EP1561109A1 - Analytical platform and detection method with analytes which are to be detected in a sample in the form of immobilized specific binding partners - Google Patents

Analytical platform and detection method with analytes which are to be detected in a sample in the form of immobilized specific binding partners

Info

Publication number
EP1561109A1
EP1561109A1 EP03793766A EP03793766A EP1561109A1 EP 1561109 A1 EP1561109 A1 EP 1561109A1 EP 03793766 A EP03793766 A EP 03793766A EP 03793766 A EP03793766 A EP 03793766A EP 1561109 A1 EP1561109 A1 EP 1561109A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
samples
analytes
field sensor
evanescent field
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03793766A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Michael Pawlak
Eginhard Schick
Peter Oroszlan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Intellectual Property GmbH
Original Assignee
Zeptosens AG
Bayer Technology Services GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeptosens AG, Bayer Technology Services GmbH filed Critical Zeptosens AG
Publication of EP1561109A1 publication Critical patent/EP1561109A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings

Definitions

  • the present invention relates to an analytical platform and a ner driving carried out with it to examine a Niel number of "nature-identical" samples for compounds contained in the samples that are biologically relevant as participants in specific binding reactions as analytes, characterized in that
  • Said changes in optoelectronic signals as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measurement areas in the samples, can be carried out in the evanescent field of the evanescent field sensor platform, for example from the comparison of the simultaneously measured signals from different measurement areas which contain corresponding analytes to be detected ( in known or unknown concentration or amount) with the Signals from measuring ranges which do not contain the corresponding analytes to be detected are determined.
  • a corresponding change can also be determined from the time course of the signals from the corresponding measurement areas.
  • washing steps are necessary in order to remove the complexes formed from the detection elements and the analytes to be detected and, if appropriate, further detection substances from the rest of the sample and the to separate any additional reagents used.
  • microarrays both for the detection of nucleic acids and other biopolymers, such as proteins
  • a large number of different specific recognition elements are immobilized in discrete measurement areas for the production of an array for analyte detection and subsequently the The sample to be examined is brought into contact with the analytes present in a (possibly complex) mixture.
  • different specific detection elements are present in the most highly pure form possible in different discrete measurement ranges, so that Measuring areas with different detection elements generally bind different analytes from the sample.
  • This type of known assay requires that the specific recognition elements to be immobilized in the highest possible purity are enriched by means of sometimes very complex work steps. Since different recognition elements differ more or less strongly in their physicochemical properties (e.g. in their polarity), there are also corresponding differences in the conditions for optimal immobilization of these recognition elements, for example by adsorption or covalent bonding, in discrete measuring ranges on a common solid support, optionally on an adhesion-promoting layer applied thereon.
  • the immobilization conditions chosen for immobilizing a large number of different recognition elements can hardly be an optimum for all recognition elements at the same time, but merely a compromise between the immobilization properties of the different recognition elements.
  • This type of assay also has the disadvantage that the detection of analytes in a large number of different samples generally requires the provision of a corresponding number of discrete arrays of recognition elements to which the different samples are fed on common or discrete supports. To examine a large number of different samples, this means the need for a large number of discrete arrays, the production of which is relatively complex.
  • the hybrids formed by immobilized oligonucleotides and contained in a sample supplied and complementary to the immobilized oligonucleotides can be dissociated again with high efficiency under suitable dissociation conditions and thus a recognition surface can be regenerated, but a 100% regeneration ability can hardly be guaranteed become.
  • bioaffinity complexes with proteins there is often no reversibility of the Binding step, ie no possibility to regenerate the detection surface.
  • RNA molecules to be detected are isolated from a biological sample, the size is separated, applied to a solid support and then there, for example in a hybridization assay by hybridization with known, complementary polynucleotides, be detected.
  • the RNA molecules to be detected which are isolated from an organism, can either be subjected directly to the further detection method if they are present in high concentration, or must be known before the actual detection method using known amplification methods (e.g. by means of PCR, “polymerase Chain Reaction ”) can be increased. Even if the method proposed in US Pat. No.
  • 6,287,768 opens up the possibility of determining RNA from different samples at the same time, it still requires a number of complex sample preparation steps and in particular the isolation from the biological sample matrix and a subsequent separation according to the molecular size. Since the claimed method, which is only described using the example of RNA, requires at least the isolation from the original sample matrix and subsequent separation of the biopolymers to be detected according to their size, it can be expected that the relative molecular composition after this separation step, before the detection step, will differ is of the relative molecular composition in the original sample matrix.
  • the term “unchanged relative molecular composition” should mean that the concentration ratio of the analytes to be determined in an analysis remains unchanged. Changes in the content of solvent or matrix molecules or other compounds which are not determined in the detection method in question are not taken into account in this designation.
  • the detection steps used in this case generally do not have sufficient sensitivity to determine the analytes to be detected in the samples with the desired detection limits.
  • detection components used for analyte detection (such as radioactive isotopes or chromophores with a characteristic absorption and / or luminescence or fluorescence) and the reading out of the signals from arrays of the type mentioned is based on classic, for example optical arrangements and detection methods
  • Measurement methods such as absorption or fluorescence measurements, are generally based on the direct illumination of a sample volume in a sample container or a measurement field on an inner wall of a sample container of a liquid sample.
  • the detection of the analyte is based on its interaction with the evanescent field, which is connected to the light guide in an optical waveguide.
  • a light wave is coupled into an optical waveguide that is made of optically thinner media, i.e. Media with a lower refractive index is surrounded, so it is guided by total reflection at the interfaces of the waveguiding layer.
  • a fraction of the guided light enters the optically thinner media. This portion is called the evanescent or cross-damped field.
  • the strength of the evanescent field is very much dependent on the thickness of the waveguiding layer itself and on the ratio of the refractive indices of the waveguiding layer and the media surrounding it.
  • Waveguides with layer thicknesses of the same or lower thickness than the wavelength to be guided can be distinguished from discrete modes of the guided light.
  • Such methods have the advantage that the interaction of the excitation light with the analyte is limited to the depth of penetration of the evanescent field into the adjacent medium, on the order of a few hundred nanometers, and interference signals from the depth of the medium can be largely avoided.
  • the first proposed measuring arrangements of this type were based on highly multimodal, self-supporting single-layer waveguides, such as fibers or platelets made of transparent plastic or glass, with thicknesses from a few hundred micrometers to several millimeters.
  • planar thin-film waveguides have been proposed.
  • a planar thin-film waveguide consists of a three-layer system: carrier material, wave-guiding layer, superstrate (or too investigating sample), the waveguiding layer having the highest refractive index.
  • Different methods for the detection of analytes in the evanescent field of guided light waves in optical layer waveguides can be distinguished.
  • a distinction can be made, for example, between fluorescence or general luminescence methods on the one hand and refractive methods on the other.
  • methods for generating a surface plasmon resonance in a thin metal layer on a dielectric layer with a lower refractive index can be included in the group of refractive methods, provided that the resonance angle of the irradiated excitation light is used as the basis for determining the measurement variable to generate the surface plasmon resonance.
  • the surface plasmon resonance can also be used to enhance luminescence or to improve the signal-to-background ratio in a luminescence measurement.
  • luminescence refers to the spontaneous emission of photons in the ultraviolet to infrared range according to optical or non-optical, such as, for example, electrical or chemical or biochemical or thermal excitation.
  • optical or non-optical such as, for example, electrical or chemical or biochemical or thermal excitation.
  • chemiluminescence, bioluminescence, electroluminescence and in particular fluorescence and phosphorescence are included under the term "luminescence”.
  • the change in the so-called effective refractive index due to molecular adsorption or desorption on the waveguide is used to detect the analyte.
  • This change in the effective refractive index in the case of grating coupler sensors, is determined from the change in the coupling angle for the coupling or decoupling of light into or from the grating coupler sensor, and in the case of interferometric sensors from the change in the phase difference between the a sensor arm and a reference arm of the interferometer-guided measuring light.
  • the refractive methods mentioned have the advantage that they can be used without the use of additional labeling molecules, so-called molecular labels.
  • the disadvantage of these label-free methods is, however, that the detection limits that can be achieved with them are limited to pico- to nanomolar concentration ranges due to the low selectivity of the measurement principle, depending on the molecular weight of the analyte, which is necessary for many applications of modern trace analysis, for example for diagnostic applications. is not sufficient.
  • luminescence-based methods appear more suitable due to the greater selectivity of the signal generation.
  • the luminescence excitation is limited to the depth of penetration of the evanescent field into the optically thinner medium, i.e. to the immediate vicinity of the wave-guiding region with a depth of penetration of the order of a few hundred nanometers into the medium. This principle is called evanescent luminescence excitation.
  • the excitation light is coupled into the waveguiding film as a diffractive optical element via a relief grating.
  • the isotropically emitted luminescence in the penetration depth of the evanescent field of luminescent substances is measured by means of suitable measuring devices, such as photodiodes, photomultipliers or CCD cameras. It is also possible to couple out and measure the portion of the evanescently excited radiation fed back into the waveguide via a diffractive optical element, for example a grating. This method is described for example in WO 95/33198.
  • a “mixture of compounds to be subjected to analysis” is to be referred to as “nature-identical sample", which has the same relative molecular composition of the analytes to be detected therein ("unchanged relative molecular composition" (according to the above definition)) as the original sample from which it was obtained.
  • the original sample also falls under the designation "nature-identical sample”.
  • the original sample can be a biological cell in which different molecules or compounds are distributed heterogeneously.
  • one of a whole should also be used a sample created from one or more cells that are previously selected from a larger number of cells, for example by centrifugation, filtration or by “laser capture microdissection”.
  • the cell can be lysed in a first preparation step, which is generally necessary for further examination steps.
  • the lysate obtained therefrom with a homogeneous distribution of the compounds contained should also be referred to as a "nature-identical sample” if the relative molecular composition of the analytes to be detected has remained unchanged.
  • a "nature-identical sample” is characterized in particular by the fact that it covers the entire proteome of the "original sample”.
  • the lysate can be in a suitable Solvent, for example a buffer solution, be dissolved and contain known added admixtures, for example stabilizers such as enzyme inhibitors, in order to prevent degradation of the biopolymers contained therein.
  • a “nature-identical” sample in the definition sense can also contain additions of known concentrations of similar compounds (as standards) such as the analytes to be detected, comparable to a "spiking" of samples in chromatography. Such additives can be useful, for example, for calibration purposes.
  • the "nature-identical” samples can contain additives from compounds similar to the sample matrix but different from the analytes to be detected, such as bovine serum albumin (BSA), which can be used, for example, to control the surface density of immobilized analyte molecules in a measuring range.
  • BSA bovine serum albumin
  • samples containing analytes ie in particular biopolymers such as nucleic acids or proteins, can be in native form or denatured form, after treatment of the" original sample ", for example with urea or surfactants (eg SDS).
  • urea or surfactants eg SDS
  • the analytes contained in the "nature-identical samples”, ie in particular biopolymers such as nucleic acids or proteins, are present in denatured form after treatment with urea, the epitopes of these analytes for binding their respective detection substances, for example antibodies.
  • biopolymers such as nucleic acids or proteins
  • the sensitivity of the method according to the invention is so great that a “nature-identical” sample can also be greatly diluted and the compounds contained in the mixture, despite the concentration being very low and the amount available in a single measuring range being correspondingly lower, still being present High accuracy can be detected, which is not possible with the known conventional methods.
  • the analytes applied, contained in a sample and to be detected, generally also after their immobilization on an evanescent field sensor platform are generally still in the same relative molecular composition as in the original sample
  • the method can therefore provide results that are representative of the overall molecular composition of the original sample, since the otherwise usual enrichment and separation steps can be avoided.
  • analyte is to be referred to a molecular species which is distinguished and bound with the aid of a specific detection substance used for this purpose from other compounds contained in a sample to be analyzed. For example, if a corresponding detection substance is only bound to the phosphorylated, but not to the unphosphorylated form of a compound or species to be detected, then, according to this definition, both forms of this compound or species represent two different analytes. If any compounds or species are recognized and bound by a corresponding detection substance, if they are phosphorylated, then accordingly under this condition the corresponding phosphorylated compounds or species together represent an analyte.
  • Specific binding partners as detection substances of an analyte according to this definition can be selected for example in this way in that they only recognize and bind to the phosphorylated form or the glycolized form (or correspondingly the non-phosphorylated or non-glycolized form) of a compound to be detected.
  • the activity of a biological signaling pathway in a cell or organism can be correlated with the proportion of phosphorylated or glycolized compounds (depending on the nature of the signaling pathway) that control this signaling pathway.
  • the relative proportion of the phosphorylated or glycolized form in the total amount ie the quotient of the amount of a compound in its phosphorylated or glycolized form and the total amount of this compound in phosphorylated and non-phosphorylated form or glycolized and non-glycolized form, in a sample hereinafter referred to as the degree of phosphorylation or degree of glycolization of this compound in the sample.
  • the degree of phosphorylation and degree of glycolysis can be summarized under the generic term of the degree of activation of a compound whose numerical value corresponds, for example, to the degree of phosphorylation or the degree of glycolysis.
  • the degree of activation of a compound can also denote other chemically modified forms of a compound.
  • Specific binding partners as detection substances can also be selected such that they only bind to a connection to be detected if it is present in a certain three-dimensional structure. For example, many antibodies only recognize and bind to specific sub-areas (epitopes) of a substance to be detected with a special three-dimensional structure. Depending on the conformational state of the corresponding compound to be detected, these partial areas (epitopes) can be accessible or hidden for the binding of the corresponding detection substance.
  • the specific binding partners can also be selected such that they bind to regions of the connection to be detected, the accessibility of which is independent of the three-dimensional structure of this connection. By using appropriately selected detection substances, it is therefore possible to determine the relative proportion of the total amount of a compound to be detected in a sample, which has a specific conformational state.
  • biologically relevant compounds which are known to be participants in specific binding reactions to molecules or compounds of biological origin or to their synthetically produced analogs are to be referred to as “biologically relevant”.
  • biologically relevant compounds are therefore not only natural proteins, such as antibodies or receptors , or nucleic acids, but also their binding partners, such as antigens, which can also be synthetic compounds, even of very low molecular weight.
  • spatially separate or discrete measurement areas are to be defined by the closed area, which binding partners immobilized there assume for the detection of one or more analytes in one or more samples in a bioaffinity assay.
  • These surfaces can have any geometry, for example the shape of circles, rectangles, triangles, ellipses, etc.
  • Different measurement ranges of this type can be, for example, a multiplicity of different samples applied to the carrier substrate or different dilutions of one or more samples applied (each in different discrete measurement ranges).
  • the material for the discrete Measuring ranges can be provided, for example, by selective micro-preparations, such as, for example, the selective detachment of individual cells from a cell assembly by "laser capture micro dissection".
  • the "nature-identical" sample with the analytes to be detected therein can be selected from the group of extracts from healthy or pathological cells (e.g. from human, animal, bacterial or plant cell extracts), extracts from animal or human tissue, such as for example organ, skin, hair or bone tissue, or of plant tissue, as well as body fluids or their components, such as blood, serum or plasma, synovial fluids, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid, lymph.
  • a “nature-identical "The sample can also be selected from the group comprising extracts of stimulated or untreated cells and extracts of healthy or pathological tissue.
  • a “nature-identical” sample can also be taken from an organism or tissue or cell structure or cell using a method from the group of tissue sections, biopsy.
  • binding partners will be immobilized simultaneously in one measuring range. Most of the time it will be a variety, i.e. H. Trade several hundred or even several thousand different analytes immobilized analytes in one measuring range.
  • the first object of the invention is a method for examining a large number of "nature-identical" samples for compounds contained in the samples that are biologically relevant as participants in specific binding reactions, characterized in that
  • One or more detection substances as a second plurality of specific binding partners, for the specific detection of one or more analytes contained in the samples, from said first plurality of specific binding partners, in a single or more steps of a specific binding reaction with the samples applied in said discrete measuring ranges be brought into contact
  • the simplest form of immobilization of specific binding partners for an analyte detection in a specific binding reaction is physical adsorption, for example as a result of hydrophobic interactions between the specific binding partners to be immobilized and the evanescent field sensor platform as a solid carrier.
  • these interactions can be greatly changed in their extent by the composition of the medium and its physicochemical properties, such as polarity and ionic strength.
  • the adherence of the recognition elements after purely adsorptive immobilization on the surface is often insufficient.
  • the evanescent field sensor platform in order to improve the adherence of the "nature-identical" samples applied in discrete measurement areas or of their dilutions, comprises an adhesion-promoting layer on which said samples or their dilutions are applied.
  • the thickness of the adhesion-promoting layer is preferably less than 200 nm, particularly preferably less than 20 nm.
  • the adhesion-promoting layer can comprise compounds from the group of silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized passive or functionalized mono- or multilayers", thiols, alkyl phosphates and phosphonates, multifunctional block copolymers, such as, for example, poly (L) lysine / polyethylene glycols.
  • adhesion-promoting layer comprises compounds from the group of organophosphoric acids of the general formula I (A)
  • B is an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, hetaryl or hetarylalkyl radical and Y is hydrogen or a functional group from the series hydroxyl, carboxy, amino, optionally mono- or substituted by lower alkyl Dialkylamino, thiol, or a negative acid group from the series ester, phosphate, phosphonate, sulfate, sulfonate, maleimide, succinimydyl, epoxy or acrylate.
  • the method according to the invention is preferably designed in such a way that the relative molecular composition of a first plurality of specific binding partners immobilized in a measurement area matches as analytes with the original relative molecular composition of the sample applied there.
  • This condition can be met, for example, in that the material of a sample applied in a measuring area is the same size or less than for the formation of a monolayer on the evanescent field sensor platform solid support is required.
  • the best possible accessibility of the first multitude of specific binding partners immobilized as analytes is guaranteed for the detection substances to be brought into contact with it.
  • the accessibility can be improved further in that a previously applied adhesion-promoting layer leads to oriented immobilization, for example by immobilizing antibodies contained in the applied sample to their Fc part, so that their specific binding epitopes are accessible.
  • the sample amount should be understood to mean the total amount that is applied in a discrete measuring range. For example, it is possible for a sample to comprise the material of fewer than 20,000 cells and still be able to be analyzed with high accuracy. A sample to be applied can even comprise the material of less than 1000 cells. The required amount of sample can even include the material of less than 100 cells, or even only 1-10 cells, and can still be reliably analyzed. The material. which corresponds to the content of a cell should also be referred to as a line equivalent.
  • a sample has a volume of less than 1 ⁇ l.
  • a sample to be applied can even have a volume of less than 10 nl or even less than 1 nl.
  • the method according to the invention enables the relative total amounts of one or more compounds contained in a “nature-identical” sample to be determined as analytes, as the sum of their occurrence in phosphorylated or non-phosphorylated form and / or glycated and / or non-glycated form
  • the relative amounts contained in a "nature-identical" sample of one or more compounds as analytes in each case of their occurrence in phosphorylated and / or non-phosphorylated form and / or glycated and / or non-glycated form, for one or more of said forms certainly.
  • the method according to the invention makes it possible, according to the above definition, to determine the degree of activation of one or more analytes contained in a "nature-identical” sample.
  • the said method can be used to determine the degree of phosphorylation and / or degree of glycolysis of one or more analytes contained in a "nature-identical” sample.
  • the method according to the invention is also characteristic due to its high sensitivity and high accuracy and reproducibility, in particular due to a large number of simultaneously or alternatively usable , independent referencing and calibration methods, that differences of less than 20% with respect to less than 10%, of the relative amounts of one or more compounds in phosphorylated and / or contained in a "nature-identical" sample and in one or more comparative samples non-phosphorylated form and / or glycated and / or non-glycated form as analytes, for one or more of said forms.
  • a major advantage of the method according to the invention due to its inherent, method-specific high sensitivity and various possibilities for referencing and / or calibration using one and the same analytical platform (or evanescent field sensor platform) is that the variation of the measurement results obtained is very low.
  • the method according to the invention is therefore also suitable for examining the temporal course (i.e. the changes) of the relative amounts or concentrations of biologically relevant substances under the influence of the disease of a biological organism or a cell culture and / or the external influence of an organism or a cell culture.
  • a further embodiment of the method according to the invention is therefore characterized in that said “nature-identical” sample and one or more reference samples are taken from the same place of origin at different times and that changes in the relative amounts of one or more compounds in phosphorylated and / or or non-phosphorylated form and / or glycolized and / or not Glycolized form as analytes.
  • “The same place of origin” should be understood to mean the same organism or a similar organism or the same cell culture or cell culture (in each case after a different length of the same disease or influence).
  • the method according to the invention preferably enables changes in the relative concentration or amount over time said analytes of less than 20%, preferably less than 10%.
  • Said samples can be dissolved and / or diluted with a suitably high initial concentration of the analytes contained therein before application to said evanescent field sensor platform as a solid carrier in a liquid dilution medium, and different dilutions of a sample can be applied in different discrete measurement ranges on said evanescent field sensor platform.
  • the samples can be diluted by at least a factor of 10, even by a factor of 30 or 100.
  • Different samples can be taken from the same organism or cell culture. Statistical information about the reproducibility of the relative molecular composition of the applied samples determined in these measurement areas can then be obtained by analysis on several measurement areas with material contained therein from the same organism or from similar cell cultures (or from the same cell culture).
  • Different samples can also be taken from different organisms or different cell cultures. For example, it can be Trade samples of organisms treated and untreated with an active pharmaceutical ingredient. Similar to an expression analysis in nucleic acid analysis, the influence of the respective active substance on the relative molecular composition of the samples can then be examined.
  • a special embodiment of the method according to the invention is characterized in that one or more samples, before being applied to the evanescent field sensor platform, are used as a solid support (to improve the adhesion on said solid support and increase the uniformity of the application) with a solution of polymers or polymerizable monomers , if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (eg glutaraldehyde).
  • This variant of the method can, for example, help to create inhomogeneities in the distribution of the sample material within a measuring range in the process of evaporation of the Avoid sample liquid, which leads to a better "spot morphology" and thus facilitates the evaluation of the results.
  • said solution of polymers or polymerizable monomers or chemical "crosslinkers” is selected from the group consisting of solutions of polysaccharides, such as agarose, or of acrylamides or of glutaralehyde, etc.
  • This particular variant of the method according to the invention is also characterized in that the mixture of the one or more samples with a solution of polymers or polymerizable monomers, if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (eg glutaraldehyde) in The immobilization of a three-dimensional network structure with integrated sample components accessible to detection substances in the subsequent step of a bioaffinity reaction results on the evanescent field sensor platform as a solid support.
  • This enables a higher degree of surface coverage of the evanescent field sensor platform to be achieved as a monolayer, which leads to a It is important that the polymer network structure created does not extend beyond the depth of penetration of the evanescent field into the medium, since an analyte detection depends on the analyte detection step is not possible beyond this distance from the surface of the evanescent field sensor platform and it would therefore no longer be guaranteed that the The result of the analysis would reflect the original relative molecular composition of the sample.
  • the samples can be spatially selectively applied in discrete measurement areas on the evanescent field sensor platform or on an adhesive layer applied thereon using a method which is selected from the group of methods by "inkjet spotting", mechanical spotting using a pen, pen or capillary , “Micro contact printing”, fluidic contacting of the measurement areas with said sample, the supply of which is formed in parallel or crossed microchannels, under the influence of pressure differences or electrical or electromagnetic potentials, and photochemical or photolithographic immobilization processes.
  • these non-binding components can be selected from the groups consisting of albumins, in particular bovine serum albumin or human serum albumin, casein, non-specific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies for the analyte (s) to be detected (especially for immunoassays), detergents - such as Tween 20 - that do not hybridize with polynucleotides to be analyzed, fragmented natural or synthetic DNA, such as an extract of herring or salmon sperm ( in particular for polynucleotide hybridization assays), or also uncharged but hydrophilic polymers, such as, for example, polyethylene glycols or dextrans.
  • albumins in particular bovine serum albumin or human serum albumin
  • casein non-specific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies for the analyte (s) to be detected (especially for immunoassays)
  • detergents - such as Tween 20 - that do not
  • the analytes to be detected contained in the samples applied in discrete measurement areas can, for example, be compounds from the group consisting of proteins, for example mono- or polyclonal antibodies and antibody fragments, peptides, enzymes, glycopeptides, oligosaccharides, lectins, antigens for antibodies, with additional binding sites functionalized proteins ("tag proteins", such as "histidine tag proteins") and nucleic acids (e.g. DNA, RNA) is formed.
  • the analytes to be detected contained in the samples applied in discrete measurement areas can also be compounds from the group which contain cytosolic or membrane-bound cell proteins, in particular proteins involved in the processes of signal transduction in cells, such as, for. B. kinases.
  • the analytes can also be biotechnically modified, for example with luminescent or fluorescent groups and biologically expressed biopolymers, for example with “blue fluorescent proteins” (BFP), “green fluorescent proteins” (GFP) or “red fluorescent proteins” (RFP).
  • BFP blue fluorescent proteins
  • GFP green fluorescent proteins
  • RFP red fluorescent proteins
  • a possible variant is characterized in that the spatially resolved changes in optoelectronic signals, as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measuring ranges in the samples, are caused by local changes in the resonance conditions to produce a surface plasmon in a thin metal layer as part of said evanescent field. Sensor platform are caused.
  • the resonance angle (when the angle of incidence varies with a constant wavelength of the incident light) and the resonance wavelength (with constant angle of incidence and variation in the incident excitation wavelength) are accessible for determining changes in the resonance conditions.
  • said change in the resonance conditions in a change in the resonance angle for the irradiation of an excitation light to generate a surface plasmon in a thin metal layer can be part of said Evanescent field sensor platform exist.
  • said change in the resonance conditions can also consist in a change in the resonance wavelength of an irradiated excitation light for generating a surface plasmon in a thin metal layer as part of said evanescent field sensor platform.
  • the spatially resolved changes in optoelectronic signals as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measurement areas in the samples, can be caused by local changes in the effective refractive index in these areas on said evanescent field sensor platform.
  • Another important embodiment of the method according to the invention is characterized in that the spatially resolved changes in optoelectronic signals, as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measurement areas in the samples, by local changes in one or more luminescences from said evanescent field within the evanescent field -Luminescent molecules located sensor platform are caused.
  • said changes in one or more luminescences originate from luminescent molecules or luminescent nanoparticles which are bound as luminescent labels to one or more detection substances for the analytes contained in discrete measurement areas.
  • two or more luminescence labels with different emission wavelengths and / or different excitation spectra are used for analyte detection. If several luminescence labels with different spectral properties, in particular different emission wavelengths, are bound to different detection substances from the second plurality of specific binding partners, which are brought into contact with the measurement areas, for example different analytes can be bound in a single detection step, ie Contacting of the measuring areas with said detection substances and simultaneous or subsequent detection of the luminescence generated can be determined.
  • such a variant of the method according to the invention is particularly well suited for simultaneously detecting, for example, the phoshorylated and the non-phosphorylated form of a compound, in particular also within a single (common) measuring range, with the aid of two corresponding different, in this case directly (e.g. specific binding partners marked with green or red emitting luminescence labels) as detection substances.
  • two or more different analytes can be detected simultaneously if two or more luminescence labels with different emission decay times are used for analyte detection.
  • two or more luminescence labels are used to detect different analytes in a sample. It is also preferred that two or more luminescence labels are used to detect different analytes in one measuring range.
  • the excitation light is irradiated in pulses with a duration between 1 fsec and 10 minutes and the emission light from the measuring ranges is measured in a temporally resolved manner.
  • the solid-state evanescent field sensor platform preferably comprises an optical waveguide, comprising one or more layers.
  • it can be a fiber-optic waveguide consisting of several layers.
  • it is preferably a planar optical waveguide which is formed continuously over a surface of the evanescent field sensor platform or can also be divided into discrete waveguiding areas, as is described, for example, in patent application WO 96/35940, the contents of which are hereby fully described in the present application is introduced.
  • the evanescent field sensor platform as a solid support comprises a planar optical thin-film waveguide with an essentially optically transparent, waveguiding layer (a) on a second, likewise essentially optically transparent layer ( b) with a lower refractive index than layer (a) and optionally also an essentially optically transparent intermediate layer (b ') between layer (a) and layer (b) with a likewise lower refractive index than layer (a).
  • the excitation light from one or more light sources can be coupled into a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform via one or more optical coupling elements, which are selected from the group consisting of prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers one end face of the waveguiding layer arranged focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers is formed.
  • optical coupling elements which are selected from the group consisting of prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers one end face of the waveguiding layer arranged focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers is formed.
  • the excitation light is coupled into a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform with the aid of one or more grating structures (c) which are pronounced in the said wave-guiding layer.
  • the coupling out of light guided in a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform takes place with the aid of one or more grating structures (c ') which are pronounced in said waveguiding layer and have the same or different period and grating depth as grating structures (c) ,
  • a particularly preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that excitation light from one or more light sources is coupled via a grating structure (c) into a wave-guiding layer of said evanescent field sensor platform and is guided as a guided wave to measurement areas located on the evanescent field sensor platform, that the luminescence of. in the evanescent field of said guided wave Luminescent molecules are detected with one or more detectors in a spatially resolved manner and the relative concentration of one or more analytes is determined from the relative intensity of these luminescence signals.
  • excitation light from one or more light sources is coupled via a grating structure (c) into a wave-guiding layer of said evanescent field sensor platform and is guided as a guided wave to measurement areas located on the evanescent field sensor platform, that the luminescence of. in the evanescent field of said guided wave Luminescent molecules are detected with one or more detectors in a spatially resolved manner and the relative concentration of one or more analytes is determined from the relative intensity of
  • a special variant consists in that, in addition to the determination of one or more luminescences, changes in the effective refractive index on the measurement areas are determined.
  • the one or more luminescences and / or determinations of light signals are carried out polarization-selectively at the excitation wavelength. It is preferred that the one or more luminescences are measured with a different polarization than that of the excitation light.
  • Another object of the present invention is an analytical platform for examining a large number of “nature-identical” samples for compounds contained in the samples that are biologically relevant as participants in bioaffinity reactions, as analytes
  • the "nature-identical samples” are preferably in denatured form, the epitopes of the analytes contained being freely accessible for the binding of their respective detection substances, for example antibodies. This is made possible by the destruction of the tertiary or quaternary structure due to treatment with urea.
  • the evanescent field sensor platform in order to improve the adhesiveness of the "nature-identical" samples applied in discrete measurement areas or of their dilutions, comprises an adhesion-promoting layer on which said samples or their dilutions are applied.
  • the thickness of the adhesion-promoting layer is preferably less than 200 nm, particularly preferably less than 20 nm.
  • the adhesion-promoting layer can comprise compounds from the group of silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized passive or functionalized mono- or multilayers", thiols, alkyl phosphates and phosphonates, multifunctional block copolymers, such as, for example, poly ( L) lysine / polyethylene glycols.
  • adhesion promoter layer comprises compounds from the group of organophosphoric acids of the general formula I (A)
  • B is an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, hetaryl or hetarylalkyl radical and Y is hydrogen or a functional group from the series hydroxyl, carboxy, amino, optionally mono- or substituted by lower alkyl Dialkylamino, thiol, or a negative acid group from the series ester, phosphate, phosphonate, sulfate, sulfonate, maleimide, succinimydyl, epoxy or acrylate.
  • the relative molecular composition of a first plurality of specific binding partners immobilized in a measuring area coincides as analytes with the original relative molecular composition of the sample applied there.
  • An applied "nature-identical” sample can be selected from the extracts of healthy or pathological cells (eg from human, animal, bacterial or plant cell extracts), extracts from animal or human tissue, such as organ, skin, Hair or bone tissue, or from plant tissue, as well as from body fluids or their components, such as blood, serum or plasma, joint fluids, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid, lymph.
  • healthy or pathological cells eg from human, animal, bacterial or plant cell extracts
  • extracts from animal or human tissue such as organ, skin, Hair or bone tissue, or from plant tissue, as well as from body fluids or their components, such as blood, serum or plasma, joint fluids, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid, lymph.
  • a “nature-identical” sample can also be selected from the group comprising extracts of stimulated or untreated cells and extracts of healthy or pathological tissue.
  • Said samples can be taken from an organism or tissue or cell assembly or cell by means of a method from the group of tissue sections, biopsy or “laser capture micro dissection”.
  • An applied sample can comprise the material of less than 20,000 cells, even less than 1,000 cells.
  • the sample can have a volume of less than 1 ⁇ l, even less than 10 nl.
  • the required amount of sample can even include the material of less than 100 cells and can still be reliably analyzed. This is the case if the analytes to be detected are ingredients that occur in relatively high concentrations.
  • One or more of said "nature-identical” samples can be taken from biological organisms or tissue or cell assemblies or cells and applied directly (i.e. after lysis of the cells) to said solid support without further dilution
  • one or more of said samples can be dissolved and / or diluted as a solid carrier in a liquid dilution medium prior to application on the evanescent field sensor platform, and for different dilutions of a sample to be applied to said evanescent field sensor platform in different discrete measurement ranges.
  • the samples can be diluted by at least a factor of 10.
  • the high sensitivity of the analytical platform according to the invention even makes it possible to dilute the samples by a factor of 30 or even 100 and, despite this strong dilution, to quantify a large number of different analytes within a measurement range.
  • Different applied samples can be taken from the same organism or the same cell culture.
  • the samples can be taken from different positions of the same organism.
  • Different applied samples can also be taken from different organisms or different cell cultures.
  • a particular embodiment of the analytical platform according to the invention is characterized in that one or more samples, before being applied to the evanescent field sensor platform, are used as a solid support (to improve the adhesion on said solid support and increase the uniformity of the application) with a solution of polymers or polymerisable Monomers, if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (e.g. glutaraldehyde).
  • a solution of polymers or polymerisable Monomers if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (e.g. glutaraldehyde).
  • This variant of the method can, for example, help to avoid the formation of inhomogeneities in the distribution of the sample material within a measuring range during the process of evaporation of the sample liquid, which leads to a better “spot morphology” and thus facilitates the evaluation of the results that said solution of polymers or polymerizable monomers or chemical "cross-linkers" is selected from the group consisting of solutions of polysaccharides, such as. Agarose, or acrylamides or glutaradehyde, etc.
  • Such a special embodiment of an analytical platform according to the invention is also characterized in that the mixture of the one or more samples with a solution of polymers or polymerizable monomers, if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (eg glutaraldehyde ) in the immobilization of a three-dimensional network structure with integrated, accessible for detection substances in the subsequent step of a bioaffinity reaction.
  • a solution of polymers or polymerizable monomers if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (eg glutaraldehyde ) in the immobilization of a three-dimensional network structure with integrated, accessible for detection substances in the subsequent step of a bioaffinity reaction.
  • an array comprises more than 50, preferably more than 500, particularly preferably more than 5000 measuring ranges.
  • Each measuring area can contain an immobilized "nature-identical” sample or immobilized comparative sample that is identical or different to other measuring areas.
  • the measurement areas of an array are arranged in a density of more than 10, preferably more than 100, particularly preferably more than 1000 measurement areas per square centimeter.
