werden. Techniken, um Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA einzubringen, die eine bekannte oder teilweise bekannte Sequenz besitzt, sind gut bekannt und umfassen z.B. M13-Mutagenese. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen mit Substitutionen, Insertionen oder Deletionen ist z.B. in Sambrook et. al. (1989) ausführlich beschrieben.The amino acid variants described above can easily be obtained using known peptide synthesis techniques such as e.g. by "Solid Phase Synthesis" (Merrifield, 1964) and similar methods or by recombinant DNA manipulation. Techniques for introducing substitution mutations at predetermined locations in DNA that have a known or partially known sequence are well known and include, for example, M13 The manipulation of DNA sequences for the production of proteins with substitutions, insertions or deletions is described in detail, for example, in Sambrook et al. (1989).
„Derivate" von Proteinen oder Polypeptiden umfassen erfindungsgemäß auch einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Enzym assoziiert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine oder Polypeptide. Ferner erstreckt sich der Begriff "Derivat" auch auf alle funktioneilen chemischen Äquivalente der Proteine oder Polypeptide.According to the invention, “derivatives” of proteins or polypeptides also include single or multiple substitutions, deletions and / or additions of any molecules which are associated with the enzyme, such as carbohydrates, lipids and / or proteins or polypeptides. Furthermore the term "derivative" also extends to all functional chemical equivalents of the proteins or polypeptides.
Ein Teil oder Fragment eines Tumor-assoziierten Antigens weist erfindungsgemäß eine funktioneile Eigenschaft des Polypeptids auf, aus dem es abgeleitet sind. Solche funktioneilen Eigenschaften umfassen die Interaktion mit Antiköφern, die Interaktion mit anderen Polypeptiden oder Proteinen, die selektive Bindung von Nukleinsäuren und eine enzymatische Aktivität. Eine bedeutende Eigenschaft ist die Fähigkeit, einen Komplex mit HLA einzugehen und gegebenenfalls eine Immunreaktion zu erzeugen. Diese Immunreaktion kann auf Stimulation von cytotoxischen oder Helfer T-Zellen beruhen. Vorzugsweise umfasst ein erfindungsgemäßer Teil oder Fragment eines Tumor-assoziierten Antigens eine Sequenz von mindestens 6, insbesondere mindestens 8, mindestens 10, mindestens 12, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 30 oder mindestens 50 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus dem Tumor-assoziierten Antigen.According to the invention, a part or fragment of a tumor-associated antigen has a functional property of the polypeptide from which it is derived. Such functional properties include the interaction with antibodies, the interaction with other polypeptides or proteins, the selective binding of nucleic acids and an enzymatic activity. An important property is the ability to complex with HLA and possibly to generate an immune response. This immune response can be based on stimulation of cytotoxic or helper T cells. A part or fragment of a tumor-associated antigen according to the invention preferably comprises a sequence of at least 6, in particular at least 8, at least 10, at least 12, at least 15, at least 20, at least 30 or at least 50, consecutive amino acids from the tumor-associated antigen.
Bevorzugte Teile oder Fragmente eines Tumor-assoziierten Antigens weisen erfindungsgemäß vorzugsweise eine der nachstehend aufgeführten Sequenzen auf, die von den erfindungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigenen abgeleitet sind, und sind vorzugsweise Peptidepitope, die erfindungsgemäß insbesondere zur Stimulierung von cytotoxischen T-Lymphozyten in vivo aber auch zur Herstellung expandierter und stimulierter T-Lymphozyten zum therapeutischen adoptiven Transfer ex vivo geeignet sind. Diese Sequenzen sind insbesondere Peptidepitope für die nachstehend angegebenen MHC Klasse I Allele:Preferred parts or fragments of a tumor-associated antigen according to the invention preferably have one of the sequences listed below, which are derived from the tumor-associated antigens identified according to the invention, and are preferably peptide epitopes which, according to the invention, in particular also for stimulating cytotoxic T-lymphocytes in vivo are suitable for the production of expanded and stimulated T lymphocytes for therapeutic adoptive transfer ex vivo. These sequences are in particular peptide epitopes for the MHC class I alleles given below:
HLA-A*0201HLA-A * 0201
HLA-A*2402HLA-A * 2402
HLA-A*01HLA-A * 01
HLA-A*03HLA-A * 03
HLA-B*0702 HLA-B * 0702
Ein Teil oder ein Fragment einer Nukleinsäure, die für ein Tumor-assoziiertes Antigen kodiert, betrifft erfmdungsgemäß den Teil der Nukleinsäure, der zumindest für das Tumorassoziierte Antigen kodiert und/oder für einen Teil oder ein Fragment des Tumor-assoziierten Antigens wie vorstehend definiert kodiert.According to the invention, a part or a fragment of a nucleic acid which codes for a tumor-associated antigen relates to the part of the nucleic acid which codes at least for the tumor-associated antigen and / or codes for a part or a fragment of the tumor-associated antigen as defined above.
Die Isolierung und Identifizierung von Genen, die für Tumor-assoziierte Antigene kodieren, ermöglicht auch die Diagnose einer Erkrankung, die sich durch die Expression von einem oder mehreren Tumor-assoziierten Antigenen auszeichnet. Diese Verfahren umfassen die Bestimmung einer oder mehrerer Nukleinsäuren, die für ein Tumor-assoziiertes Antigen kodieren, und/oder die Bestimmung der kodierten Tumor-assoziierten Antigene und/oder von davon abgeleiteten Peptiden. Eine Bestimmung der Nukleinsäure kann in herkömmlicher Weise erfolgen, einschließlich durch Polymerase-Kettenreaktion oder Hybridisierung mit einer markierten Sonde. Eine Bestimmung von Tumor-assoziierten Antigenen oder davon abgeleiteten Peptiden kann durch ein Screening von Patienten-Antiseren in Bezug auf eine Erkennung des Antigens und/oder der Peptide erfolgen. Sie kann auch erfolgen durch ein Screening von T-Zellen des Patienten auf Spezifität für das entsprechende tumor-assoziierte Antigen.The isolation and identification of genes coding for tumor-associated antigens also enables the diagnosis of a disease which is characterized by the expression of one or more tumor-associated antigens. These methods include determining one or more nucleic acids encoding a tumor associated antigen and / or determining the encoded tumor associated antigens and / or peptides derived therefrom. The nucleic acid can be determined in a conventional manner, including by polymerase chain reaction or hybridization with a labeled probe. A determination of tumor-associated antigens or peptides derived therefrom can be carried out by screening patient antisera with regard to recognition of the antigen and / or the peptides. It can also be done by screening the patient's T cells for specificity for the corresponding tumor-associated antigen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Isolierung von Proteinen, die an hier beschriebene Tumor-assoziierte Antigene binden, einschließlich Antiköφer und zelluläre Bindepartner der Tumor-assoziierten Antigene.The present invention also enables isolation of proteins that bind to tumor-associated antigens described herein, including antibodies and cellular binding partners of the tumor-associated antigens.
Erfindungsgemäß werden auch in bestimmten Ausführungsformen "dominant negative" Polypeptide bereitgestellt, die von Tumor-assoziierten Antigenen abgeleitet sind. Ein dominant negatives Polypeptid ist eine inaktive Variante eines Proteins, die durch Interaktion mit der zellulären Maschinerie ein aktives Protein von seiner Interaktion mit der zellulären Maschinerie verdrängt oder mit dem aktiven Protein kompetitiert, wodurch die Wirkung des aktiven Proteins verringert wird. Zum Beispiel kann ein dominant negativer Rezeptor, der einen Liganden bindet, jedoch kein Signal in Reaktion auf die Bindung des Liganden erzeugt, die biologische Wirkung des Liganden verringern. In ähnlicher Weise kann eine dominant negative katalytisch-inaktive Kinase, die normalerweise mit Zielproteinen interagiert, jedoch die Zielproteine nicht phosphoryliert, die Phosphorylierung der Zielproteine in Reaktion auf ein zelluläres Signal verringern. In ähnlicher Weise kann ein dominant negativer Transkriptionsfaktor, der an eine Promotorstelle in der Kontrollregion eines Gens bindet, jedoch die Transkription des Gens nicht erhöht, die Wirkung eines normalen Transkriptionsfaktors durch die Besetzung von Promotorbindestellen ohne eine Erhöhung der Transkription verringern.According to the invention, "dominant negative" polypeptides are also provided in certain embodiments, which are derived from tumor-associated antigens. A dominant negative polypeptide is an inactive variant of a protein that, by interacting with the cellular machinery, displaces an active protein from its interaction with the cellular machinery or competes with the active protein, thereby reducing the activity of the active protein. For example, a dominant negative receptor that binds a ligand but does not produce a signal in response to ligand binding can reduce the biological activity of the ligand. Similarly, a dominant negative catalytically inactive kinase that normally interacts with target proteins but does not phosphorylate the target proteins can decrease the phosphorylation of the target proteins in response to a cellular signal. Similarly, a dominant negative transcription factor that binds to a promoter site in the control region of a gene can however, the transcription of the gene does not increase, reducing the effect of a normal transcription factor by occupying promoter binding sites without increasing transcription.
Das Ergebnis der Expression eines dominant negativen Polypeptids in einer Zelle ist eine Verringerung der Funktion aktiver Proteine. Der Fachmann kann dominant negative Varianten eines Proteins beispielsweise durch herkömmliche Mutageneseverfahren und Bewerten der dominant negativen Wirkung des Varianten-Polypeptids herstellen.The result of the expression of a dominant negative polypeptide in a cell is a decrease in the function of active proteins. The person skilled in the art can produce dominant negative variants of a protein, for example by conventional mutagenesis methods and evaluating the dominant negative effect of the variant polypeptide.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch Stoffe wie Polypeptide, die an Tumor-assoziierte Antigene binden. Solche Bindestoffe können z.B. in Screening- Assays für einen Nachweis von Tumor-assoziierten Antigenen und Komplexen von Tumor-assoziierten Antigenen mit ihren Bindepartnern sowie bei einer Aufreinigung der Tumor-assoziierten Antigene und von Komplexen davon mit ihren Bindepartnern Verwendung finden. Solche Stoffe können auch für eine Hemmung der Aktivität Tumor-assoziierter Antigene beispielsweise durch Bindung an solche Antigene Verwendung finden.The invention also includes substances such as polypeptides that bind to tumor-associated antigens. Such binders can e.g. in screening assays for the detection of tumor-associated antigens and complexes of tumor-associated antigens with their binding partners as well as in the purification of the tumor-associated antigens and of complexes thereof with their binding partners. Such substances can also be used for inhibiting the activity of tumor-associated antigens, for example by binding to such antigens.
Erfindungsgemäß umfasst sind daher Bindestoffe wie z.B. Antiköφer oder Antiköφerfragmente, die die Fähigkeit aufweisen, selektiv an Tumor-assoziierte Antigene zu binden. Antiköφer umfassen polyklonale und monoklonale Antiköφer, die in herkömmlicher Weise hergestellt werden.According to the invention, binding agents such as e.g. Antibodies or antibody fragments that have the ability to selectively bind to tumor-associated antigens. Antibodies include polyclonal and monoclonal antibodies that are made in a conventional manner.
Es ist bekannt, dass nur ein kleiner Teil eines Antiköφermoleküls, das Paratop, an der Bindung des Antiköφers an sein Epitop beteiligt ist (vgl. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7. Auflage, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Die pFc'- und Fc-Regionen sind z.B. Effektoren der Komplementkaskade, sind jedoch nicht an der Antigenbindung beteiligt. Ein Antiköφer, von dem die pFc' -Region enzymatisch abgespalten wurde oder der ohne die pFc' -Region hergestellt wurde, bezeichnet als F(ab')2-Fragment, trägt beide Antigenbindestellen eines vollständigen Antiköφers. In ähnlicher Weise trägt ein Antiköφer, von dem die Fc-Region enzymatisch abgespalten wurde oder der ohne die Fc- Region hergestellt wurde, bezeichnet als Fab-Fragment, eine Antigenbindestelle eines intakten Antiköφermoleküls. Des weiteren bestehen Fab-Fragmente aus einer kovalent gebundenen leichten Kette eines Antiköφers und einem Teil der schweren Kette des Antiköφers, bezeichnet als Fd. Die Fd-Fragmente sind die Haupt-Determinanten der Antiköφer-Spezifität (ein einzelnes Fd-Fragment kann mit bis zu zehn verschiedenen leichten Ketten assoziiert werden, ohne die Spezifität des Antiköφers zu verändern) und Fd- Fragmente behalten bei einer Isolierung die Fähigkeit, an ein Epitop zu binden.It is known that only a small part of an antibody molecule, the paratope, is involved in binding the antibody to its epitope (see Clark, WR (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). The pFc 'and Fc regions are, for example, effectors of the complement cascade, but are not involved in antigen binding. An antibody from which the pFc 'region was cleaved enzymatically or which was produced without the pFc' region, referred to as the F (ab ') 2 fragment, carries both antigen binding sites of a complete antibody. Similarly, an antibody from which the Fc region was cleaved enzymatically or which was produced without the Fc region, referred to as a Fab fragment, carries an antigen binding site of an intact antibody molecule. Furthermore, Fab fragments consist of a covalently bound light chain of an antibody and part of the heavy chain of Antibodies, referred to as Fd. The Fd fragments are the main determinants of antibody specificity (a single Fd fragment can be associated with up to ten different light chains without changing the specificity of the antibody) and Fd fragments retain isolation the ability to bind to an epitope.
Innerhalb des Antigen-bindenden Teils eines Antiköφers befinden sich komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs), die direkt mit dem Epitop des Antigens wechselwirken, und Gerüstregionen (FRs), die die Tertiärstruktur des Paratops aufrechterhalten. Sowohl in dem Fd-Fragment der schweren Kette als auch in der leichten Kette von IgG-Immunglobulinen befinden sich vier Gerüstregionen (FRl bis FR4), die jeweils durch drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR1 bis CDR3) getrennt sind. Die CDRs und insbesondere die CDR3 -Regionen und noch mehr die CDR3 -Region der schweren Kette sind größtenteils für die Antiköφer-Spezifität verantwortlich.Within the antigen-binding part of an antibody are complementarity-determining regions (CDRs) that interact directly with the epitope of the antigen, and framework regions (FRs) that maintain the tertiary structure of the paratope. Both the Fd fragment of the heavy chain and the light chain of IgG immunoglobulins contain four framework regions (FR1 to FR4), which are each separated by three complementarity-determining regions (CDR1 to CDR3). The CDRs and in particular the CDR3 regions and even more the CDR3 region of the heavy chain are largely responsible for the antibody specificity.
Man weiß, dass die Nicht-CDR-Regionen eines Säuger- Antiköφers durch ähnliche Regionen von Antiköφern mit der gleichen oder einer anderen Spezifität ersetzt werden können, wobei die Spezifität für das Epitop des ursprünglichen Antiköφers erhalten bleibt. Dies ermöglichte die Entwicklung sogenannter "humanisierter" Antiköφer, bei denen nicht-menschliche CDRs kovalent mit menschlichen FR- und/oder Fc/pFc'-Regionen für die Herstellung eines funktionellen Antiköφers verbunden sind.It is known that the non-CDR regions of a mammalian antibody can be replaced by similar regions of antibodies with the same or a different specificity, while maintaining the specificity for the epitope of the original antibody. This enabled the development of so-called "humanized" antibodies, in which non-human CDRs are covalently linked to human FR and / or Fc / pFc 'regions for the production of a functional antibody.
Zum Beispiel beschreibt die WO 92/04381 die Herstellung und Verwendung von humanisierten RSV-Antiköφern aus Maus, bei denen mindestens ein Teil der FR-Regionen aus Maus durch FR-Regionen eines menschlichen Ursprungs ersetzt wurden. Solche Antiköφer, einschließlich Fragmente intakter Antiköφer mit einer Antigen-Bindefähigkeit werden oft als "chimäre" Antiköφer bezeichnet.For example, WO 92/04381 describes the production and use of humanized RSV antibodies from mouse, in which at least some of the FR regions from mouse have been replaced by FR regions of human origin. Such antibodies, including fragments of intact antibodies with an antigen binding ability, are often referred to as "chimeric" antibodies.
Erfindungsgemäß werden auch F(ab')2-, Fab-, Fv- und Fd-Fragmente von Antiköφern, chimäre Antiköφer, bei denen die Fc- und/oder FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder leichte Kette-CDR3 -Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, chimäre F(ab') -Fragment-Antiköφer, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder leichte Kette-CDR3 -Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, chimäre Fab-Fragment- Antiköφer, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder leichte Kette- CDR3-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, und chimäre Fd-Fragment- Antiköφer, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt wurden, bereitgestellt. Erfindungsgemäß umfasst sind auch sogenannte einzelkettige Antiköφer.According to the invention, F (ab ') 2 , Fab, Fv and Fd fragments of antibodies are also chimeric antibodies in which the Fc and / or FR and / or CDR1 and / or CDR2 and / or light fragments Chain CDR3 regions were replaced by homologous human or non-human sequences, chimeric F (ab ') fragment antibodies in which the FR and / or CDR1 and / or CDR2 and / or light chain CDR3 - Regions have been replaced by homologous human or non-human sequences, chimeric Fab fragment antibodies, in which the FR and / or CDR1 and / or CDR2 and / or light chain CDR3 regions were replaced by homologous human or non-human sequences, and chimeric Fd fragment antibodies, in which the FR and / or CDR1 and / or CDR2 regions were replaced by homologous human or non-human sequences , According to the invention, so-called single-chain antibodies are also included.
Vorzugsweise ist ein erfmdungsgemäß verwendeter Antiköφer gegen eine der in SEQ ID NO:14-18, 80-84 oder 101-116 des Sequenzprotokolls dargestellten Sequenzen gerichtet und/oder kann durch Immunisierung mit diesen Peptiden erhalten werden.An antibody used according to the invention is preferably directed against one of the sequences shown in SEQ ID NO: 14-18, 80-84 or 101-116 of the sequence listing and / or can be obtained by immunization with these peptides.
Erfmdungsgemäß umfasst sind auch Polypeptide, die spezifisch an Tumor-assoziierte Antigene binden. Beispielsweise können solche Polypeptid-Bindestoffe durch degenerierte Peptid-Bibliotheken bereitgestellt werden, die einfach in Lösung in einer immobilisierten Form oder als Phagen-Display-Bibliotheken hergestellt werden können. Kombinatorische Bibliotheken aus Peptiden mit einer oder mehreren Aminosäuren können ebenfalls hergestellt werden. Ferner können Bibliotheken aus Peptoiden und nicht-peptidischen synthetischen Resten hergestellt werden.The invention also includes polypeptides that bind specifically to tumor-associated antigens. For example, such polypeptide binders can be provided by degenerate peptide libraries that can be easily prepared in solution in an immobilized form or as phage display libraries. Combinatorial libraries of peptides with one or more amino acids can also be made. Libraries can also be made from peptoids and non-peptide synthetic residues.
Phagen-Display kann besonders wirksam bei der Identifizierung erfindungsgemäßer Bindepeptide sein. Dabei wird beispielsweise eine Phagen-Bibliothek (durch Verwendung beispielsweise des ml 3-, fd- oder lambda-Phagen) hergestellt, die Inserts einer Länge von 4 bis etwa 80 Aminosäureresten präsentiert. Es werden sodann Phagen ausgewählt, die Inserts tragen, die an das Tumor-assoziierte Antigen binden. Dieser Prozess kann über mehrere Zyklen einer Rückselektion von Phagen wiederholt werden, die an das Tumor-assoziierte Antigen binden. Wiederholte Runden führen zu einer Anreicherung von Phagen, die bestimmte Sequenzen tragen. Es kann eine Analyse von DNA-Sequenzen erfolgen, um die Sequenzen der exprimierten Polypeptide zu identifizieren. Der kleinste lineare Anteil der Sequenz, der an das Tumor-assoziierte Antigen bindet, kann bestimmt werden. Das "two- hybrid-System" aus Hefe kann auch für die Identifizierung von Polypeptiden eingesetzt werden, die an ein Tumor-assoziiertes Antigen binden. Erfindungsgemäß beschriebene Tumor-assoziierte Antigene oder Fragmente davon können für ein Screening von Peptid- Bibliotheken, einschließlich Phagen-Display-Bibliotheken, eingesetzt werden, um Peptid- Bindepartner der Tumor-assoziierten Antigene zu identifizieren und selektieren. Solche Moleküle können beispielsweise für Screening-Assays, Aufreinigungsprotokolle, für eine Interferenz mit der Funktion des Tumor-assoziierten Antigens und für andere Zwecke, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden.Phage display can be particularly effective in identifying binding peptides according to the invention. For example, a phage library (using, for example, the ml 3, fd or lambda phage) is produced, which presents inserts with a length of 4 to about 80 amino acid residues. Phages are then selected which carry inserts that bind to the tumor associated antigen. This process can be repeated over several cycles of back-selection of phages that bind to the tumor-associated antigen. Repeated rounds lead to an accumulation of phages that carry certain sequences. DNA sequences can be analyzed to identify the sequences of the expressed polypeptides. The smallest linear portion of the sequence that binds to the tumor associated antigen can be determined. The "yeast two-hybrid system" can also be used to identify polypeptides that bind to a tumor-associated antigen. Tumor-associated antigens or fragments thereof described in accordance with the invention can be used for screening peptide libraries, including phage display libraries, to identify and select peptide binding partners of the tumor-associated antigens. Such molecules can be used, for example, for screening assays, purification protocols, for a Interference with the function of the tumor associated antigen and for other purposes known to those skilled in the art.
Die vorstehend beschriebenen Antiköφer und andere Bindemoleküle können beispielsweise für die Identifizierung von Gewebe verwendet werden, das ein Tumor-assoziiertes Antigen exprimiert. Antiköφer können auch an spezifische diagnostische Stoffe für eine Darstellung von Zellen und Geweben gekoppelt werden, die Tumor-assoziierte Antigene exprimieren. Sie können ferner an therapeutisch nützliche Stoffe gekoppelt werden. Diagnostische Stoffe umfassen in nicht begrenzender Weise Bariumsulfat, Iocetaminsäure, lopansäure, Calcium- Ipodat, Natrium-Diatrizoat, Meglumin-Diatrizoat, Metrizamid, Natrium-Tyropanoat und Radiodiagnostika, einschließlich Positronen-Emitter wie Fluorin-18 und Carbon-11, gamma- Emitter wie Iodin-123, Technitium-99m, Iod-131 und Indium-111, Nuklide für magnetische Kernresonanz wie Fluorin und Gadolinium. Der Begriff "therapeutisch nützlicher Stoff meint erfindungsgemäß jedes therapeutische Molekül, das wunschgemäß selektiv zu einer Zelle geführt wird, die ein oder mehrere Tumor-assoziierte Antigene exprimiert, einschließlich Antikrebsmittel, mit radioaktivem Iod versehene Verbindungen, Toxine, cytostatische oder cytolytische Arzneistoffe, usw. Antikrebsmittel umfassen beispielsweise Aminoglutethimid, Azathioprin, Bleomycinsulfat, Busulfan, Carmustin, Chlorambucil, Cisplatin, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Cytarabidin, Dacarbazin, Dactinomycin, Daunorubin, Doxorubicin, Taxol, Etoposid, Fluoruracil, Interferon-α, Lomustin, Mercaptopurin, Methotrexat, Mitotan, Procarbazin-HCl, Thioguanin, Vinblastinsulfat und Vincristinsulfat. Weitere Antikrebsmittel sind beispielsweise in Goodman und Gilman, "The Pharmacological Basis' of Therapeutics", 8. Auflage, 1990, McGraw-Hül, Inc., insbesondere Kapitel 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi und Bruce A. Chabner) beschrieben. Toxine können Proteine wie Pokeweed-antivirales Protein, Choleratoxin, Pertussistoxin, Ricin, Gelonin, Abrin, Diphtherie-Exotoxin oder Pseudomonas-Exotoxin sein. Toxinreste können auch Hochenergie-emittierende Radionuklide wie Kobalt-60 sein.The above-described antibodies and other binding molecules can be used, for example, for the identification of tissue which expresses a tumor-associated antigen. Antibodies can also be coupled to specific diagnostic agents for imaging cells and tissues that express tumor-associated antigens. They can also be coupled to therapeutically useful substances. Diagnostic agents include, but are not limited to, barium sulfate, iocetamic acid, lopanoic acid, calcium ipodate, sodium diatrizoate, meglumine diatrizoate, metrizamide, sodium tyropanoate and radiodiagnostics, including positron emitters such as fluorine-18 and carbon-11, gamma emitters such as Iodine-123, Technitium-99m, Iodine-131 and Indium-111, nuclear magnetic resonance nuclides such as fluorine and gadolinium. The term "therapeutically useful substance according to the invention means any therapeutic molecule which, if desired, is selectively guided to a cell which expresses one or more tumor-associated antigens, including anti-cancer agents, radioactive iodinated compounds, toxins, cytostatic or cytolytic drugs, etc. anti-cancer agents for example, aminoglutethimide, azathioprine, bleomycin sulfate, busulfan, carmustine, chlorambucil, cisplatin, cyclophosphamide, cyclosporine, Cytarabidin, dacarbazine, dactinomycin, Daunorubin, doxorubicin, taxol, etoposide, fluorouracil, interferon-α, lomustine, mercaptopurine, methotrexate, mitotane, Procarbazin- HCl, thioguanine, vinblastine sulfate and vincristine sulfate Other anticancer agents are described, for example, in Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis ' of Therapeutics", 8th edition, 1990, McGraw-Hull, Inc., in particular chapter 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner) Toxins k can be proteins such as pokeweed antiviral protein, cholera toxin, pertussis toxin, ricin, gelonin, abrin, diphtheria exotoxin or Pseudomonas exotoxin. Toxin residues can also be high energy emitting radionuclides such as cobalt-60.
Im Fall von TPTE (vgl. Beispiel 2) konnte erfindungsgemäß gezeigt werden, dass dieses nicht nur ein membranständiges Protein ist, sondern auch zu internalisieren vermag. Daher können die TPTE betreffenden erfingungsgemäß identifizierten Tumor-assoziierten Antigene selbst einem Transport von daran bindenden Substanzen, insbesondere den vorstehend beschriebenen therapeutischen Antiköφern, von der Membran ins Cytoplasma und somit einer Internalisierung dienen, wo diese Substanzen vorzugsweise ihre Wirkung wie eine zellzerstörende Wirkung entfalten können.In the case of TPTE (cf. Example 2) it was possible to show according to the invention that this is not only a membrane-bound protein, but is also capable of internalizing. Therefore, the TPTE-related tumor-associated antigens according to the invention can themselves transport substances binding to them, in particular the therapeutic antibodies described above, from the membrane into the cytoplasm and thus serve an internalization, where these substances can preferably develop their effect like a cell-destroying effect.
Der Begriff "Patient" bedeutet erfindungsgemäß Mensch, nicht menschlicher Primat oder ein anderes Tier, insbesondere Säugetier wie Kuh, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Hund, Katze oder Nagetier wie Maus und Ratte. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Patient ein Mensch.According to the invention, the term “patient” means human, not human primacy or another animal, in particular mammal such as cow, horse, pig, sheep, goat, dog, cat or rodent such as mouse and rat. In a particularly preferred embodiment, the patient is a human.
Der Begriff "Erkrankung" betrifft erfindungsgemäß jeden pathologischen Zustand, bei dem Tumor-assoziierte Antigene exprimiert oder abnormal exprimiert werden. „Abnormale Expression" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Expression gegenüber dem Zustand bei einem gesunden Individuum verändert, vorzugsweise erhöht ist. Eine Erhöhung der Expression betrifft eine Erhöhung um mindestens 10%, insbesondere mindestens 20%, mindestens 50% oder mindestens 100%). In einer Ausführungsform wird das Tumor- assoziierte Antigen nur in Gewebe eines erkrankten Individuums exprimiert, während die Expression bei einem gesunden Individuum reprimiert ist. Ein Beispiel einer solchen Erkrankung ist Krebs, insbesondere Seminome, Melanome, Teratome, Gliome, Kolorektal-, Brust-, Prostata-, Gebärmutter-, Ovarial-, und Lungenkrebs.According to the invention, the term “disease” relates to any pathological condition in which tumor-associated antigens are expressed or abnormally expressed. According to the invention, “abnormal expression” means that the expression is changed, preferably increased, compared to the condition in a healthy individual. An increase in expression relates to an increase of at least 10%, in particular at least 20%, at least 50% or at least 100%) In one embodiment, the tumor associated antigen is only expressed in tissue of a diseased individual while expression is repressed in a healthy individual, an example of such a disease is cancer, especially seminomas, melanomas, teratomas, gliomas, colorectal, breast, prostate -, uterine, ovarian, and lung cancer.
Eine biologische Probe kann erfindungsgemäß eine Gewebe- und/oder zelluläre Probe sein und kann für eine Verwendung in den verschiedenen, hier beschriebenen Verfahren in herkömmlicher Weise gewonnen werden, wie durch Gewebebiopsie, einschließlich Stanzbiopsie, und Entnahme von Blut, Bronchialaspirat, Urin, Fäces oder anderen Köφerflüssigkeiten.A biological sample may be a tissue and / or cellular sample in accordance with the invention and may be obtained for use in the various methods described herein in a conventional manner, such as by tissue biopsy, including punch biopsy, and by drawing blood, bronchial aspirate, urine, faeces or other body fluids.
Der Begriff "immunreaktive Zelle" bedeutet erfindungsgemäß eine Zelle, die in eine Immunzelle (wie B-Zelle, T-Helferzelle oder cytolytische T-Zelle) bei geeigneter Stimulierung reifen kann. Immunreaktive Zellen umfassen CD34+ hämatopoietische Stammzellen, unreife und reife T-Zellen sowie unreife und reife B-Zellen. Falls die Herstellung cytolytischer oder Helfer T-Zellen, die ein Tumor-assoziiertes Antigen erkennen, gewünscht ist, wird die immunreaktive Zelle mit einer Zelle, die ein Tumor-assoziiertes Antigen exprimiert, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Produktion, Differenzierung und/oder Selektion von cytolytischen sowie Helfer T-Zellen begünstigen. Die Differenzierung von T-Zell- Vorläufern in eine cytolytische T-Zelle bei einer Exposition gegenüber einem Antigen ist ähnlich zur klonalen Selektion des Immunsystems.According to the invention, the term “immunoreactive cell” means a cell which can mature into an immune cell (such as a B cell, T helper cell or cytolytic T cell) with suitable stimulation. Immunoreactive cells include CD34 + hematopoietic stem cells, immature and mature T cells, and immature and mature B cells. If the production of cytolytic or helper T cells recognizing a tumor associated antigen is desired, the immunoreactive cell is contacted with a cell expressing a tumor associated antigen under conditions that allow for production, differentiation and / or selection of cytolytic as well as helper T cells favor. The Differentiation of T cell precursors into a cytolytic T cell upon exposure to an antigen is similar to clonal selection of the immune system.
Manche therapeutische Verfahren beruhen auf einer Reaktion des Immunsystems eines Patienten, die zu einer Lyse Antigen-präsentierender Zellen führt, wie Krebszellen, die ein oder mehrere Tumor-assoziierte Antigene präsentieren. Dabei werden beispielsweise autologe cytotoxische T-Lymphozyten, die für einen Komplex aus einem Tumor-assoziierten Antigen und einem MHC-Molekül spezifisch sind, an einen Patienten mit einer Zellabnormalie verabreicht. Die Produktion solcher cytotoxischer T-Lymphozyten in vitro ist bekannt. Ein Beispiel für ein Verfahren zur Differenzierung von T-Zellen findet sich in der WO-A- 9633265. Im Allgemeinen wird eine Probe mit Zellen wie Blutzellen aus dem Patienten entnommen und die Zellen werden mit einer Zelle in Kontakt gebracht, die den Komplex präsentiert und eine Vermehrung von cytotoxischen T-Lymphozyten auslösen kann (z.B. dendritische Zellen). Die Zielzelle kann eine transfizierte Zelle wie eine COS -Zelle sein. Diese transfizierten Zellen präsentieren den gewünschten Komplex auf ihrer Oberfläche und stimulieren bei einer Kontaktierung mit cytotoxischen T-Lymphozyten deren Vermehrung. Die klonal expandierten autologen cytotoxischen T-Lymphozyten werden sodann an den Patienten verabreicht.Some therapeutic methods rely on a patient's immune system response that leads to lysis of antigen-presenting cells, such as cancer cells that present one or more tumor-associated antigens. For example, autologous cytotoxic T lymphocytes, which are specific for a complex of a tumor-associated antigen and an MHC molecule, are administered to a patient with a cell abnormality. The production of such cytotoxic T lymphocytes in vitro is known. An example of a method for differentiating T cells can be found in WO-A-9633265. In general, a sample with cells such as blood cells is taken from the patient and the cells are brought into contact with a cell which presents the complex and can trigger an increase in cytotoxic T-lymphocytes (eg dendritic cells). The target cell can be a transfected cell like a COS cell. These transfected cells present the desired complex on their surface and stimulate their proliferation when contacted with cytotoxic T lymphocytes. The clonally expanded autologous cytotoxic T lymphocytes are then administered to the patient.
Bei einem anderen Verfahren zur Selektion Antigen-spezifischer cytotoxischer T- Lymphozyten werden fluorogene Tetramere von MHC-Klasse I-Molekül/Peptid-Komplexen für einen Nachweis spezifischer Klone von cytotoxischen T-Lymphozyten verwendet (Altman et al, Science 274:94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol 8:413-416, 1998). Lösliche MHC-Klasse I-Moleküle werden in vitro in Gegenwart von ß2-Mikroglobulin und eines Peptid- Antigens, das an das Klasse I-Molekül bindet, gefaltet. Nach Aufreinigung der MHC/Peptid-Komplexe werden diese mit Biotin markiert. Tetramere werden durch Mischen der biotinylierten Peptid-MHC-Komplexe mit markiertem Avidin (z.B. Phycoerythrin) bei einem molaren Verhältnis von 4:1 gebildet. Tetramere werden sodann mit cytotoxischen T- Lymphozyten wie peripherem Blut oder Lymphknoten in Kontakt gebracht. Die Tetramere binden an cytotoxische T-Lymphozyten, die den Peptid- Antigen/MHC-Klasse I-Komplex erkennen. Zellen, die an die Tetramere gebunden werden, können durch Fluoreszenzgesteuerte Zellsortierung für eine Isolierung reaktiver cytotoxischer T-Lymphozyten sortiert werden. Die isolierten cytotoxischen T-Lymphozyten können sodann in vitro vermehrt werden. Bei einem therapeutischen Verfahren, das als adoptiver Transfer bezeichnet wird (Greenberg, J Immunol 136(5):1917, 1986; Riddel et al., Science 257:238, 1992; Lynch et al., Eur. J Immunol 21:1403-1410, 1991; Käst et al, Cell 59:603-614, 1989), werden Zellen, die den gewünschten Komplex präsentieren (z.B. dendritische Zellen) mit cytotoxischen T- Lymphozyten des zu behandelnden Patienten kombiniert, was zu einer Vermehrung spezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten führt. Die vermehrten cytotoxischen T- Lymphozyten werden sodann an einen Patienten mit einer zellulären Abnormalie verabreicht, die sich durch bestimmte abnormale Zellen auszeichnet, die den spezifischen Komplex präsentieren. Die cytotoxischen T-Lymphozyten lysieren sodann die abnormalen Zellen, wodurch eine gewünschte therapeutische Wirkung erreicht wird.Another method for selecting antigen-specific cytotoxic T lymphocytes uses fluorogenic tetramers of MHC class I molecule / peptide complexes for the detection of specific clones of cytotoxic T lymphocytes (Altman et al, Science 274: 94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol 8: 413-416, 1998). Soluble MHC class I molecules are folded in vitro in the presence of β 2 microglobulin and a peptide antigen that binds to the class I molecule. After the MHC / peptide complexes have been purified, they are labeled with biotin. Tetramers are formed by mixing the biotinylated peptide-MHC complexes with labeled avidin (eg phycoerythrin) at a molar ratio of 4: 1. Tetramers are then contacted with cytotoxic T lymphocytes such as peripheral blood or lymph nodes. The tetramers bind to cytotoxic T lymphocytes that recognize the peptide-antigen / MHC class I complex. Cells that bind to the tetramers can be sorted by fluorescence-controlled cell sorting for isolation of reactive cytotoxic T lymphocytes. The isolated cytotoxic T lymphocytes can then be grown in vitro. In a therapeutic process called adoptive transfer (Greenberg, J Immunol 136 (5): 1917, 1986; Riddel et al., Science 257: 238, 1992; Lynch et al., Eur. J Immunol 21: 1403- 1410, 1991; Käst et al, Cell 59: 603-614, 1989), cells which present the desired complex (eg dendritic cells) are combined with cytotoxic T lymphocytes of the patient to be treated, which leads to an increase in specific cytotoxic T Lymphocyte leads. The increased cytotoxic T lymphocytes are then administered to a patient with a cellular abnormality that is characterized by certain abnormal cells that present the specific complex. The cytotoxic T lymphocytes then lyse the abnormal cells, thereby achieving a desired therapeutic effect.