  • Such an embodiment of an analytical platform according to the invention is also advantageous, which is characterized in that a multiplicity of arrays of measurement areas are arranged on the evanescence field sensor platform as a solid support.
  • a multiplicity of arrays of measurement areas are arranged on the evanescence field sensor platform as a solid support.
  • at least 5, preferably at least 50, arrays of measurement areas can be arranged on the evanescence field sensor platform. It is particularly advantageous if different arrays of measuring areas of such a variant of an analytical platform according to the invention are arranged in different sample containers.
  • an experimental conception is made possible, which can be described as "multidimensional": for example, different samples, for example of different organisms (e.g. corresponding columns), can be used in different ways in the rows and columns of an array Different arrays of measurement areas in different sample containers can then be brought into contact with different second varieties of specific binding partners as detection substances for determining different immobilized analytes in different arrays With such a variant of an analytical platform according to the invention, an almost unlimited number of different experiments can be carried out.
  • these non-binding components can be selected from the groups consisting of albumins, in particular bovine serum albumin or human serum albumin, casein, non-specific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies for the analyte (s) to be detected (especially for immunoassays), detergents - such as Tween 20 - that do not hybridize with analyzed polynucleotides, fragmented natural or synthetic DNA, such as an extract of herring or salmon sperm ( in particular for polynucleotide hybridization assays), or also uncharged but hydrophilic polymers, such as, for example, polyethylene glycols or dextrans.
  • albumins in particular bovine serum albumin or human serum albumin
  • casein non-specific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies for the analyte (s) to be detected (especially for immunoassays)
  • detergents - such as Tween 20 - that do not hybridize
  • the analytes to be detected contained in the discrete measurement areas of an analytical platform according to the invention can be compounds from the group consisting of proteins, for example mono- or polyclonal antibodies and antibody fragments, peptides, enzymes, glycopeptides, oligosaccharides , Lectins, antigens for antibodies, with additional binding sites functionalized proteins ("tag proteins", such as "histidine tag proteins") and nucleic acids (e.g. DNA, RNA) is formed.
  • proteins for example mono- or polyclonal antibodies and antibody fragments, peptides, enzymes, glycopeptides, oligosaccharides , Lectins, antigens for antibodies, with additional binding sites functionalized proteins ("tag proteins", such as "histidine tag proteins") and nucleic acids (e.g. DNA, RNA) is formed.
  • the analytes to be detected contained in the samples applied in discrete measurement areas can be compounds from the group which contain cytosolic or membrane-bound cell proteins, in particular proteins involved in the processes of signal transduction in cells, such as, for. B. kinases.
  • the analytes can also be biotechnically modified, for example with luminescent or fluorescent groups and biologically expressed biopolymers, such as with "blue fluorescent proteins” (BFP), "green fluorescent proteins” (GFP) or “red fluorescent proteins” (RFP).
  • a special variant of an analytical platform according to the invention is characterized in that the evanescent field sensor platform, as part of the analytical platform, comprises a thin metal layer, optionally on an intermediate layer underneath with a refractive index, preferably ⁇ 1.5, such as silicon dioxide or magnesium fluoride, the thickness the metal layer and the possible intermediate layer is selected such that a surface plasmon can be excited at the wavelength of an irradiated excitation light and / or at the wavelength of a luminescence generated.
  • a refractive index preferably ⁇ 1.5, such as silicon dioxide or magnesium fluoride
  • the metal is selected from the group comprising gold and silver.
  • the metal layer has a thickness between 10 nm and 1000 nm, preferably between 30 nm and 200 nm.
  • the evanescent field sensor platform preferably comprises, as a solid support, an optical waveguide comprising one or more layers.
  • an optical waveguide comprising one or more layers.
  • it can be a fiber-optic waveguide consisting of several layers.
  • it is preferably a planar optical waveguide which is formed continuously over a surface of the evanescent field sensor platform or can also be divided into discrete waveguiding regions, as is described, for example, in patent application WO 96/35940.
  • the evanescent field sensor platform as a solid support has a planar optical thin-film waveguide with an essentially optically transparent, waveguiding layer (a) on a second, also essentially optically transparent layer ( b) with a lower refractive index than layer (a) and optionally also an essentially optically transparent intermediate layer (b ') between layer (a) and layer (b) with a likewise lower refractive index than layer (a).
  • An analytical platform is preferably designed in such a way that a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform is in optical contact with one or more optical coupling elements, which enable the coupling of excitation light from one or more light sources into said wave-guiding layer, wherein said optical coupling elements are selected are from the group of prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers with focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers arranged in front of one end face of said waveguiding layer of the evanescent field sensor platform.
  • one or more grating structures (c) are formed, which enable the coupling of excitation light from one or more light sources.
  • one or more grating structures (c ') with the same or different grating period and grating depth as grating structures (c) are formed, which enable the coupling out of light guided in said waveguiding layer.
  • Another object of the present invention is the use of a method according to the invention or an analytical platform according to the invention for quantitative and / or qualitative analyzes for the determination of chemical, biochemical or biological analytes in screening methods in pharmaceutical research, combinatorial chemistry, clinical and preclinical development, for real-time binding studies and for the determination of kinetic parameters in affinity screening and in research, on qualitative and quantitative Analyte determinations, in particular for DNA and RNA analysis and the determination of genomic or proteomic differences in the genome, such as, for example, single nucleotide polymorphisms, for measuring protein-DNA interactions, for determining control mechanisms for m-RNA expression and for protein (bio) synthesis, for the preparation of toxicity studies and for the determination of expression profiles, in particular for the determination of biological and chemical marker substances such as mRNA, proteins, peptides or low-molecular organic (messenger) substances, as well as for the detection of antibodies, antigens , Pathogens or bacteria in pharmaceutical product research and development, human and veterinary diagnostics, agro
  • An evanescent field sensor platform serves as an analytical platform as a solid support with the dimensions 14 mm width x 57 mm length x 0.7 mm thickness.
  • the evanescent field sensor platform is designed as a thin-film waveguide, comprising a glass substrate (AF 45) and a 150 nm thin, highly refractive layer of tantalum pentoxide applied thereon.
  • a glass substrate AF 45
  • two surface relief gratings (Gitte ⁇ eriode: 318 nm, grating depth: (12 +/- 2) nm) are modulated at a distance of 9 mm.
  • these structures which are intended to serve as diffractive gratings for coupling light into the high refractive index layer, were transferred into the surface of the tantalum pentoxide layer.
  • DDP mono-dodecyl phosphate
  • Human T-cell cultures (Jurkat, DMZ # ACC282) are used for the detection of biologically relevant protein analytes in "nature-identical" samples. These cells are in a solution containing RPMI 1640, 10% FCS (fetal bovine serum), 2mM glutamine , 50 U / ml penicillin, 50 / g / ml streptamycin cultivated at 37 ° C. (cell density approx. 0.5-1.0 x 10 6 cells / ml).
  • the cell cultures treated or untreated in this way are then cooled to 4 ° C. and pelleted for 2 minutes at a centrifuging force of 350 ⁇ g (cell number approx. 10 7 ).
  • the cells are only separated from the medium without damage.
  • the supernatant is then decanted and lysis buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT, 4 mM Sper idin and Complete (protease inhibitor, Röche AG, 1 tablet / 50 ml)) is added, the total protein concentration being about 10 mg / ml is set. All protein-containing cell components are spontaneously and completely denatured and solubilized.
  • Treatment with the antibodies mentioned serves as a model system for the stimulatory activation of human T cells (M. Diehn et al., "Genomic expression programs and the Integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation", Proceedings of the National Academy of Sciences 99 (2002) 11796 - 11801.
  • the binding of said antibodies to cell membrane-bound receptors triggers a phosphoryl long cascade with connected, different signaling pathways within the affected cells.
  • the activity of a specific signaling pathway can be determined by determining the degree of phosphorylation of a corresponding one Key protein (as a so-called "Brand ⁇ rotein”) or its substrate demonstrate what is to be carried out using an analytical platform according to the invention.
  • a Western blot analysis is carried out as a reference method for the method according to the invention.
  • samples obtained using the preparatory steps described above are again diluted by a factor of 10 to a total protein concentration of about 1 mg / ml and then as "nature-identical" samples in discrete measurement areas to produce an array of measurement areas on the evanescent field provided with the adhesion-promoting layer. Senso ⁇ lattform applied.
  • each microarray contains further measurement areas with Cy5 fluorescence-labeled bovine seramalbumin (Cy5-BSA) immobilized therein, which are used to reference local differences and / or temporal variations in the excitation light intensity during the measurement ( “reference spots”).
  • Cy5-BSA is applied in a concentration of 1.0 nM in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) (labeling rate: 3 Cy5 molecules per BSA molecule).
  • the analytical platform After applying the "nature-identical" samples and Cy5-BSA, the analytical platform is stored for two hours at room temperature and 100% relative humidity and then dried in room air. Then the free, non-protein-covered, hydrophobic surface areas of the evanescent field sensor platform Saturated with bovine seramalbumin (BS A) by incubating the surface with a solution of BSA (30 mg / ml) in 50mM imidazole / 100mM NaCl (pH 7.4), then watering the evanescent field sensor platform with the measuring areas created on it washed and then dried in a stream of nitrogen and stored at 4 ° C. until the detection method according to the invention has been carried out.
  • BSA bovine seramalbumin
  • FIG. 1 The geometry of a typical arrangement of the measurement areas in a two-dimensional array and a linear arrangement of six (identical) arrays on an evanescent field sensor platform is shown in FIG. 1 (for the examples, which are discussed in more detail with reference to FIG. 3A / B or FIG. 4A B).
  • the diameter of the spots, with a distance (center-to-center) of 600 ⁇ m, is approximately 90 ⁇ m.
  • an array of measurement areas each comprises an arrangement of measurement areas with 8 different samples applied in 5 replicates, the 5 identical measurement areas each being arranged in a common column perpendicular to the direction of propagation of the light guided in the waveguiding layer of the analytical platform during the detection step are.
  • the reproducibility of the measurement signals within the array of measurement areas is to be determined using the 5 identical measurement areas in each case.
  • Columns of measuring areas with Cy5-BSA applied therein (for reference purposes) are arranged between and next to the columns of measuring areas with samples to be anylated.
  • the analytical platform according to the invention comprises 6 such arrays of measurement areas of the same type, as shown in FIG. 1.
  • Antibodies AI and A2 recognize and bind a number of different proteins phosphorylated on serine or serine / threonine, which serve as substrates for protein kinases. This can be seen from the large number of bands in the western blot (FIG. 2A and section 2.4, "Results").
  • Antibodies A3 and A4 recognize and bind the same type of compound, namely the p44 / 42 MAP kinase (also known as Erk2), although antibody A3 only recognizes its phosphorylated "active" form (pErk2), whereas antibody A4 recognizes both forms (the recognizes and binds non-phosphorylated form Erk2 and the phosphorylated form pErk2).
  • a second assay step is carried out using a Cy5-labeled anti-rabbit antibody (Amersham Biosciences, D Wegner, CH) binds all of the above-mentioned antibodies AI - A4
  • This Cy5-labeled antibody is applied to the arrays in a concentration of typically 10 nM in assay buffer (30 ⁇ l each) and is then incubated for 2 hours at room temperature in the dark the arrays are washed with assay buffer (five times with 100 ⁇ l) to remove non-specifically bound Cy5-anti-rabbit antibodies, and the analytical platforms prepared in this way are stored in the ZeptoREADER TM until the detection step by means of excitation and detection of resulting fluorescence signals (see below) ,
  • the fluorescence signals from the various arrays of measurement areas are measured automatically and sequentially with a ZeptoREADER TM (Zeptosens AG, CH-4108 Witterswil, Switzerland).
  • the analytical platform according to the invention is adjusted to meet the resonance conditions for the light coupling into the wave-guiding tantalum pentoxide. Layer and to maximize the excitation light available in the measuring ranges.
  • Each array then generates a user-selectable number of images of the fluorescence signals from the array in question, with different exposure times being selectable.
  • the excitation wavelength in the measurements for the present example is 633 nm
  • the fluorescence light is detected with a cooled camera at the fluorescence wavelength of Cy5, using an interference filter (transmission 670 ⁇ 20 nm) to suppress stray light at the excitation wavelength that occurs before Lens of the camera is positioned.
  • the fluorescence images generated are automatically stored on the memory plate of the control computer. Further details of the optical system (ZeptoREADER TM) are described in the international patent application PCT / EP 01/10012, which is hereby fully introduced as part of this application.
  • the mean signal intensity from the measuring areas is determined using an image analysis software (ZeptoVIEW, Zeptosens AG, CH-4108 Witterswil), which enables the fluorescence images of a large number of arrays of measuring areas to be evaluated semi-automatically.
  • the raw data of the individual pixels of the camera represent a two-dimensional matrix of digitized measurement values, with the measured intensity as a measurement value of an individual pixel corresponding to the area on the sensor platform depicted on it.
  • a two-dimensional (coordinate) network is first placed manually over the image points (pixel values) such that the partial image of each spot falls into an individual two-dimensional network element.
  • a circular "evaluation area" (AOI) with a radius (typically 90 ⁇ m) to be specified by the user is assigned to each spot.
  • the location of the individual AOIs is individually determined as a function of the signal intensity of the individual by the image analysis software Pixel is determined, whereby the radius of the AOIs specified by the user is retained at the beginning - as the mean gross signal intensity of each Spots, the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) is determined within a selected evaluation range.
  • the background signals are determined from the measured signal intensities between the spots.
  • four further circular areas are defined as evaluation areas for background signal determination, which are preferably arranged in the middle between adjacent spots.
  • the mean background signal intensity is determined, for example, as the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) within an AOI selected for this.
  • the mean net signal intensity from the measurement areas (spots) is then calculated as the difference between the local mean gross and the local mean background signal intensity of the respective spot.
  • the net signal intensity of all spots is referenced using reference spots (Cy5-BS A) of each array of measurement areas.
  • the net signal intensity of each spot is divided by the mean value of the net signal intensities of the neighboring reference spots of the same row (arranged parallel to the direction of propagation of the light guided in the evanescent field sensor platform). This referencing compensates for the local differences in the available excitation light intensity orthogonal to the direction of light propagation both within each microarray and between different microarrays.
  • FIG. 2A The results of the Western blot analysis as a comparison method with the method according to the invention are shown in FIG. 2A.
  • the lower part of the figure shows the results with the cell cultures which were treated with the antibodies against the surface receptors CD23 ("CD3") and CD28 ("CD28"), the upper part the results with the untreated cultures as a comparison sample, after incubation with the solutions of the mentioned antibodies AI - A4.
  • the Western blot analysis confirms that the antibodies AI and A2 recognize and bind to a number of different proteins, phosphorylated on serine and serine / threonine, which serve as protein kinases as substrates. This can be seen from the large number of bands in the western blot.
  • Antibodies A3 and A4 recognize and bind the same type of connection, namely p44 / 42 MAP kinase (also known as Erk2), although antibody A3 only recognizes its phosphorylated "active" form (pErk2), whereas antibody A4 recognizes both forms ( recognizes and binds to the non-phosphorylated form Erk2 and the phosphorylated form pErk2).
  • FIG. 2B shows the results which were achieved with the method according to the invention with the analytical platform according to the invention.
  • the bar graph shows the results of the cell culture (filled bars) treated with the antibodies against the surface receptors CD23 (" ⁇ CD3") and CD28 (" ⁇ CD28") and the untreated culture ("negative control", empty bars), which results "nature-identical” samples obtained therefrom after application in 6 identical arrays of measurement areas on an above-described evanescent field sensor platform have been brought together with the solutions of the various antibodies AI-A4.
  • 4 different arrays of the same type which were arranged in different sample containers on a common evanescent field sensor platform, each with different solutions, each containing one of the 4 mentioned antibodies AI - A4, and then, as in 2.1. described, Cy5-labeled anti-rabbit antibodies supplied.
  • Figure 2B are the mean values of the signal intensities of five identical measuring ranges within an array and their standard deviations referenced by the method described above are shown.
  • the determined signal intensities correlate with the concentration of a particular analyte that occurs (high signal intensity corresponding to high concentration). It can be clearly seen that by treating the Jurkat cell cultures with the antibodies against the surface receptors CD23 (“ ⁇ CD3”) and CD28 (“ ⁇ CD28”) (“stimulation”), the relative intracellular concentration of phospho- (Ser) PKC and Phospho- (Ser / Thr) Akt substrates was increased by a factor of 2.5 or 1.8 compared to the negative control, and the concentration of pErk2 increased even more, namely by a factor of 10, the sum of the content of Erk2 and pErk2 / detected with the aid of antibody A4) remained constant within the measurement accuracy, which means that within the stimulation period of 10 minutes the total content of Erk2 was not increased by an increase in expression, but only the content of pErk2 was increased by phosphorylation.
  • an untreated cell lysate (negative Control), which according to the test carried out previously (the results of which are shown in FIG. 2B) demonstrably contained only a very low content of pErk2 (third pair of bars in FIG.
  • FIG. 3A shows a typical signal distribution from an array of measurement areas, the marked rectangles each representing 5 replicate spots of a pErk2 concentration added to the untreated cell lysate (1-8: increasing concentration, according to the geometric arrangement shown in FIG. 1).
  • 3B shows the concentration curve of the signals for the lower concentrations, the increase in the representation for the whole
  • the sensitivity of the assay is based on the sum of the signal of the O value ("blank", without added p-Erk2) and its double standard deviation, a value of 2.0 ng / ml determines what a weight fraction of 2x10 " g per g totalp corresponds to red.
  • FIGS. 4A and 4B show the results of a third experiment essentially analogous to the second.
  • the assay according to 2.1 is carried out in this third experiment using antibody A4 (ie adding to arrays of the same type as in the second experiment).
  • the total of phosphorylated and non-phosphorylated compound (pErk2 and Erk2) is determined according to the different addition of pErk2.
  • FIG. 4A shows a typical signal distribution from an array of measurement areas, the marked rectangles each representing 5 replicate spots of a pErk2 concentration added to the untreated cell lysate (1-8: increasing concentration, according to the geometric arrangement shown in FIG. 1).
  • the sensitivity of the assay determines a value of 120 ng / ml, which corresponds to a weight fraction of 1.2 ⁇ 10 4 g per g total protein.
  • the latter cell culture serves as a negative control since there should be no pErk2 due to the inhibition of all protein kinases (see also section 1.2), so a signal measured for this should correspond to the signal of a sample free of pErk2.
  • the cell lysates treated in this way are then spotted on the evanescent field sensor platform and an assay according to 2.1 is carried out using the A3 antibody to detect changes in the concentrations of pErk2.
  • FIG. 5A The result of this measurement is shown in FIG. 5A.
  • Each of the bars shown in the graph represents the referenced mean of the net signal intensity of 5 replicate analyte spots with the associated standard deviation.

Abstract

The invention relates to an analytical platform and a method carried out therewith for examining a plurality of naturally identical samples for biologically relevant compounds taking part in specific binding reactions in the form of analytes, characterized in that said samples or dilutions of said samples, with the analyte to be detected contained therein, are applied without modification of the relative molecular composition in comparison to the original relative molecular composition of the sample, as a first plurality of specific binding partners in at least one one-dimensional or two-dimensional array in discrete measuring areas on an evanescence field sensor platform as a fixed carrier; one or several detection substances are brought into contact in one or more steps of a specific binding reaction with the samples applied in said discrete measuring areas in the form of a second plurality of specific binding partners for specific detection of one or several analytes contained in the sample from said first plurality of specific binding partners; modifications of optoelectronic signals resulting from the binding of detection substances to analytes contained in the samples in the discrete measuring areas are measured with local resolution in the evanescence field of the evanescence field sensor platform and the presence of the analytes which are to be specifically detected is determined quantitatively or qualitatively on the basis of the relative quantity of the modifications of said optoelectronic signals from the respective measuring areas.

Description

Analytische Plattform und Nachweisverfahren mit den in einer Probe nachzuweisenden Änalyten als immobilisierten spezifischen BindungspartnernAnalytical platform and detection method with the analytes to be detected in a sample as immobilized specific binding partners
Die vorliegende Erfindung betrifft eine analytische Plattform und ein damit ausgeführtes Nerfahren zur Untersuchung einer Nielzahl „natur-identischer" Proben auf in den Proben enthaltene, als Teilnehmer an spezifischen Bindungsreaktionen biologisch relevante Verbindungen als Änalyten, dadurch gekennzeichnet, dassThe present invention relates to an analytical platform and a ner driving carried out with it to examine a Niel number of "nature-identical" samples for compounds contained in the samples that are biologically relevant as participants in specific binding reactions as analytes, characterized in that
- besagte Proben oder Verdünnungen besagter Proben ohne Änderung der relativen molekularen Zusammensetzung, im Vergleich zur ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der Probe, mit den darin enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten, als einer ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern, in mindestens einem ein- oder zweidimensisonalen Array in diskreten Messbereichen auf einer Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger aufgetragen werden,- Said samples or dilutions of said samples without changing the relative molecular composition, in comparison to the original relative molecular composition of the sample, with the analytes contained therein, as a first plurality of specific binding partners, to be detected, in at least one or two-dimensional array in discrete Measuring ranges are applied to a evanescent field sensor platform as a solid support,
- eine oder mehrere Νachweissubstanzen, als eine zweite Vielzahl spezifischer Bindungspartner, zum spezifischen Nachweis von einem oder mehreren in den Proben enthaltenen Änalyten, aus besagter ersten Vielzahl spezifischer Bindungspartner, in einem einzigen oder mehreren Schritten einer spezifischen Bindungsreaktion mit den in besagten diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben in Kontakt gebracht werden,- one or more detection substances, as a second plurality of specific binding partners, for the specific detection of one or more analytes contained in the samples, from said first plurality of specific binding partners, in a single or more steps of a specific binding reaction with the samples applied in said discrete measuring ranges be brought into contact
- Änderungen von optoelektronischen Signalen als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, im evaneszenten Feld der Evaneszentfeld-Sensorplattform, ortsaufgelöst gemessen werden und aus der relativen Grosse der Änderungen besagter optoelektronischer Signale aus den jeweiligen Messbereichen qualitativ und / oder quantitativ das Vorhandensein der dort spezifisch nachzuweisenden Änalyten bestimmt wird.- Changes in optoelectronic signals as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measurement areas in the samples, in the evanescent field of the evanescent field sensor platform, are measured in a location-resolved manner and from the relative magnitude of the changes in said optoelectronic signals from the respective measurement areas, qualitatively and / or quantitatively determining the presence of the analytes specifically to be detected there.
Dabei können besagte Änderungen von optoelektronischen Signalen, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, im evaneszenten Feld der Evaneszentfeld-Sensorplattform, beispielsweise aus dem Vergleich der gleichzeitig gemessenen Signale aus unterschiedlichen Messbereichen, welche entsprechende nachzuweisende Änalyten enthalten (in bekannter oder unbekannter Konzentration bzw. Menge) mit den Signalen aus Messbereichen, welche entsprechende nachzuweisende Änalyten nicht enthalten, bestimmt werden. Für die Bestimmung besagter Signaländerungen können auch die Signale aus Messbereichen mit unbekannter Konzentration mit denjenigen Messbereichen mit darin in bekannter Konzentration enthaltenen Änalyten benutzt werden. Für den Fall der kontinuierlichen Signalerfassung vor und während der Zugabe der entsprechenden Nachweissubstanzen und deren Bindung an die entsprechenden Änalyten enthaltenden Messbereiche kann eine entsprechende Änderung auch aus dem zeitlichen Verlauf der Signale aus den entsprechenden Messbereichen bestimmt werden.Said changes in optoelectronic signals, as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measurement areas in the samples, can be carried out in the evanescent field of the evanescent field sensor platform, for example from the comparison of the simultaneously measured signals from different measurement areas which contain corresponding analytes to be detected ( in known or unknown concentration or amount) with the Signals from measuring ranges which do not contain the corresponding analytes to be detected are determined. For the determination of said signal changes, it is also possible to use the signals from measurement areas with unknown concentration with those measurement areas with analytes contained therein in known concentration. In the case of continuous signal acquisition before and during the addition of the corresponding detection substances and their binding to the measurement areas containing the corresponding analytes, a corresponding change can also be determined from the time course of the signals from the corresponding measurement areas.
Im folgenden (und insbesondere auch in den Ansprüchen dieser Patentanmeldungsschrift) bezieht sich die Bezeichnung "einer ("natur-identischen") Probe jeweils auch auf zwei oder mehr, d.h. auf eine Vielzahl ("natur-identischer") Proben, sofern nicht ausdrücklich anders vermerkt.In the following (and in particular also in the claims of this patent application specification) the designation "one (" nature-identical ") sample also refers to two or more, ie to a large number of (" nature-identical ") samples, unless expressly different noted.
Für zahlreiche Anwendungsgebiete ist es erforderlich, eine Vielzahl von biologisch relevanten Änalyten in einer komplexen Probe zu bestimmen, beispielsweise in diagnostischen Verfahren zur Bestimmung des Gesundheitszustandes eines Individuums oder in der Pharmaforschung und -entwicklung zur Bestimmung der Beeinflussung eines Organismus und dessen komplexer Funktionsweise durch Zuführung biologisch aktiver Verbindungen.For numerous areas of application, it is necessary to determine a large number of biologically relevant analytes in a complex sample, for example in diagnostic methods for determining the health status of an individual or in pharmaceutical research and development for determining the influence of an organism and its complex functioning by supplying it biologically active connections.
Während bekannte analytische Trennverfahren im allgemeinen dahingehend optimiert sind, innerhalb möglichst kurzer Zeit eine möglichst grosse Anzahl von in einer gegebenen Probe enthaltenen Verbindungen gemäss eines vorgegebenen physikalisch-chemischen Parameters, wie beispielsweise des Molekulargewichts oder des Quotienten aus molekularer Ladung und Masse, aufzutrennen, beruhen Bioaffinitäts-Nachweisverfahren darauf, mit jeweils einem biologischen oder biochemischen oder synthetischen Erkennungselement möglichst hoher Spezifizität den entsprechenden (einzelnen) Änalyten hochselektiv in einer komplex zusammengesetzten Probe zu erkennen und zu binden. Der Nachweis einer Vielzahl unterschiedlicher Verbindungen erfordert also die Verwendung einer entsprechenden Anzahl unterschiedlicher spezifischer Erkennungselemente. Ein Nachweisverfahren basierend auf Bioaffinitätsreaktionen kann sowohl in einer homogenen Lösung als auch an der Oberfläche eines festen Trägers erfolgen. Je nach dem spezifischen Aufbau des Verfahrens sind nach Bindung der Änalyten an die entsprechenden Erkennungselemente und gegebenenfalls weitere Nachweissubstanzen sowie gegebenenfalls zwischen verschiedenen Verfahrensschritten jeweils Waschschritte notwendig, um die gebildeten Komplexe aus den Erkennungselementen und den nachzuweisenden Änalyten sowie gegebenenfalls weiteren Nachweissubstanzen vom Rest der Probe und der gegebenenfalls eingesetzten zusätzlichen Reagentien zu trennen.While known analytical separation processes are generally optimized to separate the largest possible number of compounds contained in a given sample according to a given physicochemical parameter, such as the molecular weight or the quotient of the molecular charge and mass, based on bioaffinity - Detection method for using a biological or biochemical or synthetic recognition element with the highest possible specificity to recognize and bind the corresponding (individual) analyte in a complex sample in a highly selective manner. The detection of a large number of different connections therefore requires the use of a corresponding number of different specific recognition elements. A detection method based on bioaffinity reactions can be carried out both in a homogeneous solution and on the surface of a solid support. Depending on the specific structure of the method, after binding the analytes to the corresponding detection elements and, if appropriate, further detection substances and, if appropriate, between different process steps, washing steps are necessary in order to remove the complexes formed from the detection elements and the analytes to be detected and, if appropriate, further detection substances from the rest of the sample and the to separate any additional reagents used.
Relativ weit verbreitet sind inzwischen Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl unterschiedlicher Nukleinsäuren in einer Probe mithilfe entsprechender komplementärer, auf einem festen Träger in diskreten, räumlich getrennten Messbereichen immobiliserter Nukleinsäuren als Erkennungselementen. Beispielsweise sind, basierend auf einfachen Glas- oder Mikroskop-Plättchen, Arrays von Oligonukleotiden als Erkennungselementen mit einer sehr hohen Feature-Dichte (Dichte von Messbereichen auf einem gemeinsamen festen Träger) bekannt. Beispielsweise werden in der US -Patentschrift No. 5,445,934 (Affymax Technologies) Arrays von Oligonukleotiden mit einer Dichte von mehr als 1000 Features pro Quadratzentimeter beschrieben und beansprucht.Methods for the simultaneous detection of a large number of different nucleic acids in a sample are now relatively widespread using corresponding complementary nucleic acids immobilized on a solid support in discrete, spatially separated measurement areas as recognition elements. For example, based on simple glass or microscope plates, arrays of oligonucleotides are known as recognition elements with a very high feature density (density of measuring areas on a common solid support). For example, US Pat. No. 5,445,934 (Affymax Technologies) arrays of oligonucleotides with a density of more than 1000 features per square centimeter described and claimed.
Seit kurzem häufen sich auch Beschreibungen von Arrays und damit ausgeführter Nachweisverfahren ähnlicher Art zur gleichzeitigen Bestimmung einer Vielzahl von Proteinen, beispielsweise in der US-Patentschrift No. 6,365,418 Bl.Recently, descriptions of arrays and related detection methods of a similar type for the simultaneous determination of a large number of proteins, for example in US Pat. No. 6,365,418 sheets
In den Patentschriften für derartige sogenannte „Mikroarrays", sowohl für den Nachweis von Nukleinsäuren als auch anderer Biopolymere, wie beispielsweise Proteine, wird jeweils beschrieben, dass eine Vielzahl unterschiedlicher spezifischer Erkennungselemente in diskreten Messbereichen zur Erzeugung eines Arrays für die Analyterkennung immobilisiert und anschliessend damit die zu untersuchende Probe mit den darin in einer (gegebenenfalls komplexen) Mischung vorhandenen Änalyten in Kontakt gebracht wird. Den bekannten Beschreibungen folgend, liegen unterschiedliche spezifische Erkennungselemente dabei jeweils in einer möglichst hochreinen Form in unterschiedlichen diskreten Messbereichen vor, so dass an Messbereiche mit unterschiedlichen Erkennungselementen im allgemeinen unterschiedliche Änalyten aus der Probe binden.In the patents for such so-called "microarrays", both for the detection of nucleic acids and other biopolymers, such as proteins, it is described in each case that a large number of different specific recognition elements are immobilized in discrete measurement areas for the production of an array for analyte detection and subsequently the The sample to be examined is brought into contact with the analytes present in a (possibly complex) mixture. According to the known descriptions, different specific detection elements are present in the most highly pure form possible in different discrete measurement ranges, so that Measuring areas with different detection elements generally bind different analytes from the sample.
Diese Art bekannter Assays erfordert, dass die in möglichst hochreiner Form zu immobilisierenden spezifischen Erkennungselemente mittels teilweise sehr aufwendiger Arbeitsschritte angereichert werden. Da sich unterschiedliche Erkennungselemente mehr oder minder stark in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften (z. B. in ihrer Polarität) unterscheiden, gibt es auch entsprechende Unterschiede in den Bedingungen für eine optimale Immobilisierung dieser Erkennungselemente, beispielsweise durch Adsorption oder kovalente Bindung, in diskreten Messbereichen auf einem gemeinsamen festen Träger, gegebenenfalls auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht. Demzufolge können die zur Immobilisierung einer Vielzahl unterschiedlicher Erkennungselemente gewählten Immobilisierungsbedingungen (wie z. B. Art der Haftvermittlungsschicht) kaum gleichzeitig für alle Erkennungselemente ein Optimum, sondern lediglich einen Kompromiss zwischen den Immobilisierungseigenschaften der verschiedenen Erkennungselemente darstellen.This type of known assay requires that the specific recognition elements to be immobilized in the highest possible purity are enriched by means of sometimes very complex work steps. Since different recognition elements differ more or less strongly in their physicochemical properties (e.g. in their polarity), there are also corresponding differences in the conditions for optimal immobilization of these recognition elements, for example by adsorption or covalent bonding, in discrete measuring ranges on a common solid support, optionally on an adhesion-promoting layer applied thereon. As a result, the immobilization conditions chosen for immobilizing a large number of different recognition elements (such as, for example, the type of adhesion-promoting layer) can hardly be an optimum for all recognition elements at the same time, but merely a compromise between the immobilization properties of the different recognition elements.
Bei dieser Art des Assays ist ausserdem nachteilig, dass zum Nachweis von Änalyten in einer Vielzahl unterschiedlichen Proben im allgemeinen die Bereitstellung einer entsprechenden Anzahl diskreter Arrays von Erkennungselementen, denen die unterschiedlichen Proben zugeführt werden, auf gemeinsamen oder diskreten Trägern erforderlich ist. Zur Untersuchung einer Vielzahl unterschiedlicher Proben bedeutet dieses den Bedarf einer hohen Anzahl diskreter Arrays, deren Herstellung relativ aufwendig ist.This type of assay also has the disadvantage that the detection of analytes in a large number of different samples generally requires the provision of a corresponding number of discrete arrays of recognition elements to which the different samples are fed on common or discrete supports. To examine a large number of different samples, this means the need for a large number of discrete arrays, the production of which is relatively complex.
Zwar ist beschrieben worden, dass beispielsweise die von immobilisierten Oligonukleotiden und in einer zugeführten Probe enthaltenen, zu den immobilisierten komplementären Oligonukleotiden gebildeten Hybride unter geeigneten Dissoziationsbedingungen mit hoher Effizienz wieder dissoziiert werden können und so eine Erkennungsoberfläche regeneriert werden kann, jedoch kann kaum eine hundertprozentige Regenerierungsfähigkeit garantiert werden. Im Falle von Bioaffinitätskomplexen mit Proteinen besteht oft sogar keine Reversibilität des Bindungschrittes, d.h. keine Möglichkeit zur Regenerierung der Erkennungsoberfläche.Although it has been described that, for example, the hybrids formed by immobilized oligonucleotides and contained in a sample supplied and complementary to the immobilized oligonucleotides can be dissociated again with high efficiency under suitable dissociation conditions and thus a recognition surface can be regenerated, but a 100% regeneration ability can hardly be guaranteed become. In the case of bioaffinity complexes with proteins, there is often no reversibility of the Binding step, ie no possibility to regenerate the detection surface.