Oft lassen sich aus dem T-Zell-Repertoire eines Patienten lediglich niedrig-affine T-Zellen gegen einen solchen spezifischen Komplex vermehren, da die hochaffmen durch Toleranzentwicklung ausgelöscht worden sind. Eine Alternative kann hier ein Transfer des T- Zell-Rezeptors selbst sein. Hierfür werden ebenfalls Zellen, die den gewünschten Komplex präsentieren (z.B. dendritische Zellen) mit cytotoxischen T-Lymphozyten von Gesunden kombiniert. Dies führt zu einer Vermehrung hochaffiner spezifischer cytotoxischer T- Lymphozyten, wenn der Spender mit dem spezifischen Komplex bisher keinen Kontakt hatte. Der hochaffine T-Zell-Rezeptor aus diesen vermehrten spezifischen T-Lymphozyten wird kloniert und kann durch Gentransfer z.B. mit retroviralen Vektoren beliebig in T-Zellen von anderen Patienten transduziert werden. Adoptiver Transfer erfolgt dann mit diesen genetisch veränderten T-Lymphozyten (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2:962-70, 2001 ; Kessels et al, Nat Immunol. 2:957-61, 2001).Often, only a low affinity T cell against such a specific complex can be increased from a patient's T cell repertoire, since the high affinity cells have been erased by developing tolerance. An alternative here can be a transfer of the T cell receptor itself. For this purpose, cells that present the desired complex (e.g. dendritic cells) are also combined with cytotoxic T lymphocytes from healthy individuals. This leads to an increase in high-affinity specific cytotoxic T lymphocytes if the donor has not had any contact with the specific complex. The high affinity T cell receptor from these increased specific T lymphocytes is cloned and can be transferred by gene transfer e.g. with retroviral vectors can be transduced as desired in T cells from other patients. Adoptive transfer then takes place with these genetically modified T lymphocytes (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2: 962-70, 2001; Kessels et al, Nat Immunol. 2: 957-61, 2001).
Die vorstehenden therapeutischen Aspekte gehen davon aus, dass zumindest manche der abnormalen Zellen des Patienten einen Komplex aus einem Tumor-assoziierten Antigen und einem HLA-Molekül präsentieren. Eine Identifizierung solcher Zellen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Sobald Zellen, die den Komplex präsentieren, identifiziert wurden, können sie mit einer Probe aus dem Patienten, die cytotoxische T-Lymphozyten enthält, kombiniert werden. Falls die Zellen, die den Komplex präsentieren, durch die cytotoxischen T-Lymphozyten lysiert werden, kann angenommen werden, dass ein Tumor-assoziiertes Antigen präsentiert wird.The above therapeutic aspects assume that at least some of the patient's abnormal cells present a complex of a tumor-associated antigen and an HLA molecule. Such cells can be identified in a manner known per se. Once cells presenting the complex have been identified, they can be combined with a sample from the patient containing cytotoxic T lymphocytes. If the cells presenting the complex are lysed by the cytotoxic T lymphocytes, it can be assumed that a tumor-associated antigen is presented.
Der adoptive Transfer ist nicht die einzige Therapieform, die erfindungsgemäß anwendbar ist. Cytotoxische T-Lymphozyten können auch in vivo in an sich bekannter Weise erzeugt werden. Bei einem Verfahren werden nicht-proliferative Zellen verwendet, die den Komplex exprimieren. Die Zellen, die dabei verwendet werden, werden diejenigen sein, die normalerweise den Komplex exprimieren, wie bestrahlte Tumorzellen oder Zellen, die mit einem oder beiden Genen transfiziert wurden, die für eine Präsentation des Komplexes notwendig sind (d.h. das Antigene Peptid und das präsentierende HLA-Molekül). Verschiedene Zelltypen können eingesetzt werden. Des weiteren können Vektoren verwendet werden, die eines oder beide der interessierenden Gene tragen. Virale oder bakterielle Vektoren sind besonders bevorzugt. Zum Beispiel können Nukleinsäuren, die für ein Tumorassoziiertes Antigen oder einen Teil davon kodieren, funktionell mit Promotor- und Enhancersequenzen verknüpft werden, die eine Expression des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Fragments davon in bestimmten Geweben oder Zelltypen steuern. Die Nukleinsäure kann in einen Expressionsvektor eingebaut werden. Expressionsvektoren können nicht-modifizierte extrachromosomale Nukleinsäuren, Plasmide oder virale Genome sein, in die eine Insertion exogener Nukleinsäuren möglich ist. Nukleinsäuren, die für ein Tumor-assoziiertes Antigen kodieren, können auch in ein retrovirales Genom inseriert werden, wodurch die Integration der Nukleinsäure in das Genom des Zielgewebes oder der Zielzelle ermöglicht wird. Bei diesen Systemen trägt ein Mikroorganismus wie Vacciniavirus, Poxvirus, Heφes simplex- Virus, Retrovirus oder Adenovirus das interessierende Gen und "infiziert" de facto Wirtszellen. Eine weitere bevorzugte Form ist die Einbringung des tumor- assoziierten Antigenes in Form von rekombinanter RNA. Diese kann z.B. durch liposomalen Transfer oder durch Elektroporation in Zellen eingebracht werden. Die resultierenden Zellen präsentieren den interessierenden Komplex und werden von autologen cytotoxischen T- Lymphozyten erkannt, die sich sodann vermehren.The adoptive transfer is not the only form of therapy that can be used according to the invention. Cytotoxic T lymphocytes can also be generated in vivo in a manner known per se become. One method uses non-proliferative cells that express the complex. The cells used will be those that normally express the complex, such as irradiated tumor cells or cells that have been transfected with one or both of the genes necessary for presentation of the complex (ie, the antigen peptide and the presenting HLA -Molecule). Different cell types can be used. Vectors can also be used which carry one or both of the genes of interest. Viral or bacterial vectors are particularly preferred. For example, nucleic acids encoding a portion of a tumor-associated antigen can be operably linked to promoter and enhancer sequences that direct expression of the tumor-associated antigen or a fragment thereof in certain tissues or cell types. The nucleic acid can be incorporated into an expression vector. Expression vectors can be unmodified extrachromosomal nucleic acids, plasmids or viral genomes into which an insertion of exogenous nucleic acids is possible. Nucleic acids encoding a tumor associated antigen can also be inserted into a retroviral genome, thereby enabling the nucleic acid to be integrated into the genome of the target tissue or cell. In these systems, a microorganism such as vaccinia virus, pox virus, Heφes simplex virus, retrovirus or adenovirus carries the gene of interest and "infects" de facto host cells. Another preferred form is the introduction of the tumor-associated antigen in the form of recombinant RNA. This can be introduced into cells, for example, by liposomal transfer or by electroporation. The resulting cells present the complex of interest and are recognized by autologous cytotoxic T lymphocytes, which then multiply.
Eine ähnliche Wirkung kann durch Kombination des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Fragments davon mit einem Adjuvans erreicht werden, um einen Einbau in Antigen- präsentierende Zellen in vivo zu ermöglichen. Das tumor-assoziierte Antigen oder ein Fragment davon können als Protein, als DNA (z.B. innerhalb eines Vektors) oder als RNA repräsentiert sein. Das Tumor-assoziierte Antigen wird prozessiert, um einen Peptidpartner für das HLA-Molekül zu ergeben, während ein Fragment davon präsentiert werden kann, ohne dass eine weitere Prozessierung erforderlich ist. Letzteres ist insbesondere der Fall, wenn diese and HLA-Moleküle binden können. Verabreichungsformen, bei denen das Gesamt-Antigen in vivo von einer Dendritischen Zelle prozessiert wird, sind bevorzugt, da hier auch Helfer T-Zell- Antworten entstehen können. Eine effektive Immunantwort benötigt diese (Ossendoφ et al, Immunol Lett. 74:75-9, 2000; Ossendoφ et al, J Exp. Med. 187:693- 702, 1998). Im allgemeinen kann eine wirksame Menge des Tumor-assoziierten Antigens an einen Patienten z.B. durch eine intradermale Injektion verabreicht werden. Die Injektion kann aber auch intranodal in einen Lymphknoten erfolgen (Maloy et al, Proc Natl Acad Sei USA 98:3299-303, 2001). Sie kann auch in Kombination mit Reagenzien erfolgen, die eine Aufnahme in Dendritische Zellen erleichtern. Eine in vivo Bevorzugte Tumor-assoziierte Antigene umfassen diejenigen, die mit allogenen Krebs- Antiseren oder mit T-Zellen vieler Krebs-Patienten reagieren. Von besonderem Interesse sind aber auch solche, gegen die keine spontanen Immunantworten vorbestehen. Gegen diese können nachweislich Immunantworten induziert werden, die Tumoren lysieren können (Keogh et al, J Immunol 167:787-96, 2001; Appella et al, Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1:177-84, 1995; Wentworth et al, Mol Immunol. 32:603-12, 1995).A similar effect can be achieved by combining the tumor-associated antigen or a fragment thereof with an adjuvant in order to enable incorporation into antigen-presenting cells in vivo. The tumor-associated antigen or a fragment thereof can be represented as a protein, as DNA (eg within a vector) or as RNA. The tumor associated antigen is processed to give a peptide partner for the HLA molecule, while a fragment thereof can be presented without the need for further processing. The latter is particularly the case if they can bind to HLA molecules. Forms of administration in which the entire antigen is processed in vivo by a dendritic cell are preferred, since helper T cell responses can also arise here. An effective immune response is needed these (Ossendoφ et al, Immunol Lett. 74: 75-9, 2000; Ossendoφ et al, J Exp. Med. 187: 693-702, 1998). In general, an effective amount of the tumor-associated antigen can be administered to a patient, for example, by intradermal injection. However, the injection can also take place intranodally in a lymph node (Maloy et al, Proc Natl Acad Sei USA 98: 3299-303, 2001). It can also be used in combination with reagents that facilitate absorption into dendritic cells. An in vivo preferred tumor associated antigens include those that react with allogeneic cancer antisera or with T cells from many cancer patients. Of particular interest are those against which there are no spontaneous immune responses. Immune responses to these can be demonstrably induced, which can lyse tumors (Keogh et al, J Immunol 167: 787-96, 2001; Appella et al, Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1: 177-84, 1995; Wentworth et al, Mol Immunol 32: 603-12, 1995).
Die erfindungsgemäß beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch als Vacccinen für die Immunisierung eingesetzt werden. Die Begriffe "Immunisierung" oder "Vaccinierung" bedeuten erfindungsgemäß eine Erhöhung oder Aktivierung einer Immunreaktion gegenüber einem Antigen. Tiermodelle können für ein Testen einer immunisierenden Wirkung gegenüber Krebs durch Verwendung eines Tumor-assoziierten Antigens oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure eingesetzt werden. Zum Beispiel können menschhche Krebszellen in eine Maus für die Schaffung eines Tumors eingebracht werden und eine oder mehrere Nukleinsäuren, die für Tumor-assoziierte Antigene kodieren, können verabreicht werden. Die Wirkung auf die Krebszellen (beispielsweise Verringerung der Tumorgröße) kann als Maß für die Wirksamkeit einer Immunisierung durch die Nukleinsäure gemessen werden.The pharmaceutical compositions described according to the invention can also be used as vaccines for the immunization. According to the invention, the terms “immunization” or “vaccination” mean an increase or activation of an immune response to an antigen. Animal models can be used to test an immunizing effect against cancer by using a tumor-associated antigen or a nucleic acid coding therefor. For example, human cancer cells can be placed in a mouse to create a tumor, and one or more nucleic acids encoding tumor-associated antigens can be administered. The effect on cancer cells (e.g. reduction in tumor size) can be measured as a measure of the effectiveness of immunization by the nucleic acid.
Als Teil der Zusammensetzung für eine Immunisierung werden eines oder mehrere Tumorassoziierte Antigene oder stimulierende Fragmente davon mit einem oder mehreren Adjuvanzien für eine Induktion einer Immunreaktion oder eine Erhöhung einer Immunreaktion verabreicht. Ein Adjuvans ist eine Substanz, die in das Antigen eingebaut oder gemeinsam mit diesem verabreicht wird und die Immunreaktion verstärkt. Adjuvanzien können die Immunreaktion durch Bereitstellen eines Antigen-Reservoirs (extrazellulär oder in Makrophagen), Aktivierung von Makrophagen und Stimulierung bestimmter Lymphozyten verstärken. Adjuvanzien sind bekannt und umfassen in nicht begrenzender Weise Monophosphoryl-Lipid-A (MPL, SmithKline Beecham), Saponine wie QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 und QS-Ll (So et al, Mol. Cells 7:178-186, 1997), unvollständiges Freundsches Adjuvans, vollständiges Feundsches Adjuvans, Vitamin E, Montanid, Alaun, CpG-Oligonukleotide (vgl. Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995) und verschiedene Wasser-in-Öl-Emulsionen, die aus biologisch abbaubaren Ölen wie Squalen und/oder Tocopherol hergestellt werden. Vorzugsweise werden die Peptide in einer Mischung mit DQS21/MPL verabreicht. Das Verhältnis von DQS21 zu MPL beträgt typischerweise etwa 1:10 bis 10:1, vorzugsweise etwa 1:5 bis 5:1 und insbesondere etwa 1:1. Für eine Verabreichung an den Menschen sind DQS21 und MPL typischerweise in einer Vaccine-Formulierung in einem Bereich von etwa 1 μg bis etwa 100 μg vorhanden.As part of the composition for immunization, one or more tumor-associated antigens or stimulating fragments thereof with one or more adjuvants for inducing an immune response or increasing an immune response are administered. An adjuvant is a substance that is incorporated into, or co-administered with, the antigen that enhances the immune response. Adjuvants can enhance the immune response by providing an antigen reservoir (extracellular or in macrophages), activating macrophages and stimulating certain lymphocytes. Adjuvants are known and include, but are not limited to, monophosphoryl lipid-A (MPL, SmithKline Beecham), saponins such as QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 and QS-Ll (So et al, Mol. Cells 7: 178-186, 1997), incomplete Freund's adjuvant, complete Feundsch adjuvant, vitamin E. , Montanide, alum, CpG oligonucleotides (see Kreig et al., Nature 374: 546-9, 1995) and various water-in-oil emulsions which are produced from biodegradable oils such as squalene and / or tocopherol. The peptides are preferably administered in a mixture with DQS21 / MPL. The ratio of DQS21 to MPL is typically about 1:10 to 10: 1, preferably about 1: 5 to 5: 1 and in particular about 1: 1. For human administration, DQS21 and MPL are typically present in a vaccine formulation in a range from about 1 µg to about 100 µg.
Andere Stoffe, die eine Immunreaktion des Patienten stimulieren, können auch verabreicht werden. Zum Beispiel sind Cytokine bei einer Vaccinierung aufgrund ihrer regulatorischen Eigenschaften auf Lymphozyten verwendbar. Solche Cytokine umfassen z.B. Interleukin-12 (IL-12), von dem gezeigt wurde, dass es die schützenden Wirkungen von Vaccinen verstärkt (vgl. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF und IL-18.Other substances that stimulate a patient's immune response can also be administered. For example, cytokines can be used in vaccination due to their regulatory properties on lymphocytes. Such cytokines include e.g. Interleukin-12 (IL-12), which has been shown to enhance the protective effects of vaccines (see Science 268: 1432-1434, 1995), GM-CSF and IL-18.
Es gibt eine Reihe von Verbindungen, die eine Immunreaktion verstärken und die daher bei einer Vaccinierung eingesetzt werden können. Diese umfassen co-stimulierende Moleküle, die in Form von Proteinen oder Nukleinsäuren bereitgestellt werden. Solche co- stimulierenden Moleküle sind beispielsweise B7-1 und B7-2 (CD80 bzw. CD86), die auf dendritischen Zellen (DC) exprimiert werden und mit dem auf den T-Zellen exprimierten CD28-Molekül interagieren. Diese Interaktion stellt eine Co-Stimulierung (Signal 2) für eine Antigen/MHC/TCR-stimulierte (Signal 1) T-Zelle bereit, wodurch die Vermehrung der T- Zelle und die Effektorfunktion verstärkt wird. B7 interagiert auch mit CTLA4 (CD 152) auf T- Zellen und Untersuchungen, die CTLA4- und B7-Liganden einbeziehen, zeigen, dass die B7- CTLA4-Interaktion eine Antitumor-Immunität und CTL- Vermehrung verstärken kann (Zheng, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(11):6284-6289 (1998)).There are a number of compounds that enhance an immune response and can therefore be used in vaccination. These include co-stimulating molecules that are provided in the form of proteins or nucleic acids. Such stimulating molecules are, for example, B7-1 and B7-2 (CD80 and CD86), respectively, which are expressed on dendritic cells (DC) and interact with the CD28 molecule expressed on the T cells. This interaction provides co-stimulation (signal 2) for an antigen / MHC / TCR-stimulated (signal 1) T cell, thereby enhancing T cell proliferation and effector function. B7 also interacts with CTLA4 (CD 152) on T cells and studies involving CTLA4 and B7 ligands show that the B7-CTLA4 interaction can enhance anti-tumor immunity and CTL proliferation (Zheng, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11): 6284-6289 (1998)).
B7 wird typischerweise nicht auf Tumorzellen exprimiert, so dass diese keine wirksamen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) für T-Zellen sind. Eine Induktion der B7-Expression würde ermöglichen, dass Tumorzellen wirksamer eine Vermehrung von cytotoxischen T- Lymphozyten und eine Effektorfunktion stimulieren. Eine Co-Stimulierung durch eine Kombination von B7/IL-6/IL-12 zeigte eine Induktion des IFN-gamma- und Thl-Cytokin- Profils in einer T-Zell-Population, was zu einer weiter verstärkten T-Zell-Aktivität f hrt (Gajewski et al, J. Immunol 154:5637-5648 (1995)).B7 is typically not expressed on tumor cells, so they are not effective antigen presenting cells (APCs) for T cells. Induction of B7 expression would allow tumor cells to more effectively stimulate cytotoxic T lymphocyte proliferation and effector function. Co-stimulation by a combination of B7 / IL-6 / IL-12 showed induction of IFN-gamma- and Thl-cytokine Profiles in a T cell population, which leads to a further increased T cell activity (Gajewski et al, J. Immunol 154: 5637-5648 (1995)).
Eine vollständige Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphozyten und eine vollständige Effektorfunktion erfordert eine Mitwirkung von T-Helferzellen durch die Interaktion zwischen dem CD40-Liganden auf den T-Helferzellen und dem CD40-Molekül, das von dendritischen Zellen exprimiert wird (Ridge et al., Nature 393:474 (1998), Bennett et al, Nature 393:478 (1998), Schönberger et al, Nature 393:480 (1998)). Der Mechanismus dieses co-stimulierenden Signals betrifft wahrscheinlich die Steigerung der B7- und assoziierten IL- 6/IL-12-Produktion durch die dendritischen Zellen (Antigen-präsentierenden Zellen). Die CD40-CD40L-Interaktion komplementiert so die Interaktionen des Signals 1 (Antigen/MHC- TCR) und des Signals 2 (B7-CD28).Complete activation of cytotoxic T lymphocytes and full effector function requires participation of T helper cells through the interaction between the CD40 ligand on the T helper cells and the CD40 molecule expressed by dendritic cells (Ridge et al., Nature 393: 474 (1998), Bennett et al, Nature 393: 478 (1998), Schönberger et al, Nature 393: 480 (1998)). The mechanism of this co-stimulating signal is probably related to the increase in B7 and associated IL-6 / IL-12 production by the dendritic cells (antigen presenting cells). The CD40-CD40L interaction thus complements the interactions of signal 1 (antigen / MHC-TCR) and signal 2 (B7-CD28).
Die Verwendung von anti-CD40-Antiköφern für eine Stimulierung von dendritischen Zellen würde erwartungsgemäß direkt eine Reaktion gegenüber Tumor- Antigenen verstärken, die normalerweise außerhalb des Bereichs einer entzündlichen Reaktion liegen oder von nichtprofessionellen Antigen-präsentierenden Zellen (Tumorzellen) präsentiert werden. In diesen Situationen werden T-Helfer- und B7-co-stimulierende Signale nicht bereitgestellt. Dieser Mechanismus könnte im Zusammenhang mit Therapien verwendet werden, die auf Antigen- gepulsten dendritischen Zellen basieren, oder in Situationen, bei denen T-Helfer-Epitope nicht in bekannten TRA-Vorläufern definiert wurden.The use of anti-CD40 antibodies for stimulation of dendritic cells would, as expected, directly increase a response to tumor antigens that are normally outside the range of an inflammatory response or are presented by non-professional antigen presenting cells (tumor cells). In these situations, T helper and B7 co-stimulating signals are not provided. This mechanism could be used in conjunction with therapies based on antigen-pulsed dendritic cells or in situations where T helper epitopes were not defined in known TRA precursors.
Erfindungsgemäß vorgesehen ist auch eine Verabreichung von Nukleinsäuren, Polypeptiden oder Peptiden. Eine Verabreichung von Polypeptiden und Peptiden kann in an sich bekannter Weise erfolgen. In einer Ausführungsform erfolgt die Verabreichung von Nukleinsäuren durch ex vzvo-Verfahren, d.h. durch Entfernung von Zellen aus einem Patienten, genetische Veränderung der Zellen, um ein Tumor-assoziiertes Antigen einzubauen, und Wiedereinbringung der veränderten Zellen in den Patienten. Dies umfasst im Allgemeinen das Einbringen einer funktioneilen Kopie eines Gens in die Zellen eines Patienten in vitro und die Rückführung der genetisch veränderten Zellen in den Patienten. Die funktioneile Kopie desAdministration of nucleic acids, polypeptides or peptides is also provided according to the invention. Polypeptides and peptides can be administered in a manner known per se. In one embodiment, nucleic acids are administered by ex vzvo methods, i.e. by removing cells from a patient, genetically altering the cells to incorporate a tumor-associated antigen, and reintroducing the altered cells into the patient. This generally involves inserting a functional copy of a gene into a patient's cells in vitro and returning the genetically modified cells to the patient. The functional copy of the
Gens steht unter fuhktioneller Kontrolle von regulatorischen Elementen, die eine Expression des Gens in den genetisch veränderten Zellen erlauben. Transfektions- und Transduktionsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Erfindungsgemäß vorgesehen ist auch eine Verabreichung von Nukleinsäuren in vivo durch die Verwendung von Vektoren wie Viren und zielgesteuerten Liposomen.The gene is under functional control of regulatory elements that allow expression of the gene in the genetically modified cells. Transfection and transduction methods are known to the person skilled in the art. It is also provided according to the invention administration of nucleic acids in vivo through the use of vectors such as viruses and targeted liposomes.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist ein viraler Vektor für die Verabreichung einer Nukleinsäure, die für ein Tumor-assoziiertes Antigen kodiert, aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus Adenoviren, Adeno-assoziierten Viren, Poxviren, einschließlich Vacciniavirus und attenuierten Poxviren, Semliki-Forest- Virus, Retroviren, Sindbis- Virus und Ty- Virusähnlichen Partikeln. Besonders bevorzugt sind Adenoviren und Retroviren. Die Retroviren sind üblicherweise replikationsdefizient (d.h. sie sind unfähig, infektiöse Partikel zu erzeugen).In a preferred embodiment, a viral vector for the administration of a nucleic acid encoding a tumor-associated antigen is selected from the group consisting of adenoviruses, adeno-associated viruses, poxviruses, including vaccinia virus and attenuated poxviruses, Semliki Forest virus, Retroviruses, Sindbis virus and Ty virus-like particles. Adenoviruses and retroviruses are particularly preferred. The retroviruses are usually replication-deficient (i.e. they are unable to produce infectious particles).
Verschiedene Verfahren können eingesetzt werden, um erfmdungsgemäß Nukleinsäuren in Zellen in vitro oder in vivo einzubringen. Solche Verfahren umfassen die Transfektion von Nukleinsäure-CaPO4-Präzipitaten, die Transfektion von Nukleinsäuren, die mit DEAE assoziiert sind, die Transfektion oder Infektion mit den vorstehenden Viren, die die interessierenden Nukleinsäuren tragen, die Liposomen-vermittelte Transfektion und ähnliches. In bestimmten Ausführungsformen ist eine Steuerung der Nukleinsäure an bestimmte Zellen bevorzugt. In solchen Ausführungsformen kann ein Träger, der für die Verabreichung einer Nukleinsäure an eine Zelle (z.B. ein Retrovirus oder ein Liposom) eingesetzt wird, ein gebundenes Zielsteuerungsmolekül aufweisen. Zum Beispiel kann ein Molekül wie ein Antiköφer, der für ein Oberflächenmembran-Protein auf der Zielzelle spezifisch ist, oder ein Ligand für einen Rezeptor auf der Zielzelle in den Nukleinsäureträger eingebaut oder daran gebunden werden. Bevorzugte Antiköφer umfassen Antiköφer, die selektiv ein Tumor-assoziiertes Antigen binden. Falls eine Verabreichung einer Nukleinsäure durch Liposomen erwünscht ist, können Proteine, die an ein Oberflächenmembran-Protein binden, das mit der Endozytose assoziiert ist, in die Liposomenformulierung eingebaut werden, um eine Zielsteuerung und/oder Aufnahme zu ermöglichen. Solche Proteine umfassen Kapsid-Proteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, Antiköφer gegen Proteine, die internalisiert werden, Proteine, die eine intrazelluläre Stelle ansteuern und ähnliches.Various methods can be used to introduce nucleic acids into cells according to the invention in vitro or in vivo. Such methods include transfection of nucleic acid CaPO 4 precipitates, transfection of nucleic acids associated with DEAE, transfection or infection with the above viruses that carry the nucleic acids of interest, liposome-mediated transfection, and the like. In certain embodiments, control of the nucleic acid to certain cells is preferred. In such embodiments, a carrier used to deliver a nucleic acid to a cell (e.g., a retrovirus or a liposome) can have a bound targeting molecule. For example, a molecule such as an antibody that is specific for a surface membrane protein on the target cell or a ligand for a receptor on the target cell can be incorporated into or bound to the nucleic acid carrier. Preferred antibodies include antibodies that selectively bind a tumor-associated antigen. If administration of a nucleic acid by liposomes is desired, proteins that bind to a surface membrane protein associated with endocytosis can be incorporated into the liposome formulation to allow targeting and / or uptake. Such proteins include capsid proteins or fragments thereof that are specific to a particular cell type, antibodies to proteins that are internalized, proteins that target an intracellular site, and the like.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen können in pharmazeutisch verträglichen Zubereitungen verabreicht werden. Solche Zubereitungen können gewöhnlich pharmazeutisch verträgliche Konzentrationen von Salzen, Pufferstoffen, Konservierungsstoffen, Trägern, ergänzenden immunitätssteigernden Stoffen wie Adjuvanzien, CpG und Cytokine und gegebenenfalls andere therapeutische Wirkstoffe enthalten.The therapeutic compositions according to the invention can be administered in pharmaceutically acceptable preparations. Such preparations can usually be pharmaceutically acceptable concentrations of salts, buffer substances, Preservatives, carriers, supplementary immunity-enhancing substances such as adjuvants, CpG and cytokines and possibly other therapeutic agents.
Die erfmdungsgemäßen therapeutischen Wirkstoffe können auf jedem herkömmlichen Weg verabreicht werden, einschließlich durch Injektion oder durch Infusion. Die Verabreichung kann beispielsweise oral, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan oder transdermal erfolgen. Eine therapeutische Verabreichung von Antiköφern erfolgt vorzugsweise durch ein Lungenaerosol. Die Verabreichung von Antisense-Nukleinsäuren erfolgt vorzugsweise durch langsame intravenöse Verabreichung.The therapeutic agents of the invention can be administered by any conventional route, including by injection or infusion. The administration can take place, for example, orally, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously or transdermally. Therapeutic administration of antibodies is preferably carried out through a pulmonary aerosol. Antisense nucleic acids are preferably administered by slow intravenous administration.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine "wirksame Menge" betrifft die Menge, die alleine oder zusammen mit weiteren Dosen eine gewünschte Reaktion oder eine gewünschte Wirkung erzielt. Im Fall einer Behandlung einer bestimmten Erkrankung oder eines bestimmten Zustands, der sich durch die Expression eines oder mehrerer Tumor-assoziierter Antigene auszeichnet, betrifft die gewünschte Reaktion die Hemmung des Krankheitsverlaufs. Dies umfasst die Verlangsamung des Fortschreitens der Erkrankung und insbesondere eine Unterbrechung des Fortschreitens der Erkrankung. Die gewünschte Reaktion bei einer Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands kann auch die Verzögerung des Ausbruchs oder eine Verhinderung des Ausbruchs der Krankheit oder des Zustands sein.The compositions of the invention are administered in effective amounts. An "effective amount" refers to the amount that achieves a desired reaction or effect, alone or together with further doses. In the case of treatment of a specific disease or condition, which is characterized by the expression of one or more tumor-associated antigens, the desired reaction relates to the inhibition of the course of the disease. This includes slowing the progression of the disease and, in particular, stopping the progression of the disease. The desired response in treating a disease or condition may also be to delay the onset or prevent the onset of the disease or condition.
Eine wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird von dem zu behandelnden Zustand, der Schwere der Krankheit, den individuellen Parametern des Patienten, einschließlich Alter, physiologischer Zustand, Größe und Gewicht, der Dauer derAn effective amount of a composition according to the invention will depend on the condition to be treated, the severity of the disease, the individual parameters of the patient, including age, physiological condition, height and weight, the duration of the
Behandlung, der Art einer begleitenden Therapie (falls vorhanden), dem spezifischen Verabreichungsweg und ähnlichen Faktoren abhängen.Treatment, the type of concomitant therapy (if any), the specific route of administration and similar factors.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind vorzugsweise steril und enthalten eine wirksame Menge der therapeutisch wirksamen Substanz für die Erzeugung der gewünschten Reaktion oder der gewünschten Wirkung.The pharmaceutical compositions according to the invention are preferably sterile and contain an effective amount of the therapeutically active substance for producing the desired reaction or the desired effect.
Die Dosen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die verabreicht werden, können von verschiedenen Parametern wie der Verabreichungsart, dem Zustand des Patienten, dem gewünschten Verabreichungszeitraum, usw. abhängen. Für den Fall, dass eine Reaktion bei einem Patienten bei einer anfänglichen Dosis unzureichend ist, können höhere Dosen (oder effektiv höhere Dosen, die durch einen anderen, stärker lokalisierten Verabreichungsweg erzielt werden) eingesetzt werden.The doses of the compositions according to the invention which are administered can vary from various parameters such as the mode of administration, the condition of the patient, the depending on the desired administration period, etc. In the event that a patient's response to an initial dose is inadequate, higher doses (or effectively higher doses obtained by another, more localized route of administration) can be used.
Im Allgemeinen werden für eine Behandlung oder für eine Erzeugung oder Erhöhung einer Immunreaktion Dosen des Tumor-assoziierten Antigens von 1 ng bis 1 mg, vorzugsweise von 10 ng bis 100 μg formuliert und verabreicht. Falls die Verabreichung von Nukleinsäuren (DNA sowie RNA), die für Tumor-assoziierte Antigene kodieren, erwünscht ist, werden Dosen von 1 ng bis 0,1 mg formuliert und verabreicht.In general, doses of the tumor-associated antigen from 1 ng to 1 mg, preferably from 10 ng to 100 μg, are formulated and administered for treatment or for generating or increasing an immune response. If the administration of nucleic acids (DNA and RNA) which code for tumor-associated antigens is desired, doses of 1 ng to 0.1 mg are formulated and administered.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in pharmazeutisch verträglichen Mengen und in pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzungen verabreicht. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" betrifft ein nicht- toxisches Material, das nicht mit der Wirkung des aktiven Bestandteils der pharmazeutischen Zusammensetzung wechselwirkt. Solche Zubereitungen können gewöhnlich Salze, Pufferstoffe, Konservierungsstoffe, Träger und gegebenenfalls andere therapeutische Wirkstoffe enthalten. Bei einer Verwendung in der Medizin sollten die Salze pharmazeutisch verträglich sein. Nicht-pharmazeutisch verträgliche Salze können jedoch für die Herstellung pharmazeutisch verträglicher Salze davon verwendet werden und sind erfindungsgemäß umfasst. Solche pharmakologisch und pharmazeutisch verträglichen Salze umfassen in nicht begrenzender Weise diejenigen, die aus den nachstehenden Säuren hergestellt werden: Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Phosphor-, Malein-, Essig-, Salicyl-, Citronen-, Ameisen-, Malon-, Bernsteinsäure und ähnliches. Pharmazeutisch verträgliche Salze können auch als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze wie Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze hergestellt werden.The pharmaceutical compositions according to the invention are generally administered in pharmaceutically acceptable amounts and in pharmaceutically acceptable compositions. The term "pharmaceutically acceptable" refers to a non-toxic material that does not interfere with the action of the active ingredient in the pharmaceutical composition. Such preparations can usually contain salts, buffering agents, preservatives, carriers and optionally other therapeutic agents. When used in medicine, the salts should be pharmaceutically acceptable. However, non-pharmaceutically acceptable salts can be used for the production of pharmaceutically acceptable salts thereof and are included according to the invention. Such pharmacologically and pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, those made from the following acids: hydrogen chloride, hydrogen bromide, sulfur, saltpetre, phosphorus, maleic, vinegar, salicyl, lemon, ants , Malonic, succinic acid and the like. Pharmaceutically acceptable salts can also be prepared as alkali metal or alkaline earth metal salts such as sodium, potassium or calcium salts.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Der Begriff "pharmazeutisch verträglicher Träger" betrifft erfmdungsgemäß einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder Kapselsubstanzen, die für eine Verabreichung an einen Menschen geeignet sind. Der Begriff "Träger" betrifft einen organischen oder anorganischen Bestandteil, natürlicher oder synthetischer Natur, in dem der aktive Bestandteil kombiniert wird, um eine Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sind gewöhnlich derart, dass keine Interaktion auftritt, die die gewünschte pharmazeutische Wirksamkeit wesentlich beeinträchtigt.A pharmaceutical composition according to the invention can comprise a pharmaceutically acceptable carrier. According to the invention, the term “pharmaceutically acceptable carrier” relates to one or more compatible solid or liquid fillers, diluents or capsule substances which are suitable for administration to a human. The term "carrier" refers to an organic or inorganic ingredient, natural or synthetic, in which the active ingredient is combined to facilitate application. The components of the pharmaceutical according to the invention Compositions are usually such that there is no interaction that significantly affects the desired pharmaceutical efficacy.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können geeignete Pufferstoffe wie Essigsäure in einem Salz, Citronensäure in einem Salz, Borsäure in einem Salz und Phosphorsäure in einem Salz enthalten.The pharmaceutical compositions according to the invention can contain suitable buffer substances such as acetic acid in a salt, citric acid in a salt, boric acid in a salt and phosphoric acid in a salt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch gegebenenfalls geeignete Konservierungsstoffe wie Benzalkoniumchlorid, Chlorbutanol, Parabene und Thimerosal enthalten.The pharmaceutical compositions can also optionally contain suitable preservatives such as benzalkonium chloride, chlorobutanol, parabens and thimerosal.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden gewöhnlich in einer einheitlichen Dosisform dargeboten und können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können beispielsweise in Form von Kapseln, Tabletten, Lutschpastillen, Suspensionen, Sirupen, Elixieren oder als Emulsion vorliegen.The pharmaceutical compositions are usually presented in a unitary dosage form and can be prepared in a manner known per se. Pharmaceutical compositions according to the invention can be present, for example, in the form of capsules, tablets, lozenges, suspensions, syrups, elixirs or as an emulsion.
Zusammensetzungen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen gewöhnlich eine sterile wässrige oder nicht-wässrige Zubereitung des Wirkstoffs, die vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Verträgliche Träger und Lösungsmittel sind beispielsweise Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden gewöhnlich sterile, fixierte Öle als Lösungs- oder Suspensionsmedium eingesetzt.Compositions suitable for parenteral administration usually comprise a sterile aqueous or non-aqueous preparation of the active ingredient, which is preferably isotonic with the blood of the recipient. Compatible carriers and solvents are, for example, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile, fixed oils are usually used as the solution or suspension medium.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Abbildungen und Beispiele ausführlich beschrieben, die ausschließlich der Erläuterung dienen und nicht begrenzend zu verstehen sind. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung und der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die ebenfalls erfindungsgemäß umfasst sind. Abbildungen:The present invention is described in detail by the following figures and examples, which serve only for illustration and are not to be understood as limiting. Based on the description and the examples, the person skilled in the art can access further embodiments, which are likewise encompassed according to the invention. pictures:
Abb. 1: Schematische Darstellung der Klonierung von eCT. Die Strategie umfasst die Identifizierung von Kandidaten-Genen (GOI = „Genes of interest") in Datenbanken und das Testen dieser Gene durch RT-PCR.Fig. 1: Schematic representation of the cloning of eCT. The strategy includes the identification of candidate genes (GOI = "Genes of interest") in databases and the testing of these genes by RT-PCR.
Abb. 2: Splicing von LDH C. Alternative Splicingereignisse führen zum Fehlen von Exon 3 (SEQ ID NO:2), der beiden Exons 3 und 4 (SEQ ID NO:3), der Exons 3, 6 und 7 (SEQ ID NO:4) bzw. von Exon 7 (SEQ ID NO:5). ORF = Offener Leserahmen, aa = Aminosäure.Fig. 2: Splicing of LDH C. Alternative splicing events lead to the absence of exon 3 (SEQ ID NO: 2), the two exons 3 and 4 (SEQ ID NO: 3), exons 3, 6 and 7 (SEQ ID NO : 4) or exon 7 (SEQ ID NO: 5). ORF = open reading frame, aa = amino acid.
Abb. 3: Alignment von möglichen LDH-C-Proteinen. SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:10 stellen frankierte Anteile des Prototyp-Proteins (SEQ ID NO: 6) dar. Die Proteinsequenzen von SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:l l, SEQ ID NO:12 und SEQ ID NO:13 sind zusätzlich verändert und beinhalten ausschließlich Tumor-spezifische Epitope (fett gedruckt). Das katalytische Zentrum ist gerahmt.Fig. 3: Alignment of possible LDH-C proteins. SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 represent franked portions of the prototype protein (SEQ ID NO: 6). The protein sequences of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: II, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 have also been changed and only contain tumor-specific epitopes (printed in bold). The catalytic center is framed.
Abb. 4: Quantifizierung von LDH C in verschiedenen Geweben durch Real-Time-PCR.Fig. 4: Quantification of LDH C in different tissues by real-time PCR.
Es wurden keine Transkripte in Normalgeweben außer Testis, allerdings signifikante Expressionslevel in Tumoren nachgewiesen.No transcripts were found in normal tissues other than testis, but significant expression levels in tumors were detected.
Abb. 5: Exon-Zusammensetzung von TPTE-Varianten. Erfindungsgemäß wurden Splicevarianten identifiziert (SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57), die in testikulärem Gewebe und Tumoren exprimiert werden und Leserasterverschiebungen und somit veränderte Sequenzbereiche aufweisen.Fig. 5: Exon composition of TPTE variants. According to the invention, splice variants were identified (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57), which are expressed in testicular tissue and tumors and have reading frame shifts and thus changed sequence areas.
Abb. 6: Alignment der möglichen TPTE-Proteine. Alternative Splicing-Ereignisse resultieren in Veränderungen des kodierten Proteins, wobei das Leseraster grundsätzlich erhalten bleibt. Die putativen transmembrandomänen sind fettgedruckt, die katalytische Domäne ist eingerahmt.Fig. 6: Alignment of the possible TPTE proteins. Alternative splicing events result in changes in the encoded protein, whereby the reading frame is basically preserved. The putative transmembrane domains are in bold, the catalytic domain is framed.
Abb. 7: Alignment von TSBP- Varianten auf Nukleotidebene. Die Unterschiede in den Nukleotidsequenzen der erfindungsgemäß aufgefundenen TSBP- Varianten (SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33) zu der bekannten Sequenz (NM_006781, SEQ ID NO:29) sind fett gedruckt.Fig. 7: Alignment of TSBP variants at the nucleotide level. The differences in the nucleotide sequences of the TSBP variants found according to the invention (SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33) for the known sequence (NM_006781, SEQ ID NO: 29) are printed in bold.
Abb. 8: Alignment von TSBP-Varianten auf Proteinebene. Leserasterverschiebungen führen bei den Proteinen, die durch die erfindungsgemäß aufgefundenen TSBP-Varianten kodiert werden (SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36), zu substantiellen Unterschieden zu dem vorbeschriebenen Protein (SEQ ID NO:30, NM_006781) und sind durch Fettdruck gekennzeichnet.Fig. 8: Alignment of TSBP variants at the protein level. Reading frame shifts in the proteins which are encoded by the TSBP variants found according to the invention (SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36) lead to substantial differences from the protein described above (SEQ ID NO: 30, NM_006781) and are marked in bold.
Abb. 9: RT-PCR für MS4A12. In den getesteten Geweben konnte eine Expression nur in Testis, Kolon und kolorektalen Karzinomen (Kolon-Ca's) nachgewiesen werden. Von den gezeigten 6 Lebergewebsproben wurde in einer ein positiver Nachweis für MS4A12 geführt, da diese infiltriert ist durch eine Metastase eines Kolonkarzinoms. Spätere Untersuchungen zeigten auch eine deutliche Expression In Kolonkarzinim-MetastasenFig. 9: RT-PCR for MS4A12. In the tissues tested, expression could only be detected in testis, colon and colorectal carcinoma (colon ca's). Of the 6 liver tissue samples shown, one was positive for MS4A12, since it is infiltrated by a metastasis from a colon carcinoma. Later examinations also showed clear expression in colon carcinoma metastases
Abb. 10: RT-PCR für BRCO1. In Brusttumoren ist BRCO1 im Vergleich zu der Expression in normalem Brustdrüsengewebe deutlich überexprimiert.Fig. 10: RT-PCR for BRCO1. BRCO1 is significantly overexpressed in breast tumors compared to expression in normal mammary gland tissue.
Abb 11: RT-PCR für MORC, TPX1, LDHC, SGY-1. Untersuchung verschiedener Normalgewebe zeigt Expression lediglich in Testis (1 Haut, 2 Dünndarm, 3 Kolon, 4 Leber, 5 Lunge, 6 Magen, 7 Brust, 8 Niere, 9 Ovar, 10 Prostata, 11 Schilddrüse, 12 Leukozyten, 13 Thymus, 14 Negativ-Kontrolle, 15 Testis). Die Untersuchung von Tumoren (1-17 Lungentumoren, 18-29 Melanome, 30 Negativ-Kontrolle, 31 Testis) zeigt ektope Expression in diesen in unterschiedlichen Frequenzen für die einzelnen eCT.Fig. 11: RT-PCR for MORC, TPX1, LDHC, SGY-1. Examination of various normal tissues shows expression only in testis (1 skin, 2 small intestine, 3 colon, 4 liver, 5 lungs, 6 stomach, 7 breast, 8 kidney, 9 ovary, 10 prostate, 11 thyroid, 12 leukocytes, 13 thymus, 14 negative Control, 15 testis). The examination of tumors (1-17 lung tumors, 18-29 melanomas, 30 negative controls, 31 testis) shows ectopic expression in these at different frequencies for the individual eCT.
Abb 12: Mitochondriale Lokalisation von LDHC in der MCF-7 Brustkrebs-Zelllinie.Fig. 12: Mitochondrial localization of LDHC in the MCF-7 breast cancer cell line.
MCF-7 Zellen wurden transient mit einem LDHC-Expressions-Plasmid transfiziert. Das Antigen wurde mit LDHC-spezifischen Antiköφern detektiert und zeigte eine deutliche Kolokalisation mit dem mitochondrialen Atmungsketten-Enzym Cytochome C-Oxidase.MCF-7 cells were transiently transfected with an LDHC expression plasmid. The antigen was detected with LDHC-specific antibodies and showed a clear colocalization with the mitochondrial respiratory chain enzyme cytochrome C oxidase.
Abb 13: Prädizierte Topologie von TPTE und subzelluläre Lokalisation an der Zelloberfläche von MCF-7 Zellen. Das linke Schema zeigt die 4 putativen Trabsmembran- Domänen (Pfeile) von TPTE. MCF-7 Zellen wurden transient mit einem TPTE-Expressions- Plasmid transfiziert. Das Antigen wurde mit TPTE-spezifischen Antikörpern detektiert und zeigte eine deutliche Kolokalisation mit an der Zelloberfläche lokalisierten MHC I Molekülen.Fig. 13: Predicted topology of TPTE and subcellular localization on the cell surface of MCF-7 cells. The left scheme shows the 4 putative trot membrane domains (arrows) of TPTE. MCF-7 cells were transiently transfected with a TPTE expression plasmid. The antigen was detected with TPTE-specific antibodies and showed a clear colocalization with MHC I molecules located on the cell surface.
Abb. 14: MS4A12 Lokalisation an der Zellmembran. Tumorzellen wurden transient mit einem GFP-getaggten MS4A12-Konstrukt transfiziert und zeigten in der konfokalen Immunfluoreszenz-Mikrskopie eine komplette Kolokalisation mit Plamamembranmarkern.Fig. 14: MS4A12 localization on the cell membrane. Tumor cells were transiently transfected with a GFP-tagged MS4A12 construct and showed complete colocalization with plasma membrane markers in confocal immunofluorescence microscopy.
Abb. 15: Western Blot Nachweis von LDHC in Normalgeweben. Die Expression von LDHC ist nur in Testis nachweisbar, alle anderen getesteten Normalgewebe sind negativ. 1- Testis, Normalgewebe, 2-Hautnormalgewebe, 3-Mammanormalgewebe, 4- Lebernormalgewebe, 5-Milznormalgewebe, 6-Kolonnormalgewebe, 7-Lungenormalgewebe, 8 -Nierenormalgewebe, 9 -LymphknotennormalgewebeFig. 15: Western blot detection of LDHC in normal tissues. The expression of LDHC is only detectable in Testis, all other normal tissues tested are negative. 1- testis, normal tissue, 2-skin normal tissue, 3-breast normal tissue, 4- liver normal tissue, 5-spleen normal tissue, 6-column normal tissue, 7-lung normal tissue, 8-kidney normal tissue, 9 -lymph node normal tissue
Abb. 16: Expression von LDHC in der HCT116 DKO Zellinie. HCT116 P und HCT116 DKO wurden mit einem LDHC-spezifischen Antiköφer gefärbt. Endogene LDHC ist nur in HCT116 DKO Zellen nachweisbar.Fig. 16: Expression of LDHC in the HCT116 DKO cell line. HCT116 P and HCT116 DKO were stained with an LDHC-specific antibody. Endogenous LDHC is only detectable in HCT116 DKO cells.
Abb. 17: Mitochondriale Lokalisation von LDHC in der MCF-7 Brustkrebs-Zelllinie.Fig. 17: Mitochondrial localization of LDHC in the MCF-7 breast cancer cell line.
MCF-7 Zellen wurden transient mit einem LDHC-Expressions-Plasmid transfiziert. Das Antigen wurde mit LDHC-spezifischen Antiköφern detektiert und zeigte eine deutliche Kolokalisation mit dem mitochondrialen Atmungsketten-Enzym Cytochome C-Oxidase.MCF-7 cells were transiently transfected with an LDHC expression plasmid. The antigen was detected with LDHC-specific antibodies and showed a clear colocalization with the mitochondrial respiratory chain enzyme cytochrome C oxidase.
Abb. 18: Membranlokalisation von heterolog und endogen exprimierter TPTE in Zellinien. (Links) NIH3T3 Zellen wurden transient mit einem TPTE-Expressions-Plasmid transfiziert. TPTE wurde mit spezifischen Antiköφern detektiert und zeigte eine deutliche Kolokalisation mit an der Zelloberfläche lokalisierten MHC I Molekülen. (Rechts) Endogene TPTE in SK-Mel 37 Zellen wurde mit einem spezifischen Antiköφer detektiert und zeigt deutliche Membranlokalisation.Fig. 18: Membrane localization of heterologously and endogenously expressed TPTE in cell lines. (Left) NIH3T3 cells were transiently transfected with a TPTE expression plasmid. TPTE was detected with specific antibodies and showed a clear colocalization with MHC I molecules located on the cell surface. (Right) Endogenous TPTE in SK-Mel 37 cells was detected with a specific antibody and shows clear membrane localization.
Abb. 19: Quantifizierung der TPTE mRNA Expression in verschiedenen Geweben durch Real-Time PCR. Expression in Normalgeweben ist nur in Testis nachweisbar. Signifikante Expressionslevel finden sich auch in Tumoren und Tumorzellinien. Abb. 20: Nachweis der Antiköper-Spezifität. Schnitte von Testisgewebe wurden mit TPTE- spezifischem Antiköφer gefärbt. Der spezifische Nachweis von TPTE wird durch Blocken (rechts) des Antiköφers mit dem zur Immunisierung eingesetzten Peptid verhindert.Fig. 19: Quantification of TPTE mRNA expression in different tissues by real-time PCR. Expression in normal tissues is only detectable in Testis. Significant expression levels can also be found in tumors and tumor cell lines. Fig. 20: Evidence of antibody specificity. Sections of testis tissue were stained with TPTE-specific antibodies. The specific detection of TPTE is prevented by blocking (right) the antibody with the peptide used for immunization.
Abb. 21: Immunhistochemischer Nachweis von TPTE in Bronchialkarzinomen. Schnitte von Bronchialkarzinomen wurden mit TPTE-spezifischem Antiköφer gefärbt. TPTE wird homogen im gesamten Tumor exprimiert und ist an der Zellmembran lokalisiert.Fig. 21: Immunohistochemical detection of TPTE in bronchial carcinomas. Sections of bronchial carcinomas were stained with TPTE-specific antibodies. TPTE is expressed homogeneously throughout the tumor and is located on the cell membrane.
Abb. 22: Nachweis der TPTE-Lokalisation in vitalen Zellen. NIH3T3 Zellen wurden transient mit einem TPTE-Expressions-Plasmid transfiziert und mittels Time-Lapse Mikroskopie analysiert. Die Lokalisation von TPTE an die Membran von Zellprotrusionen und Pseudoposien hat die unmittelbare Refraktion der betreffenden Membranbereiche zur Folge.Fig. 22: Detection of TPTE localization in vital cells. NIH3T3 cells were transiently transfected with a TPTE expression plasmid and analyzed using time-lapse microscopy. The localization of TPTE on the membrane of cell protrusions and pseudoposias results in the immediate refraction of the membrane areas concerned.
Abb. 23: TPTE verstärkt Zellmigration in chemotaktischen Gradienten. (Links) Schematische Darstellung des Boyden-Kammer Assays. NIH3T3/c-erbB-2 Zellen wurden mit TPTE-eGFP transfiziert und die Migration der Zellen im Vergleich mit nicht-transfizierten und mit Leer-pEGFP- Vektor transfizierten Zellen bestimmt. (Rechts oben) Die Expression von TPTE f hrt zu einer um den Faktor 4-5 erhöhten Migration der Zellen bei Einsatz von 10%FCS als Chemotaktikum. (Recht unten) Die Expression von TPTE fuhrt schon bei sehr geringen Konzentrationen von PDGF zu einer signifikanten Steigerung der Migration.Fig. 23: TPTE enhances cell migration in chemotactic gradients. (Left) Schematic representation of the Boyden chamber assay. NIH3T3 / c-erbB-2 cells were transfected with TPTE-eGFP and the migration of the cells was determined in comparison with non-transfected cells and cells transfected with empty pEGFP vector. (Top right) The expression of TPTE leads to a 4 to 5-fold increase in cell migration when using 10% FCS as a chemotactic. (Right below) The expression of TPTE leads to a significant increase in migration even at very low concentrations of PDGF.
Abb. 24: Expression TPTE in Tumoren ist assoziiert mit Metastasierung. Statistische Auswertung der TNM- Stadien von 58 Tumoφroben in Korrelation mit der Expression von TPTE zeigt, dass TPTE positive Tumoren signifankt häufiger lymphogen und hämatogen metastasieren.Fig. 24: Expression TPTE in tumors is associated with metastasis. Statistical analysis of the TNM stages of 58 tumor samples in correlation with the expression of TPTE shows that TPTE positive tumors metastasized significantly more often lymphogenically and hematogenously.
Abb. 25: Expression von TSBP in der HCT116 DKO Zellinie. HCT116 P und HCT116 DKO wurden mit einem TSBP-spezifischen Antiköφer gefärbt. Endogenes TSBP ist nur in HCT116 DKO Zellen nachweisbar und ist mit der Kernmembran assoziiert.Fig. 25: Expression of TSBP in the HCT116 DKO cell line. HCT116 P and HCT116 DKO were stained with a TSBP-specific antibody. Endogenous TSBP is only detectable in HCT116 DKO cells and is associated with the nuclear membrane.
Abb. 26: Nachweis der MS4A12 mRNA Expression in Geweben durch RT-PCR und Real-Time PCR. Die Expression von MS4A12 in Normalgeweben ist beschränkt auf Kolon, Rektum, terminales Ileum und Testis. 80% der Kolonkarzinome und 80% der Kolonkarzinommetastasen zeigen signifikante Expressionslevel von MS4A12.Fig. 26: Detection of MS4A12 mRNA expression in tissues by RT-PCR and real-time PCR. Expression of MS4A12 in normal tissues is restricted to colon, Rectum, terminal ileum and testis. 80% of colon carcinomas and 80% of colon carcinoma metastases show significant levels of expression of MS4A12.
Abb.27: Western Blot Nachweis von MS4A12 in Kolon und Kolonkarzinomen. Die spezifische Bande ist normalem Kolongewebe und in einigen Kolonkarzinomen nachweisbar. M-MagicMark (Invitrogen), 1 -Kolonnormalgewebe, 2-6-KolontumorgewebeFig. 27: Western blot detection of MS4A12 in colon and colon carcinoma. The specific band is normal colon tissue and is detectable in some colon carcinomas. M-MagicMark (Invitrogen), 1 -colon normal tissue, 2-6-colon tumor tissue
Abb. 28: MS4A12 Lokalisation an der Zellmembran. Tumorzellen wurden transient mit MS4A12-eGFP transfiziert und zeigen nach Färbung mit einem MS4A12-spezifischen Antiköφer in der konfokalen Immunfluoreszenz-Mikroskopie Lokalisation an der Plasmamembran.Fig. 28: MS4A12 localization on the cell membrane. Tumor cells were transiently transfected with MS4A12-eGFP and, after staining with an MS4A12-specific antibody, show localization on the plasma membrane in confocal immunofluorescence microscopy.
Abb. 29: Immunhistoch emischer Nachweis von MS4A12 in Kolon und Kolonkarzinomen. Gewebeschnitte wurden mit einem MS4A12-spezifischen Antiköφer gefärbt. In normalem Kolon wird MS4A12 nur in den apikalen Enterozyten exprimiert. In Kolonkarzinomen ist die die Expression von MS4A12 in allen Tumorzellen nachweisbar.Fig. 29: Immunohistochemical detection of MS4A12 in colon and colon carcinomas. Tissue sections were stained with an MS4A12-specific antibody. In normal colon, MS4A12 is only expressed in the apical enterocytes. In colon carcinomas, the expression of MS4A12 is detectable in all tumor cells.
Abb. 30: Quantifizierung der BRCOl mRNA Expression in verschiedenen Geweben durch Real-Time PCR. Die Expression von BRCOl in Normalgeweben ist beschränkt auf Brust und Testis. Signifikante Expressionlevel von BRCOl sind in allen untersuchten Mammakarzinomen nachweisbar. 50% der Tumoren zeigen eine Überexpression von BRCOl im Vergleich mit exprimierenden Normalgeweben.Fig. 30: Quantification of BRCO1 mRNA expression in different tissues by real-time PCR. The expression of BRCOl in normal tissues is restricted to the breast and testis. Significant expression levels of BRCO1 are detectable in all breast cancers examined. 50% of the tumors show an overexpression of BRCOl in comparison with expressing normal tissues.
Abb. 31: Überexpression von BRCOl in Mammakarzinomen. Real-Time PCR Untersuchung von BRCOl in Mammakarzinomen und dem adjazenten Normalgeweben zeigt eine Überexpression von BRCOl in 50% der Mammakarzinome.Fig. 31: Overexpression of BRCOl in breast cancer. Real-time PCR analysis of BRCOl in breast cancer and the adjacent normal tissue shows an overexpression of BRCOl in 50% of breast cancer.
Abb. 32: Quantifizierung der PCSC mRNA Expression in verschiedenen Geweben durch Real-Time PCR. Die Expression von PCSC in Normalgeweben ist beschränkt auf Kolon, Rektum und terminales Ileum. Expression von PCSC ist in allen Kolonkarzinomen nachweisbar. 85% der Kolonkarzinommetastasen zeigen eine signifikante Überexpression von PCSC im Vergleich mit den Primärtumoren. Abb. 33: Nachweis der Induzierbarkeit von TPTE durch genomische Demethylierung.Fig. 32: Quantification of PCSC mRNA expression in different tissues by real-time PCR. The expression of PCSC in normal tissues is restricted to the colon, rectum and terminal ileum. Expression of PCSC is detectable in all colon carcinomas. 85% of colon carcinoma metastases show significant overexpression of PCSC compared to primary tumors. Fig. 33: Evidence of the inducibility of TPTE through genomic demethylation.
Real-Time RT-PCR Analyse der TPTE-Expression in nicht-exprimierenden Zellinien BT549 und HCTl 16 nach Behandlung der Zellen mit 2μM bzw. lOμM 5-Aza-2'-deoxycytidin und in DNA-Methyltransferase defizienten HCTl 16 Zellen.Real-time RT-PCR analysis of TPTE expression in non-expressing cell lines BT549 and HCTl 16 after treatment of the cells with 2μM or lOμM 5-aza-2'-deoxycytidine and HCTl 16 cells deficient in DNA methyl transferase.
Abb. 34: Western Blot Nachweis von TPTE in Normalgeweben und Tumorzellinien. Die Expression von LDHC ist nur in Testis und Tumorzellinien (SK-Mel-37, LCLC-107, PC-3) nachweisbar, alle anderen getesteten Normalgewebe sind negativ. Die Spezifität des Antiköφers wird durch den Nachweis von TPTE in transfizierten NIH3T3 Zellen (TPTE- pcDNA3.1) bestätigt.Fig. 34: Western blot detection of TPTE in normal tissues and tumor cell lines. The expression of LDHC is only detectable in testis and tumor cell lines (SK-Mel-37, LCLC-107, PC-3), all other normal tissues tested are negative. The specificity of the antibody is confirmed by the detection of TPTE in transfected NIH3T3 cells (TPTE-pcDNA3.1).
Abb. 35: TPTE kolokalisiert mit PIP4.5. TPTE transfizierte NIH3T3/c-erb-2 Zellen wurden mit PH-eGFP von PLC-deltal kotransfiziert und mit TPTE-spezifischem Antiköφer gefärbt. In der Überlagerung zeigt sich eine eindeutige Kolokalisation von TPTE mit PLC-deltal -PH- eGFP als Marker für PIP4,5-Fig. 35: TPTE colocalized with PIP4.5. NIH3T3 / c-erb-2 cells transfected with TPTE were co-transfected with PH-eGFP from PLC-delta and stained with TPTE-specific antibodies. The overlay shows a clear colocalization of TPTE with PLC-delta -PH- eGFP as a marker for PIP4,5-
Abb. 36: Knock-down der TPTE-Expression in PC-3 Zellen durch RNAi. PC-3 Zellen wurden mit lμM siRNA spezifisch für TPTE elektroporiert. Nach 24h wurde die mRNA- Expression mittels Real-Time RT-PCR quantifiziert. Als Kontrolle dienten nicht- elektroporierte Zellen und Zellen, die mit DsRed siRNA elektroporiert wurden.Fig. 36: Knock-down of TPTE expression in PC-3 cells by RNAi. PC-3 cells were electroporated with lμM siRNA specifically for TPTE. After 24 hours, mRNA expression was quantified using real-time RT-PCR. Non-electroporated cells and cells that were electroporated with DsRed siRNA served as a control.
Abb. 37: Verminderung der Zellmigration von PC-3 Zellen nach Elektroporation mit TPTE-siRNA. 48h nach Elektropration mit lμM TPTE-siRNA zeigt sich eine relevante Abnahme der Zellmigration im Boyden-Kammer Assay.Fig. 37: Reduction of cell migration of PC-3 cells after electroporation with TPTE-siRNA. 48h after electropration with 1μM TPTE-siRNA, a relevant decrease in cell migration in the Boyden chamber assay is shown.
Abb. 38: Region von Position 121 bis 540 der in SEQ ID NO:822 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz. Beispiele:Fig. 38: Region from position 121 to 540 of the sequence shown in SEQ ID NO: 822 of the sequence listing. Examples:
Material und Methodenmaterial and methods
Die Begriffe "in silico", "elektronisch" und "virtuell klonieren" beziehen sich rein auf die Nutzung von auf Datenbanken beruhenden Verfahren, mit denen auch Labor-experimentelle Vorgänge simuliert werden können.The terms "in silico", "electronic" and "virtual cloning" refer purely to the use of database-based methods with which laboratory experimental processes can also be simulated.
Alle anderen Begriffe und Termini sind, falls nicht explizit anders definiert, so verwendet, wie sie der Fachmann versteht. Die genannten Techniken und Methoden erfolgen in an sich bekannter Weise und sind z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y beschrieben. Alle Verfahren, die die Verwendung von Kits und Reagenzien einschließen, sind entsprechend den Angaben der Hersteller durchgeführt.Unless explicitly defined otherwise, all other terms and terms are used as they are understood by the person skilled in the art. The techniques and methods mentioned are carried out in a manner known per se and are e.g. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. All procedures involving the use of kits and reagents have been carried out according to the manufacturer's instructions.
Datamining-basierte Strategie zur Ermittlung von eCT (elektronisch Monierte Cancer/Testis-Gene)Data mining-based strategy for the determination of eCT (electronically cloned cancer / testis genes)
Zwei in silico Strategien nämlich GenBank-Schlagwort-Suche und der cDNAxProfiler wurden kombiniert (Abb. 1). Es wurde unter Nutzung des ENTREZ Search and Retrieval Systems des NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez) eine Suche nach Kandidaten-Genen in der GenBank durchgeführt, die annotiert sind als spezifisch exprimiert in testikulärem Gewebe (Wheeler et al., Nucleic Acids Research 28:10-14, 2000).Two in silico strategies namely GenBank keyword search and the cDNAxProfiler were combined (Fig. 1). Using the ENTREZ Search and Retrieval System of the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez), a search was carried out in the GenBank for candidate genes that are annotated as specifically expressed in testicular tissue ( Wheeler et al., Nucleic Acids Research 28: 10-14, 2000).
Durch Suchabfragen mit den Schlagworten "testis-specifϊc gene", "sperm-specific gene", "spermatogonia-specific gene" wurden Kandidatengene (GOI, genes of interest) aus den Datenbanken herausextrahiert. Die Suche wurde auf einen Teil der Gesamtinformation dieser Datenbanken eingeschränkt, indem als Limits "homo sapiens" für den Organismus und "mRNA" für die Molekülart eingesetzt wurden.Candidate genes (GOI, genes of interest) were extracted from the databases using search queries with the keywords "testis-specif -c gene", "sperm-specific gene", "spermatogonia-specific gene". The search was limited to part of the total information in these databases by using "homo sapiens" for the organism and "mRNA" for the type of molecule.
Die Liste der gefundenen GOI wurde kuratiert, indem unterschiedliche Bezeichnungen für dieselbe Sequenz ermittelt und solche Redundanzen behoben wurden. Alle Kandidatengene, die sich durch die Schlagwort- Suche ergaben, wurden wiederum durch das Verfahren des "electronic Northern" (eNorthern) bezüglich ihrer Gewebeverteilung untersucht. Der eNorthern basiert darauf, dass die Sequenz eines GOI gegenüber einer EST- (expressed sequence tag) Datenbank (Adams et al, Science 252:1651, 1991) abgeglichen wird (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Zu jedem EST, das sich als homolog zum eingegebenen GOI ergibt, lässt sich die Gewebeherkunft ermitteln und durch die Summe aller ESTs auf diese Weise eine vorläufige Einschätzung der Gewebeverteilung des GOI erreichen. Nur diejenigen GOI wurden weiteren Untersuchungen zugeführt, die keine Homologien zu EST aus nicht-testikulären Normalgeweben mit Ausnahme von Plazenta und fetalem Gewebe hatten. Für dies Beurteilung wurde auch berücksichtigt, dass es falsch-annotierte cDNA Banken in der öffentlichen Domäne gibt (Scheurle et al., Cancer Res. 60:4037-4043, 2000) (www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm).The list of GOI found was curated by determining different names for the same sequence and eliminating such redundancies. All candidate genes, which resulted from the keyword search, were in turn examined by the "electronic Northern" (eNorthern) method with regard to their tissue distribution. The eNorthern is based on the fact that the sequence of a GOI is compared with an EST (expressed sequence tag) database (Adams et al, Science 252: 1651, 1991) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ). For each EST that is homologous to the entered GOI, the tissue origin can be determined and by the sum of all In this way, ESTs achieve a preliminary assessment of the tissue distribution of the GOI. Only those GOI who had no homology to EST from normal non-testicular tissues with the exception of placenta and fetal tissue were followed up. For this assessment, it was also taken into account that there are false-annotated cDNA banks in the public domain (Scheurle et al., Cancer Res. 60: 4037-4043, 2000) (www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm ).
Als zweites Datamining- Verfahren wurde der cDNA xProfiler des Cancer Genome Anatomy Projekts des NCBI (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler) genutzt (Hillier et al., Genome Research 6:807-828, 1996; Pennisi, Science 276:1023-1024, 1997). Dieser erlaubt Pools von in Datenbanken abgelegten Transkriptomen durch logische Operatoren in Beziehung zueinander zu setzen. Wir haben einen Pool A definiert, dem alle aus Testis hergestellten Expressionsbibliotheken, unter Ausschluss von gemischten Bibliotheken zugeordnet wurden. Dem Pool B wurden alle cDNA-Bibliotheken zugeordnet, die von Normalgeweben mit Ausnahme von Testis, Ovar und Fetalgewebe hergestellt waren. Generell wurden alle cDNA- Banken unabhängig vom zugrundeliegenden Herstellungsverfahren genutzt, allerdings lediglich solche mit einer Mächtigkeit > 1000 zugelassen. Mittels des BUT NOT Operators wurde Pool B digital von Pool A subtrahiert. Auch das Set der auf diese Weise gefundenen GOI wurde eNorthern-Studien unterzogen, sowie durch eine Literaturrecherche abgesichert. Dieses kombinierte Datamining schließt alle etwa 13 000 Vollänge-Gene in der öffentlichen Domäne ein und prädiziert aus diesen insgesamt 140 Gene mit potentieller Testis-spezifischer Expression. Unter diesen waren 25 bereits bekannte Gene der CT-Genklasse, was die Effizienz unserer Strategie unterstreicht.The cDNA xProfiler of the Cancer Genome Anatomy Project of the NCBI (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler) was used as the second data mining method (Hillier et al., Genome Research 6: 807-828, 1996; Pennisi, Science 276: 1023-1024, 1997). This allows pools of transcriptomes stored in databases to be related to one another by logical operators. We have defined a pool A to which all expression libraries made from Testis have been assigned, excluding mixed libraries. Pool c was assigned all cDNA libraries that were made from normal tissues with the exception of testis, ovary and fetal tissue. In general, all cDNA banks were used regardless of the underlying manufacturing process, but only those with a thickness> 1000 were permitted. Pool B was digitally subtracted from pool A using the BUT NOT operator. The set of GOI found in this way was also subjected to eNorthern studies and verified by a literature search. This combined data mining includes all approximately 13,000 full length genes in the public domain and predicts a total of 140 genes with potential Testis-specific expression. Among these were 25 known genes of the CT gene class, which underlines the efficiency of our strategy.
Alle anderen Gene wurden zunächst durch spezifische RT-PCR in Normalgeweben evaluiert. Alle GOI, die sich als in nicht-testikulären Normalgeweben exprimiert erwiesen, hatten als Falsch-Positive zu gelten und wurden aus weiteren Untersuchungen ausgeschlossen. Die verbliebenen wurden in einem großen Panel an verschiedensten Tumorgeweben untersucht. Die unten dargestellten Antigene erwiesen sich dabei als ektop in Tumorzellen aktiviert.All other genes were first evaluated by specific RT-PCR in normal tissues. All GOIs that were found to be expressed in non-testicular normal tissues were considered false positives and were excluded from further studies. The remaining ones were examined in a large panel on a wide variety of tumor tissues. The antigens shown below were found to be ectopically activated in tumor cells.
RNA-Extraktion, Herstellung von poly-d(T) geprimter cDNA und RT-PCR Analyse Gesamt-RNA aus nativem Gewebematerial wurde unter Verwendung von Guanidium- isothiocyanate als chaotrophem Agens extrahiert (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-9, 1987). Nach Extraktion mit saurem Phenol und Fällung mit Isopropanol wurde die RNA in DEPC-behandeltem Wasser gelöst. Aus 2-4 μg Gesamt-RNA wurde in einem 20μl Reaktionsansatz mittels Superscript II (Invitrogen) entsprechend den Angaben des Herstellers eine Erststrang-cDNA-Synthese durchgeführt. Als Primer wurde ein dT(18) Oligonukleotid verwendet. Integrität und Qualität der cDNA wurden durch Amplifikation von p53 in einer 30 Zyklen-PCR (sense CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, antisense CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, Hybridisierungstemperatur 67°C) übeφriift.RNA extraction, preparation of poly-d (T) primed cDNA and RT-PCR analysis. Total RNA from native tissue material was extracted using guanidium isothiocyanate as a chaotrophic agent (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-9 , 1987). After extraction with acidic phenol and precipitation with isopropanol, the RNA was dissolved in DEPC-treated water. A first-strand cDNA synthesis was carried out from 2-4 μg of total RNA in a 20 μl reaction mixture using Superscript II (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. A dT (18) oligonucleotide was used as the primer. Integrity and quality of the cDNA were checked by amplification of p53 in a 30 cycle PCR (sense CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, antisense CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, hybridization temperature 67 ° C.).
Es wurde ein Archiv aus Erststrang-cDNAs aus einer Reihe von Normalgeweben und Tumorentitäten hergestellt. Für Expressionsstudien wurden 0,5 μl dieser cDNAs in einem 30μl Reaktionsansatz mit GOI-spezifischen Primern (siehe unten) und 1 U HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen) amplifiziert. Der Reaktionsansatz enthielt jeweils 0,3 mM dNTPs, je 0,3 μM jeden Primers und 3 μl 10 x Reaktionspuffer.An archive of first strand cDNAs from a range of normal tissues and tumor entities was created. For expression studies, 0.5 μl of these cDNAs were amplified in a 30 μl reaction mixture with GOI-specific primers (see below) and 1 U HotStarTaq DNA polymerase (Qiagen). The reaction mixture contained 0.3 mM dNTPs, 0.3 μM each of each primer and 3 μl 10 × reaction buffer.