Es besteht daher das Bedürfnis nach einem geänderten Assay- Aufbau, welcher es ermöglicht, eine Vielzahl von Proben in einem Array auf einem gemeinsamen Träger gleichzeitig auf in den Proben enthaltene Änalyten zu untersuchen. Dazu wäre es zweckmässig, nicht die unterschiedlichen spezifischen Erkennungselemente, sondern die zu untersuchenden Proben selbst direkt, d.h. unbehandelt, oder nach möglichst wenigen Vorbereitungsschritten in diskreten Messbereichen in einem Array auf einem Träger aufzutragen. Ein solcher Assay-Aufbau soll nachfolgend als eine „invertierte Assay-Architektur" bezeichnet werden.There is therefore a need for a modified assay structure which enables a large number of samples in an array on a common support to be examined simultaneously for analytes contained in the samples. For this purpose, it would be advisable not directly to use the different specific recognition elements, but rather the samples to be examined, i.e. untreated, or after as few preparation steps as possible in discrete measuring areas in an array on a carrier. Such an assay structure will be referred to below as an “inverted assay architecture”.
In der US-Patentschrift No. 6,316,267 wird ein Verfahren beschrieben, in dem PolyAminosäuren in einer Probenmischung (wobei es sich offensichtlich auch um eine komplex zusammengesetzte Probe handeln kann) beispielsweise auf einer festen oder quasi-festen („semi-solid") Probenmatrix aufgetragen werden. Der Nachweisschritt erfolgt jedoch nicht durch ein Bioaffinitätsassay, sondern durch Anfärbung mit einer Reagentienmischung, welche bestimmte, in der Patentschrift benannte Metallkomplexe enthält. Hierbei handelt es sich nicht um einen spezifischen Analytnachweis.In U.S. Patent No. No. 6,316,267 describes a method in which polyamino acids in a sample mixture (which can obviously also be a sample with a complex composition) are applied, for example, to a solid or quasi-solid (“semi-solid”) sample matrix. However, the detection step is not carried out by a bioaffinity assay, but by staining with a reagent mixture that contains certain metal complexes named in the patent specification. This is not a specific analyte detection.
In der US -Patentschrift 6,287,768 wird ein Verfahren beschrieben, dem zufolge verschiedenartige nachzuweisende RNA-Moleküle aus einer biologischen Probe isoliert, der Grosse nach aufgetrennt, auf einem festen Träger aufgebracht und anschliessend dort, beispielsweise in einem Hybridisierungsassay durch Hybridisierung mit bekannten, komplementären Polynukleotiden, nachgewiesen werden. Gemäss der Beschreibung können die aus einem Organismus isolierten nachzuweisenden RNA-Moleküle dabei entweder direkt dem weiteren Nachweisverfahren unterzogen werden, wenn sie in hoher Konzentration vorhanden sind, oder müssen vor dem eigentlichen Nachweisverfahren noch mit bekannten Vervielfältigungsverfahren (z. B. mittels PCR, „Polymerase Chain Reaction") vermehrt werden. Auch wenn das in dem US-Patent 6,287,768 vorgeschlagene Verfahren die Möglichkeit eröffnet, RNA aus verschiedenen Proben gleichzeitig zu bestimmen, erfordert es immer noch eine Reihe aufwendiger Probenaufbereitungsschritte und insbesondere die Isolation aus der biologischen Probenmatrix und eine nachfolgende Trennung nach der Molekülgrösse. Indem das beanspruchte Verfahren, welches nur am Beispiel von RNA beschrieben wird, mindestens die Isolation aus der ursprünglichen Probenmatrix und nachfolgende Auftrennung der nachzuweisenden Biopolymere nach deren Grosse voraussetzt, ist zu erwarten, dass die relative molekulare Zusammensetzung nach diesem Auftrennungsschritt, vor dem Nachweisschritt, unterschiedlich ist von der relativen molekularen Zusammensetzung in der ursprünglichen Probenmatrix.US Pat. No. 6,287,768 describes a method according to which different types of RNA molecules to be detected are isolated from a biological sample, the size is separated, applied to a solid support and then there, for example in a hybridization assay by hybridization with known, complementary polynucleotides, be detected. According to the description, the RNA molecules to be detected, which are isolated from an organism, can either be subjected directly to the further detection method if they are present in high concentration, or must be known before the actual detection method using known amplification methods (e.g. by means of PCR, “polymerase Chain Reaction ") can be increased. Even if the method proposed in US Pat. No. 6,287,768 opens up the possibility of determining RNA from different samples at the same time, it still requires a number of complex sample preparation steps and in particular the isolation from the biological sample matrix and a subsequent separation according to the molecular size. Since the claimed method, which is only described using the example of RNA, requires at least the isolation from the original sample matrix and subsequent separation of the biopolymers to be detected according to their size, it can be expected that the relative molecular composition after this separation step, before the detection step, will differ is of the relative molecular composition in the original sample matrix.
Hierbei und im folgenden soll die Bezeichnung „unveränderte relative molekulare Zusammensetzung" bedeuten, dass das Konzentrationsverhältnis der in einer Analyse zu bestimmenden Änalyten unverändert bleibt. Änderungen des Inhalts an Lösungsmittel- oder Matrixmolekülen oder anderer Verbindungen, welche in dem betreffenden Nachweisverfahren nicht bestimmt werde, sind bei dieser Bezeichnungsweise nicht berücksichtigt.Here and in the following, the term “unchanged relative molecular composition” should mean that the concentration ratio of the analytes to be determined in an analysis remains unchanged. Changes in the content of solvent or matrix molecules or other compounds which are not determined in the detection method in question are not taken into account in this designation.
Als Ursache für den Einbezug der genannten Trenn- oder Anreicherungsschritte in die genannten Nachweismethoden ist zu sehen, dass die dabei angewandten Detektionsschritte im allgemeinen keine ausreichende Empfindlichkeit aufweisen, um die in den Proben nachzuweisenden Änalyten mit den erwünschten Nachweisgrenzen zu bestimmen.The reason for including the separation or enrichment steps mentioned in the detection methods mentioned is that the detection steps used in this case generally do not have sufficient sensitivity to determine the analytes to be detected in the samples with the desired detection limits.
Die Anregung von zum Analytnachweis eingesetzten „Nachweiskomponenten" (wie beispielsweise radioaktiven Isotopen oder Chromophoren mit einer charakteristischen Absorption und / oder Lumineszenz bzw. Fluoreszenz) und das Auslesen der Signale von Arrays der genannten Art beruht auf klassischen, beispielweise optischen Anordnungen und Detektionsmethoden. Die klassischen Messmethoden, wie beispielsweise Absorptions- oder Fluoreszenzmessungen, beruhen im allgemeinen auf der direkten Beleuchtung eines Probevolumens in einem Probenbehältnis oder eines Messfeldes auf einer Innenwand eines Probenbehältnisses einer flüssigen Probe. Diese Anordnungen haben den Nachteil, dass neben dem Anregungsvolumen oder der Anregungsfläche, innerhalb derer ein Signal zum Nachweis eines Änalyten erzeugt werden soll, im allgemeinen ein erheblicher Anteil der Umgebung von Anregungslicht erfasst wird, was zur nachteiligen Erzeugung von störenden Untergrundsignalen führen kann.The excitation of "detection components" used for analyte detection (such as radioactive isotopes or chromophores with a characteristic absorption and / or luminescence or fluorescence) and the reading out of the signals from arrays of the type mentioned is based on classic, for example optical arrangements and detection methods Measurement methods, such as absorption or fluorescence measurements, are generally based on the direct illumination of a sample volume in a sample container or a measurement field on an inner wall of a sample container of a liquid sample. These arrangements have the disadvantage that, in addition to the excitation volume or the excitation area within which a signal for the detection of an analyte is to be generated, in general a considerable proportion of the environment is detected by excitation light, which can lead to the disadvantageous generation of disturbing background signals.
Zur Erreichung tieferer Nachweisgrenzen sind zahlreiche Messanordnungen entwickelt worden, in denen der Nachweis des Änalyten auf dessen Wechselwirkung mit dem evaneszenten Feld beruht, welches mit der Lichtleitung in einem optischen Wellenleiter verbunden ist. Koppelt man eine Lichtwelle in einen optischen Wellenleiter ein, der von optisch dünneren Medien, d.h. Medien mit niedrigerem Brechungsindex, umgeben ist, so wird sie durch Totalreflexion an den Grenzflächen der wellenleitenden Schicht geführt. In die optisch dünneren Medien tritt dabei ein Bruchteil des geführten Lichts ein. Diesen Anteil bezeichnet man als evaneszentes oder quergedämpftes Feld. Die Stärke des evaneszenten Feldes ist sehr stark abhängig von der Dicke der wellenleitenden Schicht selbst sowie vom Verhältnis der Brechungsindices der wellenleitenden Schicht und der sie umgebenden Medien. Bei dünnen Wellenleitern, d. h. Wellenleitern mit Schichtdicken von derselben oder niedrigerer Dicke als der zu führenden Wellenlänge, können diskrete Moden des geleiteten Lichts unterschieden werden. Derartige Verfahren haben den Vorteil, dass die Wechselwirkung des Anregungslichts mit dem Änalyten auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ins angrenzende Medium, in der Grössenordnung von einigen hundert Nanometern, beschränkt ist und Störsignale aus der Tiefe des Mediums weitgehend vermieden werden können. Die ersten vorgeschlagenen derartigen Messanordnungen beruhten auf hochmultimodalen, selbsttragenden Einschichtwellenleitern, wie beispielsweise Fasern oder Plättchen aus transparentem Kunststoff oder Glas, mit Stärken von einigen hundert Mikrometern bis zu mehreren Millimetern.To achieve lower detection limits, numerous measuring arrangements have been developed in which the detection of the analyte is based on its interaction with the evanescent field, which is connected to the light guide in an optical waveguide. If a light wave is coupled into an optical waveguide that is made of optically thinner media, i.e. Media with a lower refractive index is surrounded, so it is guided by total reflection at the interfaces of the waveguiding layer. A fraction of the guided light enters the optically thinner media. This portion is called the evanescent or cross-damped field. The strength of the evanescent field is very much dependent on the thickness of the waveguiding layer itself and on the ratio of the refractive indices of the waveguiding layer and the media surrounding it. With thin waveguides, i.e. H. Waveguides with layer thicknesses of the same or lower thickness than the wavelength to be guided can be distinguished from discrete modes of the guided light. Such methods have the advantage that the interaction of the excitation light with the analyte is limited to the depth of penetration of the evanescent field into the adjacent medium, on the order of a few hundred nanometers, and interference signals from the depth of the medium can be largely avoided. The first proposed measuring arrangements of this type were based on highly multimodal, self-supporting single-layer waveguides, such as fibers or platelets made of transparent plastic or glass, with thicknesses from a few hundred micrometers to several millimeters.
Zur Verbesserung der Empfindlichkeit und gleichzeitig einfacheren Herstellung in Massenfabrikation wurden planare Dünnschichtwellenleiter vorgeschlagen. Ein planarer Dünnschichtwellenleiter besteht im einfachsten Fall aus einem Dreischichtsystem: Trägermaterial, wellenleitende Schicht, Superstrat ( bzw. zu untersuchende Probe), wobei die wellenleitende Schicht den höchsten Brechungsindex besitzt.To improve sensitivity and at the same time simplify mass production, planar thin-film waveguides have been proposed. In the simplest case, a planar thin-film waveguide consists of a three-layer system: carrier material, wave-guiding layer, superstrate (or too investigating sample), the waveguiding layer having the highest refractive index.
Es sind verschiedene Verfahren für die Einkopplung von Anregungslicht in einen planaren Wellenleiter bekannt. Die am frühesten benutzten Verfahren beruhten auf Stirnflächenkopplung oder Prismenkopplung, wobei zur Verminderung von Reflexionen infolge von Luftspalten im allgemeinen eine Flüssigkeit zwischen Prisma und Wellenleiter aufgebracht wird. Diese beiden Methoden sind vor allem in Verbindung mit Wellenleitern relativ grosser Schichtdicke, d. h. insbesondere selbsttragenden Wellenleitern, sowie bei einem Brechungsindex des Wellenleiters von deutlich unter 2 geeignet. Zur Einkopplung von Anregungslicht in sehr dünne, hochbrechende wellenleitende Schichten ist demgegenüber die Verwendung von Koppelgittern eine wesentlich elegantere Methode.Various methods for coupling excitation light into a planar waveguide are known. The earliest methods used were based on face coupling or prism coupling, a liquid between prism and waveguide being generally applied to reduce reflections due to air gaps. These two methods are especially in connection with waveguides of relatively large layer thickness, i. H. Particularly suitable for self-supporting waveguides, as well as with a refractive index of the waveguide of significantly less than 2. In contrast, the use of coupling gratings is a much more elegant method for coupling excitation light into very thin, highly refractive waveguiding layers.
Es können verschiedene Methoden zum Analytnachweis im evaneszenten Feld geführter Lichwellen in optischen Schichtwellenleitern unterschieden werden. Aufgrund des eingesetzten Messprinzips kann man beispielsweise zwischen Fluoreszenz- oder allgemeiner Lumineszenzmethoden auf der einen Seite und refraktiven Methoden andererseits unterscheiden. Hierbei können Verfahren zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz in einer dünnen Metallschicht auf einer dielektrischen Schicht mit niedrigerem Brechungsindex in die Gruppe der refraktiven Methoden mit einbezogen werden, sofern als Basis zur Bestimmung der Messgrösse der Resonanzwinkel des eingestrahlten Anregungslichts zur Erzeugung der Oberflächenplasmonenresonanz dient. Die Oberflächenplasmonenresonanz kann aber auch zur Verstärkung einer Lumineszenz oder zur Verbesserung des Signal-zu- Hintergrund- Verhältnisses in einer Lumineszenzmessung verwendet werden. Die Bedingungen zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz sowie zur Kombination mit Lumineszenzmessungen sowie mit wellenleitenden Strukturen sind vielfach in der Literatur beschrieben, beispielsweise in den US-Patenten US-P 5,478,755, US-P 5,841,143, US-P 5,006,716 und US-P 4,649,280.Different methods for the detection of analytes in the evanescent field of guided light waves in optical layer waveguides can be distinguished. On the basis of the measurement principle used, a distinction can be made, for example, between fluorescence or general luminescence methods on the one hand and refractive methods on the other. In this case, methods for generating a surface plasmon resonance in a thin metal layer on a dielectric layer with a lower refractive index can be included in the group of refractive methods, provided that the resonance angle of the irradiated excitation light is used as the basis for determining the measurement variable to generate the surface plasmon resonance. However, the surface plasmon resonance can also be used to enhance luminescence or to improve the signal-to-background ratio in a luminescence measurement. The conditions for generating a surface plasmon resonance and for combining it with luminescence measurements and with waveguiding structures have been described many times in the literature, for example in US Pat. Nos. 5,478,755, 5,841,143, 5,006,716 and 4,649,280.
Mit dem Begriff "Lumineszenz" wird in dieser Anmeldung die spontane Emission von Photonen im ultravioletten bis infraroten Bereich nach optischer oder nichtoptischer, wie beispielsweise elektrischer oder chemischer oder biochemischer oder thermischer Anregung, bezeichnet. Beispielsweise sind Chemilumineszenz, Biolumineszenz, Elektrolumineszenz und insbesondere Fluoreszenz und Phosphoreszenz unter dem Begriff "Lumineszenz" mit eingeschlossen.In this application, the term “luminescence” refers to the spontaneous emission of photons in the ultraviolet to infrared range according to optical or non-optical, such as, for example, electrical or chemical or biochemical or thermal excitation. For example, chemiluminescence, bioluminescence, electroluminescence and in particular fluorescence and phosphorescence are included under the term "luminescence".
Bei den refraktiven Messmethoden wird die Änderung des sogenannten effektiven Brechungsindex aufgrund molekularer Adsorption oder Desorption auf dem Wellenleiter zum Nachweis des Änalyten benutzt. Diese Änderung des effektiven Brechungsindex wird, im Falle von Gitterkoppler-Sensoren, bestimmt aus der Änderung des Koppelwinkels für die Ein- oder Auskopplung von Licht in oder aus dem Gitterkoppler-Sensor, und im Falle von interferometrischen Sensoren aus der Änderung der Phasendifferenz zwischen dem in einem Sensorarm und einem Referenzarm des Interferometers geführten Messlichts.In the refractive measurement methods, the change in the so-called effective refractive index due to molecular adsorption or desorption on the waveguide is used to detect the analyte. This change in the effective refractive index, in the case of grating coupler sensors, is determined from the change in the coupling angle for the coupling or decoupling of light into or from the grating coupler sensor, and in the case of interferometric sensors from the change in the phase difference between the a sensor arm and a reference arm of the interferometer-guided measuring light.
Die genannten refraktiven Methoden haben den Vorteil, dass sie ohne Verwendung zusätzlicher Markierungsmoleküle, sogenannter molekularer Labels, eingesetzt werden können. Der Nachteil dieser labelfreien Methoden ist jedoch, dass die damit erzielbaren Nachweisgrenzen aufgrund der geringen Selektivität des Messprinzips, in Abhängigkeit von dem Molekulargewicht des Änalyten, auf pico- bis nanomolare Konzentrationsbereiche beschränkt sind, was für viele Anwendungen der modernen Spurenanalytik, beispielsweise für diagnostische Applikationen, nicht ausreichend ist.The refractive methods mentioned have the advantage that they can be used without the use of additional labeling molecules, so-called molecular labels. The disadvantage of these label-free methods is, however, that the detection limits that can be achieved with them are limited to pico- to nanomolar concentration ranges due to the low selectivity of the measurement principle, depending on the molecular weight of the analyte, which is necessary for many applications of modern trace analysis, for example for diagnostic applications. is not sufficient.
Zur Erreichung noch tieferer Nachweisgrenzen erscheinen lumineszenz-basierende Methoden aufgrund grösserer Selektivität der Signalerzeugung besser geeignet. Dabei ist die Lumineszenzanregung auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in das optisch dünnere Medium, also auf die unmittelbare Umgebung des wellenleitenden Bereichs mit einer Eindringtiefe in der Grössenordnung von einigen hundert Nanometern ins Medium beschränkt. Dieses Prinzip wird evaneszente Lumineszenzanregung genannt.To achieve even lower detection limits, luminescence-based methods appear more suitable due to the greater selectivity of the signal generation. The luminescence excitation is limited to the depth of penetration of the evanescent field into the optically thinner medium, i.e. to the immediate vicinity of the wave-guiding region with a depth of penetration of the order of a few hundred nanometers into the medium. This principle is called evanescent luminescence excitation.
Mittels hochbrechender Dünnschichtwellenleiter, in Kombination mit Lumineszenzdetektion, basierend auf einem nur einige hundert Nanometer dünnen wellenleitenden Film auf einem transparenten Trägermaterial, konnte in den letzten Jahren die Empfindlichkeit deutlich gesteigert werden. Beispielsweise wird in der WO 95/33197 eine Methode beschrieben, in der das Anregungslicht über ein Reliefgitter als diffraktives optisches Element in den wellenleitenden Film eingekoppelt wird. Die isotrop abgestrahlte Lumineszenz in der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes befindlicher lumineszenzfähiger Substanzen wird mittels geeigneter Messvorrichtungen, wie zum Beispiel Photodioden, Photomultiplier oder CCD-Kameras, gemessen. Es ist auch möglich, den in den Wellenleiter rückgekoppelten Anteil der evaneszent angeregten Strahlung über ein diffraktives optisches Element, zum Beispiel ein Gitter, auszukoppeln und zu messen. Diese Methode ist zum Beispiel in der WO 95/33198 beschrieben.Sensitivity has been increased significantly in recent years using high-index thin-film waveguides, in combination with luminescence detection, based on a waveguiding film that is only a few hundred nanometers thick on a transparent carrier material. For example, in the WO 95/33197 describes a method in which the excitation light is coupled into the waveguiding film as a diffractive optical element via a relief grating. The isotropically emitted luminescence in the penetration depth of the evanescent field of luminescent substances is measured by means of suitable measuring devices, such as photodiodes, photomultipliers or CCD cameras. It is also possible to couple out and measure the portion of the evanescently excited radiation fed back into the waveguide via a diffractive optical element, for example a grating. This method is described for example in WO 95/33198.
In den vergangenen Jahren sind Weiterentwicklungen von planaren Dünnschichtwellenleitern als Sensorplattformen für „Mikroarrays" bekannt geworden, beispielsweise in den Internationalen Patentanmeldungen WO 01/13096, WO 01/43875, teilweise in Kombination mit entsprechend angepassten Fluidikstrukturen. Diese Patentanmeldeschriften werden hiermit vollumfänglich als Bestandteil der vorliegenden Anmeldung eingeführt. In der WO 01/79821 wird eine Dünnschicht- Wellenleiterstruktur beschrieben, welche eine Zweiphotonen- Anregung an der Oberfläche des Wellenleiters ermöglicht. In der WO 01/88511 werden eine Gitter- Wellenleiter-Struktur und ein damit ausgeführtes Messverfahren beschrieben, welche ein bildgebendes Verfahren zur Analytbestimmung mithilfe einer refraktiven Messmethode ermöglichen. Beide Patentanmeldeschriften werden hiermit ebenfalls als Bestandteil der vorliegenden Anmeldung eingeführt.- Den genannten Anordnungen ist gemeinsam, dass jeweils bekannte biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente für den Nachweis einer Vielzahl von Änalyten in diskreten Messbereichen bekannter Lage, als Bestandteile eines oder mehrerer Arrays von Messbereichen, auf dem Trägersubstrat immobilisiert sind.In recent years, further developments of planar thin-film waveguides have become known as sensor platforms for “microarrays”, for example in the international patent applications WO 01/13096, WO 01/43875, partly in combination with appropriately adapted fluidic structures. These patent application documents are hereby fully incorporated into the present WO 01/79821 describes a thin-layer waveguide structure which enables two-photon excitation on the surface of the waveguide, and WO 01/88511 describes a grating waveguide structure and a measurement method carried out with it, which include a imaging method for analyte determination using a refractive measurement method enable both patent application documents are hereby also introduced as part of the present application Iochemical or synthetic recognition elements for the detection of a large number of analytes in discrete measurement areas of known location, as components of one or more arrays of measurement areas, on which the carrier substrate is immobilized.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass, bei geeigneter Wahl der physikalischchemischen Parameter (wie Schichtdicken, Brechungsindices der beteiligten Schichten) einer Evaneszentfeld-Sensorplattform, infolge der hohen Anregungslichtintensität an der Oberfläche und der gleichzeitigen Beschränkung dieses starken Anregungsfeldes auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in die benachbarten Medien, die erreichbare Empfindlichkeit für die Detektion molekularer Wechselwirkungen an der Oberfläche einer Evaneszentfeld-Sensorplattform ausreichend hoch ist, um eine Vielzahl von Proben oder Verdünnungen dieser Proben auf die darin enthaltenen Änalyten, ohne eine Anreicherung der in den Proben enthaltenen Änalyten durch weitere Probenaufbreitungsschritte, nach direkter Auftragung dieser Proben oder von deren Verdünnungen auf besagter Evaneszentfeld- Sensorplattform zu analysieren. Damit wird ein Verfahren mit invertierter Assay- Architektur möglich, bei welchem eine in einem Messbereich auf der Evaneszentfeld- Sensorplattform als festem Träger aufzubringende Probe eine „unveränderte relative molekulare Zusammensetzung" (gemäss obiger Definition) aufweist im Vergleich zur ursprünglichen Probe („Ursprungsprobe").It has now surprisingly been found that, with a suitable choice of the physicochemical parameters (such as layer thicknesses, refractive indices of the layers involved) of an evanescent field sensor platform, due to the high excitation light intensity on the surface and the simultaneous limitation of this strong excitation field to the penetration depth of the evanescent field into the neighboring media, the achievable sensitivity for the detection of molecular interactions on the surface of an evanescent field sensor platform is sufficiently high to analyze a large number of samples or dilutions of these samples on the analytes contained therein, without an enrichment of the analytes contained in the samples by further sample preparation steps, after direct application of these samples or from their dilutions on said evanescent field sensor platform. This enables a method with an inverted assay architecture in which a sample to be applied as a solid support in a measurement area on the evanescent field sensor platform has an “unchanged relative molecular composition” (according to the above definition) compared to the original sample (“original sample”) ,
Als „natur-identische Probe" soll im Sinne dieser Erfindung ein einer Analyse zu unterziehendes Gemisch von Verbindungen bezeichnet werden, welches die gleiche relative molekulare Zusammensetzung der darin nachzuweisenden Änalyten („unveränderte relative molekulare Zusammensetzung" (gemäss obiger Definition)) aufweist wie die Ursprungsprobe, aus dem es gewonnen wurde. Die Ursprungsprobe fällt entsprechend dieser Definition ebenfalls unter die Bezeichnung „natur-identische Probe". Beispielsweise kann es sich bei der Ursprungsprobe um eine biologische Zelle handeln, in welcher unterschiedliche Moleküle oder Verbindungen heterogen verteilt sind. Als „Ursprungsprobe" soll auch eine von einer Gesamtheit von einer oder mehreren Zellen erstellte Probe bezeichnet werden, die zuvor aus einer grösseren Anzahl von Zellen selektiert werden, beispielsweise durch Zentrifugation, Filtration oder durch „Laser Capture Microdissection".For the purposes of this invention, a "mixture of compounds to be subjected to analysis" is to be referred to as "nature-identical sample", which has the same relative molecular composition of the analytes to be detected therein ("unchanged relative molecular composition" (according to the above definition)) as the original sample from which it was obtained. According to this definition, the original sample also falls under the designation "nature-identical sample". For example, the original sample can be a biological cell in which different molecules or compounds are distributed heterogeneously. As an "original sample", one of a whole should also be used a sample created from one or more cells that are previously selected from a larger number of cells, for example by centrifugation, filtration or by “laser capture microdissection”.
Im folgenden bezieht sich die Bezeichnung einer (einzelnen) Zelle für die auszuführenden Probenbehandlungsschritte jeweils auch auf eine Vielzahl von Zellen, sofern dieses nicht ausdrücklich anders vermerkt ist.In the following, the designation of an (individual) cell for the sample treatment steps to be carried out also refers to a large number of cells, unless this is expressly stated otherwise.
In einem ersten, für weitere Untersuchungsschritte im allgemeinen notwendigen Aufbereitungsschritt kann die Zelle lysiert werden. Das daraus gewonnene Lysat mit homogener Verteilung der enthaltenen Verbindungen soll ebenfalls als „naturidentische Probe" bezeichnet werden, wenn die relative molekulare Zusammensetzung der darin nachzuweisenden Änalyten unverändert geblieben ist. Eine „natur-identische Probe" ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie das gesamte Proteom der „Ursprungsprobe" enthält. Das Lysat kann in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise einer Pufferlösung, gelöst sein und bekannte zugesetzte Beimischungen enthalten, beispielsweise Stabilisatoren wie Enzym-Inhibitoren, um einen Abbau enthaltener Biopolymere zu verhindern. Eine „natur-identische" Probe im definitionsgemässen Sinne kann auch Zusätze von bekannten Konzentrationen gleichartiger Verbindungen (als Standards) wie der nachzuweisenden Änalyten, vergleichbar mit einem „Spiken" von Proben in der Chromatographie, enthalten. Solche Zusätze können beispielsweise für Kalibrationszwecke dienlich sein. Ausserdem können die „natur-identischen" Proben Zusätze von der Probenmatrix ähnlichen, aber von den nachzuweisenden Änalyten verschiedenen Verbindungen, wie beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA), enthalten, welche beispielsweise der kontrollierten Einstellung der Oberflächendichte immobilisierter Analytmoleküle in einem Messbereich dienen können. In den „natur-identischen" Proben enthaltene Änalyten, d.h. insbesondere Biopolymere wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, können in nativer Form oder denaturierter Form, nach Behandlung der „Ursprungsprobe" beispielsweise mit Harnstoff oder Tensiden (z. B. SDS) vorliegen.The cell can be lysed in a first preparation step, which is generally necessary for further examination steps. The lysate obtained therefrom with a homogeneous distribution of the compounds contained should also be referred to as a "nature-identical sample" if the relative molecular composition of the analytes to be detected has remained unchanged. A "nature-identical sample" is characterized in particular by the fact that it covers the entire proteome of the "original sample". The lysate can be in a suitable Solvent, for example a buffer solution, be dissolved and contain known added admixtures, for example stabilizers such as enzyme inhibitors, in order to prevent degradation of the biopolymers contained therein. A "nature-identical" sample in the definition sense can also contain additions of known concentrations of similar compounds (as standards) such as the analytes to be detected, comparable to a "spiking" of samples in chromatography. Such additives can be useful, for example, for calibration purposes. In addition, the "nature-identical" samples can contain additives from compounds similar to the sample matrix but different from the analytes to be detected, such as bovine serum albumin (BSA), which can be used, for example, to control the surface density of immobilized analyte molecules in a measuring range. Nature-identical "samples containing analytes, ie in particular biopolymers such as nucleic acids or proteins, can be in native form or denatured form, after treatment of the" original sample ", for example with urea or surfactants (eg SDS).
Bevorzugt liegen die in den „natur-identischen Proben" enthaltenen Änalyten, , d.h. insbesondere Biopolymere wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, nach Behandlung mit Harnstoff, in denaturierter Form vor, wobei die Epitope dieser Änalyten für die Bindung ihrer jeweiligen Nachweissubstanzen, beispielsweise von Antikörpern, frei zugänglich sind. Dieses wird ermöglicht durch die Zerstörung der tertiären oder quarternären Struktur infolge der Behandlung mit Harnstoff.Preferably, the analytes contained in the "nature-identical samples", ie in particular biopolymers such as nucleic acids or proteins, are present in denatured form after treatment with urea, the epitopes of these analytes for binding their respective detection substances, for example antibodies. This is made possible by the destruction of the tertiary or quaternary structure as a result of the treatment with urea.
Überraschenderweise ist die Empfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens derart gross, dass eine „natur-identische" Probe auch noch stark verdünnt werden kann und in der Mischung enthaltene Verbindungen, trotz teilweiser nur sehr niedriger vorliegender Konzentration und entsprechend geringer verfügbarer Menge in einem einzelnen Messbereich, noch mit hoher Genauigkeit nachgewiesen werden können, was mit den bekannten herkömmlichen Methoden nicht möglich ist. Dabei ist es von einem ausserordentlichen Vorteil, dass bei dem erfindungsgemässen Verfahren die aufgebrachten, in einer Probe enthaltenen und nachzuweisenden Änalyten im allgemeinen auch nach ihrer Immobilisierung auf einer Evaneszenzfeld- Sensorplattform im allgemeinen noch in gleicher relativer molekularer Zusammensetzung vorliegen wie in der Ursprungsprobe. Das erfindungsgemässe Verfahren kann daher Ergebnisse liefern, welche repräsentativ für die gesamthafte molekulare Zusammensetzung der Ursprungsprobe sind, da die sonst üblichen Anreicherungs- und Trennschritte vermieden werden können.Surprisingly, the sensitivity of the method according to the invention is so great that a “nature-identical” sample can also be greatly diluted and the compounds contained in the mixture, despite the concentration being very low and the amount available in a single measuring range being correspondingly lower, still being present High accuracy can be detected, which is not possible with the known conventional methods. It is an extraordinary advantage that in the method according to the invention, the analytes applied, contained in a sample and to be detected, generally also after their immobilization on an evanescent field sensor platform are generally still in the same relative molecular composition as in the original sample The method can therefore provide results that are representative of the overall molecular composition of the original sample, since the otherwise usual enrichment and separation steps can be avoided.
Als „Analyt" soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine solche molekulare Spezies bezeichnet werden, welche mithilfe einer hierfür eingesetzten spezifischen Nachweissubstanz von anderen in einer zu analysierenden Probe enthaltenen Verbindungen unterschieden und gebunden wird. Erfolgt beispielsweise die Bindung einer entsprechenden Nachweissubstanz nur an die phosphorylierte, aber nicht an die unphosphorylierte Form einer nachzuweisenden Verbindung oder Spezies, so stellen gemäss dieser Definition beide Formen dieser Verbindung bzw. Spezies zwei unterschiedliche Änalyten dar. Werden von einer entsprechenden Nachweissubstanz jegliche Verbindungen oder Spezies erkannt und gebunden, wenn sie phosphoryliert sind, so stellen entsprechend unter dieser Bedingung die entsprechenden phosphorylierten Verbindungen oder Spezies gemeinsam einen Änalyten dar. Spezifische Bindungspartner als Nachweissubstanzen eines Änalyten gemäss dieser Definition können beispielsweise so ausgewählt sein, dass sie ausschliesslich die phosphorylierte Form oder die glykolisierte Form (oder entsprechend die nicht phosphorylierte bzw. nicht glykolisierte Form) einer nachzuweisenden Verbindung erkennen und daran binden. Die Aktivität eines biologischen Signalwegs in einer Zelle oder einem Organismus kann mit dem Anteil phosphorylierter oder glykolisierter Verbindungen (abhängig von der Natur des Signalwegs), welche diesen Signalweg steuern, korreliert werden. Der relative Anteil der phosphorylierten bzw. glykolisierten Form an der Gesamtmenge, d.h. der Quotient der Menge einer Verbindung in ihrer phosphorylierten bzw. glykolisierten Form und der Gesamtmenge dieser Verbindung in phosphorylierter und nicht phosphorylierter Form bzw. glykolisierter und nicht glykolisierter Form, in einer Probe wird nachfolgend als Phosphorylierungssgrad bzw. Glykolisierungsgrad dieser Verbindung in der Probe bezeichnet. Phosphorylierungsgrad und Glykolisierungsgrad können unter dem Oberbegriff des Aktivierungsgrads einer Verbindung zusammengefasst werden, dessen numerischer Wert beispielsweise dem Phosphorylierungsgrad oder dem Glykolisierungsgrad entspricht. Der Aktivierungsgrad einer Verbindung kann aber auch andere chemisch veränderte Formen einer Verbindung bezeichnen. Spezifische Bindungspartner als Nachweissubstanzen können auch so ausgewählt sein, dass sie nur dann an eine nachzuweisende Verbindung binden, wenn diese in einer bestimmten dreidimensionalen Struktur vorliegt. Beispielsweise erkennen und binden viele Antikörper nur an spezielle Teilbereiche (Epitope) einer nachzuweisenden Substanz mit einer speziellen dreidimensionalen Struktur. Je nach Konformationszustand der entsprechenden nachzuweisenden Verbindung können diese Teilbereiche (Epitope) für die Bindung der entsprechenden Nachweissubstanz zugänglich oder verborgen sein. Die spezifischen Bindungspartner können jedoch auch so ausgewählt sein, dass sie an Bereiche der nachzuweisenden Verbindung binden, deren Zugänglichkeit unabhängig von der dreidimensionalen Struktur dieser Verbindung ist. Durch den Einsatz entsprechend ausgewählter Nachweissubstanzen ist es daher möglich, den relativen Anteil an der Gesamtmenge einer in einer Probe nachzuweisenden Verbindung, welche einen spezifischen Konformationszustand aufweist, zu bestimmen.In the context of the present invention, “analyte” is to be referred to a molecular species which is distinguished and bound with the aid of a specific detection substance used for this purpose from other compounds contained in a sample to be analyzed. For example, if a corresponding detection substance is only bound to the phosphorylated, but not to the unphosphorylated form of a compound or species to be detected, then, according to this definition, both forms of this compound or species represent two different analytes. If any compounds or species are recognized and bound by a corresponding detection substance, if they are phosphorylated, then accordingly under this condition the corresponding phosphorylated compounds or species together represent an analyte. Specific binding partners as detection substances of an analyte according to this definition can be selected for example in this way in that they only recognize and bind to the phosphorylated form or the glycolized form (or correspondingly the non-phosphorylated or non-glycolized form) of a compound to be detected. The activity of a biological signaling pathway in a cell or organism can be correlated with the proportion of phosphorylated or glycolized compounds (depending on the nature of the signaling pathway) that control this signaling pathway. The relative proportion of the phosphorylated or glycolized form in the total amount, ie the quotient of the amount of a compound in its phosphorylated or glycolized form and the total amount of this compound in phosphorylated and non-phosphorylated form or glycolized and non-glycolized form, in a sample hereinafter referred to as the degree of phosphorylation or degree of glycolization of this compound in the sample. The degree of phosphorylation and degree of glycolysis can be summarized under the generic term of the degree of activation of a compound whose numerical value corresponds, for example, to the degree of phosphorylation or the degree of glycolysis. The degree of activation of a compound can also denote other chemically modified forms of a compound. Specific binding partners as detection substances can also be selected such that they only bind to a connection to be detected if it is present in a certain three-dimensional structure. For example, many antibodies only recognize and bind to specific sub-areas (epitopes) of a substance to be detected with a special three-dimensional structure. Depending on the conformational state of the corresponding compound to be detected, these partial areas (epitopes) can be accessible or hidden for the binding of the corresponding detection substance. However, the specific binding partners can also be selected such that they bind to regions of the connection to be detected, the accessibility of which is independent of the three-dimensional structure of this connection. By using appropriately selected detection substances, it is therefore possible to determine the relative proportion of the total amount of a compound to be detected in a sample, which has a specific conformational state.