Die Primer wurden so ausgewählt, dass sie in 2 verschiedenen Exons liegen und die Beseitigung der Interferenz durch kontaminierende genomische DNA als Grund für falsch positive Resultate wurde durch Testen von nicht revers transkribierter DNA als Matritze bestätigt. Nach 15 Minuten bei 95°C zur Aktivierung der HotStarTaq DNA Polymerase wurden 35 Zyklen PCR durchgeführt (1 min 94°C, 1 min jeweilige Hybridisierungstemperatur, 2 min 72°C und abschließende Elongation bei 72°C für 6 min). 20μl dieser Reaktion wurden auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel aufgetrennt und analysiert.The primers were selected to be in 2 different exons and the elimination of interference by contaminating genomic DNA as the reason for false positive results was confirmed by testing non-reverse transcribed DNA as a template. After 15 minutes at 95 ° C to activate the HotStarTaq DNA polymerase, 35 cycles of PCR were carried out (1 min 94 ° C, 1 min respective hybridization temperature, 2 min 72 ° C and final elongation at 72 ° C for 6 min). 20 μl of this reaction were separated and analyzed on an agarose gel stained with ethidium bromide.
Folgende Primer wurden für die Expressionsanalyse der entsprechenden Antigene bei der angegebenen Hybridisierungstemperatur verwendet.The following primers were used for the expression analysis of the corresponding antigens at the stated hybridization temperature.
LDH-C (67°C) sense TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC, antisense CAACATCTGAGACACCATTCCLDH-C (67 ° C) sense TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC, antisense CAACATCTGAGACACCATTCC
TPTE (64°C) sense TGGATGTCACTCTCATCCTTG, antisense CCATAGTTCCTGTTCTATCTGTPTE (64 ° C) sense TGGATGTCACTCTCATCCTTG, antisense CCATAGTTCCTGTTCTATCTG
TSBP (63 °C) sense TCTAGCACTGTCTCGATCAAG, antisense TGTCCTCTTGGTACATCTGAC MS4A12 (66°C) sense CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, antisense TTCACCTTTGCCAGCATGTAGTSBP (63 ° C) sense TCTAGCACTGTCTCGATCAAG, antisense TGTCCTCTTGGTACATCTGAC MS4A12 (66 ° C) sense CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, antisense TTCACCTTTGCCAGCATGTAG
BRCOl (60°C) sense CTTGCTCTGAGTCATCAGATG, antisense CACAGAATATGAGCCATACAGBRCOl (60 ° C) sense CTTGCTCTGAGTCATCAGATG, antisense CACAGAATATGAGCCATACAG
TPX1 (65°C) sense TTTTGTCTATGGTGTAGGACC, antisense GGAATGGCAATGATGTTACAGTPX1 (65 ° C) sense TTTTGTCTATGGTGTAGGACC, antisense GGAATGGCAATGATGTTACAG
Herstellung von Random-Hexamer-geprimter cDNA und quantitative Real-Time-PCRProduction of random hexamer-primed cDNA and quantitative real-time PCR
Die Expression von LDHC wurde mittels Real-Time-PCR quantifiziert. Das Prinzip der quantitativen Real-Time-PCR mit dem ABI PRISM Sequence Detection System (PE Biosystems, USA) nutzt die 5'-3' Exonuklease- Aktivität der Taq DNA Polymerase zur direkten und spezifischen Detektion von PCR-Produkten durch Freisetzung von Fluoreszenz-Reporterfarbstoffen. Neben Sense- und Antisense-Primern wird bei der PCR eine doppelt fluoreszenz-markierte Sonde (TaqMan-Probe) eingesetzt die an eine Sequenz des PCR-Produkts hybridisiert. Die Sonde ist 5' mit einem Reporterfarbstoff (z.B. FAM) und 3' mit einem Quencherfarbstoff (z.B. TAMRA) markiert. Ist die Sonde intakt, supprimiert die räumliche Nähe von Reporter zu Quencher die Emission der Reporterfluoreszenz. Hybridisiert die Sonde während der PCR an das PCR-Produkt, wird sie durch die 5'-3' Exonuklease-Aktivität der Taq DNA Polymerase gespalten und die Suppression der Reporterfluorszenz aufgehoben. Das Ansteigen der Reporterfluoreszenz als Folge der Zielamplifikation wird nach jedem PCR-Zyklus gemessen und zur Quantifizierung genutzt. Die Expressionsquantifizierung des Zielgens erfolgt absolut oder relativ zur Expression eines Kontrollgens mit konstanter Expression in den zu untersuchenden Geweben. Die Expression von LDHC wurde nach Normalisierung der Proben gegen 18s RNA als sog. Housekeeping- Gen mittels der ΔΔ- Methode (PE Biosystems, USA) berechnet. Die Reaktionen wurden in Duplex- Ansätzen durchgeführt und in Duplikaten bestimmt. Die Synthese der cDNA erfolgte mit dem High Capacity cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA) unter Verwendung von Hexamer-Primern nach Angaben des Herstellers. Jeweils 5 μl der verdünnten cDNA wurden in 25 μl Gesamtvolumen für die PCR eingesetzt: sense-Primer (GGTGTCACTTCTGTGCCTTCCT) 300 nM; antisense-PrimerThe expression of LDHC was quantified using real-time PCR. The principle of quantitative real-time PCR with the ABI PRISM Sequence Detection System (PE Biosystems, USA) uses the 5'-3 'exonuclease activity of Taq DNA polymerase for the direct and specific detection of PCR products by the release of fluorescence reporter dyes. In addition to sense and antisense primers, a double fluorescence-labeled probe (TaqMan probe) is used in the PCR, which hybridizes to a sequence of the PCR product. The probe is labeled 5 'with a reporter dye (e.g. FAM) and 3' with a quencher dye (e.g. TAMRA). If the probe is intact, the proximity of the reporter to the quencher suppresses the emission of the reporter fluorescence. If the probe hybridizes to the PCR product during the PCR, it is cleaved by the 5'-3 'exonuclease activity of the Taq DNA polymerase and the suppression of the reporter fluorescence is abolished. The increase in reporter fluorescence as a result of the target amplification is measured after each PCR cycle and used for quantification. The expression quantification of the target gene takes place absolutely or relative to the expression of a control gene with constant expression in the tissues to be examined. The expression of LDHC was calculated after normalizing the samples against 18s RNA as a so-called housekeeping gene using the ΔΔ method (PE Biosystems, USA). The reactions were carried out in duplex batches and determined in duplicates. The cDNA was synthesized using the High Capacity cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA) using hexamer primers according to the manufacturer's instructions. 5 μl of the diluted cDNA were used in a total volume of 25 μl for the PCR: sense primer (GGTGTCACTTCTGTGCCTTCCT) 300 nM; antisense primer
(CGGCACCAGTTCCAACAATAG) 300 nM; TaqMan-Probe(CGGCACCAGTTCCAACAATAG) 300 nM; TaqMan probe
(CAAAGGTTCTCCAAATGT) 250 nM; sense-Primer 18s RNA 50 nM; antisense-Primer 18s RNA 50 nM; 18 s RNA-Probe 250 nM; 12,5 μl TaqMan Universal PCR Master Mix; anfängliche Denaturierung 95°C (10 min); 95°C (15 sec); 60°C (1 min); 40 Zyklen. Durch die Amplifikation eines 128 bp-Produkts über die Grenze von Exon 1 und Exon 2 wurden alle beschriebenen Splicevarianten von LDHC in die Quantifizierung einbezogen.(CAAAGGTTCTCCAAATGT) 250 nM; sense primer 18s RNA 50 nM; antisense primer 18s RNA 50 nM; 18 s RNA sample 250 nM; 12.5 ul TaqMan Universal PCR Master Mix; initial denaturation 95 ° C (10 min); 95 ° C (15 sec); 60 ° C (1 min); 40 cycles. By amplifying a 128 bp product across the border of exon 1 and exon 2, all described splicing variants of LDHC were included in the quantification.
Die Expression von TPTE, MS4A12, PCSC und BRCOl wurde ebenfalls mittels Real-Time- PCR quantifiziert, jedoch wurden die PCR-Produkte mit SYBR-Green als Reporterfarbstoff detektiert. Die Reporterfluoreszenz von SYBR-Green ist in Lösung supprimiert und erst nach Bindung an dopplesträngige DNA-Fragmente ist der Farbstoff aktiv. Das Ansteigen der SYBR-Green Fluoreszenz als Folge der spezifischem Amplifikation mittels GOI-spezifische Primern nach jedem PCR Zyklus wird zur Quantifizierung genutzt. Die Expressionsquantifizierung des Zielgens erfolgt absolut oder relativ zur Expression eines Kontrollgens mit konstanter Expression in den zu untersuchenden Geweben. Die Expression von LDHC wurde nach Normalisierung der Proben gegen 18s RNA als sog. Housekeeping- Gen mittels der ΔΔ- Methode (PE Biosystems, USA) berechnet. Die Reaktionen wurden in Duplex-Ansätzen durchgeführt und in Triplikaten bestimmt. Verwendet wurde das QuantiTect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers. Die Synthese der cDNA erfolgte mit dem High Capacity cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA) unter Verwendung von Hexamer-Primern nach Angaben des Herstellers. Jeweils 5 μl der verdünnten cDNA wurden in 25 μl Gesamtvolumen für die PCR eingesetzt: sense-Primer 300nM, antisense-Primer 300nM; initiale Denaturierung 95° 15 min; 95° 30 sec; Annealing 30 sec; 72° 30 sec; 40 Zyklen.The expression of TPTE, MS4A12, PCSC and BRCOl was also quantified using real-time PCR, but the PCR products were used with SYBR-Green as a reporter dye detected. The reporter fluorescence of SYBR-Green is suppressed in solution and the dye is only active after binding to double-stranded DNA fragments. The increase in SYBR-Green fluorescence as a result of the specific amplification using GOI-specific primers after each PCR cycle is used for the quantification. The expression quantification of the target gene takes place absolutely or relative to the expression of a control gene with constant expression in the tissues to be examined. The expression of LDHC was calculated after normalizing the samples against 18s RNA as a so-called housekeeping gene using the ΔΔ method (PE Biosystems, USA). The reactions were carried out in duplex batches and determined in triplicates. The QuantiTect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions was used. The cDNA was synthesized using the High Capacity cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA) using hexamer primers according to the manufacturer's instructions. In each case 5 μl of the diluted cDNA was used for the PCR in a total volume of 25 μl: sense primer 300 nm, antisense primer 300 nm; initial denaturation 95 ° 15 min; 95 ° 30 sec; Annealing 30 sec; 72 ° 30 sec; 40 cycles.
TPTE (62°) sense GAGTCTACAATCTATGCAGTG, antisense CCATAGTTCCTGTTCTATCTGTPTE (62 °) sense GAGTCTACAATCTATGCAGTG, antisense CCATAGTTCCTGTTCTATCTG
MS4A12 (65°) sense CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, antisense TTCACCTTTGCCAGCATGTAGMS4A12 (65 °) sense CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, antisense TTCACCTTTGCCAGCATGTAG
PCSC (59°) sense AGAATAGAATGTGGCCTCTAG, antisense TGCTCTTACTCCAAAAAGATGPCSC (59 °) sense AGAATAGAATGTGGCCTCTAG, antisense TGCTCTTACTCCAAAAAGATG
BRCOl (60°) sense CTTGCTCTGAGTCATCAGATG, antisense CACAGAATATGAGCCATACAGBRCOl (60 °) sense CTTGCTCTGAGTCATCAGATG, antisense CACAGAATATGAGCCATACAG
Klonierung und Sequenzanalyse Klonierung von Vollängen bzw. Genfragmenten erfolgte nach gängigen Methoden. Zur Ermittlung der Sequenz wurden entsprechende Antigene mittels der Proofreading-Polymerase pfu (Stratagene) amplifiziert. Nach Beendigung der PCR wurde Adenosin mittels HotStarTaq DNA Polymerase an die Enden des Amplikons ligiert, um die Fragmente entsprechend den Angaben des Herstellers in den TOPO-TA Vektor zu klonieren. Die Sequenzierung wurde durch einen kommerziellen Service durchgeführt. Die Sequenzen wurden mittels gängiger Prädiktionsprogramme und Algorithmen analysiert.Cloning and sequence analysis Cloning of full lengths or gene fragments was carried out using standard methods. To determine the sequence, appropriate antigens were amplified using the proofreading polymerase pfu (Stratagene). After the PCR had ended, adenosine was ligated to the ends of the amplicon using HotStarTaq DNA polymerase in order to clone the fragments into the TOPO-TA vector according to the manufacturer's instructions. The sequencing was done performed by a commercial service. The sequences were analyzed using common prediction programs and algorithms.
Western blot Zellen aus Zellkultur (endogene Expression des Zielgens oder Synthese des Zielproteins nach Transfektion eines Expressionsvektors, der das Zielprotein kodiert) oder Gewebeproben, die das Zielprotein enthalten könnten, werden in einer l%igen SDS Lösung lysiert. Das SDS denaturiert dabei die im Lysat enthaltenen Proteine. Die Lysate eines experimentellen Ansatzes werden abhängig von der erwarteten Proteingröße auf 8-15 %igen denaturierenden Polyacrylamidgelen (enthalten 1% SDS) der Größe nach elekrophoretisch aufgetrennt (SDS- Polyacrylamid Gelelektrophorese, SDS-PAGE). Anschließend werden die Proteine durch das semi-dry Elektroblot Verfahren (Biorad) auf Nitrozellulose Membran (Schleicher & Schüll) transferiert, auf der das gewünschte Protein nachgewiesen werden kann. Dazu wird die Membran zunächst blockiert (z.B. mit Milchpulver) und anschließend mit dem spezifischen Antiköφer in einer Verdünnung von 1:20-1:200 (je nach Spezifität des Antiköφers) für 60 Minuten inkubiert. Nach einem Waschschritt wird die Membran mit einem zweiten, mit einem Marker (z.B. Enzyme wie Peroxidase oder alkalische Phosphatase) gekoppelten Antiköφer inkubiert, der den ersten Antiköφer erkennt. Nach einem weiteren Waschschritt wird anschließend das Zielprotein in einer Färb- oder ChennTumineszenz-Reaktion auf der Membran mittels einer Enzymreaktion sichtbar gemacht (z.B. ECL, Amersham Bioscience). Das Ergebnis wird durch Aufnahme mit einer geeigneten Kamera dokumentiert.Western blot cells from cell culture (endogenous expression of the target gene or synthesis of the target protein after transfection of an expression vector which encodes the target protein) or tissue samples which could contain the target protein are lysed in a 1% SDS solution. The SDS denatures the proteins contained in the lysate. Depending on the expected protein size on 8-15% denaturing polyacrylamide gels (containing 1% SDS), the lysates of an experimental approach are separated by size by electrophoresis (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE). The proteins are then transferred to the nitrocellulose membrane (Schleicher & Schüll) by means of the semi-dry electroblot method (Biorad), on which the desired protein can be detected. For this purpose, the membrane is first blocked (e.g. with milk powder) and then incubated with the specific antibody at a dilution of 1: 20-1: 200 (depending on the specificity of the antibody) for 60 minutes. After a washing step, the membrane is incubated with a second antibody coupled with a marker (e.g. enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase), which recognizes the first antibody. After a further washing step, the target protein is then made visible on the membrane in a staining or chennuminescence reaction using an enzyme reaction (e.g. ECL, Amersham Bioscience). The result is documented by recording with a suitable camera.
Immunfluoreszenzimmunofluorescence
Es werden Zellen etablierter Zelllinien benutzt, die entweder das Zielprotein endogen synthetisieren (Nachweis der RNA in der RT-PCR oder des Proteins im Western blot) oder aber vor der IF mit Plasmid-DNA transfiziert worden sind. Zur Transfektion von Zelllinien mit DNA sind die verschiedensten Methoden (z.B. Elektroporation, Liposomen basierte Transfektion, Calciumphosphatpräzipitation) gut etabliert (z.B. Lemoine et al. Methods Mol Biol. 1997; 75: 441-7). Das transfizierte Plasmid kann bei der Immunfluoreszenz das unmodifizierte Protein kodieren oder aber auch unterschiedliche Aminosäuremarker an das Zielprotein koppeln. Die wichtigsten Marker sind z.B. das fluoreszierende „green fluorescent protein" (GFP) in seinen verschiedenen differentiell fluoreszierenden Formen, kurze Peptidsequenzen von 6-12 Aminosäuren, für die hoch affine und spezifische Antiköφer zur Verfügung stehen. Zellen, die das Zielprotein synthetisieren, werden mit Paraformaldehyd; Saponin oder Methanol fixiert. Anschließend können die Zellen bei Bedarf durch Inkubation mit Detergenzien (z.B. 0,2% Triton X-100) permeabilisiert werden. Nach der Fixierung/Permeabilisierung werden die Zellen mit einem primären Antiköφer inkubiert, der gegen das Zielprotein oder gegen einen der gekoppelten Marker gerichtet ist. Nach einem Waschschritt wird der Ansatz mit einem zweiten, mit einem fluoreszierenden Marker (z.B. Fluorescin, Texas Red, Dako) gekoppelten Antiköφer inkubiert, der an den ersten Antiköφer bindet. Anschließend werden die so markierten Zellen mit Glycerin überschichtet und mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops nach den Angaben des Herstellers analysiert. Spezifische Fluoreszenzemissionen werden dabei, abhängig von den eingesetzten Substanzen, durch spezifische Anregung erreicht. Die Analyse erlaubt in der Regel die sichere Lokalisation des Zielproteins, wobei zur Bestätigung der Antiköφerqualität und des Zielproteins in Doppelfärbungen zusätzlich zum Zielprotein auch die gekoppelten Aminosäuremarker oder andere Markeφroteine angefärbt werden, deren Lokalisation bereits in der Literatur beschrieben ist. Ein Sonderfall stellt das GFP und seine Derivate dar, dass direkt angeregt werden kann und selbst fluoresziert, so dass zum Nachweis keine Antiköφer benötigt werden.Cells of established cell lines are used which either endogenously synthesize the target protein (detection of the RNA in RT-PCR or the protein in Western blot) or have been transfected with plasmid DNA before the IF. Various methods (eg electroporation, liposome-based transfection, calcium phosphate precipitation) are well established for the transfection of cell lines with DNA (eg Lemoine et al. Methods Mol Biol. 1997; 75: 441-7). In the case of immunofluorescence, the transfected plasmid can encode the unmodified protein or else can couple different amino acid markers to the target protein. The most important markers are, for example, the fluorescent "green fluorescent protein" (GFP) in its differentially fluorescent forms, short peptide sequences of 6-12 amino acids, for which highly affine and specific antibodies are available. Cells that synthesize the target protein are included paraformaldehyde; Saponin or methanol fixed. If necessary, the cells can then be permeabilized by incubation with detergents (eg 0.2% Triton X-100). After fixation / permeabilization, the cells are incubated with a primary antibody which is directed against the target protein or against one of the coupled markers. After a washing step, the mixture is incubated with a second antibody, which is coupled to a fluorescent marker (eg fluorescin, Texas Red, Dako) and which binds to the first antibody. The cells marked in this way are then overlaid with glycerol and analyzed with the aid of a fluorescence microscope according to the manufacturer's instructions. Specific fluorescence emissions are achieved by specific excitation, depending on the substances used. The analysis generally allows the target protein to be localized reliably, with the coupled amino acid markers or other brand proteins being stained in addition to the target protein in order to confirm the antibody quality and the target protein in double stains, the localization of which has already been described in the literature. A special case is the GFP and its derivatives, which can be excited directly and fluoresce themselves, so that no antibodies are required for detection.
Immunhistochemieimmunohistochemistry
Die IHC dient im einzelnen dazu, um (1) die Menge an Zielprotein in Tumor und Normalgeweben abschätzen zu können, (2) zu analysieren, wie viele Zellen in Tumor und gesundem Gewebe das Zielgen synthetisieren, (3) den Zelltyp in einem Geweben (Tumor, gesunde Zellen) zu definieren, in dem das Zielprotein nachweisbar ist. Je nach individuellem Antiköφer müssen unterschiedliche Protokolle verwendet werden (z.B. „Diagnostic Immunohistochemistry by David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667" oder in „Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy ISBN: 0306467704").The IHC is used in particular to (1) estimate the amount of target protein in tumor and normal tissues, (2) analyze how many cells in tumor and healthy tissue synthesize the target gene, (3) the cell type in a tissue ( Define tumor, healthy cells) in which the target protein is detectable. Depending on the individual antibody, different protocols must be used (e.g. "Diagnostic Immunohistochemistry by David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667" or in "Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy ISBN: 0306467704").
Formalin fixierte (andere Fixierungen: z.B. Methanol) und in Paraffin eingebettete Gewebestücke mit einer Dicke von ca. 4μm werden auf einem Glasträger aufgebracht und z.B. mit Xylene deparaffiniert. Die Proben werden mit TBS-T gewaschen in Serum blockiert. Anschließend erfolgt die Inkubation mit dem ersten Antiköφer (Verdünnung: 1 :2 bis 1 :2000) für 1-18 Stunden, wobei in der Regel affmitätsgereinigete Antiköφer verwendet werden. Nach einem Waschschritt erfolgt eine ca. 30-60 minütige Inkubation mit einem zweiten mit Alkalischer Phosphatase (alternativ: z.B. Peroxidase) gekoppelten Antikörper, der gegen den ersten Antiköφer gerichtet ist. Anschließend erfolgt eine Farbreaktion unter Verwendung der Alkalischen Phosphatase (Referenzen: Shi et al. J Histochem Cytochem 1991 39: 741-748; Shin et al. Lab Invest. 1991 64: 693-702). Zum Nachweis der Antiköφerspezifität kann die Reaktion durch vorherige Zugabe des Immunogens blockiert werden.Tissue pieces with a thickness of approx. 4μm fixed in formalin (other fixations: e.g. methanol) and embedded in paraffin are applied to a glass support and deparaffinized with xylene, for example. The samples are washed with TBS-T and blocked in serum. The incubation is then carried out with the first antibody (dilution: 1: 2 to 1: 2000) for 1-18 hours, with affinity-purified antibodies being used as a rule. After a washing step, there is an approximately 30-60 minute incubation with a second antibody coupled with alkaline phosphatase (alternatively: eg peroxidase), which is directed against the first antibody. A color reaction then takes place using the alkaline phosphatase (references: Shi et al. J Histochem Cytochem 1991 39: 741-748; Shin et al. Lab Invest. 1991 64: 693-702). To demonstrate antibody specificity, the reaction can be blocked by adding the immunogen beforehand.
Immunisierung (Siehe auch Monoclonal Antibodies: A Practical Approach by Philip Shepherd, Christopher Dean isbn 0-19-963722-9; Antibodies: A Laboratory Manualby Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447). Im Folgenden wird der Herstellungsprozess von Antiköφern kurz beschrieben, Details sind den zitierten Publikationen zu entnehmen. Zunächst werden Tiere (z.B. Kaninchen) durch eine erste Injektion des gewünschten Zielproteins immunisiert. Durch eine zweite oder dritte Immunisierung innerhalb eines definierten Zeitraums (ca. 2-4 Wochen nach der vorangegangenen Immunisierung) lässt sich die Immunantwort des Tieres gegen das Immunogen verstärken. Wiederum nach verschiedenen definierten Zeitabständen (1. Blutung nach 4 Wochen, anschließend ca. alle 2 Wochen mit insgesamt bis zu 5 Entnahmen) wird den Tieren Blut entnommen und daraus ein Immunserum gewonnen.Immunization (See also Monoclonal Antibodies: A Practical Approach by Philip Shepherd, Christopher Dean isbn 0-19-963722-9; Antibodies: A Laboratory Manualby Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447). The production process of antibodies is briefly described below, details can be found in the cited publications. First animals (e.g. rabbits) are immunized by a first injection of the desired target protein. The animal's immune response to the immunogen can be enhanced by a second or third immunization within a defined period (approx. 2-4 weeks after the previous immunization). Again after various defined time intervals (1st bleeding after 4 weeks, then approximately every 2 weeks with a total of up to 5 withdrawals), blood is drawn from the animals and an immune serum is obtained therefrom.
Die Immunisierung der Tiere erfolgt in der Regel über eines von vier gut etablierte Verfahren, wobei auch andere Verfahren existieren. Immunisiert werden kann dabei mit Peptiden, die für das Zielprotein spezifisch sind, dem gesamten Protein, mit extrazellulären Teilsequenzen eines Proteins, das experimentell oder über Prediktionsprogramme identifiziert werden kann. (1) Im ersten Fall werden an KLH (keyhole limpet hemocyanin) konjugierte-Peptide (Länge: 8-12 Aminosäuren) über ein standardisiertes in vitro Verfahren synthetisiert und diese Peptide zur Immunisierung verwendet. In der Regel erfolgen 3 Immunisierungen mit einer Konzentration von 5-1000 μg/Immunisierung. Die Durchführung der Immunisierung kann auch als Service von Dienstleistern erfolgen. (2) Alternativ kann die Immunisierung durch rekombinante Proteine erfolgen. Dazu wird die klonierte DNA des Zielgens in einen Expressionsvektor kloniert und das Zielprotein analog den Bedingungen des jeweiligen Herstellers (z.B. Röche Diagnostics, Invitrogen, Clontech, Qiagen) z.B. zellfrei in vitro, in Bakterien (z.B. E. coli), in Hefe (z.B. S. pombe), in Insektenzellen oder in mammalen Zellen synthetisiert. Nach Synthese in einem der Systeme wird das Zielprotein aufgereinigt, die Aufreinigung erfolgt dabei in der Regel über standardisierte chromatografische Methoden. Dabei können auch Proteine für die Immunisierung verwendet werden, die über einen molekularen Anker als Hilfsmittel zur Reinigung verfügen (z.B. His-Tag, Qiagen; FLAG-Tag, Röche Diagnostics; Gst Fusionsproteine). Eine Vielzahl von Protokollen befinden sich z.B. in den „Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons Ltd, Wiley InterScience). (3) Falls eine Zelllinie zur Verfügung steht, die das gewünschte Protein endogen synthetisiert, kann auch diese Zelllinie zur Herstellung des spezifischen Antiserums verwendet werden. Die Immunisierung erfolgt dabei in 1-3 Injektionen mit jeweils ca. 1-5 x lO7 Zellen. (4) Die Immunisierung kann auch durch Injektion von DNA (DNA Immunisierung) erfolgen. Dazu wird das Zielgen zunächst in einen Expressionsvektor kloniert, so dass die Zielsequenz unter der Kontrolle eines starken eukaryontischen Promotors steht (z.B. CMV Promotor). Anschließend werden 5-100 μg DNA als Immunogen mit einer „gene gun" in stark durchblutete, kapillare Bereiche eines Organismus transferiert (z.B. Maus, Kaninchen). Die transferierte DNA wird von Zellen des Tieres aufgenommen, das Zielgen wird exprimiert und das Tier entwickelt schließlich eine Immunantwort gegen das Zielgen (Jung et al, Mol Cells 12: 41-49, 2001; Kasinrerk et a., Hybrid Hybridomics 21: 287-293, 2002).The animals are usually immunized using one of four well-established methods, although other methods also exist. Immunization can be carried out with peptides that are specific for the target protein, the entire protein, with extracellular partial sequences of a protein that can be identified experimentally or via prediction programs. (1) In the first case, peptides conjugated to KLH (keyhole limpet hemocyanin) (length: 8-12 amino acids) are synthesized using a standardized in vitro method and these peptides are used for immunization. As a rule, 3 immunizations are carried out with a concentration of 5-1000 μg / immunization. The immunization can also be carried out as a service by service providers. (2) Alternatively, immunization can be carried out by recombinant proteins. For this purpose, the cloned DNA of the target gene is cloned into an expression vector and the target protein analogously to the conditions of the respective manufacturer (e.g. Röche Diagnostics, Invitrogen, Clontech, Qiagen) e.g. cell-free in vitro, in bacteria (e.g. E. coli), in yeast (e.g. S. pombe), synthesized in insect cells or in mammalian cells. After synthesis in one of the systems, the target protein is purified, which is usually done using standardized chromatographic methods. Proteins can also be used for the immunization which have a molecular anchor as an aid for cleaning (for example His-Tag, Qiagen; FLAG day, Röche Diagnostics; Gst fusion proteins). A large number of protocols can be found, for example, in the “Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons Ltd, Wiley InterScience). (3) If a cell line is available which endogenously synthesizes the desired protein, this cell line can also be used to produce the specific antiserum. The immunization is carried out in 1-3 injections, each with approx. 1-5 x 10 7 cells. (4) The immunization can also be carried out by injection of DNA (DNA immunization). For this purpose, the target gene is first cloned into an expression vector so that the target sequence is under the control of a strong eukaryotic promoter (eg CMV promoter). Subsequently, 5-100 μg of DNA are transferred as immunogen with a “gene gun” into highly perfused, capillary areas of an organism (eg mouse, rabbit). The transferred DNA is taken up by cells of the animal, the target gene is expressed and the animal finally develops an immune response against the target gene (Jung et al, Mol Cells 12: 41-49, 2001; Kasinrerk et a., Hybrid Hybridomics 21: 287-293, 2002).
AffϊnitätsreinigungAffϊnitätsreinigung
Die Reinigung der polyklonalen Seren erfolgte im Fall der Peptidantiköφer gänzlich oder im Fall der Antiköφer gegen rekombinante Proteine teilweise als Service durch die beauftragten Firmen. Hierzu wurde in beiden Fällen das entsprechende Peptid bzw. rekombinante Protein kovalent an eine Matrix gebunden, diese nach der Kopplung mit einem nativen Puffer (PBS: phosphate buffered saline) äquilibriert und im Anschluß mit dem Rohserum inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt mit PBS wurde der Antiköφer mit 100 mM Glycin pH 2,7 eluiert und das Eluat sogleich in 2 M TRIS pH 8 neutralisiert. Die so gereinigten Antiköφer konnten dann zur spezifischen Detektion der Zielproteine sowohl durch Westernblotting als auch durch Immunfluoreszenz eingesetzt werden.The purification of the polyclonal sera was carried out entirely in the case of the peptide antibodies or partially in the case of the antibodies against recombinant proteins as a service by the contracted companies. For this purpose, in both cases the corresponding peptide or recombinant protein was covalently bound to a matrix, this was equilibrated after coupling with a native buffer (PBS: phosphate buffered saline) and then incubated with the raw serum. After a further washing step with PBS, the antibody was eluted with 100 mM glycine pH 2.7 and the eluate was immediately neutralized in 2 M TRIS pH 8. The antibodies thus purified could then be used for the specific detection of the target proteins both by Western blotting and by immunofluorescence.
Boydenkammer Migrationsassay Die Boydenkammer dient der Quantifizierung der Zellmigration in Reaktion auf chemotaktische Stimuli. Die Kammer besteht aus zwei Kompartimenten die durch eine Micropore-Membran voneinander getrennt sind. In das obere Kompartment gibt man die zu untersuchenden Zellen in Minimalmedium, währen das untere Kompartment mit Medium gefüllt wird welches das entsprechende Chemotaktikum enthält. Die Zellen wandern entsprechend des Gradienten durch die Membran und adhärieren an die Unterseite der Membran. Nach Fixation können die transmigrierten Zellen unter dem Mikroskop ausgezählt werden.Boyden Chamber Migration Assay The Boyden Chamber is used to quantify cell migration in response to chemotactic stimuli. The chamber consists of two compartments separated by a micropore membrane. The cells to be examined are placed in minimal medium in the upper compartment, while the lower compartment is filled with medium which contains the corresponding chemotactic. The cells move according to the gradient through the membrane and adhering to the underside of the membrane. After fixation, the transmigrated cells can be counted under the microscope.
Der Migrationsassay wurde zur Bestimmung des promigratorischen Potentials von TPTE durchgeführt. Eingesetzt wurden mit TPTE-eGFP transfizierte, c-erbB2 transformierte NIH3T3 Fibroblasten. Als Kontrollzellen wurden nicht-transfizierte Zellen und mit eGFP-N3 Leervektor transfizierte Zellen eingesetzt. Für den Assay wurden Transwell Kammern (Becton Dickinson) mit einer Porengrösse von 8,0 μM in der Membran verwendet. Jeweils 4xl04 Zellen in 400 μl Serum-freiem DMEM Medium wurden in das obere Kompartiment gegeben. Das untere Kompartiment wurde mit 800 μl DMEM Medium gefüllt, dem 10%FCS oder PDGF-BB in aufsteigenden Konzentrationen (10-300ng/μl) zugefügt wurde. Die Kammern wurden für 40h bei 37° inkubiert. Anschliessend wurden die transmigrierten Zellen in eiskaltem Methanol fixiert, die Membranen wurden ausgeschnitten und auf Objektträgern mit Hoechst Kernfarbstoff (DAKO) zur Fluoreszenzmikroskopie eingedeckt. Zellen in fünf Gesichtsfeldern (Vergrösserung 20fach) pro Membran wurden ausgezählt. Alle Experimente wurden in Triplikaten durchgeführt.The migration assay was performed to determine the promigratory potential of TPTE. NIH3T3 fibroblasts transfected with TPTE-eGFP, c-erbB2 transformed were used. Non-transfected cells and cells transfected with eGFP-N3 empty vector were used as control cells. Transwell chambers (Becton Dickinson) with a pore size of 8.0 μM in the membrane were used for the assay. 4 × 10 4 cells in 400 μl of serum-free DMEM medium were added to the upper compartment. The lower compartment was filled with 800 μl DMEM medium, to which 10% FCS or PDGF-BB was added in increasing concentrations (10-300ng / μl). The chambers were incubated at 37 ° for 40 h. The transmigrated cells were then fixed in ice-cold methanol, the membranes were cut out and covered on slides with Hoechst core dye (DAKO) for fluorescence microscopy. Cells in five visual fields (20x magnification) per membrane were counted. All experiments were carried out in triplicate.
RNA-Interferenz (RNAi)RNA interference (RNAi)
Die siRNA-Oligos wurden entsprechend der Tuschl-Klriterien ausgewählt (Elbashir et al., Nature 411(6836):428-9, 2001). TPTE siRNA-Oligos (sense 5'-The siRNA oligos were selected according to the Tuschl criteria (Elbashir et al., Nature 411 (6836): 428-9, 2001). TPTE siRNA oligos (sense 5'-
CCCUGCCACAUGUUCAUAUdTdT-3'; antisense 5'-CCCUGCCACAUGUUCAUAUdTdT-3 '; antisense 5'-
AUAUGAACAUGUGGCAGGGdTdT-3') targetierten die Nukleotide 2043-2061 der TPTE mRNA-Sequenz (NM_013315). Als Kontrolle wurden siRNA-Oligos spezifisch für das irrelevante DsRed-Fluoreszenzprotein (AF506025) eingesetzt (sense 5'- AGUUCCAGUACGGCUCCAAdTdT-5'; antisense 5'-AUAUGAACAUGUGGCAGGGdTdT-3 ') targeted nucleotides 2043-2061 of the TPTE mRNA sequence (NM_013315). As a control, siRNA oligos were used specifically for the irrelevant DsRed fluorescent protein (AF506025) (sense 5'- AGUUCCAGUACGGCUCCAAdTdT-5 '; antisense 5'-
UUGGAGCCGUACUGGAACUdTdT-3'). Zur Generierung der siRNA-Duplexe wurden jeweils 200μM der entsprechenden sense- und antisense-Oligos in Hybridisierungspuffer (30mM HEPES (pH 7,4), lOOmM Natrium- Acetat, 2mM Magnesium- Acetat) nach initialer Denaturierung (1 min. bei 90°C) für lh bei 37°C inkubiert.) UUGGAGCCGUACUGGAACUdTdT-3 '. In order to generate the siRNA duplexes, 200μM of the corresponding sense and antisense oligos were in hybridization buffer (30mM HEPES (pH 7.4), 100mM sodium acetate, 2mM magnesium acetate) after initial denaturation (1 min. At 90 ° C ) incubated for 1 h at 37 ° C.
siRNA-ElektroporationsiRNA electroporation
5x106 Zellen wurden in 250μl Serum-freiem X-VIVO 15 Medium aufgenommen und mit lμM der entsprechenden siRNA-Duplexe elektroporiert (200V, 250μF). Die TPTE mRNA- Expression wurde 24h später mittels Real-Time RT-PCR quantifiziert. Methylierungsstudien5x10 6 cells were taken up in 250μl serum-free X-VIVO 15 medium and electroporated with lμM of the corresponding siRNA duplexes (200V, 250μF). The TPTE mRNA expression was quantified 24 hours later using real-time RT-PCR. methylation Analysis
Zur Untersuchung der Induzierbarkeit der TPTE-Expression durch genomische Demethylierung wurden die TPTE-negative Zellinien BT549 (Mamma-Ca) und HCTl 16 (Kolon-Ca) für 72h mit 2μM bzw. lOμM 5-Aza-2'-deoxycytidin kultiviert. Anschliessend wurde die TPTE-Expression mittels Real-Time RT-PCR quantifiziert. Desweiteren wurde die TPTE-Expression in DNA-Methyltransferase (DNMT) defizienten HCTl 16 Zellen quantifiziert. Während DNMT1 (HCT116DNMTW-) bzw. DNMT3b (HCT116DNMT3W-) defiziente Zellen ein nahezu unverändertes Methylierungsmuster im Vergleich zur parentalen Zellinie aufweisen (HCT116par), sind Zellen in denen beide DNMTs gemeinsam deletiert sind (HCT116DK0) durch fast vollständige Demethylierung der genomischen DNA gekennzeichnet.To investigate the inducibility of TPTE expression by genomic demethylation, the TPTE-negative cell lines BT549 (mamma-Ca) and HCTl 16 (colon-Ca) were cultivated for 72h with 2μM and 10μM 5-aza-2'-deoxycytidine. The TPTE expression was then quantified using real-time RT-PCR. Furthermore, the TPTE expression in DNA methyl transferase (DNMT) deficient HCTl 16 cells was quantified. While DNMT1 (HCT116 DNMTW -) or DNMT3b ( H CT116 DNMT3W -) deficient cells have an almost unchanged methylation pattern compared to the parental cell line (HCT116 par ), cells in which both DNMTs are deleted together (HCT116 DK0 ) due to almost complete demethylation of genomic DNA.
Time-Lapse MikroskopieTime-lapse microscopy
Die Membranlokalisation von TPTE und die Beteilung an der Regulation von Membrandynamiken in vitalen Zellen wurde mittels Time-Lapse Mikroskopie untersucht. Hierfür wurden TPTE-eGFP transfizierte Zellen für 12h in serum-freiem DMEM Medium inkubiert. Zur Induktion von spontanen Zellmemdynamiken in Form von Membranprotrusionen, Pseudopodien und Filopodien wurden die Zellen vor der Analyse durch Zugabe von FCS stimuliert. Bilder der vitalen Zellen wurden in 30sec Abständen mit einem üivert Olympus Mikroskop (1X70) mit einer TILL IMAGO-VGA CCD Kamera aufgenommen.The membrane localization of TPTE and the involvement in the regulation of membrane dynamics in vital cells was examined using time-lapse microscopy. For this, TPTE-eGFP transfected cells were incubated for 12 h in serum-free DMEM medium. To induce spontaneous cell membrane dynamics in the form of membrane protrusions, pseudopodia and filopodia, the cells were stimulated by adding FCS before the analysis. Images of the vital cells were taken at 30sec intervals with a üivert Olympus microscope (1X70) with a TILL IMAGO-VGA CCD camera.
Herstellung EGFP-TransfektantenProduction of EGFP transfectants
Für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie von heterolog exprimierter TPTE wurde der komplette ORF von TPTE in pEGFP-Cl und pEGFP-N3 Vektoren (Clontech) kloniert. AufFor the immunofluorescence microscopy of heterologously expressed TPTE, the complete ORF of TPTE was cloned into pEGFP-Cl and pEGFP-N3 vectors (Clontech). On
Objekträgern kultivierte CHO und NIH3T3 Zellen wurden mit den entsprechendenSlide-grown CHO and NIH3T3 cells were mixed with the corresponding
Plasmidkonstrukten unter Verwendung von Fugene Transfektionsreagenz (Röche) nachPlasmid constructs using Fugene transfection reagent (Röche)
Herstellerangaben transfiziert und nach 12-24h miteis Immunfluoreszenz-Mikroskopie anlysiert.Manufacturer's details were transfected and analyzed after 12-24 h with ice immunofluorescence microscopy.
Prädiktion von Peptidepitopen für MHC Klasse IPrediction of peptide epitopes for MHC class I
Peptidepitope aus jeder der Proteinsequenzen mit Bindungseigenschaften für die polymoφhen HLA-Allele A*0201, A*2402, A*0101, A*0301, B*0702 wurden unterPeptide epitopes from each of the protein sequences with binding properties for the polymorphic HLA alleles A * 0201, A * 2402, A * 0101, A * 0301, B * 0702 were found under
Nutzung des unter http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ abgelegten Prädiktionalgorithmus ermittelt. Als Peptidlänge wurden 8, 9 und lOmere vorgegeben und ein Cutoff bei einem Score von 15 gesetzt. Ergab die Suche weniger als 10 Peptide für die jeweilige Länge, wurden alternativ die 10 besten Peptide ausgewählt.Use of the prediction algorithm stored at http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ determined. 8, 9 and 10 mm were specified as the peptide length and a cutoff for one Score of 15 set. If the search yielded fewer than 10 peptides for the respective length, the 10 best peptides were alternatively selected.
Beispiel 1: Identifizierung von LDH C als neues TumorantigenExample 1: Identification of LDH C as a new tumor antigen
LDH C (SEQ ID NO:l) und sein Translationsprodukt (SEQ ID NO:6) wurden als Testis- spezifisches Isoenzym der Laktatdehydrogenase-Familie beschrieben. Die Sequenz ist in GenBank unter der Zugangsnummer NM_017448 veröffentlicht. Das Enzym bildet ein Homotetramer mit einem Molekulargewicht von 140 kDa (Goldberg, E. et al, Contraception 64(2):93-8, 2001; Cooker et al, Biol. Reprod. 48(6):1309-19, 1993; Gupta, G.S., Grit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 34(6):361-85, 1999).LDH C (SEQ ID NO: 1) and its translation product (SEQ ID NO: 6) have been described as the testis-specific isoenzyme of the lactate dehydrogenase family. The sequence is published in GenBank under accession number NM_017448. The enzyme forms a homotetramer with a molecular weight of 140 kDa (Goldberg, E. et al, Contraception 64 (2): 93-8, 2001; Cooker et al, Biol. Reprod. 48 (6): 1309-19, 1993; Gupta, GS, Grit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 34 (6): 361-85, 1999).
RT-PCR Untersuchungen zur Expressionsanalyse mit einem Primeφaar (5'- TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC-3\ S^-CAACATCTGAGACACCATTCC-S , das die verwandten und ubiquitär exprimierten Isoenzyme LDH A und LDH B nicht kreuzamplifiziert und auf der LDH C Prototypsequenz NM_017448, die als Testis-spezifisch vorbeschrieben ist, basiert, bestätigten erfindungsgemäß das Fehlen von Expression in allen getesteten Normalgeweben, zeigten jedoch, dass die stringente transkriptionelle Repression dieses Antigenes in somatischen Zellen bei Tumoren aufgehoben ist; vgl. Tabelle 1. Wie klassischerweise für CT-Gene beschrieben, wird LDH C in einer Reihe von Tumorentitäten exprimiert. RT-PCR investigations for expression analysis with a Primeφaar (5'- TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC-3 \ S ^ -CAACATCTGAGACACCATTCC-S, which does not cross-amplify the related and ubiquitously expressed isoenzymes LDH A and LDH B and on the LDH C prototype sequence NM_017448, as the test is specifically described, confirmed according to the invention the lack of expression in all normal tissues tested, but showed that the stringent transcriptional repression of this antigen in somatic cells in tumors is eliminated, see Table 1. As is classically described for CT genes, LDH C is expressed in a number of tumor entities.
Tabelle 1. Expression von LDHC in TumorenTable 1. Expression of LDHC in tumors
Die erwartete Größe des Amphfikationsproduktes mit vorstehend genannten PCR-Primern beträgt 824 bp. Erfindungsgemäß wurde allerdings in Tumoren, jedoch nicht in Testis, die Amplifikation von multiplen zusätzlichen Banden beobachtet. Da dies indikativ für das Vorhandensein alternativer Splice- Varianten ist, wurde mit LDH-C spezifischen Primern (5'- TAGCGCCTCAACTGTCGTTGG-3', 5'-CAACATCTGAGACACCATTCC-3') das gesamte offene Leseraster amplifiziert und unabhängige Vollänge-Klone sequenziert. Abgleiche mit dem Prototyp-ORF der beschriebenen Sequenz von LDH C (SEQ ID NO:l) und der genomischen Sequenz auf Chromosom 11 bestätigen zusätzliche Splice- Varianten (SEQ ID NO:2-5). Die alternativen Splicingereignisse führen zum Fehlen von Exon 3 (SEQ ID NO:2), der beiden Exons 3 und 4 (SEQ ID NO:3), der Exons 3, 6 und 7 (SEQ ID NO:4) bzw. von Exon 7 (SEQ ID NO:5) (vgl. Abb. 2).The expected size of the amphication product with the above-mentioned PCR primers is 824 bp. According to the invention, however, the amplification of multiple additional bands was observed in tumors, but not in testis. Since this is indicative of the presence of alternative splice variants, the entire open reading frame was amplified with LDH-C specific primers (5'-TAGCGCCTCAACTGTCGTTGG-3 ', 5'-CAACATCTGAGACACCATTCC-3') and independent full-length clones were sequenced. Alignments with the prototype ORF of the described sequence of LDH C (SEQ ID NO: 1) and the genomic sequence on chromosome 11 confirm additional splice variants (SEQ ID NO: 2-5). The alternative splicing events result in the absence of exon 3 (SEQ ID NO: 2), the two exons 3 and 4 (SEQ ID NO: 3), exons 3, 6 and 7 (SEQ ID NO: 4) and exon 7 (SEQ ID NO: 5) (see Fig. 2).
Diese neuen Splicevarianten werden ausschließlich in Tumoren aber nicht im Testis generiert. Das alternative Splicing führt zu Veränderungen im Leseraster und resultiert in neuen möglichen ORF, die die in SEQ ID NO:7-13 gezeigten Aminosäuresequenzen kodieren (ORF für SEQ ID NO:7: Nukleotidposition 59-214 von SEQ ID NO:2 bzw. SEQ ID NO:4; ORF für SEQ ID NO:8: Nukleotidposition 289-939 von SEQ ID NO:2; ORF für SEQ ID NO:9: Nukleotidposition 59-196 von SEQ ID NO:3; ORF für SEQ ID NO:10: Nukleotidposition 535-765 von SEQ ID NO:3; ORF für SEQ ID NO:l l: Nukleotidposition 289-618 von SEQ ID NO:4; ORF für SEQ ID NO: 12: Nukleotidposition 497-697 von SEQ ID NO:4; ORF für SEQ ID NO:13: Nukleotidposition 59-784 von SEQ ID NO:5) (Abb. 2, 3). Neben einer vorzeitigen Termination ist auch die Nutzung von alternativen Startcodons möglich, so dass die kodierten Proteine N- wie auch C-terminal verkürzt sein können.These new splice variants are generated exclusively in tumors but not in the testis. The alternative splicing leads to changes in the reading frame and results in new possible ORFs which code for the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 7-13 (ORF for SEQ ID NO: 7: nucleotide position 59-214 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; ORF for SEQ ID NO: 8: nucleotide position 289-939 of SEQ ID NO: 2; ORF for SEQ ID NO: 9: Nucleotide position 59-196 of SEQ ID NO: 3; ORF for SEQ ID NO: 10: nucleotide position 535-765 of SEQ ID NO: 3; ORF for SEQ ID NO: II: nucleotide position 289-618 of SEQ ID NO: 4; ORF for SEQ ID NO: 12: nucleotide position 497-697 of SEQ ID NO: 4; ORF for SEQ ID NO: 13: nucleotide position 59-784 of SEQ ID NO: 5) (Fig. 2, 3). In addition to early termination, the use of alternative start codons is also possible, so that the encoded proteins can be shortened at the N- and C-terminal.
Während SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO: 10 frankierte Anteile des Prototyp-Proteins darstellen, sind die Proteinsequenz von SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:l l, SEQ ID NO:12 und SEQ ID NO:13 zusätzlich verändert und beinhalten ausschließlich Tumor- spezifische Epitope (fett gedruckt in Abb. 3). Peptidregionen, die zu Tumor-spezifischen Epitopen führen könnten sind wie folgt (der streng Tumor-spezifische Anteil, der durch Leserasterverschiebungen entsteht ist unterstrichen):While SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 represent stamped portions of the prototype protein, the protein sequence of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: II, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 additionally changed and only contain tumor-specific epitopes (printed in bold in Fig. 3). Peptide regions that could result in tumor-specific epitopes are as follows (the strictly tumor-specific portion that is caused by frame shifting is underlined):
SEQ ID NO: 14: GAVGMACAISILLKITVYLQTPE faus SEQ ID NO:7) SEQ ID NO:15: GAVGMACAISILLKWJF (aus SEQ ID NO:9)SEQ ID NO: 14: GAVGMACAISILLKITVYLQTPE faus SEQ ID NO: 7) SEQ ID NO: 15: GAVGMACAISILLKWJF (from SEQ ID NO: 9)
SEQ ID NO: 16: GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN Taus SEQSEQ ID NO: 16: GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN Thousand SEQ
ID NO:l l)ID NO: l l)
SEQ ID NO:17: MVGLLENMVILVGLYGIKEELFL (aus SEQ ID NO:12)SEQ ID NO: 17: MVGLLENMVILVGLYGIKEELFL (from SEQ ID NO: 12)
SEQ ID NO: 18: EHWKNIHKOVIORDYME Taus SEQ ID NO: 13)SEQ ID NO: 18: EHWKNIHKOVIORDYME thousand SEQ ID NO: 13)
Diese Regionen können potentiell Epitope enthalten, die auf MHC I bzw. MHC II Molekülen von T-Lymphozyten erkannt werden können und zu einer strikt Tumor-spezifischen Antwort führen.These regions can potentially contain epitopes that can be recognized on MHC I or MHC II molecules of T lymphocytes and lead to a strictly tumor-specific response.
Nicht alle der prädizierten Proteine weisen die katalytische Laktatdehydrogenase-Domäne für die NADH-abhängige Metabolisierung von Pyruvat zu Laktat auf, die den letzten Schritt der anaeroben Glycolyse darstellt. Diese Domäne wäre für die enzymatische Funktion als Lactatdehydrogenase notwendig (gerahmt in Abb. 3). Weiterführende Analysen z.B. mit Algorithmen wie TMpred und pSORT (Nakai & Kanehisa, 1992) prädizieren unterschiedliche subzelluläre Lokalisationen für die putativen Proteine.Not all of the predicted proteins have the catalytic lactate dehydrogenase domain for the NADH-dependent metabolism of pyruvate to lactate, which is the last step in anaerobic glycolysis. This domain would be necessary for the enzymatic function as lactate dehydrogenase (framed in Fig. 3). Further analyzes e.g. with algorithms such as TMpred and pSORT (Nakai & Kanehisa, 1992) predict different subcellular locations for the putative proteins.
Erfmdungsgemäß wurde durch Real-Time-PCR mit einem spezifischen Primer-Probe-Set Expressionslevel quantifiziert. Das Amplicon liegt im Übergang zwischen Exon 1 and 2 und detektiert damit alle Varianten (SEQ ID NO: 1-5). Auch diese Untersuchungen detektieren keine Transkripte in Normalgeweben außer Testis. Sie bestätigen signifikante Expressionslevel in Tumoren (Abb. 4).According to the invention, expression levels were quantified by real-time PCR using a specific primer probe set. The amplicon lies in the transition between exon 1 and 2 and thus detects all variants (SEQ ID NO: 1-5). Detect these tests too no transcripts in normal tissues other than testis. They confirm significant expression levels in tumors (Fig. 4).
Es wurden Antiköφer durch Immunisierung von Kaninchen mit Peptiden hergestellt, die jeweils verschiedene der oben genannten Varianten abdecken: SEQ ID NO:80: MSTVKEQLIEKLIEDDENSQ (aa 1-19) SEQ ID NO: 101: RNGVSDVVKINLNSE (C-terminus) SEQ ID NO:102: GIIWNKRRTLSQYPL (Variante 5.3 spezifisch)Antibodies were produced by immunizing rabbits with peptides, each of which covers various of the variants mentioned above: SEQ ID NO: 80: MSTVKEQLIEKLIEDDENSQ (aa 1-19) SEQ ID NO: 101: RNGVSDVVKINLNSE (C-terminus) SEQ ID NO: 102 : GIIWNKRRTLSQYPL (variant 5.3 specific)
Beispielhaft sollen die Daten dargestellt werden für Antikörper, die gegen SEQ ID NO: 80 gerichtet sind. Diese erkennen in der Westernblot Untersuchung LDHC Protein in Testis- Gewebe aber nicht in anderen Normalgeweben (Abb. 15) und bestätigen somit die RT-PCR Daten auf Transkriptebene. Der spezifische Antiköφer lässt sich auch unter verschiedenen Fixationsbedigungen für Immunfluoreszenz-Untersuchungen nutzen. So ergaben RT-PCR Untersuchungen, dass die Kolonkarzinom Zellinie HCT 116 P kein LDHC exprimiert. Ihre DNA Methyltransferase deletierte Variante HCT 116 DKO allerdings positiv für LDHC ist. Vergleichende Färbungen beider Zellinien mit dem oben genannten Antiköφer delektierten das entsprechende Protein in gut nachweisbarer Menge spezifisch in den als positiv typisierten Zellinien (Abb. 16). Entsprechend qualifiziert sich dieser Antiköφer auch zu immunhistochemischen Färbung von Normal- und Tumorgewebsschnitten durch den kundigen Fachmann. Die Färbung von Testisgewebe z.B. zeigt eine klare Positivität von Keimzellen (Abb. 16).As an example, the data should be presented for antibodies that are directed against SEQ ID NO: 80. These recognize LDHC protein in Testis tissue but not in other normal tissues in the Western blot examination (Fig. 15) and thus confirm the RT-PCR data at the transcript level. The specific antibody can also be used under various fixation conditions for immunofluorescence studies. RT-PCR studies showed that the colon carcinoma cell line HCT 116 P does not express LDHC. However, their DNA methyltransferase deleted variant HCT 116 DKO is positive for LDHC. Comparative staining of both cell lines with the above-mentioned antibody specifically detected the corresponding protein in an easily detectable amount in the cell lines typed as positive (Fig. 16). Accordingly, this antibody also qualifies for immunohistochemical staining of normal and tumor tissue sections by the expert. The staining of testis tissue e.g. shows a clear positivity of germ cells (Fig. 16).
Laktatdehydrogenasen katalysieren die Interkonversion von Pyravat und Laktat in der Glykolyse. Unter aeroben Bedingungen wird Pyruvat als Endprodukt der Glykolyse in die Mitochondrien transportiert, wo es als Substrat für den Zitratzyklus zur Verfügung steht. Der Krebs-Zyklus dient der Generierung von Reduktionsäquivalenten in Form von NADH, die für die ATP-Gewinnung im Rahmen der Atmungskette (oxydative Phosphorylierung) verbraucht werden. Unter anaeroben Bedingungen kann ATP nicht über die Atmungskette generiert werden. Die Zelle reguliert ihren Energiehaushalt unter diesen Bedingungen fast ausschliesslich über die Glykolyse. Pyruvat, das unter diesen Bedingungen nicht verstoffwechselt werden kann, wird durch Laktatdehydrogenasen zu Laktat reduziert. Die verschiedene Laktatdehydrogenase-Isoformen unterscheiden sich in erster Linie durch ihre Gewebsverteilung und unterschiedliche Substratspezifitäten und -affmitäten. Die keimzell-spezifische LDHC katalysiert bevorzugt die Oxidation von Laktat zu Pyruvat und wird auch durch hohe Konzentrationen von Laktat nicht in ihrer Aktivität gehemmt (Goldberg E. Exp. Clin. Immunogenet. 2:120-4, 1985). Diese Eigenschaften sind physiologisch sinnvoll da sich die Spermatiden in einem Milieu entwickeln das durch hohe Laktatkonzentrationen gekennzeichnet ist. Spermatiden bevorzugen Laktat als Energiequelle vor Glucose, Fructose oder Pyruvat (Mita M. Biol. Reprod. 26:445-55, 1982). Die Oxidation von Laktat durch die LDHC stellt Pyruvat als Ausgangssubstrat für den Zitratzyklus zur Verfügung. Demgemäss nutzen Spermatiden bevorzugt den Zitratzyklus als Hauptquelle zur Energiegewinnung (Storey B.T. Biol. Reprod. 16:549-556, 1977). Es ist lange bekannt dass Tumorzellen häufig ihren Energiebedarf über die anaerobe Glykolyse decken, d.h. vermehrt Laktat bilden, und den Zitratzyklus und die Atmungskette auch unter aeroben Bedingungen nicht nutzen. Die molekulare Grundlagen dieses als Warburg-Effekt beschriebenen Phänomens sind bis heute nicht aufgeklärt, ursächlich werden Enzymdefekte in den Mitochondrien und die Überexpression von Schlüsselenzymen der Glykolyse dikutiert. In diesem Zusammenhang könnte die Expression von LDHC, die durch hohe Konzentrationen von Laktat in ihrer Funktion nicht gehemmt wird von Vorteil für den Energiehaushalt der Tumorzelle sein, indem Laktat zur Gewinnung von ATP genutzt werden kann. Mitochondriendefekte, insbesondere Enzymdefekte des Zitratzyklus sind bekannte Alterationen in Tumorzellen. Durch einen Ausfall des Zitratzyklus können keine Reduktionsäquivalente für die Atmungskette generiert werden. Eine mitochondriale Laktatdehydro genäse mit hoher Affinität für Lactat wie die LDHC könnte eine Umgehung für einen defekten Zitratzyklus darstellen. Lactat das über Monocarboxylate-Transporter (MCT) in Mitochondrien transportiert wird könnte intramitochondrial zu Pyruvat oxidiert werden und somit der Generierung von Reduktionsäquivalenten dienen die in der Atmungskette zur ATP- Gewinnnung verbraucht werden. Zur Analyse der subzellulären Lokalisation von von LDHC transfizierten wir die LDHC negative Brusttumorzellinie MCF-7 mit einem Fusionskonstrukt aus LDHC und Green-Fluorescent-Protein und färbten diese Transfektante mit einem Antiköφer gegen den mitochondrialen Marker Cytochrom C. Die Ko-Lolokalisation der beiden Signale in der konfokalen Lasermikroskopie (Abb. 17) beweist die Präsenz von LDHC in Mitochondrien. Somit wäre denkbar dass die Expression LDHC in Tumorzellen tatsächlich einen benefitären Effekt für den Energiehaushalt der Zelle darstellt und eine spezifische Hemmung der LDHC-Aktivität in Tumoren zur Therapie von Tumorerkrankungen genutzt werden könnte. Beispiel 2: Identifizierung von TPTE als neues TumorantigenLactate dehydrogenases catalyze the interconversion of pyravate and lactate in glycolysis. Under aerobic conditions, pyruvate is transported to the mitochondria as the end product of glycolysis, where it is available as a substrate for the citrate cycle. The Krebs cycle is used to generate reduction equivalents in the form of NADH, which are used for ATP production within the respiratory chain (oxidative phosphorylation). Under anaerobic conditions, ATP cannot be generated via the respiratory chain. Under these conditions, the cell regulates its energy balance almost exclusively via glycolysis. Pyruvate, which cannot be metabolized under these conditions, is reduced to lactate by lactate dehydrogenases. The different lactate dehydrogenase isoforms differ primarily in their tissue distribution and different substrate specificities and affinities. The germ cell-specific LDHC preferentially catalyzes the oxidation of lactate to pyruvate and is also not inhibited in its activity by high concentrations of lactate (Goldberg E. Exp. Clin. Immunogenet. 2: 120-4, 1985). These properties are physiologically useful because the spermatids develop in a milieu that is characterized by high lactate concentrations. Spermatids prefer lactate as an energy source over glucose, fructose or pyruvate (Mita M. Biol. Reprod. 26: 445-55, 1982). The oxidation of lactate by the LDHC provides pyruvate as a starting substrate for the citrate cycle. Accordingly, spermatids prefer to use the citrate cycle as the main source of energy (Storey BT Biol. Reprod. 16: 549-556, 1977). It has long been known that tumor cells often cover their energy requirements through anaerobic glycolysis, ie they increasingly produce lactate, and do not use the citrate cycle and the respiratory chain even under aerobic conditions. The molecular basis of this phenomenon, which is described as the Warburg effect, has not yet been elucidated. Caused by enzyme defects in the mitochondria and the overexpression of key enzymes in glycolysis. In this context, the expression of LDHC, which is not inhibited in its function by high concentrations of lactate, could be advantageous for the energy balance of the tumor cell, since lactate can be used to obtain ATP. Mitochondrial defects, especially enzyme defects of the citrate cycle, are known alterations in tumor cells. If the citrate cycle fails, no reduction equivalents can be generated for the respiratory chain. Mitochondrial lactate dehydro genes with high affinity for lactate like LDHC could be a workaround for a defective citrate cycle. Lactate that is transported in mitochondria via monocarboxylate transporters (MCT) could be oxidized intramitochondrially to pyruvate and thus be used to generate reduction equivalents that are used in the respiratory chain to obtain ATP. To analyze the subcellular localization of LDHC, we transfected the LDHC negative breast tumor cell line MCF-7 with a fusion construct from LDHC and green fluorescent protein and stained this transfectant with an antibody against the mitochondrial marker cytochrome C. The co-localization of the two signals in Confocal laser microscopy (Fig. 17) proves the presence of LDHC in mitochondria. It would therefore be conceivable that the expression LDHC in tumor cells actually represents a beneficial effect for the energy balance of the cell and that a specific inhibition of LDHC activity in tumors could be used for the therapy of tumor diseases. Example 2: Identification of TPTE as a new tumor antigen
Die Sequenzen des Transkripts von TPTE (SEQ ID NO: 19) und seines Translationsprodukt (SEQ ID NO:22) sind in GenBank unter der Zugangsnummer NM_013315 veröffentlicht (Walker, S.M. et al., Biochem. J. 360(Pt 2):277-83, 2001; Guipponi M. et al., Hum. Genet. 107(2): 127-31, 2000; Chen H. et al, Hum. Genet. 105(5):399-409, 1999). TPTE wurde als Gen, das für eine mögliche transmembrane Tyrosinphosphatase kodiert, mit Testis- spezifischer Expression beschrieben, die in der perizentromeren Region der Chromosomen 21, 13, 15, 22, and Y liegt (Chen, H. et al., Hum. Genet. 105:399-409, 1999). Erfindungsgemäße Abgleichuntersuchungen zeigen zusätzlich homologe genomische Sequenzen auf den Chromosomen 3 und 7.The sequences of the transcript of TPTE (SEQ ID NO: 19) and its translation product (SEQ ID NO: 22) are published in GenBank under accession number NM_013315 (Walker, SM et al., Biochem. J. 360 (Pt 2): 277 -83, 2001; Guipponi M. et al., Hum. Genet. 107 (2): 127-31, 2000; Chen H. et al, Hum. Genet. 105 (5): 399-409, 1999). TPTE has been described as a gene coding for a possible transmembrane tyrosine phosphatase with Testis-specific expression that is located in the pericentromeric region of chromosomes 21, 13, 15, 22, and Y (Chen, H. et al., Hum. Genet 105: 399-409, 1999). Alignment studies according to the invention additionally show homologous genomic sequences on chromosomes 3 and 7.
Die Membranlokalisation, die z.B. für die Erreichbarkeit von therapeutischen Antiköφern Voraussetzung ist, konnte zweifelsfrei nachgewiesen werden durch Transfektion von TPTE- negativen Zellen mit einem Fusionskonstrukt aus TPTE und Green-Fluorescent-Protein (Abb. 18, rechts). Dieses reichert sich an der Membranoberfläche an und lässt sich dort als kolokalisierend mit anderen bekannten Membranmarkern wie HLA-Molekülen nachweisen.The membrane localization, e.g. A prerequisite for the accessibility of therapeutic antibodies could be proven beyond any doubt by transfection of TPTE-negative cells with a fusion construct of TPTE and green fluorescent protein (Fig. 18, right). This accumulates on the membrane surface and can be shown to be colocalizing with other known membrane markers such as HLA molecules.
Basierend auf der Sequenz von TPTE (SEQ ID NO: 19) wurden erfindungsgemäß PCR- Primer generiert (5*-TGGATGTCACTCTCATCCTTG-3' and 5'-Based on the sequence of TPTE (SEQ ID NO: 19), PCR primers were generated according to the invention (5 * -TGGATGTCACTCTCATCCTTG-3 'and 5'-
CCATAGTTCCTGTTCTATCTG3*-) und für RT-PCR-Analysen (95° 15min; 94° 1 min; 63° 1 min; 72° 1 min; 35 Zyklen) in einer Reihe von humanen Geweben eingesetzt. Es zeigte sich, dass die Expression in Normalgeweben auf Testis beschränkt ist. Wie für die anderen eCT beschrieben, konnte erfindungsgemäß gezeigt werden, dass TPTE-Varianten ektop in einer Reihe von Tumorgeweben aktiviert werden; vgl. Tabelle 2. CCATAGTTCCTGTTCTATCTG3 * -) and for RT-PCR analyzes (95 ° 15min; 94 ° 1 min; 63 ° 1 min; 72 ° 1 min; 35 cycles) in a number of human tissues. It was shown that the expression in normal tissues is limited to testis. As described for the other eCT, it could be shown according to the invention that TPTE variants are activated ectopically in a number of tumor tissues; see. Table 2.
Tabelle 2. Expression von TPTE in TumorenTable 2. Expression of TPTE in tumors
Es wurde eine quantitative Realtime-PCR (40 Zyklen, initiale Denaturierang 15 min 95°C, 30 sek 94°C, 30 sek 62°C, und 30 sek 72°C) mit den spezifischen Primern (sense GAGTCTACAATCTATGCAGTG; antisense CCATAGTTCCTGTTCTATCTG) durchgeführt (Abb. 19). Diese bestätigt nicht nur das Fehlen von TPTE in nicht-testikulärem Normalgewebe und die ektope Expession in Tumoren, sondern deckt hohe Transkriptmengen in den Tumoren auf, die mit der physiologischen expression in Testisgewebe durchaus vergleichbar sind. Die ektope Expression vieler bekannter CT-Gene in Tumoren wird durch Promotordemethylierung induziert. Zur Untersuchung ob dieser Mechanismus auch für die ektope Aktivierung von TPTE effektiv ist, wurden die nicht-exprimierenden Zellinien BT549 (Mamma-Ca) und HCTl 16 (Kolon-Ca) mit 5-Aza-2'-deoxycytidin, einem pharmakologischen Inhibitor der DNA-Methylierung, kultiviert. In beiden Fällen resultierte die Demethylierung der DNA in einer starken Induktion der TPTE-Expression (Abb. 33). Der gleiche Effekt zeigt sich auch in DNA-Methyltransferase DNMT1 und DNMT3b defizienten HCTl 16 Zellen, die durch fast vollständigen Verlust der DNA-Methylierung charakterisiert sind. Diese Ergebnisse belegen dass die Promoterdemethylierung des Genlokus auch für die ektope Induktion der TPTE-Expression effektiv ist. Zum Nachweis von TPTE Protein wurden Antiköφer durch Immunisieren von Kaninchen hergestellt. Folgende Peptide bzw. ein rekombinant in E. coli exprimiertes und gereinigtes Protein wurden zur Propagierung dieser Antiköφer genutzt: SEQ ID NO:103: FTDSKLYIPLEYRSC (aa 116 - 128) SEQ ID NO:104: CFDIKLLRNIPRWT (aa 179 - 191)A quantitative real-time PCR (40 cycles, initial denaturation for 15 min 95 ° C, 30 sec 94 ° C, 30 sec 62 ° C, and 30 sec 72 ° C) with the specific primers (sense GAGTCTACAATCTATGCAGTG; antisense CCATAGTTCCTGTTCTATCTG) was carried out (Fig. 19). This not only confirms the absence of TPTE in non-testicular normal tissue and the ectopic exposure in tumors, but also reveals high amounts of transcripts in the tumors, which are quite comparable to the physiological expression in testis tissue. The ectopic expression of many known CT genes in tumors is induced by promoter demethylation. To investigate whether this mechanism is also effective for the ectopic activation of TPTE, the non-expressing cell lines BT549 (Mamma-Ca) and HCTl 16 (Kolon-Ca) with 5-aza-2'-deoxycytidine, a pharmacological inhibitor of the DNA -Methylation, cultivated. In both cases, demethylation of the DNA resulted in a strong induction of TPTE expression (Fig. 33). The same effect can also be seen in DNA-methyltransferase DNMT1 and DNMT3b deficient HCTl 16 cells, which are characterized by almost complete loss of DNA methylation. These results prove that the promoter demethylation of the gene locus is also effective for the ectopic induction of TPTE expression. To detect TPTE protein, antibodies were produced by immunizing rabbits. The following peptides or a protein recombinantly expressed and purified in E. coli were used to propagate these antibodies: SEQ ID NO: 103: FTDSKLYIPLEYRSC (aa 116-128) SEQ ID NO: 104: CFDIKLLRNIPRWT (aa 179-191)
SEQ ID NO:105: MNESPDPTDLAGVIIELGPNDSPQTSEFKGATEEAPAKESPHTS EFKGAARVSP (rek.Prot. aa 1-54)SEQ ID NO: 105: MNESPDPTDLAGVIIELGPNDSPQTSEFKGATEEAPAKESPHTS EFKGAARVSP (rec. Prot. Aa 1-54)
Beispielhaft sollen die Daten dargestellt werden für Antikörper, die gegen SEQ ID NO: 105 gerichtet sind. Der spezifische Antiköφer lässt sich unter verschiedenen Fixationsbedigungen für Immunfluoreszenz-Untersuchungen nutzen. Bei vergleichenden Färbungen von RT-PCR positiven wie auch negativen Zellinien ist das entsprechende Protein in gut nachweisbarer Menge spezifisch in den als positiv typisierten Zellinien detektierbar (Abb. 18, rechts). Das endogene Protein ist membranlokalisiert. Dieser Antiköφer wurde des weiteren eingesetzt zur immunhistochemischen Färbung von Gewebsschnitten. Wie erwartet färbt der Antiköφer Testisgewebe spezifisch an. Insbesondere sind es Keimzellen, die angefärbt werden (Abb. 20). Auch Gewebeschnitte von Lungenkarzinomen lassen sich anfärben. TPTE Protein lässt sich dabei homogen und in grosser Menge in allen Zellen eines Tumors detektieren. Auch hier bestätigt sich die Lokalisation des Proteins an der Membran der Zellen (Abb. 21). Die Spezifität der Färbung wurde durch Kompetitionsexperimente bestätigt. Der spezifische Antiköφer wurde zunächst mit rekombinantem TPTE Protein vor-inkubiert und danach auf die Gewebeschnitte (z.B. Testis als Positivkontrolle, Abb. 20) verbracht. Hierdurch lässt sich die Reaktivität erfolgreich blockieren. Mit diesem Antiköφer lassen sich viele verschiedene primäre Tumortypen (auch Brusttumoren, Melanome etc.) aber nicht das dazugehörige Normalgewebe erfolgreich anfärben. Beispielhaft ist auch dargestellt eine Färbung von Prostatagewebe. Normales Prostatagewebe ist negativ, während invasive wie auch noch nicht invadierte Prostatatumoren positiv für dieses Molekül sind. Auch eine einfache Hypertrophie von Prostata-Epithel färbt sich nicht an, allerdings innerhalb dieser gutartigen Veränderung bereits vorliegende premaligne Bereiche, die in der Folge transformieren werden sind TPTE positiv. Entsprechend kann ein solcher spezifischer Antiköφer gegen TPTE dazu dienen, diagnostisch eine bestehende Anlage für Prosatakarzinome früh zu detektieren. Des weiteren wurde der Antiköφer zum Expressionsnachweis von TPTE im Western-Blot eingesetzt. Proteinexpression konnte in Lysaten aus Testisgewebe und spontan exprimierenden Zellinien nachgewiesen werden, Normalgewebe zeigten wie erwartet keine Expression (Abb. 34). Erfindungsgemäß wurden für TPTE weitere Splicevarianten identifiziert (SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57), die in testikulärem Gewebe und Tumoren exprimiert werden und Leserasterverschiebungen und somit veränderte Sequenzbereiche aufweisen (Abb. 5).As an example, the data should be presented for antibodies that are directed against SEQ ID NO: 105. The specific antibody can be used under various fixation conditions for immunofluorescence studies. In the case of comparative staining of RT-PCR positive and negative cell lines, the corresponding protein can be detected in a clearly detectable amount specifically in the cell lines typified as positive (Fig. 18, right). The endogenous protein is membrane-localized. This antibody was also used for immunohistochemical staining of tissue sections. As expected, the antibody stains testis tissue specifically. In particular, it is the germ cells that are stained (Fig. 20). Tissue sections from lung carcinomas can also be stained. TPTE protein can be detected homogeneously and in large quantities in all cells of a tumor. The localization of the protein on the membrane of the cells is also confirmed here (Fig. 21). The specificity of the staining was confirmed by competition experiments. The specific antibody was first pre-incubated with recombinant TPTE protein and then placed on the tissue sections (eg Testis as a positive control, Fig. 20). This can successfully block the reactivity. This antibody can be used to successfully stain many different primary tumor types (including breast tumors, melanomas, etc.) but not the associated normal tissue. A staining of prostate tissue is also shown as an example. Normal prostate tissue is negative, while invasive as well as not yet invaded prostate tumors are positive for this molecule. Even a simple hypertrophy of the prostate epithelium does not stain, but within this benign change, premalignant areas that are already present and will subsequently be transformed are TPTE positive. Correspondingly, such a specific antibody against TPTE can be used to diagnose an existing plant for prostate cancer early. Furthermore, the antibody was used for the detection of TPTE expression in a Western blot. Protein expression could be detected in lysates from testis tissue and spontaneously expressing cell lines, normal tissue showed no expression as expected (Fig. 34). According to the invention, further splice variants were identified for TPTE (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57), which are found in testicular tissue and Tumors are expressed and have frame changes and thus changed sequence areas (Fig. 5).