Als „biologisch relevant" sollen solche Verbindungen bezeichnet werden, welche bekannt sind als Teilnehmer an spezifischen Bindungsreaktionen zu Molekülen oder Verbindungen biologischen Ursprungs oder zu deren synthetisch erzeugten Analogen. Beispiele für „biologisch relevante" Verbindungen sind daher nicht nur natürliche Proteine, wie Antikörper oder Rezeptoren, oder Nukleinsäuren, sondern auch deren Bindungspartner, wie beispielsweise Antigene, bei denen es sich auch um synthetische Verbindungen, auch sehr niedrigen Molekulargewichts, handeln kann.Those compounds which are known to be participants in specific binding reactions to molecules or compounds of biological origin or to their synthetically produced analogs are to be referred to as “biologically relevant”. Examples of “biologically relevant” compounds are therefore not only natural proteins, such as antibodies or receptors , or nucleic acids, but also their binding partners, such as antigens, which can also be synthetic compounds, even of very low molecular weight.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen räumlich getrennte oder diskrete Messbereiche durch die geschlossene Fläche definiert werden, die dort immobilisierte Bindungspartner, zum Nachweis eines oder mehrerer Änalyten in einer oder mehreren Proben in einem Bioaffinitätsassay, einnehmen. Diese Flächen können dabei eine beliebige Geometrie, beispielsweise die Form von Kreisen, Rechtecken, Dreiecken, Ellipsen etc., haben.For the purposes of the present invention, spatially separate or discrete measurement areas are to be defined by the closed area, which binding partners immobilized there assume for the detection of one or more analytes in one or more samples in a bioaffinity assay. These surfaces can have any geometry, for example the shape of circles, rectangles, triangles, ellipses, etc.
Bei unterschiedlichen derartigen Messbereichen kann es sich beispielsweise um eine Vielzahl unterschiedlicher, auf dem Trägersubstrat aufgetragener Proben oder um aufgetragene unterschiedliche Verdünnungen einer oder mehrerer Proben (jeweils in unterschiedlichen diskreten Messbereichen) handeln. Das Material für die diskreten Messbereiche kann beispielsweise durch selektive Mikropräparationen, wie beispielsweise das selektive Herauslösen einzelner Zellen aus einem Zellverband durch „Laser Capture Micro Dissection", bereitgestellt sein.Different measurement ranges of this type can be, for example, a multiplicity of different samples applied to the carrier substrate or different dilutions of one or more samples applied (each in different discrete measurement ranges). The material for the discrete Measuring ranges can be provided, for example, by selective micro-preparations, such as, for example, the selective detachment of individual cells from a cell assembly by "laser capture micro dissection".
Allgemeiner kann die „natur-identische" Probe mit den darin nachzuweisenden Änalyten ausgewählt sein aus der Gruppe von Extrakten gesunder oder krankhafter Zellen, (z. B. von menschlichen, tierischen, bakteriellen oder pflanzlichen Zellextrakten), Extrakten von tierischem oder menschlichem Gewebe, wie beispielsweise Organ-, Haut-, Haar- oder Knochengewebe, oder von Pflanzengewebe, sowie von Körperflüssigkeiten oder deren Bestandteilen, wie beispielsweise Blut, Serum oder Plasma, Gelenkflüssigkeiten, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel, Gewebeflüssigkeit, Lymphe. Insbesondere kann eine „natur-identische" Probe auch ausgewählt sein aus der Gruppe, welche Extrakte stimulierter oder unbehandelter Zellen und Extrakte gesunden oder krankhaften Gewebes umf asst.More generally, the "nature-identical" sample with the analytes to be detected therein can be selected from the group of extracts from healthy or pathological cells (e.g. from human, animal, bacterial or plant cell extracts), extracts from animal or human tissue, such as for example organ, skin, hair or bone tissue, or of plant tissue, as well as body fluids or their components, such as blood, serum or plasma, synovial fluids, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid, lymph. In particular, a “nature-identical "The sample can also be selected from the group comprising extracts of stimulated or untreated cells and extracts of healthy or pathological tissue.
Entsprechend kann, ausser durch „Laser Capture Micro Dissection", eine „natur- . identische" Probe auch einem Organismus oder Gewebe- oder Zellverband oder Zelle mittels einer Methode aus der Gruppe von Gewebeschnitten, Biopsie entnommen sein.Accordingly, in addition to “laser capture micro dissection”, a “nature-identical” sample can also be taken from an organism or tissue or cell structure or cell using a method from the group of tissue sections, biopsy.
In einem Messbereich werden im allgemeinen mehrere unterschiedliche Bindungspartner gleichzeitig immobilisiert sein. Meistens wird es sich um eine Vielzahl, d. h. mehrere hundert oder sogar mehrere tausend unterschiedliche Änalyten in einem Messbereich immobilisierte Änalyten handeln.In general, several different binding partners will be immobilized simultaneously in one measuring range. Most of the time it will be a variety, i.e. H. Trade several hundred or even several thousand different analytes immobilized analytes in one measuring range.
Erster Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Untersuchung einer Vielzahl „natur-identischer" Proben auf in den Proben enthaltene, als Teilnehmer an spezifischen Bindungsreaktionen biologisch relevante Verbindungen als Änalyten, dadurch gekennzeichnet, dassThe first object of the invention is a method for examining a large number of "nature-identical" samples for compounds contained in the samples that are biologically relevant as participants in specific binding reactions, characterized in that
- besagte Proben oder Verdünnungen besagter Proben ohne Änderung der relativen molekularen Zusammensetzung, im Vergleich zur ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der Probe, mit den darin enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten, als einer ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern, in mindestens einem ein- oder zweidimensisonalen Array in diskreten Messbereichen auf einer Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger aufgetragen werden,- Said samples or dilutions of said samples without changing the relative molecular composition, in comparison to the original relative molecular composition of the sample, with the analytes contained therein, as a first plurality of specific binding partners, to be detected, in at least one or two-dimensional array in discrete measurement areas are applied to an evanescent field sensor platform as a solid support,
- eine oder mehrere Nachweissubstanzen, als eine zweite Vielzahl spezifischer Bindungspartner, zum spezifischen Nachweis von einem oder mehreren in den Proben enthaltenen Änalyten, aus besagter ersten Vielzahl spezifischer Bindungspartner, in einem einzigen oder mehreren Schritten einer spezifischen Bindungsreaktion mit den in besagten diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben in Kontakt gebracht werden,- One or more detection substances, as a second plurality of specific binding partners, for the specific detection of one or more analytes contained in the samples, from said first plurality of specific binding partners, in a single or more steps of a specific binding reaction with the samples applied in said discrete measuring ranges be brought into contact
- Änderungen von optoelektronischen Signalen als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, im evaneszenten Feld der Evaneszentfeld-Sensorplattform, ortsaufgelöst gemessen werden und aus der relativen Grosse der Änderungen besagter optoelektronischer Signale aus den jeweiligen Messbereichen qualitativ und / oder quantitativ das Vorhandensein der dort spezifisch nachzuweisenden Änalyten bestimmt wird.- Changes in optoelectronic signals as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measurement areas in the samples, in the evanescent field of the evanescent field sensor platform, are measured in a location-resolved manner and from the relative magnitude of the changes in said optoelectronic signals from the respective measurement areas, qualitatively and / or quantitatively determining the presence of the analytes specifically to be detected there.
Die einfachste Form der Immobilisierung von spezifischen Bindungspartnern für einen Analytnachweis in einer spezifischen Bindungsreaktion besteht in physikalischer Adsorption, beispielsweise infolge hydrophober Wechselwirkungen zwischen den zu immobilisierenden spezifischen Bindungspartnern und der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger. Diese Wechselwirkungen können jedoch durch die Zusammensetzung des Mediums und dessen physikalisch-chemische Eigenschaften, wie beispielsweise Polarität und Ionenstärke, in ihrem Ausmass stark verändert werden. Insbesondere im Falle sequentieller Zugabe verschiedener Reagentien in einem mehrstufigen Assay ist das Haftvermögen der Erkennungselemente nach rein adsorptiver Immobilisierung auf der Oberfläche oft unzureichend. Es wird daher bevorzugt, dass die Evaneszentfeld-Sensorplattform, zur Verbesserung des Haftvermögens der in diskreten Messbereichen aufgetragenen „natur-identischen" Proben oder von deren Verdünnungen, eine Haftvermittlungsschicht umfasst, auf welcher besagte Proben oder deren Verdünnungen aufgetragen werden.The simplest form of immobilization of specific binding partners for an analyte detection in a specific binding reaction is physical adsorption, for example as a result of hydrophobic interactions between the specific binding partners to be immobilized and the evanescent field sensor platform as a solid carrier. However, these interactions can be greatly changed in their extent by the composition of the medium and its physicochemical properties, such as polarity and ionic strength. In particular in the case of sequential addition of different reagents in a multi-stage assay, the adherence of the recognition elements after purely adsorptive immobilization on the surface is often insufficient. It is therefore preferred that the evanescent field sensor platform, in order to improve the adherence of the "nature-identical" samples applied in discrete measurement areas or of their dilutions, comprises an adhesion-promoting layer on which said samples or their dilutions are applied.
Vorzugsweise beträgt dabei die Dicke der Haftvermittlungsschicht weniger als 200 nm, besonders bevorzugt weniger als 20 nm. Für die Herstellung der Haftvermittlungsschicht eignen sich eine Vielzahl von Materialien. Beispielsweise kann die Haftvermittlungsschiht Verbindungen umfassen aus der Gruppe von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren und "selbstorganisierten passiven oder funktionalisierten Mono- oder Mehrfachschichten", Thiolen, Alkylphosphaten und - phosphonaten, multifunktionellen Block-Copolymeren, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycolen.The thickness of the adhesion-promoting layer is preferably less than 200 nm, particularly preferably less than 20 nm. A large number of materials are suitable for producing the adhesion-promoting layer. For example, the adhesion-promoting layer can comprise compounds from the group of silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized passive or functionalized mono- or multilayers", thiols, alkyl phosphates and phosphonates, multifunctional block copolymers, such as, for example, poly (L) lysine / polyethylene glycols.
Es ist auch möglich, dass besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Gruppe von Organophosphorsäuren der allgemeinen Formel I (A)It is also possible for said adhesion-promoting layer to comprise compounds from the group of organophosphoric acids of the general formula I (A)
oder von Organophosphonsäuren der allgemeinen Formel I (B)or of organophosphonic acids of the general formula I (B)
und deren Salzen, in denen B einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Hetaryl- oder Hetarylalkylrest und Y Wasserstoff oder eine funktionelle Gruppe aus der Reihe Hydroxy, Carboxy, Amino, gegebenfalls durch Niederalkyl substituiertes Mono-oder Dialkylamino, Thiol, oder eine negative Säuregruppe aus der Reihe Ester, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Maleimid, Succinimydyl, Epoxy oder Acrylat bedeutet. Diese Verbindungen sind genauer beschrieben in der internationalen Anmeldung PCT/EP 01/10077, welche hiermit vollumfänglich als Bestandteil dieser Anmeldung eingeführt wird.and their salts in which B is an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, hetaryl or hetarylalkyl radical and Y is hydrogen or a functional group from the series hydroxyl, carboxy, amino, optionally mono- or substituted by lower alkyl Dialkylamino, thiol, or a negative acid group from the series ester, phosphate, phosphonate, sulfate, sulfonate, maleimide, succinimydyl, epoxy or acrylate. These compounds are described in more detail in the international application PCT / EP 01/10077, which is hereby fully introduced as part of this application.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemässe Verfahren so gestaltet, dass die relative molekulare Zusammensetzung einer in einem Messbereich immobilisierten ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern als Änalyten mit der ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der dort aufgebrachten Probe übereinstimmt. Diese Bedingung kann beispielsweise dadurch erfüllt werden, dass das Material einer in einem Messbereich aufgebrachten Probe gleich gross oder weniger ist, als zur Ausbildung einer Monoschicht auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger erforderlich ist. Im Falle einer Sub-Monolayerbedeckung der Oberfläche des festen Trägers ist zugleich eine bestmögliche Zugänglichkeit der als Änalyten immobilisierten ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern für die damit in Kontakt zu bringenden Nachweissubstanzen gewährleistet. Die Zugänglichkeit kann noch dadurch verbessert werden, dass eine zuvor aufgebrachte Haftvermittlungsschicht zu einer orientierten Immobilisierung führt, beispielsweise indem in der aufgebrachten Probe enthaltene Antikörper an ihrem Fc-Teil gebunden immobilisiert werden, so dass ihre spezifischen Bindungsepitope zugänglich sind.The method according to the invention is preferably designed in such a way that the relative molecular composition of a first plurality of specific binding partners immobilized in a measurement area matches as analytes with the original relative molecular composition of the sample applied there. This condition can be met, for example, in that the material of a sample applied in a measuring area is the same size or less than for the formation of a monolayer on the evanescent field sensor platform solid support is required. In the case of a sub-monolayer covering of the surface of the solid support, the best possible accessibility of the first multitude of specific binding partners immobilized as analytes is guaranteed for the detection substances to be brought into contact with it. The accessibility can be improved further in that a previously applied adhesion-promoting layer leads to oriented immobilization, for example by immobilizing antibodies contained in the applied sample to their Fc part, so that their specific binding epitopes are accessible.
Aufgrund der hohen Empfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens ist es möglich, auch nur sehr geringe eingesetzten Probevolumina und -mengen zu analysieren. Als Probenmenge soll dabei die Gesamtmenge verstanden werden, welche in einem diskreten Messbereich aufgebracht ist. Es ist beispielsweise möglich, dass eine Probe das Material von weniger als 20000 Zellen umfasst und trotzdem noch mit hoher Genauigkeit analysiert werden kann. Eine aufzubringende Probe kann sogar das Material von weniger als 1000 Zellen umfassen. Die erforderliche Probenmenge kann sogar das Material von weniger als 100 Zellen, oder sogar von nur 1 - 10 Zellen umfassen und noch verlässlich analysiert werden. Das Material. welches dem Inhalt einer Zelle entspricht, soll auch als ein Zeil-Äquivalent bezeichnet werden. Die Notwendigkeit einer nur so kleinen Menge für eine Analyse benötigter Zeil- Äquivalente ist dann gegeben, wenn es sich bei den nachzuweisenden Änalyten um in relativ hoher Konzentration auftretende Inhaltsstoffe handelt. Ebenso ist es möglich, dass eine Probe ein Volumen von weniger als 1 μl hat. Eine aufzubringende Probe kann sogar ein Volumen von weniger als 10 nl oder sogar weniger als 1 nl haben.Because of the high sensitivity of the method according to the invention, it is possible to analyze even very small sample volumes and amounts. The sample amount should be understood to mean the total amount that is applied in a discrete measuring range. For example, it is possible for a sample to comprise the material of fewer than 20,000 cells and still be able to be analyzed with high accuracy. A sample to be applied can even comprise the material of less than 1000 cells. The required amount of sample can even include the material of less than 100 cells, or even only 1-10 cells, and can still be reliably analyzed. The material. which corresponds to the content of a cell should also be referred to as a line equivalent. The need for such a small amount of line equivalents required for an analysis is given when the analytes to be detected are ingredients which occur in a relatively high concentration. It is also possible that a sample has a volume of less than 1 μl. A sample to be applied can even have a volume of less than 10 nl or even less than 1 nl.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht, dass die in einer „natur-identischen" Probe enthaltenen relativen Gesamtmengen von einer oder mehreren Verbindungen als Änalyten, als Summe von deren Vorkommen in phosphorylierter oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form, bestimmt werden. Vorzugsweise werden die in einer „naturidentischen" Probe enthaltenen relativen Mengen von einer oder mehreren Verbindungen als Änalyten, jeweils von deren Vorkommen in phosphorylierter und / oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form, für eine oder mehrere besagter Formen bestimmt. Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht es, gemäss obiger Definition den Aktivierungsgrad eines oder mehrerer in einer "natur-identischen" Probe enthaltenen Änalyten zu bestimmen. Insbesonder kann mit besagtem Verfahren der Phosphorylierunsgrad und / oder Glykolisierungsgrad eines oder mehrerer in einer „naturidentischen" Probe enthaltenen Änalyten bestimmt werden. Charakteristisch füt das erfindungsgemässe Vefahren ist ausserdem aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit und hohen Genauigkeit und Reproduzierberkait, insbesondere aufgrund einer Vielzahl gleichzeitig oder alternativ einsetzbarer, voneinander unabhängiger Referenzierungs- und Kalibrationsmethoden, dass Unterschiede von weniger als 20 %m bevozugt von weniger als 10 %, von den in einer „naturidentischen" Probe und in einer oder mehreren Vergleichsproben enthaltenen relativen Mengen von einer oder mehreren Verbindungen in phosphorylierter und / oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form als Änalyten, für eine oder mehrere besagter Formen nachgewiesen werden.The method according to the invention enables the relative total amounts of one or more compounds contained in a “nature-identical” sample to be determined as analytes, as the sum of their occurrence in phosphorylated or non-phosphorylated form and / or glycated and / or non-glycated form Preferably, the relative amounts contained in a "nature-identical" sample of one or more compounds as analytes, in each case of their occurrence in phosphorylated and / or non-phosphorylated form and / or glycated and / or non-glycated form, for one or more of said forms certainly. The method according to the invention makes it possible, according to the above definition, to determine the degree of activation of one or more analytes contained in a "nature-identical" sample. In particular, the said method can be used to determine the degree of phosphorylation and / or degree of glycolysis of one or more analytes contained in a "nature-identical" sample. The method according to the invention is also characteristic due to its high sensitivity and high accuracy and reproducibility, in particular due to a large number of simultaneously or alternatively usable , independent referencing and calibration methods, that differences of less than 20% with respect to less than 10%, of the relative amounts of one or more compounds in phosphorylated and / or contained in a "nature-identical" sample and in one or more comparative samples non-phosphorylated form and / or glycated and / or non-glycated form as analytes, for one or more of said forms.
Ein grosser Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens aufgrund seiner inhärenten, methodenspezifischen hohen Empfindlichkeit und vielfältigen Möglichkeiten der Referenzierung und / oder Kalibration unter Benutzung ein- und derselben analytischen Plattform (bzw. Evaneszentfeld-Sensorplattform) ist , dass die Variation der damit gewonnnen Messergebnisse sehr niedrig ist. Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher auch geeignet zur Untersuchung des zeitlichen Verlaufs (d. h. der Veränderungen) der relativen Mengen oder Konzentrationen von biologisch relevanten Substanzen unter Einfluss der Erkrankung eines biologischen Organismus oder einer Zellkultur und / oder der äusseren Beeinflussung eines Organismus oder einer Zellkultur.A major advantage of the method according to the invention due to its inherent, method-specific high sensitivity and various possibilities for referencing and / or calibration using one and the same analytical platform (or evanescent field sensor platform) is that the variation of the measurement results obtained is very low. The method according to the invention is therefore also suitable for examining the temporal course (i.e. the changes) of the relative amounts or concentrations of biologically relevant substances under the influence of the disease of a biological organism or a cell culture and / or the external influence of an organism or a cell culture.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist daher dadurch gekennzeichnet, dass besagte „naturidentische" Probe und eine oder mehrere Vergleichsproben dem gleichen Ursprungsort zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen sind und dass zeitliche Veränderungen der in diesen Proben enthaltenen relativen Mengen von einer oder mehreren Verbindungen in phosphorylierter und / oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form als Änalyten, bestimmt werden. Unter „dem gleichen Ursprungsort" soll dabei der gleiche Organismus oder ein gleichartiger Organismus oder die gleiche Zellkultur bzw. gleichartige Zellkultur (jeweils nach unterschiedlich langer gleichartiger Erkrankung oder Beeinflussung) verstanden werden. Vorzugsweise ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren, zeitliche Änderungen der relativen Konzentration bzw. Menge besagter Änalyten von weniger als 20 % , bevorzugt von weniger als 10 %, nachzusweisen.A further embodiment of the method according to the invention is therefore characterized in that said “nature-identical” sample and one or more reference samples are taken from the same place of origin at different times and that changes in the relative amounts of one or more compounds in phosphorylated and / or or non-phosphorylated form and / or glycolized and / or not Glycolized form as analytes. “The same place of origin” should be understood to mean the same organism or a similar organism or the same cell culture or cell culture (in each case after a different length of the same disease or influence). The method according to the invention preferably enables changes in the relative concentration or amount over time said analytes of less than 20%, preferably less than 10%.
Besagte Proben können bei geeignet hoher Ausgangskonzentration der darin enthaltenen Änalyten vor der Auftragung auf besagter Evaneszentfeld- Sensorplattform als festem Träger in einem flüssigen Verdünnungsmedium gelöst und / oder verdünnt werden und unterschiedliche Verdünnungen einer Probe in unterschiedlichen diskreten Messbereichen auf besagter Evaneszentfeld- Sensorplattform aufgetragen werden. Die Proben können dabei um mindestens einen Faktor 10, ja sogar um einen Faktor 30 oder 100 verdünnt werden.Said samples can be dissolved and / or diluted with a suitably high initial concentration of the analytes contained therein before application to said evanescent field sensor platform as a solid carrier in a liquid dilution medium, and different dilutions of a sample can be applied in different discrete measurement ranges on said evanescent field sensor platform. The samples can be diluted by at least a factor of 10, even by a factor of 30 or 100.
Unterschiedliche Proben können dem gleichen Organismus oder der gleichen Zellkultur entnommen werden. Dann kann durch die Analyse auf mehreren Messbereichen mit darin enthaltenem Material aus dem gleichen Organismus oder aus gleichartigen Zellkulturen ( bzw. aus der gleichen Zellkultur) beispielsweise statistische Information über die Reproduzierbarkeit der in diesen Messbereichen bestimmten relativen molekularen Zusammensetzung der aufgebrachten Proben gewonnen werden.Different samples can be taken from the same organism or cell culture. Statistical information about the reproducibility of the relative molecular composition of the applied samples determined in these measurement areas can then be obtained by analysis on several measurement areas with material contained therein from the same organism or from similar cell cultures (or from the same cell culture).
Unterschiedliche Proben können insbesondere an verschiedenen Positionen des gleichen Organismus entnommen werden. Dann kann aus den Analysen auf den entsprechenden diskreten Messbereichen beispielsweise Information über Inhomogenitäten der relativen molekularen Zusammensetzung der nachzuweisenden Änalyten in dem Organismus, aus dem besagte Proben entnommen wurden, gewonnen werden. Ein solches Vorgehen ist beispielsweise für die Untersuchung krebsbehafteter Organismen von grosser Bedeutung.Different samples can be taken in particular at different positions of the same organism. Information about inhomogeneities in the relative molecular composition of the analytes to be detected in the organism from which said samples were taken can then be obtained from the analyzes on the corresponding discrete measurement areas. Such a procedure is of great importance, for example, for the investigation of cancerous organisms.
Unterschiedliche Proben können aber auch verschiedenen Organismen oder verschiedenen Zellkulturen entnommen sein. Beispielsweise kann es sich dabei um Proben von mit einem pharmazeutischen Wirkstoff behandelten und unbehandelten Organismen handeln. Ähnlich einer Expressionsanalyse in der Nukleinsäure- Analytik kann dann der Einfluss des jeweiligen Wirkstoffes auf die relative molekulare Zusammensetzung der Proben untersucht werden.Different samples can also be taken from different organisms or different cell cultures. For example, it can be Trade samples of organisms treated and untreated with an active pharmaceutical ingredient. Similar to an expression analysis in nucleic acid analysis, the influence of the respective active substance on the relative molecular composition of the samples can then be examined.
Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Proben vor ihrer Auftragung auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger (zur Verbesserung des Haftvermögens auf besagtem festem Träger und Erhöhung der Gleichmässigkeit der Auftragung) mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) gemischt werden. Diese Variante des Verfahrens kann beispielsweise dazu beitragen, die Ausbildung von Inhomogenitäten der Verteilung des Probenmaterials innerhalb eines Messbereichs beim Prozess der Verdampfung der Probenflüssigkeit zu vermeiden, was zu einer besseren „Spot-Morphologie" führt und damit die Auswertung der Ergebnisse erleichtert. Dabei wird bevorzugt, dass besagte Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren oder chemischen „Cross- Linkern" ausgewählt ist aus der Gruppe, welche Lösungen von Polysacchariden, wie z. B. Agarose, oder von Acrylamiden oder von Glutaralehyd etc.umfasst.A special embodiment of the method according to the invention is characterized in that one or more samples, before being applied to the evanescent field sensor platform, are used as a solid support (to improve the adhesion on said solid support and increase the uniformity of the application) with a solution of polymers or polymerizable monomers , if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (eg glutaraldehyde). This variant of the method can, for example, help to create inhomogeneities in the distribution of the sample material within a measuring range in the process of evaporation of the Avoid sample liquid, which leads to a better "spot morphology" and thus facilitates the evaluation of the results. It is preferred that said solution of polymers or polymerizable monomers or chemical "crosslinkers" is selected from the group consisting of solutions of polysaccharides, such as agarose, or of acrylamides or of glutaralehyde, etc.
Diese besondere Variante des erfindungsgemässen Verfahrens ist auch dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung der einen oder mehreren Proben mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) in der Immobilisierung einer dreidimensionalen Netzwerkstruktur mit darin eingebundenen, für Nachweissubstanzen in dem nachfolgenden Schritt einer Bioaffinitätsreaktion zugänglichen Probenbestandteilen, auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger resultiert. Damit kann ein höherer Grad der Oberflächenbedeckung der Evaneszentfeld-Sensorplattform als eine Monoschicht erreicht werden, was zu einer weiteren Erhöhung der messbaren Signale beim Schritt des Analytnachweises führen kann. Wichtig ist dabei, dass die geschaffene Polymeren-Netzwerkstruktur sich nicht über die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ins Medium hinaus erstreckt, da ein Analytnachweis jenseits dieser Entfernung von der Oberfläche der Evaneszentfeld- Sensorplattform nicht möglich ist und damit nicht mehr gewährleistet wäre, dass das Ergebnis der Analyse die ursprüngliche relative molekulare Zusammensetzung der Probe widerspiegeln würde.This particular variant of the method according to the invention is also characterized in that the mixture of the one or more samples with a solution of polymers or polymerizable monomers, if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (eg glutaraldehyde) in The immobilization of a three-dimensional network structure with integrated sample components accessible to detection substances in the subsequent step of a bioaffinity reaction results on the evanescent field sensor platform as a solid support.This enables a higher degree of surface coverage of the evanescent field sensor platform to be achieved as a monolayer, which leads to a It is important that the polymer network structure created does not extend beyond the depth of penetration of the evanescent field into the medium, since an analyte detection depends on the analyte detection step is not possible beyond this distance from the surface of the evanescent field sensor platform and it would therefore no longer be guaranteed that the The result of the analysis would reflect the original relative molecular composition of the sample.
Die Proben können in diskreten Messbereichen auf der Evaneszentfeld- Sensorplattform direkt oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht räumlich selektiv mithilfe eines Verfahrens aufgebracht werden, welches ausgewählt ist aus der Gruppe von Verfahren, die von "InkJet spotting", mechanischem Spotting mittels Stift, Feder oder Kapillare, „Micro contact printing", fluidischer Kontaktierung der Messbereiche mit besagten Probe, durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen sowie photochemischen oder photolithographischen Immobilisierungsverfahren gebildet wird.The samples can be spatially selectively applied in discrete measurement areas on the evanescent field sensor platform or on an adhesive layer applied thereon using a method which is selected from the group of methods by "inkjet spotting", mechanical spotting using a pen, pen or capillary , "Micro contact printing", fluidic contacting of the measurement areas with said sample, the supply of which is formed in parallel or crossed microchannels, under the influence of pressure differences or electrical or electromagnetic potentials, and photochemical or photolithographic immobilization processes.
Es ist von Vorteil, wenn Bereiche zwischen den diskreten Messbereichen zur Minimierung unspezifischer Bindung von Nachweissubstanzen "passiviert werden", d.h. dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Nachweissubstanzen für besagte Änalyten "chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten aufgebracht sind.It is advantageous if areas between the discrete measurement areas are "passivated" to minimize non-specific binding of detection substances, i.e. that between the spatially separated measuring ranges compared to the analytes and other constituents of the applied samples and to the detection substances for said analytes "chemically neutral", i.e. these non-binding components are applied.
Besagte gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Nachweissubstanzen für besagte Änalyten „chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten können ausgewählt sein aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Änalyten unspezifischen Antikörpern (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycolen oder Dextranen, gebildet werden. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit kann es sich bei den in diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten beispielsweise um Verbindungen aus der Gruppe handeln, die von Proteinen, beispielsweise mono- oder polyklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten, Peptiden, Enzymen, Glycopeptiden, Oligosacchariden, Lektinen, Antigenen für Antikörper, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag- Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag-Proteinen") sowie Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA) gebildet wird. Bei den in diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten kann es sich auch um Verbindungen aus der Gruppe handeln, welche cytosolische oder membrangebundene Zellproteine, insbesondere an den Prozessen der Signaltransduktion in Zellen beteiligte Proteine, wie z. B. Kinasen, umfasst. Die Änalyten können auch biotechnisch modifizierte, beispielsweise mit lumineszenten bzw. fluoreszenten Gruppen und biologisch expremierte Biopolymere, wie beispielsweise mit „blue fluorescent proteins" (BFP), „green fluorescent proteins" (GFP) oder „red fluorescent proteins" (RFP) sein.Said compared to the analytes and other ingredients of the applied samples and to the detection substances for said analytes "chemically neutral", ie these non-binding components can be selected from the groups consisting of albumins, in particular bovine serum albumin or human serum albumin, casein, non-specific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies for the analyte (s) to be detected (especially for immunoassays), detergents - such as Tween 20 - that do not hybridize with polynucleotides to be analyzed, fragmented natural or synthetic DNA, such as an extract of herring or salmon sperm ( in particular for polynucleotide hybridization assays), or also uncharged but hydrophilic polymers, such as, for example, polyethylene glycols or dextrans. Without restricting the generality, the analytes to be detected contained in the samples applied in discrete measurement areas can, for example, be compounds from the group consisting of proteins, for example mono- or polyclonal antibodies and antibody fragments, peptides, enzymes, glycopeptides, oligosaccharides, lectins, antigens for antibodies, with additional binding sites functionalized proteins ("tag proteins", such as "histidine tag proteins") and nucleic acids (e.g. DNA, RNA) is formed. The analytes to be detected contained in the samples applied in discrete measurement areas can also be compounds from the group which contain cytosolic or membrane-bound cell proteins, in particular proteins involved in the processes of signal transduction in cells, such as, for. B. kinases. The analytes can also be biotechnically modified, for example with luminescent or fluorescent groups and biologically expressed biopolymers, for example with “blue fluorescent proteins” (BFP), “green fluorescent proteins” (GFP) or “red fluorescent proteins” (RFP).
Abhängig von der physikalischen Ausgestaltung der Evaneszentfeld-Sensorplattform gibt es für die messtechnische Art der Signalerzeugung beim Analytnachweis verschiedene Möglichkeiten. Eine mögliche Variante ist dadurch gekennzeichnet, dass die ortsaufgelöst zu messenden Änderungen optoelektronischer Signale, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, durch lokale Änderungen der Resonanzbedingungen zur Erzeugung eines Oberflächenplasmons in einer dünnen Metallschicht als Teil besagter Evaneszentfeld-Sensorplattform hervorgerufen werden.Depending on the physical design of the evanescent field sensor platform, there are various options for the metrological type of signal generation for analyte detection. A possible variant is characterized in that the spatially resolved changes in optoelectronic signals, as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measuring ranges in the samples, are caused by local changes in the resonance conditions to produce a surface plasmon in a thin metal layer as part of said evanescent field. Sensor platform are caused.
Messtechnisch sind für die Bestimmung von Änderungen der Resonanzbedingungen der Resonanzwinkel (bei Variation des Einstrahlungswinkels bei konstanter Wellenlänge des eingestrahlten Lichts) und die Resonanzwellenlänge (bei konstantem Einstrahlungswinkel und Variation der eingestrahlten Anregungswellenlänge) zugänglich. Entsprechend kann besagte Änderung der Resonanzbedingungen in einer Änderung des Resonanzwinkels für die Einstrahlung eines Anregungslichts zur Erzeugung eines Oberflächenplasmons in einer dünnen Metallschicht als Teil besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform bestehen. Entsprechend kann auch besagte Änderung der Resonanzbedingungen in einer Änderung der Resonanzwellenlänge eines eingestrahlten Anregungslichts zur Erzeugung eines Oberflächenplasmons in einer dünnen Metallschicht als Teil besagter Evaneszentfeld-Sensorplattform bestehen.In terms of measurement technology, the resonance angle (when the angle of incidence varies with a constant wavelength of the incident light) and the resonance wavelength (with constant angle of incidence and variation in the incident excitation wavelength) are accessible for determining changes in the resonance conditions. Accordingly, said change in the resonance conditions in a change in the resonance angle for the irradiation of an excitation light to generate a surface plasmon in a thin metal layer can be part of said Evanescent field sensor platform exist. Correspondingly, said change in the resonance conditions can also consist in a change in the resonance wavelength of an irradiated excitation light for generating a surface plasmon in a thin metal layer as part of said evanescent field sensor platform.