Die genomische Sequenz von TPTE besteht aus 24 Exons (Zugangsnummer NT_029430). Das in SEQ ID NO: 19 gezeigte Transkript enthält alle diese Exons. Die in SEQ ID NO:20 gezeigte Splicevariante entsteht durch heraussplicen von Exon 7. Die in SEQ ID NO:21 gezeigte Splicevariante zeigt eine partielle Inkoφoration eines Introns, das auf Exon 15 folgt. Wie aus den Varianten SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 ersichtlich, können alternativ auch Exons 18, 19, 20 und 21 herausgesplict werden. Diese alternativen Splicing-Ereignisse resultieren in Veränderungen des kodierten Proteins, wobei das Leseraster grundsätzlich erhalten bleibt (Abb. 6). Beispielsweise weist das Translationsprodukt, das von der in SEQ ID NO:20 gezeigten Sequenz kodiert wird (SEQ ID NO:23) eine Deletion von 13 Aminosäuren im Vergleich zu der in SEQ ID NO:22 gezeigten Sequenz auf. Das Translationsprodukt, das von der in SEQ ID NO:21 gezeigten Sequenz kodiert wird (SEQ ID 24) trägt eine zusätzliche Insertion im zentralen Bereich des Moleküls und unterscheidet sich dadurch um 14 Aminosäuren von den anderen Varianten. Die Translationsprodukte der Varianten SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 nämlich die Proteine SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 sind ebenfalls verändert.The TPTE genomic sequence consists of 24 exons (accession number NT_029430). The transcript shown in SEQ ID NO: 19 contains all of these exons. The splice variant shown in SEQ ID NO: 20 results from splicing out exon 7. The splicing variant shown in SEQ ID NO: 21 shows a partial incoherence of an intron that follows exon 15. As can be seen from the variants SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, exons 18, 19, 20 and 21 can alternatively be spliced out. These alternative splicing events result in changes in the encoded protein, whereby the reading frame is basically retained (Fig. 6). For example, the translation product encoded by the sequence shown in SEQ ID NO: 20 (SEQ ID NO: 23) has a deletion of 13 amino acids compared to the sequence shown in SEQ ID NO: 22. The translation product which is encoded by the sequence shown in SEQ ID NO: 21 (SEQ ID 24) carries an additional insertion in the central region of the molecule and thus differs from the other variants by 14 amino acids. The translation products of the variants SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, namely the proteins SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 are also changed.
Analysen zur Prädiktion funktioneller Domänen ergeben für SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, aber nicht für SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, das Vorhandensein einer Tyrosinphosphatase-Domäne. Für alle Varianten werden 3-4 Transmembrandomänen prädiziert (Abb. 6).Analyzes for the prediction of functional domains for SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, but not for SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, the presence of a tyrosine phosphatase domain. 3-4 transmembrane domains are predicted for all variants (Fig. 6).
Die Analyse der TPTE-Antigen-Expression mit spezifischen Antiköφern bestätigte die selektive Expression in Testis sowie in einer Reihe von unterschiedlichen Tumoren. Durch Kolokalisationsuntersuchungen zeigte sich zudem, dass TPTE erfindungsgemäß mit Klasse I Histokompatibilitätsantigenen an der Zelloberfläche von Tumorzellen lokalisiert ist. Bisher war TPTE lediglich als Golgi-assoziiertes Protein beschrieben worden. Aufgrund der Expression von TPTE auf der Zelloberfläche von Tumorzellen eignet sich dieses Tumorantigen erfindungsgemäß als hervorragendes Target für die Entwicklung diagnostischer und therapeutischer monoklonaler Antiköφer. Aufgrund der prädizierten Membrantopologie von TPTE eignen sich für diesen Zweck erfindungsgemäß insbesondere die extrazellulär exponierten Bereiche. Dies umfasst erfindungsgemäß die Peptide FTDSKLYIPLEYRS (SEQ ID NO:81) und FDIKLLRNIPRWT (SEQ ID NO:82). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass TPTE die Migration von Tumorzellen fördert. Zellen die für mehrere Stunden in Minimalmedium ohne FCS kultiviert werden neigen zur spontanen Ausbildung von Pseudopodien und Membranprotrusionen. Sowohl in heterolog exprimierenden Zellen (TPTE-eGFP) als auch in spontan exprimierenden Zellinien (AK- Färbung) konnte eine ausgeprägte Anreicherung des Proteins an der Membran dieser Struktur nachgewiesen werden. Ferner ergab eine Ko-Färbung mit Rhodamine-Phalloidin eine eindeutige Ko-Lokalisation von TPTE mit F-Aktin in diesen Bereichen. Die durch Second Messenger wie Phosphoinisitide und Kalzium vermittelte Aktin-Polymerisierung ist ein kritischer Faktor für die Initiierung der Zellmigration in Reaktion auf extrazelluläre Gradienten von Chemotaktika. Die Signaltransduktion über diese Second Messenger wird hauptsächlich durch Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK) initiiert. Einer der wichtigsten Faktoren in der Regulation des Second Messenger Signalling über Phosphoinositide und der daraus folgenden Modulation des Aktin-Zytoskeletts ist die RTK c-erbB-2 (HER2), die in verschiedenen Tumortypen frequent überexprimiert wird. Diese Ergebnisse führten zur Überlegung dass TPTE als zellmembranständige Lipidphosphatase mit Substratspezifität für PιP3,4,5 eine regulierende Funktion auf die RTK- vermittelte Signaltransduktion hat und somit modulierende Effekt auf die Membrandynamik in Tumorzellen ausübt. Für eine detaiherte Analyse wurde TPTE-eGFP in NIH3T3 Fibroblasten exprimiert die durch Transformation mit c-erbB-2 ein konstitutiv aktiviertes PI-3 Kinase Signalling und somit eine Übeφroduktion des Second Messengers PIP3,4>5 aufweisen. Time-Lapse Mikroskopie dieser Zellen nach mehrstündiger Kultivierung in Minimalmedium zeigte, dass die Lokalisation von TPTE an der Membran von Pseudopodien und Protrusionen unverzüglich zur Refraktion des entsprechenden Memranbereichs führt. Eine Erklärung für diese Beobachtung bietet der PI-3 Kinase antagonistische Effekt der TPTE der durch die Termination der RTK-vermittelten Signaltransduktion die Aktin-Polimerisation unter dem betroffene Membranbereich beendet. Diese PI-3K antagonistischen Effekte von TPTE werden durch Dephosphorylierung des Second Messengers PIP3, j5 zu PIP4,5 vermittelt. PIP4js reguliert die kortikale Aktinpolymerisation und vermittelt die Adhäsion des Zytoskeletts an die Plasmamembran. Zum Nachweis der Kolokalisation von TPTE und PIP4>5 and wurden TPTE transfizierte NIH3T3/c-erbB2 Zellen mit der eGFP gekoppelten PH-Domäne von Phospholipase C-δl (PLC-δl) kotransfiziert. Die PH-Domäne vermittelt die spezifische Bindung von PLC-δl an ihr physiologisches Substrat PIP ;5, daher ist sie für die Darstellung der PIP >5 Verteilung and der Plasmamembran hervorragend geeignet. Erwartungsgemäss zeigte sich in den kotransfizierten Zellen eine eindeutige Kolokalisation von TPTE und PIP >5 an der Plasmamembran (Abb. 35). Dies konnte in weiteren Untersuchungen durch Kofärbung mit einem PIP j5-spezifischen Antiköφer nochmals bestätigt werden. Kürzlich wurde gezeigt, dass das zu TPTE homologe PTEN das migratorische Potential von Zellen positiv reguliert. Zellmigration ist ein direktionaler Prozess für den die Wahrnehmung extrazellulärer Gradienten von Chemotaktika von essentieller Bedeutung ist. Gerichtete Zellmigration bedingt, dass die Zelle nach Detektion des Chemotaktikums in Richtung des Gradienten polarisiert. PTEN vermittelt die Polarisation der Zelle durch Ausbildung eines intrazellulären Gradienten von Second Messenger PIP3,4,5 in Richtung des extrazellulären Gradienten und somit eine gerichtete Aktin-Polimerisation und Migration. Zur Untersuchung, ob TPTE ähnliche promigratorische Eigenschaften besitzt wurde ein Transwell-Migrationsassay durchgeführt. TPTE transfizierte NIH3T3/c-erbB-2 Zellen und entsprechende Kontrollzellen (nicht-transfizierte NIH3T3/c-erbB-2 Zellen und mit Leer-peGFP- Vektor transfizierte NIH3T3/c-erbB-2 Zellen) wurden mit verschiedenen Mengen an chemischen Lockstoffen getestet. Zellen, die TPTE exprimierten, zeigten eine signifikant erhöhte Migrationsrate von mehr als vierfach im Vergleich zu den Kontrollzellen in Reaktion auf 10% FCS (Abb. 23). Durch den Einsatz von RNA-Interferenz (RNAi) konnte der Nachweis erbracht werden dass auch die spontane Expression von TPTE in Tumorzellinien die Chemotaxis dieser Zellen verstärkt. Hierzu wurden TPTE-positive PC-3 Prostatakarzinomzellen mit TPTE-spezifischen doppelsträngigen RNA-Oligos (sense 5'-CCCUGCCACAUGUUCAUAUdTdT-3' und antisense 5'-AUAUGAACAUGUGGCAGGGdTdT-3') elektroporiert. Nach 24 Stunden konnte mittels quantitativer Real-Time RT-PCR eine Abnahme der TPTE-Expression um 70% nachgewiesen werden (Abb. 36). Im Transwell-Migrationsassay zeigte sich eine deutliche Reduktion der Migrationsrate (70%) im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen (unbehandelte PC-3 Zellen und PC-3 Zellen die mit irrelevanter siRNA elektroporiert wurden) (Abb. 37). Während PTEN ein cytoplasmatisches Protein ist, das mittels PH-Domänen-rekrutierenden Second Messengern wie PIP3,4,5 zu der Plasmamembran gelenkt werden kann, könnte TPTE im Gegensatz dazu eine Wahrnehmung von chemotaktischen Gradienten direkt an der Membran durch eine Blockierung der Signaltransduktion von aktivierten RTKs modulieren, die häufig in Krebszellen überexprimiert sind, und dadurch eine Wahrnehmung eines räumlichen Gradienten vermitteln. Phosphatasen sind oft bei der Zellmotilität und Migration involviert. Um die Bedeutung der TPTE bei Zellbewegung zu prüfen, wurde TPTE als Fusionsprotein mit Green-Fluorescence Protein in eine TPTE-negative Zellinie eingebracht und die Verteilung dieses Proteins in vivo mittels Real-time Mikroskopie beobachtet. Zellen bilden Membranausläufer (Protrusionen) als Vorstufe zur Migration. Nach Ausbildung einer solchen Protrusion sammelt sich TPTE an diesem Membranbereich an (Abb. 22). Bei beginnender Abflachung der Protrusion wird TPTE von der Membran zurückgezogen und internalisiert und ist offensichtlich in den Ablauf von Motilitätsereignissen der Zelle involviert. Gleichsam ergibt der Vergleich der Wandereigenschaften der mit TPTE- versus Kontrollplasmid-transfizierten Zellen in der Migrationskammer (BOYDEN Chamber), dass TPTE zu einer signifikanten Erhöhung der Migration entlang chemotaktischer Gradienten von Wachstumsfaktoren (hier z.B. PDGF=Platelet-derived Growth Factor, oder FCSHFetales Kalbsserum) führt (Abb. 23).Analysis of the TPTE antigen expression with specific antibodies confirmed the selective expression in Testis and in a number of different tumors. Colocalization studies also showed that, according to the invention, TPTE is localized with class I histocompatibility antigens on the cell surface of tumor cells. Previously, TPTE had only been described as a Golgi-associated protein. Due to the expression of TPTE on the cell surface of tumor cells, this tumor antigen is suitable according to the invention as an excellent target for the development of diagnostic and therapeutic monoclonal antibodies. Because of the predicted Membrane topology of TPTE are particularly suitable for this purpose according to the invention in the extracellularly exposed areas. According to the invention, this includes the peptides FTDSKLYIPLEYRS (SEQ ID NO: 81) and FDIKLLRNIPRWT (SEQ ID NO: 82). It was also shown that TPTE promotes the migration of tumor cells. Cells that are cultivated for several hours in minimal medium without FCS tend to spontaneously develop pseudopodia and membrane protrusions. A pronounced accumulation of the protein on the membrane of this structure was demonstrated both in heterologously expressing cells (TPTE-eGFP) and in spontaneously expressing cell lines (AK staining). Furthermore, co-staining with rhodamine-phalloidin resulted in clear co-localization of TPTE with F-actin in these areas. Actin polymerization mediated by second messengers such as phosphoinisitides and calcium is a critical factor in initiating cell migration in response to extracellular gradients of chemotactics. Signal transduction via these second messengers is mainly initiated by receptor tyrosine kinases (RTK). One of the most important factors in the regulation of second messenger signaling via phosphoinositides and the resulting modulation of the actin cytoskeleton is the RTK c-erbB-2 (HER2), which is overexpressed in various tumor types. These results led to the consideration that TPTE as a cell membrane-bound lipid phosphatase with substrate specificity for PιP 3,4,5 has a regulating function on the RTK-mediated signal transduction and thus exerts a modulating effect on the membrane dynamics in tumor cells. For a detailed analysis, TPTE-eGFP was expressed in NIH3T3 fibroblasts which, by transformation with c-erbB-2, have a constitutively activated PI-3 kinase signaling and thus an overproduction of the second messenger PIP 3.4> 5 . Time-lapse microscopy of these cells after culturing for several hours in minimal medium showed that the localization of TPTE on the membrane of pseudopodia and protrusions immediately leads to refraction of the corresponding membrane area. An explanation for this observation is provided by the PI-3 kinase antagonistic effect of the TPTE, which terminates the actin polymerization under the affected membrane area by terminating the RTK-mediated signal transduction. These PI-3K antagonistic effects of TPTE are mediated by dephosphorylation of the second messenger PIP3, j5 to PIP 4 , 5 . PIP 4j s regulates cortical actin polymerization and mediates the adhesion of the cytoskeleton to the plasma membrane. To detect the colocalization of TPTE and PIP 4> 5 and TPTE transfected NIH3T3 / c-erbB2 cells were co-transfected with the eGFP-coupled PH domain of phospholipase C-δl (PLC-δl). The PH domain mediates the specific binding of PLC-δl its physiological substrate PIP ; 5 , therefore it is ideally suited for the representation of the PIP > 5 distribution on the plasma membrane. As expected, there was a clear colocalization of TPTE and PIP > 5 on the plasma membrane in the cotransfected cells (Fig. 35). This could be confirmed in further investigations by co-staining with a PIP j 5-specific antibody. It was recently shown that the PTEN homologous to TPTE positively regulates the migratory potential of cells. Cell migration is a directional process for which the perception of extracellular gradients of chemotactics is essential. Directed cell migration requires the cell to polarize in the direction of the gradient after detection of the chemotactic. PTEN mediates the polarization of the cell by forming an intracellular gradient from second messenger PIP 3 , 4, 5 in the direction of the extracellular gradient and thus directed actin polymerization and migration. A Transwell migration assay was carried out to investigate whether TPTE has similar promigratory properties. NIH3T3 / c-erbB-2 cells transfected with TPTE and corresponding control cells (NIH3T3 / c-erbB-2 non-transfected cells and NIH3T3 / c-erbB-2 cells transfected with an empty peGFP vector) were tested with different amounts of chemical attractants , Cells expressing TPTE showed a significantly increased migration rate of more than fourfold compared to the control cells in response to 10% FCS (Fig. 23). Through the use of RNA interference (RNAi), it was possible to prove that the spontaneous expression of TPTE in tumor cell lines also increases the chemotaxis of these cells. For this purpose, TPTE-positive PC-3 prostate cancer cells were electroporated with TPTE-specific double-stranded RNA oligos (sense 5'-CCCUGCCACAUGUUCAUAUdTdT-3 'and antisense 5'-AUAUGAACAUGUGGCAGGGdTdT-3'). After 24 hours, a quantitative real-time RT-PCR showed a decrease in TPTE expression by 70% (Fig. 36). The Transwell migration assay showed a significant reduction in the migration rate (70%) compared to the corresponding controls (untreated PC-3 cells and PC-3 cells that were electroporated with irrelevant siRNA) (Fig. 37). In contrast, while PTEN is a cytoplasmic protein that can be directed to the plasma membrane using PH domain-recruiting second messengers such as PIP 3,4,5 , TPTE could perceive chemotactic gradients directly on the membrane by blocking signal transduction from modulate activated RTKs, which are often overexpressed in cancer cells, thereby conveying a spatial gradient perception. Phosphatases are often involved in cell motility and migration. In order to test the importance of TPTE in cell movement, TPTE was introduced into a TPTE-negative cell line as a fusion protein with green fluorescence protein and the distribution of this protein was observed in vivo using real-time microscopy. Cells form membrane extensions (protrusions) as a precursor to migration. After forming such a protrusion, TPTE accumulates on this membrane area (Fig. 22). When the protrusion begins to flatten, TPTE is withdrawn from the membrane and internalized, and is obviously involved in the course of motility events in the cell. At the same time, the comparison of the migration properties of the cells transfected with TPTE versus control plasmid in the migration chamber (BOYDEN Chamber) shows that TPTE significantly increases the migration along chemotactic gradients of growth factors (here, for example, PDGF = platelet-derived growth factor, or FCSH fetal calf serum ) leads (Fig. 23).
Da TPTE einer Zelle offensichtlich promigratorische Eigenschaften vermittelt, wurden Brast- bzw. Lungentumoren von insgesamt 58 Patienten auf Expression von TPTE untersucht und statistisch mit derm Krankheitsverlauf der Patienten verglichen. Diejenigen Tumoren, die TPTE exprimieren, neigen signifikant häufiger zu Lymphknoten- aber auch zu Fernmetastasen als die TPTE-negativen (Abb. 24).Since TPTE apparently imparts promigratory properties to a cell, Brast or lung tumors of a total of 58 patients were examined for expression of TPTE and compared statistically with the course of the patient's disease. Those tumors that express TPTE are significantly more likely to have lymph nodes, but also distant metastases, than the TPTE-negative ones (Fig. 24).
Diese funktionellen Daten deuten daraufhin, dass TPTE bei der Metastasierung von Tumoren eine wesentliche Rolle spielt. Entsprechend kann TPTE als Marker für prognostisch schlechteren Verlauf und Metastasenneigung gelten. Ferner können Verfahren, die erfindungsgemäß die endogene Aktivität von TPTE in Tumorzellen inhibieren, z.B. durch den Einsatz von Antisene RNA, unterschiedlicher Methoden der RNA-Interferenz (RNAi) mittels Expressionsvektoren oder Retroviren, sowie durch den Einsatz von kleinen Moleküle, zu einer reduzierten Meatstasierung führen und somit therapeutisch sehr bedeutsam sein.These functional data indicate that TPTE plays an essential role in the metastasis of tumors. Accordingly, TPTE can be used as a marker for prognostically worse progression and tendency to metastasis. Furthermore, methods which inhibit the endogenous activity of TPTE in tumor cells, e.g. through the use of antisene RNA, different methods of RNA interference (RNAi) using expression vectors or retroviruses, as well as through the use of small molecules, lead to reduced breast stasis and are therefore therapeutically very important.
Beispiel 3: Identifizierung von TSBP als neues TumorantigenExample 3: Identification of TSBP as a new tumor antigen
Das erfindungsgemäß eingesetzte elektronische Klonierungsverfahren ergab TSBP (SEQ ID NO:29) und das davon abgeleitete Protein (SEQ ID NO:30). Das Gen ist als Testis-spezifisch reguliert vorbeschrieben (Zugangsnummer NM_006781). Es wurde prädiziert, dass das Gen ein basisches Protein kodiert und auf Chromosom 6 in der Nähe einer für einen MHC- Komplex kodierenden Sequenz (C6orfl0) lokalisiert ist (Stammers M. et al., Immuno genetics 51(4-5):373-82, 2000). Erfindungsgemäß wurde gezeigt, dass die vorbeschriebene Sequenz fehlerhaft ist. Die erfindungsgemäße Sequenz weist signifikante Sequenzunterschiede zu der bekannten Sequenz auf. Erfindungsgemäß wurden 3 verschiedene Splicingvarianten kloniert. Die Unterschiede in den Nukleotidsequenzen der erfindungsgemäß aufgefundenen TSBP- Varianten (SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33) zu der bekannten Sequenz (NM 006781, SEQ ID NO:29) sind in Abb. 7 gezeigt (Unterschiede fett dargestellt). Sie führen zu Leserasterverschiebungen, so dass sich die Proteine, die durch die erfindungsgemäß aufgefundenen TSBP-Varianten kodiert werden (SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36) substantiell von dem vorbeschriebenen Protein (SEQ ID NO:30) unterscheiden (Abb. 8).The electronic cloning method used according to the invention gave TSBP (SEQ ID NO: 29) and the protein derived therefrom (SEQ ID NO: 30). The gene is described as Testis-specifically regulated (accession number NM_006781). The gene was predicted to encode a basic protein and to be located on chromosome 6 in the vicinity of a sequence coding for an MHC complex (C6orfl0) (Stammers M. et al., Immuno genetics 51 (4-5): 373-82, 2000). According to the invention, it was shown that the sequence described above is incorrect. The sequence according to the invention has significant sequence differences from the known sequence. According to the invention, 3 different splicing variants were cloned. The differences in the nucleotide sequences of the TSBP variants found according to the invention (SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33) from the known sequence (NM 006781, SEQ ID NO: 29) are shown in FIG. 7 (Differences shown in bold). They lead to reading frame shifts, so that the proteins which are encoded by the TSBP variants found according to the invention (SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36) differ substantially from the protein described above (SEQ ID NO: 30) differentiate (Fig. 8).
Für dieses Antigen wurde erfindungsgemäß eine strikte transkriptionale Repression in Normalgeweben bestätigt (PCR-primer 5'-TCTAGCACTGTCTCGATCAAG-3' und 5'- TGTCCTCTTGGTACATCTGAC-3'). Allerdings wurde in 25 untersuchten Normalgeweben außer in Testis auch in normalem Lymphknotengewebe TSBP exprimiert. Erfindungsgemäß wurde auch für TSBP eine ektope Aktivierung in Tumoren nachgewiesen, weshalb es sich als Tumormarker bzw. Tumor-assoziiertes Antigen qualifiziert (Tabelle 3). TSBP-Expression findet sich zwar in primärem Tumorgewebe aber nicht in permanenten Zellinien aus entsprechenden Tumorentitäten. Außerdem liegt das Gen in direkter Nachbarschaft zu Notch 4, das eine spezifische Expression in Arterien aufweißt und in die vaskuläre Moφhogenese involviert ist. Dies sind signifikante Hinweise dafür, dass es sich hier um einen Marker für spezifische Endothelzellen handelt. TSBP kann daher als potentieller Marker für Tumorendothelien und für neovaskuläres Targeting dienen. Mithin kann der Promotor von TSBP an ein anderes Genprodukt kloniert werden, dessen selektive Expression im Lymphknoten erwünscht ist. Die Analyse der TSBP-Antigen-Expression mit spezifischen Antiköφern bestätigte die selektive Lokalisation des Proteins in Testis und Lymphknoten sowie in Melanomen und Bronchialkarzinomen. Darüber hinaus zeigten immunhistologische Untersuchungen mit GFP- getaggtem TSBP eine ausgeprägte perinukleäre Akkumulation. Tabelle 3. Expression von TSBP in TumorenFor this antigen, strict transcriptional repression in normal tissues was confirmed according to the invention (PCR primer 5'-TCTAGCACTGTCTCGATCAAG-3 'and 5'-TGTCCTCTTGGTACATCTGAC-3'). However, in 25 normal tissues examined, TSBP was also expressed in normal lymph node tissue in addition to Testis. According to the invention, an ectopic activation in tumors was also detected for TSBP, which is why it qualifies as a tumor marker or tumor-associated antigen (Table 3). TSBP expression is found in primary tumor tissue, but not in permanent cell lines from corresponding tumor entities. In addition, the gene is in the immediate vicinity of Notch 4, which has a specific expression in arteries and is involved in vascular morphogenesis. This is significant evidence that this is a marker for specific endothelial cells. TSBP can therefore serve as a potential marker for tumor endothelia and for neovascular targeting. The TSBP promoter can thus be cloned to another gene product whose selective expression in the lymph node is desired. Analysis of TSBP antigen expression with specific antibodies confirmed the selective localization of the protein in testis and lymph nodes as well as in melanoma and bronchial carcinoma. In addition, immunohistological examinations with GFP-tagged TSBP showed a pronounced perinuclear accumulation. Table 3. Expression of TSBP in tumors
Zum Nachweis von TSBP Protein wurden Antiköφer durch Immunisieren von Kaninchen hergestellt. Folgende Peptide bzw. ein rekombinant in E. coli exprimiertes und gereinigtes Protein wurden zur Propagierung dieser Antiköφer genutzt: SEQ ID NO: 106: CYQHKVTLHMITERDP (aa 60 - 74) SEQ ID NO:107: CRIPQVHTMDSSGKI (aa 191 - 204) SEQ ID NO:108:To detect TSBP protein, antibodies were produced by immunizing rabbits. The following peptides or a protein recombinantly expressed and purified in E. coli were used to propagate these antibodies: SEQ ID NO: 106: CYQHKVTLHMITERDP (aa 60-74) SEQ ID NO: 107: CRIPQVHTMDSSGKI (aa 191-204) SEQ ID NO : 108:
RRKQSEMHISRYSSEQSARLLDYEDGRGSRHAYSTQSDTSCDNRERSKRDYTPSTNSL ALSRSSIALPQGSMSSIKCLQTTEELPSRTAGAMMQFTAPIPGATGPIKLSQKTIVQTPG PΓVQYPGPNVRSHPHTITGPPSAPRGPPMAPIIISQRTASQLAAPIIISQRTARIPQVHTM DSSGKTTLTPVVILTGYMDEELAKKSCSKIQILKCGGTARSQNSREENKEALKNDIIFT NSVESLKSAHIKEPEREGKGTDLEKDKIGMEVKVDSDAGIPKRQETQLKISEMSIPQG QGAQIKKSVSDVPRGQESQVKKSESGVPKGQEAQVTKSGLVVLKGQEAQVEKSEMG VPRRQESQVKKSQSGVSKGQEAQVKKRESVVLKGQEAQVEKSELKVPKGQEGQVE KTEADVPKEQEVQEKKSEAGVLKGPESQVKNTEVSVPETLESQVKKSESGVLKGQEA QEKKESFEDKGNNDKEKERDAEKDPNKKEKGDKNTKGDKGKDKVKGKRESEINGE KSKGSKRAKANTGRKYNKKVEE (rek.Prot. 29 - 569) Beispielhaft sollen die Daten dargestellt werden für Antiköφer, die gegen SEQ ID NO: 108 gerichtet sind. Der spezifische Antiköφer lässt sich unter verschiedenen Fixationsbedigungen für Immunfluoreszenz-Untersuchungen nutzen. So ergaben RT-PCR Untersuchungen, dass die Kolonkarzinom Zellinie HCT 116 P kein TSBP exprimiert. Ihre DNA Methyltransferase deletierte Variante HCT 116 DKO allerdings positiv für TSBP ist. Vergleichende Färbungen beider Zellinien mit dem oben genannten Antikörper detektierten das entsprechende Protein in gut nachweisbarer Menge spezifisch in den als positiv typisierten Zellinien (Abb. 25). Das endogene Protein ist in erster Linie an der Kern- und ER-Membran lokalisiert mit einer leichten Anfärbung der Plasmamembran.RRKQSEMHISRYSSEQSARLLDYEDGRGSRHAYSTQSDTSCDNRERSKRDYTPSTNSL ALSRSSIALPQGSMSSIKCLQTTEELPSRTAGAMMQFTAPIPGATGPIKLSQKTIVQTPG PΓVQYPGPNVRSHPHTITGPPSAPRGPPMAPIIISQRTASQLAAPIIISQRTARIPQVHTM DSSGKTTLTPVVILTGYMDEELAKKSCSKIQILKCGGTARSQNSREENKEALKNDIIFT NSVESLKSAHIKEPEREGKGTDLEKDKIGMEVKVDSDAGIPKRQETQLKISEMSIPQG QGAQIKKSVSDVPRGQESQVKKSESGVPKGQEAQVTKSGLVVLKGQEAQVEKSEMG VPRRQESQVKKSQSGVSKGQEAQVKKRESVVLKGQEAQVEKSELKVPKGQEGQVE KTEADVPKEQEVQEKKSEAGVLKGPESQVKNTEVSVPETLESQVKKSESGVLKGQEA QEKKESFEDKGNNDKEKERDAEKDPNKKEKGDKNTKGDKGKDKVKGKRESEINGE KSKGSKRAKANTGRKYNKKVEE (rek.Prot. 29 - 569) The data should be shown as an example for antibodies which are directed against SEQ ID NO: 108. The specific antibody can be used under various fixation conditions for immunofluorescence studies. RT-PCR studies showed that the colon carcinoma cell line HCT 116 P does not express TSBP. However, their DNA methyltransferase deleted variant HCT 116 DKO is positive for TSBP. Comparative staining of both cell lines with the above-mentioned antibody specifically detected the corresponding protein in an easily detectable amount in the cell lines typed as positive (Fig. 25). The endogenous protein is primarily localized on the core and ER membrane with a slight staining of the plasma membrane.
Dieser Antiköφer wurde des weiteren eingesetzt zur immunhistochemischen Färbung von Gewebsschnitten. Wie erwartet färbt der Antikörper Testisgewebe spezifisch an. Insbesondere sind es Keimzellen, die angefärbt werden (Abb. 25). In der bioinformatischen Analyse zeigt sich dass TSBP ein stark basisches Protein mit nuklearem Lokahsationssignal ist. Dementsprechend wird die subzelluläre Lokalisation des Proteins eindeutig nuklear prädiziert, während das endogen exprimierte Protein wie oben beschrieben an der Kernmembran lokalisiert ist. Der N-Terminus enthält eine Transmembrandomäne gefolgt von einer proteolytischen Spaltstelle, was darauf schliessen lässt dass die Transmembrandomäne im Verlauf der Proteinprozessierung durch Proteasen abgespalten wird. Diese Kombination von nuklearen Lokalisationssignalen, Lokalisation des Proteins an Kern-, ER- oder Plasma-Membranen und Transmembrandomänen gefolgt von proteolytischen Spaltstellen findet sich bei einer distinkten Klasse von Transkriptionsfaktoren von denen Mitglieder der NOTCH-Familie und SREBP am besten charakterisiert sind (Weinmaster G. Curr. Opin. Genet. Dev. 10(4):363-9, 2000; Hoppe T. et al. Curr. Opin. Cell Biol. 13(3):344-8, 2001)). Die biologische Aktivität dieser Faktoren wird durch den Mechanismus der Regulierten Intramembran Proteolyse (RIP) reguliert. Nach der Translation werden die Proteine über die Transmembrandomäne in die Kern-, ER- oder Plasmamembran integriert. Im Falle von NOTCH induziert die Bindung eines spezifischen Liganden die proteolytische Abspaltung unterhalb der Membrandomäne so dass das Protein an den Ort der Wirkung gelangt. Transkriptionsprozesse können auf diese Weise z.B. im Laufe der Organentwicklung milieuabhängig reguliert werden. Aufgrund seiner strukturellen Merkmale und der membranständigen Lokalisation könnte TSBP in diese Klasse eingeordnet werden. Zwar enthält die TSBP-Sequenz keine spezifischen DNA-bindenden Strukturelemente, doch macht die hohe Basizität des Proteins eine Bindung an DNA wahrscheinlich, so dass es sich bei TSBP um einen Transkriptionsfaktor bzw. transkriptionsmodulierenden Faktor handeln könnte.This antibody was also used for immunohistochemical staining of tissue sections. As expected, the antibody stains testis tissue specifically. In particular, it is the germ cells that are stained (Fig. 25). The bioinformatic analysis shows that TSBP is a strongly basic protein with a nuclear localization signal. Accordingly, the subcellular localization of the protein is clearly predicted to be nuclear, while the endogenously expressed protein is located on the nuclear membrane as described above. The N-terminus contains a transmembrane domain followed by a proteolytic cleavage site, which suggests that the transmembrane domain is cleaved by proteases in the course of protein processing. This combination of nuclear localization signals, localization of the protein on nuclear, ER or plasma membranes and transmembrane domains followed by proteolytic cleavage sites can be found in a distinct class of transcription factors of which members of the NOTCH family and SREBP are best characterized (Weinmaster G. Curr. Opin. Genet. Dev. 10 (4): 363-9, 2000; Hoppe T. et al. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (3): 344-8, 2001)). The biological activity of these factors is regulated by the mechanism of regulated intramembrane proteolysis (RIP). After translation, the proteins are integrated into the core, ER or plasma membrane via the transmembrane domain. In the case of NOTCH, the binding of a specific ligand induces proteolytic cleavage below the membrane domain so that the protein reaches the site of action. In this way, transcription processes can be regulated in a milieu-dependent manner, for example in the course of organ development. Due to its structural features and membrane-localization, TSBP could be classified in this class. Although the TSBP sequence does not contain any specific DNA-binding structural elements, the high basicity of the protein makes binding to DNA likely, so that it is TSBP could be a transcription factor or transcription modulating factor.
Beispiel 4: Identifizierung von MS4A12 als neues TumorantigenExample 4: Identification of MS4A12 as a new tumor antigen
MS4A12 (SEQ ID NO:37, Zugangsnummer NM ) 17716) und sein Translationsprodukt (SEQ ID NO:38) sind als Mitglieder einer Multigen-Familie mit Verwandschaft zum B-Zell spezifischen Antigen CD20, dem hämatopoesezell-spezifischen Protein HTm4, und der ß- Kette des high-affmity IgE-Rezeptors vorbeschrieben. Als Charakteristikum besitzen alle Familienmitglieder mindestens vier potentielle Transmembrandomänen, sowohl der C- als auch der N-Terminus sind cytoplasmatisch (Liang Y. et al., Immunogenetics 53(5):357-68, 2001; Liang Y. & Tedder, Genomics 72(2): 119-27, 2001). Erfindungsgemäß wurden RT-PCR Untersuchungen für MS4A12 durchgeführt. Die Primer wurden basierend auf der veröffentlichten MS4A12-Sequenz (NM_017716) ausgewählt (sense: CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, antisense: TTCACCTTTGCCAGCATGTAG). In den getesteten Geweben konnte eine Expression nur in Testis, Kolon (6/8) und kolorektalen Karzinomen (Kolon-Ca's) (16/20) sowie in Kolon-Metastasen nachgewiesen (12/15) werden (Abb. 9). Die hohe Inzidenz in Kolon-Metastasen machen TSBP zu einem attraktiven diagnostischen und therapeutischen Target. Für die Herstellung von monoklonalen Antiköφern und kleiner chemischer Inhibitoren eignet sich erfindungsgemäß besonders der pädizierte extrazelluläre Bereich der die Proteinsequenz GVAGQDYWAVLSGKG (SEQ ID NO:83) umfasst. Die intrazelluläre Lokalisation des MS4A12-Proteins an der Zellmembran wurde erfindungsgemäß auch durch Fluoreszenzüberlagerung mit Plasmamembranmarkern in der konfokalen Immunfluoreszenz bestätigt. MS4A12 (SEQ ID NO: 37, accession number NM) 17716) and its translation product (SEQ ID NO: 38) are members of a multigen family related to the B cell-specific antigen CD20, the hematopoiesis cell-specific protein HTm4, and the ß - Chain of the high-affinity IgE receptor described above. All family members have at least four potential transmembrane domains as characteristics, both the C- and the N-terminus are cytoplasmic (Liang Y. et al., Immunogenetics 53 (5): 357-68, 2001; Liang Y. & Tedder, Genomics 72 (2): 119-27, 2001). According to the invention, RT-PCR tests for MS4A12 were carried out. The primers were selected based on the published MS4A12 sequence (NM_017716) (sense: CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, antisense: TTCACCTTTGCCAGCATGTAG). In the tissues tested, expression could only be detected in testis, colon (6/8) and colorectal cancer (colon ca's) (16/20) and in colon metastases (12/15) (Fig. 9). The high incidence in colon metastases make TSBP an attractive diagnostic and therapeutic target. The production of monoclonal antibodies and small chemical inhibitors is particularly suitable according to the invention in the pediculated extracellular region which comprises the protein sequence GVAGQDYWAVLSGKG (SEQ ID NO: 83). The intracellular localization of the MS4A12 protein on the cell membrane was also confirmed according to the invention by fluorescence overlaying with plasma membrane markers in confocal immunofluorescence.
Tabelle 4. Expression von MS4A12 in Normalgeweben und kolorektalen Karzinomen und MetastasenTable 4. Expression of MS4A12 in normal tissues and colorectal cancer and metastases
Somit ist MS4A12 ein zellrnembranständiges Differenzierungsantigen für normales Kolon- Epithel, das auch in kolorektalen Tumoren und Metastasen exprimiert wird. Es wurde eine quantitative Realtime-PCR (40 Zyklen, initiale Denaturierung 15 min 95°C, 30 sek 94°C, 30 sek 62°C, und 30 sek 72°C) mit den spezifischen Primern (CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC und TTCACCTTTGCCAGCATGTAG) durchgeführt (Abb. 26). Diese bestätigt nicht nur das Fehlen von MS4A12 in der Mehrheit der Normalgewebe ausser Testis und colorektalen Normalgeweben. Sondern sie deckt hohe Transkriptmengen in z.B. primären Darmtumoren und ihren Metastasen auf. Zum Nachweis von MS4A12 Protein wurden Antiköφer durch Immunisieren von Kaninchen hergestellt. Folgende Peptide bzw. ein rekombinant in E.Coli exprimiertes und gereinigtes Protein wurden zur Propagierung dieser Antiköφer genutzt: SEQ ID NO: 109: MMSSKPTSHAEVNETC (aa 1 - 15) SEQ ID NO: 110: CGVAGQDYWAVLSGKG (aa 64 - 73) SEQ ID NO:l l l :MS4A12 is therefore a cell-membrane-based differentiation antigen for normal colonic epithelium, which is also expressed in colorectal tumors and metastases. A quantitative real-time PCR (40 cycles, initial denaturation 15 min 95 ° C, 30 sec 94 ° C, 30 sec 62 ° C, and 30 sec 72 ° C) was carried out with the specific primers (CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC and TTCACCTTTGCCAGCATGTAG) (Fig . 26). This not only confirms the absence of MS4A12 in the majority of normal tissues except testis and colorectal normal tissues. Rather, it reveals large amounts of transcripts in, for example, primary intestinal tumors and their metastases. To detect MS4A12 protein, antibodies were produced by immunizing rabbits. The following peptides or a recombinantly expressed and purified protein in E. Coli were used to propagate these antibodies: SEQ ID NO: 109: MMSSKPTSHAEVNETC (aa 1 - 15) SEQ ID NO: 110: CGVAGQDYWAVLSGKG (aa 64 - 73) SEQ ID NO : lll:
MMSSKPTSHAEVNETIPNPYPPGSFMAPGFQQPLGSINLENQAQGAQRAQPYGITSPGI FASS (rek.Prot. aa 1-63)MMSSKPTSHAEVNETIPNPYPPGSFMAPGFQQPLGSINLENQAQGAQRAQPYGITSPGI FASS (rec.Prot. Aa 1-63)
Beispielhaft sollen die Daten dargestellt werden für Antiköφer, die gegen SEQ ID NO:l l l gerichtet sind. Im Westernblot ist auf erwarteter Höhe in normalem Darm, in Kolonkarzinomen aber nicht in anderen Normalgeweben eine spezifischen Bande nachweisbar (Abb. 27). Der spezifische Antiköφer lässt sich unter verschiedenen Fixationsbedigungen für Immunfluoreszenz-Untersuchungen nutzen. Bei Färbungen von RT- PCR positiven wie auch negativen Zellinien ist das entsprechende Protein in gut nachweisbarer Menge spezifisch in den als positiv typisierten Zellinien detektierbar und auch eukaryontisch rekombinant exprimiertes MS4A12 wird spezifisch erkannt (Abb. 28). Auch diese Experimente bestätigen die Membranlokalisation. Dieser Antikörper wurde des weiteren eingesetzt zur immunhistochemischen Färbung von Gewebsschnitten. Wie erwartet färbt derThe data should be shown as an example for antibodies which are directed against SEQ ID NO: 11. A specific band can be detected in the Western blot at the expected level in normal intestine, but in colon carcinomas but not in other normal tissues (Fig. 27). The specific antibody can be used under various fixation conditions for immunofluorescence studies. In the case of staining of RT-PCR positive and negative cell lines, the corresponding protein can be detected specifically in a well-detectable amount specifically in the cell lines typified as positive and MS4A12 also expressed in a eukaryotic recombinant manner is specifically recognized (Fig. 28). These experiments also confirm membrane localization. This antibody was also used for immunohistochemical staining of tissue sections. As expected, the color
Antiköφer gesundes Darmgewebe. Allerdings sind es lediglich die apikalen Epithelzellen der Kolonmukosa (Abb. 29, links). Tumorzellen von Darmtumoren werden homogen und ebenfalls an der Membran angefärbt (Abb. 29, rechts).Antibody healthy intestinal tissue. However, it is only the apical epithelial cells of the colon mucosa (Fig. 29, left). Tumor cells from intestinal tumors are homogeneous and also stained on the membrane (Fig. 29, right).
Beispiel 5: Identifizierung von BRCOl als neues TumorantigenExample 5: Identification of BRCOl as a new tumor antigen
BRCOl und sein Translationsprodukt sind nicht vorbeschrieben. Das erfindungs gemäße Datamining-Verfahren ergab das EST (expressed sequence tag) AI668620. Mit spezifischen Primern (sense: CTTGCTCTGAGTCATCAGATG, antisense: CACAGAATATGAGCCATACAG) wurden RT-PCR Studien zur Expressionsanalyse durchgeführt. Erfindungsgemäß wurde spezifische Expression in testikulärem Gewebe, sowie zusätzlich in normaler Brustdrüse gefunden (Tabelle 5). In allen anderen Geweben ist dieses Antigen transkriptioneil reprimiert. In Brastdrüsentumoren wird es ebenfalls (20 von 20) nachgewiesen. In Brasttumoren ist BRCOl im Vergleich zu der Expression in normalem Brastdrüsengewebe deutlich überexprimiert (Abb. 10).BRCOl and its translation product are not previously described. The data mining method according to the invention resulted in the EST (expressed sequence tag) AI668620. With specific primers (sense: CTTGCTCTGAGTCATCAGATG, antisense: CACAGAATATGAGCCATACAG) RT-PCR studies were carried out for expression analysis. According to the invention, specific expression was found in testicular tissue and additionally in normal mammary gland (Table 5). This antigen is repressed in all other tissues. It is also found in mammary gland tumors (20 out of 20). In breast tumors, BRCO1 is clearly overexpressed compared to the expression in normal breast gland tissue (Fig. 10).
Durch elektronische Vollängeklonierung unter Nutzung von EST-contigs (folgende EST wurden inkoφoriert AW137203, BF327792, BF327797, BE069044, BF330665) gelang erfindungsgemäß die Klonierung von mehr als 1500 bp dieses Transkriptes (SEQ ID NO:39). Die Sequenz kartiert auf Chromosom lOpl 1-12. In der gleichen Region in unmittelbarer Nähe ist bereits das Gen für ein Mamma-DifferenzierungsAntigen NY-BR-1 beschrieben worden (NM_052997; Jager, D. et al, Cancer Res. 61(5):2055-61, 2001).By electronic full length cloning using EST contigs (the following EST were incoφorated AW137203, BF327792, BF327797, BE069044, BF330665), the cloning of more than 1500 bp of this transcript was achieved according to the invention (SEQ ID NO: 39). The sequence mapped onto chromosome IOpl 1-12. In the same region in the immediate vicinity, the gene for a breast differentiation antigen NY-BR-1 has already been described (NM_052997; Jager, D. et al, Cancer Res. 61 (5): 2055-61, 2001).
Tabelle 5. Expression von BRCOl in Normalgeweben und BrusttumorenTable 5. Expression of BRCOl in normal tissues and breast tumors
In matched pair (Mama-Karzinom und benachbartes Normalgewebe) Untersuchungen zeigte sich erfindungsgemäß in 70 % der Mama-Karzinome eine BRCOl Überexpression im Vergleich zum Normagewebe.In matched pair (mom carcinoma and adjacent normal tissue) examinations, according to the invention, 70% of the mom carcinomas showed BRCO1 overexpression in comparison to the normal tissue.
Somit ist BRCOl ein neues DifferenzierungsAntigen für normales Brastdrüsenepithel, das in Brusttumoren überexprimiert wird.BRCOl is thus a new differentiation antigen for normal mammary gland epithelium that is overexpressed in breast tumors.
Dies bestätigt auch die quantitative Realtime-PCR (40 Zyklen, initiale Denaturierung 15 min 95°C, 30 sek 94°C, 30 sek 60°C, und 30 sek 72°C) mit spezifischen Primern (5'- CTTGCTCTGAGTCATCAGATG-3'; 5'-CACAGAATATGAGCCATACAG-3') (Abb. 30 & 31). Diese bestätigte nicht nur das Fehlen von BRCOl in der Mehrheit der Normalgewebe außer Testis und Brust-Normalgeweben, sondern deckte auch eine Überexpression in Brasttumoren auf.This also confirms the quantitative real-time PCR (40 cycles, initial denaturation 15 min 95 ° C, 30 sec 94 ° C, 30 sec 60 ° C, and 30 sec 72 ° C) with specific primers (5'- CTTGCTCTGAGTCATCAGATG-3 ' ; 5'-CACAGAATATGAGCCATACAG-3 ') (Fig. 30 & 31). This not only confirmed the absence of BRCOl in the majority of normal tissues except testis and breast normal tissues, but also revealed overexpression in brain tumors.
Zum Nachweis von BRCOl Protein wurden Antiköφer durch Immunisieren von Kaninchen hergestellt. Folgende Peptide wurden zur Propagierung dieser Antiköφer genutzt: SEQ ID NO:115: IAPNTRGQQTIVL SEQ ID NO:116: VWKSNGKSILKMPFTo detect BRCO1 protein, antibodies were produced by immunizing rabbits. The following peptides were used to propagate these antibodies: SEQ ID NO: 115: IAPNTRGQQTIVL SEQ ID NO: 116: VWKSNGKSILKMPF
Beispiel 6: Identifizierung von TPX1 als neues TumorantigenExample 6: Identification of TPX1 as a new tumor antigen
Die Sequenz von TPX1 (Acc-Nr NM_003296; SEQ ID NO:40) und seines Translationsprodukts (SEQ ID NO:41) sind bekannt. Das Antigen ist bisher als lediglich Testis-spezifisch beschrieben worden und zwar als Element der äußeren Fibern und des Akrsosoms von Spermien. Ihm wurde bisher eine Rolle als Adhäsionsmolekül bei der Anheftung von Spermien an Sertoli-Zellen zugeschrieben (O'Bryan, M.K. et al., Mol. Reprod. Dev. 58(l):116-25, 2001; Maeda, T. et al., Dev. Growth Differ. 41(6):715-22, 1999). Erfindungsgemäß wurde erstmals die aberrante Expression von TPX1 in soliden Tumoren gezeigt (Tabelle 6). Aufgrund der ausgeprägten Aminosäure Homologie zwischen TPX1 und dem Neutrophilen-spezifischen Matrix -Glykoprotein SGP 28 (Kjeldsen et al., FEBS Lett 380:246-259, 1996) eignen sich für die Herstellung diagnostischer und therapeutischer Moleküle erfindungsgemäß TPX1 -spezifische Proteinsequenzen, die das Peptid SREVTTNAQR (SEQ ID NO:84) umfassen.The sequence of TPX1 (Acc No. NM_003296; SEQ ID NO: 40) and its translation product (SEQ ID NO: 41) are known. The antigen has so far been described as only Testis-specific, namely as an element of the outer fibers and the acromosome of sperm. He has previously been assigned a role as an adhesion molecule in the attachment of sperm to Sertoli cells (O'Bryan, MK et al., Mol. Reprod. Dev. 58 (l): 116-25, 2001; Maeda, T. et al., Dev. Growth Differ. 41 (6): 715-22, 1999). According to the invention, the aberrant expression of TPX1 in solid tumors was shown for the first time (Table 6). On account of the pronounced amino acid homology between TPX1 and the neutrophil-specific matrix glycoprotein SGP 28 (Kjeldsen et al., FEBS Lett 380: 246-259, 1996), TPX1-specific protein sequences which are suitable for the production of diagnostic and therapeutic molecules according to the invention Peptide SREVTTNAQR (SEQ ID NO: 84).
Tabelle 6. Expression von TPX1 in TumorenTable 6. Expression of TPX1 in tumors
Beispiel 7: Identifizierung von BRCO2 als neues Tumor-GenproduktExample 7: Identification of BRCO2 as a new tumor gene product
BRCO2 und sein Translationsprodukt sind nicht vorbeschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren ergab die ESTs (expressed sequence tag) BE069341, BF330573 und AA601511. Mit spezifischen Primern (sense: AGACATGGCTCAGATGTGCAG, antisense: GGAAATTAGCAAGGCTCTCGC) wurden RT-PCR Studien zur Expressionsanalyse durchgeführt. Erfindungsgemäß wurde spezifische Expression in testikulärem Gewebe, sowie zusätzlich in normaler Brustdrüse gefunden (Tabelle 7). In allen anderen Geweben ist dieses Genprodukt transkriptionell reprimiert. In Brustdrüsentumoren wird es ebenfalls nachgewiesen. Durch elektronische Vollängeklonierung unter Nutzung von EST-contigs (folgende EST wurden inkoφoriert BF330573, AL 044891 und AA601511) gelang erfindungsgemäß die Klonierung von 1300 bp dieses Transkriptes (SEQ ID 62). Die Sequenz kartiert auf Chromosom 10pl l-12. In der gleichen Region in unmittelbarer Nähe ist bereits das Gen für ein Mamma-DifferenzierangsGenprodukt NY-BR-1 beschrieben worden (NM_052997; Jager, D. et al., Cancer Res. 61(5):2055-61, 2001) und hier liegt das unter Beispiel 6 vorbeschriebene BRCOl. Weiterführende genetische Analysen zeigten erfindungsgemäß, dass die unter SEQ ID NO: 62 aufgeführte Sequenz den bisher nicht beschriebenen 3' untranslatierten Bereich des NY-BR-1 Gens repräsentiert.BRCO2 and its translation product are not previously described. The method according to the invention gave the ESTs (expressed sequence tag) BE069341, BF330573 and AA601511. RT-PCR studies for expression analysis were carried out with specific primers (sense: AGACATGGCTCAGATGTGCAG, antisense: GGAAATTAGCAAGGCTCTCGC). According to the invention, specific expression was found in testicular tissue and additionally in normal breast gland (Table 7). This gene product is transcriptionally repressed in all other tissues. It is also found in mammary tumors. Through electronic full length cloning using EST contigs (The following EST were incorporated BF330573, AL 044891 and AA601511) the cloning of 1300 bp of this transcript (SEQ ID 62) was achieved according to the invention. The sequence mapped onto chromosome 10pl 1-12. The gene for a breast differentiation gene product NY-BR-1 has already been described in the same region in the immediate vicinity (NM_052997; Jager, D. et al., Cancer Res. 61 (5): 2055-61, 2001) and here is the BRCOl described in Example 6. Further genetic analyzes according to the invention showed that the sequence listed under SEQ ID NO: 62 represents the 3 'untranslated region of the NY-BR-1 gene which has not previously been described.
Tabelle 7. Expression von BRCO2 in Normalgeweben und BrusttumorenTable 7. Expression of BRCO2 in normal tissues and breast tumors
BRCO2 ist ein neues Differenzierungs-Genprodukt für normales Brastdrüsenepithel, das auch in Brusttumoren exprimiert wird. BRCO2 is a new differentiation gene product for normal mammary gland epithelium, which is also expressed in breast tumors.
Beispiel 8: Identifizierung von PCSC als neues Tumor-GenproduktExample 8: Identification of PCSC as a new tumor gene product
PCSC (SEQ_ID_63) und sein Translationsprodukt sind nicht vorbeschrieben. Das erfindungsgemäße Datamining- Verfahren ergab das EST (expressed sequence tag) BF064073. Mit spezifischen Primern (sense: TCAGGTATTCCCTGCTCTTAC, antisense: TGGGCAATTCTCTCAGGCTTG) wurden RT-PCR Studien zur Expressionsanalyse durchgeführt. Erfindungsgemäß wurde spezifische Expression in normalem Kolon, sowie zusätzlich in Kolonkarzinomen gefunden (Tabelle 5). In allen anderen Geweben ist dieses Genprodukt transkriptionell reprimiert. PCSC kodiert für drei putative ORFs (SEQ_ID_64, SEQ_ID_65 und SEQ_ID_117). Sequenzanalyse von SEQ_ID_64 ergab eine strukturelle Homologie zu CXC-Cytokinen. Darüber hinaus wurden 4 alternative PCSC- cDNA- Fragmente kloniert (SEQ ID NO:85-88). Dabei enthält erfindungsgemäß jede cDNA 3 putative ORFs, die für die in SEQ ID NO: 89- 100 gezeigten Polypeptide kodieren.PCSC (SEQ_ID_63) and its translation product are not previously described. The data mining method according to the invention resulted in the EST (expressed sequence tag) BF064073. RT-PCR studies for expression analysis were carried out with specific primers (sense: TCAGGTATTCCCTGCTCTTAC, antisense: TGGGCAATTCTCTCAGGCTTG). According to the invention, specific expression was found in normal colon and also in colon carcinoma (Table 5). This gene product is transcriptionally repressed in all other tissues. PCSC encodes three putative ORFs (SEQ_ID_64, SEQ_ID_65 and SEQ_ID_117). Sequence analysis of SEQ_ID_64 revealed structural homology to CXC cytokines. In addition, 4 alternative PCSC cDNA fragments were cloned (SEQ ID NO: 85-88). According to the invention, each cDNA contains 3 putative ORFs which code for the polypeptides shown in SEQ ID NO: 89-100.
Tabelle 8. Expression von PCSC in Normalgeweben und kolorektalen KarzinomenTable 8. Expression of PCSC in normal tissues and colorectal cancer
Somit ist PCSC ein Differenzierungsantigen für normales Kolon-Epithel, das auch in kolorektalen Tumoren sowie in allen untersuchten Kolon-Metastasen exprimiert wird. Die erfindungsgemäß in allen kolorektalen Metastasen nachgewiesene PCSC-Expression machen dieses Tumorantigen zu einem sehr interessanten Target für die Prophylaxe und Behandlung von metastasiernden Kolon- Tumoren.PCSC is therefore a differentiation antigen for normal colon epithelium, which is also expressed in colorectal tumors and in all colon metastases investigated. The PCSC expression detected according to the invention in all colorectal metastases make this tumor antigen a very interesting target for the prophylaxis and treatment of metastatic colon tumors.
Es wurde eine quantitative Realtime-PCR (40 Zyklen, initiale Denaturierung 15 min 95°C, 30 sek 94°C, 30 sek 59°C, und 30 sek 72°C) mit den spezifischen Primern (5'- AGAATAGAATGTGGCCTCTAG-3 ' ; 5 ' -TGCTCTTACTCCAAAAAGATG-3 ') durchgeführt (Abb. 32). Diese bestätigt nicht nur das Fehlen von PCSC in der Mehrheit der Normalgewebe außer Testis und kolorektalen Normalgeweben. Sondern es deckt hohe Transkriptmengen in z.B. Darmtumoren auf. Dabei haben Metastasen von Darmtumoren eine signifikant höhere Expression als Primärtumoren. Dies und der Umstand, dass PCSC Homologien mit der Familie der Chemokine untermauern eine Rolle bei erhöhter Zellmotilität und Metastasierungsvorgängen.A quantitative real-time PCR (40 cycles, initial denaturation 15 min 95 ° C, 30 sec 94 ° C, 30 sec 59 ° C, and 30 sec 72 ° C) with the specific primers (5'- AGAATAGAATGTGGCCTCTAG-3 ' ; 5 '-TGCTCTTACTCCAAAAAGATG-3') carried out (Fig. 32). This not only confirms the lack of PCSC in the majority of normal tissues except testis and colorectal normal tissues. But it covers large amounts of transcripts in e.g. Intestinal tumors. Here, metastases from intestinal tumors have a significantly higher expression than primary tumors. This and the fact that PCSC homologies with the chemokine family underpin a role in increased cell motility and metastasis.
Zum Nachweis von PCSC Protein wurden Antiköφer durch Immunisieren von Kaninchen hergestellt. Folgende Peptide wurden zur Propagierung dieser Antiköφer genutzt: SEQ ID NO: 112: GHGPGHPPPGPHH SEQ ID NO : 113 : KPERIAQLTWNEA SEQ ID NO: 114: PRSPTPWSTSLRK Beispiel 9: Identifizierung von SGY-1 als neues TumorantigenTo detect PCSC protein, antibodies were produced by immunizing rabbits. The following peptides were used to propagate these antibodies: SEQ ID NO: 112: GHGPGHPPPGPHH SEQ ID NO: 113: KPERIAQLTWNEA SEQ ID NO: 114: PRSPTPWSTSLRK Example 9: Identification of SGY-1 as a new tumor antigen
Die Sequenzen des Transkripts von SGY-1 (SEQ ID NO:70) und seines Translationsprodukt (SEQ ID NO:71) sind in GenBank unter der Zugangsnummer AF177398 veröffentlicht (Krupnik et al., Gene 238, 301-313, 1999). Soggy-1 ist vorbeschrieben als Mitglied der Dickkopf-Protein Familie, welche als Inhibitoren und Antagonisten der Wnt-Familie von Proteinen wirken. Die Wnt-Proteine wiederum haben wichtige Funktionen bei der Embryonalentwicklung. Basierend auf der Sequenz von SGY-1 (SEQ ID NO:70) wurden erfindungsgemäß PCR-Primer generiert (5'-CTCCTATCCATGATGCTGACG-3' und 5'- CCTGAGGATGTACAGTAAGTG-3*) und für RT-PCR- Analysen (95° 15min; 94° 1 min; 63° 1 min; 72° 1 min; 35 Zyklen) in einer Reihe von humanen Geweben eingesetzt. Es zeigte sich, dass die Expression in Normalgeweben auf Testis beschränkt ist. Wie für die anderen eCT beschrieben, konnte erfmdungs gemäß gezeigt werden, dass SGY-1 ektop in einer Reihe von Tumorgeweben aktiviert wird; vgl. Tabelle 9.The sequences of the transcript of SGY-1 (SEQ ID NO: 70) and its translation product (SEQ ID NO: 71) are published in GenBank under accession number AF177398 (Krupnik et al., Gene 238, 301-313, 1999). Soggy-1 is prescribed as a member of the thick-headed protein family, which act as inhibitors and antagonists of the Wnt family of proteins. The Wnt proteins in turn have important functions in embryonic development. Based on the sequence of SGY-1 (SEQ ID NO: 70), PCR primers were generated according to the invention (5'-CTCCTATCCATGATGCTGACG-3 'and 5'-CCTGAGGATGTACAGTAAGTG-3 *) and for RT-PCR analyzes (95 ° 15min; 94 ° 1 min; 63 ° 1 min; 72 ° 1 min; 35 cycles) in a number of human tissues. It was shown that expression in normal tissues is limited to testis. According to the invention, as described for the other eCTs, SGY-1 was shown to be activated ectopically in a number of tumor tissues; see. Table 9.
Tabelle 9. Expression von SGY-1 in TumorenTable 9. Expression of SGY-1 in tumors
Beispiel 10: Identifizierung von MORC als neues Tumorantigen Example 10: Identification of MORC as a new tumor antigen
Die Sequenzen des Transkripts von MORC (SEQ ID NO:74) und seines Translationsprodukt (SEQ ID NO:75) sind in GenBank unter der Zugangsnummer XM_037008 veröffentlicht (Inoue et al., Hum Mol Genet. Jul;8(7):1201-7, 1999). MORC ist ursprünglich beschrieben als involviert in die Spermatogenese. Mutation dieses Proteins im Maussystem führt zur Gonadenunterentwicklung. Basierend auf der Sequenz von MORC (SEQ ID NO: 74) wurden erfindungsgemäß PCR- Primer generiert (5'-CTGAGTATCAGCTACCATCAG-3' und 5'- TCTGTAGTCCTTCACATATCG-3') und für RT-PCR-Analysen (95° 15min; 94° 1 min; 63° 1 min; 72° 1 min; 35 Zyklen) in einer Reihe von humanen Geweben eingesetzt. Es zeigte sich, dass die Expression in Normalgeweben auf Testis beschränkt ist. Wie für die anderen eCT beschrieben, konnte erfindungsgemäß gezeigt werden, dass MORC ektop in einer Reihe von Tumorgeweben aktiviert wird; vgl. Tabelle 10.The sequences of the transcript of MORC (SEQ ID NO: 74) and its translation product (SEQ ID NO: 75) are published in GenBank under accession number XM_037008 (Inoue et al., Hum Mol Genet. Jul; 8 (7): 1201- 7, 1999). MORC is originally described as being involved in spermatogenesis. Mutation of this protein in the mouse system leads to gonadal underdevelopment. Based on the sequence of MORC (SEQ ID NO: 74), PCR primers were generated according to the invention (5'-CTGAGTATCAGCTACCATCAG-3 'and 5'-TCTGTAGTCCTTCACATATCG-3') and for RT-PCR analyzes (95 ° 15min; 94 ° 1 min; 63 ° 1 min; 72 ° 1 min; 35 cycles) in a number of human tissues. It was shown that the expression in normal tissues is limited to testis. As described for the other eCT, it was possible to show according to the invention that MORC is activated in a number of tumor tissues; see. Table 10.
Tabelle 10. Expression von MORC in TumorenTable 10. Expression of MORC in tumors

Claims

Patentansprüche claims
1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Mittel, das die Expression oder Aktivität eines Tumor-assoziierten Antigens hemmt, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:1. A pharmaceutical composition comprising an agent that inhibits the expression or activity of a tumor-associated antigen, the tumor-associated antigen having a sequence encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88 einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88 a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
2. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Mittel mit tumorhemmender Aktivität, das selektiv ist für Zellen, die eine Expression oder abnormale Expression eines tumorassoziierten Antigens aufweisen, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus2. A pharmaceutical composition comprising an agent having tumor inhibitory activity which is selective for cells which have expression or abnormal expression of a tumor associated antigen, the tumor associated antigen having a sequence encoded by a nucleic acid from the group is selected consisting of
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Ansprach 2, wobei das Mittel die Induktion des Zelltods, die Reduktion des Zellwachstums, eine Schädigung der Zellmembran oder eine Sekretion von Zytokinen bewirkt. 3. Pharmaceutical composition according spoke 2, wherein the agent causes the induction of cell death, the reduction of cell growth, damage to the cell membrane or secretion of cytokines.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel eine Antisense-Nukleinsäure ist, die selektiv mit der Nukleinsäure hybridisiert, die für das Tumorassoziierte Antigen kodiert.The pharmaceutical composition of claim 1 or 2, wherein the agent is an antisense nucleic acid that selectively hybridizes with the nucleic acid encoding the tumor associated antigen.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Mittel ein Antiköφer ist, der selektiv an das Tumor-assoziierte Antigen bindet.5. A pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein the agent is an antibody which selectively binds to the tumor-associated antigen.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Mittel ein komplementaktivierender Antiköφer ist, der selektiv an das Tumor-assoziierter Antigen bindet.6. The pharmaceutical composition of claim 2, wherein the agent is a complement activating antibody that selectively binds to the tumor-associated antigen.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Mittel, das bei einer Verabreichung selektiv die Menge an Komplexen zwischen einem HLA-Molekül und einem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon erhöht, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Grappe ausgewählt ist, bestehend aus:7. A pharmaceutical composition comprising an agent which when administered selectively increases the amount of complexes between an HLA molecule and a tumor-associated antigen, or a portion thereof, the tumor-associated antigen having a sequence encoding a nucleic acid selected from the Grappe, consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Mittel einen oder mehrere Bestandteile umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus:8. The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the agent comprises one or more components selected from the group consisting of:
(i) dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon,(i) the tumor-associated antigen or a part thereof,
(ii) einer Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon kodiert, (iii) einer Wirtszelle, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimiert, und(ii) a nucleic acid encoding the tumor associated antigen or a portion thereof, (iii) a host cell expressing the tumor associated antigen or a portion thereof, and
(iv) isolierten Komplexen zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem HLA-Molekül. (iv) isolated complexes between the tumor-associated antigen or a part thereof and an HLA molecule.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 7, wobei das Mittel mehrere Mittel umfasst, die jeweils selektiv die Expression oder Aktivität verschiedener Tumor-assoziierter Antigene hemmen, jeweils selektiv für Zellen sind, die verschiedene Tumor-assoziierte Antigene exprimieren oder die Menge an Komplexen zwischen HLA- Molekülen und verschiedenen Tumor-assoziierten Antigenen oder Teilen davon erhöhen, wobei mindestens eines der Tumor-assoziierten Antigene eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Grappe ausgewählt ist, bestehend aus:9. The pharmaceutical composition according to claim 1, 2 or 7, wherein the agent comprises several agents, each of which selectively inhibit the expression or activity of different tumor-associated antigens, each of which is selective for cells which express different tumor-associated antigens or the amount of Increase complexes between HLA molecules and various tumor-associated antigens or parts thereof, wherein at least one of the tumor-associated antigens has a sequence encoded by a nucleic acid selected from the Grappe, consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Grappe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence consisting of the Grappe consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(c) a nucleic acid that is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid that is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
10. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen oder mehrer Bestandteile, die aus der Grappe ausgewählt sind, bestehend aus:10. A pharmaceutical composition comprising one or more ingredients selected from the grapple, consisting of:
(i) einem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon, (ii) einer Nukleinsäure, die für ein Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon kodiert, (iii) einem Antiköφer, der an ein Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon bindet, (iv) einer Antisense-Nukleinsäure, die spezifisch mit einer Nukleinsäure, die für ein Tumorassoziiertes Antigen kodiert, hybridisiert, (v) einer Wirtszelle, die ein Tumor-assoziiertes Antigen oder einen Teil davon exprimiert, und (vi) isolierten Komplexen zwischen einem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem HLA-Molekül, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:(i) a tumor-associated antigen or a part thereof, (ii) a nucleic acid coding for a tumor-associated antigen or a part thereof, (iii) an antibody which binds to a tumor-associated antigen or a part thereof , (iv) an antisense nucleic acid that hybridizes specifically with a nucleic acid encoding a tumor-associated antigen, (v) a host cell that expresses a tumor-associated antigen or a part thereof, and (vi) isolated complexes between one Tumor-associated antigen or part thereof and an HLA molecule, the tumor-associated antigen having a sequence encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a), (c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Ansprach 8 oder 10, wobei die Nukleinsäure unter (ii) in einem Expressionsvektor vorliegt.11. Pharmaceutical composition according to spoke 8 or 10, wherein the nucleic acid under (ii) is present in an expression vector.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 10, wobei die Nukleinsäure unter (ii) funktionell mit einem Promotor verbunden ist.12. Pharmaceutical composition according to claim 8 or 10, wherein the nucleic acid under (ii) is functionally linked to a promoter.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 10, wobei die Wirtszelle das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon sekretiert.13. A pharmaceutical composition according to claim 8 or 10, wherein the host cell secretes the tumor-associated antigen or part thereof.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 10, wobei die Wirtszelle zusätzlich ein HLA-Molekül exprimiert, das an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon bindet.14. The pharmaceutical composition according to claim 8 or 10, wherein the host cell additionally expresses an HLA molecule which binds to the tumor-associated antigen or part thereof.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle das HLA-Molekül und/oder das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon rekombinant exprimiert.15. The pharmaceutical composition according to claim 14, wherein the host cell expresses the HLA molecule and / or the tumor-associated antigen or part thereof recombinantly.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle das HLA-Molekül endogen exprimiert.16. The pharmaceutical composition according to claim 14, wherein the host cell endogenously expresses the HLA molecule.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, 10, 14 oder 16, wobei die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle ist.17. A pharmaceutical composition according to claim 8, 10, 14 or 16, wherein the host cell is an antigen presenting cell.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei die Antigen- präsentierende Zelle eine dendritische Zelle oder ein Makrophage ist.18. The pharmaceutical composition of claim 17, wherein the antigen presenting cell is a dendritic cell or a macrophage.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8, 10 und 13-18, wobei die Wirtszelle nicht-proliferativ ist. 19. A pharmaceutical composition according to any one of claims 8, 10 and 13-18, wherein the host cell is non-proliferative.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 10, wobei der Antiköφer ein monoklonaler Antiköφer ist.20. Pharmaceutical composition according to claim 5 or 10, wherein the Antiköφer is a monoclonal Antiköφer.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 10, wobei der Antiköφer ein chimärer oder humanisierter Antiköφer ist.21. A pharmaceutical composition according to claim 5 or 10, wherein the Antiköφer is a chimeric or humanized Antiköφer.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 10, wobei der Antiköφer ein Fragment eines natürlichen Antiköφers ist.22. Pharmaceutical composition according to claim 5 or 10, wherein the Antiköφer is a fragment of a natural Antiköφers.