Die ortaufgelöst zu messenden Änderungen optoelektronischer Signale, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, können durch lokale Änderungen des effektiven Brechungsindex in diesen Bereichen auf besagter Evaneszentfeld-Sensorplattform hervorgerufen werden.The spatially resolved changes in optoelectronic signals, as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measurement areas in the samples, can be caused by local changes in the effective refractive index in these areas on said evanescent field sensor platform.
Eine andere wichtige Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die ortaufgelöst zu messenden Änderungen optoelektronischer Signale, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, durch lokale Änderungen einer oder mehrerer Lumineszenzen von innerhalb des evaneszenten Feldes besagter Evaneszentfeld-Sensorplattform befindlichen lumineszenzfähigen Molekülen hervorgerufen werden.Another important embodiment of the method according to the invention is characterized in that the spatially resolved changes in optoelectronic signals, as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measurement areas in the samples, by local changes in one or more luminescences from said evanescent field within the evanescent field -Luminescent molecules located sensor platform are caused.
Es wird bevorzugt, dass besagte Änderungen einer oder mehrerer Lumineszenzen von lumineszenzfähigen Molekülen oder lumineszenzfähigen Nanopartikeln stammen, welche als Lumineszenzlabel an eine oder mehrere Nachweissubstanzen für die in diskreten Messbereichen enthaltenen Änalyten gebunden sind.It is preferred that said changes in one or more luminescences originate from luminescent molecules or luminescent nanoparticles which are bound as luminescent labels to one or more detection substances for the analytes contained in discrete measurement areas.
Von besonderem Vorteil ist, wenn zum Analytnachweis zwei oder mehr Lumineszenzlabel mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen und / oder unterschiedlichen Anregungsspektren, bevorzugt mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen und gleicher Anregungswellenlänge, eingesetzt werden. Wenn mehrere Lumineszenzlabel mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften, insbesondere unterschiedlichen Emissionswellenlängen an unterschiedliche Nachweissubstanzen aus der zweiten Vielzahl spezifischer Bindungspartner, welche mit den Messbereichen in Kontakt gebracht wird, gebunden sind, können beispielsweise unterschiedliche Änalyten in einem einzigen Nachweisschritt, d.h. Kontaktierung der Messbereiche mit besagten Nachweissubstanzen und gleichzeitige oder nachfolgende Detektion der erzeugten Lumineszenzen, bestimmt werden.It is particularly advantageous if two or more luminescence labels with different emission wavelengths and / or different excitation spectra, preferably with different emission wavelengths and the same excitation wavelength, are used for analyte detection. If several luminescence labels with different spectral properties, in particular different emission wavelengths, are bound to different detection substances from the second plurality of specific binding partners, which are brought into contact with the measurement areas, for example different analytes can be bound in a single detection step, ie Contacting of the measuring areas with said detection substances and simultaneous or subsequent detection of the luminescence generated can be determined.
Beispielsweise ist eine solche Variante des erfindungsgemässen Verfahrens besonders gut dafür geeignet, gleichzeitig zum Beispiel die phoshorylierte und die nicht phosphorylierte Form einer Verbindung, insbesondere auch innerhalb eines einzelnen (gemeinsamen) Messbereiches nachzuweisen, mithilfe zweier entsprechender unterschiedlicher, in diesem Fall direkt (z. B. mit grün bzw. rot emittierenden Lumineszenzlabeln) markierter spezifischer Bindungspartner als Nachweissubstanzen.For example, such a variant of the method according to the invention is particularly well suited for simultaneously detecting, for example, the phoshorylated and the non-phosphorylated form of a compound, in particular also within a single (common) measuring range, with the aid of two corresponding different, in this case directly (e.g. specific binding partners marked with green or red emitting luminescence labels) as detection substances.
In ähnlicher Weise können gleichzeitig zwei oder mehr verschiedene Änalyten detektiert werden, wenn zum Analytnachweis zwei oder mehr Lumineszenzlabel mit unterschiedlichen Emissionsabklingzeiten eingesetzt werden.Similarly, two or more different analytes can be detected simultaneously if two or more luminescence labels with different emission decay times are used for analyte detection.
Für das erfindungsgemässe Verfahren wird also bevorzugt, dass zum Nachweis unterschiedlicher Änalyten in einer Probe zwei oder mehr Lumineszenzlabel verwendet werden. Ebenso wird bevorzugt, dass zum Nachweis unterschiedlicher Änalyten in einem Messbereich zwei oder mehr Lumineszenzlabel verwendet werden.It is therefore preferred for the method according to the invention that two or more luminescence labels are used to detect different analytes in a sample. It is also preferred that two or more luminescence labels are used to detect different analytes in one measuring range.
Von Vorteil ist ausserdem, wenn die Einstrahlung des Anregungslichts in Pulsen mit einer Dauer zwischen 1 fsec und 10 Minuten erfolgt und das Emissionslicht aus den Messbereichen zeitlich aufgelöst gemessen wird.It is also advantageous if the excitation light is irradiated in pulses with a duration between 1 fsec and 10 minutes and the emission light from the measuring ranges is measured in a temporally resolved manner.
Vorzugsweise umfasst die Evaneszentfeld-Sensorplattform als fester Träger einen optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten. Es kann sich dabei beispielsweise um einen faseroptischen Wellenleiter, bestehend aus mehreren Schichten handeln. Bevorzugt handelt es sich jedoch um einen planaren optischen Wellenleiter, welcher durchgehend über eine Oberfläche der Evaneszentfeld- Sensorplattform ausgebildet ist oder auch in diskrete wellenleitende Bereiche aufgeteilt sein kann, wie dieses beispielsweise in der Patentanmeldung WO 96/35940 beschrieben ist, deren Inhalt hiermit vollumfänglich in die vorliegende Anmeldung eingeführt wird. Besonders bevorzugt wird eine solche Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Evaneszentfeld- Sensorplattform als fester Träger einen planaren optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer im wesentlichen optisch transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer zweiten, ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und gegebenenfalls einer ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Zwischenschicht (b') zwischen Schicht (a) und Schicht (b) mit ebenfalls niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst.The solid-state evanescent field sensor platform preferably comprises an optical waveguide, comprising one or more layers. For example, it can be a fiber-optic waveguide consisting of several layers. However, it is preferably a planar optical waveguide which is formed continuously over a surface of the evanescent field sensor platform or can also be divided into discrete waveguiding areas, as is described, for example, in patent application WO 96/35940, the contents of which are hereby fully described in the present application is introduced. Such an embodiment of the method according to the invention is particularly preferred, which is characterized in that the evanescent field sensor platform as a solid support comprises a planar optical thin-film waveguide with an essentially optically transparent, waveguiding layer (a) on a second, likewise essentially optically transparent layer ( b) with a lower refractive index than layer (a) and optionally also an essentially optically transparent intermediate layer (b ') between layer (a) and layer (b) with a likewise lower refractive index than layer (a).
Das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen kann in eine wellenleitende Schicht der Evaneszentfeld-Sensorplattform über ein oder mehrere optische Koppelemente eingekoppelt werden, welche ausgewählt sind aus der Gruppe, die von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern gebildet wird.The excitation light from one or more light sources can be coupled into a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform via one or more optical coupling elements, which are selected from the group consisting of prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers one end face of the waveguiding layer arranged focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers is formed.
Es wird bevorzugt, dass die Einkopplung von Anregungslicht in eine wellenleitende Schicht der Evaneszentfeldsensorplattform mithilfe von einer oder mehreren Gitterstrukturen (c) erfolgt, die in der besagten wellenleitenden Schicht ausgeprägt sind.It is preferred that the excitation light is coupled into a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform with the aid of one or more grating structures (c) which are pronounced in the said wave-guiding layer.
Ausserdem wird bevorzugt, dass die Auskopplung von in einer wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld-Sensorplattform geführtem Licht mithilfe von einer oder mehreren Gitterstrukturen (c') erfolgt, die in besagter wellenleitender Schicht ausgeprägt sind und gleiche oder unterschiedliche Periode und Gittertiefe wie Gitterstrukturen (c) haben.In addition, it is preferred that the coupling out of light guided in a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform takes place with the aid of one or more grating structures (c ') which are pronounced in said waveguiding layer and have the same or different period and grating depth as grating structures (c) ,
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen über eine Gitterstruktur (c) in eine wellenleitende Schicht besagter Evaneszentfeld- Sensorplattform eingekoppelt und zu auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform befindlichen Messbereichen als geführte Welle geleitet wird, dass weiterhin die im evaneszenten Feld besagter geführter Welle erzeugte Lumineszenz von lumineszenzfähigen Molekülen mit einem oder mehreren Detektoren ortsaufgelöst erfasst und die relative Konzentration eines oder mehrerer Änalyten aus der relativen Intensität dieser Lumineszenzsignale bestimmt wird.A particularly preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that excitation light from one or more light sources is coupled via a grating structure (c) into a wave-guiding layer of said evanescent field sensor platform and is guided as a guided wave to measurement areas located on the evanescent field sensor platform, that the luminescence of. in the evanescent field of said guided wave Luminescent molecules are detected with one or more detectors in a spatially resolved manner and the relative concentration of one or more analytes is determined from the relative intensity of these luminescence signals.
Eine besondere Variante besteht dabei darin, dass neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden.A special variant consists in that, in addition to the determination of one or more luminescences, changes in the effective refractive index on the measurement areas are determined.
Für eine weitere Verbesserung der Empfindlichkeit kann dabei vorteilhaft sein, wenn die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden. Dabei wird bevorzugt, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.For a further improvement in sensitivity, it can be advantageous if the one or more luminescences and / or determinations of light signals are carried out polarization-selectively at the excitation wavelength. It is preferred that the one or more luminescences are measured with a different polarization than that of the excitation light.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine analytische Plattform zur Untersuchung einer Vielzahl „natur-identischer" Proben auf in den Proben enthaltene, als Teilnehmer an Bioaffinitätsreaktionen biologisch relevante Verbindungen als Änalyten, umfassendAnother object of the present invention is an analytical platform for examining a large number of “nature-identical” samples for compounds contained in the samples that are biologically relevant as participants in bioaffinity reactions, as analytes
- eine Evaneszentfeld-Sensorplattform als festen Träger- An evanescent field sensor platform as a solid support
- mindestens ein ein- oder zweidimensionales Array von diskreten Messbereichen mit darin immobilisierten Bindungspartnern auf besagter Evaneszentfeld- Sensorplattform für den Nachweis besagter Änalyten in einer Bioaffinitätsreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass besagte diskrete Messbereiche durch die Auftragung besagter „natur-identischer" Proben oder daraus hergestellter Verdünnungen, ohne Änderung der relativen molekularen Zusammensetzung, im Vergleich zur ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der Probe, mit den darin nachzuweisenden Änalyten, als einer ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern, erzeugt werden und es sich bei dem einen oder den mehreren immobilisierten Bindungspartnern, welche besagte erste Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern bilden, um den einen oder um die mehreren Änalyten selbst handelt, welche in besagten „natur-identischen" Probe enthalten sind. In den „natur-identischen" Proben enthaltene Proteine können in nativer Form oder denaturierter Form, nach Behandlung der „Ursprungsprobe" beispielsweise mit Harnstoff oder Tensiden (z. B. SDS) vorliegen.- at least one or two-dimensional array of discrete measurement areas with binding partners immobilized therein on said evanescent field sensor platform for the detection of said analytes in a bioaffinity reaction, characterized in that said discrete measurement areas by the application of said “nature-identical” samples or dilutions made therefrom , without changing the relative molecular composition, in comparison to the original relative molecular composition of the sample, with the analytes to be detected therein, as a first plurality of specific binding partners, and the one or more immobilized binding partners, which said first plurality form specific binding partners, which is the one or more analytes themselves, which are contained in said "nature-identical" sample. Proteins contained in the "nature-identical" samples can be present in native or denatured form after treatment of the "original sample", for example with urea or surfactants (eg SDS).
Bevorzugt liegen die „natur-identischen Proben", nach Behandlung mit Harnstoff, in denaturierter Form vor, wobei die Epitope der enthaltenen Änalyten für die Bindung ihrer jeweiligen Nachweissubstanzen, beispielsweise von Antikörpern, frei zugänglich sind. Dieses wird ermöglicht durch die Zerstörung der tertiären oder quarternären Struktur infolge der Behandlung mit Harnstoff.After treatment with urea, the "nature-identical samples" are preferably in denatured form, the epitopes of the analytes contained being freely accessible for the binding of their respective detection substances, for example antibodies. This is made possible by the destruction of the tertiary or quaternary structure due to treatment with urea.
Es wird bevorzugt, dass die Evaneszentfeld-Sensorplattform, zur Verbesserung des Haftvermögens der in diskreten Messbereichen aufgetragenen „natur-identischen" Proben oder von deren Verdünnungen, eine Haftvermittlungsschicht umfasst, auf welcher besagte Proben oder deren Verdünnungen aufgetragen werden.It is preferred that the evanescent field sensor platform, in order to improve the adhesiveness of the "nature-identical" samples applied in discrete measurement areas or of their dilutions, comprises an adhesion-promoting layer on which said samples or their dilutions are applied.
Vorzugsweise beträgt dabei die Dicke der Haftvermittlungsschicht weniger als 200 nm, besonders bevorzugt weniger als 20 nm.The thickness of the adhesion-promoting layer is preferably less than 200 nm, particularly preferably less than 20 nm.
Die Haftvermittlungsschicht kann Verbindungen umfassen aus der Gruppe von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren und "selbstorganisierten passiven oder funktionalisierten Mono- oder Mehrfachschichten", Thiolen, Alkylphosphaten und -phosphonaten, multifunktionellen Block-Copolymeren, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycolen.The adhesion-promoting layer can comprise compounds from the group of silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized passive or functionalized mono- or multilayers", thiols, alkyl phosphates and phosphonates, multifunctional block copolymers, such as, for example, poly ( L) lysine / polyethylene glycols.
Als besonders vorteilhaft hat sich erwiesen, wenn besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Gruppe von Organophosphorsäuren der allgemeinen Formel I (A)It has proven to be particularly advantageous if said adhesion promoter layer comprises compounds from the group of organophosphoric acids of the general formula I (A)
oder von Organophosphonsäuren der allgemeinen Formel I (B)or of organophosphonic acids of the general formula I (B)
und deren Salzen, in denen B einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Hetaryl- oder Hetarylalkylrest und Y Wasserstoff oder eine funktioneile Gruppe aus der Reihe Hydroxy, Carboxy, Amino, gegebenfalls durch Niederalkyl substituiertes Mono-oder Dialkylamino, Thiol, oder eine negative Säuregruppe aus der Reihe Ester, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Maleimid, Succinimydyl, Epoxy oder Acrylat bedeutet. and their salts, in which B is an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, hetaryl or hetarylalkyl radical and Y is hydrogen or a functional group from the series hydroxyl, carboxy, amino, optionally mono- or substituted by lower alkyl Dialkylamino, thiol, or a negative acid group from the series ester, phosphate, phosphonate, sulfate, sulfonate, maleimide, succinimydyl, epoxy or acrylate.
Es wird bevorzugt, dass die relative molekulare Zusammensetzung einer in einem Messbereich immobilisierten ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern als Änalyten mit der ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der dort aufgebrachten Probe übereinstimmt.It is preferred that the relative molecular composition of a first plurality of specific binding partners immobilized in a measuring area coincides as analytes with the original relative molecular composition of the sample applied there.
Eine aufgebrachte „natur-identische" Probe kann ausgewählt sein aus der Extrakten gesunder oder krankhafter Zellen, (z. B. von menschlichen, tierischen, bakteriellen oder pflanzlichen Zellextrakten), Extrakten von tierischem oder menschlichem Gewebe, wie beispielsweise Organ-, Haut-, Haar- oder Knochengewebe, oder von Pflanzengewebe, sowie von Körperflüssigkeiten oder deren Bestandteilen, wie beispielsweise Blut, Serum oder Plasma, Gelenkflüssigkeiten, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel, Gewebeflüssigkeit, Lymphe.An applied "nature-identical" sample can be selected from the extracts of healthy or pathological cells (eg from human, animal, bacterial or plant cell extracts), extracts from animal or human tissue, such as organ, skin, Hair or bone tissue, or from plant tissue, as well as from body fluids or their components, such as blood, serum or plasma, joint fluids, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid, lymph.
Insbesondere kann eine „natur-identische" Probe auch ausgewählt sein aus der Gruppe, welche Extrakte stimulierter oder unbehandelter Zellen und Extrakte gesunden oder krankhaften Gewebes umfasst.In particular, a "nature-identical" sample can also be selected from the group comprising extracts of stimulated or untreated cells and extracts of healthy or pathological tissue.
Besagte Proben können Proben aus einem Organismus oder Gewebe- oder Zellverband oder Zelle mittels einer Methode aus der Gruppe von Gewebeschnitten, Biopsie oder „Laser Capture Micro Dissection" entnommen sein.Said samples can be taken from an organism or tissue or cell assembly or cell by means of a method from the group of tissue sections, biopsy or “laser capture micro dissection”.
Eine aufgebrachte Probe kann das Material von weniger als 20000 Zellen, ja sogar von weniger als 1000 Zellen umfassen. Die Probe kann ein Volumen von weniger als 1 μl, ja sogar von weniger als 10 nl haben. Die erforderliche Probenmenge kann sogar das Material von weniger als 100 Zellen umfassen und noch verlässlich analysiert werden. Dieses ist dann der Fall, wenn es sich bei den nachzuweisenden Änalyten um in relativ hoher Konzentration auftretende Inhaltsstoffe handelt.An applied sample can comprise the material of less than 20,000 cells, even less than 1,000 cells. The sample can have a volume of less than 1 μl, even less than 10 nl. The required amount of sample can even include the material of less than 100 cells and can still be reliably analyzed. This is the case if the analytes to be detected are ingredients that occur in relatively high concentrations.
Eine oder mehrere besagter „natur-identischer" Proben können biologischen Organismen oder Gewebe- oder Zellverbänden oder Zellen entnommen und direkt (d.h. nach Lyse der Zellen) ohne weitere Verdünnung, auf besagtem festen Träger aufgetragen worden seinOne or more of said "nature-identical" samples can be taken from biological organisms or tissue or cell assemblies or cells and applied directly (i.e. after lysis of the cells) to said solid support without further dilution
Es ist auch möglich, dass eine oder mehrere besagter Proben vor der Auftragung auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger in einem flüssigen Verdünnungsmedium gelöst und / oder verdünnt wurden und unterschiedliche Verdünnungen einer Probe in unterschiedlichen diskreten Messbereichen auf besagter Evaneszentfeld-Sensorplattform aufgetragen wurden. Dabei können die Proben um mindestens eine Faktor 10 verdünnt werden. Die hohe Empfindlichleit der erfindungsgemässen analytischen Plattform ermöglicht es sogar, die Proben um einen Faktor 30 oder sogar 100 zu verdünnen und trotz dieser starken Verdünnung eine Vielzahl unterschiedlicher Änalyten jeweils innerhalb eines Messbereichs quantitativ zu bestimmen.It is also possible for one or more of said samples to be dissolved and / or diluted as a solid carrier in a liquid dilution medium prior to application on the evanescent field sensor platform, and for different dilutions of a sample to be applied to said evanescent field sensor platform in different discrete measurement ranges. The samples can be diluted by at least a factor of 10. The high sensitivity of the analytical platform according to the invention even makes it possible to dilute the samples by a factor of 30 or even 100 and, despite this strong dilution, to quantify a large number of different analytes within a measurement range.
Unterschiedliche aufgetragene Proben können dem gleichen Organismus oder gleichen Zellkulturen entnommen sein. Dabei können die Proben an verschiedenen Positionen des gleichen Organismus entnommen sein.Different applied samples can be taken from the same organism or the same cell culture. The samples can be taken from different positions of the same organism.
Unterschiedliche aufgetragene Proben können auch verschiedenen Organismen oder verschiedenen Zellkulturen entnommen sein.Different applied samples can also be taken from different organisms or different cell cultures.
Eine besondere Ausführungsform der erfindungsgemässen analytischen Plattform ist dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Proben vor ihrer Auftragung auf der Evaneszentfeld-Sensorplattform als festem Träger (zur Verbesserung des Haftvermögens auf besagtem festem Träger und Erhöhung der Gleichmässigkeit der Auftragung) mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) gemischt werden. Diese Variante des Verfahrens kann beispielsweise dazu beitragen, die Ausbildung von Inhomogenitäten der Verteilung des Probenmaterials innerhalb eines Messbereichs beim Prozess der Verdampfung der Probenflüssigkeit zu vermeiden, was zu einer besseren „Spot-Morphologie" führt und damit die Auswertung der Ergebnisse erleichtert. Dabei wird bevorzugt, dass besagte Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren oder chemischen „Cross- Linkern" ausgewählt ist aus der Gruppe, welche Lösungen von Polysacchariden, wie z. B. Agarose, oder von Acrylamiden oder von Glutaradehyd etc.umfasst.A particular embodiment of the analytical platform according to the invention is characterized in that one or more samples, before being applied to the evanescent field sensor platform, are used as a solid support (to improve the adhesion on said solid support and increase the uniformity of the application) with a solution of polymers or polymerisable Monomers, if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (e.g. glutaraldehyde). This variant of the method can, for example, help to avoid the formation of inhomogeneities in the distribution of the sample material within a measuring range during the process of evaporation of the sample liquid, which leads to a better “spot morphology” and thus facilitates the evaluation of the results that said solution of polymers or polymerizable monomers or chemical "cross-linkers" is selected from the group consisting of solutions of polysaccharides, such as. Agarose, or acrylamides or glutaradehyde, etc.
Eine solche spezielle Ausführungsform einer erfindungsgemässen analytischen Plattform ist auch dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung der einen oder mehreren Proben mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) in der Immobilisierung einer dreidimensionalen Netzwerkstruktur mit darin eingebundenen, für Nachweissubstanzen in dem nachfolgenden Schritt einer Bioaffinitätsreaktion zugänglichen. Damit kann ein höherer Grad der Oberflächenbedeckung der Evaneszentfeld-Sensoφlattform als eine Monoschicht erreicht werden, was zu einer weiteren Erhöhung der messbaren Signale beim Schritt des Analytnachweises führen kann. Wichtig ist dabei, dass die geschaffene Polymeren-Netzwerkstruktur sich nicht über die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ins Medium hinaus erstreckt, da ein Analytnachweis jenseits dieser Entfernung von der Oberfläche der Evaneszentfeld- Sensoφlattform nicht möglich ist und damit nicht mehr gewährleistet wäre, dass das Ergebnis der Analyse die ursprüngliche relative molekulare Zusammensetzung der Probe widerspiegeln würde.Such a special embodiment of an analytical platform according to the invention is also characterized in that the mixture of the one or more samples with a solution of polymers or polymerizable monomers, if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (eg glutaraldehyde ) in the immobilization of a three-dimensional network structure with integrated, accessible for detection substances in the subsequent step of a bioaffinity reaction.This enables a higher degree of surface coverage of the evanescent field sensor platform to be achieved than a monolayer, which leads to a further increase in the measurable signals in the step of analyte detection It is important that the created polymer network structure does not extend beyond the depth of penetration of the evanescent field into the medium, since an analyte detection beyond this distance from the surface of the evanescent field d- Sensoφlatform is not possible and would no longer be guaranteed that the result of the analysis would reflect the original relative molecular composition of the sample.
Vorteilhaft sind solche Ausführungsformen einer erfindungsgemässen analytischen Plattform, bei denen ein Array mehr als 50, bevorzugt mehr als 500, besonders bevorzugt mehr als 5000 Messbereiche umfasst.Such embodiments of an analytical platform according to the invention are advantageous in which an array comprises more than 50, preferably more than 500, particularly preferably more than 5000 measuring ranges.
Dabei kann jeder Messbereich eine zu anderen Messbereichen gleiche oder unterschiedliche immobilisierte „natur-identische" Probe oder immobilisierte Vergleichsprobe enthalten. Die Messbereiche eines Arrays sind in einer Dichte von mehr als 10, bevorzugt von mehr als 100, besonders bevorzugt von mehr als 1000 Messbereichen pro Quadratzentimeter angeordnet.Each measuring area can contain an immobilized "nature-identical" sample or immobilized comparative sample that is identical or different to other measuring areas. The measurement areas of an array are arranged in a density of more than 10, preferably more than 100, particularly preferably more than 1000 measurement areas per square centimeter.
Vorteilhaft ist auch eine solche Ausführungsform einer erfindungsgemässen analytischen Plattform, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass auf der Evaneszenzfeld-Sensoφlattform als festem Träger eine Vielzahl von Arrays von Messbereichen angeordnet sind. Insbesondere können auf der Evaneszenzfeld- Sensoφlattform mindestens 5, bevorzugt mindestens 50 Arrays von Messbereichen angeordnet sein. Besonders vorteihaft ist es, wenn unterschiedliche Arrays von Messbereichen einer solchen Variante einer erfindungsgemässen analytischen Plattform in unterschiedlichen Probenbehältnissen angeordnet sind. Beispielsweise in den Internationalen Patentanmeldungen WO 01/13096 und WO 01/43875 ist beschrieben, wie eine Evaneszentfeld-Sensoφlattform, welche für eine erfindungsgemässe analytische Plattform geeignet ist, als Bodenplatte mit einem geeigneten Aufsatzköφer zur Erzeugung eines geeigneten Arrays von Probenbehältnissen, jeweils für die Aufnahme eines Arrays von Messbereichen, kombiniert werden kann.Such an embodiment of an analytical platform according to the invention is also advantageous, which is characterized in that a multiplicity of arrays of measurement areas are arranged on the evanescence field sensor platform as a solid support. In particular, at least 5, preferably at least 50, arrays of measurement areas can be arranged on the evanescence field sensor platform. It is particularly advantageous if different arrays of measuring areas of such a variant of an analytical platform according to the invention are arranged in different sample containers. For example, international patent applications WO 01/13096 and WO 01/43875 describe how an evanescent field sensor platform, which is suitable for an analytical platform according to the invention, as a base plate with a suitable attachment body for producing a suitable array of sample containers, in each case for the receptacle of an array of measuring ranges can be combined.
Mit einer solchen Ausführungsform einer erfindungsgemässen analytischen Plattform wird eine experimentelle Konzeption ermöglicht, welche man als „multidimensional" bezeichnen kann: Beispielsweise können in den Zeilen und Spalten eines Arrays verschiedene Proben, beispielsweise von unterschiedlichen Organismen (z. B. entsprechend Spalten), in unterschiedlicher Verdünnung (z. B. entsprechend Zeilen) aufgebracht sein. Unterschiedliche Arrays von Messbereichen, in unterschiedlichen Probenbehältnissen, können dann mit unterschiedlichen zweiten Vielzahlen von spezifischen Bindungspartnern als Nachweissubstanzen zur Bestimmung unterschiedlicher immobilisierter Änalyten in unterschiedlichen Arrays in Kontakt gebracht werden. Es ist offensichtlich, dass sich mit einer solchen Variante einer erfindungsgemässen analytischen Plattform eine nahezu unbegrenzte Anzahl verschiedener Experimente durchführen lässt.With such an embodiment of an analytical platform according to the invention, an experimental conception is made possible, which can be described as "multidimensional": for example, different samples, for example of different organisms (e.g. corresponding columns), can be used in different ways in the rows and columns of an array Different arrays of measurement areas in different sample containers can then be brought into contact with different second varieties of specific binding partners as detection substances for determining different immobilized analytes in different arrays With such a variant of an analytical platform according to the invention, an almost unlimited number of different experiments can be carried out.
Von Vorteil ist weiterhin, wenn Bereiche zwischen den diskreten Messbereichen zur Minimierung unspezifischer Bindung von Nachweissubstanzen "passiviert sind", d.h. dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Nachweissubstanzen für besagte Änalyten "chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten aufgebracht sind.It is also advantageous if areas between the discrete measurement areas are "passivated" to minimize non-specific binding of detection substances, ie that "chemically neutral", ie non-binding, components are applied between the spatially separated measuring areas with respect to the analytes and other constituents of the applied samples and with respect to the detection substances for said analytes.
Besagte gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Nachweissubstanzen für besagte Änalyten „chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten können ausgewählt sein aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Änalyten unspezifischen Antiköφern (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycolen oder Dextranen, gebildet werden.Said compared to the analytes and other ingredients of the applied samples and to the detection substances for said analytes "chemically neutral", ie these non-binding components can be selected from the groups consisting of albumins, in particular bovine serum albumin or human serum albumin, casein, non-specific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies for the analyte (s) to be detected (especially for immunoassays), detergents - such as Tween 20 - that do not hybridize with analyzed polynucleotides, fragmented natural or synthetic DNA, such as an extract of herring or salmon sperm ( in particular for polynucleotide hybridization assays), or also uncharged but hydrophilic polymers, such as, for example, polyethylene glycols or dextrans.
Ohne Beschränkung der Allgemeinheit kann dass es sich bei den in diskreten Messbereichen einer erfindungsgemässen analytischen Plattform aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten um Verbindungen aus der Gruppe handeln, die von Proteinen, beispielsweise mono- oder polyklonalen Antiköφern und Antiköφerfragmenten, Peptiden, Enzymen, Glycopeptiden, Oligosacchariden, Lektinen, Antigenen für Antiköφer, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag-Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag- Proteinen") sowie Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA) gebildet wird.Without restricting generality, the analytes to be detected contained in the discrete measurement areas of an analytical platform according to the invention can be compounds from the group consisting of proteins, for example mono- or polyclonal antibodies and antibody fragments, peptides, enzymes, glycopeptides, oligosaccharides , Lectins, antigens for antibodies, with additional binding sites functionalized proteins ("tag proteins", such as "histidine tag proteins") and nucleic acids (e.g. DNA, RNA) is formed.
Insbesondere kann es sich bei den in diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten um Verbindungen aus der Gruppe handeln, welche cytosolische oder membrangebundene Zellproteine, insbesondere an den Prozessen der Signaltransduktion in Zellen beteiligte Proteine, wie z. B. Kinasen, umfasst. . Die Änalyten können auch biotechnisch modifizierte, beispielsweise mit lumineszenten bzw. fluoreszenten Gruppen und biologisch expremierte Biopolymere, wie beispielsweise mit „blue fluorescent proteins" (BFP), „green fluorescent proteins" (GFP) oder „red fluorescent proteins" (RFP) sein.In particular, the analytes to be detected contained in the samples applied in discrete measurement areas can be compounds from the group which contain cytosolic or membrane-bound cell proteins, in particular proteins involved in the processes of signal transduction in cells, such as, for. B. kinases. , The analytes can also be biotechnically modified, for example with luminescent or fluorescent groups and biologically expressed biopolymers, such as with "blue fluorescent proteins" (BFP), "green fluorescent proteins" (GFP) or "red fluorescent proteins" (RFP).
Eine spezielle Variante einer erfindungsgemässen analytischen Plattform ist dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld-Sensoφlattform, als Bestandteil der analytischen Plattform, eine dünne Metallschicht, gegebenenfalls auf einer darunter befindlichen Zwischenschicht mit Brechungsindex vorzugsweise < 1.5, wie beispielsweise Siliciumdioxid oder Magnesiumfluorid, umfasst, wobei die Dicke der Metallschicht und der eventuellen Zwischenschicht so ausgewählt ist, dass ein Oberflächenplasmon bei der Wellenlänge eines eingestrahlten Anregungslichts und / oder bei der Wellenlänge einer erzeugten Lumineszenz angeregt werden kann.A special variant of an analytical platform according to the invention is characterized in that the evanescent field sensor platform, as part of the analytical platform, comprises a thin metal layer, optionally on an intermediate layer underneath with a refractive index, preferably <1.5, such as silicon dioxide or magnesium fluoride, the thickness the metal layer and the possible intermediate layer is selected such that a surface plasmon can be excited at the wavelength of an irradiated excitation light and / or at the wavelength of a luminescence generated.
Dabei wird bevorzugt, dass das Metall ausgewählt ist aus der Gruppe, welche Gold und Silber umfasst. Ausserdem wird bevorzugt, dass die Metallschicht eine Dicke zwischen 10 nm und 1000 nm, bevorzugt zwischen 30 nm und 200 nm, hat.It is preferred that the metal is selected from the group comprising gold and silver. In addition, it is preferred that the metal layer has a thickness between 10 nm and 1000 nm, preferably between 30 nm and 200 nm.
Vorzugsweise umfasst die Evaneszentfeld-Sensoφlattform als fester Träger einen optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten. Es kann sich dabei beispielsweise um einen faseroptischen Wellenleiter, bestehend aus mehreren Schichten handeln. Bevorzugt handelt es sich jedoch um einen planaren optischen Wellenleiter, welcher durchgehend über eine Oberfläche der Evaneszentfeld- Sensoφlattform ausgebildet ist oder auch in diskrete wellenleitende Bereiche aufgeteilt sein kann, wie dieses beispielsweise in der Patentanmeldung WO 96/35940 beschrieben ist.The evanescent field sensor platform preferably comprises, as a solid support, an optical waveguide comprising one or more layers. For example, it can be a fiber-optic waveguide consisting of several layers. However, it is preferably a planar optical waveguide which is formed continuously over a surface of the evanescent field sensor platform or can also be divided into discrete waveguiding regions, as is described, for example, in patent application WO 96/35940.
Besonders bevorzugt wird eine solche Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Evaneszentfeld- Sensoφlattform als fester Träger einen planaren optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer im wesentlichen optisch transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer zweiten, ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und gegebenenfalls einer ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Zwischenschicht (b') zwischen Schicht (a) und Schicht (b) mit ebenfalls niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst. Vorzugsweise ist eine erfindungsgemässe analytische Plattform so gestaltet, dass eine wellenleitende Schicht der Evaneszenzfeld-Sensoφlattform mit einem oder mehreren optischen Koppelelementen in optischem Kontakt steht, welche die Einkopplung von Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in die besagte wellenleitende Schicht ermöglichen, wobei besagte optische Koppelelemente ausgewählt sind aus der Gruppe von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der besagten wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld-Sensoφlattform angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern.Such an embodiment of the method according to the invention is particularly preferred, which is characterized in that the evanescent field sensor platform as a solid support has a planar optical thin-film waveguide with an essentially optically transparent, waveguiding layer (a) on a second, also essentially optically transparent layer ( b) with a lower refractive index than layer (a) and optionally also an essentially optically transparent intermediate layer (b ') between layer (a) and layer (b) with a likewise lower refractive index than layer (a). An analytical platform according to the invention is preferably designed in such a way that a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform is in optical contact with one or more optical coupling elements, which enable the coupling of excitation light from one or more light sources into said wave-guiding layer, wherein said optical coupling elements are selected are from the group of prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers with focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers arranged in front of one end face of said waveguiding layer of the evanescent field sensor platform.
Besonders bevorzugt wird, wenn in einer wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld- Sensoφlattform eine oder mehrere Gitterstrukturen (c) ausgeprägt sind, welche die Einkopplung von Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen ermöglichen.It is particularly preferred if, in a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform, one or more grating structures (c) are formed, which enable the coupling of excitation light from one or more light sources.
Vorteilhaft ist ausserdem, wenn in einer wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld- Sensoφlattform eine oder mehrere Gitterstrukturen (c') mit gleicher oder unterschiedlicher Gitteφeriode und Gittertiefe wie Gitterstrukturen (c) ausgeprägt sind, welche die Auskopplung von in besagter wellenleitender Schicht geführtem Licht ermöglichen.It is also advantageous if, in a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform, one or more grating structures (c ') with the same or different grating period and grating depth as grating structures (c) are formed, which enable the coupling out of light guided in said waveguiding layer.
Weitere Ausführungsformen von Evaneszenzfeld-Sensoφlattformen, welche für eine erfindungsgemässe analytische Plattform geeignet sind, sind beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 95/33197, WO 95/33198 und WO96/35940 beschrieben, welche hiermit ebenfalls vollumfänglich als Bestandteil der vorliegenden Erfindung eingeführt werden.Further embodiments of evanescent field sensor platforms which are suitable for an analytical platform according to the invention are described, for example, in patent applications WO 95/33197, WO 95/33198 and WO96 / 35940, which are also hereby fully introduced as part of the present invention.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemässen Verfahrens oder einer erfindungsgemässen analytischen Plattform zu quantitativen und / oder qualitativen Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Änalyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik und die Bestimmung von genomischen oder proteomischen Unterschieden im Genom, wie beispielsweise Einzelnukleotid-Polymoφhismen, zur Messung von Protein-DNA- wechselwirkungen, zur Bestimmung von Steuerungsmechanismen für die m-RNA- Expression und für die Protein(bio)synthese, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofilen, insbesondere zur Bestimmung von biologischen und chemischen Markerstoffen, wie mRNA, Proteinen, Peptiden oder niedermolekularen organischen (Boten-)Stoffen, sowie zum Nachweis von Antiköφern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Protduktforschung und -entwicklung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktforschung und -entwicklung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischehn Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregem, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, insbesondere in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.Another object of the present invention is the use of a method according to the invention or an analytical platform according to the invention for quantitative and / or qualitative analyzes for the determination of chemical, biochemical or biological analytes in screening methods in pharmaceutical research, combinatorial chemistry, clinical and preclinical development, for real-time binding studies and for the determination of kinetic parameters in affinity screening and in research, on qualitative and quantitative Analyte determinations, in particular for DNA and RNA analysis and the determination of genomic or proteomic differences in the genome, such as, for example, single nucleotide polymorphisms, for measuring protein-DNA interactions, for determining control mechanisms for m-RNA expression and for protein (bio) synthesis, for the preparation of toxicity studies and for the determination of expression profiles, in particular for the determination of biological and chemical marker substances such as mRNA, proteins, peptides or low-molecular organic (messenger) substances, as well as for the detection of antibodies, antigens , Pathogens or bacteria in pharmaceutical product research and development, human and veterinary diagnostics, agrochemical product research and development, symptomatic and presymptomatic plant diagnostics, for patient stratification in pharmaceutical product development and for therapeutic medication selection ahl, for the detection of pathogens, pollutants and pathogens, especially salmonella, prions, viruses and bacteria, especially in food and environmental analysis.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen weiter erläutert, wobei die dort beschriebenen Ausführungsformen keine Einschränkung der Allgemeinheit bedeuten. The invention is explained in more detail below on the basis of exemplary embodiments, the embodiments described there not implying any restriction of generality.
BeispieleExamples
1. Analytische Plattform1. Analytical platform
1.1. Evaneszentfeld-Sensorplattform1.1. Evanescent field sensor platform
Als analytische Plattform dient eine Evaneszentfeld-Sensoφlattform als fester Träger mit den Abmessungen 14 mm Breite x 57 mm Länge x 0.7 mm Dicke. Die Evaneszentfeld-Sensoφlattform ist als ein Dünnschichtwellenleiter ausgeprägt, umfassend ein Glasssubstrat (AF 45) und eine darauf aufgebrachte 150-nm dünne, hochbrechende Schicht aus Tantalpentoxid. In dem Glassubstrat sind, parallel zur Länge, zwei Oberflächenreliefgitter (Gitteφeriode: 318 nm, Gittertiefe: (12 +/- 2) nm) im Abstand von 9 mm moduliert. Bei der nachfolgenden Auftragung der hochbrechenden Schicht wurden diese Strukturen, die als diffraktive Gitter der Lichteinkopplung in die hochbrechende Schicht dienen sollen, in die Oberfläche der Tantalpentoxidschicht übertragen.An evanescent field sensor platform serves as an analytical platform as a solid support with the dimensions 14 mm width x 57 mm length x 0.7 mm thickness. The evanescent field sensor platform is designed as a thin-film waveguide, comprising a glass substrate (AF 45) and a 150 nm thin, highly refractive layer of tantalum pentoxide applied thereon. In the glass substrate, parallel to the length, two surface relief gratings (Gitteφeriode: 318 nm, grating depth: (12 +/- 2) nm) are modulated at a distance of 9 mm. In the subsequent application of the high refractive index layer, these structures, which are intended to serve as diffractive gratings for coupling light into the high refractive index layer, were transferred into the surface of the tantalum pentoxide layer.
Nach sorgfältiger Reinigung der Evaneszentfeld-Sensoφlattform wird auf der Oberfläche der Metalloxidschicht eine Monoschicht aus Mono-Dodecylphosphat (DDP) durch spontane Selbstorganisation als Haftvermittlungsschicht erzeugt, mittels Abscheidung aus wässriger Lösung (0.5 mM DDP). Diese Oberflächenmodifikation der zuvor hydrophilen Metalloxidoberfläche führt zu einer hydrophoben Oberfläche (mit einem Kontaktwinkel von etwa 100° gegenüber Wasser), auf der eine Vielzahl „natur-identischer" Proben mit darin enthaltenen Änalyten als spezifischen Bindungspartnern für den Analytnachweis in einer spezifischen Bindungsreaktion aufgetragen werden sollen.After careful cleaning of the evanescent field sensor platform, a monolayer of mono-dodecyl phosphate (DDP) is created on the surface of the metal oxide layer by spontaneous self-organization as an adhesion-promoting layer, by means of deposition from aqueous solution (0.5 mM DDP). This surface modification of the previously hydrophilic metal oxide surface leads to a hydrophobic surface (with a contact angle of approximately 100 ° with respect to water) on which a large number of “nature-identical” samples with analytes contained therein are to be applied as specific binding partners for the analyte detection in a specific binding reaction ,
Auf den mit der hydrophoben Haftvermittlungsschicht versehenen Evaneszentfeld- Sensoφlattformen werden 6 identische Mikroarrays von je 90 Messbereichen (Spots), ihrerseits in einer Anordnung von jeweils 10 Reihen und 9 Spalten, mit einem Inkjet- Spotter (Modell BCA1, Perkin Eimer, Boston, MA,USA) aufgetragen. Jeder Spot wird durch die Auftragung eines einzelnen Tröpfchens von 280 pL Volumen auf die Chipoberfläche erzeugt. 1.2. Reagentien und Erzeugung der Arrays von Messbereichen6 identical microarrays, each with 90 measuring ranges (spots), each in an arrangement of 10 rows and 9 columns, with an inkjet spotter (model BCA1, Perkin Eimer, Boston, MA,) are placed on the evanescent field sensor platforms provided with the hydrophobic adhesive layer. USA) applied. Each spot is created by applying a single droplet of 280 pL volume to the chip surface. 1.2. Reagents and generation of arrays of measuring areas
Für den Nachweis von biologisch relevanten Proteinanalyten in „natur-identischen" Proben werden humane T-Zell-Kulturen (Jurkat, DMZ # ACC282) benutzt. Diese Zellen werden in einer Lösung enthaltend RPMI 1640, 10% FCS (Fötales Rinderserum), 2mM Glutamin, 50 U/ml Penicillin, 50 / g/ml Streptamycin bei 37°C kultiviert (Zelldichte ca. 0.5-1.0 x 106 Zellen/ml). Diese Zellen werden dann mit Antiköφern, nämlich „Maus-anti-human-CD3" („mouse-α-human-CD3") bzw. („Maus-anti-Human-CD28") („mouse-α-human-CD28"), gegen die Oberflächenrezeptoren CD3 bzw. CD28 (in einer Lösung von je 1 μg/ml für 10 min) inkubiert. Für eine Vergleichsprobe zu den mit den Antiköφern behandelten Zellkulturen wird eine ansonsten gleichartige Zellkultur benutzt, die unbehandelt blieb und im analytischen Nachweisverfahren als Negativ-Kontrolle dienen wird. Eine weitere ansonsten gleichartige Zellkultur wird mit Staurosporin (Konzentration: 10 μM), einem starken Proteinkinase-Inhibitor, 180 min lang behandelt.Human T-cell cultures (Jurkat, DMZ # ACC282) are used for the detection of biologically relevant protein analytes in "nature-identical" samples. These cells are in a solution containing RPMI 1640, 10% FCS (fetal bovine serum), 2mM glutamine , 50 U / ml penicillin, 50 / g / ml streptamycin cultivated at 37 ° C. (cell density approx. 0.5-1.0 x 10 6 cells / ml). These cells are then treated with antibodies, namely “mouse anti-human CD3” ("Mouse-α-human-CD3") or ("mouse-anti-human-CD28") ("mouse-α-human-CD28"), against the surface receptors CD3 or CD28 (in a solution of 1 μg / ml for 10 min) For a comparison sample to the cell cultures treated with the antibodies, an otherwise identical cell culture is used, which remained untreated and will serve as a negative control in the analytical detection method. Another otherwise identical cell culture is mixed with staurosporine (concentration : 10 μM), a strong protein kinase inhibitor, 180 min l treated nec.
Anschliessend werden die so behandelten bzw. unbehandelten Zellkulturen auf 4°C gekühlt und 2 Minuten bei einer Zentrifugationskraft von 350 x g pelletiert (Zellzahl ca. 107). Dabei werden die Zellen lediglich, ohne Schädigung, vom Medium getrennt. Danach wird der Überstand dekantiert und Lysepuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 1% DTT, 4 mM Sper idin und Complete (Proteaseinhibitor, Röche AG, 1 Tablette/50 ml)) zugegeben, wobei die Totalproteinkonzentration auf etwa 10 mg/ml eingestellt wird.. Alle proteinhaltigen Zellbestandteile werden hierbei spontan und vollständig denaturiert und solubilisiert.The cell cultures treated or untreated in this way are then cooled to 4 ° C. and pelleted for 2 minutes at a centrifuging force of 350 × g (cell number approx. 10 7 ). The cells are only separated from the medium without damage. The supernatant is then decanted and lysis buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT, 4 mM Sper idin and Complete (protease inhibitor, Röche AG, 1 tablet / 50 ml)) is added, the total protein concentration being about 10 mg / ml is set. All protein-containing cell components are spontaneously and completely denatured and solubilized.
Die Behandlung mit den genannten Antiköφern dient als Modellsystem für die co- stimulatorische Aktivierung von humanen T-Zellen (M. Diehn et al., „Genomic expression programs and the Integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation", Proceedings of the National Academy of Sciences 99 (2002) 11796 - 11801). Die Bindung besagter Antiköφer an zellmembrangebundene Rezeptoren löst eine Phosphorylierangskaskade mit anschlossenen, unterschiedlichen Signalwegen innerhalb der betroffenen Zellen aus. Die Aktivität eines bestimmten Signal wegs lässt sich hierbei durch die Bestimmung des Phosphorylierungsgrades eines entsprechenden involvierten Schlüsselproteins (als einem sogenannten „Markeφrotein") oder dessen Substrats nachweisen, was mithilfe einer erfindungsgemässen analytischen Plattform durchgeführt werden soll.Treatment with the antibodies mentioned serves as a model system for the stimulatory activation of human T cells (M. Diehn et al., "Genomic expression programs and the Integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation", Proceedings of the National Academy of Sciences 99 (2002) 11796 - 11801. The binding of said antibodies to cell membrane-bound receptors triggers a phosphoryl long cascade with connected, different signaling pathways within the affected cells. The activity of a specific signaling pathway can be determined by determining the degree of phosphorylation of a corresponding one Key protein (as a so-called "Brandφrotein") or its substrate demonstrate what is to be carried out using an analytical platform according to the invention.
Als Referenzmethode zu dem erfindungsgemässen Verfahren wird eine Westem-Blot Analyse durchgeführt.A Western blot analysis is carried out as a reference method for the method according to the invention.
Die mithilfe der vorangehend beschriebenen Vorbereitungsschritte gewonnenen Proben werden nochmals um einen Faktor 10 auf eine Totalproteinkonzentration von etwa 1 mg/ml verdünnt und dann als „natur-identische" Proben in diskreten Messbereichen zur Erzeugung eines Arrays von Messbereichen auf der mit der Haftvermittlungsschicht versehenen Evaneszentfeld-Sensoφlattform aufgetragen.The samples obtained using the preparatory steps described above are again diluted by a factor of 10 to a total protein concentration of about 1 mg / ml and then as "nature-identical" samples in discrete measurement areas to produce an array of measurement areas on the evanescent field provided with the adhesion-promoting layer. Sensoφlattform applied.
Zusätzlich zu den Messbereichen mit darin aufgebrachten „natur-identischen" Proben enthält jedes Mikroarray weitere Messbereiche mit darin immobilisiertem Cy5- fluoreszenzmarkiertem Rinderseramalbumin (Cy5-BSA), die zur Referenzierang von lokalen Unterschieden und / oder zeitlichen Variationen der Anregungslichtintensität bei der Messung verwendet werden („Referenz-Spots"). Cy5-BSA wird in einer Konzentration von 1.0 nM in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7.4) aufgetragen (Markierungsrate: 3 Cy5-Moleküle pro BSA-Molekül).In addition to the measurement areas with "nature-identical" samples applied to them, each microarray contains further measurement areas with Cy5 fluorescence-labeled bovine seramalbumin (Cy5-BSA) immobilized therein, which are used to reference local differences and / or temporal variations in the excitation light intensity during the measurement ( "reference spots"). Cy5-BSA is applied in a concentration of 1.0 nM in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) (labeling rate: 3 Cy5 molecules per BSA molecule).
Nach Aufbringen der „natur-identischen" Proben und Cy5-BSA wird die analytische Plattform zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und 100 % relativer Luftfeuchte gelagert und anschliessend bei Raumluft getrocknet. Dann werden die freien, nicht protein-bedeckten, hydrophoben Oberflächenbereiche der Evaneszentfeldsensor- Plattform mit Rinderseramalbumin (BS A) abgesättigt, indem die Oberfläche mit einer Lösung von BSA (30 mg/ml) in 50 mM Imidazol / 100 mM NaCl (pH 7.4) inkubiert wird. Danach wird die Evaneszentfeldsensor-Plattform mit den darauf erzeugten Messbereichen mit Wasser gewaschen und anschliessend in einem Stickstoffstrom getrocknet und bei 4°C bis zur Durchführung des erfindungsgemässen Nachweisverfahrens gelagert.After applying the "nature-identical" samples and Cy5-BSA, the analytical platform is stored for two hours at room temperature and 100% relative humidity and then dried in room air. Then the free, non-protein-covered, hydrophobic surface areas of the evanescent field sensor platform Saturated with bovine seramalbumin (BS A) by incubating the surface with a solution of BSA (30 mg / ml) in 50mM imidazole / 100mM NaCl (pH 7.4), then watering the evanescent field sensor platform with the measuring areas created on it washed and then dried in a stream of nitrogen and stored at 4 ° C. until the detection method according to the invention has been carried out.
Die Geometrie einer typischen Anordnung der Messbereiche in einem zweidimensionalen Array und eine lineare Anordnung von sechs (identischen) Arrays auf einer Evaneszentfeldsensor-Plattform ist in Figur 1 dargestellt (für die Beispiele, die anhand von Figur 3A/B bzw. Figur 4A B genauer besprochen werden) . Der Durchmesser der Spots, mit einem Abstand (Zentrum-zu-Zentram) von 600 μm, beträgt etwa 90 μm. Ein Array von Messbereichen umfasst für diese Beispiele jeweils eine Anordnung von Messbereichen mit 8 verschiedenen, in 5 Replikaten aufgetragenenen Proben, wobei die 5 gleichartigen Messbereiche jeweils in einer gemeinsamen Spalte senkrecht zur Aubreitungsrichtung des während des Detektionsschritts in der wellenleitenden Schicht der analytischen Plattform geführten Lichts angeordnet sind. Mithilfe der jeweils 5 gleichartigen Messbereiche soll die Reproduzierbarkeit der Mess-Signale innerhalb des Arrays von Messbereichen bestimmt werden. Zwischen und neben den Spalten von Messbereichen mit darin aufgebrachten zu anylsierenden Proben sind jeweils Spalten von Messbereichen mit darin aufgebrachtem Cy5-BSA (zu Referenzierungszwecken) angeordnet. Die erfindungsgemässe analytische Plattform umfasst in diesem Beispiel 6 gleichartige derartige Arrays von Messbereichen, wie in Figur 1 dargestellt.The geometry of a typical arrangement of the measurement areas in a two-dimensional array and a linear arrangement of six (identical) arrays on an evanescent field sensor platform is shown in FIG. 1 (for the examples, which are discussed in more detail with reference to FIG. 3A / B or FIG. 4A B). The diameter of the spots, with a distance (center-to-center) of 600 μm, is approximately 90 μm. For these examples, an array of measurement areas each comprises an arrangement of measurement areas with 8 different samples applied in 5 replicates, the 5 identical measurement areas each being arranged in a common column perpendicular to the direction of propagation of the light guided in the waveguiding layer of the analytical platform during the detection step are. The reproducibility of the measurement signals within the array of measurement areas is to be determined using the 5 identical measurement areas in each case. Columns of measuring areas with Cy5-BSA applied therein (for reference purposes) are arranged between and next to the columns of measuring areas with samples to be anylated. In this example, the analytical platform according to the invention comprises 6 such arrays of measurement areas of the same type, as shown in FIG. 1.
2. Analytisches Nachweisverfahren 2.1. Assay- Architektur2. Analytical detection method 2.1. Assay architecture
Der Nachweis bestimmter Proteine allgemein (d. h. z. B. mit oder ohne Phosphorylierung) bzw. bestimmter Proteine speziell in aktivierter (z.B. phosphorylierter) Form in den immobilisierten Zell-Lysaten als in diskreten Messbereichen aufgetragenen „natur-identischen" Proben erfolgt mithilfe sequentieller Zugabe entsprechender Nachweisreagentien als Assay-Schritten vor der Vermessung der resultierenden Fluoreszenzsignale: Zur Vorbereitung für einen ersten Assay-Schritt werden polyklonale analytspezifische Kaninchen- Antiköφer (Antiköφer AI (#2261): Phospho-(Ser) PKC Substrat; Antiköφer A2 (#9611): Phosρho-(Ser/Thr) Akt Substrat; Antiköφer A3 (#9101): Phospho-p44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr204); Antiköφer A4 (#9102): p44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr204); alle Antiköφer bezogen von Cell Signaling Technology, INC., Beverly, MA, USA) typischerweise im Verhältnis 1:500 in Assay-Puffer (50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% Tween 20 pH 7.4) verdünnt. Von diesen vier verschiedenen Antiköφerlösungen werden jeweils 30 μ\ auf jeweils eines der 6 identischen Arrays von Messbereichen aufgebracht, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht (Erster Assay-Schritt). Überschüssige, nicht spezifisch gebundene Antiköφer werden durch Waschen eines jeden Arrays mit Assaypuffer (5x100 ul) entfernt.The detection of certain proteins in general (ie with or without phosphorylation) or certain proteins especially in activated (eg phosphorylated) form in the immobilized cell lysates as "nature-identical" samples applied in discrete measurement areas is carried out with the sequential addition of appropriate detection reagents as Assay steps before measuring the resulting fluorescence signals: In preparation for a first assay step, polyclonal analyte-specific rabbit antibodies (Antiköφer AI (# 2261): Phospho- (Ser) PKC substrate; Antiköφer A2 (# 9611): Phosρho- ( Ser / Thr) Akt substrate; Antibodies A3 (# 9101): Phospho-p44 / 42 MAP Kinase (Thr202 / Tyr204); Antibodies A4 (# 9102): p44 / 42 MAP Kinase (Thr202 / Tyr204); all antibodies obtained from Cell Signaling Technology, INC., Beverly, MA, USA) typically diluted 1: 500 in assay buffer (50mM imidazole, 100mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% Tween 20 pH 7.4), of these four different ones Antibody solutions are applied 30 μ \ each to one of the 6 identical arrays of measuring areas, followed by incubation at room temperature overnight (first assay step). Excess, not specific bound antibodies are removed by washing each array with assay buffer (5x100 µl).
Die hier benutzten 4 verschiedenen Antiköφer sind grundsätzlich unterschiedlicher Natur: Antiköφer AI und A2 erkennen und binden eine Reihe unterschiedlicher, an Serin bzw. Serin/Threonin phosphorylierten Proteinen, welche Proteinkinasen als Substrate dienen. Dieses ist an der Vielzahl der Banden im Westem-Blot zu erkennen (Figur 2A und Abschnitt 2.4, "Ergebnisse"). Antiköφer A3 und A4 erkennen und binden die gleiche Art von Verbindung, nämlich die p44/42 MAP-Kinase (auch Erk2 genannt), wobei jedoch Antiköφer A3 nur dessen phosphorylierte „aktive" Form (pErk2) erkennt, während Antiköφer A4 beide Formen (die nicht phosphorylierte Form Erk2 und die phosphorylierte Form pErk2) erkennt und daran bindet.The 4 different antibodies used here are fundamentally different in nature: Antibodies AI and A2 recognize and bind a number of different proteins phosphorylated on serine or serine / threonine, which serve as substrates for protein kinases. This can be seen from the large number of bands in the western blot (FIG. 2A and section 2.4, "Results"). Antibodies A3 and A4 recognize and bind the same type of compound, namely the p44 / 42 MAP kinase (also known as Erk2), although antibody A3 only recognizes its phosphorylated "active" form (pErk2), whereas antibody A4 recognizes both forms (the recognizes and binds non-phosphorylated form Erk2 and the phosphorylated form pErk2).
Für den Nachweis von in disketen Messbereichen an dort in den immobilisierten „natur-identischen" Proben enthaltene gebundene analytspezifische Antiköφer erfolgt ein zweiter Assay-Schritt unter Benutzung eines Cy5-markierten anti-Kaninchen- Antiköφers (Amersham Biosciences, Dübendorf, CH), welches an alle vorangehend genannten Antiköφer AI - A4 bindet. Dieser Cy5-markierte Antiköφer wird in einer Konzentration von typischerweise 10 nM in Assay-Puffer auf die Arrays aufgebracht (je 30 μl) und damit anschliessend 2 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert wird. Anschliessend werden die Arrays mit Assaypuffer (jeweils fünfmal mit 100 μl) gewaschen, um nicht spezifisch gebundene Cy5-anti-Kaninchen Antiköφer zu entfernen. Danach werden die so vorbereiteten analytischen Plattformen bis zum Detektionsschritt mittels Anregung und Detektion resultierender Fluoreszenzsignale im ZeptoREADER™ (siehe unten) gelagert.For the detection of bound analyte-specific antibodies contained in discrete measurement areas on the immobilized “nature-identical” samples, a second assay step is carried out using a Cy5-labeled anti-rabbit antibody (Amersham Biosciences, Dübendorf, CH) binds all of the above-mentioned antibodies AI - A4 This Cy5-labeled antibody is applied to the arrays in a concentration of typically 10 nM in assay buffer (30 μl each) and is then incubated for 2 hours at room temperature in the dark the arrays are washed with assay buffer (five times with 100 μl) to remove non-specifically bound Cy5-anti-rabbit antibodies, and the analytical platforms prepared in this way are stored in the ZeptoREADER ™ until the detection step by means of excitation and detection of resulting fluorescence signals (see below) ,
2.2. Bestimmung der Fluoreszenzsignale aus den Arrays von Messbereichen2.2. Determination of the fluorescence signals from the arrays of measurement areas
Die Fluoreszenzsignale aus den verschiedenen Arrays von Messbereichen werden mit einem ZeptoREADER™ (Zeptosens AG, CH-4108 Witterswil, Schweiz) sequentiell automatisch gemessen Für jedes Array von Messbereichen wird die erfindungsgemässe analytische Plattform justiert zur Erfüllung der Resonanzbedingung für die Lichteinkopplung in die wellenleitende Tantalpentoxid- Schicht und zur Maximierung des in den Messbereichen verfügbaren Anregungslichts. Anschliessend wird von jedem Array eine vom Benutzer wählbare Anzahl von Bildern der Fluoreszenzsignale aus dem betreffenden Array erzeugt, wobei unterschiedliche Belichtungszeiten gewählt werden können. Die Anregungswellenlänge beträgt bei den Messungen für das vorliegende Beispiel 633 nm, die Detektion des Fluoreszenzlicht erfolgt mit einer gekühlten Kamera bei der Fluoreszenzwellenlänge von Cy5, unter Verwendung eines Interferenzfilters (Transmission 670±20 nm) zur Unterdrückung von Streulicht bei der Anregungswellenlänge, der vor dem Objektiv der Kamera positioniert ist. Die erzeugten Fluoreszenzbilder werden automatisch auf der Speicheφlatte des Steuer- Computers abgespeichert. Weitere Details des optischen Systems (ZeptoREADER™) sind in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP 01/10012 beschrieben, welche hiermit vollumfänglich als Bestandteil dieser Anmeldung eingeführt wird.The fluorescence signals from the various arrays of measurement areas are measured automatically and sequentially with a ZeptoREADER ™ (Zeptosens AG, CH-4108 Witterswil, Switzerland). For each array of measurement areas, the analytical platform according to the invention is adjusted to meet the resonance conditions for the light coupling into the wave-guiding tantalum pentoxide. Layer and to maximize the excitation light available in the measuring ranges. Each array then generates a user-selectable number of images of the fluorescence signals from the array in question, with different exposure times being selectable. The excitation wavelength in the measurements for the present example is 633 nm, the fluorescence light is detected with a cooled camera at the fluorescence wavelength of Cy5, using an interference filter (transmission 670 ± 20 nm) to suppress stray light at the excitation wavelength that occurs before Lens of the camera is positioned. The fluorescence images generated are automatically stored on the memory plate of the control computer. Further details of the optical system (ZeptoREADER ™) are described in the international patent application PCT / EP 01/10012, which is hereby fully introduced as part of this application.
2.3. Auswertung und Referenzierung:2.3. Evaluation and referencing:
Die mittlere Signalintensität aus den Messbereichen (Spots) wird bestimmt mithilfe einer Bildanalyse-Software (ZeptoVIEW, Zeptosens AG, CH-4108 Witterswil), welche es ermöglicht, die Fluoreszenzbilder einer Vielzahl von Arrays von Messbereichen halbautomatisch auzuwerten.The mean signal intensity from the measuring areas (spots) is determined using an image analysis software (ZeptoVIEW, Zeptosens AG, CH-4108 Witterswil), which enables the fluorescence images of a large number of arrays of measuring areas to be evaluated semi-automatically.
Die Rohdaten der einzelnen Pixel der Kamera stellen eine zweidimensionale Matrix digitalisierter Messwerte dar, mit der gemessenen Intensität als Messwert eines einzelnen Pixels entsprechend der auf ihn abgebildeten Fläche auf der Sensoφlattform. Für die Auswertung der Daten wird zunächst manuell ein zweidimensionales (Koordinaten-) Netz über die Bildpunkte (Pixelwerte) gelegt derart, dass das Teilbild jedes Spots in ein individuelles zweidimensionales Netzelement fällt. Innerhalb dieses Netzelements wird jedem Spot ein kreisförmiger möglichst gut anzupassender „Auswertebereich" (area of interest, AOI) mit einem vom Benutzer vorzugebenden Radius (typischerweise 90 μm) zugeordnet. Durch die Bildanalysesoftware wird der Ort der einzelnen AOIs individuell als Funktion der Signalintensität der einzelnen Pixel bestimmt. Dabei bleibt der zu Beginn vom Nutzer vorgegebene Radius der AOIs erhalten. Als mittlere Bruttosignalintensität eines jeden Spots wird das arithmetische Mittel der Pixelwerte (Signalintensitäten) innerhalb eines gewählten Auswertebereichs bestimmt.The raw data of the individual pixels of the camera represent a two-dimensional matrix of digitized measurement values, with the measured intensity as a measurement value of an individual pixel corresponding to the area on the sensor platform depicted on it. For the evaluation of the data, a two-dimensional (coordinate) network is first placed manually over the image points (pixel values) such that the partial image of each spot falls into an individual two-dimensional network element. Within this network element, a circular "evaluation area" (AOI) with a radius (typically 90 μm) to be specified by the user is assigned to each spot. The location of the individual AOIs is individually determined as a function of the signal intensity of the individual by the image analysis software Pixel is determined, whereby the radius of the AOIs specified by the user is retained at the beginning - as the mean gross signal intensity of each Spots, the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) is determined within a selected evaluation range.
Die Hintergrundsignale werden bestimmt aus den gemessenen Signalintensitäten zwischen den Spots. Dazu werden pro Spot vier weitere kreisförmige Flächen (mit typischerweise gleichem Radius wie für die Auswertebereiche der Spots) als Auswertebereiche zur Hintergrundsignalbestimmung definiert, welche vorzugsweise in der Mitte zwischen zwischen benachbarten Spots angeordnet sind. Aus diesen vier Kreisflächen wird die mittlere Hintergrundsignalintensität beispielsweise als das arithmetische Mittel der Pixelwerte (Signalintensitäten) innerhalb eines hierfür gewählten AOIs bestimmt. Die mittlere Nettosignalintensität aus den Messbereichen (Spots) wird dann als Differenz zwischen der lokalen mittleren Brutto- und der lokalen mittleren Hintergrundsignalintensität des jeweiligen Spots berechnet.The background signals are determined from the measured signal intensities between the spots. For this purpose, four further circular areas (typically with the same radius as for the evaluation areas of the spots) are defined as evaluation areas for background signal determination, which are preferably arranged in the middle between adjacent spots. From these four circular areas, the mean background signal intensity is determined, for example, as the arithmetic mean of the pixel values (signal intensities) within an AOI selected for this. The mean net signal intensity from the measurement areas (spots) is then calculated as the difference between the local mean gross and the local mean background signal intensity of the respective spot.
Die Referenzierung der Netto-Signalintensität aller Spots erfolgt geweils mithilfe von Referenzspots (Cy5-BS A) eines jeden Arrays von Messbereichen. Dazu wird die Netto-Signalintensität eines jeden Spots durch den Mittelwert der Netto- Signalintensitäten der benachbarten Referenzspots derselben Reihe (angeordnet parallel zur Ausbreitungsrichtung des in der Evaneszentfeld-Sensoφlattform geführten Lichts) dividiert. Durch diese Referenzierang werden die lokalen Unterschiede der verfügbaren Anregungslichtintensität orthogonal zur Lichtausbreitungsrichtung sowohl innerhalb eines jeden Mikroarrays als auch zwischen verschiedenen Mikroarrays kompensiert.The net signal intensity of all spots is referenced using reference spots (Cy5-BS A) of each array of measurement areas. For this purpose, the net signal intensity of each spot is divided by the mean value of the net signal intensities of the neighboring reference spots of the same row (arranged parallel to the direction of propagation of the light guided in the evanescent field sensor platform). This referencing compensates for the local differences in the available excitation light intensity orthogonal to the direction of light propagation both within each microarray and between different microarrays.
2.4. Ergebnisse2.4. Results
Die Ergebnisse der Westem-Blot Analyse als Vergleichsverfahren zu dem erfindungsgemässen Verfahren sind in Figur 2A dargestellt. Der untere Teil der Figur zeigt die Ergebnisse mit den Zellkulturen, die mit den Antiköφern gegen die Oberflächenrezeptoren CD23 („ CD3") und CD28 („ CD28") behandelt wurden, der obere Teil die Ergebnisse mit den unbehandelten Kulturen als Vergleichsprobe, nach Inkubation mit den Lösungen der genannten Antiköφer AI - A4.The results of the Western blot analysis as a comparison method with the method according to the invention are shown in FIG. 2A. The lower part of the figure shows the results with the cell cultures which were treated with the antibodies against the surface receptors CD23 ("CD3") and CD28 ("CD28"), the upper part the results with the untreated cultures as a comparison sample, after incubation with the solutions of the mentioned antibodies AI - A4.