23. Pharmazeutische Zusammensetzimg nach Ansprach 5 oder 10, wobei der Antiköφer mit einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel gekoppelt ist.23. Pharmaceutical composition according spoke 5 or 10, wherein the Antiköφer is coupled with a therapeutic or diagnostic agent.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 10, wobei die Antisense- Nukleinsäure eine Sequenz von 6-50 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, umfasst.24. The pharmaceutical composition according to claim 4 or 10, wherein the antisense nucleic acid comprises a sequence of 6-50 contiguous nucleotides from the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 und 10-13, wobei das durch die pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellte Tumor-assoziierte Antigen oder der Teil davon an MHC-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen bindet, die eine abnormale Menge des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon exprimieren.25. A pharmaceutical composition according to any one of claims 8 and 10-13, wherein the tumor-associated antigen provided by the pharmaceutical composition or the part thereof binds to MHC molecules on the surface of cells which contain an abnormal amount of the tumor-associated antigen or express part of it.
26. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei die Bindung eine cytolytische Reaktion hervorruft und/ oder eine Cytokinausschüttung induziert26. The pharmaceutical composition according to claim 25, wherein the binding causes a cytolytic reaction and / or induces a cytokine release
27. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-26, ferner umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein Adjuvans.27. A pharmaceutical composition according to any one of claims 1-26, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier and / or an adjuvant.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27, wobei das Adjuvans Saponin, GM-CSF, CpG, Zytokin oder ein Chemokin ist.28. The pharmaceutical composition of claim 27, wherein the adjuvant is saponin, GM-CSF, CpG, cytokine or a chemokine.
29. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-28, die zur Behandlung einer Erkrankung eingesetzt werden kann, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet. 29. Pharmaceutical composition according to one of claims 1-28, which can be used for the treatment of a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen.
30. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei die Erkrankung Krebs ist.30. The pharmaceutical composition of claim 29, wherein the disease is cancer.
31. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei die Erkrankung ein Lungentumor, ein Brusttumor, ein Prostatatumor, ein Melanom, ein Colontumor, eine31. The pharmaceutical composition according to claim 29, wherein the disease is a lung tumor, a breast tumor, a prostate tumor, a melanoma, a colon tumor, a
Metastase eines Colontumors, ein Nierenzellkarzinom oder ein Zervixkarzinom, ein Coloncarcinom oder ein Mammacarcinom ist.Metastasis of a colon tumor, a renal cell carcinoma or a cervical carcinoma, a colon carcinoma or a breast carcinoma.
32. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-31, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 6-13, 14-18, 30, 34-36, 38, 41, 64, 65, 71, 75, 80, 83, 84, 89-100, 101, 102, 106-117 einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist.32. Pharmaceutical composition according to one of claims 1-31, wherein the tumor-associated antigen comprises an amino acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 6- 13, 14-18, 30, 34-36, 38, 41, 64, 65, 71, 75, 80, 83, 84, 89-100, 101, 102, 106-117 a part or derivative thereof is selected.
33. Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend33. A method for diagnosing a disease characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen, comprising
(i) den Nachweis einer Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teils davon, und/oder(i) the detection of a nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen, or a part thereof, and / or
(ii) den Nachweis des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon, und/oder (iii) den Nachweis eines Antiköφers gegen das Tumor-assoziierte Antigen oder eines Teils davon und/oder(ii) the detection of the tumor-associated antigen or a part thereof, and / or (iii) the detection of an antibody against the tumor-associated antigen or a part thereof and / or
(iv) den Nachweis von cytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten, die für das Tumorassoziierte Antigen oder einen Teil davon spezifisch sind in einer aus einem Patienten isolierten biologischen Probe, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:(iv) the detection of cytotoxic or helper T lymphocytes which are specific for the tumor-associated antigen or a part thereof in a biological sample isolated from a patient, the tumor-associated antigen having a sequence which is encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist. (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Nachweis34. The method of claim 33, wherein the detection
(i) die Kontaktierung der biologischen Probe mit einem Mittel, das spezifisch an die Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder den Teil davon, an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon, an den Antiköφer oder an die cytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten bindet, und(i) contacting the biological sample with an agent that specifically binds to the nucleic acid encoding the tumor-associated antigen or the part thereof, to the tumor-associated antigen or the part thereof, to the antibody or to the cytotoxic or helper T lymphocytes, and
(ii) den Nachweis der Komplexbildung zwischen dem Mittel und der Nukleinsäure oder dem Teil davon, dem Tumor-assoziierten Antigen oder dem Teil davon, dem Antiköφer oder den cytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten umfasst.(ii) comprises the detection of the complex formation between the agent and the nucleic acid or the part thereof, the tumor-associated antigen or the part thereof, the antibody or the cytotoxic or helper T lymphocytes.
35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei der Nachweis mit dem Nachweis in einer vergleichbaren normalen biologischen Probe verglichen wird.35. The method of claim 33 or 34, wherein the detection is compared with the detection in a comparable normal biological sample.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-35, wobei sich die Erkrankung durch die Expression oder abnormale Expression mehrerer verschiedener Tumor-assoziierter Antigene auszeichnet und der Nachweis einen Nachweis mehrerer Nukleinsäuren, die für die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene kodieren, oder von Teilen davon, den Nachweis der mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder von Teilen davon, den Nachweis mehrerer Antiköφer, die an die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder an Teile davon binden, oder den Nachweis mehrerer cytotoxischer oder Helfer- T-Lymphozyten, die für die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene spezifisch sind, umfasst.36. The method according to any one of claims 33-35, wherein the disease is characterized by the expression or abnormal expression of several different tumor-associated antigens and the detection of a detection of several nucleic acids coding for the several different tumor-associated antigens, or of parts thereof, the detection of several different tumor-associated antigens or parts thereof, the detection of several antibodies which bind to the several different tumor-associated antigens or parts thereof, or the detection of several cytotoxic or helper T-lymphocytes which are responsible for which are specific to several different tumor-associated antigens.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-36, wobei der Nachweis der Nukleinsäure oder des Teils davon mit einer Polynukleotid- Sonde erfolgt, die spezifisch mit der Nukleinsäure oder dem Teil davon hybridisiert.37. The method according to any one of claims 33-36, wherein the detection of the nucleic acid or part thereof is carried out with a polynucleotide probe that hybridizes specifically with the nucleic acid or part thereof.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Polynukleotid-Sonde eine Sequenz von 6-50 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, umfasst.38. The method of claim 37, wherein the polynucleotide probe comprises a sequence of 6-50 contiguous nucleotides from the nucleic acid encoding the tumor associated antigen.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-36, wobei der Nachweis der Nukleinsäure oder des Teils davon durch selektive Amplifikation der Nukleinsäure oder des Teils davon erfolgt. 39. The method according to any one of claims 33-36, wherein the detection of the nucleic acid or part thereof is carried out by selective amplification of the nucleic acid or part thereof.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-36, wobei das nachzuweisende Tumorassoziierte Antigen oder der Teil davon in einem Komplex mit einem MHC-Molekül vorliegt.40. The method according to any one of claims 33-36, wherein the tumor-associated antigen to be detected or the part thereof is present in a complex with an MHC molecule.
41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei das MHC-Molekül ein HLA-Molekül ist.41. The method of claim 40, wherein the MHC molecule is an HLA molecule.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-36 und 40-41, wobei der Nachweis des Tumor-assoziierten Antigens oder des Teils davon mit einem Antiköφer erfolgt, der spezifisch an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon bindet.42. The method according to any one of claims 33-36 and 40-41, wherein the detection of the tumor-associated antigen or the part thereof is carried out with an antibody which specifically binds to the tumor-associated antigen or the part thereof.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-36, wobei der Nachweis des Antiköφers mit einem Protein oder Peptid erfolgt, das spezifisch an den Antiköφer bindet.43. The method according to any one of claims 33-36, wherein the detection of the antibody is carried out with a protein or peptide that binds specifically to the antibody.
44. Verfahren zur Bestimmung der Regression, des Verlaufs oder des Ausbruchs einer44. Procedure for determining the regression, course or outbreak of a
Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor- assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend die Überwachung einer Probe aus einemDisease characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen, comprising monitoring a sample from a
Patienten, der die Erkrankung aufweist oder in Verdacht steht, an der Erkrankung zu erkranken in Bezug auf einen oder mehrere Parameter, ausgewählt aus der Grappe, bestehend aus:Patients who have the disease or are suspected of developing the disease in relation to one or more parameters selected from the Grappe, consisting of:
(i) der Menge der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teil davon,(i) the amount of the nucleic acid coding for the tumor-associated antigen or a part thereof,
(ii) der Menge des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon,(ii) the amount of the tumor-associated antigen or a part thereof,
(iii) der Menge an Antiköφern, die an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon binden, und(iii) the amount of antibodies that bind to the tumor-associated antigen or a part thereof, and
(iv) der Menge an cytolytischen oder Cytokin-ausschüttenden T-Zellen, die für einen Komplex zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem MHC-(iv) the amount of cytolytic or cytokine-releasing T cells that are required for a complex between the tumor-associated antigen or a part thereof and an MHC
Molekül spezifisch sind, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:Are molecule specific, wherein the tumor-associated antigen has a sequence encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei das Verfahren die Bestimmung des oder der Parameter zu einem ersten Zeitpunkt in einer ersten Probe und zu einem zweiten Zeitpunkt in einer weiteren Probe umfasst und durch einen Vergleich der beiden Proben der Verlauf der Erkrankung ermittelt wird.45. The method according to claim 44, wherein the method comprises the determination of the parameter or parameters at a first point in time in a first sample and at a second point in time in a further sample and the course of the disease is determined by comparing the two samples.
46. Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, wobei die Erkrankung sich durch die Expression oder abnormale Expression mehrerer verschiedener Tumor-assoziierter Antigene auszeichnet und die Überwachung eine Überwachung46. The method of claim 44 or 45, wherein the disease is characterized by the expression or abnormal expression of several different tumor-associated antigens and the monitoring monitoring
(i) der Menge mehrerer Nukleinsäuren, die für die mehreren verschiedenen Tumorassoziierten Antigene kodieren, oder von Teilen davon,(i) the amount of several nucleic acids coding for the several different tumor-associated antigens or of parts thereof,
(ii) der Menge der mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder von Teilen davon, (iii) der Menge mehrerer Antiköφer, die an die mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigene oder an Teile davon binden, und/oder(ii) the amount of the several different tumor-associated antigens or parts thereof, (iii) the amount of several antibodies which bind to the several different tumor-associated antigens or parts thereof, and / or
(iv) der Menge mehrerer cytolytischer oder Cytokine-ausschüttender T-Zellen, die für Komplexe zwischen den mehreren verschiedenen Tumor-assoziierten Antigenen oder von Teilen davon und MHC-Molekülen spezifisch sind, umfasst.(iv) the amount of multiple cytolytic or cytokine-releasing T cells specific for complexes between the multiple different tumor-associated antigens or portions thereof and MHC molecules.
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 44-46, wobei die Überwachung der Menge der Nukleinsäure oder des Teils davon mit einer Polynukleotid-Sonde erfolgt, die spezifisch mit der Nukleinsäure oder dem Teil davon hybridisiert.47. The method according to any one of claims 44-46, wherein the monitoring of the amount of the nucleic acid or part thereof is carried out with a polynucleotide probe which hybridizes specifically with the nucleic acid or part thereof.
48. Verfahren nach Ansprach 47, wobei die Polynukleotid-Sonde eine Sequenz von 6-50 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, umfasst.48. The method according to spoke 47, wherein the polynucleotide probe comprises a sequence of 6-50 contiguous nucleotides from the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen.
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 44-46, wobei die Überwachung der Menge der Nukleinsäure oder des Teils davon durch selektive Amplifikation der Nukleinsäure oder des Teils davon erfolgt. 49. The method according to any one of claims 44-46, wherein the monitoring of the amount of nucleic acid or part thereof is carried out by selective amplification of the nucleic acid or part thereof.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 44-46, wobei die Überwachung der Menge des Tumor-assoziierten Antigens oder des Teils davon mit einem Antiköφer erfolgt, der spezifisch an das Tumor-assoziierte Antigen oder den Teil davon bindet.50. The method according to any one of claims 44-46, wherein the monitoring of the amount of the tumor-associated antigen or part thereof is carried out with an antibody which specifically binds to the tumor-associated antigen or part thereof.
51. Verfahren nach einem der Ansprüche 44-46, wobei die Überwachung der Menge an Antiköφern mit einem Protein oder Peptid erfolgt, das spezifisch an den Antiköφer bindet.51. The method according to any one of claims 44-46, wherein the monitoring of the amount of antibodies is carried out with a protein or peptide that binds specifically to the antibody.
52. Verfahren nach einem der Ansprüche 44-46, wobei die Überwachung der Menge an cytolytischen oder Cytokin-aussschüttenden T-Zellen mit einer Zelle erfolgt, die den Komplex zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder dem Teil davon und einem MHC- Molekül präsentiert.52. The method according to any one of claims 44-46, wherein the monitoring of the amount of cytolytic or cytokine-releasing T cells is carried out with a cell presenting the complex between the tumor-associated antigen or the part thereof and an MHC molecule.
53. Verfahren nach einem der Ansprüche 37-38, 42-43, 47-48 und 50-52, wobei die Polynukleotid-Sonde, der Antiköφer, das Protein oder Peptid oder die Zelle nachweisbar markiert sind.53. The method according to any one of claims 37-38, 42-43, 47-48 and 50-52, wherein the polynucleotide probe, the antibody, the protein or peptide or the cell are detectably labeled.
54. Verfahren nach Ansprach 53, wobei der nachweisbare Marker ein radioaktiver Marker oder ein Enzymmarker ist.54. The method according to spoke 53, wherein the detectable marker is a radioactive marker or an enzyme marker.
55. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-54, wobei die Probe Köφerflüssigkeit und/oder Köφergewebe umfasst.55. The method according to any one of claims 33-54, wherein the sample comprises body fluid and / or body tissue.
56. Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-32, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Grappe ausgewählt ist, bestehend aus:56. A method of treating a disease characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen, comprising administering a pharmaceutical composition according to any one of claims 1-32, wherein the tumor-associated antigen has a sequence that is one of Encoding nucleic acid selected from the Grappe, consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
57. Verfahren zur Behandlung, Diagnose oder Überwachung einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend die Verabreichung eines Antiköφers, der an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon bindet und mit einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel gekoppelt ist, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Grappe ausgewählt ist, bestehend aus:57. A method for the treatment, diagnosis or monitoring of a disease which is characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen, comprising the administration of an antibody which binds to the tumor-associated antigen or a part thereof and with a therapeutic or is coupled diagnostic means, wherein the tumor-associated antigen has a sequence encoded by a nucleic acid selected from the Grappe, consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Grappe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence consisting of the Grappe consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
58. Verfahren nach Ansprach 42, 50 oder 57, wobei der Antiköφer ein monoklonaler Antiköφer ist.58. The method of spoke 42, 50 or 57, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
59. Verfahren nach Anspruch 42, 50 oder 57, wobei der Antiköφer ein chimärer oder humanisierter Antiköφer ist.59. The method of claim 42, 50 or 57, wherein the antibody is a chimeric or humanized antibody.
60. Verfahren nach Anspruch 42, 50 oder 57, wobei der Antiköφer ein Fragment eines natürlichen Antiköφers ist.60. The method of claim 42, 50 or 57, wherein the Antiköφer is a fragment of a natural Antiköφers.
61. Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend: (i) die Entfernung einer Probe mit immunreaktiver Zellen aus dem Patienten,61. A method of treating a patient with a disease characterized by the expression or abnormal expression of a tumor associated antigen, comprising: (i) removing a sample of immunoreactive cells from the patient,
(ii) die Kontaktierung der Probe mit einer Wirtszelle, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimiert, unter Bedingungen, die eine Produktion cytolytischer oder Cytokine-ausschüttender T-Zellen gegen das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon begünstigen, und (iii) das Einbringen der cytolytischen oder Cytokine-ausschüttenden T-Zellen in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, Zellen zu lysieren, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimieren, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(ii) contacting the sample with a host cell which expresses the tumor-associated antigen or a part thereof under conditions which favor the production of cytolytic or cytokine-releasing T cells against the tumor-associated antigen or a part thereof, and (iii) introducing the cytolytic or cytokine-releasing T-cells into the patient in an amount suitable for lysing cells that express the tumor-associated antigen or a part thereof, the tumor-associated antigen having a sequence which is encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of: (a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence consisting of the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5 , 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die imter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(b) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a), (c) a nucleic acid that is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid that is the nucleic acid under (a), (b) or (c) is complementary.
62. Verfahren nach Anspruch 61, wobei die Wirtszelle ein HLA-Molekül rekombinant exprimiert, das an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon bindet.62. The method of claim 61, wherein the host cell recombinantly expresses an HLA molecule that binds to the tumor-associated antigen or a portion thereof.
63. Verfahren nach Ansprach 62, wobei die Wirtszelle ein HLA-Molekül endogen exprimiert, das an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon bindet.63. The method of approached 62, wherein the host cell endogenously expresses an HLA molecule that binds to the tumor-associated antigen or a part thereof.
64. Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend:64. A method of treating a patient with a disease characterized by the expression or abnormal expression of a tumor-associated antigen, comprising:
(i) die Identifizierung einer Nukleinsäure, die von Zellen exprimiert wird, die mit der Erkrankung assoziiert sind, wobei die Nukleinsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:(i) the identification of a nucleic acid expressed by cells associated with the disease, the nucleic acid being selected from the group consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist, (ii) die Transfektion einer Wirtszelle mit der Nukleinsäure oder einem Teil davon, (iii) die Kultivierung der transfizierten Wirtszelle für eine Expression der Nukleinsäure, und (iv) das Einbringen der Wirtszellen oder eines Extrakts davon in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, die Immunreaktion gegen die Zellen des Patienten, die mit der Erkrankung assoziiert sind, zu erhöhen.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c), (ii) the transfection of a host cell with the nucleic acid or a part thereof, (iii) culturing the transfected host cell for expression of the nucleic acid, and (iv) introducing the host cells or an extract thereof into the patient in an amount appropriate to the immune response against the patient's cells associated with the disease are increasing.
65. Verfahren nach Ansprach 64, ferner umfassend die Identifizierung eines MHC- Moleküls, das das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentiert, wobei die Wirtszelle das identifizierte MHC-Molekül exprimiert und das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentiert.65. The method of claim 64, further comprising identifying an MHC molecule that presents the tumor-associated antigen or a portion thereof, the host cell expressing the identified MHC molecule and presenting the tumor-associated antigen or a portion thereof.
66. Verfahren nach Anspruch 64 oder 65, wobei die Immunreaktion eine B-Zellen- Reaktion oder eine T-Zellen-Reaktion umfasst.66. The method of claim 64 or 65, wherein the immune response comprises a B cell response or a T cell response.
67. Verfahren nach Ansprach 66, wobei die Immunreaktion eine T-Zellen-Reaktion ist, umfassend die Produktion cytolytischer oder Cytokine-ausschüttenden T-Zellen, die spezifisch für die Wirtszellen sind, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon präsentieren oder spezifisch für Zellen des Patienten sind, die das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon exprimieren.67. The method of approached 66, wherein the immune response is a T-cell response comprising producing cytolytic or cytokine-releasing T-cells specific for the host cells presenting or specific to the tumor-associated antigen or a portion thereof for cells of the patient which express the tumor-associated antigen or a part thereof.
68. Verfahren nach einem der Ansprüche 61-67, wobei die Wirtszellen nicht-proliferativ sind.68. The method according to any one of claims 61-67, wherein the host cells are non-proliferative.
69. Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung, die sich durch die Expression oder abnormale Expression eines Tumor-assoziierten Antigens auszeichnet, umfassend: (i) die Identifikation von Zellen aus dem Patienten, die abnormale Mengen des Tumorassoziierten Antigens exprimieren, (ii) die Isolierung einer Probe der Zellen, (iii) die Kultivierung der Zellen, und (iv) das Einbringen der Zellen in den Patienten in einer Menge, die geeignet ist, eine Immunreaktion gegen die Zellen auszulösen, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Grappe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,69. A method of treating a disease characterized by the expression or abnormal expression of a tumor associated antigen, comprising: (i) identifying cells from the patient that express abnormal amounts of the tumor associated antigen, (ii) isolating one Sample of the cells, (iii) culturing the cells, and (iv) introducing the cells into the patient in an amount suitable to elicit an immune response against the cells, the tumor-associated antigen having a sequence of encoding a nucleic acid selected from the group consisting of: (a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence consisting of the Grappe consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
70. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-69, wobei die Erkrankung Krebs ist.70. The method according to any one of claims 33-69, wherein the disease is cancer.
71. Verfahren zur Hemmung der Entwicklung von Krebs bei einem Patienten, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-32.71. A method of inhibiting the development of cancer in a patient, comprising administering an effective amount of a pharmaceutical composition according to any one of claims 1-32.
72. Verfahren nach einem der Ansprüche 33-71, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 22-24, 58- 61, 81, 82, 103-105, 6-13, 14-18, 30, 34-36, 38, 41, 64, 65, 71, 75, 80, 83, 84, 89-100, 101, 102, 106-117 einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist.72. The method according to any one of claims 33-71, wherein the tumor-associated antigen comprises an amino acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 6-13 , 14-18, 30, 34-36, 38, 41, 64, 65, 71, 75, 80, 83, 84, 89-100, 101, 102, 106-117 a part or derivative thereof is selected.
73. Nukleinsäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 20-21, 54-57, 2-5, 31-33, 37, 39, 62, 63, 85-88 einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist, (b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,73. Nucleic acid selected from the group consisting of: (a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence consisting of the group consisting of SEQ ID NOs: 20-21, 54-57, 2-5, 31-33 , 37, 39, 62, 63, 85-88 a part or derivative thereof is selected, (b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
74. Nukleinsäure, die für ein Protein oder Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 23-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 7-13, 14-18, 34-36, 64, 65, 80, 83, 84, 89-100, 101, 102, 106-117 einem Teil oder Derivat davon. 74. Nucleic acid encoding a protein or polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 7-13, 14-18 , 34-36, 64, 65, 80, 83, 84, 89-100, 101, 102, 106-117 a part or derivative thereof.
75. Rekombinantes DNA- oder RNA-Molekül, das eine Nukleinsäure nach Ansprach 73 oder 74 umfasst.75. Recombinant DNA or RNA molecule which comprises a nucleic acid according to spoke 73 or 74.
76. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 75, wobei das rekombinante DNA- Molekül ein Vektor ist.76. The recombinant DNA molecule according to claim 75, wherein the recombinant DNA molecule is a vector.
77. Rekombinantes DNA-Molekül nach Ansprach 76, wobei der Vektor ein viraler Vektor oder ein Bakteriophage ist.77. Recombinant DNA molecule according to spoke 76, wherein the vector is a viral vector or a bacteriophage.
78. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 75-77, das ferner Expressionskontrollsequenzen umfasst, die die Expression der Nukleinsäure steuern.78. A recombinant DNA molecule according to any one of claims 75-77, further comprising expression control sequences that direct expression of the nucleic acid.
79. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 78, wobei die Expressionskontrollsequenzen homo- oder heterolog zu der Nukleinsäure sind.79. A recombinant DNA molecule according to claim 78, wherein the expression control sequences are homo- or heterologous to the nucleic acid.
80. Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 73 oder 74 oder ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 75-79 umfasst.80. Host cell comprising a nucleic acid according to claim 73 or 74 or a recombinant DNA molecule according to one of claims 75-79.
81. Wirtszelle nach Anspruch 80, die ferner eine Nukleinsäure umfasst, die für ein HLA- Molekül kodiert.81. The host cell of claim 80, further comprising a nucleic acid encoding an HLA molecule.
82. Protein oder Polypeptid, das von einer Nukleinsäure nach Ansprach 73 kodiert wird.82. Protein or polypeptide which is encoded by a nucleic acid according to spoke 73.
83. Protein oder Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 23-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 7-13, 14-18, 34-36, 64, 65, 80, 83, 84, 89-100, 101, 102, 106-117 einem Teil oder Derivat davon.83. Protein or polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 7-13, 14-18, 34-36, 64 , 65, 80, 83, 84, 89-100, 101, 102, 106-117 a part or derivative thereof.
84. Immunogenes Fragment des Proteins oder Polypeptids nach Anspruch 82 oder 83.84. Immunogenic fragment of the protein or polypeptide according to claim 82 or 83.
85. Fragment des Proteins oder Polypeptids nach Anspruch 82 oder 83, das an menschlichen HLA-Rezeptor oder menschlichen Antikörper bindet. 85. Fragment of the protein or polypeptide according to claim 82 or 83, which binds to human HLA receptor or human antibody.
86. Mittel, das spezifisch an ein Protein oder Polypeptid oder an einen Teil davon bindet, wobei das Protein oder Polypeptid von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:86. Agent which binds specifically to a protein or polypeptide or to a part thereof, the protein or polypeptide being encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
87. Mittel nach Anspruch 86, wobei das Protein oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 6-13, 14-18, 30, 34-36, 38, 41, 64, 65, 71, 75, 80, 83, 84, 89-100, 101, 102, 106-117 einem Teil oder Derivat davon.87. The agent of claim 86, wherein the protein or polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 6-13, 14 -18, 30, 34-36, 38, 41, 64, 65, 71, 75, 80, 83, 84, 89-100, 101, 102, 106-117 a part or derivative thereof.
88. Mittel nach Anspruch 86 oder 87, wobei das Mittel ein Antiköφer ist.88. Agent according to claim 86 or 87, wherein the agent is an antibody.
89. Mittel nach Anspruch 88, wobei der Antiköφer ein monoklonaler, chimärer oder humanisierter Antiköφer oder ein Fragment eines Antikörpers ist.89. A composition according to claim 88, wherein the antibody is a monoclonal, chimeric or humanized antibody or a fragment of an antibody.
90. Antiköφer, der selektiv an einen Komplex aus: (i) einem Protein oder Polypeptid oder einem Teil davon und (ii) einem MHC-Molekül bindet, an das das Protein oder Polypeptid oder der Teil davon bindet, wobei der Antiköper nicht alleine an (i) oder (ii) bindet und das Protein oder Polypeptid von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:90. Antibody that selectively binds to a complex of: (i) a protein or polypeptide or part thereof and (ii) an MHC molecule to which the protein or polypeptide or part thereof binds, the antibody not being attached to alone (i) or (ii) binds and the protein or polypeptide is encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88, einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70 , 74, 85-88, a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a), (c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
91. Antiköφer nach Anspruch 90, wobei das Protein oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Grappe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 6-13, 14-18, 30, 34-36, 38, 41, 64, 65, 71, 75, 80, 83, 84, 89- 100, 101, 102, 106-117 einem Teil oder Derivat davon.91. Antibody according to claim 90, wherein the protein or polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the Grappe, consisting of SEQ ID NOs: 22-24, 58-61, 81, 82, 103-105, 6-13, 14 -18, 30, 34-36, 38, 41, 64, 65, 71, 75, 80, 83, 84, 89- 100, 101, 102, 106-117 a part or derivative thereof.
92. Antiköφer nach Anspruch 90 oder 91, wobei der Antiköφer ein monoklonaler, chimärer oder humanisierter Antiköφer oder ein Fragment eines Antiköφers ist.92. Antibody according to claim 90 or 91, wherein the antibody is a monoclonal, chimeric or humanized antibody or a fragment of an antibody.
93. Konjugat zwischen einem Mittel nach einem der Ansprüche 86-89 oder einem Antiköφer nach einem der Ansprüche 90-92 und einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel.93. Conjugate between an agent according to any one of claims 86-89 or an antibody according to any one of claims 90-92 and a therapeutic or diagnostic agent.
94. Konjugat nach Anspruch 93, wobei das therapeutische oder diagnostische Mittel ein Toxin ist.94. The conjugate of claim 93, wherein the therapeutic or diagnostic agent is a toxin.
95. Kit zum Nachweis der Expression oder abnormalen Expression eines Tumorassoziierten Antigens, umfassend Mittel zum Nachweis95. Kit for the detection of expression or abnormal expression of a tumor associated antigen, comprising means for detection
(i) der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teils davon, (ii) des Tumor-assoziierten Antigens oder eines Teils davon, (iii) von Antiköφern, die an das Tumor-assoziierte Antigen oder einen Teil davon binden, und/oder(i) the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen or a part thereof, (ii) the tumor-associated antigen or part thereof, (iii) antibodies which bind to the tumor-associated antigen or a part thereof bind, and / or
(iv) von T-Zellen, die für einen Komplex zwischen dem Tumor-assoziierten Antigen oder einem Teil davon und einem MHC-Molekül spezifisch sind, wobei das Tumor-assoziierte Antigen eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88 einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(iv) T cells specific for a complex between the tumor-associated antigen or a portion thereof and an MHC molecule, the tumor-associated antigen having a sequence encoded by a nucleic acid derived from the Group is selected consisting of: (a) a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence consisting of the group consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88 a part or derivative thereof is selected,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert, (c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a), (c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and
(d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
96. Kit nach Anspruch 95, wobei die Mittel zum Nachweis der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, oder eines Teils davon Nukleinsäuremoleküle für die selektive Amplifikation der Nukleinsäure sind.96. The kit according to claim 95, wherein the means for detecting the nucleic acid coding for the tumor-associated antigen or a part thereof are nucleic acid molecules for the selective amplification of the nucleic acid.
97. Kit nach Ansprach 96, wobei die Nukleinsäuremoleküle für die selektive Amplifikation der Nukleinsäure eine Sequenz von 6-50 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für das Tumor-assoziierte Antigen kodiert, umfassen.97. Kit according to spoke 96, wherein the nucleic acid molecules for the selective amplification of the nucleic acid comprise a sequence of 6-50 contiguous nucleotides from the nucleic acid which codes for the tumor-associated antigen.
98. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Promotorregion, die von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist, die aus der Grappe bestehend aus SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88 ausgewählt ist.98. Recombinant DNA molecule comprising a promoter region derived from a nucleic acid sequence derived from the Grappe consisting of SEQ ID NOs: 19-21, 54-57, 1-5, 29, 31-33, 37, 39, 40, 62, 63, 70, 74, 85-88 is selected.
99. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Mittel, das die Expression oder Aktivität des Tumorantigens TPTE SEQ ID NOs: 19, 22 hemmt.99. A pharmaceutical composition comprising an agent that inhibits the expression or activity of the tumor antigen TPTE SEQ ID NOs: 19, 22.
100. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Mittel, das die Migrations- und Metastasierungsaktivität von TPTE hemmt.100. A pharmaceutical composition comprising an agent that inhibits the migration and metastasis activity of TPTE.
101. Mittel nach Anspruch 99 oder 100, wobei das Mittel ein Antiköφer ist.101. Agent according to claim 99 or 100, wherein the agent is an antibody.
102. Mittel nach Anspruch 101, wobei der Antikörper ein monoklonaler, chimärer oder humanisierter Antiköφer oder ein Fragment eines Antiköφers ist.102. A composition according to claim 101, wherein the antibody is a monoclonal, chimeric or humanized antibody or a fragment of an antibody.
103. Antiköφer, der an die extrazellulären Proteinbereiche umfassend die Sequenzen SEQ ID NOs: 81-82 bindet.103. Antibody that binds to the extracellular protein regions comprising the sequences SEQ ID NOs: 81-82.
104. Mittel nach Anspruch 99 oder 100, wobei das Mittel eine Antisense-Nukleinsäure ist, die selektiv mit der Nukleinsäure hybridisiert, die für TPTE kodiert. 104. The agent of claim 99 or 100, wherein the agent is an antisense nucleic acid that selectively hybridizes with the nucleic acid encoding TPTE.
105. Mittel nach Anspruch 104, wobei die Antisense-Nukleinsäure eine Sequenz von 6-50 zusammenhängenden Nukleotiden aus der Nukleinsäure, die für TPTE kodiert, umfasst.105. The agent of claim 104, wherein the antisense nucleic acid comprises a sequence of 6-50 contiguous nucleotides from the nucleic acid encoding TPTE.
106. Mittel nach Anspruch 99 oder 100, wobei das Mittel RNA Interferenz (RNAi) ist.106. The agent of claim 99 or 100, wherein the agent is RNA interference (RNAi).
107. Mittel nach Anspruch 106, wobei RNAi eine sog. short haiφin Struktur (shRNA) enthält.107. Composition according to claim 106, wherein RNAi contains a so-called short haiφin structure (shRNA).
108. Mittel nach Anspruch 107, wobei shRNA durch Transkription nach Transfektion mit Expressionsvektoren entstehen.108. Agent according to claim 107, wherein shRNA is formed by transcription after transfection with expression vectors.
109. Mittel nach Anspruch 107, wobei shRNA durch Transkription von Retroviren entsteht109. Agent according to claim 107, wherein shRNA is produced by transcription of retroviruses
110. Mittel nach Anspruch 107, wobei shRNA durch lentivirale Systeme vermittelt wird.110. Agent according to claim 107, wherein shRNA is mediated by lentiviral systems.
111. Mittel nach Anspruch 99 oder 100, wobei das Mittel ein kleines chemisches Molekül ist.111. The agent of claim 99 or 100, wherein the agent is a small chemical molecule.
112. Mittel nach Anspruch 111, wobei die kleinen chemischen Moleküle an TPTE binden112. The agent of claim 111, wherein the small chemical molecules bind to TPTE
113. Mittel nach Anspruch 112, wobei die kleinen chemischen Moleküle an die extrazellulären Bereiche umfassend SEQ ID NO:81-82 binden.113. The agent of claim 112, wherein the small chemical molecules bind to the extracellular regions comprising SEQ ID NO: 81-82.
114. Verfahren zur Behandlung Diagnose oder Überwachung eines metastasierenden Tumors, der sich durch die Expression oder abnormaler Expression von TPTE auszeichnet, umfassend die Verabreichung eines Antiköφers, der an TPTE oder einen Teil davon bindet und mit einem therapeutischen oder diagnostischen Mittel gekoppelt ist, wobei das TPTE eine Sequenz aufweist, die von einer Nukleinsäure kodiert wird bestehend aus:114. A method of treatment for diagnosing or monitoring a metastatic tumor which is characterized by the expression or abnormal expression of TPTE, comprising the administration of an antibody which binds to TPTE or a part thereof and is coupled to a therapeutic or diagnostic agent, the TPTE has a sequence encoded by a nucleic acid consisting of:
(a) einer Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz umfassend die SEQ ID NO: 19 einem Teil oder Derivat davon ausgewählt ist,(a) a nucleic acid selected from a part or derivative thereof of a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 19,
(b) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure unter (a) hybridisiert,(b) a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid under (a),
(c) einer Nukleinsäure, die in Bezug auf die Nukleinsäure unter (a) oder (b) degeneriert ist und (d) einer Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäure unter (a), (b) oder (c) komplementär ist.(c) a nucleic acid which is degenerate with respect to the nucleic acid under (a) or (b) and (d) a nucleic acid which is complementary to the nucleic acid under (a), (b) or (c).
115. Verfahren nach Ansprach 114, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antiköφer ist.115. The method of spoke 114, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
116. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der Antiköφer ein chimärer oder humanisierter Antiköφer ist.116. The method of claim 114, wherein the antibody is a chimeric or humanized antibody.
117. Verfahren nach Anspruch 114, wobei der Antiköφer ein Fragment eines natürlichen Antiköφers ist. 117. The method of claim 114, wherein the antibody is a fragment of a natural antibody.
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