Die Westem-Blot Analyse bestätigt, dass die Antiköφer AI und A2 eine Reihe unterschiedlicher, an Serin bzw. Serin/Threonin phosphorylierten Proteinen, welche Proteinkinasen als Substrate dienen, erkennen und daran binden. Dieses ist an der Vielzahl der Banden im Westem-Blot zu erkennen. Die Antiköφer A3 und A4 erkennen und binden die gleiche Art von Verbinduung, nämlich die p44/42 MAP- Kinase (auch Erk2 genannt), wobei jedoch Antiköφer A3 nur dessen phosphorylierte „aktive" Form (pErk2) erkennt, während Antiköφer A4 beide Formen (die nicht phosphorylierte Form Erk2 und die phosphorylierte Form pErk2) erkennt und daran bindet. Daher wird erwartet, dass sich nach Zugabe von A3 zu der behandelten Probe eine stärker ausgeprägte Bande ergeben sollte als nach Zugabe von A3 zur unbehandelten Probe (sofern diese überhaupt in einer nachweisbaren Menge pErk2 enthält). Tatsächlich ist für die unbehandelte Probe keine solche Bande im Westem- Blot zu erkennen. Für die behandelte Probe sollte sich in beiden Fällen jeweils eine einzelne Bande ergeben. Diese Erwartungen finden sich in den in Figur 2A dargestellten Ergebnissen vollständig bestätigt.The Western blot analysis confirms that the antibodies AI and A2 recognize and bind to a number of different proteins, phosphorylated on serine and serine / threonine, which serve as protein kinases as substrates. This can be seen from the large number of bands in the western blot. Antibodies A3 and A4 recognize and bind the same type of connection, namely p44 / 42 MAP kinase (also known as Erk2), although antibody A3 only recognizes its phosphorylated "active" form (pErk2), whereas antibody A4 recognizes both forms ( recognizes and binds to the non-phosphorylated form Erk2 and the phosphorylated form pErk2). It is therefore expected that a stronger band should result after the addition of A3 to the treated sample than after the addition of A3 to the untreated sample (if this is at all in a detectable amount of pErk2). In fact, no such band can be seen in the Western blot for the untreated sample. In both cases, a single band should result for the treated sample. These expectations are fully confirmed in the results shown in FIG. 2A ,
Figur 2B zeigt die Ergebnisse, welche mit dem erfindungsgemässen Verfahren mit der erfindungsgemässen analytischen Plattform erzielt wurden. Das Balkendiagramm zeigt jeweils im Vergleich die Ergebnisse der mit den Antiköφern gegen die Oberflächenrezeptoren CD23 („αCD3") und CD28 („αCD28") behandelten Zellkultur (ausgefüllte Balken) und der unbehandelten Kultur („Negativ-Kontrolle", leere Balken), welche daraus gewonnenen „natur-identischen" Proben nach Aufbringung in jeweils 6 gleichartigen Arrays von Messbereichen auf einer oben beschriebenen Evaneszentfeld-Sensoφlattform mit den Lösungen der verschiedenen Antiköφer AI - A4 zusammengebracht worden sind. Dabei wurden auf jeweils 4 gleichartige Arrays, die in unterschiedlichen Probenbehältnissen auf einer gemeinsamen Evaneszentfeld-Sensoφlattform angeordnet waren, jeweils unterschiedliche, jeweils einen der 4 genannten Antiköφer AI - A4 enthaltene Lösungen aufgebracht und anschliessend, wie unter 2.1. beschrieben, Cy5-markierte anti-Kaninchen-Antiköφer zugeführt. In Figur 2B sind jeweils die Mittelwerte der nach dem vorangehend beschriebenen Verfahren referenzierten Signalintensitäten von jeweils fünf gleichartigen Messbereichen innerhalb eines Arrays und deren Standardabweichungen dargestellt.FIG. 2B shows the results which were achieved with the method according to the invention with the analytical platform according to the invention. The bar graph shows the results of the cell culture (filled bars) treated with the antibodies against the surface receptors CD23 ("αCD3") and CD28 ("αCD28") and the untreated culture ("negative control", empty bars), which results "nature-identical" samples obtained therefrom after application in 6 identical arrays of measurement areas on an above-described evanescent field sensor platform have been brought together with the solutions of the various antibodies AI-A4. In each case, 4 different arrays of the same type, which were arranged in different sample containers on a common evanescent field sensor platform, each with different solutions, each containing one of the 4 mentioned antibodies AI - A4, and then, as in 2.1. described, Cy5-labeled anti-rabbit antibodies supplied. In Figure 2B are the mean values of the signal intensities of five identical measuring ranges within an array and their standard deviations referenced by the method described above are shown.
Dabei korrelieren die ermittelten Signalintensitäten mit der Konzentration eines jeweilig auftretenden bestimmten Änalyten (hohe Signalintensität entsprechend hoher Konzentration). Es ist deutlich zu erkennen, dass durch Behandlung der Jurkat- Zellkulturen mit den Antiköφern gegen die Oberflächenrezeptoren CD23 („αCD3") und CD28 („αCD28") („Stimulation") die relative intrazelluläre Konzentration an Phospho-(Ser) PKC- und Phospho-(Ser/Thr) Akt Substraten um den Faktor 2.5 bzw. 1.8 im Vergleich zur Negativ-Kontrolle erhöht wurde. Noch stärker, nämlich um den Faktor 10, stieg die Konzentration an pErk2, wobei die Summe des Gehaltes an Erk2 und pErk2 /detektiert mithilfe von Antiköφer A4) innerhalb der Messgenauigkeit konstant blieb. Dieses bedeutet, dass innerhalb der Stimulationsdauer von 10 Minuten der Gesamtgehalt an Erk2 nicht durch Anstieg der Expression erhöht wurde, sondern nur der Gehalt an pErk2 durch Phosphorylierung gesteigert wurde. Die Ergebnisse sind in guter Übereinstimmung mit der als Vergleichsmethode durchgeführten Westem-Blot Analyse (Fig. 2A), wobei hier allerdings der Anstieg des Anteils von Phospho-(Ser/Thr) Akt Substraten nur schwach oder gar nicht zu erkennen ist und eine quantitative Aussage über relative Konzentrationen oder über deren Änderungen, im Gegensatz zu den Ergebnissen des erfindungsgemässen Verfahrens, generell nicht gemacht werden kann.The determined signal intensities correlate with the concentration of a particular analyte that occurs (high signal intensity corresponding to high concentration). It can be clearly seen that by treating the Jurkat cell cultures with the antibodies against the surface receptors CD23 (“αCD3”) and CD28 (“αCD28”) (“stimulation”), the relative intracellular concentration of phospho- (Ser) PKC and Phospho- (Ser / Thr) Akt substrates was increased by a factor of 2.5 or 1.8 compared to the negative control, and the concentration of pErk2 increased even more, namely by a factor of 10, the sum of the content of Erk2 and pErk2 / detected with the aid of antibody A4) remained constant within the measurement accuracy, which means that within the stimulation period of 10 minutes the total content of Erk2 was not increased by an increase in expression, but only the content of pErk2 was increased by phosphorylation. The results are good Agreement with the Western blot analysis carried out as a comparison method (FIG. 2A), but here the increase in the proportion of phospho- (Ser / Thr) Akt substrates n is weak or not at all recognizable and a quantitative statement about relative concentrations or about their changes, in contrast to the results of the method according to the invention, cannot generally be made.
Um die Empfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens für den Nachweis eines einzelnen interessierenden „Markeφroteins" in einer in einem Messbereich aufgebrachten „natur-identischen" Probe, d.h. in dem in einem einzelnen Messbereich immobilisierten Proteom, zu prüfen, wird ein unbehandeltes Zell-Lysat (Negativ- Kontrolle), welches gemäss dem zuvor durchgeführtem Versuch (dessen Ergebnisse in Figur 2B dargestellt sind) nachweislich nur einen sehr geringen Gehalt an pErk2 (drittes Balkenpaar in Figur 2B) enthielt, für einen zweiten Versuch in einzelne Teillösungen aufgeteilt, welche mit diesem „Markeφrotein" in unterschiedlichen Konzentrationen von (0-3645 ng/ml) versetzt werden. Anschliessend werden diese Lösungen, wie zuvor beschrieben, auf dem planaren Wellenleiterchip immobilisiert und ein Assay gemäss 2.1 (unter Verwendung von Antiköφer A3) durchgeführt. Figur 3A zeigt eine typische Signalverteilung aus einem Array von Messbereichen, wobei die markierten Rechtecke jeweils 5 Replikatspots einer zu dem unbehandelten Zell-Lysat hinzugegebenen pErk2-Konzentration darstellen (1-8: aufsteigende Konzentration, gemäss der in Figur 1 dargestellten geometrischen Anordnung).In order to test the sensitivity of the method according to the invention for the detection of a single "mark phrotein" of interest in a "nature-identical" sample applied in a measuring area, ie in the proteome immobilized in a single measuring area, an untreated cell lysate (negative Control), which according to the test carried out previously (the results of which are shown in FIG. 2B) demonstrably contained only a very low content of pErk2 (third pair of bars in FIG. 2B), for a second test divided into individual partial solutions which were labeled with this “brand φrotein” in different concentrations of (0-3645 ng / ml) are added Solutions, as described above, are immobilized on the planar waveguide chip and an assay according to 2.1 (using antibody A3) is carried out. FIG. 3A shows a typical signal distribution from an array of measurement areas, the marked rectangles each representing 5 replicate spots of a pErk2 concentration added to the untreated cell lysate (1-8: increasing concentration, according to the geometric arrangement shown in FIG. 1).
Das Ergebnis dieser Messung für die Detektion von pErk2, in Abhängigkeit von dessen hinzugegebener Konzentration, kann durch eine typische Bindungskurve beschrieben werden, indem an den Konzentrationsverlauf der Signale eine Hill- Funktion angepasst („gefittet") wird (Fig. 3B). Jeder Datenpunkt in Figur 3B stellt den Mittelwert der referenzierten Nettosignalintensitäten von 5 Replikat-Analytspots, jeweils mit der durch Fehlerbalken markierten zugehörigen Standardabweichung, dar. Der vergrösserte Bildausschnitt in Figur 3B zeigt den Konzentrationsverlauf der Signale für die niedrigeren Konzentrationen, dessen Anstieg in der Darstellung für den gesamten Konzentrationsverlauf nicht mehr aufgelöst werden kann. Als Empfindlichkeit des Assays (Limit of Detection) wird, basierend auf der Summe des Signals des O-Wertes („Blank", ohne hinzugefügtes p-Erk2) und dessen zweifacher Standardabweichung, ein Wert von 2.0 ng/ml bestimmt, was einer Gewichtsfraktion von 2x10" g pro g Totalprotein entspricht.The result of this measurement for the detection of pErk2, depending on its added concentration, can be described by a typical binding curve by adapting a hill function (“fitted”) to the concentration curve of the signals (FIG. 3B). Each data point 3B shows the mean value of the referenced net signal intensities of 5 replicate analyte spots, each with the associated standard deviation marked by error bars. The enlarged image section in FIG. 3B shows the concentration curve of the signals for the lower concentrations, the increase in the representation for the whole The sensitivity of the assay (limit of detection) is based on the sum of the signal of the O value ("blank", without added p-Erk2) and its double standard deviation, a value of 2.0 ng / ml determines what a weight fraction of 2x10 " g per g totalp corresponds to red.
Die Figuren 4A und 4B zeigen die Ergebnisse eines zu dem zweiten im wesentlichen analogen dritten Versuchs. Als Unterschied zum vorangehend beschriebenen zweiten Versuch mit den in Figur 3 A und 3 B dargestellten Ergebnissen wird in diesem dritten Versuch das Assay gemäss 2.1 unter Verwendung des Antiköφers A4 (d.h. unter Zugabe zu gleichartigen Arrays wie im zweiten Versuch) durchgeführt. In diesem Versuch wird also die Gesamtheit von phosphorylierter und nicht phosphorylierter Verbindung (pErk2 und Erk2), entsprechend der unterschiedlichen Zugabe von pErk2, bestimmt. Figur 4A zeigt eine typische Signalverteilung aus einem Array von Messbereichen, wobei die markierten Rechtecke wiederum jeweils 5 Replikatspots einer zu dem unbehandelten Zell-Lysat hinzugegebenen pErk2-Konzentration darstellen (1-8: aufsteigende Konzentration, gemäss der in Figur 1 dargestellten geometrischen Anordnung). In diesem Fall wird für die Emfindlichkeit des Assays (Limit of Detection) ein Wert von 120 ng/ml bestimmt, was einer Gewichtsfraktion von 1.2xl0"4 g pro g Totalprotein entspricht.FIGS. 4A and 4B show the results of a third experiment essentially analogous to the second. In contrast to the previously described second experiment with the results shown in FIGS. 3A and 3B, the assay according to 2.1 is carried out in this third experiment using antibody A4 (ie adding to arrays of the same type as in the second experiment). In this experiment, the total of phosphorylated and non-phosphorylated compound (pErk2 and Erk2) is determined according to the different addition of pErk2. FIG. 4A shows a typical signal distribution from an array of measurement areas, the marked rectangles each representing 5 replicate spots of a pErk2 concentration added to the untreated cell lysate (1-8: increasing concentration, according to the geometric arrangement shown in FIG. 1). In this case, the sensitivity of the assay (Limit of Detection) determines a value of 120 ng / ml, which corresponds to a weight fraction of 1.2 × 10 4 g per g total protein.
In einem weiteren, vierten Experiment wird untersucht, ob sich auch unterschiedliche Änderungen der Konzentration an pErk2 infolge Co-Stimulation von Jurkat-Zellen mit CD3/ CD28, mit unterschiedlicher Stimulationsdauer nachweisen lassen und ob die Unterschiede dieser Änderungen mit dem erfindungsgemässen Verfahren aufgelöst werden können.. Dazu werden Jurkat-Zellkulturen vor ihrer Lyse jeweils unterschiedlich lange (im Minutenbereich) mit je 1 μg/ml αCD3/ccCD28 inkubiert. Weiterhin wird eine Jurkat Zeil-Kultur mit Staurosporin (Proteinkinase-Inhibitor) behandelt. Letzere Zellkultur dient als eine Negativkontrolle, da hier aufgrund der Inhibition aller Proteinkinasen kein pErk2 vorhanden sein sollte (siehe auch Abschnitt 1.2), ein hierfür gemessenes Signal also dem Signal einer von pErk2 freien Probe entsprechen sollte. Anschliessend werden die so behandelten Zell-Lysate auf die Evaneszentfeld-Sensor-Plattform gespottet und ein Assay gemäss 2.1, unter Benutzung des Antiköφers A3 zum Nachweis der Änderungen der Konzentrationen von pErk2, durchgeführt.In a further, fourth experiment, it is examined whether different changes in the concentration of pErk2 due to co-stimulation of Jurkat cells with CD3 / CD28 can be detected with different stimulation times and whether the differences of these changes can be resolved with the method according to the invention. For this purpose, Jurkat cell cultures are incubated with 1 μg / ml αCD3 / ccCD28 for different lengths of time (in the minute range) before they are lysed. A Jurkat Zeil culture is also treated with staurosporine (protein kinase inhibitor). The latter cell culture serves as a negative control since there should be no pErk2 due to the inhibition of all protein kinases (see also section 1.2), so a signal measured for this should correspond to the signal of a sample free of pErk2. The cell lysates treated in this way are then spotted on the evanescent field sensor platform and an assay according to 2.1 is carried out using the A3 antibody to detect changes in the concentrations of pErk2.
Das Ergebnis dieser Messung ist in Fig. 5 A dargestellt. Jeder der im Graph gezeigten Balken stellt den referenzierten Mittelwert der Nettosignalintenstät von 5 Replikat- Analytspots mit der dazugehörigen Standardabweichung dar. Es ist gut zu erkennen, dass sich die Änderung der pErk2-Konzentration, detektiert mit dem Antiköφer 3, sehr gut auflösen lässt, wobei die Zeitabhängigkeit, d.h. die Abhängigkeit von der Stimulationsdauer, durch einen schnellen Anstieg der pErk2-Konzentration gekennzeichnet ist, gefolgt von einem Abfall auf das Niveau der Anfangskonzentration nach einer Stimulationsdauer von 60 Minuten, wobei das Konzentrationsmaximum nach etwa 10 Minuten erreicht wird. Das Signal der nicht stimulierten Kontrollprobe liegt geringfügig höher als als dasjenige der mit Staurosporin behandelten Probe, was den natürlichen Anteil von pErk2 ohne Stimulation repräsentiert.The result of this measurement is shown in FIG. 5A. Each of the bars shown in the graph represents the referenced mean of the net signal intensity of 5 replicate analyte spots with the associated standard deviation. It can be clearly seen that the change in the pErk2 concentration, detected with the antibody 3, can be resolved very well, whereby the time dependency, ie the dependence on the duration of the stimulation is characterized by a rapid increase in the concentration of pErk2, followed by a drop to the level of the initial concentration after a stimulation period of 60 minutes, the maximum concentration being reached after about 10 minutes. The signal of the non-stimulated control sample is slightly higher than that of the sample treated with staurosporine, which represents the natural proportion of pErk2 without stimulation.
Als Kontrollmessung werden ein ansonsten gleichartiges Assay und Nachweisverfahren durchgeführt, wobei anstelle des Antiköφers 3 der Antiköφer 4 zum Nachweis der Gesamtheit der entsprechenden phosphorylierten und nicht phosphorylierten Proteinform, also des relativen Gesamtgehalts an Erk2/pErk2 eingesetzt wird. Hierbei wird innerhalb der experimentellen Genauigkeit kein signifikanter Unterschied der Signale, d.h. keine Konzentrationsänderung für die unterschiedlichen Stimulationsdauern, von bis zu 60 Minuten, und auch kein Unterschied zur unbehandelten Kontrollprobe und zur mit Staurosporin behandelten Probe festgestellt (Fig. 5B). An otherwise similar assay and detection method are carried out as a control measurement, with the antibody 4 instead of the antibody 3 to detect the entirety of the corresponding phosphorylated and non-phosphorylated protein form, that is to say the relative total content of Erk2 / pErk2. Here, no significant difference in the signals, ie no change in concentration for the different stimulation periods, of up to 60 minutes, and also no difference to the untreated control sample and to the sample treated with staurosporine is found within the experimental accuracy (FIG. 5B).

Claims

Ansprüche Expectations
1. Verfahren zur Untersuchung einer Vielzahl „natur-identischer" Proben auf in den Proben enthaltene, als Teilnehmer an spezifischen Bindungsreaktionen biologisch relevante Verbindungen als Änalyten, dadurch gekennzeichnet, dass1. A method for the investigation of a large number of "nature-identical" samples for compounds contained in the samples which are biologically relevant as participants in specific binding reactions as analytes, characterized in that
- besagte Proben oder Verdünnungen besagter Proben ohne Änderung der relativen molekularen Zusammensetzung, im Vergleich zur ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der Probe, mit den darin enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten, als einer ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern, in mindestens einem ein- oder zweidimensisonalen Array in diskreten Messbereichen auf einer Evaneszentfeld-Sensoφlattform als festem Träger aufgetragen werden, eine oder mehrere Nachweissubstanzen, als eine zweite Vielzahl spezifischer Bindungspartner, zum spezifischen Nachweis von einem oder mehreren in den Proben enthaltenen Änalyten, aus besagter ersten Vielzahl spezifischer Bindungspartner, in einem einzigen oder mehreren Schritten einer spezifischen Bindungsreaktion mit den in besagten diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben in Kontakt gebracht werden,- Said samples or dilutions of said samples without changing the relative molecular composition, in comparison to the original relative molecular composition of the sample, with the analytes contained therein, as a first plurality of specific binding partners, to be detected, in at least one or two-dimensional array in discrete Measuring areas are applied to an evanescent field sensor platform as a solid support, one or more detection substances, as a second plurality of specific binding partners, for the specific detection of one or more analytes contained in the samples, from said first plurality of specific binding partners, in a single or more steps a specific binding reaction is brought into contact with the samples applied in said discrete measuring ranges,
- Änderungen von optoelektronischen Signalen als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, im evaneszenten Feld der Evaneszentfeld-Sensoφlattform, ortsaufgelöst gemessen werden und- Changes in optoelectronic signals as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measuring ranges in the samples, in the evanescent field of the evanescent field sensor platform, are measured in a spatially resolved manner and
- aus der relativen Grosse der Änderungen besagter optoelektronischer Signale aus den jeweiligen Messbereichen qualitativ und / oder quantitativ das Vorhandensein der dort spezifisch nachzuweisenden Änalyten bestimmt wird.- The presence of the analytes specifically to be detected there is determined qualitatively and / or quantitatively from the relative size of the changes in said optoelectronic signals from the respective measuring ranges.
2. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass die relative molekulare Zusammensetzung einer in einem Messbereich immobilisierten ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern als Änalyten mit der ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der dort aufgebrachten Probe übereinstimmt.2. The method according to spoke 1, characterized in that the relative molecular composition of a first plurality of specific binding partners immobilized in a measuring area corresponds as analytes with the original relative molecular composition of the sample applied there.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld-Sensoφlattform, zur Verbesserung des Haftvermögens der in diskreten Messbereichen aufgetragenen „natur-identischen" Proben oder von deren Verdünnungen, eine Haftvermittlungsschicht umfasst, auf welcher besagte Proben oder deren Verdünnungen aufgetragen werden.3. The method according to any one of claims 1-2, characterized in that the Evaneszentfeld-Sensoφlatform, to improve the adhesiveness of the in "nature-identical" samples applied to discrete measurement areas or of their dilutions, an adhesion-promoting layer on which said samples or their dilutions are applied.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Haftvermittlungsschicht eine Dicke von weniger als 200 nm, bevorzugt von weniger als 20 nm hat.4. The method according to claim 3, characterized in that said adhesive layer has a thickness of less than 200 nm, preferably less than 20 nm.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Gruppe von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren und "selbstorganisierten passiven oder funktionalisierten Mono- oder Mehrfachschichten", Thiolen, Alkylphosphaten und -phosphonaten, multifunktionellen Block-Copolymeren, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycolen.5. The method according to any one of claims 3-4, characterized in that said adhesive layer comprises compounds from the group of silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized passive or functionalized mono- or multiple layers", thiols, Alkyl phosphates and phosphonates, multifunctional block copolymers, such as poly (L) lysine / polyethylene glycols.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Gruppe von Organophosphorsäuren der allgemeinen Formel I (A)6. The method according to any one of claims 3-4, characterized in that said adhesive layer comprises compounds from the group of organophosphoric acids of the general formula I (A)
Y-B-OPO3 H2 (IA)YB-OPO 3 H 2 (IA)
oder von Organophosphonsäuren der allgemeinen Formel I (B)or of organophosphonic acids of the general formula I (B)
und deren Salzen, in denen B einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl- , Hetaryl- oder Hetarylalkylrest und Y Wasserstoff oder eine funktioneile Gruppe aus der Reihe Hydroxy, Carboxy, Amino, gegebenfalls durch Niederalkyl substituiertes Mono-oder Dialkylamino, Thiol, oder eine negative Säuregruppe aus der Reihe Ester, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Maleimid, Succinimydyl, Epoxy oder Acrylat bedeutet and their salts, in which B is an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, hetaryl or hetarylalkyl radical and Y is hydrogen or a functional group from the series hydroxyl, carboxy, amino, optionally mono- or substituted by lower alkyl Dialkylamino, thiol, or a negative acid group from the series ester, phosphate, phosphonate, sulfate, sulfonate, maleimide, succinimydyl, epoxy or acrylate
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, dass besagte „natur-identische" Proben ausgewählt sind aus der Gruppe von Extrakten gesunder oder krankhafter Zellen, (z. B. von menschlichen, tierischen, bakteriellen oder pflanzlichen Zellextrakten), Extrakten von tierischem oder menschlichem Gewebe, wie beispielsweise Organ-, Haut-, Haar- oder Knochengewebe, oder von Pflanzengewebe, sowie von Köφerflüssigkeiten oder deren Bestandteilen, wie beispielsweise Blut, Serum oder Plasma, Gelenkflüssigkeiten, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel, Gewebeflüssigkeit, Lymphe.7. The method according to any one of claims 1-6, characterized in that said "nature-identical" samples are selected from the group of extracts of healthy or pathological cells (eg of human, animal, bacterial or plant cell extracts), Extracts from animal or human tissue, such as organ, skin, hair or bone tissue, or from plant tissue, and from body fluids or their constituents, such as blood, serum or plasma, synovial fluids, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid, lymph ,
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, dass besagte „natur-identische" Proben ausgewählt sind aus der Gruppe, welche Extrakte stimulierter oder unbehandelter Zellen und Extrakte gesunden oder krankhaften Gewebes umfasst.8. The method according to any one of claims 1-6, characterized in that said "nature-identical" samples are selected from the group comprising extracts of stimulated or untreated cells and extracts of healthy or pathological tissue.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass besagte „natur-identische" Probe aus einem Organismus oder Gewebe- oder Zellverband oder Zelle mittels einer Methode aus der Gruppe von Gewebeschnitten, Biopsie oder „Laser Micro Dissection" entnommen wird.9. The method according to any one of claims 1-8, characterized in that said "nature-identical" sample is taken from an organism or tissue or cell structure or cell by means of a method from the group of tissue sections, biopsy or "Laser Micro Dissection" ,
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe das Material von weniger als 20000 Zellen umfasst.10. The method according to any one of claims 1-9, characterized in that a sample comprises the material of less than 20,000 cells.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe das Material von weniger als 1000 Zellen umfasst.11. The method according to any one of claims 1-10, characterized in that a sample comprises the material of less than 1000 cells.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11, dadurch gekennzeichnet, dass in einer „natur-identischen" Probe enthaltene Änalyten, d.h. insbesondere Biopolymere wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, in nativer Form vorliegen.12. The method according to any one of claims 1-11, characterized in that analytes contained in a "nature-identical" sample, i.e. in particular biopolymers such as nucleic acids or proteins, are present in native form.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11, dadurch gekennzeichnet, dass in einer „natur-identischen" Probe enthaltene Änalyten, d.h. insbesondere Biopolymere wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, in denaturierter Form vorliegen.13. The method according to any one of claims 1-11, characterized in that contained in a "nature-identical" sample analytes, ie in particular Biopolymers such as nucleic acids or proteins are present in denatured form.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11, dadurch gekennzeichnet, dass die in einer „natur-identischen" Probe enthaltenen Änalyten, d.h. insbesondere Biopolymere wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, nach Behandlung mit Harnstoff, in denaturierter Form vorliegen, wobei die Epitope besagter Änalyten für die Bindung ihrer jeweiligen Nachweissubstanzen, beispielsweise von Antiköφern, frei zugänglich sind.14. The method according to any one of claims 1-11, characterized in that the analytes contained in a "nature-identical" sample, ie in particular biopolymers such as nucleic acids or proteins, are present in denatured form after treatment with urea, the epitopes being said Analytes for the binding of their respective detection substances, for example of antibodies, are freely accessible.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, dass die in einer „naturidentischen" Probe enthaltenen relativen Gesamtmengen von einer oder mehreren Verbindungen als Änalyten, als Summe von deren Vorkommen in phosphorylierter oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form, bestimmt werden.15. The method according to any one of claims 1-14, characterized in that the relative total amounts contained in a "nature-identical" sample of one or more compounds as analytes, as the sum of their occurrence in phosphorylated or non-phosphorylated form and / or glycolized and / or non-glycosylated form.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, dass die in einer „naturidentischen" Probe enthaltenen relativen Mengen von einer oder mehreren Verbindungen als Änalyten, jeweils von deren Vorkommen in phosphorylierter und / oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form, für eine oder mehrere besagter Formen bestimmt werden.16. The method according to any one of claims 1-14, characterized in that the relative amounts contained in a "nature-identical" sample of one or more compounds as analytes, in each case of their occurrence in phosphorylated and / or non-phosphorylated form and / or glycolized and / or non-glycolized form, for one or more of said forms.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktivierangsgrad eines oder mehrerer in einer „naturidentischen" Probe enthaltenen Änalyten bestimmt wird.17. The method according to any one of claims 1-14, characterized in that the degree of activation of one or more analytes contained in a "nature-identical" sample is determined.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Phosphorylieransgrad und / oder Glykolisierungsgrad eines oder mehrerer in einer „naturidentischen" Probe enthaltenen Änalyten bestimmt wird.18. The method according to any one of claims 1-14, characterized in that the degree of phosphorylier and / or degree of glycolization of one or more analytes contained in a "nature-identical" sample is determined.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 18, dadurch gekennzeichnet, dass Unterschiede von weniger als 20 %.bevozugt von weniger als 10 %, von den in einer „naturidentischen" Probe und in einer oder mehreren Vergleichsproben enthaltenen relativen Mengen von einer oder mehreren Verbindungen in phosphorylierter und / oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form als Änalyten, für eine oder mehrere besagter Formen nachgewiesen werden.19. The method according to any one of claims 1-18, characterized in that differences of less than 20%, preferably less than 10%, of those in a "nature-identical" sample and in one or more Comparative samples containing relative amounts of one or more compounds in phosphorylated and / or non-phosphorylated form and / or glycated and / or non-glycated form as analytes can be detected for one or more of said forms.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 19, dadurch gekennzeichnet, dass besagte „naturidentische" Probe und eine oder mehrere Vergleichsproben dem gleichen Ursprungsort zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen sind und dass zeitliche Veränderungen der in diesen Proben enthaltenen relativen Mengen von einer oder mehreren Verbindungen in phosphorylierter und / oder nicht phosphorylierter Form und / oder glykolisierter und / oder nicht glykolisierter Form als Änalyten, bestimmt werden.20. The method according to any one of claims 1-19, characterized in that said "nature-identical" sample and one or more comparative samples are taken from the same place of origin at different times and that temporal changes in the relative amounts contained in these samples of one or more compounds in phosphorylated and / or non-phosphorylated form and / or glycosylated and / or non-glycosylated form as analytes.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere besagter Proben vor der Auftragung auf besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform als festem Träger in einem flüssigen Verdünnungsmedium gelöst und / oder verdünnt werden und unterschiedliche Verdünnungen einer Probe in unterschiedlichen diskreten Messbereichen auf besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform aufgetragen werden.21. The method according to any one of claims 1-20, characterized in that one or more of said samples before application to said evanescent field sensor platform as a solid carrier are dissolved and / or diluted in a liquid dilution medium and different dilutions of a sample in different discrete measuring ranges can be applied to said evanescent field sensor platform.
22. Verfahren nach Ansprach 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere besagter Proben vor der Auftragung auf besagter Evaneszentfeld- Sensoφlattform als festem Träger in einem flüssigen Verdünnungsmedium gelöst und mindestens um einen Faktor 10 verdünnt werden.22. The method according spoke 21, characterized in that one or more of said samples are dissolved in a liquid dilution medium and diluted by at least a factor of 10 before application to said evanescent field sensor platform as a solid carrier.
23 Nerfahren nach Ansprach 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere besagter Proben vor der Auftragung auf besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform als festem Träger in einem flüssigen Nerdünnungsmedium gelöst und mindestens um einen Faktor 30 verdünnt werden23 ner driving according to spoke 21, characterized in that one or more of said samples before application to said evanescent field sensor platform as a solid carrier are dissolved in a liquid ner thinning medium and diluted by at least a factor of 30
24 Nerfahren nach einem der Ansprüche 1 - 23, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche Proben dem gleichen Organismus oder der gleichen Zellkultur entnommen wurden. 24 Nerfahren according to any one of claims 1-23, characterized in that different samples were taken from the same organism or the same cell culture.
25.Verfahren nach Ansprach 24, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche Proben an verschiedenen Positionen des gleichen Organismus entnommen wurden.25. The method according to spoke 24, characterized in that different samples were taken at different positions of the same organism.
26. Nerfahren nach einem der Ansprüche 1 - 23, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche Proben verschiedenen Organismen oder verschiedenen Zellkulturen entnommen wurden.26. Nerfahren according to any one of claims 1-23, characterized in that different samples were taken from different organisms or different cell cultures.
27 Nerfahren nach einem der Ansprüche 1 - 26, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Proben vor ihrer Auftragung auf der Evaneszentfeld- Sensoφlattform als festem Träger (zur Verbesserung des Haftvermögens auf besagtem festem Träger und Erhöhung der Gleichmässigkeit der Auftragung) mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) gemischt werden.27 Nerfahren according to any one of claims 1-26, characterized in that one or more samples before their application on the Evaneszentfeld- Sensoφlatform as a solid carrier (to improve the adhesion on said solid carrier and increase the uniformity of the application) with a solution of polymers or polymerizable monomers, optionally in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (for example glutaraldehyde).
28Nerfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren oder chemischen „Cross- Linkern" ausgewählt ist aus der Gruppe, welche Lösungen von Polysacchariden, wie z. B. Agarose, oder von Acrylamiden oder von Glutaraldehyd etc.umfasst.The method according to claim 27, characterized in that said solution of polymers or polymerizable monomers or chemical “cross-linkers” is selected from the group consisting of solutions of polysaccharides, such as agarose, or of acrylamides or of glutaraldehyde, etc. ,
29. Nerfahren nach einem der Ansprüche 27 - 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung der einen oder mehreren Proben mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) in der Immobilisierung einer dreidimensionalen Νetzwerkstraktur mit darin eingebundenen, für Νachweissubstanzen in dem nachfolgenden Schritt einer Bioaffinitätsreaktion zugänglichen Probenbestandteilen, auf der Evaneszentfeld-Sensoφlattform als festem Träger resultiert.29. Nerfahren according to any one of claims 27-28, characterized in that the mixture of the one or more samples with a solution of polymers or polymerizable monomers, optionally in the presence of initiators, or of chemical "cross-linkers" (z. B. Glutaraldehyde) in the immobilization of a three-dimensional network structure with embedded sample components accessible to detection substances in the subsequent step of a bioaffinity reaction, on which the evanescent field sensor platform results as a solid support.
30Nerfahren nach einem der Ansprüche 1 - 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben in diskreten Messbereichen auf der Evaneszentfeld-Sensoφlattform direkt oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht räumlich selektiv mithilfe eines Verfahrens aufgebracht werden, welches ausgewählt ist aus der Gruppe von Verfahren, die von "InkJet spotting", mechanischem Spotting mittels Stift, Feder oder Kapillare, „Micro contact printing", fluidischer Kontaktierung der Messbereiche mit besagten Proben durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Drackunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen sowie photochemischen oder photolithographischen Immobilisierungsverfahren gebildet wird.30Nerfahren according to any one of claims 1-29, characterized in that the samples in discrete measurement areas on the evanescent field sensor platform directly or spatially selectively applied to an adhesion-promoting layer applied thereon using a method which is selected from the group of methods comprising "inkjet spotting", mechanical spotting by means of pen, spring or capillary, "micro contact printing", fluidic contacting of the measuring areas with said samples are formed by their supply in parallel or crossed microchannels, under the influence of differences in density or electrical or electromagnetic potentials as well as photochemical or photolithographic immobilization processes.
31 Nerfahren nach einem der Ansprüche 1 - 30, dadurch gekennzeichnet, dass Bereiche zwischen den diskreten Messbereichen zur Minimierang unspezifischer Bindung von Νachweissubstanzen "passiviert werden", d.h. dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Νachweissubstanzen für besagte Änalyten "chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten aufgebracht sind.31 Nerfahren according to any one of claims 1-30, characterized in that areas between the discrete measurement areas to minimize the range of unspecific binding of detection substances are "passivated", i.e. that between the spatially separated measuring ranges with respect to the analytes and other constituents of the applied samples and with respect to the detection substances for said analytes "chemically neutral", i.e. these non-binding components are applied.
32Nerfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass besagte gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Νachweissubstanzen für besagte Änalyten „chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten ausgewählt sind aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderseramalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Änalyten unspezifischen Antiköφem (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Heringsoder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierangsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycolen oder Dextranen, gebildet werden.32The method according to claim 31, characterized in that said components are selected from the groups of albumins, in particular bovine serum albumin or against the analytes and other constituents of the applied samples and against the detection substances for said analytes “chemically neutral”, ie non-binding components Human serum albumin, casein, non-specific, polyclonal or monoclonal, alien or empirically unspecific for the analyte (s) to be detected (especially for immunoassays), detergents, such as Tween 20, which do not hybridize with the analyzed polynucleotides, fragmented natural or synthetic DNA, such as an extract of herring or salmon sperm (especially for polynucleotide hybridization assays), or also uncharged but hydrophilic polymers such as polyethylene glycols or dextrans.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 32, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den in diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten um Verbindungen aus der Gruppe handelt, die von Proteinen, beispielsweise mono- oder polyklonalen Antiköφem und Antiköφerfragmenten, Peptiden, Enzymen, Glycopeptiden, Oligosacchariden, Lektinen, Antigenen für Antiköφer, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag-Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag- Proteinen") sowie Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA) gebildet wird.33. The method according to any one of claims 1-32, characterized in that the analytes to be detected contained in the samples applied in discrete measurement areas are compounds from the group consisting of Proteins, for example mono- or polyclonal antibodies and antibody fragments, peptides, enzymes, glycopeptides, oligosaccharides, lectins, antigens for antibodies, with additional binding sites functionalized proteins ("tag proteins", such as "histidine tag proteins") and nucleic acids ( for example DNA, RNA) is formed.
34. Verfahren nach Ansprach 33, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den in diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten um Verbindungen aus der Gruppe handelt, welche cytosolische oder membrangebundene Zellproteine, insbesondere an den Prozessen der Signaltransduktion in Zellen beteiligte Proteine, wie z. B. Kinasen, umfasst.34. Method according to claim 33, characterized in that the analytes to be detected contained in the samples applied in discrete measurement areas are compounds from the group which contain cytosolic or membrane-bound cell proteins, in particular proteins involved in the processes of signal transduction in cells, such as , B. kinases.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 34, dadurch gekennzeichnet, dass die ortaufgelöst zu messenden Änderungen optoelektronischer Signale, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, durch lokale Änderungen der Resonanzbedingungen zur Erzeugung eines Oberflächenplasmons in einer dünnen Metallschicht als Teil besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform hervorgerufen werden.35. The method according to any one of claims 1-34, characterized in that the spatially resolved changes in optoelectronic signals, as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measurement areas in the samples, by local changes in the resonance conditions for generating a surface plasmon in one thin metal layer as part of said evanescent field sensor platform.
36. Verfahren nach Ansprach 35, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Änderung der Resonanzbedingungen in einer Änderung des Resonanzwinkels für die Einstrahlung eines Anregungslichts zur Erzeugung eines Oberflächenplasmons in einer dünnen Metallschicht als Teil besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform besteht.36. The method according to claim 35, characterized in that said change in the resonance conditions consists in a change in the resonance angle for the irradiation of an excitation light for generating a surface plasmon in a thin metal layer as part of said evanescent field sensor platform.
37. Verfahren nach Ansprach 35, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Änderung der Resonanzbedingungen in einer Änderung der Resonanzwellenlänge eines eingestrahlten Anregungslichts zur Erzeugung eines Oberflächenplasmons in einer dünnen Metallschicht als Teil besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform besteht.37. The method according to claim 35, characterized in that said change in the resonance conditions consists in a change in the resonance wavelength of an irradiated excitation light for generating a surface plasmon in a thin metal layer as part of said evanescent field sensor platform.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 37, dadurch gekennzeichnet, dass die ortaufgelöst zu messenden Änderungen optoelektronischer Signale, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, durch lokale Änderungen des effektiven Brechungsindex in diesen Bereichen auf besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform hervorgerafen werden.38. The method according to any one of claims 1-37, characterized in that the spatially resolved changes in optoelectronic signals, as a result of the binding of detection substances to in discrete measurement areas in the samples contained analytes, are caused by local changes in the effective refractive index in these areas on said evanescent field sensor platform.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 34, dadurch gekennzeichnet, dass die ortaufgelöst zu messenden Änderungen optoelektronischer Signale, als Folge der Bindung von Nachweissubstanzen an in diskreten Messbereichen in den Proben enthaltene Änalyten, durch lokale Änderungen einer oder mehrerer Lumineszenzen von innerhalb des evaneszenten Feldes besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform befindlichen lumineszenzfähigen Molekülen hervorgerafen werden.39. The method according to any one of claims 1-34, characterized in that the spatially resolved changes in optoelectronic signals, as a result of the binding of detection substances to analytes contained in discrete measuring ranges in the samples, by local changes of one or more luminescence from within the evanescent Field of said evanescent field-Sensoφlatform be found luminescent molecules.
40. Verfahren nach Ansprach 39, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Änderungen einer oder mehrerer Lumineszenzen von lumineszenzfähigen Molekülen oder lumineszenzfähigen Nanopartikeln stammen, welche als Lumineszenzlabel an eine oder mehrere Nachweissubstanzen für die in diskreten Messbereichen enthaltenen Änalyten gebunden sind.40. The method according to spoke 39, characterized in that said changes of one or more luminescence originate from luminescent molecules or luminescent nanoparticles, which are bound as luminescent labels to one or more detection substances for the analytes contained in discrete measurement areas.
41. Verfahren nach Ansprach 40, dadurch gekennzeichnet, dass zum Analytnachweis zwei oder mehr Lumineszenzlabel mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen und / oder unterschiedlichen Anregungsspektren, bevorzugt mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen und gleicher Anregungswellenlänge, eingesetzt werden.41. The method according to spoke 40, characterized in that two or more luminescence labels with different emission wavelengths and / or different excitation spectra, preferably with different emission wavelengths and the same excitation wavelength, are used for the analyte detection.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 40 - 41, dadurch gekennzeichnet, dass zum Analytnachweis zwei oder mehr Lumineszenzlabel mit unterschiedlichen Emissionsabklingzeiten eingesetzt werden42. The method according to any one of claims 40-41, characterized in that two or more luminescence labels with different emission decay times are used for the analyte detection
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 - 42, dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweis unterschiedlicher Änalyten in einer Probe zwei oder mehr Lumineszenzlabel verwendet werden.43. The method according to any one of claims 41-42, characterized in that two or more luminescence labels are used to detect different analytes in a sample.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 - 43, dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweis unterschiedlicher Änalyten in einem Messbereich zwei oder mehr Lumineszenzlabel verwendet werden. 44. The method according to any one of claims 41-43, characterized in that two or more luminescence labels are used for the detection of different analytes in a measuring range.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 - 44, dadurch gekennzeichnet, dass die Einstrahlung des Anregungslichts in Pulsen mit einer Dauer zwischen 1 fsec und 10 Minuten erfolgt und das Emissionslicht aus den Messbereichen zeitlich aufgelöst gemessen wird.45. The method according to any one of claims 39-44, characterized in that the excitation light is irradiated in pulses with a duration of between 1 fsec and 10 minutes and the emission light is measured in a temporally resolved manner from the measuring ranges.
46. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 - 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld-Sensoφlattform als fester Träger einen optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten, umfasst.46. The method according to any one of claims 38-45, characterized in that the evanescent field sensor platform as a solid support comprises an optical waveguide comprising one or more layers.
47. Verfahren nach Ansprach 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld- Sensoφlattform als fester Träger einen durchgehenden oder in diskrete wellenleitende Bereiche aufgeteilten planaren optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten, umfasst.47. The method according to spoke 46, characterized in that the evanescent field sensor platform comprises as a solid support a continuous or divided into discrete waveguiding areas planar optical waveguide, comprising one or more layers.
48. Verfahren nach Ansprach 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld- Sensoφlattform als fester Träger einen planaren optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer im wesentlichen optisch transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer zweiten, ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und gegebenenfalls einer ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Zwischenschicht (b') zwischen Schicht (a) und Schicht (b) mit ebenfalls niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst.48. The method according to spoke 47, characterized in that the evanescent field sensor platform as a solid support comprises a planar optical thin-film waveguide with an essentially optically transparent, waveguiding layer (a) on a second, also essentially optically transparent layer (b) with a lower refractive index as layer (a) and optionally also an essentially optically transparent intermediate layer (b ') between layer (a) and layer (b) with likewise lower refractive index than layer (a).
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 48, dadurch gekennzeichnet, dass Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in eine wellenleitende Schicht der Evaneszentfeld-Sensoφlattform über ein oder mehrere optische Koppelemente eingekoppelt wird, welche ausgewählt sind aus der Grappe, die von Prismenkopplem, evaneszenten Kopplem mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stimflächenkopplem mit vor einer Stirnseite der wellenleitenden Schicht angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplem gebildet wird.49. The method according to any one of claims 1-48, characterized in that excitation light from one or more light sources is coupled into a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform via one or more optical coupling elements, which are selected from the Grappe by eccentric prism couplers Couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers with focusing lenses, preferably cylindrical lenses, arranged in front of an end face of the waveguiding layer, and grating couplers are formed.
50. Verfahren nach Ansprach 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Einkopplung von Anregungslicht in eine wellenleitende Schicht der Evaneszentfeldsensoφlattform mithilfe von einer oder mehreren Gitterstrakturen (c) erfolgt, die in der besagten wellenleitenden Schicht ausgeprägt sind.50. The method according spoke 49, characterized in that the coupling of excitation light into a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform using one or more lattice structures (c), which are pronounced in said waveguiding layer.
51. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -50, dadurch gekennzeichnet, dass die Auskopplung von in einer wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld- Sensoφlattform geführtem Licht mithilfe von einer oder mehreren Gitterstrakturen (c') erfolgt, die in besagter wellenleitender Schicht ausgeprägt sind und gleiche oder unterschiedliche Periode und Gittertiefe wie Gitterstrakturen (c) haben.51. The method according to any one of claims 1-50, characterized in that the coupling of light guided in a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform takes place with the aid of one or more lattice structures (c ') which are pronounced in said wave-guiding layer and are the same or have different periods and grid depths like grid structures (c).
52. Verfahren nach einem der Ansprüche 50 - 51, dadurch gekennzeichnet, dass Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen über eine Gitterstruktur (c) in eine wellenleitende Schicht besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform eingekoppelt und zu auf der Evaneszentfeld-Sensoφlattform befindlichen Messbereichen als geführte Welle geleitet wird, dass weiterhin die im evaneszenten Feld besagter geführter Welle erzeugte Lumineszenz von lumineszenzfähigen Molekülen mit einem oder mehreren Detektoren ortsaufgelöst erfasst und die relative Konzentration eines oder mehrerer Änalyten aus der relativen Intensität dieser Lumineszenzsignale bestimmt wird.52. The method according to any one of claims 50-51, characterized in that excitation light from one or more light sources is coupled via a grating structure (c) into a wave-guiding layer of said evanescent field sensor platform and is guided as a guided wave to measurement areas located on the evanescent field sensor platform that the luminescence of molecules capable of luminescence generated in the evanescent field of said guided wave is detected with one or more detectors and the relative concentration of one or more analytes is determined from the relative intensity of these luminescence signals.
53. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 - 52, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden.53. The method according to any one of claims 39-52, characterized in that in addition to the determination of one or more luminescences, changes in the effective refractive index on the measurement areas are determined.
54. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 - 53, dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen und / oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden.54. The method according to any one of claims 35-53, characterized in that the one or more luminescences and / or determinations of light signals are carried out polarization-selectively at the excitation wavelength.
55. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 - 54, dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.55. The method according to any one of claims 39-54, characterized in that the one or more luminescences are measured at a different polarization than that of the excitation light.
56. Analytische Plattform zur Untersuchung einer Vielzahl „natur-identischer" Proben auf in den Proben enthaltene, als Teilnehmer an Bioaffinitätsreaktionen biologisch relevante Verbindungen als Änalyten, umfassend - eine Evaneszentfeld-Sensoφlattform als festen Träger56. Analytical platform for the investigation of a large number of “nature-identical” samples for compounds contained in the samples that are biologically relevant as participants in bioaffinity reactions, comprising as analytes - An evanescent field sensor platform as a solid support
- mindestens ein ein- oder zweidimensionales Array von diskreten Messbereichen mit darin immobilisierten Bindungspartnern auf besagter Evaneszentfeld- Sensoφlattform für den Nachweis besagter Änalyten in einer Bioaffinitätsreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass besagte diskrete Messbereiche durch die Auftragung besagter „natur-identischer" Proben oder daraus hergestellter Verdünnungen, ohne Änderung der relativen molekularen Zusammensetzung, im Vergleich zur ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der Probe, mit den darin nachzuweisenden Änalyten, als einer ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern, erzeugt werden und es sich bei dem einen oder den mehreren immobilisierten Bindungspartnern, welche besagte erste Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern bilden, um den einen oder um die mehreren Änalyten selbst handelt, welche in besagten „natur-identischen" Probe enthalten sind.- At least one or two-dimensional array of discrete measurement areas with binding partners immobilized therein on said evanescent field sensor platform for the detection of said analytes in a bioaffinity reaction, characterized in that said discrete measurement areas by the application of said “nature-identical” samples or dilutions made therefrom , without changing the relative molecular composition, in comparison to the original relative molecular composition of the sample, with the analytes to be detected therein, as a first plurality of specific binding partners, and it is the one or more immobilized binding partners, which said first plurality form specific binding partners, which is the one or more analytes themselves, which are contained in said "nature-identical" sample.
57. Analytische Plattform nach Ansprach 56, dadurch gekennzeichnet, dass die relative molekulare Zusammensetzung einer in einem Messbereich immobilisierten ersten Vielzahl von spezifischen Bindungspartnern als Änalyten mit der ursprünglichen relativen molekularen Zusammensetzung der dort aufgebrachten Probe übereinstimmt.57. Analytical platform according to spoke 56, characterized in that the relative molecular composition of a first plurality of specific binding partners immobilized in a measuring area corresponds as analytes with the original relative molecular composition of the sample applied there.
58. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 57, dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld-Sensoφlattform, zur Verbesserung des Haftvermögens der in diskreten Messbereichen aufgetragenen „natur-identischen" Proben oder von deren Verdünnungen, eine Haftvermittlungsschicht umfasst, auf welcher besagte Proben oder deren Verdünnungen aufgetragen werden.58. Analytical platform according to one of claims 56-57, characterized in that the evanescent field sensor platform, in order to improve the adhesiveness of the "nature-identical" samples applied in discrete measurement areas or of their dilutions, comprises an adhesion-promoting layer on which said samples or whose dilutions are applied.
59. Analytische Plattform nach Ansprach 58, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Haftvermittlungsschicht eine Dicke von weniger als 200 nm, bevorzugt von weniger als 20 nm hat.59. Analytical platform according to spoke 58, characterized in that said adhesive layer has a thickness of less than 200 nm, preferably less than 20 nm.
60. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 58 - 59, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Grappe von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren und "selbstorganisierten passiven oder funktionalisierten Mono- oder Mehrfachschichten", Thiolen, Alkylphosphaten und - phosphonaten, multifunktionellen Block-Copolymeren, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycolen.60. Analytical platform according to one of claims 58-59, characterized in that said adhesion-promoting layer comprises compounds from the grapple of silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized passive or functionalized mono- or multilayers", thiols, alkyl phosphates and phosphonates, multifunctional block copolymers, such as poly (L) lysine / polyethylene glycols.
61. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 58 - 59, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Grappe von Organophosphorsäuren der allgemeinen Formel I (A)61. Analytical platform according to one of claims 58-59, characterized in that said adhesion-promoting layer comprises compounds from the grapple of organophosphoric acids of the general formula I (A)
oder von Organophosphonsäuren der allgemeinen Formel I (B)or of organophosphonic acids of the general formula I (B)
und deren Salzen, in denen B einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Hetaryl- oder Hetarylalkylrest und Y Wasserstoff oder eine funktionelle Gruppe aus der Reihe Hydroxy, Carboxy, Amino, gegebenfalls durch Niederalkyl substituiertes Mono-oder Dialkylamino, Thiol, oder eine negative Säuregruppe aus der Reihe Ester, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Maleimid, Succinimydyl, Epoxy oder Acrylat bedeutet.and their salts in which B is an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, hetaryl or hetarylalkyl radical and Y is hydrogen or a functional group from the series hydroxyl, carboxy, amino, optionally mono- or substituted by lower alkyl Dialkylamino, thiol, or a negative acid group from the series ester, phosphate, phosphonate, sulfate, sulfonate, maleimide, succinimydyl, epoxy or acrylate.
62. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 61, dadurch gekennzeichnet, dass besagte aufgebrachte „natur-identische" Proben ausgewählt sind aus der Grappe von Extrakten gesunder oder krankhafter Zellen, (z. B. von menschlichen, tierischen, bakteriellen oder pflanzlichen Zellextrakten), Extrakten von tierischem oder menschlichem Gewebe, wie beispielsweise Organ-, Haut-, Haar- oder Knochengewebe, oder von Pflanzengewebe, sowie von Köφerflüssigkeiten oder deren Bestandteilen, wie beispielsweise Blut, Serum oder Plasma, Gelenkflüssigkeiten, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel, Gewebeflüssigkeit, Lymphe.62. Analytical platform according to any one of claims 56-61, characterized in that said applied "nature-identical" samples are selected from the group of extracts of healthy or pathological cells (eg of human, animal, bacterial or plant cell extracts ), Extracts from animal or human tissue, such as organ, skin, hair or bone tissue, or from plant tissue, as well as from body fluids or their components, such as blood, serum or plasma, synovial fluids, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid , Lymph.
63. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 61, dadurch gekennzeichnet, dass besagte „natur-identische" Proben ausgewählt sind aus der Gruppe, welche Extrakte stimulierter oder unbehandelter Zellen und Extrakte gesunden oder krankhaften Gewebes umfasst.63. Analytical platform according to one of claims 56-61, characterized in that said “nature-identical” samples are selected from the Group comprising extracts of stimulated or untreated cells and extracts of healthy or pathological tissue.
64. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 63, dadurch gekennzeichnet, dass besagte „natur-identische" Proben aus einem Organismus oder Gewebe- oder Zellverband oder Zelle mittels einer Methode aus der Gruppe von Gewebeschnitten, Biopsie oder „Laser Capture Micro Dissection" entnommen sind.64. Analytical platform according to one of claims 56-63, characterized in that said "nature-identical" samples from an organism or tissue or cell structure or cell by means of a method from the group of tissue sections, biopsy or "Laser Capture Micro Dissection" are removed.
65. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 456- 54, dadurch gekennzeichnet, dass eine aufgebrachte Probe das Material von weniger als 20000 Zellen umfasst.65. Analytical platform according to one of claims 456- 54, characterized in that an applied sample comprises the material of less than 20,000 cells.
66. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 65, dadurch gekennzeichnet, dass eine aufgebrachte Probe das Material von weniger als 1000 Zellen umfasst.66. Analytical platform according to one of claims 56-65, characterized in that an applied sample comprises the material of less than 1000 cells.
67. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 66, dadurch gekennzeichnet, dass in einer „natur-identischen" Probe enthaltene Änalyten, d.h. insbesondere Biopolymere wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, in nativer Form vorliegen.67.Analytical platform according to one of claims 56-66, characterized in that analytes contained in a "nature-identical" sample, i.e. in particular biopolymers such as nucleic acids or proteins, are present in native form.
68. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 66, dadurch gekennzeichnet, dass in einer „natur-identischen" Probe enthaltene Änalyten, d.h. insbesondere Biopolymere wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, in denaturierter Form vorliegen.68.Analytical platform according to one of claims 56-66, characterized in that analytes contained in a "nature-identical" sample, i.e. in particular biopolymers such as nucleic acids or proteins, are present in denatured form.
69. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 66, dadurch gekennzeichnet, dass die in einer „natur-identischen" Probe enthaltenen Änalyten, d.h. insbesondere Biopolymere wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, nach Behandlung mit Harnstoff, in denaturierter Form vorliegen, wobei die Epitope besagter Änalyten für die Bindung ihrer jeweiligen Nachweissubstanzen, beispielsweise von Antiköφem, frei zugänglich sind. 69. Analytical platform according to one of claims 56-66, characterized in that the analytes contained in a "nature-identical" sample, ie in particular biopolymers such as nucleic acids or proteins, are present in denatured form after treatment with urea, the epitopes said analytes for the binding of their respective detection substances, for example of antibodies, are freely accessible.
70. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 69, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere besagter Proben vor der Auftragung auf der Evaneszentfeld-Sensoφlattform als festem Träger in einem flüssigen Verdünnungsmedium gelöst und / oder verdünnt wurden und unterschiedliche Verdünnungen einer Probe in unterschiedlichen diskreten Messbereichen auf besagter Evaneszentfeld-Sensoφlattform aufgetragen wurden.70. Analytical platform according to any one of claims 56-69, characterized in that one or more of said samples were dissolved and / or diluted as a solid carrier in a liquid dilution medium before application to the evanescent field sensor platform and / or different dilutions of a sample in different discrete Measuring ranges were applied to said evanescent field sensor platform.
71. Analytische Plattform nach Ansprach 70, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere besagter Proben vor der Auftragung auf besagter Evaneszentfeld- Sensoφlattform als festem Träger in einem flüssigen Verdünnungsmedium gelöst und mindestens um einen Faktor 10 verdünnt wurden.71. Analytical platform according to spoke 70, characterized in that one or more of said samples before application to said evanescent field sensor platform as a solid support were dissolved in a liquid dilution medium and diluted by at least a factor of 10.
72. Analytische Plattform nach Ansprach 70, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere besagter Proben vor der Auftragung auf besagter Evaneszentfeld- Sensoφlattform als festem Träger in einem flüssigen Verdünnungsmedium gelöst und mindestens um einen Faktor 30 verdünnt wurden.72. Analytical platform according to spoke 70, characterized in that one or more of said samples before application to said evanescent field sensor platform as a solid support were dissolved in a liquid dilution medium and diluted by at least a factor of 30.
73. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 72, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche aufgetragene Proben dem gleichen Organismus oder der gleichen Zellkultur entnommen wurden.73. Analytical platform according to one of claims 56-72, characterized in that different applied samples were taken from the same organism or the same cell culture.
74. Analytische Plattform nach Ansprach 73, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche aufgetragene Proben an verschiedenen Positionen des gleichen Organismus entnommen wurden.74. Analytical platform according to spoke 73, characterized in that different applied samples were taken at different positions of the same organism.
75. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 74, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche aufgetragene Proben verschiedenen Organismen oder verschiedenen Zellkulturen entnommen wurden.75. Analytical platform according to one of claims 56-74, characterized in that different applied samples were taken from different organisms or different cell cultures.
76. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 75, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Proben vor ihrer Auftragung auf der Evaneszentfeld-Sensoφlattform als festem Träger (zur Verbesserung des Haftvermögens auf besagtem festem Träger und Erhöhung der Gleichmässigkeit der Auftragung) mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) gemischt werden.76. Analytical platform according to one of claims 56-75, characterized in that one or more samples before their application on the evanescent field sensor platform as a solid carrier (to improve the adhesion on said solid carrier and increase the uniformity of the application) with a solution of polymers or polymerizable monomers, optionally in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (eg glutaraldehyde).
77. Analytische Plattform nach Ansprach 76, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren oder chemischen „Cross- Linkern" ausgewählt ist aus der Gruppe, welche Lösungen von Polysacchariden, wie z. B. Agarose, oder von Acrylamiden oder von Glutaraldehyd etc.umfasst.77. Analytical platform according to spoke 76, characterized in that said solution of polymers or polymerizable monomers or chemical "cross-linkers" is selected from the group consisting of solutions of polysaccharides, such as agarose, or of acrylamides or of glutaraldehyde etc.umfasst.
78. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 76 - 77, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung der einen oder mehreren Proben mit einer Lösung von Polymeren oder polymerisierbaren Monomeren, gegebenenfalls in Anwesenheit von Initiatoren, oder von chemischen „Cross-Linkern" (z. B. Glutaraldehyd) in der Immobilisierung einer dreidimensionalen Netzwerkstruktur mit darin eingebundenen, für Nachweissubstanzen in dem nachfolgenden Schritt einer Bioaffinitätsreaktion zugänglichen Probenbestandteilen, auf der Evaneszentfeld-Sensoφlattform als festem Träger resultiert.78. Analytical platform according to one of claims 76-77, characterized in that the mixture of the one or more samples with a solution of polymers or polymerizable monomers, if appropriate in the presence of initiators, or of chemical “cross-linkers” (e.g. . Glutaraldehyde) in the immobilization of a three-dimensional network structure with embedded sample components accessible to detection substances in the subsequent step of a bioaffinity reaction, on which the evanescent field sensor platform results as a solid support.
79. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 78, dadurch gekennzeichnet, dass ein Array mehr als 50, bevorzugt mehr als 500, besonders bevorzugt mehr als 5000 Messbereiche umfasst.79. Analytical platform according to one of claims 56-78, characterized in that an array comprises more than 50, preferably more than 500, particularly preferably more than 5000 measuring ranges.
80. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 79, dadurch gekennzeichnet, dass die Messbereiche eines Arrays in einer Dichte von mehr als 10, bevorzugt von mehr als 100, besonders bevorzugt von mehr als 1000 Messbereichen pro Quadratzentimeter angeordnet sind.80. Analytical platform according to one of claims 56-79, characterized in that the measurement areas of an array are arranged in a density of more than 10, preferably more than 100, particularly preferably more than 1000 measurement areas per square centimeter.
81. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 80, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Evaneszenzfeld-Sensoφlattform als festem Träger eine Vielzahl von Arrays von Messbereichen angeordnet sind.81. Analytical platform according to one of claims 56-80, characterized in that a plurality of arrays of measuring areas are arranged on the evanescent field sensor platform as a solid support.
82. Analytische Plattform nach Ansprach 81, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Evaneszenzfeld-Sensoφlattform als festem Träger mindestens 5, bevorzugt mindestens 50 Arrays von Messbereichen angeordnet sind. 82. Analytical platform according to spoke 81, characterized in that at least 5, preferably at least 50, arrays of measurement areas are arranged on the evanescence field sensor platform as a solid support.
83. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 82, dadurch gekennzeichnet, dass Bereiche zwischen den diskreten Messbereichen zur Minimierang unspezifischer Bindung von Nachweissubstanzen "passiviert sind", d.h. dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Nachweissubstanzen für besagte Änalyten "chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten aufgebracht sind.83. Analytical platform according to one of claims 56 - 82, characterized in that areas between the discrete measurement areas for minimizing the non-specific binding of detection substances are "passivated", i.e. that between the spatially separated measuring ranges compared to the analytes and other constituents of the applied samples and to the detection substances for said analytes "chemically neutral", i.e. these non-binding components are applied.
84. Analytische Plattform nach Ansprach 83, dadurch gekennzeichnet, dass besagte gegenüber den Änalyten und anderen Inhaltsstoffen der aufgebrachten Proben sowie gegenüber den Nachweissubstanzen für besagte Änalyten „chemisch neutrale", d.h. diese nicht bindende, Komponenten ausgewählt sind aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderseramalbumin oder Humanseramalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Änalyten unspezifischen Antiköφem (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierangsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycolen oder Dextranen, gebildet werden.84. Analytical platform according to spoke 83, characterized in that the said “chemically neutral”, ie non-binding, components are selected from the groups consisting of albumins, compared to the analytes and other constituents of the applied samples and to the detection substances for said analytes. in particular bovine serum albumin or human serum albumin, casein, non-specific, polyclonal or monoclonal, alien or empirically unspecific antibodies (especially for immunoassays) for the analyte (s) to be detected, detergents - such as Tween 20 - that do not hybridize with the analyzed polynucleotides, or fragmented DNA , such as an extract of herring or salmon sperm (in particular for polynucleotide hybridization assays), or also uncharged but hydrophilic polymers, such as polyethylene glycols or dextrans.
85. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 84, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den in diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten um Verbindungen aus der Grappe handelt, die von Proteinen, beispielsweise mono- oder polyklonalen Antiköφem und Antiköφerfragmenten, Peptiden, Enzymen, Glycopeptiden, Oligosacchariden, Lektinen, Antigenen für Antiköφer, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen („Tag-Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag- Proteinen") sowie Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA) gebildet wird.85. Analytical platform according to one of claims 56-84, characterized in that the analytes to be detected contained in the samples applied in discrete measurement areas are Grapple compounds which are derived from proteins, for example mono- or polyclonal antibodies and antibody fragments, peptides , Enzymes, glycopeptides, oligosaccharides, lectins, antigens for antibodies, with additional binding sites functionalized proteins ("tag proteins", such as "histidine tag proteins") and nucleic acids (e.g. DNA, RNA) is formed.
86. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 84, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den in diskreten Messbereichen aufgetragenen Proben enthaltenen, nachzuweisenden Änalyten um Verbindungen aus der Grappe handelt, welche cytosolische oder membrangebundene Zellproteine, insbesondere an den Prozessen der Signaltransduktion in Zellen beteiligte Proteine, wie z. B. Kinasen, umfasst.86. Analytical platform according to one of claims 56-84, characterized in that the analytes to be detected contained in the samples applied in discrete measurement areas are compounds from the Grappe which cytosolic or membrane-bound cell proteins, in particular proteins involved in the processes of signal transduction in cells, such as. B. kinases.
87. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 86, dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld-Sensoφlattform eine dünne Metallschicht, gegebenenfalls auf einer darunter befindlichen Zwischenschicht mit Brechungsindex vorzugsweise < 1.5, wie beispielsweise Siliciumdioxid oder Magnesiumfluorid, umfasst, wobei die Dicke der Metallschicht und der eventuellen Zwischenschicht so ausgewählt ist, dass ein Oberflächenplasmon bei der Wellenlänge eines eingestrahlten Anregungslichts und / oder bei der Wellenlänge einer erzeugten Lumineszenz angeregt werden kann.87. Analytical platform according to one of claims 56-86, characterized in that the evanescent field sensor platform comprises a thin metal layer, optionally on an intermediate layer underneath with a refractive index, preferably <1.5, such as silicon dioxide or magnesium fluoride, the thickness of the metal layer and the possible intermediate layer is selected such that a surface plasmon can be excited at the wavelength of an irradiated excitation light and / or at the wavelength of a luminescence generated.
88. Analytische Plattform nach Anspruch 87, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall ausgewählt ist aus der Grappe, welche Gold und Silber umfasst.88. Analytical platform according to claim 87, characterized in that the metal is selected from the grappa, which comprises gold and silver.
89. Analytische Plattform nach Anspruch 87, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallschicht eine Dicke zwischen 10 nm und 1000 nm, bevorzugt zwischen 30 nm und 200 nm, hat.89. Analytical platform according to claim 87, characterized in that the metal layer has a thickness between 10 nm and 1000 nm, preferably between 30 nm and 200 nm.
90. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 89, dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld-Sensoφlattform als fester Träger einen optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten, umfasst.90. Analytical platform according to one of claims 56-89, characterized in that the evanescent field sensor platform as a solid support comprises an optical waveguide comprising one or more layers.
91. Analytische Plattform nach Ansprach 90, dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld-Sensoφlattform als fester Träger einen durchgehenden oder in diskrete wellenleitende Bereiche aufgeteilten planaren optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten, umfasst.91. Analytical platform according to spoke 90, characterized in that the evanescent field sensor platform comprises as a solid support a continuous or divided into discrete waveguiding areas planar optical waveguide, comprising one or more layers.
92. Analytische Plattform nach Ansprach 91, dadurch gekennzeichnet, dass die Evaneszentfeld-Sensoφlattform als fester Träger einen planaren optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer im wesentlichen optisch transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer zweiten, ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und gegebenenfalls einer ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Zwischenschicht (b') zwischen Schicht (a) und Schicht (b) mit ebenfalls niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst.92. Analytical platform according to spoke 91, characterized in that the evanescent field sensor platform as a solid support comprises a planar optical thin-film waveguide with an essentially optically transparent, waveguiding layer (a) on a second, likewise essentially optically transparent layer (b) with a lower one Refractive index as layer (a) and optionally also an essentially optically transparent intermediate layer (b ') between layer (a) and layer (b) with a likewise lower refractive index than layer (a).
93. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 92, dadurch gekennzeichnet, dass eine wellenleitende Schicht der Evaneszenzfeld-Sensoφlattform mit einem oder mehreren optischen Koppelelementen in optischem Kontakt steht, welche die Einkopplung von Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in die besagte wellenleitende Schicht ermöglichen, wobei besagte optische Koppelelemente ausgewählt sind aus der Grappe von Prismenkopplem, evaneszenten Kopplem mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der besagten wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld-Sensoφlattform angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplem.93. Analytical platform according to one of claims 56-92, characterized in that a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform is in optical contact with one or more optical coupling elements, which enable the coupling of excitation light from one or more light sources into said wave-guiding layer , wherein said optical coupling elements are selected from the group of prism couplers, evanescent couplers with matched optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers with focusing lenses, preferably cylindrical lenses, and grating couplers arranged in front of an end face of said waveguiding layer of the evanescent field sensor platform.
94. Analytische Plattform nach Ansprach 93, dadurch gekennzeichnet, dass in einer wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld-Sensoφlattform eine oder mehrere Gitterstrakturen (c) ausgeprägt sind, welche die Einkopplung von Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen ermöglichen.94. Analytical platform according to spoke 93, characterized in that in a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform one or more lattice structures (c) are formed, which enable the coupling of excitation light from one or more light sources.
95. Analytische Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 94, dadurch gekennzeichnet, dass in einer wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld- Sensoφlattform eine oder mehrere Gitterstrakturen (c') mit gleicher oder unterschiedlicher Gitteφeriode und Gittertiefe wie Gitterstrakturen (c) ausgeprägt sind, welche die Auskopplung von in besagter wellenleitender Schicht geführtem Licht ermöglichen.95. Analytical platform according to one of claims 56-94, characterized in that in a wave-guiding layer of the evanescent field sensor platform one or more lattice structures (c ') with the same or different lattice period and lattice depth as lattice structures (c) are formed, which are the decoupling of light guided in said waveguiding layer.
96. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 - 55 oder einer analytischen Plattform nach einem der Ansprüche 56 - 95 zu quantitativen und / oder qualitativen Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Änalyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik und die Bestimmung von genomischen oder proteomischen Unterschieden im Genom, wie beispielsweise Einzelnukleotid- Polymoφhismen, zur Messung von Protein-DNA- Wechselwirkungen, zur Bestimmung von Steuerangsmechanismen für die m-RNA-Expression und für die Protein(bio)synthese, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofilen, insbesondere zur Bestimmung von biologischen und chemischen Markerstoffen, wie mRNA, Proteinen, Peptiden oder niedermolekularen organischen (Boten-)Stoffen, sowie zum Nachweis von Antiköφem, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Protduktforschung und -entwicklung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktforschung und -entwicklung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischehn Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregem, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, insbesondere in der Lebensmittel- und Umweltanalytik. 96. Use of a method according to any one of claims 1-55 or an analytical platform according to any one of claims 56-95 for quantitative and / or qualitative analyzes for the determination of chemical, biochemical or biological analytes in screening processes in pharmaceutical research, combinatorial chemistry, clinical and preclinical development, for real-time binding studies and for determining kinetic parameters in affinity screening and in research, for qualitative and quantitative analyte determinations, in particular for DNA and RNA analysis and the determination of genomic or proteomic differences in the genome, such as single nucleotide polymorphisms, for measuring protein-DNA interactions, for determining control mechanisms for m-RNA expression and for protein (bio ) synthesis, for the preparation of toxicity studies and for the determination of expression profiles, in particular for the determination of biological and chemical marker substances, such as mRNA, proteins, peptides or low molecular weight organic (messenger) substances, as well as for the detection of antibodies, antigens, pathogens or bacteria in pharmaceutical product research and development, human and veterinary diagnostics, agrochemical product research and development, symptomatic and presymptomatic plant diagnostics, for patient stratification in pharmaceutical product development and for therapeutic drug selection, for the detection of pathogens, harm substances and pathogens, in particular of salmonella, prions, viruses and bacteria, in particular in food and environmental analysis.
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